WO2014077195A1

WO2014077195A1 - 人工生体粒子およびその製造方法

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Publication number: WO2014077195A1
Application number: PCT/JP2013/080219
Authority: WO
Inventors: 田中　秀明
Original assignee: 独立行政法人科学技術振興機構
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2014-05-22
Also published as: KR101665901B1; EP2921555A1; US9840540B2; EP2921555B1; JP5591418B1; TW201436807A; KR20150085822A; US20160002305A1; JPWO2014077195A1; EP2921555A4; CN104797709A; TWI568446B

Abstract

　ボルト（２）のウェスト（８）を構成するＭＶＰ（３）のＮ末端のそれぞれにロイシンジッパー（４）が組み込まれたことを特徴とする人工生体粒子（１）、ならびに、ロイシンジッパー遺伝子をＭＶＰ遺伝子のＮ末端となる側に組み込み、発現させる人工生体粒子（１）の製造方法により、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などへの応用が可能なナノカプセルとして用いられ得る、その大きな内部空間を有効に利用することができるボルトを用いた新規な人工生体粒子およびその製造方法が提供される。

Description

人工生体粒子およびその製造方法

　本発明は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などへの応用が可能なナノカプセルとして用いられ得る、ボルト（Ｖａｕｌｔ）を用いた新規な人工生体粒子およびその製造方法に関する。

　ボルト２は、粒子サイズが４０ｎｍ×４０ｎｍ×６７ｎｍの卵型の巨大な生体粒子であり、細胞内で最大の分子量を有する核酸－タンパク質複合体である（図２を参照）。生体内に存在するボルト２は、３種類のタンパク質（ＭＶＰ（Ｍａｊｏｒ　Ｖａｕｌｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＶＰＡＲＰ（ｖａｕｌｔ　ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＴＥＰ１（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ－１））と１種類のＲＮＡで構成されている。ボルト２は、主成分である分子量約１００ｋＤａのＭＶＰ３が３９個集まってお椀型の半分のボルト（各部位はキャップ５、ショルダー６、ボディ７およびウェスト８と称される）を形成し、それら２つがお椀の縁と縁を合わせるように、ウェスト８において会合することで卵型粒子の外殻が形成される。ＭＶＰ以外の成分については、外殻により形成された内部空間に存在する。

　ボルト２の外殻を構成するＭＶＰ３は、逆平行βシートで形成される９つの繰り返し構造（３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇ，３ｈ，３ｉ）と、ショルダー６、キャップヘリックス９およびキャップリング１０の計１２個のドメインで構成されており（図３）、キャップヘリックス９のドメイン間の分子間疎水結合が、お椀型をした半分のボルトの形成に重要である。２つの半分のボルトは、ＭＶＰ３のＮ末端同士を会合することによって卵型のボルト粒子を形成し、その会合はイオン結合と短い分子間βシートだけという非常に弱い相互作用のみで形成されている。このようなボルトの構造情報および粒子形成のメカニズムは、本発明者が２００９年にラット肝臓由来ボルトの全体構造決定に成功し、明らかにされた（たとえば、Ｈｉｄｅａｋｉ　Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｔｈｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｒａｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｖａｕｌｔ　ａｔ　３．５　Ａｎｇｓｔｒｏｍ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ．３２３、　ｐｐ．３８４－３８８（２００９）（非特許文献１）を参照。）。

　ボルトは、その主成分であるＭＶＰを昆虫細胞で発現させると、生体内と同じ卵型の粒子が形成されることは以前から知られていた（たとえば、Ａｎｄｒｅｗ　Ｇ．Ｓｔｅｐｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，「Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　Ｖａｕｌｔ－ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｏｎｌｙ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｖａｕｌｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ．２７６、　Ｎｏ．２６、　ｐｐ．２３２１７－２３２２０（２００１）（非特許文献２）を参照。）。ボルトは、その特徴的な形のため、ナノカプセルとして利用することによるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の開発が進められている（たとえば、Ｖａｌｅｒｉｅ　Ａ．　Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｖａｕｌｔ　ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、ＰＮＡＳ、　Ｖｏｌ．１０２，　Ｎｏ．１２、　ｐｐ．４３４８－４３５２（２００５）（非特許文献３）、Ｖａｌｅｒｉｅ　Ａ．　Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｖａｕｌｔ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｔｏ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＡＣＳ　ｎａｎｏ、３（１）：２７－３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ８００６３８ｘ（２００９）（非特許文献４）を参照。）。

　また、たとえば特表２０１３－５０９２０２号公報（特許文献１）では、ＭＶＰならびに融合タンパク質かつｍＩＮＴおよび関心対象のタンパク質（サイトカイン）を有する組換え粒子であるボルト粒子を、細胞もしくは腫瘍または対象への関心対象のタンパク質の送達のために用いることが開示されている。その他、たとえば特表２００７－５０８８４６号公報（特許文献２）では、ポリペプチドでパッケージングされた、ポリヌクレオチドを送達するための組成物であって、ポリヌクレオチド結合領域としてロイシンジッパーを有する技術が開示されている。

　従来の方法では、薬剤の粒子内部への取り込みに、ボルトの構成成分で粒子内部に存在するＶＰＡＲＰのＣ末端１６０残基（ＩＮＴドメイン：ＭＶＰと結合する）をタグとして利用している。これは、粒子内部に薬剤を保持させておくためでもある。しかしながら、この方法では、ボルトの大きな内部空間を十分に活かしきれていない。

特表２０１３－５０９２０２号公報特表２００７－５０８８４６号公報

Ｈｉｄｅａｋｉ　Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｔｈｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｒａｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｖａｕｌｔ　ａｔ　３．５　Ａｎｇｓｔｒｏｍ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ．３２３、　ｐｐ．３８４－３８８（２００９）Ａｎｄｒｅｗ　Ｇ．Ｓｔｅｐｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，「Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　Ｖａｕｌｔ－ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｏｎｌｙ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｖａｕｌｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ．２７６、　Ｎｏ．２６、　ｐｐ．２３２１７－２３２２０（２００１）Ｖａｌｅｒｉｅ　Ａ．　Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｖａｕｌｔ　ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、ＰＮＡＳ、　Ｖｏｌ．１０２，　Ｎｏ．１２、　ｐｐ．４３４８－４３５２（２００５）Ｖａｌｅｒｉｅ　Ａ．　Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｖａｕｌｔ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｔｏ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＡＣＳ　ｎａｎｏ、３（１）：２７－３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ８００６３８ｘ（２００９）

　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などへの応用が可能なナノカプセルとして用いられ得る、その大きな内部空間を有効に利用することができるボルトを用いた新規な人工生体粒子およびその製造方法を提供することである。

　本発明の人工生体粒子は、ボルトのウェストを構成するＭＶＰのＮ末端のそれぞれにロイシンジッパーが組み込まれたことを特徴とする。

　本発明の人工生体粒子は、ＭＶＰのＮ末端とロイシンジッパーとの間にリンカーが介在されていることが好ましい。この場合、リンカーは、３～６個のグリシンであることがより好ましい。

　本発明の人工生体粒子において、ロイシンジッパーは酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４由来であることが、好ましい。

　本発明はまた、上述した本発明の人工生体粒子を製造する方法であって、ロイシンジッパー遺伝子をＭＶＰ遺伝子のＮ末端となる側に組み込み、発現させる、人工生体粒子の製造方法についても提供する。

　本発明の人工生体粒子の製造方法において、ＭＶＰ遺伝子とロイシンジッパー遺伝子とを、制限酵素サイトを介さずに、リンカーをコードする遺伝子で連結させることが好ましい。

　本発明の人工生体粒子の製造方法により、従来と比較して格段に高収率で人工生体粒子を得ることが可能となった。本発明の人工生体粒子は、その内部空間を有効に利用することができるＤＤＳなどに利用可能なナノカプセルとして期待され、本発明により収量が一桁上がったことで、大幅なコストダウンに繋がる。また、本発明の人工生体粒子を基盤として、ｐＨ依存で可逆的な開閉制御可能な粒子の開発が進むことが期待できる。

本発明の人工生体粒子１における、ボルト２を構成するＭＶＰ３のＮ末端３ａとロイシンジッパー４との結合について概念的に示す模式図である。本発明の人工生体粒子１に用いられるボルト２を模式的に示す図である。ボルト２を構成するＭＶＰ３を模式的に示す図である。本発明の人工生体粒子１をナノカプセルとして応用した場合を模式的に示す図である。本発明の人工生体粒子１をナノカプセルとして応用したドラッグデリバリーシステムの一例を模式的に示す図である。図６の左側は、破砕後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真であり、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３についての上清（レーンＡ）、沈殿（レーンＢ）、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６についての上清（レーンＣ）、沈殿（レーンＤ）をそれぞれ示している。また図６の右側は、ショ糖密度勾配遠心分離後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真であり、左側の群ａがＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３についての結果、右側の群ｂがＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６についての結果をそれぞれ示している。ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３について、最終精製標品を示す電子顕微鏡写真である。

　図１は、本発明の人工生体粒子１における、ボルト２を構成するＭＶＰ３のＮ末端３ａとロイシンジッパー４との結合について概念的に示す模式図である。また図２は、本発明の人工生体粒子１に用いられるボルト２を模式的に示す図であり、図３は、ボルト２を構成するＭＶＰ３を模式的に示す図である。上述のように、ボルト２は、主成分であるＭＶＰ３が３９個集まってお椀型の半分のボルト（各部位はキャップ５、ショルダー６、ボディ７およびウェスト８と称される）を形成し、それら２つがお椀の縁と縁を合わせるように、ウェスト８において会合することで卵型粒子の外殻が形成される（図２）。ボルト２の外殻を構成するＭＶＰ３は、逆平行βシートで形成される９つの繰り返し構造（３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇ，３ｈ，３ｉ）と、ショルダー６、キャップヘリックス９およびキャップリング１０の計１２個のドメインで構成されている（図３）。本発明の人工生体粒子１は、ボルト２のウェスト８を構成するＭＶＰ３のＮ末端のそれぞれにロイシンジッパー４が組み込まれたことを特徴とする。

　本発明の人工生体粒子１は、ＭＶＰ３のＮ末端とロイシンジッパー４との間にリンカーが介在されていることが好ましい。このようなリンカーが介在されていることで、人工生体粒子１におけるロイシンジッパー４の動きの自由度が担保される。

　本発明の人工生体粒子１におけるＭＶＰ３のＮ末端とロイシンジッパー４との間のリンカーは、小さなアミノ酸が１～６個直鎖状に連なって形成されることが好ましい。リンカーを形成するアミノ酸の数が１～６個のいずれの場合であってもロイシンジッパー４を有する人工生体粒子１は発現されるが、より発現量が多く、得られる人工生体粒子１が均一であるという観点から、さらには、ロイシンジッパー４の動きの自由度の観点から、リンカーは、小さなアミノ酸が３～６個直鎖状に連なって形成されることが好ましい。リンカーを構成するアミノ酸としては、たとえばグリシン、アラニンなどの側鎖の小さいアミノ酸が挙げられる。後述する本実験例では、３個または６個の直鎖状のグリシンでリンカーを形成した例を示している。

　ロイシンジッパー４は、約３０残基のアミノ酸で構成されるα－ヘリックス２本が、互いのロイシン残基で疎水結合することにより形成されるチャックの様なモチーフである。本発明におけるロイシンジッパー４としては、たとえば酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４由来のロイシンジッパー、それ以外の他のタンパク質由来のロイシンジッパーについても、特に制限なく用いることができる。中でも、１９９１年に酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４由来のロイシンジッパーのＸ線結晶構造が１．８Å分解能で決定されており、３３残基のアミノ酸で構成されたペプチドがお互いのロイシン残基で疎水結合することにより、強固なコイルドコイルを形成することが原子レベルで明らかになっていることから、酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４由来のロイシンジッパーが好適に用いられ得る。

　このような本発明の人工生体粒子によれば、その内部空間を有効に利用することができるＤＤＳなどに利用可能なナノカプセルとして期待され、本発明により収量が一桁上がったことで、大幅なコストダウンに繋がる。また、本発明の人工生体粒子を基盤として、ｐＨ依存で可逆的な開閉制御可能な粒子の開発が進むことが期待できる。

　ここで図４は、本発明の人工生体粒子１をナノカプセルとして応用した場合を模式的に示す図であり、図５は、本発明の人工生体粒子１をナノカプセルとして応用したＤＤＳの一例を模式的に示す図である。本発明の人工生体粒子１により、たとえば、ＭＶＰのＮ末端に付けたロイシンジッパーにシステイン残基を導入することで、図４に示すように、中性条件ではジスルフィド結合によって安定な卵型粒子を形成し、酸性条件下ではジスルフィド結合の開裂により卵を真っ二つに割ったように開くような、ｐＨ依存で可逆的に開閉制御可能なナノカプセルを開発できる可能性がある。このようなナノカプセルを用いることで、たとえば、図５に示すように、酸性条件下で薬剤１１をボルト２の内部空間に入れておき、これを投与することで、標的細胞１３の表面の特異的な抗原１２と、ボルト２の表面に予め付着した抗体（Ｆａｂ）との抗原抗体反応によりナノカプセルが標的細胞１３内に取り込まれ、エンドソーム１４内で酸性条件となることでナノカプセルが開き、薬剤１１が放出される、というようなＤＤＳも考えられ得る。このような本発明の人工生体粒子は、その内部に非常に大きな空間があるため、遺伝子治療の際のキャリアとしても有望であると考えられる。

　また、本発明の人工生体粒子１は、化粧品などの成分を閉じ込めて、肌の奥まで浸透させるナノカプセルとしての利用なども考えられる。

　また、近年、タンパク質複合体の内部空間を鋳型として利用し、金属を重合させ、それらを規則的に配列させることで、極小半導体のベースとなる基板を作る技術なども確立されてきている。現在は、フェリチンなどの球状タンパク質が用いられているが、本発明の人工生体粒子１を利用することにより、ボルト２のような楕円をした粒子を用いることで、これまでにない新規な基板を作成できる可能性がある。

　本発明はまた、ロイシンジッパー遺伝子をＭＶＰ遺伝子のＮ末端となる側に組み込み、発現させることを特徴とする、人工生体粒子１の製造方法についても提供する。これにより、実験例において後述するように、野生型ＭＶＰ（Ｗ－ＭＶＰ）で形成されるＷ－ボルトの昆虫細胞を用いた従来の発現系と比較すると、１０倍以上という格段に高い収率で本発明の人工生体粒子１を得ることができる。ロイシンジッパー遺伝子およびＭＶＰ遺伝子の塩基配列は既に公知であり、従来公知の遺伝子工学手法を適宜組み合わせることで、ロイシンジッパー遺伝子をＭＶＰ遺伝子のＮ末端となる側に組み込むことができる。後述する実験例では、酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４から切り出し、精製されたロイシンジッパー遺伝子のフラグメント、同様に切り出し、精製されたラット由来のＭＶＰ遺伝子のフラグメントを（後述するリンカーを介して）ライゲーションさせた例を示している。

　ロイシンジッパー遺伝子をＭＶＰ遺伝子のＮ末端となる側に組み込んだものを発現させる細胞としては、特に制限されないが、昆虫細胞、昆虫細胞よりも高等な生物の細胞が例示される。昆虫細胞よりも下等な、たとえば大腸菌を用いた場合には、生体粒子がうまく形成されない場合があることが知られており、当分野で通常用いられている昆虫細胞を用いて発現させることが好ましい。昆虫細胞の具体例としては、Ｓｆ９が例示される。発現された人工生体粒子は、従来公知の適宜の方法により、精製され得る。

　本発明の人工生体粒子１の製造方法においては、ＭＶＰ遺伝子とロイシンジッパー遺伝子とを、制限酵素サイトを介さずに、リンカーをコードする遺伝子で連結させることが好ましい。上述した酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４由来のロイシンジッパー遺伝子のフラグメント、ラット由来のＭＶＰ遺伝子を用いた場合、その連結させようとすると、その間にＥｃｏＲＩのサイト（ＧＡＡＴＴＣ）が残り、ボルト粒子の形成を阻害する可能性がある。後述する実験例では、ＥｃｏＲＩサイトを最も小さい側鎖を持つアミノ酸グリシンを３残基または６残基つなげたＧｌｙリンカーに置き換えた後、昆虫細胞で発現させた。具体的には、導入させたいリンカーに応じてプライマーを設計し、ＰＣＲ後、精製したフラグメントを、ＭＶＰ遺伝子のＮ末端とロイシンジッパー遺伝子との間に介在させるようにライゲーションさせればよい。

　なお、本発明の人工生体粒子１の製造方法においても、ロイシンジッパー、リンカーなど、好ましいものは、人工生体粒子１について上述したとおりである。

　以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

　＜実験例＞
　〔１〕昆虫細胞Ｓｆ９による野生型ＭＶＰ（Ｗ－ＭＶＰ）の大量発現系の構築
　〔Ａ〕Ｗ－ＭＶＰをクローニングした組換えバキュロウィルスゲノム（Ｂａｃｍｉｄ　ＤＮＡ）の調製
　以下の手順で作業を行なった。
（１）ラット肝臓由来ＭＶＰ（Ｗ－ＭＶＰ）のＤＮＡをＥｃｏＲＩとＳｐｈＩの制限酵素サイトにより、ｐＦａｓｔＢａｃベクターに導入した。
（２）得られたｐＦａｓｔＢａｃを大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換し、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）入りのＬＢプレートにまき、３７℃で２４時間静置培養した。
（３）コロニー数個を白金耳等で拾い、コロニーＰＣＲにて目的の遺伝子が増幅するかを確認した。
（４）上記（３）で、遺伝子の増幅が確認できたコロニーをＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）入りのＬＢ液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。
（５）一晩培養した大腸菌（ＤＨ５α）から、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いてＷ－ＭＶＰがクローニングされたｐＦａｓｔＢａｃを精製した。
（６）Ｗ－ＭＶＰがクローニングされたｐＦａｓｔＢａｃ　０．１μｇをＤＨ１０Ｂａｃ　２０μＬに加え、軽く混合した後、氷上で２０分間静置した。
（７）４２℃で１分間、ヒートショックを行ない、氷上で２分間静置した後、２００μＬのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で４時間、振盪培養した。
（８）上記（７）の培養液をｋａｎａｍｙｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ)、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（７μｇ／ｍＬ）、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（１０μｇ／ｍＬ）、Ｘ－ｇａｌ（１００μｇ／ｍＬ）、ＩＰＴＧ（５０μｇ／ｍＬ）入りのＬＢプレートに２０μＬまき、３７℃で２４時間静置培養した（コロニーの発色の有無（青色か白色か）を判別できるまで培養した）。
（９）白色のコロニーを白金耳等で拾い、新しいＬＢプレート（上記と同じ）に植菌して、３７℃で一晩静置培養した後、発色の有無を再確認した。
（１０）上記（９）で再確認した白色のコロニー由来の大腸菌（ＤＨ５α）をｋａｎａｍｙｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（７μｇ／ｍＬ)、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（１０μｇ／ｍＬ）入りのＬＢ液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。
（１１）一晩培養した大腸菌（ＤＨ１０Ｂａｃ）から、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いてＷ－ＭＶＰがクローニングされたＢａｃｍｉｄを精製した。Ｂａｃｍｉｄは非常にサイズが大きいので、精製の際、溶出バッファーは７０℃に温めたものを使用した。

　〔Ｂ〕Ｗ－ＭＶＰをクローニングした組換えバキュロウィルスの増殖（ウィルス液の作成）
　安全キャビネット内で、以下の手順で行なった。
（１）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｆ９００－ＩＩ培地（１０％血清入り）で培養中のＳｆ９細胞（１．５－２．０×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ）を１５ｍＬ　ｔｕｂｅ内でＳｆ９００－ＩＩ培地（１０％血清入り）を用いて希釈することで、濃度を１．２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬに調製した。
（２）１２穴培養プレートに終濃度０．４×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬに調製した細胞培養液を１ｍＬ入れた。上述の１．２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの培養液を３００μＬ、Ｓｆ９００－ＩＩ培地（１０％血清入り）を７００μＬ加えてトータル１ｍＬとした。
（３）２７℃で２０分間静置し、細胞を細胞培養プレートの底面に接着させた。
（４）１．５ｍＬチューブ内で、Ｇｒａｃｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　２１４μＬ、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ　８μＬ、Ｂａｃｍｉｄ　１μｇを混合し、安全キャビネット内で室温、３０分間放置した（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎはボルテックスミキサーで１０秒ほど撹拌してから使用）。
（５）上記（３）での１２穴培養プレートを倒立顕微鏡観察し、細胞が容器の底面に付着していることを確認してから、培地を取り除いた（プレートを奥に傾けながら、フタを手前に立てるようにしておき、ピペットマンで吸い出した）。
（６）培地を取り除いた後、Ｇｒａｃｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１ｍＬで洗った。洗浄液は捨てた。
（７）その後、細胞に上述のＢａｃｍｉｄとＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎの混合液をかけた。
（８）１２穴プレートを密閉されたタッパー内に入れ、２７℃で４時間静置した。タッパー内の湿度を保つためにキムワイプ数枚を純水で湿らせ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを１ｍＬ含ませたものをタッパーの端に置いておいた。
（９）４時間後、Ｇｒａｃｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１０％血清入り）を４００μＬ重層し、中２日間、２７℃で培養した。
（１０）中２日の培養後、培養液を１．５ｍＬのチューブに移し、高速遠心分離（４，０００×ｇ、３ｍｉｎ）で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液（Ｐ０）となるので、これを新しい１．５ｍＬのチューブに移した。ウィルス液（Ｐ０）は、遮光フィルムを貼った４℃のクロマトチャンバ内で保存した。
（１１）底面積２５ｃｍ^２の培養フラスコに、細胞数が３×１０^６ｃｅｌｌになるように培養液を加えた（トータル５ｍＬとなるようにした）。例えば、Ｓｆ９００－ＩＩ培地（１０％血清入り）で培養中のＳｆ９細胞の細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬの場合、培養液３ｍＬにＳｆ９００－ＩＩ培地（１０％血清入り）２ｍＬを加えて５ｍＬとしたものを培養フラスコに入れた。
（１２）２７℃で１５分間静置し、細胞を細胞培養フラスコの底面に接着させた。
（１３）Ｐ０のウィルス液２００μＬを加えて、中３日間培養した。
（１４）中３日の培養後、ウィルス液（Ｐ１）を回収する前に底面積７５ｃｍ^２の培養フラスコに細胞数が９×１０^６ｃｅｌｌとなるように培養液を加えた（トータル１５ｍＬとなるようにした）。６×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの培養液を１５ｍＬ用意すれば、トータルの細胞数が９×１０^６ｃｅｌｌとなる。
（１５）２７℃で１５分間静置し、細胞を細胞培養フラスコの底面に接着させた。
（１６）ウィルス液（Ｐ１）を回収する前に、上述した底面積２５ｃｍ^２の培養フラスコから、ピペットを使って０．５ｍＬの上清液を取り出し、上記（１４）の培養液に加えた（コンタミ防止のため）。その後、培養液を２７℃で中３日間培養した。
（１７）残りの培養液をピペットで吸ったり吐いたりしながら、フラスコ底面に付着した細胞をはがし、１５ｍＬのチューブに移して高速遠心分離（４，０００×ｇ、３ｍｉｎ）で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液（Ｐ１）となるので、これを新しい１５ｍＬのチューブに移した。沈殿として落ちたＳｆ９細胞は発現チェック用として－８０℃で凍結保存した。ウィルス液（Ｐ１）は、遮光フィルムを貼った４℃のクロマトチャンバ内で保存した。
（１８）底面積７５ｃｍ^２の培養フラスコでの培養で中３日が経ったら、培養液をピペットで吸ったり吐いたりしながら、フラスコ底面に付着した細胞をはがし、５０ｍＬのチューブに移して高速遠心分離（４，０００×ｇ、３ｍｉｎ）で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液（Ｐ２）となるので、これを新しい５０ｍＬのチューブに移した。沈殿として落ちたＳｆ９細胞は発現チェック用として－８０℃で凍結保存した。ウィルス液（Ｐ２）は、遮光フィルムを貼った４℃のクロマトチャンバ内で保存した。
（１９）１Ｌのスピナーフラスコに１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬの培養液を３００ｍＬ用意し、ウィルス液（Ｐ２）を３ｍＬ（培地の１％量）加えて２７℃で中３日培養した。
（２０）中３日培養後、培養液を遠心チューブに移して高速遠心分離（４，０００×ｇ、３０ｍｉｎ）で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液（Ｐ３）となるので、これを新しい５００ｍＬのメディウム瓶に移した。この際に用いる遠心チューブ、遠心チューブのフタ、メディウム瓶は、アルミホイルでくるんでオートクレーブにより滅菌しておいた。沈殿として落ちたＳｆ９細胞は精製用として－８０℃で凍結保存した。ウィルス液（Ｐ３）は、遮光フィルムを貼った４℃のクロマトチャンバ内で保存した。
（２１）３Ｌのスピナーフラスコに１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬの培養液を５００ｍＬ用意し、ウィルス液（Ｐ３）を５ｍＬ（培地の１％量）加えて２７℃で中３日培養した。
（２２）中３日培養後、培養液を遠心チューブに移して高速遠心分離（４，０００×ｇ、３０ｍｉｎ）で細胞を沈殿させた。上清がウィルス液（Ｐ４）となるので、これを新しい５００ｍＬのメディウム瓶に移した。この際に用いる遠心チューブ、遠心チューブのフタ、メディウム瓶は、アルミホイルでくるんでオートクレーブにより滅菌しておいた。沈殿として落ちたＳｆ９細胞は精製用として－８０℃で凍結保存した。ウィルス液（Ｐ４）は、遮光フィルムを貼った４℃のクロマトチャンバ内で保存した。

　〔２〕昆虫細胞Ｓｆ９によるＮ末端にロイシンジッパーを付加したＭＶＰ（ＬＺ－ＭＶＰ）の大量発現系の構築
　以下の手順で作業を行なった。
（１）酵母菌由来ＧＣＮ４（２８１アミノ酸）のアミノ酸配列（配列番号１）２４９番目のアルギニンから、２８１番目のアルギニンまでをコードするＤＮＡ（ロイシンジッパー遺伝子）（ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを含む）（配列番号２）（発現されるロイシンジッパーのアミノ酸配列を配列番号３に示す）をプロメガ社のｐＧＥＭ－Ｔベクターに導入し、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いてロイシンジッパーがクローニングされたプラスミドを精製した。ｐＦａｓｔＢａｃに導入したロイシンジッパー遺伝子の塩基配列（制限酵素サイト（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ）、開始Ｍｅｔを含む）を配列番号４に、発現されるロイシンジッパーのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
（２）ｐＧＥＭ－Ｔベクターから、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを用いてロイシンジッパー遺伝子を切り出した。
（３）同様に、ラット由来のＷ－ＭＶＰをクローニングしたｐＦａｓｔＢａｃも制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで処理しておいた。
（４）上記（２）および（３）で得られたロイシンジッパー遺伝子のフラグメントおよびＭＶＰ遺伝子のフラグメントをそれぞれアガロースゲル電気泳動し、目的のバンドを切り出し、Ｑｕｉａｇｅｎ社のＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてゲルから目的物を精製した。
（５）タカラバイオ社のＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ）を用いて、上記（４）で精製した両者をライゲーションさせた（ライゲーション後の塩基配列を配列番号６、発現されるロイシンジッパー、ＭＶＰのアミノ酸配列を配列番号７、８に示す）。
（６）以下、上述したＷ－ＭＶＰをクローニングした組換えバキュロウィルスゲノムの調製（手順（１）－（１１））、ならびに、Ｗ－ＭＶＰをクローニングした組換えバキュロウィルスの増殖（手順（１）－（２０））と同じ操作を行ない、ＬＺ－ＭＶＰをクローニングした組換えバキュロウィルスを増殖し、ウィルス液（Ｐ４）を作成した。

　〔３〕ＬＺ－ＭＶＰのロイシンジッパーとＭＶＰの間へのグリシンリンカーの挿入
　上記構築した発現系では、ロイシンジッパー遺伝子とＭＶＰ遺伝子の間にＥｃｏＲＩのサイト（ＧＡＡＴＴＣ）が残り、ボルト粒子の形成を阻害する可能性があるため、発明者は、これらを最も小さい側鎖を持つアミノ酸（グリシン（Ｇｌｙ））を３残基（Ｇｌｙ３）（アミノ酸配列を配列番号９に示す）または６残基（Ｇｌｙ６）（アミノ酸配列を配列番号１０に示す）つなげたＧｌｙリンカーに置き換えた。
（１）以下の３種のプライマーを作成した（Ｇｌｙをコードする塩基配列はｇｃｃ）。

　・ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（ｌｚｍｖｐ＿０ｇ＿ｆ）
　ａｔｇｇｃａａｃｔｇａａｇａｇｇｃｃａｔ（配列番号１１）
　・ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（ｌｚｍｖｐ_３ｇ_ｆ）
　ｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｔｇｇｃａａｃｔｇａａｇａｇｇｃｃａｔｃａｔｃｃｇｃａｔｃ（配列番号１２）
　・ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（ｌｚｍｖｐ＿３ｇ＿ｒ）
　ＧＣＣＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＴＴＧＧＣＧＡＡＣＧＣｇｇｃｇｇｃｇｇｃ（配列番号１３）
　なお、ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒの相補配列は以下のとおりである。

　ｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｇｔｔｃｇｃｃａａｃｔａａｔｔｔｃｔｔｔａａｔｃｔｇｇｃ（配列番号１４）
（２）Ｇｌｙ３残基のリンカーを挿入する場合は、ｌｚｍｖｐ＿０ｇ＿ｆとｌｚｍｖｐ＿３ｇ＿ｒ、Ｇｌｙ６残基のリンカーを挿入する場合は、ｌｚｍｖｐ＿３ｇ＿ｆとｌｚｍｖｐ＿３ｇ＿ｒをプライマーとして用い、先に作成したＬＺ－ＭＶＰのｐＦａｓｔＢａｃを鋳型として、東洋紡（株）社製のＫＯＤ－ｐｌｕｓ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔを用いてＰＣＲ（９４℃、２分→９８℃、１０秒→６８℃、８分（下線部を１０サイクル））を行なった。
（３）ＰＣＲ後、東洋紡（株）社製のＫＯＤ－ｐｌｕｓ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔに含まれるＤｐｎＩを用いて鋳型プラスミドを消化した。１．５ｍＬチューブ内でＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　５０μＬとＤｐｎＩ　２μＬを混合し、タッピング、スピンダウンした後に３７℃で1時間インキュベートした。
（４）１．５ｍＬチューブ内で上記（３）の反応液を２μＬ、滅菌水を７μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈを５μＬ、Ｔ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅを１μＬ、ここに記した順番に加え、タッピング、スピンダウンした後に１６℃で1時間イン
キュベートした。
（５）大腸菌ＤＨ５α　５０μＬに上記（４）の反応液を５μＬ加え、氷上で３０分静置した。
（６）４２℃で４５秒、ヒートショックを行なった。
（７）氷上で２分間静置した。
（８）ＳＯＣ培地４５０μＬを加えて、３７℃で１時間、振盪培養した。
（９）上記（８）の培養液５０μＬをＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）入りのＬＢプレートにまいた。
（１０）３７℃で一晩静置培養した。

　これ以降は、上したＷ－ＭＶＰをクローニングした組換えバキュロウィルスゲノムの調製の手順（２）－（２０）と同様の作業を行ない、ロイシンジッパーとＭＶＰの間にＧｌｙリンカーを導入したＬＺＭＶＰ（ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６）のウィルス液（Ｐ４）を作成した。

　〔４〕ボルト（Ｗ－ボルト、ＬＺ－ボルト）の精製
（１）３Ｌのスピナーフラスコで５００ｍＬのＳｆ９細胞を培養し、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬになったところで、Ｐ４またはＰ３のウィルス液を加えて感染して中３日間培養した。
（２）中３日培養後、培養液を遠心チューブに移して高速遠心分離（４，０００×ｇ、３０ｍｉｎ）で細胞を沈殿させた。
（３）沈殿させた細胞をＰＢＳ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて懸濁し、懸濁液を遠心チューブに移して高速遠心分離（４，０００×ｇ、３０ｍｉｎ）することで細胞を洗浄し、培地成分等を取り除いた。
（４）沈殿として得られた細胞を細胞破砕用Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤・動物細胞用（ナカライテスク（株）社製）２本）１００ｍＬで懸濁し、超音波破砕した（ＴＯＭＹ　ＵＤ－２０１、ＯＵＴＰＵＴ　２、ＤＵＴＹ　６０、２ｍｉｎ×２）。
（５）破砕液を高速遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＨＰ－２６ＸＰ、ＪＡ２５．５０　ｒｏｔｏｒ）を用いて、１４，３００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で高速遠心分離を行なうことにより、細胞破砕カスを沈殿として取り除いた。
（６）上清を超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ４５ＡＴ　ｒｏｔｏｒ）を用いて、４０，０００ｒｐｍ、２時間、４℃で超高速遠心分離を行なうことにより、ボルト画分を沈殿として落とした。
（７）沈殿として得られたボルト画分に精製用Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁した。
（８）上記（７）の溶液に等量のＦｉｃｏｌｌ／Ｓｕｃｒｏｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（９０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、０．０２％　ＮａＮ_３、１４％　Ｆｉｃｏｌｌ－ＰＭ７０、１４％　Ｓｕｃｒｏｓｅ）を加えてよく混合した。
（９）上記（８）の溶液を超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ４５ＡＴ　ｒｏｔｏｒ）を用いて、２５，２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で超高速遠心分離を行ない、不要物を沈殿として落とした。
（１０）上清のボルト画分を精製用Ｂｕｆｆｅｒ　Ａで４倍希釈し、超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ４５ＡＴ　ｒｏｔｏｒ）を用いて、４０，０００ｒｐｍ、２時間、４℃で超高速遠心分離を行ない、ボルト画分を沈殿として落とした。
（１１）沈殿として得られたボルト画分に精製用Ｂｕｆｆｅｒ　Ａを少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁した。
（１２）超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ２８Ｓ　ｒｏｔｏｒ）の遠心チューブにショ糖の密度勾配を作成した。遠心チューブの底から、６０％、５０％、４５％、４０％、３０％、２０％　Ｓｕｃｒｏｓｅをそれぞれ、４ｍＬ、５ｍＬ、５ｍＬ、５ｍＬ、５ｍＬ、５ｍＬ重層した。これを４本作成した。
（１３）上記（１１）の溶液５ｍＬを上記（１２）のショ糖密度勾配の２０％層の上に重層した。
（１４）超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ２８Ｓ　ｒｏｔｏｒ）を用いて、２５，０００ｒｐｍ、１６時間、４℃で超高速遠心分離を行なった。
（１５）ボルトは４０－４５％画分と５０％画分の一部に含まれているので、これをピペットで回収した。４０、４５％画分は全て（５ｍＬずつ）、５０％画分は半分（２．５ｍＬ）を回収した。
（１６）上記（１５）の回収液を精製用Ｂｕｆｆｅｒ　Ａで４倍希釈し、超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ４５ＡＴ　ｒｏｔｏｒ）を用いて、４０，０００ｒｐｍ、２時間、４℃で超高速遠心分離を行なうことにより、ボルト画分を沈殿として落とした。
（１７）沈殿として得られたボルト画分にＢｕｆｆｅｒ　Ａを少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁した。
（１８）上記（１７）のボルト試料を０．２２μｍのフィルターに通し、ゴミ等を取り除いた。
（１９）ゲルろ過用Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＤＴＴ）を２ベッドボリューム流して平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）社製、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－５００、２６／６０）に上記（１８）の試料を２ｍＬアプライし、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで４ｍＬずつ分取した。
（２０）目的のボルト画分は、試料アプライ後１４０～１９０ｍＬ（フラクションＮｏ．３９－４９）あたりに出てくるので、これを回収し、超高速遠心機（Ｈｉｔａｃｈｉ　ＣＰ８０ＷＸ、Ｐ４５ＡＴ　ｒｏｔｏｒ）を用いて、４０，０００ｒｐｍ、２時間、４℃で超高速遠心分離を行なうことにより、ボルト画分を沈殿として落とした。（９０～１１０ｍＬ（フラクションＮｏ．２７－３０）あたりには、ボルトの会合体が出てくるので、これを取り除くことで均一なボルト粒子を得る事ができる）。
（２１）沈殿として得られたボルト画分にＢｕｆｆｅｒ　Ａを少量加え、ダウンスホモジナイザーで懸濁し、これを最終精製標品とした。

　ここで、図６の左側は、破砕（上記手順（９））後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真であり、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３についての上清（レーンＡ）、沈殿（レーンＢ）、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６についての上清（レーンＣ）、沈殿（レーンＤ）をそれぞれ示している。また図６の右側は、ショ糖密度勾配遠心分離（上記手順（１４））後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真であり、左側の群ａがＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３についての結果、右側の群ｂがＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６についての結果をそれぞれ示している。また、図７は、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３について、最終精製標品を示す電子顕微鏡写真である。

　〔５〕精製したボルトのタンパク質定量
（１）ピアス社のＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔを用いて、上述のようにして得られたＷ－ＭＶＰ、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３およびＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６についてのタンパク質定量を行なった。
（２）キットの試薬Ａを５ｍＬ、試薬Ｂを１００μＬ、１５ｍＬチューブに入れて、よく混合した。
（３）上記（２）の混合溶液を１．５ｍＬのエッペンチューブに５００μＬ入れたものを７本用意した。
（４）事前に用意した５つのＢＳＡ標準溶液（１０００、５００、２５０、１２５、６２．５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ２５μＬ取り、上記（３）の１．５ｍＬチューブに入れて、ボルテックスでよく混合した。
（５）定量するボルト溶液（Ｗ－ＭＶＰ、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３またはＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６を含む）を超純水で希釈したものを２種類作った（たとえば、５倍希釈と１０倍希釈、２５倍希釈と５０倍希釈など）。
（６）上記（５）で作製したボルトの希釈溶液２種をそれぞれ、上記（３）の１．５ｍＬチューブに入れて、ボルテックスでよく混合した。
（７）上記（４）と上記（６）の１．５ｍＬチューブを３７℃で３０分間インキュベートした。
（８）分光光度計を用い、上記（７）の５６２ｎｍでの吸光度を測定する（ビュレット反応による還元Ｃｕ（＋）とビシンコニン酸（ＢＣＡ）の配位による比色定量）。
（９）まず、ＢＣＡについて測定結果を、縦軸を吸光度、横軸をＢＳＡ濃度としてプロットし、最小二乗法により近似曲線（標準曲線）を求めた。
（１０）上記（９）の標準曲線から、ボルトの希釈溶液の濃度を求めて、希釈倍率からボルト原液の濃度を求めた。
（１１）ボルト原液の濃度に総液量を乗じ、ボルトの総収量を計算した。
（１２）結果、１Ｌ培養あたり、Ｗ－ボルト（比較例１）は３～５ｍｇであったのに対し、ＬＺ－ボルト（ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ３（実施例１）、ＬＺＭＶＰ＿Ｇｌｙ６（実施例２））では約１０倍を超える７０～８０ｍｇの収量が得られていた。

　今回開示された実施の形態および実験例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

１　人工生体粒子、２　ボルト、３　ＭＶＰ、４　ロイシンジッパー、５　キャップ、６　ショルダー、７　ボディ、８　ウェスト、９　キャップヘリックス、１０　キャップリング、１１　薬剤、１２　抗原、１３　標的細胞、１４　エンドソーム。

Claims

　ボルト（２）のウェスト（８）を構成するＭＶＰ（３）のＮ末端のそれぞれにロイシンジッパー（４）が組み込まれたことを特徴とする、人工生体粒子（１）。
　ＭＶＰ（３）のＮ末端とロイシンジッパー（４）との間にリンカーが介在されている、請求項１に記載の人工生体粒子（１）。
　前記リンカーが、３～６個のグリシンである、請求項２に記載の人工生体粒子（１）。
　ロイシンジッパーが酵母の転写活性化因子ＧＣＮ４由来である、請求項１に記載の人工生体粒子（１）。
　請求項１～４のいずれかに記載の人工生体粒子（１）を製造する方法であって、
　ロイシンジッパー遺伝子をＭＶＰ遺伝子のＮ末端となる側に組み込み、発現させる、人工生体粒子（１）の製造方法。
　ＭＶＰ遺伝子とロイシンジッパー遺伝子とを、制限酵素サイトを介さずに、リンカーをコードする遺伝子で連結させることを特徴とする、請求項５に記載の人工生体粒子（１）の製造方法。