KR19980042918A - 핵산의 세포-특이적 전이를 위한 다관능성 리간드 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뉴클레오티드 서열의 세포-특이적 전이를 수행하는, 면역원성이 아닌, 다관능성 리간드 시스템에 관한 것이다. 본 시스템은 하나 이상의 표적 세포-특이적 리간드, 하나 이상의 링커 및 하나 이상의 유전자 작제물-특이적 리간드를 포함하며, 이때, 유전자 작제물-특이적 리간드는 유전자 작제물에 직접 또는 간접적으로 결합하는 항체 또는 이의 일부를 포함하는 것이 유익하다. 본 발명은 또한 피부 질환, 점막 질환, 신경계 질환, 내부 기관 질환, 혈액 응고 질환, 조혈계 질환, 면역계 질환, 근조직 질환 및 재돌기 조직 또는 관절 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제 또는 백신을 제조하기 위한 리간드 시스템에 관한 것이다.

Description

핵산의 세포-특이적 전이를 위한 다관능성 리간드 시스템

발명의 분야

본 발명은 폴리뉴클오티드를 세포내로 전이시키기 위한 개선된 방법 및 제제에 관한 것이다.

발명의 배경

세포 표면에 유전자 작제물을 결합시키는 것은, 비록 불충분할지라도, 유전자를 세포내로 전이시키기 위한 필수적인 선행조건이다. 상기 결합이 강할수록, 유전자 작제물이 세포에 의애 성공적으로 흡입되어 새포내에서 전사될 수 있는 가능성이 커질 것이다. 상기 결합이 특이적일수록, 유전자 작제물은 우세적으로 또는 유일하게 표적 세포에 결합되어 상기 세포에 의해 흡입되기가 쉽다. 유전자 작제물의 표적 세포에 대한 결합의 특이성은, 유전자 작제물 및 표적 세포외에 또 다른 유형의 세포가 존재하더라도 유전자 작제물이 표적 세포에 의해 우세적으로 또는 배타적으로 흡입되어야 하는 경우, 특히 중요하다.

다양한 기술이 개발되어 유전자 작제물을 세포-특이적 방법으로 결합시킬 수 있다. 모든 기술중에서, (1) 세포 막에 발현되는 수용체에 대한 리간드의 결합, 또는 (2) 세포 막에 노출되는 항원 또는 합텐에 대한 항체의 결합을 이용하는 것이 일반적이다. 이러한 기술의 예에는 헤레굴린과 같은 리간드[참조: Han et al., PNAS 92, 9747(1995)], 에리트로포이에틴[참조: Kasahara et al., Science 266, 1373(1994], 단일-쇄 Fv와 같은 항체 단편[참조: Marin et al., J. Virol. 70, 2957 (1996)] 또는 Fc 수용체의 세포외 부분과 같은 수용체[Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)]를 레트로바이러스 벡터의 코트 당단백질에 혼입시켜 상기 방식으로 표적 세포 특이성을 일으키는 재조합 방법을 포함한다.

또한 화학적 방법을 사용하여 아시알로글리코프로테인[Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 1152 (1994)] 또는 상기 단백질의 합성 유도체[Marwin et al., Bioconjugate Chem. 5, 612 (1994)]와 같은 리간드를 폴리리신에 결합시키고, 후자와 유전자 작제물의 복합체를 형성시키거나 후자를 아데노바이러스 벡터의 코트 단백질에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 또 다른 방법은 리간드를 스트렙타비딘에 결합시키고나서, 리포좀의 인지질 상부에 결합된 비오틴에 결합시켜, 리포좀이 유전자 작제물과 복합체를 형성하도록 하는 것이다[참조: Redelmeir et al., Drug Deliv. J. Deliv. Targeting Therap. Agents 2, 98, (1995)]. 제1 리간드 시스템이 Fominaya 등[참조: J. Biol. Chem. 271, 10560, 1996]에 의해 제시되었다. 상기 리간드 시스템은 종양 세포상의 Erb B2 수용체, 슈도모나스 융합성(fusogenic) 펩티드 외독소 A 및 효모 Gal-4 단백질의 DNA-결합 도메인에 특이적인 항체 단편을 포함하고, 이는 전이유전자(transgene)를 함유하는 플라스미드에 삽입된 상응하는 Gal-4 결합 서열에 결합된다. 상기 리간드 시스템은 표적 세포-특이적 형질감염을 일으킬 수 있지만, 효모 Gal-4 단백질의 면역원성에 따른 단점이 있다.

상기 공개된 방법중의 어느 것도 표적 세포-특이적 방법으로 벡터를 결합시키는 문제를 적당히 해결하지 못했다. 이러한 특이성 결핍의 주원인에는 (1) 개질된 바이러스 벡터 기능의 손상; (2) 사용된 리간드 시스템의 상당한 복잡성과 크기; (3) 이종 단백질 또는 개질된 단백질 또는 사용된 스트렙타비딘-비오틴 결합 시스템의 면역원성 및 적합성; 및 (4) 표적 세포-특이적 세포 형질도입을 수행하는데 있어서의 결합된 유전자 작제물의 부적당한 능력이 포함된다.

이러한 한계의 결과로서, 간단하게 제조되고, 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터를 표적 세포에 결합시키는데 유용한 관능성 리간드의 필요성이 여전히 존재한다.

따라서, 뉴클레오티드 서열의 표적 세포-특이적 전이를 위한, 이미 공지된 시스템보다 제조하고 사용하기가 간단한, 면역원성이 아닌 리간드 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 또 다른 목적은 표적 세포에 대한 결합 벡터의 특이성을 증가시키고, 이로써 표적 세포에의 핵산의 전이 효율 및 선택성을 개선시키고자 하는데 있다.

상기 및 기타 목적을 성취하는데 있어서, 본 발명의 한 태양은 하나 이상의 표적 세포-특이적 리간드, 항체 또는 항체 일부를 포함하는 하나 이상의 유전자 작제물-특이적 리간드, 두 개의 리간드를 연결하는 링커를 포함하고, 면역원성이 아닌, 뉴클레오티드 서열의 표적 세포-특이적 전이를 위한 다관능성 리간드 시스템을 제공하는 것이다. 유익한 태양에서, 하나 이상의 리간드는 사람화된 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 유익한 태양에서, 하나 이상의 표적 세포-특이적 리간드, 항체 또는 항체 일부를 포함하는 하나 이상의 유전자 작제물-특이적 리간드, 두 개의 리간드를 연결하는 링커를 포함하고, 면역원성이 아닌, 뉴클레오티드 서열의 표적 세포-특이적 전이를 위한 다관능성 리간드 시스템을 포함하는 조성물은 질환을 치료하는데 제공되고 환자에 투여하기에 적합한 담체에 제공된다.

또 다른 유익한 태양에서, 당해 리간드 시스템은 두 개의 리간드를 서로 연결하는 연결체를 포함하고 당해 연결체는 두 개의 링커를 포함한다. 또 다른 유익한 태양에서, (a) Fv 단편의 가변성 중쇄 및 경쇄가 짧은 펩티드 서열에 의해 공유결합된 항-NCAM 재조합 단일-쇄 Fv 단편을 포함하는 TS 리간드; (b) 서열 GLFEALLELLESLWELLLEA(서열 1)을 갖는 융합성 펩티드를 포함하는 링커; 및 (c) N⁶-메틸아데닌에 대한 재조합 항체를 포함하는 GS 리간드를 포함하는 리간드 시스템이 제공된다.

또 다른 유익한 태양에서, 본 발명은 피부 질환, 점막 질환, 신경계 질환, 내부 기관 질환, 혈액 응고 질환, 조혈계 질환, 면역계 질환, 근조직 질환 및 재돌기 조직 또는 관절 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 리간드 시스템의 용도에 관한 것이다. 상기 리간드 시스템을 환자 또는 환자로 부터 수득된 세포에 국소적으로 투여하거나 주사하여, 피부, 점막, 신경계, 내부 기관, 혈액 응고, 조혈계, 면역계, 재돌기 조직 및 관절중의 하나 이상과 관련된 질환을, 백신으로서, 예방하거나 치료한다.

이러한 이점은 본 발명에 따라 세포 특이적 리간드를 유전자 작제물에 연결시킴으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세로 부터 명백해질 것이다. 그러나, 당업자는 상세를 통해 본 발명의 취지 및 범위내의 각종 변화 및 변형을 알수 있으므로, 본 발명의 바람직한 태양을 나타내는, 하기 상세 및 구체예는 단지 설명을 위한 것이다.

도1에는 리간드가 링커(도1a 및 도1b) 또는 연결체(도1c)에 의해 연결된, 표적 세포-특이적 리간드 및 유전자 작제물-특이적 리간드로 이루어진 3개의 또 다른 리간드 시스템이 도시되어 있다.

도2에는 연결체가 항체의 경첩부를 포함하는, 도1c의 리간드 시스템의 태양이 도시되어 있다.

도3에는 연결체가 Gal80 단백질 및 Gal4의 Gal80-결합 도메인을 포함하는, 도1c의 리간드 시스템의 또 다른 태양이 도시되어 있다.

도4에는 융합성 펩티드가 두 개의 항체 단편을 연결시키는데 사용되는 태양이 도시되어 있다.

도5에는 본 발명에 유용한 발현 벡터 pHENIS 및 pAB1의 개략도가 도시되어 있다.

본 발명자들은 면역원성 복합체를 형성시키지 않으면서, 도1에 도시된 바와 같이 링커에 의해 표적 세포-특이적 리간드와 유전자 작제물-특이적 리간드가 서로 연결될수 있다는 것을 발견했다. 또한, 특히, 도1c, 도2 및 도3에 도시된 연결체를 사용함으로써, 종래 당업계의 한계인 면역원성, 저조한 특이성 및 형질도입된 세포의 효율성을 극복하기 위한, 리간드 시스템을 작제할 수 있다.

본원에서 사용된 표적 세포-특이적 리간드(TS 리간드)는 표적 세포의 표면상의 결정인자에 결합하는 분자, 즉 표적 세포-특이적 리간드의 상대를, 예를 들면 수용체 또는 흡착 분자에 결합시키는 분자이다.

링커는, 가장 간단한 경우, 표적 세포-특이적 리간드를 유전자 작제물과 연결시키고, 유익하게도 융합성, 즉 세포 막 및/또는 리소좀 막을 통한, 즉 리소좀으로 부터 세포질로의 신규 리간드 시스템의 침투를 허용하는 성질을 갖는다.

유전자 작제물-특이적 리간드(GS 리간드)는 항체 또는 이의 일부를 유전자 작제물에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시키는 분자이다.

본 발명의 적합한 태양에서, TS 리간드 및 GS 리간드는 연결체에 의해 연결된다. 또한, 상기 리간드중 하나 또는 둘다는 별도의 링커를 함유한다. 연결체를 이용하는 태양은 사용된 특이적 GS 리간드 및 TS 리간드에 따라 상이한 형태일 것으로 추측된다(예: 1×링커, 2×TS 리간드, 1×GS 리간드 또는 1×링커, 1×TS 리간드, 2×GS 리간드).

TS 리간드, 링커, GS 리간드사이의 결합은 공유 결합[참조 문헌: Sedlacek et al. Contrib. to Oncol. 32, 42-49 and 81-85, Karger Verlag Munich (1988)] 또는 상이한 전하에 의한 비공유 결합(이온 결합)에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 또한 리간드 시스템은, 이미 EP-A1-0 464 533에 기술된 바와 같이, 재조합 기술을 사용하여 융합 단백질로서 제조될 수 있다.

본 발명의 리간드 시스템에 의해 표적 세포에 도입될 수 있는 핵산 서열은 나상 RNA 또는 DNA, 비-바이러스 담체 또는 바이러스 담체와 혼합된 나상 RNA 또는 나상 DNA일 수 있다. 사용중에 본 발명의 리간드 시스템을 유전자 작제물과 혼합하여 생성된 복합체를 형질도입될 세포에 가하거나, 상기 복합체를 환자에 투여할 수 있다.

본 발명에 유용한 표적 세포-특이적 리간드, 유전자 작제물-특이적 리간드, 링커 및 연결체의 예가 본 발명자에 의해 제시된 몇가지 가능한 조합체를 설명하기 위하여 본원에 기재되어 있다.

TS 리간드

본 발명에서, TS 리간드는 표적 세포상의 수용체에 결합하는 활성 화합물, 활성 화합물의 일부 또는 활성 화합물의 동족체이다. 내생 물질, 내생 물질의 일부, 내생 물질의 하나 이상의 에프토프를 모사하는 기타 물질이 유익한데, 이는 이들이 대부분의 외래 물질에 비해 체내로 도입되었을 때 면역원성이 낮기 때문이다.

이러한 활성 화합물의 예에는 VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFβ, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, 뉴로트로핀, BMF, 봄베신, M-CSF, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, SCF, SDGF, 온코스타틴, PDEGF 및 엔도텔린1과 같은 성장 인자; IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 및 IL-15와 같은 사이토킨; 인터페론 α, β 및 γ; 종양 괴사 인자 TNFα 및 TNFβ; RANTES, MCAF, MIP-1α, MIP-1β, NAP 및 β-트롬보글로불린과 같은 케모킨; SRH, SIH, STH, MRH, MSH, PRH, PIH, 프로락틴, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH, FSH, TRH, TSH, CRH, ACTH와 같은 펩티드 호르몬; 안기오텐신, 키닌, 또는 히스타민 또는 이의 상동체 또는 동족체; 에스트로겐, 게스타겐, 안드로겐, 글루코코르티코이드 또는 미네랄로코르티코이드, 또는 이의 상동체 또는 동족체; 및 폴산과 같은 바이타민이 있다.

본 발명에서, TS 리간드는 또한 흡착 분자, 흡착 분자의 일부 또는 흡착 분자의 동족체일 수 있으며 이는 세포 막에 존재하는 상응하는 흡착 분자에 또는 흡착 분자에 특이적으로 결합하는 표적 세포의 또 다른 구조물에 결합한다.

TS 리간드와 같이 기능을 발휘할 수 있는 상기 흡착 분자의 예에는 루이스 X(GMP-140의 경우), S-루이스 X(ELAM-1의 경우), LFA-1(ICAM-1 및 ICAM-2의 경우), MAC-1(ICAM-1의 경우), VLA-4(VCAM-1의 경우), PECAM(PECAM의 경우), 비트로넥틴(비트로넥틴 수용체의 경우), GMP-140(루이스 X의 경우), S-루이스 X(ELAM-1의 경우), ICAM-1, ICAM-2(LFA-1, MAC-1의 경우), VCAM-1(또는 VLA-4), 프브로넥틴(VLA-4), 라미닌(VLA-6의 경우), 프브로넥틴, 라미닌(VLA-1, VLA-2, VLA-3의 경우), 프브로넥틴(VLA-4의 경우), 프브리노겐(GPⅡb-Ⅲa의 경우), B7(CD28의 경우), CD28(B7의 경우), CD40(CD40L의 경우) 및 CD40L(CD40의 경우)이 있다.

본 발명에서, TS 리간드는 또한 Fc 수용체의 세포외 부분일수 있으며[참조 문헌: Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)], 표적 세포에 특이적인 항체가 Fc부분에 의해 Fc 수용체의 세포외 부분에 결합된다.

본 발명에서, TS 리간드는 또한 VDL 수용체 또는 LDL 수용체[예: LDL 수용체, LDL-관련 수용체 단백질, IgG의 FC-수용체(예: Fcγ RⅡ-B2, Fcγ RⅠ); 88 kDa 당단백질 수용체, 아세틸화 LDL 수용체, 산화 LDL 수용체 또는 메갈린]에 대한 리간드일 수 있다. 상기 성질의 리간드는 이미 문헌에 상세히 기술되어 있는데, 이의 예에는 카복시 말단부를 함유하는 아폴리포프로테인 B-100 또는 이의 단편, 아폴리포프로테인 E, tPA/PAI-1복합체와 같은 프로테아제/억제제 복합체, 2-마크로글로불린, 트롬보스폰딘 또는 이의 헤파린-결합 아미노 말단 도메인(예: 아미노산 1-214), 산화 LDL, 아세틸화 LDL 또는 아세토아세틸화 LDL, 아세틸화 리신, 데시알릴화 LDL, 말론디알데히드-결합된 LDL, 포름알데히드-처리된 또는 글루타르알데히드-처리된 알부민, 말레이화 알부민, 39 kDa 수용체-관련 단백질 또는 이의 단편(예: 아미노산 18 내지 112, 113 내지 218 및 219 내지 323 또는 아미노산 1 내지 114 및 114 내지 319을 함유하는 단편), 락토페린, 아프로티닌, 지방단백질 리파제, 아밀로이드 전구체 단백질(프로테아제 넥신 2) 및 슈도모나스 외독소가 있다.

본 발명에서, TS 리간드는 또한 항체 분자 또는 항체 분자의 에피토프-결합 부분일 수 있다.

사용한다면, 쥐 모노클로날 항체를 사람화된 형태로 사용하여 이의 면역원성을 제한하는 것이 바람직하다. 사람화는 문헌[참조: Winter et al., Nature 349, 293 (1991) and Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)]에 기술된 방법에 따라 수행된다. 항체 단편은, 예를 들면 문헌[참조: Winter et al., Nature 349, 293 (1991), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379(1991) or Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195(1993)]에 기술된 방법에 따라 제조된다.

재조합 항체 단편은 현존 하이브리도마로 부터 직접 제조될 수 있거나, 파지-디스플레이 기술을 사용하여 쥐 또는 사람 항체 단편의 라이브러리로 부터 분리할 수 있다[참조 문헌: Smith, Science 228, 1315 (1985), Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433(1994)]. 이 후, 이들 항체 단편은 추가적 조작(예: 다른 단백질과의 융합)을 위한 유전공학적 수준에서 직접적으로 사용된다.

하이브리도마로 부터 재조합 항체 단편을 제조하기 위한, 항체의 항원-결합 도메인(VH, VL)을 암호화하는 유전 정보를 mRNA의 분리, cDNA으로 부터 RNA의 역전사, 및 폴리머라제 연쇄 반응[참조 문헌: Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)] 및 가변성 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드[참조 문헌: Orlandi et al., PNAS-USA 86, 3833 (1989)]을 사용하는 후속적인 증폭에 의해 수득한다. 이 후, VH 및 VL 단편을, 예를 들면 Fv 단편(Skerra Pluckthun, Science 240, 1038 (1998)), 단일-쇄 Fv 단편(sc-Fc)(Bird et al., Science 242, 423 (1988), Huston et al., PNAS-USA 85, 5879(1988) 또는 Fab 단편(Better et al., Science 240, 1041(1988))의 형태로 박테리아 발현 벡터내에 클로닝시킨다.

또한, 신규 항체 단편을 파지-디스플레이 기술을 사용하여 쥐 또는 사람 기원의 항체 라이브러리(쥐 라이브러리, 미처리 라이브러리)로 부터 직접 분리할 수 있다. 항체 단편의 파지 디스플레이에서, 항원-결합 도메인을 섬유상 박테리아파지의 g3P 코트 단백질과의 융합 단백질로서 파지 게놈(McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) 또는 파지미드 벡터(Breitling et al., Gene 104, 147 (1991)내에 scFv 단편(McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) 또는 Fab 단편(Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19, 4113 (1991), Barbas et al., PNAS-USA 88. 7978 (1991))의 형태로 클로닝시킨다. 항원-결합 파지는 항원-충전된 플라스틱 용기(패닝)상(Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)), 항원-결합된 상자성 비드상(Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992))에서 또는 세포 표면에의 결합(Marks et al., Bio/Technol, 11, 1145 (1993))에 의해 선택된다.

면역 라이브러리를 면역화된 동물의 B 림파구(Sastry et al., PNAS-USA 86, 5728 (1989), Ward et al., Nature 341, 544 (1989), Clackson et al., Nature 352, 624 (1991)) 또는 환자의 B 림파구(Mullinax et al., PNAS-USA 87, 8095 (1990), Barbas et al., PNAS-USA 88, 7978 (1991))로 부터의 가변성 항체 단편을 PCR 증폭시켜 제조한다. 이 경우에, 쥐 면역글로불린 유전자(Orlandi et al., PNAS-USA 86, 3833 (1989), Sastry et al., PNAS-USA 86, 5728 (1989) 또는 사람 면역글로불린 유전자(Larrick et al., BBRC 160, 1250 (1989))에 특이적인 또는 사람 면역글로불린 유전자 패밀리(Marks et al., Eur. J. Immunol, 21 985 (1991))에 특이적인 올리고뉴클레오티드의 조합물을 사용한다.

고유 유전자 라이브러리를 면역글로불린 유전자의 공급원으로서 비-면역화된 공여자를 사용하여 제조할 수 있다. 또 다른 방법으로, 면역글로불린 생식세포계 유전자를, 축퇴성 프라미머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨 가변성 단편의 상보성-결정 영역 3과 함께, 사용하여 반-합성적 항체 레퍼토리를 제조할 수 있다[참조 문헌: Hoogenboom Winter, J. Mol. 227, 381 (1992), Barbas et al., PNAS-USA 89. 4457(1992), Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994), Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245 (1994)]. 수 많은 항원에 대해 항체 단편이 하나의 단일 라이브러리로 부터 분리될 수 있는, 소위 단일-폿트 라이브러리는 면역 라이브러리에 비해 이점을 갖는다[참조 문헌: Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994)].

항체 단편의 친화성은 파지-디스플레이 기술을 사용함으로써 더욱 증가될 수 있고, 신규 라이브러리가 임의의 돌연변이유발(Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992), Gram et al., PNAS-USA 89, 3576 (1992)), 코돈-기초한 돌연변이유발(Glaser et al., J. Immunol. 149, 3903 (1992)) 또는 부위-지정된 돌연변이유발(Balint Larrick, Gene 137, 109 (1993))에 의해, 미처리 레퍼토리로 부터의 단편(Marks et al., Bio/Technol. 10, 779(1992))을 사용하거나 박테리아 돌연변이유발 균주(Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359 (1996))를 사용하는 개개의 도메인의 쇄-서플링(shuffling)에 의해 이미 현존하는 항체 단편으로 부터 제조되고, 엄격한 조건하에서 재선택에 의해 분리(Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992))된 개선된 특성을 갖는 항체 단편으로 부터 제조된다. 또한, 쥐 항체 단편은 가변성 도메인중의 하나를 사람 레퍼토리로 단계적으로 대체하고, 이어서 본래의 항원을 선별(지침된 선별)함으로써 사람화될 수 있다[참조 문헌: Jespers et al., Bio/Technol. 12, 889 (1994)]. 또 다른 방법으로, 쥐 항체는 사람 항체의 고가변성 영역을 고유 쥐 항체의 상응하는 영역으로 특이적으로 대체함르로써 사람화될 수 있다[참조 문헌: Jones et al., Nature 321, 522 (1987)].

본 발명에서, TS 리간드는 또한 바이러스의 외포(enverope) 단백질 또는 외포 단백질의 일부일 수 있느데, 바이러스는 이들 외포 단백질에 의해 선택된 세포에 특이적으로 결합한다. TS 리간드의 선택은 유전자 작제물로 형질도입될 표적 세포에 의존적이다.

본 발명에 유용한 리간드의 예에는 내피세포, 대식세포 및 림프구를 활성화하는 물질; 근육세포, 조혈세포, 활액세포 및 염증성 세포에 결합하는 물질: 바이러스에 감염된 세포에 결합하는 물질; 간 세포와 같은 조직 세포에 결합하는 물질; 신경교 세포에 결합하는 물질; 백혈병 세포에 결합하는 물질이 포함된다. 이들 리간드중 대표적인 일부 리간드를 본원에 요약해 두었다.

활성화된 내피세포에 대한 TS 리간드

본 발명의 경우에, 이들 리간드에는, 예를 들면 문헌[Burrows et al., Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al., Cancer Res. 49, 6214 (1989) and Maruyama et al., PANS-USA 87, 5744 (1990)]에 기술된 바와 같이, 내피세포의 막 구조에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 특히, 이들 리간드에는 VEGF 수용체에 대한 항체가 포함된다.

또한, TS 리간드에는 내피세포상의 막 구조 또는 막 수용체에 결합하는 모든 활성 화합물이 포함된다. 예를 들면, 이들 리간드에는 말단에 만노즈를 함유하는 물질, 및 내피세포에 의해 발현된 수용체에 결합하는 IL-1 또는 성장인자(예:PDGF, bFGF, VEGF 또는 TGFβ), 또는 이들의 단편이나 이의 일부 서열이 포함된다[참조 문헌: Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)].

또한 TS 리간드에는 LDL 수용체, 예를 들면 아세틸화 LDL 수용체, 산화 LDL 수용체, LDL-관련 수용체 단백질(LRP), 88 kDa 당단백질 수용체 및 IgG에 대한 Fc 수용체에 대한 리간드가 포함된다. 상기 성질의 리간드는 이미 문헌에 기술되어 있다.

또한 TS 리간드에는 활성화된 및/또는 증식하는 내피세포에 결합하는 흡착 분자가 포함된다. Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 또는 비트로넥틴과 같은 상기 성질의 흡착 분자는 이미 문헌에 기술되어 있다. 본 발명의 경우에, TS 리간드에는, 특히, 내피세포에 대한 친화성을 갖는 바이러스 코트 당단백질이 포함된다. 이들 바이러스의 예에는 필로바이러스, 예를 들면 GP(당단백질) 및 sGP(제2 당단백질) 코트 단백질를 갖는 마르부르그(Marburg) 바이러스 또는 각 경우에 GP 및 sGP 코트 단백질을 갖는 에볼라(Ebola) 바이러스, 특히 gB 단백질을 갖는 사이토메갈로바이러스, 단순포진 바이러스 제I형, HIV-1 바이러스, 마진 바이러스, 한탄(Hantaan) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스와 같은 알파바이러스, 유행성 출혈 발열 바이러스, 폴리오 바이러스, 및 ECHO 9, ECHO 12 또는 콕삭키(Coxsackie) B3과 같은 엔테로바이러스가 포함된다.

활성화된 대식세포 및/또는 활성화된 림프구에 대한 TS 리간드

본 발명에서, 리간드는 면역 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질에는 면역 세포의 막 구조물에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이 포함된다[참조 문헌: Powelson et al., Biotech. Adv. 11, 725 (1993)].

또한 TS 리간드에는 상기한 바와 같이 LDL 수용체에 대한 모든 리간드가 포함된다. 또한 TS 리간드에는 항원-결합 가변부에 의해 면역세포상의 Fc-γ 또는 Fc-ε 또는 Fc-μ 수용체에 결합하는 모노클로날 또는 폴리크로날 항체 또는 항체 단편이 포함된다[참조 문헌: Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)].

또한 이들 리간드에는 사람 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린의 Fc 단편이 포함된다. 상기 성질의 Fc 단편은, 예를 들면 재조합 DNA를 사용하는 유전공학적 조작에 의해, 또는 문헌[참조: Haupt et al., Klin. Wschr. 47, 270 (1969), Kranz et al., Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979); Fehr et al., Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974), Menninger et al., Immunochem. 13, 633 (1976)]의 방법에 따라 제조된다.

TS 리간드에는 또한 면역 세포의 표면상의 막 수용체에 결합하는 모든 물질이 포함된다. 이들 리간드에는 면역 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하는, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF 및 M-CSF와 같은 사이토킨, 및 EGF, TGF, FGF, IGF 또는 PDGF와 같은 성장인자, 또는 이들의 단편 또는 이의 일부 서열이 포함된다.

TS 리간드에는 또한 세포 막 구조물, 예를 들면 지라, 간, 폐 및 기타 조직의 대식세포상의 만노즈 6-포스페이트 수용체에 결합하는, 흡착 분자 및 기타 리간드가 포함된다. 이들 리간드 및 막 구조물의 선택이 문헌[참조 문헌: Perles et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)]에서 검토되었다.

본 발명에서, TS 리간드에는 또한 림프구 및/또는 대식세포에 대한 친화성을 갖는, 바이러스 기원의 외포 당단백질이 포함된다. 대식세포를 감염시키는 바이러스의 예에는 HIV-1(특히, gp120의 V3 영역에, 대식세포에의 결합을 증가시키는 돌연변이를 갖는 주), HIV-2, 한타(Hanta) 바이러스, 예를 들면 푼말라(Punmala) 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 호흡 신시튬 바이러스, 단순포진 바이러스 및 필로바이러스가 있다.

림프구를 감염시키는 바이러스의 예에는 대상포진 수두 바이러스(VZV); 포진 바이러스 6(HHV-6); 광견병 바이러스; HIV-1; HTLV-Ⅱ; HTLV-Ⅰ; C형 인플엔자 바이러스(C형 인플엔자 바이러스는, 혈구응집소-에스테라제 융합(HEF) 단백질에 의해, B림프구상에 우세적으로 발생하는 N-아세틸-β-아세틸네우라민산(Neu 5.9 Ac) 및 T림프구상에 다소 감소된 수준으로 발생하는 또는 전혀 발생하지 않는 N-아세틸-β-아세틸네우라민산(Neu 5.9 Ac)에 결합하기 때문); HEF 아미노산 서열의 284번 위치를 암호화하는 뉴클레오티드 872번 위치에 돌연변이를 갖는, 예를 들면 트레오닌이 이소루이신으로 치환된 C형 인플엔자 바이러스(상기 돌연변이를 갖는 HEF 표면 단백질은 야생형 바이러스 보다도 N-아세틸-9-O-아세틸네우라민산 수용체에 대해 현저히 강한 친화성을 갖기 때문); N-아세틸-9-O-아세틸네우라민산에의 결합을 위한 구조를 포함하는 C형 인플엔자 바이러스 절단 산물(상기 결합 구조는 촉매성 3셋트, 즉 세린 71, 히스티딘 368 또는 369 및 아스파라긴산 261로 정의되기 때문); 엡스타인-바르(Epstin-Barr) 바이러스(EBV는 B 세포를 감염시키기 때문); 단순포진 바이러스 제2형(HSV-2는 T-세포를 감염시키기 때문); 및 마진 바이러스가 있다.

근육세포에 대한 리간드

근육세포 표면에 결합하는 리간드에는, 예를 들면 근육세포, 특히 평활근 세포의 막 구조물에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 이러한 성질의 항체의 예에는 항체 10F3; 액틴에 대한 항체; 안기오텐신 Ⅱ 수용체에 대한 항체; 성장 인자에 대한 항체; EGF 수용체, PDGF 수용체 또는 FGF 수용체에 대해 지시된 항체; 엔도텔린 A 수용체에 대한 항체가 있다.

TS 리간드에는 또한 근육세포상의 막 구조물 또는 막 수용체에 결합하는 모든 활성 물질이 포함된다. 이들 리간드에는, 예를 들면 평활근 세포에 의해 발현된 수용체에 결합하는 성장 인자(예: PDGF, EGF, TGFβ, TGFα, FGF 및 엔도텔린 A) 또는 이의 단편이나 이의 일부 서열이 포함된다.

본 발명에서, TS 리간드에는 또한 근육세포에 대해 친화성을 갖는 바이러스 기원의 외포 당단백질이 포함된다. 이들 바이러스에는, 예를 들면 사이토메갈로바이러스가 포함된다.

조혈세포에 대한 TS 리간드

TS 리간드에는 비교적 미분화된 혈액세포상에 발현되는 수용체에 대해 지시되는 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 상기 성질의 항체는, 예를 들면 하기 수용체에 대해 기술되어 있다; 간(stem) 세포 인자 수용체, IL-1 수용체(제Ⅰ형), IL-1 수용체(제Ⅱ형), IL-3 수용체 α, IL-3 수용체 β, IL-6 수용체 및 GM-CSF 수용체.

TS 리간드에는 또한 불변 도메인에 의해 면역세포상의 Fc-γ 수용체에 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이 포함된다. TS 리간드에는 또한 비교적 미분화된 혈액세포의 표면상의 막 구조물 또는 막 수용체에 결합하는 모든 물질이 포함된다. 이들 리간드에는, 예를 들면 혈액세포에 의해 발현된 수용체에 결합하는, SCF, IL-1, IL-3, IL-6 및 GM-CSF와 같은 성장 인자, 또는 이의 단편이나 이의 일부 서열이 포함된다.

활액 세포 및 염증 세포에 대한 리간드

이들 리간드에는 가변 도메인에 의해 활액 세포 또는 염증 세포의 막 구조물에 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 이러한 막 구조물의 예에는 비멘틴, 피브로넥틴 및 Fc 수용체가 있다.

이들 리간드에는 또한 불변 도메인에 의해 Fc 수용체에 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 이들 리간드에는 또한 활액 세포상의 막 구조물 또는 막 수용체에 결합하는 모든 활성 물질이 포함된다. 이들에는, 예를 들면 활액 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하는, 사이토킨 또는 성장 인자(예: IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10 및 TGFβ), 또는 이의 단편이나 이의 일부 서열이 포함된다. 이들 리간드에는 또한 대식세포상의 만노즈 6-포스페이트 수용체에 결합하는, 말단 만노즈를 필수 성분으로 하는 TS 리간드가 포함된다.

바이러스에 감염된 세포에 대한 TS 리간드

TS 리간드는 바이러스에 감염된 세포의 세포 막상에 발현된 바이러스 항원에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 상기 성질의 항체는, 예를 들면 HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV 및 HTLV 바이러스에 의해 감염된 세포에 대해 기술되어 있다.

간(liver) 세포 및 기타 조직 세포에 대한 리간드

TS 리간드에는 간세포의 표면상의 막 구조물 또는 막 수용체에 결합하는 모든 물질이 포함된다. 이들 리간드에는, 예를 들면 상기 성질의 세포에 의해 발현된 수용체에 결합하는, 사이토킨, EGF, TGF, FGF 또는 PDGF와 같은 성장 인자, 또는 이의 단편이나 이의 일부 서열이 포함된다. 이들 리간드에는 또한 특정 조직에 선택적인 세포 막 구조물에 결합하는 TS 리간드가 포함된다. 이의 예는 표1에 기재되어 있다.

막 구조물	TS 리간드	조직 세포
아시알로글리코프로테인 수용체	아시알로오로소뮤코이드네오글리코프로테인갈락토즈	간 세포
트랜스페린 수용체	트랜스페린	간 및 기타 조직 세포
인슐린 수용체	인슐린	간 및 기타 조직 세포
만노즈 6-포스페이트 수용체	만노즈	지라, 간, 페 및 기타 조직내의 대식세포
Fc-γ 수용체	면역글로불린 G	망내계 및 기타 조직

이들 리간드 및 막 구조물은 문헌[Perles et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)]에서 검토되었다.

본 발명에서, TS 리간드에는, 특히, 선택적 세포에 대해 친화성을 갖는, 바이러스 기원의 외포 당단백질, 예를 들면 기관지 상피 세포에 대한 호흡 신시튬 바이러스 기원의 당단백질, 및 간 세포에 대한 C형 간염 바이러스, 필로바이러스, B형 간염 바이러스 및 D형 간염 바이러스 기원의 당단백질이 포함된다. 예를 들면, 간 세포는 아시알로글리코프로테인 수용체에 의해 마르부르그 바이러스에 결합하거나 간 세포는 아시알로글리코프로테인 수용체에 의해 HBV의 preS2 및 preS2 도메인에 우세적으로 결합한다. HBV는 피브로넥틴에 의해 결합되기 때문에, 또 다른 예로 간 동양구조 세포에 대한 B형 간염 바이러스 기원의 당단백질을 들 수 있다.

신경교 세포에 대한 TS 리간드

이들 리간드에는 신경교 세포의 막 구조물에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이 포함된다[참조 문헌: Mirsky et al., Coakham et al. and McKeever et al]. 이들 막 구조물에는 또한 N-CAM과 같은 신경조직 흡착 분자, 특히 이의 폴리펩티드 C쇄가 포함된다.

이들 리간드에는 또한 신경교 세포상의 막 구조물 또는 막 수용체에 결합하는 모든 활성 화합물이 포함된다. 예를 들면, 이들 리간드에는 말단부에 만노즈를 수반하고 만노즈 6-포스페이트 수용체에 결합하는 물질, 관련 막 수용체에 결합하는, 인슐린과 인슐린-유사 성장 인자 및 PDGF, 및 이들 성장 인자의 단편이 포함된다.

본 발명에서, TS 리간드에는, 특히, 신경교 세포에 대해 친화성을 갖는 바이러스 기원의 외포 당단백질이 포함된다. 이들 바이러스의 예에는 HIV-1 아형 JRF 1 및 단순포진 바이러스 제Ⅰ형이 있다.

백혈병 세포에 대한 TS 리간드

이들 리간드에는 백혈병 세포상의 막 구조물에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 이러한 성질의 수 많은 모노클로날 항체가 이미 진단 및 치료 방법을 위해 기술되어있다[참조 문헌: Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therpia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk, Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr., Opin. Oncol, 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest, 9, 69 (1991)]. 하기 모노클로날 항체, 또는 이의 항원-결합 항체 단편은, 백혈병 유형에 따라, 리간드로서 사용하기에 적합하다: (1) AML 세포의 경우, 막 항원 CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, 시알로실-Le; (2) B-CLL의 경우, 막 항원 CD5, CD1c, CD23, 막 면역글로불린의 유전형 및 동기준형; (3) T-CLL의 경우, 막 항원 CD33, M38, IL-2 수용체, T 세포 수용체; (4) ALL의 경우, CALLA, CD19, 비-호지킨 임파종.

TS 리간드에는 또한 백혈병 세포의 막 구조물 또는 막 수용체에 결합하는 모든 활성 화합물이 포함된다. 이들 리간드에는, 예를 들면 백혈병 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하는, 성장 인자, 또는 이의 단편이나 이의 일부 서열이 포함된다.

이러한 성질의 성장 인자는 이미 문헌[Cross et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); and Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)]. 이의 예는 다음과 같다: 비-호지킨 임파종의 경우에 IFNα; 특히 T 세포 백혈병의 경우에 IL-2; T 세포성, 단구성, 골수성, 적혈구성 및 거핵아구성 백혈병의 경우에 FGF; 백혈병의 경우에 TGFβ; 및 급성 전골수성 백혈병의 경우에 레티노이드, 예를 들면 레티노산.

종양 세포에 대한 TS 리간드

이들 리간드에는 종양 세포상의 막 구조물에 대해 지시된 항체 또는 항체의 단편이 포함된다. 이러한 성질의 항체는 문헌[Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich(1988) and Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992)]에서 검토 되었다.

기타 예에는 시알릴 루이스, T 세포에 의해 인식되는 종양 세포상의 펩티드, 온코진에 의해 발현되는 단백질, GD3, GD2, GM2, 9-O-아세틸 GD3 및 푸코실(Fucosyl) GM1과 같은 간글리오사이드, 혈액 그룹 항원과 이의 전구체, 다형성 상피 무친상의 항원 및 열 충격 단백질상의 항원에 대한 항체가 있다.

링커

TS 리간드와 GS 리간드의 화학적 성질 및 TS 리간드와 GS 리간드를 링커로 서로 연결시키는데 사용된 방법에 따라 링커를 선택한다. 리간드가 펩티드 또는 단백질인 경우, 펩티드 또는 단백질이 링커로서 사용되는 것이 바람직하고 당해 링커는 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 TS 리간드와 GS 리간드에 연결된다. 이러한 성질의 TS 리간드-링커-GS 리간드 또는 TS 리간드-GS 리간드-링커 분자는 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 사용하여 융합 단백질로서 제조된다. 일반적으로, 유익한 링커는 내생적으로 발생하는 물질이거나 내생 물질과 유사하여 면역원성을 제한할 것이다.

TS 리간드가 펩티드 또는 단백질이 아닌 경우, 가장 간단한 형태의 링커는 TS 리간드를 GS 리간드에 연결시키는 구조이다. 이러한 성질의 구조는 분자를 단백질중의 아미노 그룹, 하이드록실 그룹, SH-그룹, 카복실 그룹 또는 알데히드 그룹에 결합시키는데 사용되는 상이한 화학적 결합 방법에 의해 생성된다[당해 방법의 검토를 위한 참조 문헌: Sedlack et al., Contrib. to Oncol. 32, 42-49 and 81-85, Karger Verlag, Munich (1988)]

상기 링커 및 GS 리간드는 또한 각각 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 이 경우에, 둘사이의 연결은 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 이루어지고 화학적 결합 방법중의 하나를 사용하여 링커에 연결된다. 이는, 특히, 본 발명의 태양 c)의 경우에 적용된다.

또한 GS 리간드에 의해 결합되는 유전자 작제물의 성질에 따라 링커를 선택한다. 유전자 작제물이 단독의 나상 RNA 또는 나상 DNA인 경우 또는 이와 비-바이러스 담체와의 복합체인 경우, 링커는 바람직하게는 융합성을 갖는 분자이다. 이러한 융합성은 유전자 작제물의 세포 막을 통한 이동 및 리소좀에서 세포질로의 이동을 용이하게 한다.

유전자 작제물이 바이러스인 경우, 융합성을 갖는 분자가 링커로서 선택된다. 본 발명에서, 융합성을 갖는 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 링커의 융합성은, 바이러스에 결합된 GS 리간드로 인한, 바이러스 코트 단백질의 융합성의 손상을 보완하거나, 바이러스의 코트 단백질의 융합성을 증가시킬 것이다.

본 발명에서, 바이러스 또는 박테리아 펩티드 또는 단백질은 물론 합성 펩티드(예를 들면, 엔도솜의 산성 환경하에서 α-나선형을 형성하는 것)이 융합성을 갖는 링커로서 사용된다. 융합성을 갖는 분자의 예는 다음과 같다: 슈도모나스 외독소 A의 전위 도메인(도메인Ⅲ)을 함유하는 펩티드[참조 문헌: Wels et al., Cancer Res. 52, 6310 (1992); Fominaga et al., J. Biol. Chem. 271, 10560 (1996)], 펩티드 GLFEALLELLESLWELLLEA(서열 1)을 포함하는 펩티드[참조 문헌: Gottschalk et al., Gene Ther. 3, 448 (1996)], 펩티드 AALAEA[LAEA]₄LAAAAGC(서열 2)를 포함하는 펩티드[참조 문헌: Wang et al., Technol. Adances in Vector Syst. For Gene Ther., May 6-7, 1996, Coronado, IBC Conference], 마진 바이러스 융합 단백질의 펩티드 FAGVVLAGAALGVAAAAQI(서열 3)을 포함하는 펩티드[참조 문헌: Yeagle et al., Biochem. Biophys. Acta 1065, 49 (1991)], 인플엔자 A HA2 단백질의 펩티드 GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG(서열 4)을 포함하는 펩티드[참조 문헌: Luneberg et al., J. Biol. Chem. 270, 27606 (1995)], 펩티드 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(서열 5)을 포함하는 펩티드[참조 문헌: Burger et al., Biochem. 30, 11173 (1991)], 펩티드 GLFGAIAGFIE(서열 6), ALFGAIAGFIE(서열 7), LFLGAIAGFIE(서열 8), LLLGAIAGFIE(서열 9), LILGAIAGFIE(서열 10), GIFGAIAGFIE(서열 11), GLLGAIAGFIE(서열 12), GLFAAIAGFIE(서열 13), GLFEAIAGFIE(서열 14), GLFGAMAGFIE(서열 15), GLFGAIAGLIE(서열 16), 또는 펩티드 GLFGAIAGFIV(서열 17)[참조 문헌: Steinhauer et al., J. Viol. 69. 6643 (1995)], 펩티드 GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG(서열 18), 또는 펩티드 GLLEALAELLEGGWEGLLEG(서열 19)[참조 문헌: Ishiguro et al., Biochem. 32 9792 (1993)].

본 발명에서, 또한 융합성을 갖는, 바이러스 기원의 단백질이 사용된다. 수 많은 바이러스가 융합성 코트 단백질을 합유하며, 이의 예에는 파라믹소바이러스(paramyxoviruses), 레트로바이러스, 포진 바이러스가 있다[참조 문헌: Gaudin et al., J. Gen. Virol. 76, 1541 (1995)]. 수 많은 바이러스는 또한 바이러스 흡착 및 후속적인 세포 막 융합 모두에 관여하는 당단백질을 함유한다.[참조 문헌: Gaudin et al., J. Gen. Virol. 76, 1541 (1995)]. 이러한 성질의 단백질은, 예를 들면 알파바이러스, 라브도바이러스(rhabdoviruses) 및 오르토믹소바이러스(orthomyxoviruses)에 의해 형성된다.

본 발명에서의 바이러스 융합성 단백질은 문헌[Hughson, Curr. Biol. 5, 265 (1995); Hoekstra, J. Bioenergetic Biomembranes 22, 675 (1990); White, Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990)]에서 검토 되었다. 본 발명에서의 융합성 단백질의 예는 다음과 같다: A형 인플엔자 또는 B형 인플엔자 바이러스의 혈구응집소, 특히 HA2 성분; 단독으로 또는 인플엔자 혈구응집소와 배합[참조 문헌: Ohuchi et al., J. Virol. 68, 920 (1994)]되거나 효소 활성은 결핍되었지만 혈구응집은 일으킬 수 있는 A형 인플엔자 네우라미니다제(인플엔자 바이러스 혈구응집소의 펩티드 동족체)의 돌연변이와 배합되어 사용되는 A형 인플엔자 바이러스의 M2 단백질; C형 인플엔자 바이러스의 HEF 단백질(HEF 단백질의 융합 활성은 HEF0를 HEF1 및 HEF2 서브유니트로 절단함으로써 활성화된다); 필로바이러스, 예를 들면 마르부르그 바이러스 및 에볼라 바이러스의 경막 당단백질; 광견병 바이러스의 경막 당단백질; 소포성 구내염 바이러스의 경막 당단백질(G); HIV 바이러스의 융합 단백질, 특히 이의 gp41 성분 및 융합성 성분; 센다이(Sendai) 바이러스의 융합 단백질, 특히 F1 성분의 33 개의 아미노 말단의 아미노산; 셈리키 포레스트 바이러스의 경막 당단백질, 특히 E1 성분; 참진드기유래 뇌염 바이러스의 경막 당단백질; 사람 호흡계 신시튬 바이러스(RSV)의 융합 단백질(특히 gp37 성분); B형 간염 바이러스의 융합 단백질(S 단백질); 마진 바이러스의 융합 단백질; 뉴우캣슬병 바이러스의 융합 단백질; 비스나(visna) 바이러스의 융합 단백질; 쥐 백혈병 바이러스의 융합 단백질(특히 p15E), HTL 바이러스의 융합 단백질(특히 gp21) 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)의 융합 단백질.

바이러스 융합성 단백질은 세정제(예: β-D-옥틸글루코피라노사이드)를 사용하여 바이러스 농화물로 부터 코트 단백질을 용해시키고 원심분리[참조 문헌: Mannio et al., BioTechnique 6, 682 (1988)]로 또는 당업자에게 공지된 분자 생물학적 방법으로 이들을 분리한다. 융합성 단백질의 제조 예는, 예를 들면 인플엔자 혈구응집소, 인플엔자 혈구응집소의 융합성 단편, B형 인플엔자의 M2 단백질, C형 인플엔자의 HEF 단백질, 필로바이러스(예: 마르부르그 바이러스 및 에볼라 바이러스)의 경막 당단백질, 광견병 바이러스의 경막 당단백질, 소포성 구내염 바이러스의 경막 당단백질, 셈리키 포레스트 바이러스의 경막 당단백질, 참진드기유래 뇌염 바이러스의 경막 당단백질 및 HIV-1 바이러스의 경막 당단백질에 대해 기술되어 있다.

유전자 작제물-특이적 리간드

본 발명에서, GS 리간드는 직접적으로 또는 간접적으로 유전자 작제물에 결합하고 전체 항체 분자 또는 항체의 에피토프-결합 단편을 함유하는 구조이다. 쥐 모노클로날 항체는 이의 면역원성을 제한하기 위하여 사람화된 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 사람화는 이미 문헌[ Description of the TS ligand, Winter et al., Nature 349, 293 (1991) and Hoogenenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 항체 단편 및 재조합 Fv 단편을 당업계의 기술에 따라 문헌[Description of the TS ligand]에 기술된 바와 같이 제조한다.

이가 또는 일가 단편이 사용되는지의 여부는 항체 특이성 및 유전자 작제물의 선텍에 의존적이다. 선택된 항체가 바이러스 유전자 작제물의 코트 단백질의 융합 활성을 손상시키는 경우, 일가 항체 단편이 바람직하다[참조 문헌: Ubol et al., J. Virol. 69 1990 (1995)].

항체의 특이성은 사용된 유전자 작제물의 성질에 의존적이다. 유전자 작제물이 단독의 나상 RNA 또는 나상 DNA, 또는 이와 비-바이러스 담체의 복합체인 경우, 본 발명의 신규 태양중의 하나는 항체의 특이성이 DNA에 도입된 에피토프에 대해 지시된다는 것이다.

이러한 성질의 에피토프는 외래 그룹(이종 물질)을 도입시키거나 도입시키지 않으면서, DNA를 하나 이상 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 이의 예에는 시스플라틴에 의한 DNA의 가교화, 질소 머스터드, 멜파란 또는 클로르암부실과 같은 알킬화제에 의한 구아닌의 N⁷의 알킬화, DNA 이중 나선에의 독소루비신 또는 다우노마이신과 같은 안트라사이클린의 개재화가 포함된다.

변형된 DNA 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 예에는 메틸화된 DNA, O⁶-에틸데옥시구아닌(에틸니트로소우레아에 의한 DNA의 처리 후), N⁷-에틸구아닌, N⁵-메틸-N⁵-포밀-2,5,6-트리아미노-4-하이드록시피리미딘, O⁶-메틸-2'-데옥시구아노신, O⁶-에틸-2'-데옥시구아노신, O⁶-n-부틸-2'-데옥시구아노신, O⁶-이소프로필-2'-데옥시구아노신, O⁴-메틸-2'-데옥시티미딘, O⁴-에틸-2'-데옥시티미딘, 멜파란과 DNA의 첨가 산물 및 안트라사이클린이 있다. 이중에서 일부 유용한 에피토프는 DNA 대사중에 DNA의 메틸화에 의해 DNA에 생긴 것이다.

이.콜라이 균주는 박테리아에 도입된 플라스미드를 메틸화시키는 것으로 알려졌다. 메틸레이션은 아데닌의 N⁶-위치에서 일어난다[참조 문헌: Wnnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)]. 박테리아는 복제중에 N⁶-위치의 아데닌을 특이적으로 메틸화시키는 효소 DNA 아데닌 메틸라제를 보유한다[참조 문헌: Hattman et al., J. Mol. Biol. 126, 367 (1978)]. 결과적으로, 본 발명은 신규한 리간드 시스템에서, 특히 메틸화된 DNA에 대한, 더욱 특히 N⁶이 메틸화된 아데닌에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.

유전자 작제물이 비-바이러스 담체와 복합체를 형성하는 경우, 본 발명의 또 다른 특정 태양은 항체의 특이성이 담체상의 에피토프에 대해 지시되는 것이다. 이들 담체에는 양이온 폴리머, 펩티드, 단백질, 폴리아민 또는 양이온 지질 및 인지질과 같은 양이온 지질이 포함된다. 이러한 성질의 담체에 대한 항체의 예에는 스페르미딘, 스페르민, 푸트레스신, 폴리리신, 알부민 및 인지질이 있다.

유전자 작제물이 바이러스인 경우, 항체의 특이성은 바이러스 코트 단백질의 하나 이상의 동일하거나 상이한 에피토프에 대해 지시된다. 사용된 리간드 시스템의 링커는 바람직하게는 융합성 펩티드 또는 단백질이기 때문에, 코트 단백질에의 결합에 의한 바이러스의 세포 흡착 및/또는 융합성 활성이 손상된 항체가 사용될 수 있다.

벡터로서 사용될 수 있는 바이러스의 코트 단백질에 항체의 예에는 쥐 백혈병 바이러스, 특히 코트 단백질 gp70 및 p15, HIV 바이러스, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스, 특히 당해 바이러스의 당단백질 B, 당단백질 H, 당단백질 L 및 당단백질 D, 사이토메갈로바이러스, 특히 당단백질 B(gpB), 마우스의 미세 바이러스, 선관련 바이러스, 특히 cap 및 rep 단백질, 신비스(Sindbis) 바이러스, 특히 외포 단백질 E2 또는 E, 왁지니아 바이러스에 대한 항체가 있다.

본 발명의 또 다른 유익한 태양의 경우, GS 리간드는 세포의 외부에 있는 Fc 수용체의 일부이다. 항원-결합부에 의해 직접 또는 간접적으로 유전자 작제물에 결합하는, 앞서 언급한 항체중의 하나는 Fc 부분에 의해 상기 Fc 수용체에 결합한다.

또다른 유익한 태양에서, GS 리간드는 양이온 아미노산, 양이온 펩티드 또는 단백질 또는 생원성 아민과 같은 양이온 구조 단위가 있으며, 이는 유전자 작제물과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 양이온 구조 단위의 예에는 리신, 폴리리신, 아르기닌, 폴리아르기닌, 히스티딘, 폴리히스티딘, 하나 이상의 1 리신, 1 아르기닌 및/또는 1 히스티딘을 함유하는 펩티드, 및 카다베린, 스페르미딘, 스페르민, 아그마틴 또는 푸트레신과 같은 폴리아민이 포함된다.

또 다른 유익한 태양에서, GS 리간드는 전이 유전자를 보유하는 바이러스의 코트 단백질에 대한 수용체이다. 이러한 성질의 수용체는, 예를 들면 하기 바이러스에 관하여 기술되어 있다: HIV의 경우 CD4 분자(가용성 또는 고유), 및 갈락토실세르아미드, HBV의 경우 IL-6 수용체 및 안넥신 또는 아폴리포프로테인, HTLV의 경우 IL-2 수용체(β 및 γ 쇄), 마진 바이러스의 경우 CD46 분자, 푸렌드(Friend) 백혈병 바이러스의 경우 에리트로포이에틴 수용체, 바리셀라 조스터(varicella Zoster)의 경우 사람 면역글로불린 G의 Fc 단편, 센다이 바이러스의 경우 당단백질, C형 인플엔자 바이러스의 경우 N-아세틸-9-아세트아미노-9-데옥시네우르아민산 및 9-O-아세틸-N-아세틸네우르아민산, 발 및 입 질환 바이러스의 경우 인테그린 αVβ3, EBV의 경우 캄플리먼트(complement) 수용체 2(CD21) 및 단순포진 바이러스의 경우 275 kDa 만노즈 6-포스페이트 수용체 또는 46 kDa 만노즈 -포스페이트 수용체.

두 개이상의 분자의 복합체(연결체)로서의 링커

본 발명의 특정한 태양 c)에서, 연결체는 2 이상의 분자 또는 성분을 포함하는 특수한 유형의 링커이다. 연결체의 분자 또는 성분중의 일부는 하나 이상의 유전자 작제물-특이적 리간드에 결합하고 연결체의 다른 분자 또는 성분은 하나 이상의 표적 세포-특이적 리간드에 결합한다. 또한 당해 복합체는 유익하게도 하나 이상의 다른 임의적 링커를 포함한다. 임의적 링커는 융합성 펩티드일 수 있다. 링커가 하나 이상인 경우에, 임의적 링커는 화학적으로 동일하거나 상이할 수 있다. 융합성 펩티드는 표적 세포에의 핵산의 출입을 용이하게 한다. 이와 관련하여, 또 다른 임의적 링커는 방사성 동위원소와 같은 시그날-생성 물질일 수 있으므로, 세포에 들어가는 복합체를 정량할 수 있다.

연결체의 유익한 예에는 항체의 경첩부가 있으며, 이에 의해 항체의 중쇄 두 개가 서로 연결된다[참조 문헌: Burbon, TIBS 15, 64, (1990); Oi et al., Nature 307, 136 (1984); Alt et al., Science 238, 1079 (1987); Lorenz, degree dissertation; Konstruktion und Expression von rek. Antikorper-Enzym-Hybridmolekulen fur die Tumortherapie[Construction and expression of rec. antibody/enzyme hybrid molecules for tumor therapy], Faculty of Human Medicine, Marburg University (1991)].

경첩부의 신규한 배열이 예를 들면 도2의 다이아그램 c1)에 도시되어 았다. 경첩부는 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 링커 및 GS와 TS 리간드에 융합 단백질의 형태로 연결되는데, 이때 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다.

도3의 다이아그램 c2)에 따르면, 연결체의 또 다른 예에는 Gal4의 Gal80-결합 도메인[참조 문헌: Leuther et al., Science 256, 1333 (1992)]과 조합된 Gal80 단백질[참조 문헌: Leuther et al., Science 256, 1333 (1992)]이 있다.

하기 실시예는 설명을 위하여 제시된 것이지 제한하기 위한 것은 아니며, 도4에 도시된 바와 같은 다관능성 시스템의 구성을 나타낸다.

실시예 1

TS 리간드의 제조

항-NCAM 모노클로날 항체 575/100/2의 하이브리도마를 TS 리간드의 출발 물질로서 사용한다[참조 문헌: Jaques et al., Cancer 72, 418 (1993)]. 상기 하이브리도마의 약 10⁷세포를 원심분리로 분리하고, 파마시아(Pharmacia) mRNA 추출 키트를 사용하여 상기 세포로 부터 mRNA를 추출한다. 이어서, cDNA 합성 키트 및 임의의 헥사올리고뉴클레오티드(파마시아 제품)를 사용하여 상기 RNA를 cDNA로 역전사한다. 상기 cDNA는 면역글로불린의 가변성 중쇄 또는 가변성 경쇄를 특이적 프라이머[참조 문헌: Clackson et al., Nature 352, 624 (1991)]를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응[참조 문헌: Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)]으로 증폭시키기 위한 출발 물질로서 작용한다. 동시에, 프라이머를, 상기 단편을 박테리아 발현 벡터 pHENIS(pHEN1으로 부터 유래됨; 도5참조)[참조 문헌: Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19, 4133 (1991)]에 클로닝시키기 위한 제한효소 절단 부위에 도입한다. 상기 벡터는 외형질 분비를 위한 pelB 시그날 서열, 모노클로날 항체 9E10으로 검출하기 위한 myc 태그, 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 정제하기 위한 히스티딘 태그는 물론, 중쇄 및 경쇄를 클로닝하기 위한 영역 및 14 개 아미노산 길이의 글리신-세린 링커를 암호화하는 짧은 서열를 포함한다. 또한, 박테리오파지의 표면상에 표시할 목적으로 g3β 단백질과의 융합을 수행한다. 중쇄 및 경쇄를 적당한 제한효소로 절단(SfiI 및 ShoI으로 VH를 절단하고; ApaLI 및 NotI으로 VL를 절단)하고 차례로 벡터내에 클로닝한다. 이 결과 짧은 펩티드 서열에 의해 공유결합된 가변성 중쇄와 경쇄를 포함하는 재조합 단일-쇄 Fv 단편이 수득된다.

실시예 2

GS 리간드의 제조

N⁶-메틸아데닌(Sigma 제품)에 대해 특이성을 갖는 재조합 항체를, 상기한 바와 같이, N⁶-메틸아데닌-BSA 또는 N⁶-메틸아데닌-티로글로불린 콘주게이트[참조 문헌: Beiser et al., Methods Enzymol. XII, 889 (1968)]상에 바이오패닝(biopanning)하여 고유 또는 반합성적 항체 라이브러리[참조 문헌: Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994)]로 부터 선별한다. 양성 항체 단편을 항원-코트된 미량역가 플레이트에서 ELISA로 동정한다. 이들 라이브러리로 부터의 항체는 이미 목적하는 단일-쇄 Fv 포맷내에 존재하므로 이는 후속적인 클로닝에 직접적으로 사용될 수 있다.

실시예 3

링커의 제조

아미노산 서열 GLFEALLELLESLWELLLEA(서열 1, Gottschalk et al., 1996)를 갖는 융합성 펩티드를 링커로서 사용한다. 상기 펩티드를 암호화하는 DNA는 적당한 제한효소 절단 부위(AscI 및 XbaI)가 말단에 결합된 이중쇄 합성 올리고뉴클레오티드로서 제조된다. 이를 위하여, 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드 O1(5'GGCCGCAGGCTTATTTGAGGCCCTTCTGGAATTGCTAGAGAGCCTCTGGGAATTGCTTCTGGAGGCAT, 서열 20) 및 O2(5'CTAGATGCCTCCAGAAGCAATTCCCAGAGGCTCTCTAGCAATTCCAGAAGGGCCTCAAATAAGCCTG, 서열 21)를 제조자의 설명서에 따라 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco 제품)를 사용하여 포스포릴화시키고, 80℃로 5분간 가열하고나서 실온으로 서서히 냉각시킨다. 상기 이중쇄 DNA 단편은 후속적 클로닝에 직접 사용된다.

실시예 4

다관능성 리간드의 제조

완전한 리간드 시스템을 발현 벡터 pAB1(이는 pHENIS와 유사하게 작제되지만 g3p와의 융합은 포함하지 않는다)에서 3-단편 클로닝의 형태로 제조한다. 제한효소 SfiI 및NotI로 절단한 항-NCAM 단일쇄 Fv 단편(TS 리간드), 클로닝 부위 NotI 및 XbaI를 함유하는 링커, 및 항-N⁶-메틸아데닌 단일쇄 Fv 단편(GS 리간드)를 출발 물질로서 사용한다. 클로닝을 위해, N-말단 및 C-말단에 각각 제한효소 절단 부위 XbaI 및 AscI를 삽입한 프라이머를 사용하여, GS 단편을 재증폭한다. 이들 단편를 제한효소 SfiI 및 AscI로 절단한 pAB1 벡터에 클로닝한다. 상기 작제물을 박테리아 균주 TG1에 형질전환시킨다. 상기 리간드 시스템의 발현을 박테리아 lacZ 프로모터로 조절하고 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)를 가하여 유도한다[참조 문헌: McCafferty et al., Appl. Biochem. Biotech. 47, 157 (1994)]. 상기 발현 단백질을 문헌[Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245 (1994)]의 방법에 따라 IMAC로 외형질 제조물로 부터 정제한다. 전체 단백질은 약 55,000달톤의 분자량을 갖고 단량체로서 존재한다.

실시예 5

다관능성 리간드의 작동 시험

NCAM-발현 종양 세포(소 세포 기관지 암종)을 당업자에게 공지된 세포 배양 기술을 사용하여, 세포 배양액에서 증식시키고 분리한다. 아데닌의 N⁶이 메틸화된 DNA를 이.콜라이에서 플라스미드(이는 β-글루쿠로니다제의 구조 유전자를 함유한다; 특허 출원 제WO/96/06940 참조)를 증식시켜 제조한다.

상기 다관능성 리간드 시스템을 20:1의 몰비로 플라스미드 DNA와 혼합하고 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한다. 플라스미드에 대한 결합을 ELISA로 점검한다. 다괸능성 리간드와 플라스미드를 포함하는 복합체를 10:1의 비로 종양 세포와 혼합하고 전체를 37℃에서 1 시간 동안 배앵한다. 종양 세포의 일부를 세척한다. 이들 종양 세포에 대한 복합체의 결합을 면역형광성으로 점검한다. 잔존 종양 세포를 24 시간 동안 추가로 배양한다. 성공적인, 상기 세포로의 당해 복합체의 흡입, 엔도솜으로 부터의 링커-매개된 방출, 및 효과인자 유전자의 전사 및 발현을 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-글루크로니드를 사용하여 배지에서 β-글루쿠로나다제의 효소 활성을 검출하여 측정한다.

본 발명은 면역원성이 아닌 다관능성 리간드 시스템에 관한 것으로서 뉴클레오티드 서열의 세포-특이적 전이를 개선시킬 수 있다.

Claims (26)

1. 하나 이상의 표적 세포-특이적 리간드, 항체 또는 항체 일부를 포함하는 하나 이상의 유전자 작제물-특이적 리간드, 및 두 개의 리간드를 연결하는 링커를 포함하고, 면역원성이 아닌, 뉴클레오티드 서열의 표적 세포-특이적 전이를 위한 다관능성 리간드 시스템
2. 제1항에 있어서, 두 개의 리간드를 서로 연결하고, 두 개의 링커를 포함하는 연결체를 추가로 포함하는 리간드 시스템.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 세포 특이적 리간드가 표적 세포의 표면에 결합하는 리간드 시스템.
4. 제1항 내지 제3항중의 어느한 항에 있어서, 표적 세포-특이적 리간드가 성장 인자, 사이토킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 케모킨, 펩티드 호르몬, 안기오텐신, 키닌, 히스타민, 스테로이드 호르몬, 흡착 분자, VDL 수용체 리간드, LDL 수용체 리간드, 산화된 LDL 수용체 리간드 , LDL-관련 수용체 단백질 리간드, IgG Fc 수용체 리간드, 88kDa 당단백질 수용체 리간드, 아세틸화된 LDL 수용체 리간드, 메갈린 리간드 및 비타민으로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 리간드 시스템.
5. 제1항 내지 제3항중의 어느한 항에 있어서, 표적 세포-특이적 리간드가 표적 세포에 결합하는 항체 또는 항체 단편인 리간드 시스템.
6. 제5항에 있어서, 항체 단편이 F(ab)₂단편, Fab 단편, 이중쇄 Fv 단편, 단일쇄 Fv 단편 및 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로 선택되는 리간드 시스템.
7. 제1항 내지 제3항중의 어느한 항에 있어서, 표적 세포-특이적 리간드가 항체 Fc 단편에 의해 인식되는 Fc 수용체의 세포외-영역인 리간드 시스템.
8. 제5항 내지 제7항중의 어느한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 적어도 부분적으로 사람 기원인 리간드 시스템.
9. 제1항 내지 제8항중의 어느한 항에 있어서, 유전자 작제물-특이적 리간드가 항체, 항체 단편, 양이온 구조 단위, 및 바이러스 코트(coat) 단백질의 수용체로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 리간드 시스템.
10. 제9항에 있어서, 항체 단편이 F(ab)₂단편, Fab 단편, 이중쇄 Fv 단편 및 단일쇄 Fv 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 리간드 시스템.
11. 제1항 내지 제8항중의 어느한 항에 있어서, 유전자 작제물-특이적 리간드가 항체 Fc 단편에 의해 인식되는 Fc 수용체의 세포외-영역인 리간드 시스템.
12. 제1항 내지 제11항중의 어느한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 적어도 부분적으로 사람 기원인 리간드 시스템.
13. 제1항 내지 제12항중의 어느한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이, 핵산에 이종 물질을 결합시키거나 핵산을 메틸화시키거나 핵산을 알킬화시킴으로써 도입된 핵산의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드 시스템.
14. 제1항 내지 제13항중의 어느한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 비-바이러스 담체상의 에피토프에 결합하는 리간드 시스템.
15. 제14항에 있어서, 비-바이러스 담체가 양이온 폴리머, 펩티드, 단백질, 생원성 아민, 폴리아민, 지질 및 인지질로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 리간드 시스템.
16. 제1항 내지 제15항중의 어느한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 바이러스 코트 단백질의 에피토프에 결합하는 리간드 시스템.
17. 제16항에 있어서, 바이러스가 쥐 백혈병 바이러스, HIV, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 마우스의 미세(minute) 바이러스, 선(adeno)관련 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스 및 왁지니아 바이러스로 이루어진 그룹으로 선택되는 리간드 시스템.
18. 제9항에 있어서, 양이온 구조 단위가, 단독으로 또는 배합되어, 하나 이상의 리신 잔기, 하나 이상의 아르기닌 잔기, 하나 이상의 히스티딘 잔기 및 하나 이상의 폴리아민 잔기를 포함하는 리간드 시스템.
19. 제2항 내지 제18항중의 어느한 항에 있어서, 연결체가, 아미노 잔기, 하이드록실 잔기, SH 잔기, 카복실 잔기 및 알데히드 잔기로 이루어진 그룹중의 관능성 잔기에 공유 결합된 잔기를 포함하는 리간드 시스템.
20. 제2항 내지 제19항중의 어느한 항에 있어서, 하나 이상의 링커가 융합성 물질인 리간드 시스템.
21. 제20항에 있어서, 융합성 물질이 합성 융합성 펩티드, 박테리아 융합성 펩티드 또는 단백질, 및 펩티드 또는 단백질과 바이러스간의 융합 산물로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 리간드 시스템.
22. 제2항 내지 제21항중의 어느한 항에 있어서, 연결체가 항체의 경첩부 또는 Gal14 단백질과 조합된 Gal80 단백질을 포함하는 리간드 시스템.
23. 제1항에 있어서, (a) Fv 단편의 가변성 중쇄 및 경쇄가 짧은 펩티드 서열에 의해 공유결합된, 항-NCAM 재조합 단일-쇄 Fv 단편을 포함하는 표적 세포-특이적 리간드;

    (b) 서열 GLFEALLELLESLWELLLEA(서열 1)을 갖는 융합성 펩티드를 포함하는 링커; 및

    (c) N⁶-메틸아데닌에 대한 재조합 항체를 포함하는 유전자 작제물-특이적 리간드를 포함하는 리간드 시스템.
24. 제23항에 있어서, 유전자 작제물을 추가로 포함하는 리간드 시스템.
25. 제24항에 있어서, 유전자 작제물이 나상 RNA; 플라스미드; 양이온 폴리머, 펩티드, 단백질 또는 지질과 조합된 나상 핵산 또는 플리스미드; 및 바이러스로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 리간드 시스템.
26. 피부 질환, 점막 질환, 신경계 질환, 내부 기관 질환, 혈액 응고 질환, 조혈계 질환, 면역계 질환, 근조직 질환 및 재돌기 조직 또는 관절 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 제1항 내지 제25항중의 어느한 항에 따른 리간드 시스템의 용도.