JP2001522236A

JP2001522236A - 改変アデノウイルスファイバーおよび標的アデノウイルス

Info

Publication number: JP2001522236A
Application number: JP54126098A
Authority: JP
Inventors: バレリー、ルグラン; マジド、メターリ; ピエール、ブーランジェ
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2001-11-13
Also published as: DE69831741T2; WO1998044121A1; ATE305513T1; CA2285565A1; DK0991763T3; AU7054798A; US20030175243A1; FR2761689B1; AU741728B2; EP0991763A1; US6569677B1; FR2761689A1; DE69831741D1; ES2246533T3; US7256036B2; EP0991763B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、１個以上の残基の突然変異によって改変されるアデノウイルスファイバーに関する。残基は、上記アデノウイルスの三次元構造中の天然細胞レセプターに指定されている。本発明は、ＤＮＡ断片、および発現ベクター、および上記ファイバーを発現する細胞系に関し、アデノウイルス、この型のアデノウイルスの製造法、および感染性宿主細胞、並びにそれらの治療応用、および相当する医薬組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】改変アデノウイルスファイバーおよび標的アデノウイルス本発明の目的は、アデノウイルスに対する天然の細胞レセプターの認識および結合に関与する領域で変異したアデノウイルスファイバーである。本発明は、表面にこのようなファイバーと特定の細胞型に対する改変または標的設定された宿主特異性を組換え体に付与するリガンドとを有する組換えウイルス、これらのアデノウイルスを含む細胞、並びに治療での使用を目的とする感染性ウイルス粒子の製造法にも関する。本発明は、特にヒトにおける遺伝子治療の展望にとって極めて興味深いものである。アデノウイルスは、その独特な性質のために、遺伝子治療においてますます多くの用途に用いられている。それらは多数の動物種で同定されているが、病原性は余り高くなく、非組込み型であり、分裂および静止細胞のいずれでも複製する。更に、それらは広汎な宿主スペクトルを示し、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞、および骨膜細胞のような多数の細胞型に感染することができる(Bramson et al.，1995，Curr．Op．Biotech.，6，590-595)。しかしながら、この感染の特異性の欠如により、一方では、宿主生物中で組換え遺伝子が散布(d issimination)されることがあるので安全性の観点から、また他方では、ウイルスは治療が望まれる細胞型に特異的には感染しないので効率の観点から、組換えアデノウイルスの使用に制限を設けなければならなかった。一般に、アデノウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む約３６ｋｂの二本鎖の線状ＤＮＡ分子と、その両端における複製に関与する２個の逆方向反復配列（逆方向末端反復配列(Inverted Terminal Repeat)についてはＩＴＲと命名）およびキャプシド形成領域からなっている。初期遺伝子は、アデノウイルスゲノムに分散した４個の領域に分布しており(Ｅ１〜Ｅ４；Ｅは初期の意味)、独自のプロモーターを備えた６個の転写単位を有する。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５；Ｌは後期の意味）は、初期転写単位を部分的にカバーしており、大部分は、主要後期プロモーターＭＬＰから転写される。参考のため、遺伝子治療プロトコールに用いられる総てのアデノウイルスは、少なくともＥ１領域を欠失することによって複製には不適当であり、欠失したウイルス機能をイン・トランスで(in trans)提供する相補細胞系で増殖する。ヒト胚腎臓細胞から得られ、Ｅ１機能を効率的に補足する(Graham et al.，1977，J ．Gen．Virol.，36，59-72)２９３系が、一般に用いられている。第二世代ベクターが、最近文献で提案されている。それらは、感染細胞でウイルスの複製に必要な隣接領域(in cis)を保存しており(ＩＴＲおよびキャプシド形成配列)、in v ivoでの発現により宿主に炎症や免疫反応を発症することがあるウイルス遺伝子のほとんどを除去するようにデザインされた実質的な内部欠失を含んでいる。アデノウイルスベクターおよびその調製法は、当業者が入手し得る多数の公表物の主題となってきている。アデノウイルスの感染サイクルは、２段階で起こる。初期相は複製の開始前に起こり、ウイルスＤＮＡの複製と転写を制御する初期タンパク質を生成することができる。ゲノムの複製に続いて後期相が起こり、ウイルス粒子を構成する構造タンパク質が合成される。新たなビリオンの集合体が、核に現れるのである。第一段階では、ウイルスタンパク質が集合して、正二十面体構造の空キャプシドを形成し、その中でゲノムが合成されるのである。放出されたアデノウイルスは、他の許容細胞に感染することができる。これに関して、ファイバーとキャプシドの表面にあるペントン基部とは、ビリオンの細胞への結合とそのインターナリゼーションに重要な役割を果たしている。アデノウイルスは、トリマー性ファイバーを介して許容細胞の表面にある細胞レセプターに結合する(Philipson et al.，1968，J．Virol.，2，1064-1075;Def er et al.，1990，J．Virol.，64，3661-3673)。次いで、粒子は、細胞インテグリンα_vβ₃およびα_vβ₅へのペントン基部の結合によるエンドサイトーシスによってインターナリゼーションされる(Mathias et al.，1994，J．Virol.，68，68 11-6814)。可溶性ファイバーまたは抗ファイバー抗体の感染を抑制する能力は、ウイルスの細胞付着においてその役割を示す。ファイバーは、 (1) Ｎ−末端において、一つの血清型からもう一つの型へ高度に保存される尾は、ペントン基部と相互作用を行い、キャプシドでの分子を確実に固定する。 (2) 幹は棒状の構造であり、多数のβシートの繰返しからなり、この数は血清型によって変化する。 (3) 最後に、幹の末端において、頭がトリマー化シグナルを含む丸い球状構造である(Hong and Engler，1996，J．Virol.，70，7071-7078;Novelli and Boula nger，1991，J．Biol．Chem.，266，9299-9303;Novelli and Boulanger，1991， Virology，185，365-376)。更に、実験データーのほとんどは、頭ドメインが許容細胞への結合に関与していることを示している(Henry et al.，1994，J．Viro l.，68，5239-5246;Louis et al.，1994，J．Virol.，68，4104-4106)の３つのドメインからなっている(Chroboczek et al.，1995，Current Top．Microbiol． Immunol，199，165-200)。固有ファイバーを修飾して、異なる細胞レセプターを認識するようにした「標的設定した」アデノウイルスが、既に文献に紹介されている。例えば、ＷＯ９４／１０３２３号明細書には、(ｓｃＦｖ型の)抗体断片をコードする配列を幹の２２個の反復単位の一つの末端に挿入して、標的抗原を有する細胞に対する感染の特異性を改変するＡｄ５のファイバーの突然変異体が記載されている。米国特許第５，５４３，３２８号明細書には、頭ドメインを腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に代え、ＴＮＦの細胞レセプターと相互作用するようにしたＡｄ５キメラファイバーが記載されている。もう一つの構成では、Ａｄ５固有ファイバーは、そのＣ末端において肝細胞の表面にあるＬＤＬ（低密度リポタンパク質）に結合することができるペプチドＡｐｏＥと融合している。ＷＯ９５／２６４１２号明細書には、トリマー化能を保存しているＣ末端にリガンドを組込むことによって改変したファイバーが記載されている。ＷＯ９６／２６２８１号明細書には、固有ファイバーと特に頭の一部を他の血清型のアデノウイルスファイバーの同等な部分に代え、場合によってはＣ末端にビトロネクチンに特異的なペプチドＲＧＤを挿入することによって得られたキメラファイバーが記載されている。上記のように、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面にある細胞レセプターへのアデノウイルスファイバーの付着によって決定される。仏国特許出願第９７０１００５号明細書では、アデノウイルスのそれぞれ一次レセプターおよびコファクターとしてのクラスＩの主要組織適合遺伝子複合体およびフィブロネクチンのモジュールＩＩＩの抗原の役割が確認されている。しかしながら、他のタンパク質が関与している可能性がある。これに関して、最近の研究では、２および５型のアデノウイルスがコクサッキーウイルスの細胞レセプターを用いて標的細胞へ浸透すると推定している(Bergelson et al.，1997，Science，27 5，1320-1323)。本発明が解決しようとしている問題点は、アデノウイルスファイバーと（複数の）細胞レセプターとの相互作用の領域を修正して、突然変異ファイバーを有するアデノウイルスの天然宿主特異性を変更することである。理解を容易にするため、アデノウイルスの「細胞レセプター」という用語は、これ以後はアデノウイルスのそれらの天然標的細胞への結合または後者への浸透に直接的または他のやり方で関与している（複数の）細胞ポリペプチドを表すのに用いられる。当然のことであるが、このレセプターは血清型によって変化することがある。リガンドを加えることによって、このリガンドによって認識される標的分子を表面に有する１個以上の特異細胞型への新たな向性を与えることができる。本発明は、アデノウイルスの天然の細胞レセプターへの結合を阻害または防止するため、突然変異を行うファイバーの領域が開示されているので、前技術の改良からなる。Ａｄ５ファイバーの頭の４４３〜４６２領域の１個以上の残基を置換または欠失し、正常な許容細胞に対する相当するアデノウイルスの感染性の阻害を示した。ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）リガンドをこれらのファイバーに導入することによってＧＲＰレセプターを発現する細胞に対して感染を標的設定することができる。本発明の目的は、使用するアデノウイルスの治療量を減少し、治療を行う細胞に感染を目的とすることである。この特異性は、細胞毒性遺伝子を用いるときには、細胞毒性効果の健康な細胞への伝播を回避する上で重要である。本発明によって提供される利点は、アデノウイルス技術に関連した散布 (dissemination)および二次的効果の危険性を少なくすることである。従って、本発明の主題は、アデノウイルスファイバーの１個以上の残基の突然変異によって修飾されたアデノウイルスファイバーであって、上記残基がこのアデノウイルスの天然の細胞レセプターに指定されているものである。「ファイバー」という用語は、導入部で広義に定義されている。本発明のファイバーは、ヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ，ヒツジ，ブタまたはサル起源のアデノウイルスから誘導することができ、またはハイブリッドでありかつ様々な起源の断片を含んでなることもある。ヒトアデノウイルスに関しては、血清型Ｃのもの、特に２または５型のアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）が好ましい。 23-4042)に開示されている５８０個のアミノ酸（ａａ）を含むことが示されている。Ａｄ５のファイバーは５８２個のａａを含み、配列アイデンティファイアー１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示されたその配列は、Chroboczek and Jacrot( 1987，Virology，161，549-554)によって決定されたものである。本発明のファイバーが動物アデノウイルスに由来するときには、ウシアデノウイルス、特にＢＡＶ−３株のものが好ましく用いられる。後者は数多くの研究の主題であり、ファイバーの配列は国際出願ＷＯ９５／１６０４８号明細書に開示されている。勿論、本発明のファイバーは、本発明の主題以外の天然の配列と比較して他の変更を示すことがある。本発明が求める目的によれば、本発明によるファイバーは、天然細胞レセプターに結合する能力を減少またはなくなるように改変される。このような特性は、以下に詳説する当該技術分野の手法を応用することによって相当するウイルスの感染性または細胞結合を検討することによって証明することができる。有利な態様によれば、トリマー化およびペントン−基部−結合特性は影響されない。本発明のために、「突然変異」という用語は、１個以上の残基の欠失、置換または付加、またはこれらの可能性の組合せを表す。天然の細胞レセプターとの相互作用の領域が完全にまたは部分的に欠失し、特にアデノウイルスの天然レセプター以外の細胞表面タンパク質に特異的なリガンドに代わる場合が、極めて好ましい。アデノウイルスの頭の三次元結晶学的構造は、Xia et al．(1994，Structure ，2,1259-1270)によって決定された。それぞれのモノマーは、Ａ〜ＤおよびＧ〜Ｊと呼ばれる８種類の逆平行βシートと、８〜５５残基の６種類の主要ループを含んでいる。例えば、ＣＤループは、βシートＣをβシートＤに結合する。小シート(minor sheets)ＥおよびＦは、ＤおよびＧシートの間にあるＤＧループの一部であると考えられる。参考のため、第１表には、配列アイデンティファイアー１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示されるＡｄ５のファイバーのアミノ酸配列におけるこれらの構造の位置が示されており、＋１はイニシエーターＭｅｔ残基を表している。一般に、シートは管理されたコンパクトな構造を形成するが、ループは一層柔軟性に富んでいる。これらの用語はタンパク質生化学の分野で一般に用いられており、基本的な入門書に定義されている(例えば、Stryer，Biochemistr y，第２版，Freeman and Company社より刊行，サンフランシスコ)。第１表４個のβシートＡ、Ｂ、ＣおよびＪは、ウイルス粒子に対して指定されたＶシートを構成する。他の４個（Ｄ、Ｇ、ＨおよびＩ）は、細胞レセプターに面していると思われるＲシートを形成する。Ｖシートは、構造のトリマー化で重要な役割を果たしていると思われ、Ｒシートはレセプターとの相互作用に関与していると思われる。Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５、Ａｄ７、Ａｄ４０、Ａｄ４１の、およびこれらの様々な構造を形成するイヌアデノウイルスＣＡＶのファイバーの残基は、上記文献に詳しく記載されている。本発明によるアデノウイルスファイバーを改変すると、更に具体的にはＣＤループからＩシートまで伸びているドメインに影響を与え、特にＡｄ５ファイバーの残基４４１〜５５７およびＡｄ２ファイバーの４４１〜５５８を伴う。天然ファイバーでの空間的配置の結果、これらの残基は当該アデノウイルスの天然の細胞レセプターを認識し、および／または直接または間接的に相互作用することができる。ＣＤループ、ＤシートおよびＤＧループの基部（Ａｄ２およびＡｄ５ファイバーの位置４４１〜４７８）を含んでなり、および更に具体的にはＡｄ５に関して残基４４３から４６２まで伸びている領域、またはＡｄ２の場合には４５１から４６６まで伸びている領域を含んでなる部分を改変するのが好ましい。改変のための他の標的領域は、Ｈシート（Ａｄ５ファイバーおよびＡｄ２ファイバーのａａ５２９〜５３６）である。もう一つの代替法は、小シートＥ（ａａ４７９〜４８２Ａｄ５）およびＦ（ａａ４８５〜４８６Ａｄ５）の改変である。上記のように、暴露した領域で１個以上のアミノ酸を置換することによる手続きを行うことができる。これに関して、Ａｄ５ファイバーから誘導され、 − ４４３位のグリシン残基がアスパラギン酸によって置換されており、 − ４４５位のロイシン残基がフェニルアラニンによって置換されており、 − ４５０位のグリシン残基がアスパラギンによって置換されており、 − ４５１位のトレオニン残基がリシンによって置換されており、 − ４５２位のバリン残基がアスパラギンによって置換されており、 − ４５５位のアラニン残基がフェニルアラニンによって置換されており、 − ４５７位のロイシン残基がアラニンまたはリシンによって置換されており、および／または − ４５９位のイソロイシン残基がアラニンによって置換されている実施例が挙げられる。ファイバーの標的設定領域に、幾つかの置換を、特に肘(elbow)を形成する、好ましくはαα型のアミノ酸の水準で導入することもできる(Xia et al.，1994 ，上記引用の第２表を参照されたい)。例えば、Ａｄ５ファイバーを − ４４３位のグリシン残基のアスパラギン酸による、 − ４４４位のセリン残基のリシンによる、および − ４４６位のアラニン残基のトレオニンによる置換、または、 − ４４９位のセリン残基のアスパラギン酸による、 − ４５０位のグリシン残基のリシンによる、 − ４５１位のトレオニン残基のロイシンによる、および − ４５２位のバリン残基のトレオニンによる置換によって改変する２例が挙げられる。勿論、置換アミノ酸は参考として挙げたに過ぎないのであり、任意のアミノ酸が本発明の目的に適当であるということがいえる。しかしながら、三次元構造を急激に変化させないのが好ましい。肘を形成するアミノ酸は、上記のXia et al ．の文献に記載されているような同様な構造を形成する残基で置換するのが好ましい。本発明のファイバーは、欠失によって改変することもできる。除去される領域は、暴露されたドメイン、および特にＣＤループ、Ｄシート、ＤＧループおよび／またはＥおよびＦシートの総てまたは部分を包含することがある。本発明によるＡｄ５ファイバーに関しては、更に詳細には、 − ４５４位のセリンから４６１位のフェニルアラニンまで伸びる領域、 − ４４１位のバリンから４５３位のグルタミンまで伸びる領域、 − ４４１位のバリンから４６１位のフェニルアラニンまで伸びる領域、または − ４７９位のアスパラギンから４８６位のトレオニンまで伸びる領域の欠失が挙げられる。他のシートやループ、例えばＧ、ＨおよびＩシートおよびＨＩおよびＤＧループの置換や欠失から他の突然変異体を生成させることも可能である。有利な態様によれば、改変の少なくとも１つは、ループおよび／またはシートの少なくとも３個の連続的残基の欠失であり、欠失残基は、第一のアデノウイルスによって認識されたものとは異なる細胞レセプターと相互作用することができる第二のアデノウイルスのファイバーから誘導される同等なループおよび／またはシートの残基で置換することができる。第二のアデノウイルスは、任意の起源、すなわちヒトまたは動物のものでよい。これにより、本発明によるファイバーの構造に第二のアデノウイルスの特異性に相当する宿主特異性をしながら、その構造を保持することができる。Xia et al．(1994，上記引用)に示されるように、アデノウイルス２および５型による感染を媒介するさせレセプターは、アデノウイルス３および７型と相互作用するものとは異なっている。従って、上記のものの中で少なくとも３個の連続残基について欠失したＡｄ５またはＡｄ２ファイバーは、Ａｄ３またはＡｄ７ファイバーの同等な領域から誘導される残基によって置換し、Ａｄ５レセプターと結合する能力をＡｄ３またはＡｄ７のさせレセプターに対する新しい特異性を付与することができる。非制限的例としては、Ａｄｒファイバーの残基ＬＡＰＩＳＧＴＶＱＳＡＨＬＩＩＲＦＤ（４４５〜４６２位）のＡｄ３ファイバーの残基ＶＮＴＬＦＫＮＫＮＶＳＩＮＶＥＬＹＦＤによる置換、またはＡｄ５のファイバーの残基ＰＶＴＬＴＩＴＬ（５２９〜５３６位）のＡｄ３ファイバーの残基ＰＬＥＶＴＶＭＬによる置換が挙げられる。本発明は、天然の細胞レセプターへの結合の能力は実質的に減少しているが、トリマー化およびペントン基部の結合を行うことができるアデノウイルスファイバーにも関する。上記のように、天然の細胞レセプターは、クラスＩの主要組織適合性抗原、フィブロネクチン、およびコクサッキーウイルス（ＣＡＲ）の細胞レセプター、または通常はアデノウイルスの感染性を伴うまたはに関与する任意の他の細胞表面決定基からなる群から選択するのが有利である。同様に有利な態様によれば、本発明によるファイバーは、更にリガンドをも含んでなる。本発明の目的のために、リガンドという用語は、天然の細胞レセプターとは異なる細胞表面分子を認識し、好ましくは高親和性で結合することができる任意のものを定義している。この分子は、標的設定に所望な細胞の表面で発現または暴露するこどができる(細胞表面マーカー、レセプター、組織適合性抗原によって提供される抗原性ペプチドなど)。本発明が求める目的によれば、リガンドは抗体、ペプチド、ホルモン、ポリペプチドまたは糖質であることができる。抗体という用語は、特にモノクローナル抗体、抗体断片(Ｆａｂ)、および一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含んでなる。これらの名称および略号は、免疫学の分野で一般に用いられている。本発明の構成の範囲内では、更に具体的には腫瘍細胞、感染細胞、特定の細胞型、または特異的表面マーカーを有する細胞の範疇に標的設定するのが有利であることがある。例えば、標的設定を行う宿主細胞がＨＩＶウイルス(ヒト免疫不全症ウイルス)に感染した細胞であれば、リガンドはフシン(fusin)であるＣＤレセプターに対する、または暴露されたウイルスタンパク質（エンベロープ糖タンパク質）または残基３７〜７２から伸びているＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質の部分に対する抗体の断片であることがある(Fawell et al.，1994，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，91，664-668)。腫瘍細胞に関しては、腫瘍に特異的な抗原を認識するリガンド(例えば、乳癌の場合のＭＵＣ−１、パピローマウイルスＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質の幾つかのエピトープ)、または過剰発現したも herapy，2，660-668)および膵臓、前立腺および胃腫瘍で過剰発現したＧＲＰペプチド（ガストリン放出ペプチド）の過剰発現したＩＬ−２のレセプター）が選択される。Ｔリンパ球に標的設定することが所望な場合には、Ｔ細胞レセプターのリガンドを用いることができる。更に、トランスフェリンは、肝臓スクリーニングの良好な候補である。一般に、本発明に関して用いることができるリガンドは文献に広汎に記載されており、標準的手法によってクローニングすることができる。それらを化学的経路によって合成し、それらを本発明によるファイバーにカップリングすることもできる。これに関して、ガラクトシル残基のカップリングは、アシアロ糖タンパク質レセプターと相互作用するため、肝臓特異性が付与されることになる。しかしながら、好ましい態様は、本発明によるまたは改変の少なくとも１つが少なくとも３個の連続した残基の欠失であるときには欠失した残基の代替としてのファイバーのＣ末端にリガンドを挿入することである。本発明は、本発明によるファイバーをコードするＤＮＡ断片、並びにこのような断片を発現するベクターにも関する。任意の型のベクターを、プラスミドまたはウイルス起源、包括的であるかまたはそうではないに関わらず、この効果に用いることができる。このようなベクターは市販されており、または文献に記載されている。同様に、当業者は、本発明によるＤＮＡ断片の発現に必要な調節要素を適合させることができる。更に、これは、トランスフェクション効率および／またはベクターの安定性を向上させることができる１種類以上の物質と組合わせることができる。これらの物質は、当業者が入手し得る文献に詳細に記載されている(例えば、Felgner et al.，1989，Proc．West．Pharmacol．Soc.，32，115- 121;Hodgson and Solaiman，1996，Nature Biotechnology，14，339-342;Remy e t al.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，647-654)。非制限的例示として、これらは、ポリマー、脂質、特にカチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質、および中性脂質でよい。考えられる組合せは、カチオン性脂質（ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳなど）および中性脂質と組合わせたベクターである。本発明は、官能性の固有ファイバーを欠いており、表面に本発明によるファイバーを含んでなるアデノウイルスにも関する。後者は、アデノウイルスゲノムによって発現することができ、または以下に定義されるような相補細胞系によってイン・トランスで(in trans)提供することができる。更に、これは、上記に定義されたようなリガンドを含んでなることができる。好ましくは、このようなアデノウイルスのその天然の細胞レセプターへの結合の特異性は、それが改変ファイバーを有するため、著しく減少し、あるいは更に好ましくはなくなる。天然の特異性の喪失は、標識ウイルス（例えば、Roelvink e t al.，1996，J．Virol.，70，7614-7621の手法に従って³Ｈ−チミジンで標識した）の存在下で行った細胞付着の研究によって、または許容性であるかまたはリガンドによって標的設定された表面分子を発現する細胞の感染性の研究によって評価することができる(下記の実施例を参照されたい)。リガンドは、本発明によるアデノウイルスに化学的にカップリングすることができる。しかしながら、リガンドをコードする配列が、アデノウイルスゲノム、特に読取り枠を保存するため好ましくは一致して本発明による改変ファイバーをコードする配列に挿入されている突然変異体が好ましい。挿入は、任意の部位で起こることができる。しかしながら、挿入の好ましい部位は、Ｃ末端における停止コドンの上流または欠失した残基の所定位置である。リガンドの配列をアデノウイルス配列、特にヘキソンまたはペントンのような別のキャプシドタンパク質をコードする配列に導入しようとすることも可能である。有利なことには、本発明によるアデノウイルスは、組換え体でありかつ複製欠損(replication-defective)、すなわち宿主細胞中で自律的に複製を行うことができないものである。この欠陥は、１個以上の本質的なウイルス遺伝子、特にＥ１領域の総てまたは部分の突然変異または欠失によって得られる。Ｅ３領域における欠失を、クローニング容量を増加する目的で考えることができる。しかしながら、ｇｐ１９ｋタンパク質をコードする配列を保存して(Gooding and Wood，1 990，Critical Reviews of Immunology，10，53-71)、宿主の免疫反応を調節することが有利であることがある。勿論、本発明によるアデノウイルスのゲノムは、他の領域、特にＥ２、Ｅ４、および／またはＬ１〜Ｌ５領域に影響を与える他の欠失または突然変異を含んでなることもある(例えば、Ｅ２のＤＢＰ遺伝子の熱感受性突然変異を記載している国際出願第ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびEn singer et al.，1972，J．Virol.，10，328-339)。好ましい態様によれば、本発明によるアデノウイルスは組換え体であり、宿主細胞でのそれらの発現に必要な要素の制御下に置かれた目的とする１個以上の遺伝子を含んでなる。この遺伝子は、任意の起源の、ゲノム性のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）またはハイブリッド（１個以上のイントロンを欠いているミニジーン）であることができる。これは、通常の分子生物学の手法によって、または化学合成によって得ることができる。これは、アンチセンスＲＮＡ、リボチームまたはｍＲＮＡをコードすることができ、これは次に目的とするポリペプチドに翻訳される。後者は、細胞質性、膜性であることができ、または宿主細胞から分泌することができる。更に、これは、天然に見いだされるポリペプチド、様々な起源の配列の融合から得られるキメラポリペプチド、または改良されたおよび／または改変された生物学的特性を有する固有配列に対して突然変異したポリペプチドの総てまたは部分であることができる。本発明に関して、下記のポリペプチド − サイトカインまたはリンホカイン(α−、β−およびγ−インターフェロン、インターロイキン、および特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ− １２、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど)、 − 細胞または核レセプター、特に病原性生物(ウイルス、細菌または寄生生物) 、好ましくはＨＩＶウイルスまたはそれらのリガンド（ｆａｓリガンド）によって認識されるレセプター、 − 遺伝病に関与するタンパク質（ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ジストロフィンまたはミニジストロフィン、インシュリン、ＣＦＴＲタンパク質(嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質)、成長ホルモン(ｈＧＨ)、 − 酵素(ウレアーゼ、レニン、トロンビンなど)、 − 酵素阻害薬(α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、ウイルス性プロテアーゼ阻害薬など)、 − 腫瘍または癌の開始または進行を少なくとも部分的に抑制することができる抗腫瘍効果を有するポリペプチド(細胞分裂または形質導入シグナルに作用する阻害薬、腫瘍抑制遺伝子の発現の生成物、例えばｐ５３またはＲｂ、免疫系を刺激するタンパク質など)、 − クラスＩまたはＩＩの主要組織適合性複合体のタンパク質、または相当する遺伝子の発現に作用する調節タンパク質、 − ウイルス、細菌または寄生生物の感染またはその発生を阻害することができるポリペプチド(免疫原性を有する抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、抗体、競合などにより固有タンパク質の作用を阻害することができるトランスドミナント変異体(transdominant variants))、 − 毒素(単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ(ＨＳＶ−１−ＴＫ)、リシン、コレラ毒素、ジフテリア毒素など)、または免疫毒素、 − マーカー(β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど)、 − アポトーシスに効果を有するポリペプチド(アポトーシスの誘導物質：Ｂａｘなど、アポトーシスの誘導物質Ｂｃｌ２、Ｂｃｌｘ)、細胞分裂抑制因子(ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂなど)、アポリポタンパク質(ａｐｏＥなど)、ＳＯＤ、カタラーゼ、酸化窒素シンターゼ(ＮＯＳ)、および − 成長因子(ＦＧＦ(繊維芽細胞成長因子)、ＶＥＧＦ(血管内皮細胞増殖因子) など) をコードする遺伝子を用いるのが有利であることがある。このリストは制限的なものではなく、他の遺伝子を用いることもできる点に留意すべきである。更に、本発明によるアデノウイルスは、更に、感染細胞を選択または同定することができる選択可能な遺伝子も含んでなることができる。抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する遺伝子ｎｅｏ(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)、ｄｈｆｒ(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)、ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)、ｐａｃ（プロマイシンアセチルートランスフェラーゼ）またはｇｐｔ（キサンチングアニンホスホリボキシルトランスフェラーゼ）を挙げることができる。一般に、選択可能な遺伝子は、当業者に知られている。宿主細胞中で目的とする遺伝子の発現に必要な要素は、ＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を行うことができる総ての要素を意味すると理解される。これらの中で、プロモーターは特に重要である。本発明に関して、これは真核性またはウイルス起源の任意の遺伝子から誘導することができ、本質的または調節可能であることができる。更に、これを改変してプロモーター活性を改良し、転写抑制領域を抑制し、本質的プロモーターを調節可能またはその逆にし、制限部位などに導入することかできる。あるいは、それは、発現を行う遺伝子の天然のプロモーターであってもよい。例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ウイルスプロモーター、ＨＳＶ−１ウイルスＴＫ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０ウイルス（サルウイルス４０）の初期プロモーター、アデノウイルスＭＬＰプロモーターまたはＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）のネズミまたはヒト遺伝子の真核性プロモーター、ＭＴ(メタロチオネイン)、α１−アンチトリプシン、およびアルブミン( 肝臓特異的)、免疫グロブリン(肝臓特異的)、免疫グロブリン（リンパ球特異的）を挙げることができる。腫瘍特異的プロモーターを用いることもできる（α− フェトタンパク質ＡＦＰ，Ido et al.，1995，Cancer Res.，55，3105-3109;ＭＵＣ−１；ＰＳＡ(前立腺特異的抗原、Lee et al.，1996，J．Biol．Chem.，271 ，4561-4568;および内皮細胞に特異的なｆｌｔ１，Morishita et al.，1995，J ． Biol．Chem.，270，27948-27953)。勿論、本発明で用いる目的の遺伝子は、更に発現に必要な追加の要素(イントロン配列、シグナル配列、核局在化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳ型の翻訳の開始のための部位など)、または宿主細胞にそれを保持するための要素を含んでなる。このような要素は、当業者に知られている。本発明は、本発明によるアデノウイルスの調製法であって、 − 上記アデノウイルスのゲノムを、適当な細胞系にトランスフェクションし、 − 上記のトランスフェクションした細胞系を適当な条件下で培養して、上記アデノウイルスを生成させ、 − 上記アデノウイルスを、上記のトランスフェクションした細胞系を培養物から回収し、場合によっては、上記のアデノウイルスを実質的に精製することを特徴とする、方法にも関する。細胞系の選択は、本発明によるアデノウイルスにおける欠陥機能によって変化し、（複数の）欠陥機能をイン・トランスで提供することができる相補系が用いられる。２９３の系が、Ｅ１機能を補足するのに適している(Graham et al.，19 77，J．Gen．Virol.，36，59-72)。二重欠陥Ｅ１およびＥ２またはＥ４については、仏国特許出願第９６０４４１３号明細書に記載されている系の中の一つを用いることができる。任意の宿主細胞中の本発明による欠陥アデノウイルスを補足するのにヘルパーウイルスを、または要素同士が互いに変化する相補細胞とヘルパーウイルスを用いる混合系を用いることもできる。欠陥アデノウイルスの増殖手段は、当業者に知られており、例えばGraham and Prevec(1991，分子生物学の方法，第７巻，190−128頁，E.J．Murey監修，The Human Press Inc.)を参照することができる。アデノウイルスゲノムは、連結反応によってまたは相同的組換えによって大腸菌(E．coli)でイン・ビトロで再構成するのが好ましい(例えば、仏国特許出願第９４１４４７０号明細書を参照されたい)。精製法は、技術の状態に記載されている。密度勾配遠心分離法が挙げられる。本発明は、ゲノムに組込まれた形態でまたはエピソームの形態で、発現を行う要素の制御下に置いた本発明によるファイバーをコードするＤＮＡ断片を含んでなる細胞系にも関する。この系は、更に、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５領域によってコードされたものから選択される１個以上の機能を欠いているアデノウイルスを補足することができる。これは、２９３の系から誘導するのが好ましい。このような系は、ゲノムがファイバーをコードし（非機能的ファイバーを生成）する配列の総てまたは部分を欠いているアデノウイルスの調製に用いることができる。本発明の主題は、相当する方法であって、 − 上記アデノウイルスのゲノムを、本発明による細胞系にトランスフェクションし、 − 上記のトランスフェクションした細胞系を適当な条件下で培養して、上記のアデノウイルスを生成させ、 − 上記のアデノウイルスを上記のトランスフェクションした細胞系の培養物から回収し、場合によっては上記アデノウイルスを実質的に精製することを特徴とする、方法でもある。本発明は、本発明によるアデノウイルスに感染した、または本発明による方法によって得ることができる宿主細胞も包含する。これは、哺乳類細胞、特にヒト細胞であるのが有利である。これは、一次または腫瘍細胞であることができ、例えば造血起源(全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージなど) 、筋肉(衛星細胞、単球、筋原細胞、平滑筋細胞)、心臓，鼻、肺、気管、肝臓、上皮または繊維芽細胞起源のような任意の起源のものであることができる。本発明の主題は、医薬組成物であって、治療または予防薬として、本発明によるまたは本発明による方法によって得ることができる宿主細胞またはアデノウイルスを、薬学上許容可能なキャリヤーと組合わせて含んでなる組成物でもある。本発明による組成物は、特に遺伝病(血友病、嚢胞性繊維症、糖尿病、デュシェンヌ型ミオパシーまたはベッカー型ミオパシーなど)、癌、例えば癌遺伝子またはウイルスによって誘導される癌、ウイルス疾患、例えばＢまたはＣ型肝炎、およびＡＩＤＳ(ＨＩＶ感染によって起きる後天性免疫不全症候群)、再発性ウイルス疾患、例えばヘルペスウイルスによって引起されるウイルス感染症および再狭窄などの循環器疾患のような疾患の予防または治療を目的とする。本発明による医薬組成物は、通常の方法で製造することができる。特に、治療または予防薬の治療上有効量を、希釈剤のようなキャリヤーと組合わせる。本発明による組成物は、局所、全身またはエアゾール経路によって、特に胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、肺内、鼻内または気管内経路によって投与することができる。投与は、単一投与量で行うことも、または一定時間感覚の後１回または数回繰返すこともできる。適当な投与経路および適当な投与量は、様々なパラメーター、例えば治療を行う個人または患者、または輸送を行う目的とする（複数の）遺伝子によって変化する。特に、本発明によるウイルス粒子は、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ(プラーク形成単位)、有利には１０⁵〜１０¹³ｐｆｕ、好ましくは１０⁶〜１０¹²ｐｆｕの間の投与量の形態で処方することができる。処方物は、希釈剤、アジュバント、薬学上許容可能な賦形剤、並びに安定剤、防腐剤、および／または可溶化剤を含むこともできる。食塩水、非水溶液または等張溶液での処方物が、特に注射可能な投与に適している。これは、液体または乾燥形態（例えば、凍結乾燥物など）または薬学分野で普通に用いられる任意の他の生薬形態で提供することができる。最後に、本発明は、本発明によるアデノウイルスまたは宿主細胞、または本発明の方法によって得られるアデノウイルスを治療または予防的に使用して、ヒトまたは動物体遺伝子治療によって治療するための医薬を製造することに関する。第一の可能性によれば、医薬は、直接イン・ビボで（例えば、静脈内注射により、接近可能な腫瘍に、エアゾールにより肺などに）投与することができる。エクス・ビボ法であって、細胞を患者から集め(骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋細胞など)、従来技術の手法によりイン・ビトロでそれらをトランスフェクションまたは感染させ、それらを患者に再投与することからなる方法を採用することもできる。本発明は、治療法であって、本発明によるアデノウイルスまたは宿主細胞の治療上有効量を、治療を必要とする患者に投与することを特徴とする方法にも敷衍される。実施例下記の実施例は、本発明の態様だけを例示するものである。下記の構築物は、Maniatis et al.，(1989，実験室便覧(Laboratory Manual) ，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク)に詳説されている一般的遺伝子工学および分子クローニング法によって、または市販のキットを用いるときには製造業者の推薦に従って調製する。細菌性プラスミドを用いるクローニング段階は、E．coli 5K(Hubacek and Glo ver，1970，J．Mol．Biol.，50，111-127)またはBJ 5183(Hanahan，1983，J．Mo l．Biol.，166，557-580)菌株で好ましく行われる。この後者の菌株は、相同組換え段階に好ましく用いられる。菌株NM522(Stratagene)は、Ｍ１３ファージベクターの増殖に適当である。ＰＣＲ増幅法は、当業者に知られている(例えば、ＰＣＲプロトコール−方法および応用の手引き(PCR Protocols-A guide to meth ods and application)，1990，Innis，Gelfand，SninskyおよびWhite監修，Acad emic Press Incを参照されたい)。制限部位の修復に関しては、用いた手法は、突出５’末端をE．coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ）の大きな断片で充填することにある。Ａｄ５ヌクレオチド配列は、リファレンス番号Ｍ７３２６０Gene bankデーターバンクで用いられているものである。細胞生物学に関しては、細胞は当業者に周知の標準的方法によってトランスフェクションされる。リン酸カルシウム法(Maniatis et al.,上記引用)が挙げられるが、任意の他のプロトコール、例えばＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔、浸透ショックに基づく方法，マイクロインジェクションまたはカチオン性脂質の使用に基づく方法を用いることもできる。培養条件については、通常のものである。下記の実施例において、ヒト細胞系２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）およびネズミＳｗｉｓｓ３Ｔ３(ＡＴＣＣＣＣＬ９２)、ＮＲ６(Wells et al.,19 90,Science,247:962-964)、ＮＲ６−ｈＥＧＦR(Schneider et al.,1986,Proc.Na tl.Acad.Sci.USA,83,333-336)、ＤａｕｄｉＨＬＡ−（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）およびＤａｕｄｉＨＬＡ＋(Quillet et al.,1988,J.Immunol.,141,17-20)が用いられる。Ｄａｕｄｉ系は、ブルキット型リンパ腫から得られ、本来β２−ミクログロブリンの発現に欠陥があり、従ってその表面にはクラスＩＨＬＡ分子を持たない(ＤａｕｄｉＨＬＡ−)。Ｄａｕｄｉから誘導された細胞系Ｅ８．１は、β２−ミクログロブリンをコードする遺伝子のトランスフェクションによって生成し、その表面にクラスＩＨＬＡ分子の発現を回復した(Daudi-HLA+;Quil let et al.,1988,J.Immunol.,141,17-20)。他の細胞系を用いることもできると考えられる。実施例１：ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）レセプターを発現する細胞へ宿主向性を示すアデノウイルスの構築Ａ．ＧＲＰリガンド（ＧＲＰファイバー）をコードする配列の挿入プラスミドｐＴＧ６５９３を、ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片（ヌクレオチド（ｎｔ）３００４９〜３３０９３）の形態でのＡｄ５ファイバーをコードする完全遺伝子を導入することによってｐポリＩＩ(Lathe et al.,1987,Gene,57,193-201) から誘導する。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片（ｎｔ３１９９４−３３０９３）を単離し、これらの同じ酵素で消化したＭ１３ＴＧ１３０(Kieny et al.,1983 ,Gene,26,91-99)にクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５２６を得る。後者を、オリゴヌクレオチドｏＴＧ７０００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）により位置指定突然変異誘発を行い(Sculptorキット，イン・ビトロ突然変異誘発，Amersham)、配列ＰＳＡＳＡＳＡＳＡＰＧＳを有する１２アミノ酸のスペーサーアームをコードするアダプターを導入する。このようにして得られた突然変異ベクターＭ１３ＴＧ６５２７を、第二の突然変異誘発に付し、ＧＲＰペプチドの１０個の残基をコードする配列を導入することができる(ＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ；Michael et al.,1995,G ene Ther.,2,660-668)。オリゴヌクレオチドｏＴＧ７００１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を、この効果に用いる。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片を変異したファージＭ１３ＴＧ６５２８から単離し、相同組換え法(Chartier et al.,1996,J.Vi rol.,70,4805-4810)によってｎｔ２７０８１〜ｎｔ３５９３５まで伸びるＡｄ５アデノウイルスゲノム断片を有するプラスミドｐＴＧ６５９０に導入して、ＭｕｎＩ（ｎｔ３２８２５）で線形化する。ＳｐｅＩ−ＳｃａＩ断片（スペーサーアームとＧＲＰペプチドの導入によって改変されているＡｄ５ゲノムのｎｔ２７０８２〜３５９３５を有する）をｐＴＧ８５９９という名称の先行ベクターから単離した後、これらの同じ酵素であらかじめ消化したｐＴＧ６５９１の同等な断片に交換する。例えば、ｐＴＧ６５９１は２１５６２〜３５９３５位の野生型アデノウイルス配列を含んでなる。ｐＴＧ４６００が得られ、これからＢｓｔＥＩＩ断片（ｎｔ２４８４３〜３５２３３）を単離する。Ａｄ５ゲノム（国際出願ＷＯ９６／１７０７０号明細書に更に詳細に記載されている）を含んでなるプラスミドｐＴＧ３６０２で相同組換えを行った後、ベクターｐＴＧ４６０１が生成する。ＬａｃＺ遺伝子を発現させるカセットを、ＣｌａＩで線形化したプラスミドｐＴＧ４６０１と、Ａｄ２ＭＬＰプロモーターとＳＶ４０ウイルスポリアデニル化シグナルとの制御下でβ−ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺ遺伝子を含んでなる断片ＢｓｒＧＩ−ＰｓｔＩとの間の相同組換えによってＥ１アデノウイルス領域の代わりに導入する。この断片を、ウイルスゲノムＤＮＡ（ｎｔ１〜６２４１）であって、Ｅ１領域（ｎｔ４５９〜３３２８）がＬａｃＺ発現カセットで置換されているものの５’末端を含むベクターｐＴＧ８５２６から単離する。その向性は、当業者の能力の範囲内のものである。最終ベクターをｐＴＧ４６２８と呼ぶ。相当するウイルスＡｄＴＧ４６０１およびＡｄｔｇ４６２８を、ＰａｃＩ消化によるプラスミド配列から放出されたアデノウイルス断片を２９３系にトランスフェクションすることによって得る。例えば、ＡｄＴＧ４６０１は、ファイバーの遺伝子が３’末端にスペーサーアームと、続いてＧＲＰペプチドを含んでなる完全Ａｄ５ゲノムを有する。組換えウイルスＡｄＴＧ４６２８は、更に、ＭＬＰアデノウイルスプロモーターの制御下でＬａｃＺレポーター遺伝子の発現用カセットも有する。Ｂ．ＧＲＰファイバーを有するウイルスの向性の検討アデノウイルスファイバーにＧＲＰペプチドが存在することにより、細胞表面でＧＲＰレセプターを発現する細胞を標的設定することができる。後者をコードするメッセンジャーの発現を、ノーザンブロット法によって２９３細胞およびネズミＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞(Zachary et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82 ,7616-7620)で検討する。プローブとして、通常の方法によって³²Ｐ同位体で標識されているＧＲＰレセプターをコードする配列に相補的な２個のＤＮＡ断片の混合物を用いる。例えば、断片は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０７７６（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）およびｏＴＧ１０７８１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）により総細胞ＲＮＡから逆ＰＣＲによって生成する(Battey et al.,1991,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,88,395-399;Corjay et al.,1991,J.Biol.Chem.,266,18771-18779) 。検出されるｍＲＮＡの強度は、２９３細胞でよりもＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞の場合にずっと高く、ネズミ細胞系によるＧＲＰレセプターの過剰発現を示している。競合実験は、２種類の細胞で行う。競合体は、アデノウイルス細胞−レセプター結合特性が示されているE.coliで生成したＡｄ５ファイバーの頭からなっている(Henry et al.,1994,J.Virol.,68,5239-5246)。単層細胞を予め、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足したＤＭＥＭ培地(Gibco BRL)中にＰＢＳまたは組換えＡｄ５の頭の増加濃度（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下で３０分間インキュベーションする。次に、ファイバーがＧＲＰペプチドを含むウイルスＡｄＴＧ４６２８を、０．００１感染単位／細胞の感染多重度で、３７℃で２４時間加える。ファイバーに固有の遺伝子を有する組換えウイルスＡｄＬａｃZ(Stratford- Perricaudet et al.,1992,J.Clin.Invest.,90,626-630)を、コントロールとして、同一実験条件に基づいて用いる。次に、細胞を固定し、ＬａｃＺ遺伝子の発現を評価する(Sanes et al.,1986,EMBO J.,5,3133-3142)。青色細胞の数は、ウイルス感染の効率を表している。競争による阻害の結果、競合物（ＰＢＳ）を含まないコントロールと比較して着色細胞の数は減少する。濃度が１００μｇ／ｍｌの組換えＡｄ５の頭を添加すると、２９３細胞のＡｄＬａｃＺおよびＡｄＴＧ４６２８ウイルスによる感染が著しく阻害される(阻害水準９５および９８％)。これは、競合物が存在すると、アデノウイルスファイバーとその天然の細胞レセプターとの相互作用が妨げられることを示している。一方、２個のウイルスは、Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞に対しては異なる挙動を示す。１００μｇ／ｍｌの競合物の存在下でのＡｄＴＧ４６２８の感染は部分的にしか阻害されないが、同じ実験条件下では、固有のファイバーを有するＡｄＬａｃＺウイルスの感染は、完全に阻害される。これらの結果は、Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞のＡｄＴＧ４６２８による感染は、独立したレセプター、恐らくはこれらの細胞が過剰発現するＧＲＰレセプターによって部分的に媒介されることを示している。要するに、ＧＲＰリガンドをファイバーのＣ末端に付加すると、ファイバーー天然細胞レセプター相互作用とは独立してＧＲＰレセプターを発現する細胞の感染が促進されるのである。実施例２：ＥＧＦ（表皮成長因子）レセプターを発現する細胞への宿主向性を示すアデノウイルスの構築この実施例では、Ｃ末端にＥＧＦ配列を有するファイバーを記載する。そのために、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）およびｏＴＧ１１０６６（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）を用いて、プラスミドＭ１３ＴＧ６５２７からのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ断片を増幅する。オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６７（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）およびｏＴＧ１１０６６（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）により、Ｍ１３ＴＧ６５２７からＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片( 停止コドンからｎｔ３３０９３まで)を生成することができる。ＡＴＣＣ（＃５９９５７）から得られたＥＧＦに相補的なＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１０６９（(ＳＥＱＩＤＮＯ：１０)およびｏＴＧ１１０７０（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）によりＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片の形態で増幅する。次に、適当な酵素で消化した３個の断片を再連結し、ファイバーのＣ末端に融合したＥＧＦを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片を得る。実施例１に記載したものと同一の相同組換え法を適用して、ゲノムに関するこの断片を置換する。しかしながら、通常の突然変異誘発法によってユニークＢｓｔＢＩ部位を標的領域に導入することによってクローニング段階を簡略化することができる。ｐＴＧ４６００９およびｐＴＧ４２１３は、ＬａｃＺを用いて得られる。ＢｓｔＢＩで線形化したｐＴＧ４６０９と先行するＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片との間の相同組換えにより、野生型Ｅ１領域を有するプラスミドｐＴＧ４２２５を生成する。ＬａｃＺ発現カセットｐＴＧ４２２６を有するその同等なものは、ＢｓｔＢＩで消化したｐＴＧ４２１３を用いる相同組換えによって得られる。ウイルスＡｄＴＧ４２２５およびＡｄＴＧ４２２６は、例えばＥＧＦレセプターを過剰発現する適当な細胞系のトランスフェクションによって通常の方法で生成することができる。これらのウイルスによる感染の特異性を試験するため、ＮＲ６ネズミ繊維芽腫細胞と、ヒトＥＧＦレセプターを発現するＮＲ６−ｈＥＧＦＲ細胞を用いることができる。組換えＡｄ５の頭またはＥＧＦとの競合により、天然の細胞レセプター、およびウイルスによる感染を媒介するＥＧＦの関与を評価することができる。実施例３：ファイバーの頭の改変による天然の細胞レセプターへの結合の除去天然の細胞レセプターとの相互作用に関与したアデノウイルスファイバーの領域の突然変異を行い、ファイバーがその天然のレセプターに結合する能力を除去し、リガンドの付加により、相当するアデノウイルスの向性を改変することができる。残基４４３から４６２まで、５２９から５３６まで伸びている領域をコードするＡｄ５ファイバーの配列について、様々な突然変異を行った。Ｄシートの欠失では、突然変異誘発オリゴヌクレオチドｏＴＧ７４１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を用い、ＣＤループの欠失では、オリゴヌクレオチドｏＴＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）を用いる。オリゴヌクレオチドｏＴＧＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）は、それに関する限り、ＣＤループおよびＤシートを欠失することができる。オリゴヌクレオチドＯＴＧ７４１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）は、Ｈシートを欠失することができる。これらのオリゴヌクレオチドは総て、ＢａｍＨＩ部位を含み、これにより突然変異体を容易に検出しかつリガンドをコードする配列、例えばＥＧＦペプチドを挿入することができる。もう一つの系列の改変は、Ａｄ３ファイバーから誘導した同等な配列でこれらの欠失領域を置換することからなる(Ｄ＋ＣＤ５〜Ｄ＋ＣＤ３は、Ａｄ５ファイバーのＣＤおよびＤ領域がＡｄ３と同等なものによって置換されていることを意味する)。実際に、多くのデーターは、Ａｄ５およびＡｄ３は同一レセプターに結合しないので、このような置換は、Ａｄ５レセプターによって媒介される感染をなくし、Ａｄ３レセプターを有する細胞を標的設定すべきである。Ａｄ５ＣＤループのＡｄ３のものによる置換では、ｏＴＧ１１１３５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）が用いられ、Ａｄ５ファイバーのＤシートのＡｄ３ファイバーのシートによる置換は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０３５０（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）によって行われ、Ａｄ５のＤシートおよびＣＤループのＡｄ３のものによる置換は、ｏＴＧ１１１３６（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）による先行突然変異体について行われる。Ｈシートの置換は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０３５２( ＳＥＱＩＤＮＯ：３９)によって行われる。アデノウイルスの頭のこの標的領域も、一連の点突然変異 − ααＧＳＬＡ肘からＤＫＬＴ肘までの置換：ｏＴＧＣ(ＳＥＱＩＤＮＯ：１８)、 − ααＳＧＴＶ肘からＤＫＬＴ肘までの置換：ｏＴＧＤ(ＳＥＱＩＤＮＯ：１９)、 − Ｇ４４３からＤまで(Ｇ４４３Ｄ)：ｏＴＧＥ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２０)、 − Ｌ４４５からＦまで(Ｌ４４５Ｆ)：ｏＴＧＦ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２１)、 − Ｇ４５０からＮまで(Ｇ４５０Ｎ)：ｏＴＧＧ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２２)、 − Ｔ４５１からＫまで(Ｔ４５１Ｋ)：ｏＴＧＨ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２３)、 − Ｖ４５２からＮまで(Ｖ４２５Ｎ)：ｏＴＧＩ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２４)、 − Ａ４５５からＦまで(Ａ４５５Ｆ)：ｏＴＧＪ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２５)、 − Ｌ４５７からＫまで(Ｌ４５７Ｋ)：ｏＴＧＫ(ＳＥＱＩＤＮＯ：２６)、 − １４５９からＡまで(Ｉ４５９Ａ)：ｏＴＧＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）によっても改変された。Ｉに対するｏＴＧＥは、Ａｄ５とＡｄ３との間で非保存性であるアミノ酸上でアデノウイルスファイバーのＣＤループに突然変異を導入し、ｏＴＧＪからＫまでは、構造を安定化する水素結合に関与しないＤシートのアミノ酸に関するものである。突然変異誘発は、ベクターＭ１３ＴＧ６５２６またはＭ１３ＴＧ６５２８について行うことができる。第一のものは、野生のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片を有し、第二のものはＧＲＰ配列の挿入によって改変した同じ断片を有する。アデノウイルスゲノムを有するプラスミドは、プラスミドｐＴＧ４６０９（野生型Ｅ１）およびｐＴＧ４２１３（Ｅ１領域の代わりにＬａｃＺ）について上記したように再構成することができる。ウイルスは、２９３個の細胞、または関連リガンドに結合するレセプターを過剰発現する細胞のトランスフェクションによって生成される。このような細胞は、相当する相補的ＤＮＡのトランスフェクションによって生成することができる。アデノウイルス、例えばＤａｕｄｉ系（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）の天然の細胞レセプターを天然では発現しない細胞を用いるのが好ましい。各種の突然変異体の成長可能性を、細胞２９３および２９３−Ｆｂ＋（野生型Ａｄ５ファイバーを発現するためベクターでトランスフェクションした２９３個の細胞）のトランスフェクションによって評価する。しかしながら、トランスフェクション効率は、ＧＲＰペプチドをそのＣ末端に組込んだ野生型ファイバー( ＡｄＦｂＧＲＰ)を有するアデノウイルスに関しても、実験毎に変動する。結果を標準化するため、２９３−Ｆｂ＋細胞のトランスフェクションの後に得られたプラークをこの同一系で最初に増幅し、生成したウイルスを滴定して、この段階で、それらは野生型ファイバーまたは突然変異ファイバーまたは両方の型を有する。次に、２９３個の細胞を低感染多重度でこれらのウイルスで感染させ、細胞の約１０％しか感染しないようにすることができ(約０.２感染単位／細胞のＭＯＩ)、ウイルス感染の程度を、ウイルスＤＮＡの蓄積およびウイルス力価を測定することによって感染から７日目に測定する。感染の増殖は突然変異したファイバーによって変化するが、有利な突然変異体は、増殖性感染を生じないものであり、突然変異が天然レセプターに対する結合を変化させることを示している。突然変異したファイバーを有するアデノウイルスの増殖能を、野生型アデノウイルスおよびＡｄＦｂＧＲＰの増殖能と比較する。結果は、野生型ファイバーの末端にＧＲＰペプチドを挿入すると、野生型Ａｄと比較して相当するウイルスの成長を若干減少させるが、増殖因子は１０００の程度である。突然変異Ｖ４５２Ｎ、Ｄ＋ＣＤ５からＤ＋ＣＤ３まで、およびＬ４４５Ｆは、アデノウイルスの天然の細胞レセプターについての突然変異ファイバーの頭の親和性を著しく減少させる。突然変異ΔＤ(Ａｄ５ファイバーのＤシートの欠失)、ΔＣＤ＋Ｄ(ＣＤループおよびＤシートの欠失)、ＣＤ５からＣＤ３まで(Ａｄ５のＣＤループの、Ａｄ３からの同等なものでの置換)、Ｇ４４３Ｄ、Ａ４５５Ｆ、Ｌ４５７ＫおよびＩ４５９Ａは、２９３個の細胞（増殖因子１未満）中の相当するウイルスの増殖はなくなる。次に、突然変異体ウイルスがＧＲＰレセプターによって標的細胞中に浸透する能力を立証する。有利な突然変異体は、有意な増殖因子（１を上回る）を示すものである。これに関して、ＭＨＣ−ＩおよびＧＲＰレセプターを高水準で発現する２９３−ＧＲＰＲと呼ばれる系を用いることができる。これは、２９３個の細胞をＧＲＰレセプターに対するｃＤＮＡを有する真核性発現プラスミドでトランスフェクションすることによって生成される(Corjay et al.,1991,J.Biol.Chem. ,266,18771-18779)。発現カセットは、初期ＣＭＶプロモーター(Boshart et al. ,1985,Cell,41,521)、β−グロブリン遺伝子をスプライシングする配列、ＧＲＰレセプターをコードするｃＤＮＡ、およびβ−グロブリン遺伝子のポリＡ配列からなる。形質転換体の選択は、ヒューグロマイシン（３５０μｇ／ｍｌ）の存在下で行われ、５０個のクローンを選択し、増幅し、ノーザン法によってレセプターをコードするｍＲＮＡの発現について試験する。最も増殖性のクローンを集めて、２９３−ＧＲＰＲと呼ぶ。タンパク質の発現は、ビオチンおよびアビジン− ＦＩＴＣと接合したＧＲＰペプチドを用いてＦＡＣＳを行った後、蛍光による検出によってによってチェックした。実施例４：ファイバーの上記改変の一つと組合わせたファイバーを除くキャプシドタンパク質へのリガンドの挿入この実施例では、ＥＧＦリガンドのヘキソンキャプシドタンパク質への挿入を説明する。当然のことながら、相当するアデノウイルスは天然の細胞レセプターへの付着の能力を喪失しているのが好ましい。そのゲノムとしては、例えば改変したファイバー遺伝子（実施例３）が挙げられ、または少なくともファイバーの配列の一部を欠いていることがある。輸送プラスミドは、ヘキソン（ｎｔ１８８４２〜２１７００）をコードするＡｄ５ゲノムの領域を包含する相同組換えのために構築する。Ａｄ５ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片（ｎｔ１８８３６〜２４８１６）をこれらの同一の酵素で消化したｐＢＳＫ＋(Stratagene)にクローニングし、プラスミドｐＴＧ４２２４を得る。ＥＧＦペプチドをコードする配列を、ＰＣＲによるキメラ断片を作成することによってヘキソンの超可変Ｌ１ループに導入する：ヘキソン（ｎｔ１９０４３〜１９６４７）−ＸｂａＩ−ＥＧＦ−ＢｓｒＧＩ−ヘキソン(ｎｔ１９６９９〜２０３１２)。ｎｔ１９０４３〜１９６４７の断片を、プラスミドｐＴＧ３６０２からオリゴヌクレオチドｏＴＧ１１１０２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）およびｏＴＧ１１１０３(ＳＥＱＩＤＮＯ：２９)を用いてＰＣＲによって得る。ｎｔ１９６９９〜２０３１２の断片を、同一ＤＮＡから，オリゴヌクレオチドｏＴＧ１１１０４（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）およびｏＴＧ１１１０５（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）を用いて増幅する。ＥＧＦを、ｃＤＮＡからオリゴヌクレオチドｏＴＧ１１１０６（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）およびｏＴＧ１１１０７（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）を用いてクローニングし、一致したＥＧＦのコード配列をヘキソンで置換することができるようにする。ＰＣＲ生成物を適当な酵素で消化した後、再連結する。次に、キメラ断片を、ＮｄｅＩ（ｎｔ１９５４９）で線形化したプラスミドｐＴＧ４２２４に相同組換えによって挿入して、ｐＴＧ４２２９を得ることができる。改変ヘキソンをコードする配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ消化を行い、それらのゲノムに関して相同組換えによって置換することができる。ＳｇｆＩで線形化したベクターｐＴＧ３６０２、ｐＴＧ４６０７、ｐＴＧ４６２９、またはファイバー配列が欠失したアデノウイルスゲノムを有する（例えば、以下に記載するｐＴＧ４６０７）または実施例３による改変ファイバーを発現するベクターを用いることができる。機能的な固有のファイバーを生成することができないアデノウイルスゲノムは、イニシエーターコドンに影響するが、他のアデノウイルスＯＲＦまで伸びない欠失によって得られる。この方法は、下記の方法で行われ、欠失の５’のアデノウイルス断片（ｎｔ３０５６４〜３１０４１）を、プライマーｏＴＧ７１７１およびｏＴＧ７２７５（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４および３５）を用いるＰＣＲによって増幅する。３’の断片の（ｎｔ３１１２９〜３３０９９）の増幅には、プライマーｏＴＧ７２７６とｏＴＧ７０４９（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６および３７）を用いる。ＰＣＲ断片をＸｈｏＩで消化して、連結した後、ＮｄｅＩで線形化したベクターｐＴＧ６５９１に相同組換えによって導入し、ｐＴＧ４６０２を得る。次いで、後者から単離したＢｓｔＥＩＩＩ断片に、ＳｐｅＩで消化したベクターｐＴＧ３６０２で相同組換えを施す。ベクターｐＴＧ４６２９はｐＴＧ４６０７と同等であるが、Ｅ１の代わりに更にＬａｃＺ発現カセットを有する。相当するウイルスは、２９３または２９３−Ｆｂ＋細胞またはＥＧＦレセプターを過剰発現する細胞のトランスフェクションの後に得ることができる。感染の特異性の研究は、ＥＧＦを競合体として用いて上記した方法で行うことができる。実施例５：ＥおよびＦシートを欠失したファイバーの突然変異体の構築Ａｄ５ファイバーの頭のドメインのＥＦシートの欠失突然変異体も、生成した。プラスミドｐＴＧ６５９３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化し、ファイバー配列を有する断片を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで開裂したベクターＭ１３ＴＧ１３０にクローニングした。有害な突然変異では、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示されるオリゴヌクレオチドを用いる。突然変異したＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片を、ＢｓｔＢＩで線形化したｐＴＧ４６０９でE.coliに再結合する。後者は、ファイバーの停止コドンの下流の３２９４０位のＢｓｔＢＩ部位を含む完全なＡｄ５ゲノムを含む。改変したファイバーのトリマー化能を、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置いた相当する配列を有する組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞Ｓｆ９の組換え経路によって生成したタンパク質を用いて、ＮＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で試験する(Novelli and Boulanger,J.of Biological Chemicstry,1991,266,9299-93 03)。平行して、突然変異ファイバーを有するビリオンの成長可能性（または増殖能）を２９３および２９３Ｆｂ＋細胞のトランスフェクションによって決定する。最後に、ＭＨＣ−ＩおよびＣＡＲ細胞レセプターへのファイバーの結合を、Ｄａｕｄｉ−ＨＬＡ＋およびＣＨＯ−ＣＡＲ細胞上で組換えアデノウイルスＡｄ５−Ｌｕｃにより、感染についての競合実験で検討することができる(Bergelson et al.,1997,Science,275,1320-1323)。例えば、ウイルスＡｄ５Ｌｕｃは、アデノウイルスゲノムのＥ３領域に挿入したＳＶ４０ウイルス(Simian Virus 40) 初期プロモーターの制御下に置いたルシフェラーゼ遺伝子を含む複製競合アデノウイルスである(Mittal et al.,1993，Virus Research,28,67-90)。 ΔＥＦファイバーは、トリマーの形態で蓄積し、２９３および３９３Ｆｂ＋細胞で増殖することができ、Ｄａｕｄｉ−ＨＬＡ＋細胞のＡｄ５Ｌｕｃによる感染の競合物ではない。これはＣＨＯ−ＣＡＲ細胞の感染を部分的に阻害することができるが、野生型ファイバーよりも効率は低い。これにより、ＥおよびＦシートは、Ａｄ５のＭＨＣ−１レセプターへの付着にとって重要であるが、ＣＡＲへの結合における安定化のため、更に小さな役割を演じている。新たなリガンドの挿入により、感染性をリガンドによって認識されるレセプターを有する細胞に再指定することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/43 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 38/55 5/00 Ｂ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/00 48/00 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/075 37/36 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/465 7/00 37/26 37/48 37/64 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者マジド、メターリフランス国イルキーク、グラフェンスターデン、アンパース、ド、ランス、16 (72)発明者ピエール、ブーランジェフランス国モンペリエ、リュ、マグローヌ、６

Claims

【特許請求の範囲】１．アデノウイルスファイバーの１個以上の残基を突然変異によって改変し、上記残基が、上記アデノウイルスの天然の細胞レセプターに向けられ、上記ファイバーのＣＤループおよびβシートＩの間に、好ましくはＣＤおよびＤＧループの間に、あることを特徴とする、アデノウイルスファイバー。２．アデノウイルスファイバーが、上記ファイバーのＣＤループおよびβシートＩの間で、好ましくはＥおよびＦシートでの１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項１に記載のアデノウイルスファイバー。３．配列番号：１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示される配列の総てまたは部分を含んでなるアデノウイルス５型（Ａｄ５）ファイバーから誘導され、残基４４１〜５５７の間の領域の１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項１または２に記載のアデノウイルスファイバー。４．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基４４１〜４７８、好ましくは４４３〜４６２の間の領域の１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項３に記載のＡｄ５アデノウイルスファイバー。５．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基４７９〜４８６の間の領域の１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項３に記載のＡｄ５アデノウイルスファイバー。６．Ａｄ５アデノウイルスファイバーが、 − ４４３位のグリシン残基の、アスパラギン酸による、 − ４４５位のロイシン残基の、フェニルアラニンによる、 − ４５０位のグリシン残基の、アスパラギンによる、 − ４５１位のトレオニン残基の、リシンによる、 − ４５２位のバリン残基の、アスパラギンによる、 − ４５５位のアラニン残基の、フェニルアラニンによる、 − ４５７位のロイシン残基の、アラニンまたはリシンによる、および／または − ４５９位のイソロイシン残基の、アラニンによる置換によって改変される、請求項４に記載のＡｄ５アデノウイルスファイバー。７．Ａｄ５アデノウイルスファイバーが、 − ４４３位のグリシン残基のアスパラギン酸による、 − ４４４位のセリン残基のリシンによる、および − ４４６位のアラニン残基のトレオニンによる置換、または、 − ４４９位のセリン残基のアスパラギン酸による、 − ４５０位のグリシン残基のリシンによる、 − ４５１位のトレオニン残基のロイシンによる、および − ４５２位のバリン残基のトレオニンによる置換によって改変される、請求項４に記載のＡｄ５アデノウイルスファイバー。８．Ａｄ５アデノウイルスファイバーが、 − ４５４位のセリンから４６１位のフェニルアラニンまで伸びる領域、 − ４４１位のバリンから４５３位のグルタミンまで伸びる領域、 − ４４１位のバリンから４６１位のフェニルアラニンまで伸びる領域、または − ４７９位のアスパラギンから４８６位のトレオニンまで伸びる領域の欠失によって改変される、請求項４または５に記載のＡｄ５アデノウイルスファイバー。９．アデノウイルスファイバー２型から誘導され、上記ファイバーの残基４４１〜５５８の間の領域の１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項１に記載のアデノウイルスファイバー。１０．Ａｄ２アデノウイルスファイバーの残基４４１〜４７８、好ましくは４５１〜４６６の間の領域の１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項９に記載のアデノウイルスファイバー。１１．Ａｄ２ファイバーの残基４７９〜４８６の間の領域の１個以上の残基の突然変異によって改変される、請求項９に記載のファイバー。１２．改変の少なくとも１つは、上記ファイバーのループおよび／またはシートの少なくとも３個の連続的残基の欠失であり、上記欠失残基は、第一のアデノウイルスとは異なる細胞レセプターと相互作用することができる第二のアデノウイルス、特に３または７型のファイバーから誘導される同等なループおよび／またはシートの残基で置換されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアデノウイルスファイバー。１３．天然の細胞レセプターへの結合能力が実質的に減少し、トリマー化を行うことができることを特徴とする、アデノウイルスファイバー。１４．更に、アデノウイルスの天然の細胞レセプターとは異なる細胞表面分子を認識できるリガンドを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアデノウイルスファイバー。１５．リガンドが、抗体、ペプチド、ホルモン、ポリペプチド、または糖質からなる群から選択される、請求項１４に記載のアデノウイルスファイバー。１６．リガンドをファイバーのＣ末端に挿入し、または改変の少なくとも１つが、欠失残基の代わりとしての少なくとも３個の連続した残基の欠失である、請求項１４または１５に記載のアデノウイルスファイバー。１７．請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアデノウイルスファイバーをコードするＤＮＡ断片または発現ベクター。１８．ゲノム中に組込まれた形態で、またはエピトープの形態で、細胞系で発現することができる要素の制御下に置かれた請求項１７に記載のＤＮＡ断片を含んでなる、細胞系。１９．更に、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５領域によってコードされた機能から選択される１個以上の機能を欠いているアデノウイルスを補足することができる、請求項１８に記載の細胞系。２０．２９３系から誘導される、請求項１８または１９に記載の細胞系。２１．機能的な固有のファイバーを欠き、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のファイバーを含んでなり、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の上記ファイバーを上記アデノウイルスのゲノムによってコードし、または請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の細胞系によってイン・トランスに提供することができる、アデノウイルス。２２．機能的ファイバーを欠き、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のファイバーと、上記アデノウイルスの天然の細胞レセプターとは異なる細胞表面分子を認識することができるリガンドとを含んでなる、アデノウイルス。２３．リガンドが抗体、ペプチド、ホルモン、ポリペプチドまたは糖質からなる群から選択される、請求項２２に記載のアデノウイルス。２４．リガンドをファイバーのＣ末端に挿入し、または改変の少なくとも１個が、欠失残基の代わりとしての少なくとも３個の連続した残基の欠失である、請求項２２または２３に記載のアデノウイルス。２５．リガンドがファイバー以外のキャプシドタンパク質、特にヘキソンまたはペントンに挿入される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。２６．複製に欠陥を有する組換えアデノウイルスである、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のアデノウイルス。２７．Ｅ１領域の総てまたは部分、および場合によってはＥ３領域の総てまたは部分について欠失がある、請求項２６に記載のアデノウイルス。２８．更に、Ｅ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５領域の総てまたは部分についても欠失がある、請求項２７に記載のアデノウイルス。２９．サイトカイン、細胞または核レセプター、リガンド、凝固因子、ＣＦＴＲタンパク質、インシュリン、ジストロフィン、成長ホルモン、酵素、酵素阻害剤、抗腫瘍効果を有するポリペプチド、細菌、寄生生物またはウイルス感染を阻害することができるポリペプチド、特にＨＩＶ、抗体、毒素、免疫毒素、およびマーカーをコードする遺伝子から選択される目的とする遺伝子を含んでなる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のアデノウイルス。３０． − 上記アデノウイルスのゲノムを適当な細胞系にトランスフェクションし、 − 上記トランスフェクションした細胞系を適当な条件下で培養して、上記アデノウイルスを生成させ、 − 上記アデノウイルスを上記トランスフェクションした細胞系の培養物から回収し、場合によっては上記アデノウイルスを実質的に精製する、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルスの製造法。３１．ゲノムがファイバーをコードする配列の総てまたは部分を欠き、 − 上記アデノウイルスのゲノムを、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の細胞系にトランスフェクションし、 − 上記トランスフェクションした細胞系を適当な条件下で培養して、上記アデノウイルスを生成させ、 − 上記アデノウイルスを上記トランスフェクションした細胞系の培養物から回収し、場合によっては上記アデノウイルスを実質的に精製する、ことを特徴とする、アデノウイルスの製造法。３２．請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルスに感染した、または請求項３０または３１に記載の方法によって得られる、宿主細胞。３３．請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のまたは請求項３０または３１に記載の方法によって得られるアデノウイルス、または請求項３２に記載の宿主細胞を、薬学上許容可能なキャリヤーと組合わせて含んでなる、医薬組成物。３４．請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のまたは請求項３０または３１に記載の方法によって得られるアデノウイルス、または請求項３２に記載の宿主細胞の、遺伝子治療によるヒトおよび動物体の治療を目的とする医薬の製造のための治療または予防的使用。