JP2009511024A - 免疫応答を誘導するためのＣ型肝炎ウイルスポリペプチドおよびＦｃフラグメントを含むキメラ抗原 - Google Patents

免疫応答を誘導するためのＣ型肝炎ウイルスポリペプチドおよびＦｃフラグメントを含むキメラ抗原 Download PDF

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Abstract

本明細書では、抗原に対する免疫応答の誘導を目的とする、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原および免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含むキメラ抗原を開示している。宿主免疫系に免疫応答ドメイン（ＨＣＶコア、エンベロープ、または非構造タンパク質フラグメントからのＨＣＶ抗原）および標的結合ドメイン（Ｆｃフラグメント）を提示することにより、免疫応答は高められる。標的結合ドメインを介して、抗原提示細胞は、キメラ抗原を内在化およびプロセッシングすることにより、抗原を提示し、それによって体液性および細胞性免疫応答を誘導する。

Description

本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をターゲッティングおよび活性化することにより、細胞性および体液性免疫応答を誘導するキメラ抗原（例、融合タンパク質）に関するものである。特に、本発明は、１種またはそれ以上の予め選択されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原（複数も可）、および免疫グロブリンフラグメントを含む１種またはそれ以上のキメラ抗原を含むかまたは使用する組成物および方法であって、キメラ抗原が、プロセッシングおよび抗原提示の遂行により細胞性および体液性免疫応答を誘導するＡＰＣ、特に樹状細胞に結合し、それらを活性化し得るものである、組成物および方法について報告している。
世界中で１億７０００万を超える人々が、ＨＣＶの慢性保菌者である［Delwaide et al.（２０００）Rev.Med.Liege ５５：３３７−３４０］。ＨＣＶについては現在利用可能な予防用ワクチンも治療用ワクチンも存在しない。感染経路は血液または他の体液を介するものであり、７０％を超える割合の患者はウイルスの慢性保菌者となる。持続的感染の結果、進行性の肝臓疾患に至り得る慢性活動性肝炎が誘発される［Alter et al.（１９９９）N.Engl.J.Med.３４１：５５６−５６２］。現在のところ、Ｃ型肝炎（ウイルス）感染についての唯一の治療法は、インターフェロン−Ｉ（ＩＦＮ−Ｉ）およびリバビリンである。しかしながら、この治療法は高価であり、かなりの副作用を伴い、効果があるのは選択された患者群の約５０％に過ぎない。宿主免疫応答を高めることにより慢性ＨＣＶ感染を排除する治療用ワクチンは、この疾患の処置における大きな進歩となる。
免疫系は、ＨＣＶ感染がもたらす結果に関して重要な役割を演じる。ＨＣＶに暴露されたほとんどの個体は、ウイルスに対して広範で強い多抗原特異的ＣＤ４＋（調節的）およびＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞応答を展開する。これらの個体は自己限定性感染のみを発症する。しかしながら、ＨＣＶに暴露された個体の中には、弱いか、または検出不可能で焦点の狭い免疫応答の結果、慢性感染に至る場合もある。
ＨＣＶは、ＲＮＡウイルスのフラビウイルス科（flaviviridae）の一員である。ＨＣＶゲノムは、宿主およびウイルスプロテアーゼにより触媒される個々のタンパク質に開裂されることにより、３種の構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）、ｐ７タンパク質および６種の非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）を生じる単一ポリタンパク質をコード化する約９.５Ｋｂのプラスセンス１本鎖ＲＮＡ分子である［Hijikkata et al.（１９９１）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８：５５４７−５５５１］。ＮＳ３タンパク質は、非構造タンパク質のタンパク質分解的プロセッシングに関与するウイルス性セリンプロテアーゼである［Bartenschlager et al.（１９９３）J.Virol. ６７；３８３５−３８４４］。
ウイルスが宿主免疫組織を回避する機構は、明確には確立されていない［Shoukry et al.（２００４）Ann.Rev.Microbiol.５８：３９１−４２４］。幾つかのＨＣＶタンパク質が、免疫回避機構に関与している。これらには、ＩＦＮ−誘導抗ウイルス応答を阻害するＩＬ−８の産生を誘導し［Polyak et al.（２００１）J.Virol. ７５：６０９５−６１０６］、細胞性ＩＦＮ−γ−誘導ＰＫＲプロテインキナーゼを阻害、すなわち抗ウイルス性免疫応答を阻害する［Tan et al.（２００１）Virol.２８４：１−１２］ことが示唆されているＮＳ５Ａ、ＤＣ分化を阻害する［Dolganiuc et al.（２００３）J.Immunol. １７０：５６１５−５６２４］ことが示唆されているコアおよびＮＳ３；ＤＣ成熟の調節および最終的にはヘルプメモリーＴ細胞の欠乏［Shoji et al.（１９９９）Virology ２５４：３１５−３２３］によりＴ細胞応答を調節することが示唆されているコアおよびＥ１［Sarobe et al.（２００２）J.Virol. ７７：１０８６２−１０８７１；および Grakoui et al.（２００３）Science ３０２：６５９−６６２］がある。
本発明は、免疫応答誘発における初期段階の一つである、ＡＰＣをターゲッティングおよび活性化する組成物および方法に関するものである。本発明組成物は、標的結合ドメイン（ＴＢＤ）、例えば抗体フラグメント部分に結合された、免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）、例えば組換えタンパク質を含む新規クラスの分子（以後、「キメラ抗原」と称す）を包含する。さらに具体的には、キメラ抗原は、ウイルス抗原、例えばＣ型肝炎コア、エンベロープタンパク質、例えばＥ１およびＥ２、または非構造タンパク質を免疫グロブリンフラグメント、例えばマウス免疫グロブリンＧＦｃフラグメントにカップリングする分子である。実施態様によっては、抗体フラグメントが異種抗体フラグメントの場合もある。
本発明の組成物および方法は、ＡＰＣのターゲッティングおよび活性化に有用である。本発明の組成物および方法は、ＨＣＶに関連するウイルス抗原に対して細胞性および／または体液性宿主免疫応答を誘導するのに有用である。本発明は、慢性ＨＣＶ感染処置用の治療的ワクチンおよびＨＣＶ感染防止用の予防的ワクチンを包含する。
本発明の一つまたはそれ以上の態様は、ＨＣＶに対して免疫応答を開始させるのに適切な１種またはそれ以上のキメラ抗原を含む。これらの本発明実施態様では、選択されたＨＣＶ抗原を抗体のフラグメントに結合させる。生じたキメラ抗原は、ＡＰＣ、例えば樹状細胞をターゲッティングおよび活性化し得る。
本発明はまた、融合タンパク質をコード化するＤＮＡ構築物をクローニングし、異種発現系で融合タンパク質を製造する方法も包含する。好ましい本発明実施態様において、クローニングおよび製造方法では、限定されるわけではないが、発現された融合タンパク質のグリコシル化（例、マンノシル化）を含む特有な翻訳後修飾を導入する。
有効な抗原提示を誘導するために、本発明者らは、新規ウイルス抗原−マウスモノクローナル抗体Ｆｃフラグメント融合タンパク質を開発した。この分子は、Ｆｃフラグメントをもつため、特異的受容体を介してＡＰＣ（例、樹状細胞）により高い効率で認識され、融合タンパク質はプロセッシングされ、ウイルス抗原からのペプチドエピトープは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩとの複合体として提示される。このプロセッシングおよび抗原提示の結果、細胞傷害性Ｔリンパ球による応答はアップレギュレーションされ、ウイルス感染細胞集団は排除される。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子により抗原が提示され、ヘルパーＴ細胞が活性化されるため、体液性応答がウイルス抗原に対して誘導され得、ウイルス感染の阻止および／または排除を助けることになる。
分子のキメラ性によって、適切な抗原提示細胞（例、樹状細胞）への抗原のターゲッティングを促進させることから、ＡＰＣ受容体を特異的にターゲッティングすることによる慢性感染症の独特な治療方法となる。これは、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を処置するための治療的ワクチンの開発に有用である。
これらのキメラ融合タンパク質の投与により、細胞性および体液性の両応答を含む、宿主からの広範な免疫応答が誘発され得る。すなわち、それらを治療用ワクチンとして使用することにより、ＨＣＶ感染に対して免疫寛容性を示す対象を処置し得る。
さらに具体的には、本発明は、免疫応答を誘発し、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含むキメラ抗原であって、免疫応答ドメインがＣ型肝炎（ＨＣＶ）抗原を含み、標的結合ドメインが抗体フラグメントを含むキメラ抗原を特徴とする。抗体フラグメントは、異種抗体フラグメントであり得る。キメラ抗原は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発し得る。さらに、キメラ抗原は、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答またはＴｈ１およびＴｈ２の両免疫応答を誘発し得る。免疫応答は、生体内または生体外免疫応答であり得る。免疫応答ドメインは、複数のタンパク質を含み得る。例えばそれは、例えばＨＣＶコア（１〜１９１）タンパク質、ＨＣＶコア（１〜１７７）タンパク質、ＨＣＶ ｐ７タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質、またはＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質を含む１種またはそれ以上のタンパク質の１つまたはそれ以上の免疫原性部分を含み得る。標的結合ドメインは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合することが可能である。抗体フラグメントは、Ｆｃフラグメントであり得る。キメラ抗原は、さらに６ｘＨｉｓ標識、プロテアーゼ開裂部位、および免疫応答ドメインと標的結合ドメインを結合するリンカーのうちの一つまたはそれ以上を含み得る。リンカーは、ロイシンジッパー、アビジンに結合されたビオチン、および共有結合的ペプチド結合から選択され得る。さらに、キメラ抗原は、グリコシル化、例えばマンノースグリコシル化され得る。抗体フラグメントは、免疫グロブリン重鎖フラグメントを含み得、免疫グロブリン重鎖フラグメントは、ヒンジ領域を含み得る。さらに、免疫グロブリン重鎖フラグメントは、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインから成る群から選択される抗体フラグメントの全部または一部分を含み得る。
本発明の別の態様は、抗原提示細胞への抗原の送達方法であって、本明細書に開示されたキメラ抗原のいずれかを抗原提示細胞に投与することを含む方法である。抗原提示細胞は、樹状細胞であり得る。
本発明はまた、抗原提示細胞の活性化方法を提供する。本方法は、抗原提示細胞を本明細書で開示されているキメラ抗原のいずれかと接触させることを含み得る。この接触は、エクスビボまたはインビボで行われ得る。それは、例えばヒトで行われ得る。本方法は、本発明キメラ抗原のいずれかを含む組成物を対象に投与することを含み得、この場合抗原提示細胞は対象内に存するものとする。接触は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発し得る。細胞性免疫応答は、Ｔｈ１応答、Ｔｈ２応答、およびＣＴＬ応答の一つまたはそれ以上であり得る。対象は、免疫治療可能な状態を有するか、または有すると思われ得る。免疫治療可能な状態は、急性感染（例、急性ウイルス感染）であり得るか、またはそれは慢性感染（例、慢性ウイルス感染）であり得る。慢性感染は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染であり得る。免疫治療可能な状態は、Ｃ型肝炎ウイルス感染であり得、免疫応答ドメインは、ＨＣＶコア（１〜１９１）タンパク質、ＨＣＶコア（１〜１７７）タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｐ７タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質、およびＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質から成る群から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上の抗原性部分を含み得る。本方法を用いることにより、対象はウイルス感染に対してワクチン接種され得、例えばウイルス感染に対して予防的にワクチン接種されるかまたは既存のウイルス感染に対して治療的にワクチン接種され得る。
本発明の別の態様は、キメラ抗原の製造方法である。上記方法は、（ａ）微生物または細胞、特にキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む微生物または細胞を準備し、次いで（ｂ）キメラ抗原を発現させる条件下で微生物または細胞を培養することを含み得る。微生物または細胞は、真核生物の微生物または細胞であり得る。細胞は、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞であり得る。さらに、キメラ抗原は、グリコシル化を含むように翻訳後修飾され得、例えば、それはマンノースグリコシル化を含むように翻訳後修飾され得る。
本発明のさらに別の態様は、キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドであって、免疫応答ドメインをコード化する第１ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメイン、具体的には抗体フラグメントを含む標的結合ドメインをコード化する第２ポリヌクレオチド部分を含むポリヌクレオチドである。抗体フラグメントは、異種抗体フラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号３９および４１〜５１に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは、配列番号４０および５２〜６２に示されたアミノ酸配列から成る群から選択される全アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるキメラ抗原をコードし得る。ポリヌクレオチドは、配列番号３９および４１〜５１に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイゼーションし得る。本発明はまた、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター、例えばポリヌクレオチドが転写調節エレメント（ＴＲＥ）に機能し得るように結合されたベクターを提供する。さらに、本発明は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれかを含む微生物または細胞を包含する。
本発明の別の態様は、本明細書で開示されたキメラ抗原のいずれかおよびそれを必要とする対象へのキメラ抗原投与に関する指示書を含み得る製品である。
本発明のさらに別の態様は、本明細書で開示されたキメラ抗原のいずれかおよび医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
さらに、本発明は、キメラ抗原の別の製造方法を提供する。本方法は、（ａ）微生物または細胞、特に標的結合ドメイン−リンカー分子をコード化するポリヌクレオチドを含み、その標的結合ドメイン−リンカー分子がリンカー分子に結合された標的結合ドメインを含んでいる微生物または細胞を準備し、（ｂ）標的結合ドメイン−リンカー分子が発現される条件下で微生物または細胞を培養し、次いで（ｃ）免疫応答ドメインへリンカーを結合させ得、その結合によりキメラ抗原を生じさせる条件下で標的結合ドメイン−リンカー分子および免疫応答ドメインを接触させることを含み得る。微生物または細胞、ポリヌクレオチド、標的結合ドメイン、リンカー分子、および免疫応答ドメインは、本明細書に開示されたもののいずれかであり得る。
特に断らなければ、本明細書で使用している技術的および科学的用語は全て、本発明が属する業界において通常レベルで一般的に理解されているのと同じ意味を有するものとする。対立する場合、定義を含む本文書で統制する。好ましい方法および材料を下記に示しているが、本明細書記載のものと類似または均等内容の方法および材料でも、本発明を実践または試験する際に使用され得る。本明細書で挙げた出版物、特許出願、特許および他の参考文献については全て、出典明示で援用する。本明細書で開示されている材料、方法、および例は、説明を目的としているのに過ぎず、限定を意図したものではない。
本発明の他の特徴および利点、例えば免疫治療可能な状態を処置または予防するためのキメラ抗原は、以下の記載、図面および請求の範囲から容易に想到できるものである。
図１は、Chimigen（キミゲン） ３ワクチンの２量体化形態の概略図である。それは、２つのサブユニットを含み、各々免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）および標的結合ドメイン（ＴＢＤ）により構成される。
図２ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦ（読み枠）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。
図３ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号３９）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。図３Ａおよび図３Ｂの下線を付した太字の位置には、保存された自然突然変異（ＴＴＣ（Ｐｈｅ）〜ＴＴＴ（Ｐｈｅ））がある。
ヌクレオチド配列では：
ヌクレオチド１〜３： 出発コドン
ヌクレオチド１３〜３０： ６ＸＨｉｓエピトープ標識
ヌクレオチド９１〜１４３１： ＨＣＶ ＮＳ５Ａ
ヌクレオチド１４３２〜１４６１： リンカーペプチド
ヌクレオチド１４６２〜２１５７： ＴＢＤ
ヌクレオチド２１５８〜２１８７： 末端ペプチド
ヌクレオチド２１８８〜２１９０： 停止コドン
ヌクレオチド１６３９〜１６４１： ＴＢＤ ＴＴＣ−ＴＴＴ保存突然変異
アミノ酸配列では：
アミノ酸５〜１０： ６ｘＨｉｓエピトープ標識
アミノ酸３１〜４７７： ＨＣＶ ＮＳ５Ａ
アミノ酸４７８〜４８７： リンカーペプチド
アミノ酸４８８〜７１９： ＴＢＤ
アミノ酸７２０〜７２９： 末端ペプチド
図４ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５２）を示す図である。図４Ａおよび図４Ｂの下線を付した太字の位置には、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））および保存自然突然変異（ＴＴＣ（Ｐｈｅ）〜ＴＴＴ（Ｐｈｅ））がある。
ヌクレオチド配列では：
ヌクレオチド１〜３： 出発コドン
ヌクレオチド１〜７２： ｇｐ６４シグナルペプチド
ヌクレオチド９７〜１１４： ６ＸＨｉｓエピトープ標識
ヌクレオチド１７５〜１５１５： ＨＣＶ ＮＳ５Ａ
ヌクレオチド１５１６〜１５４５： リンカーペプチド
ヌクレオチド１５４６〜２２４１： ＴＢＤ
ヌクレオチド２２４２〜２２７１： 末端ペプチド
ヌクレオチド２２７２〜２２７４： 停止コドン
ヌクレオチド６１〜６３： シグナルペプチドＧＡＴ〜ＴＡＴ人工的突然変異
ヌクレオチド１７２５： ＴＢＤ ＴＴＣ−ＴＴＴ保存突然変異
アミノ酸配列では：
アミノ酸１〜２４： ｇｐ６４分泌シグナル
アミノ酸３３〜３８： ６ｘＨｉｓエピトープ標識
アミノ酸５９〜５０５： ＨＣＶ ＮＳ５Ａ
アミノ酸５０６〜５１５： リンカーペプチド
アミノ酸５１６〜７４７： ＴＢＤ
アミノ酸７４８〜７５７： 末端ペプチド
アミノ酸２１： シグナルペプチドＤ〜Ｙ人工的突然変異
図５ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＰＳＣ１２−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４２）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。
図６ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５４）を示す図である。下線を引いた図６Ａのコドンおよび図６Ｂのアミノ酸により２つの突然変異が示されている。図６Ａの上流から下流および図６ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異および自然ＣＣＡ（Ｐｒｏ）〜ＧＧＡ（Ｇｌｙ）突然変異である。
図７ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４４）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５５）を示す図である。下線を引いた太字の図７Ａのコドンおよび図７Ｂのアミノ酸により２つの突然変異が示されている。図７Ａの上流から下流および図７ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、自然保存ＡＧＧ（Ａｒｇ）〜ＣＧＧ（Ａｒｇ）突然変異および遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異である。
ヌクレオチド配列では：
ヌクレオチド１〜３： 出発コドン
ヌクレオチド１３〜３０： ６ＸＨｉｓエピトープ標識
ヌクレオチド９１〜１９６５： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ
ヌクレオチド１９６６〜１９９５： リンカーペプチド
ヌクレオチド１９９６〜２６９１： ＴＢＤ
ヌクレオチド２６９２〜２７２１： 末端ペプチド
ヌクレオチド２７２２〜２７２４： 停止コドン
ヌクレオチド１４６２〜１４６４： ＮＳ３ｍｕｔ ＡＧＧ〜ＣＧＧ自然突然変異
ヌクレオチド１４７４〜１４７６： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＧＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異
アミノ酸配列では：
アミノ酸５〜１０： ６ｘＨｉｓエピトープ標識
アミノ酸３１〜６５５： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ
アミノ酸６５６〜６６５： リンカーペプチド
アミノ酸６６６〜８９７： ＴＢＤ
アミノ酸８９８〜９０７： 末端ペプチド
アミノ酸４８８： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ｒ自然突然変異
アミノ酸４９２： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ａ遺伝子操作突然変異
図８ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５６）を示す図である。強調した図８Ａのコドンおよび図８Ｂのアミノ酸により３つの突然変異が示されている。図８Ａの上流から下流および図８ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））、自然保存ＡＧＧ（Ａｒｇ）〜ＣＧＧ（Ａｒｇ）突然変異および遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異である。
ヌクレオチド配列では：
ヌクレオチド１〜３： 出発コドン
ヌクレオチド１〜７２： ｇｐ６４シグナルペプチド
ヌクレオチド９７〜１１４： ６ＸＨｉｓエピトープ標識
ヌクレオチド１７５〜２０４９： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ
ヌクレオチド２０５０〜２０７９： リンカーペプチド
ヌクレオチド２０８０〜２７７５： ＴＢＤ
ヌクレオチド２７７６〜２８０５： 末端ペプチド
ヌクレオチド２８０６〜２８０８： 停止コドン
ヌクレオチド６１〜６３： シグナルペプチドＧＡＴ〜ＴＡＴ人工的突然変異
ヌクレオチド１５４６〜１５４８： ＮＳ３ｍｕｔ ＡＧＧ〜ＣＧＧ保存突然変異
ヌクレオチド１５５８〜１５６０： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＧＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異
アミノ酸配列では：
アミノ酸１〜２４： ｇｐ６４分泌シグナル
アミノ酸３３〜３８： ６ｘＨｉｓエピトープ標識
アミノ酸５９〜６８３： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ
アミノ酸６８４〜６９３： リンカーペプチド
アミノ酸６９４〜９２５： ＴＢＤ
アミノ酸９２６〜９３５： 末端ペプチド
アミノ酸２１： シグナルペプチドＤ〜Ｙ人工的突然変異
アミノ酸５２０： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ａ遺伝子操作突然変異
図９ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４６）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５７）を示す図である。下線を引いた太字の図９Ａのコドンおよび図９Ｂのアミノ酸により４つの突然変異が示されている。図９Ａの上流から下流および図９ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））、遺伝子操作されたＴＣＧ（Ｓｅｒ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、および自然ＣＣＡ（Ｐｒｏ）〜ＧＧＡ（Ｇｌｙ）突然変異である。
図１０ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５８）を示す図である。下線を引いた図１０Ａのコドンおよび図１０Ｂのアミノ酸により４つの突然変異が示されている。図１０Ａの上流から下流および図１０ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））、遺伝子操作されたＴＣＧ（Ｓｅｒ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、および自然ＣＣＡ（Ｐｒｏ）〜ＧＧＡ（Ｇｌｙ）突然変異である。
ヌクレオチド配列では：
ヌクレオチド１〜３： 出発コドン
ヌクレオチド１〜７２： ｇｐ６４シグナルペプチド
ヌクレオチド９７〜１１４： ６ＸＨｉｓエピトープ標識
ヌクレオチド１７５〜２０４９： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ
ヌクレオチド２０５０〜２０５８： リンカーペプチド
ヌクレオチド２０５９〜３４０２： ＨＣＶ ＮＳ５Ａ
ヌクレオチド３４０３〜３４２６： リンカーペプチド
ヌクレオチド３４２７〜４１２２： ＴＢＤ
ヌクレオチド４１２３〜４１５２： 末端ペプチド
ヌクレオチド４１５３〜４１５５： 停止コドン
ヌクレオチド６１〜６３： シグナルペプチドＧＡＴ〜ＴＡＴ人工的突然変異
ヌクレオチド５８９： ＮＳ３ｍｕｔ ＴＣＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異
ヌクレオチド１５５８〜１５５９： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＧＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異ヌクレオチド２０５０〜２０５２： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＣＡ〜ＧＧＡ自然突然変異
アミノ酸配列では：
アミノ酸１〜２４： ｇｐ６４分泌シグナル
アミノ酸３３〜３８： ６ｘＨｉｓエピトープ標識
アミノ酸５９〜６８３： ＨＣＶ ＮＳ３
アミノ酸６８４〜６８６： リンカーペプチド
アミノ酸６８７〜１１３４： ＨＣＶ ＮＳ５Ａ
アミノ酸１１３５〜１３７４： ＴＢＤ
アミノ酸１３７５〜１３８４： 末端ペプチド
アミノ酸２１： シグナルペプチドＤ〜Ｙ人工的突然変異
アミノ酸１９７： ＮＳ３ｍｕｔ Ｓ〜Ａ遺伝子操作突然変異
アミノ酸５２０： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ａ遺伝子操作突然変異
アミノ酸６８４： ＮＳ３ｍｕｔ Ｐ〜Ｇ自然突然変異
図１１ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４８）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５９）を示す図である。
図１２ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号６０）を示す図である。
図１３ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ Ｅ２−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号５０）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号６１）を示す図である。
図１４ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号６２）を示す図である。
図１５は、異なる３濃度での、未成熟ＤＣへのＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の結合を示す一連の蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）プロフィールである。
図１６は、ＣＤ３２およびＣＤ２０６に特異的な抗体による未成熟ＤＣへのＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。
図１７は、実施例記載の要領で製造された成熟ＤＣによる示された細胞表面抗原マーカーの発現を示す一連の棒グラフである。データは、ＦＦＣにより得られたもので、「陽性細胞パーセント（％）」（上のグラフ）および「平均蛍光強度」（「ＭＦＩ」）（下のグラフ）として示されている。
図１８Ａ〜Ｂは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣの４日目培養物におけるＣＤ６９発現Ｔ細胞（図１８Ａ）、ＣＤ６９発現ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１８Ｂ）、およびＣＤ６９発現ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１８Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。
図１９Ａ〜Ｃは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣの４日目培養物におけるＣＦＳＥｌｏ Ｔ細胞（図１９Ａ）、ＣＦＳＥｌｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１９Ｂ）、およびＣＦＳＥｌｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１９Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。
図２０Ａ〜Ｃは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣまたはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；図２０Ａ中）の７日目培養物におけるＣＤ６９発現Ｔ細胞（図２０Ａ）、ＣＤ６９発現ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２０Ｂ）、およびＣＤ６９発現ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２０Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。
図２１Ａ〜Ｃは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣまたはＰＨＡ（図２１Ａ中）の７日目培養物におけるＣＦＳＥｌｏ Ｔ細胞（図２１Ａ）、ＣＦＳＥｌｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２１Ｂ）、およびＣＦＳＥｌｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２１Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。
図２２は、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣまたはＰＨＡの７日目培養物における芽細胞であるＴ細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。
図２３は、示された細胞表面マーカーの成熟抗原付加ＤＣの発現を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。
図２４は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の芽細胞であるＴ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データは（ＦＦＣ）により得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図２５は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内インターフェロン−Ｋ（ＩＦＮ−Ｋ）含有Ｔ細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。ＰＭＡ：ホルボールミルスチン酸；ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）。
図２６は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図２７は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図２８は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内腫瘍壊死因子−Ｉ（ＴＮＦ−Ｉ）含有Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質；ＰＭＡ：ホルボールミルスチン酸；ＤＰＢＳ。
図２９は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＴＮＦ−Ｉ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図３０は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の顆粒タンパク質ＧｒＢ（左グラフ）およびＰｆｎ（右グラフ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図３１は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のリンパ球（Ｒ１ゲート細胞）の総数および芽細胞の比率を示す一対の棒グラフである。細胞を最終刺激の６日後に分析した。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図３２は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の６日後に細胞を分析した。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図３３は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のＥＢＶペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体（陽性対照）または対照四量体（陰性四量体）と結合した抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の６日後に３つの各培養ウェルからの細胞（試験および対照群における３本の棒線に対応）を分析した。データはＦＦＣにより得られた。
図３４は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激（異なる数のＴ細胞およびＤＣを使用）後のＮＳ５Ａペプチド／ＨＬＡ−Ａ２五量体と結合したＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の６日後に３つの各培養ウェルからの細胞（試験および対照群における３本の棒線に対応）を分析した。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。
図３５は、２種の異なる濃度での、未成熟ＤＣへのＮＳ３ Chimigen３タンパク質の結合を示す一連のＦＦＣプロフィールである。
図３６は、ＣＤ３２およびＣＤ２０６に特異的な抗体による未成熟ＤＣへのＮＳ３ Chimigen３タンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。
図３７は、ＮＳ３ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣを含む４日目（上のグラフ）および７日目培養物におけるＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図３８は、ＮＳ３ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣを含む４日目（上のグラフ）および７日目培養物におけるＣＦＳＥｌｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＦＳＥｌｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図３９は、実施例においてＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質について記載した要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の芽細胞であるＴ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。２種の異なるＴ細胞濃度および２種の異なるＤＣ濃度を用いて刺激を行った。データはＦＣにより得られた。３Ｃ：ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４０は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有Ｔ細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４１は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４２は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＴＮＦ−Ｉ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４３は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の顆粒タンパク質ＧｒＢ（左グラフ）およびＰｆｎ（右グラフ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４４は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の相対比率を示す一対のグラフである。最終刺激の６日後に細胞を分析した。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４５は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のリンパ球（Ｒ１ゲート細胞）の総数（左グラフ）および芽細胞の比率（右グラフ）を示す一対の棒グラフである。細胞を最終刺激の６日後に分析した。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ、ＡＳ６０−１： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４６は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激（異なる数のＴ細胞およびＤＣを使用）後のＮＳ３ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２五量体と結合したＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の５日後に３つの各培養ウェルからの細胞（試験群および対照群の両方における３本の棒線に対応）を分析した。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。
図４７は、３種の異なる濃度での、未成熟ＤＣへのＨＣＶコアChimigen３タンパク質の結合を示す一連の蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）プロフィールである。
図４８は、ＣＤ３２およびＣＤ２０６に特異的な抗体、マンノシル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、およびマウスＩｇＧフラグメントによる未成熟ＤＣへのＨＣＶ Chimigen３コアタンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。
図４９は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。ＨＣＶコア−ＴＢＤ： ＨＣＶコア Chimigen３タンパク質。
図５０は、ＨＣＶコアChimigen３タンパク質（ＨＣＶコア−ＴＢＤ）（右ドットプロット）またはＴＢＤ単独（ＴＢＤ）（左ドットプロット）を付加したＤＣによる３回刺激後のＨＣＶコアペプチド／ＨＬＡ−Ｂ７四量体と結合したＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の二次元ＦＦＣドットプロットである。
Ａ．概観
本明細書では、抗原に対して免疫応答を誘導する組成物および方法を開示している。具体的実施態様では、本化合物および方法が、「自己」抗原として宿主により他で認識される抗原に対して免疫応答を誘導する。免疫応答は、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、すなわち抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を宿主免疫系に提示することにより増強される。標的結合ドメインにより、ＡＰＣは、内在化し、プロセッシングし、キメラ抗原を提示することにより、体液性および細胞性の両免疫応答を引き起こす。
ＨＣＶは、ヒトに感染して急性および慢性肝炎を誘発し得るフラビウイルス科（flaviviridae）の一員であり、肝細胞癌を誘発し得る［Hoofnagle（２００２）Hepatology ３６：Ｓ２１−Ｓ２９］。ＨＣＶゲノムは、９.６Ｋｂの非キャップ正極性１本鎖ＲＮＡ分子であり、複製はマイナス鎖中間体を介して行われる［Lindenbachおよび Rice（２００５）Nature４３６：９３３−９３８］。ＨＣＶゲノムはポリタンパク質をコード化する単一読み枠をコードし、これがプロセッシングされることによりコアまたはキャプシドタンパク質（Ｃ）、２種のエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１およびＥ２）、小疎水性タンパク質（ｐ７）、および６種の非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）を生じる。個々のタンパク質へのポリタンパク質のプロセッシングは、宿主およびウイルスプロテアーゼにより触媒される［Lohmann et al.（１９９６）J.Hepatol.２４：１１−１９、Penin et al.（２００４）J.Hepatol.２４：１１−１９］。
健康な宿主（ヒトまたは動物）が外来抗原（例えば細菌、ウイルスおよび／または寄生体由来のタンパク質）と遭遇したとき、宿主は通常免疫応答を開始する。適応免疫応答は、体液性、細胞性またはその両方であり得る［Whitton et al.（２００４）Adv.Virus Res.６３：１８１−２３８］。細胞性応答は、抗原を含む細胞を直接排除し得る特異的Ｔヘルパー細胞およびＴリンパ球（ＣＴＬ）の選択および拡大を特徴とする。体液性応答の場合、抗体はＢ細胞により産生され、抗原性刺激因子に応答して血液および／またはリンパへ分泌される。抗体は、表面のエピトープと特異的に結合することにより抗原（例、ウイルス）を中和し、それに印を付けて食細胞および／または補体介在機構により破壊させ、感染細胞を溶解する［Carroll（２００５）Nature Immunol.５：９８１−９８６］。ヘルパー細胞（主としてＣＤ４ Ｔ細胞）は、ＣＴＬ（主としてＣＤ８ Ｔ細胞）およびＢ細胞抗体応答の両方に要求されるヘルパー活性を提供する。
慢性ウイルス感染を伴う個体では、免疫系は入ってくる病原体に対して応答しないため、適応免疫応答を発生して感染を排除することもなく、したがって宿主は病原体に対して寛容となる。ＨＣＶが免疫監視をくぐり抜けるのに用いる機構は完全に解明されているわけではないが、幾つかの可能性が示唆されている。これらの可能性には、ＮＳ３−４Ａ、Ｅ２およびＮＳ５Ａ配列によるＩ型ＩＦＮのＩＲＦ３−仲介誘導の遮断、ＰＫＲ（２本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）の遮断およびＮＫ細胞の機能をもつＨＣＶタンパク質の干渉がある［Rehermann et al.（２００５）Nature Rev.Immunol.５：２１５−２２９］。また最近の結果は、ＨＣＶ感染の制御および根絶におけるＴ細胞の中枢的役割を示している［Bowen et al.（２００５）Nature ４３６：９４６−９５２；Wieland et al.（２００５）J.Virol. ７９：９３６９−９３８０］。急性ＨＣＶ感染の場合、ウイルス特異的抗体はＨＣＶ感染の７〜８週間後に検出されたが［Pawlotsky（１９９９）J.Hepatol.３１（補遺）：７１−７９］、ＨＣＶ感染がチンパンジーにおいて抗ＨＣＶ抗体の非存在下でも消散され得［Cooper et al.（１９９９）Immunity１０：４３９−４４９］、ヒトではセロコンバージョンが起こらないこと［Post et al.（２００４）J.Infect.Dis.１８９：１８４６−１８５５］が示されたため、抗体の役割は明らかではない。さらに、最近の証拠は、ＨＣＶに対して検出可能なレベルのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じ得ない場合、その個体は慢性感染となることを示唆している［Cooper et al.（１９９９）前出、Thimme et al.（２００１）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９９：１５６６１−１５６６８；Thimme et al.（２００２）J.Exp.Med.１９４：１３９５−１４０６；Shoukry et al.（２００３）J.Exp.Med.１９７：１６４５−１６５５］。免疫機能の相互作用、例えばウイルス複製中に生成された２本鎖ＲＮＡに対するＩ型ＩＦＮ応答および免疫応答における転写変化が起こることは示唆されているが、ウイルス感染の浄化におけるこの効果に関する直接的証拠は観察されなかった［Rehermann et al.（２００５）前出］。ＨＣＶ感染を消散している患者では、免疫系が強いマルチ−エピトープ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じることが観察され［Rehermann et al.（２００５）前出］、慢性ＨＣＶ感染患者では、Ｔ細胞応答が遅く、一時的であるか、または焦点が狭かった［Thimme et al.（２００１）前出、Diepolder et al.（１９９５）Lancet ３６：１００６−１００７；Lechner et al.（２０００）J.Exp.Med.１９１：１４９９−１５２２］。
ＨＣＶ抗原に対する力強いＴ細胞応答が欠如すると、慢性的感染に至ることになるが、これはまた、宿主免疫系への適切なウイルス抗原の適正な提示を欠くことに起因し得る。ウイルス排除における成果は、抗原がＡＰＣによりプロセッシングおよび提示される方法および調節Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の関与によりもたらされる。
抗原提示プロセスを主として担うのは樹状細胞（ＤＣ）であり、この細胞は抗原を捕獲し、プロセッシングする。さらに、ＤＣはリンパ球共刺激分子を発現し、リンパ性器官に移動し、そこでサイトカインを分泌することにより免疫応答を開始させる。ＤＣはまた、免疫性の伝達物質であるＢおよびＴリンパ球の増殖を制御する［Steinman et al.（１９９９）Hum.Immunol.６０：５６２−５６７］。ＣＴＬ応答の発生は、ウイルス感染細胞の排除、したがって感染の消散にとって不可欠である。
ＡＰＣは、抗原に遭遇すると、その局在性によって異なる形で抗原をプロセッシングする［Steinman et al.（１９９９）前出］。外因性抗原は、ＡＰＣのエンドソーム内でプロセッシングされ、生成されたペプチドフラグメントは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子と複合体を形成した細胞の表面で提示される。ＣＤ４＋Ｔ細胞へのこの複合体の提示により、それらが活性化される。その結果、ヘルパーＴ細胞により分泌されるサイトカインは、Ｂ細胞の活性化に要求される可溶性因子を提供することにより、外因性抗原に対して抗体を産生させる（体液性応答）。
逆に、細胞内抗原はプロテアソームでプロセッシングされ、生じたペプチドフラグメントは、ＡＰＣの表面でＭＨＣクラスＩ分子との複合体として提示される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）へのこの複合体の結合後、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示が行われ、ＣＴＬ免疫応答を誘発する。ＣＴＬは、感染細胞を殺し、ウイルス複製を阻害すべく作用する、例えばサイトカインインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）といった因子の産生によりウイルスを排除し得る。
ウイルスが慢性ウイルス感染を有する個体で活発に複製しているとき、ウイルス抗原は宿主細胞内で産生され、分泌された抗原は循環系に存在する。これらの抗原の存在にもかかわらず、ウイルスに対する有効な免疫応答は欠如している。有効な免疫応答は、高い親和力でウイルスエピトープの広範なアレイを認識し得る、ＣＴＬの産生を必然的に伴う。すなわち、ウイルス抗原を含む適切な治療用ワクチンは、ウイルスペプチドをＭＨＣクラスＩ分子のグルーブで提示させるために適切な細胞区画で内在化およびプロセッシングされなければならない。クラスＩ提示の状況でウイルスエピトープが認識されると、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化され、産生され、ウイルス感染に対して有効な応答を開始させることが可能な機能的ＣＴＬに分化され得る。
すなわち、ウイルス抗原を含む治療用ワクチンは、それがプロテアソーム経路を通してプロセッシングされ、ＭＨＣクラスＩを介して提示される場合には有効である［Larsson et al.（２００１）Trends Immunol.２２：１４１−１４８］。これは、抗原を宿主細胞内で産生させることにより、または望ましい細胞性応答を誘導する形で抗原がプロセッシングおよび提示されるように適切な細胞区画へ送達することにより達成され得る。幾つかの方法が、ウイルスベクター［Lorenz et al.（２００１)Hum.Gene Ther.１０：１０９５−１１０３］を含む、抗原の細胞内送達、ＤＮＡトランスフェクション細胞の使用［Donnelly at al.（２００１）Annu.Rev.Immunol.１５：６１７−６４８］、および注入されたＤＮＡベクターによる抗原の発現［Lai et al.（１９９８）Crit.Rev.Immunol.１８：４４９−４８４］に関する文献で報告されている。
単球から誘導されるＤＣは、それらのＡＰＣ機能性により、一次Ｔ細胞応答を刺激する免疫伝達物質として大きな可能性を有することが示されている［Banchereau et al.（１９９８）Nature ３９２：２４５−２５２］。ＤＣは、抗原を捕獲し、プロセッシングし、有効に提示するという独特な特性を有することから、治療用ワクチン開発にとって非常に重要な道具となっている［Laupeze et al.（１９９９）Hum Immunol.６０：５９１−５９７］。ＤＣへの抗原のターゲッティングは、非常に重大な段階であり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｃ領域に特異的なＤＣ上の幾つかの受容体の存在がこの目的のために利用されている［Regnault et al.（１９９９）J.Exp.Med.１８９：３７１−３８０］。この方法の例には、卵巣癌ｍＡｂ−Ｂ４３.１３［Berlyn et al.（２００１）Clin Immunol.１０１：２７６−２８３］、抗ＰＳＡ ｍＡｂ、および抗ＨＢＶ抗体抗原複合体［Wen et al.（１９９９）Int.Rev.Immunol.１８：２５１−２５８］がある。腫瘍関連抗原を付加したＤＣを用いる癌免疫療法は、腫瘍特異的免疫応答および抗腫瘍活性を生じることが示されている［Campton et al.（２０００）J.Invest.Dermatol.１１５：５７−６１；Fong et al.（２０００）Annu.Rev.Immunol. １８：２４５−２７３］。腫瘍抗原パルスＤＣを用いるインビボ臨床試験では有望な結果が得られた［Tarte et al.（１９９９）Leukemia １３：６５３−６６３］。これらの試験結果は、癌抗原に対して免疫応答を発生させるためのＤＣ使用の効力を明らかに立証している。治療用ワクチンは、宿主免疫系が寛容であるウイルス抗原に対して免疫応答を誘発できるものでなくてはならない。これは、ＤＣへの抗原の送達、適切な抗原提示およびＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを必然的に含むもので、慢性保菌者において治療効果をもたらし得る。
本発明のキメラ抗原ワクチンは、選択された抗原および抗体の特異的領域の融合タンパク質として製造される新規種類の組換え「キメラ抗原」である。分子の二機能性設計は、ＡＰＣ、特にＤＣへウイルス抗原をターゲッティングすることにより、選択された抗原に対して体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導するように調整されている。ＨＣＶ Chimigen（商標）ワクチンの二量体形態は、図１で概略的に示されている。
ワクチンは、組換えＨＣＶウイルス抗原を含む免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）、およびモノクローナル抗体のＦｃフラグメントを含む標的結合ドメイン（ＴＢＤ）という、２つのドメインを有する。ワクチンの設計は、その機能に幾つかの独特な特性を分与している。キメラ的デザインは、特異的受容体を通じてその取り込みを促進する抗体様構造の形成に有利であり、適切な抗原提示を誘導する。それは、プロテアソーム経路を通してプロセッシングされ、ペプチドがＭＨＣクラスＩとの複合体として提示されることにより、ＣＴＬ応答を誘導し得る。Chimigen（商標）ワクチンはまた、エンドソーム経路を介してプロセッシングされ、ＭＨＣクラスIIにより提示されることによって、体液性応答を生じさせ得る。
ＴＢＤは、特異的ＡＰＣ受容体、例えばＦｃγ受容体へのChimigen（商標）ワクチンの結合を仲介する。本発明は特定の作用機構により限定されるわけではないが、ＡＰＣ（例、未成熟ＤＣ）上のＦｃγ受容体への分子の結合により、ＭＨＣクラスＩ経路を通じて抗原のプロセッシングが誘発されると思われる。具体的実施態様では、異種ＴＢＤ、組換え抗原、抗原のアミノおよびカルボキシ末端に組み込まれた様々な長さのリンカーペプチドにより、分子全体が「外来」のものとなるため、ＨＣＶ抗原を含む融合タンパク質に対して宿主免疫系からエピトープ性免疫応答を引き出すことが可能となる。融合タンパク質 Chimigen３タンパク質はまた、非哺乳類細胞（例、酵母または昆虫細胞）でも製造され得、その場合、それらは非哺乳類的な形でグリコシル化されることにより、哺乳類（例、ヒト）宿主においてもそれらの免疫原性を高める。また、昆虫細胞で導入されたマンノース／少（pauci）マンノースグリコシル化により、ワクチンはＡＰＣ上のマンノース受容体により取り込まれ得る。
したがって、Chimigen（商標）ワクチンは、特異的Ｆｃγ受容体Ｉ、IIおよびIII（ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６）、マンノース受容体（ＣＤ２０６）、他のＣ型レクチン受容体を通じてＡＰＣにより、また食作用により内在化され得る［Geijtenbeek et al.（２００４）Annu.Rev.Immunol. ２２：３３−５４］。特異的受容体を介した取り込み、エンドソームおよびプロテアソーム経路によるプロセッシング、および両クラスのＭＨＣ分子での提示の結果、ウイルス感染を阻止またはウイルス感染細胞を排除し得る広範な免疫応答が誘発され得る。ＣＴＬ応答の発生は、ウイルス感染細胞を浄化するのに不可欠である［Whitton et al.（２００４）Adv.Virus Res. ６３：１８１−２３８］。慢性ＨＢＶ感染処置用のHepaVaxx B、ViRexx の最初のChimigen（商標）治療用ワクチンは、前臨床試験で非常に有望な結果を示した［George et al.（２００３）A novel class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic viral infections :evaluation in ducks chronically infected with duck hepatitis B virus (DHBV)（慢性ウイルス感染を処置するための新規種類の治療用ワクチン：カモＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）に慢性感染したカモにおける評価）、Hepdart ２００３、Frontiers in Drug Development for Viral Hepatitis ：１２月１４〜１８日、カウアイ、ハワイ、米国；George et al.（２００３）慢性ウイルス感染を処置するための新規種類の治療用ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスの分子生物学の国際会議（A novel class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic viral infections、International Meeting of the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses）、９月７〜１０日、ツェントロ・コングレッシ・ジョバンニ ＸＸIII、ベルガモ、イタリア国；George et al.（２００４）慢性Ｂ型肝炎感染を処置するための新規キメラ治療用ワクチンの免疫学的評価（Immunological Evaluation of a Novel Chimeric Therapeutic Vaccine for the Treatment of Chronic Hepatitis B Infections）（２００４）Ｂ型肝炎ウイルスの分子生物学の国際会議（International Meetingu of the Molecular B Viruses）、ウッズ・ホール、マサチューセッツ、米国、２００４年１０月２４〜２７日；George et al.（２００５）BioProcessing Journal ４：３９−４５；George et al.（２００６）A new class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic hepatitis B infections、Framing the Knowledge of Viral Hepatitis、Schinazi,R.F.編集者、ＩＨＬプレス、米国］。
Ｂ．定義
本願で使用している用語は、（特に断らなければ）以下の定義により示される意味を有する。
「抗体」は、Ｂリンパ系細胞により産生される免疫グロブリン分子をいう。これらの分子は、抗原と特異的に結合する能力を有することを特徴とするもので、それぞれ互いに関連付けて定義されている。
「抗体応答」または「体液性応答」は、抗原性刺激因子に応答して抗体がＢリンパ球により産生され、血液および／またはリンパ系へ分泌される免疫応答の一タイプをいう。適正に機能している免疫応答では、抗体が細胞表面上の抗原と特異的に結合することにより、細胞に印を付け、食細胞、抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）エフェクター細胞、および／または補体介在機構により破壊させる。抗体はまた、全身的に循環し、遊離ビリオンに結合し得る。この抗体結合は、ビリオンを中和し、それが細胞に感染するのを阻止し、ビリオンに印を付けて食作用または腎臓での濾過により宿主から排出させ得る（排出するのを阻止し得る？）。
「抗原」は、適切な細胞との接触に至った結果、感受性および／または免疫応答性を示す状態を誘導し、インビボまたはインビトロで感作された対象の抗体および／または免疫細胞と立証可能な方法で反応する物質を包含する。すなわち、抗原は、例えば細胞またはウイルス粒子および／またはそれらの成分の各々を包含し得る。ウイルスの場合、成分は、具体的にはウイルスタンパク質を含む。
「抗原提示細胞」（「ＡＰＣ」）は、主として抗原を内在化させ、抗原をプロセッシングし、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはII 分子の領域で抗原性エピトープをリンパ球に提示することにより機能する抗原誘導事象の副存細胞をいう。ＡＰＣと抗原の相互作用によりリンパ球は抗原性分子と遭遇し、それを認識し得ることから、この作用は免疫誘導における本質的段階である。ＡＰＣの例としては、マクロファージ、単球、ランゲルハンス細胞、指状嵌入樹状細胞、濾胞樹状細胞およびＢ細胞がある。
「Ｂ細胞」は、抗原と相互作用する免疫グロブリン（抗体）を産生するリンパ球の一タイプをいう。
「ＣＨ１領域」、「ＣＨ２領域」、「ＣＨ３領域」は、各々抗体の重鎖定常ドメインの異なる領域を指す。
「細胞性応答」または「細胞性宿主応答」は、ウイルス感染または癌細胞を直接的または間接的に排除する能力がある特異的ヘルパーおよびキラーＴ細胞により伝達される免疫応答の一タイプをいう。
本明細書で使用されている「キメラ抗原」の語は、免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）および標的結合ドメイン（ＴＢＤ）を含むポリペプチドをいう。免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインは、共有結合または非共有結合により直接的または間接的に結合され得る。
「複合体」または「抗原抗体複合体」は、抗体および抗原間の反応の生成物をいう。多価抗原により形成された複合体は、水系に不溶性である傾向を示す。
「細胞傷害性Ｔリンパ球」は、ウイルス抗原を産生する感染源により感染した外来細胞および宿主細胞を破壊する能力があるリンパ球の一特化タイプである。
「エピトープ」は、複合抗原分子上の抗原性決定基の最も単純な形態をいう。これは、抗体またはＴ細胞受容体により認識される抗原の特異的部分である。
「フラグメント」は、非統一体（disunified entity）の一部分をいう。本発明の場合、この語は対応物の一部としてその部分を指すのにも用いられ得る。したがって、Ｆｃフラグメントを含む融合タンパク質は、天然フラグメントと同じペプチド配列を含む組換え分子を指し得る。
「融合タンパク質」は、２つまたはそれ以上のコーディング配列を組み合わせることにより作られたハイブリッド遺伝子の発現により形成されたタンパク質をいう。
「ヒンジ領域」は、ＦａｂフラグメントをＦｃフラグメントに連結する抗体の部分をいう。ヒンジ領域は、２本の重鎖を共有結合で連結することにより二量体分子を形成するジスルフィド結合を含む。
「相同体」の語は、別の分子について、例えば、対応する位置で同一または類似している化学的残基の配列を有することにより、その分子との相同性を呈する分子をいう。「％相同である」または「％相同性」の語は、同一または類似している相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同一位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセントをいう。例えば、２種のタンパク質における８０残基のうち７５が同一である場合、２種のタンパク質は９３.７５％相同である。相同性パーセントは、当業者には周知の様々なソフトウェアプログラムを用いて決定され得る。
「宿主」は、例えばキメラ抗原が投与され得る温血動物をいう。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対合をいう。本発明では、対合の好ましい機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間における、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を含む。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な環境下で行われ得る。ポリヌクレオチドに関連して使用されている、「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズしている」、「ハイブリダイズする」などの語は、慣用的ハイブリダイゼーション条件、好ましくは例えば５０％ホルムアミド／６ＸＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍＬのｍＤＮＡで、ハイブリダイゼーション温度が３７℃より高く、０.１ＸＳＳＣ／０.１％ＳＤＳでの洗浄温度が５５℃を超える場合のハイブリダイゼーションをいうものとする。
「免疫性」または「免疫応答」は、抗原に対する身体の応答をいう。具体的態様では、この語は感染疾患に対して抵抗するかまたは自身を防御する能力をいう。
「免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）」は、キメラ分子の多様な配列の抗原性部分をいう。ＩＲＤは、１個またはそれ以上の抗原または１個またはそれ以上の組換え抗原を含む。好ましいウイルス性抗原には、ＨＣＶコア、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２、ＨＣＶ Ｅ１、ＨＣＶ Ｅ２、ＨＣＶ Ｐ７、ＨＣＶ ＮＳ３−セリンプロテアーゼ、ＨＣＶ ＮＳ４Ａ、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂ、およびＨＣＶ ＮＳ５Ａがあるが、これらに限定はされない。
本明細書で使用されている「免疫治療可能な状態」の語は、対象における免疫応答を誘発または調節することにより防止、阻害または軽減され得る状態または病気をいう。
「リンパ球」は、特異的免疫応答を伝達する、例えば血液から見出される有核細胞のサブセットをいう。
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、融合ハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマ細胞のクローンまたは遺伝的均一集団から産生される抗体をいう。ハイブリッド細胞をクローン化することにより、化学的または免疫学的に均一である、すなわち唯一のタイプの抗原を認識する特異的モノクローナル抗体を産生するセルラインを確立する。
本明細書で使用されている「機能し得るように結合された」とは、発現制御配列が、興味の対象であるコーディング配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物へ組み込まれていることをいう。
「ペプチド結合（linkage）」または「ペプチド結合（bond）」は、２種またはそれ以上のアミノ酸間における共有結合的化学結合をいう。これは、一アミノ酸のα−アミノ基および別のアミノ酸のα−カルボキシル基間の置換アミド結合である。
「医薬用賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤、保存剤などの物質を包含する。
「医薬上許容される」とは、ヒトまたは他の動物と生理学的に適合し得る非毒性組成物を指す。
本明細書で使用されている「ポリヌクレオチド」の語は、あらゆる長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形態をいう。この語は、分子の一次構造のみを指す。すなわち、この語は、２本および１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また、この語は、公知タイプの修飾形態、例えば、当業界で公知の標識、メチル化、「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドの１個またはそれ以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるもの、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リシンなどを含む）を含むもの、インターカレーター（例、アクリジン、プソラレンなど）を伴うもの、キレート剤（例、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例、アルファアノマー核酸など）によるもの、およびポリヌクレオチドの非修飾形態を包含する。
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用されており、長さまたは翻訳後修飾とは関係なく、アミノ酸のペプチド結合鎖を意味する。
本明細書で使用されている「予防」とは、疾患の症状を完全に防止するか、疾患の症状の開始を遅らせるか、または後続的に発現した病状の重症度を軽減することをいう。
疾患の「防止」は、疾患の症状が本質的に存在しないことを意味する。
「プロテアーゼ開裂部位」とは、タンパク質分解酵素が、ポリペプチド鎖におけるアミノ酸間のペプチド結合の加水分解（切断）を触媒する部位をいう。
本発明では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」の語は、本発明化合物が、その標的配列と、ただし他の配列については最小限の数でハイブリダイズする条件を指す。
「対象」の語は、温血動物、好ましくはヒトを指す。
「標識」とは、標識を含む分子を単離または精製するのに使用されるマーカーまたはマーカー配列をいう。標識の例には、６ｘＨｉｓ（すなわち、６ヒスチジンの配列）標識がある。
「Ｔ細胞」は、抗原に対して抗原特異的応答を開始させ得、体液性および細胞性免疫応答においてある一定の役割を演じるリンパ球の一タイプをいう。
「標的結合ドメイン（ＴＢＤ）」は、免疫グロブリン重鎖定常域の全部または一部をいう（例、ＣＨ１（全部または一部）−ＣＨ２−ＣＨ３）。
「治療有効量」の語は、抗原に対して有効なＢ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／またはヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）応答を誘発し、疾患または障害の症状および／または合併症を遮断するか、またはそれらを治癒または少なくとも部分的に停止または遅延させるのに十分な薬剤（例、キメラ抗原またはキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド）の量をいう。Ｔ細胞のサブセットは、Ｂ細胞の活性化を促して抗体を分泌させるかまたは別のＴ細胞サブセットがエフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）になるように促すサイトカインを分泌することによりＴヘルパー細胞として機能する。
本明細書で使用されている「処置する」および「処置」の語は、動物、特にヒトにおけるキメラ抗原により処置可能な状態の処置を包含するもので、（ｉ）上記状態に罹患し得るが、まだその診断は下されていない対象においてその状態が起こるのを防止するか、（ii）上記状態を阻害する、例えばその発症を停止または進行を遅らせるか、または（iii）その状態を軽減する、例えば上記状態またはその症状の退縮を誘発することを含む。
本明細書で使用されている「治療用」である薬剤は、疾患の症状の完全な排除または疾患の症状の重症度の低下を誘発する薬剤をいう。
「異種の（xenotypic）」とは、宿主以外の種に起源を有することをいう。例えば、マウスゲノムからクローン化された組換え発現抗体は、組換え発現抗体が細菌、昆虫、ヒトまたはマウス細胞のいずれで産生されたものであろうと、ヒトにとっては異種であるが、マウスにとっては異種ではない。すなわち、本発明のキメラ抗原の場合、異種ＴＢＤ（例、異種抗体分子または異種抗体フラグメント）とは、キメラ抗原が関わるもの以外の種に由来するＴＢＤである。
Ｃ．キメラ抗原
本発明組成物は、免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）および標的結合ドメイン（ＴＢＤ）を含むキメラ抗原を含む。本発明の好ましい実施態様では、ＩＲＤ部分は、体液性および／またはＴ細胞応答を誘導する能力をもち、標的結合ドメインは、ＡＰＣ、例えば樹状細胞と結合する能力をもつ。本発明のキメラ抗原はまた、以下のものの一つまたはそれ以上を含み得る：免疫グロブリンのヒンジ領域（またはそのセグメント）、免疫グロブリンのＣＨ１領域（またはそのセグメント）、ペプチドリンカー、プロテアーゼ開裂部位、および精製プロトコルでの使用に適切な標識。本発明のキメラ抗原は、ＡＰＣに結合し、それを活性化する能力をもつ。必ずというわけではないが、一般的に、ＩＲＤはＴＢＤのＮ−末端である。
本発明の具体的実施態様では、キメラ抗原のＩＲＤは、１種またはそれ以上のＨＣＶタンパク質、例えば上記のものまたは１種またはそれ以上の組換えＨＣＶタンパク質から成る群から選択される１種またはそれ以上（例、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種）のタンパク質（抗原）を含む。上記タンパク質間には、所望によりリンカー、例えば本明細書で開示されているリンカーのいずれかが存在し得る。本発明のキメラ抗原では、完全長抗原ではなく、これらの抗原の免疫原性フラグメントが使用され得る。複数の抗原がキメラ抗原に存在する場合、完全長のみ、免疫原性フラグメントのみ、または完全長抗原および完全長タンパク質の混合物が使用され得る。
本発明のキメラ抗原は単量体であり得るか（すなわち、それらはＩＲＤおよびＴＢＤを含む単一単位を含む）、またはそれらは多量体であり得る（すなわち、それらは、各々ＩＲＤおよびＴＢＤを含む多数の単位を含み得る）。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体であり得る。上記多量体では、個々の単位は同一または異なり得るか、または同一のものもあれば、異なるものもあり得る。図１は二量体キメラ抗原を描いている。
本発明のさらに別の実施態様では、キメラ抗原のＩＲＤは、１種またはそれ以上のＨＣＶタンパク質、または１種またはそれ以上の組換えＨＣＶタンパク質に融合された６ｘＨｉｓ−ペプチドを含む。
本発明の具体的実施態様では、キメラ抗原のＴＢＤは、抗体フラグメントであり得る。ＴＢＤは、適切なキメラ抗原が投与される宿主（対象）と同じ種に由来したものであり得る。他方、本発明の好ましい実施態様では、キメラ抗原のＴＢＤは、宿主にとって異種の抗体フラグメントである。例えば、宿主がヒトである場合、具体例としての異種抗体フラグメントは、ヒト以外の動物の抗体フラグメント、例えばマウス抗体フラグメントである。本発明のある種の実施態様では、異種抗体フラグメントは、マウスＦｃフラグメントを含む。本発明の最も好ましい実施態様では、ＴＢＤは、異種Ｆｃフラグメント（またはそのフラグメント）、ヒンジ領域（またはそのセグメント）、ＣＨ１領域（またはそのセグメント）、およびＩＲＤへ標的結合ドメインを連結するのに適切なペプチド結合を含む。
本発明はまた、ＴＢＤへＩＲＤを連結する結合性分子の使用を含む。具体例としてのリンカー分子は、ロイシンジッパー、およびビオチン／アビジンを含む。（例えば融合タンパク質において）使用され得る他のリンカーは、ペプチド配列である。上記ペプチドリンカーは、一般的に約２〜約４０のアミノ酸（例、約４〜１０アミノ酸）長である。ペプチドリンカーの一例は、アミノ酸配列ＳＲＰＱＧＧＧＳ（配列番号１）を含む。他のリンカーは当業界では公知であり、一般的にグリシンおよび／またはアラニンに富むことにより、それらが連結する領域間に可撓性がもたらされている。一般的に、本発明のキメラ抗原の場合、ＩＲＤおよびＴＢＤは、ＴＢＤの抗原結合部分（例、抗体分子または抗体分子のフラグメント）およびＩＲＤ上の適切な抗原性エピトープ間における物理的抗原抗体相互作用により連結されているわけではない。
一具体例において、本発明のキメラ抗原は、２つの部分、すなわち抗原性配列（例えばウイルス性抗原（複数も可））を含むＩＲＤ、および異種Ｆｃフラグメントを含むＴＢＤを有する融合タンパク質である。異種マウスＦｃフラグメントは、ＡＰＣ、具体的には樹状細胞上の特異的受容体に結合する。すなわち、キメラ抗原の結合領域は、抗原提示細胞を特異的にターゲッティングする。次いで、ＡＰＣの内部機構はキメラ抗原をプロセッシングし、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII分子上に特異的ペプチドを提示することにより、Ｔ細胞と接触させてそれを活性化し、体液性および細胞性免疫応答を発生させることにより、感染細胞またはこれに適した他の望ましくない細胞、例えば癌細胞を除去する。
さらなる実施態様では、キメラ抗原は、２部分、すなわち一修飾ウイルス性抗原または複数の同抗原、抗原性タンパク質フラグメントまたはペプチド、または特異的部位にグリコシル化を伴うこれらのいずれか、および同じくグリコシル化され得る異種マウスＦｃフラグメントを有する融合タンパク質であり得る。
さらに別の実施態様において、本発明は、さらなる修飾キメラ抗原であって、抗原（ＩＲＤ）がビオチニル化され、ＴＢＤ（例、Ｆｃフラグメント）が、例えば融合タンパク質でアビジン（例、ストレプトアビジン）とコンジュゲートされているキメラ抗原を提供する。かかるアビジン−コンジュゲートＴＢＤにより、ＩＲＤ−ＴＢＤコンジュゲートの広範な寄せ集めの生成が促進される。当然、ＩＲＤはアビジンとコンジュゲートされ得（例、融合タンパク質形態で）、ＴＢＤ（例、Ｆｃフラグメント）はビオチニル化され得るものとする。
さらに別の実施態様において、本発明は、化学的コンジュゲーションを介したＩＲＤ（抗原）およびＴＢＤ（例、抗体Ｆｃフラグメント）間の会合をもたらす。
本発明の一実施態様は、分子生物学的技術により抗体フラグメントに融合されたＨＣＶの組換え抗原の使用、バキュロウイルス発現系における融合タンパク質の製造、および慢性ＨＣＶ感染に対する治療用ワクチンとしてのそれらの使用を含む。本発明では、インビボにおけるＡＰＣへのＨＣＶ抗原の有効な送達方法を提供することにより、広範な免疫応答、ＣＴＬを含むＴｈ１応答およびＴｈ２（抗体）応答を発生させる。予め選択されたウイルス性抗原（例、宿主免疫系により認識されないもの）の免疫原性は、異種抗体フラグメントの存在により、また昆虫細胞発現系で導入された特異的グリコシル化の存在により増強され得る。抗原−抗体フラグメント融合タンパク質は、抗体成分が存在することから、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞および顆粒球を含む免疫系の様々な細胞（例、ＡＰＣ）上に存在する特異的受容体に結合する。ヒトまたは動物に投与された融合タンパク質は、ＡＰＣ、特にＤＣにより内在化され、小ペプチドに加水分解され、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスII分子との複合体として細胞表面上で、適切な特異性をもつ抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞に提示される。この方法で、キメラ抗原（融合タンパク質）は、広範な免疫応答を誘導し、ウイルス感染を除去し得る。
本明細書で使用されている「標的結合ドメイン（ＴＢＤ）」の語は、ＡＰＣ上のＦｃ受容体に結合し得る抗体フラグメントである、免疫グロブリン重鎖定常域の全部または一部をいう。本発明によると、ＴＢＤは、ＡＰＣ、特に樹状細胞上のＦｃ受容体に結合し得るタンパク質であり、それに続いて受容体を介した取込みによりＡＰＣへ輸送される。本発明によると、Ｆｃフラグメントの存在により、ＡＰＣ、特にＤＣ上のＦｃ受容体を通じたキメラ抗原の取込みは増加する。特異的取込みにより、ウイルス性抗原は外来のものとしてプロセッシングおよび提示される。すなわち、それだけでは宿主が寛容を起こすか、または宿主で誘導する免疫応答が非常に弱いものであったウイルス性抗原に対して免疫応答が効果的に誘導される。
また、本発明によると、キメラ抗原は、好ましくは、マクロファージマンノース受容体／Ｃ型レクチン受容体に結合する能力を有する。マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）はまた、ＣＤ２０６としても知られ、ＡＰＣ、例えばＤＣ上で発現される。この分子は、エンドサイトーシス受容体のＣ型レクチンファミリーの一員である。マンノシル化キメラ抗原は、ＣＤ２０６により結合および内在化され得る。一般に、外因性抗原は、主としてＭＨＣクラスII経路を通じてプロセッシングおよび提示されると考えられる。しかしながら、ＣＤ２０６を通したターゲッティングの場合、ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIの両経路が関与しているという証拠がある［Apostolopoulos et al.（２０００）Eur.J.Immunol.３０：１７１４；Apostolopoulos et al.（２００１）Curr.Mol.Med.１：４６９；Ramakrishna et al.（２００４）J.Immunol.１７２：２８４５−２８５２］。すなわち、ＣＤ２０６を特異的にターゲッティングするキメラ抗原をローディングした単球由来の樹状細胞は、強力なクラスＩ−依存的ＣＤ８＋ＣＴＬ応答およびクラスII−依存的増殖性Ｔヘルパー応答の両方を誘導する［Ramakrishna et al.（２００４）J.Immunol.１７２：２８４５−５２］。
典型的ＴＢＤは、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ 発現ベクターでクローン化されたマウス抗ＨＢＶｓＡｇ ｍＡｂ（ハイブリドーマ２Ｃ１２）から誘導され、昆虫細胞発現系（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア、米国）で発現される。このＴＢＤは、ＣＨ１の部分（アミノ酸配列ＶＤＫＫＩ；配列番号２を有する）、およびマウス抗ＨＢＶ ｓＡｇ ｍＡｂのＮ−末端からＣ−末端のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３により構成される。本発明の実施にあたり、ＩｇＧ１分子の定常域は、リンカーペプチド、ＣＨ１−ヒンジの部分および領域ＣＨ２およびＣＨ３を含み得る。モノマーＴＢＤのヒンジ領域部分は、第２ＴＢＤ分子とのジスルフィド結合を形成し得る。このタンパク質は、６ｘＨｉｓ標識、７アミノ酸ｒＴＥＶ（組換えタバコエッチウイルス）プロテアーゼ開裂部位およびＨＢＶ ｓＡｇ（ハイブリドーマ２Ｃ１２）に対して産生した異種（マウス）ｍＡｂの標的結合ドメイン（ＴＢＤ）のＮ−末端融合を伴うタンパク質として発現され得る。典型的ＴＢＤは、８アミノ酸ペプチドリンカー、ＣＨ１領域の５アミノ酸を含むアミノ酸の配列、ヒンジ配列、ＣＨ２およびＣＨ３領域配列および、所望により発現ベクターから誘導されたヌクレオチドによりコードされた１０追加アミノ酸のＣ−末端ペプチドを伴う２Ｃ１２からのＩｇＧ１ ｍＡｂの定常鎖のフラグメントである。本明細書で定義されている典型的ＴＢＤフラグメントは、ＨＣＶウイルスに由来する抗原との融合タンパク質の生成に関する親分子を形成する。
Ｄ．新規ポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、本明細書に開示されているキメラ抗原の全てをコード化するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、免疫応答ドメインをコード化する第１ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメインをコード化する第２ポリヌクレオチド部分を含む。第１および第２ポリヌクレオチド部分は、同一または異なるヌクレオチド鎖上に配列され得る。
本発明のキメラ抗原の上記領域に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、一般的に、キメラ抗原を産生する細胞（例、酵母または昆虫細胞）からのその分泌を促すリーダーペプチドをコード化するリーダー配列を含む。関連のあるリーダー配列は、一般的に細胞からの分泌前にキメラ抗原から開裂される。リーダー配列は、本明細書に開示されているものおよび当業界で公知の他のもののいずれか、例えば、昆虫細胞での発現に有用なヌクレオチド配列ＡＴＧＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＴＡＡＣＧＣＧＡＴＴ（配列番号３８）によりコード化されるアミノ酸配列ＭＰＬＹＫＬＬＮＶＬＷＬＶＡＶＳＮＡＩ（配列番号３７）を有するＡｃＮＰＶキチナーゼシグナル配列および酵母細胞（例、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母細胞）での発現に有用なアルファ交配因子リーダーであり得る、
本発明は、キメラ抗原変異型タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む、好ましくは単離形態である、キメラ抗原をコード化する遺伝子、ｍＲＮＡ、および／またはコーディング配列に対応するかまたは相補的であるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ポリヌクレオチド、キメラ抗原をコード化する遺伝子またはｍＲＮＡ配列またはその一部と相補的であるか、または少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、およびキメラ抗原をコード化する遺伝子、ｍＲＮＡ、またはキメラ抗原エンコーディングポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、本明細書で具体的に開示されているキメラ抗原をコード化する遺伝子の類似体を包含する。類似体は、例えば、免疫応答誘発能力を保持し、好ましくは配列番号３９および４１〜５１に示された配列により具体的に記載されている、キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドのいずれかと少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％の相同性を有する突然変異体を包含する。典型的には、上記類似体は、１〜１０個のコドン変化のみが異なる。例としては、ウイルス性抗原または抗体フラグメントの天然アミノ酸配列からの小さなアミノ酸変異、特に同類アミノ酸置換を伴うポリペプチドがある。同類置換は、側鎖が同類であるアミノ酸の一ファミリー内で行われるものである。遺伝子コード化アミノ酸は、一般的に４つのファミリー：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として合わせて分類されることもある。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンにより、アスパラギン酸をグルタミン酸により、トレオニンをセリンにより単発的に置換するか、またはアミノ酸を構造的に関連したアミノ酸により類似同類置換しても、生物活性に大した影響を及ぼすことはないと予測することは妥当である。本明細書に開示されているポリペプチドのいずれかと実質的に同じ配列を有するが、キメラ抗原の免疫応答誘発能力に実質的に影響することのない小さなアミノ酸置換を有するポリペプチド分子は、キメラ抗原の定義の範囲内に含まれる。誘導体は、他のキメラ抗原分子との集合性コンジュゲートおよび非関連化学的部分との共有結合コンジュゲートを包含する。共有結合誘導体は、当業界で公知の手段によりキメラ抗原アミノ酸鎖またはＮ−またはＣ−末端残基で見出される基への官能基の結合により製造される。
アミノ酸の省略形を表１に示す。
表１：アミノ酸省略形
Figure 2009511024
同類アミノ酸置換は、タンパク質の立体配座または機能を改変することなくタンパク質中で行われ得る。本発明の、または本発明に有用なタンパク質は、１５個未満（例、未満：１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個）の同類置換（複数も可）を含み得る。上記変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかをこれらの疎水性アミノ酸の他のいずれかの代わりに用いるか、グルタミン酸（Ｅ）の代わりにアスパラギン酸およびその逆、アスパラギン（Ｎ）の代わりにグルタミン（Ｑ）およびその逆、およびトレオニン（Ｔ）の代わりにセリン（Ｓ）およびその逆といった置換がある。また、他の置換も、タンパク質の三次元構造における特定アミノ酸の環境およびその役割によって、同類であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）の場合と同様、交換可能であり得る場合が多い。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシンおよびイソロイシンと置き換えられ得ることが多く、バリンと置き換えられる場合もある。リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の顕著な特徴がその電荷であり、これら２種のアミノ酸残基のｐＫの相違が著しくはない状況では置換可能であることが多い。さらに他の変化も特定の環境では「同類」であるとみなされ得る［例、Biochemistry 第４版、Lubert Stryer編（W.H.Freeman and Co.）、１８〜２３頁；Henikoff et al.（１９９２）Proc Natl Acad Sci USA ８９：１０９１５−１０９１９；Lei et al.（１９９５）J.Biol.Chem.２７０：１１８８２−１１８８５参照］。
追加的類似体ポリヌクレオチドは、例えば、適切なキメラ抗原の溶解度を増加させる役割を果たすＴＢＤのいずれかおよび／またはＩＲＤのいずれかにおける１個またはそれ以上（例、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０個）の付加または欠失を伴うものを含む。付加または欠失は、ポリヌクレオチドによりコード化されるキメラ抗原における１個またはそれ以上（例、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上）のアミノ酸（およびポリヌクレオチド自体における相当数のヌクレオチド）によるものであり得る。
本発明はまた、キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で配列番号３９および４１〜５１に示された配列の一つまたはそれ以上とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者により容易に決定され得るもので、一般的にはプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に左右される経験的な計算である。一般に、プローブが長いとき、適正なアニーリングに要求される温度も高くなり、プローブが短いとき、低温を必要とする。相補鎖がそれらの融解温度より低い環境に存在するとき、ハイブリダイゼーションは、一般的に変性した核酸配列が再アニーリングする能力に左右される。プローブおよびハイブリダイゼーション可能な配列間の所望の相同性の度合が高いとき、使用され得る相対温度も高くなる。その結果として、相対温度が高いと、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーも高くなり、温度が低いと同ストリンジェンシーも低くなる傾向が示される。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、例えばAusubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience Publishers（著作権１９９５、２００４年４月増補、補遺６６）２.９.１−２.１０.８および４.９.１−４.９.１３参照。
本明細書で定義されている「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、必ずしも限定されるわけではないが、（１）低イオン強度および高い洗浄温度、例えば０.０１５Ｍの塩化ナトリウム／０.００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０.１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を使用するもの；（２）ハイブリダイゼーション中、変性剤、例えばホルムアミド、例えば０.１％ウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０.１％Ficoll／０.１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム含有、４２℃を使用するもの、または（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０.７５ＭのＮａＣｌ、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハート溶液、音波処理したサケ精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０.１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン、４２℃で０.２ＸＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および５５℃の５０％ホルムアミド中での洗浄、次いで５５℃でＥＤＴＡ含有０.１ＸＳＳＣから成る高ストリンジェンシー洗浄液を使用するものをいう。「緩和なストリンジェント条件」は、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、ニューヨーク：Cold Spring Harbor Press（１９８９）に記載されているが、これに限定されるわけではなく、上記条件よりストリンジェンシーの低い洗浄液およびハイブリダイゼーション条件（例、温度、イオン強度およびＳＤＳの％）の使用も包含する。緩和なストリンジェント条件の一例は、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５Ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性せん断サケ精液ＤＮＡを含む溶液中３７℃での一晩インキュベーション、次いで約３７〜５０℃で１ＸＳＳＣ中でのフィルター洗浄である。当業者であれば、例えばプローブ長などの因子を適応させるため必要に応じて温度、イオン強度などを調節する方法を認識しているはずである。
本発明ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号４０および５２〜６２で示される配列のいずれかから選択される配列を有するキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド、配列番号３９および４１〜５１に示された配列のいずれかから選択されるキメラ抗原のヌクレオチド配列であって、ＴヌクレオチドがＵヌクレオチドにより置換されたものを含む。例えば、キメラ抗原ヌクレオチドの具体例は、制限するわけではないが、以下のものを含む：
（ａ）配列番号３９および４１〜５１に示された配列（ただし、ＴはＵでもあり得る）のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれにより構成されるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列が配列番号３９および４１〜５１に示された配列のいずれかから選択される配列と少なくとも８０％相同性であるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列が、本明細書で開示されているプラスミドのいずれかに含まれるＤＮＡによりコード化されるキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列が配列番号４０および５２〜６２に示された配列のいずれかから選択される配列であるキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列が配列番号４０および５２〜６２に示された配列のいずれかから選択される全アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるキメラ抗原関連タンパク質をコード化するポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つのポリヌクレオチドと完全に相補的であるポリヌクレオチド；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｈ）配列番号３９および４１〜５１に示された配列のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれにより構成されるが、ＩＲＤ（例、本明細書で挙げられているＨＣＶタンパク質）およびＴＢＤ以外の配列の全部または一部を欠き、所望により例えば１個またはそれ以上のオルターナティブリンカーおよび／またはオルターナティブ分泌（リーダー）ペプチドを含んでいてもよいポリヌクレオチド。さらに、追加的配列（例、ＴＢＤのＣ−末端にあるアミノ酸をコード化するベクター由来の配列）が、本発明のポリヌクレオチドから欠失され得る。上記追加的配列は、１〜１５個（例、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個）のアミノ酸をコード化するものであり得る。
本発明はまた、限定されるわけではないが、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、並びに当業界でよく知られている様々なウイルス性および非ウイルス性ベクターを含む、キメラ抗原ポリヌクレオチド、その類似体または相同体を含む組換えＤＮＡまたは転写ＲＮＡ分子、および上記組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子により形質転換またはトランスフェクションされた細胞を提供する。上記分子の生成方法はよく知られている［例えば、Sambrook et al.、１９８９、前出、参照］。
さらに本発明は、適切な原核生物または真核生物宿主細胞内におけるキメラ抗原ポリヌクレオチド、その類似体または相同体を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例には、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞、例えば哺乳類細胞または昆虫細胞（例、バキュロウイルス感染性細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、expresSF＋（登録商標）、Drosophila Ｓ２またはHigh Five（商標）細胞）がある。適切な哺乳類細胞の例には、様々な前立腺癌セルライン、例えばＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクション可能または形質導入可能な前立腺癌セルライン、一次細胞（ＰｒＥＣ）、および組換えタンパク質の発現に常用される若干の哺乳類細胞（例、ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、２９３Ｔ細胞）がある。さらに具体的には、キメラ抗原のコーディング配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、類似体または相同体は、当業界で常用され、広く知られているかなり多数の宿主−ベクター系を用いてそのキメラ抗原を生成するのに使用され得る。
キメラ抗原の発現に適切な広い範囲の宿主−ベクター系が利用可能である、例えば、Sambrook et al.、１９８９、前出；Ausubel、Current Protocols in Molecular Biology、１９９５（前出）参照。昆虫細胞発現に好ましいベクターには、トランスファーベクタープラスミドpFastBac HTa（Invitrogen）があるが、限定されるわけではない。上記トランスファーベクタープラスミドを用いると、組換えバキュロウイルスが昆虫細胞で生産され得、これらを、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、expresSF＋（登録商標）、Drosophila Ｓ２またはHigh Five（商標）を含む、幾つかの昆虫セルラインの感染に用いることにより、キメラ抗原を発現させ得る。これの一例は、Ｂａｃ〜Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen）である。別法として、好ましい酵母発現形には、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイシス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・アウグスト（Pichia august）がある。本発明の宿主−ベクター系は、キメラ抗原の製造に有用である。
キメラ抗原またはその類似体または相同体はまた、適切なプロモーター（例、昆虫細胞プロモーター）を含み、キメラ抗原をコード化するプラスミド構築物による細胞（例、昆虫細胞）の安定したトランスフェクションにより製造され得る。例えば、キメラ抗原またはその類似体または相同体をコード化する組換えプラスミドｐＭＩＢ−Ｖ５（Invitrogen）は、Ｓｆ９昆虫細胞の安定したトランスフェクションに使用され得る。キメラ抗原または関連タンパク質は、Ｓｆ９細胞で発現され、キメラ抗原は標準精製方法を用いて単離される。当業界で公知の様々な他の発現系もまた使用され得る。キメラ抗原コーディング配列と枠内で連結されたリーダーペプチドをコード化する発現構築物は、キメラ抗原の分泌形態の生成に使用され得る。
本明細書で検討したところによると、遺伝コードの重複性により、キメラ抗原遺伝子配列は変更され得る。特に、特定の宿主種には多くの場合特定のコドン優先性が決まっていることが当業界では知られているため、所望の宿主に好適であるように開示された配列を適合させることができる。例えば、好ましい類似体コドン配列では、典型的には稀なコドン（すなわち、所望の宿主の既知配列における使用頻度が約２０％未満であるコドン）が高頻度のコドンにより置き換えられている。特定種についてのコドン優先性は、例えば、インターネット上、例えばワールド・ワイド・ウェブＵＲＬ www.kazusa.or.jp/codon.で入手可能なコドン使用表を用いることにより計算される。
追加的な配列修飾は、細胞宿主におけるタンパク質発現を高めることが知られている。これの例には、擬似ポリアデニル化シグナル、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコード化する配列、および／または遺伝子発現に有害である十分に特性確認された他の配列の排除がある。宿主細胞で発現された既知遺伝子を基準にして算出された、所定の細胞宿主に関する平均レベルに配列のＧＣ含有率を調節する。可能な場合、配列に修飾を加えることにより、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。他の有用な修飾には、Kozak［（１９８９）Mol.Cell Biol.９：５０７３−５０８０］により報告された、読み枠の開始点での翻訳開始共通配列の付加がある。当業者であれば、真核生物リボソームが排他的に５'近位ＡＵＧコドンで翻訳を開始させるという一般的規則が稀な条件下でのみ排除されることは理解できるはずである［例えば、Kozak（１９９５）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９２：２６６２−２６６６；Kozak（１９８７）Nucl.Acids Res. １５：８１２５−８１４８参照］。
各々下記に列挙したプラスミドの一つにより形質転換された、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）クローンを、カナダ国Ｒ３Ｅ ３Ｒ２、マニトバ、１０１５アーリントン・ストリート・ウィニペグ（電話番号：（２０４）７８９−６０３０；ファクシミリ番号：（２０４）７８９−２０１８）の、インターナショナル・デポジトリー・オーソリティー・オブ・カナダ（ＩＤＡＣ）にブタペスト条約のもと、２００６年１０月１１日に寄託した。各クローンは、示されたＩＤＡＣ受託番号により容易に同定され得る。
Figure 2009511024
ＩＤＡＣに寄託されたサンプルは、本願出願前に ViRexx Medical Corporationにより維持されている同寄託物から採取されたものである。寄託物は、３０年間、または最新請求後５年間、または特許の有効期間中、ＩＤＡＣ受託所で制限無く維持され、その期間中に寄託物が生育不能になった場合には交換される。
Ｅ．本発明の医薬組成物
本発明の一態様は、医薬上許容される賦形剤および免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、特に抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を含む医薬組成物に関するものである。治療適用において、医薬組成物は、抗原に対して有効なＢ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／またはヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）応答を誘発し、感染を阻止するかまたは感染の症状および／または合併症を治癒または少なく部分的に停止させるか遅らせるのに十分な量で対象に投与され得る。この用途に有効な量は、例えば投与される特定組成物、投与方法、処置されている疾患の段階および重症度、対象の体重および全般的健康状態、および担当医の判断に左右される。
初回治療的免疫（キメラ抗原による）についての投薬は、一般的に、低い方の値が約１、５、５０、５００または１０００ｎｇであり、高い方の値が約１００００、２００００、３００００または５００００μｇである単位投薬量範囲で行われる。ヒトに関する投薬量の値は、典型的には７０キログラムの対象に対して約５００ｎｇ〜約５００００μｇの範囲である。対象の応答および状態によって、日単位から月単位の期間に及ぶブースタープログラムに準じてキメラ抗原約１.０ｎｇ〜約５００００μｇの促進薬量が投与され得る。上記状態が阻止、停止、緩和または排除されたことを少なくとも臨床症状または試験結果が示すまで、およびその後の一定期間投与は続行すべきである。投薬量、投与経路、および投薬スケジュールは、当業界で公知の方法にしたがって調節される。
キメラ抗原のヒト単位用量形態は、典型的には許容される担体、一具体例では水性担体のヒト単位用量を含む医薬組成物に含まれ、ヒトへの上記ポリペプチドの投与に有用であることが当業者に知られている体積／分量で投与される（例、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、A.Gennaro、編集者、Lippincott Williams & Wilkins、バルチモア、メリーランド（２０００）参照）。当業者が認めるところによると、様々な因子が特定の症例における理想用量に影響を及ぼし得る。上記因子には、例えば、キメラ抗原の半減期、キメラ抗原の結合親和力、組成物の免疫原性、所望の定常状態濃度レベル、投与経路、処置頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される他の薬剤の影響、並びに特定対象の健康状態がある。
一般的に、キメラ抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分なキメラ抗原を対象に投与する。ＴＢＤは、キメラ抗原をＡＰＣ、例えばＤＣ上の特異的受容体にターゲッティングする。キメラ抗原は、抗原提示経路を介して内在化され、プロセッシングされることにより、体液性および細胞性の両免疫応答を誘発する。
実施態様によっては、本発明組成物を、深刻な病状、すなわち生命を脅かすかまたは生命を脅かす可能性がある状況で使用する場合もある。そのような場合、本発明の好ましい組成物におけるキメラ抗原は比較的非毒性であることから、これらのキメラ抗原を上記で述べた用量に対して過剰な量で投与することが可能であり、担当医が望ましいと感じる処置でもあり得る。
医薬製剤中における本発明キメラ抗原の濃度は、広範に、すなわち、重量にして約０.１％未満から、通常約２％または少なくとも約２％から２０％〜５０％またはそれ以上に及ぶ範囲で変動し得、選択された特定投与方法にしたがって、主として液量、粘稠性などにより選択される。
医薬組成物は、当業界で公知の経路を介して、例えば非経口、鞘内、脈管内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、皮下、鼻腔内、局所、経口、直腸、膣、肺または腹腔内経路により送達され得る。好ましくは、組成物は、非経口経路、例えば皮下または皮内投与により送達される。
医薬組成物は、意図した投与経路に適切な賦形剤と所望のキメラ抗原を混合することにより製造され得る。本発明医薬組成物を製造する場合、キメラ抗原を、通常賦形剤と混合するか、賦形剤により希釈するか、またはカプセル、サシェ、紙または他の容器の形態であり得る担体内に封入する。医薬上許容される賦形剤を希釈剤として使用するとき、それは、固体、半固体、または液体材料であり得、治療剤用の賦形剤、担体または媒質として作用する。すなわち、組成物は、錠剤、丸薬、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル（固体または液体媒質として）、例えば１０重量％以下の割合でキメラ抗原を含有する軟膏、ソフトおよびハードゼラチンカプセル剤、座薬、滅菌注射可能溶液、および滅菌パッケージ粉末の形態であり得る。
適切な賦形剤の若干の例には、デキストロース、蔗糖、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカントゴム、ゼラチン、珪酸カルシウム、微晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースがあるが、これらに限定されるわけではない。製剤は、さらに滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油、湿潤剤、乳化および懸濁剤、保存剤、例えばメチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエート、甘味料、および風味剤を含み得る。本発明組成物は、当業界で公知の手順を用いることにより、対象への投与後キメラ抗原の迅速、持続または遅延放出を可能にするように製剤化され得る。例えば、Remington、前出、９０３−９２頁および１０１５−１０５０頁参照。
固体組成物、例えば錠剤を製造する場合、キメラ抗原を医薬用賦形剤と混合することにより、本発明キメラ抗原の均一混合物を含む固体プレフォーミュレーション組成物を形成する。均一なものとしてこれらのプレフォーミュレーション組成物に言及するとき、キメラ抗原を組成物全体に均等に分散させることにより、組成物が容易に均等有効単位用量形態、例えば錠剤、丸薬およびカプセルに小分割され得ることを意味する。
本発明の錠剤または丸薬をコーティングまたは他の方法で調合することにより、長時間作用という利点をもたらす用量形態が提供され得る。例えば、錠剤または丸薬は、内側投薬および外側投薬成分を含み得、後者は前者全体を覆うエンベロープ形態である。これら２成分は、胃での分解に抵抗し、内側成分を十二指腸まで無傷のまま通過させるかまたは放出を遅延させるべく機能する腸溶層により分離され得る。上記腸溶層またはコーティングには様々な材料、例えば若干のポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースといった材料との混合物を含む材料が使用され得る。
本発明の新規組成物が経口または注射による投与用に組み込まれ得る液体形態には、水溶液、好適に調味したシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油、例えばコーン油、綿実油、ゴマ油、ココヤシ油または落花生油による調味したエマルジョン、並びにエリキシルおよび同様の医薬用賦形剤がある。
非経口投与用組成物を製造する場合、刺激を減らすため張度調節に厳格な注意を払わなければならない。再構成可能組成物は、乾燥形態でパッケージされた滅菌固体である。即座に投与できる溶液中よりも乾燥固体として貯蔵する方が、安定性が高いことから、再構成可能組成物が好ましい。乾燥固体は、通常、固体が確実に最適湿度範囲に保たれるようにブチルゴム閉め具の付いた滅菌容器にパッケージされている。再構成可能乾燥固体は、乾燥充填、噴霧乾燥、または凍結乾燥方法により形成される。これらの方法は、例えばRemington、前出、６８１〜６８５頁および８０２〜８０３頁に記載されている。
非経口注射用組成物は、一般的に希釈されており、高い比率で存在する成分は賦形剤である。賦形剤は、通常治療活性を持たず、非毒性であるが、吸収に適切な形態で身体組織にキメラ抗原を提示する。キメラ抗原が水溶液として提示されると、吸収は、通常非常に迅速かつ完全に行われる。しかしながら、水混和性液体で賦形剤を修飾するか、水混和性液体と置き換えることにより、吸収速度に影響を与えることは可能である。好ましくは、この組成物に関して最も価値のある賦形剤は等張性食塩水である。注射に適切な組成物を製造する際、水性賦形剤、水混和性賦形剤および非水性賦形剤が使用され得る。
組成物の品質を改良または保護するため、追加的物質を本発明の注射可能組成物中に含ませ得る。すなわち、追加される物質は、溶解性に影響し、対象を快適にし、化学的安定性を高めるか、または微生物増殖から製品を防御し得る。すなわち、組成物は、適切な可溶化剤、酸化防止剤として作用する物質、および微生物増殖を阻止する保存剤として作用する物質を含み得る。これらの物質は、それらの機能に適切な量で存在するが、組成物の作用に悪影響を及ぼすことはない。適切な抗菌剤の例には、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルがある。適切な酸化防止剤は、Remington、前出、１０１５〜１０１７頁に記載されている。
若干の具体例では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などが本発明キメラ抗原の投与に使用される。特に、本発明組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体、ナノ粒子などに封入された形での送達用に処方され得る。別法として、本発明組成物は、共有結合または非共有結合的に上記担体賦形剤の表面に結合され得る。
リポソームを介して投与される組成物はまた、１）キメラ抗原を特定組織、例えばリンパ系組織にターゲッティングする、２）ＡＰＣへ選択的にターゲッティングする、３）追加的な刺激性または調節性分子を担う、または４）キメラ抗原組成物の半減期を増加させるべく機能し得る。リポソームは、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるキメラ抗原は、リポソームの一部として、単独またはリンパ系細胞間で優勢な受容体に結合する分子、例えばＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体と、または他の治療用または免疫原性組成物と連係的に組み込まれる。すなわち、所望の本発明キメラ抗原を充填または装飾したリポソームは、リンパ系細胞部位へ指向され得、次いでリポソームがキメラ抗原を送達する。本発明にしたがって使用されるリポソームは、一般的に中性および負に荷電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む、標準小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般的に例えばリポソームサイズ、所望の投与経路に関する、例えば血流中におけるリポソームの酸不安定性および安定性を考慮することにより異なってくる。リポソームの製造については様々な方法が利用可能である［例、Szoka et al.（１９８０）Ann.Rev.Biophys.Bioeng.９：４６７−５０８；および米国特許第４２３５８７１号、同第４５０１７２８号、同第４８３７０２８号および同第５０１９３６９号に記載］。キメラ抗原を含むリポソーム懸濁液は、特に投与方法、送達されるキメラ抗原、および処置されている病気の段階にしたがって変動する用量で静脈内、局部、局所などの経路で投与され得る。
吸入または通気用組成物には、医薬上許容される水性または有機溶媒、またはそれらの混合物中での溶液および懸濁液、および粉末がある。液体または固体組成物は、本明細書記載の適切な医薬上許容される賦形剤を含み得る。組成物は、局所または全身効果を目的として経口または鼻腔呼吸器経路により投与され得る。医薬上許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧液は、噴霧装置から直接吸入され得るか、または噴霧装置はフェースマスクテント、または間歇陽圧呼吸器に取り付けられ得る。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な方法で処方物を送達する装置から、好ましくは経口または鼻腔内投与され得る。
本発明方法で使用される別の製剤は、経皮送達装置（「パッチ」）を使用する。上記経皮パッチを使用することにより、本発明キメラ抗原を制御された量で連続的または不連続的に注入させ得る。医薬製剤を送達するための経皮パッチの構築および使用は当業界ではよく知られている。例えば、米国特許第５０２３２５２号参照、これについては出典明示で援用する。上記パッチは、医薬製剤の連続的、拍動的、またはオンデマンド式送達用に構築され得る。
さらに、キメラ抗原および医薬用賦形剤に加えて少なくとも１種の抗ウイルス治療薬または化学療法薬を含ませることが有利であり得る。例としては、インターフェロン−α２ａ／ｂ、および抗ウイルス剤、例えばリバビリンがあるが、これらに限定されるわけではない。
実施態様によっては、本発明医薬組成物中に、Ｂ−リンパ球またはＴリンパ球を初回感作する少なくとも１種の成分を含ませることが望ましい場合もあり得る。脂質は、インビボでＣＴＬを初回感作し得る作用物質として認識されている。例えば、パルミチン酸残基を、リシン残基のε−およびα−アミノ基に結合させ、次いで、例えば、１個またはそれ以上のリンキング残基、例えばＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどを介して免疫原性ペプチドに連結させ得る。次いで、脂質化ペプチドを、直接ミセルまたは粒子中で投与するか、リポソームに組み込むか、またはアジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント中で乳化させ得る。好ましい実施態様では、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含んでおり、これを連鎖、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒを介して免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合させる。
ＣＴＬ応答の脂質初回感作の別の例として、エシェリキア・コリ（E.coli）リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）を、適切なペプチドに共有結合させた場合、ウイルス特異的ＣＴＬの初回感作にこれを使用することができる［例、Deres et al.（１９８９）Nature ３４２：５６１参照］。本発明のキメラ抗原を、例えばＰ３ＣＳＳにカップリングさせ、リポペプチドを個体に投与することにより、標的抗原に対し免疫応答を特異的に誘発させ得る。
本発明組成物は当然アジュバントの使用を要求するものではないが、アジュバントを使用することは可能である。宿主の種によって免疫学的応答を高めるのに様々なアジュバントが使用され得、それらの例としては、フロイント（完全および不完全）、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、デタージェント、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、免疫刺激性ポリヌクレオチド配列、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin、カルメット-ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）があるが、これらに限定されるわけではない。追加的アジュバントもまた当業界では公知である。
Ｆ．キメラ抗原の使用方法
本発明の別の態様は、ＡＰＣによる抗原提示を増強する方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント（例、異種抗体フラグメント）を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原をＡＰＣに投与することを含む方法を提供する。好ましい具体例では、ＡＰＣは樹状細胞である。
本発明の一態様は、ＡＰＣの活性化方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント（例、異種抗体フラグメント）を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原とＡＰＣを接触させることを含む方法に関するものである。好ましい具体例では、ＡＰＣをインビボでキメラ抗原と接触させる。別の好ましい具体例では、接触はヒトで行われる。
本発明のさらに別の態様は、免疫応答誘発方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント（例、異種抗体フラグメント）を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を哺乳類に投与することを含む方法を提供する。免疫応答は、体液性および／または細胞性免疫応答であり得る。好ましい具体例において、細胞性免疫応答は、Ｔｈ１、Ｔｈ２および／またはＣＴＬ応答である。
本発明の別の態様は、免疫治療可能な状態の処置方法であって、処置を必要とする動物に、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし異種抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、免疫治療可能な状態は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ＨＣＶの処置の場合、好ましくは、免疫応答ドメインは、ＨＣＶコア（１−１９１）タンパク質、ＨＣＶコア（１−１７７）タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ２タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質、ＨＣＶ ｐ７タンパク質、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質を含む。
本発明の別の態様は、ウイルス感染に対して動物にワクチン投与する方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を動物に投与することを含む方法を提供する。本発明方法は、ウイルス感染に対して動物に予防的または治療的にワクチンを投与し得る。
本発明はまた、本発明組成物を用いることにより、ＡＰＣ、例えばＤＣに結合し、それらを活性化する方法を含む。本発明はまた、本発明組成物の使用によるＴ細胞の活性化方法を含む。本発明はまた、免疫系細胞、例えばＡＰＣへの抗原の送達方法を含む。本発明はまた、動物またはヒトにおいて体液性および／または細胞性免疫応答を活性化する組成物および方法であって、１種またはそれ以上の本発明キメラ抗原を投与することを含む方法を包含する。
クローニングおよび発現後、免疫応答誘発におけるその効力についてキメラ抗原を評価する。評価は、エクスビボまたはインビボでのＤＣへのキメラ抗原の提示を含む。キメラ抗原の結合および内在化についてＤＣを評価する。キメラ抗原をローディングしたナイーブＤＣをＴリンパ球に提示し、Ｔ細胞応答のマーカーとしてインターフェロン−γの産生について評価する。具体的には、エクスビボ状況の場合、単球を末梢血から単離し、ＤＣに分化させる。ＤＣは抗原と結合し、それを内在化し、プロセッシングし、ナイーブオートロガスＴリンパ球に提示する。ＤＣによりプロセッシングされ、提示された抗原を認識するＴ細胞は、エフェクター細胞、例えばヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球へ活性化される。次いで、樹状細胞によるＴ細胞の活性化を、公知手順［例、Berlyn et al.（２００１）Clin.Immunol.１０１（３）：２７６−２８３］によりマーカー、例えばインターフェロン−γレベルの測定により評価する。バックグラウンドを少なくとも５０％の割合で超えるインターフェロン−γを産生するＴ細胞のパーセンテージの増加によりインビボでの効力が予測される。好ましい具体例において、パーセンテージ増加は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または１００％である。インビボ状況の場合、キメラ抗原を直接宿主において非経口的に導入するが、宿主において利用可能な樹状細胞および他の抗原プロセッシング細胞は、全抗原と相互作用することにより、それらをプロセッシングする能力を有する。
Ｇ．多剤併用療法
本発明の別の態様は、キメラ抗原および抗ウイルス剤を含むウイルス感染処置用組成物を提供する。本発明はまた、キメラ抗原および抗ウイルス剤を同時に、または連続して投与することを含むウイルス感染処置方法を提供する。
抗ウイルス剤とキメラ抗原、例えばヌクレオシド類似体の併用は、慢性Ｃ型肝炎に罹患している対象の処置において持続的応答を誘導するのに非常に有効であることが証明され得る。併用される２薬剤の作用機序は、Ｃ型肝炎対象の処置において相乗効果を生み出しうる。例えば、本明細書記載のＨＣＶキメラ抗原とＨＣＶ抗ウイルス剤、例えばリバビリンの組み合わせは、抗原特異的な細胞性および体液性免疫応答を発生させるため、慢性感染症対象におけるＨＣＶ感染は取り除かれる。
Ｈ．キメラ抗原の製造方法
本発明の一態様は、キメラ抗原の製造方法であって、(ａ)キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む、微生物またはセルライン（または細胞）、好ましくは真核生物、さらに好ましくは非哺乳類微生物またはセルライン（または細胞）を準備し、(ｂ）キメラ抗原が発現される条件下で微生物またはセルライン（または細胞）を培養することを含む方法を提供する。好ましくは、微生物またはセルライン（または細胞）は、酵母、植物セルライン（または細胞）または昆虫セルライン（または細胞）である。さらに好ましくは、セルライン（または細胞）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、expresSF（商標）、Drosophila Ｓ２、および High Five（商標）セルラインまたは細胞から成る群から選択される昆虫セルライン（または細胞）である。
本発明は、本発明を実施するにあたり必要とされる選択された抗原（複数も可）およびＴＢＤの融合タンパク質の製造を目的とする確立された組換えＤＮＡ技術を使用する。融合タンパク質構築物は、発現ベクターへの所望のＤＮＡフラグメントの組み込みで利用される特異的制限酵素部位を組み込むものとしてＤＮＡレベルで生成され、異種発現系における所望の融合タンパク質の発現に使用される。本明細書で使用されている「ベクター」の語は、所望のタンパク質（複数も可）をコード化するＤＮＡを運び得るプラスミドを意味する。本発明で使用するプラスミドベクターには、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａおよびＤＨ１０Ｂａｃ（商標）エシェリキア・コリ（E.coli）（Invitrogen）で調製される対応する組換え「ＢＡＣＭＩＤＳ」（バクミド、細菌性人工染色体）があるが、これらに限定されるわけではない。所望のタンパク質のＯＲＦを起動させ、本発明で使用する、Bac-to-Bac（登録商標）バキュロウイルス発現系（Invitrogen）に加えて、他の系（細菌または哺乳類）でタンパク質を発現させる他の組換えプラスミドを製造することは可能である。使用されている「発現」の語は、ＤＮＡ配列のｍＲＮＡへの転写、ｍＲＮＡ転写物の融合タンパク質への翻訳を意味する。
これは、バクミドへ目的遺伝子を転位させ、Ｓｆ９昆虫細胞へトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスを作製することにより達成される。これらを用いてＳｆ９またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）昆虫細胞を感染させ、目的タンパク質を生産させる。生産された組換えタンパク質は、Ｎ−末端６ｘＨｉｓ標識を有し得、これはＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen、ヒルデン、ドイツ国）を用いることによるタンパク質の精製で利用される。これらのタンパク質はまた、Ｎ−末端ｒＴＥＶプロテアーゼまたはクローン化された他の開裂部位を有し得る。Ｎｉ−精製タンパク質を、同じくＮ−末端６ｘＨｉｓ標識を有する、例えばｒＴＥＶプロテアーゼ（Invitrogen）による消化にかける。プロテアーゼ消化後、混合物をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムにローディングし得、純粋タンパク質を洗浄し得、６ｘＨｉｓ標識フラグメントはカラムに結合される。この精製方法は標準手順であり、当業者であればそれ以上の説明が無くても本方法について理解できるはずである。
ウイルス性抗原およびマウスモノクローナル抗体のＦｃフラグメントをコード化することによりキメラ抗原を生成するＤＮＡ配列のクローニングおよび発現は、２方法を通じて達成され得る。第１法では、融合タンパク質として２種のタンパク質をクローニングし、第２法では分子のいずれか一方に特異的「バイオ-リンカー」、例えばビオチンまたはストレプトアビジンを組み込み、それらを別々に精製し、キメラ抗原を生成させる。
具体例として、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ２Ｃ１２を、マウス免疫グロブリンＧに関する全ＲＮＡの供給源として使用した。全ＲＮＡを分離し、マウスＦｃフラグメントのクローニングに使用した。具体的には、マウスＩｇＧを発現するハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡを、Trizol（登録商標）試薬（Invitrogen／Gibco BRL、製品カタログ番号１０５５１−０１８、１０２９８−０１６；フェノールおよびグアニジンイソチオシアネート（isothiocyante）の単相溶液、米国特許第５３４６９９４号）を用いて分離する。オリゴ−ｄＴカラム（Invitrogen／Gibco BRL、製品カタログ番号１５９３９−０１０）でのアフィニティー・クロマトグラフィーにより、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから精製した。ポリメラーゼ連鎖反応において逆転写酵素を用いることにより、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。特有な制限酵素認識部位を付加してクローニングし易くするようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。Bac-to-Bac（登録商標）バキュロウイルス発現系（Invitrogen／Gibco BRL、製品カタログ番号１５９３９−０１０）を用いて、このｃＤＮＡをクローン化した。
大量の異種タンパク質が製造されるだけでなく、タンパク質の翻訳後修飾、例えばリン酸化およびグリコシル化も感染昆虫細胞内で行われるため、バキュロウイルス系を優先的に使用する。この発現系では、ＤＮＡを、pFastBac（商標）（Invitrogen／Gibco BRL、製品カタログ番号１５９３９−０１０）と呼ばれるベクターにクローン化し得る。Bac-to-Bac（登録商標）系では、組換え体の調製は、細菌性トランスポゾンＴｎ７による部位特異的転位に基づいている。目的遺伝子を、クローニング部位の両端に隣接してミニＴｎ７エレメントを有する、pFastBac（商標）にクローン化する。プラスミドを、ＬａｃＺ遺伝子内にＴｎ７の付着部位を含むバキュロウイルスシャトルプラスミド（バクミド）を有する、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）株DH10Bac（商標）（Invitrogen／Gibco BRL、製品カタログ番号１０３６１−０１２）に形質転換する。転位によってＬａｃＺ遺伝子が破壊されることにより、組換え体のみが白色コロニーを生産し、容易に選択される。エシェリキア・コリ（E.coli）での転位を用いる利点は、単コロニーが組換え体のみを含むため、プラーク精製およびスクリーニングが要求されないことである。組換えバクミドを昆虫細胞でトランスフェクションすることにより、組換えタンパク質を発現するバキュロウイルスを作製する。
Bac-to-Bac（登録商標）バキュロウイルス発現系はInvitrogenから市販されており、使用される手順は、例えば、www.invitrogen.comで入手可能な会社のプロトコルに記載されている通りである。目的遺伝子は、例えばpFastBac HTaドナープラスミドへクローン化され、組換えタンパク質の製造は、Bac-to-Bac（登録商標）バキュロウイルス発現系（Invitrogen）に基づいている。
次の段階で、目的遺伝子を含むｐFastBac HTaドナープラスミドを、部位特異的転位で使用することにより、クローン化された遺伝子をバキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）へ移入する。これは、エシェリキア・コリ（E.coli）株DH10Bac（商標）で達成される。目的遺伝子を伴う組換えｐFastBac HTaプラスミドを、転位させるためDH10Bac（商標）細胞へ形質転換することにより、組換えバクミドを作製する。
組換えバクミドを標準プロトコル（Sambrook、前出）により分離する。ＤＮＡサンプルをトランスフェクションに使用した。
バキュロウイルスを作製するため、バクミドをＳｆ９昆虫細胞へトランスフェクションする。トランスフェクション後、細胞を適切な条件下でインキュベーションし、バキュロウイルスを含む培地を集め、貯蔵する。
バキュロウイルスの作製およびタンパク質の発現が確認されると、ウイルスストックを増幅することにより、目的遺伝子をもつバキュロウイルスの濃縮ストックを調製する。バキュロウイルスを少なくとも２回増幅することが当業界での標準的実施法であり、本明細書記載の全プロトコルでも、この標準的実施法を厳守した。第２ラウンドの増幅後、キットの製造業者（Invitrogen）が記載したプロトコルによるプラーク検定法を用いて、作製されたバキュロウイルスの濃度が定量され得る。昆虫細胞に感染させるウイルスの最も適切な濃度および所望のタンパク質製造の最適な時点もまた一般的に確立されている。
目的タンパク質をコード化するＤＮＡを、１コピーの完全ウイルスゲノムを含むプラスミドから特有な制限酵素部位をもつオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにより調製し、融合タンパク質としてＦｃ ＤＮＡと共にクローン化する。Ｎｉ−ＮＴＡ、レクチン、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティー・クロマトグラフィーまたは当業者に熟知されている他の標準的精製方法により、このキメラタンパク質を精製する。
ＩＲＤおよびＴＢＤを連結する第２方法では、分子のいずれか一方に特異的「バイオ-リンカー」、例えばビオチンまたはアビジン（例、ストレプトアビジン）を組み込み、それらを別々に精製し、キメラ抗原を作製する。目的ウイルス性抗原を、バクテリオファージＴ７プロモーターによりタンパク質の発現を制御するプラスミドへクローン化する。次いで、組換えプラスミドを、ｌａｃプロモーターにより調節されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの生産能を有する、エシェリキア・コリ（E.coli）株、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）Codon Plus（商標）ＲＩＬ細胞（Stratagene、製品カタログ番号２３０２４５）へ形質転換する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターについて高度に特異的であり、エシェリキア・コリ（E.coli）宿主のＲＮＡポリメラーゼより生産性がかなり高い（〜８倍速い）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの生成をイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導した場合、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの特異性および生産性は、Ｔ７プロモーターの制御下における遺伝子の高レベルの転写をもたらす。２種のタンパク質をカップリングするため、ビオチンおよびアビジン（例、ストレプトアビジン）間の堅固な結合を利用する。エシェリキア・コリ（E.coli）では、ＢｉｒＡ酵素が、特異的認識配列における特定リシン残基へのビオチンの共有結合を触媒する。マウスＦｃフラグメントを、アビジンとの融合タンパク質として上記要領でバキュロウイルス系において発現させる。これら２種のタンパク質を混合することにより、ビオチン−ストレプトアビジン結合による２量体タンパク質複合体を形成し得る。
本発明の実施法は、特に断らなければ、当業界の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的技術を用いる。上記技術は文献で詳細に説明されている。例えば、Sambrook、前出、およびAusubel、前出参照。
Ｉ．製品およびキット
本発明の別の態様は、組成物の非経口的、例えば皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内または脈管内投与方法の解説を載せた使用指示書を印刷したラベルと組み合わせて注射または注射用の再構成に適切なキメラ抗原を含む組成物を内包する容器を含む製品を提供する。組成物は、組成物と重大な相互作用を起こすことのない適切な容器に含まれ得、それが非経口用であることを示す適切なラベルが貼付され得る。前述した処置方法と一致する使用指示書のラベルが容器に貼付され得る。本発明組成物を内包する容器は、注入に適切な液体組成物を有する容器であり得る。容器は、注射針を刺し込むように適合化され得る。製品は、患者、医師、看護士または他の従業者がキメラ抗原を投与できるように適切な針および注入用注射器を包含し得る。別法として、組成物は、キメラ抗原の可溶性バージョンを含む乾燥または濃縮組成物であり、水性または非水性賦形剤と合わせるかまたはそれで希釈することにより、組成物を溶解または懸濁させ得る。別法として、容器は、液中懸濁液を有し得るか、または不溶性バージョンが懸濁される賦形剤と組み合わせた形の塩の不溶性バージョンであり得る。適切な容器については、Remington、前出、７８８−７８９、８０５、８５０−８５１および１００５−１０１４頁で検討されている。
本発明キットは、典型的には上記容器および商業的および使用者の立場から望ましい物質、例えば緩衝液、希釈液、充填剤、針、注射器、およびパッケージ挿入物を使用指示書と共に含む１個またはそれ以上の他の容器を含む。組成物が特異的治療または非治療的適用に使用されることを示すためのラベルが容器上に貼付され得、上記ラベルはまた、インビボまたはエクスビボでの使用法、例えば上記の使用法を示し得る。使用法および／または他の情報もまた、キットに包含される挿入物に含まれ得る。
Ｖ．実施例
以下、非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１．材料および方法
材料
これらの実施例で記載しているChimigen3 分子で使用するＴＢＤ（便宜上、実施例では
「ＴＢＤ」と称す）は、マウスＨＢｓＡｇ−特異的ｍＡｂを産生し、カナダ国アルバータ、エドモントンのユニバーシティー・オブ・アルバータを通してTyrrell研究室から許可を得たハイブリドーマ２Ｃ１２から誘導される。ＨＣＶ抗原をコード化するＤＮＡを含むプラスミドｐＣＶ−Ｈ７７Ｃを、ユニバーシティー・オブ・アルバータの Tyrrell 研究室から入手した。
ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａクローニングベクター、昆虫セルラインＳｆ９、Cellfectin（商標）試薬、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Platinum Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、TRizol 試薬、Superscript First-Strand Synthesis 逆転写酵素、Ｘ−gal、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を、Invitrogen（米国カリフォルニア、カールスバッド）から購入した。
昆虫細胞培養および発現培地ＥＳＦ９２１を、Expression Systems（米国カリフォルニア、ウッドランド）から購入した。制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、ＨｉｎｄIII、Ｒｓｒ II、Ａｖａ II およびＮｏｔ Ｉを、New England Biolabs（米国マサチューセッツ、イプスウィッチ）から購入した。
Expression Systems Baculovirus Titering Assay を用いてウイルスストックをタイトレーションした。ＩｇＧ２A−ＰＥ（米国カリフォルニア、サンディエゴ、BD Biosciences）を、１：１０に希釈し、イソタイプ対照として使用した。ＦＡＣＳ捕捉および分析を用いて、バキュロウイルス力価を測定した。Becton Dickinson Biosciences FACSCalibur3（４色、デュアルレーザー）で細胞を捕捉し、CELLQuest Pro3ソフトウェア（BD Biosciences）を用いてデータを分析した。Expression Systemsが提供したMicrosoft Excel スプレッドシートにデータを入力し、標準曲線に基づいてウイルス力価を測定した。Ｎｉ−ＮＴＡ Superflow3（Quiagen、ドイツ国ヒルデン）および Toyopearl Super Q3 650C（Tosoh Biosciences、米国オハイオ、グローブシティー）により精製を実施した。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）ゲル調製用の３０％アクリルアミド溶液を、Bio-Rad（米国カリフォルニア、ハーキュラス）から購入した。PageBlue3 染料、５ｘローディング緩衝液、PageRuler3 前染色タンパク質ラダーおよび２０ｘ還元剤を、Fermentas（カナダ国オンタリオ、バーリントン）から購入した。
Hybond3 ＥＣＬニトロセルロースおよびＥＣＬ Western Detectionキット（GE Healthcare）をウエスタン・ブロッティングに使用した。
Tween20、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体、抗マウス（Ｆａｂ特異的）ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体、ヤギ抗ウサギホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体および抗生物質カナマイシン、アンピシリンおよびゲンタマイシンを、Sigma（米国ミズーリ、セントルイス）から購入した。
ウサギ抗ＮＳ５Ａ、ヤギ抗ＮＳ３、およびヤギ抗ＮＳ４ポリクローナル抗体およびマウス抗ＮＳ５Ａモノクローナル抗体を、Abcam（米国マサチューセッツ、キャンブリッジ）から入手した。６ｘＨｉｓホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲートモノクローナル抗体を、Clontech（米国カリフォルニア、パロアルト）から購入した。
Slide-a-lyzer3 カセットおよび Micro ＢＣＡ３アッセイキットを、Pierce（米国イリノイ、ロックフォード）から購入した。
Pro-Q（登録商標）Emerald 300 Glycoprotein GelおよびBlot Stain Kitを、Molecular Probes（米国カリフォルニア、カールスバッド）から購入した。
健康なドナーからの白血球搬出サンプルを、SeraCare Life Sciences（米国カリフォルニア、オーシャンサイド）から購入した。Ｔ細胞ネガティブ・アイソレーション用のDynal Dynabeads3を、Invitrogen（米国カリフォルニア、カールスバッド）から購入した。Ｌ−グルタミン、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含む AIM V（商標）培地を、Invitrogenから購入した。適合ドナー血清を、フィコール−ハイパーク血液調製物の遠心分離後の血清画分から入手した。AIM V（商標）培地中５０％の血清を加熱不活化し、アリコートに分け、−２０℃で貯蔵した。ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をInvitrogenから入手した。
以下の特異性をもつコンジュゲートモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、BD Biosciences（カリフォルニア、サンディエゴ）から入手した：ＣＤ６４−フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３２−Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ＣＤ１６−ＰＥ、ＣＤ２０６−ＰＥ−Ｃｙ５、ＣＤ８０−ＰＥ、ＣＤ８６−ＦＩＴＣ、ＣＤ８３−ＰＥ、ＣＤ４０−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１ｃ−ＰＥ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ３−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ６９−ＦＩＴＣ、ＣＤ６９−ＡＰＣ、ＨＬＡ−ＡＢＣ−ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、ＩＦＮ−γ−ＰＥ、ＴＮＦ−α−ＰＥ、ｇｒＢ−ＦＩＴＣ、ｐｆｎ−ＦＩＴＣおよびマウスＩｇＧ１−ビオチン。ビオチニル化抗６ｘＨｉｓを、Qiagen（カナダ国オンタリオ、ミッシサウガ）から入手した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ビオチン抗体を、Jackson ImmunoResearch Laboratories（ペンシルベニア、ウエストグローブ）から入手した。マウスイソタイプｍＡｂおよびＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５を、BD Biosciencesから入手した。混合異性体５−（および６）−カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（５（６）−ＣＦＤＡ、ＳＥ；ＣＦＳＥ）を、Invitrogenから入手した。
抗原に対するＴ細胞の特異性を、特異的ＰＥ−コンジュゲート四量体（Beckman Coulter、カナダ国オンタリオ、ミッシサウガ）または五量体（ProImmune、バージニア、スプリングフィールド）の使用により測定した。使用した五量体は、ＨＣＶ ＮＳ５ＡペプチドＶＬＳＤＦＫＴＷＬ（配列番号３）／ＨＬＡ−Ａ２およびＨＣＶ ＮＳ３ペプチドＣＩＮＧＶＣＷＴＶ（配列番号４）／ＨＬＡ−Ａ２を含んでいた。使用した四量体は、ＥＢＶペプチドＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号５）／ＨＬＡ−Ａ２、ＨＣＶ ＮＳ３ペプチドＫＬＶＡＬＧＩＮＡＶ（配列番号６）／ＨＬＡ−Ａ２および負の対照四量体（複対立遺伝子）を含んでいた。
以下のサイトカインを、R & D Systems（ミネソタ、ミネアポリス）から購入した：インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子−Ｉ（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−Ｋ（ＩＦＮ−γ）、およびインターフェロン−Ｉ（ＩＦＮ−α）。製造業者の使用指示書にしたがって、サイトカインを再構成し、アリコートに分け、−７０℃で貯蔵した。ポリＩＣを、Sigmaから購入した。
Wave Bioreactor System23/10EH および Cellbag 10L/Oを、Wave Biotech（米国ニュージャージー、ソマーセット）から購入した。
方法
発現プラスミド構築
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ-ＴＢＤ、親プラスミド構築物
ＨＢＶ表面抗原（ｓＡｇ）に対してｍＡｂを産生するハイブリドーマ２Ｃ１２から分離したｍＲＮＡから、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域のアミノ酸をコード化するマウスＩｇＧ１ ＤＮＡ配列を作製した。TRizol試薬を用いて全ｍＲＮＡを単離し、Superscript First-Strand Synthesis を用いるＲＴ−ＰＣＲによりＴＢＤのｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲプライマーは、５'末端にリンカーペプチド−ＳＲＰＱＧＧＧＳ−（配列番号１）をコード化するリンカー配列、５'末端に特有なＮｏｔ Ｉ部位および３'末端に特有なＨｉｎｄ III制限部位を含んでいた。生成したｃＤＮＡは、（５'Ｎｏｔ Ｉ）−リンカー配列−ＣH１（ＶＤＫＫＩ：配列番号２）の部分−ＣH２−ＣＨ３（３'Ｈｉｎｄ III）を含む。制限酵素で消化後、同じ制限酵素部位を用いてフラグメントをｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａ発現プラスミドベクターと連結した。ＰＣＲ増幅に用いた５'プライマーは、（センス）５'−ＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＡＧＧ−３'（配列番号７）であり、３'プライマーは、（アンチセンス）５'−ＡＣＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ−３'（配列番号８）であり、Ｎｏｔ ＩおよびＨｉｎｄ III部位をそれぞれ含んでいた。増幅したＤＮＡをＮｏｔ ＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化し、フラグメントをアガロースゲルにより精製し、同じ制限酵素で消化したｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａ発現ベクタープラスミドと連結することにより、発現プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤを調製した。この生成物を用いて、融合タンパク質６ｘＨｉｓ標識−ｒＴＥＶプロテアーゼ開裂部位−ＴＢＤを発現させた。ＤＮＡ配列および読み取り枠（ＯＲＦ）の正確さを、標準配列決定方法により証明した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号９）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号１０）を図２に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４の構築
分泌については、アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ｇｐ６４タンパク質からのシグナル配列を、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａにクローン化した。２つのオリゴヌクレオチドを合成し、一緒にアニーリングした。オリゴヌクレオチド配列は、５'−ＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＣＧＣＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＴＣＣＧＡＴＧＣ−３'（配列番号１１）および５'−ＧＣＡＴＣＧＧＡＣＣＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＣＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＣ−３'（配列番号１２）である。オリゴヌクレオチドは、５'Ａｖａ II部位および３'Ｒｓｒ II部位を含む。Ａｖａ IIおよびＲｓｒ IIで消化後、フラグメントを、６ｘＨｉｓ標識の上流に隣接してｇｐ６４シグナル配列を置くＲｓｒ II消化ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａへクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａ−ｇｐ６４を作製した。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン融合タンパク質発現ベクタープラスミドの構築
ＰＣＲ方法を用いて、ＨＣＶ ＮＳ５Ａフラグメントをコード化するＤＮＡを、プラスミドｐＣＶ−Ｈ７７Ｃ鋳型から調製した。ＰＣＲに使用した５'プライマーは、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ部位を含む（センス）５'−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＧＧ−３'（配列番号１３）であった。３'末端についてのＰＣＲプライマーは、制限酵素Ｓｐｅ Ｉ部位を含む（アンチセンス）５'−ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＡＣＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴ−３'（配列番号１４）であった。増幅ＤＮＡを制限酵素で消化し、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａ−ＴＢＤに連結することにより、発現プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン（またはｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤ）を調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるヌクレオチド配列（配列番号３９）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号４０）を図３に示す。ＮＳ５Ａ単独の場合、ＮＳ５Ａフラグメントを、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｓｐｅ Ｉ消化ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａへ連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ５Ａを調製した。
分泌に関するｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン発現プラスミドの構築
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４へＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチンをクローン化するため、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン（上記）を、Ｒｓｒ IIおよびＨｉｎｄ IIIで消化し、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチンフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により精製した。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチンフラグメントを、Ｒｓｒ IIおよびＨｉｎｄ III消化ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４プラスミドに連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン（ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤ）発現プラスミド（ＩＤＡＣ受入番号１１１００６−０４）を生成した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５２）を図４に示す。
分泌に関するｐＰＳＣ１２−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤ Chimigen（商標）ワクチン発現プラスミドの構築
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン分子の分泌を促進するため、プラスミドｐＰＳＣ１２（Protein Sciences Corporation）へのクローニングを実施した。このプラスミドは、バキュロウイルスのアウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）からのキチナーゼ遺伝子に関するシグナルペプチドを有する。４つのＰＣＲプライマーが、目的遺伝子をトランスファーベクターへクローン化するのに必要とされた。２種の特有なプライマー（プライマー１ ＧＴＴＴＣＴＡＡＣＧＣＧＴＣＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号１５）および２ ＣＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号１６））を用いて、目的遺伝子を増幅した。別々の２種のプライマーが、上流多面体プロモーターおよびシグナルペプチド配列を含む、多面体上流領域を増幅するのに必要とされた（プライマー３ ＣＴＧＧＴＡＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＧＴＧ（配列番号１７）および４ ＧＧＴＡＧＴＡＣＧＡＣＧＣＧＴＴＡＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＣ（配列番号１８））。最後に、２種の外側プライマー（プライマー３および２、上記配列）を、不可欠なオーバーラップ伸長ＰＣＲで使用した。プライマー４の５'末端にアニーリングする配列を含むプライマー１およびベクターへクローニングするための特有な３'Ｋｐｎ Ｉ部位を付加するプライマー２を用いるＰＣＲにより、ＮＳ５Ａ−ＴＢＤをｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤから増幅した。ｐＰＳＣ１２の上流多面体領域を、オーバーラップ伸長ＰＣＲ中にプライマー１の５'末端にアニーリングさせ得るプライマー４およびプライマー３で増幅した。この上流領域はまた、ベクターへのクローニングに使用される特有なＮｇｏＭ IV 部位を含む。上流多面体プロモーター、シグナルペプチド配列、および所望の遺伝子を、プライマー２および３を用いるオーバーラップ伸長ＰＣＲによりシームレス融合した。完全長融合生成物を、ＮｇｏＭ ＩＶおよびＫｐｎ Ｉで消化し、生じたフラグメントを、同様に消化したｐＰＳＣ１２へ連結することにより、ｐＰＳＣ１２−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤを生成した。ｐＰＳＣ１２−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４２）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５３）を、図５に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ ＮＳ３ Chimigen（商標）ワクチンプラスミドの構築
以下のプライマーを用いるＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１０２７〜１６５２（ｎｔ３４２０〜５２９４）のプラスミドｐＣＶ−Ｈ７７Ｃ鋳型からのＰＣＲにより、ＮＳ３をコード化するＤＮＡを調製した。ＮＳ３の最終Ｃ−末端６アミノ酸はＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性に関する標的配列であるため、それらの配列を構築物には含ませなかった。使用した５'末端プライマーは、Ｅｃｏ ＲＩ制限部位を含む５'−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＴＡ−３'（配列番号１９）であり、３'末端プライマーは、Ｓｐｅ Ｉ制限部位を含む５'−ＣＣＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣ ＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴ−３'（配列番号２０）であった。Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｐｅ Ｉによる二重消化による生成物を、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤと連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＮＳ３−ＴＢＤを調製した。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ ＮＳ３ Chimigen（商標）ワクチンプラスミドベクターの突然変異導入
細胞性プロテアーゼ（複数も可）により伝達されると思われる、昆虫細胞での発現時におけるＮＳ３タンパク質の内部開裂については、Shoji et al.［（１９９９）Virology ２５４：３１５−３２３］により報告されており、１４８８位にアルギニン残基をもたらす。オーバーラップ伸長（ＯＥ）ＰＣＲを用いて、アミノ酸アルギニンからアラニンへの突然変異を導入することにより、ＮＳ３ Chimigen３タンパク質のＮＳ３部分の上記開裂を回避した。２つのＮＳ３ ＤＮＡフラグメントを、親ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＮＳ３−ＴＢＤプラスミドから調製した。Ｅｃｏ ＲＩ制限部位を含むプライマー５'−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＴＡ−３'（配列番号１９）および突然変異プライマー（アルギニンからアラニンへの突然変異を含む）５'−ＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＣＧＴTＧＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧ−３'（配列番号２１）により、５'ＮＳ３フラグメントを調製した。３'ＮＳ３フラグメントを、５'プライマー５'−ＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴ−３'（配列番号２２）およびＳｐｅ Ｉ制限部位を含む３'プライマー５'−ＣＣＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴ−３'（配列番号２０）により調製した。ＯＥ ＰＣＲを５'および３'ＮＳ３フラグメントに２種の外側プライマーを加えて実施した。Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｐｅ Ｉでの二重消化による生成物を、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤと連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤ（ＩＤＡＣ受入番号１１１００６−０５）を調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４４）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５５）を図７に示す。タンパク質の推定分子量は９８.３ＫＤａである。ＮＳ３ｍｕｔ単独の場合、ＮＳ３ｍｕｔフラグメントをＥｃｏ ＲＩおよびＳｐｅ Ｉでの消化により分離し、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａへクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ３ｍｕｔを調製した。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ Chimigen（商標）ワクチンベクタープラスミドの構築
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤプラスミドを、Ｒｓｒ IIおよびＨｉｎｄ III 制限酵素で消化し、ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤフラグメントを、Ｒｓｒ IIおよび Ｈｉｎｄ III消化ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４へクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤ（受入番号１１１００６−０２）を調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５６）を図８に示す。タンパク質の推定分子量は、１０１.５ＫＤａである。また、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤ（ただし、１つの自然突然変異を欠き、別のものを有する）を作製するのに使用したのと類似した突然変異ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤフラグメントのクローンを、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４に連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤの第２クローンを調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＴＢＤの第２クローンにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５４）を図６に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ多抗原Chimigen（商標）融合タンパク質発現ベクタープラスミドの構築
ＨＣＶ多抗原ベクタープラスミドを作製するため、まずＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ配列をクローン化した。ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａをコード化するＤＮＡ配列を、プライマー、５'末端についての５'−ＧＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣ−３'（配列番号２３）および３'末端についての５'−ＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＧ−５'（配列番号２４）を用いるプラスミドｐＣＶ−Ｈ７７ＣからのＰＣＲにより調製した。これらのプライマーでのＰＣＲにより、５'末端にＳｐｅ Ｉ部位および３'末端にＮｏｔ Ｉ部位の特有な制限酵素部位をもつ生成物を得た。ＰＣＲ産物をＳｐｅ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し、Ｓｐｅ ＩおよびＮｏｔ Ｉ消化ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４に連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａを得た。次に、ＴＢＤ部分を構築物に付加した。プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａを、Ｓｐｅ ＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化した。Ｓｐｅ Ｉ／Ｈｉｎｄ III消化ＴＢＤフラグメントを分離し、消化されたｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤを調製した。
ＮＳ３活性部位セリン残基の突然変異導入
ＮＳ３では、活性部位セリン（ｓｅｒ１１６５）からアラニンへの突然変異を導入することにより、プロテアーゼ活性を排除した。内側２種および５'および３'末端に相補的なもの２種の４種の異なるプライマーを用いて、鋳型としてのｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤによるＯＥ ＰＣＲにより２つのＮＳ３フラグメントを作製した。制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ部位を含む、５'末端プライマー（センス）５'ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＴＡ−３'（配列番号１９）および突然変異プライマー（ｓｅｒからａｌａへの突然変異を含む）（アンチセンス）５'−ＣＡＡＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧＴＡＧ−３'（配列番号２５）を用いて、５'ＮＳ３フラグメントを作製した。５'末端プライマー（センス）５'ＧＴＣＣＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＧＡＣＡＣＧ−３'（配列番号２６）および制限酵素Ｓｐｅ Ｉ部位を含む、３'末端プライマー（アンチセンス）５'−ＣＣＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡ−３'（配列番号２７）を用いて、３'ＮＳ３フラグメントを作製した。５'および３'フラグメントおよび２種の外側プライマーからのＯＥ−ＯＣＲにより、完全長ＮＳ３（ｓｅｒ１１６５→ａｌａ）を調製した。Ａｒｇ１４８８からＡｌａおよびＳｅｒ１１６５からＡｌａへの突然変異を伴うこの生成物をＮＳ３ｍｕｔＳと呼ぶ。このフラグメントをｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４へクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３ｍｕｔＳ−ＴＢＤ（ＩＤＡＣ受入番号１１１００６−００１）を作製した。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ 多抗原融合タンパク質ベクタープラスミドの構築
融合タンパク質ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔＳ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５の発現に使用され得る構築物を作製するため、ＮＳ３ｍｕｔＳ ＯＥ−ＰＣＲ産物を、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｐｅ Ｉで消化した。消化されたＮＳ３ｍｕｔＳを、Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｐｅ Ｉ消化プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤへ連結することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ多抗原プラスミドである、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤ（ＩＤＡＣ受入番号１１１００６−０６）を作製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４６）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５７）を図９に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ５Ａ 多抗原融合タンパク質ベクタープラスミドの構築
ＨＣＶ ＮＳ５ＡおよびＴＢＤについてのＤＮＡを、鋳型ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤからのＰＣＲにより調製した。Chimigen（商標）ワクチン融合タンパク質発現ベクタープラスミド。ＰＣＲ用の５'プライマーは、制限酵素Ｓｐｅ Ｉの認識部位を含む（センス）５'−ＧＡＧＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡＣ−３'（配列番号２８）であった。３'末端についてのＰＣＲプライマーは、（アンチセンス）５'−ＣＣＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＧＡＣ−３'（配列番号２９）であった。ＰＣＲ産物（ＮＳ５Ａ−ＴＢＤ）をゲル精製し、それに続いてＳｐｅ ＩおよびＨｉｎｄ III制限酵素で消化した。プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤを、制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化すると、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡおよびＴＢＤをコード化する配列から成るフラグメントが遊離した。生じたｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ３ベクターバックボーンをゲル精製し、ＮＳ５Ａ−ＴＢＤフラグメントに連結することにより、発現プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチン（ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤ）（ＩＤＡＣ受入番号１１１００６−０３）を生成した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５８）を図１０に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤ融合タンパク質プラスミドおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）の構築
ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１−１７７（ｎｔ３４２−８７２）をコード化するＨＣＶコアＤＮＡ配列を、ｐＣＶ−Ｈ７７Ｃからの５'プライマー ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣ（配列番号３０）および３'プライマー ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣ（配列番号３１）でのＰＣＲにより増幅した。使用したプライマーは、特有な５'ＥｃｏＲ Ｉおよび３'Ｓｐｅ Ｉ部位を付加した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤおよびｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａに連結することにより、Chimigen（商標）ワクチン構築物ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）をそれぞれ調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４８）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号５９）を図１１に示す。
ＨＣＶコア（１−１７７）を、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４およびｐＰＳＣ１２へクローン化することにより、タンパク質を分泌形態で製造した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４へクローニングするため、ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤフラグメントを、Ｒｓｒ IIおよびＨｉｎｄ III消化によりｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤから分離し、同様に消化されたｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４へクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤを生成した。
ｐＰＳＣ１２へのクローン化については、プライマー２が特有な３'Ｂｇｌ II部位（ＡＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ；配列番号３２）をコード化すること以外、ＮＳ５Ａ−ＴＢＤについて記載したのと類似したスキームを使用した。生成した構築物は、ｐＰＳＣ１２−ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤである。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ Ｅ１−ＴＢＤ融合タンパク質プラスミドおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１の構築
ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２−３６９（９１４−１４５２）をコード化するＤＮＡ配列を、特有な５'ＥｃｏＲＩ部位および特有な３'Ｓｐｅ Ｉ部位を加える５'プライマーＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＧＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴ（配列番号３３）および３'プライマーＧＣＧＣＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣ（配列番号３４）でｐＣＶ−Ｈ７７Ｃから増幅した。全Ｅ１読み取り枠はアミノ酸３８３で終わるが、アミノ酸３７０および３８３間の領域は、Ｅ２についてのシグナル配列であるため、増幅されなかった。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、同様に消化したｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤへ連結することにより、ＨＣＶ Ｅ１ Chimigen（商標）構築物ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−ＴＢＤを生成した。Ｅ１を単独で発現するため、消化したＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａへクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１を生成した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号６０）を図１２に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ Ｅ２−ＴＢＤ融合タンパク質プラスミドおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ２の構築
アミノ酸３８４〜７１８（ＨＣＶポリタンパク質のｎｔ１４９４〜２４９５）のＥ２配列を、特有な５'ＳｐｅＩ部位および特有な３'ＮｏｔＩ部位を付加する５'プライマーＧＣＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧ（配列番号３５）および３'プライマーＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧＣ（配列番号３６）を用いてｐＣＶ−Ｈ７７ＣからＰＣＲにより増幅した。アミノ酸７１９〜７４６は、ｐ７についてのシグナル配列であるため、構築物には含まれなかった。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に消化したｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤへ連結することにより、ＨＣＶ Ｅ２ Chimigen（商標）構築物ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ Ｅ２−ＴＢＤを生成した。また、Ｅ２タンパク質を単独で発現させるため、消化したＥ２を、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＨＴａへクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ２を生成した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ Ｅ２−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号５０）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号６１）を図１３に示す。
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２−ＴＢＤ融合タンパク質プラスミドおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２の構築
ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１におけるＥ１配列をｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ２へサブクローニングすることにより、Ｅ１およびＥ２タンパク質の融合体を調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１プラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ消化ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ２へクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２を調製した。Ｅ１−Ｅ２ Chimigen（商標）構築物を作製するため、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に消化したｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤへクローン化することにより、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２−ＴＢＤを調製した。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびＯＲＦによりコード化されたアミノ酸配列（配列番号６２）を図１４に示す。
Bac-to-Bac（登録商標）発現系における組換えバキュロウイルスの製造
エシェリキア・コリ（E.coli）の形質転換
連結させたプラスミドを用いて、エシェリキア・コリ（E.coli）ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドを標準プロトコルにより分離した。配列および読み取り枠を配列決定により立証し、組換えバキュロウイルスの製造に使用した。
転位
組換え体の作製は、細菌性トランスポゾンＴｎ７による部位特異的転位を用いるBac-to-Bac（登録商標）クローニング系（Invitrogen）に基づく。これをエシェリキア・コリ（E.coli）株ＤＨ１０Ｂａｃで遂行する。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞は、カナマイシン耐性を付与するバクミドｐＭＯＮ１４２７２、およびトランスポザーゼをコード化し、テトラサイクリン耐性を付与するヘルパープラスミド（ｐＭＯＮ７１２４）を含む。
クローニング部位の両端に隣接するミニＴｎ７エレメントを有するｐＦａｓｔＢａｃプラスミドへ目的遺伝子をクローン化する。ＬａｃＺα遺伝子内にＴｎ７の付着部位を含むバキュロウイルスシャトルプラスミド（バクミド）を有する、エシェリキア・コリ（E.coli）株ＤＨ１０Ｂａｃへプラスミドを形質転換する。この転位により、ＬａｃＺα遺伝子が破壊されるため、組換え体のみが白色コロニーを生じることから、容易に選択される。
エシェリキア・コリ（E.coli）での転位を用いる利点は、単一コロニーが組換え体のみを含むことである。標準プラスミド分離プロトコルを用いて組換えバクミドを分離し、昆虫細胞でのトランスフェクションに使用することにより、組換えタンパク質を発現するバキュロウイルスを作製する。
ドナープラスミドおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ Chimigen（商標）ワクチンベクターを、バキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）へのクローン化遺伝子の部位特異的転位に使用した。目的遺伝子を伴う組換えｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４プラスミドを、転位用のＤＨ１０Ｂａｃ細胞へ形質転換することにより、組換えバクミドを調製した。４０μＬアリコートの形質転換能ＤＨ１０Ｂａｃ細胞を氷上で解凍し、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４に基づくプラスミドを加え、電気穿孔により形質転換を遂行した。形質転換混合物を１ｍＬのＳＯＣ培地に加え、４時間３７℃でインキュベーションした。形質転換細胞をＬＢで１０−１および１０−２に系列希釈し、各希釈液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（７μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（２００μｇ／ｍＬ）およびＩＰＴＧ（４０μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢ寒天プレートで培養し、少なくとも３６時間３７℃でインキュベーションした。
ゲンタマイシン耐性は、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４プラスミドにより付与され、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧは、白色コロニー（組換えバクミド）と青色コロニー（非組換え体）間を区別するのに使用された。白色コロニーを採取し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（７μｇ／ｍＬ）、およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢ２ｍＬに接種し、振とうしながら３７℃で一晩インキュベーションした。滅菌ループを用いて、少量の一晩培養物の試料を採取し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（７μｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）、Ｘ−ｇａｌ（１００μｇ／ｍＬ）およびＩＰＴＧ（４０μｇ／ｍＬ）を補った新鮮なＬＢ寒天プレートへ線状に接種し、少なくとも３６時間３７℃でインキュベーションし、白色表現型を確認した。
組換えバクミドを標準プロトコル［Sambrook et al.（２００１）In Molecular Cloning、A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー・プレス］により単離し、ＤＮＡ試料を４０μＬのＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶かし、トランスフェクションに使用した。
トランスフェクション：組換えバキュロウイルスの作製
組換えバキュロウイルスを作製するため、適切なバクミドをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションした。Ｓｆ９細胞（９×１０５）を、２ｍＬのＥＳＦ９２１中の６ウェル細胞培養皿（３５ｍｍウェル）の各ウェルに播種し、少なくとも１時間２７℃で付着させた。Ｓｆ９細胞の供給者が提供したプロトコルにより、Cellfectin（商標）試薬を用いて、トランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、細胞を２７℃で７２時間インキュベーションした。バキュロウイルスを含む培地を集め、暗所中４℃で貯蔵した。
バキュロウイルスＤＮＡの生成についてチェックすることにより、トランスフェクションの有効性を証明した。単離したバキュロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲにかけ、挿入した目的遺伝子についてスクリーニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびプローブとして６ｘＨｉｓ標識−ＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗体または抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いるウエスタン・ブロッティングにより、細胞における異種タンパク質の発現を証明した。
組換えバキュロウイルスストックの増幅
バキュロウイルスの生成および所望のタンパク質の発現が確認されると、ウイルス濃度を増幅することにより、興味の対象である遺伝子をもつバキュロウイルスの濃縮ストックを製造した。本明細書記載の全プロトコルでは、少なくとも２回バキュロウイルスを増幅する標準的実践法に従った。第２ラウンドの増幅後、生成したバキュロウイルスの濃度を、バキュロウイルスタイトレーションアッセイ（Expression Systems）を用いて定量した。Ｓｆ９細胞を感染させるのに最も適切なウイルス濃度および目的タンパク質の最適な生成時間についても確立された。Ｓｆ９細胞の単層および懸濁培養物の両方に関する発現についてのプロトコルを、標準手順にしたがって展開した。
バキュロウイルスタイトレーションアッセイ
Expression Systems バキュロウイルスタイトレーションアッセイを用いて、全ウイルスストックをタイトレーションする。ウイルスストックを１０−１から１０−４まで系列希釈した。各希釈試料の１００μＬアリコートを、Costar Low Attachment3 ９６ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、２×１０６細胞／ｍＬの濃度で、１００μＬのＳｆ９細胞を各ウェルに加え、プレートを２７℃で１８時間、２００〜２５０ｒｐｍでのオービタル振とうインキュベーター中においてインキュベーションした。
インキュベーション後、ｇｐ６４−ＰＥコンジュゲート抗体を、１：２００に希釈し、イソタイプ対照（ＩｇＧ２Ａ−ＰＥ）を１：１０に希釈した。プレートを、３分間１８００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。培地をプレートの転置により除去し、５０μＬのｇｐ６４−ＰＥコンジュゲート抗体または５０μＬのイソタイプ対照をウェルに加えた。次いで、プレートを暗所中４℃で２０分間インキュベーションした。
１５０μＬの冷ＰＢＳを各ウェルに加え、上記要領でプレートを遠心分離にかけることにより、細胞を洗浄した。次に、２００μＬの冷ＰＢＳを各ウェルに加え、もう一度スピンさせ、最後に２００μＬのＰＢＳ／０.１％ＢＳＡを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、分析用のＦＡＣＳ管へ移した。イソタイプ対照を用いて、蛍光フローサイトメーターにおけるゲートを設定した。提供された Excel スプレッドシートへ発現について陽性である細胞集団のパーセンテージを挿入し、対照ウイルスに基づいて標準曲線を作成することにより、ウイルス力価を測定した。
タンパク質発現の最適化
Chimigen（商標）タンパク質発現を、ある一定範囲のＭＯＩおよび時間にわたって最適化した。ＥＳＦ９２１中のＳｆ９細胞の４×５０ｍＬ培養物を、２×１０６細胞／ｍＬで播種し、０.５、１、５および１０のＭＯＩで感染させ、感染後様々な時点で１ｍＬの培養物を採取した。試料採取した培養物を、１分間１２０００×ｇでの遠心分離にかけ、上清および細胞を分離した。細胞および上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用にその場で調製した。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、１５０μＬの懸濁液を４０μＬの５×ローディング緩衝液および１０μＬの２０×還元剤に加えた。また、１５０μＬの上清を、４０μＬの５×ローディング緩衝液および１０μＬの２０×還元剤と混合した。試料を５分間沸騰させ、ウエスタン・ブロット分析用に１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルへローディングした。タンパク質生産を評価したところ、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質については３６時間および０.５のＭＯＩで最良であり、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質については４８時間および２のＭＯＩで最良であり、多抗原Chimigen（商標）タンパク質については３６時間および１.５のＭＯＩで最良であった。
細胞内Chimigen（商標）ワクチンの精製
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の大規模発現および細胞ライゼートの調製
ＥＳＦ９２１培地中〜２×１０６細胞／ｍｌの密度で、５リットルのＳｆ９細胞培養物を、０.５のＭＯＩでバキュロウイルスにより感染させた。細胞生存能が〜９５％である感染開始の〜３６時間後、細胞を採取した。発現時間が長いとき、細胞生存能の損失は増大し、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の分解は激しくなる。感染細胞を遠心分離により集め、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
１Ｌ感染細胞培養物からの冷凍ペレットを、高濃度のTween 20（６ＭのＧｕＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.５ＭのＮａＣｌ、１％Tween 20、１０ｍＭの９−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０）を含む２００ｍｌの溶菌緩衝液中、氷上で渦状に混合することにより、迅速に再懸濁した。高濃度のTween２０が、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂へのＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の有効な結合には必要であった。再懸濁した懸濁液を、３×１分間各音波処理パルス間は２分間隔として、氷上で音波処理した。次いで、音波処理したライゼートを室温で２時間攪拌した。攪拌したライゼートを遠心分離（〜２７０００×ｇ、１５分間、１０℃）により澄明にし、上清をＮｉ−ＮＴＡスーパーフローでのアフィニティー・クロマトグラフィーに使用した。
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質の発現および細胞ライゼートの調製
標準化感染多重度（ＭＯＩ）のＨＣＶ ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質をコード化する組換えバキュロウイルスを用いて、細胞発現用にＳｆ９細胞を感染させた。Ｓｆ９細胞を、２Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中のＥＳＦ９２１培地５００ｍＬ中、６×１０５細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞密度が２〜３×１０６細胞／ｍＬに達するまで、細胞培養物を１２０ｒｐｍで振とうしながら２７.５℃でインキュベーションした。ＨＣＶ ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質については、細胞を４８時間２のＭＯＩで感染させた。細胞ライゼートでのウエスタン・ブロット分析を実施して、興味の対象であるタンパク質の発現をモニターした。４℃で１０分間、３０００ｒｐｍでの遠心分離（１５９３×ｇ、ＪＡ１０、Beckman Coulter Avanti（商標）J ２５）により細胞を採取し、新鮮な細胞ペレットを組換えタンパク質の精製に使用した。別法として、細胞ペレットを条件培地により再懸濁し、５０ｍＬの円錐管（各管には２５０ｍＬの細胞培養物）へ分配し、Beckman GS-6R 遠心分離機中４℃で８分間、２２００ｒｐｍでスピンさせた。細胞ペレットを液体窒素中急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。
冷凍した細胞ペレット（均等内容の２×５００ｍＬの細胞培養培地）を、７８Ｗ（６.５に設定）で１分間音波処理により氷冷溶菌緩衝液（６ＭのＧｕＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.００）２００ｍＬに氷上で再懸濁した。混合物を２５０ｍＬのガラス製ビーカーに移し、５分の冷却中断期間をおいて、１分間毎回７８Ｗでさらに４回音波処理した。混合物を室温に戻し、ＣＴＡＢを１％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように加えた。ｐＨをチェックし、ｐＨ８.００に調節し、ライゼートを２時間インキュベーションした。Beckman Avanti Ｊ−２５遠心分離機中ＪＡ２５.５０ローターを用いて、ライゼートを１０℃で３０分間、１５０００ｒｐｍ（２７０００×ｇ）での遠心分離にかけ、上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
多抗原Chimigen（商標）タンパク質の大規模発現および細胞ライゼートの調製
４リットルのＥＳＦ９２１培地を、セルバッグ(Cellbag)中に移し入れ、Wave Bioreactor System2/10EH において２７.５℃まで温めた。６×１０６細胞／ｍＬのＳｆ９細胞培養物１リットルをセルバッグに加えた。次いで、１分間に０.３Ｌの空気を注入しながら、バッグを２７.５℃でインキュベーションし、１３０ｒｐｍで振動させた。細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌに達したとき、組換えバキュロウイルスを１.５のＭＯＩで接種した。感染の３６時間後、バッグを氷上で冷却し、４℃で１０分間、４５００×ｇでの遠心分離により細胞を採取した。細胞ペレットを氷冷ＰＢＳに懸濁し、次いで５０ｍＬ円錐管に移し入れた（１管当たり３００ｍＬ培養物からのペレット）。細胞ペレットを４℃で１５分間、２８００×ｇでの遠心分離により回収した。ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、使用時まで−８０℃冷凍庫中で貯蔵した。
２５０ｍｌ培養物からの冷凍Ｓｆ９細胞ペレットを、２０ｍｌの１ＸＰＢＳ、１％Tween 20、５０ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０に懸濁し、氷上で３０分間インキュベーションした。ライゼートのｐＨをＮａＯＨによりｐＨ１２.０に調節し、室温で３０分間攪拌した。ｐＨをＨＣｌにより８.０まで下げ、３０分間３９１９１×ｇで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを２０ｍｌの１ＸＰＢＳ、１％Tween 20、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０に懸濁した。上記要領で、ｐＨを１２.０まで上昇させ、８.０まで低下させた。上清をプールし、サイズ排除および疎水性相互作用クロマトグラフィーで使用するため、２０ｍＭのトリス、０.０５％Tween 20、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの９−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０に対して透析した。
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーについては、５００ｍｌ培養物からの冷凍Ｓｆ９細胞ペレットを、５０ｍＬの氷冷溶菌緩衝液（６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭの炭酸ナトリウム、２０％のエタノール、ｐＨ１０）に懸濁した。細胞ライゼートを、８０Ｗで１分間、Sonicator 3000（Misonic Inc.）により氷上で５回音波処理した。Tween 20をライゼートに加え（最終濃度１％）、ライゼートを室温で２時間攪拌した。ライゼート中の不溶性粒子を、４℃で３０分間、３９１９１×ｇでの遠心分離により除去し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
ＨＣＶ コアChimigen（商標）タンパク質の発現および細胞ライゼートの調製
ＨＣＶコアChimigen（商標）を２つの系で発現させた。Ｓｆ９細胞におけるｐＰＳＣ１２−ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤおよび線状バキュロウイルスゲノムのコ-トランスフェクションにより、組換えウイルスを作製し、プラーク精製し、増幅した。最適化後、Ｓｆ９培養物を５のＭＯＩで感染させ、２７.５℃で５０時間のインキュベーション後に採取した。また、Bac-to-Bac（登録商標）系を用いて、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤによるエシェリキア・コリ（E.coli）ＤＨ１０Ｂａｃ細胞のトランスフェクションにより組換えウイルスを作製した。組換えバクミドを単離し、これを用いてＳｆ９細胞をトランスフェクションすることにより、組換えバキュロウイルスを作製した。Ｓｆ９培養物を、２７.５℃で４９時間、５のＭＯＩで感染させた後、遠心分離により採取した。本質的に他のChimigen（商標）タンパク質について記載したのと同じ方法でライゼートを調製し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィー
細胞ライゼートを、１０ベッド容量の溶菌緩衝液で平衡させておいたＮｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（細胞培養ペレット２.５Ｌにつき１０ｍｌの樹脂ベッド容量）にローディングした。低％のTween 20（６ＭのＧｕＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.５ＭのＮａＣｌ、０.１％Tween 20、１０ｍＭの９−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０）を含む洗浄緩衝液で、カラムをＡ２８０＜０.０１となるまで洗浄し、次いで、１５ｍＭのイミダゾールを含む同じ洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、標的タンパク質を、１ベッド容量フラクション中、１０ｍｌベッド容量の溶離緩衝液（６ＭのＧｕＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのイミダゾール、０.１％Tween 20、１０ｍＭの９−メルカプトエタノール、ｐＨ８.０）で溶離した。溶離したタンパク質を含むフラクションをプールし、透析緩衝液３×４Ｌ（８Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス、０.１％のTween 20、２５ｍＭのエチレンジアミン、１０ｍＭの９−メルカプトエタノール、ｐＨ８.５）に対して透析した。尿素含有緩衝液を全て脱イオン化尿素で調製することにより、タンパク質のカルバミル化を阻止した。尿素をAmberlite（商標）ＭＢ−１（Supelco、米国ペンシルベニア）（１０ｇ／Ｌ／時）で脱イオン化し、シアン酸スカベンジャーのエチレンジアミンを緩衝液に加えた（２５ｍＭ最終濃度）。
イオン交換クロマトグラフィー
次に、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーにより得た透析ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質含有試料を、透析緩衝液で平衡させておいたToyopearl（商標）Super Ｑ３樹脂カラム（２.５ｍｌベッド容量／２.５Ｌ細胞培養物ペレット）に通した。イオン交換カラムを、Ａ２８０＜０.０１となるまでイオン交換洗浄緩衝液（８Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス、０.０５％のTween 20、２５ｍＭのエチレンジアミン、１０ｍＭの９−メルカプトエタノール、ｐＨ８.５）で洗浄した。次いで、タンパク質が、増加濃度の塩（７５ｍＭ、１５０ｍＭおよび５００ｍＭのＮａＣｌ）を含む洗浄緩衝液１０ベッド容量を有するカラムから溶離された。１ベッド容量フラクションを集めた。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質が、主として１５０ｍＭのＮａＣｌフラクションで溶出した。僅かに低いＭＷの汚染タンパク質が７５ｍＭのＮａＣｌで溶離した。溶離したタンパク質フラクションをプールし、４℃で最終透析緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.０５％のTween 20、ｐＨ８.５）に対して直ちに透析した。透析１回当たり２Ｌ、透析緩衝液を５回交換した。タンパク質が付着するのを阻止するため予め湿らせておいた０.２μｍフィルターで、透析タンパク質を濾過した。精製ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を４℃で貯蔵した。
ＮＳ３ Chimigen3 タンパク質をさらに精製するため、ＣＭ−Sepharose3 Fast Flowマトリックスを、８Ｍの尿素（脱イオン化）、２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭのエチレンジアミン、０.０５％（ｖ／ｖ）のTween 20、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６.５０により平衡状態にした。同緩衝液中、１ｍＬ／分の流速で直線勾配（０〜０.６Ｍ）の塩化ナトリウムを用いて、タンパク質を溶離させた。タンパク質含有フラクション（２５〜５０ｍＭのＮａＣｌ）をプールした。
Ｎｉ−ＮＴＡカラムにより捕捉された多抗原Chimigen３ タンパク質含有試料を、AKTAexplorer3 １００ＦＰＬＣシステムを用いてHiTrap3 ＱＸＬ１ｍｌカラムによりさらに精製した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーからの溶離緩衝液中のタンパク質を、Amicon Ultra-15（ＭＷＣＯ３０００Ｄａ）により濃縮し、次いで緩衝液を、バファーＡ（８Ｍの尿素、５０ｍＭの炭酸ナトリウム、２５ｍＭのエチレンジアミン、１％のTween 20、ｐＨ１０）に交換した。タンパク質を、６０ｍＬ／時の流速で、５０ｍｌのバファーＡにより平衡させておいた、HiTrap Q(商標）ＸＬカラムにローディングした。溶離のＡ２８０が０.０１未満になるまで、カラムをバファーＡで洗浄した。タンパク質が、２０カラム容量中、１００％バファーＡから１００％バファーＢ（バファーＡに１Ｍ塩化ナトリウムを含む）への、直線勾配溶離により溶離された。ＨＣＶ多抗原 Chimigen（商標）タンパク質が、フロー・スルーフラクション中、および４０から５０％間のバファーＢに溶出したフラクション中で溶離された。
サイズ排除クロマトグラフィー
Superdex3 ２００調製用を、AKTAexplorer １００ＦＰＬＣシステム（GEヘルスケア）を用いて３ＭＰａの圧力下でTricon3 カラム１０／３００（１×３０ｃｍ、Pharmacia Biotech）に詰めた。カラムを１００ｍｌの６Ｍグアニジン、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０で洗浄した。Chimigen3 多抗原タンパク質を含むライゼート０.５ｍＬを、Superdex ２００カラムにローディングした。タンパク質を、３０ｍＬ／時の流速により溶離させ、０.５ｍＬフラクションを集めた。タンパク質溶離を２８０ｎｍでの吸光度によりモニターした。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
フェニル−６５０Ｃ Toyopearl（商標）（０.５ｍＬ、TOSOH Corp.）を、Poly-prep カラム（Bio-Rad）に詰めた。カラムを２０ｍＬのＨＩＣ結合緩衝液（０.１Ｍのトリス、２Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８）により平衡状態にした。最終濃度２Ｍの塩化ナトリウムを、Chimigen３ 多抗原タンパク質を含む０.５ｍＬのライゼートに加え、抽出物を３.５ｍＬのＨＩＣ結合緩衝液で希釈した。２０分間１８０００ｒｐｍでの遠心分離（３９１９１×ｇ、ＪＡ２５.５０ローターによる、Beckman Coluter Avanti（商標）Ｊ−２５遠心分離機）により、不溶性粒子を除去した。重力流により３０ｍＬ／時の流速で、上清をカラムにローディングした。次いで、カラムを１０ｍＬのＨＩＣ結合緩衝液で洗浄し、カラムに結合されたタンパク質を５ｍＬのＨＩＣ溶離緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのエチレンジアミン、０.５％のTween 20、ｐＨ１０.５）で溶離した。
精製Chimigen（商標）タンパク質の生化学的評価
Micro ＢＣＡ３タンパク質アッセイ試薬キットを用いて、製造業者が提供したプロトコルによるマイクロプレート手順でタンパク質濃度を評価した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析については、精製タンパク質のアリコートを、５ｘタンパク質ローディング緩衝液および２０ｘ還元剤を加えることにより変性させ、５分間沸騰させた。変性タンパク質を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ゲルを、製造業者が提供した条件下においてPageBlue3で染色した。
ウエスタン・ブロット分析については、タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、４８ｍＭのトリス基剤、３９ｍＭのグリシン、２０％メタノールおよび０.０３７５％ＳＤＳを含む緩衝液を用いて Hybond3 ECL3 ニトロセルロース膜へエレクトロブロッティングした。膜を、まず室温で１時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％脱脂乳、０.１％Tween２０）中でインキュベーションした。検出用抗体をブロッキング緩衝液中で所望の濃度に希釈した。膜を、室温で１時間絶えず混合しながら希釈抗体とインキュベーションした。各抗体とインキュベーション後、室温で洗浄１回につき１０分間、膜をブロッキング緩衝液で３回洗浄した。ECL3 ウエスタン・ブロッティング検出キットでの化学発光および Kodak Biomax XAR Ｘ線フィルムへの暴露によりタンパク質の検出を実施した。
タンパク質のグリコシル化の定性的検出については、Molecular Probes が開発したPro-Q（登録商標）エメラルド 300 グリコプロテイン・ゲルおよびブロット・ステイン・キットを使用した。このキットは、ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質およびブロットにおける炭水化物の検出に使用され得る。染料は、ほとんどの全タンパク質染色および所望ならば、質量分析法による分析と適合し得る。染料が過ヨウ素酸−酸化炭水化物基と反応したとき、明緑色蛍光シグナルが発生し、１バンドにつき０.５ｎｇほどの僅かな糖タンパク質が検出される。染色は、過ヨウ素酸およびシッフ法の修正法であり、製造業者は５０倍高い感度レベルを主張している。キットには、CandyCane（商標）分子量標準が含まれる。この標準は、それぞれ陽性および陰性対照として機能する交互のグリコシル化および非グリコシル化タンパク質により構成される。タンパク質試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを一晩５０％ＭｅＯＨおよび５％酢酸に固定した。ゲルを、３％氷酢酸中で２０分間２回洗浄し、次いで３０分間酸化溶液過ヨウ素酸中でグリカン酸化した。ゲルを、３％氷酢酸で２０分間３回洗浄し、次いで暗所中で最大１２０分間、新鮮なPro-Q3 エメラルド３００染色液で染色した。さらに暗所中での３％氷酢酸による２０分洗浄が追加的に２回、イメージング前に必要とされる。染料の励起／放射最大値は、２８０／５３０ｎｍであり、最適な視覚化は〜３００ｎｍでもたらされる。GeneGenius（Syngene）トランスイルミネーターおよび対応するソフトウェアを用いて、ゲルを視覚化し、走査した。
Chimigen(商標）ワクチンの免疫学的特性検定
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）
ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを有する非ＨＣＶ感染個体からの白血球搬出製品（Biological Specialty Corporation）のフィコール-ハイパーク勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを得た。ＰＢＭＣを、冷凍培地（５０％ヒトＡＢ血清、４０％AIM-V（商標）、および１０％ＤＭＳＯ）中、３×１０７細胞／クリオバイアルで液体窒素中において貯蔵した。
単球の単離および未成熟ＤＣ（樹状細胞）への分化
ＰＢＭＣを、２.５％適合血清含有AIM V（商標）培地中、３７℃で１時間１００ｍｍ組織培養皿（BD Biosciences）において培養した。培養後、非接着細胞を除去し、プレートをAIM V（商標）培地で洗浄した。次いで、接着細胞を、２ｍＬのAIM V（商標）／ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ含有（各々１００ＩＵ／ｍＬ）２.５％適合血清中で培養した。
未成熟ＤＣへのＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質の結合
未成熟ＤＣを、２４〜７２時間ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養中の単球から入手した。培養後、細胞を採取し、２.５％適合血清含有AIM V（商標）培地で１回洗浄し、次いで０.１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Invitrogen）（ＰＢＳＢ）で２回洗浄した。上記細胞を用いて、Chimigen（商標）タンパク質の結合および内在化を評価した。未成熟ＤＣの表現型を、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＣＤ２０６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ４を含む様々な細胞表面マーカーについての標識により評価した。
結合検定法については、全段階を４℃で実施し、インキュベーション後には洗浄した。細胞を、様々な濃度のChimigen（商標）タンパク質または対応する透析緩衝液を含むＰＢＳＢ中で６０分間インキュベーションした（２５μＬの容量中、９６ウェルｖ底プレートにおいて２×１０５細胞／ウェル）。細胞を、ＰＢＳＢ中で２０分間ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１または抗６ｘＨｉｓ抗体、次いで２０分間ＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５とインキュベーションすることにより、タンパク質結合を検出した。細胞を、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦ）含有ＰＢＳＢに再懸濁した。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を用いる実験では、ウサギ抗ＮＳ５Ａポリクローナル抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ビオチン、ＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５組み合わせにより結合を検出した。細胞を２％パラホルムアルデヒド（ＰＦ）含有ＰＢＳＢに再懸濁し、細胞結合を蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）により評価した。
結合阻害剤を用いるChimigen（商標）ワクチンについてのＤＣ受容体の特性検定
未成熟ＤＣを、４℃で６０分間、ＰＢＳＢ中抗ＣＤ３２ｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂイソタイプ）、抗ＣＤ２０６（ＩｇＧ１イソタイプ）、またはイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ１ ｍＡｂとインキュベーションした。それに続いて、細胞を、４℃で６０分間ＰＢＳＢ中のChimigen（商標）ワクチンとインキュベーションした。洗浄後、ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂまたはビオチニル化抗６ｘＨｉｓ ｍＡｂ、次いでＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５を用いるＦＦＣ分析により、細胞への結合を検出した。
蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）分析
CellQuest Pro 捕捉手段を取り付けたFACSCalibur および解析ソフトウェア（BD Biosciences）で、細胞を捕捉した。ＦＳＣおよびＳＳＣ散乱プロファイルにより測定された生存可能細胞集団についてゲートを設定し、２００００以上の事象を捉えた。特異的陽性細胞のパーセンテージを次式で計算した：(陽性細胞試験試料％−陽性細胞対照％)／（１００−対照の陽性細胞％）×１００。相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を次式で決定した：試験試料のＭＦＩ−対照試料のＭＦＩ。
抗原提示検定法（ＡＰＡ）
ＡＰＡを用いて、ＡＰＣにより提示された抗原に対するＴ細胞の免疫応答を測定する。この検定法では、機能的Ｔ細胞免疫応答および抗原付加成熟ＤＣの抗原特異的Ｔ細胞増殖誘導能力を定量する。この手順では、ＰＢＭＣ由来の単球を未成熟ＤＣに分化させ、未成熟ＤＣに抗原（Chimigen（商標）タンパク質またはＴＴ）を載せ、未成熟ＤＣを成熟ＤＣに分化させ、次いで成熟抗原付加ＤＣをオートロガスナイーブＴ細胞と一緒に培養する。活性化および増殖検定法については、７日間の培養後、Ｔ細胞を分析した。Ｔ細胞機能および特異性の分析については、Ｔ細胞をさらに２回抗原付加成熟ＤＣで刺激し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、グランザイムＢ（ｇｒＢ）およびパーフォリン（ｐｆｎ）の産生を評価した。抗原に対するＴ細胞の特異性を、特異的ＭＨＣクラスＩ四量体または五量体で評価した。
抗原付加成熟ＤＣの作製
未成熟ＤＣを上記要領で作製し、抗原または緩衝液（対照）と８時間インキュベーションした。次いで、細胞を成熟促進剤ｐｏｌｙＩＣ（２０μｇ／ｍＬ）、組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＦＮ−αＡ（１０００Ｕ／ｍＬ）、およびｒｈＩＦＮ−γ（１０００Ｕ／ｍＬ）と１６時間培養した。ＤＣの成熟程度を表現型解析により評価した。ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４を含む様々な細胞表面マーカーについて細胞を標識した。
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来Ｔ細胞の単離
製造業者の手順にしたがって、Dynal Biotech Ｔ細胞負の選択キット（Invitrogen）を用いる負の選択法により、Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。適合血清をＢＳＡおよびＦＢＳの代わりに使用した。様々な細胞マーカーに関する表現型標識により、単離細胞の表現型を評価した。Ｔ細胞（ＣＤ３＋細胞）は、９８％を超える割合の単離集団を含んでいた。Ｔ細胞をＣＦＳＥ（下記参照）で標識するか、またはＤＣとの細胞培養に直接加えた。
Ｔ細胞のＣＦＳＥ標識
新鮮な単離Ｔ細胞（１〜５×１０７細胞）を、５００μｌのＰＢＳＢに懸濁し、ＣＦＳＥの新たに製造した１０μｇ／ｍｌ調製用ストック溶液５００μｌと混合した。３７℃で１０分間インキュベーション後、細胞を血清含有培地（AIM V（商標）／１０％適合血清）で十分に洗浄することにより、組み込まれていないＣＦＳＥを除去した。Ｔ細胞のＣＦＳＥ標識をＦＦＣにより確認した。
ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の培養
Ｔ細胞を、AIM V（商標）／２５％適合血清中、１ウェルにつき１〜２０×１０４Ｔ細胞〜１〜５×１０４ＤＣの割合で抗原付加成熟ＤＣとインキュベーションした。Ｔ細胞活性化および増殖ＡＰＡ実験については、４日および７日培養後にＴ細胞を採取した（下記参照）。Ｔ細胞機能および特異性ＡＰＡ実験については、Ｔ細胞を７日間培養し、次いで抗原付加成熟ＤＣにより再刺激し、さらに７日間培養した。次いで、１４日培養Ｔ細胞を、２群（細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）プレートおよび四量体プレート）に分け、抗原付加ＤＣで３回目の刺激を加えた。１μｇ／ｍＬのBrefeldin A（BD Biosciences）をＩＣＣ ＩＦＮ−γプレートのウェルに加え、細胞を６時間培養した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ｇｒＢおよびｐｆｎの発現を下記で概略を示した要領により評価した。下記で概略を示したとおり、四量体分析を刺激の５〜６日後に実施した。
Ｔ細胞活性化および増殖分析
活性化／増殖ＡＰＡについては、抗原付加ＤＣとの４または７日培養後にＴ細胞を採取した。ＣＤ６９（初期活性化マーカー）の発現およびＣＦＳＥ強度（増殖の程度）について、Ｔ細胞を評価した。採取した細胞を、抗ＣＤ３−ＰＥ、抗ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５および抗ＣＤ６９−ＡＰＣにより標識した。緩衝液対照試料を用いて、倍加に至らなかったＴ細胞の集団を同定した。高度の蛍光で標識したこの集団は、ＦＬ１チャンネルで検出され、ＣＦＳＥｈｉと命名された。１回分裂が行われた細胞集団は、ＣＦＳＥｈｉ集団のＭＦＩの半分を有していた。同様に、２回分裂が行われた集団は、ＣＦＳＥｈｉ集団の約２５％（４分の１）のＭＦＩを有していた。ＣＦＳＥ蛍光がＣＦＳＥｈｉ蛍光より低い細胞をＣＦＳＥｌｏと命名した。細胞集団の中には、バックグラウンド付近のＦＬ１チャンネル蛍光を有するものもあり、ＣＦＳＥ−（ＣＦＳＥマイナス）と命名され得た。しかしながら、ここで概説した実験の目的に関して、Ｔ細胞は、ＣＦＳＥｈｉ（細胞分裂無し）またはＣＦＳＥｌｏ（少なくとも１細胞分裂）であるとみなされた。
ＣＤ６９の発現を評価することにより、Ｔ細胞活性化を定量した。若干の実験では、高ＦＳＣおよびＳＳＣ強度ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団でのゲーティングにより、Ｔ芽細胞を定量した。すなわち、細胞集団における相対数の芽細胞が、（これらの試験について）集団における小さな(Ｇ０）休止細胞と比べて直径が大きく（ＦＳＣｈｉ）、細胞コンプレキシティーが大きい（ＳＳＣｈｉ）細胞集団として発現された。
細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ｇｒＢおよびｐｆｎの検出
ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの産生およびセリンプロテアーゼグランザイムＢ（ｇｒＢ）［Lobe et al.（１９８６）Science ２３２：８５８−８６１］並びに穿孔型タンパク質パーフォリン（ｐｆｎ）［Hameed et al.（１９９２）Am.J.Pathol. １４０：１０２５−１０３０］の発現を、標準ＩＣＣ（細胞内サイトカイン）プロトコル（BD Biosciences）を用いることにより定量した。簡単に述べると、これは、細胞を、ＣＤ３（抗ＣＤ３−ＡＰＣ）およびＣＤ８（抗ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５）検出用の特異的蛍光色素コンジュゲートｍＡｂで標識し、固定および透過性にすることから成る。次いで、細胞試料を、一方は抗ＩＦＮ−γ−ＰＥ抗体および抗ｇｒＢ−ＦＩＴＣ抗体とインキュベーションしたもの、および他方は抗ＴＮＦ−α−ＰＥおよび抗パーフォリン−ＦＩＴＣとインキュベーションしたものである、２試料に分割した。１試料あたり平均して２００００〜１０００００細胞がBD FACSCaliburを用いて捕捉された。
四量体および五量体分析
Ｔ細胞を、抗ＣＤ−８ＰＥ−Ｃｙ５、抗ＣＤ４−ＡＰＣ、および抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣ抗体および以下のＰＥコンジュゲートiTag（商標）四量体（Beckman Coulter）または五量体（ProImmune）の一つで標識した：ＨＣＶ ＮＳ５Ａ（ＶＬＳＤＦＫＴＷＬ；配列番号３）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＥＢＶ（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ；配列番号５）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＣＶ ＮＳ３ペプチド（ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ；配列番号４）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＣＶ ＮＳ３ペプチド（ＫＬＶＡＬＧＩＮＡＶ；配列番号６）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、および陰性対照四量体（複対立遺伝子）。FACSCaliburを用いることにより、約１０００００細胞が捕捉された。
共焦点顕微鏡によるChimigen（商標）タンパク質結合、内在化およびプロセッシングの分析
未成熟ＤＣによるChimigen（商標）タンパク質の結合、内在化およびプロセッシングを、共焦点顕微鏡を用いて試験した。これらの試験で使用した未成熟ＤＣは、２.５％ドナー適合血清を含むAIM V（商標）培地中、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で２日間、接着ＰＢＭＣ由来単球を分化させることにより得られた。２日目、未成熟ＤＣをチャンバースライドへ移し、使用前にさらに１日インキュベーションした。適切な細胞表面受容体および形態を有する細胞間における中間物として３日目のものを選択した。
ＤＣ表面へのChimigen（商標）タンパク質の結合を試験するため、細胞を、４℃で１時間、ＰＢＳＢ中において５Ｔｇ／ｍＬのChimigen（商標）タンパク質または陰性対照として緩衝液のみとインキュベーションした。１時間後、細胞をＰＢＳＢで洗浄し、次いでビオチニル化抗マウスＩｇＧ１抗体、次いでストレプトアビジンAlexaFluor（商標）５４６により標識した。各工程間でＰＢＳＢ洗浄を実施した。標識および洗浄後、細胞を、４℃で１０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳＢ中で調製）により固定した。次いで、スライドに、４´−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ；Invitrogen）と共にSlowFade（商標）ゴールド褪色防止剤を載せ、マニキュア液を用いてカバーグラスでスライドを密閉した。
ＤＣによるChimigen（商標）タンパク質（５Ｔｇ／ｍＬ）の内在化について、３７℃（７％ＣＯ２）で、Chimigen（商標）タンパク質含有培地中において細胞を直接インキュベーションするか、またはまずＰＢＳＢ中４℃で表面受容体を標識し、非結合タンパク質を洗い流し、次いでAIM V（商標）／２.５％適合血清培地中３７℃（７％ＣＯ２）で時間経過にともなって（０分、１５分、６０分および２４０分）受容体結合タンパク質の取り込みを調べることにより試験した。３７℃でインキュベーションした細胞を、ＰＢＳＢで洗浄し、次いで１０分間BD Biosciences Cytofix/Cytoperm（商標）溶液により固定し、透過性にした。次いで、細胞を洗浄し、BD Biosciences Perm/Wash（商標）溶液中ビオチン抗マウスＩｇＧ１で標識し（１時間）、続いてストレプトアビジンAlexa Fluor（商標）５４６で標識した。他の抗体による共標識も必要に応じて実施した。細胞の最終洗浄後、スライドに上記と同じ要領で載せた。
Chimigen（商標）タンパク質が貪食作用を受けたことを確認するため、パルスチェイス実験を実施した。未成熟ＤＣを、氷上で３０分間、Chimigen（商標）タンパク質（５Ｔｇ／ｍＬ）によりパルスした。細胞をＰＢＳＢで洗浄し、Chimigen（商標）タンパク質不含有のAIM V（商標）／２.５％適合血清培地中でチェイスし、３７℃（７％ＣＯ２）で１５分間インキュベーションした。パルスチェイス細胞をＰＢＳＢで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＭＨＣクラスII抗体で標識することにより、原形質膜のみを標識した。Chimigen（商標）タンパク質がエンドソームに存在するか否かを測定するため、原形質膜標識細胞を、１０分間BD Biosciences Cytofix/Cytoperm（商標）溶液により固定し、透過性にした。BD Biosciences Perm/Wash（商標）で洗浄後、上記と同じ要領で、抗マウスＩｇＧ１ビオチン／ストレプトアビジンによりChimigen（商標）タンパク質を検出した。
マクロ飲作用試験については、ＦＩＴＣデキストラン（ＭＷ７００００、アニオン性、リシン固定可能、Invitrogen）を、Chimigen（商標）タンパク質（５Ｔｇ／ｍＬ）の存在または非存在下、AIM V（商標）／２.５％適合血清培地中で流動相マーカーとして使用した。
受容体伝達貪食作用を試験するため、Alexa Fluor（商標）４８８トランスフェリンコンジュゲート（Invitrogen）を、Chimigen（商標）タンパク質（５Ｔｇ／ｍＬ）含有ＰＢＳＢ中２０Ｔｇ／ｍＬで使用した。システインプロテアーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤の両方として、ラクタシスチン（Sigma）を使用した（最終濃度５Ｔｇ／ｍＬ）。
インビボ動物モデルにおける免疫応答の評価
これらの試験は、２種の同系交配実験動物（マウスおよびラット）および１種の異系交配大型動物（子ブタ）種を使用する。特に、ＢＡＬＢ/cマウス（６〜８週齢、Charles River Laboratoriesから）、Wistarラット（４〜６週齢、Charles River Laboratoriesから）および異系交配子ブタ（４〜６週齢、University of Saskatchewan、Prairie Swine Centerから）を使用する。この試験では、Chimigen（商標）タンパク質の免疫応答および防御効力を調べる。
安全性評価
ＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質を、皮下（s.c.）または皮内（i.d.）投与する。以下のプロトコルおよび用量を注射に使用する。０日目、１４日目、２８日目および４２日目で２週間ごとに皮下または皮内注射により動物を４回免疫化する。マウスについては、皮下および皮内注射、０.１Ｔｇ、１μｇまたは１０Ｔｇ／マウスの用量を使用する。ラットの免疫用量は、０.１５Ｔｇ、１.５Ｔｇまたは１５Ｔｇ／ラットであり、子ブタについては、０.２Ｔｇ、２Ｔｇまたは２０Ｔｇ／子ブタである。
ＥＬＩＳＡ技術による特異抗体の量およびＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の分析用に、血液試料を免疫前（−１日目）および各注射の７日後（７、２１、３５、４９日目）に採取する。
最終免疫の２週間後に動物を殺す。免疫後、週に少なくとも３回動物の理学的診断により、ＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質の安全性プロフィールを評価する。これは、体重および有害事象の観察を含む。全身的毒物学については、一定間隔で集めた血液試料を用いて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを含む血清化学作用における変化をモニターする。さらに、実験の最後に、剖検時点で脾臓、肝臓、腎臓、心臓、肺、筋肉、および脳から採取した組織を、将来の潜在的病理学的変化の分析用に、１０％ホルマリン緩衝液に固定し、パラフィンに埋封する。年齢適合動物を対照として使用する。
Chimigen（商標）タンパク質に対する免疫応答
Chimigen（商標）タンパク質は、強い細胞性および体液性免疫応答を誘導すると予測される。動物試験を実施することにより、子ブタにおけるＨＣＶ Chimigen（商標）Caccinesに対する宿主免疫応答を測定する。これらの試験では、コア、ＮＳ５Ａ、ＮＳ３、および多抗原Chimigen（商標）タンパク質を使用する。第１ラウンドでは、ＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質に対する免疫応答を評価する。上記要領で、タンパク質を皮下および皮内投与する。
マウスまたはラットの脾臓細胞、および子ブタからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、下記要領で、皮下および皮内経路による投与後のＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質に対する免疫応答の量および質を測定する。これらの試験により、どのChimigen（商標）ワクチンおよび投与経路が最大の免疫応答を誘導するかが決定され得る。ＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質の標的指向送達は、強い体液性応答に加えてＴｈ１に偏った強力な免疫応答を誘発し得る。ＨＣＶワクチンに関するＶＩＤＯからの試験は、ＤＮＡワクチンによる初回免疫、次いでタンパク質追加刺激により、Ｔｈ１／Ｔｈ２で均衡のとれた強い免疫応答が誘発され得ることを立証した［Yu et al.（２００４）J.Gen.Virol.８５：５３３−１５４３］。
免疫応答の評価
ｉ）抗体応答。全ＩｇＧ並びにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体レベルを試験するＥＬＩＳＡにより、ＨＣＶ抗原特異的抗体の存在を測定する。ＩｇＧレベルは、免疫応答の量を立証し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの相対レベルは、免疫応答の質（Ｔｈ１またはＴｈ２）を立証する。確立されたプロトコルを用いてこれらの実験を実施する。
ｉｉ）リンパ球増殖検定法。マウスまたはラットの脾臓細胞、子ブタからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インビトロでＨＣＶ抗原により刺激する。分裂中の細胞のＤＮＡへの［メチル−３Ｈ］チミジン取込みにより増殖性応答を測定する。
ｉｉｉ）サイトカインＥＬＩＳＰＯＴ検定法。免疫応答の質をさらに確認するため、我々の確立されたプロトコルにしたがって、脾臓細胞（マウスおよびラット）またはＰＢＭＣ（子ブタ）におけるインターフェロン−γおよびインターロイキン−４分泌細胞の数を、ＨＣＶ抗原による刺激後にＥＬＩＳＰＯＴ検定法で測定する。
ＨＣＶ Chimigen（商標）タンパク質により誘導される防御的抗ウイルス免疫
ＨＣＶの宿主範囲は、非常に狭い。それは、ヒトおよびチンパンジーでのみ複製する。チンパンジーは高価であり、供給も限られていることから、生ＨＣＶによるワクチン接種動物の攻撃は実際的ではない。しかしながら、ワクチン接種後のＨＣＶ抗原をコード化する組換えワクシニアウイルスによる攻撃は、動物モデルにおいてＨＣＶ予防ワクチンにより誘導される防御能力を評価するための代替モデルである。Chimigen（商標）タンパク質を個々に、または組み合わせとして使用することにより、動物を免疫化する。ワクチン接種後に誘導される防御的免疫を評価するため、予め定められた戦略を用いてスケジュール通りにワクチン接種を完了させた２週間後、関連したChimigen3 タンパク質と同じＨＣＶ抗原をコード化する組換えワクシニアウイルスにより動物を腹腔内経路で攻撃する。攻撃用量は、マウスの場合１Ｘ１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）、ラットの場合２Ｘ１０７ＰＦＵ、および子ブタの場合１Ｘ１０９ＰＦＵである。５日後、動物を殺し、確立されたプロトコルにしたがってワクシニアウイルス力価をプラーク検定法により測定する。
ＨＣＶ治療用および予防用ワクチンに最適な候補（複数も可）の同定
治療用ワクチンは、ＨＣＶウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ５Ａ、ＮＳ３）に基づき、予防用ワクチンは、構造タンパク質（例、Ｅ１、Ｅ２）および非構造タンパクに基づいている。１種またはそれ以上のChimigen（商標）ワクチンの組み合わせを、エクスビボＤＣ／Ｔ細胞抗原提示検定法および動物モデルの両方で使用し、免疫学的結果を評価する。
治療用および予防用Chimigen（商標）ワクチンの免疫化プロトコルおよび投与経路については、現在試験されている。抗体レベル、リンパ球増殖およびサイトカイン産生を測定することにより、免疫応答を評価する。予防用ＨＣＶ Chimigen（商標）ワクチン候補により誘導される防御的抗ウイルス免疫についても上記と同様、攻撃実験で評価する。
実施例２．ＮＳ５Ａ Chimigen3 タンパク質による結果
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を精製および特性確認した
精製ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の予測分子量は、〜８１ｋＤａであるが、このタンパク質はＳＤＳ−８％ＰＡＧＥにより〜１０５ｋＤａのバンドとして移動した。実測および予測分子量間の不一致は、主にタンパク質の高いプロリン含有率（〜１１％）、グリコシル化および他の可能な翻訳後修飾に起因し得る。マウスＩｇＧ１ Ｆｃ、６ｘＨｉｓ標識およびＮＳ５Ａに対する抗体により、精製タンパク質を検出した。精製タンパク質（ゲルから切断したバンド）に関するＭＳ／ＭＳ ＩＤ（質量分析法）分析により、ＮＳ５Ａ、マウスＩｇＧ１重鎖およびＨＣＶポリタンパク質について顕著なヒットが出たことから、それが実際にＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質であることが示された。精製ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を８％ＳＤＳゲルで分離し、Pro-Q（登録商標）エメラルド３００糖タンパク質ゲルおよびブロット染色キットを用いてグリコシル化について染色し、ＵＶ照明により検出した。この手順により、精製ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質のグリコシル化が示された。
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は未成熟ＣＤに結合する
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を、未成熟ＤＣへのその結合能力について調べた。細胞を、４℃で１時間、様々な濃度のＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションした。ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂおよびＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５により結合したワクチンを検出した。ワクチンと結合している細胞のパーセンテージ（陽性細胞％）および結合タンパク質の相対量（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより測定した（図１５）。４〜５０μｇ／ｍＬのＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質では、ほとんどのＤＣが結合について陽性であり、結合タンパク質の量は用量依存的に増加していた（図１５および１６）。タンパク質の結合は、未成熟ＤＣへの結合が飽和可能であることを示す５０μｇ／ｍＬと比べて２０μｇ／ｍＬではそれほど大きくなかった。観察された結合の高いＭＦＩは、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質が非常に有効にかつ高レベルで未成熟ＤＣに結合することを示している。４℃での結合が飽和可能であったことは、その過程に受容体が介在していることを示唆している。結合はまた、４℃での５分インキュベーション後に検出される結合タンパク質では非常に急速であり、結合のＭＦＩは１時間インキュベーション後に観察されたものの約半分であった（データは示さず）。
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は未成熟ＤＣ上の特異的受容体に結合する
それに含まれるＦｃフラグメントにより、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は、そのＴＢＤ領域を介して未成熟ＤＣ上のＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）に結合すると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は、Ｃ型レクチン受容体、例えばＣＤ２０６（ＭＭＲ）に結合すると予測される。ワクチン候補の結合特異性を測定するため、未成熟ＤＣを、遮断性抗ＣＤ３２および／または抗ＣＤ２０６ｍＡｂの存在下で、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした。
未成熟ＤＣを、緩衝液対照、または５μｇ／ｍｌのイソタイプ対照ｍＡｂ、抗ＣＤ３２ｍＡｂ、抗ＣＤ２０６ｍＡｂ、または抗ＣＤ３２および抗ＣＤ２０６の両方と４℃で１時間インキュベーションした後、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質と４℃で１時間インキュベーションした。結合したＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を、ビオチニル化抗６ｘＨｉｓ ｍＡｂ、次いでＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５により検出した。イソタイプ対照ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ）は、緩衝液対照と比べて結合を阻害しなかった。しかしながら、緩衝液対照と比べた場合、抗ＣＤ３２および抗ＣＤ２０６は両方とも、それぞれ約６０％および４０％の割合で結合を阻害した。
両ｍＡｂを加えると、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質結合が阻害され、８０％阻害がもたらされた。これらのデータは、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の結合におけるＣＤ３２およびＣＤ２０６の両方に関する一定の役割を示している。共焦点顕微鏡観察により、４℃でＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした細胞は、緩衝液のみの対照と比べてそれらの表面で強い標識を示したことから、Chimigen（商標）タンパク質は細胞表面に結合していることが示された。
未成熟ＣＤによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の内在化を３７℃で評価した。３７℃で１時間、Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした未成熟ＤＣは、多くの場合核付近で断続的な標識パターンを示したことから、Chimigen（商標）タンパク質は内在化され、あるとしてもごく小さな表面標識しか存在しないことを示唆していた。
ＤＣは、食作用、マクロ飲作用、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよび非クラスリン／カベオラエンドサイトーシスを含む幾つかの経路による抗原取り込み能力をもつ。マクロ飲作用は、未成熟ＤＣにおける構成的プロセスであると報告されている（Trombetta および Mellman ２００５）。３７℃でのマクロ飲作用により未成熟ＤＣがＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を内在化する能力について、マクロ飲作用マーカーＦＩＴＣデキストランを用いて評価した［Hewlett et al.（１９９４）J.Cell Biology １２４：６８９−７０３］。Chimigen（商標）タンパク質およびＦＩＴＣデキストランと１５分間および６０分間未成熟ＤＣをインキュベーションした後、タンパク質およびＦＩＴＣデキストランの両方を含む小胞様構造が観察されたことから、３７℃でChimigen（商標）タンパク質がマクロ飲作用により取り込まれ得ることがわかる。また、ＦＩＴＣデキストランは、マクロファージマンノース受容体（ＣＤ２０６）に結合し得るため、Chimigen（商標）タンパク質およびＦＩＴＣデキストランの両方を含むエンドソームは、場合によっては受容体介在性食作用により形成された可能性があることに留意するべきである。
Chimigen（商標）タンパク質の取り込みにおける受容体介在エンドサイトーシスの役割を、パルスチェイス実験により試験した。未成熟ＤＣを、４℃で蛍光標識Chimigen（商標）タンパク質によりパルスし、洗浄し、３７℃で１５分間インキュベーションした。細胞を固定し、透過性にし、抗体で標識することにより、Chimigen（商標）タンパク質およびトランスフェリン受容体を検出した。トランスフェリン受容体は、受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれ、次いで初期エンドソームから原形質膜に再循環で戻る。４℃で、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は細胞表面に結合し、トランスフェリン受容体は主として細胞内に存在していた。３７℃に切り替えると、エンドソームの形成が観察され、中にはChimigen（商標）タンパク質およびトランスフェリン受容体の両方を含むものもあった。実験開始時（４℃）での多数の既存の細胞内トランスフェリン受容体は、Chimigen（商標）タンパク質とは共存していない多くのトランスフェリン含有エンドソームに関与していると思われる。
ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の取り込み、およびトランスフェリン受容体に対する抗体での共標識による、トランスフェリンとのその共存について、共焦点顕微鏡により評価した。トランスフェリンはトランスフェリン受容体と結合し、受容体介在プロセスにより内在化されることが知られている。この分析が２分子の共存を示していることから、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれることがわかる。
Chimigen（商標）タンパク質およびトランスフェリン受容体シグナル間の重複を増加させる試みにおいて、細胞を、ヒトトランスフェリンとコンジュゲートしたAlexa Fluor ４８８とインキュベーションすることにより、細胞中の全トランスフェリン受容体ではなく、エンドサイトーシスが行われたばかりのトランスフェリン受容体のみが間接的に検出された。未成熟ＤＣを、Chimigen（商標）タンパク質およびトランスフェリンにコンジュゲートしたAlex Fluor ４８８の混合物により４℃で表面標識した。僅かなAlexa Fluor ４８８トランスフェリン陽性エンドソームしか観察されなかったが、存在時にはそれらがＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を含むことから、Chimigen（商標）タンパク質が実際に受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれていることがわかる。これらの結果は、Chimigen3 タンパク質が、主として受容体介在エンドサイトーシスにより内在化されることを示している。
未成熟ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質のプロセッシングについて試験した。特に、慢性感染症を処置するためのワクチンを設計するためには、ＣＤ８＋細胞の活性化およびＭＨＣクラスＩ受容体を介した抗原クロスプレゼンテーションが要求される。抗原クロスプレゼンテーションについては２種の異なるプロセッシング経路が提案されている［Lizee et al.（２００５）Trends Immunol.２６（３）：１４１−１４９］。第１経路は、食作用により取り込まれた抗原のプロセッシングを含み、第２経路は、他のエンドサイトーシス経路、例えば受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれた抗原のプロセッシングを含む。第２経路の場合、タンパク質は、初期エンドソームへ取り込まれ、次いで後期エンドソームへターゲッティングされ、そこでカテプシンにより分解され、次いでＭＨＣクラスＩ受容体へ載せられる。すなわち、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質が後期エンドソームで検出され得るか否かを測定し、またそれが上記構造においてＭＨＣクラスＩ受容体と共存しているか否かを測定する実験を実施した。４℃でＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質によりパルスされ、次いで３７℃でチェイスされた細胞を、共標識することにより、Chimigen（商標）タンパク質およびＬＡＭＰ１（後期エンドソーム／リソソームのマーカー）の両方が検出された。４時間および２４時間後、少数の細胞で、ＮＳ５Ａ Chimigen タンパク質およびＬＡＭＰ１間に重複が観察されたことから、ＮＳ５Ａ Chimigen タンパク質は後期エンドソーム／リソソームにあることがわかった。別の共標識実験において、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ分子との類似構造で存在することが見出されたことから、Chimigen（商標）タンパク質はＭＨＣクラスＩ分子を介した提示用にプロセッシングされていることがわかる。
プロテアソームは、ファゴリソソーム経路によるクロスプレゼンテーションについての抗原破壊に関与していると考えられている。５μｇ／ｍＬの濃度の細胞透過性プロテアソーム阻害剤ラクタシスチンで細胞を処理した。最近、ラクタシスチンは、リソソームプロテアーゼ、カテプシンＡの阻害で以前に考えられていたよりも特異性が低いことが示された［Kozlowski et al.（２００１）Tumour Biol.２２（４）：２１１−２１５］。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質のプロセッシングがファゴリソソーム経路の場合と同様にプロテアソームを伴うとすれば、細胞質ゾルにおける不完全分解ペプチドの部分的蓄積が予測されるが、上記蓄積は、後期エンドソームでのプロセッシングについては予測されない［Lizee et al.（２００５）前出］。４時間のチェイス後、５μｇ／ｍＬのラクタシスチンで処理（パルスおよびチェイス）したパルス細胞は、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を含む多数のエンドソームを示した。さらに、エンドソームは、対照細胞の場合よりタンパク質の多くを含むと思われた。細胞質ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の増加は、マウスＩｇＧ１に対するモノクローナル抗体では検出され得なかった。これらのデータもまた、ファゴリソソーム経路ではなく受容体介在エンドサイトーシスを、Chimigen３ タンパク質がＤＣで内在化される機構であると指摘している。
ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両Ｔ細胞の活性化および増殖が誘発される
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質に対する機能的免疫応答を、エクスビボＡＰＡにより評価した。この検定法は、抗原付加ＤＣによるＴ細胞刺激後の機能的Ｔ細胞免疫応答の様々なパラメーターを測定するのに使用され得る。この検定法は、まずＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの添加によりＰＢＭＣ由来の単球から未成熟ＤＣを生成させることから成る。次いで、未成熟ＤＣを、ワクチン候補、担体緩衝液（陰性対照）またはテタヌス・トキソイド（ＴＴ）（陽性対照）とインキュベーションする。次いで、ＤＣをサイトカインで処理することにより成熟させ、洗浄し、オートロガスナイーブＴ細胞とインキュベーションする。サイトカイン産生、細胞傷害性顆粒成分の存在、およびＮＳ５Ａ特異的Ｔ細胞の生成を測定するため、Ｔ細胞にさらに２回刺激を加えることにより、Chimigen（商標）タンパク質特異的Ｔ細胞を拡大させた。初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９を測定することにより、活性化を評価し、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の蛍光を追跡することにより、増殖を測定した。抗原付加ＤＣとの４日および７日培養後に、ＣＤ６９発現およびＣＦＳＥ蛍光を両方とも評価した。
予備分析は、培養物中のＤＣおよびＴ細胞の濃度が、Ｔ細胞免疫応答の測定における重要なパラメーターであることを示していた。すなわち、６つの異なるＴ細胞：ＤＣ比が評価されるようにＡＰＡを設計した。５×１０４ＤＣ／ウェルの高濃度および１×１０４ＤＣ／ウェルの低濃度という、２セットのＤＣ濃度を使用した。４８時間の培養後、未成熟ＤＣを、緩衝液（陰性対照）、５μｇ／ｍＬでのＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質（５ＡＣ）の２種の異なる調製物、ＴＴ（陽性対照）、またはＰＢＳとインキュベーションした。次いで、ＤＣを８時間培養し、ｐｏｌｙＩＣ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γを加えることにより成熟させた。一晩（１６時間）培養後、ＰＢＳ対照群からのＤＣを洗浄し、様々な成熟ＤＣマーカーの発現について調べた。高濃度および低濃度の両ＤＣは、高レベルのＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスII）、ＣＤ８６、ＣＤ８０、およびＣＤ８３を発現した（図１７）。一般に、高濃度のＤＣの方が、僅かに高レベルのＤＣ成熟マーカーを発現した。
オートロガスＴ細胞を負の選択手順により単離し、細胞分裂を測定するためＣＦＳＥで標識した。９６ウェルプレートにおける１００μｌ／ウェルのＤＣに、１００μｌ／ウェルのＴ細胞を、１ウェルにつき２０×１０４、５×１０４、または２×１０４の濃度として加えた。高ＤＣ濃度ウェル（５×１０４ＤＣ／ウェル）については、１ウェルあたりのＴ細胞対ＤＣ比の組み合わせは、２０×１０４：５×１０４（４：１）、５×１０４：５×１０４（１：１）、および２×１０４：５×１０４（０.４：１）であった。低ＤＣ濃度ウェル（１×１０４ＤＣ／ウェル）については、１ウェルあたりのＴ細胞対ＤＣ比の組み合わせは、２０×１０４：１×１０４（２０：１）、５×１０４：１×１０４（５：１）、および２×１０４：１×１０４（２：１）であった。Ｔ細胞を、外性サイトカインの非存在下でＤＣに加えた。対照として、培養の３日目に、１μｇ／ｍＬのＰＨＡを、ＰＢＳ処理ＤＣ群に載せられたＴ細胞に加えた。
４日の培養後、細胞培養物の半分（１００μｌ）を活性化および増殖の分析用に採取した。細胞培養物の残り半分に、１００μｌの新鮮なAIM V（商標）／２.５％適合血清を加え、細胞をさらに３日間培養した。４日間培養後のＴ細胞におけるＣＤ６９の発現を図１８Ａ〜Ｃに示す。図１８Ａは、異なるＴ細胞：ＤＣ比についてのＣＤ６９を発現するＣＤ３＋細胞のパーセンテージを示す。ＰＨＡ処理細胞の大多数は、Ｔ細胞：ＤＣ比とは関係なくＣＤ６９を発現した。ＣＤ６９はまた、高ＤＣ濃度により培養したＴ細胞から検出されたが、低ＤＣ濃度により培養したＴ細胞からはほとんど検出されなかった。緩衝液対照と比べると、抗原刺激Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ６９を発現した。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を載せたＤＣは、４日目にＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞の方をＣＤ４＋Ｔ細胞よりも高いパーセンテージで誘導した（図１８ＢおよびＣ）。ＣＤ８＋細胞のＣＤ６９発現のパーセンテージは、リコール抗原ＴＴと比べてChimigen3 タンパク質について同等であるかまたは大きかった。これは、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質がナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な活性化因子であることを示していた。
４日間培養後に少なくとも１回分裂が行われた細胞（ＣＦＳＥｌｏ）のパーセンテージを図１９Ａ〜Ｃに示す。ＰＨＡで処理したＴ細胞は、２４時間早く分裂を始めていた（図１９Ａ）。ＴＴ付加ＤＣで処理したＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、４日間の培養後に検出可能な増殖を示したが、これは、高ＤＣ濃度で明白であったに過ぎない（図１９ＢおよびＣ）。４日目、Chimigen（商標）タンパク質処理群においてＴ細胞増殖はほとんど検出されなかった。すなわち、ＣＤ６９の発現により立証されたところによると、ナイーブＴ細胞は、培養４日目にＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣにより活性化されたが、これらのＴ細胞はまだ分裂していないか、または使用した検定法では検出され得ない程度の分裂であった。
７日間の培養後、細胞を活性化および増殖分析用に採取した。７日間培養後のＴ細胞におけるＣＤ６９の発現を、図２０Ａ〜Ｃに示す。図２０Ａは、異なるＴ細胞：ＤＣ比についてのＣＤ６９発現性ＣＤ３＋細胞のパーセンテージを示す。ＰＨＡで処理したＴ細胞のＣＤ６９発現は著しく増加していた。しかしながら、ＣＤ６９発現性細胞のパーセンテージは、４日目に観察されたものからは減少しており、ＰＨＡ応答から予測されること；ＣＤ６９の急速な誘導、次いで時間の経過に伴う発現の減少と一致している。Chimigen3 タンパク質刺激Ｔ細胞については、ＣＤ６９は、高ＤＣ濃度で培養したＴ細胞において５％を超えるレベルで検出されたが、低ＤＣ濃度で培養したＴ細胞からはほとんど検出されなかった。すなわち、低ＤＣ濃度（１×１０４ＤＣ／ウェル）では、抗原特異的Ｔ細胞活性化に十分ではなかった。緩衝液対照と比べると、５×１０４Ｔ細胞および２×１０４Ｔ細胞：５×１０４ＤＣ比に関して、多数のChimigen３タンパク質刺激Ｔ細胞がＣＤ６９を発現した。７日目、リコールＴＴ応答についてＣＤ６９の発現は低下していた。ｄ４Ｔ細胞とは対照的に、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣは、７日目にＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞の方をＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高いパーセンテージで誘導した（図２０ＢおよびＣ）。高いＤＣ濃度（５×１０４／ウェル）については、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ６９発現のパーセンテージは、緩衝液またはリコール抗原ＴＴの場合と比べると Chimigen（商標）タンパク質については同等であるかまたは大きかった。すなわち、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）は、最初にナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、次いでＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
７日間培養後に少なくとも１回分裂が行われた細胞（ＣＦＳＥｌｏ）のパーセンテージを図２１Ａ〜Ｃに示す。結果は、本質的にどのＰＨＡ処理Ｔ細胞も分裂していたことを示す（図２１Ａ）。Chimigen３タンパク質またはＴＴを載せたＤＣは、７日間培養後に著しいＴ細胞増殖を呈したが、これは高ＤＣ濃度で最も明白であった。高ＤＣ濃度ウェルでのみ、抗原付加の結果として著しいＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が誘導された（図２１Ｂ）。しかしながら、低濃度の抗原付加ＤＣでも、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導には十分であった（図２１Ｃ）。特に、高ＤＣ濃度では、Chimigen３ タンパク質付加ＤＣは、ＴＴ付加ＤＣに匹敵するレベルまでＴ細胞増殖を誘導した。
Ｔ細胞増殖の別の尺度は、Ｔ細胞集団におけるＴリンパ芽球の相対比率である。Ｔリンパ芽球は、フローサイトメトリーでの評価によると、リンパ球ゲートにおける休止リンパ球よりも高いＦＳＣ（前方光散乱）およびＳＳＣ（側面光散乱）を有する細胞として定義される。培養物中のＴリンパ芽球のパーセンテージを図２２に示す。これらの結果は、図２１Ａで示されているように分裂が行われている細胞のパーセンテージと非常に良好な相関関係を示す。したがって、集団におけるＴリンパ芽球の評価は、ＣＦＳＥ検定法に代わるものとして使用され得る。全般的に、これらの発見は、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質が、Ｔ細胞活性化および増殖により測定される１次Ｔ細胞応答の誘導に非常に有効であったことを示している。
ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が生成される
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）ワクチンに対する機能的免疫応答を、３回刺激エクスビボＡＰＡにより評価した。４×１０４ＤＣ／ウェル（高濃度）または２×１０４ＤＣ／ウェル（低濃度）の未成熟ＤＣに、対照担体緩衝液、ＰＢＳ、ＴＴ（陽性対照）、またはＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を載せた。次いで、ＤＣを成熟させ、それらの表現型を評価した。ＤＣ成熟は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ８３の高レベル発現を用いて確立された（図２３）。オートロガスＴ細胞を、成熟抗原付加ＤＣと２０×１０４Ｔ細胞／ウェル：４×１０４ＤＣ／ウェルまたは４×１０４Ｔ細胞／ウェル：２×１０４ＤＣ／ウェルの比でインキュベーションした。Ｔ細胞に３回刺激を加え、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内レベルの検出により、３回目の刺激６時間後にＴ細胞機能を評価した。さらに、Ｔリンパ芽球のレベルについても評価した。
図２４は、高および低ＤＣ濃度でのＴリンパ芽球のパーセンテージを示す。２：１のＴ細胞：ＤＣ比は、５：１比の場合と比べて低いバックグラウンド（緩衝液）Ｔ細胞増殖応答をもたらした。その結果、２：１比では、緩衝液および抗原誘導Ｔ細胞増殖応答間にさらに著しい差異があった。
ＩＦＮ−γ応答を、５：１および２：１のＴ細胞：ＤＣ比で測定した。データは、群の各ウェルの応答として、および平均の標準偏差と共に３ウェルの平均として示されている（図２５）。Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答の比較結果は、５：１および２：１のＴ細胞：ＤＣ比間で著しい差異を示した。高いＤＣ濃度では、対照緩衝液の場合を凌ぐChimigen3 誘導ＩＦＮ−γ応答の証拠は無かった。しかしながら、ＤＣ濃度が低い場合、対照緩衝液付加ＤＣと培養したＴ細胞でＩＦＮ−γを産生したのはごく僅かに過ぎなかったが、Chimigen3 タンパク質付加ＤＣと培養したＴ細胞については高いパーセンテージでＩＦＮ−γを産生した。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質２.５μｇ／ｍＬの場合と比べて５μｇ／ｍＬを載せたＤＣにより刺激したＴ細胞ではＩＦＮ−γ産生細胞が多かった。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋集団におけるＩＦＮ−γを発現するＴ細胞のパーセンテージについても測定した（図２６および２７）。低ＤＣ濃度群は、Chimigen3−ＤＣによる刺激の結果としてＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の高いパーセンテージを示した。ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、Chimigen3タンパク質付加ＤＣにより刺激されたＴ細胞についての方がＴＴ付加ＤＣによる場合と比べて高かった（図２６）。同様に、対照緩衝液による場合と比べてＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質による刺激時にＩＦＮ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージも高かった（図２７）。ＩＦＮ−Ｋを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＴＴ付加ＤＣの場合と比べて Chimigen3 タンパク質付加ＤＣにより刺激されたＴ細胞については匹敵し得るものであった（図２７）。これらの結果は、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質が、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団の両方において著しいＩＦＮ−γ応答を誘導することを示しており、分子が、ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIの両経路においてＤＣによりプロセッシングされることを示唆している。
図２８は、抗原付加成熟ＤＣによる６時間刺激の結果としてＴＮＦ−αを産生したＴ細胞のパーセンテージを示す。これらの結果は、ＩＦＮ−γ結果と類似している。高ＤＣ濃度（５：１比）によるＴ細胞の抗原刺激の結果としてＴＮＦ−αを産生する細胞のパーセンテージは増加していたが、低ＤＣ濃度（２：１比）ではさらに大きな差異があった。５μｇ／ｍＬのChimigen3 タンパク質を載せたＤＣにより刺激したときの方が、２.５μｇ／ｍＬのタンパク質による場合よりもＴＮＦ−αを産生したＴ細胞のパーセンテージは高かった。ＴＮＦ−α応答は、ＴＴと比べるとＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質についての方が大きかった。ＴＴ付加ＤＣで刺激すると、ＴＮＦ−αを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの方がＣＤ８＋Ｔ細胞の場合よりも高くなった（図２９）。しかしながら、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両集団において類似した程度のＴＮＦ−α産生を誘導した（図２９）。
ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）抗原提示により、３回目の刺激の６時間後にｇｒＢおよびｐｆｎ＋を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞が生成される
Ｔ細胞の細胞傷害性顆粒タンパク質ｇｒＢおよびｐｆｎの産生能力についても、エクスビボ抗原提示検定法により評価した。未成熟ＤＣに、対照緩衝液、ＴＴ（陽性対照）または様々な濃度のＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を載せ、成熟させた後、オートロガスＴ細胞とインキュベーションした。ｇｒＢの発現は、酵素検定法を含む種々の方法で特異抗体により検出され得る［Ewen et al.（２００３）J.Immunol.Meth．２７６：８９−１０１；Spaeny-Dekking et al.（１９９８）J.Immunol.１６０：３６１０；Hamann et al.（１９９７）J.Exp.Med. １８６：１４０７］。抗ｇｒＢおよび抗ｐｆｎ ｍＡｂをそれぞれ用いる細胞内染色法により、ＧｒＢおよびｐｆｎ発現を検出した。図３０は、抗原付加成熟ＤＣによる３回刺激後にｇｒＢおよびｐｆｎを発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣは、無抗原対照と比べてＣＤ８＋Ｔ細胞においてｇｒＢおよびｐｆｎ発現の増加を誘導した。これらの結果は、ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質が、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてｇｒＢおよびｐｆｎの発現を誘導することを示しており、このことは、このタンパク質が、クラスＩ経路でＤＣによりプロセッシングされることにより、Ｔ細胞への有効な提示が行われ、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞から細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）への分化を誘導することを示唆している。
成熟ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）抗原提示により、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が生成され、活性化が維持される
Ｔ細胞をＡＰＡで３回抗原付加ＤＣにより刺激した。３回目の刺激後の６日間培養後、Ｔ細胞を採取し、増殖の尺度として芽細胞のパーセンテージについて、および活性化マーカーＣＤ６９の発現についてＦＦＣにより検査した。さらに、培養物から回収されたＴ細胞の絶対数を評価する手段として、ＦＳＣおよびＳＳＣフローサイトメトリー分析に基づいたリンパ球ゲート（Ｒ１ゲート）にはまるゲート細胞の数を測定した。
緩衝液対照と比べると、ＴＴおよび Chimigen（商標）タンパク質刺激細胞からのＴ細胞の収率には著しい差異があった（図３１）。ＴＴ刺激細胞は、Chimigen３ タンパク質刺激細胞よりも高いＴ細胞収率を示した。しかしながら、ＴＴ応答は、リコール応答であるため、ＴＴに対して特異的応答性を示すＴ細胞の出発集団は、ＮＳ５Ａに特異的なナイーブＴ細胞の出発集団よりも収率が高いと予測される。特に、芽細胞集団の評価において、芽細胞／増殖細胞のパーセンテージは、ＴＴ培養物と比べてＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質培養物における方が現実に高かった。緩衝液対照培養物には、芽細胞／増殖細胞はごく僅かしか存在しなかった。ＣＤ６９発現により評価した活性化ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを図３２に示す。緩衝液対照と比べると、Chimigen3 タンパク質付加ＤＣで刺激したＴ細胞ではＣＤ６９を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両Ｔ細胞のパーセンテージが高かった。これらの結果は、Chimigen3 タンパク質による刺激は、３回目の刺激の６日後（Ｔ細胞培養の２０日目）でも明白である顕著なＴ細胞活性化および増殖をもたらすことを示している。したがって、Chimigen3 タンパク質は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の活性化および拡大において非常に有効である。
成熟ＤＣによるＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＮＳ５Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成が誘導される
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質に対する免疫応答の抗原特異性を評価するため、ＨＬＡ−Ａ２の状況において免疫優性ＮＳ５Ａエピトープに特異的なＴ細胞のパーセンテージを定量した。Ｔ細胞を、ＰＥにコンジュゲートしたＮＳ５Ａペプチド／ＨＬＡ−Ａ２五量体で標識することによりこれを測定した。異なる濃度のＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を載せたＤＣにより、ナイーブＴ細胞に３回刺激を加え、ＡＰＡにおいて抗原を伴わない（緩衝液）各対照ＤＣの場合と比較した。３回目の刺激の６日後にＴ細胞を採取し、ＮＳ５Ａ−特異的Ｔ細胞またはＥＢＶ−特異的Ｔ細胞（対照）を、四量体標識およびＦＦＣにより検出した。
負の四量体標識（陰性対照）およびＥＢＶ四量体標識（陽性対照）ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを図３３に示す。試験した３ウェルのうち１ウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるＥＢＶ四量体標識（陽性四量体）について陽性であった。評価したＴ細胞は、緩衝液対照処理ウェルからのものであったため、ＥＢＶ四量体標識Ｔ細胞の数は比較的低いと予測される。ＡＰＡによるＮＳ５Ａ五量体でのＣＤ８＋Ｔ細胞標識のパーセンテージを図３４に示す。ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質をＤＣに載せることにより、ＮＳ５ＡエピトープＶＬＳＤＦＫＴＷＬ（配列番号３）に対する特異性をもつＴ細胞が生成された。この特異性をもつＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい拡大は、高ＤＣ濃度ウェルのうちの２ウェルおよび低ＤＣ濃度ウェルのうちの３ウェルで明白であった。すなわち、ＮＳ５Ａ Chimigenタンパク質は、このＮＳ５Ａ免疫優性エピトープに特異的なＴ細胞の生成を誘導する能力をもち、Ｔ細胞は他のＮＳ５Ａエピトープに対する特異性を伴って存在すると思われる。
実施例３．ＮＳ３ Chimigen3 タンパク質による結果
ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質を精製し、特性検定した
Ｓｆ９細胞で発現されたＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて精製試料を分析した。電気泳動後、ゲルをウエスタン・ブロッティング用にニトロセルロースへ移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをPageBlueで染色し、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質の種々の成分に特異的な抗体でウエスタン・ブロットを展開した。精製タンパク質は、約１１０ＫＤａおよび１２０ＫＤａで二重線として現れた。両種類とも、抗体、すなわちＮ−末端（抗６ｘＨｉｓ）、ＴＢＤ（抗Ｆｃ）およびＮＳ３（ポリクローナル抗ＮＳ３）に対する抗体により検出され、精製タンパク質が無傷であることを示していた。
Pro-Q（登録商標）エメラルド３００糖タンパク質ゲルおよびブロット染色キットを用いて、精製ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質のグリコシル化の定性的評価を実施した。８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの精製タンパク質の電気泳動後、製造業者のプロトコルを用いてゲルを染色し、ＵＶ照明下で走査した。精製タンパク質は二重線であることから、分子量の差は、グリコシル化のレベルが異なるためであると推測される。
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質は未成熟ＤＣに結合する
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を、その未成熟ＤＣへの結合能力について調べた。細胞を、４℃で１時間、様々な濃度のＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションした。結合タンパク質を、ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂおよびＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５で検出した。Chimigen3 タンパク質と結合している細胞のパーセンテージ（陽性細胞％）および結合タンパク質の相対量（ＭＦＩ）をＦＦＣにより測定した。４〜５５μｇ／ｍＬのＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質では、ほとんどのＤＣが結合について陽性であり、結合タンパク質の量は、用量依存的に増加していた（図３５および３６）。タンパク質の結合は、５５μｇ／ｍＬの場合と比べて２２μｇ／ｍＬではそれほど大きくはなかったことから、未成熟ＤＣへの結合は飽和し得ることが示された。観察された結合の高いＭＦＩは、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質が非常に有効にかつ高レベルで未成熟ＤＣに結合することを示していた。４℃での結合は飽和し得るものであり、それが受容体介在性であることを示していた。結合はまた、４℃で５分のインキュベーション後に検出された結合タンパク質では非常に急速に進んでおり、結合のＭＦＩは６０分インキュベーション後に観察されたものの約半分であった（データは示さず）。
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質は、未成熟ＤＣ上の特異的受容体に結合する
Ｆｃフラグメントの存在により、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質は、未成熟ＤＣ上のＣＤ３２（ＦｃγＲII）にＴＢＤ領域を介して結合すると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質は、Ｃ型レクチン受容体、例えばＣＤ２０６（ＭＭＲ）に結合すると予測される。タンパク質の結合の特異性を測定するため、未成熟ＤＣを、遮断性抗ＣＤ３２および／または抗ＣＤ２０６ ｍＡｂの存在下でＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした。
未成熟ＣＤを、４℃で１時間、緩衝液対照、または５μｇ／ｍＬのイソタイプ対照ｍＡｂ、抗ＣＤ３２ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０６ｍＡｂ、または抗ＣＤ３２および抗ＣＤ２０６の両方とインキュベーションした後、４℃で１時間ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした。結合したＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を、ビオチニル化抗６ｘＨｉｓ ｍＡｂ、次いでＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５により検出した。イソタイプ対照ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２）は、緩衝液対照と比べると結合を阻害しなかった。しかしながら、緩衝液対照との比較において、抗ＣＤ３２および抗ＣＤ２０６は両方とも、それぞれ約７０％および６０％の割合で結合を阻害した（図３６）。両遮断性ｍＡｂの追加により、さらにＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質結合を阻害したところ、９０％阻害が起こった（図３６）。すなわち、データは、未成熟ＤＣに結合しているＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質の結合におけるＣＤ３２およびＣＤ２０６の両方についてのある一定の役割を示唆している。
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質の結合を、共焦点顕微鏡により視覚化した。未成熟ＤＣを、４℃でＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした。緩衝液のみの対照と比べて強い細胞表面での標識は、Chimigen（商標）タンパク質が細胞の表面、おそらくは受容体に結合していることを示すものであった。
内在化を調べるため、未成熟ＤＣを３７℃で１時間、Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした。細胞は、表面標識（原形質膜輪郭）をあるとしてもごく僅かしか示さなかったが、代わりに多くの場合核付近で斑点状の標識パターンを示しており、Chimigen（商標）タンパク質が内在化されていることを示していた。
ＤＣによるＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両Ｔ細胞の活性化および増殖が誘発される
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質への機能的免疫応答を、エクスビボ抗原提示検定法（ＡＰＡ）により評価した。この検定法は、抗原付加ＤＣでのＴ細胞刺激後における機能的Ｔ細胞免疫応答の様々なパラメーターを測定するのに使用され得る。この検定法は、まずＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの添加によりＰＢＭＣ由来の単球から未成熟ＤＣを生成させることから成る。次いで、未成熟ＤＣを、ワクチン候補、担体緩衝液（陰性対照）またはＴＴ（陽性対照）とインキュベーションする。それに続いて、ＤＣをサイトカインで処理することにより成熟させ、洗浄し、オートロガスナイーブＴ細胞とインキュベーションする。サイトカイン産生、細胞傷害性顆粒成分の存在、およびＮＳ３特異的Ｔ細胞の生成を測定するため、Ｔ細胞にさらに２回刺激を加えることにより、Chimigen（商標）タンパク質特異的Ｔ細胞を拡大させる。しかしながら、１回の刺激でナイーブＴ細胞集団からの拡大が開始されると予測される。初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９を測定することにより、活性化を評価し、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の蛍光を追跡することにより、増殖を測定した。抗原付加ＤＣとの４日および７日培養後に、ＣＤ６９発現およびＣＦＳＥ蛍光を両方とも評価した。
予備分析は、培養物中のＤＣおよびＴ細胞の濃度が、Ｔ細胞免疫応答の測定における重要なパラメーターであることを示していた。すなわち、６つの異なるＴ細胞：ＤＣ濃度が評価されるようにＡＰＡを設計した。５×１０４ＤＣ／ウェルの高濃度および１×１０４ＤＣ／ウェルの低濃度という、２セットのＤＣ濃度を使用した。４８時間の培養後、未成熟ＤＣを、緩衝液（陰性対照）、５μｇ／ｍＬでのＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質（３Ｃ）、ＴＴ（陽性対照）、またはＰＢＳとインキュベーションした。次いで、ＤＣを８時間培養し、ｐｏｌｙＩＣ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γを加えることにより成熟させた。一晩（１６時間）培養後、ＰＢＳ対照群からのＤＣを洗浄し、様々な成熟ＤＣマーカーの発現について調べた。高および低濃度ＤＣは両方とも、高レベルのＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣクラスＩ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスII）、ＣＤ８６、ＣＤ８０、およびＣＤ８３を発現した。
オートロガスＴ細胞を負の選択手順により単離し、細胞分裂を測定するためＣＦＳＥで標識した。９６ウェルプレートにおける１００μｌ／ウェルのＤＣに、１００μｌ／ウェルのＴ細胞を、１ウェルにつき２０×１０４、５×１０４、または２×１０４の濃度として加えた。高ＤＣ濃度ウェル（５×１０４ＤＣ／ウェル）については、１ウェルあたりのＴ細胞対ＤＣ比の組み合わせは、２０×１０４：５×１０４（４：１）、５×１０４：５×１０４（１：１）、および２×１０４：５×１０４（０.４：１）であった。低ＤＣ濃度ウェル（５×１０４ＤＣ／ウェル）については、１ウェルあたりのＴ細胞対ＤＣ比の組み合わせは、２０×１０４：１×１０４（２０：１）、５×１０４：１×１０４（５：１）、および２×１０４：１×１０４（２：１）であった。Ｔ細胞を、外性サイトカインの非存在下でＤＣに加えた。対照として、培養の３日目に、１μｇ／ｍＬのＰＨＡを、ＰＢＳ処理ＤＣ群に載せられたＴ細胞に加えた。
４日の培養後、細胞培養物の半分（１００μｌ）を活性化および増殖の分析用に採取した。細胞培養物の残り半分に、１００μｌの新鮮なAIM V（商標）／２.５％適合血清を加え、細胞をさらに３日間培養した。４日間および７日間培養後の５×１０４Ｔ細胞／ウェル：５×１０４ＤＣ／ウェル比（１：１）でのＴ細胞におけるＣＤ６９の発現を図３７に示す。ＰＨＡ処理細胞の大多数は、Ｔ細胞：ＤＣ比とは関係なくＣＤ６９を発現した。ＣＤ６９は、高ＤＣ濃度により培養したＴ細胞から検出されたが、低ＤＣ濃度により培養したＴ細胞からはほとんど検出されなかった（データは示さず）。緩衝液対照と比べると、抗原刺激Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ６９を発現した。ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を載せたＤＣは、４日目にＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞の方をＣＤ４＋Ｔ細胞よりも高いパーセンテージで誘導した。４日間培養後に少なくとも１回分裂が行われた細胞（ＣＦＳＥｌｏ）のパーセンテージを図３８に示す。結果は、ＰＨＡ処理Ｔ細胞が２４時間早く分裂を始めることを示していた。ＴＴ付加ＤＣで処理したＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、４日間の培養後に検出可能な増殖を示したが、これは、高ＤＣ濃度で明白であったに過ぎない（データは示さず）。４日目、ワクチン候補処理群においてＴ細胞増殖はほとんど検出されなかった。すなわち、ＣＤ６９の発現により立証されたところによると、ナイーブＴ細胞は、培養４日目にＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣにより活性化されるが、これらのＴ細胞はまだ分裂していなかった。
７日間の培養後、細胞を活性化および増殖分析用に採取した。７日間培養後のＴ細胞におけるＣＤ６９の発現を、図３７に示す。Chimigen3 タンパク質刺激Ｔ細胞については、ＣＤ６９は、高ＤＣ濃度で培養したＴ細胞において５％を超えるレベルで検出されたが、低ＤＣ濃度で培養したＴ細胞からはほとんど検出されなかった（データは示さず）。すなわち、低ＤＣ濃度（１×１０４ＤＣ／ウェル）では、抗原特異的Ｔ細胞活性化に十分ではなかった。７日目、リコールＴＴ応答についてＣＤ６９の発現は低下していた。ｄ４Ｔ細胞とは対照的に、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣは、７日目にＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞の方をＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高いパーセンテージで誘導した。７日目のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ６９発現のパーセンテージは、リコール抗原ＴＴの場合と比べると Chimigen（商標）タンパク質については大きかった。すなわち、ＮＳ３ Chimigen（商標）は、最初にナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、次いでＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。７日間培養後に少なくとも１回分裂が行われた細胞（ＣＦＳＥｌｏ）のパーセンテージを図３８に示す。Chimigen３タンパク質またはＴＴを載せたＤＣは、７日間培養後に著しいＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を呈したが、これは高ＤＣ濃度で最も明白であった（データは示さず）。
ＤＣによるＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が生成される
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質に対する機能的免疫応答を、３回刺激エクスビボＡＰＡにより評価した。４×１０４ＤＣ／ウェル（高濃度）または２×１０４ＤＣ／ウェル（低濃度）の未成熟ＤＣに、対照担体緩衝液、ＰＢＳ、ＴＴ（陽性対照）、またはＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を載せた。次いで、ＤＣを成熟させ、それらの表現型を評価した。ＤＣについては、それらが高レベルのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＣＤ８３を発現したとき成熟したものとして評価した。オートロガスＴ細胞を、成熟抗原付加ＤＣと２０×１０４Ｔ細胞／ウェル：４×１０４ＤＣ／ウェルまたは４×１０４Ｔ細胞／ウェル：２×１０４ＤＣ／ウェルの比でインキュベーションした。Ｔ細胞に３回刺激を加え、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内レベルの検出により、３回目の刺激６時間後にＴ細胞機能を評価した。さらに、Ｔリンパ芽球の程度についても評価した。
Ｔ細胞集団におけるＴリンパ芽球のパーセンテージの測定結果は、Ｔ細胞増殖の程度の尺度として使用され得る。Ｔリンパ芽球は、フローサイトメトリーでの評価によると、リンパ球ゲートにおける休止リンパ球よりも高いＦＳＣおよびＳＳＣ光散乱を有する細胞として定義される。１４日培養後の培養物中のＴリンパ芽球のパーセンテージを図３９に示す。ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質は、Ｔ細胞増殖（芽細胞生成）の誘導に有効であり、２：１のＴ細胞：ＤＣ比は、５：１比の場合と比べて低いバックグラウンド（緩衝液）Ｔ細胞増殖応答をもたらした。その結果、２：１のＴ細胞：ＤＣ比では、緩衝液と比べてＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質による刺激時にはＴ細胞増殖に著しい差異があった。
ＩＦＮ−γ応答を、５：１および２：１の両Ｔ細胞：ＤＣ比で測定した。データを、群の各ウェルの応答として、および平均の標準偏差と共に３ウェルの平均として示す（図４０）。Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答の比較結果は、５：１および２：１のＴ細胞：ＤＣ比間で著しい差異を示した。高いＤＣ濃度では、対照緩衝液の場合を凌ぐワクチン候補誘導ＩＦＮ−γ応答の証拠はほとんど無かった。しかしながら、ＤＣ濃度が低い場合、対照緩衝液付加ＤＣと培養したＴ細胞でＩＦＮ−γを産生したのはごく僅かに過ぎなかったが、ワクチン候補付加ＤＣと培養したＴ細胞については高いパーセンテージでＩＦＮ−γを産生した。ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質５Ｔｇ／ｍＬの場合と比べて同２.５μｇ／ｍＬを載せたＤＣにより刺激したＴ細胞ではＩＦＮ−γ産生細胞の減少は無かった。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋集団におけるＩＦＮ−γを発現するＴ細胞のパーセンテージを定量し、図４１に示す。ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージに関して、２.５μｇ／ｍＬのワクチン候補付加ＤＣにより刺激されたＴ細胞はＴＴ付加ＤＣによる場合と類似していた。同様に、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質による刺激時にＩＦＮ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージも、対照緩衝液による場合と比べて高かった。ＩＦＮ−γを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージについては、ワクチン候補付加ＤＣにより刺激されたＴ細胞による場合とＴＴ付加ＤＣの場合は類似していた。これらの結果は、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質が、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団の両方において著しいＩＦＮ−γ応答を誘導することを示しており、分子が、ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIの両経路においてＤＣによりプロセッシングされることを示唆している。
図４２は、抗原付加成熟ＤＣによる６時間刺激の結果としてＴＮＦ−αを産生したＴ細胞のパーセンテージを示す。これらの結果は、ＩＦＮ−γ結果と類似している。ＴＮＦ−α応答は、ＴＴによる場合と比べるとＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質による方が大きいか、またはほぼ同等であった。ＴＴまたはＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣで刺激すると、ＴＮＦ−αを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの方が同ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合よりも高くなった。
ＤＣによるＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ｇｒＢおよびｐｆｎを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞が生成される
Ｔ細胞の細胞傷害性顆粒タンパク質ｇｒＢおよびｐｆｎの産生能力についても、エクスビボＡＰＡにより評価した。未成熟ＤＣに、対照緩衝液、ＴＴ（陽性対照）または様々な濃度のＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を載せ、成熟させた後、オートロガスＴ細胞とインキュベーションした。抗ｇｒＢおよび抗ｐｆｎ ｍＡｂをそれぞれ用いる細胞内染色法により、ＧｒＢおよびｐｆｎ発現を検出した。図４３は、抗原付加成熟ＤＣによる３回刺激後にｇｒＢおよびｐｆｎを発現するＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣは、緩衝液対照処理ＤＣと比べてＣＤ８＋Ｔ細胞においてｇｒＢおよびｐｆｎ発現の増加を誘導した。これらの結果は、ＮＳ３ Chimigen（商標）ワクチンが、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてｇｒＢおよびｐｆｎの発現を誘導することを示していた。この発見は、ワクチン候補が、ＭＨＣクラスＩ経路でＤＣによりプロセッシングされることにより、Ｔ細胞への有効な提示が行われ、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞から細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）への分化を誘導することを示している。
成熟ＤＣによるＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が生成され、活性化が維持される
Ｔ細胞をＡＰＡで３回抗原付加ＤＣにより刺激した。３回目の刺激後の６日間培養後、Ｔ細胞を採取し、増殖の尺度として芽細胞のパーセンテージについて、および活性化マーカーＣＤ６９の発現についてフローサイトメトリーにより検査した。さらに、培養物から回収されたＴ細胞の絶対数を評価する手段として、ＦＳＣおよびＳＳＣ ＦＦＣ分析に基づいたリンパ球ゲート（Ｒ１ゲート）にはまるゲート細胞の数を測定した。
ＣＤ６９発現により評価した活性化ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを図４４に示す。緩衝液対照と比べた場合、Chimigen3 タンパク質付加ＤＣで刺激したＴ細胞ではＣＤ６９を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両Ｔ細胞のパーセンテージが増加していた。緩衝液対照と比べると、ＴＴおよび Chimigen（商標）タンパク質刺激ウェルからのＴ細胞の収率には著しい差異があった（図４５）。ＴＴ刺激細胞は、ワクチン候補刺激ウェルよりも高いＴ細胞収率をもたらした。しかしながら、ＴＴ応答はリコール応答であるため、ＴＴに対して特異的反応性を示すＴ細胞の出発集団は、ＮＳ３に特異的なナイーブＴ細胞の出発集団よりも収率が高いと予測される。培養物中に存在するＴリンパ芽球を調べると、特に、芽細胞／増殖細胞のパーセンテージは、ＴＴ培養物と比べてＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質含有培養物における方が高かった。緩衝液対照培養物には、芽細胞／増殖細胞はごく僅かしか存在しなかった。すなわち、Chimigen3 タンパク質による刺激は、３回目の刺激の６日後（Ｔ細胞培養の２０日目）でも明白である顕著なＴ細胞活性化および増殖をもたらした。したがって、ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の活性化および拡大において非常に有効である。
成熟ＤＣによるＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＮＳ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成が誘導される
ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質に対する免疫応答の抗原特異性を評価するため、ＨＬＡ−Ａ２の状況において２つの免疫優性ＮＳ３エピトープに特異的なＴ細胞のパーセンテージを定量した。Ｔ細胞を、ＰＥにコンジュゲートしたＮＳ３ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２五量体で標識することによりこれを測定した。異なる濃度のＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質を載せたＤＣにより、ナイーブＴ細胞に３回刺激を加え、ＡＰＡにおいて抗原を伴わない（緩衝液）各対照ＤＣの場合と比較した。３回目の刺激の６日後にＴ細胞を採取し、ＮＳ３−特異的Ｔ細胞またはＥＢＶ−特異的Ｔ細胞（対照）を、四量体標識により検出し、フローサイトメトリーにより分析した。試験した３ウェルの緩衝液対照群うち１ウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるＥＢＶ四量体標識（陽性四量体）について陽性であり、負の四量体標識について陽性のウェルは無かった（データは示さず）。評価したＴ細胞は、緩衝液対照処理ウェルからのものであったため、ＥＢＶ四量体標識Ｔ細胞の数は比較的低いと予測される。ＡＰＡによるＮＳ３五量体でのＣＤ８＋Ｔ細胞標識のパーセンテージを図４６に示す。ＮＳ３ Chimigen（商標）タンパク質をＤＣに載せることにより、ＮＳ３エピトープに対する特異性をもつＴ細胞が生成された。この特異性をもつＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい拡大は、低ＤＣ濃度群の６ウェルのうちの４ウェルで明白であった。すなわち、ＮＳ３ Chimigenタンパク質は、ＮＳ３免疫優性エピトープに特異的なＴ細胞の生成を誘導する能力をもち、他のＮＳ３エピトープに対する特異性をもつＴ細胞も存在したと思われる。
実施例４．ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ多抗原 Chimigen3 タンパク質による結果
ＨＣＶ ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の発現
Ｓｆ９細胞におけるＨＣＶ 多抗原Chimigen（商標）タンパク質の発現の時間推移を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウエスタン・ブロットにより分析した。ＨＣＶ多抗原Chimigen（商標）タンパク質の発現および分解の両因子を考慮に入れることにより、最良のタンパク質発現条件が、感染後３６時間１.５のＭＯＩとして測定された。
Ｓｆ９細胞ペレットの澄明なライゼートからのＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質の精製
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィー
精製の第１段階として、ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ Chimigen（商標）タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ Superflow3 カラムで捕捉した。Ｎｉ−ＮＴＡ Superflow3 カラムに結合したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロットにより分析した。ウエスタン・ブロットは、Chimigen（商標）タンパク質の優勢なバンドを示したが、ニトロセルロース膜の銀染色は、非免疫反応性タンパク質のさらなるバンドを示していた。
HiTRap Q-XL イオン交換クロマトグラフィー
Ｎｉ−ＮＴＡ Superflow カラムにより捕獲されたタンパク質を、HiTrap Q XL １ｍＬカラムクロマトグラフィーによりさらに分離した。タンパク質をフロー・スルーフラクション中で溶離し、フラクションを０.４および０.５Ｍ間のＮａＣｌの塩濃度で溶離した。カラムに結合した、ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ多抗原Chimigen（商標）タンパク質は、フロー・スルーフラクション中のタンパク質よりも汚染度が低かった。少なくとも６本の免疫反応性バンドが銀染色により観察された。
Superdex ２００クロマトグラフィー
ライゼート中のタンパク質を、Superdex ２００カラムにより分画した。ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ多抗原Chimigen（商標）タンパク質は、最初のピークで溶離された。フラクションのウエスタン・ブロットおよび銀染色を実施した。タンパク質は、銀染色では優勢なバンドとして示されるが、汚染物質の多数のバンドも見られた。ウエスタン・ブロットの結果は、精製中におけるタンパク質の凝集を示唆している。
フェニル−６５０Ｃ Toyopearlでの疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ多抗原Chimigen（商標）タンパク質を含む細胞ライゼートを、フェニル−６５０Ｃ Toyopearl（商標）に載せ、非吸収および吸収フラクションの両方で溶離した。フラクションのウエスタン・ブロットおよび銀染色を実施した。両フラクションでは、ＨＣＶ多抗原Chimigen（商標）タンパク質が、ウエスタン・ブロットおよびニトロセルロース膜の銀染色における優勢なバンドとして観察された。
実施例５．ＨＣＶコア Chimigen3 タンパク質による結果
ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質を精製および特性検定した
ＨＣＶコアChimigen3 タンパク質を、変性条件下Ｎｉキレート化クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー）により、次いでカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＭセファロース）により精製した。精製タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。主要バンドは融合タンパク質（〜５５ＫＤａ）であり、２８ｋＤａで認められる第２バンドは分解産物であると思われる。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離後、精製タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。抗６ｘＨｉｓ−ＨＲＰコンジュゲート抗体、抗Ｆｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗体および抗ＨＣＶコア抗体、二次抗体として抗Ｆａｂ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗体により、ウエスタン・ブロッティングを実施した。結合抗体を化学発光により検出した。ブロットへの抗体の結合は、精製ＨＣＶコア−ＴＢＤが無傷のＮ−末端、コアおよびＴＢＤ部分を有することを示していた。さらに、低分子量バンドが全３抗体により検出されたことから、それが、完全長ＨＣＶコアChimigen（商標）分子由来のタンパク質であり、分解の結果である可能性が高いことを示していた。
ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質は未成熟ＤＣに結合する
ＨＣＶコアChimigen（商標）ワクチンを、その未成熟ＤＣへの結合能力について調べた。４℃で１時間、細胞を様々な濃度のＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションし、結合をＦＦＣまたは共焦点顕微鏡により検出した。ＦＦＣ分析については、結合ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質を、ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂおよびＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５により検出した。
ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質と結合している細胞のパーセンテージ（陽性細胞％）および結合タンパク質の相対量（ＭＦＩ）をＦＦＣにより測定した。５〜４０μｇ／ｍＬのＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質では、細胞のほぼ１００％が結合に関して陽性であり、結合ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質の量は用量依存的に増加していた（図４７）。観察された結合の高いＭＦＩは、ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質が非常に有効かつ高レベルで未成熟ＤＣに結合することを示唆していた。
ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質の結合を、同様に共焦点顕微鏡を用いて試験した。結合を、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧで検出した。青色蛍光染料ＤＡＰＩを用いて、核を映像化した。共焦点画像および対応する光造影は、タンパク質が、４℃で１時間パルス後、未成熟ＤＣの膜に結合していることを示していた。
ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質は未成熟ＤＣ上の特異的受容体に結合する
Ｆｃフラグメントの存在により、ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質は、未成熟ＤＣ上のＣＤ３２（ＦｃγＲII）にＴＢＤ領域を介して結合し得ると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質は、Ｃ型レクチン受容体、例えばＣＤ２０６（ＭＭＲ）に結合すると予測される。ＨＣＶコアChimigen（商標）タンパク質の結合の特異性を測定するため、未成熟ＤＣを、ＣＤ３２またはＣＤ２０６に特異的な遮断性ｍＡｂの存在下でＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質とインキュベーションした。また、競合リガンド、Ｆｃγ受容体についてのマウスＩｇＧ Ｆｃフラグメント、およびＣ型レクチン受容体についてのマンノシル化ＢＳＡ（ｍＢＳＡ）の存在下でも結合を調べた。
未成熟ＤＣを、４℃で１時間、ＰＢＳ（緩衝液対照）、マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメント（５００μｇ／ｍＬ）、ＣＤ３２ｍＡｂ（２００μｇ／ｍＬ）、マンノシル化ＢＳＡ（５００μｇ／ｍＬ）、または抗ＣＤ２０６（２００μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした後、４℃で１時間ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質（３０μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。結合したタンパク質を、ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂまたはビオチニル化抗ＨＣＶコアｍＡｂ、次いでＳＡ−ＰＥ−Ｃｙ５で検出した。結合したＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質の相対量（ＭＦＩ）をＦＦＣにより測定した。結合および阻害試験からの結果は、ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質が、Ｆｃγ受容体、例えばＣＤ３２およびＣ型レクチン受容体、例えばＣＤ２０６に結合していることを示した（図４８）。
ＤＣによるＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質提示により、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞において細胞内ＩＦＮ−γレベルは増加する
ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質に対する機能的免疫応答を、エクスビボ抗原提示検定法により評価した。未成熟ＤＣに、ＰＢＳ（緩衝液対照）、テタヌス・トキソイド（陽性対照）、または様々な濃度のＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質を載せた。ＤＣが成熟すると、それらをオートロガスＴ細胞とインキュベーションした。Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γの細胞内レベルの検出により、Ｔ細胞機能を評価した。細胞のＣＤ３およびＣＤ８表現型についてもＦＦＣにより測定した。図４９ＡおよびＢは、それぞれ抗原付加成熟ＤＣによる３回目の刺激の１２時間後にＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。テタヌス・トキソイドを有効な抗原提示についての陽性対照として用いた。ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣは、無抗原対照と比べるとＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ発現の著しい増加を誘発した。ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質付加ＤＣで刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γの発現は増加していた。これらの結果は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両Ｔ細胞集団においてＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質がＩＦＮ−γ応答を誘導することを示しており、分子がＭＨＣクラスＩおよびクラスIIの両経路でＤＣによりプロセッシングされることを示唆している。
成熟ＤＣによるＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質提示は、ＨＣＶコア特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を誘導する
ＨＣＶコアに対する免疫応答の特異性を評価するため、ＨＬＡ−Ｂ７の状況において免疫優性ＨＣＶコアエピトープに特異的なＴ細胞のパーセンテージを定量した。Ｔ細胞を、ＰＥにコンジュゲートしたＨＣＶコアペプチド／ＨＬＡ−Ｂ７四量体で標識することにより、これを達成した。さらに、Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８特異的ｍＡｂで標識した。
ＨＣＶコアナイーブＴ細胞に、異なる濃度のＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質を載せたＤＣにより３回刺激を加え、無抗原、テタヌス・トキソイドまたはＴＢＤ付加の各対照ＤＣと比較した。３回目の刺激の５日後、Ｔ細胞を採取し、ＨＣＶコア特異的Ｔ細胞を二次元ＦＦＣにより検出した。図５０における二次元ＦＦＣドットプロットは、ＨＣＶコア Chimigen（商標）タンパク質を付加したＤＣとインキュベーションしたＴ細胞が、コア四量体陽性Ｔ細胞で僅かに増加したことを示している。
添付書類を全て含め、米国仮出願第６０／７２６７０１号の開示を、本明細書では出典明示で援用する。
上記明細書で挙げた出版物、特許出願、および特許については全て、本明細書では出典明示で援用する。記載されている本発明の方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱しなければ当業者には容易に理解できるはずである。本発明について、好ましい実施態様と関連付けて説明したが、請求の範囲で主張されている本発明は、上記実施態様に限定されるわけではないものと理解すべきである。事実、記載されている本発明実施方法の様々な修飾も、当業者には明白なものであり、請求の範囲内に含まれるものとする。
図１は、Chimigen（キミゲン） ３ワクチンの２量体化形態の概略図である。それは、２つのサブユニットを含み、各々免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）および標的結合ドメイン（ＴＢＤ）により構成される。 図２ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦ（読み枠）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。 図３ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号３９）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。図３Ａおよび図３Ｂの下線を付した太字の位置には、保存された自然突然変異（ＴＴＣ（Ｐｈｅ）〜ＴＴＴ（Ｐｈｅ））がある。 ヌクレオチド配列では：ヌクレオチド１〜３： 出発コドンヌクレオチド１３〜３０： ６ＸＨｉｓエピトープ標識ヌクレオチド９１〜１４３１： ＨＣＶ ＮＳ５Ａヌクレオチド１４３２〜１４６１： リンカーペプチドヌクレオチド１４６２〜２１５７： ＴＢＤヌクレオチド２１５８〜２１８７： 末端ペプチドヌクレオチド２１８８〜２１９０： 停止コドンヌクレオチド１６３９〜１６４１： ＴＢＤ ＴＴＣ−ＴＴＴ保存突然変異 アミノ酸配列では：アミノ酸５〜１０： ６ｘＨｉｓエピトープ標識アミノ酸３１〜４７７： ＨＣＶ ＮＳ５Ａアミノ酸４７８〜４８７： リンカーペプチドアミノ酸４８８〜７１９： ＴＢＤアミノ酸７２０〜７２９： 末端ペプチド 図４ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４１）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５２）を示す図である。図４Ａおよび図４Ｂの下線を付した太字の位置には、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））および保存自然突然変異（ＴＴＣ（Ｐｈｅ）〜ＴＴＴ（Ｐｈｅ））がある。 ヌクレオチド配列では：ヌクレオチド１〜３： 出発コドンヌクレオチド１〜７２： ｇｐ６４シグナルペプチドヌクレオチド９７〜１１４： ６ＸＨｉｓエピトープ標識ヌクレオチド１７５〜１５１５： ＨＣＶ ＮＳ５Ａヌクレオチド１５１６〜１５４５： リンカーペプチドヌクレオチド１５４６〜２２４１： ＴＢＤヌクレオチド２２４２〜２２７１： 末端ペプチドヌクレオチド２２７２〜２２７４： 停止コドンヌクレオチド６１〜６３： シグナルペプチドＧＡＴ〜ＴＡＴ人工的突然変異ヌクレオチド１７２５： ＴＢＤ ＴＴＣ−ＴＴＴ保存突然変異 アミノ酸配列では：アミノ酸１〜２４： ｇｐ６４分泌シグナルアミノ酸３３〜３８： ６ｘＨｉｓエピトープ標識アミノ酸５９〜５０５： ＨＣＶ ＮＳ５Ａアミノ酸５０６〜５１５： リンカーペプチドアミノ酸５１６〜７４７： ＴＢＤアミノ酸７４８〜７５７： 末端ペプチドアミノ酸２１： シグナルペプチドＤ〜Ｙ人工的突然変異 図５ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＰＳＣ１２−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４２）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。 図６ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４３）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５４）を示す図である。下線を引いた図６Ａのコドンおよび図６Ｂのアミノ酸により２つの突然変異が示されている。図６Ａの上流から下流および図６ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異および自然ＣＣＡ（Ｐｒｏ）〜ＧＧＡ（Ｇｌｙ）突然変異である。 図７ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４４）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５５）を示す図である。下線を引いた太字の図７Ａのコドンおよび図７Ｂのアミノ酸により２つの突然変異が示されている。図７Ａの上流から下流および図７ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、自然保存ＡＧＧ（Ａｒｇ）〜ＣＧＧ（Ａｒｇ）突然変異および遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異である。 ヌクレオチド配列では：ヌクレオチド１〜３： 出発コドンヌクレオチド１３〜３０： ６ＸＨｉｓエピトープ標識ヌクレオチド９１〜１９６５： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔヌクレオチド１９６６〜１９９５： リンカーペプチドヌクレオチド１９９６〜２６９１： ＴＢＤヌクレオチド２６９２〜２７２１： 末端ペプチドヌクレオチド２７２２〜２７２４： 停止コドンヌクレオチド１４６２〜１４６４： ＮＳ３ｍｕｔ ＡＧＧ〜ＣＧＧ自然突然変異ヌクレオチド１４７４〜１４７６： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＧＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異 アミノ酸配列では：アミノ酸５〜１０： ６ｘＨｉｓエピトープ標識アミノ酸３１〜６５５： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔアミノ酸６５６〜６６５： リンカーペプチドアミノ酸６６６〜８９７： ＴＢＤアミノ酸８９８〜９０７： 末端ペプチドアミノ酸４８８： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ｒ自然突然変異アミノ酸４９２： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ａ遺伝子操作突然変異 図８ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３ｍｕｔ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５６）を示す図である。強調した図８Ａのコドンおよび図８Ｂのアミノ酸により３つの突然変異が示されている。図８Ａの上流から下流および図８ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））、自然保存ＡＧＧ（Ａｒｇ）〜ＣＧＧ（Ａｒｇ）突然変異および遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異である。 ヌクレオチド配列では：ヌクレオチド１〜３： 出発コドンヌクレオチド１〜７２： ｇｐ６４シグナルペプチドヌクレオチド９７〜１１４： ６ＸＨｉｓエピトープ標識ヌクレオチド１７５〜２０４９： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔヌクレオチド２０５０〜２０７９： リンカーペプチドヌクレオチド２０８０〜２７７５： ＴＢＤヌクレオチド２７７６〜２８０５： 末端ペプチドヌクレオチド２８０６〜２８０８： 停止コドンヌクレオチド６１〜６３： シグナルペプチドＧＡＴ〜ＴＡＴ人工的突然変異ヌクレオチド１５５８〜１５６０： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＧＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異 アミノ酸配列では：アミノ酸１〜２４： ｇｐ６４分泌シグナルアミノ酸３３〜３８： ６ｘＨｉｓエピトープ標識アミノ酸５９〜６８３： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔアミノ酸６８４〜６９３： リンカーペプチドアミノ酸６９４〜９２５： ＴＢＤアミノ酸９２６〜９３５： 末端ペプチドアミノ酸２１： シグナルペプチドＤ〜Ｙ人工的突然変異アミノ酸５２０： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ａ遺伝子操作突然変異 図９ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４ ＮＳ３−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４６）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５７）を示す図である。下線を引いた太字の図９Ａのコドンおよび図９Ｂのアミノ酸により４つの突然変異が示されている。図９Ａの上流から下流および図９ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））、遺伝子操作されたＴＣＧ（Ｓｅｒ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、および自然ＣＣＡ（Ｐｒｏ）〜ＧＧＡ（Ｇｌｙ）突然変異である。 図１０ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−ｇｐ６４−ＮＳ３−ＮＳ５Ａ−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４７）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５８）を示す図である。下線を引いた図１０Ａのコドンおよび図１０Ｂのアミノ酸により４つの突然変異が示されている。図１０Ａの上流から下流および図１０ＢのＮ−末端からＣ−末端についての突然変異は、人工的突然変異（ＧＡＴ（Ａｓｐ）〜ＴＡＴ（Ｔｙｒ））、遺伝子操作されたＴＣＧ（Ｓｅｒ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、遺伝子操作されたＣＧＧ（Ａｒｇ）〜ＧＣＧ（Ａｌａ）突然変異、および自然ＣＣＡ（Ｐｒｏ）〜ＧＧＡ（Ｇｌｙ）突然変異である。 ヌクレオチド配列では：ヌクレオチド１〜３： 出発コドンヌクレオチド１〜７２： ｇｐ６４シグナルペプチドヌクレオチド９７〜１１４： ６ＸＨｉｓエピトープ標識ヌクレオチド１７５〜２０４９： ＨＣＶ ＮＳ３ｍｕｔヌクレオチド２０５０〜２０５８： リンカーペプチドヌクレオチド２０５９〜３４０２： ＨＣＶ ＮＳ５Ａヌクレオチド３４０３〜３４２６： リンカーペプチドヌクレオチド３４２７〜４１２２： ＴＢＤヌクレオチド４１２３〜４１５２： 末端ペプチドヌクレオチド４１５３〜４１５５： 停止コドンヌクレオチド６１〜６３： シグナルペプチドＧＡＴ〜ＴＡＴ人工的突然変異ヌクレオチド５８９： ＮＳ３ｍｕｔ ＴＣＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異ヌクレオチド１５５８〜１５５９： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＧＧ〜ＧＣＧ遺伝子操作突然変異ヌクレオチド２０５０〜２０５２： ＮＳ３ｍｕｔ ＣＣＡ〜ＧＧＡ自然突然変異 アミノ酸配列では：アミノ酸１〜２４： ｇｐ６４分泌シグナルアミノ酸３３〜３８： ６ｘＨｉｓエピトープ標識アミノ酸５９〜６８３： ＨＣＶ ＮＳ３アミノ酸６８４〜６８６： リンカーペプチドアミノ酸６８７〜１１３４： ＨＣＶ ＮＳ５Ａアミノ酸１１３５〜１３７４： ＴＢＤアミノ酸１３７５〜１３８４： 末端ペプチドアミノ酸２１： シグナルペプチドＤ〜Ｙ人工的突然変異アミノ酸１９７： ＮＳ３ｍｕｔ Ｓ〜Ａ遺伝子操作突然変異アミノ酸５２０： ＮＳ３ｍｕｔ Ｒ〜Ａ遺伝子操作突然変異アミノ酸６８４： ＮＳ３ｍｕｔ Ｐ〜Ｇ自然突然変異 図１１ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶコア（１−１７７）−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４８）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号５９）を示す図である。 図１２ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号４９）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号６０）を示す図である。 図１３ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ Ｅ２−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号５０）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号６１）を示す図である。 図１４ＡおよびＢは、それぞれプラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ−Ｅ１−Ｅ２−ＴＢＤにおけるＯＲＦのヌクレオチド配列（配列番号５１）およびそのＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列（配列番号６２）を示す図である。 図１５は、異なる３濃度での、未成熟ＤＣへのＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の結合を示す一連の蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）プロフィールである。 図１６は、ＣＤ３２およびＣＤ２０６に特異的な抗体による未成熟ＤＣへのＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。 図１７は、実施例記載の要領で製造された成熟ＤＣによる示された細胞表面抗原マーカーの発現を示す一連の棒グラフである。データは、ＦＦＣにより得られたもので、「陽性細胞パーセント（％）」（上のグラフ）および「平均蛍光強度」（「ＭＦＩ」）（下のグラフ）として示されている。 図１８Ａ〜Ｂは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣの４日目培養物におけるＣＤ６９発現Ｔ細胞（図１８Ａ）、ＣＤ６９発現ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１８Ｂ）、およびＣＤ６９発現ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１８Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。 図１９Ａ〜Ｃは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣの４日目培養物におけるＣＦＳＥｌｏ Ｔ細胞（図１９Ａ）、ＣＦＳＥｌｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１９Ｂ）、およびＣＦＳＥｌｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１９Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。 図２０Ａ〜Ｃは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣまたはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；図２０Ａ中）の７日目培養物におけるＣＤ６９発現Ｔ細胞（図２０Ａ）、ＣＤ６９発現ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２０Ｂ）、およびＣＤ６９発現ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２０Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。 図２１Ａ〜Ｃは、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣまたはＰＨＡ（図２１Ａ中）の７日目培養物におけるＣＦＳＥｌｏ Ｔ細胞（図２１Ａ）、ＣＦＳＥｌｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２１Ｂ）、およびＣＦＳＥｌｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２１Ｃ）の比率を示す３セットの棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。 図２２は、様々な濃度のＴ細胞およびＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣまたはＰＨＡの７日目培養物における芽細胞であるＴ細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ１および５ＡＣ２：ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質の２種の異なる調製物。 図２３は、示された細胞表面マーカーの成熟抗原付加ＤＣの発現を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。 図２４は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の芽細胞であるＴ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データは（ＦＦＣ）により得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図２５は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内インターフェロン−Ｋ（ＩＦＮ−Ｋ）含有Ｔ細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。ＰＭＡ：ホルボールミルスチン酸；ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）。 図２６は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図２７は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図２８は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内腫瘍壊死因子−Ｉ（ＴＮＦ−Ｉ）含有Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質；ＰＭＡ：ホルボールミルスチン酸；ＤＰＢＳ。 図２９は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＴＮＦ−Ｉ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図３０は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の顆粒タンパク質ＧｒＢ（左グラフ）およびＰｆｎ（右グラフ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図３１は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のリンパ球（Ｒ１ゲート細胞）の総数および芽細胞の比率を示す一対の棒グラフである。細胞を最終刺激の６日後に分析した。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図３２は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の６日後に細胞を分析した。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図３３は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のＥＢＶペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体（陽性対照）または対照四量体（陰性四量体）と結合した抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の６日後に３つの各培養ウェルからの細胞（試験および対照群における３本の棒線に対応）を分析した。データはＦＦＣにより得られた。 図３４は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激（異なる数のＴ細胞およびＤＣを使用）後のＮＳ５Ａペプチド／ＨＬＡ−Ａ２五量体と結合したＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の６日後に３つの各培養ウェルからの細胞（試験および対照群における３本の棒線に対応）を分析した。データはＦＦＣにより得られた。５ＡＣ： ＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質。 図３５は、２種の異なる濃度での、未成熟ＤＣへのＮＳ３ Chimigen３タンパク質の結合を示す一連のＦＦＣプロフィールである。 図３６は、ＣＤ３２およびＣＤ２０６に特異的な抗体による未成熟ＤＣへのＮＳ３ Chimigen３タンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。 図３７は、ＮＳ３ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣを含む４日目（上のグラフ）および７日目培養物におけるＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図３８は、ＮＳ３ Chimigen３タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加ＤＣを含む４日目（上のグラフ）および７日目培養物におけるＣＦＳＥｌｏ ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＦＳＥｌｏ ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図３９は、実施例においてＮＳ５Ａ Chimigen３タンパク質について記載した要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の芽細胞であるＴ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。２種の異なるＴ細胞濃度および２種の異なるＤＣ濃度を用いて刺激を行った。データはＦＣにより得られた。３Ｃ：ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４０は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有Ｔ細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４１は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４２は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＴＮＦ−Ｉ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４３は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の顆粒タンパク質ＧｒＢ（左グラフ）およびＰｆｎ（右グラフ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４４は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のＣＤ６９発現性ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ６９発現性ＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の相対比率を示す一対のグラフである。最終刺激の６日後に細胞を分析した。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４５は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後のリンパ球（Ｒ１ゲート細胞）の総数（左グラフ）および芽細胞の比率（右グラフ）を示す一対の棒グラフである。細胞を最終刺激の６日後に分析した。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ、ＡＳ６０−１： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４６は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激（異なる数のＴ細胞およびＤＣを使用）後のＮＳ３ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２五量体と結合したＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の５日後に３つの各培養ウェルからの細胞（試験群および対照群の両方における３本の棒線に対応）を分析した。データはＦＦＣにより得られた。３Ｃ： ＮＳ３ Chimigen３タンパク質。 図４７は、３種の異なる濃度での、未成熟ＤＣへのＨＣＶコアChimigen３タンパク質の結合を示す一連の蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）プロフィールである。 図４８は、ＣＤ３２およびＣＤ２０６に特異的な抗体、マンノシル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、およびマウスＩｇＧフラグメントによる未成熟ＤＣへのＨＣＶ Chimigen３コアタンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。 図４９は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加ＤＣによる３回刺激後の細胞内ＩＦＮ−Ｋ含有ＣＤ８＋Ｔ細胞（左グラフ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（右グラフ）の比率を示す一対の棒グラフである。データはＦＦＣにより得られた。ＨＣＶコア−ＴＢＤ： ＨＣＶコア Chimigen３タンパク質。 図５０は、ＨＣＶコアChimigen３タンパク質（ＨＣＶコア−ＴＢＤ）（右ドットプロット）またはＴＢＤ単独（ＴＢＤ）（左ドットプロット）を付加したＤＣによる３回刺激後のＨＣＶコアペプチド／ＨＬＡ−Ｂ７四量体と結合したＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す一対の二次元ＦＦＣドットプロットである。

Claims (49)

  1. 免疫応答を誘導するキメラ抗原であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含み、免疫応答ドメインがＣ型肝炎（ＨＣＶ）抗原を含み、標的結合ドメインが抗体フラグメントを含む、キメラ抗原。
  2. 抗体フラグメントが異種抗体フラグメントである、請求項１記載のキメラ抗原。
  3. キメラ抗原が、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導する、請求項１または請求項２記載のキメラ抗原。
  4. キメラ抗原が、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答またはＴｈ１およびＴｈ２の両免疫応答を誘導する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  5. 免疫応答がインビボ免疫応答である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  6. 免疫応答ドメインが２個以上のタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  7. 免疫応答ドメインが、ＨＣＶコア（１〜１９１）タンパク質、ＨＣＶコア（１〜１７７）タンパク質、ＨＣＶｐ７タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質、およびＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質から成る群から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の１個またはそれ以上の免疫原性部分を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  8. 標的結合ドメインが抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合し得る、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  9. 抗体フラグメントがＦｃフラグメントである、請求項２〜８のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  10. さらに、６ｘＨｉｓ標識、プロテアーゼ開裂部位、および免疫応答ドメインと標的結合ドメインを連結するリンカーのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  11. リンカーが、ロイシンジッパー、アビジンに結合したビオチン、および共有結合的ペプチド結合から成る群から選択される、請求項１０記載のキメラ抗原。
  12. キメラ抗原がグリコシル化されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  13. キメラ抗原がマンノースグリコシル化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  14. 抗体フラグメントが免疫グロブリン重鎖フラグメントを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキメラ抗原。
  15. 免疫グロブリン重鎖フラグメントがヒンジ領域を含む、請求項１４記載のキメラ抗原。
  16. 免疫グロブリン重鎖フラグメントが、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインから成る群から選択される抗体フラグメントの全部または一部分を含む、請求項１４記載のキメラ抗原。
  17. 抗原提示細胞への抗原の送達方法であって、抗原提示細胞に請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラ抗原を投与することを含む方法。
  18. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１７記載の方法。
  19. 抗原提示細胞の活性化方法であって、抗原提示細胞を請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラ抗原と接触させることを含む方法。
  20. 接触がエクスビボ（生体外）で行われる、請求項１９記載の方法。
  21. 接触がインビボ（生体内）で行われる、請求項１９記載の方法。
  22. 接触が人体で行われる、請求項２１記載の方法。
  23. 請求項１記載のキメラ抗原を含む組成物を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が対象中に存在する、請求項２１または２２記載の方法。
  24. 接触が、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発する、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 細胞性免疫応答が、Ｔｈ１応答、Ｔｈ２応答、およびＣＴＬ応答のうちの一つまたはそれ以上である、請求項２４記載の方法。
  26. 対象が、免疫治療可能な状態を有するか、または有すると思われる、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 免疫治療可能な状態が急性感染である、請求項２６記載の方法。
  28. 免疫治療可能な状態が慢性感染である、請求項２６記載の方法。
  29. 慢性感染が慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である、請求項２８記載の方法。
  30. 免疫治療可能な状態がＣ型肝炎ウイルス感染であり、免疫応答ドメインが、ＨＣＶコア（１〜１９１）タンパク質、ＨＣＶコア（１〜１７７）タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｐ７タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質、およびＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質から成る群から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の１個またはそれ以上の免疫原性部分を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 対象に、ウイルス感染に対するワクチンを接種する、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 対象に、ウイルス感染に対するワクチンを予防的に接種する、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 対象に、既存のウイルス感染に対するワクチンを治療的に接種する、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. （ａ）微生物または細胞、特にキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む微生物または細胞を準備し、次いで
    （ｂ）キメラ抗原を発現させる条件下で微生物または細胞を培養する
    ことを含むキメラ抗原の製造方法。
  35. 微生物または細胞が真核生物の微生物または細胞である、請求項３４記載の方法。
  36. 細胞が、酵母細胞、植物細胞または昆虫細胞である、請求項３４または３５記載の方法。
  37. キメラ抗原が、グリコシル化を含むように翻訳後修飾されている、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. キメラ抗原が、マンノースグリコシル化を含むように翻訳後修飾されている、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. キメラ抗原をコードし、免疫応答ドメインをコード化する第１ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメインをコード化する第２ポリヌクレオチド部分を含むポリヌクレオチドであって、標的結合ドメインが抗体フラグメントを含むポリヌクレオチド。
  40. 抗体フラグメントが異種抗体フラグメントである、請求項３９記載のポリヌクレオチド。
  41. ポリヌクレオチドが、配列番号３９および４１〜５１に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  42. ポリヌクレオチドが、配列番号４０および５２〜６２に示されたアミノ酸配列から成る群から選択される全アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるキメラ抗原をコード化する、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  43. ポリヌクレオチドが、配列番号３９および４１〜５１に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイゼーションする、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  44. 請求項３９〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  45. ポリヌクレオチドが、転写調節エレメント（ＴＲＥ）に機能し得るように結合されている、請求項４４記載のベクター。
  46. 請求項３９〜４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む微生物または細胞。
  47. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラ抗原およびそれを必要とする対象へのキメラ抗原投与に関する指示書を含む製品。
  48. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラ抗原および医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  49. （ａ）微生物または細胞、特に標的結合ドメイン−リンカー分子をコード化するポリヌクレオチドを含み、その標的結合ドメイン−リンカー分子がリンカー分子に結合された標的結合ドメインを含んでいる微生物または細胞を準備し、
    （ｂ）標的結合ドメイン−リンカー分子が発現される条件下で微生物または細胞を培養し、次いで
    （ｃ）免疫応答ドメインへリンカーを結合させ得、その結合によりキメラ抗原を生じさせる条件下で標的結合ドメイン−リンカー分子および免疫応答ドメインを接触させる
    ことを含む、キメラ抗原の製造方法。
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