JP2002500637A

JP2002500637A - 遺伝物質のデリバリー用パポバウイルスカプシド蛋白質の使用

Info

Publication number: JP2002500637A
Application number: JP54673898A
Authority: JP
Inventors: エレイングリフィン，ビヴァリー; シェイラクラウゼウィック，ニーナ
Original assignee: アールピーエムエステクノロジーリミテッド
Priority date: 1997-04-26
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2002-01-08
Also published as: EP0977596A1; DE69821227D1; EP0977596B1; WO1998048841A1; AU7220198A

Abstract

(57)【要約】本発明は、パポバウイルス主要カプシド抗原からなりマイナーカプシド抗原を除く偽カプシドの、該偽カプシドはそれと結合した外因性材料を有する、該外因性材料が細胞に取り込まれ且つその細胞中の生物学的に機能するようにニューロンの宿主細胞を治療するための偽カプシド組成物の製造においての使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝物質のデリバリー用パポバウイルスカプシド蛋白質の使用本発明はデリバリー用の物質のパッケージング、例えば遺伝子治療や他の状況におけるものに関する。遺伝子移入は、遺伝子治療を行うための手段として、益々重要になってきている。選択した遺伝子を適切な受容宿主に導入するために、真核細胞に感染するウイルス本来の能力を利用する数多くの研究がなされている(Anderson，1992;Morg an及びAnderson，1993;Mulligan，1993でレビューされたように)。この目的のためにはアデノウイルスが特に魅力的であり、これはそのゲノムを操作して約８ｋｂｐまでの外因性ＤＮＡを導入することができ、またレトロウイルスとは異なり、形質導入された遺伝子は、非分裂細胞において発現することが可能であるからである。しかしながら、現在のウイルスベクターの全てに共通する一の難点は、ウイルスの望まない遺伝情報を重要な遺伝子とともに受容宿主へ導入してしまうことである。この望ましくないウイルス性物質についての難点は、完全に決定する必要があるが、標的細胞へのウイルス遺伝子の望まない導入を行うことのない、改善された遺伝子移入を行う手段の必要性は非常に大きい。物理的、非ウイルス性遺伝子移入法、例えば化学的及び機械的手法、並びにリポソームによる膜融合仲介性移入が使用されている(Morgan及びAnderson 1993) 。しかしながら、移入された遺伝物質の発現で表した移入効率は低い。言い換えると、これらの方法は、遺伝物質が生物学的に機能するような安定な様式で、当該物質を細胞内へ移入する点においては不十分である。マウスポリオーマウイルス等のパポバウイルスの空のカプシドは、遺伝子移入用の可能なベクターとして注目されている。 Barrら（1979）は、ポリオーマＤＮＡ及び精製した空のカプシドを無細胞系でインキュベーションして、ポリオーマの空の粒子を使用することを最初に記載している。この新規の粒子のＤＮＡは、膵ＤＮａｓｅの作用から保護されていた。 Slilaty及びAposhian（1983）は、形質転換性のポリオーマのＤＮＡ断片をラットFIII細胞へ移入するために、再構築した粒子の使用を記載している。空のカプシド及び再構築した粒子は、ポリオーマカプシド抗原であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３つ全てからなっていて、主要カプシド抗原ＶＰ１のみからなる偽カプシド（pseudocapsid）を遺伝子移入において使用することができるという示唆は一切ない。 Montrossら（1991）は、主要カプシド抗原、ポリオーマウイルスＶＰ１遺伝子のクローニング及び昆虫細胞内でのその発現のみについて記載している。ＶＰ１からなる空の偽カプシドの自己集合が開示されていて、また偽カプシドにはＤＮＡが含まれていないと言及されている。ＤＮＡは、ＶＰ１から空の偽カプシドへの試験管内集合を阻害することが報告されているが、これは当該偽カプシドが、宿主細胞へ移入するための外因性ＤＮＡをパッケージすることには使用できないことを示唆している。Sandigら（1993）の結果は、空のカプシドは、粒子がポリオーマカプシド抗原のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３つ全てからなっている場合にのみ、宿主細胞へ生物学的に機能するようにして外因性ＤＮＡを導入することを示した。ＶＰ１からなる偽カプシドは、宿主細胞内で発現されるように外因性ＤＮＡを搬入することができる程度には安定ではないといわれていた。Hagens eeら（J．Virol.，67，315-322，1993）は、ヒトパピローマウイルスのカプシドＬ１及びＬ１／Ｌ２の産生を開示したが、外因性物質を持たせるためのそれらの使用については言及していない。より最近になってから、Forstovaら（Human Gene Therapy,6:297-306，1995）は、マウスポリオーマの偽カプシドを使用することを報告しているが、これはマイナーカプシド抗原を含まず、主要カプシド抗原ＶＰ１からなっていて、これにより異種ＤＮＡをラットの細胞へ導入し、これにより当該異種ＤＮＡを発現した。Forstoveら（1995）の開示は、特にＶＰ１偽カプシドの調製について記載した方法であるが、これを参照することにより本願に組み込む。神経系細胞への遺伝子移入に関する研究は、神経科学における最も急速に成長している分野の一つである。遺伝子移入についての重要な適用は遺伝子治療であり、これは治療性の遺伝子を、エクスビボ、又はインビボの手法により神経系の細胞へ導入することに基礎をおいている。効率がよく、安全なベクターの開発の結果、治療性の遺伝子で適切なプロモータの制御下にあるものを、適切なニューロン又はグリア細胞に標的化することが可能である。遺伝子治療は、神経系の遺伝性疾患や悪性の腫瘍形成の制御に適用することが可能であるのみならず、後天性の変性脳障害(アルツハイマー病、パーキンソン病)や、神経の成長を促進し、種々の病理的段階における再生のための治療の可能性を有している。本発明は、外因性物質を移入するための既知のウイルス的及び非ウイルス的方法に関しての上記の問題を解決することを目的としているが、これはパポバウイルスの主要カプシド抗原からなる偽カプシドを使用して、外因性物質を宿主の神経細胞へ移入し、当該物質を生物学的に機能させることを含む方法を提供することにより達成される。本発明は、外因性物質が細胞に取りこまれて、その細胞内で生物学的に機能するようにして、神経宿主細胞を治療するための擬カプシド組成物の製造において、パポバウイルスの主要カプシド抗原から形成され、マイナーなカプシド抗原を排除した偽カプシドの使用を提供するものであるが、ここで偽カプシドは、それと結合した外因性物質を有するものである。好ましくは、ニューロン宿主細胞は、哺乳動物の中枢神経系に由来するか、又はそれに存在しているものである。好ましくは、ニューロン宿主細胞は、哺乳動物の脳に由来するか、又はそれに存在しているものである。好ましくは、主要カプシド抗原は、ヒトパピローマウイルス；マウスポリオーマウイルス、ウシパピローマウイルス；シミアンウイルス４０；又はヒトポリオーマウイルスＢＫの−、又はそれ以上に由来するものである。好ましくは、主要カプシド抗原は、マウスポリオーマウイルスのＶＰ１である。好ましくは、宿主細胞内での外因性物質の生物学的機能は、細胞又はその細胞を含む哺乳動物において、有益な効果を有するものであり、特に神経系疾患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の治療及び／又は予防を行うものである。好ましくは、外因性物質は遺伝物質であり、好ましくは少なくとも一の遺伝子の全て又はコード領域部分を具備するものである。好ましくは、当該遺伝子は神経成長因子、チロシンヒドロキシラーゼ、又は神経アポトーシス-阻害蛋白質の一以上より選択される。好ましくは、当該遺伝子又は当該遺伝子群の発現は、神経系特異的プロモータ又は特定の神経細胞部分母集団特異的プロモータの制御下にある。好ましくは、プロモータは神経フィラメント軽鎖、神経特異的エノラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ、グリア酸性筋原線維蛋白質、Ｔα-1 チューブリン、血小板由来成長因子のβ鎖、ミエリン塩基性蛋白質、及びプレプロエンケファリン用のプロモータより選択される。生物学的機能は、特定の興味ある細胞又は組織のタイプに向けることが可能であるので、これは有益である。従って、他の細胞又は組織での生物学的機能による副作用は最小限に抑えられる。別の態様において、本発明は、パポバウイルスの主要カプシド抗原から形成され、且つマイナーなカプシド抗原を除外している空の偽カプシドを準備し、当該空の偽カプシド及び外因性物質を混合することにより当該外因性物質を当該偽カプシドと結合させることを具備した、偽カプシド組成物の調整方法を提供するものであるが、ここで外因性物質は、使用時に神経宿主細胞内の当該外因性物質の生物学的機能が、神経疾患を治療及び／又は予防することにより、当該細胞又はその細胞を含む哺乳動物に有益な効果を与えるようにして選択される。別の態様において本発明は、パポバウイルスの主要カプシド抗原から形成され、且つマイナーなカプシド抗原を除外している偽カプシドを具備した薬学的組成物であって、偽カプシドがそれと結合した薬学的に活性な化合物を有するものを提供するが、ここで偽カプシドは薬学的に許容される担体とともに提供されるものであり、薬学的に活性な化合物は、神経疾患を治療及び／又は予防することにより神経宿主細胞又はその細胞を含む哺乳動物に対して有益な効果を与えるものである。好ましくは、薬学的組成物は、鼻腔内、腹腔内、静脈内、又は皮下的投与に適応されている。 "偽カプシド"とは、唯一のパポバウイルスカプシド抗原が主要カプシド抗原であり、マイナーなカプシド抗原を含まないものを意味するが、この構造は外因性物質を保持することが可能なように中空となっている。 "パポバウイルス"とは、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)、ポリオーマウイルス(マウスのウイルス)、ヒトにおける変異株(ＢＫ及びＪＣ等)、ヒト及びウシにおける変異体を含むパピローマウイルス並びに他のメンバーを含むウイルスの一般的なファミリー（科）を意味する。それぞれの場合に、主要カプシド抗原及び一以上のマイナーカプシド抗原が存在する。例えば、パピローマウイルスにおいては、主要抗原はＬ１であり、マイナー抗原はＬ２である。別のパポバウイルスの場合、主要カプシド抗原はＶＰ１である。本発明においては、"偽カプシド"は、主要カプシド抗原から形成されるがマイナーカプシドからは形成されない。 "主要カプシド抗原"には、その保存的変異体で偽カプシドへの集合化能を有し、好ましくは野生型抗原と共通の抗原決定基を有するものが含まれる。カプシド抗原は、ポリオーマウイルスの主要カプシド抗原、例えばヒトＢＫウイルス主要カプシド抗原とマウスポリオーマウイルスＶＰ１とのハイブリッドとすることができる。外因性物質が偽カプシド"と結合している"とは、その物質がそれにより保護されることを意味する。例えば、外因性ＤＮＡは、ＤＮａｓｅＩ等のＤＮａｓｅによる分解より保護されるであろうし、また外因性蛋白質はプロテアーゼより保護されるであろう。外因性物質は、空の偽カプシド内に取り込まれ、又はカプシド抗原で包みこまれる。本願において"外因性物質"という用語は、野生型パポバウイルスの核酸以外の物質を意味する。好ましくはこの物質は遺伝物質、例えばＤＮＡである。 "神経細胞"という用語は、哺乳動物の神経系の細胞を包含する意味であり、特に中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞で、血液脳関門（bbb）内に位置するもの、特には脳の細胞を意味する。好ましい神経細胞には、脊髄、小脳、脳幹神経節、視床、海馬、黒質、新皮質、神経冠由来の内皮細胞、胎神経細胞（foetal neurons ）、神経多能性細胞株、副腎クロム親和細胞、線条、グリア細胞、筋原細胞、線維芽細胞が含まれる。好ましい神経細胞は分裂することができない分化した神経細胞である。 "有益な効果"とは、治療効果のみならず非治療的適用にも有益である他の効果を包含する意味である。例えば、外因性物質の生物学的機能により、所望の細胞タイプを容易に検出することが可能である。このような検出は、診断的適用のみならず、神経細胞の実験的研究にも価値がある。 "神経疾患"という用語は、哺乳動物、特にはヒトの神経系の細胞の生理学的状態により引き起こされるか又は影響を受ける、いかなる疾患をも包含する意味である。このような神経疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、グリオーシス、自律神経失調症、及びトマキュラス（Tomaculous）神経障害が挙げられる。本願発明者らは、パポバウイルスの主要カプシド抗原のみが関与する偽カプシドからなる簡略化された担体が、外因性ＤＮＡをパッケージしてそれを保護し、機能的発現がなされるようにして細胞内へそれを導入することが可能であることを証明した。ｄｌ８ＭＴと命名され、マウスポリオーマウイルスのミドルＴ抗原（ＭＴ）についての能率的形質転換変異株である、十分に特徴付けされた遺伝子（Griffin及びMaddoxk，1979）を選んで、このシステムの価値を示した。このｄｌ 8-由来抗原は、顕著な物理的及び生物学的特徴を有するものであり、これにより簡単にアッセイされ、また受容細胞を偶発的に汚染したいかなる野生型のウイルス遺伝子産物からも容易に識別される。パポバウイルスは広い宿主範囲を有しており、感受性細胞には、哺乳動物細胞、例えば齧歯類やヒトの細胞等が含まれる(Pontcn，1971)。本発明者らは、偽カプシドによりヒトの細胞内へ外因性遺伝物質をうまく移入することが可能なことを証明した。物理的、非ウイルス性遺伝子移入方法、例えば化学的及び機械的手法、並びにリポソームを利用した膜融合仲介性移入が、最近レビューされかつ評価されている(Morgan及びAnderson，1993)。本発明の偽カプシド（遺伝物質が関与する好ましい態様におけるもの）によるアプローチは、研究目的であるＤＮＡのみであって、望まないウイルス情報は全く含まないものが細胞内に導入されるという点において、上記の方法と似ている。更に、本発明の方法により成し遂げられる機能的遺伝子の移入効率は、通常の遺伝子移入方法を使用して達成されるものよりも５０倍〜１００倍の高い範囲であることがわかった。現時点でのデータによれば、リン酸カルシウム又はリポソームにより仲介されるルートとは対照的に、長期間安定な遺伝子移入及び発現が偽カプシドにより成し遂げられることが示されている。最後に、リン酸カルシウム法により、より大量の外因性ＤＮＡが齧歯類の受容細胞内へ導入されるが、後者のルートで搬送されるＤＮＡにおいては、偽カプシドアプローチによるものよりも不均一性がより大きく、蛋白質発現については効率的ではないことに注目すべきである。偽カプシドアプローチはまた、化学的及び物理的移入ルートには適用することができない方法で操作することができ、そのため遺伝子治療へ適用する研究を含む将来の研究において価値のあるものとなる。偽カプシドを産生することの容易さ、及び細胞の核へのＤＮＡの搬送が含まれる、外因性物質のデリバリーの効率により、本発明のパポバウイルス偽カプシド搬送法は、治療、特に遺伝子治療及び抗体又は薬剤標的化において特に魅力的である。偽カプシドの移入法の独特の利点は、機能性の外因性物質を細胞の核にまで搬送することが可能であるという点にある。好ましくは、外因性物質は真核性供給源より得られるものであり、特には齧歯類又はヒト等の哺乳動物由来である。"・・・由来の"物質とは、真核性の供給源から実際に由来するもの、又は真核性の物質（例えば真核性のｍＲＮＡを使用して得られるｃＤＮＡ）を使用して得られるもの、又は真核性物質に対応して合成したもの(例えば化学的に合成したもの、又は真核性ｃＤＮＡの組換え体コピー、又は真核性遺伝物質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)を包含する意味である。これとは別に、又はこれに付け加えて、外因性物質は蛋白質又は他のポリペプチドであってもよく、又は、薬学的に活性な化合物、特には細胞の核内又は核上で作用するものであってもよい。好ましい態様においては、外因性物質は二以上の物質、例えば生物学的高分子等の複合体を具備してもよい。例えば、ＤＮＡを差し向ける部位の配列が既知であるならば、これを興味ある遺伝子とともに外因性ＤＮＡ内に導入し、その部位での相同組換えを促進してもよいが、この目的のためには２０乃至２００塩基長の二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを使用する。組換えを促進するために、一本鎖結合蛋白質のリコンビナーゼ(single stranded recombinase binding proteins)、例えば大腸菌のRecA(B.J.Rao and C.M.Radding,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,6161- 6165,1994)又はＳ.セレビシアエにおけるその対照物(カウンターパート)、Rad51 （A.Shinohara,H.Ogawa,and T.Ogawa,Cell 69,457-470,1992）をＤＮＡに結合してもよい。このような方法を使用して、宿主細胞ゲノム内へのＤＮＡの組み込みについての効率及び特異性を大きく増大させることが可能である。上記の方法の効率を証明するため、例えばポリオーマウイルスの遺伝子移入性遺伝子ｄｌ８ＭＴであって、２０乃至２００長のマウスＤＮＡ断片を、付属するリコンビナーゼとともに又はそれなしで結合したものを偽カプシドへ導入して、この担体が密集したフォーカス、即ち細胞形質転換のマーカーを産生する能力を試験管内でモニターした。マウスＤＮＡ配列の場合、D.M.Ding,M.D．Jones,A.Le igh-Brown,及びB.E.Griffinの結果(EMBO J.1,461-466,1982;)、C.H.Streuli,N.S ．Krauzewicz,及びB.E.Griffinの結果(J．Virol．64，3570-3580（1990）を使用することが可能である。得られた密集フォーカスの比較数は、当該システムの効率、及び例えばリコンビナーゼ蛋白質の添加により産生された効果の指標である。フォーカスの染色体ＤＮＡに由来する配列データにより、標的化の効率及び特異性が確認された。よって本発明は、外因性ＤＮＡを宿主の染色体へ特異的に標的化する方法を提供する。本発明の偽カプシドとの結合に特に好ましい外因性物質は、ペプチド-核酸（P NA）を含む。ペプチド核酸（pNA）は、側鎖に結合しているプリン又はピリミジン塩基を有するポリアミドバックボーンからなる単一鎖の化合物であって、表面上は単一核酸鎖のものと同様の塩基配列を形成するものである。これらの構造、組成、及び合成は文献に記載されている(Nielsen et al.，Sciencc，254，1497-5001(1992) ;Egholm等.,American Chem.Soc.,114(1992);及びCherny等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,90,1667-70,(1993))。 PNAは好ましい外因性物質であるが、これらは疾患を治療することや、生細胞のゲノム構造を遺伝子発現への影響によって改変することにおいて有益な性質を有しているからである。生細胞においては、二重鎖にある一の相補ＤＮＡ鎖を結合して、他方の鎖の部分をＤループ構造を形成するようにして置き換えることにより、PNAは遺伝子の転写を阻害するか、又は細胞性酵素機構が障害を修復しようとする結果、ＤＮＡに破損を与えることが可能である。このような破損部は、同じ偽カプシド又は搬送された別の偽カプシド中に存在するいかなる相同性ＤＮＡ鎖との、増大したレベルでの組換えの集中点である。このような破損部はまた、そのＤＮＡが属している生物を死滅させる。この生物とは、細胞自身であるか、原生動物である寄生生物、又はウイルス等である。宿主ゲノム中に自身のＤＮＡを組み込むことが可能なレトロウイルス等が含まれるウイルス等の病原体に対して特異的である配列特異性を有するユニークなPNA部分を合成することは可能であるため、宿主ゲノムに悪影響を全く与えることなく標的病原体を選択的に攻撃するのにPNAを使用することができる。蛋白質又はポリペプチドで特に好ましいものは、抗体、組換え抗体、又はその断片である。抗体の可変重鎖領域(Ｖ_H)、及び可変軽鎖領域（Ｖ_L）は、抗原認識に関与するが、これは初期のプロテアーゼ消化実験により認識される事実である。齧歯類の抗体の"ヒト化"により更なる確認がなされた。齧歯類起源の可変領域は、ヒト起源の定常領域に融合させて、得られる抗体が齧歯類の親抗体の抗原特異性を保持するようにすることが可能である(Morrison等（1984）Proc．Natl．Acad．Sci.U SA 81,6851-6855)。抗原特異性は可変領域により付与されるものであり定常領域には依存しないということは、全てが一以上の可変領域を含んでいる抗体断片を細菌で発現する実験から既に知られている。これらの分子にはＦａｂ様分子(Better等，（1988）S cience 240，1041)、Ｆｖ分子(Skerra等，(1988)Science 240，(1038))、Ｖ_H及びＶ_Lのパートナー領域がフレキシブルなオリゴペプチドで結合されている単一鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Bird等，(1988)Science 242,423;Huston等，(1988)Pr oc. Natl.Acad.Sci.,USA 85,5879)、及び単離したＶ領域を具備した単一領域抗体(ｄＡｂｓ)（Ward等，(1989)Nature 341，544）が含まれる。特異的結合部を保持した抗体断片の合成に関る技術の一般的レビューは、Winter及びMilsteinの文献（ 1991）(Nature 349、293-299)にある。 "ＳｃＦｖ分子"とは、Ｖ_H及びＶ_Lのパートナー領域がフレキシブルなオリゴペプチドで結合された分子を意味する。全体的抗体ではなくて抗体断片を使用する利点は、いくつかある。断片のサイズが小さいことにより、密な組織によく浸透するといった薬理学的特性が改善される可能性がある。全体的抗体のエフェクター機能、例えば補体結合性が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｄＡｂ抗体断片は全て、大腸菌内で発現され、また分泌されるので、従って当該断片を大量に産生することが容易である。全体的抗体、及びＦ（ａｂ'）₂断片は、"二価"である。ここで"二価"とは、当該抗体及びＦ（ａｂ'）₂断片が二つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｄＡｂ断片は一価であり、一の抗原結合部位しか有さない。好ましくは薬理学的に活性な化合物は化学療法剤である。化学療法剤は、癌にかかった組織を除去するのに使用される。最近になって蛋白質や、腫瘍壊死因子、インターロイキン、インターフェロン、及びモノクローナル抗体等の免疫系の分子が含まれる他の生物学的産物の形態をとる薬剤が、化学療法に使用されてきている。 Jain，R.K.により議論されるように(Scientific American July 1994:42-49) 、腫瘍を排除するには、化学療法剤は十分に高濃度で、成長にわたってずっと分散しなくてはならない。しかしながら腫瘍には、そのような分散に抵抗性があることが発見されている。通常の化学療法剤は小型であり(２０００ダルトン未満の分子量)、哺乳動物に投与されると、血管を離れて主に拡散により正常組織中に行き渡る。しかし、上記の生物学的産物は大型の分子であるので(５０００ダルトンを越える分子量)、主として対流により移動し、よって流体物の流れにのって移動する。対流-依存性薬剤は、腫瘍内の均一な圧力により対流の機能が阻害されるので、腫瘍内に渡る分散が阻害される。このことはそのような薬剤が生体内での腫瘍除去をなしえないことを説明している。大型及び小型の化学療法剤の双方は、標的である癌細胞に到達する前の分解に対して感受性がある。従って、繰り返して投与して腫瘍除去に必要である十分な高濃度を維持することが要求される。これには多額の費用を要し、又、当該薬剤が機能する前に分解する免疫反応を生じてしまう可能性がある。化学療法剤の効率を低減する他の腫瘍バリアには、大量の乳酸を分泌させるかもしれない腫瘍中の酸素の欠乏が挙げられる。多くの薬剤は酸性環境下で分解されるか、又は機能発揮に失敗する。上記の問題を解消する現時点での方法は、酵素を腫瘍細胞抗原に特異的な抗体と結合させて"抗体酵素（abzymc）"を形成させることである。この酵素は、プロドラッグを腫瘍細胞殺傷能を有する活性型に変換することが可能である。多量の抗体酵素を血流に接種して、腫瘍内に蓄積させる。当該抗体酵素が正常組織からなくなったら、このプロドラッグを接種する。プロドラッグは小型であるので腫瘍内へ拡散することができ、また抗体酵素によって活性化されて癌細胞を死滅させる。しかしながらこの方法は完全には有効ではなく、それはプロドラッグが迅速に分解されて血管内へ染み込んで、血管から拡散するのと同様に容易に腫瘍から無くなってしまうからである。化学療法剤を神経細胞に搬送する偽カプシド法は、当該薬剤を、標的癌細胞への移動中に分解から保護するので有益である。好ましくは、外因性物質は少なくとも一の遺伝子の全て又はコード領域部分を具備している。有益には、宿主細胞内での遺伝子発現は、神経疾患を治療及び／又は予防することにより、細胞及び／又はその細胞を具備する多細胞性生物に治療効果を生じるものである。本発明により神経細胞へ移入する好ましい遺伝子には、チロシンヒドロキシラーゼ、好ましくはヒトのチロシンヒドロキシラーゼ；神経アポトーシス阻害蛋白質遺伝子(Roy等,1995,Cell 80:167)、及び神経成長因子遺伝子が含まれる。外因性物質が蛋白質であるならば、プロテアーゼによる分解から保護される。外因性物質が薬理学的に活性な化合物ならば、周囲の環境により生じる分解から保護される。偽カプシドによる外因性物質の分解からの保護は、容易に決定することができる。例えば、ＤＮＡの保護レベルを確立するために、偽カプシドを、放射性標識した断片でパッケージングして、緩衝液を10mM MgCl₂に調節し、次いで20分間、 37℃でＤＮａｓＩ（100μｇ／ml）に露出する。ＤＮａｓｅで処理した試料を次いで、（以下の）緩衝液Ａであってグリセリンを欠くもので調製した10-40％ショ糖密度勾配で分画し、保護されたＤＮＡを分解されたＤＮＡから分離する。回収画分の屈折率及び放射能を測定する。放射能のほとんどは、非取り込みＤＮＡであり、勾配のトップに見られる。勾配内の放射能のピークで偽カプシドに対応するものは(電子顕微鏡で示される様に)、標識されたＤＮＡ及び偽カプシドが結合してＤＮＡの保護を行っていることを示している。保護されたＤＮＡは、典型的には測定した全ＤＮＡのうち2-5％を占めている。外因性物質はパッケージングされていてもよく、即ち空の偽カプシド内に取り込まれていてもよい。"空の"とは偽カプシドがパポバウイルスの遺伝物質を一切含まないことを意味する。もちろん他の物質、例えば蛋白質を含んでいてもよい。保護された外因性物質の偽カプシドへの結合、例えば電荷を有する分子でのコートによるものは、当該物質を空の偽カプシドと結合させる好ましい方法であるが、それはより多量の物質を移入することが可能だからである。例えばより多量の外因性遺伝物質は、以下に記載するもののようなインビトロ法を使用してパッケージングすることができ、また電荷を有する分子（例えばポリ-L-リシン、又は塩基性ヒストン）を添加し、その後に37℃で30分間インキュベーションすることにより更に保護することも可能である。電荷を有する分子の結合は、ＤＮＡ等の外因性遺伝物質のコンフォメーション変化を引き起こし、これにより空の偽カプシドにパッケージングされる遺伝物質の量が影響を受ける。使用する偽カプシドは、野生型のパポバウイルスカプシドの様に二十面体の、又は大型の球形若しくは繊維状の形の形態で提供することができるが、これはより大きな核酸断片のパッケージングを許容するために有益である。よって、"偽カプシド"という用語は野生型パポバウイルスカプシドに非常に似た粒子には限定されない。より大量の外因性物質の移入が望ましい。例えば二十面体の空のＶＰ１偽カプシドを使用した場合、パッケージングされて宿主細胞へ移入される遺伝物質の量についてはサイズの制約があることがわかっているので、例えば遺伝物質のより大きな断片を移入することは有益である。パポバウイルスの野生型のウイルスゲノムは5.2ｋｂｐであり、Barrら（1979）又はSlilatyら（1982）の受動的ＤＮＡパッケージング法を使用すると、パッケージングすることが可能なＤＮＡの量は３ｋｂｐ程である。このサイズは多くの哺乳動物のｃＤＮＡの発現や、例えばアンチセンス"ノックアウト"実験（即ち、遺伝子機能が欠損されられている）に使用するオリゴヌクレオチドには適切であるが、一方では数多くの哺乳動物の遺伝子の全体をパッケージングすることを妨げてしまうであろう。パポバウイルスの主要カプシド抗原の遺伝子、例えばマウスポリオーマウイルスの主要カプシド抗原ＶＰ１を有する組換えバキュロウイルスを構築して、この抗原を昆虫細胞内で、Forstovaら（1993）により記載されるようにして発現することが可能である。この方法においては、昆虫細胞をＶＰ１発現性組換えバキュロウイルスで感染して、感染後72時間で回収して、緩衝液Ａ（150mM NaCl，10m M トリス−ＨＣｌ,pH7.4,0.01mM CaCl₂,0.01％ Triton X-100,5％グリセリン）に再懸濁し、超音波で粉砕する。細胞破片を低速の遠心で除去して、ＶＰ１偽カプシドをCsCl密度勾配で精製する。偽カプシドのピーク画分をショ糖密度勾配（10-40％）にかけて、ピーク画分（免疫ブロット及び電子顕微鏡によりモニターする）を次いでCsCl勾配超遠心で濃縮する。個々の遠心後、偽カプシドを緩衝液Ａに対して透析する。好ましい方法においては、Ｓｆ９細胞を感染多重度10-20で、ＶＰ１発現性組換えバキュロウイルスにより感染させ、感染後72時間で回収し、緩衝液Ａ（150m M NaCl,10μＭ CaCl₂,10mM トリス−ＨＣｌ,pH7.6，5％グリセリン，0.01％ Tr iton X-100,）に再懸濁し、超音波で粉砕する。細胞破片を8000ｘｇの低速遠心で除去する。上清中の空のＶＰ１偽カプシドをショ糖クッションでの沈殿、及びその後のCsCl勾配でのバンディングにより濃縮する。精製された空の偽カプシドを含んだ画分は、屈折率の測定又は電子顕微鏡により判明するが、これを第二のショ糖クッションで濃縮した。上記の方法を使用すると、空のＶＰ１偽カプシドの収率は、ＶＰ１、並びにマイナーカプシド抗原であるＶＰ２及びＶＰ３を発現する組換えバキュロウイルスで共感染することにより同様の方法を実施した場合に比較して、少なくとも１０倍大きい。更に、空のＶＰ１疑似遺伝子は、外因性遺伝物質のパッケージングにおいては、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドと同様の効率がある。他のパポバウイルスの主要カプシド抗原から形成される空の偽カプシドは、同様の方法により産生することが可能である。外因性物質を空の偽カプシドで保護することは、外因性ＤＮＡ、例えば１μｇのＤＮＡを10-60μｇの空の偽カプシドと混合し、この混合物を150mM NaCl,0.01 mM CaCl₂,10mM トリス,pH7.4,0.01％ Triton X-100中で37℃で10分間インキュベーションすることにより、簡便に成し遂げられる。次いでこの混合物を、最終濃度が35mM NaClとなるように水で迅速に希釈することによる浸透ショックにかけて、更に20分間のインキュベーションを行う。次いで外因性ＤＮＡを組み込んだ偽カプシドを、本発明の外因性物質移入法で使用することが可能である。蛋白質、並びに抗体及びその断片等のポリペプチド、及び薬理学的に活性な化合物の形態をとる外因性物質は、上記の方法においてＤＮＡをパッケージング用の外因性物質で置換した同様の方法により、空の偽カプシド内へパッケージングすることが可能である。あるいは、空の偽カプシド構造を解離させ、当該物質の存在下で再構築させることにより、外因性物質を空の偽カプシドと結合させる。本発明の偽カプシドの一つの利点は、主要カプシド抗原及びマイナーカプシド抗原の両方を含むカプシドよりも簡単に産生することが可能なことにある。これは構築したカプシド内において種々のカプシド抗原の割合を制御することが難しいからである。結果的には、産生されたカプシドの性質が変化し、この予想困難性は望ましくない。生体内での外因性物質移入において、本発明の偽カプシドを従来のカプシドと比較したときの更なる利点は、単一の外因性抗原、即ち主要カプシド抗原しか含まないので、複数のカプシドよりも強い免疫反応を引き起こしにくいことにある。本発明に従った、偽カプシドでの宿主細胞の処理は、細胞を無血清培地で洗浄し、これを組織培養培地で10⁶細胞当たり1mlに希釈した偽カプシドとともにインキュベーションすることにより行える。90分問のインキュベーション後、血清含有培地を培養物に加える。例えば、サイトメガロウイルス極初期プロモータの制御下にある細胞性遺伝子ｐ４３（Koch et al.，1990）であってアガロースゲルで精製したもの（2.5μｇ）を含む15μｇの偽カプシドを使用して、ヒト胎児肺（ＨＥＬ）線維芽細胞の２Ｘ10⁵細胞を処理することができる。次いで細胞を処理後72時間、37℃でインキュベーションする。ｐ４３断片の機能を試験するため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（pBS）で洗浄して回収し、Laemmliのサンプル緩衝液（Laemmli，1970）で溶解した。蛋白質を10％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、免疫ブロットして、まずｐ４３特異的モノクローナル抗体で、次に抗−βチューブリン抗体(シグマ社)でプローブした。免疫複合体をＨＲＰ共役二次抗体（ダコｐｌｃ社）及び化学ルミネンスＥＣＬ試薬（アマシャムｐｌｃ社）で検出した。図面の説明図１（Ａ）偽カプシドに取りこまれたポリオーマウイルスＤＮＡ断片の概略表示。ｐＰｙＭＴｄｌ８由来の直鎖ＢｃｌＩ-ＥｃｏＲＩ（1680 b.p.）のＤＮＡ断片で、ポリオーマウイルスの複製起点(ori)、プロモータ（ｐ）及びミドルＴ抗原のｄｌ８欠損変異体（以下参照）の遺伝子を含むものを、ＤＮＡパッケージング及び移入実験で使用する前にゲルで精製した。ポリオーマウイルスの配列の番号付けは、Ｓｏｅｄａ等（1980）のものである。制限酵素の開裂部位を示した。図１（Ｂ）自己集合した二十面体のＶＰ１-偽カプシドで昆虫細胞より単離したものの電子顕微鏡検査。バーは50ｎｍである。図１（Ｃ）偽カプシドによる、パッケージングされたＤＮＡのＤＮａｓｅＩ開裂からの保護。それぞれのトラックは以下のものを含む：１及び２はそれぞれ１μｇのＤＮＡを使用した、偽カプシドの無い条件下での、ＤＮａｓｅＩ処理有、及び処理無の対照反応；３及び４は、１μｇのＤＮＡとのパッケージング混合を、それぞれＤＮａｓｅＩ処理有、及び処理無で行ったもの。図２形質転換した細胞のフォーカスよりクローン化した細胞株の形態及びソフトアガーアッセイであって、以下のものの位相差顕微鏡像である：図２（ａ）非処理の親のrat-2細胞株；図２（ｂ）リン酸カルシウム遺伝子移入後に形成されたフォーカス由来の形質転換済細胞株の一例；又は図２（ｃ）ｄｌ８ＭＴＤＮＡをパッケージングした偽カプシド由来の密なフォーカス由来の細胞分離株。図２（ｄ）擬似カプシド由来細胞株に由来する形質転換コロニーのソフトアガー上での増殖を示す。図３形質転換済細胞株におけるｄｌ８ミドルＴ抗原（Ｄｌ８ＭＴ）遺伝子の発現の分析。図３（Ａ）３つのポリオーマウイルス初期抗原のＮ末端領域に特異的なモノクローナル抗体であるＰＡｂ７０１でプローブした、細胞溶解物の免疫ブロット。図３（Ｂ）ｃ-ｓｒｃ（Ｃ-トラック）と複合体形成したＭＴを認識しないＰａｂ７０１、又はプロテインキナーゼ活性な、ＭＴ及びｃ-ｓｒｃの複合体（Ｍ-トラック）を沈殿させるモノクローナル抗体であるＰａｂ７２１を使用した、細胞溶解物の免疫沈降物の試験管内キナーゼ反応。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）においては、ゲルはそれぞれ以下の蛋白質を含んでいる：(トラック１)リン酸カルシウム遺伝子移入に由来するクローン化細胞株Ｃ１；(トラック２及び３)偽カプシド処理済細胞由来の細胞株Ｐ１及びＰ２；（トラック４）親のrat-2株；及び（トラック５）ｄｌ８ポリオーマウイルス変異体で形質転換したrat-2細胞。ｄｌ８ＭＴ（及び観察される場合にはＬＴ）の位置を、分子量マーカー（右側）と同様に記してある。図４形質転換した細胞株のサザンブロット分析。トラックはそれぞれ以下のものを含む：(ａ、ｅ及びｉ)リン酸カルシウム沈殿により産生され細胞株Ｃ１（上記参照）由来のＤＮＡであって、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ(ウイルスＤＮＡ中には存在しない)、ＰｓｔＩ(１カ所)、ＳａｃＩ（２カ所）で開裂させたもの；(トラックｂ、ｆ及びｊ)及び（ｃ、ｇ及びｋ）ポリオーマ偽カプシドで産生された個々の形質転換フォーカスのうちの二つに由来するＤＮＡであって、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｃＩで開裂させたもの；トラック（ｄ、ｈ及びｌ）対照のrat-2細胞由来のＤＮＡであって、同じ酵素で開裂させたもの；トラックｍ、ＢｃｌＩ−ＥｃｏＲＩのインプット断片(１ｎｇ)。より大きい分子量のバンドはおそらく、組み込まれたウイルスＤＮＡによるものであろう。ＭＴ遺伝子の６５４ｂｐの内部ＳａｃＩ断片の位置は外因性ＤＮＡの効率（図１Ａ）を示すものであるが、これを記してある(●)。分子量マーカー（ｋｂ）の移動位置を記してある。図５ＨＥＬ細胞への偽カプシド遺伝子移入後の、ｐ４３の促進された発現についてのウエスタンブロット分析。図５（Ａ）それぞれのトラックは、以下のもので処理した細胞を含む：(１及び４)ｐ４３ＤＮＡを有する偽カプシド；(トラック２)空の偽カプシド；(トラック３)ＤＮＡのみ；(トラック５及び６)リン酸カルシウムとともに共沈殿させたＤＮＡ。トラック２及び３はおそらく内在性のｐ４３のレベルを反映している。図５（Ｂ）同じゲルを抗−チューブリン抗体でプローブして、個々のトラックの全蛋白質量の充填量を示したもの。図６ポリオーマｄｌ８変異体ウイルスのゲノムを含むプラスミドｐＰｙＭＴｄｌ８の概略地図。図７自己集合した偽カプシドの電子顕微鏡像。二十面体及び管状の偽カプシド集合体を、分画遠心分離により昆虫細胞核より単離し、ネガティブ染色電子顕微鏡法で観察した。バーは100ｎｍである。図８ポリ−Ｌ−リシン存在下及び不存在下において、偽カプシドと結合したＤＮＡ。 β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現カセットを含む、７.２ｋｂｐのスーパーコイル状ｐＣＭＶβＤＮＡを１０分間、単独で(パネルＡ)、１：３０の比率（ｗ／ｗ）で偽カプシドと(パネルＢ)、偽カプシドとその後にポリ−Ｌ−リシンと(パネルＣ)、又は完全な偽カプシドと（パネルＤ）インキュベーションした。チトクロームＣの存在下で試料をのばし、銅のグリッドに移し、酢酸ウラニルで染色し、電子顕微鏡で観察した。 (倍率はｘ70,000)。図９緑色蛍光蛋白質をコードするマーカー遺伝子の、Ｃｏｓ７細胞内でのin vitr o発現。Ａ．Ｃｏｓ７サル細胞を、ＤＮＡ単独(ＤＮＡ)、ＤＮＡ-偽カプシド複合体(ＤＮＡ+ｐ’ｃａｐs)、ＤＮＡ-完全偽カプシド混合物（ＤＮＡ+完全ｐ’ｃａｐ)、ＤＮＡ-偽カプシド-ポリ−Ｌ−リシン複合体(ＤＮＡ+ｐ’ｃａｐs+ＰＬＫ)、又はＤＮＡ-ポリＬ−リシン複合体（ＤＮＡ+ＰＬＫ）の存在下で、３６時間培養し、それぞれの試料中で緑色蛍光蛋白質を発現している細胞を計測した。陽性細胞を、実験当たりの全細胞に対する割合で表した。（○）は試料には陽性細胞が全く無かったことを意味する。Ｂ．真性のポリオーマウイルス粒子の感染性に影響を与える試薬の存在下で、ＤＮＡ-偽カプシド複合体（黒塗りのバー）又はＤＮＡ-偽カプシド-ポリ−Ｌリシン複合体（白抜きのバー）におけるそれぞれのマーカープラスミドの発現間の比較を行った。ノイラミニダーゼ(+ノイラミニダーゼ)、又はｐＨ６でのインキュベーション（低ｐＨ）が偽カプシド遺伝子移入へ与える影響を、対照条件下でのインキュベーション（即ちｐＨ7.5、及びノイラミニダーゼ非存在下）との対比において、前記の条件下で緑色蛍光蛋白質を発現している細胞の数の割合の変化を表してある。表１Ａ１及び６週時にｐＣＭＶβ ＤＮＡ、偽カプシド、又はｐＣＭＶβ ＤＮＡ-偽カプシド複合体で皮下接種した胸腺欠損マウス（ｎｕ／ｎｕ）の器官における、マーカー遺伝子であるβ-ガラクトシダーゼの発現。図１０マウスの中枢神経系へのマーカー遺伝子β-ガラクトシダーゼの安定な移入。パネルＡ：胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスを、首の後ろ部分において皮下的に、15 0μｇの偽カプシド(ＣＡＰＳＩＤ)、又は５μｇのｐＣＭＶβ ＤＮＡ(ＤＮＡ)、又はｐＣＭＶβ ＤＮＡ-偽カプシド複合体（Ｄ+Ｃ）で接種した。接種後６週間で、マウスを殺し、脳を固定し、Ｘ-ｇａｌを基質として使用して染色して、β- ガラクトシダーゼ活性を調べた。パネルＢ：ＤＮＡ-偽カプシド複合体で接種したマウスの脳に由来する組織断面を、光学顕微鏡で観察した。 (倍率は、パネルＡではｘ３／４、パネルＢではｘ40)。図１１ウサギ角膜器官培養における、マーカー遺伝子であるβ-ガラクトシダーゼの長期間発現。角膜をウサギ（メス、ニュージーランド白）より切除し、四等分にして、ｐＣＭＶβ ＤＮＡ-偽カプシド複合体（1μｇＤＮＡ：30μｇ偽カプシド）(パネルＡ)、１μｇのｐＣＭＶβ ＤＮＡのみ(パネルＢ)、β-ガラクトシダーゼ遺伝子発現性の組換えアデノウイルスの1.5Ｘ10⁷ｐｆｕ／ｍｌ（パネルＣ）とともにインキュベーションした。角膜を組織培養中で４週間インキュベーションして、固定し、Ｘ-ｇａｌを基質として使用して染色してβ-ガラクトシダーゼ活性を調べた。図１２偽カプシド及びポリリシンによる、外因性ＤＮＡのＤＮａｓｅＩからの保護。ゲルにはそれぞれ以下のものが含まれる：レーン１、非処理のスーパーコイル状７.２ｋｂｐｐＣＭＶβ ＤＮＡ、レーン２から４、同じＤＮＡであるが、それぞれ、精製した偽カプシドとの複合体形成後(レーン２)、又は予めポリリシンでまず処理しておき、次いで偽カプシドで処理した後(レーン３)、又は偽カプシドとのインキュベーション後にポリリシンと複合体形成した後（レーン４）にＤＮａｓｅＩで処理し、Ｍｇ²⁺及びＣａ²⁺とともに37℃でインキュベーションしたもの。ＤＮａｓｅＩ消化後のいくらかの明らかなＤＮＡの消失に加えて、優勢なスーパーコイル状のＤＮＡ（レーン１）は、その一部が、実験の間に環状及び直鎖状に変換されている(レーン３及び４)。レーンＭは分子量サイズマーカーを含む。同様の実験において、ｐＰｙＭＴ１をＥｃｏＲＩで消化することにより得られる６.２及び２.６ｋｂｐのＤＮＡ断片の混合物を使用すると、得られたデータは(示さず)、上記の結果と矛盾せず、二つの断片のうちの小さいほうが好ましく保護されることは無かった。図１３偽カプシド及び／又はポリリシンと複合体形成したＤＮＡのＣｓＣｌ密度勾配のプロフィール。表記した試薬で処理したｐＣＭＶβ ＤＮＡ（7.2ｋｂｐ）をＣｓＣｌ勾配で沈殿させた(実験材料及び実験方法を参照)。ＤＮＡを含む画分は、³² Ｐ-標識直鎖化ｐＣＭＶβ ＤＮＡでハイブリダイゼーションして検出した。複合体形成しなかったＤＮＡは勾配の底まで沈降した。シグナルはデンシトメトリーで分析した。Ａ.偽カプシドに結合したＤＮＡ(ＤＮＡ／カプシド)；Ｂ.ポリリシンのみと結合したＤＮＡ(ＤＮＡ／ポリＬＫ)；Ｃ.まず偽カプシドと複合体形成し、次いでポリリシンと混合したＤＮＡ(ＤＮＡ／カプシド／ポリＬＫ)；Ｄ. まずポリリシンと複合体形成し、次いで偽カプシドを添加したＤＮＡ(ＤＮＡ／ポリＬＫ／カプシド)。擬似カプシドの大部分を含む画分ｓは、矢印で示したが、これはその屈折率により同定される；ＶＰ１の存在は、ウエスタンブロッティングにより確認した。図１４ＤＮＡ、偽カプシド、及びポリリシンと形成した複合体の電子顕微鏡像。複合体は以下のものからなる：Ａ.浸透圧ショック後に得られた偽カプシド及びＤＮＡ；Ｂ.ＤＮＡ及びポリリシンのみ；ｃ.ＤＮＡ及び偽カプシドを混合し、次いでポリリシンで処理したもの；Ｄ.ＤＮＡ及びポリリシンを混合し、次いで偽カプシドで処理したもの。矢印はＣにおける三次元複合体を示す。図１５ポリリシン（ポリＬＫ）又はカルシウムイオン濃度が移入効率に与える影響。Ａ.ｐＣＭＶβ ＤＮＡ及び偽カプシドからなる複合体を、表示したポリリシン濃度でインキュベーションし、次いで浸透圧ショックにかけた；又はＢ.精製したＶＰ１偽カプシドを使用して、精製緩衝液中のカルシウム濃度を変化させて、種々のカルシウム濃度（0、5、10、50、又は100μＭ）の緩衝液中で保存した。２４穴ディッシュ中で増殖させたＣＣＬ１３細胞を、表示した濃度のそれぞれの混合物で処理し、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現している細胞を、37℃での48時間のインキュベーション後の組織化学的アッセイにより同定した。Ｘ−ｇａｌ溶液での一晩のインキュベーション後に、青色の細胞数を顕微鏡下で計測した。図１６ＲＴ-ＰＣＲで決定した、rat２細胞中でのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現の比較。rat２細胞の培養物を"裸の"ｐＣＭＶβ ＤＮＡ又はＤＮＡ/ポリリシン（ｐＬＫ）で処理し、偽カプシド（ｐｃａｐｓ）で、ポリリシンとともに又はそれなしで、疑似感染するか、あるいは遺伝子移入(リン酸カルシウムを使用して)した。単離した全ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成し、これを細菌性β-ガラクトシダーゼ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマとともにＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離した。サザンブロットを³²Ｐで放射性標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィーにかけた。レーン1-3には非処理のrat２細胞から抽出したＲＮＡ由来のｃＤＮＡが含まれる -これはそれぞれ、2、１４及び２１日において、β-ガラクトシダーゼの内在性レベルの転写物と交叉ハイブリダイズしていることを示している。レーン4-18；別の実験でのデータであり、示したようにそれぞれは2、14、21日に対応する３点で取得したものである。レーン4-6、ＤＮＡのみで処理した細胞；レーン7-9、ＤＮＡ／偽カプシド複合体で疑似感染した細胞、又はレーン10-12は同じ複合体で、ポリリシンの存在下で行ったもの；レーン13-15、ポリリシンのみで複合体形成したＤＮＡで処理した細胞、又は（レーン16-18）はリン酸カルシウム沈殿法を使用してＤＮＡを遺伝子移入したもの。図１７ β-ガラクトシダーゼの心臓及び脳への生体内遺伝子移入に与える投与ルートの影響。Ａ.腹腔的(ｉ.ｐ.)、皮下的(ｓ.ｃ.)、静脈内的(ｉ.ｖ.)、又は鼻腔内的(ｉ. ｎ.)に、５μｇのｐＣＭＶβ ＤＮＡのみ、又は偽カプシド-ＤＮＡ複合体（150 μｇ／５μｇ）で処理し、７週後に殺したヌードマウス。パネルＡ：(ａ)ゲル電気泳動で分離したＰＣＲ産物の臭化エチジウム染色；(ｂ)放射性標識したｐＣＭＶβでハイブリダイズしたゲルのサザンブロットのオートラジオグラフ。トラックＡ-Ｆ：それぞれ10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²及び０コピーのｐＣＭＶβからのＰＣＲ産物であって、500ｎｇの非処理のマウスの脳由来のＤＮＡ（990ｂｐ、矢印でマーク）と混合したもの；トラックＧ：テンプレート無し、トラックｍ：分子量マーカ。表示してあるように、偽カプシド-ＤＮＡ複合体（Ｄ+Ｐ）又はＤＮＡのみ（ＤＮＡ）で処理したマウス由来の500ｎｇの脳ＤＮＡ由来のＰＣＲ産物。Ｂ及ひＣ上記のようにしてマウスより切除した脳(パネルＢ)、及び心臓（パネルＣ）を、Ｘ−ｇａｌ染色によりβ-ガラクトシダーゼ発現について試験したが、ここで（-）は組織中に染色された領域がないことを、(+)、(++)、(+++)、（++++）は陽性染色された領域の数が増えていることを示し、これは光学顕微鏡法及びβ- ガラクトシダーゼ特異的プライマにより同定される(ＤＮＡは、ｐＣＭＶ特異的プライマを使用して、当該組織の４分の１から増幅した)。黒のバー：偽カプシド-ＤＮＡで処理したマウス組織のＰＣＲ産物；白のバーはＤＮＡのみで処理したマウスＰＣＲ産物を示す。表２Ａマーカー遺伝子の生体内発現に対して、投与ルートが与える影響。ここで、本発明の好ましい態様を、実施例のみで、上記の図を参照しつつ説明する。実施例１：VL-VP1組換えバキュロウィルスの調製とポリオーマウィルスVP1の空の偽カプシド粒子の単離大腸菌(Escherichia coli)DH5株を、移入ベクターと組換えプラスミドの増殖に用いた。BclI酵素の消化物を用いた場合、プラスミドは大腸菌JM110株(JM101 のdam dcn変異誘導体)（Yanish-Perronら,1985,Gene 33:103-119）内で増殖した。 BamHIクローニング部位を含むバキュロウィルス遺伝子移入ベクターpVL941と、マルチクローニング部位ポリリンカーを含むpVL1393を、ポリオーマVP1がポリヘドリンプロモーターの制御化におかれた組換えプラスミド構築のために用いた。EcoRI部位内に挿入したポリオーマウィルスゲノム全体を含むプラスミドpMJA2 （Krauzewiczら、1990）を遺伝子の単離のために用いた。組換えプラスミドpVL-VP1を、pMJA2プラスミドのEcoRV-XbaI 1584bp断片（ポリオーマウィルス番号付け4106、EcoRVから2522-XbaIはベクターpVL1393でのSoc daら(1980)のものであり、SmaIとXbaIで開裂されている）の連結により構築した。受容体細菌DH5を、連結混合物で形質転換し、プラスミドpVL-VP1を選択した。 Spodoptera frugiperda(Sf9)細胞を、Hink(1970,Nature:226:466-467)により記載されたように、２７℃において１０％胎児ウシ血清（FCS）を含む標準TNM-F H培地中で単層培養として増殖させた。Autographa Californica核多角体病ウィルス（AcNpv）を、Summersにより記載されたように(1987,Texas agricultural B ulletin No.1555,Texas agricultural Experiment Station)、増殖させた。すでに記載された方法に従って(Forstovaら、1989)、ポリオーマVP1を含む組換えバキュロウィルスを、野生型AcNPV DNAと組換えトランスファープラスミドpVL-VP1 の個々のDNAとの間のインビボ対立交換により調製した。Sf9細胞を、組換えバキュロウィルスの細胞当たり１０プラーク形成単位で感染させた。細胞の単層をTN M-FH培地で洗浄し、ウィルスの接種を加えた。細胞は、室温で１時間振とうした。ついで１０％FCSを含む完全培地を加えて、細胞を２７℃でインキュベーションした。昆虫細胞からの、空のポリオーマウイルスの偽カプシドの単離。昆虫細胞をVL-V P1バキュロウィルスで感染させた。細胞を７２p.i.で回収し、緩衝液Ａ（10mM T ris-HCl[pH7.6],150mM NaCl,10マイクロモルCaCl₂,5％グリセリン, 0.01％ Triton X-100）中に再懸濁し、超音波で破砕した(3秒間、10振幅ミクロン[MSE Soniprep 150])。細胞屑を遠心分離（２０分、8,000×ｇ）によって除去し、粒子をショ糖クッション(２０％、グリセリンを含まない緩衝液Ａで作製)、 150000×ｇ、３時間の遠心分離で精製した。ペレットをグリセリンを含まない緩衝液Ａ中で再懸濁し、短時間超音波にかけた。 CsClを１．３０−１．３３ｇ/ｍｌの密度になるように添加し、150000×ｇ、２０時間の遠心分離により勾配を形成した。１．３０と１．３５ｇ/ｍｌの間のピークの画分を集め、第２のショ糖クッションにより濃縮した。電子顕微鏡 Formvar（EMSCOPE）がコートされたグリッドを、１０μｌの偽カプシドサンプルで数秒間インキュベートし、余分の液を棄て、一滴の３％リン酸タングステン酸（ｐＨ６．６）に移し、４５秒置いた。グリッドを乾燥させ、室温に保存した。他のパポバウィルスからのVP1偽カプシドは、目的のパポバウィルスのVP1遺伝子でバキュロウィルス発現ベクター内のポリオーマVP1遺伝子を置換すること以外は、上記プロトコールを用いて調製することができる。他のパポバウィルスの VP1遺伝子配列は、ここに参照して取りこまれる以下の文献に開示されている。実施例２：ポリオーマウィルスdl8 MT遺伝子のVP1偽カプシド内へのパッケージング。細胞：dl8ウィルス形質転換株を、コントロールとして、rat-2細胞のdl8変異ウィルスでの感染の後に形成されたフォーカスから単離した。これらの細胞と親のrat-2細胞株を、１０％胎児ウシ血清を含む完全Culbecco修正イーグル培地（D MEM）中で継代した。ポリオーマウィルスミドルＴ抗原の遺伝子のイントロンを、部位特異的変異により欠失させた(図６およびStraussら、1986を参照)。BclI/EcoRI直鎖DNAフラグメントを、Barrら（1986）の手法にしたがって偽カプシド内にパッケージした：簡単に説明すると、１μｇアガロースゲル精製DNAを、空の偽カプシド１０ −６０μｇと混合し、150mM NaCl,10μＭ CaCl₂，10mM Tris,pH7.6,5％グリセリン、０．０１％ Triton X-100に１０分間３７℃でインキュベートした。ついで混合物を、水を用いてすばやく希釈し、最終濃度３５ｍＭ NaClとすることにより浸透圧ショックにかけ、インキュベーションをさらに２０分続行した。この後、細胞内への遺伝子移入に用いられる粒子の一部を、DNase処理と密度勾配精製にかけた。粒子により保護されたDNAのレベルを確立するために、パッケージ混合物を10mM MgCl₂に調整し、DNaseＩ(１００μｇ/ｍｌ)に３０℃で２０分間接触させた。５０mMまでの過剰量のウシ胸腺DNAとEDTAを加え、パッケージされたDNA が、１００mMジチオトレイトール、５０mM EDTA、１％ w/v SDSの存在下で偽カプシドから放出された。フェノール：クロロホルム(２４：１)抽出でタンパク質を取り除き、アガロースゲルにロードした。DNAフラグメント投入量は、³²Ｐ標識BclI-EcoRIフラグメントを用いたサザンブロッティングで同定した。パッケージングに関するデータを図１に示す。図１Ａは、我々の最初の研究で遺伝子移入に用いた直鎖DNAフラグメントのスキームを含み、図１Ｂは、用いられた精製された二十面体VP1粒子の電子顕微鏡写真を示す。DNAは、溶解ポリオーマウィルス感染の間に得られたウィルスの空のカプシドが用いられるすでに記載された手法で(Barrら、1979)、粒子内にパッケージされた。図１Ｃは、偽カプシド存在下（トラック４）または非存在下（トラック２）でのパッケージング混合物のDNasc Ｉでの処理の後の残りと比較した、全投入DNA（トラック１と３）のサザンブロットを示す。約２−５％の投入DNAが、DNascI耐性物質としてVP1偽カプシド内に取りこまれていることがわかった(トラック３と４の比較、図１ｃ)。放射標識されたDNAが偽カプシド内にパッケージされる補充研究において(示さず )、約５％の放射活性が、ショ糖密度勾配遠心分離で粒子と共に沈殿することがわかった。実施例２(i) 外因性物質の解離／再集合パッケージング別のパッケージング方法は、EGTAなどのイオンキレーターと、β−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下で、カプシドを解離させるものである。(各化学物質の濃度は、各カプシド調製物について滴定により算出される。)ついで、パッケージされる物質の存在下で、特定の偽カプシド調製物に対して滴定されたカルシウムイオン濃度を用いた、緩衝液Ａに対する透析により、偽カプシドは再集合される。ついでパッケージされた物質と粒子は、１０−３０％ショ糖勾配（緩衝液Ａで作製、グリセリンを除く）を通した１５００００×ｇ、３時間の遠心分離により、パッケージされていない物質から分離されることができる。実施例３：導入された外因性DNAに対する細胞応答カプシド内に入れる（encapsidation）工程に続き、正常ポリオーマウィルス感染プロトコールを用いて、受容体のラット不朽化（rat-2）細胞内にDNAを導入するために、パッケージ混合物を用いた。４分の３の集密細胞シートを血清を含まない培養培地、DMEMで１回洗浄し、偽カプシド（DMEMで１ｍｌ/１０⁶細胞に希釈）を添加した。細胞は３７℃、９０分間、インキュベーションし、ついで４ｍｌ DMEM+１０％胎児ウシ血清を加えた。細胞を培養中に静置し、MT発現と細胞内形質転換のマーカーである稠密なフォーカスが形成されるかどうかを観察した。対照実験は、偽感染（偽カプシド非存在下）で、または古典的な遺伝子移入手法（Grahamおよびvan der Eb、1973）におけるリン酸カルシウムとの共沈殿で、最初のパッケージング工程で用いられたものと同量のDNAを用いて、rat-2細胞で行った。これらの実験で、３週間後に、偽感染培養を除く全てにおいて細胞の稠密なフォーカスがみられた。フォーカスは染色後カウントされるか、あるいは培養で増殖するためにプレートから採取された。表１に示されたデータは２つの実験の結果である。それらは、偽カプシドで得られたフォーカスの数が、リン酸カルシウム移入からのものをかなり上回ることを示す。パッケージング工程（図１Ｃ参照）が比較的低い効率であることを考慮するなら、個々の実験で生産される稠密な細胞フォーカスの数の評価において、DNA導入の偽カプシド経路は、細胞への、機能的に有用なDNAの搬送のためには、遺伝子移入手法よりも５０〜１００倍効果的であることが見出された。表１稠密なフォーカスの形成効率の比較＊５％のパッケージング効率に基づき算出形質転換アッセイから選び、単層培養を確立した、個々のフォーカスを形態学的に最初のrat-2培養と比較し、細胞内形質転換のもう１つのマーカーである、それらが半固体培地でコロニーとして成長する能力を評価した。図２は、リン酸カルシウム遺伝子移入された（transfected）細胞（図２ｂ）または偽カプシド処理細胞（図２ｃ）から選ばれたフォーカスから確立された典型的な形質転換細胞培養の形態と比較した、正常（偽感染）ラット繊維芽細胞の形態（図2a）を示し、また図２ｃで示す細胞を用いた軟寒天培養で観察される典型的なコロニー成長（図２ｄ）を示す。形質転換コロニーの形成は、組換えウィルスにより生産されたVP1粒子内にパッケージされたdl8MT遺伝子が、rat-2細胞内に安定に導入され、明らかに機能的に活性であることを示唆した。例えば自然発生的な形質転換株でなく、後者のケースであることを示すために、タンパク質サンプルを、ウィルス抗原の存在と発現について分析した。これらの細胞株のMTを調べるために２つのアッセイを用い、一方は免疫（ウエスタン）ブロッティング、他方は標準的なタンパク質キナーゼアッセイ(Collett及びErik son,1978)を用いた、MTと細胞内オンコジーンc-srec(Courtneidge及びSmith、19 83)の間のよく特徴付けられた相互作用を調べるものである。ウエスタンブロットのデータ（図３Ａ）は、野生型MTよりSDS-ゲル電気泳動で早く移動するdl8MT が、形質移入されたrat-2細胞でも、また偽カプシド処理rat-2細胞でも、発現されたことを示し、同じ数のdl8ウィルス由来形質転換細胞株(トラック５)でみられるもの（後者の場合、ウィルスの小さなＴ抗原と同様に、図１ａに示す組換え dl8 ＭＴｃＤＮＡで発現されない大きなＴ抗原も観察される。図示せず）と比較して、発現レベルは高い(トラック１−３)ことを示す。同様のデータ（図示せず）が他のフォーカス由来細胞株から得られた。インビトロでのキナーゼアッセイ（図３Ｂ）から得られた結果は、フォーカス形成と軟寒天アッセイからの結果と矛盾していない。それらは、細胞の偽カプシド処理の後生産されたＭＴが、ウィルス感染細胞で生産されるＭＴ(Smithら、1979;Courtneidge及びSmith、1983) から区別できないようにして、細胞srcオンコジーン産物と相互作用でき、かつ活性化でき、したがって十分機能しているらしいことを示す。親のrat-2細胞ではＭＴ活性は見られなかった。宿主細胞での外因性ＤＮＡの状態細胞内へ偽カプシドを介して輸送されたＤＮＡからのdl8 ＭＴ遺伝子が、効率的かつ生理的に活性な発現をすることを示した後、発明者らは、細胞での外因性ＤＮＡの状態を、特に宿主染色体に組み込まれているかどうかに関して調べた。対応する親の（rat-2）細胞からのＤＮＡと並行して、カプシド移入由来と、リン酸カルシウム遺伝子移入由来の細胞の２つの株の初期の継代からの全細胞内ＤＮＡのサザンブロット分析を行った。得られたデータを図４に示す。ここで、リン酸カルシウム遺伝子移入培養は、図示したように(トラックa,e,i)、高いコピー数の非（またはタンデム）組み込みdl8 ＤＮＡを含むことが示される。これに対して、ポリオーマVP1偽カプシドを遺伝子移入に用いた実験（トラックb,c,f,g ,j,及びk）では、DNAのこれらの型では、観察されたとしても、ずっと低いレベルであった。後者では、おそらく宿主染色体内への単一のコピーの組み込みを反映するバンドがゲル上に存在し、取りこまれるDNAが、おそらく宿主ゲノム内に１つまたは数カ所でのみ組み込まれることを示唆する。さらにこれを評価するため、DNAを、適当な制限酵素で開裂させた(図１Ａ参照)。SacIでの消化は、内部の６５４ｂｐウィルス断片の放出をもたらした。このバンドは明らかに、リン酸カルシウム形質移入細胞からのDNA中にあり、VP１偽カプシドト移入（図４、トラックi-k）から発生する株内にさらに長く曝すことにより見える。これは組み込まれた粒子のDNAが大きな再配置を受けていないことを示唆する。これらのデータはまた、観察される高いレベルのdl8MT発現（図３）は、組み込まれたDNAのコピー数と直線的に相関しないことを示す。その理由は、リン酸カルシウム沈殿法(トラックa,e,及びi）由来の細胞は、多くのコピーの導入遺伝子を含むのに対し、偽カプシド移入は低いレベルまたは単一の組み込みにすぎないからである（トラックb,c,f,g,j,及びk)。実施例４：DNA担体システムの比較準集密２５ｃｍ²Ｔフラスコのrat-2不朽化細胞を、各々、ポリオーマＭＴ遺伝子を含む”裸の”BclI-EcoRI直鎖ＤＮＡ断片１μｇと接触させて偽感染し、あるいはリン酸カルシウムを用いてこの断片１μｇで遺伝子移入し、あるいは１μｇＤＮＡと混合した偽カプシド６０μｇで処理した。培養の培地は毎週交換した。３週間目の終わりに、形質転換細胞のフォーカスが、Leishmann's染色溶液でのカウントのために可視化され、あるいは増殖のために個々のフォーカスとして選択された。偽カプシドＤＮＡ移入から得られた４つのフォーカス（Ｐ１−４）からの、およびリン酸カルシウム形質移入細胞から単離された２つのフォーカス（Ｃ１−２)からの細胞株を、短期培養で確立した。個々の単離細胞株は、その形態学的外見と軟寒天で形質転換細胞として成長する能力(TurlerおよびBeard,198 5)について分析した。タンパク質分析ウエスタン免疫ブロット検出のために、全細胞溶解液からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli,1970）により分離し、電気ブロットし、ポリオーマウィルス初期抗原に対するモノクローナル抗体でプローブした(DilworthおよびGriff in，1982)。免疫複合体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ・コンジュゲート・第２抗体で検出し、ＥＣＬ試薬（Amersham plc）で可視化した。キナーゼアッセイを、放射標識[³²P]-γＡＴＰ（CollettおよびErikson，1978;Dilworth ，1982）で、抗体Pab701と721を用いて、免疫沈降で行った。ゲルは、オートラジオグラフィフィルム（XAR-5,KODAK）に−７０℃、４時間接触させた。サザンブロッティング分析２０μｇ全細胞内DNAの制限酵素消化物を、０．８％アガロースゲル上で分離し、ブロットし³²P-標識BclI-EcoRI DNAフラグメントとハイブリダイズさせた。フィルターはオートラジオグラフィフィルム（XAR-5,KODAK）に−７０℃４日間接触させた。実施例５：ヒト細胞へのヘテロDNAの導入パポバウィルス偽カプシド担体手法がヒト細胞に適用可能かどうかを調べるために、発明者らは、正常細胞で低いレベルで見出される（Kochら,1990）外因性作用であるp43の発現を、ヒト胚芽肺（HEL）線維芽細胞への遺伝子トランスファーによって増進させることを探求した。HEL細胞は、原始ヒト胚芽肺由来のもので、（毎週）約３０回培養されて継代した。サイトメガロウィルス・直前(immed iate early)プロモーターの制御下に、pcDNA3（Promega Inc）内にクローン化された、細胞内遺伝子のアガロースゲル精製NruI/EcoRI制限酵素断片(２．５μｇ) 、p43（Kochら,1990）を、上述のごとく、VP1偽カプシド（１５μｇ）内にパッケージした。パッケージ混合物は、２連で調製し、ヒト胚芽肺（HEL）繊維芽細胞２×１０⁵細胞を処理するために用いた。対照として、等量の"裸の"DNAで、あるいは空の偽カプシドで、あるいはリン酸カルシウム共沈殿法で遺伝子移入した DNAで、細胞を処理した。細胞は７２時間後に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、Laemmliサンプル緩衝液（Laemmli,1970）で溶解して回収した。タンパク質は、１０％ SDS-PAGEで分画し、免疫ブロットし、最初に上記ｐ４３特異的モノクローナル抗体で、次に抗β-チューブリン抗体(Sigma) でプローブした。免疫複合体を、HRPコンジュゲート第２抗体（Daco社）と化学発光ECL試薬(Amersham社)で検出した。２連の実験で得られた結果を図５Ａに示す。それらは、偽または対照実験（裸のDNAまたは偽カプシドのみで処理された細胞、各々トラック２と３）で観察されるものと比較して、偽カプシドで処理されたHEL細胞内の遺伝子発現（トラック１と４）において、少しではあるが（数倍）有意の増加を示している。p43遺伝子のリン酸カルシウムによる共沈澱（トラック４と５）は、p43発現のベースレベルを超す発現の増加をおこさなかった。これらの発見の妥当性を確かめるために、実験におけるチューブリンのレベルを同じゲルで評価した。図５Ｂに示すように、抗チューブリン抗体を用いたとき、個々のトラックで見られたチューブリンの量には著しい差異は見られなかった。その結果は、パポバウィルス偽カプシドが、生理的に機能する外因性DNAを安定に受容細胞に導入するための担体として用いることができることを示す。たとえ免疫蛍光データ（示さず）が多くの細胞中で高い偽カプシドを示しても、偽カプシドでは、実験の間にほとんど細胞の死は観察されず、細胞に毒性を示さないようである。リン酸カルシウム共沈澱遺伝子移入法と比較すると、偽カプシド担体のアプローチは、より選択的でより効率的であることが見出された。これは、より高いDNA取り込みの効率、DNAのより強い保護、核へのより効率的な輸送、宿主染色体への好ましい組み込み、またはこれらの２つ以上のファクターの組み合わせが反映しているかもしれない。これらの結果は、偽カプシドで導入されるときに、少なくとも一時的なヒト遺伝子p43（Kochら、1990）産物の発現の上向きの制御が、HEL細胞で得られることを示す。こうして担体パポバウィルス偽カプシドはヒト細胞に適用される。リン酸カルシウムでのDNA共沈澱を用いる随伴実験は、同じようには成功しないことは特記すべきことである。過去の文献には、”外来”物質のヒト細胞内への遺伝子移入の困難性が記載されている(Hoeijmakersら、1987；Mayneら、1988)。偽カプシド担体アプローチの対応する成功は、細胞核への効率的な標的化がこの手法で起こるという事実に基づくかもしれない。 VP1偽カプシド内に組み込まれた遺伝子材料の量を増加させることおそらくVP1二十面体偽カプシド内部にパックされ得る遺伝子情報の量についてはサイズの制約があるであろう。ここで行ったような研究のための上限を、ポリオーマ野生型ウィルスゲノムのサイズ（５．２ｋｂｐ）により決定することができる。Barrら(1979)またはSlilatyら(1982)の受動的なポリオーマパッケージング手法を用い、”裸の”DNAを用いれば、その制限は３ｋｂｐ近くであると思われる。このサイズは、多くの哺乳類c DNA、またはアンチセンス”ノックアウト”実験のために用いられるオリゴヌクレオチド、または他の小さな生理活性分子の発現のためには適当であろうが、多くの遺伝子全部のパッケージングの妨げになるであろう。しかしながら遺伝子治療のためには、偽カプシドによりDNAが完全にカプシド内に入ることは必ずしも必要でない。実施例６：偽カプシドとDNAを集合させること (i)偽カプシドにより宿主細胞へ移入されることができるDNA断片または他の外因性物質のサイズを増加させるために以下の技術を用いることができる。その技術は、実施例２に記載されたようにDNAを空の偽カプシド内にパッケージすることと、ついでさらに、１０μｇポリリシン（ｐ L300）／６０μｇ偽カプシドの存在下で３７℃２０分間のインキュベーションにより、DNAを保護することを含む。 (ii)別のDNAパッケージングおよび偽カプシドによる偽感染 DNAをBarrら（１９７９）の手法にしたがって偽カプシド内にパッケージした。インビトロでのパッケージングのために、リポーター遺伝子を含む約１μｇの環状または直鎖状DNAを、３０μｇの偽カプシドと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。混合物を４容量のＨ₂Ｏで希釈することにより浸透圧ショックにかけた。ポリリシン（Sigma,分子量30,000-70,000）をＤＮＡ濃縮の手段として用いた実験では、２μｇのポリリシンを、浸透圧ショックの前に、ＤＮＡ/ 偽カプシド混合物に添加した。反応は、３７℃でさらに１０分間インキュベートし、ついで細胞に添加した。１/２集密細胞培養をさらに９０分間随時揺とうしてインキュベートし、ついで１０％ＦＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地を過剰量添加した。ポリリシンによる、カプシド内に入らない外因性ＤＮＡの、DNaseIに対する保護ポリリシン存在下または非存在下で、偽カプシドによる、カプシド内に入らない材料の保護を評価するために、ｐＣＭＶβ ＤＮＡ（１μｇ）を用いた。パッケージング工程¹の後、０．１１Ｕ膵臓のDNascIを、１ｍＭＭｇＣｌ₂と０．５ｍＭＣａＣｌ₂の存在下、パッケージング混合液に添加し、溶液を６０分間３７℃でインキュベートした。酵素反応を、７６８ｍＭ酢酸ナトリウム、１２８ｍＭＥＤＴＡおよび２５６μｇ/ｍｌ酵母ＲＮＡからなる溶液の添加により止めた。パッケージされたＤＮＡを偽カプシドから放出させるために、反応混合物をプロテイナーゼＫで３７℃２０分間消化した。ポリリシンからＤＮＡを分離するためにトリプシン/verseneを用いた。溶液は等量のフェノール−クロロホルム（２５：２４ｖ/ｖ）で抽出し、ＤＮＡを冷エタノールで沈殿させ、ＴＥ（ｐＨ８）に再懸濁し、臭化エチジウムを含む１．０％アガロースゲルにのせ、電気泳動にかけた。 ¹ Forstova，J.ら、ヘテロなＤＮＡの哺乳類細胞への効率的な担体としてのポリオーマウィルス偽カプシド、Hum Gene Ther;6:297-306 （1995）ＤＮＡ、偽カプシド、ポリリシンの相互作用の分析ポリリシン存在下でパッケージされたＶＰ１とＤＮＡの緩衝液Ｂ中の混合物を、重量２．５ｇに調整し、１．２ｇのＣｓＣｌを添加し、最終溶液を超遠心チューブ（Beckman roter SW 55）に移した。ＤＮＡを含む偽カプシドを、空の偽カプシドから、SW 55ローター中40,000rpm、２０時間、２０℃の遠心分離により分離した。結果として得られた勾配を０．５ｍｌ分画で集め、各分画サンプル１０ μｌをプロテイナーゼＫ（０．１μｇ）で３７℃２０分間１％ＳＤＳ存在下で処理した。フェノール/クロロホルム抽出の後、ＤＮＡを５分間煮沸し、氷上で冷却した。スロットブロット装置を用いて、サンプルを予浸（２×ＳＳＣ中）膜（Zata-ProbeおよびBiodyne B．Pall）にのせ、マルチプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham）の指示に従って作製したｐＣＭＶβ（EcoRIで消化）³² Ｐ標識プローブにハイブリダイズさせた。膜はＸ線フィルム（XAR-5,KODAK）に室温で２０分間接触させ、結果として得られたハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーで分析した。細胞中のβ-ガラクトシダーゼ活性組織化学染色ポリリシン存在下または非存在下で、ＤＮＡと偽カプシドの組み合わせで遺伝祖移入した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％グルタルアルデヒドで、１０分間室温で定着させ、ついで２回ＰＢＳで洗浄し、Ｘ−ｇａｌ溶液（５ｍＭＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆、５ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆：３Ｈ₂Ｏ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、 N-N-ジメチルホルムアミド中２００μｇ/ｍｌ 5-ブロモ-4-クロロ-インドリル- β-D-ガラクトピラノシド）中で２０−２４時間室温でインキュベートした。β ガラクトシダーゼ遺伝子産物の細胞中の発現をインディゴブルー色により顕微鏡で検出した。全組織中のβ-ガラクトシダーゼ活性染色マウスからの全組織を、解剖の直後に、ＰＢＳで洗浄し、１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド、２ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＥＧＴＡ，０．０２％ＮＰ−４０を含む溶液で定着させた。１時間後に過剰の固定液をＰＢＳでの洗浄により除去し、サンプルをＰＢＳ中の染色試薬(５ｍＭＫ₃Ｆｅ(ＣＮ)₆ 、５ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆：３Ｈ₂Ｏ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０２％ＮＰ −４０、１ｍｇ/ｍｌＸ−ｇａｌ[5-ブロモ-4-クロロ-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド；Promega,Madison Wisc,USA]）と暗所で一晩インキュベートした。すべての操作は室温で行った。サンプルは低出力光顕微鏡で調べ、全組織で青く染色された領域を評点をつけるか、あるいは確認し、断面（１−２ｍｍ）を染色組織の領域から摘出し、高倍率で観察した。ＲＮＡ単離と逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲアッセイトランスフェクションまたは偽感染（偽カプシドによる）された哺乳類細胞培養（rat2細胞）から、ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。DNAを除去するために、単離した全ＲＮＡをDNascIで消化した。cDNA の合成は、オリゴヌクレオチドリバースプライマー（５’−TTCCAGATAACTGCCGTC ACTCC）を用いて行った。逆転写酵素を不活性化し、RNA/c DNAハイブリッドを変性するために、サンプルを９６℃５分間インキュベートした。PCRはオリゴヌクレオチドプライマー（5'-GGCATTGGTCTGGACACCAGCA）とリバースプライマーで、９４℃５分間、６０℃４５秒間、及び７２℃２分間の１サイクルと、これに続く９４℃４５秒間、６０℃４５秒間、及び７２℃２分間の３０サイクルとからなるプログラムを用いた熱サイクル（Hybaid）で行った。７２℃１０分間の最後の１サイクルで反応を完了させた。PCR産物を、１．０％アガロースゲルの電気泳動で分析し、産物をHybond N（Amersham）ナイロン膜に移し、³²P標識p CMV/β DN Aプローブ（上記参照）とハイブリダイズさせた。偽カプシド担体の見かけのDNAサイズの能力の制限を克服するために、および細胞を介した経路の間、非パッケージDNAを分解から保護するため、そして複合体を濃縮するために、われわれはポリカチオンアミン、ポリ-L-リシンの使用をその目的達成のために探究した。レセプター仲介遺伝子移入において、および遺伝子移入実験^2,3における他のレセプター媒介アプローチの為にヘテロなDNAを特異的ターゲットのリガンドに連結する手段として、ポリリシンを用いることに成功した。負にチャージされたDNAと正にチャージされたポリマーとの静電的相互作用は、DNAのリガンドへの結合に役立つだけでなく、コンパクトな構造⁴へ濃縮するのにも役立つ。ポリリシンは、アデノウィルスベクターと共に、後者⁵の取りこみ効率を増進させるためにも用いられている。 ² Wagncr,E.ら、ポリオーマウィルス主カプシドタンパク質VP1は、バキュロウィルスシステムで発現されたときに、細胞内DNAをパッケージすることが可能である。J.Viol.;71:2857-2865(1997) ³Cotten，M.ら、欠損あるいは化学的不活性化アデノウィルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いた、小さい、および大きい(４８キロベース）遺伝子構築物の高効率リセプター媒介デリバリー。Proc．Natl．Acad ．Sci.USA;89:6094-8(1992) ⁴Wagner,E.,Cotten,M.,Forsner,R.及びBirnstiel,M.L．トランスフェリン-ポリカチオン-DNA複合体：ポリカチオンの複合体の構造と細胞へのD NAデリバリーに対する効果。Proc.Natl.Acad.Sci.USA;88:4255-9（1991 ） ⁵Arcasoy,S.M.ら、ポリカチオンはin vitroで、上皮および内非細胞へのアデノウィルス-媒介遺伝子トランスファーの効率を増加させる。Gen e Therapy;4:32-38(1997) 我々の研究は、DNA/偽カプシドトランスファーシステムに添加されたポリリシンが、遺伝子活性の、ヒトを含む細胞へのインビトロでの短期搬送を増大させ、インビボ実験でも同様の効果を有することを示す。しかしながら、その存在は、高分子量DNAの偽カプシドによる移入に必須ではなく、長期遺伝子発現にとってはむしろマイナスであるかもしれない。偽カプシド経路によるインビボでの導入遺伝子発現は、検出されるような病状なしに、数ヶ月維持され、ポリリシンが存在するときにターゲットの臓器に関して若干の違いが観察された。このように、ポリリシン自体がVP1偽カプシドの細胞に特異的に入る能力を変えて、一時的な発現を増進させるのに対して、それは外因性遺伝子の長期的発現に対しては制限的な効果であるかもしれない。カプシド内に入らない外因性DNAの、ポリリシンによる保護主なポリオーマウィルスカプシド抗原、VP1は、偽カプシド内に自己集合されており、細胞フリーのシステムで、DNAに非特異的に結合する能力を有する。最初の研究で、偽カプシドとの集合でみられた、低いレベルの共精製細胞内DNascI 活性から保護される外因性DNAのサイズが、約３ｋｂｐ⁶であることを見出した。我々は、続いてVP1の精製プロトコルを、付随するDNascI活性を除去するように修正した。より大きいDNAの移入効率を増加させる試みにおいて、我々はポリリシンが、DNA/偽カプシド複合体と相互作用するかどうか試験し、インビトロ又はインビボでの細胞内DNaseの作用に対して保護される程度を測定した。７．２ｋｂｐのスーパーコイルプラスミドDNA（p CMVβ）を用いるデータを示す(図１２)。ポリリシンの添加または無添加において、DNA/偽カプシドにおけるプラスミドDNAのDNaseIによる消化物を、ゲル電気泳動で分析した。その結果、偽カプシドでパッケージされたDNAの大部分が、ポリリシンの保護なしで、約３ｋｂｐのサイズに分解されており、(レーン２)、以前の研究⁶と一致していた。ポリリシンが前もって形成されたDNA/偽カプシド複合体に添加されたとき（レーン４をレーン１と３と比較）と同様に、ポリリシンと混合され、その後VP1偽カプシドが添加されたDNAで、DNAの大部分が保護されていた(レーン３をレーン１と比較)。両方のケースで、その産物は、初期のDNA（レーン３）とスーパーコイル、環状および直鎖DNAの混合物において異なっており、ポリリシン自体がDNA ニッキングを起こすことが示唆された。同様のデータ（示さず）を、偽カプシド非存在下でのポリリシンで得た。 ⁶ Fostova J．ら。ヘテロDNAの哺乳類細胞への効率的担体としてのポリオーマウィルス偽カプシド。Hum Gene Ther 6:297-306(1995) 複合体形成のモードにより影響される構造変化パッケージングの後に、DNA/偽カプシド、DNA/ポリリシン、または３つ全部の混合物（DNA/ポリリシン/偽カプシド）のいずれかの相互作用を、CsCl均衡遠心分離による、複合体の動きを観察することにより分析した。p CMV β（７．２ｋｂｐ）DNAの偽カプシド、ポリリシン、あるいは両方との複合体は、CsCl密度勾配で沈殿した。偽カプシドの位置は、屈折率の測定とSDS-PAGEによるピークVP1 分画の同定により検出した。各分画の一部を、スロットブロッティングによりフィルター上に移し、DNAを³²Ｐランダム標識直線化p CMV β DNAとのハイブリダイゼーションにより同定した。各分画のシグナルの強度を、得られたオートラジオグラムのデンシトメトリー分析により測定した。得られたデータを図１３に示す。非複合化DNAは、CsCl勾配の底に沈殿しており、DNAと偽カプシドの屈折率の間の屈折率を有する分画においてDNAとポリリシンとの複合体のみが観察された(図１３、パネルＡとＢの比較)。ポリリシン（パネルＣ）と混合された、前もって形成されたDNA/偽カプシド複合体は、VP1偽カプシドの密度を有する分画でより顕著であったが、最初にポリリシンと結合し、その後偽カプシドが添加された（パネルＤ）DNAでは、ほとんど偽カプシドとの共移動は見られなかった。偽カプシドでの処理前にポリリシンと混合されたp CMV β DNAが、その混合手順を反対にした場合とは異なる構造を形成するとみられるので、電子顕微鏡(EM) により、上述と同じ条件で生産された材料を用いて、複合体をさらに研究した。パッケージングの後のp CMV β DNAと偽カプシドとの反応混合物（図１４、パネルＡ）は、DNA分子当たり２、３、または４個からなる粒子の複合体を含むのに対し、ポリリシンの存在下では、DNAの十分な濃縮が起こった(パネルＢ)。DNA /偽カプシド複合体は、さらにポリリシンを添加した結果、さらに濃縮された(パネルＣ)。DNA/ポリリシン複合体と混合された偽カプシドは、ポリリシンと結合したカプシド及びDNAの多くの分子と大きな集合体を形成した(パネルＤ)。構造変化は、細胞によるDNA取りこみに影響を与えるようである。（パネルＤで）見られたような、かなりの量の複合体は、特に取りこみがレセプター介在⁷であるならば、長期発現において、物質の細胞核への移入を阻害することが予想された。 ⁷ Zenke，M.ら、トランスフェリン-ポリカチオンコンジュゲートのレセプター媒介エンドサイトーシス：DNAを造血細胞へ導入するための効率的な方法。Proc.Natl.Acad.Sci.USA;87:3655-9(1990) この推定を検証するために、DNA/ポリリシン、DNA/偽カプシド、またはポリリシンと偽カプシドとが混合されたDNAの、適当な複合体を、（材料と方法で）記載されているようにヒトCCL13細胞に適用した。予備実験では、細胞を４８時間静置し、β-ガラクトシダーゼリポーター遺伝子の発現を、組織化学アッセイで（Xgalで染色し青く染まった細胞を形成）同定し、定量した。効率は低いものの、各実験において青い細胞が観察され、各ケースでポリリシン添加がかなり発現増加をもたらしていた(データ示さず)。遺伝子トランスファーでの偽カプシドの役割を評価することはこの研究の目的の一部であるので、この後の実験では、ポリリシンを前もって形成したDNA/偽カプシド複合体に添加して、３重の複合体を常に生成させた。偽感染効率に対するポリリシンとCa²⁺イオンの濃度の影響効率を増加させる試みにおいて、我々は、DNA/偽カプシド複合体とポリリシンとの間の比率を変えることが、EM研究によって示唆されたように、それらの構造を変化させ、偽感染に影響を与えるかどうかを探究した。反応におけるDNA/偽カプシド複合体とポリリシンとの最適な比率を確立するために、一定量のDNAまたはDNA/偽カプシドを、ポリリシンの量を増加させつつこれと混合し、その混合物をCCL13細胞とインキュベートした。実験を２回以上繰り返し、平均の結果を図１５Ａに示す。DNA/偽カプシド予備形成複合体が、０．２μｇ/μｌの濃度のポリリシンで濃縮されたときに、偽感染の一貫した増加が見られた。より高い濃度のポリリシンは、裸のDNAの発現を増進させたが、DNA/偽カプシド複合体処理細胞に対して毒性を有することがわかった。これらのデータに基づき、０．２μｇ /μｌのポリリシン濃度を最適な濃度として採用し、以降の偽感染反応に用いた。 Ca²⁺は、自己集合とVP1偽カプシドの保持に必要であり、ポリオーマウィルスのライフサイクルにおける、集合、安定性、および外部カプシドの脱集合で重要な役割を果たし、カプシドの細胞膜への浸透能力に影響を与える⁸ことが知られている。ポリリシンと複合したp CMV β DNA/偽カプシドを用いた、CCL １３細胞への効率的な遺伝子移入のためのカルシウムイオンの最適な濃度を見出すために、偽カプシドを、異なる濃度の（０μＭ、５μＭ、５０μＭおよび１００μＭ）緩衝液中で単離した。図１５Ｂに示すように、ポリリシンの存在下で、低い［ Ca²⁺］緩衝液中でカプシドと複合化したDNAは、遺伝子移入の高いレベルを示した。遺伝子導入の一貫した増加が、１０μ MCa²⁺を含む緩衝液中で調製された偽カプシドで観察された。 ⁸ Brady,J.N.,Winston，およびV.D．Consigli，R.A．精製ウィルスとの集合で見出される、ポリオーマウィルスの、カルシウムイオンキレーティングによる解離。J.Virol.;23:714-24(1977) インビボでのβ-ガラクトシダーゼ発現の持続性少なくともp CM β DNAに対して、一時的な偽感染効率を最適化することに向けて前進したので、β-ガラクトシダーゼ活性の持続性を、複合体の種々の調製物で形質導入した細胞内で検討した。各複合体について、CCL １３細胞の培養物を、ポリリシン存在下または非存在下で、DNA偽カプシド複合体で偽感染させ、あるいは対照としてポリリシンと混合したDNAで感染させた。偽感染細胞は２１日まで保持した(３日毎に１：５希釈での継代培養による)。サンプルは、２，５，１１，１４および２１日で取り出して、β-ガラクトシダーゼ発現をX-galで染色した。５日後に、観察された青く染色した細胞の数（約４００/ウェル）は、ポリリシン存在下で、DNA/ポリリシンまたはDNA/偽カプシド複合体で処理されたサンプルにおいて、半分以上消失した。しかしながら、１１日後では、少しの染色細胞が観察され、１４日後には全くなくなった(データ示さず)。比較的低感度の組織化学アッセイで、さらなるリサイクルを要する細胞で、大きなDNAの長期発現は、どの経路でも見られなかった。 β-ガラクトシダーゼの、静置培養で生存しているrat２細胞での発現は、こうして同様に調べ、青い細胞（数の減少）を偽感染後、あるいはリン酸カルシウム存在下でのDNAトランスフェクション後、２、１４、２１日目に観察した。しかしながら、どのプロトコルでも外因性酵素の発現が高いバックグラウンドの染色を起こしたため、これらの細胞でのデータの定量は困難であった。別のアッセイとして、β-ガラクトシダーゼの発現を、m RNAレベルにおいて、全RNAと細菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写-ポリメラーゼ鎖反応（RT-PCR）で評価した。その結果、図１６に示したように、ポリリシン非存在下(トラック7-9)、あるいは存在下（トラック10-12）で、DNA/偽カプシド複合体で処理された細胞の長時間の発現が示された。ポリリシンなしで（トラック4-6）または存在下で(トラック13-15)、あるいはリン酸カルシウム存在下で(トラック16-18)、DNA単独での遺伝子移入後２日目に、rat ２細胞から精製された全RNAを、対照として用いた。DNA/偽カプシド（pcaps）だけでの細胞の処理は、偽感染直後に、β-ガラクトシダーゼRNAの適度の発現をもたらし、発現は時間と共に、低い、しかし安定したレベルに減少した。ポリリシン（p LK）の添加はβ-ガラクトシダーゼ転写の最初のレベルを増加させ(例えば、トラック１０をトラック７と比較)、これも時間と共に強度も減少し(トラック１０から１２)、長期の効果は偽カプシド非存在下で見られたものと類似していた。ポリリシンだけ、あるいはリン酸カルシウムを、トランスフェクション剤として用いたときは(各々、トラック１３から１５および１６から１８)、ずっと高い初期レベルの転写が達成されたが、これはすばやく減少し、特に後者では、安定した状態が２１日まで続かないようであった。これらのデータは、偽カプシドが長期から短期までの発現に有利であることがみられた⁹以前のインビトロ実験と一致している。 ⁹ Forstova，J.ら、ヘテロなＤＮＡの哺乳類細胞への効率的な担体としてのポリオーマウィルス偽カプシド、Hum Gene Thcr;6:297-306(19 95) インビボのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現の持続性我々は、細胞をプラスチックに付着させるために敷かれたマトリックスがインビトロ実験で得られたデータに影響を及ぼしたのではないかと、疑いを抱いた。インビトロの人工物を回避するために、マウスでのインビボ実験を行い、偽感染に対するポリリシンの効果を評価した。ポリリシン存在下または非存在下で、７．２ｋｂｐのｐ CMV β DNAをリポーター遺伝子として用いて（対照としては裸のDNA）偽カプシド/DNA複合体をヌードマウスに皮下接種した。接種から１週間後と７週間後に組織を集め、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を組織化学アッセイにより評価した。データを表２Ａに要約する。ここで”高”発現と” 中”発現は、組織化学法で観察された青色発色の相対レベルを示す。”低または無発現”は明らかにネガティブの結果を示す。１週間後に、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の高いレベルの発現が、DNA/ポリリシンだけ、あるいはDNA/偽カプシドと複合化したポリリシンを接種されたマウスの脾臓、腎臓および脳で観察された。後者において、マウスからの皮膚も、接種箇所で強い遺伝子発現をみせた。DN A/偽カプシド複合体で接種されたマウスは、脾臓のみで強い発現をみせた。接種から７週間後、長期インビトロ実験と同様に、発現パターンは変化した。高いレベルの発現は、DNA/偽カプシド複合体を接種されたマウスの心臓でみられた。中程度の発現は、報告されているように¹⁰、脾臓および脳で観察された。適度な発現は、ポリリシン存在下でDNA/偽カプシド複合体で接種されたマウスのいくつかの臓器でまだ検出することができた。しかしながら、大部分の遺伝子発現は、DN AまたはDNA-ポリリシン複合体のみを接種されたマウスからは失われた。これらの結果は、VP1偽カプシド複合体は、インビトロ同様インビボでも長期発現に有利であることを裏付けるものである。 ¹⁰ Krauzewicz，N.ら、ポリオーマ偽カプシドタンパク質アッセンブリのin vitro遺伝子トランスファー、準備中の原稿上記研究で、レセプター介在遺伝子移入^11,12,13,14において広く用いられているポリ-L-リシン（ポリリシン）を、偽カプシド複合体に取りこまれていないD NAを保護して、遺伝子移入を容易にするために添加した。この試薬は、ポリオーマゲノムサイズの材料より大きいものを用いたときに、保護されたDNAのレベルを上昇させた(図１２参照)。創出した複合体に対する時間のオーダーの効果を探るときに、ポリリシンを最初にDNAと混合し、ついで偽カプシドに添加したものは、大きな集合体となった(図１３Ｄと１４Ｄ)。ゆえに、これに続く実験では、そのような集合体を防ぐために、最初にDNAと偽カプシドを混合し、ついでポリリシンを添加する含むプロトコルを用いた。この手順を最適化するために、Ca²⁺ またはポリリシンの濃度を変化させて評価した。DNA/カプシド/ポリリシン複合体は、複合体形成の間、０．２μｇ/μｌのポリリシンを用いたとき、インビトロでβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の最高の発現を与えた。DNA/ポリリシン複合体単独はより高い濃度で最高であった。電子顕微鏡データ(図１４) は、ポリリシンがDNA/偽カプシド複合体を濃縮することを示唆する。ウィルスカプシド集合、脱集合、細胞膜への浸透で重要な役割を果たす^15,16Ca²⁺では、１０μＭの濃度が最適であることがわかった(図１５Ｂ)。興味深いことに、これは本来のポリオーマカプシドとウィルス¹⁷の精製に用いられた緩衝液中の濃度である。 ¹¹Wagner,E.ら、細胞へのDNA取りこみのための担体としてのトランスフェリン-ポリカチオン・コンジュゲート Proc．Natl．Acad．Sci．USA; 87:3410-4(1990) ¹²Wagner,E.,Cotten,M.,Forsner,R.及びBirnstiel,M.L．トランスフェリン-ポリカチオン-DNA複合体：ポリカチオンの複合体の構造と細胞へのDNAデリバリーに対する効果。Proc.Natl.Acad.Sci.USA;88:4255-9(19 91) ¹³Arcasoy,S.M.ら、ポリカチオンはインビトロで、上皮および内非細胞へのアデノウィルス-媒介遺伝子トランスファーの効率を増加させる。G ene Therapy;4:32-38(1997) ¹⁴Zenke,M.ら、トランスフェリン-ポリカチオンコンジュゲートのレセプター媒介エンドサイトーシス：DNAを造血細胞へ導入するための効率的な方法。Proc.Natl.Acad.Sci.USA;87:3655-9(1990) ¹⁵Brady,J.N.,Winston，およびV.D．Consigli，R.A．精製ウイルスとの集合で見出される、ポリオーマウィルスの、カルシウムイオンキレーティングによる解離。J.Virol.;23:714-24(1977) ¹⁶Ruiz,M.C.ら、ロタウィルス粒子から外部カプシドタンパク質を可能化するCa2+の濃度は、株に依存する。J.Virol.:70:4877-83(1996) ¹⁷Turier，H.及びBeard,P in "Virology"(Mahy,B.W.J.編)(IRL Press ,Oxford,1985)pp.169-192 持続する長期発現は遺伝子治療の好ましい要素であるので¹⁸、我々は、組織培養で、CCL13ヒト肝細胞での７．２ｋｂｐ組換えDNAからのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現をモニターし、遺伝子デリバリーの種々のモードに適用して、この特性の評価を試みた。得られたデータは、遺伝子発現のレベルと一致しており、短期では、ポリリシン存在下で増進されたが、連続培養で徐々に減少して組織化学的に検出可能なレベルを下回った(偽カプシド存在または非存在下)。偽カプシドが、効果的な遺伝子デリバリーを達成するために時間を必要とする可能性を検討するため、３週間生存するために継代培養を必要としないrat２細胞を、CCL １３細胞で用いたものと同じ実験系で評価し、RT-PCRで転写の発現を測定した。インビトロ研究で、すべての同じ結果となった。すなわち、DNA/ポリリシン複合体自体が一時的遺伝子発現に向いているにもかかわらず、発現レベルは、他でみられたのと同様に^19,20、不安定であり、２１日目までに減少していた(図１６、トラック１３−１５を比較)。偽カプシドが存在するときに(トラック１０−１２) 、１４日と２１日の実験の間の差はより少なかった。同じことが偽感染実験（トラック７から９）でもおこったが、これは短期転写発現（トラック７）がポリリシン存在下でみられたもの(トラック１０)より下回った。この結果は、偽カプシドとポリリシンとの間の協同的効果を示し、我々の現在のプロトコールで、ポリリシンが短期発現を増加させるが、偽カプシド単独は高レベル発現よりも長期に有利であることを示す。 ¹⁸Wagner,E．ポリオーマウィルス主カプシドタンパク質VP1は、バキュロウィルスシステムで発現されたときに、細胞内DNAをパッケージすることが可能である。J.Viol.;71:2857-2865(1997) ¹⁹Wagner,E．細胞へのDNA取りこみのための担体としてのトランスフェリン-ポリカチオン・コンジュゲート Proc．Natl．Acad．Sci．USA;87 :3410-4(1990) ²⁰Wagner,E.,Cotten,M.,Forsner,R.Birnstiel,M.L．トランスフェリン- ポリカチオン-DNA複合体：ポリカチオンの複合体の構造と細胞へのDNA 搬送に対する効果。Proc.Natl.Acad.Sci.USA;88:4255-9(1991) このことをさらに探るために、我々は、時間が、組織培養での細胞で経験した制約を提供しないであろうと考えられる動物実験を行った。インビトロ培養研究で定めたように作製した複合体を、マウスの皮下に接種し、結果を１週間（短期発現を示す）および７週問（長期発現）で調べた。我々は、１週間で、偽カプシド存在または非存在下のポリリシン実験で一般的に同様の結果が得られ、脾臓、腎臓および脳で発現の最高のレベルが観察された。偽カプシドの存在下、ポリリシンなしで、標的は主に脾臓であった。DNA単独では、全臓器の全体の発現レベルはより低く、この経路で７週間までに全く発現が観察されなかった。現時点までに、DNA/ポリリシン複合体では、発現レベルも減少した。他方、DNA/偽カプシド複合体では、発現レベルは維持され、またはむしろ増加し、多くの臓器が安定してターゲットとなり、予期せぬことに、脳もそれに含まれていた。興味深いことに、ポリリシンは耳下腺をのターゲット化を可能にするようであり、これはDN A/偽カプシド自体では見られなかった。偽カプシドによる搬送の最初の低効率は、後から補償されるようであり、おそらく宿主染色体への安定な組み込みによるものと推測される。なお、他の遺伝子移入ベクター系に関しては、偽カプシドも含め、各実験で、少量の（５μｇ）のDNAを用いている。偽カプシドを用いる遺伝子移入は、ウィルスゲノムが存在していない非ウィルス遺伝子移入系に類似している。我々の実験は、高分子量DNAの遺伝子移入を助けるポリリシンの役割を研究するために設計され、それが(または類似化学剤)偽カプシド単独によって保護され得るサイズ（すなわち約３ｋｂｐ）より大きなサイズのDNAを保護するために必要とされることを仮定していた。我々の現在の実験は、これはそのようなケースではなく、VP1偽カプシド自体が、インビトロとインビボの両方で、より大きなプラスミド、例えば我々のアッセイで用いられた７．２ｋｂｐにコードされた遺伝子を、持続的に発現するように搬送できることを示す(我々は、１０ｋｂｐより大きいサイズのプラスミドの発現も、この経路で達成されるという予備的データをもっている。未発表の観察)。ポリリシンが取りこまれたリポーター遺伝子の一時的発現の増加に効果的であっても、それは長期持続性の発現を目的とした実験では明らかな価値はほとんどない。しかしながら、その使用は、特定の臓器または細胞型（表２Ａ参照）に対する遺伝子に関しては、および遺伝子発現レベルが持続性よりも重要である場合では、有利かもしれない。実施例７：代替的なアプローチは、パッケージ化の前の結合タンパク質によってＤＮＡを予備濃縮することである。実施例８：より大きな偽カプシド偽カプシドによって宿主細胞を手にするべきＤＮＡフラグメントのような外因性材料のより大きな量を与えるための代替のアプローチは、全てではないバキュウロウイルスが標準の４５ｎｍ二十面体構造へのＶＰ１自己集合のようなパポバウイルス主要カプシド抗原を発現したことを観測する有効性を獲得する。反対に、生産したカプシド抗原の幾つかは、より大きな球体および糸状形態に集合する (Forstova等，1993)。類似の形態学的知見は、ポリオーマウイルス感染した細胞によって、電子顕微鏡検査が２７から６５ｎｍまでのサイズの範囲内のカプシドを明らかにしたことでより早期に報告された(Eddy，1969)。本発明において、より大きなこれらの集合が単離され且つ実施例１と２において記載したようにパッケージＤＮＡとして使用される。これらのより大きな偽カプシドはパッケージすることができ且つ標準サイズの二十面体構造よりもより大きなＤＮＡフラグメントを移入する。実施例９：ＨＰＶＬ１タンパク質からの偽カプシドの調製偽カプシドは、Hagensee等(1993)J.Virol.67,315-322の方法によりヒト乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質から形成され得る。概略的には、そのＨＰＶＬ１遺伝子(このケースにおいてＨＰＶ１型からの)は、ＴＫ組換え法によりワクシニアウイルスに挿入され且つ適当な細胞、例えばＢＳＣ-1サル腎細胞中で発現される。同様に、Ｌ１は、組換えバキュウロウイルスから発現できる。ＨＰＶ-カプシドの精製化：ＢＳＣ-１細胞(２０-から１５０-ｍｍプレート)は、３０の感染の多様性で組換えワクシニアウイルスにより感染させた。細胞は、５％胎児ウシ血清と抗生物質を補充したDulbeccoの修正イーグル培地中、３７℃で７２時間培養した。次いで細胞を吸入により採集した。細胞は遠心分離(1,000ｘｇ，１０分)によりペレット化し、リン酸緩衝化塩溶液(ＰＢＳ)で一度洗浄した。各フラクションは、ＨＥＰＥＳ[N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'2-エタンスルホン酸]緩衝液(10mM ＨＥＰＥＳ[pH 7.9]、10mM ＫＣｌ、1.5mg ＭｇＣｌ₂ ）の１０ｍｌ中で細胞ペレットを再懸濁すること及び１０分間氷上でインキュベートすることによって調製した。細胞は緊密乳棒(tight-fitting pestle)で５０ストロークのホモジナイズにより溶解させた。核は、2,000ｘｇで１０分間の遠心分離によって採集した。その核は、２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、次いで２分間音波処理し、次いで2.1gの塩化セシウムを加えた。その核懸濁物を超遠心分離管に配し、その密度を1.340g/mlに調節した。サンプルは、ＳＷ５５ローター中、４℃で３６時間、45,000rpmで回転させた。フラクションは、管の底を穴開けすること又はカプシドバンドのニードル吸入によって採集した。得られたフラクションの密度は、Bausch & Lomb屈折計によって測定した。フラクションはＰＢＳの３度の変更に対して透析し、且つＨＰＶタンパク質はＰＢＳのウエスタンブロットによって検出した。Ｌ１タンパク質を含んでいるフラクションは、電子顕微鏡によって偽カプシド形成を分析した。その収量はほぼ１０¹⁰粒子であった。Ｌ１タンパク質が偽カプシドを形成するように自己集合できたかどうかを測定するため、組換えワクシニアウイルスによって感染させた細胞を採集し、次いで核を単離し、溶解し、且つ塩化セシウム密度勾配上で層形成させた。４８時間の遠心分離後、フラクションを採集し、そしてウエスタンブロットによってＬ１タンパク質を分析した。ほぼ1.30 g/mlの密度に移動した大量のＬ１タンパク質を製造した。電子顕微鏡によって分析した場合、５５-ｎｍ二十面体粒子が見出された。空の偽カプシドは、浸透圧ショック及び上述した再集合技術により、外因性材料、例えば哺乳動物のｃＤＮＡと結合させた。実施例１０：空の偽カプシドと他の外因性材料の集合抗体又はそれのフラグメントのようなタンパク質及びポリペプチドのような非遺伝的外因性材料、及び製薬学的に活性な化合物は、実施例２中の外因性ＤＮＡについて記載した方法を用いて空の偽カプシドと集合させることかできる。その方法はＤＮＡ用の外因性材料の置換により簡単に修正される。外因性材料がヌクレオシド類似物のような細胞の核の中に又はその上で作用する一つであることが好ましい。本発明の偽カプシドは、細胞核に有効な材料を誘導する。例えば、偽カプシドは遺伝子の発現を制御するためのホルモン感受性要素を活性化する核シグナリング分子の作用を誘発するための細胞核にホルモンを搬送するために使用され得る。実施例１１：哺乳動物への偽カプシドの投与本発明の上述した偽カプシドは、経口及び非経口(例えば皮下又は筋肉内)注入を含む何れかの通常の方法によって投与され得る。投与の好適な方法は、偽カプシドがエアゾルとして製造される場合に、鼻の吸入スプレーによるものである。そのようなアプローチは、肺上皮細胞に治療薬を搬送する有効な手段として嚢胞性線維症の遺伝子治療において使用されている。その治療法は、一定期間にわたり単一投薬量又は複数投薬量からなることができる。単独で投与することが本発明の偽ペプチドで可能である一方で、それは１又はそれ以上の許容できる担体と一緒に製薬調製物としてそれを提供することが好適である。その担体は、本発明の偽カプシドと和合可能である意味において「許容され」、それの受容者に有害とならない必要がある。典型的に、該担体は、滅菌され且つ発熱物質フリーとされるであろう水又は生理食塩水とされるであろう。実施例１２：偽カプシドの製薬調製該調製物は、単位投薬量形態において利便的に提供でき且つ医薬の分野で周知の方法の何れかによって調製され得る。そのような方法は、１又はそれ以上のアクセサリー成分を構成する担体と活性成分(本発明の偽カプシド)との結合をもたらすことの工程を含む。一般にその調製物は、液体担体又は微細に分割した固体担体又は両方と活性成分との結合を均一に且つ密接にもたらすことによって、次いでもし必要ならば、その生産物を成型することによって調製される。経口投与用に好適な本発明に従う製薬は、活性成分の予め決定した量をそれぞれ含んでいる、カプセル、カフェ剤又は錠剤のような；水性の液体又は非水性の液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油型液状エマルジョン又は油中水型液状エマルジョンとして提供することができる。その活性成分はまた、ボーラス、舐剤又はペーストとして提供され得る。錠剤は、任意に１又はそれ以上のアクセサリー成分を伴い、圧縮又は成形により作製され得る。圧縮した錠剤は、任意にバインダー(例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース)、滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、架橋したポビドン、架橋したカルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤又は分散剤と混合した、粉末又は顆粒のような自由流動化形態において活性剤と適当な機械で圧縮することにより調製され得る。成形した錠剤は、不活性な液状希釈剤によって保湿した粉体化化合物の混合物を適当な機械で成形化することによって作製され得る。錠剤は任意に被覆又は刻みを入れることができ、また例えば望ましい放出プロフィールを提供するために比率を変えるヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いてその中の活性成分の緩やかな又は制御した放出を提供するために製剤化され得る。口腔内に局所投与されるために好適な製剤は、香味化した基剤、普通はショ糖とアカシア又はトラガカント中に活性成分を含む薬用ドロップ；ゼラチンとグリセリン、又はショ糖とアカシアのような不活性基剤中に活性成分を含むトローチ；及び適当な液状担体中に活性成分を含む口内洗浄剤を含む。非経口投与のために好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤及び意図した受容者の血液と等張の製剤を与える溶質を含み得る水性及び非水性滅菌注射溶液；及び懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。その製剤は、単位投薬量又は複数投薬量容器、例えばシールされたアンプル及びバイアルで提供でき、且つ使用の直前に、滅菌液状担体、例えば注射用の水の添加のみが要求されるフリーズドライした(凍結乾燥した)状態において保存され得る。即時調合注射溶液と懸濁液は、先に記載した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。好ましい単位投薬量製剤は、活性成分の一日投薬量又は単位、一日サブ投薬量又は適当なそのフラクションを含んでいるそれらである。本発明の特に上記した成分に加え、当該の製剤のタイプに関係を有している分野において通常の他の剤、例えば香味剤を含み得る経口投与に適当なそれを含み得ることが理解されるであろう。実施例１３(i)：マウスの中枢神経系への、マーカー遺伝子、β-ガラクトシダーゼの安定な移入。方法偽カプシドの単離ＶＬ-ＶＰ１組換えバキュウロウイルスに完全したＳｆ９挿入細胞は、感染後７２時間で収穫し、緩衝液Ａ(150mM ＮａＣｌ、10mM Tris-HCl,pH7.6、10μＭＣａＣｌ₂、5％グリセリン、0.01％ Triton X-100)中に再懸濁し、１５秒バースト３回で１５マイクロアンペアで音波破砕によって破砕した。細胞の破片は、80 00ｘｇでの遠心分離によって除去し、偽カプシドは150,000ｘｇで１時間、20％ショ糖クッションを通してペレット化した。そのペレットは、緩衝液Ｂ(150mM ＮａＣｌ、10mM Tris-HCl,pH7.6、10μＭＣａＣｌ₂、0.01％ Triton X-100)中に再懸濁し、1.30-1.33g/ml(w/v)ＣｓＣｌに調整し次いで150,000ｘｇで４０時間、遠心分離によってバンド化した。空の偽カプシド(浮力密度1.280-1.295g/ml )と充満粒子(1.30-1.40)に相当するピークのフラクションを採集し、次いで偽カプシドを更に精製し、次いで第２のショ糖クッションを経て濃縮した。偽カプシドは、4mg/mlのタンパク質濃度で緩衝液Ａ中に最終的に再懸濁した。ｐＣＭＶβＤＮＡ-偽カプシド複合体の調製プロモーターの直前にサイトメガロウイルスの制御の下にβ-ガラクトシダーゼを含んでいるアフィニティカラム精製したｐＣＭＶβ(Clontech)、又は同じプロモーターの制御の下に緑色蛍光タンパク質(Chalfie等；セリン65のトレオニンへの変異で生じた増大した蛍光を持つ)のための遺伝子を含んでいるｐＳ６５Ｔ( Clontech)は、緩衝液Ａ(150mM ＮａＣｌ、10mM Tris-HCl,pH7.6、10μＭＣａＣｌ₂、5％グリセリン、0.01% Triton X-100)中、１：３０(w/w)の割合で、精製した偽カプシドと室温で１５分間インキュベートした。ＤＮＡと偽カプシドコントロールは、同様に調製した。ＤＮＡポリ-L-リシン複合体の調製は、室温で１０分間、ポリ-L-リシン(0.35mg/ml)とＤＮＡ-偽カプシド複合体をインキュベートすることによって実行した。偽カプシド-ＤＮＡ複合体電子顕微鏡検査精製した偽カプシド(4mg/ml)は、Formvarと炭素被覆グリッド(200メッシュ)上で５分間インキュベートし、そのグリッドは２倍量の蒸留水で２度洗浄し、次いでリンタングステン酸の１％溶液pH6.0中、２ｘ30秒間染色した。グリッドを乾燥し、60kVで操作するJEOL JEM 1200EX電子顕微鏡上で観測した。ＤＮＡと偽カプシド-ＤＮＡ複合体の可視化のために、サンプルは、1.75μg/m lのＤＮＡ濃度で、0.12mg/mlシトクロムＣ、0.5M酢酸アンモニウム、1mM ＥＤＴＡ、pH7.5中で調製した。水の分離に続き、その複合体はコロジオン被覆銅グリッド(200メッシュ)に移し、酢酸ウラニル(90％エタノール中、50mM酢酸ウラニル、50mM ＨＣｌ)で染色した。グリッドはＰｔ／Ｐｄ合金で回転造影化し、60kVで操作するJEOL JEM 1200EX電子顕微鏡上で観測した。インビトロでの緑色蛍光タンパク質をコードしているマーカー遺伝子の形質導入ガラスカバースリップ上の半全面に配した、ＳＶ４０ラージＴ抗原を構造的に発現するサルＣｏｓ７細胞(2x10⁴)は、胎児ウシ血清(CS)を欠くＤＭＥＭ中で洗浄し、ｐＳ６５ＴＤＮＡ(Clontech)と偽カプシドとを胎児ウシ血清(CS)を欠くＤＭＥＭ中で90分間、各15分間おきに撹拌しつつインキュベートした。10％ＣＳを補充した過量のＤＭＥＭを該培養物中に加え、且つインキュベーションを３６時間継続した。次いでカバースリップ上の細胞をＰＢＳ中で洗浄し、蛍光顕微鏡によって観測した。緑色に蛍光を発した細胞を、それぞれのカバースリップ上でカウントした。ノイラミニダーゼによる処理のために、細胞はＤＮＡ／偽カプシド／ポリ-L- リシン混合物との、次いでインキュベーションの残りについて50mUノイラミニダーゼとインキュベーションの間に200mUノイラミニダーゼ中で培養した。低ｐＨ実験は、pH６に調整したＤＭＥＭ中でＤＮＡ／偽カプシド／ポリ-L-リシン混合物と細胞とを培養することによって実行した。インビトロでのマーカー遺伝子、β-ガラクトシダーゼの形質導入６週齢の雌ヌード(nu/nu)マウスは、ＤＮＡ-偽カプシド複合体(5μｇＤＮＡ:1 50μｇ偽カプシド)、ＤＮＡ(5μg)、又は偽カプシド(150μg)単独を首の背部で皮下的に注射した。動物は注射後１又は６週で首の脱臼によって殺し、主要な器官を即座に凍結し、−７０℃で保存した。それぞれの器官の４分の１は、リン酸塩緩衝化塩溶液(PBS)中で洗浄し、固定液(ＰＢＳ中、1％ホルムアルデヒド、0.2 %グルタルアルデヒド、2mM ＭｇＣｌ₂、5mM ＥＧＴＡ、0.02％ Nonidet P40)中でインキュベートし、洗浄し且つＸ-ｇａｌ溶液(ＰＢＳ中、3mM K₄ Fe(CN)₆、3m M K₃ Fe(CN)₆、1mM ＭｇＣｌ２、0.05％ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D -ガラクトピラノシド)中、室温で一晩、インキュベーションした。青色生産物の沈澱によって測定した酵素的活性は、肉眼又は低出力光検鏡により測定した。結果９９％(データは示さず)よりも多いＶＰ１から構成された、精製した偽カプシド調製物は、電子顕微鏡検査中に示した通り(図７)、二十面体及び環状構造に集合されることが見出された。これら微構造の大部分は、それぞれの形の内に電子密集材料を欠くことによって測定されたように空である。スーパーコイルＤＮＡと偽カプシドとのインキュベーションは、安定な複合体の形成を生じる結果になる。電子顕微鏡検査による観測(図８)は、7.2kbpスーパーコイルＤＮＡ(単独でインキュベートした、パネルＡ)がＤＮＡ分子当たり2-4偽カプシドで集合したこと、及びそのスーパーコイルは集合により緩和された(パネルＢ)。さらに、スーパーコイル化及び複合化したＤＮＡ分子の測定の比較は、70％のＤＮＡが偽カプシドによってパッケージされたことを示す、平均短縮化が明らかになった。残りの遊離ＤＮＡの濃縮は、大きさにおいて200-300nmの高親和性複合体を生じる、ＤＮＡ-偽カプシド複合体へのポリ-L-リシンの添加(パネルＣ)によって達成できた。スーパーコイルＤＮＡと完全偽カプシド(宿主細胞からパッケージしたＤＮＡを持つ偽カプシド；Pawlita等，1996)は、空の偽カプシドのみが外因的に加えたＤＮＡをパッケージできることを示す、5％以下の複合体形成の結果を生じる(パネルＤ)。細胞にＤＮＡを移入する、異なる複合体の能力を試験するために、緑色蛍光タンパク質(GFP；Chalfie等，1994)の遺伝子をコードしているプラスミドをマーカーとして用いた。その結果は図９Ａ中に示される。ＤＮＡ単独(DNA)、又はＤＮＡ-完全偽カプシド混合物(DNA＋full p'caps)中でインキュベーションした細胞は、検出可能なＧＦＰを発現するのに十分なＤＮＡを取り込まない。しかしながら、ＤＮＡ-偽カプシド混合物(DNA+p'caps)とインキュベーションした0.5％の細胞は、培養において３６時間後に蛍光タンパク質を発現した。陽性の細胞の数は、もし複合体が、0.05％より少ない細胞がＧＦＰを発現したこれらの調製物(DNA +PLK)とインキュベーションしたとして、ＤＮＡ-ポリ-L-リシン複合体の形態によるものではなく、ポリ-L-リシンの添加(DNA+p'caps+PLK)により更に濃縮され、４％以上にまで増加した。ＤＮＡ-偽カプシド-ポリ-L-リシン複合体によるＤＮＡの形質導入は、しかしながら、図９Ｂ中に示した通り、天然ポリオーマウイルス、又はＤＮＡ-偽カプシド複合体に対し異なる特性を有することを実証できた。ノイラミニダーゼは、細胞とポリオーマウイルスの最初の相互作用及びウイルス感染のために必須の表面シアリン酸残基を除去する。ＤＮＡ-偽カプシド複合体とのインキュベーションの間と後にノイラミダーゼ(+neuraminidase)と共に培養した処理細胞は、ＧＦＰ遺伝子の何れかの検出可能な移入を抑制した(黒棒)。しかしながら、ＤＮＡ- 偽カプシド-ポリ-L-リシン複合体とインキュベーションした細胞の類似の処理物 (白棒)は、コントロールと比較して、形質導入した細胞の数が50-60％のみに減少した。さらに、天然ビリオン感染性を増大する(FogelとSachs，1959)、ｐＨ６ (低いｐＨ)での培地中での細胞についての複合体インキュベーションは、ＤＮＡ -偽ペプチド取込みを６倍増加したが、ＤＮＡ-偽カプシド-ポリ-L-リシン取込みについての有意な効果はなかった。これらの結果は、ＤＮＡ-偽カプシド複合体が天然ビリオンに類似した手法において細胞内に取り込まれる一方で、ＤＮＡ- 偽カプシド-ポリ-L-リシン複合体は取り込まないことを示す。インビトロデータに基づいて、インビボでの実験を、ＤＮＡ-偽カプシド複合体で実施した。これらの実験用に選択したマーカー遺伝子は、ヒトＣＭＶ直前プロモーター(ｐＣＭＶβ,Clontech)の制御の下でβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードした。調製物は、腫瘍形成実験用の天然ポリオーマウイルスを導入するために同じルートを使用している(Eddy,1969)、皮下的に、アシミック(athymic)ヌ- ド(nu/nu)マウス内に導入した。導入に続いて、マウスを１と６週で殺し、器官を、酵素の存在において青色生産物の堆積を生じる基質としてＸ-ｇａｌを用いて細菌性β-ガラクトシダーゼ活性を試験した。主要な器官の選択的な染色の結果を表１Ａ中に示した。８匹の動物を、ＤＮＡ(DNA1と2)、又は偽カプシド(PART1と2)でそれぞれ２匹、単独及びDNA-偽カプシド調製物(D+P1-4)にで４匹を処理した。１週間後(短期間)、接種の(Ｎ)サイトで皮膚は、ＤＮＡ単独を、又はＤＮＡ-偽カプシド複合体を注射下マウスにおいてβ-ガラクトシダーゼ活性を発現することが見出された。低いレベルのシグナルもまた、ＤＮＡ-偽カプシド注入マウスの肝臓及び腎臓サンプル中に見出された。しかしながら、６週間後、ＤＮＡ単独を注射したマウスにおいて検出可能なβ-ガラクトシダーゼの発現はないが、しかし皮膚のサイトはＤＮＡ-偽カプシド複合体を接種したマウスにおいてさらに陽性であった。さらに、予期せぬことには、β-ガラクトシダーゼの最も高い発現が、これらマウスの脳組織中で見出された。染色した脳組織は、ＤＮＡ(DNA)又は偽カプシド(CAPSID)単独がＸ-ｇａｌ中でインキュベーションした場合に組織がいずれかの青色の着色がいずれもない一方で、Ｄ＋Ｐ４(D+C)マウスの脳が広く染色されることを見ることができる、図１０、パネルＡ中に示される。その発現は、より高い程度で示した通り、脳においてエリアを分けるように局在した。図１０、パネルＢ中。第２のＤＮＡ-偽カプシドを注射したマウス(D+p3)の脳はまた、たとえ染色の強度がD+P4マウスと同じく大きいものではないとしても、試験した何れかの他の組織よりも顕著により陽性であった(データは示さず)。偽カプシドの投与のルートの影響は、表２Ａ中に示される。観測した染色がＤＮＡを導入したためであり、内因性遺伝子のためでないことを確認するために、ポリメラーゼ連鎖反応を、ＣＭＶプロモーターと細菌の遺伝子の中から選択したプライマーによって実行した。この技術はまた、遺伝子レベルのセミ提供評価をも与えた。ＰＣＲＱＩＡａｍｐ組織キット(QLAGEN)を用いて調製した、変性したＤＮＡ（500ng ）を、100pMプライマー(GTCAGATCGCCTGGAGACGCCATとTTCCAGATAACTGCCGTCACTCC、ｐＣＭＶβのヌクレオチド548-570と1538-1516)(Stratagene，Cambridge，UK)を含むＰＣＲ反応に加え、３５サイクルで増幅した。並行反応は、プラスミドＤＮＡの10²コピーが可能性のある酵素抑制を制御するために加えていたサンプルにより実行した。アガロースゲル電気泳動によって分離した生産物は、ナイロン膜 (Biodyne B,Pall,Portsmouth,Hampshire)に対するサザンブロッティングによって移入し、³²Ｐ-標識ｐＣＭＶβによってプローブ化した。オートラジオグラフの結果は、デジタル化し(Nikon Scantouch 10,東京、日本)、及びバンド強度を測定した(Kodak Cigital Scicncc 1D program,Kodak Scientific Imaging Syste ms,Rochester,NY,USA)。コピー数は、未処置ヌードマウス組織から抽出したＤＮＡのアリコートと混合したプラスミドＤＮＡの同様のＰＣＲｓからの生産物とバンドの強度を比較することによって測定した。偽カプシド-ＤＮＡ複合体で処理後７週で採取した脳組織から分離したＤＮＡについて実行したＰＣＲは、予期したサイズ(990bp；図１７Ａ、パネルａとｂ) の生産物の増幅を生じた。これらの生産物は、導入したβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の相同性を確認するために、放射能標識したｐＣＭＶβ(標識したＤ＋Ｐのトラック)に特異的にハイブリダイズした。ＰＣＲ生産物は、ＤＮＡのみで処理した動物の脳で有意のレベルで７週後に検出されなかった(標識したＤＮＡのトラック)。特に、投与のルート、即ち、i.p.、i.n.及びs.c.搬送に基いて異なった脳のサンプル中のＰＣＲ生産物のレベルは、i.v.ルートよりも脳へのＤＮＡ搬送で顕著に良好であった。この効果を分析するため、さらに、マーカー遺伝子のレベルを脳と心臓で比較した。ＰＣＲデータは、デンシトメトリーにより定量化し、ルート-従属バリエーションの概念を裏付ける、細菌β-ガラクトシダーゼ活性と脳におけるＰＣＲによって検出したＤＮＡのレベルとの間の相関関係を実証した(図１７Ｂ、黒棒) 。ＤＮＡが単独で導入された場合、遺伝子移入がわずか又は無いことがいずれのルートによっても検出された(白棒)。これに対して、心臓組織では、７週での酵素的な及びＰＣＲアッセイが、偽カプシド-ＤＮＡ複合体(図１７Ｃ)と同様に、ＤＮＡのみで処置したマウスにおいてβ-ガラクトシダーゼの発現と該遺伝子の存在を実証した(図１７Ｃ)。しかしながら、ここでは遺伝子発現とＰＣＲ生産物のレベルとの間の相関関係がより劣っており、及び脳において異なる、投与のルートに関連した個別のパターンはない。I.v.投与は、しかしながら、ＤＮＡが単独投与された場合、検出したＤＮＡの高いレベルの、及びＤＮＡ-偽カプシドのケースにおいて遺伝子発現の高いレベルを生じる。この観測は、この搬送ルートによって血流を経て急速に到達する高濃度のＤＮＡ又はＤＮＡ-偽カプシド複合体によって説明され得る。トータルで３５匹のマウスを用いた、３つの分離した実験において、全般的なパターンは表２Ａ中に要約したように明示されている(投与の全てのルート空のデータが結び付けられている)。即ち、１週間後、投与の全てのルートで、偽カプシドを使用した場合一貫して高くしたレベルによって、裸のＤＮＡとＤＮＡ- 偽カプシドの両方についてβ-ガラクトシダーゼの一時的な発現が心臓、脾臓及び腎臓において検出された。この相違は経時により大きく増加し、且つ７週間で、ＤＮＡ単独で処置したマウスからの最も大きな発現が失われていた一方で、ＤＮＡ-偽カプシド搬送によって発現は増加し且つ維持された。加えて、後者において、動物の脳における発現が観測された。偽カプシドの導入は、これらの研究において、又は免疫応答性ラット中の脳の第３脳室内に注射した場合のその他の実験において、完全に症状が無かった(後述を参照)。観測した器官の発現分布は、インビボで異なる組織で変化することが報告されている²¹、ＣＭＶプロモーターの活性化を反映させることができる。しかしながら、我々のデータは偽カプシドそれ自身が発現パターンに影響し得ることを示唆し、及びこれまでのその他の共同研究(T．Dalianis，個人的な論説) がマウスポリオーマウイルスゲノムから得た他の組換えプラスミドＤＮＡ構築物が偽カプシドとの複合体を導入した場合に脳においてＰＣＲにより検出できることをも示す。インビトロで、偽カプシドによって導入されたＤＮＡは、宿主染色体をまとめることが示されている²²。インビボで、遺伝子移入を仲介した偽カプシドもまた、安定であると思われる。進行中の実験は、入力ＤＮＡの発現が少なくとも３．５ヶ月後まで同定できることを示す；長期の実験は進行中である。心臓において遺伝し搬送の高いレベルを生じる、i.v.投与は、少なくとも脳に対して首尾の良いルートであった。他方で鼻内投与は、この際とへのＤＮＡ搬送において有効であった。かくして、ＣＮＳへの偽カプシドの伝達は、血液脳関門を経て進行することはできず、代替のルートにより、例えばヘルペス単純ウイルスで見られたそれと類似した手法において^23,24、逆行性の軸索輸送による。マウスポリオーマウイルスは、ウイルス用の大抵のアッセイ(例えば、プラークアッセイ)が測定用の十分な材料を生産するためにこの特性に基づいていることから、このサイトで非効率な複製のためにＣＮＳにおいて検出されていない。ＣＮＳへの遺伝子のインビボ搬送用のこの新規のアプローチは、安全性及び効率化に関して欠点を有する^25,26,27、以前に使用したウイルス及び非特異的な方法を超える顕著な有効性を提供する。ウイルスベクターは、発現のレベルと持続性の観点から有望性を示しているが、しかし、ウイルスＤＮＡの搬送及び効果を減じた株における復帰変異の危険が有り、且つ非ウイルスベクターは長期間発現が得られない^28,29,30。本発明の偽カプシドは、かくして、それらが特異的なウイルス介在した取込みを模倣するが、しかしそれらがヘルパーウイルス機能を要求することなく、それ自身はウイルスの遺伝情報を含むものではない、代替担体アプローチを提供する。ＣＮＳへのアクセスは、多くのケースにおいて、大脳内注入により、ＤＮＡの投与を必要とする、血液脳関門によって制限される³¹。神経栄養性ＨＳＶとアデノウイルスのような、ウイルスの末梢投与は、変化しやすい結果を与え^32,33,34、且つこれらウイルスへの炎症性応答はそれらの使用をも制限し得る^35,36。この研究において、偽カプシドを介したＤＮＡ搬送は、低毒の又は無毒の末梢投与(侵襲性の鼻内ルートを含む)に続くニューロンの組織における一貫した及び持続した発現の結果となった。これらの結果は、該偽カプシドアプローチが、将来の遺伝子治療プロトコル、特に神経系のための、基礎を形成することができた。実施例１３(ii)：ＤＮＡとＤＮＡ／偽カプシド複合体の定位の投与に続くラット脳中のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現プラスミドＤＮＡ(0.5μg；ｐＣＭＶβ)、β-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしている、偽カプシドに複合化した、又は単独を、ラット脳の第３脳室に定位注射によって導入した。動物は、１及び７週で殺し、偽カプシドへの抗体応答及びβ-ガラクトシダーゼの発現を試験した。注射の１週後、β-ガラクトシダーゼの高レベル発現が、ＤＮＡとＤＮＡ／偽カプシド複合体の両方で処置した動物において第３脳室の管壁の細胞でＸ-ｇａ１染色によって検出された。更なる発現が、ＤＮＡ／偽カプシド処置したラットの注射痕及び注射のポイントから離れた細胞の小さな斑で検出された。７週後、発現は小脳においても検出された。それの食餌パターン、体重の変化又は他の行動によって測定されるような動物における偽ペプチド治療の不利な効果の徴候はなかった。しかしながら、偽カプシドによって処置した動物中でのＶＰ１に対する有意な免疫応答があった。実施例１３(iii)：免疫応答性マウスにおけるβ-ガラクトシダーゼの偽カプシド仲介発現６週齢の雌のｂａｌｂｃマウスは、ＤＮＡ(5μg；ｐＣＭＶβ)単独、又は偽カプシドと複合化したＤＮＡのいずれか一方を、皮下的に注射し、又は鼻内処置した。マウスは１及び７週で殺し、抗体生産及びＸ-ｇａｌ染色によってβ-ガラクトシダーゼの発現について試験した。注射後１週、β-ガラクトシダーゼの発現が、ＤＮＡ又はＤＮＡ／偽カプシド複合体を皮下的に注射したマウス中の心臓、肝臓、腎臓及び脾臓中で検出された。ＤＮＡ／偽カプシド複合体を注射したマウスにおいて、発現は脳においてもさらに見出された。鼻内を複合体で処置した動物において、低いレベルの発現が、１週で腎臓においてのみ検出された。７週では、ＤＮＡ単独で処置したマウスからの組織において検出された発現はなく、一方、皮下及び鼻内の両方で、ＤＮＡ／偽カプシド複合体によって処置したマウスの脳、腎臓及び心臓において高いレベルの、及び肝臓と脾臓において中度の発現が見出された。ＶＰ１に対する有意の抗体価が偽カプシド／ＤＮＡ複合体での処置の後１週でマウス中に見出されたにもかかわらず、マーカー遺伝子の持続した発現が観測された。その価は鼻内で処置したマウスにおいて低く、経時によって減少した。実施例１４：エクスビボでのウサギ角膜培養物におけるマーカー遺伝子、β-ガラクトシダーゼの長期発現方法偽カプシド、ＤＮＡ及び複合体の調製実施例１３に記載した通り。角膜エクスビボへのマーカー遺伝子の形質導入角膜は、異系交配雌ニュージーランドホワイトラビットから収穫し、４分の１に分割し、そしてＤＮＡ-偽カプシド複合体(1μｇＤＮＡ：３０μｇ偽カプシド) 、ＤＮＡ(1μg)単独、又は陽性コントロールとして、ヒトサイトメガロウイルス直前プロモーター(ＲＡｄ３５：WilkinsonとAckrigg,1922)の制御下にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる1.5ｘ10⁷pfu組換えアデノウイルスとインキュベーションした。培養物は2％胎児ウシ血清(FCS)を補充した最小必須培地(MEM; Gibco-BRL)中で１又は４週間維持し、次いで角膜を固定し、そして実施例１３に記載した通り、β-ガラクトシダーゼ活性用に染色した。結果器官培養において分化した組織に特異的な移入ＤＮＡへの偽カプシドの能力を試験した。ウサギ角膜は、解剖後の４週までの間、それらがエクスビボ培養され得るように、及び培養において、分割している(上皮)及び分割していない(内皮) 細胞層を有するように、この実験用に選択した。加えて、その内皮細胞は器官中の神経である(TuftとCoster，1990)。角膜は、ＤＮＡ-偽カプシド複合体、ＤＮＡ単独、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしている組換えアデノウイルスとインキュベーションし、Ｘ-ｇａｌで染色することによってβ-ガラクトシダーゼの発現について２つの時間点で分析した。組換えアデノウイルスとインキュベーションした角膜のみは、培養の１週間後にβ-ガラクトシダーゼを発現することが見出された。しかしながら、４週間後、β-ガラクトシダーゼの発現はＤＮＡ-偽カプシド複合体とインキュベーションした角膜の内皮細胞層において見出された(図１１，パネルＡ)。その培地から捨て去った及び培養皿の表面上に増殖している非常に多数の分割した上皮細胞はマーカータンパク質について陽性であった(データは示さず)。ＤＮＡ単独においてインキュベーションした角膜中の内皮細胞層において染色は観測されなかった(パネルＢ)が、しかし組換えアデノウイルスによって感染した細胞において、ＤＮＡ-偽カプシド複合体によって達成したそれと類似のレベルで、培養期間にわたり発現が維持された(パネルＣ)。補足欠如又は減じた因子への導入遺伝子実施例１５：チロシンヒドロキシラーゼの過剰発現によるドーパミン増加レベル構成ウイルス(広い活性)、又はそれ自身(神経特異性)のプロモーターの制御下にヒトチロシンヒドロキシラーゼｃＤＮＡは、上述した標準プロトコルによって偽カプシド内にパッケージした。インビボ偽カプシド複合体は、哺乳動物に、皮下、腹腔内、静脈内注射、又は鼻内投与によって導入される。代替的に、複合体は定位的な注入によって脳の線条内に直接注入される。全身的な導入のため、もし必要性が考慮されるなら、一時的な免疫抑制が偽カプシド複合体の導入後１週間までに実行され得る。インビトロインビトロ投与のために、胎児ニューロン、ニューロン多能細胞系、副腎クロム親和細胞、グリア細胞、筋芽細胞又は線維芽細胞が、血清フリー培地中で１時間、偽カプシド複合体とインキュベートされ、次いで補充した増殖培地中で一晩培養される。遺伝子移入した(transfected)細胞は、治療が要求される、神経系の適切なサイトに注入される。変法において、抗アポトーシス遺伝子、例えば神経アポトーシス抑制タンパク質が使用される(Roy等1995 Cell,80;167)。上記方法は、そのｃＤＮＡからの何れかの神経ペプチドの発現、又は、例えばプリオンタンパク質へのアンチセンスの導入を達成するために使用され得る。神経学的疾患の治療のために重要な他の遺伝性材料は、以下の表中に与えられる：薬剤感受性遺伝子の導入による癌の治療実施例１６：ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼの導入によるガンシクロビルへの薬剤感受性の導入(シトシンデアミナーゼ用にも好ましい) 適切な感受性体制のための遺伝子は、標準プロトコルによって偽カプシド内にパッケージされ、腫瘍塊中に直接注入によって導入される。２日後にガンシクロビルが全身的に投与される。ペプチド核酸(PNA)／ペプチド／タンパク質導入実施例１７：プリオンタンパク質に対するアンチセンス遺伝子を生産するためのＰＮＡの導入１８マーまでのＰＮＡ(Buchardt等1993 Trends Biotech,11;384)は、ヒトプリオンタンパク質遺伝子に対するアンチセンス配列として合成され、そしてマウスボリオーマウイルスの非コード化領域に共有結合される(5021-173転写の起源の端から端まで)。代替的な結合は、パッケージングを助けるために、この領域から短縮ＤＮＡ配列までに作られる。修正したＰＮＡｓは、室温で１５分間、1:30 (w/w)の割合で偽カプシドと相互作用させる。代替的に、偽カプシドは10mM ＥＧＴＡと100mMジチオトレイトールの存在中で分解し、30:1(w/w)の割合でＰＮＡｓと混合し、次いで緩衝液(150mM ＮａＣｌ、 10mMトリス-塩酸pH7.4、0.01マイクロＭＣａＣｌ₂，0.05％ Triton X 100、5％グリセリン)により４℃で一晩透析される。再構成した偽カプシド-ＰＮＡ複合体は、限外濾過によって濃縮し、次いで注射によって哺乳動物の皮下、腹腔内、静脈内に、又は鼻内に投与される。代替的に、複合体は定位注入によって脳の中に直接注入される。神経活性ペプチド又はタンパク質は、分解した偽カプシド又はＤＮＡに共有結合し次いで上記の通りパッケージしたものとのインキュベーションによっていずれか一方にパッケージされる。代替的に、ペプチド又はタンパク質は、トランスグルタミネーションによって偽カプシドに直接共有結合され、次いで上記の通り導入される。全身的な導入のため、もし必要性が考慮されるなら、一時的な免疫抑制が偽カプシド複合体の導入後１週間までに実行され得る。インビトロ投与のために、胎児ニューロン、ニューロン多能細胞系、副腎クロム親和細胞、グリア細胞、筋芽細胞又は線維芽細胞が、血清フリー培地中で１時間、偽カプシド複合体とインキュベートされ、次いで補充した増殖培地中で一晩培養される。遺伝子移入した細胞は、治療が要求される、神経系の適切なサイトに注入される。たとえ当業者が重要な哺乳動物の適切な投薬量を決定できるであろうとも、成人への投与のため、３００ミリグラムの偽カプシドにほぼ１０ミリグラムのＤＮＡの投薬量とすることが適当とされるだろう。論考これらの結果は、偽カプシド遺伝子移入系がインビトロ及びインビボで細胞内に少なくとも7.2kbpのサイズのマーカープラスミドの移入を仲介できることを実証する。インビトロで偽カプシドは、予期しない組織向性を呈し、つまり皮下的に導入した場合、主要な標的器官の一つは中枢神経系である。偽カプシドがニューロンの期間の非分割細胞へのＤＮＡに移入できることは、エクスビボ培養での角膜内皮において実証された、マーカー遺伝子の高レベル発現によってさらに裏付けられる。腫瘍形成によるポリオーマウイルスの組織向性の形跡は、たとえ腫瘍がその哺乳動物の至る所の多くの他のサイトで誘導されたとしても、ウイルスと共に皮下的に注射したマウスの脳において形成された腫瘍は無いことが示されている(Edd y，1969)。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応による検出は、ウイルスに感染した免疫無防備状態のマウスの脳中のウイルス性ＤＮＡの存在は明らかにされていない。それ故に、本発明の偽カプシドの組織向性は、完全に予期されないものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者クラウゼウィック，ニーナシェイライギリス国ロンドンＷ12 ０ＮＮドゥケーンロード（番地なし）コモンウェルスビルディングロイヤルポストグラデュエイトメディカルスクール

Claims

【特許請求の範囲】１．パポバウイルス主要カプシド抗原からなりマイナーカプシド抗原を除く偽カプシドの、該偽カプシドはそれと結合した外因性材料を有する、該外因性材料が細胞に取り込まれ且つその細胞中の生物学的に機能するようにニューロンの宿主細胞を治療するための偽カプシド組成物の製造においての使用。２．ニューロンの宿主細胞が哺乳動物の中枢神経系から誘導される又は存在する請求項１記載の使用。３．ニューロンの宿主細胞が哺乳動物の脳から誘導される又は存在する請求項１又は２記載の使用。４．主要カプシド抗原が、ヒト乳頭腫ウイルス；マウスポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス；シミアンウイルス４０；又はヒトポリオーマウイルスＢＫからの１又はそれ以上である請求項１記載の使用。５．主要カプシド抗原がマウスポリオーマウイルスからのＶＰ１である請求項１記載の使用。６．宿主細胞における外因性物質の生物学的機能が、その細胞又はその細胞を含有している哺乳動物についての有益な効果である請求項１から５のいずれか１項記載の使用。７．有益な効果が神経学的疾患の治療及び／又は予防である請求項６記載の使用。８．神経学的疾患がアルツハイマー病又はパーキンソン病から選択される請求項７記載の使用。９．偽カプシド組成物が製薬的に許容される担体を含む請求項１から８のいずれか１項記載の使用。１０．外因性材料が遺伝物質である請求項１から９のいずれか１項記載の使用。１１．遺伝物質が少なくとも１の遺伝子の全て又はコード化部分を含む請求項１０記載の偽カプシドの使用。１２．遺伝子が神経発育因子、チロシンヒドロキシラーゼ又は神経アポトーシス-抑制タンパク質から選択される請求項１１記載の使用。１３．遺伝子の発現が神経系-特異的プロモーター又は特有の神経細胞サブ集団に特異的なプロモーターの制御の下にある請求項１１又は１２記載の使用。１４．プロモーターが、神経フィラメント軽鎖、ニューロン-特異エノラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ、グリアの酸性線維性タンパク質、Ｔα１-チューブリン、血小板誘導成長因子のβ-鎖、ミエリン塩基性タンパク質、及びプレプロエンケファリンのプロモーターから選択される請求項１３記載の使用。１５．外因性材料がタンパク質又はペプチドである請求項１から９のいずれか１項記載の偽カプシドの使用。１６．タンパク質又はポリペプチドが抗体又はそのフラグメントである請求項１から９のいずれか１項記載の偽カプシドの使用。１７．外因性材料が製薬的活性化合物である請求項１から９のいずれか１項記載の偽カプシドの使用。１８．外因性材料がペプチド核酸である請求項１から９のいずれか１項記載の偽カプシドの使用。１９．外因性材料が生物学的マクロ分子の複合体である請求項１から９のいずれか１項記載の偽カプシドの使用。２０．複合体がＤＮＡとレコンビナーゼを含む請求項１９記載の偽カプシドの使用。２１．ＤＮＡが宿主細胞のゲノム中のサイトの配列を含む請求項２０記載の偽カプシドの使用。２２．パポバウイルス主要カプシド抗原から形成した空の偽カプシドを用意すること、及びマイナーカプシド抗原を排除すること；外因性材料を用意すること；及び該からの偽カプシドと該外因性材料とを混合すること、ここで外因性材料は空の偽カプシドと結合することになる；ただし、外因性材料は、使用において、ニューロンの宿主細胞の生物学的機能化が、神経学的疾患を治療する及び／又は予防することによってその細胞又はその細胞を含んでいる哺乳動物についての有益な効果を有するように選択される、を含む偽カプシド組成物の作製方法。２３．偽カプシド組成物が空の偽カプシド内部の材料をパッケージすることによって提供される請求項２２記載の方法。２４．その材料が偽カプシドへのそれの接合によって偽カプシドと結合される請求項２２記載の方法。２５．空の偽カプシドと外因性材料の混合物が浸透圧ショックにさらされる請求項２２記載の方法。２６．空の偽カプシドと外因性材料の混合物がカルシウムイオンの存在中で混合される請求項２２記載の方法。２７．パポバウイルス主要カプシド抗原からなりマイナーカプシド抗原を除く偽カプシドを含む製薬組成物であり、偽カプシドはそれをもって結合した製薬的活性化合物を有し；該偽カプシドは製薬的に許容される担体と一緒に提供され、ここで製薬的に許容される化合物は神経学的疾患を治療する及び／又は予防することによってその細胞又はその細胞を含んでいる哺乳動物についての有益な効果を有するように選択される、製薬組成物。２８．鼻内又は腹腔内投与に適応した請求項２７記載の製薬組成物。２９．製薬学的活性化合物が宿主細胞の核内で作用する請求項２７記載の製薬組成物。３０．偽カプシド組成物が哺乳動物に鼻内又は腹腔内投与されるために適応される請求項１から２１のいずれか１項記載の使用。