TWI568446B - Artificial living particles and methods for producing the same - Google Patents

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TWI568446B
TWI568446B TW102141375A TW102141375A TWI568446B TW I568446 B TWI568446 B TW I568446B TW 102141375 A TW102141375 A TW 102141375A TW 102141375 A TW102141375 A TW 102141375A TW I568446 B TWI568446 B TW I568446B
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Description

人工活體粒子及其製造方法
本發明係關於可用作為應用於藥物遞輸系統(Drug Delivery System，DDS)等之奈米膠囊，並使用穹窿體(Vault)的新穎人工活體粒子及其製造方法。
穹窿體2係粒子尺寸為40nm×40nm×67nm的卵型的巨大活體粒子，係細胞內具有最大分子量的核酸-蛋白質複合體(參照第2圖)。活體內存在的穹窿體2，係由3種蛋白質(MVP(Major Vault Protein)、VPARP(vault poly (ADP-ribose)polymerase)、TEP1(telomerase-associated protein-1))與1種RNA構成。穹窿體2，係39個主成分即分子量約100kDa之MVP3集合而形成碗型的半個穹窿體(各部位稱為蓋5、肩6、體7及腰8)，然後此等的兩個以碗的邊緣與邊緣對齊的方式，在腰8組合而形成卵型粒子的外殼。針對MVP以外的成分，存在於以外殼形成的內部空間。
構成穹窿體2之外殼的MVP3，係由以反平行β片形成之9個重複結構(3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i)、肩6、蓋螺旋9及蓋環10的共計12個域(domain)構成(第3圖)，蓋螺旋9的域間的分子間疏水鍵，對於為碗型之半個穹窿體的形成係為重要。2個一半的穹窿體，藉 由MVP3的N端彼此組合而形成卵型的穹窿體粒子，其組合係僅以離子鍵及短的分子間β摺疊(β-sheet)這種非常弱的交互作用形成。如此的穹窿體的結構資訊及粒子形成的機制，係由本案發明人於2009年成功測定大鼠肝臟來源之穹窿體之全體結構而解明(例如參照Hideaki Tanaka et al.,「The Structure of Rat Liver Vault at 3.5 Angstrom Resolution」,Science,Vol.323,pp.384-388(2009)(非專利文獻1))。
穹窿體，自以往已知其主成分MVP在昆蟲細胞表現，且在活體內形成同樣卵型的粒子(例如參照Andrew G.Stephen et al.,「Assembly of Vault-like Particles in Insect Cells Expressing Only the Major Vault Protein」、The Journal of Biological Chemistry,Vol.276,No.26,pp.23217-23220(2001)(非專利文獻2))。穹窿體由於其特徵的形態，已使用作為奈米膠囊而進行藥物遞輸系統(DDS)之開發(例如參照Valerie A.Kickhoefer et al.,「Engineering of vault nanocapsules with enzymatic and fluorescent properties」,PNAS, Vol.102, No.12,pp.4348-4352(2005)(非專利文獻3)、Valerie A.Kickhoefer et al.,「Targeting Vault Nanoparticles to Specific Cell Surface Receptors」,ACS nano,3(1)：27-36.doi：10.1021/nn800638x(2009)(非專利文獻4))。
又，例如日本特表2013-509202號公報(專利文獻1)中，揭示將具有MVP與融合蛋白質及mINT及關注對象之蛋白質(細胞激素)的重組粒子即穹窿體粒子，用 在將關注對象之蛋白質送達細胞或腫瘤或對象。此外，例如日本特表2007-508846號公報(專利文獻2)中揭示一種技術，係用以送達聚核苷酸之以多胜肽包裝的組成物，具有白胺酸拉鏈作為聚核苷酸結合區域。
習知方法中，為了使藥劑納入粒子內部，係將為穹窿體之構成成分且存在粒子內部之VPARP之C端160個殘基(INT域：與MVP結合)作為標籤(tag)。其原因也有為了使藥劑先保持在粒子內部。但是此方法，並未充分活用穹窿體的廣大內部空間。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2013-509202號公報
[專利文獻2]日本特表2007-508846號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Hideaki Tanaka et al.,「The Structure of Rat Liver Vault at 3.5 Angstrom Resolution」,Science,Vol.323, pp.384-388(2009)
[非專利文獻2]Andrew G.Stephen et al.,「Assembly of Vault-like Particles in Insect Cells Expressing Only the Major Vault Protein」, The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, No.26, pp.23217-23220(2001)
[非專利文獻3]Valerie A. Kickhoefer et al.,「Engineering of vault nanocapsules with enzymatic and fluorescent properties」,PNAS,Vol.102, No.12,pp.4348-4352(2005)
[非專利文獻4]Valerie A. Kickhoefer et al.,「Targeting Vault Nanoparticles to Specific Cell Surface Receptors」,ACS nano,3(1): 27-36.doi: 10.1021/nn800638x(2009)
本發明係為了解決上述課題而成，其目的為提供能用作為用於藥物遞輸系統(DDS)等之應用的奈米膠囊，並使用能將其廣大內部空間有效利用的穹窿體的新穎人工活體粒子及其製造方法。
本發明之人工活體粒子，其特徵為：於構成穹窿體之腰之MVP的N端分別納入白胺酸拉鏈(Leucine zipper)。
本發明之人工活體粒子，在MVP之N端與白胺酸拉鏈之間較佳為插入有連結子。於此情形，連結子為3~6個之甘胺酸更佳。
本發明之人工活體粒子中，白胺酸拉鏈較佳為來自酵母之轉錄活化因子GCN4。
本發明也提供一種人工活體粒子之製造方法，係製造上述本發明之人工活體粒子之方法，將白胺酸拉鏈基因納入成為MVP基因之N端之側並使其表現。
本發明之人工活體粒子之製造方法中，較佳 為將MVP基因與白胺酸拉鏈基因不經由限制酶部位而以編碼為連結子之基因使其連結。
利用本發明之人工活體粒子之製造方法，能比起以往以分外高的產率獲得人工活體粒子。本發明之人工活體粒子，期待能作為可有效利用其內部空間之可利用在DDS等之奈米膠囊，利用本發明使產量增加1個位數，與成本大幅下降有關。又，將本發明之人工活體粒子作為基礎，可期待進行以pH依存性而能進行可逆地開閉控制之粒子的開發。
1‧‧‧人工活體粒子
2‧‧‧穹窿體
3‧‧‧MVP
3a‧‧‧重複結構
3b‧‧‧重複結構
3c‧‧‧重複結構
3d‧‧‧重複結構
3e‧‧‧重複結構
3f‧‧‧重複結構
3g‧‧‧重複結構
3h‧‧‧重複結構
3i‧‧‧重複結構
4‧‧‧白胺酸拉鏈
5‧‧‧蓋
6‧‧‧肩
7‧‧‧體
8‧‧‧腰
9‧‧‧蓋螺旋
10‧‧‧蓋環
11‧‧‧藥劑
12‧‧‧抗原
13‧‧‧標的細胞
14‧‧‧內體
第1圖顯示本發明之人工活體粒子1中構成穹窿體2之MVP3之N端3a與白胺酸拉鏈4間的結合的概念示意圖。
第2圖顯示本發明之人工活體粒子1所使用之穹窿體2的示意圖。
第3圖顯示構成穹窿體2之MVP3之示意圖。
第4圖顯示將本發明之人工活體粒子1應用作為奈米膠囊時之示意圖。
第5圖顯示將本發明之人工活體粒子1應用作為奈米膠囊之藥物遞輸系統之一例的示意圖。
第6圖的左側係顯示破碎後之SDS-PAGE之結果的照片，分別顯示針對LZMVP_Gly3之上清(線A)、沉澱(線B)、針對LZMVP_Gly6之上清(線C)、沉澱(線D)。又，第6圖之右側顯示蔗糖密度梯度離心分離後之SDS-PAGE之 結果之照片，左側之組a係針對LZMVP_Gly3之結果、右側之組b係針對LZMVP_Gly6之結果。
第7圖顯示針對LZMVP_Gly3代表最終精製製備品之電子顯微鏡照片。
[實施發明之形態]
第1圖係針對本發明之人工活體粒子1中構成穹窿體2之MVP3之N端3a與白胺酸拉鏈4間之結合以概念顯示之示意圖。又，第2圖係示意顯示本發明之人工活體粒子1所使用之穹窿體2之示意圖，第3圖係示意顯示構成穹窿體2之MVP3之示意圖。如上述，穹窿體2，係39個主成分MVP3集合而形成碗型的半個穹窿體(各部位稱為蓋5、肩6、體7及腰8)，且此等的2個以碗的邊緣與邊緣對齊的方式，於腰8組合而形成卵型粒子的外殼(第2圖)。構成穹窿體2之外殼的MVP3，係由以反平行β片形成之9個重複結構(3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i)、與肩6、蓋螺旋9及蓋環10共計12個域構成(第3圖)。本發明之人工活體粒子1，特徵為在構成穹窿體2之腰8之MVP3的N端分別納入了白胺酸拉鏈4。
本發明之人工活體粒子1，於MVP3之N端與白胺酸拉鏈4之間較佳為插入有連結子。藉由插入了如此的連結子，能確保人工活體粒子1之中之白胺酸拉鏈4的活動自由度。
本發明之人工活體粒子1中，MVP3之N端與白胺酸拉鏈4之間之連結子，較佳為1~6個小的胺基酸連 結成直鏈狀而形成。形成連結子之胺基酸之數目為1~6個任一情形，會表現具有白胺酸拉鏈4之人工活體粒子1，但是從表現量更多、獲得之人工活體粒子1更均勻的觀點，以及從白胺酸拉鏈4之活動自由度之觀點而言，連結子較佳為由3~6個小的胺基酸以直鏈狀連結而形成。作為構成連結子之胺基酸，可舉出例如甘胺酸、丙胺酸等之側鏈小的胺基酸。後述本實驗例中，表示以3個或6個直鏈狀之甘胺酸形成連結子之例。
白胺酸拉鏈4，係2條約30個殘基之胺基酸所構成之α-螺旋以彼此的白胺酸殘基進行疏水鍵結而形成之夾頭(chuck)狀的模式(motif)。本發明中，作為白胺酸拉鏈4，例如來自酵母之轉錄活化因子GCN4之白胺酸拉鏈，針對其他蛋白質來源之白胺酸拉鏈，也可無特別限制地使用。其中，1991年，來自酵母之轉錄活化因子GCN4之白胺酸拉鏈之X射線結晶結構以於1.8埃解析能力被決定，在原子層級解明：由33個殘基之胺基酸所構成之胜肽以彼此的白胺酸殘基進行疏水鍵結形成牢固的雙重線圈(Coiled-coil)，因此可理想地使用來自酵母之轉錄活化因子GCN4的白胺酸拉鏈。
若依如此之本發明之人工活體粒子，可期待作為能有效利用其內部空間之可利用在DDS等之奈米膠囊，依本發明能使產量提高1個位數，與成本大幅下降有關。又，以本發明之人工活體粒子作為基礎，可期待進行以pH依存性而能可逆地開閉控制之粒子的開發。
於此，第4圖係顯示將本發明之人工活體粒子 1應用作為奈米膠囊的情形之圖，第5圖係顯示將本發明之人工活體粒子1應用於作為奈米膠囊之DDS之一例之示意圖。藉由本發明之人工活體粒子1，例如，藉由對於附著於MVP之N端的白胺酸拉鏈導入半胱胺酸殘基，如第4圖所示，於中性條件會以雙硫鍵形成穩定的卵型粒子，於酸性條件下由於雙硫鍵斷開而使卵破開成2等分，此方式具有可開發以pH依存性而能可逆地開閉控制之奈米膠囊之可能性。藉由使用如此之奈米膠囊，例如如第5圖所示，可考慮如下的DDS：於酸性條件下將藥劑11放入穹窿體2之內部空間並進行投予，藉此，利用標的細胞13之表面之專一性抗原12、與預先附著於穹窿體2之表面的抗體(Fab)間的抗原抗體反應而使奈米膠囊進入標的細胞13內，因於內體(endosome)14內成為酸性條件，而奈米膠囊打開，釋出藥劑11。如此之本發明之人工活體粒子，其內部有非常大的空間，所以被認為亦可望作為基因治療時之載體(carrier)。
又，本發明之人工活體粒子1亦被認為可作為將化妝品等成分封入，而使其滲透直到皮膚深處的奈米膠囊之利用等。
又，近年來已確立以下技術：將蛋白質複合體的內部空間利用作為模板使金屬聚合，並以使此等規則排列而製成成為極小半導體的基礎的基板等。現在，雖使用鐵蛋白(ferritin)等之球狀蛋白質，但藉由利用本發明之人工活體粒子1，使用如穹窿體2之橢圓狀的粒子，有可製出前所未見的新穎基板之可能性。
本發明也提供人工活體粒子1之製造方法，其特徵為：使白胺酸拉鏈基因納入成為MVP基因之N端之側並使其表現。藉此，於實驗例中，如後述，比起使用以野生型MVP(W-MVP)形成之W-穹窿體之昆蟲細胞之習知表現系，能以10倍以上之分外高的產率獲得本發明之人工活體粒子1。白胺酸拉鏈基因及MVP基因之鹼基序列已經周知，藉由適當組合以往周知之基因工程方法，能將白胺酸拉鏈基因納入成為MVP基因之N端之側。後述實驗例中，舉例：將從酵母之轉錄活化因子GCN4切出並精製之白胺酸拉鏈基因之片段和同樣切出並精製之來自大鼠之MVP基因之片段予以(經由後述連結子)接合之例。
作為表現使白胺酸拉鏈基因納入成為MVP基因之N端之側者的細胞雖不特別限制，但可列舉昆蟲細胞、比昆蟲細胞高等的生物的細胞。當使用比昆蟲細胞低等，例如使用大腸桿菌的情形，已知有時不能順利地形成活體粒子，較佳為使用該技術領域通常使用之昆蟲細胞使其表現。作為昆蟲細胞之具體例，可列舉Sf9。被表現之人工活體粒子可藉由以往周知的適當方法精製。
本發明之人工活體粒子1之製造方法中，較佳為將MVP基因與白胺酸拉鏈基因不經由限制酶部位而以編碼為連結子之基因使其連結。使用上述來自酵母之轉錄活化因子GCN4之白胺酸拉鏈基因之片段、來自大鼠之MVP基因的情形，若欲使其連結，在其之間殘留EcoRI之部位(GAATTC)，有妨礙穹窿體粒子之形成的可能性。後述實驗例中，係將EcoRI部位取代成將帶有最小側鏈之 胺基酸即甘胺酸連接3個殘基或6個殘基而得之Gly連結子後，於昆蟲細胞使其表現。具體而言，因應欲導入之連結子而設計引子，進行PCR後，將已精製之片段以插入於MVP基因之N端與白胺酸拉鏈基因之間之方式接合即可。
又，本發明之人工活體粒子1之製造方法中，白胺酸拉鏈、連結子等，其較佳者係與上述針對人工活體粒子1相同。
以下舉實驗例更詳細說明本發明，但本發明不限定於此等。
<實驗例>
[1]藉由昆蟲細胞Sf9建構野生型MVP(W-MVP)之大量表現系
[A]選殖W-MVP之重組桿狀病毒(baculovirus)基因體(Bacmid DNA)之製備
依以下程序進行作業。
(1)將來自大鼠肝臟之MVP(W-MVP)之DNA藉由EcoRI與SphI之限制酶部位導入到pFastBac載體。
(2)將獲得之pFastBac於大腸桿菌(DH5α)轉形，接種於含安比西林(Ampicillin)(100μg/mL)的LB板，於37℃進行24小時靜置培養。
(3)以鉑耳等挑取數個菌落，以菌落PCR確認目的基因是否放大。
(4)將於上述(3)已確認基因之放大的菌落接種於含安比西林(100μg/mL)的LB液體培養基5mL，於37℃進行 一晚振盪培養。
(5)從已培養一晚的大腸桿菌(DH5α)使用QIAGEN公司的QIAprep Spin Miniprep Kit，精製已選殖W-MVP的pFastBac。
(6)將已選殖W-MVP的pFastBac 0.1μg加到DH10Bac20μL中，輕輕混合後於冰上靜置20分鐘。
(7)於42℃實施1分鐘熱休克(heat shock)，於冰上靜置2分鐘後，加入200μL之SOC培養基，於37℃進行4小時振盪培養。
(8)將上述(7)之培養液20μL接種於含有卡那黴素(50μg/mL)、慶大黴素(7μg/mL)、四環黴素(10μg/mL)、X-gal(100μg/mL)、IPTG(50μg/mL)的LB板，於37℃靜置培養24小時(培養直到能判別菌落是否發色(藍色或是白色))。
(9)以鉑耳等挑取白色菌落，接菌在新的LB板(與上述相同)，於37℃靜置培養一晚後，再確認是否發色。
(10)將於上述(9)已再確認之白色菌落來源的大腸桿菌(DH5α)接菌在含卡那黴素(50μg/mL)、慶大黴素(7μg/mL)、四環黴素(10μg/mL)的LB液體培養基5mL，於37℃振盪培養一晚。
(11)自已培養一晚的大腸桿菌(DH10Bac)，使用QIAGEN公司之QIAprep Spin Miniprep Kit精製已選殖W-MVP的Bacmid。Bacmid的尺寸非常大，所以精製時，溶出緩衝液使用加溫至70℃者。
[B]已選殖W-MVP之重組桿狀病毒之增殖(病 毒液之製作)
在安全櫃內依以下程序進行。
(1)以Invitrogen公司的Sf900-II培養基(含10%血清)，將培養中之Sf9細胞(1.5-2.0×106cell/mL)於15mL試管內使用Sf900-II培養基(含10%血清)稀釋，調製成濃度為1.2×105cell/mL。
(2)於12孔培養板加入調製成最終濃度0.4×105cell/mL之細胞培養液1mL。加入上述1.2×105cell/mL之培養液300μL、Sf900-II培養基(含10%血清)700μL，使總計1mL。
(3)於27℃靜置20分鐘，使細胞黏著在細胞培養板的底面。
(4)於1.5mL管(tube)內將Grace medium unsupplement 214μL、Cellfectin 8μL、Bacmid 1μg混合，於安全櫃內於室溫放置30分鐘(Cellfectin係以旋渦混合器攪拌約10秒後使用)。
(5)以倒立顯微鏡觀察於上述(3)之12孔培養板，確認細胞附著在容器底面後，去除培養基(以將板向後傾斜且同時將蓋子以向前豎立的方式放置，以微量吸管吸出)。
(6)去除培養基後，以Grace medium unsupplement 1mL洗滌。丟棄洗滌液。
(7)之後對於細胞加入上述Bacmid與Cellfectin的混合液。
(8)將12孔板放入已密閉的膠盒(tupperware)內，於 27℃靜置4小時。為了保持膠盒內的濕度，將數片擦拭紙(kimwip)以純水潤濕，使含0.5M EDTA1mL後，放在膠盒的端部。
(9)4小時後，重疊Grace medium unsupplement(含10%血清)400μL，於其中於27℃培養2日。
(10)於其中培養2日後，將培養液移至1.5mL的管，以高速離心分離(4,000×g，3min)使細胞沉澱。上清成為病毒液(P0)，故將其移至新的1.5mL管。病毒液(P0)在貼有遮光膜的4℃的層析室內保存。
(11)在底面積25cm2的培養燒瓶中加入培養液使細胞數成為3×106個細胞(總共5mL)。例如：欲於Sf900-II培養基(含10%血清)培養中之Sf9細胞之細胞數為1×106cell/mL時，則在培養燒瓶中裝入於培養液3mL加入Sf900-II培養基(含10%血清)2mL使成為5mL者。
(12)於27℃靜置15分鐘，使細胞黏著在細胞培養燒瓶的底面。
(13)加入P0之病毒液200μL，於其中培養3日。
(14)於其中培養3日後，在回收病毒液(P1)前，於底面積75cm2之培養燒瓶中加入培養液使細胞數成為9×106個細胞(總共成為15mL)。若準備6×105cell/mL之培養液15mL，則總細胞數成為9×106個細胞。
(15)於27℃靜置15分鐘，使細胞黏著於細胞培養燒瓶之底面。
(16)在回收病毒液(P1)前，從上述底面積25cm2之培養燒瓶使用微量吸管吸取0.5mL的上清液，並加到上述 (14)之培養液中(為了防止污染)。之後將培養液於27℃培養3日。
(17)邊將剩餘的培養液以微量吸管吸取、排放，邊使在燒瓶底面附著的細胞剝離，移到15mL的管，以高速離心分離(4,000×g，3min)使細胞沉澱。上清成為病毒液(P1)，故將其移到新的15mL管。將沉降成沉澱的Sf9細胞，作為表現檢查用，在-80℃冷凍保存。病毒液(P1)，於貼有遮光膜之4℃之層析室內保存。
(18)以底面積75cm2之培養燒瓶培養經過3日後，邊以微量吸管吸取、排放培養液，邊將附著在燒瓶底面的細胞剝離，移到50mL的管，以高速離心分離(4,000×g，3min)使細胞沉澱。上清成為病毒液(P2)，故將其移到新的50mL的管。將沉降成沉澱的Sf9細胞，作為表現檢查用，在-80℃冷凍保存。病毒液(P2)，於貼有遮光膜之4℃之層析室內保存。
(19)於1L之旋轉燒瓶中準備1×106cell/mL之培養液300mL，加入病毒液(P2)3mL(培養基之1%量)，於27℃培養3日。
(20)於其中培養3日後，將培養液移到離心管，以高速離心分離(4,000×g，30min)使細胞沉澱。上清成為病毒液(P3)，故將其移到新的500mL的培養基瓶。此時使用之離心管、離心管之蓋、培養基瓶已事先以鋁箔包裹後並以高壓釜滅菌。將沉降成沉澱的Sf9細胞，作為表現檢查用，在-80℃冷凍保存。病毒液(P3)，於貼有遮光膜之4℃之層析室內保存。
(21)於3L之旋轉燒瓶中準備1×106cell/mL之培養液500mL，加入病毒液(P3)5mL(培養基之1%量)，於27℃培養3日。
(22)於其中培養3日後，將培養液移到離心管，以高速離心分離(4,000×g，30min)使細胞沉澱。上清成為病毒液(P4)，故將其移到新的500mL的培養基瓶。此時使用之離心管、離心管之蓋、培養基瓶事先以鋁箔包裹後並以高壓釜滅菌。將沉降成沉澱的Sf9細胞，作為精製用，在-80℃冷凍保存。病毒液(P4)，於貼有遮光膜之4℃之層析室內保存。
[2]利用昆蟲細胞Sf9建構於N端加成了白胺酸拉鏈之MVP(LZ-MVP)之大量表現系
依以下程序實施作業。
(1)將編碼為從來自酵母菌之GCN4(281個胺基酸)之胺基酸序列(序列編號1)第249號之精胺酸到第281號之精胺酸之DNA(白胺酸拉鏈基因)(包括BamHI與EcoRI之限制酶部位)(序列編號2)(表現之白胺酸拉鏈之胺基酸序列如序列編號3)導入到PROMEGA公司之pGEM-T載體，並使用QIAGEN公司之QIAprep Spin Miniprep Kit精製已選殖白胺酸拉鏈之質體。已導入到pFastBac之白胺酸拉鏈基因之鹼基序列(包括限制酶部位(BamHI、EcoRI)、起始Met)如序列編號4所示，表現之白胺酸拉鏈之胺基酸序列如序列編號5所示。
(2)從pGEM-T載體使用限制酶BamHI與EcoRI切出白胺酸拉鏈基因。
(3)同樣地，將選殖了來自大鼠之W-MVP的pFastBac也以限制酶BamHI與EcoRI先處理。
(4)將上述(2)及(3)所獲得之白胺酸拉鏈基因之片段及MVP基因之片段分別進行瓊脂凝膠電泳並切出目的之帶(band)，使用Quiagen公司之QIAquick Gel Extraction Kit從凝膠精製目的物。
(5)使用TAKARABIO公司之DNA Ligation Kit(Mighty Mix)，將上述(4)精製的兩者接合(接合後之鹼基序列如序列編號6，表現之白胺酸拉鏈、MVP之胺基酸序列如序列編號7、8)。
(6)以下，實施與上述選殖了W-MVP之重組桿狀病毒基因體之製備(程序(1)-(11))、及選殖了W-MVP之重組桿狀病毒之增殖(程序(1)-(20))相同之操作，將選殖了LZ-MVP之重組桿狀病毒增殖並製作病毒液(P4)。
[3]將甘胺酸連結子插入LZ-MVP之白胺酸拉鏈與MVP之間
上述建構的表現系中，於白胺酸拉鏈基因與MVP基因之間殘留EcoRI部位(GAATTC)，有妨礙穹窿體粒子形成之可能性，所以，本案發明人將此等取代成將連結了帶有最小側鏈之胺基酸(甘胺酸(Gly))3個殘基(Gly3)(胺基酸序列如序列編號9)或6個殘基(Gly6)(胺基酸序列如序列編號10)而得的Gly連結子。
(1)製作以下3種引子(編碼為Gly之鹼基序列為gcc)。
‧前置引子(forward primer)(lzmvp_0g_f)
atggcaactgaagaggccat(序列編號11)
‧前置引子(forward primer)(lzmvp_3g_f)
ggcggcggcatggcaactgaagaggccatcatccgcatc(序列編號12)
‧反置引子(reverse primer)(lzmvp_3g_r)
GCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCggcggcggc(序列編號13)
又，反置引子(reverse primer)之互補序列如下。
gccgccgccgcgttcgccaactaatttctttaatctggc(序列編號14)
(2)插入Gly3殘基之連結子的情形，使用lzmvp_0g_f與lzmvp_3g_r，插入Gly6殘基之連結子的情形，使用lzmvp_3g_f與lzmvp_3g_r作為引子，並將先前製作的LZ-MVP的pFastBac作為模板，使用東洋紡(股)製之KOD-plus Mutagenesis kit實施PCR(94℃，2分鐘→98℃，10秒→68℃，8分鐘(底線部進行10次循環))。
(3)PCR後，使用東洋紡(股)製之KOD-plus Mutagenesis kit包括的DpnI將模板質體消化。於1.5mL管內混合PCR產物50μL與DpnI 2μL，進行輕敲(tapping)、旋降(spin-down)後，於37℃溫育1小時。
(4)於1.5mL管內依此處記載的順序加入上述(3)之反應液2μL、滅菌水7μL、Ligation high 5μL、T4聚核苷酸激酶1μL，進行輕敲、旋降後，於16℃溫育1小時。
(5)對於大腸桿菌DH5α 50μL加入上述(4)之反應液5μL，於冰上靜置30分鐘。
(6)於42℃實施45秒熱休克。
(7)於冰上靜置2分鐘。
(8)加入SOC培養基450μL，於37℃進行1小時振盪培養。
(9)將上述(8)之培養液50μL接種於含安比西林(Ampicillin)(100μg/mL)的LB板。
(10)於37℃靜置培養一晚。
之後，實施與上述已選殖W-MVP之重組桿狀病毒基因體之製備程序(2)-(20)為同樣的作業，製作於白胺酸拉鏈與MVP之間導入了Gly連結子的LZMVP(LZMVP_Gly3、LZMVP_Gly6)的病毒液(P4)。
[4]穹窿體(W-穹窿體、LZ-穹窿體)之精製
(1)於3L之旋轉燒瓶培養500mL之Sf9細胞，於細胞數成為1×106cell/mL時，加入P4或P3之病毒液進行感染，於其中培養3日。
(2)於其中培養3日後，將培養液移到離心管，以高速離心分離(4,000×g，30min)使細胞沉澱。
(3)將沉澱的細胞使用PBS緩衝液懸浮，將懸浮液移到離心管，進行高速離心分離(4,000×g，30min)以洗滌細胞，去除培養基成分等。
(4)將以沉澱形式獲得之細胞以細胞破碎用緩衝液A(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、1mM PMSF、蛋白酶抑制劑‧動物細胞用(Nacalai tesque(股)製)2根)100mL懸浮，進行超音波破碎(TOMY UD-201、OUTPUT2、DUTY 60、2min×2)。
(5)將破碎液使用高速離心機(Beckman HP-26XP、 JA25.50轉子)，藉由以14,300rpm、30min、4℃進行高速離心分離，將細胞破碎渣以沉澱形式去除。
(6)將上清使用超高速離心機(Hitachi CP80WX、P45AT轉子)，藉由以40,000rpm、2小時、4℃進行超高速離心分離，使穹窿體片段(fraction)以沉澱形式沉降。
(7)於以沉澱形式獲得之穹窿體片段加入少量精製用緩衝液A(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、1mM PMSF)，以Dounce均質機懸浮。
(8)於上述(7)之溶液中加入等量的Ficoll/蔗糖緩衝液(90mM MES-NaOH(pH6.5)、10mM磷酸鈉、1mM MgCl2、0.5mM EGTA、0.02% NaN3、14% Ficoll-PM70、14%蔗糖)，並充分混合。
(9)將上述(8)之溶液使用超高速離心機(Hitachi CP80WX、P45AT轉子)，於25,200rpm、10min、4℃進行超高速離心分離，使不要的成分以沉澱形式沉降。
(10)將上清之穹窿體片段以精製用緩衝液A稀釋4倍，使用超高速離心機(Hitachi CP80WX、P45AT轉子)，於40,000rpm、2小時、4℃進行超高速離心分離，使穹窿體片段以沉澱形式沉降。
(11)於以沉澱形式獲得之穹窿體片段加入少量精製用緩衝液A，以Dounce均質機懸浮。
(12)於超高速離心機(Hitachi CP80WX、P28S轉子)之離心管製作蔗糖之密度梯度。從離心管之底部起將60%、50%、45%、40%、30%、20%蔗糖分別重疊4mL、5mL、5mL、5mL、5mL、5mL。製作4根。
(13)將上述(11)之溶液5mL重層於上述(12)之蔗糖密度梯度之20%層之上。
(14)使用超高速離心機(Hitachi CP80WX、P28S轉子)，於25,000rpm、16小時、4℃實施超高速離心分離。
(15)穹窿體係含於40-45%片段與50%片段的一部分，故將其以微量吸管予以回收。40、45%片段全部回收(各5mL)、50%片段回收一半(2.5mL)。
(16)將上述(15)之回收液以精製用緩衝液A稀釋4倍，使用超高速離心機(Hitachi CP80WX、P45AT轉子)，藉由以40,000rpm、2小時、4℃實施超高速離心分離，使穹窿體片段以沉澱形式沉降。
(17)對於以沉澱形式獲得之穹窿體片段加入少量緩衝液A，以Dounce均質機懸浮。
(18)使上述(17)之穹窿體試樣通過0.22μm過濾器，去除髒污等。
(19)對於已流入2倍柱床體積之凝膠過濾用緩衝液A(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT)而平衡化的凝膠過濾管柱(GE Healthcare Japan(股)製、Sephacryl S-500、26/60)中通入上述(18)之試樣2mL，以流速0.5mL/min各分取4mL。
(20)目的之穹窿體片段於通入試樣後在140~190mL(片段編號39-49)處流出，故將其回收，並使用高速離心機(Hitachi CP80WX、P45AT rotor)，藉由以40,000rpm、2小時、4℃實施超高速離心分離，使穹窿體片段以沉澱形式沉降。(90~110mL(片段編號No.27-30)處，流出穹 窿體之組合體，可將其去除而獲得均一的穹窿體粒子)。
(21)於以沉澱的形式獲得之穹窿體片段中加入少量的緩衝液A，以Dounce均質機懸浮，將其作為最終精製製備品。
在此，第6圖之左側係顯示破碎(上述程序(9))後之SDS-PAGE之結果之照片，分別顯示針對LZMVP_Gly3之上清(線A)、沉澱(線B)、針對LZMVP_Gly6之上清(線C)、沉澱(線D)。又，第6圖之右側係顯示蔗糖密度梯度離心分離(上述程序(14))後之SDS-PAGE之結果之照片，左側之組a顯示針對LZMVP_Gly3之結果，右側之組b顯示針對LZMVP_Gly6之結果。又，第7圖係針對LZMVP_Gly3顯示最終精製製備品之電子顯微鏡照片。
[5]精製之穹窿體之蛋白質定量
(1)使用Pias公司之BCA Protein Assay Reagent Kit，實施針對以上述方式所獲得之W-MVP、LZMVP_Gly3及LZMVP_Gly6之蛋白質定量。
(2)將套組之5mL試藥A、100μL試藥B放入15mL管，充分混合。
(3)準備7根將上述(2)之混合溶液500μL裝入1.5mL之微離心管(eppendorf)者。
(4)分別取事前準備的5種BSA標準溶液(1000、500、250、125、62.5μg/ml)25μL，裝入上述(3)之1.5mL管，以旋渦混合器充分混合。
(5)製作2種將定量之穹窿體溶液(包括W-MVP、 LZMVP_Gly3或LZMVP_Gly6)以超純水稀釋者(例如5倍稀釋與10倍稀釋、25倍稀釋與50倍稀釋等)。
(6)將上述(5)製作之2種穹窿體之稀釋溶液分別放入上述(3)之1.5mL管，以旋渦混合器充分混合。
(7)將上述(4)與上述(6)之1.5mL管於37℃溫育30分鐘。
(8)使用分光光度計，測定上述(7)於562nm之吸光度(利用雙縮脲反應之還原Cu(+)與利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid；BCA)之配位所為之比色法)。
(9)首先，針對BCA之測定結果，將吸光度繪製於縱軸、BSA濃度繪製於橫軸，以最小平方法求取近似曲線(標準曲線)。
(10)從上述(9)之標準曲線求取穹窿體之稀釋溶液之濃度，並從稀釋倍率求取穹窿體原液之濃度。
(11)將穹窿體原液之濃度乘以總液量，計算穹窿體之總產量。
(12)結果，每1L培養獲得W-穹窿體(比較例1)3~5mg，反觀，LZ-穹窿體(LZMVP_Gly3(實施例1)、LZMVP_Gly6(實施例2))獲得超過約10倍之70~80mg之產量。
本次揭示之實施形態及實驗例應認為係在所有觀點為例示，並非為限制性者。本發明之範圍並非由上述說明顯示，而是由申請專利範圍顯示，意欲包括與申請專利範圍為均等之含意及範圍內的所有變更。
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<120> 人工活體粒子及其製造方法
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<212> PRT
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<223> 白胺酸拉鏈及MVP
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<212> PRT
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<223> LZ-MVP(Gly連結子3個殘基)
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<223> LZ-MVP(Gly連結子6個殘基)
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<223> 前置引子(lzmvp_0g_f)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 反置引子的互補序列
<400> 14
1‧‧‧人工活體粒子
2‧‧‧穹窿體
3a‧‧‧重複結構
3b‧‧‧重複結構
4‧‧‧白胺酸拉鏈
8‧‧‧腰

Claims (5)

  1. 一種人工活體粒子，其特徵為：構成穹窿體之腰之MVP之N端各納入有白胺酸拉鏈(Leucine zipper)，其中在MVP之N端與白胺酸拉鏈之間插入有連結子。
  2. 如請求項1之人工活體粒子，其中該連結子為3~6個之甘胺酸。
  3. 如請求項1之人工活體粒子，其中白胺酸拉鏈來自酵母之轉錄活化因子GCN4。
  4. 一種人工活體粒子之製造方法，其係製造如請求項1至3中任一項之人工活體粒子之方法；係將白胺酸拉鏈基因納入成為MVP基因之N端之側，並使其表現。
  5. 如請求項4之人工活體粒子之製造方法，其係將MVP基因與白胺酸拉鏈基因不經由限制酶部位而以編碼連結子之基因使其連結。
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