JP3733329B2 - 分子性物質のためのモジュール式輸送系ならびにその製造方法および使用方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、分子性物質のための個別に組換えによって製造される部分ユニット（単独構築用ブロック）からモザイク様に形成された輸送系に関し、さらには、モジュール式輸送系の製造方法およびその使用方法に関する。
【０００２】
（発明の分野および現行技術）
医学の遺伝子治療は、一連の重病を永久的かつ穏やかに治療することを可能にするとともに、一般的な意見によれば、たとえば化学療法などの従来の医学的方法の重要な代替となるものである。一般的な手順は、大抵は核酸を主成分とする治療上有効な物質を、身体細胞内の標的に向けて挿入することに基づいている。遺伝子治療処置の目的は、先天的な遺伝子欠損の治療（古典的遺伝子治療）、感染症の治療（たとえばＥＢＶ感染、ＨＩＶ感染）、または腫瘍の治療である。こうした前提のもと、重病を治療するための様々な概念が、遺伝子治療処置として蓄積されてきた。
【０００３】
古典的遺伝子治療は、遺伝子の（先天性）欠損とこれに関連する病気に対処するものであり、殆どの場合は唯一の原因（通常は機能不全タンパク質）に対して施すことができる。これらの単因性疾病のいくつかの例として、ＡＤＡ欠損症、血友病、デュシェンヌ筋ジストロフィー、および嚢胞性線維症が挙げられ、これらの疾病に対する遺伝子治療法が１９９０年頃から研究されてきた。その目的は、体細胞に適当な遺伝材料を特異的に挿入して、欠損タンパク質を置換または補填することである。これに対し、感染症の遺伝子治療は、関連する病原体を除去することによりウイルスまたは細菌感染症の治療を試みるものであり、ウイルスに冒された細胞は、通常は新しい感染性ウイルスが成熟する前に処理または失活される。現在の研究努力の主たる標的は、ＨＩＶ感染症である。これに対し、腫瘍疾病の遺伝子治療は、腫瘍細胞への毒性物質の輸送、あるいは悪性細胞を選択的に除去するための類似性原理（アポトーシス、免疫刺激）の適用を意図している。
【０００４】
基本的に、遺伝子治療においては現行技術によって以下の２つの方法的に異なるアプローチが検討されている。（ｉ）単離細胞を、遺伝子材料、大抵は細胞型非特異的レトロウイルスにより、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で形質転換し、その後、形質転換細胞をドナーの体内に再移植する。（ｉｉ）標的細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて特異的ベクターに感染させる。この場合は、特に複製欠損レトロウイルスまたはアデノウイルス、もしくはアデノ関連ウイルスが使用される。しかしながら、縮合ＤＮＡ、ウイルス様粒子などを使用した物理的な系も存在する。
【０００５】
挿入された遺伝子材料（主にＤＮＡ）は、染色体に組み込んでもよいし（たとえば先天性、単因性疾病の治療のための永久発現）、あるいは、一時的に発現させてもよい。たとえば感染症治療または腫瘍治療にはこの一時的な発現で十分である。上記の場合において、ＤＮＡの代わりにアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを挿入してもよく、あるいは、ペプチドやタンパク質のような治療物質を使用してもよい。
【０００６】
遺伝子治療が当初から実験的には成功を遂げているにもかかわらず、現在の技術ではいくつかの問題が知られている。たとえば、複製能のあるレトロウイルスをベクターとして用いると、動物モデルにおいて重篤な疾病がもたらされる（Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４、１〜２頁、１９９３年；Ｏｔｔｏ，Ｊｏｎｅｓ−Ｔｒｏｗｅｒ，Ｖａｎｉｎ，Ｓｔａｍｂａｕｇｈ，Ｍｕｅ１１ｅｒ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ＆ＭｃＧａｒｒｉｔｙ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５、５６７〜５７５頁、１９９４年）。ｉｎ ｖｉｖｏ法では細胞の形質転換の効率が低い場合が多く、ベクターとしてレトロウイルスを用いた細胞ターゲティングでは、通常は特異性が得られない。ＧＭＰ条件に従う作製に関してこの系は煩雑であり、パッケージング細胞系列の助けを借りたウイルスベクターの作製では調製物の分析が煩雑になる。以下に記載する現行技術の上記および他の欠点は、分子性物質のための輸送伝達体としての新しいモジュール式ベクター系によって本発明に従って回避されるであろう。
【０００７】
殆ど全ての周知のウイルスおよびファージは、少なくとも１個または数個のタンパク質から構成されるキャプシドを有しており、このキャプシドによってウイルスのゲノムが包装されている。キャプシドは、特定のウイルスまたはファージに対して特徴的な所定の形態を示す。正二十面体または繊維状のキャプシドが構築されることが特に多い。表１は、公知のウイルスの形態の総覧である。ウイルスのゲノムや細胞性因子が存在しない状態でも、これらのキャプシドが単離ウイルスタンパク質からｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されうるという多数の例が知られている。この結果として得られる中空または中実のタンパク質外被から成る構造は、ウイルス様またはウイルス類似粒子と呼ばれる。
【０００８】
【表１】

【０００９】
上記のようなウイルス様粒子を輸送伝達体として用いる場合、使用するコートタンパク質は適切な発現系において産生されなければならない。特に、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞などの真核系、あるいは、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核系が用いられる。真核発現系を用いた場合、完全なウイルス様粒子が細胞内に形成され、さらに、たとえば、ポリオーマウイルスコートタンパク質ＶＰ１とＶＰ２などの異なるウイルスタンパク質から構築されるウイルスエンベロープを産生することができる（Ａｎ，Ｇｉｌｌｏｃｋ，Ｓｗｅａｔ，Ｒｅｅｖｅｓ＆Ｃｏｎｓｉｇｌｉ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８０、１００９〜１０１６頁、１９９９年）。これらの方法の欠点は、何よりも、ウイルスキャプシドの作製が煩雑でコストが高くつくことにある。大腸菌内でウイルスコートタンパク質が発現している間、細胞内では完全なウイルスキャプシドは構築されず、その代わりにキャプソメアが産生される。このキャプソメアは細胞から単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス様粒子に集合させなければならない。しかしながら、大量のコートタンパク質が得られるようにするために、各コートタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ集合に対する適当なプロトコールを見つける必要がある。さらに、上記の方法を用いた場合、異なるウイルスコートタンパク質からウイルスキャプシドを構築できる可能性があり、これはそれぞれのウイルスにおいて自然に起こることであり、一例として、単純ヘルペスウイルスキャプシドは、ＶＰ５，ＶＰ１９ＣおよびＶＰ２３から構築されうる（Ｃｈｅｎｇ，Ｓｔｅｖｅｎ，Ｂｏｏｙ＆Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、４２３９〜４２５０頁，１９９９年）。しかしながら、異なる修飾部分ユニットからウイルスキャプシドを構築する可能性については、現行技術では記載されていない。
【００１０】
ポリオーマウイルスのＶＰ１タンパク質は、適切な溶媒条件下において自発的にウイルス様シェルへと集合し、この野生型タンパク質の性質は現行技術によってすでに知られている。このプロセスは、ウイルス様粒子の外被内にキャプシド被包された分子（たとえば治療剤）を標的に輸送するのための分子輸送伝達体を製造するために用いることができる。ポリオーマＶＰ１タンパク質は、重要な構造の研究以外にも、その分子生物学的および病理学的特徴について非常によく研究されている。公表されている研究には、タンパク質の構造および集合だけでなく、生産、精製およびキャラクタリゼーションが含まれる（Ｒａｙｍｅｎｔ，Ｂａｋｅｒ＆Ｃａｓｐａｒ，Ｎａｔｕｒｅ、２９５，１１０〜１１５頁、１９８２年；Ｇａｒｃｅａ＆Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、３６１３〜３６１７頁，１９８３年；Ｓｌｉｌａｔｙ＆Ａｐｏｓｈｉａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２０、７２５〜７２７頁、１９８３年；Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｇａｒｃｅａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６０、１２８０３〜１２８０９頁、１９８５年；Ｍｏｒｅ１ａｎｄ，Ｍｏｎｔｒｏｓｓ＆Ｇａｒｃｅａ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、１１６８〜１１７６頁、１９９１年；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｇｒｉｆｒｌｔｈ，Ｒａｙｍｅｎｔ，Ｍｕｒａｋａｍｉ＆Ｃａｓｐｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５５、６５２〜６５４頁、１９９２年）。特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの集合については、現行技術によって詳細に記載されている（Ｓｌｉｌａｔｙ，Ｂｅｒｎｓ＆Ａｐｏｓｈｉａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、６５７１〜６５７５頁、１９８２年；Ｓａｌｕｎｋｅ，Ｃａｓｐａｒ＆Ｇａｒｃｅａ、Ｃｅｌｌ、６０４、８９５〜９０４頁、１９８６年；Ｇａｒｃｅａ，Ｓａｌｕｎｋｅ＆Ｃａｓｐａｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８６〜８７頁、１９８７年；Ｓａｌｕｎｋｅ，Ｃａｓｐａｒ＆Ｇａｒｃｅａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、５６、８８７〜９００頁、１９８９年）。このようにして構築される、天然に存在するタンパク質のサブユニットから成る伝達体の潜在的用途としては、主に遺伝子導入に対するものが記載されている（Ｆｏｒｓｔｏｖａ，Ｋｒａｕｚｅｗｉｃｚ，Ｓａｎｄｉｇ，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐａｌｋｏｖａ，Ｓｔｒａｕｓｓ，＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６、２９７〜３０６頁、１９９５年）。ＷＯ９７／４３４３１には、ウイルスに由来する少なくとも１つのキャプソメアから成り、分子性物質がキャプソメアに結合できるようにその一方が修飾されている分子性物質輸送用の伝達体が記載されている。
【００１１】
部分ユニットの修飾は該部分ユニットの集合能力の損失を招くことが多いため、ポリオーマウイルスキャプシドをｉｎ ｖｉｔｒｏでモザイク様式に集合させる方法、あるいは、様々な修飾部分ユニットまたは同様の多修飾部分ユニットから成る他のウイルス類似粒子は、現行技術としてはまだ記載されていない。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、異なる修飾を受けた部分ユニットまたは同様の多修飾部分ユニットによって構成され、上述した現行技術の欠点を有しない分子性物質のための分子輸送系を提供することにある。
【００１３】
上述の目的を達成するために、請求項１の発明により、アミノ酸を主成分とする組換えによって作製される部分ユニットを含む、分子性物質の輸送系が提供される。該輸送系は、
−互いに異なる修飾を受けた少なくとも２個の部分ユニット、
および／または
−２回の異なる修飾を受けた１個または数個の部分ユニット、および
−代わりに、非修飾部分ユニット
を含み、
該部分ユニットは、モザイク様の輸送系を形成することができ、さらに、分子性物質は輸送系内にキャプシド被包されることができる。
【００１４】
輸送系の有利な形態、ならびに輸送系の製造方法および使用方法は、従属請求項および以下の説明に従う。
【００１５】
（説明）
細胞に核酸を移入するために天然のウイルスまたはウイルス類似系を使用すること（遺伝子治療）は、分子医学分野における重要な研究領域である。ここで、特に課題となるのは、現行技術に従って、遺伝子治療処置に関する欠点を除去または最小限に抑えたベクター系（輸送系）を製造することである。
【００１６】
本発明においては、異なる単一の成分からｉｎ ｖｉｔｒｏで集合させることのできる分子性物質のための輸送系が記載されている。上記輸送系は、本発明に従うタンパク質から成る分子状成分または部分ユニット（モジュール）を使用することによって達成される。これらの部分ユニットは、本発明によって様々な方法で修飾することができる。すなわち、これらのモジュールから望ましい性質を輸送系に組み込むために、部分ユニットのアミノ酸配列を変更、延長または短縮することができる。モジュールは、特に融合や挿入によって他のタンパク質からの機能的ドメインを含んでいてもよい。単機能性モジュールは、その分子的性質によって直接、あるいはたとえばモジュールが集合能力を持たない場合には、要求される集合能力を示す特別なモジュールをカップリングすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて構成（集合）させることができる。本発明の限界範囲内で、自らの組成に起因する特定機能を有するウイルス様粒子を、モザイク様式に構築することができる。特に有利なのは、輸送系の分子組成を化学量論的に求めることができることである。発現したウイルス様粒子は、核酸、ペプチドあるいはタンパク質などの分子性物質を効率よく真核細胞内部の標的に輸送するために使用することができる。本発明の実施の手順が図１に概略的に示されている。
【００１７】
本発明によれば、輸送系は、表１に示したウイルスおよびファージの修飾部分ユニット、あるいは、プロテオソームやシャペロンなどの内部を有した高分子タンパク質集合体の修飾部分ユニットおよびその代わりに非修飾部分ユニットを含むことができる。本発明に従えば、輸送系は部分ユニットのモノマー、ダイマーまたはオリゴマーを含むことができる。本発明によれば、部分ユニットがポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質に由来するか、あるいは該タンパク質の修飾部分ユニットであるような輸送系が好ましい。さらに、部分ユニットが、特に、好熱性または超好熱性の宿主を起源とし、したがって高温環境下（７０℃以上）であっても安定な構造を形成するファージのファージタンパク質に由来するような輸送系が好ましい。ここでは、古細菌スルフォロブス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ）を感染させるＳＳＶ１粒子（フセロウイルス科）を強調しておく。このファージの代表は、その宿主の特異性により超好熱性であるため、高温下でも安定であるため、バイオテクノロジーおよび薬学の分野において多くの用途に最適に利用することができる。非常に安定なタンパク質外被を開発することができると共に、構築用ブロックを組換えにより容易に製造することができる。同様の好熱性または超好熱性ファージの代表は、たとえば、リポスリクスウイルス科（代表例：ＴＴＶ１，ＴＴＶ２，ＴＴＶ３）から見いだすことができる。上記のようなプロセスに用いることのできる、好熱性および超好熱性の代表であるバチロウイルス科（例：ＴＴＶ４，ＳＩＲＶ）およびグッタウイルス科（例：ＳＮＤＶ）は、（ファージタンパク質から形成された）タンパク質外被の安定性が他のどれよりも顕著であるが、まだこれ以上には分類されていない。
【００１８】
修飾部分ユニットは、本発明によっては、組換えによって作製されることが好ましい。
本発明によれば、輸送系は、互いに異なる修飾を受けた少なくとも２個の部分ユニットを含み、上記「異なる修飾を受けた」という表現は、部分ユニット同士が異なる修飾を有しているか、あるいは、各部分ユニットの異なる位置に同じ修飾を有していることを意味する。
【００１９】
本発明による輸送系は、少なくとも２回の修飾を受けた１個または数個の部分ユニットを含んでいてもよく、異なる２回の修飾を受けた部分ユニットが好ましい。
本発明による輸送系は、さらに非修飾部分ユニットを含んでいてもよい。
【００２０】
本発明によれば、組換えによって作製される部分ユニットは、（単数／複数の）末端の位置および／または部分ユニットの配列内の位置において、点変異を行うか、あるいは、１個または数個のアミノ酸、ペプチド、またはタンパク質配列またはタンパク質ドメインを挿入、除去または変更することにより修飾することができる。
【００２１】
修飾は、たとえば、蛍光染料、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、ペプチドホルモン、脂質、脂肪酸または炭水化物などの標識であってもよい。
【００２２】
部分ユニットは、部分ユニットの分子性物質への結合親和性を高める、たとえばプロリンに富む配列、ＷＷ配列、ＳＨ３ドメイン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または多イオン配列などの修飾を有していてもよい。このような修飾は輸送系の内部に配置されることが好ましい。
【００２３】
さらに、本発明によれば、たとえば、炭水化物構造物、タンパク質またはタンパク質ドメイン、抗体または修飾抗体、抗原、あるいは、リガンドの受容体結合ドメインの単離物、あるいは標的細胞表面上の受容体への結合を媒介する他の物質または配列などにより、所望の標的細胞への取込みを高めることができるような修飾も計画されている
【００２４】
さらに、本発明によれば、部分ユニットは、特定の細胞小器官（たとえば、核、ミトコンドリア、小胞体）への標的細胞の輸送、あるいは標的細胞からの輸送を可能にするような修飾を有していてもよい。標的細胞、細胞小器官への取込みや、標的細胞からの輸送を高める修飾の殆どは、輸送系の外側にあるか、あるいは、輸送すべき分子性物質の成分である。
【００２５】
本発明による輸送系の製造方法は、以下のステップを含んでいる。
−部分ユニットの組換え発現。
−宿主細胞の溶菌による部分ユニットの放出。
−モザイク様の輸送系を構成（集合）させるために、所望の化学量論関係で部分ユニット同士を接触させるステップ。
−分子性物質を輸送系にキャプシド被包するために、上記集合の前または最中に、分子性物質と接触させるステップ。
【００２６】
本発明の説明の出発点は、実験的遺伝子治療の現行の慣習的方法、たとえば、ウイルス、リポソームまたは物理的な系の使用に対する有益な代替となるかどうかである。たとえば複製欠失ウイルスを用いる場合、これらのベクターの生物学的および治療的安全性を保証するために徹底的な検査が必要である。これらの系とは対照的に、本発明に記載されているのは、モザイク様に構成された部分から成るウイルス類似粒子の単純かつ穏和なｉｎ ｖｉｔｒｏ構築を基本とする方法であるため、医療および治療の用途に関して非常に安全な方法である。
【００２７】
従来の殆どのレトロウイルス系と比較した場合の、本発明に記載する人工ウィルベクター系のモジュール式構築の利点を以下にまとめる。
・いくつかの性質によって複合の潜在的に病原性をもつウイルスが低減されるばかりでなく、たとえばタンパク質から構築される人工集合体のみに必要な性質を拡張させるため、人工的な複製欠失ウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス）の構築時に起こるとしてしばしば議論される、ベクターの安全性の問題が回避される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全にキャプシドを合成するため、遺伝子治療適用に対する安全な系に対する最大限の要求を実現することができる。単一の成分は、治療の出発点から完全に切り離され、治療上有効な物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または類似分子）は、分子伝達体の産生に関するいかなる情報も含んでいない。したがって、複製能力のある種の発生を完全に除外することができる。さらに、最終的なベクターは粒子の構築計画に関する遺伝情報を一切含んでおらず、欠点となる組換えによる潜在的危険を完全に問題から外すことができる。
【００２８】
・現行技術に従って個別に高品質に製造できる成分をｉｎ ｖｉｔｒｏで集合させることにより、高い系の純度と均一性が保証される。単離された成分の高特異性のアフィニティ精製ステップ（現行では、たとえば、アフィニティ基質にある自己スプライシングタンパク質によって達成される）を行うことにより、全ての不要な問題成分（混入ＤＮＡ、細菌タンパク質および内毒素）を効率的に除去することができる。
【００２９】
・合成により（組換えにより）作製されたウイルスキャプシドは、特定の変異体の各サブユニット内の唯一のシステイン残基の助けを借りて蛍光標識してもよいし、あるいは、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）または他の位置特定方法に適した分子標識を与えてもよい。これらの標識により、完全な生きている有機体内のベクターだけでなく、（非固定の、すなわち生きている）細胞内のベクターも共焦点蛍光顕微鏡によって（時間分解的に）検出することができる。
【００３０】
・システムの全ての成分を蛍光標識することにより、キャプシドのＦＡＣＳ分析によって、調製物の組成に関する質の調節を行うことができる。ＦＡＣＳ分析においては、単独粒子を統計的に計数することにより、組成を正確に検出することができる。
【００３１】
・原理的には、ベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにも適用可能である。
本発明に従うモジュール式で構築された人工ウイルス類似ベクター系が、同一の成分（たとえば、文献に記載されているウイルス様粒子）から構築された系より勝る点について以下にまとめる。
【００３２】
・遺伝子治療法に最小限必要とされる、以下の１つ１つのステップを切り離すことができる。（ｉ）疾病特異的治療剤の特別なパッケージング、（ｉｉ）細胞特異的ターゲティング（細胞親和性）、（ｉｉｉ）エンドソームからの取込みと放出、（ｉｖ）細胞内の区画特異的転移、および（ｖ）治療用物質の作用の選択的開始。
【００３３】
・伝達体のモジュール式構造は、全ての必要な機能を合成粒子内に選択的に統合することを可能にし、用途の種類に対して必要な機能しか考慮に入れなくてよい。たとえば、疾病特異的治療剤（たとえば、組織特異的プロモータによって治療用遺伝子が発現されるＤＮＡ）の輸送は、細胞型特異的ターゲッティングのためのドメインを必ずしも必要としない。
【００３４】
・正確に投与可能な粒子組成により、様々な要求される機能を正確に必要なだけその投与量の中に組み込むことができる。治療投与量が多い場合における望ましくない副作用を低減または回避することができる。
【００３５】
・異なる治療標的に対して、全く新しい系および製造方法を案出する必要がないが、新しい単独構築用ブロックを導入するか、あるいは、完全な系の中にすでに存在する成分を修飾することが必要である。たとえば腫瘍治療について見た場合、対応する受容体結合ドメインによって特定の型の腫瘍細胞に対して特異的に送達されるように、抗腫瘍剤を腫瘍組織に輸送することができる。受容体結合ドメインを変えることにより、同じ治療剤を別の型の腫瘍細胞に輸送することができる。さらに、天然型の系においては異なる作用をする治療用物質を、たとえば中央ドメインを変えることにより、治療剤の特異的パッケージング（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質）に適用することができる。
【００３６】
・治療手法の潜在的な弱点は、異なる機能性モジュールの比較試験によって容易に同定することができ、その後に除去することができる。また、天然のウイルスにおける基本的な分子生物学的プロセスをより良く理解することができる。
【００３７】
輸送系の単独構築用ブロック（部分ユニット）は、個々に機能的性質を有するように作成することができる。モザイク様構成（集合）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施することができ、構築用ブロックを化学量論的添加と適切な集合条件によって決定することができる。輸送系の構築用ブロックは通常は組換えによって作製される。したがって、生成されたウイルス様エンベロープ構造物（キャプシド）は、それぞれの用途に対して望ましい性質と機能を示すことができる。新しい機能および応用分野が、さらなるモジュールを追加することによって提供または付加され、単独モジュール同士はそれらの機能および分子の性質に関して互いに無関係に作製される。このようにして作製された分子性物質に対する輸送系は、遺伝子治療の分野における用途に特に適しており、たとえばＤＮＡやタンパク質などの物質を真核細胞に特異的に挿入するのにも適している。
【００３８】
本発明の適用形態によれば、ポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質は天然の性質が変更されており、輸送系には現在の現行技術では記載されていない性質が与えられている。ＶＰ１タンパク質は、マウスの腎臓上皮細胞などの細胞の表面上の特異的受容体への結合などの、望ましくない天然の性質が、集合体形成に影響を及ぼさずに除去されるように、変更することができる。一方、真核細胞への包有メカニズムは、特異的な新しい配列、すなわち細胞への取込みを刺激する特定の配列モチーフを導入することにより調節することができる。
【００３９】
上記タンパク質の三次構造は周知である（Ｓｔｅｈｌｅ，Ｙａｍ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ＆Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６９、１６０〜１６３頁、１９９４年）。本発明の範囲において、ドメインの形態の機能的モジュールを、たとえば、受容体特異的ラベル付け（細胞型特異的ターゲティング）のために、タンパク質外側の少なくとも２つのループ区間（アミノ酸位置１４８および２９３）に挿入可能であることが示された（実施例４を参照）。
【００４０】
さらに、サブユニットならびに集合したキャプシドのシステイン組成を変えることにより、ジスルフィド架橋パターンを調節することができることが示された。このようにして、粒子の生物学的安定性を変えることができる。
【００４１】
本発明に従えば、天然に存在する野生型タンパク質が示さない特別の新しい性質を示すＶＰ１タンパク質の変異体が作製される。ここで、修飾ＶＰ１タンパク質の作製および精製が、実施例１に記載の方法によって行えるという特別な利点が証明されている。さらに、変更は遺伝子工学（点変異、実施例２、３および５を参照）によって行うことができ、追加の（機能性）ドメイン、ペプチドまたはタンパク質をＶＰ１タンパク質の末端に固定するか、ＶＰ１タンパク質の配列中に埋め込むことができる（実施例４を参照）。これらの機能性ユニットは、コートタンパク質の性質を、たとえば、特異的受容体ドッキング、標的細胞への効率的取込み、あるいは輸送すべき分子の結合およびパッケージングに関する機能によって拡張することができる。特に、多機能性ウイルス様粒子が形成されるように、異なるコートタンパク質をモザイク様に集合させることにより、単独機能性ユニット同士をエンベロープ内で統合することもできる。ここで、１つのウイルスキャプシドに含まれる各機能性ユニットの最適量は、用途の種類によって設定することができる。このようにして組立てられた人工ウイルス類似粒子は多くの用途に用いることができるが、とりわけ、治療上有効な分子性物質を標的細胞に特異的に導入するために用いることができる。
【００４２】
本発明は、モザイク様式に構築された、治療用物質のためのモジュール式輸送系であって、各用途に対して容易にかつ迅速に適応させることができる系を記載している。本発明の応用分野としては、例えばＡＩＤＳなどの感染症の治療がある。ＡＩＤＳでは、ＣＤ４⁺リンパ球内においてＨＩＶウイルスの複製が起こり、これによって上述の症状が引き起こされる。感染細胞は感染後期の間に該細胞表面上にウイルスタンパク質ｇｐ１２０を提示し、このタンパク質ｇｐ１２０が天然の受容体ＣＤ４に結合し、細胞へのウイルス取込みの手はずを整える。上記のメカニズムは、本発明に記載された輸送系の表面を、ｇｐ１２０への結合に必要な受容体ＣＤ４または単一のＣＤドメインで修飾することにより、細胞特異的ターゲティングのために用いることができる。ＣＤ４とｇｐ１２０の間の相互作用は非常に特異的であり、体の他のいかなる組織でも起こらないため、そのような輸送伝達体は、ＨＩＶにうまく感染したリンパ球としか相互作用しない。すなわち、治療用物質は所望の感染細胞内へしか輸送されない。
【００４３】
ＤＮＡは、細胞内で作用する抗体をコードする治療用物質として用いることができ、この抗体はＨＩＶタンパク質と特異的に結合してその機能を中和する。治療用ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖核酸のいずれの形態で細胞に挿入してもよい。二本鎖ＤＮＡの場合、粒子への包有は、二本鎖ＤＮＡと相互作用する単独の修飾されたモジュールを挿入することによって実現できる。そのようなモジュールは、ＤＮＡと相互作用する粒子の内側に塩基性配列を有していてもよい。さらに、二本鎖ＤＮＡを結合させるためのＤＮＡ挿入物質を連結してもよい。次に、一本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を有するモジュールを用いることによって、粒子内に導入することができる。また、ハイブリダイゼーションによって治療用一本鎖ＤＮＡとのパッケージングをアレンジする配列特異的オリゴヌクレオチドを粒子の内側に連結することも可能である。
【００４４】
ＨＩＶ治療に対するもう一つの出発点は、ＨＩＶ−ＲＮＡに対する特異的認識配列を有するリボザイムのパッケージングであろう。ウイルスＲＮＡは触媒によって分解され、リボザイムの結合によって不活性化される。この場合、リボザイムのパッケージングは、一本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチドで修飾された伝達体によってキャプシド被包するために、ＲＮＡ結合ドメインまたは類似の構築用ブロックを有するモジュールによって実現される。治療は、核酸の代わりにタンパク質またはペプチドを挿入したものによって行うこともできる。挿入されたトランスドミナント（修飾）タンパク質は細胞中の天然型のＨＩＶタンパク質と競争可能であり、それらの機能を阻害する。また、ペプチドまたは合成的に修飾されたペプチドは、特定のＨＩＶタンパク質、たとえばＨＩＶプロテアーゼの作用を阻害することができる。さらに、ウイルスＳＶ４０の大きなＴ抗原の核内移行配列の手助けにより、細胞内のタンパク質を対応するシグナル配列によって、たとえば核内に導くことができる。このことは、たとえばＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質などの核内に局在している因子との相互作用にとって必要であり、該ＨＩＶ−Ｔａｔタンパク質は、とりわけ、細胞核内における転写因子として機能し、ウイルスタンパク質の転写を劇的に増加させる。タンパク質は、結合したタンパク質が伝達体の内部に持ち込まれるように、配列特異的結合ドメインを含むモジュールに結合することによって、輸送伝達体内に包有させることができる。さらに、上述のタンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドを細胞内に放出し、再び感染細胞内で特異的に放出するＨＩＶプロテアーゼまたは細胞プロテアーゼに対する認識配列が間に介在されるように、伝達体構築用ブロックに直接融合させてもよい。
【００４５】
本発明の他の用途は、悪性の疾病による抗腫瘍薬剤としての用途である。したがって、伝達体は腫瘍組織への薬剤の輸送を保証する構築用ブロックを含んでいなければならない。このことは、腫瘍のタイプに応じて、腫瘍細胞上でしか（殆ど）利用できない腫瘍抗原に結合する粒子の表面上に局在する抗体によって実現される。固体の腫瘍は十分な血液供給を必要とするため、腫瘍組織内での新たな血管の形成を開始させる成長因子を分泌する。新たに形成された血管の上皮細胞では、形質膜結合インテグリン受容体の発現量が増大する。これらの受容体は、配列ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を特異的に認識し、ＲＧＤを含むリガンドの受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する。腫瘍組織に治療用物質が包有されるように、ＲＧＤ露出モジュールを輸送伝達体内に組み込むことにより、この性質もまた腫瘍細胞とそれに結合した上皮細胞のターゲティングにも用いることができる。異なる受容体結合特性を組み合わせることにより、組織特異性の向上以外に、幾つかの部位にある腫瘍を攻撃するとともに、薬剤耐性細胞の形成を低減する治療を行うことができる。
【００４６】
一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸も薬剤として使用することができる。これらによってコードされるタンパク質は、たとえば、対応する部位における細胞性シグナル導入カスケードを妨害することにより、細胞内アポトーシスを開始させる。腫瘍特異性を高め、ひいては高い安全性を得るために、腫瘍細胞内において優性に作用する転写用プロモータを用いることもできる。基質メタロプロテアーゼの阻害を誘導するペプチドも同様に用いることができる。特に、特異的な短いペプチド配列によるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の阻害が効果的な作用を示す。
【００４７】
上述の核酸以外では、アポトーシスまたはネクローシスを開始させるタンパク質やペプチドもパッケージングすることができる。これに適したものとしては、細菌毒素（たとえば、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ボツリヌス毒素他）の触媒ドメインが挙げられ、これらは、高い効率で細胞のタンパク質生合成を阻害し、ネクローシスを開始させる。ここでは、細胞を殺すためにわずかの分子しか必要でないことは利点であると言えよう。他の治療の出発点は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを腫瘍細胞に輸送することである。この酵素は、核酸構築用ブロックをリン酸化し、細胞キナーゼに比べて基質特異性が低いため、たとえばガンシクロビルなどの人工ヌクレオチドもリン酸化される。リン酸化されたガンシクロビルは、ＤＮＡ複製の間に新たに合成されるＤＮＡ鎖に組み込まれて複製を停止させ、これにより細胞分裂を阻害する。
【００４８】
基本的に、本明細書中に記載の発明は、ＡＤＡ欠損症、血友病、デュシェンヌ萎縮症、および嚢胞性線維症のような遺伝による遺伝子の欠陥を修正するためにも使用することができる。これらの疾病は単因性であり、１つの単一遺伝子の欠陥に帰着することができる。したがって、症状を相殺または軽減するためには、正しい形の上記遺伝子を挿入するだけで十分である。この用途のためには、安定なエピソームベクターによって、あるいは、治療用ＤＮＡを細胞の染色体に組み込むことによって、安定な遺伝子発現を達成しなければならない。したがって、伝達される核酸は、組込みを容易にする配列を含んでいてもよい。たとえば、染色体組込みに寄与するアデノ関連ウイルス由来のＩＴＲ配列（逆方向末端反復）を末端に有する一本鎖ＤＮＡを用いることができる。また、治療用ＤＮＡまたはＲＮＡ以外にも、ＨＩＶインテグラーゼあるいはアデノ関連ウイルス由来のＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８などいかなる組込み活性を触媒するタンパク質も細胞内に輸送することができる。
【００４９】
修正用遺伝子の発現は、天然のプロモータの制御下で行われることが理想であり、これにより同時に適合された調節も保証される。したがって、多くの場合において、輸送伝達体の細胞型特異的ターゲッティングは必要ない。たとえば、血友病患者は、筋肉組織中の血液凝固カスケードから欠損した因子を産生することができ、これらの因子には、該因子が細胞から分泌されて作用部位、すなわち血流に到達するように、適切なシグナル配列が融合されている。
【００５０】
あらゆる実用的用途において、細胞内における治療用物質の効率的な放出が必要となる。すなわち、物質はエンドソーム膜を上手く通過しなければならない。この機能は、溶血素、特にチオールによって活性化される細胞溶解素、細菌毒素の移行ドメイン、あるいは、例えばアデノウイルスペントンタンパク質などの特定のウイルスタンパク質などによって実現可能である。これらの機能は、本発明に記載のベクター系の一部としてモザイク様に構成された輸送伝達体に包含させることができる。さらに、この機能は、たとえばポリカチオンまたはデンドリマー等の化学物質によっても実現可能である。対応する成分は粒子の表面に配置されるか、あるいは粒子内にキャプシド被包されなければならない。
【００５１】
多くの用途に対しては、治療用物質だけでなく輸送系の免疫原性も最小限に抑える必要があるかもしれない。輸送伝達体自体の体液免疫原性、ならびに、マクロファージによる認識と除去は、本発明によりポリエチレングリコールによるマスキングまたは脂質二重層によるエンベロープによって達成することができる。ポリエチレングリコールは、粒子表面上の特異的ＳＨ基に共有結合するように化学的に修飾することができる。直接挿入されたタンパク質であるか、あるいは治療用核酸が転写および／または翻訳されたタンパク質である治療用物質の免疫原性は、３５〜４０のＧＡ（グリシン−アラニン）反復配列との融合により除去することができる。ＧＡに富む配列は、ヒトのエプスタインバールウイルスのＥＢＮＡ１タンパク質内に天然に存在し、ウイルスタンパク質を細胞プロテアーゼによる分解、およびクラスＩＭＨＣ受容体上での提示から守る。この安全性機能は、モザイク様ベクター系の一部として用いられる様々なタンパク質およびペプチドによって行われうるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ集合が積極的な役割を果たす。
【００５２】
実施例
以下の実施例は本発明の適用を示すものであるが、本発明の保護範囲を限定するものではない。実施例において、以下の図面を参照する。
図１は、可能な集合体の形態を示した本発明の概略図である。少なくとも２回の修飾を受けた同一のサブユニット、または異なる部分ユニット（成分）から成るキャプシドが、モザイク様式で構築される。集合したキャプシドは、予め選択された、たとえば遺伝子の移入に適切と思われる性質を示し得る。
【００５３】
図２は、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの作製の様子を示したものである。（ａ）実施例１に示した条件に従う変異ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの発現と精製。（ｂ）ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ変異型の集合能力を検出するためのゲル濾過。キャプシドは６ｍＬと８ｍＬの間で溶出し、遊離のキャプソメアは９ｍＬと１０ｍＬの間で溶出する。（ｃ）変異ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳのサブユニットのみからなるキャプシドの電子顕微鏡写真。縮尺バーは１００ｎｍ。
【００５４】
図３は、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃのキャプソメアを示す。（ａ）ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃの５量体キャプソメアの三次元構造の上面図（部分図）。各サブユニットのアミノ酸位置２４９が、丸印によって示されている。この保護部位において、キャプソメアの特異的な天然の標識を行うことが可能である。（ｂ）唯一のシステインにおけるＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃタンパク質（左側半分）と、対照ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ（右側半分）の特異的標識。クーマシー染料による染色（下側部分）はタンパク質が存在することを示すが、２４９位にシステインを有する変異型のみがテキサスレッドのような染料によって標識することができる（上側部分）。（ｃ）ＰｙＶＰ１ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ変異型の集合能力を証明するためのゲル濾過、ならびにキャプシドへの染料の組込み。キャプシドは８ｍＬと１０ｍＬの間で溶出し、遊離のキャプソメアは１１ｍＬと１２ｍＬの間で溶出する。（ｄ）変異ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳＴ２４９Ｃの蛍光標識されたサブユニットのみから成るキャプシドの電子顕微鏡写真。縮尺バーは１００ｎｍ。
【００５５】
図４は、細胞溶解物における検出の結果を示す。蛍光標識したＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃとともに１時間インキュベートした後の、真核Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞溶解物のＳＤＳゲル（非染色）である。細胞内に取込まれたキャプシドは、タンパク分解により広範に分解されているが、蛍光染料は明確に観察することができるため、細胞へのキャプシドの取込みが検出可能である。レーン１：テキサスレッドで標識したＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ。レーン２：細胞上の培地（上清）。レーン３：包有された粒子と細胞溶解物。レーン４：ＰＢＳによる洗浄画分（キャプシド含まず）。レーン５〜１０：各レーンはレーン２〜４の同様の平行実験によるものである。
【００５６】
図５は集合の様子を示す。（ａ）ゲル濾過による変異ＰｙＶＰ１−２Ｃの集合の分析。ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ変異型とは対照的に（図２ｂ）、キャプソメアからキャプシドへの集合（６ｍＬと８ｍＬの間の溶出）が完全に起こっている。遊離の５量体（９ｍＬと１０ｍＬの間）はもはや検出されない。（ｂ）完全にＰｙＶＰ１−２Ｃから形成されたキャプシドの電子顕微鏡写真。
【００５７】
図６は、キャプシドの組込みを示す。Ｃａｃｏ−２型の真核細胞において、（ａ）ＲＧＤモチーフなし、（ｂ）ＲＧＤ配列モチーフあり（他の条件は同一）。（ａ）ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ型のキャプシドがテキサスレッドによって標識されており、細胞へのキャプシドの取込みの様子が蛍光顕微鏡によって可視化されている。（ｂ）（ａ）と同一条件下におけるキャプシドの取込みであるが、蛍光標識されたキャプシドは、タイプＰｙＶＰ１−ＲＧＤ１４８のものである。これらのキャプシドは、ＲＧＤモチーフによって細胞内に著しく効率的に取込まれている。
【００５８】
図７は、異なる方法で標識されたＰｙＶＰ１変異型のＦＡＣＳ分析の結果を示す。フロオレセインで標識された種およびテキサスレッドで標識された種から成る、ＰｙＶＰ１ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ由来のキャプシドが形成されている。キャプシド集団は明らかなフルオレセイン蛍光（ａにおけるＭ１）ならびにテキサスレッド蛍光（ｂにおけるＭ２）を示している。フルオレセインの（ＦＬ１）を用いたものをテキサスレッド（ＦＬ３）蛍光と比較すると、いずれの染料も１つの粒子上に局在し（ｃの右側上方四半分）、一方の染料のみを含む粒子は形成されず検出されないことが明らかである。
【００５９】
図８は、集合体の分析を示す。（ａ）集合欠失成分ＰｙＶＰ１−Ｄｅｆのゲル濾過分析。標準的な集合条件下において、キャプシドは全く形成されず、キャプソメアのみが検出されている（９ｍＬと１０ｍＬの間の溶出）。（ｂ）（蛍光標識された）ＰｙＶＰ１−ＤｅｆとＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳとから成る混合集合（化学量論比１：５）されたキャプシドのゲル濾過分析。（ｃ）異なるキャプソメアの化学量論比におけるＰｙＶｐ１−Ｄｅｆのキャプシドへの包有率。
【００６０】
図９には、システインを含まないＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−ＷＷ１５０とシステインを含むＰｙＶＰ１−ｗｔの混合集合の様子が示されている。（ａ）ゲル濾過分析は、変異ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−ＷＷ１５０が約１５％しか集合できないことを示している。キャプシドは６ｍＬと８ｍＬの間で溶出し、遊離のキャプソメアは１１ｍＬと１２ｍＬの間で溶出する。（ｂ）変異ＰｙＶＰ１−ｗｔのキャプソメアは、定量的にキャプシドを形成する。（ｃ）両変異型の等モル混合物を集合させると、定量的に混合されたキャプシドが形成され、遊離のキャプソメアはもはや検出されない。したがって、ＰｙＶＰ１−ｗｔの定量的集合の性質は、混合的に構成される（モザイク様）のウイルスキャプシドに完全に移入することができる。
【００６１】
図１０は、細胞の取込みを示す。集合したＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃからのキャプシドは、Ｃ２Ｃ１２細胞に組み込まれ、ＣＬＳＭによって可視化される。キャプシドの染色に加えて（赤、テキサスレッド染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、後期エンドソーム（緑、フルオレセイン−デキストラン染料、７０ｋＤａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、核（緑、ＳＹＴＯ−１６染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびリソソーム（青、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ−Ｙｅｌｌｏｗ染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が示されている。（ａ）〜（ｃ）は取込みから１５分後のキャプシドの局在化、（ｄ）〜（ｆ）は取込みから６０分後のキャプシドの局在化である。キャプシドは、エンドサイトーシスによって細胞内に包有され、初期および後期（１５分後）のエンドソームを経て、最終的にリソソーム内に濃縮される（６０分）。
【００６２】
図１１は、タンパク質リステリオリシンＯを示す。（ａ）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）からのタンパク質リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の精製。レーン１：分子量基準（１０ｋＤａラダー）；レーン２：実施例８によるＬＬＯとセルロース結合性ドメインとの精製融合タンパク質；レーン３：エンテロキナーゼによる融合タンパク質の切断とＬＬＯの放出。（ｂ）ＬＬＯタンパク質の活性。ＬＬＯ添加し、ｐＨ値をｐＨ６．０未満に下げた後の、コレステロール含有リポソームからの蛍光染料（カルセイン，Ｓｉｇｍａ）の放出のタイムコースで示す。対照実験においては、ｐＨ７．０においてＬＬＯだけでなくＢＳＡも使用した。これらは蛍光染料の放出を誘導しない。
【００６３】
実施例１
システインを含まないコートタンパク質ＰｙＶＰ１（ＰｙＶｐ１−ＣａｌｌＳ変異型）の作製、集合およびキャラクタリゼーション
所定の実施例において用いるウイルスコートタンパク質は溶液中のポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質５量体から誘導されるものであり、該タンパク質は、現行技術に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏで容易にエンベロープに集合可能である。本実施例において、配列中にシステインを含まない、すなわち、野生型タンパク質に含まれる６つのシステイン（Ｃｙｓ−１２，Ｃｙｓ−１６，Ｃｙｓ−２０，Ｃｙｓ−１１５，Ｃｙｓ−２７４およびＣｙｓ−２８３）を現行技術に従う部位特異的変異法によりセリンで置換したポリオーマウイルス変異型を作製する。このことは、とりわけ溶液の酸化還元条件がタンパク質の状態に影響を及ぼさず、このタンパク質が多くの用途において容易に扱えるという利点をもたらす。
【００６４】
変異は製造元の指示に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって実施する。変異のために以下のオリゴヌクレオチドを使用する。Ｃ１２Ｓ，Ｃ１６Ｓ，Ｃ２０Ｓ：５′−ＧＴＣ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＧＣ ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＣＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＣＣ−３′および５′−ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＣＴ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＡＣ−３′，Ｃ１１５Ｓ：５′−ＧＡＧ ＧＡＣＣＴＣＡＣＧ ＴＣＴＧＡＣＡＣＣ ＣＴＡＣ−３′および５′−ＧＴＡ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＣＧ ＴＧＡ ＧＧＴ ＣＣＴ Ｃ−３′；Ｃ２７４Ｓ，Ｃ２８３Ｓ：５′−ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＡＣ ＣＴＣ ＴＣＧ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＴＧ−３′および５′−ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＧＴＡ ＴＡＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧＧ ＣＣＣ−３′。
【００６５】
ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの発現と精製は、Ｃ末端融合インテインドメインとこれに結合したキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）を有する融合タンパク質として実施する。このために、まずＩＭＰＡＣＴ系（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のベクターｐＣＹＢ２に基づいたプラスミドを作製する。ｐＣＹＢ２のマルチクローニングサイトを介して、制限部位ＮｄｅＩ−ＸｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製の制限酵素）を用いて、標準的な方法により、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳタンパク質をコードするＤＮＡ断片をクローン化する。
【００６６】
ＤＮＡ断片のＰＣＲのために、以下のオリゴヌクレオチドを用いる。ｖｐ１ＮＩｍｐ（５′−ＴＡＴ ＡＣＡ ＴＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ Ｃ−３′）およびｖｐ１ＣＩｍｐ（５′−ＡＴＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＴＡ ＣＡＧ ＴＣＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＴＴＣ Ｃ−３′）。また、Ｃ末端にあるアスパラギンが分解性質に関してインテリン分解系にとって好ましくないため、このＰＣＲにより、同時に野生型ＶＰ１タンパク質のＣ末端アミノ酸がＧｌｙ３８３−Ａｓｎ３８４からＰｒｏ３８３−Ｇｌｙ３８４に転換される。上述の転換は、以下に示すそれ以降の集合に対しては、ＰｙＶＰ１タンパク質の本質的性質に何の影響も及ぼさない。
【００６７】
ｐＣＹＢ２ベクターのｔａｃプロモータは、わずかな量の融合タンパク質しか発現しないため、融合構造体（ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ）−インテリン−ＣＢＤは別のＰＣＲによりｐＣＹＢ２ベクターから単離し、Ｔ７ｌａｃプロモータを有する高い発現性のＰＥＴベクタープラスミド（ｐＥＴ２１ａ，Ｎｏｖａｇｅｎ）に、制限部位ＮｄｅＩ−ＥｃｏＮを介してクローン化する。ＰＣＲは以下のオリゴヌクレオチドを用いて行う。ｖｐ１−ＮＩｍｐ（５′−ＴＡＴ ＡＣＡ ＴＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ Ｃ−３′）および５′−ＡＴＡ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＣＣ ＡＣＡ ＡＧＧ−３′。
【００６８】
このようにして作製されたベクターは、高発現性の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内において、高発現性のＴ７ｌａｃプロモーター（ｐｏｖａｇｅｎ）により、融合タンパク質（ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ）インテインＣＢＤを発現することができる。これを行うために、形質転換された細胞を、２ＬのＬＢ培地を含む５Ｌ容三角フラスコ内で、培養物のＯＤ₆₀₀が２．０〜２．５になるまで３７℃で培養する。培地中に１ｍＭＩＰＴＧを加えることによりタンパク質発現を誘導する。その後、培養物を１５℃でさらに２０時間培養する。このようにより低い温度とすることにより、ｉｎ ｖｉｖｏ状態における融合タンパク質内のインテイン部分の除去が最小限に抑えられる。遠心分離により集菌し、７０ｍＬの再懸濁バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５％（ｗ／ｖ） グリセロール，ｐＨ８．０）中に再懸濁し、高圧ホモジナイズにより溶菌する。粗抽出液を４８０００ｇで６０分間遠心分離した後、透明な細胞抽出液を得る。この抽出液を、１０℃において０．５ｍＬ／分の流速で１０ｍＬのキチンアフィニティ基質（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に流す。その後、カラムをカラム体積の３倍の再懸濁バッファーとカラム体積の１５倍の高いイオン強度を有する洗浄バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｎＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，５％ （ｗ／ｖ）グリコール，ｐＨ８．０）で洗浄し、再びカラム体積の３倍の再懸濁バッファーで洗浄することにより、全ての不要な大腸菌宿主タンパク質をキチン基質から除去する。
【００６９】
キチン基質に固定化された（ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ）キャプソメアの、自己スプライシングインテイン活性による融合タンパク質からの除去は、再懸濁バッファー中、５０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭ ヒドロキシルアミン、あるいは３０ｍＭ ＤＴＴと３０ｍＭ ヒドロキシルアミンとによるパルス（カラム体積の３倍）により誘導する。このために、上記いずれか一方の溶液を流したキチン基質を１０℃で１４時間インキュベートする。ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳタンパク質を完全に遊離させて、カラムクロマトグラフィーの標準的方法によって、キチン基質および基質に付着した融合タンパク質の他の成分から完全に分離することができる。これに対しては、０．１Ｍ〜２．０ＭのＮａＣｌ濃度の直線塩勾配を用いることが適切である。製造元によれば、キチン基質の再生は、カラム体積の３倍のＳＤＳ含有バッファー（１％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）／再懸濁バッファー）でキチン材料を洗浄することによって行う。
【００７０】
ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳタンパク質の集合は、まず現行技術によってすでに記載のものと同じ条件下（Ｓａｌｕｎｋｅ，Ｃａｓｐａｒ＆Ｇａｒｃｅａ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、５６、Ｓ．８８７〜９００頁、１９８９年を参照）で実施する。ウイルス様キャプシドは、タンパク質を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂，５％グリシン，ｐＨ７．２に対して７２時間室温で透析した後に保持されている。ゲル濾過により（カラムＴＳＫゲルＧ５０００ＰＷＸＬおよびＴＳＫゲルＧ６０００ＰＷＸＬ，ＴｏｓｏＨａａｓ）、ウイルス様のキャプシド外被を検出することができ、遊離の集合していないタンパク質構築用ブロックから分離することができる。
【００７１】
上述の方法において、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳタンパク質が可溶性５量体として発現され、これが集合成分である。図２ａは、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの作製および精製の様子を示すＳＤＳゲルを示している。図２ｂは、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳタンパク質が適切な条件下でキャプシド状構造に集合可能であることを示すゲル濾過実験を表す。図２ｃは、集合したキャプシドを電子顕微鏡画像によって示したものである。
【００７２】
本実施例は、ＰｙＶＰ１野生型タンパク質を修飾することができ、タンパク質外被内に利用できるシステインが無い場合であっても、現行技術に従って、キャプシド構造への集合が可能であることを示している。同時に、本実施例は、インテインに基づいた精製系の助けを借りた効率的なキャプソメア作製の可能性を示すものである。
【００７３】
実施例２
蛍光標識されたコートタンパク質ＰｙＶＰ１（ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ変異型）の作製、集合およびキャラクタリゼーション
キャプソメアの特異的標識のために、タンパク質の特異的部位に唯一のシステインを挿入することができる。図３ａに示されるタンパク質の三次構造によれば、上記挿入は、たとえば、システインで置換されているスレオニン２４９の位置で行われている。突然変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、オリゴヌクレオチド５′−ＧＧＡ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＧＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＧＣ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＧ３′および５′−ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＴＧ ＣＡＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＧＴ ＣＣ −３′を用いて製造元の指示に従って実施する。タンパク質の発現および精製は、実施例１と同様にして行う。
【００７４】
精製されたタンパク質を製造元のプロトコールに従って、染料フルオレセイン−マレイミドまたはテキサスレッド−マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識する。システイン２４９位において特異的カップリングが起こり、その特異性が図３ｂに示されている。ゲル濾過分析（図３ｃ）および電子顕微鏡画像（図３ｄ）に示されるように、タンパク質は実施例１と同様にしてキャプシド内に集合可能である。
【００７５】
このようにして標識されたキャプシドを真核細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）上で１時間インキュベートする。細胞に対して１０００倍過剰のウイルス様粒子を使用する。インキュベーション後、付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパを用いてフラスコの壁から除去する。その後、外れた細胞をＳＤＳサンプルバッファーと混合し、５分間かけて９９℃まで昇温する。次に、標準的な手法に従って細胞溶解物をＳＤＳゲル電気泳動によって分離する。ここで、キャプソメアの蛍光標識されたタンパク質成分が、通常のゲル染色を行わなくても明確に可視化される。所定時間のインキュベート後、セル内ではタンパク質の著しい分解が起こっている（図４）。
【００７６】
本実施例は、安全な位置に追加の唯一のシステインを有する修飾ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳタンパク質を作製することができ、蛍光染料で標識してキャプシド内に集合させることができることを示している。このタンパク質変異型からのキャプシドは、真核細胞の内部に取込まれる。取込みは蛍光染料によって検出することができる。標識はタンパク質の他の性質には影響を及ぼさない。
【００７７】
実施例３
蛍光標識オプションを有する／有しないシステイン含有コートタンパク質ＰｙＶＰ１（２Ｃ／３Ｃ変異型）の作製、集合およびキャラクタリゼーション。
ＰｙＶＰ１のアミノ酸位置２０と１１５の間で５量体内ジスルフィド架橋が形成されることは、キャプシドの集合と安定性にとって利点となりうる。したがって、セリンが存在したアミノ酸位置の両方にシステインを含むＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの変異型を作製する。突然変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により製造元の指示に従って実施する。このために、以下のオリゴヌクレオチドを使用する。Ｓ２０Ｃ：５′−ＧＣＡ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＣＧ Ｃ−３′および ５′−ＧＣＧ ＧＧＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＴＧ Ｃ−３′。変異型Ｓ１１５Ｃは、実施例１によるＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの作製における中間生成物として生じる鋳型として用いられる。このようにして作製された変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｓ２０Ｃ−Ｓ１１５Ｃは、５量体内ジスルフィド架橋のために適切な位置に２個のシステインを有し、以下ＰｙＶＰ１−２Ｃと呼ぶ。
【００７８】
この変異型ＰｙＶＰ１−２Ｃから出発して、さらに２４９位にシステインを有し、そのために実施例２のＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃと同様に特異的かつ中立的に標識可能な別の変異型を作製することができる。突然変異は、実施例２と同様にしてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、また実施例２に記載のオリゴヌクレオチドを用いて実施する。
【００７９】
実施例１に従って両方の変異型を作製するために、タンパク質を還元状態に保つためのさらなる添加剤として溶媒中で３０ｍＭＤＴＴを用いる。キャプソメア中のジスルフィド架橋の酸化は、キャプソメアをキャプシドに集合させるための透析においてＤＴＴを分離した後に起こる。図５は変異型ＰｙＶＰ１−２Ｃの集合能力を示すものであり、集合は実施例１と同様の透析によって偶発的に起こる。
【００８０】
ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ変異型と比較した本変異型の特徴は、酸化性条件下においてキャプソメアが完全にキャプシドに集合することである。遊離の集合していないタンパク質のキャプソメアは、上述の条件下においては得られない。上述の両方の変異型によって、ウイルス様粒子への成分の定量的キャプシド被包を達成することができる。
【００８１】
実施例４
表面にアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列モチーフを含むコートタンパク質ＰｙＶＰ１（ＰｙＶＰ１−ＲＧＤ変異型）の作製、集合およびキャラクタリゼーション。
【００８２】
実施例２で得られるＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃを出発点として、それぞれキャプシドシェルの外側にある別々のループ内に新しい配列を有する２つの変異型を作製した。これらの２つの配列断片の特徴は、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）が出現していることである。これらの変異型によって、アデノウイルスのメカニズムに匹敵する人工キャプシドシェルに対する細胞取込みメカニズムが移植される。現行技術によれば、このウイルスクラスに対しては、細胞表面上のインテグリン受容体への結合によって細胞へのアデノウイルスの取込みが可能になることが知られている。
【００８３】
新しい配列モチーフの挿入は、一方は配列位置１４８と１４９の間に、もう一方はアミノ酸位置２９３と２９５の間に行う。対応する領域は構造によればキャプシドの外側にあたる。
【００８４】
１４８／１４９位における交互の柔軟なセリン−グリシンモチーフを有する新しいループ断片の挿入（以後の変異型ＰｙＶＰ１−ＲＧＤ１４８の作製のための）は、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって実施する。５′−ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＣＣ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＡＡＡ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＴＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＡＧＴ Ｇ−３′および５′−ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＣＣ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＴＣ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＴＴ ＧＴＴ Ｇ−３′。２９３／２９５位における同様のループ断片の挿入（以後の変異型ＰｙＶＰ１−ＲＧＤ２９３の作製のための）のためには、以下のオリゴヌクレオチドを用いる。５′−ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＡＴ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＧ−３′および５′−ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＡＣＡ ＴＣＡ ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＴＡ ＡＣＴ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＣＣ ＡＴＴ ＡＴＡ ＴＣ−３′。第２段階において、上述の両方の変異型において、新しく作成されたループ断片にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を挿入するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用する。５′−ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧ−３′および５′−ＣＡＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＣＧＣＴＧＣ ＣＧＣ ＴＡＴ ＣＧＣ ＣＡＣ ＧＡＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＣＧ３′。この最終的なクローニング後、両変異型ＰｙＶＰ１−ＲＧＤ１４８およびＰｙＶＰ１−ＲＧＤ２９３を遺伝子レベルで産生する。
【００８５】
両タンパク質変異型の作製および精製は、実施例１と同様にして実施する。両変異型のキャプシドへの集合は、キャプソメアが天然型のものであり集合能力を有する、実施例１に示した集合条件によって問題なく行われる。さらに、これらの変異型を実施例２と同様にして唯一のシステインＣ２４９において蛍光染料で標識することもできる。蛍光標識されたキャプソメアから成る集合キャプシドは、真核細胞（Ｃａｃｏ−２型）上でインキュベートすることができる。細胞へのキャプシドの取込みは、蛍光顕微鏡によって蛍光染料を通して追跡することができ、これには細胞を固定する必要がない。図６に示すように、細胞へのキャプシドの取込みが起こる。ＰｙＶＰ１−ＲＧＤ１４８変異型（図６ｂ）は、ＲＧＤ配列モチーフを持たない比較対照の変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ（図６ａ）よりも効率的に取込まれている。したがって、移植されたＲＧＤモチーフは、インテグリン受容体媒介性エンドサイトーシスによる効率的な方法によるキャプシド取込みを誘導する。さらに、本実施例は、細胞へのキャプシドの取込みを適当な成分を用いて制御できることを示している。
【００８６】
実施例５
天然のシアリルラクトース結合部位に変化を有するコートタンパク質ＰｙＶＰ１（ＰｙＶＰ１−Ｒ７８Ｗ変異型）の作製、集合およびキャラクタリゼーション
アルギニン７８がトリプトファンに変異したアミノ酸変異を含む別の変異型を、変異型ＰｙＶＰ１−３Ｃに基づいて作製する（ＰｙＶＰ１−３Ｃ−Ｒ７８Ｗ）。アルギニン７８位は、天然のウイルスが、ポリオーマウイルスの天然受容体である、細胞の表面上のシアリルラクトースに結合する際に、深く関与している。Ｒ７８Ｗ変異により、すなわちアルギニンを構造的に互換性のないトリプトファンに交換することにより、この相互作用を抑制すると、天然の受容体結合を介しての標的細胞へのウイルス粒子の取込みが阻害される。
【００８７】
所定の変異はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により製造元の指示に従って実施する。したがって、以下のオリゴヌクレオチドを使用する。５′−ＣＴＡ ＴＧＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＡＴ ＴＡＡ ＴＴＴ Ｇ−３′および５′−ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＣＣ ＡＴＡ Ｇ−３′。得られたＰｙＶｐ１−Ｒ７８Ｗ変異型の作製、精製、ならびに集合は実施例１と同様に行う。
【００８８】
上述の他の変異型と同様に、変異型ＰｙＶＰ１−Ｒ７８Ｗはキャプシドに集合することができる。本実施例は、キャプシド構造の表面を変化させることにより、キャプシドの細胞親和性を操作できることを示している。これにより、既存の細胞親和性を除去できるだけでなく新しい細胞親和性を挿入することができる。
【００８９】
実施例６
混合キャプシドＩの作製とキャラクタリゼーション
混合キャプシド、すなわち、幾つかの異なる分子性物質からモザイク様に構築された粒子の作製は、本発明の特に重要な特徴である。異なるコートタンパク質から構築された混合キャプシドを確認するために、コートタンパク質の変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃを、実施例２に記載したように、第１のアプローチにおいては蛍光染料フルオレセイン−マレイミドで標識し、また第２のアプローチにおいてはテキサスレッド−マレイミドで標識した、システイン２４９と連結する。異なる方法で標識されたキャプシドを等モル比で混合し、続いて集合させた。キャプシド形成の分析は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって実施する。この技術は、１つの粒子内の異なる蛍光タイプを検出することができる。図７は等モルで集合させたキャプシドの分析結果を示す。蛍光標識されたキャプシドと遊離の集合していないキャプソメアからなる集団が現れている（図７ａ／ｂ）。グラフにおいてフルオレセイン蛍光とテキサスレッド蛍光を対照して見ると（図７ｃ）、両方の蛍光を有する粒子の集団が同時に観察される。一方の染料だけで標識された粒子は検出することができず、そうした粒子が明らかに形成されていないことがわかる。
【００９０】
本実施例は、異なる性質を示すポリオーマウイルスＶＰ１コートタンパク質をモザイク様式で集合することができ、両方のコートタンパク質の性質を特異的に示すウイルスキャプシドが形成されることを示している。これ以外にも、ウイルスの組成を非常に高い感度で決定および分析するための方法も示している。
【００９１】
実施例７
混合キャプシドＩＩの作製およびキャラクタリゼーション
本発明の利点をさらに証明するために、完全に集合できないＰｙＶＰ１の変異型を作製する。このために、人工ペプチド配列（配列 ＧＳＧＳＧ ＷＴＥＨＫ ＳＰＤＧＲ ＴＹＹＹＮ ＴＥＴＫＱ ＳＴＷＥＫ ＰＤＤＧＳ ＧＳＧ）を現行技術に従ってＰＣＲによりＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃのアミノ酸配列の２９３位と２９５位との間に挿入する。変異型の作製と精製は実施例１の説明に従って行う。作製された変異ＰｙＶＰ１−Ｄｅｆは天然型の５量体タンパク質である。しかしながら、このタンパク質は、完全に集合能を欠失しており、実施例１に記載の集合のための標準的な条件下でウイルス様キャプシドを形成することができない。この集合欠失は、ゲル濾過分析によって示される（図８ａ）。
【００９２】
集合欠失変異型ＰｙＶＰ１−Ｄｅｆを、２４９位の唯一のシステインを介して、実施例２に従って蛍光染料フルオレセイン−マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識する。その後、変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ存在下において、両成分が異なる化学量論比で集合する。集合は実施例１に従って透析によって実施する。ゲル濾過分析における、４９０ｎｍでのフルオレセインの吸収を測定することにより（図８ｃ）、ＰｙＶＰ１−Ｄｅｆが集合するキャプシドに組み込まれていることがわかる。集合中における両キャプシド成分の化学量論比の変化（Ｆｉｇ．８ｃ）は、集合欠失変異型ＰｙＶＰ１−Ｄｅｆが変異型の質量比に比例して混合キャプシド内に包有されることを実証するものである。
【００９３】
本実施例は、ポリオーマウイルスＶＰ１の異なる変異型から混合キャプシドを集合条件下で形成できることを示している。さらに、キャプシドに組立てられたキャプソメアは開始条件の化学量論的質量比を反映している。上述の方法は、集合能を欠失したキャプソメアをキャプシド構造に統合するためにも使用できる。
【００９４】
実施例８
混合キャプシドＩＩＩの作製およびキャラクタリゼーション
システインを含まないＶＰ１変異型、たとえば実施例２によるＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの集合は、その全てがキャプシドを形成するわけでなく、たとえば使用されるキャプソメアの５０％しかキャプシドを形成しないという欠点も有しうる。これ以外にも、これらのキャプシドはかなり不安定であり、単離後に部分的に解離する。この欠点は、システインを含む変異型とともに混合集合することにより補うことができる。
【００９５】
システインを含まない変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−ＷＷ１５０は、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳを用いた場合の５０％に対して、約１５％と集合能力が低下しているが（図９ａ）、変異型ＶＰ１−ｗｔのシステイン含有キャプソメアは、実施例３によるＰｙＶＰ１−２ＣおよびＰｙＶＰ１−３Ｃと同様に、適切な条件下で完全にウイルスキャプシドに集合する（図９ｂ）。ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−ＷＷ１５０とＰｙＶＰ１−ｗｔとの等モル混合物は、集合条件下で、モザイク様の混合ウイルス様キャプシドになる。ことのことは、混合物が完全に集合し、遊離のキャプソメアが全く検出されなくなったことから明らかである（図９ｃ）。
【００９６】
本実施例は、モザイク様式に構築されたウイルスキャプシドの形成を証明するものでもある。さらに、システイン含有キャプソメアの性質である、ウイルスキャプシドに完全に集合する性質がキャプシド全体に移入するような、システイン含有変異型とシステイン非含有変異型との組み合わせの可能性も証明する。この効果は、そもそもシステイン非含有の遊離のキャプソメアを、所定の部位に挿入されたシステイン残基において（たとえばＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳを用いて）高い特異性で修飾して、この新しい機能をウイルスキャプシドに挿入することを可能にし、該ウイルスキャプシドにおいてはシステイン非含有集合体の欠点（低い集合効率、より不安定なキャプシド）が回避される。
【００９７】
実施例９
ウイルス様キャプシドによる細胞のトランスフェクション
変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃは実施例２に従って作製、集合および蛍光標識することができる。標識されたキャプシドは、Ｃ２Ｃ１２型の真核細胞への取込み後、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって細胞内で観察することができる。したがって、このＰｙＶＰ１変異型は、同一または異なるものを（混合して）集合させた、モザイク様に組立てられたキャプシドの効率および取込みメカニズムを分析する可能性を与えるものである。かくして、蛍光標識されたＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃはキャプシド粒子に組立てられる。
【００９８】
図１０には、集合したＰｙＶＰ１ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃからなるキャプシドの、Ｃ２Ｃ１２細胞への取込みに対する一連の実験が示されている。キャプシドの染色（赤、テキサスレッド染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に加えて、後期エンドソーム（緑、フルオレセインデキストラン染料、７０ｋＤａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、核（緑、ＳＹＴＯ−１６染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびリソソーム（青、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ−Ｙｅｌｌｏｗ染料、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）も可視化されている。キャプシドはエンドサイトーシスにより最終的に細胞内に取込まれ、初期および後期（１５分後）エンドソームを経て、最終的にリソソーム中に濃縮される（６０分）。
【００９９】
本実施例は、前述の変異型を用いて成分の性質を分析することが可能であり、これらの分析が細胞の位置特定およびキャプシドの作用メカニズムも含んでいることを実証するものである。したがって、標識そのものは中性でキャプシドの性質に影響を及ぼさないような標識を用いることにより、人工的に作製されたモザイク様キャプシドを分析し、その生物学的性質を記述できることが示される。
【０１００】
実施例１０
ＤＮＡとウイルス様キャプシドの複合体による細胞のトランスフェクション
ウイルス様キャプシドによる真核細胞へのＤＮＡの輸送を調べるために、１００μＬのタンパク質ＰｙＶＰ１−３Ｃ溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５％グリセロール中に１ｍｇ／ｍＬ）を７．５μＬのプラスミドｐＥＧＦＰＮ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）溶液、ならびに１００μＬの透析バッファー（２０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ₂，５％グリコール）と混合し、頻繁にバッファーを交換しながら、透析バッファーに対して室温で４日間透析する。トランスフェクション培地の作成には、１００μＬの上記反応混合物を３００μＬのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１ｐＭ クロロキンと混合する。トランスフェクション試験には、前日に１ウェルあたり１００００個の細胞を含むように１２個のウェルに植菌しておいたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いる。トランスフェクションのために、セルをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、１ウェルあたり４００μＬのトランスフェクション培地と混合する。細胞を３７℃で５％ＣＯ₂存在下で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）とともに５％ＣＯ₂存在下で３７℃でさらに４８時間インキュベートする。この期間後、レポータ遺伝子の発現によってトランスフェクションの成功が検出される。ここで使用したプラスミドＰＥＧＦＰ−Ｎｌは、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させることができ、このＧＦＰは、細胞中における緑色の蛍光によって検出することができる。ここで記載したプロトコールによれば、１ウェル当たり平均して約２０個のレポータ遺伝子ＧＦＰを明確に産生する細胞が認められる。
【０１０１】
本実施例は、ＰｙＶＰ１−３Ｃから成る上述の輸送系を用いることにより、真核細胞内にＤＮＡをうまく輸送することができることを示している。さらに、挿入されたＤＮＡは細胞内に放出させることができ、レポータ遺伝子も正確に発現される。
【０１０２】
実施例１１
リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の作製およびキャラクタリゼーション
実施例７において明らかになったように、ウイルス様キャプシドは真核細胞内に取込まれた後にリソソーム内で大量に濃縮され、最終的に溶菌される。エンドソーム区画からの粒子の放出は、細胞溶解素を添加することによって誘導することができる。これに対するモデルは、有機体リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来するリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）である。
【０１０３】
ＬＬＯ遺伝子は、ＰＣＲにより、リステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡの断片から標準的な方法によって増幅される。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ベクターＰＴＩＰ内でのクローニングを行う。５′−ＴＡＴ ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＴＴ−３′および５′−ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＧＧ ＣＴＧ ＣＧＡ ＴＴＧ ＣＡＴ ＴＡＴ ＣＴＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＡ３′。このベクターｐＴＩＰは、ｐＥＴ２１ａに基づく、実施例１に記載したインテイン発現ベクターの誘導体であり、さらにプロリンに富む配列が挿入されている。プロリンに富む配列が遺伝子の５′−または３′末端に融合されるか、あるいは、マルチクローニングサイトを介して挿入されるようにベクターを構築する。プロリンに富む配列は主に、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを含む。
【０１０４】
第２のＰＣＲにおいて、遺伝子断片をｐＴＩＰベクターから増幅し、ｐＥＴ３４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。このために、以下のオリゴヌクレオチド、５′−ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣ３′および５′−ＡＴＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＣＧＡ ＴＴＧ ＣＡＴ ＴＡＴ ＣＴＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＡＣ−３′を用いる。ベクターをＳｒｆＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）平滑末端で切断し、ＤＮＡ断片を平滑末端でベクターｐＥＴ３４ｂにライゲートする。作製された構築物は、セルロース結合ドメインとのＮ末端融合タンパク質として、プロリンに富む配列によって標識されたＬＬＯタンパク質を発現させることができる。この結合ドメインは、アフィニティ精製が無事に終了した後に、エンテロキナーゼによりタンパク分解により分離することができる。融合タンパク質の作製は、形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を１ｍＭ ＩＰＴＧとインキュベートした後に、２５℃で培養することによって行われる。細胞のホモジナイゼーションは、実施例１に従って実施する。再懸濁バッファーとして、ここでは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いる。細菌のＤＮＡを除去するために、細胞抽出液を５ｍＭ ＭｇＣ１₂および０．１Ｕのベンゾナーゼと混合し、２５℃で３０分間インキュベートする。
【０１０５】
その後、細胞抽出液を製造元の指示に従ってセルロース基質（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入することにより、融合タンパク質の精製を行う。融合タンパク質の溶出は、カラムと同体積のエチレングリコール（Ｍｅｒｃｋ）によって行う。溶出されたタンパク質を即座に再懸濁バッファーに対して透析する。融合タンパク質からのセルロース結合ドメインの除去は、エンテロキナーゼを用いて製造元の指示に従って実施する。
【０１０６】
図１１ａは、ＬＬＯの作製と精製を示すＳＤＳ電気泳動ゲルを示している。タンパク質の活性が図１１ｂに示されている。タンパク質は、適切な溶媒条件下（ｐＨ＜６．０）において、コレステロールを含む脂質二重層膜内に細孔をもたらす。このことは、標準的な方法に従って作製された合成の、コレステロール含有リポソーム上で見られる。ここでは、蛍光染料（カルセイン）が、合成リポソームから放出され、溶液中の蛍光シグナルが測定可能に増加している（図１１ｂ）。
【０１０７】
本実施例は、タンパク質ＬＬＯを活性な形で組換えにより作製できることを示している。さらに、ＬＬＯは、それらがエンドソーム内にある場合に生物膜を溶解することができることも示されている。実施例１〜７によるキャプシドに関して、この性質はエンドソームに取込まれたキャプシドの放出のために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の略図。
【図２ａ】ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの作製。
【図２ｂ】ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの作製。
【図２ｃ】ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳの作製。
【図３ａ】ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４８Ｃのキャプソメア。
【図３ｂ】特異的標識。
【図３ｃ】ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４０Ｃのキャプソメア。
【図３ｄ】ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４０Ｃのキャプソメア。
【図４】細胞溶解物における検出。
【図５】集合の様子。
【図６】キャプシドの組込み。
【図７】混合集合ウイルス様粒子のＦＡＣＳ分析。
【図８ａ】集合体の分析。
【図８ｂ】集合体の分析。
【図８ｃ】集合体の分析。
【図９ａ】ＰｙＶＰ１のシステイン非含有およびシステイン含有変異型の混合集合の様子。
【図９ｂ】ＰｙＶＰ１のシステイン非含有およびシステイン含有変異型の混合集合の様子。
【図９ｃ】ＰｙＶＰ１のシステイン非含有およびシステイン含有変異型の混合集合の様子。
【図１０】細胞の取込み。
【図１１】リステリオリシンＯ。
【配列表】

Claims (25)

1. アミノ酸を主成分とする組換えによって作製される部分ユニットを含む、分子性物質の輸送系であって、
   −互いに異なる１回の修飾を受けた少なくとも２個の部分ユニット、
   または
   −少なくとも２回の互いに異なる修飾を受けた少なくとも２個の部分ユニット、
   のうち少なくともいずれかを含み、
   前記修飾は１または複数のアミノ酸の挿入、除去、または変更であり、
   前記部分ユニットはモザイク様に輸送系に集合することができ、分子性物質は輸送系内にキャプシド被包され、
   前記修飾部分ユニットは、
   ポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質の外側のループ領域内のアミノ酸位置１４８または２９３のうち少なくともいずれかに修飾を有するポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質由来の部分ユニットである
   輸送系。
2. ポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質内のシステイン残基が全てセリン残基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載の輸送系。
3. ポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質がアミノ酸位置２９３に修飾を有する場合、さらにアミノ酸位置２４９のスレオニンがシステインに置換されていることを特徴とする請求項２に記載の輸送系。
4. 非修飾部分ユニットをさらに含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の輸送系。
5. 一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ペプチド、ペプチドホルモン、タンパク質、タンパク質ドメイン、糖タンパク質、リボザイム、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、薬剤、ヌクレオチド、ホルモン、脂質または炭水化物を分子性物質としてキャプシド被包できることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の輸送系。
6. 輸送系内にキャプシド被包された一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡは、タンパク質が核、ミトコンドリア、小胞体内、あるいは細胞外へ輸
   送されるように、シグナル配列を備えたタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の輸送系。
7. 輸送系内にキャプシド被包された物質には、該物質が核、ミトコンドリア、小胞体内へ、あるいは細胞外へ輸送されるようにシグナル分子が与えられることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の輸送系。
8. キャプシド被包された一本鎖または二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖または二本鎖ＲＮＡによってコードされるタンパク質、あるいは、キャプシドによって包装されたタンパク質または外被の成分であるタンパク質は、グリシンおよびアラニンに富む配列をアミノ末端側に融合することによって、細胞の分解速度が低下しており、これにより、生きた有機体における免疫系の刺激を起こらないか低減されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の輸送系。
9. 輸送系は、該輸送系を有機体の免疫応答から保護する外被によって被覆されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の輸送系。
10. 外被は、ポリエチレングリコールから成るか、あるいは、合成によって作製される脂質膜の形で実施されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の輸送系。
11. 前記組換えによって作製される部分ユニットは、単数／複数の末端において、および／または部分ユニットの配列内において、点変異によって、あるいは、１個または複数個のペプチドまたはタンパク質配列またはタンパク質ドメインの挿入、除去または変更によって修飾されること、あるいは、前記組換えによって作製される部分ユニットは、該ユニットが標的細胞に対して効率的に取込まれ、および／または指向され、お よび／または分子性物質が部分ユニットに対してより良好に結合し集合するように修飾されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の輸送系。
12. 輸送系は、分子性物質が部分ユニットに対してより良好に結合し集合するように、輸送系の内側に位置する領域で修飾された少なくとも１つの部分ユニットを示すことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の輸送系。
13. 前記組換えによって作製される部分ユニットは、該部分ユニットが選択細胞型へ特異的に取込まれ得るように、点変異によって、および／または、ペプチド、ペプチドホルモン、タンパク質、タンパク質ドメイン、糖タンパク質、脂質または炭水化物を結合することによって、修飾されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の輸送系。
14. 輸送系は、ループ構造内にＲＧＤ配列を有する少なくとも１つの部分ユニットを示し、該ＲＧＤ配列は輸送系の外側に位置すると共に、インテグリン受容体媒介性のエンドサイトーシスによる標的細胞への輸送系の取込みを可能にすることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の輸送系。
15. 組換えによって作製される部分ユニットは、輸送系またはその一部がエンドソーム膜を通過できるように、少なくとも１個または数個のタンパク質、１個または数個のタンパク質ドメイン、１個または数個のペプチド、１個または数個のデンドリマー、あるいは疎水性または塩基性ポリマーによって修飾されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の輸送系。
16. 細菌の細胞溶解素またはウイルスのタンパク質をタンパク質として用い、細菌毒素の移行ドメインをタンパク質ドメインとして用いることを特徴とする請求項１５に記載の輸送系。
17. 前記組換えによって作製される部分ユニットは、蛍光染料、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチドホルモン、脂質、脂肪酸または炭水化物によって標識できることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の輸送系。
18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の輸送系の製造方法であって、
    −部分ユニットの組換え発現ステップ、
    −宿主細胞の溶菌による部分ユニットの放出ステップ、
    −輸送系をモザイク様式に構成／集合させるために、所望の化学量論関係で部分ユニット同士を接触させるステップ、および
    −分子性物質を輸送系内にキャプシド被包するために、集合の前または最中のいずれかに、分子性物質と接触させるステップから成る方法。
19. 前記組換えにより作製される修飾部分ユニットを、適当な溶媒条件を用いて、選択した化学量論関係で集合させ、これにより分子輸送系の機能的特徴の検査／決定／制御が可能であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 細胞内へ分子性物質を移入するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の輸送系の使用方法。
21. 真核細胞内へＤＮＡを移入するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の輸送系の使用方法。
22. 輸送系を細胞リソソームから放出するために、細胞溶解素が優先的に添加される、請求項２０に記載の使用方法。
23. 細胞溶解素はリステリオリシンＯである、請求項２２に記載の使用方法。
24. 細胞内での分子輸送系の位置を特定できるように、分子輸送系の部分ユニットが蛍光色素で標識されることを特徴とする請求項２０に記載の使用方法。
25. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の輸送系を、通常の医薬として許容される添加剤およびアジュバントと共に含有する、医薬組成物。

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