JP2000279178A - ウイルスベクター - Google Patents

ウイルスベクター

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Abstract

(57)【要約】 【課題】従来の治療に対して抵抗性で予後のきわめて悪
い悪性黒色腫等の腫瘍の治療および診断に有用なウイル
スベクターおよび当該ウイルスベクターを用いた腫瘍の
診断法および治療法が求められている。 【解決手段】本発明は、ウイルスを構成するタンパク質
に、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）受容体に特異
的に結合するリガンドを結合させてなるウイルスベクタ
ーおよび、該ベクターを用いた腫瘍に対する診断薬およ
び治療薬を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルスを構成す
るタンパク質に、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）
受容体に特異的に結合するリガンドを結合させてなるウ
イルスベクターおよび、該ベクターを用いた腫瘍に対す
る診断薬および治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】転移を伴う悪性黒色腫は、放射線療法や
化学療法などの従来の治療法に抵抗性であり、予後はき
わめて不良である。そのため、新しい有効な治療法の開
発が強く望まれる。一方、ウイルスベクターなどを介し
た遺伝子導入を用いた癌治療法（癌に対する遺伝子治療
法）は、近年多くの臨床研究が開始され、期待を集めて
いる。
【０００３】しかしながら、現在、悪性黒色腫に対して
十分に治療効果をあげるような効果的な遺伝子導入を行
う方法は確立されていない。例えば、従来のレトロウイ
ルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス
（ＡＡＶ）などのウイルスベクターでは悪性黒色腫細胞
に対する遺伝子導入効率は十分でない。本発明者らは現
行のアデノウイルスベクターの悪性黒色腫細胞株に対す
る遺伝子導入効率について検討し、比較的高いＭＯＩ
（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ）のウイルスを用いても充分な遺伝子導入効率が得ら
れないことを示している〔Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，９（１７）２５
０３−２５１５，１９９８、（以下、Ｙｏｓｈｉｄａｅ
ｔ ａｌ．，１９９８と略記する）〕。この論文に示さ
れた結果中、ＭＯＩ１００では、Ａ３７５ヒト悪性黒色
腫細胞で５０％、ＲＰＭＩ７９５１悪性黒色腫細胞で８
０％、ＷＭ１１５悪性黒色腫細胞で５０％程度の遺伝子
導入効率が得られるに過ぎず、１００％に近い遺伝子導
入を得るにはさらに大量のアデノウイルスの投与を必要
とする。
【０００４】現行のウイルスベクターは、単に遺伝子導
入の効率が低いのみでなく、周辺の正常細胞にも非選択
的に遺伝子が導入されるという欠点を持つ。すなわち、
悪性黒色腫の治療を行うベクターとしては、効率が低
く、悪性黒色腫に対する選択性も乏しい。アデノウイル
スのファイバーのＣ末端ないしＨＩループ部分に変異ア
ミノ酸配列を入れて、宿主域を改変する試みは、米国Ｇ
ｅｎＶｅｃ社のＷｉｃｋｈａｍ、アラバマ大学のＣｕｒ
ｉｅｌらのグループによって報告されている〔Ｗｉｃｋ
ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，８２２
１（１９９７）、Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒ．２，７５０（１９９５）、Ｗｉｃｋｈ
ａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，１４，１５７０（１９９６）、Ｃｕｒｉｅｌ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３，１４７
（１９９２）、Ｄｉｍｉｔｒｉｅｖ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，９７０６（１９９８）、ＷＯ９
４／１０３２３、ＷＯ９６／０７７３４、〕。
【０００５】多くのヒト悪性黒色腫に、ＭＳＨ受容体が
存在しＭＳＨが結合することが報告されている〔Ｓｉｅ
ｇｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４
９，６３５２（１９８９）〕。したがって、ＭＳＨをウ
イルスの外皮タンパク質に結合させたウイルスベクター
は、悪性黒色腫に効率的に遺伝子を導入できるベクター
となることが予想される。しかし、ＭＳＨリガンドを含
むベクターの作成に成功したとの報告や、ＭＳＨ受容体
を標的とした遺伝子治療の可能性を実証した報告は見当
たらない。アデノウイルス以外のウイルスベクターとし
ては、レトロウイルスのエンベロープタンパク質に細胞
の増殖因子（エリスロポエチン〔Ｋａｓａｈａｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３７３（１９
９４）〕、あるいは単鎖の抗体〔Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：１０１４８（１９
９８）〕などを融合するように組み込んで標的化を目指
しているもの、あるいは単純ヘルペスウイルスのＣ糖タ
ンパク質にエリスロポエチンを融合させたもの〔Ｌａｑ
ｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１
２）：９６８３（１９９８）〕などがある。Ｊｉａｎｇ
らの報告では、単鎖抗体の抗原としてＥＧＦ（ｅｐｉｄ
ｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）受容体ファ
ミリーに属するＨｅｒ２ｎｅｕ、骨髄幹細胞に特異的と
いわれるＣＤ３４、トランスフェリン受容体が標的とし
て検討されている。また、インデグリンと結合するＲＧ
Ｄモチーフを人工的に組み込んだキメラウイルスタンパ
ク質の報告は、アデノウイルスでは前述のＷｉｃｋｈａ
ｍのグループ〔Ｗｉｃｋｈａｍｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．７１：８２２１（１９９７）〕とＣｕｒｉｅｌ
のグループ〔Ｄｉｍｉｔｒｉｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７２：９７０６（１９９８）〕から、さら
にアデノウイルス以外では、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタ
ンパク質〔Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．７０：４８０５（１９９６）；Ｓｈａｒｍａ
ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：１５０（１
９９７）〕、バクテリオファージＦｄタンパク質〔Ｋｏ
ｉｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６８：２０２０５（１９９３）；Ｋｏｉｖｕｎｅ
ｎｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２４：３
７３（１９９４）〕などについてすでに報告されてい
る。しかしながら、アデノウイルス以外でもＭＳＨリガ
ンドを含むウイルスベクターや、ＭＳＨ受容体を標的と
した遺伝子治療の可能性を実証した報告は見当たらな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】悪性黒色腫の遺伝子治
療を開発してゆくためには、現行のウイルスベクターで
は遺伝子導入の効率も選択性も乏しい。従って、悪性黒
色腫に対して効率よく選択的に遺伝子導入が可能な手段
に対する要望は依然として存在する。そのようなベクタ
ーの使用によって、従来の治療に対して抵抗性で予後の
きわめて悪い悪性黒色腫に対してさまざまな遺伝子治療
法によるアプローチが必要である。
【０００７】本発明の目的は、悪性黒色腫を含めた腫瘍
の治療および診断に有用な、ウイルスを構成するタンパ
ク質にＭＳＨ受容体に特異的に結合するリガンドを結合
させてなるウイルスベクターおよび当該ウイルスベクタ
ーの利用方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来のウ
イルスベクターによる遺伝子導入法では悪性黒色腫に対
し効率が低く選択性に乏しいとの上記問題点が、ウイル
スを構成するタンパク質に、ＭＳＨ受容体に特異的に結
合するリガンドを結合させてなるウイルスベクターを用
いることにより解決できることを見出し、本発明を完成
させた。また、このようなウイルスベクターは、作用機
作上、アデノウイルスのファイバーと同様に、ウイルス
を構成するタンパク質にＭＳＨ受容体に特異的に結合す
るリガンドを結合させることができる他のウイルスを用
いたベクター系にも適用できる。
【０００９】このようなウイルスベクターを悪性黒色腫
等のＭＳＨ受容体を発現している腫瘍に対して遺伝子導
入用のベクターとして用いれば、効率が高く選択性に優
れた遺伝子導入が達成される。従って、本発明によれ
ば、悪性黒色腫等のＭＳＨ受容体を発現している腫瘍に
対して高効率かつ高選択性のウイルスベクター、さらに
はそれをもとにして作成される組換えウイルスベクター
が提供される。このような組換えウイルスベクターは、
含有させる遺伝子を選ぶことによって、悪性黒色腫等の
ＭＳＨ受容体を発現している腫瘍細胞を特異的に見分け
る診断薬として、または当該腫瘍細胞を特異的に殺す癌
治療薬として、あるいは当該腫瘍の持つ抗原性を特異的
に高める癌の免疫治療剤として適用できる、診断用並び
に治療用のベクターとして有用である。
【００１０】従来のアデノウイルスベクターは、ヒト５
ないし２型アデノウイルスをベースとした組換え体が主
体で、悪性黒色腫に対する遺伝子導入効率は、５０％導
入を得られるウイルス量（ＥＤ５０）がＭＯＩ１００前
後である（Ｙｏｓｈｉｄａｅｔ ａｌ．，１９９８）。
すなわち、悪性黒色腫に対しては余り高い導入効率が得
られない。一方、正常細胞に対してもそれと同等ないし
それ以上の高い効率で遺伝子導入が得られるため、悪性
黒色腫に特異的な高い遺伝子導入効率は望めない。本発
明のウイルスベクターを用いることにより、１）悪性黒
色腫等のＭＳＨ受容体を発現している腫瘍に対して従来
法に比べ飛躍的に高い導入効率が得られ、２）周辺の正
常細胞に対しては、従来のベクターと同等ないしそれ以
下の導入効率であるため、結果として、悪性黒色腫等の
ＭＳＨ受容体を発現している腫瘍に対して特異性の高い
遺伝子導入が可能である。そのため、１）高い発現量が
必要な場合は、従来法と同じウイルス量を用いたとして
も、標的となる腫瘍細胞に対し従来法よりも高い遺伝子
発現が得られ、結果としてより高い効果が得られる。ま
た、２）比較的低い発現量で充分な効果が得られるよう
な遺伝子の場合には、本ベクターを用いればウイルスの
投与量を減らすことが可能であり、結果としてウイルス
投与に伴う望ましくない副作用（アレルギー反応や周辺
正常細胞の傷害など）を軽減することが可能である。
【００１１】また、Ｅ１Ａを持つアデノウイルスなどの
増殖可能な組換えウイルスと一体型に組み合わせて用い
れば、感染効率の増加と、感染したあとの腫瘍組織内で
のウイルスの増殖再感染とが相乗的に働き、非常に有効
な治療法となる。従って、本発明は、悪性黒色腫等のＭ
ＳＨ受容体を発現している腫瘍の治療に対して高い有用
性を有している。
【００１２】ファイバータンパク質のＣ末端などにＭＳ
Ｈとは別種のリガンドを入れた変異アデノウイルスの作
成はすでに報告がある。しかし、リガンドを入れたため
にアデノウイルスができなくなってしまうものが多い。
たとえウイルスができたとしても、得られたものが期待
通りの受容体に対するアフィニティーを有していないも
のである場合も多い〔Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１．（１１）８２２１−８２２９
（１９９７）参照〕。従って、既に知られているリガン
ドから派生する融合タンパク質を用いて、すでに知られ
ている受容体を標的としたベクターであっても、有用な
ウイルスベクターが得られるか否かは実際にそれらを作
成して、作用させてみるまでは全く不明である。例え
ば、Ｗｉｃｋｈａｍらは、Ｅ−セレクチンと結合するモ
チーフ配列（ＴＲＳＤＩＴＷＤＱＬＷＷＤＬＭＫＴＳ）
やラミニンリセプターと結合するモチーフ配列（ＴＳＡ
Ａ（ＳＩＫＶＡＶ）２）をアデノウイルスのファイバー
のＣ末端に挿入したベクターを作製したが、組換えアデ
ノウイルスはできなかった。また、同様にανインテグ
リンと結合するＲＧＤモチーフを含む配列ＴＳ（ＧＲＧ
ＤＴＦ）３ＳＳやラミニンリセプターと結合するモチー
フ配列ＴＳ（ＧＹＩＧＳＲ）３ＳＳを同様に挿入したベ
クターおよびその組換えアデノウイルスを作製したが、
それぞれ予想されるリセプターに対する特異的結合が見
られなかったと報告している〔Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ
ａｌ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌ．７１（１１）８２２１−８２
２９（１９９７）〕。本発明のウイルスベクターでは悪
性黒色腫に対して通常期待される以上の格段に優れた結
果が得られた。
【００１３】本発明者は、ＭＳＨ受容体が多くの黒色腫
細胞で発現している〔Ｓｉｅｇｒｉｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９，６３５２（１９８
９）〕ことと、リガンドであるＭＳＨがＭＳＨ受容体に
高いアフィニティーで特異的に結合することを利用し
て、悪性黒色腫細胞に効率よく感染し遺伝子導入できる
ベクターを完成させた。本発明のベクターは悪性黒色腫
だけでなく、ＭＳＨ受容体を発現している他の腫瘍にも
有効である。
【００１４】本発明は、以下の（１）〜（２６）に関す
る。 （１）ウイルスを構成するタンパク質に、ＭＳＨ受容体
に特異的に結合するリガンドを結合させてなるウイルス
ベクター。 （２）ウイルスを構成するタンパク質が、リンカーを介
してメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）受容体に特異
的に結合するリガンドに結合している（１）のウイルス
ベクター。 （３）リンカーがオリゴペプチドである（２）のベクタ
ー。 （４）リンカーが配列番号２５、２７、２９および３１
のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する（３）のベ
クター。 （５）ウイルスを構成するタンパク質が、ウイルスの外
表面を構成するタンパク質である（１）〜（４）のいず
れかのベクター。 （６）リガンドが、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳ
Ｈおよびこれらのいずれかの誘導体からなる群より選ば
れるリガンドである（１）〜（５）のいずれかのベクタ
ー。 （７）ウイルスが、アデノウイルス科、レトロウイルス
科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックス
ウイルス科、パポーバウイルス科、ヘパドナウイルス
科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイル
ス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、オル
ソミクソウイルス科、バンヤウイルス科、アレナウイル
ス科およびレオウイルス科よりなる群のいずれかの科に
属するウイルスから選ばれる（１）〜（６）のいずれか
のベクター。 （８）ウイルスがヒトアデノウイルスである（１）〜
（６）のいずれかのベクター。 （９）ウイルスが外来の遺伝子を含むウイルスである
（１）〜（８）のいずれかのベクター。 （１０）遺伝子が、非毒性のプロドラッグを細胞毒性を
有する薬剤に変換することができる酵素をコードする遺
伝子である（９）のベクター。 （１１）遺伝子が、単純ヘルペスウイルス・チミジンキ
ナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）またはシトシン・デアミナーゼ
（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＣＤ）をコ
ードするものである（１０）のベクター。 （１２）遺伝子が、直接または間接的に細胞毒性作用を
有する分子をコードするものである（９）のベクター。 （１３）遺伝子がサイトカイン、細胞増殖因子または細
胞増殖抑制因子をコードするものである（１２）のベク
ター。 （１４）遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子
または細胞死調節遺伝子である（１２）のベクター。 （１５）外来の遺伝子が、アデノウイルスＥ１Ａないし
Ｅ１Ｂの野生型または変異型の遺伝子の全部または一部
である（９）のベクター。 （１６）（１）〜（１５）のいずれかのベクターを含有
してなる医薬。 （１７）（１）〜（１５）のいずれかのベクターを含有
してなる抗腫瘍剤。 （１８）腫瘍が悪性黒色腫である（１７）の抗腫瘍剤。 （１９）（１）〜（１５）のいずれかに記載のベクター
を含有してなる腫瘍の診断薬。 （２０）腫瘍が悪性黒色腫である（１９）の診断薬。 （２１）配列番号２５、２７、２９および３１のいずれ
かに示されるアミノ酸配列を有するリンカー。 （２２）（２１）のリンカーをコードするＤＮＡ。 （２３）配列番号２４、２６、２８および３０のいずれ
かに示される塩基配列からなるＤＮＡ。 （２４）配列番号３２〜３９のいずれかに示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質。 （２５）（２４）記載のベクターをコードするＤＮＡ。 （２６）配列番号７、１３、１７、１８、２０、２１、
２２および２３のいずれかに示される塩基配列からなる
ＤＮＡ。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のベクターに用いられるウ
イルスは、アデノウイルス科、レトロウイルス科、パル
ボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス
科、パポーバウイルス科、ヘパドナウイルス科、トガウ
イルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、ラブ
ドウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウ
イルス科、バンヤウイルス科、アレナウイルス科および
レオウイルス科よりなる群のいずれかの科に属するウイ
ルスおよびこれらのウイルスより由来するベクターおよ
びアデノウイルスドデカヘドロンベクター（Ｆｅｎｄｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１
５：５２−５６（１９９７）〕のようなウイルスタンパ
ク質から由来するベクター、ウイルスタンパク質をリポ
ゾームに組み合わせたベクター（例えば、センダイウイ
ルスとリポゾームベクター等）等が包含されるが、ヒト
アデノウイルスが好ましく用いられる。
【００１６】ベクターの作製は、ウイルスを構成するタ
ンパク質をコードするＤＮＡに対し、一般的な組み換え
ＤＮＡ作成技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９．などを参
照）を用いて該タンパク質とＭＳＨリガンドとの融合タ
ンパク質をコードするように該当するウイルスタンパク
質のコード領域を入れかえることによって行なえる。組
換えウイルスの作成、あるいはリポゾームとの複合体な
どの作成については既存の方法に従う。例えば以下のよ
うな文献に記載の方法により行うことができる。
【００１７】Ｗｏｌｆｆ ｅｄ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅｔｒａ
ｎｓｆｅｒ． Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏ
ｎ，１９９４； Ｋａｐｌｉｔｔ ａｎｄ Ｌｏｅｗｙ
ｅｄｓ．，Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅｔ
ｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａ
ｐｌｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９５； Ｌｉｕ ｅｔ
ａｌ．ｅｄｓ．， ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ａ ｎ
ｅｗ ｅｒａｉｎ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ．Ａｎｎａ
ｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｖｏｌ．７７２． Ｔｈ
ｅＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５； Ｇｌｕｚｍ
ａｎ ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｄｓ．， Ｖｉｒａｌ
ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｍｍｕｎｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇ
ｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８； Ｒｏｔ
ｈ ｅｄ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉ
ｏｌｏｇｙ：ｖｏｌ．４３．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １
９９４．
【００１８】本発明に用いられるウイルスを構成するタ
ンパク質としては、例えば、ウイルスの外表面を構成す
るタンパク質として、ＶＳＶ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）のＧタンパク質、レ
トロウイルスのエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）、ア
デノウイルスのキャプシドタンパク質（ヘキソン、ペン
トンベース、ファイバー）、インフルエンザウイルスの
Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、パラミクソウイルスの表
面糖タンパク質などが挙げられるが、癌細胞などの宿主
細胞の表面への吸着や特異的受容体との相互作用を担う
ようなウイルスタンパク質であれば、いずれも本発明に
用いられる。
【００１９】本発明に用いられるＭＳＨ受容体に特異的
に結合するリガンドとしては、α−ＭＳＨ、β−ＭＳ
Ｈ、γ−ＭＳＨ等が挙げられる。またこれらの変異体
（誘導体やランダムペプチドからスクリーニングしたも
のなど）を作成して、天然のＭＳＨよりも一層ＭＳＨ受
容体との結合力の強いものを人工的に作成することも可
能である。本発明に用いられるリガンドは、これら全て
のＭＳＨないしＭＳＨ様のリガンドを包含する。
【００２０】以下の説明においては、ＭＳＨ受容体に特
異的に結合するリガンドをＭＳＨと略記するが、本発明
においては、ＭＳＨ受容体と強い親和力を有する全ての
リガンドも同様に用いることができる。ＭＳＨとウイル
スタンパク質との結合は、直接結合させることもできる
が、リンカーペプチドを介して結合させることもでき
る。リンカーペプチドついては、長さは１から１００残
基程度までのオリゴペプチドが用いられる。当該オリゴ
ペプチドの配列としては、文献上報告された特定のペプ
チド配列でも、未報告のペプチド配列でも、ＭＳＨ機能
を保持しながらウイルスタンパク質とＭＳＨとを結びつ
けるような役割を果たすペプチドであれば、ＭＳＨのＣ
末端、内部あるいはＮ末端のどちらについているか、長
さ、配列などは問わず、いずれでも本発明に用いること
ができる。
【００２１】ＭＳＨがウイルスを構成するタンパク質に
結合する位置は、当該タンパク質のＣ末端、内部または
Ｎ末端であっても、いずれの位置であってもよい。例え
ば、アデノウイルスのファイバータンパク質のようなウ
イルスを構成するタンパク質のＣ末端に配列番号２５、
２７、２９および３１のいずれかに示されるアミノ酸配
列を有するオリゴペプチドを介してＭＳＨのＮ末端を結
合させることができる。当該配列番号２５、２７、２９
および３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する
リンカーペプチドおよび当該ペプチドをコードするＤＮ
Ａも本発明に包含される。
【００２２】本発明のペプチドリンカーを介してＭＳＨ
を結合させたウイルスベクターを構成するタンパク質の
具体例としては、配列番号３２〜３９のいずれかに示さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質等が挙げられる。
当該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に包含され
る。具体的には、配列番号７、１３および１７〜２３の
いずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げら
れる。
【００２３】本発明のウイルスベクターに外来の遺伝子
を組み込むことにより、当該遺伝子を効率的に標的細胞
に導入することができる。当該外来遺伝子を含むウイル
スベクターも本発明に包含される。例えば、外来遺伝子
として、直接的または間接的に標的細胞に対して細胞毒
性作用を有するような分子をコードする遺伝子を組み込
むことにより、癌細胞等の標的細胞を効率的かつ選択的
に殺すことができる。このような遺伝子としては、例え
ば、サイトカイン、細胞増殖因子および細胞増殖抑制因
子等をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調
節遺伝子、細胞死調節遺伝子等が挙げられる。
【００２４】また、外来遺伝子として、単純ヘルペスウ
イルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシン
・デアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓ
ｅ，ＣＤ）等の非毒性のプロドラッグを細胞毒性を有す
る薬剤に変換することができる酵素をコードする遺伝子
を組み込むことにより、標的細胞を当該プロドラッグに
対して感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）にすることができ
る。例えば、ＨＳＶ−ｔｋをコードする遺伝子を組み込
んだ場合は、標的細胞をガンシクロビルまたはアシクロ
ビルに対して感受性にすることができ、ＣＤをコードす
る遺伝子を組み込んだ場合は、標的細胞内で非毒性の５
−フルオロシトシンを細胞毒性を有する薬剤である５−
フルオロウラシルに変換させることができる。
【００２５】また、外来の遺伝子は、アデノウイルスＥ
１ＡないしＥ１Ｂの野生型または変異型の遺伝子の全部
または一部であってもよい。本発明のウイルスベクター
は、医薬、例えば、悪性黒色腫等のＭＳＨを発現してい
る腫瘍の治療薬、特に悪性黒色腫の治療薬として用いる
ことができる。本発明のウイルスベクターを含有する医
薬は、治療薬として該ベクター単独で投与することも可
能ではあるが、通常は該ベクターを薬理学的に許容され
る一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学
の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造
した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは
水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブ
ミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が
用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるた
めの緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容され
る添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、
乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等
を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、
使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
【００２６】投与経路は、治療に際し最も効果的なもの
を使用するのが望ましく、通常は非経口経路、例えば皮
下、筋肉内、静脈内、気道内等の投与経路が用いられ
る。本発明のベクターを含有する治療薬は、治療薬とし
て該ベクター単独で投与することも可能ではあるが、通
常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体
と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られ
る任意の方法により製造した医薬製剤として提供するの
が望ましい。
【００２７】投与経路は、治療に際して最も効果的なも
のを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、
気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口
投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧
剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座
剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。経口投与
に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル
剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤お
よびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソ
ルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、
プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリ
ーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エ
ステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパー
ミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造で
きる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブ
ドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、
アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネ
シウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒ
ドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂
肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等
を添加剤として用いて製造できる。
【００２８】非経口投与に適当な製剤としては、注射
剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、
塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる
担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪
またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、
噴霧剤は該ベクターそのもの、ないしは受容者の口腔お
よび気道粘膜を刺激せず、かつ該ベクターを微細な粒子
として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製
する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示
される。該ベクターおよび用いる担体の性質により、エ
アロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。ま
た、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として
例示した成分を添加することもできる。
【００２９】投与量または投与回数は、目的とする治療
効果、投与方法、治療期間、年齢、体重、ウイルスベク
ターの種類等により異なるが、通常成人１回当たりウイ
ルスベクターとして１０３〜１０１５個である。本発明
のウイルスベクターは、診断薬、例えば、悪性黒色腫等
のＭＳＨを発現している腫瘍の診断薬、特に悪性黒色腫
の診断薬として用いることができる。例えば、本発明の
ウイルスベクターに標識となる遺伝子を組み込むことに
より、悪性黒色腫等のＭＳＨを発現している腫瘍を特異
的に検出することができる。
【００３０】以下、ウイルスベクターとしてヒト５型の
アデノウイルス（Ａｄ５）を、ＭＳＨを結合させるウイ
ルスを構成するタンパク質としてＡｄ５のファイバーを
用いて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら
の例に限定されるものではない。
【００３１】
【実施例】実施例１ ＭＳＨ融合ファイバー変異型（Ｆ
／ＭＳＨ）の変異を持つヒト５型アデノウイルス（以
下、Ａｄ５−Ｆ／ＭＳＨと略記する）の作成 ａ）Ｆ／ＭＳＨ変異をコードするプラスミドの作成：野
生型のファイバーをコードする遺伝子領域の３’末端に
１１アミノ酸よりなるリンカーと１３アミノ酸よりなる
ヒトα−ＭＳＨをコードする塩基配列（配列番号１）
を、合成オリゴヌクレオチドＮｏ．９２４（１２６ｍｅ
ｒ、配列番号２）をテンプレートとし、Ｎｏ．９３３
（配列番号３）とＮｏ．９３４（配列番号４）をプライ
マーとして、ポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）によ
って合成した。
【００３２】このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切って、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋（ストラタジーン
社）のＥｃｏＲＩサイトへクローニングしてｐＳＫＩＩ
＋ｎｂＭＳＨを得た（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，
１９９８）。さらに、ｐＳＫＩＩ＋ｎｂＨ（Ｙｏｓｈｉ
ｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘ
ｈｏＩ断片とｐＳＫＩＩ＋ｎｂＭＳＨのＸｈｏＩ／Ｍｕ
ｎＩ断片を、ｐＳＫＩＩ＋［Ｘ−Ｋ］（Ｙｏｓｈｉｄａ
ｅｔ ａｌ．，１９９８）のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｍｕｎ
ＩサイトへクローニングしてプラスミドｐＳＫＩＩ＋
［Ｘ−Ｋ］ｎｂＭＳＨを得た。さらにｐＳＫＩＩ＋［Ｘ
−Ｋ］ｎｂＭＳＨのＮｈｅＩ／ＫｐｎＩ断片（２．１ｋ
ｂｐ）をｐＳＫＩＩ＋６．７Ｒｎｐ（Ｙｏｓｈｉｄａ
ｅｔ ａｌ．，１９９８）のＮｈｅＩ／ＫｐｎＩサイト
へサブクローニングして、ｐＳＫＩＩ＋６．７Ｒ−ＭＳ
Ｈを得た。ｐＳＫＩＩ＋６．７Ｒ−ＭＳＨからＥｃｏＲ
Ｉ／ＰａｃＩ断片を切り出してｐＴＲ（Ｙｏｓｈｉｄａ
ｅｔ ａｌ．，１９９８）のＥｃｏＲＩ／ＰａｃＩサ
イトへクローニングしてｐＴＲ−ＭＳＨを得た。Ｆ／Ｍ
ＳＨ変異型のファイバーのＣ末端の予想アミノ酸配列は
以下のようになる。ただし、数字は５型アデノウイルス
（Ａｄ５）のファイバーのＮ末端を１として数えたアミ
ノ酸残基の位置を示す。 Ｓ５７１ＳＹＴＦＳＹＩＡＱＥ５８１ＰＳＡＳＡＳＡＳ
ＡＰＧ５９２ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ６０５ ５８１までが本来のＡｄ５ファイバーのアミノ酸配列、
５８２から５９２までの１１残基がリンカーのアミノ酸
配列、５９３から６０５までの１３残基がヒトα−ＭＳ
Ｈのアミノ酸配列である。ｐＴＲ−ＭＳＨを含む大腸菌
であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α／
ｐＴＲ−ＭＳＨは、平成１１年２月２２日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−６６５６
として寄託されている。
【００３３】ｂ）Ｆ／ＭＳＨ変異型組み換えアデノウイ
ルスの作成 Ｆ／ＭＳＨを有する組み換えアデノウイルスは、公知の
方法（Ｙｏｓｈｉｄａｅｔ ａｌ．，１９９８）に準じ
て作成した。すなわち、アデノウイルスＡｄ５ｄｌＸ
〔Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１３２０−１３
２４（１９９６）〕からゲノムＤＮＡ−末端タンパク質
複合体（以下、ＤＮＡ−ＴＰＣと略記する）を分離し、
これをＥｃｏＲＩとＡｓｅＩで切断したものと、ｐＴＲ
−ＭＳＨのプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで切断したもの
とを、２９３細胞へ共トランスフェクションした。Ｙｏ
ｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８にＦ／Ｋ２０変異
体の作成法として記載した方法と本質的に同じ方法を用
いた。ただし従来通りの方法〔Ｍｉｙａｋｅ ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．９３，１３２０−１３２４（１９９６）〕に従
って共トランスフェクションを行ったところ、繰り返し
て実験を行ったにもかかわらず、プラークは１つも得ら
れなかった（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９
８）。本実施例では、得られたＡｄｖ−Ｆ／ＭＳＨ変異
体のウイルスタイターがきわめて低いために、従来通り
のウイルスプラーク作成法を用いてはウイルスの分離は
困難と考えた。そこで本発明者は、ＤＮＡをトランスフ
ェクトされた２９３細胞の９６ウエルプレートへのまき
込み数を従来法の３０％とし、培養液のウシ胎児血清
（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）の
濃度を従来の１０％からその半分の５％へと低くし、培
養液をトランスフェクションから４日目、８日目、１５
日目の３回それぞれ１ウエルに５０μｌずつ適宜追加し
ながら３週間にわたって培養を続けたところ、ようやく
全体で２クローンのプラークを分離することができた。
これらのウイルスを２９３細胞ならびにＡ３７５ヒト悪
性黒色腫細胞に感染させて増幅させてから生物活性の検
討を行った。得られたＡｄ５−Ｆ／ＭＳＨのウイルス液
のタイターは通常の２９３を用いたプラークアッセイ法
では検出限界以下であった（１０５ｐｆｕ／ｍｌ以
下）。
【００３４】ｃ）Ｆ／ＭＳＨファイバー変異型アデノウ
イルスの２９３細胞ならびにＡ３７５ヒト悪性黒色腫細
胞に対する感染によって起こる細胞毒性の検討 ２９３細胞またはＡ３７５細胞を６ウエルプレートにま
き、翌日コントロールの擬似感染（ｍｏｃｋ ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｎ）、野生型（ｗｔ）アデノウイルスＡｄ５ｄ
ｌＸ−Ｆ／ｗｔの感染、ならびに、Ｆ／ＭＳＨ変異型ア
デノウイルス（Ａｄ５−Ｆ／ＭＳＨ）の感染を行い、９
６時間後の細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。図１
のＡにコントロールの２９３細胞、Ｂ、ＣにそれぞれＦ
／ｗｔとＦ／ＭＳＨのＡｄ５ｄｌＸアデノウイルスに感
染した２９３細胞を示す。４日間の培養でＢのＦ／ｗｔ
の感染した２９３細胞はほとんど１００％の細胞が死ん
で丸く浮き上がってくる。一方、ＣのＦ／ＭＳＨの感染
した２９３細胞では細胞のダメージはほとんど見られず
コントロール（Ａ）とほぼ同等の形態を示した。
【００３５】図２のＤにコントロールのＡ３７５細胞、
Ｅ、Ｆが野生型ファイバー（Ｆ／ｗｔ）のＡｄ５ｄｌＸ
アデノウイルスをそれぞれＭＯＩ１１０、３０で感染さ
せたＡ３７５の形態を示す。４日間の培養で、２９３細
胞の結果とは対照的に、Ｆ／ｗｔの感染したＡ３７５細
胞では、十分な細胞毒性は得られていない（図２のＥ、
Ｆ）。一方、図３のＧはＦ／ＭＳＨ変異型ファイバーを
有するＡｄ５ｄｌＸアデノウイルス（Ａｄ５−Ｆ／ＭＳ
Ｈ）を感染させたＡ３７５細胞の形態を示す。４日間の
培養で非常に強い細胞毒性が得られることがわかる。以
上の結果から、Ｆ／ＭＳＨファイバー変異型アデノウイ
ルスは、２９３細胞に比し、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細
胞に対して効率高く、しかも選択性も優れた遺伝子導入
の可能なベクターとして有用であることが示された。
【００３６】実施例２ ＭＳＨ融合型の変異ファイバー
を持つヒト５型アデノウイルスの改良型（Ａｄ５−Ｆ／
ａｓＭＳＨａ）の作成 実施例１の方法では、Ｆ／ＭＳＨ変異型アデノウイルス
の悪性黒色腫細胞に対する顕著な効果、すなわち、高効
率の遺伝子導入と強い細胞毒性効果は示されたものの、
得られたウイルス液のタイターが低い（１０５ｐｆｕ／
ｍｌ以下）のでこれを改善する必要がある。そこで、以
下に述べるようなファイバー変異型アデノウイルス作成
方法を用いることによって、１０７から１０８ｐｆｕ／
ｍｌ以上の実用上充分に高いタイターを有するＭＳＨ融
合ファイバー変異アデノウイルスを得ることができた。
【００３７】ａ）Ｆ／ａｓＭＳＨａファイバー変異をコ
ードするＤＮＡ断片の作成 α−ＭＳＨのコード領域とファイバーのポリＡシグナル
領域は、新しく合成したオリゴヌクレオチドプライマー
のＮｏ．１０６１（配列番号５）とＮｏ．１０９２（配
列番号６）を用いて、実施例１のｐＳＫＩＩ＋６．７Ｒ
−ＭＳＨをテンプレートとしてＰＣＲ法によって合成し
た。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断して、
ｐＮＥＢ１９３（ＮＥＢ社）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ
サイトへクローニングし、塩基配列を確認した。
【００３８】ｂ）コスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭ
ＳＨａの作成 コスミドｐＷＥ１５（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ，Ｍ９９５６９）はＣｌｏｎｔｅｃｈ社（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ｐＳＫＩＩ
＋６．７Ｒ−Ｋ２０〔Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２５０３−２５１５
（１９９８）の２５０６ページに記載されている〕のＳ
ａｃＩＩサイトをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し
て、ここに新たに合成したリン酸化ＢｓｔＢＩリンカー
（ｐｄＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣ）を挿入した。これからＡ
ｄ５アデノウイルスのゲノムを含むＥｃｏＲＩ／Ｂｓｔ
ＢＩ断片を切り出し、ｐＷＥ１５のＥｃｏＲＩ／Ｃｌａ
ＩサイトにクローニングしてｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／Ｋ２
０を得た。これからＫ２０変異をコードする配列を含む
ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片をａ）で述べたＮｏ．１０６
１−Ｎｏ．１０９２ＰＣＲ産物のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ
断片に入れかえることによってｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａ
ｓＭＳＨａを得た。このときファイバーをコードする領
域の塩基配列（Ａｄ５−Ｆ／ａｓＭＳＨａ．ｓｅｑ）お
よびコードするアミノ酸配列を配列番号７に示した。
【００３９】ｃ）コスミドｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ａｓＭ
ＳＨａの作成 ファルマシア社から購入したプラスミドｐＵＣ−４Ｋか
らカナマイシン耐性遺伝子を含むＢａｍＨＩ切断断片
（１２６４ｂｐ）を切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
で末端を平滑化して、ｐＡｘ−ｃｗ〔Ｍｉｙａｋｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９３，１３２０−１３２４（１９９６）〕のＳ
ｗａＩサイトにクローニングしてｐＡｘＫＭを得た。こ
れのＡｄ５のゲノムを含むＥｃｏＲＩ断片（約２５７７
３ｂｐ）を、ｂ）で述べたｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭ
ＳＨａのＥｃｏＲＩサイトにクローニングして、Ａｄ５
のゲノムが正しい方向につながっているものを選択する
ことにより、全長約４０７０２ｂｐのコスミドｐＷＥＡ
ｘＫＭ−Ｆ／ａｓＭＳＨａを得た。
【００４０】ｄ）Ｆ／ａｓＭＳＨａ変異型組み換えアデ
ノウイルスの作成 アデノウイルスＡｄ５ｄｌＸのＤＮＡ−ＴＰＣをＥｃｏ
ＲＩとＡｓｅＩで切断したものと、ｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ
／ａｓＭＳＨａをＣｌａＩとＰａｃＩで切断したものと
を、２９３細胞へ共トランスフェクションした。実施例
１で述べたような細胞培養での工夫をする必要なく、従
来通りの培養方法で、多数のプラークを分離することが
でき、ウイルスゲノムの解析結果からも、予想通りのＦ
／ａｓＭＳＨａ変異をもったＡｄ５ｄｌＸの変異株であ
ることが確認された。実施例１で述べたウイルスと区別
するためこれをＡｄ５−Ｆ／ａｓＭＳＨａと名付けた。
Ａｄ５−Ｆ／ａｓＭＳＨａウイルスのストック液のタイ
ターは１．１０×１０８ｐｆｕ／ｍｌと、実用上充分に
高いタイターが得られた。
【００４１】実施例３ レポーターｌａｃＺ遺伝子を発
現するＦ／ａｓＭＳＨａファイバー変異型組み換えアデ
ノウイルスＡｘＣＡＺ３−Ｆ／ａｓＭＳＨａの作成 Ｅ１Ａ領域に各種外来性遺伝子の発現カセットを組み込
んだＦ／ａｓＭＳＨａファイバー変異型アデノウイルス
作成が可能なことを示すため、まずレポーターとして大
腸菌ｌａｃＺ遺伝子を発現する組み換え体の作成を試み
た。
【００４２】Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８
に記載されたｐＣＡＺ２からｌａｃＺを含むＡｓｅＩ断
片（末端平滑化）約４８８９ｂｐを、プロメガ社（Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入したｐＣＩプラス
ミドのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ（末端平滑化）サイトへク
ローニングしてｐＣＡＺ３を得た。これからＢｇｌＩＩ
／ＢａｍＨＩ断片（末端平滑化）約５１５３ｂｐを切り
出し、コスミドｐＡｘ−ｃｗ（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６）のＳｗａＩサイトにクローニングして
ｐＡｘＣＡＺ３を得た。このコスミドＤＮＡと、Ａｄ５
ｄｌＸのＤＮＡ−ＴＰＣを用いて野生型ファイバー（Ｆ
／ｗｔ）の組み換えアデノウイルスＡｘＣＡＺ３−Ｆ／
ｗｔを得た。これからさらにＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、
これをＥｃｏＲＩとＡｓｅＩで切断したものと、実施例
２で得られたＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ａｓＭＳＨａコスミド
ＤＮＡをＣｌａＩとＰａｃＩで切断したものとを、２９
３細胞へ共トランスフェクションした。従来通りの培養
法で多数のプラークを分離することができ、ウイルスゲ
ノムの解析結果からも、予想通りのＦ／ａｓＭＳＨａ変
異をもち、なおかつ、Ｅ１Ａ領域にレポーターｌａｃＺ
発現カセットをもつ組換えアデノウイルスであることが
確認された。この組換えウイルスをＡｘＣＡＺ３−Ｆ／
ａｓＭＳＨａと名付けた。
【００４３】実施例４ ＭＳＨ受容体（以下、ＭＳＨＲ
と略記する）を高発現する宿主細胞を用いた、Ｆ／ａｓ
ＭＳＨａ変異型アデノウイルスの作成 ａ）ＭＳＨＲを発現するレトロウイルスベクターの作成 ヒトのメラノーマ細胞Ａ３７５の粗ＲＮＡから得たｃＤ
ＮＡをテンプレートとし、ＭＳＨＲをコードする領域の
Ｎ末側半分をプライマーＮｏ．１０３７（配列番号８）
とＮｏ．１０４０（配列番号１１）、Ｃ末側半分をプラ
イマーＮｏ．１０３８（配列番号９）とＮｏ．１０３９
（配列番号１０）を用いて増幅（ＲＴ−ＰＣＲ法）し、
ＭＳＨＲのｃＤＮＡ断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片
をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断して、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩＳＫ＋のＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩサイトにクロ
ーニングしたのち塩基配列を確認した。これから、Ｎ末
側をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ、Ｃ末側をＫｐｎＩ／Ｎｏｔ
Ｉでそれぞれ切り出して、レトロウイルス作成用のプラ
スミドのｐＲｘ−ｂｓｒ〔Ｓｈｉｎｏｕｒａ ｅｔａ
ｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１９８３
−１９９３（１９９８）〕のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイ
トへ３パート・ライゲーションでクローニングしてプラ
スミドｐＲｘｈＭＳＨＲを得た。このプラスミドを用い
て文献（濱田洋文ら、レトロウイルスベクター 日本遺
伝子治療学会編集：遺伝子治療開発研究ハンドブック
第３章 導入技術、印刷中、エヌ・ティー・エス、１９
９９）に記載の方法を用いてＭＳＨ発現レトロウイルス
産生細胞のψＣＲＩＰ／ＭＳＨＲを樹立した。
【００４４】ｂ）ＭＳＨＲを高発現する２９３宿主細胞
由来の細胞株の作成 ψＣＲＩＰ／ＭＳＨＲの培養上清中のレトロウイルスを
２９３細胞に感染させることによりＭＳＨＲを高発現す
る２９３／ＭＳＨＲ細胞株を得た。ｃ）２９３／ＭＳＨ
Ｒを用いたＦ／ａｓＭＳＨａ変異型アデノウイルスの増
幅通常のアデノウイルス作成の宿主として用いる２９３
細胞の代わりに、２９３／ＭＳＨＲ細胞を用いてＦ／ａ
ｓＭＳＨａ変異型アデノウイルスのタイターをプラーク
アッセイ法で測定すると、同一の液をアッセイしている
にもかかわらず、２９３細胞で得られるタイター値に比
べて３から１０倍高い見かけ上のタイター値が得られ
た。これは、２９３細胞を使った場合に比べて２９３／
ＭＳＨＲ細胞を使えばＦ／ａｓＭＳＨａ変異型アデノウ
イルスの感染効率ならびにプラーク形成率が高まるため
と考えられる。つまり、２９３／ＭＳＨＲ細胞を宿主と
して用いれば、２９３細胞を使う場合よりもさらに高い
タイターのウイルス液を調製できると考えられる。
【００４５】実施例５ β−ＭＳＨ融合ファイバー変異
型の組換えアデノウイルスの作成 実施例１から４までは、ヒトα−ＭＳＨ融合ファイバー
変異型アデノウイルスの作成例を示した。さらに、α−
ＭＳＨ以外のリガンドに関しても悪性黒色腫細胞の治療
に有用なファイバー変異型ウイルスを作成することが可
能かどうかを、β−ＭＳＨをリガンドの一例として用い
て検討した。 ａ）β−ＭＳＨ融合ファイバータンパク質をコードする
プラスミドＤＮＡの作成β−ＭＳＨをコードするＰＣＲ
用のプライマーＮｏ．１０７５を新しく作成した（配列
番号１２） Ｎｏ．１０７５とＮｏ．１０９２（実施例２に記載）を
プライマーとして、ｐＳＫＩＩ＋６．７Ｒｎｐをテンプ
レートとしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＢａ
ｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断して、ｐＮＥＢ１９３のＢａ
ｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにクローニングした後、塩基
配列を確認した。β−ＭＳＨをコードするＤＮＡ断片を
ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩで切り出し、実施例２で得られた
ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨａのＢａｍＨＩ／Ｋｐ
ｎＩサイトにクローニングしてｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａ
ｓＭＳＨｂを得た。さらにこのＥｃｏＲＩサイトに、ｐ
ＡｘＫＭのＥｃｏＲＩ断片（約２５ｋｂｐ）を順方向に
クローニングして、ｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ａｓＭＳＨｂ
コスミドＤＮＡを得た。
【００４６】ｂ）β−ＭＳＨ融合ファイバー変異型アデ
ノウイルスの作成 実施例２と同様の方法で、Ａｄ５ｄｌＸのＤＮＡ−ＴＰ
ＣとｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ａｓＭＳＨｂのＤＮＡを２９
３細胞に共トランスフェクトすることにより、β−ＭＳ
Ｈ融合ファイバー変異型アデノウイルスＡｄ５−Ｆ／ａ
ｓＭＳＨｂを作成した。多くのプラークが得られ、ウイ
ルスゲノムの解析からも、目的としたＦ／ａｓＭＳＨｂ
変異ウイルスが得られたことが確認された。
【００４７】さらに実施例３と同様の方法で、ＡｘＣＡ
Ｚ３−Ｆ／ｗｔのＤＮＡ−ＴＰＣとｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ
／ａｓＭＳＨｂのＤＮＡを２９３細胞に共トランスフェ
クトすることにより、大腸菌ｌａｃＺレポーター遺伝子
発現カセットを持ち、なおかつ、β−ＭＳＨ融合ファイ
バー変異型の組換えアデノウイルスＡｘＣＡＺ３−Ｆ／
ａｓＭＳＨｂを作成した。Ｆ／ａｓＭＳＨｂ変異型のフ
ァイバーのＤＮＡ配列を配列番号１３に示した。
【００４８】実施例６ ＧＳリンカーを持つＭＳＨ融合
ファイバー変異型アデノウイルスの作成 実施例１から５までは、アデノウイルスのファイバータ
ンパク質のＣ末端にＡＳリンカー（ＰＳＡＳＡＳＡＳＡ
ＰＧ 配列番号２５）をはさんでα−ＭＳＨないしβ−
ＭＳＨのリガンドのアミノ酸配列が続く構造（β−ＭＳ
Ｈのリガンドの場合のＡＳリンカーは、Ｃ末端にさらに
セリン残基が付加されている）をもつ変異型アデノウイ
ルスの作成例を示した。さらにＡＳリンカー以外のリン
カーに関しても、悪性黒色腫細胞の治療に有用なファイ
バー変異型ウイルスを作成することが可能かどうかを、
ＧＳリンカー（ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ配列番号２７；
β−ＭＳＨのリガンドの場合は、Ｃ末端にさらにセリン
残基が付加されている）を一つの例として用いて検討し
た。 ａ）ＧＳリンカーをコードするプラスミドＤＮＡの作成 ＧＳリンカーをコードするプライマーＮｏ．１０６０
（６１ｍｅｒ 配列番号１４）を新たに合成した。さら
にＰＣＲ反応を容易にするために、Ｎｏ．１０６０より
も短くコドンの使用も少し異なるプライマーＮｏ．１０
９８（４１ｍｅｒ配列番号１５）を新たに合成した。ｐ
ＳＫＩＩ＋６．７Ｒ−Ｋ２０をテンプレートとしてさら
にＮｏ．９３１（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９
９８に記載 配列番号１６）とＮｏ．１０６０でＰＣＲ
反応を行い、そのＰＣＲ産物をテンプレートとしてさら
にＮｏ．９３１とＮｏ．１０９８でＰＣＲ反応を行っ
た。
【００４９】このＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂａｍ
ＨＩで切断してｐＮＥＢ１９３にクローニングして、塩
基配列を確認した。次にｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳ
ＨａとｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨｂのＡＳリンカ
ーを含むＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩのＤＮＡ断片を、ＧＳリ
ンカーを含むＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片にそれ
ぞれ入れ替えることにより、ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓ
ＭＳＨａとｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＨＳＨｂを得た。
それぞれのコスミドＤＮＡのＥｃｏＲＩサイトにｐＡｘ
ＫＭからのＥｃｏＲＩ断片（約２５ｋｂｐ）を順方向で
クローニングすることにより、それぞれｐＷＥＡｘＫＭ
−Ｆ／ｇｓＭＳＨａとｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ｇｓＭＳＨ
ｂを得た。
【００５０】ｂ）ＧＳリンカーを有するＭＳＨ融合ファ
イバー変異型アデノウイルスの作成 ａ）で作成したコスミドを、Ａｄ５ｄｌＸないしＡｘＣ
ＡＺ３−Ｆ／ｗｔ由来のＤＮＡ−ＴＰＣと共トランスフ
ェクトすることにより、ＧＳリンカーを有するＭＳＨ融
合ファイバー変異型アデノウイルス４種を樹立できた。
すなわち、Ａｄ５−Ｆ／ｇｓＭＳＨａ，Ａｄ５−Ｆ／ｇ
ｓＭＳＨｂ，ＡｘＣＡＺ３−Ｆ／ｇｓＭＳＨａ，ならび
にＡｘＣＡＺ３−Ｆ／ｇｓＭＳＨｂである。以上の４種
は、ウイルスゲノムの解析結果からも、目的とする変異
型アデノウイルスであることが確認された。Ｆ／ｇｓＭ
ＳＨａとＦ／ｇｓＭＳＨｂのファイバーをコードする塩
基配列およびそれがコードするアミノ酸配列をそれぞれ
配列番号１７、１８に示した。
【００５１】実施例７ Ｋ２１リンカーを持つＭＳＨ融
合ファイバー変異型アデノウイルスの作成 実施例１から６までは、ＡＳリンカーないしＧＳリンカ
ーのような１１〜１２アミノ酸程度の比較的短いリンカ
ー配列を有する変異型アデノウイルスの作成例を示した
が、さらに多数のアミノ酸配列を有するリンカーに関し
ても悪性黒色腫細胞の治療に有用なファイバー変異型ウ
イルスを作成することが可能かどうかを、ＡＳリンカー
（１１アミノ酸）またはＧＳリンカー（１１アミノ酸）
に２５残基のアミノ酸配列（計３７アミノ酸）を加えた
リンカーであるａｓＫ２１リンカー（配列番号２９）と
ｇｓＫ２１リンカー（配列番号３１）を例として用いて
検討した。 ａ）ａｓＫ２１リンカーならびにｇｓＫ２１リンカーを
コードするプラスミドＤＮＡの作成 Ｋ２１リンカーをコードするプライマーＮｏ．１０８９
（１２８ｍｅｒ 配列番号１９）を新たに合成した。Ｎ
ｏ．１０８９とＮｏ．１０９２のプライマーを用いてｐ
ＳＫＩＩ＋６．７ＲｎｐをテンプレートにしてＰＣＲ反
応を行い、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩサイトにクローニン
グし、塩基配列を確認した。これのＫ２１リンカーをコ
ードする領域であるＢｇｌＩＩからＢａｍＨＩまでのＤ
ＮＡ断片をｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨａ，ｐＷＥ
６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨａ，ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａ
ｓＭＳＨｂ，ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨｂのＢａ
ｍＨＩサイトへ挿入することによって、それぞれｐＷＥ
６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨａ，ｐＷＥ６．７Ｒ−
Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨａ，ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＫ
２１ＭＳＨｂ，ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨｂのコ
スミドＤＮＡを得た。これらのＫ２１リンカーを含むフ
ァイバーをコードするコスミドのＥｃｏＲＩサイトに、
ｐＡｘＫＭのＥｃｏＲＩ断片（約２５ｋｂｐ）を順方向
でクローニングすることにより、それぞれｐＷＥＡｘＫ
Ｍ−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨａ，ｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ｇ
ｓＫ２１ＭＳＨａ，ｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ａｓＫ２１Ｍ
ＳＨｂ，ｐＷＥＡｘＫＭ−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨｂのコ
スミドＤＮＡを得た。
【００５２】ｂ）ａｓＫ２１リンカーならびにｇｓＫ２
１リンカーを有するＭＳＨ融合ファイバー変異型アデノ
ウイルスの作成 ａ）で作成したコスミドＤＮＡを、Ａｄ５ｄｌＸのＤＮ
Ａ−ＴＰＣと共トランスフェクトすることにより、それ
ぞれＡｄ５−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨａ，Ａｄ５−Ｆ／ｇ
ｓＫ２１ＭＳＨａ，Ａｄ５−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨｂ，
Ａｄ５−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨｂのアデノウイルスを樹
立することができた。Ａｄ５−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨ
ａ、Ａｄ５−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨａ、Ａｄ５−Ｆ／ａ
ｓＫ２１ＭＳＨｂ、Ａｄ５−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨｂの
ファイバーをコードする領域のＤＮＡ配列およびコード
するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２０、２１、２
２、２３に示した。また同様にして、ＡｘＣＡＺ３−Ｆ
／ｗｔのＤＮＡ−ＴＰＣと共トランスフェクトすること
により、それぞれ、ＡｘＣＡＺ３−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳ
Ｈａ，ＡｘＣＡＺ３−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨａ，ＡｘＣ
ＡＺ３−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨｂ，ＡｘＣＡＺ３−Ｆ／
ａｓＫ２１ＭＳＨｂのアデノウイルスを樹立することが
できた。以上の８種は、ウイルスゲノムの解析結果から
も、目的とするファイバー変異型アデノウイルスである
ことが確認された。
【００５３】
【発明の効果】本発明によれば、ウイルスを構成してい
るタンパク質にＭＳＨ受容体に特異的に結合するリガン
ドを結合させてなるウイルスベクター、および該ベクタ
ーを用いた悪性黒色腫等のＭＳＨ受容体を発現している
腫瘍に対する診断薬および治療薬を提供することができ
る。
【００５４】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：５型アデノウイ
ルスのファイバーの一部、ＡＳリンカーペプチドおよび
α−ＭＳＨをコードするＤＮＡ 配列番号２：配列番号１のＤＮＡをＰＣＲで増幅させる
ためのテンプレートとして使用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．
９２４ 配列番号３：配列番号１のＤＮＡをＰＣＲで増幅させる
ためのセンスプライマーとして使用する合成ＤＮＡ Ｎ
ｏ．９３３ 配列番号４：配列番号１のＤＮＡをＰＣＲで増幅させる
ためのアンチセンスプライマーとして使用する合成ＤＮ
Ａ Ｎｏ．９３４ 配列番号５：α−ＭＳＨおよびアデノウイルスのファイ
バーのポリＡシグナルをコードするＤＮＡをＰＣＲで増
幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成Ｄ
ＮＡ Ｎｏ．１０６１ 配列番号６：α−ＭＳＨおよびアデノウイルスのファイ
バーのポリＡシグナルをコードするＤＮＡをＰＣＲで増
幅させるためのアンチセンスプライマーとして使用する
合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０９２ 配列番号７：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨａの変異
型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号８：ヒトＭＳＨ受容体の１−１５４残基をコー
ドするＤＮＡをＰＣＲで増幅させるためのセンスプライ
マーとして使用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０３７ 配列番号９：ヒトＭＳＨ受容体の１５０−３１７残基を
コードするＤＮＡをＰＣＲで増幅させるためのアンチセ
ンスプライマーとして使用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０
３８ 配列番号１０：ヒトＭＳＨ受容体の１５０−３１７残基
をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅させるためのセンス
プライマーとして使用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０３９ 配列番号１１：ヒトＭＳＨ受容体の１−１５４残基をコ
ードするＤＮＡをＰＣＲで増幅させるためのアンチセン
スプライマーとして使用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０４
０ 配列番号１２：β−ＭＳＨおよびアデノウイルスのファ
イバーのポリＡシグナルをコードするＤＮＡをＰＣＲで
増幅させるためのセンスプライマーとして使用する合成
ＤＮＡＮｏ．１０７５ 配列番号１３：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨｂの変
異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号１４：５型アデノウイルスのファイバーの一部
およびＧＳリンカーペプチドをコードするＤＮＡをＰＣ
Ｒで増幅させるためのアンチセンスプライマーとして使
用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０６０ 配列番号１５：５型アデノウイルスのファイバーの一部
およびＧＳリンカーペプチドをコードするＤＮＡをＰＣ
Ｒで増幅させるためのアンチセンスプライマーとして使
用する合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０９８ 配列番号１６：５型アデノウイルスのファイバーの一部
およびＧＳリンカーペプチドをコードするＤＮＡをＰＣ
Ｒで増幅させるためのセンスプライマーとして使用する
合成ＤＮＡ Ｎｏ．９３１ 配列番号１７：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨａの変
異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号１８：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨｂの変
異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号１９：Ｋ２１リンカーをコードするＤＮＡをＰ
ＣＲで増幅させるためのセンスプライマーとして使用す
る合成ＤＮＡ Ｎｏ．１０８９ 配列番号２０：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨ
ａの変異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号２１：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨ
ａの変異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号２２：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨ
ｂの変異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号２３：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨ
ｂの変異型ファイバータンパク質をコードするＤＮＡ 配列番号２４：ＡＳリンカーをコードするＤＮＡ 配列番号２５：ＡＳリンカーペプチド 配列番号２６：ＧＳリンカーをコードするＤＮＡ 配列番号２７：ＧＳリンカーペプチド 配列番号２８：ａｓＫ２１リンカーをコードするＤＮＡ 配列番号２９：ａｓＫ２１リンカーペプチド 配列番号３０：ｇｓＫ２１リンカーをコードするＤＮＡ 配列番号３１：ｇｓＫ２１リンカーペプチド 配列番号３２：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨａにコ
ードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３３：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＭＳＨｂにコ
ードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３４：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨａにコ
ードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３５：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＭＳＨｂにコ
ードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３６：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨ
ａにコードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３７：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨ
ａにコードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３８：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ａｓＫ２１ＭＳＨ
ｂにコードされる変異型ファイバータンパク質 配列番号３９：ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｇｓＫ２１ＭＳＨ
ｂにコードされる変異型ファイバータンパク質
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２９３細胞に対し、野生型アデノウイルスＡ
ｄ５ｄｌＸ−Ｆ／ｗｔおよびＦ／ＭＳＨ変異型アデノウ
イルスＡｄ５−Ｆ／ＭＳＨを感染させ４日間培養後の細
胞形態を示す図である。Ａはコントロールの擬似感染、
Ｂは野生型アデノウイルスＡｄ５ｄｌＸ−Ｆ／ｗｔ、Ｃ
はＦ／ＭＳＨ変異型アデノウイルスＡｄ５−Ｆ／ＭＳＨ
を感染させたものをそれぞれ示す。
【図２】 Ａ３７５細胞に対し、野生型アデノウイルス
Ａｄ５ｄｌＸ−Ｆ／ｗｔを感染させ４日間培養後の細胞
形態を示す図である。Ｄはコントロールの擬似感染、Ｅ
とＦは野生型アデノウイルスＡｄ５ｄｌＸ−Ｆ／ｗｔを
それぞれＭＯＩ１０、３０で感染させたものをそれぞれ
示す。
【図３】 Ａ３７５細胞に対し、Ｆ／ＭＳＨ変異型アデ
ノウイルスＡｄ５−Ｆ／ＭＳＨを感染させ４日間培養後
の細胞形態を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/075 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/075 14/52 ４Ｈ０４５ 14/52 14/68 14/68 14/72 14/72 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 9/12 9/12 9/80 Ｚ 9/80 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA10 BA11 BA21 CA04 DA06 EA02 EA06 GA11 HA01 4B050 DD02 DD20 LL01 4B065 AA26X AA99Y AB01 BA02 CA24 CA29 CA31 CA44 4C084 AA07 AA13 BA01 BA22 ZB262 4C085 AA26 BA77 BA78 BA85 BB22 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 ZB26 4H045 AA10 BA01 CA01 CA40 DA01 DA89 EA22 EA28 FA74

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルスを構成するタンパク質に、メラ
    ニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）受容体に特異的に結合
    するリガンドを結合させてなるウイルスベクター。
  2. 【請求項２】 ウイルスを構成するタンパク質が、リン
    カーを介してメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）受容
    体に特異的に結合するリガンドに結合している請求項１
    記載のウイルスベクター。
  3. 【請求項３】 リンカーがオリゴペプチドである請求項
    ２記載のベクター。
  4. 【請求項４】 リンカーが配列番号２５、２７、２９お
    よび３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する請
    求項３記載のベクター。
  5. 【請求項５】 ウイルスを構成するタンパク質が、ウイ
    ルスの外表面を構成するタンパク質である請求項１〜４
    のいずれかに記載のベクター。
  6. 【請求項６】 リガンドが、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、
    γ−ＭＳＨおよびこれらのいずれかの誘導体からなる群
    より選ばれるリガンドである請求項１〜５のいずれかに
    記載のベクター。
  7. 【請求項７】 ウイルスが、アデノウイルス科、レトロ
    ウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、
    ポックスウイルス科、パポーバウイルス科、ヘパドナウ
    イルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナ
    ウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス
    科、オルソミクソウイルス科、バンヤウイルス科、アレ
    ナウイルス科およびレオウイルス科よりなる群のいずれ
    かの科に属するウイルスから選ばれる請求項１〜６のい
    ずれかに記載のベクター。
  8. 【請求項８】 ウイルスがヒトアデノウイルスである請
    求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
  9. 【請求項９】 ウイルスが外来の遺伝子を含むウイルス
    である請求項１〜８のいずれかに記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 遺伝子が、非毒性のプロドラッグを細
    胞毒性を有する薬剤に変換することができる酵素をコー
    ドする遺伝子である請求項９記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 遺伝子が、単純ヘルペスウイルス・チ
    ミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）またはシトシン・デア
    ミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，Ｃ
    Ｄ）をコードするものである請求項１０記載のベクタ
    ー。
  12. 【請求項１２】 遺伝子が、直接または間接的に細胞毒
    性作用を有する分子をコードするものである請求項９記
    載のベクター。
  13. 【請求項１３】 遺伝子がサイトカイン、細胞増殖因子
    または細胞増殖抑制因子をコードするものである請求項
    １２記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調
    節遺伝子または細胞死調節遺伝子である請求項１２記載
    のベクター。
  15. 【請求項１５】 外来の遺伝子が、アデノウイルスＥ１
    ＡないしＥ１Ｂの野生型または変異型の遺伝子の全部ま
    たは一部である請求項９記載のベクター。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれかに記載のベ
    クターを含有してなる医薬。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜１５のいずれかに記載のベ
    クターを含有してなる抗腫瘍剤。
  18. 【請求項１８】 腫瘍が悪性黒色腫である請求項１７記
    載の抗腫瘍剤。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜１５のいずれかに記載のベ
    クターを含有してなる腫瘍の診断薬。
  20. 【請求項２０】 腫瘍が悪性黒色腫である請求項１９記
    載の診断薬。
  21. 【請求項２１】 配列番号２５、２７、２９および３１
    のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するリンカー。
  22. 【請求項２２】 請求項２１記載のリンカーをコードす
    るＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 配列番号２４、２６、２８および３０
    のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡ。
  24. 【請求項２４】 配列番号３２〜３９のいずれかに示さ
    れるアミノ酸配列を有するタンパク質。
  25. 【請求項２５】 請求項２４記載のタンパク質をコード
    するＤＮＡ。
  26. 【請求項２６】 配列番号７、１３、１７、１８、２
    ０、２１、２２および２３のいずれかに示される塩基配
    列からなるＤＮＡ。
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