JPWO2014077195A1 - 人工生体粒子およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕昆虫細胞Sf9による野生型MVP(W−MVP)の大量発現系の構築
〔A〕W−MVPをクローニングした組換えバキュロウィルスゲノム(Bacmid DNA)の調製
以下の手順で作業を行なった。
(1)ラット肝臓由来MVP(W−MVP)のDNAをEcoRIとSphIの制限酵素サイトにより、pFastBacベクターに導入した。
(2)得られたpFastBacを大腸菌(DH5α)に形質転換し、Ampicillin(100μg/mL)入りのLBプレートにまき、37℃で24時間静置培養した。
(3)コロニー数個を白金耳等で拾い、コロニーPCRにて目的の遺伝子が増幅するかを確認した。
(4)上記(3)で、遺伝子の増幅が確認できたコロニーをAmpicillin(100μg/mL)入りのLB液体培地5mLに植菌し、37℃で一晩振とう培養した。
(5)一晩培養した大腸菌(DH5α)から、QIAGEN社のQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてW−MVPがクローニングされたpFastBacを精製した。
(6)W−MVPがクローニングされたpFastBac 0.1μgをDH10Bac 20μLに加え、軽く混合した後、氷上で20分間静置した。
(7)42℃で1分間、ヒートショックを行ない、氷上で2分間静置した後、200μLのSOC培地を加えて、37℃で4時間、振盪培養した。
(8)上記(7)の培養液をkanamycin(50μg/mL)、gentamicin(7μg/mL)、tetracycline(10μg/mL)、X−gal(100μg/mL)、IPTG(50μg/mL)入りのLBプレートに20μLまき、37℃で24時間静置培養した(コロニーの発色の有無(青色か白色か)を判別できるまで培養した)。
(9)白色のコロニーを白金耳等で拾い、新しいLBプレート(上記と同じ)に植菌して、37℃で一晩静置培養した後、発色の有無を再確認した。
(10)上記(9)で再確認した白色のコロニー由来の大腸菌(DH5α)をkanamycin(50μg/mL)、gentamicin(7μg/mL)、tetracycline(10μg/mL)入りのLB液体培地5mLに植菌し、37℃で一晩振盪培養した。
(11)一晩培養した大腸菌(DH10Bac)から、QIAGEN社のQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてW−MVPがクローニングされたBacmidを精製した。Bacmidは非常にサイズが大きいので、精製の際、溶出バッファーは70℃に温めたものを使用した。
安全キャビネット内で、以下の手順で行なった。
(1)Invitrogen社のSf900−II培地(10%血清入り)で培養中のSf9細胞(1.5−2.0×106cell/mL)を15mL tube内でSf900−II培地(10%血清入り)を用いて希釈することで、濃度を1.2×105cell/mLに調製した。
(2)12穴培養プレートに終濃度0.4×105cell/mLに調製した細胞培養液を1mL入れた。上述の1.2×105cell/mLの培養液を300μL、Sf900−II培地(10%血清入り)を700μL加えてトータル1mLとした。
(3)27℃で20分間静置し、細胞を細胞培養プレートの底面に接着させた。
(4)1.5mLチューブ内で、Grace medium unsupplement 214μL、Cellfectin 8μL、Bacmid 1μgを混合し、安全キャビネット内で室温、30分間放置した(Cellfectinはボルテックスミキサーで10秒ほど撹拌してから使用)。
(5)上記(3)での12穴培養プレートを倒立顕微鏡観察し、細胞が容器の底面に付着していることを確認してから、培地を取り除いた(プレートを奥に傾けながら、フタを手前に立てるようにしておき、ピペットマンで吸い出した)。
(6)培地を取り除いた後、Grace medium unsupplement 1mLで洗った。洗浄液は捨てた。
(7)その後、細胞に上述のBacmidとCellfectinの混合液をかけた。
(8)12穴プレートを密閉されたタッパー内に入れ、27℃で4時間静置した。タッパー内の湿度を保つためにキムワイプ数枚を純水で湿らせ、0.5M EDTAを1mL含ませたものをタッパーの端に置いておいた。
(9)4時間後、Grace medium unsupplement(10%血清入り)を400μL重層し、中2日間、27℃で培養した。
(10)中2日の培養後、培養液を1.5mLのチューブに移し、高速遠心分離(4,000×g、3min)で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液(P0)となるので、これを新しい1.5mLのチューブに移した。ウィルス液(P0)は、遮光フィルムを貼った4℃のクロマトチャンバ内で保存した。
(11)底面積25cm2の培養フラスコに、細胞数が3×106cellになるように培養液を加えた(トータル5mLとなるようにした)。例えば、Sf900−II培地(10%血清入り)で培養中のSf9細胞の細胞数が1×106cell/mLの場合、培養液3mLにSf900−II培地(10%血清入り)2mLを加えて5mLとしたものを培養フラスコに入れた。
(12)27℃で15分間静置し、細胞を細胞培養フラスコの底面に接着させた。
(13)P0のウィルス液200μLを加えて、中3日間培養した。
(14)中3日の培養後、ウィルス液(P1)を回収する前に底面積75cm2の培養フラスコに細胞数が9×106cellとなるように培養液を加えた(トータル15mLとなるようにした)。6×105cell/mLの培養液を15mL用意すれば、トータルの細胞数が9×106cellとなる。
(15)27℃で15分間静置し、細胞を細胞培養フラスコの底面に接着させた。
(16)ウィルス液(P1)を回収する前に、上述した底面積25cm2の培養フラスコから、ピペットを使って0.5mLの上清液を取り出し、上記(14)の培養液に加えた(コンタミ防止のため)。その後、培養液を27℃で中3日間培養した。
(17)残りの培養液をピペットで吸ったり吐いたりしながら、フラスコ底面に付着した細胞をはがし、15mLのチューブに移して高速遠心分離(4,000×g、3min)で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液(P1)となるので、これを新しい15mLのチューブに移した。沈殿として落ちたSf9細胞は発現チェック用として−80℃で凍結保存した。ウィルス液(P1)は、遮光フィルムを貼った4℃のクロマトチャンバ内で保存した。
(18)底面積75cm2の培養フラスコでの培養で中3日が経ったら、培養液をピペットで吸ったり吐いたりしながら、フラスコ底面に付着した細胞をはがし、50mLのチューブに移して高速遠心分離(4,000×g、3min)で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液(P2)となるので、これを新しい50mLのチューブに移した。沈殿として落ちたSf9細胞は発現チェック用として−80℃で凍結保存した。ウィルス液(P2)は、遮光フィルムを貼った4℃のクロマトチャンバ内で保存した。
(19)1Lのスピナーフラスコに1×106cell/mLの培養液を300mL用意し、ウィルス液(P2)を3mL(培地の1%量)加えて27℃で中3日培養した。
(20)中3日培養後、培養液を遠心チューブに移して高速遠心分離(4,000×g、30min)で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液(P3)となるので、これを新しい500mLのメディウム瓶に移した。この際に用いる遠心チューブ、遠心チューブのフタ、メディウム瓶は、アルミホイルでくるんでオートクレーブにより滅菌しておいた。沈殿として落ちたSf9細胞は精製用として−80℃で凍結保存した。ウィルス液(P3)は、遮光フィルムを貼った4℃のクロマトチャンバ内で保存した。
(21)3Lのスピナーフラスコに1×106cell/mLの培養液を500mL用意し、ウィルス液(P3)を5mL(培地の1%量)加えて27℃で中3日培養した。
(22)中3日培養後、培養液を遠心チューブに移して高速遠心分離(4,000×g、30min)で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液(P4)となるので、これを新しい500mLのメディウム瓶に移した。この際に用いる遠心チューブ、遠心チューブのフタ、メディウム瓶は、アルミホイルでくるんでオートクレーブにより滅菌しておいた。沈殿として落ちたSf9細胞は精製用として−80℃で凍結保存した。ウィルス液(P4)は、遮光フィルムを貼った4℃のクロマトチャンバ内で保存した。
以下の手順で作業を行なった。
(1)酵母菌由来GCN4(281アミノ酸)のアミノ酸配列(配列番号1)249番目のアルギニンから、281番目のアルギニンまでをコードするDNA(ロイシンジッパー遺伝子)(BamHIとEcoRIの制限酵素サイトを含む)(配列番号2)(発現されるロイシンジッパーのアミノ酸配列を配列番号3に示す)をプロメガ社のpGEM−Tベクターに導入し、QIAGEN社のQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてロイシンジッパーがクローニングされたプラスミドを精製した。pFastBacに導入したロイシンジッパー遺伝子の塩基配列(制限酵素サイト(BamHI、EcoRI)、開始Metを含む)を配列番号4に、発現されるロイシンジッパーのアミノ酸配列を配列番号5に示す。
(2)pGEM−Tベクターから、制限酵素BamHIとEcoRIを用いてロイシンジッパー遺伝子を切り出した。
(3)同様に、ラット由来のW−MVPをクローニングしたpFastBacも制限酵素BamHIとEcoRIで処理しておいた。
(4)上記(2)および(3)で得られたロイシンジッパー遺伝子のフラグメントおよびMVP遺伝子のフラグメントをそれぞれアガロースゲル電気泳動し、目的のバンドを切り出し、Quiagen社のQIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲルから目的物を精製した。
(5)タカラバイオ社のDNA Ligation Kit(Mighty Mix)を用いて、上記(4)で精製した両者をライゲーションさせた(ライゲーション後の塩基配列を配列番号6、発現されるロイシンジッパー、MVPのアミノ酸配列を配列番号7、8に示す)。
(6)以下、上述したW−MVPをクローニングした組換えバキュロウィルスゲノムの調製(手順(1)−(11))、ならびに、W−MVPをクローニングした組換えバキュロウィルスの増殖(手順(1)−(20))と同じ操作を行ない、LZ−MVPをクローニングした組換えバキュロウィルスを増殖し、ウィルス液(P4)を作成した。
上記構築した発現系では、ロイシンジッパー遺伝子とMVP遺伝子の間にEcoRIのサイト(GAATTC)が残り、ボルト粒子の形成を阻害する可能性があるため、発明者は、これらを最も小さい側鎖を持つアミノ酸(グリシン(Gly))を3残基(Gly3)(アミノ酸配列を配列番号9に示す)または6残基(Gly6)(アミノ酸配列を配列番号10に示す)つなげたGlyリンカーに置き換えた。
(1)以下の3種のプライマーを作成した(Glyをコードする塩基配列はgcc)。
atggcaactgaagaggccat(配列番号11)
・forward primer(lzmvp_3g_f)
ggcggcggcatggcaactgaagaggccatcatccgcatc(配列番号12)
・reverse primer(lzmvp_3g_r)
GCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCggcggcggc(配列番号13)
なお、reverse primerの相補配列は以下のとおりである。
(2)Gly3残基のリンカーを挿入する場合は、lzmvp_0g_fとlzmvp_3g_r、Gly6残基のリンカーを挿入する場合は、lzmvp_3g_fとlzmvp_3g_rをプライマーとして用い、先に作成したLZ−MVPのpFastBacを鋳型として、東洋紡(株)社製のKOD−plus Mutagenesis kitを用いてPCR(94℃、2分→98℃、10秒→68℃、8分(下線部を10サイクル))を行なった。
(3)PCR後、東洋紡(株)社製のKOD−plus Mutagenesis kitに含まれるDpnIを用いて鋳型プラスミドを消化した。1.5mLチューブ内でPCR product 50μLとDpnI 2μLを混合し、タッピング、スピンダウンした後に37℃で1時間インキュベートした。
(4)1.5mLチューブ内で上記(3)の反応液を2μL、滅菌水を7μL、Ligation highを5μL、T4 polynucleotide kinaseを1μL、ここに記した順番に加え、タッピング、スピンダウンした後に16℃で1時間イン
キュベートした。
(5)大腸菌DH5α 50μLに上記(4)の反応液を5μL加え、氷上で30分静置した。
(6)42℃で45秒、ヒートショックを行なった。
(7)氷上で2分間静置した。
(8)SOC培地450μLを加えて、37℃で1時間、振盪培養した。
(9)上記(8)の培養液50μLをAmpicillin(100μg/mL)入りのLBプレートにまいた。
(10)37℃で一晩静置培養した。
(1)3Lのスピナーフラスコで500mLのSf9細胞を培養し、細胞数が1×106cell/mLになったところで、P4またはP3のウィルス液を加えて感染して中3日間培養した。
(2)中3日培養後、培養液を遠心チューブに移して高速遠心分離(4,000×g、30min)で細胞を沈殿させた。
(3)沈殿させた細胞をPBS Bufferを用いて懸濁し、懸濁液を遠心チューブに移して高速遠心分離(4,000×g、30min)することで細胞を洗浄し、培地成分等を取り除いた。
(4)沈殿として得られた細胞を細胞破砕用Buffer A(50mM Tris−HCl(pH7.5)、75mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、1mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤・動物細胞用(ナカライテスク(株)社製)2本)100mLで懸濁し、超音波破砕した(TOMY UD−201、OUTPUT 2、DUTY 60、2min×2)。
(5)破砕液を高速遠心機(Beckman HP−26XP、JA25.50 rotor)を用いて、14,300rpm、30min、4℃で高速遠心分離を行なうことにより、細胞破砕カスを沈殿として取り除いた。
(6)上清を超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P45AT rotor)を用いて、40,000rpm、2時間、4℃で超高速遠心分離を行なうことにより、ボルト画分を沈殿として落とした。
(7)沈殿として得られたボルト画分に精製用Buffer A(50mM Tris−HCl(pH7.5)、75mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、1mM PMSF)を少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁した。
(8)上記(7)の溶液に等量のFicoll/Sucrose Buffer(90mM MES−NaOH(pH6.5)、10mM Sodium phosphate、1mM MgCl2、0.5mM EGTA、0.02% NaN3、14% Ficoll−PM70、14% Sucrose)を加えてよく混合した。
(9)上記(8)の溶液を超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P45AT rotor)を用いて、25,200rpm、10min、4℃で超高速遠心分離を行ない、不要物を沈殿として落とした。
(10)上清のボルト画分を精製用Buffer Aで4倍希釈し、超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P45AT rotor)を用いて、40,000rpm、2時間、4℃で超高速遠心分離を行ない、ボルト画分を沈殿として落とした。
(11)沈殿として得られたボルト画分に精製用Buffer Aを少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁した。
(12)超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P28S rotor)の遠心チューブにショ糖の密度勾配を作成した。遠心チューブの底から、60%、50%、45%、40%、30%、20% Sucroseをそれぞれ、4mL、5mL、5mL、5mL、5mL、5mL重層した。これを4本作成した。
(13)上記(11)の溶液5mLを上記(12)のショ糖密度勾配の20%層の上に重層した。
(14)超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P28S rotor)を用いて、25,000rpm、16時間、4℃で超高速遠心分離を行なった。
(15)ボルトは40−45%画分と50%画分の一部に含まれているので、これをピペットで回収した。40、45%画分は全て(5mLずつ)、50%画分は半分(2.5mL)を回収した。
(16)上記(15)の回収液を精製用Buffer Aで4倍希釈し、超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P45AT rotor)を用いて、40,000rpm、2時間、4℃で超高速遠心分離を行なうことにより、ボルト画分を沈殿として落とした。
(17)沈殿として得られたボルト画分にBuffer Aを少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁した。
(18)上記(17)のボルト試料を0.22μmのフィルターに通し、ゴミ等を取り除いた。
(19)ゲルろ過用Buffer A(50mM Tris−HCl(pH7.5)、75mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT)を2ベッドボリューム流して平衡化したゲルろ過カラム(GEヘルスケア・ジャパン(株)社製、Sephacryl S−500、26/60)に上記(18)の試料を2mLアプライし、流速0.5mL/minで4mLずつ分取した。
(20)目的のボルト画分は、試料アプライ後140〜190mL(フラクションNo.39−49)あたりに出てくるので、これを回収し、超高速遠心機(Hitachi CP80WX、P45AT rotor)を用いて、40,000rpm、2時間、4℃で超高速遠心分離を行なうことにより、ボルト画分を沈殿として落とした。(90〜110mL(フラクションNo.27−30)あたりには、ボルトの会合体が出てくるので、これを取り除くことで均一なボルト粒子を得る事ができる)。
(21)沈殿として得られたボルト画分にBuffer Aを少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁し、これを最終精製標品とした。
(1)ピアス社のBCA Protein Assay Reagent Kitを用いて、上述のようにして得られたW−MVP、LZMVP_Gly3およびLZMVP_Gly6についてのタンパク質定量を行なった。
(2)キットの試薬Aを5mL、試薬Bを100μL、15mLチューブに入れて、よく混合した。
(3)上記(2)の混合溶液を1.5mLのエッペンチューブに500μL入れたものを7本用意した。
(4)事前に用意した5つのBSA標準溶液(1000、500、250、125、62.5μg/ml)をそれぞれ25μL取り、上記(3)の1.5mLチューブに入れて、ボルテックスでよく混合した。
(5)定量するボルト溶液(W−MVP、LZMVP_Gly3またはLZMVP_Gly6を含む)を超純水で希釈したものを2種類作った(たとえば、5倍希釈と10倍希釈、25倍希釈と50倍希釈など)。
(6)上記(5)で作製したボルトの希釈溶液2種をそれぞれ、上記(3)の1.5mLチューブに入れて、ボルテックスでよく混合した。
(7)上記(4)と上記(6)の1.5mLチューブを37℃で30分間インキュベートした。
(8)分光光度計を用い、上記(7)の562nmでの吸光度を測定する(ビュレット反応による還元Cu(+)とビシンコニン酸(BCA)の配位による比色定量)。
(9)まず、BCAについて測定結果を、縦軸を吸光度、横軸をBSA濃度としてプロットし、最小二乗法により近似曲線(標準曲線)を求めた。
(10)上記(9)の標準曲線から、ボルトの希釈溶液の濃度を求めて、希釈倍率からボルト原液の濃度を求めた。
(11)ボルト原液の濃度に総液量を乗じ、ボルトの総収量を計算した。
(12)結果、1L培養あたり、W−ボルト(比較例1)は3〜5mgであったのに対し、LZ−ボルト(LZMVP_Gly3(実施例1)、LZMVP_Gly6(実施例2))では約10倍を超える70〜80mgの収量が得られていた。
Claims (6)
- ボルト(2)のウェスト(8)を構成するMVP(3)のN末端のそれぞれにロイシンジッパー(4)が組み込まれたことを特徴とする、人工生体粒子(1)。
- MVP(3)のN末端とロイシンジッパー(4)との間にリンカーが介在されている、請求項1に記載の人工生体粒子(1)。
- 前記リンカーが、3〜6個のグリシンである、請求項2に記載の人工生体粒子(1)。
- ロイシンジッパーが酵母の転写活性化因子GCN4由来である、請求項1に記載の人工生体粒子(1)。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の人工生体粒子(1)を製造する方法であって、
ロイシンジッパー遺伝子をMVP遺伝子のN末端となる側に組み込み、発現させる、人工生体粒子(1)の製造方法。 - MVP遺伝子とロイシンジッパー遺伝子とを、制限酵素サイトを介さずに、リンカーをコードする遺伝子で連結させることを特徴とする、請求項5に記載の人工生体粒子(1)の製造方法。
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