JP2010207246A - 生理的条件下でのウイルス粒子様構造体及びその形成方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】例えばSV40ウイルスのVP1の如きウイルスタンパク質を、pH5.0〜pH7.0及び室温にて、130mM〜170mM 塩化ナトリウムおよび1.5mM〜2.5mMの二価陽イオンの存在下で、且つSV40のVP2の如き粒子形成促進因子の存在下で、インキュベートすることを特徴とする、ウイルスタンパク質から構成される均一なサイズのウイルス粒子集団の形成方法。ウイルス粒子中に被封入物質を封入する場合には、上記インキュベーションの際に被封入物質を共存させればよい。
【選択図】なし
Description
またこのウイルス様粒子を細胞より精製し、それから粒子構成単位(例えばSV40ウイルスではVP1五量体)に一旦解離させ、試験管内で再びウイルス様粒子を再構成させる方法もある。
本発明はまた、宿主細胞内でウイルス粒子様構造体を形成する方法を提供する。
本発明は試験管内において生理的条件下で効率的にサイズが均一なウイルス様粒子形成を行うために、天然のウイルス粒子中に見られるタンパク質を再構成環境に加えることで、目的を達成した。
ウイルス粒子様構造体を構成する前記ウイルス蛋白質は、好ましくは、SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質である。
前記被封入因子は、典型的には、生理活性物質であり、例えば、核酸、蛋白質、又は低分子物質である。
なお、上記の変異体の調製方法は特開2002-360266に詳細に記載されている。
実施例1. ウイルス粒子の調製
(1)ウイルスタンパク質(VP1)五量体の調製
10cm径の組織培養用ディッシュ50枚にSf9細胞を1×107個づつ蒔き、SV40のウイルスタンパク質(VP1)を発現する組換えパキュロウイルスを、m.o.i.(Multiplicity of Infection;重複感染度)5〜10で感染させた。
アミノ末端にヒスチジン配列およびFLAG配列を挿入したSV40-VP2遺伝子をpET-14bベクターに組込み大腸菌BL21株に形質転換した。形質転換した大腸菌を250mlのLB培地に接種し、37℃でしんとう培養した。培養液が、対数増殖期(濁度;0.D.値 0.3(波長660nm))で1mM IPTGでタンパク質の誘導発現を行った。誘導発現4時間後に、大腸菌を遠心して回収した後、冷却したリン酸緩衝液(PBS)により2回洗浄した。回収した大腸菌に、氷冷した結合緩衝液(20mM Tris-HCl(pH7.9),10%グリセロール,500mM KCl,0.2mM EDTA,0.1% NP-40,0.5mM DTT,10mMイミダゾール)を40ml加え、TAITEC社のVP-15S(ソニケーター)を用いて、DUTY CYCLE 50%、出力5の条件で、氷冷しながら10分間超音波破砕した。次に、細胞破砕液を14,000g、4℃にて20分間遠心し、その上清を回収した。
調製したSV40-VP1タンパク質五量体とSV40-VP2タンパク質を用いて生理的条件下でのウイルス粒子の試験管内再構成を行った。即ち、pH5〜7の場合、例えば、VP1五量体タンパク質82.5ng/μL,150μLに、VP2タンパク質800ng/μL,3.4μlを加えて、4℃で30分間インキュベーションし、150mM NaCl,2mM CaCl2の溶液で透析法を用いて透析することで再構成を行った。即ち、VP1タンパク質とVP2タンパク質のmol比が360:84になるように加えた。ウイルス様粒子の検出は、電子顕微鏡観察を用いて行った。結果を図1に示す。
精製したVP1五量体タンパク質を含む溶液を、透析により生理的条件の溶媒に置換し、その集合化様式を調べた。粒子形成が観察された(3)の結果とは異なり、生理的条件下でのpH5.0〜7.0の場合、VP1五量体のみではウイルス粒子様構造体の形成は殆ど見られなかった。VP1、例えば270ng/μL濃度のVP1五量体150μLを、室温で、150mM NaCl、2mM CaCl2でpHが4、または5、または6、または7の溶液で透析した。透析開始16時間後にこの溶液を回収し、電子顕微鏡下で観察して、各条件下で見られるVP1五量体の集合化様式を観察した。結果を図2に示す。
精製したVP1五量体タンパク質に分子量比でVP1タンパク質:VP2タンパク質=360:10.5、360:21、360:42、360:84となるようにタンパク質溶液を混合した。その溶液をpH5.0の生理的条件の溶媒に透析法を用いて室温で置換した。置換した溶媒を電子顕微鏡観察することでVP2タンパク質の濃度が変化した時に見られる集合化の様式を観察した。
精製したVP1五量体タンパク質と精製したΔC40 VP2タンパク質(分子量約34KDa)、ΔC80 VP2タンパク質(分子量約30KDa)を分子量比でVP1:カルボキシル末端欠失VP2=360:84の比で混ぜ、4℃で30minインキュベーションした。この混合液をpH5.0、150mM NaCl、2mM CaCl2の溶液で室温にて透析した。
VP1五量体タンパク質と各種の点変異を導入したVP2タンパク質、283位から285位のPro, Gly, GlyがArg, Glu, Argに変異したもの(以下PGP→RER)、276位のPheと277位のIleがGluに変異したもの(以下FI→EE)、あるいはAlaに変異したもの(以下FI→AA)、296位のLeuと300位のLeuがAlaに変異したもの(以下LPLLL→APLLA)等の各種VP2タンパク質を分子量比で、VP1:点変異体VP2=360:84の比で混合し、4℃で30min静置し、その後、室温でpH5.0、150mM NaCl、2mM CaCl2の溶液に透析した。
精製したVP1五量体タンパク質を含む溶液を、pH8.0〜pH10.0の条件で透析し、その集合化様式を調べた。粒子形成促進因子が必要なpH5.0〜pH7.0の条件とは異なり、生理的条件下でのpH8.0〜10.0の場合、VP1五量体のみでもウイルス様粒子形成が観察された。例えば270ng/μL濃度のVP1五量体150μLを、室温で、150mM NaCl、2mM CaCl2でpHが8、または9、または10の溶液で透析した。透析開始16時間後にこの溶液を回収し、電子顕微鏡下で観察して、各条件下で見られるVP1五量体の集合化様式を観察した。結果を図7に示す。
実施例1を反復した。ただし、生理的条件下でのウイルス様粒子の試験管内再構成の工程(3)において、3000bpのプラスミドを共存させる事により、ウイルス様粒子へのDNA取り込みを行った、形成されたウイルス様粒子をショ糖密度勾配遠心分離にかけて分画、サザンブロッティング法により、DNAの検出を行った。図7に示すとおり、ウイルス様粒子中にDNAが取り込まれた。
実施例2を反復した。但し、プラスミドとして、哺乳類真核細胞内で蛍光タンパク質(GFP)を発現できるpEGを用いた。pEGプラスミドDNAを含むウイルス様粒子の形成はショ糖密度勾配遠沈により行い、ウイルス様粒子を含む画分にDNAが含まれることを確認した。即ち、150mM塩化ナトリウム、2mM塩化カルシウム、20mM Tris HCl(pH7.2)の溶媒中、pEGプラスミドの存在下で、VP1 VP2タンパク質を用いてウイルス様粒子を再構成し、ショ糖密度勾配遠沈でプラスミドDNAを含むウイルス様粒子を分画した。
SV40のVP1蛋白質からのウイルス様構造体の形成に必要な、粒子形成促進因子としてのSV40のキャプシド蛋白質VP2の領域を特定するため、図10に示す、VP2蛋白質(全長アミノ酸配列は、配列番号:1に示す通り)の種々の領域0.44μMとSV40のVP1蛋白質2.2μMとを、150mM NaCl及び2mM CaCl2を含む溶液(pH 5.0)中でインキュベートし、生成物を電子顕微鏡で観察した。結果を図10に示す。図中、「V」は5量体の均一なウイルス様構造体が形成されたことを示し、「Ti」は微小形粒子を示し、「(−)」は粒子が形成されなかったことを示し、「Tu」は、チューブ状の構造体が形成されたことを示す。
SV40のVP2またはVP3タンパク質(VP3はVP2のC末端と共通な配列である)を昆虫細胞内でVP1と共発現させると、形成されるVLPの内部にVP2、VP3が包含されることが報告されている。これをこの現象を利用して、VP1から構成されるウイルス様構造体に生理活性物質を封入する可能性を確かめるため、VP2もしくはVP3又はその種々の断片にGFPを融合させ、この融合タンパク質とVP1とを共発現させることにより、当該融合タンパク質がウイルス様構造体に包含されるか検討した。
融合タンパク質としては、VP2タンパク質、VP3タンパク質(VP2タンパク質の部分)、及びVP1結合領域(VP2の273位−307位)を含むVP2タンパク質(VP3タンパク質)の4種類のC末端断片(合計6種類のタンパク質)につき、夫々のN-末端又はC-末端にGFCを融合させたもの(合計12種類の融合タンパク質)を用いた。これら12種類の融合タンパク質の構造の概略を図11に示す。これらの融合タンパク質を発現させるバキュロウイルスを作製し、当該融合タンパク質を発現させる場居路ウイルスと、VP1を発現させるバキュロウイルスとを昆虫細胞に共感染させた。
結果を図11に示す。
SV40のVP1タンパク質とDNAとを、VP1:DNA=600:0〜1の重量比で混合し、30分間、氷上で冷却した後、150mM NaCl及び2mM CaCl2を含む溶液(pH 5)に対して、室温にて16時間透析した。この透析物の一部は、電子顕微鏡観察のため、及びタンパク質の定量(inputタンパク質)のために使用し、他の一部はシュークロースクッションを用いる遠心分離にかけ、粒状物及びDNAを回収した。この回収物を用いて、(1)タンパク質の定量(粒子を形成したタンパク質の量)、(2)プロナーゼKによりタンパク質を分解下後のDNAの量(inputDNAの量)、及び(3)DNaseによる封入されていないDNAの分解除去及びプロナーゼKによるタンパク質分解の後に残ったDNA(粒子中に封入されていたDAN)の量を測定した。
精製したVP1五量体タンパク質にRNAを混合した。この混合液を生理的条件の溶媒に透析法を用いて室温で置換した。電子顕微鏡を用いて置換した溶媒中のVP1五量体の集合化様式を観察した。
高濃度のSV40のVP1五量体を生理的条件下において静置しても、粒子を形成させることはできない。例えば、pH5〜7、150mM NaCl、2mM CaCl2を含む溶液中でVP1五量体を約80ng/μL濃度で静置すると、チューブ状構造体または不定形の凝集体しか形成しない。一方、同じ条件でVP2タンパク質約15−20ng/μLの濃度で加えることにより、効率よく均一なサイズの粒子が形成できる。また高pH条件下、pH8.0〜10.0ではVP2タンパク質無しでも均一なサイズのウイルス様粒子を形成することが観察された。つまり低塩濃度、pH5からpH10の間での生理的条件下で、ウイルス粒子様構造体の作製ができるようになった。
Claims (38)
- ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成される、均一なサイズのウイルス粒子様構造体。
- ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成され、被封入物質を収容した、均一なサイズのウイルス粒子様構造体。
- 前記ウイルス蛋白質が、SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質である、請求項1又は2に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記SV40ウイルスの蛋白質が、VP1キャプシド蛋白質又はその変異体である、請求項3に記載のウイルス素粒子様構造体。
- 前記VP1キャプシド蛋白質の変異体が、配列番号:2に示すアミノ酸配列を有するVP1キャプシド蛋白質において、1〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質である、請求項4に記載のウイルス様粒子構造体。
- 前記置換が、配列番号:2に記載のアミノ酸配列における、49位のGlu、51位のGlu、160位のGlu、163位のGlu、216位のSer、217位のLys、219位のGlu、332位のGlu、333位のGlu及び348位のAspの内の少なくとも1個のアミノ酸の置換である、請求項5に記載のウイルス様粒子構造体。
- 前記粒子形成促進因子が、ウイルス粒子のキャプシド蛋白質、当該蛋白質の粒子形成促進活性を有するN-末端領域、又は当該蛋白質において1〜複数のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ粒子形成促進活性を維持している蛋白質である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質が、SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのキャプシド蛋白質VP2である、請求項7に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質が、配列番号:1に示すアミノ酸配列を有するSV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2である、請求項7又は8に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記ウイルス粒子キャプシドタンパク質が、配列番号:1の示すアミノ酸配列中の、少なくとも1−272位のアミノ酸を含んでなる、SV40ウイルスのキャプシドタンパク質VP2の部分である請求項7または8に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記ウイルス粒子キャプシドタンパク質が、配列番号:1の示すアミノ酸配列中の少なくとも、1−58位、あるいは59−118位、あるいは119−152位、あるいは153位から272位のアミノ酸を含んでなる、SV40ウイルスのキャプシドタンパク質VP2の部分である請求項7または8に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質が、配列番号:1に示すアミノ酸配列中の、少なくとも273位〜307位のVP1結合領域のアミノ酸配列を含んでなる、SV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2の部分である、請求項7又は8に記載のウイルス粒子様構造体。
- 前記被封入因子が生理活性物質または非生理活性物質またはそれらの混合物である、請求項2〜12のいずれか1項に記載のウイルス粒子構造体。
- 前記非生理活性物質が低分子物質あるいは高分子物質あるいはそれら混合物である、請求項2〜12のいずれか1項に記載のウイルス粒子構造体。
- 前記生理活性物質が、核酸、蛋白質、又は低分子物質である、請求項13に記載のウイルス様粒子構造体。
- ウイルスタンパク質を、pH5〜pH10及び室温にて、130mM〜500mM 一価の陽イオン及び2μM〜50mMの二価陽イオンの存在下で、且つ粒子形成促進因子の存在下でインキュベートすることを特徴とする、ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウイルス粒子集団の形成方法。
- ウイルスタンパク質及び被封入物質を、pH5〜pH10及び室温にて、130mM〜500mMの一価の陽イオン及び2μM〜50mMの二価の陽イオンの存在下で、且つ粒子型性促進因子の存在下でインキュベートすることを特徴とする、被封入物質とそれをとり巻くウイルスタンパク質及び粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウイルス粒子様構造体の形成方法。
- 前記一価の陽イオンがナトリウムイオンである、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記二価の陽イオンがカルシウムイオンである、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一価の陽イオンの濃度が150mMであり、そして前記二価陽イオンの濃度が2mMである、請求項16〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルス蛋白質が、SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質である、請求項16〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粒子形成促進因子が、ウイルス粒子カプシド蛋白質、当該蛋白質の粒子形成促進活性を有するN-末端領域、又は当該蛋白質において1〜複数のアミノ酸が付加、欠失及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ粒子形成促進活性を維持している、請求項16〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質が、SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのキャプシド蛋白質VP2である、請求項22に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質が、配列番号:1に示すアミノ酸配列を有するSV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2である、請求項22又は23に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子キャプシドタンパク質が、配列番号:1の示すアミノ酸配列中の、少なくとも1−272位のアミノ酸を含んでなる、SV40ウイルスのキャプシドタンパク質VP2の部分である請求項23または24に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子キャプシドタンパク質が、配列番号:1の示すアミノ酸配列中の少なくとも、1−58位、あるいは59−118位、あるいは119−152位、あるいは153位から272位のアミノ酸を含んでなる、SV40ウイルスのキャプシドタンパク質VP2の部分である請求項23または24に記載の方法。
- 前記被封入因子が生理活性物質または非生理活性物質またはそれらの混合物である、請求項17〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非生理活性物質が低分子物質あるいは高分子物質あるいはそれら混合物である、請求項17〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生理活性物質が、核酸、蛋白質、又は低分子物質である、請求項27に記載の方法。
- ウイルス蛋白質と、当該ウイルス蛋白質についての結合領域を含んでなり且つ生理活性物質が連結されたキャプシド蛋白質VP2又はその部分とを、宿主細胞中で共発現させることを特徴とする、ウイルス蛋白質から構成されるウイルス様粒子に生理活性物質を導入する方法。
- 前記ウイルス蛋白質がSV40ウイルスのVP1キャプシド蛋白質又はその変異体であり、前記VP2タンパク質が、配列番号:1に示すアミノ酸配列中の、少なくとも273位〜307位のVP1結合領域のアミノ酸配列を含んでなる、SV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2の部分である、請求項30に記載の方法。
- 請求項13〜15のいずれか1項に記載のウイルス粒子構造体を有効成分とする、生理活性物質を細胞に導入するための組成物。
- 表面が負に帯電した高分子を封入したウイルス蛋白質とから構成されるウイルス粒子集団の製造方法において、ウイルス蛋白質と、当該ウイルスキャプシド蛋白質360部に対して0.01〜100部(重量比)の高分子とを混合し、一価の金属塩および2価の金属塩を含む水溶液に対して透析する、ことを特徴とする方法。
- 上記負に帯電した高分子がDNA、各種RNA、合成核酸様構造体である、請求項33に記載される方法。
- 上記ウイルス粒子集団の製造方法において、ウイルス蛋白質と、当該ウイルスキャプシド蛋白質360部に対して加える負に帯電した高分子の重量比が0.2以上である、請求項33に記載される方法。
- 前記ウイルス蛋白質が、SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質である、請求項33に記載の方法。
- 前記ウイルス蛋白質が、配列番号:2に示す、SV40ウイルスのVP1キャプシド蛋白質又はその変異体である、請求項36に記載の方法。
- 前記1価金属イオンがナトリウムイオンであり、前記2価金属イオンがカルシウムイオンである、請求項33〜37のいずれか1項に記載の方法。
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