JP2014039557A - 免疫応答を誘導するためのC型肝炎ウイルスポリペプチドおよびFcフラグメントを含むキメラ抗原 - Google Patents
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Abstract
【課題】提示細胞(APC)をターゲッティング及び活性化することにより、細胞性及び体液性免疫応答の誘導を目的とする、C型肝炎ウイルス(HCV)抗原および免疫グロブリンのFcフラグメントを含むキメラ抗原を提供する。
【解決手段】宿主免疫系に免疫応答ドメイン(HCVコア、エンベロープ、または非構造タンパク質フラグメントからのHCV抗原)および標的結合ドメイン(Fcフラグメント)を提示することにより、免疫応答を高めること。標的結合ドメインを介して、抗原提示細胞は、キメラ抗原を内在化およびプロセッシングすることにより、抗原を提示し、それによって体液性および細胞性免疫応答を誘導する。
【選択図】図1
【解決手段】宿主免疫系に免疫応答ドメイン(HCVコア、エンベロープ、または非構造タンパク質フラグメントからのHCV抗原)および標的結合ドメイン(Fcフラグメント)を提示することにより、免疫応答を高めること。標的結合ドメインを介して、抗原提示細胞は、キメラ抗原を内在化およびプロセッシングすることにより、抗原を提示し、それによって体液性および細胞性免疫応答を誘導する。
【選択図】図1
Description
本発明は、抗原提示細胞(APC)をターゲッティングおよび活性化することにより、細胞性および体液性免疫応答を誘導するキメラ抗原(例、融合タンパク質)に関するものである。特に、本発明は、1種またはそれ以上の予め選択されたC型肝炎ウイルス(HCV)抗原(複数も可)、および免疫グロブリンフラグメントを含む1種またはそれ以上のキメラ抗原を含むかまたは使用する組成物および方法であって、キメラ抗原が、プロセッシングおよび抗原提示の遂行により細胞性および体液性免疫応答を誘導するAPC、特に樹状細胞に結合し、それらを活性化し得るものである、組成物および方法について報告している。
世界中で1億7000万を超える人々が、HCVの慢性保菌者である[Delwaide et al.(2000)Rev.Med.Liege 55:337−340]。HCVについては現在利用可能な予防用ワクチンも治療用ワクチンも存在しない。感染経路は血液または他の体液を介するものであり、70%を超える割合の患者はウイルスの慢性保菌者となる。持続的感染の結果、進行性の肝臓疾患に至り得る慢性活動性肝炎が誘発される[Alter et al.(1999)N.Engl.J.Med.341:556−562]。現在のところ、C型肝炎(ウイルス)感染についての唯一の治療法は、インターフェロン−I(IFN−I)およびリバビリンである。しかしながら、この治療法は高価であり、かなりの副作用を伴い、効果があるのは選択された患者群の約50%に過ぎない。宿主免疫応答を高めることにより慢性HCV感染を排除する治療用ワクチンは、この疾患の処置における大きな進歩となる。
免疫系は、HCV感染がもたらす結果に関して重要な役割を演じる。HCVに暴露されたほとんどの個体は、ウイルスに対して広範で強い多抗原特異的CD4+(調節的)およびCD8+(細胞傷害性)T細胞応答を展開する。これらの個体は自己限定性感染のみを発症する。しかしながら、HCVに暴露された個体の中には、弱いか、または検出不可能で焦点の狭い免疫応答の結果、慢性感染に至る場合もある。
HCVは、RNAウイルスのフラビウイルス科(flaviviridae)の一員である。HCVゲノムは、宿主およびウイルスプロテアーゼにより触媒される個々のタンパク質に開裂されることにより、3種の構造タンパク質(コア、E1、E2)、p7タンパク質および6種の非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)を生じる単一ポリタンパク質をコード化する約9.5Kbのプラスセンス1本鎖RNA分子である[Hijikkata et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5547−5551]。NS3タンパク質は、非構造タンパク質のタンパク質分解的プロセッシングに関与するウイルス性セリンプロテアーゼである[Bartenschlager et al.(1993)J.Virol. 67;3835−3844]。
ウイルスが宿主免疫組織を回避する機構は、明確には確立されていない[Shoukry et al.(2004)Ann.Rev.Microbiol.58:391−424]。幾つかのHCVタンパク質が、免疫回避機構に関与している。これらには、IFN−誘導抗ウイルス応答を阻害するIL−8の産生を誘導し[Polyak et al.(2001)J.Virol. 75:6095−6106]、細胞性IFN−γ−誘導PKRプロテインキナーゼを阻害、すなわち抗ウイルス性免疫応答を阻害する[Tan et al.(2001)Virol.284:1−12]ことが示唆されているNS5A、DC分化を阻害する[Dolganiuc et al.(2003)J.Immunol. 170:5615−5624]ことが示唆されているコアおよびNS3;DC成熟の調節および最終的にはヘルプメモリーT細胞の欠乏[Shoji et al.(1999)Virology 254:315−323]によりT細胞応答を調節することが示唆されているコアおよびE1[Sarobe et al.(2002)J.Virol. 77:10862−10871;および Grakoui et al.(2003)Science 302:659−662]がある。
本発明は、免疫応答誘発における初期段階の一つである、APCをターゲッティングおよび活性化する組成物および方法に関するものである。本発明組成物は、標的結合ドメイン(TBD)、例えば抗体フラグメント部分に結合された、免疫応答ドメイン(IRD)、例えば組換えタンパク質を含む新規クラスの分子(以後、「キメラ抗原」と称す)を包含する。さらに具体的には、キメラ抗原は、ウイルス抗原、例えばC型肝炎コア、エンベロープタンパク質、例えばE1およびE2、または非構造タンパク質を免疫グロブリンフラグメント、例えばマウス免疫グロブリンGFcフラグメントにカップリングする分子である。実施態様によっては、抗体フラグメントが異種抗体フラグメントの場合もある。
本発明の組成物および方法は、APCのターゲッティングおよび活性化に有用である。本発明の組成物および方法は、HCVに関連するウイルス抗原に対して細胞性および/または体液性宿主免疫応答を誘導するのに有用である。本発明は、慢性HCV感染処置用の治療的ワクチンおよびHCV感染防止用の予防的ワクチンを包含する。
本発明の一つまたはそれ以上の態様は、HCVに対して免疫応答を開始させるのに適切な1種またはそれ以上のキメラ抗原を含む。これらの本発明実施態様では、選択されたHCV抗原を抗体のフラグメントに結合させる。生じたキメラ抗原は、APC、例えば樹状細胞をターゲッティングおよび活性化し得る。
本発明はまた、融合タンパク質をコード化するDNA構築物をクローニングし、異種発現系で融合タンパク質を製造する方法も包含する。好ましい本発明実施態様において、クローニングおよび製造方法では、限定されるわけではないが、発現された融合タンパク質のグリコシル化(例、マンノシル化)を含む特有な翻訳後修飾を導入する。
有効な抗原提示を誘導するために、本発明者らは、新規ウイルス抗原−マウスモノクローナル抗体Fcフラグメント融合タンパク質を開発した。この分子は、Fcフラグメントをもつため、特異的受容体を介してAPC(例、樹状細胞)により高い効率で認識され、融合タンパク質はプロセッシングされ、ウイルス抗原からのペプチドエピトープは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIとの複合体として提示される。このプロセッシングおよび抗原提示の結果、細胞傷害性Tリンパ球による応答はアップレギュレーションされ、ウイルス感染細胞集団は排除される。さらに、MHCクラスII分子により抗原が提示され、ヘルパーT細胞が活性化されるため、体液性応答がウイルス抗原に対して誘導され得、ウイルス感染の阻止および/または排除を助けることになる。
分子のキメラ性によって、適切な抗原提示細胞(例、樹状細胞)への抗原のターゲッティングを促進させることから、APC受容体を特異的にターゲッティングすることによる慢性感染症の独特な治療方法となる。これは、慢性C型肝炎ウイルス感染を処置するための治療的ワクチンの開発に有用である。
これらのキメラ融合タンパク質の投与により、細胞性および体液性の両応答を含む、宿主からの広範な免疫応答が誘発され得る。すなわち、それらを治療用ワクチンとして使用することにより、HCV感染に対して免疫寛容性を示す対象を処置し得る。
さらに具体的には、本発明は、免疫応答を誘発し、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含むキメラ抗原であって、免疫応答ドメインがC型肝炎(HCV)抗原を含み、標的結合ドメインが抗体フラグメントを含むキメラ抗原を特徴とする。抗体フラグメントは、異種抗体フラグメントであり得る。キメラ抗原は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発し得る。さらに、キメラ抗原は、Th1免疫応答、Th2免疫応答またはTh1およびTh2の両免疫応答を誘発し得る。免疫応答は、生体内または生体外免疫応答であり得る。免疫応答ドメインは、複数のタンパク質を含み得る。例えばそれは、例えばHCVコア(1〜191)タンパク質、HCVコア(1〜177)タンパク質、HCV p7タンパク質、HCV E1タンパク質、HCV E2タンパク質、HCV E1−E2タンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4Bタンパク質、またはHCV NS5Aタンパク質を含む1種またはそれ以上のタンパク質の1つまたはそれ以上の免疫原性部分を含み得る。標的結合ドメインは、抗原提示細胞(APC)に結合することが可能である。抗体フラグメントは、Fcフラグメントであり得る。キメラ抗原は、さらに6xHis標識、プロテアーゼ開裂部位、および免疫応答ドメインと標的結合ドメインを結合するリンカーのうちの一つまたはそれ以上を含み得る。リンカーは、ロイシンジッパー、アビジンに結合されたビオチン、および共有結合的ペプチド結合から選択され得る。さらに、キメラ抗原は、グリコシル化、例えばマンノースグリコシル化され得る。抗体フラグメントは、免疫グロブリン重鎖フラグメントを含み得、免疫グロブリン重鎖フラグメントは、ヒンジ領域を含み得る。さらに、免疫グロブリン重鎖フラグメントは、CH1、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインから成る群から選択される抗体フラグメントの全部または一部分を含み得る。
本発明の別の態様は、抗原提示細胞への抗原の送達方法であって、本明細書に開示されたキメラ抗原のいずれかを抗原提示細胞に投与することを含む方法である。抗原提示細胞は、樹状細胞であり得る。
本発明はまた、抗原提示細胞の活性化方法を提供する。本方法は、抗原提示細胞を本明細書で開示されているキメラ抗原のいずれかと接触させることを含み得る。この接触は、エクスビボまたはインビボで行われ得る。それは、例えばヒトで行われ得る。本方法は、本発明キメラ抗原のいずれかを含む組成物を対象に投与することを含み得、この場合抗原提示細胞は対象内に存するものとする。接触は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発し得る。細胞性免疫応答は、Th1応答、Th2応答、およびCTL応答の一つまたはそれ以上であり得る。対象は、免疫治療可能な状態を有するか、または有すると思われ得る。免疫治療可能な状態は、急性感染(例、急性ウイルス感染)であり得るか、またはそれは慢性感染(例、慢性ウイルス感染)であり得る。慢性感染は、慢性C型肝炎ウイルス感染であり得る。免疫治療可能な状態は、C型肝炎ウイルス感染であり得、免疫応答ドメインは、HCVコア(1〜191)タンパク質、HCVコア(1〜177)タンパク質、HCV E1タンパク質、HCV E2タンパク質、HCV E1−E2タンパク質、HCV P7タンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4Bタンパク質、およびHCV NS5Aタンパク質から成る群から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上の抗原性部分を含み得る。本方法を用いることにより、対象はウイルス感染に対してワクチン接種され得、例えばウイルス感染に対して予防的にワクチン接種されるかまたは既存のウイルス感染に対して治療的にワクチン接種され得る。
本発明の別の態様は、キメラ抗原の製造方法である。上記方法は、(a)微生物または細胞、特にキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む微生物または細胞を準備し、次いで(b)キメラ抗原を発現させる条件下で微生物または細胞を培養することを含み得る。微生物または細胞は、真核生物の微生物または細胞であり得る。細胞は、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞であり得る。さらに、キメラ抗原は、グリコシル化を含むように翻訳後修飾され得、例えば、それはマンノースグリコシル化を含むように翻訳後修飾され得る。
本発明のさらに別の態様は、キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドであって、免疫応答ドメインをコード化する第1ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメイン、具体的には抗体フラグメントを含む標的結合ドメインをコード化する第2ポリヌクレオチド部分を含むポリヌクレオチドである。抗体フラグメントは、異種抗体フラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号39および41〜51に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは、配列番号40および52〜62に示されたアミノ酸配列から成る群から選択される全アミノ酸配列と少なくとも90%同一であるキメラ抗原をコードし得る。ポリヌクレオチドは、配列番号39および41〜51に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイゼーションし得る。本発明はまた、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター、例えばポリヌクレオチドが転写調節エレメント(TRE)に機能し得るように結合されたベクターを提供する。さらに、本発明は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれかを含む微生物または細胞を包含する。
本発明の別の態様は、本明細書で開示されたキメラ抗原のいずれかおよびそれを必要とする対象へのキメラ抗原投与に関する指示書を含み得る製品である。
本発明のさらに別の態様は、本明細書で開示されたキメラ抗原のいずれかおよび医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
さらに、本発明は、キメラ抗原の別の製造方法を提供する。本方法は、(a)微生物または細胞、特に標的結合ドメイン−リンカー分子をコード化するポリヌクレオチドを含み、その標的結合ドメイン−リンカー分子がリンカー分子に結合された標的結合ドメインを含んでいる微生物または細胞を準備し、(b)標的結合ドメイン−リンカー分子が発現される条件下で微生物または細胞を培養し、次いで(c)免疫応答ドメインへリンカーを結合させ得、その結合によりキメラ抗原を生じさせる条件下で標的結合ドメイン−リンカー分子および免疫応答ドメインを接触させることを含み得る。微生物または細胞、ポリヌクレオチド、標的結合ドメイン、リンカー分子、および免疫応答ドメインは、本明細書に開示されたもののいずれかであり得る。
特に断らなければ、本明細書で使用している技術的および科学的用語は全て、本発明が属する業界において通常レベルで一般的に理解されているのと同じ意味を有するものとする。対立する場合、定義を含む本文書で統制する。好ましい方法および材料を下記に示しているが、本明細書記載のものと類似または均等内容の方法および材料でも、本発明を実践または試験する際に使用され得る。本明細書で挙げた出版物、特許出願、特許および他の参考文献については全て、出典明示で援用する。本明細書で開示されている材料、方法、および例は、説明を目的としているのに過ぎず、限定を意図したものではない。
本発明の他の特徴および利点、例えば免疫治療可能な状態を処置または予防するためのキメラ抗原は、以下の記載、図面および請求の範囲から容易に想到できるものである。
図1は、Chimigen(キミゲン) 3ワクチンの2量体化形態の概略図である。それは、2つのサブユニットを含み、各々免疫応答ドメイン(IRD)および標的結合ドメイン(TBD)により構成される。
図2AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−TBDにおけるORF(読み枠)のヌクレオチド配列(配列番号9)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号10)を示す図である。
図3AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号39)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号40)を示す図である。図3Aおよび図3Bの下線を付した太字の位置には、保存された自然突然変異(TTC(Phe)〜TTT(Phe))がある。
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド13〜30: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド91〜1431: HCV NS5A
ヌクレオチド1432〜1461: リンカーペプチド
ヌクレオチド1462〜2157: TBD
ヌクレオチド2158〜2187: 末端ペプチド
ヌクレオチド2188〜2190: 停止コドン
ヌクレオチド1639〜1641: TBD TTC−TTT保存突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸5〜10: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸31〜477: HCV NS5A
アミノ酸478〜487: リンカーペプチド
アミノ酸488〜719: TBD
アミノ酸720〜729: 末端ペプチド
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド13〜30: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド91〜1431: HCV NS5A
ヌクレオチド1432〜1461: リンカーペプチド
ヌクレオチド1462〜2157: TBD
ヌクレオチド2158〜2187: 末端ペプチド
ヌクレオチド2188〜2190: 停止コドン
ヌクレオチド1639〜1641: TBD TTC−TTT保存突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸5〜10: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸31〜477: HCV NS5A
アミノ酸478〜487: リンカーペプチド
アミノ酸488〜719: TBD
アミノ酸720〜729: 末端ペプチド
図4AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−gp64−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号41)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号52)を示す図である。図4Aおよび図4Bの下線を付した太字の位置には、人工的突然変異(GAT(Asp)〜TAT(Tyr))および保存自然突然変異(TTC(Phe)〜TTT(Phe))がある。
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド1〜72: gp64シグナルペプチド
ヌクレオチド97〜114: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド175〜1515: HCV NS5A
ヌクレオチド1516〜1545: リンカーペプチド
ヌクレオチド1546〜2241: TBD
ヌクレオチド2242〜2271: 末端ペプチド
ヌクレオチド2272〜2274: 停止コドン
ヌクレオチド61〜63: シグナルペプチドGAT〜TAT人工的突然変異
ヌクレオチド1725: TBD TTC−TTT保存突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸1〜24: gp64分泌シグナル
アミノ酸33〜38: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸59〜505: HCV NS5A
アミノ酸506〜515: リンカーペプチド
アミノ酸516〜747: TBD
アミノ酸748〜757: 末端ペプチド
アミノ酸21: シグナルペプチドD〜Y人工的突然変異
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド1〜72: gp64シグナルペプチド
ヌクレオチド97〜114: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド175〜1515: HCV NS5A
ヌクレオチド1516〜1545: リンカーペプチド
ヌクレオチド1546〜2241: TBD
ヌクレオチド2242〜2271: 末端ペプチド
ヌクレオチド2272〜2274: 停止コドン
ヌクレオチド61〜63: シグナルペプチドGAT〜TAT人工的突然変異
ヌクレオチド1725: TBD TTC−TTT保存突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸1〜24: gp64分泌シグナル
アミノ酸33〜38: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸59〜505: HCV NS5A
アミノ酸506〜515: リンカーペプチド
アミノ酸516〜747: TBD
アミノ酸748〜757: 末端ペプチド
アミノ酸21: シグナルペプチドD〜Y人工的突然変異
図5AおよびBは、それぞれプラスミドpPSC12−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号42)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号53)を示す図である。
図6AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−gp64−NS3−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号43)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号54)を示す図である。下線を引いた図6Aのコドンおよび図6Bのアミノ酸により2つの突然変異が示されている。図6Aの上流から下流および図6BのN−末端からC−末端についての突然変異は、遺伝子操作されたCGG(Arg)〜GCG(Ala)突然変異および自然CCA(Pro)〜GGA(Gly)突然変異である。
図7AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa NS3mut−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号44)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号55)を示す図である。下線を引いた太字の図7Aのコドンおよび図7Bのアミノ酸により2つの突然変異が示されている。図7Aの上流から下流および図7BのN−末端からC−末端についての突然変異は、自然保存AGG(Arg)〜CGG(Arg)突然変異および遺伝子操作されたCGG(Arg)〜GCG(Ala)突然変異である。
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド13〜30: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド91〜1965: HCV NS3mut
ヌクレオチド1966〜1995: リンカーペプチド
ヌクレオチド1996〜2691: TBD
ヌクレオチド2692〜2721: 末端ペプチド
ヌクレオチド2722〜2724: 停止コドン
ヌクレオチド1462〜1464: NS3mut AGG〜CGG自然突然変異
ヌクレオチド1474〜1476: NS3mut CGG〜GCG遺伝子操作突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸5〜10: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸31〜655: HCV NS3mut
アミノ酸656〜665: リンカーペプチド
アミノ酸666〜897: TBD
アミノ酸898〜907: 末端ペプチド
アミノ酸488: NS3mut R〜R自然突然変異
アミノ酸492: NS3mut R〜A遺伝子操作突然変異
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド13〜30: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド91〜1965: HCV NS3mut
ヌクレオチド1966〜1995: リンカーペプチド
ヌクレオチド1996〜2691: TBD
ヌクレオチド2692〜2721: 末端ペプチド
ヌクレオチド2722〜2724: 停止コドン
ヌクレオチド1462〜1464: NS3mut AGG〜CGG自然突然変異
ヌクレオチド1474〜1476: NS3mut CGG〜GCG遺伝子操作突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸5〜10: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸31〜655: HCV NS3mut
アミノ酸656〜665: リンカーペプチド
アミノ酸666〜897: TBD
アミノ酸898〜907: 末端ペプチド
アミノ酸488: NS3mut R〜R自然突然変異
アミノ酸492: NS3mut R〜A遺伝子操作突然変異
図8AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号45)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号56)を示す図である。強調した図8Aのコドンおよび図8Bのアミノ酸により3つの突然変異が示されている。図8Aの上流から下流および図8BのN−末端からC−末端についての突然変異は、人工的突然変異(GAT(Asp)〜TAT(Tyr))、自然保存AGG(Arg)〜CGG(Arg)突然変異および遺伝子操作されたCGG(Arg)〜GCG(Ala)突然変異である。
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド1〜72: gp64シグナルペプチド
ヌクレオチド97〜114: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド175〜2049: HCV NS3mut
ヌクレオチド2050〜2079: リンカーペプチド
ヌクレオチド2080〜2775: TBD
ヌクレオチド2776〜2805: 末端ペプチド
ヌクレオチド2806〜2808: 停止コドン
ヌクレオチド61〜63: シグナルペプチドGAT〜TAT人工的突然変異
ヌクレオチド1546〜1548: NS3mut AGG〜CGG保存突然変異
ヌクレオチド1558〜1560: NS3mut CGG〜GCG遺伝子操作突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸1〜24: gp64分泌シグナル
アミノ酸33〜38: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸59〜683: HCV NS3mut
アミノ酸684〜693: リンカーペプチド
アミノ酸694〜925: TBD
アミノ酸926〜935: 末端ペプチド
アミノ酸21: シグナルペプチドD〜Y人工的突然変異
アミノ酸520: NS3mut R〜A遺伝子操作突然変異
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド1〜72: gp64シグナルペプチド
ヌクレオチド97〜114: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド175〜2049: HCV NS3mut
ヌクレオチド2050〜2079: リンカーペプチド
ヌクレオチド2080〜2775: TBD
ヌクレオチド2776〜2805: 末端ペプチド
ヌクレオチド2806〜2808: 停止コドン
ヌクレオチド61〜63: シグナルペプチドGAT〜TAT人工的突然変異
ヌクレオチド1546〜1548: NS3mut AGG〜CGG保存突然変異
ヌクレオチド1558〜1560: NS3mut CGG〜GCG遺伝子操作突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸1〜24: gp64分泌シグナル
アミノ酸33〜38: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸59〜683: HCV NS3mut
アミノ酸684〜693: リンカーペプチド
アミノ酸694〜925: TBD
アミノ酸926〜935: 末端ペプチド
アミノ酸21: シグナルペプチドD〜Y人工的突然変異
アミノ酸520: NS3mut R〜A遺伝子操作突然変異
図9AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号46)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号57)を示す図である。下線を引いた太字の図9Aのコドンおよび図9Bのアミノ酸により4つの突然変異が示されている。図9Aの上流から下流および図9BのN−末端からC−末端についての突然変異は、人工的突然変異(GAT(Asp)〜TAT(Tyr))、遺伝子操作されたTCG(Ser)〜GCG(Ala)突然変異、遺伝子操作されたCGG(Arg)〜GCG(Ala)突然変異、および自然CCA(Pro)〜GGA(Gly)突然変異である。
図10AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−gp64−NS3−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号47)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号58)を示す図である。下線を引いた図10Aのコドンおよび図10Bのアミノ酸により4つの突然変異が示されている。図10Aの上流から下流および図10BのN−末端からC−末端についての突然変異は、人工的突然変異(GAT(Asp)〜TAT(Tyr))、遺伝子操作されたTCG(Ser)〜GCG(Ala)突然変異、遺伝子操作されたCGG(Arg)〜GCG(Ala)突然変異、および自然CCA(Pro)〜GGA(Gly)突然変異である。
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド1〜72: gp64シグナルペプチド
ヌクレオチド97〜114: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド175〜2049: HCV NS3mut
ヌクレオチド2050〜2058: リンカーペプチド
ヌクレオチド2059〜3402: HCV NS5A
ヌクレオチド3403〜3426: リンカーペプチド
ヌクレオチド3427〜4122: TBD
ヌクレオチド4123〜4152: 末端ペプチド
ヌクレオチド4153〜4155: 停止コドン
ヌクレオチド61〜63: シグナルペプチドGAT〜TAT人工的突然変異
ヌクレオチド589: NS3mut TCG〜GCG遺伝子操作突然変異
ヌクレオチド1558〜1559: NS3mut CGG〜GCG遺伝子操作突然変異ヌクレオチド2050〜2052: NS3mut CCA〜GGA自然突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸1〜24: gp64分泌シグナル
アミノ酸33〜38: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸59〜683: HCV NS3
アミノ酸684〜686: リンカーペプチド
アミノ酸687〜1134: HCV NS5A
アミノ酸1135〜1374: TBD
アミノ酸1375〜1384: 末端ペプチド
アミノ酸21: シグナルペプチドD〜Y人工的突然変異
アミノ酸197: NS3mut S〜A遺伝子操作突然変異
アミノ酸520: NS3mut R〜A遺伝子操作突然変異
アミノ酸684: NS3mut P〜G自然突然変異
ヌクレオチド配列では:
ヌクレオチド1〜3: 出発コドン
ヌクレオチド1〜72: gp64シグナルペプチド
ヌクレオチド97〜114: 6XHisエピトープ標識
ヌクレオチド175〜2049: HCV NS3mut
ヌクレオチド2050〜2058: リンカーペプチド
ヌクレオチド2059〜3402: HCV NS5A
ヌクレオチド3403〜3426: リンカーペプチド
ヌクレオチド3427〜4122: TBD
ヌクレオチド4123〜4152: 末端ペプチド
ヌクレオチド4153〜4155: 停止コドン
ヌクレオチド61〜63: シグナルペプチドGAT〜TAT人工的突然変異
ヌクレオチド589: NS3mut TCG〜GCG遺伝子操作突然変異
ヌクレオチド1558〜1559: NS3mut CGG〜GCG遺伝子操作突然変異ヌクレオチド2050〜2052: NS3mut CCA〜GGA自然突然変異
アミノ酸配列では:
アミノ酸1〜24: gp64分泌シグナル
アミノ酸33〜38: 6xHisエピトープ標識
アミノ酸59〜683: HCV NS3
アミノ酸684〜686: リンカーペプチド
アミノ酸687〜1134: HCV NS5A
アミノ酸1135〜1374: TBD
アミノ酸1375〜1384: 末端ペプチド
アミノ酸21: シグナルペプチドD〜Y人工的突然変異
アミノ酸197: NS3mut S〜A遺伝子操作突然変異
アミノ酸520: NS3mut R〜A遺伝子操作突然変異
アミノ酸684: NS3mut P〜G自然突然変異
図11AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号48)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号59)を示す図である。
図12AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−E1−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号49)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号60)を示す図である。
図13AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa E2−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号50)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号61)を示す図である。
図14AおよびBは、それぞれプラスミドpFastBacHTa−E1−E2−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号51)およびそのORFによりコードされるアミノ酸配列(配列番号62)を示す図である。
図15は、異なる3濃度での、未成熟DCへのNS5A Chimigen3タンパク質の結合を示す一連の蛍光フローサイトメトリー(FFC)プロフィールである。
図16は、CD32およびCD206に特異的な抗体による未成熟DCへのNS5A Chimigen3タンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。
図17は、実施例記載の要領で製造された成熟DCによる示された細胞表面抗原マーカーの発現を示す一連の棒グラフである。データは、FFCにより得られたもので、「陽性細胞パーセント(%)」(上のグラフ)および「平均蛍光強度」(「MFI」)(下のグラフ)として示されている。
図18A〜Bは、様々な濃度のT細胞およびNS5A Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCの4日目培養物におけるCD69発現T細胞(図18A)、CD69発現CD8+T細胞(図18B)、およびCD69発現CD4+T細胞(図18C)の比率を示す3セットの棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC1および5AC2:NS5A Chimigen3タンパク質の2種の異なる調製物。
図19A〜Cは、様々な濃度のT細胞およびNS5A Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCの4日目培養物におけるCFSElo T細胞(図19A)、CFSElo CD8+T細胞(図19B)、およびCFSElo CD4+T細胞(図19C)の比率を示す3セットの棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC1および5AC2:NS5A Chimigen3タンパク質の2種の異なる調製物。
図20A〜Cは、様々な濃度のT細胞およびNS5A Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCまたはフィトヘマグルチニン(PHA;図20A中)の7日目培養物におけるCD69発現T細胞(図20A)、CD69発現CD8+T細胞(図20B)、およびCD69発現CD4+T細胞(図20C)の比率を示す3セットの棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC1および5AC2:NS5A Chimigen3タンパク質の2種の異なる調製物。
図21A〜Cは、様々な濃度のT細胞およびNS5A Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCまたはPHA(図21A中)の7日目培養物におけるCFSElo T細胞(図21A)、CFSElo CD8+T細胞(図21B)、およびCFSElo CD4+T細胞(図21C)の比率を示す3セットの棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC1および5AC2:NS5A Chimigen3タンパク質の2種の異なる調製物。
図22は、様々な濃度のT細胞およびNS5A Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCまたはPHAの7日目培養物における芽細胞であるT細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC1および5AC2:NS5A Chimigen3タンパク質の2種の異なる調製物。
図23は、示された細胞表面マーカーの成熟抗原付加DCの発現を示す一連の棒グラフである。データはFFCにより得られた。
図24は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の芽細胞であるT細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データは(FFC)により得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図25は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内インターフェロン−K(IFN−K)含有T細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。PMA:ホルボールミルスチン酸;ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)。
図26は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内IFN−K含有CD8+T細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図27は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内IFN−K含有CD4+T細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図28は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内腫瘍壊死因子−I(TNF−I)含有T細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質;PMA:ホルボールミルスチン酸;DPBS。
図29は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内TNF−I含有CD8+T細胞(左グラフ)およびCD4+T細胞(右グラフ)の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図30は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の顆粒タンパク質GrB(左グラフ)およびPfn(右グラフ)を発現するCD8+T細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図31は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後のリンパ球(R1ゲート細胞)の総数および芽細胞の比率を示す一対の棒グラフである。細胞を最終刺激の6日後に分析した。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図32は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後のCD69発現性CD8+T細胞(左グラフ)およびCD69発現性CD4+T細胞(右グラフ)の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の6日後に細胞を分析した。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図33は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後のEBVペプチド/HLA−A2四量体(陽性対照)または対照四量体(陰性四量体)と結合した抗原特異的T細胞受容体(TCR)を有するCD8+T細胞(左グラフ)およびCD4+T細胞(右グラフ)の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の6日後に3つの各培養ウェルからの細胞(試験および対照群における3本の棒線に対応)を分析した。データはFFCにより得られた。
図34は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激(異なる数のT細胞およびDCを使用)後のNS5Aペプチド/HLA−A2五量体と結合したTCRを有するCD8+T細胞の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の6日後に3つの各培養ウェルからの細胞(試験および対照群における3本の棒線に対応)を分析した。データはFFCにより得られた。5AC: NS5A Chimigen3タンパク質。
図35は、2種の異なる濃度での、未成熟DCへのNS3 Chimigen3タンパク質の結合を示す一連のFFCプロフィールである。
図36は、CD32およびCD206に特異的な抗体による未成熟DCへのNS3 Chimigen3タンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。
図37は、NS3 Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCを含む4日目(上のグラフ)および7日目培養物におけるCD69発現性CD8+T細胞(左グラフ)およびCD69発現性CD4+T細胞(右グラフ)の比率を示す一連の棒グラフである。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図38は、NS3 Chimigen3タンパク質またはテタヌス・トキソイド付加DCを含む4日目(上のグラフ)および7日目培養物におけるCFSElo CD8+T細胞(左グラフ)およびCFSElo CD4+T細胞(右グラフ)の比率を示す一連の棒グラフである。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図39は、実施例においてNS5A Chimigen3タンパク質について記載した要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の芽細胞であるT細胞の比率を示す一対の棒グラフである。2種の異なるT細胞濃度および2種の異なるDC濃度を用いて刺激を行った。データはFCにより得られた。3C:NS3 Chimigen3タンパク質。
図40は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内IFN−K含有T細胞の比率を示す一連の棒グラフである。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図41は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内IFN−K含有CD8+T細胞(左グラフ)およびCD4+T細胞(右グラフ)の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図42は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内TNF−I含有CD8+T細胞(左グラフ)およびCD4+T細胞(右グラフ)の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図43は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の顆粒タンパク質GrB(左グラフ)およびPfn(右グラフ)を発現するCD8+T細胞の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図44は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後のCD69発現性CD8+T細胞(左グラフ)およびCD69発現性CD4+T細胞(右グラフ)の相対比率を示す一対のグラフである。最終刺激の6日後に細胞を分析した。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図45は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後のリンパ球(R1ゲート細胞)の総数(左グラフ)および芽細胞の比率(右グラフ)を示す一対の棒グラフである。細胞を最終刺激の6日後に分析した。データはFFCにより得られた。3C、AS60−1: NS3 Chimigen3タンパク質。
図46は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激(異なる数のT細胞およびDCを使用)後のNS3ペプチド/HLA−A2五量体と結合したTCRを有するCD8+T細胞の相対比率を示す一対の棒グラフである。最終刺激の5日後に3つの各培養ウェルからの細胞(試験群および対照群の両方における3本の棒線に対応)を分析した。データはFFCにより得られた。3C: NS3 Chimigen3タンパク質。
図47は、3種の異なる濃度での、未成熟DCへのHCVコアChimigen3タンパク質の結合を示す一連の蛍光フローサイトメトリー(FFC)プロフィールである。
図48は、CD32およびCD206に特異的な抗体、マンノシル化ウシ血清アルブミン(mBSA)、およびマウスIgGフラグメントによる未成熟DCへのHCV Chimigen3コアタンパク質の結合の阻害を示す一対の棒グラフである。
図49は、実施例記載の要領で製造された成熟抗原付加DCによる3回刺激後の細胞内IFN−K含有CD8+T細胞(左グラフ)およびCD4+T細胞(右グラフ)の比率を示す一対の棒グラフである。データはFFCにより得られた。HCVコア−TBD: HCVコア Chimigen3タンパク質。
図50は、HCVコアChimigen3タンパク質(HCVコア−TBD)(右ドットプロット)またはTBD単独(TBD)(左ドットプロット)を付加したDCによる3回刺激後のHCVコアペプチド/HLA−B7四量体と結合したTCRを有するCD8+T細胞の比率を示す一対の二次元FFCドットプロットである。
A.概観
本明細書では、抗原に対して免疫応答を誘導する組成物および方法を開示している。具体的実施態様では、本化合物および方法が、「自己」抗原として宿主により他で認識される抗原に対して免疫応答を誘導する。免疫応答は、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、すなわち抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を宿主免疫系に提示することにより増強される。標的結合ドメインにより、APCは、内在化し、プロセッシングし、キメラ抗原を提示することにより、体液性および細胞性の両免疫応答を引き起こす。
本明細書では、抗原に対して免疫応答を誘導する組成物および方法を開示している。具体的実施態様では、本化合物および方法が、「自己」抗原として宿主により他で認識される抗原に対して免疫応答を誘導する。免疫応答は、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、すなわち抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を宿主免疫系に提示することにより増強される。標的結合ドメインにより、APCは、内在化し、プロセッシングし、キメラ抗原を提示することにより、体液性および細胞性の両免疫応答を引き起こす。
HCVは、ヒトに感染して急性および慢性肝炎を誘発し得るフラビウイルス科(flaviviridae)の一員であり、肝細胞癌を誘発し得る[Hoofnagle(2002)Hepatology 36:S21−S29]。HCVゲノムは、9.6Kbの非キャップ正極性1本鎖RNA分子であり、複製はマイナス鎖中間体を介して行われる[Lindenbachおよび Rice(2005)Nature436:933−938]。HCVゲノムはポリタンパク質をコード化する単一読み枠をコードし、これがプロセッシングされることによりコアまたはキャプシドタンパク質(C)、2種のエンベロープ糖タンパク質(E1およびE2)、小疎水性タンパク質(p7)、および6種の非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5B)を生じる。個々のタンパク質へのポリタンパク質のプロセッシングは、宿主およびウイルスプロテアーゼにより触媒される[Lohmann et al.(1996)J.Hepatol.24:11−19、Penin et al.(2004)J.Hepatol.24:11−19]。
健康な宿主(ヒトまたは動物)が外来抗原(例えば細菌、ウイルスおよび/または寄生体由来のタンパク質)と遭遇したとき、宿主は通常免疫応答を開始する。適応免疫応答は、体液性、細胞性またはその両方であり得る[Whitton et al.(2004)Adv.Virus Res.63:181−238]。細胞性応答は、抗原を含む細胞を直接排除し得る特異的Tヘルパー細胞およびTリンパ球(CTL)の選択および拡大を特徴とする。体液性応答の場合、抗体はB細胞により産生され、抗原性刺激因子に応答して血液および/またはリンパへ分泌される。抗体は、表面のエピトープと特異的に結合することにより抗原(例、ウイルス)を中和し、それに印を付けて食細胞および/または補体介在機構により破壊させ、感染細胞を溶解する[Carroll(2005)Nature Immunol.5:981−986]。ヘルパー細胞(主としてCD4 T細胞)は、CTL(主としてCD8 T細胞)およびB細胞抗体応答の両方に要求されるヘルパー活性を提供する。
慢性ウイルス感染を伴う個体では、免疫系は入ってくる病原体に対して応答しないため、適応免疫応答を発生して感染を排除することもなく、したがって宿主は病原体に対して寛容となる。HCVが免疫監視をくぐり抜けるのに用いる機構は完全に解明されているわけではないが、幾つかの可能性が示唆されている。これらの可能性には、NS3−4A、E2およびNS5A配列によるI型IFNのIRF3−仲介誘導の遮断、PKR(2本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ)の遮断およびNK細胞の機能をもつHCVタンパク質の干渉がある[Rehermann et al.(2005)Nature Rev.Immunol.5:215−229]。また最近の結果は、HCV感染の制御および根絶におけるT細胞の中枢的役割を示している[Bowen et al.(2005)Nature 436:946−952;Wieland et al.(2005)J.Virol. 79:9369−9380]。急性HCV感染の場合、ウイルス特異的抗体はHCV感染の7〜8週間後に検出されたが[Pawlotsky(1999)J.Hepatol.31(補遺):71−79]、HCV感染がチンパンジーにおいて抗HCV抗体の非存在下でも消散され得[Cooper et al.(1999)Immunity10:439−449]、ヒトではセロコンバージョンが起こらないこと[Post et al.(2004)J.Infect.Dis.189:1846−1855]が示されたため、抗体の役割は明らかではない。さらに、最近の証拠は、HCVに対して検出可能なレベルのCD4+およびCD8+T細胞応答を生じ得ない場合、その個体は慢性感染となることを示唆している[Cooper et al.(1999)前出、Thimme et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:15661−15668;Thimme et al.(2002)J.Exp.Med.194:1395−1406;Shoukry et al.(2003)J.Exp.Med.197:1645−1655]。免疫機能の相互作用、例えばウイルス複製中に生成された2本鎖RNAに対するI型IFN応答および免疫応答における転写変化が起こることは示唆されているが、ウイルス感染の浄化におけるこの効果に関する直接的証拠は観察されなかった[Rehermann et al.(2005)前出]。HCV感染を消散している患者では、免疫系が強いマルチ−エピトープ特異的CD4+およびCD8+T細胞応答を生じることが観察され[Rehermann et al.(2005)前出]、慢性HCV感染患者では、T細胞応答が遅く、一時的であるか、または焦点が狭かった[Thimme et al.(2001)前出、Diepolder et al.(1995)Lancet 36:1006−1007;Lechner et al.(2000)J.Exp.Med.191:1499−1522]。
HCV抗原に対する力強いT細胞応答が欠如すると、慢性的感染に至ることになるが、これはまた、宿主免疫系への適切なウイルス抗原の適正な提示を欠くことに起因し得る。ウイルス排除における成果は、抗原がAPCによりプロセッシングおよび提示される方法および調節Tヘルパー細胞および細胞傷害性リンパ球(CTL)の関与によりもたらされる。
抗原提示プロセスを主として担うのは樹状細胞(DC)であり、この細胞は抗原を捕獲し、プロセッシングする。さらに、DCはリンパ球共刺激分子を発現し、リンパ性器官に移動し、そこでサイトカインを分泌することにより免疫応答を開始させる。DCはまた、免疫性の伝達物質であるBおよびTリンパ球の増殖を制御する[Steinman et al.(1999)Hum.Immunol.60:562−567]。CTL応答の発生は、ウイルス感染細胞の排除、したがって感染の消散にとって不可欠である。
APCは、抗原に遭遇すると、その局在性によって異なる形で抗原をプロセッシングする[Steinman et al.(1999)前出]。外因性抗原は、APCのエンドソーム内でプロセッシングされ、生成されたペプチドフラグメントは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスII分子と複合体を形成した細胞の表面で提示される。CD4+T細胞へのこの複合体の提示により、それらが活性化される。その結果、ヘルパーT細胞により分泌されるサイトカインは、B細胞の活性化に要求される可溶性因子を提供することにより、外因性抗原に対して抗体を産生させる(体液性応答)。
逆に、細胞内抗原はプロテアソームでプロセッシングされ、生じたペプチドフラグメントは、APCの表面でMHCクラスI分子との複合体として提示される。T細胞受容体(TCR)へのこの複合体の結合後、CD8+T細胞への抗原提示が行われ、CTL免疫応答を誘発する。CTLは、感染細胞を殺し、ウイルス複製を阻害すべく作用する、例えばサイトカインインターフェロン−γ(IFN−γ)といった因子の産生によりウイルスを排除し得る。
ウイルスが慢性ウイルス感染を有する個体で活発に複製しているとき、ウイルス抗原は宿主細胞内で産生され、分泌された抗原は循環系に存在する。これらの抗原の存在にもかかわらず、ウイルスに対する有効な免疫応答は欠如している。有効な免疫応答は、高い親和力でウイルスエピトープの広範なアレイを認識し得る、CTLの産生を必然的に伴う。すなわち、ウイルス抗原を含む適切な治療用ワクチンは、ウイルスペプチドをMHCクラスI分子のグルーブで提示させるために適切な細胞区画で内在化およびプロセッシングされなければならない。クラスI提示の状況でウイルスエピトープが認識されると、CD8+T細胞が活性化され、産生され、ウイルス感染に対して有効な応答を開始させることが可能な機能的CTLに分化され得る。
すなわち、ウイルス抗原を含む治療用ワクチンは、それがプロテアソーム経路を通してプロセッシングされ、MHCクラスIを介して提示される場合には有効である[Larsson et al.(2001)Trends Immunol.22:141−148]。これは、抗原を宿主細胞内で産生させることにより、または望ましい細胞性応答を誘導する形で抗原がプロセッシングおよび提示されるように適切な細胞区画へ送達することにより達成され得る。幾つかの方法が、ウイルスベクター[Lorenz et al.(2001)Hum.Gene Ther.10:1095−1103]を含む、抗原の細胞内送達、DNAトランスフェクション細胞の使用[Donnelly at al.(2001)Annu.Rev.Immunol.15:617−648]、および注入されたDNAベクターによる抗原の発現[Lai et al.(1998)Crit.Rev.Immunol.18:449−484]に関する文献で報告されている。
単球から誘導されるDCは、それらのAPC機能性により、一次T細胞応答を刺激する免疫伝達物質として大きな可能性を有することが示されている[Banchereau et al.(1998)Nature 392:245−252]。DCは、抗原を捕獲し、プロセッシングし、有効に提示するという独特な特性を有することから、治療用ワクチン開発にとって非常に重要な道具となっている[Laupeze et al.(1999)Hum Immunol.60:591−597]。DCへの抗原のターゲッティングは、非常に重大な段階であり、モノクローナル抗体(mAb)のFc領域に特異的なDC上の幾つかの受容体の存在がこの目的のために利用されている[Regnault et al.(1999)J.Exp.Med.189:371−380]。この方法の例には、卵巣癌mAb−B43.13[Berlyn et al.(2001)Clin Immunol.101:276−283]、抗PSA mAb、および抗HBV抗体抗原複合体[Wen et al.(1999)Int.Rev.Immunol.18:251−258]がある。腫瘍関連抗原を付加したDCを用いる癌免疫療法は、腫瘍特異的免疫応答および抗腫瘍活性を生じることが示されている[Campton et al.(2000)J.Invest.Dermatol.115:57−61;Fong et al.(2000)Annu.Rev.Immunol. 18:245−273]。腫瘍抗原パルスDCを用いるインビボ臨床試験では有望な結果が得られた[Tarte et al.(1999)Leukemia 13:653−663]。これらの試験結果は、癌抗原に対して免疫応答を発生させるためのDC使用の効力を明らかに立証している。治療用ワクチンは、宿主免疫系が寛容であるウイルス抗原に対して免疫応答を誘発できるものでなくてはならない。これは、DCへの抗原の送達、適切な抗原提示およびHCV特異的CD8+T細胞のプライミングを必然的に含むもので、慢性保菌者において治療効果をもたらし得る。
本発明のキメラ抗原ワクチンは、選択された抗原および抗体の特異的領域の融合タンパク質として製造される新規種類の組換え「キメラ抗原」である。分子の二機能性設計は、APC、特にDCへウイルス抗原をターゲッティングすることにより、選択された抗原に対して体液性および細胞性免疫応答の両方を誘導するように調整されている。HCV Chimigen(商標)ワクチンの二量体形態は、図1で概略的に示されている。
ワクチンは、組換えHCVウイルス抗原を含む免疫応答ドメイン(IRD)、およびモノクローナル抗体のFcフラグメントを含む標的結合ドメイン(TBD)という、2つのドメインを有する。ワクチンの設計は、その機能に幾つかの独特な特性を分与している。キメラ的デザインは、特異的受容体を通じてその取り込みを促進する抗体様構造の形成に有利であり、適切な抗原提示を誘導する。それは、プロテアソーム経路を通してプロセッシングされ、ペプチドがMHCクラスIとの複合体として提示されることにより、CTL応答を誘導し得る。Chimigen(商標)ワクチンはまた、エンドソーム経路を介してプロセッシングされ、MHCクラスIIにより提示されることによって、体液性応答を生じさせ得る。
TBDは、特異的APC受容体、例えばFcγ受容体へのChimigen(商標)ワクチンの結合を仲介する。本発明は特定の作用機構により限定されるわけではないが、APC(例、未成熟DC)上のFcγ受容体への分子の結合により、MHCクラスI経路を通じて抗原のプロセッシングが誘発されると思われる。具体的実施態様では、異種TBD、組換え抗原、抗原のアミノおよびカルボキシ末端に組み込まれた様々な長さのリンカーペプチドにより、分子全体が「外来」のものとなるため、HCV抗原を含む融合タンパク質に対して宿主免疫系からエピトープ性免疫応答を引き出すことが可能となる。融合タンパク質 Chimigen3タンパク質はまた、非哺乳類細胞(例、酵母または昆虫細胞)でも製造され得、その場合、それらは非哺乳類的な形でグリコシル化されることにより、哺乳類(例、ヒト)宿主においてもそれらの免疫原性を高める。また、昆虫細胞で導入されたマンノース/少(pauci)マンノースグリコシル化により、ワクチンはAPC上のマンノース受容体により取り込まれ得る。
したがって、Chimigen(商標)ワクチンは、特異的Fcγ受容体I、IIおよびIII(CD64、CD32、CD16)、マンノース受容体(CD206)、他のC型レクチン受容体を通じてAPCにより、また食作用により内在化され得る[Geijtenbeek et al.(2004)Annu.Rev.Immunol. 22:33−54]。特異的受容体を介した取り込み、エンドソームおよびプロテアソーム経路によるプロセッシング、および両クラスのMHC分子での提示の結果、ウイルス感染を阻止またはウイルス感染細胞を排除し得る広範な免疫応答が誘発され得る。CTL応答の発生は、ウイルス感染細胞を浄化するのに不可欠である[Whitton et al.(2004)Adv.Virus Res. 63:181−238]。慢性HBV感染処置用のHepaVaxx B、ViRexx の最初のChimigen(商標)治療用ワクチンは、前臨床試験で非常に有望な結果を示した[George et al.(2003)A novel class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic viral infections :evaluation in ducks chronically infected with duck hepatitis B virus (DHBV)(慢性ウイルス感染を処置するための新規種類の治療用ワクチン:カモB型肝炎ウイルス(DHBV)に慢性感染したカモにおける評価)、Hepdart 2003、Frontiers in Drug Development for Viral Hepatitis :12月14〜18日、カウアイ、ハワイ、米国;George et al.(2003)慢性ウイルス感染を処置するための新規種類の治療用ワクチン、B型肝炎ウイルスの分子生物学の国際会議(A novel class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic viral infections、International Meeting of the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses)、9月7〜10日、ツェントロ・コングレッシ・ジョバンニ XXIII、ベルガモ、イタリア国;George et al.(2004)慢性B型肝炎感染を処置するための新規キメラ治療用ワクチンの免疫学的評価(Immunological Evaluation of a Novel Chimeric Therapeutic Vaccine for the Treatment of Chronic Hepatitis B Infections)(2004)B型肝炎ウイルスの分子生物学の国際会議(International Meetingu of the Molecular B Viruses)、ウッズ・ホール、マサチューセッツ、米国、2004年10月24〜27日;George et al.(2005)BioProcessing Journal 4:39−45;George et al.(2006)A new class of therapeutic vaccines for the treatment of chronic hepatitis B infections、Framing the Knowledge of Viral Hepatitis、Schinazi,R.F.編集者、IHLプレス、米国]。
B.定義
本願で使用している用語は、(特に断らなければ)以下の定義により示される意味を有する。
本願で使用している用語は、(特に断らなければ)以下の定義により示される意味を有する。
「抗体」は、Bリンパ系細胞により産生される免疫グロブリン分子をいう。これらの分子は、抗原と特異的に結合する能力を有することを特徴とするもので、それぞれ互いに関連付けて定義されている。
「抗体応答」または「体液性応答」は、抗原性刺激因子に応答して抗体がBリンパ球により産生され、血液および/またはリンパ系へ分泌される免疫応答の一タイプをいう。適正に機能している免疫応答では、抗体が細胞表面上の抗原と特異的に結合することにより、細胞に印を付け、食細胞、抗体依存的細胞傷害性(ADCC)エフェクター細胞、および/または補体介在機構により破壊させる。抗体はまた、全身的に循環し、遊離ビリオンに結合し得る。この抗体結合は、ビリオンを中和し、それが細胞に感染するのを阻止し、ビリオンに印を付けて食作用または腎臓での濾過により宿主から排出させ得る(排出するのを阻止し得る?)。
「抗原」は、適切な細胞との接触に至った結果、感受性および/または免疫応答性を示す状態を誘導し、インビボまたはインビトロで感作された対象の抗体および/または免疫細胞と立証可能な方法で反応する物質を包含する。すなわち、抗原は、例えば細胞またはウイルス粒子および/またはそれらの成分の各々を包含し得る。ウイルスの場合、成分は、具体的にはウイルスタンパク質を含む。
「抗原提示細胞」(「APC」)は、主として抗原を内在化させ、抗原をプロセッシングし、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはII 分子の領域で抗原性エピトープをリンパ球に提示することにより機能する抗原誘導事象の副存細胞をいう。APCと抗原の相互作用によりリンパ球は抗原性分子と遭遇し、それを認識し得ることから、この作用は免疫誘導における本質的段階である。APCの例としては、マクロファージ、単球、ランゲルハンス細胞、指状嵌入樹状細胞、濾胞樹状細胞およびB細胞がある。
「B細胞」は、抗原と相互作用する免疫グロブリン(抗体)を産生するリンパ球の一タイプをいう。
「CH1領域」、「CH2領域」、「CH3領域」は、各々抗体の重鎖定常ドメインの異なる領域を指す。
「細胞性応答」または「細胞性宿主応答」は、ウイルス感染または癌細胞を直接的または間接的に排除する能力がある特異的ヘルパーおよびキラーT細胞により伝達される免疫応答の一タイプをいう。
本明細書で使用されている「キメラ抗原」の語は、免疫応答ドメイン(IRD)および標的結合ドメイン(TBD)を含むポリペプチドをいう。免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインは、共有結合または非共有結合により直接的または間接的に結合され得る。
「複合体」または「抗原抗体複合体」は、抗体および抗原間の反応の生成物をいう。多価抗原により形成された複合体は、水系に不溶性である傾向を示す。
「細胞傷害性Tリンパ球」は、ウイルス抗原を産生する感染源により感染した外来細胞および宿主細胞を破壊する能力があるリンパ球の一特化タイプである。
「エピトープ」は、複合抗原分子上の抗原性決定基の最も単純な形態をいう。これは、抗体またはT細胞受容体により認識される抗原の特異的部分である。
「フラグメント」は、非統一体(disunified entity)の一部分をいう。本発明の場合、この語は対応物の一部としてその部分を指すのにも用いられ得る。したがって、Fcフラグメントを含む融合タンパク質は、天然フラグメントと同じペプチド配列を含む組換え分子を指し得る。
「融合タンパク質」は、2つまたはそれ以上のコーディング配列を組み合わせることにより作られたハイブリッド遺伝子の発現により形成されたタンパク質をいう。
「ヒンジ領域」は、FabフラグメントをFcフラグメントに連結する抗体の部分をいう。ヒンジ領域は、2本の重鎖を共有結合で連結することにより二量体分子を形成するジスルフィド結合を含む。
「相同体」の語は、別の分子について、例えば、対応する位置で同一または類似している化学的残基の配列を有することにより、その分子との相同性を呈する分子をいう。「%相同である」または「%相同性」の語は、同一または類似している相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同一位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセントをいう。例えば、2種のタンパク質における80残基のうち75が同一である場合、2種のタンパク質は93.75%相同である。相同性パーセントは、当業者には周知の様々なソフトウェアプログラムを用いて決定され得る。
「宿主」は、例えばキメラ抗原が投与され得る温血動物をいう。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対合をいう。本発明では、対合の好ましい機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基(核酸塩基)間における、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を含む。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な環境下で行われ得る。ポリヌクレオチドに関連して使用されている、「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズしている」、「ハイブリダイズする」などの語は、慣用的ハイブリダイゼーション条件、好ましくは例えば50%ホルムアミド/6XSSC/0.1%SDS/100μg/mLのmDNAで、ハイブリダイゼーション温度が37℃より高く、0.1XSSC/0.1%SDSでの洗浄温度が55℃を超える場合のハイブリダイゼーションをいうものとする。
「免疫性」または「免疫応答」は、抗原に対する身体の応答をいう。具体的態様では、この語は感染疾患に対して抵抗するかまたは自身を防御する能力をいう。
「免疫応答ドメイン(IRD)」は、キメラ分子の多様な配列の抗原性部分をいう。IRDは、1個またはそれ以上の抗原または1個またはそれ以上の組換え抗原を含む。好ましいウイルス性抗原には、HCVコア、HCV E1−E2、HCV E1、HCV E2、HCV P7、HCV NS3−セリンプロテアーゼ、HCV NS4A、HCV NS4B、およびHCV NS5Aがあるが、これらに限定はされない。
本明細書で使用されている「免疫治療可能な状態」の語は、対象における免疫応答を誘発または調節することにより防止、阻害または軽減され得る状態または病気をいう。
「リンパ球」は、特異的免疫応答を伝達する、例えば血液から見出される有核細胞のサブセットをいう。
「モノクローナル抗体」または「mAb」は、融合ハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマ細胞のクローンまたは遺伝的均一集団から産生される抗体をいう。ハイブリッド細胞をクローン化することにより、化学的または免疫学的に均一である、すなわち唯一のタイプの抗原を認識する特異的モノクローナル抗体を産生するセルラインを確立する。
本明細書で使用されている「機能し得るように結合された」とは、発現制御配列が、興味の対象であるコーディング配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物へ組み込まれていることをいう。
「ペプチド結合(linkage)」または「ペプチド結合(bond)」は、2種またはそれ以上のアミノ酸間における共有結合的化学結合をいう。これは、一アミノ酸のα−アミノ基および別のアミノ酸のα−カルボキシル基間の置換アミド結合である。
「医薬用賦形剤」は、アジュバント、担体、pH調整および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤、保存剤などの物質を包含する。
「医薬上許容される」とは、ヒトまたは他の動物と生理学的に適合し得る非毒性組成物を指す。
本明細書で使用されている「ポリヌクレオチド」の語は、あらゆる長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのポリマー形態をいう。この語は、分子の一次構造のみを指す。すなわち、この語は、2本および1本鎖DNAおよびRNAを包含する。また、この語は、公知タイプの修飾形態、例えば、当業界で公知の標識、メチル化、「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドの1個またはそれ以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合(例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)および荷電結合(例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)によるもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリL−リシンなどを含む)を含むもの、インターカレーター(例、アクリジン、プソラレンなど)を伴うもの、キレート剤(例、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合(例、アルファアノマー核酸など)によるもの、およびポリヌクレオチドの非修飾形態を包含する。
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用されており、長さまたは翻訳後修飾とは関係なく、アミノ酸のペプチド結合鎖を意味する。
本明細書で使用されている「予防」とは、疾患の症状を完全に防止するか、疾患の症状の開始を遅らせるか、または後続的に発現した病状の重症度を軽減することをいう。
疾患の「防止」は、疾患の症状が本質的に存在しないことを意味する。
「プロテアーゼ開裂部位」とは、タンパク質分解酵素が、ポリペプチド鎖におけるアミノ酸間のペプチド結合の加水分解(切断)を触媒する部位をいう。
本発明では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」の語は、本発明化合物が、その標的配列と、ただし他の配列については最小限の数でハイブリダイズする条件を指す。
「対象」の語は、温血動物、好ましくはヒトを指す。
「標識」とは、標識を含む分子を単離または精製するのに使用されるマーカーまたはマーカー配列をいう。標識の例には、6xHis(すなわち、6ヒスチジンの配列)標識がある。
「T細胞」は、抗原に対して抗原特異的応答を開始させ得、体液性および細胞性免疫応答においてある一定の役割を演じるリンパ球の一タイプをいう。
「標的結合ドメイン(TBD)」は、免疫グロブリン重鎖定常域の全部または一部をいう(例、CH1(全部または一部)−CH2−CH3)。
「治療有効量」の語は、抗原に対して有効なB細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)および/またはヘルパーTリンパ球(Th)応答を誘発し、疾患または障害の症状および/または合併症を遮断するか、またはそれらを治癒または少なくとも部分的に停止または遅延させるのに十分な薬剤(例、キメラ抗原またはキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド)の量をいう。T細胞のサブセットは、B細胞の活性化を促して抗体を分泌させるかまたは別のT細胞サブセットがエフェクター細胞傷害性Tリンパ球(CTL)になるように促すサイトカインを分泌することによりTヘルパー細胞として機能する。
本明細書で使用されている「処置する」および「処置」の語は、動物、特にヒトにおけるキメラ抗原により処置可能な状態の処置を包含するもので、(i)上記状態に罹患し得るが、まだその診断は下されていない対象においてその状態が起こるのを防止するか、(ii)上記状態を阻害する、例えばその発症を停止または進行を遅らせるか、または(iii)その状態を軽減する、例えば上記状態またはその症状の退縮を誘発することを含む。
本明細書で使用されている「治療用」である薬剤は、疾患の症状の完全な排除または疾患の症状の重症度の低下を誘発する薬剤をいう。
「異種の(xenotypic)」とは、宿主以外の種に起源を有することをいう。例えば、マウスゲノムからクローン化された組換え発現抗体は、組換え発現抗体が細菌、昆虫、ヒトまたはマウス細胞のいずれで産生されたものであろうと、ヒトにとっては異種であるが、マウスにとっては異種ではない。すなわち、本発明のキメラ抗原の場合、異種TBD(例、異種抗体分子または異種抗体フラグメント)とは、キメラ抗原が関わるもの以外の種に由来するTBDである。
C.キメラ抗原
本発明組成物は、免疫応答ドメイン(IRD)および標的結合ドメイン(TBD)を含むキメラ抗原を含む。本発明の好ましい実施態様では、IRD部分は、体液性および/またはT細胞応答を誘導する能力をもち、標的結合ドメインは、APC、例えば樹状細胞と結合する能力をもつ。本発明のキメラ抗原はまた、以下のものの一つまたはそれ以上を含み得る:免疫グロブリンのヒンジ領域(またはそのセグメント)、免疫グロブリンのCH1領域(またはそのセグメント)、ペプチドリンカー、プロテアーゼ開裂部位、および精製プロトコルでの使用に適切な標識。本発明のキメラ抗原は、APCに結合し、それを活性化する能力をもつ。必ずというわけではないが、一般的に、IRDはTBDのN−末端である。
本発明組成物は、免疫応答ドメイン(IRD)および標的結合ドメイン(TBD)を含むキメラ抗原を含む。本発明の好ましい実施態様では、IRD部分は、体液性および/またはT細胞応答を誘導する能力をもち、標的結合ドメインは、APC、例えば樹状細胞と結合する能力をもつ。本発明のキメラ抗原はまた、以下のものの一つまたはそれ以上を含み得る:免疫グロブリンのヒンジ領域(またはそのセグメント)、免疫グロブリンのCH1領域(またはそのセグメント)、ペプチドリンカー、プロテアーゼ開裂部位、および精製プロトコルでの使用に適切な標識。本発明のキメラ抗原は、APCに結合し、それを活性化する能力をもつ。必ずというわけではないが、一般的に、IRDはTBDのN−末端である。
本発明の具体的実施態様では、キメラ抗原のIRDは、1種またはそれ以上のHCVタンパク質、例えば上記のものまたは1種またはそれ以上の組換えHCVタンパク質から成る群から選択される1種またはそれ以上(例、2、3、4、5、6、7、8、9または10種)のタンパク質(抗原)を含む。上記タンパク質間には、所望によりリンカー、例えば本明細書で開示されているリンカーのいずれかが存在し得る。本発明のキメラ抗原では、完全長抗原ではなく、これらの抗原の免疫原性フラグメントが使用され得る。複数の抗原がキメラ抗原に存在する場合、完全長のみ、免疫原性フラグメントのみ、または完全長抗原および完全長タンパク質の混合物が使用され得る。
本発明のキメラ抗原は単量体であり得るか(すなわち、それらはIRDおよびTBDを含む単一単位を含む)、またはそれらは多量体であり得る(すなわち、それらは、各々IRDおよびTBDを含む多数の単位を含み得る)。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体であり得る。上記多量体では、個々の単位は同一または異なり得るか、または同一のものもあれば、異なるものもあり得る。図1は二量体キメラ抗原を描いている。
本発明のさらに別の実施態様では、キメラ抗原のIRDは、1種またはそれ以上のHCVタンパク質、または1種またはそれ以上の組換えHCVタンパク質に融合された6xHis−ペプチドを含む。
本発明の具体的実施態様では、キメラ抗原のTBDは、抗体フラグメントであり得る。TBDは、適切なキメラ抗原が投与される宿主(対象)と同じ種に由来したものであり得る。他方、本発明の好ましい実施態様では、キメラ抗原のTBDは、宿主にとって異種の抗体フラグメントである。例えば、宿主がヒトである場合、具体例としての異種抗体フラグメントは、ヒト以外の動物の抗体フラグメント、例えばマウス抗体フラグメントである。本発明のある種の実施態様では、異種抗体フラグメントは、マウスFcフラグメントを含む。本発明の最も好ましい実施態様では、TBDは、異種Fcフラグメント(またはそのフラグメント)、ヒンジ領域(またはそのセグメント)、CH1領域(またはそのセグメント)、およびIRDへ標的結合ドメインを連結するのに適切なペプチド結合を含む。
本発明はまた、TBDへIRDを連結する結合性分子の使用を含む。具体例としてのリンカー分子は、ロイシンジッパー、およびビオチン/アビジンを含む。(例えば融合タンパク質において)使用され得る他のリンカーは、ペプチド配列である。上記ペプチドリンカーは、一般的に約2〜約40のアミノ酸(例、約4〜10アミノ酸)長である。ペプチドリンカーの一例は、アミノ酸配列SRPQGGGS(配列番号1)を含む。他のリンカーは当業界では公知であり、一般的にグリシンおよび/またはアラニンに富むことにより、それらが連結する領域間に可撓性がもたらされている。一般的に、本発明のキメラ抗原の場合、IRDおよびTBDは、TBDの抗原結合部分(例、抗体分子または抗体分子のフラグメント)およびIRD上の適切な抗原性エピトープ間における物理的抗原抗体相互作用により連結されているわけではない。
一具体例において、本発明のキメラ抗原は、2つの部分、すなわち抗原性配列(例えばウイルス性抗原(複数も可))を含むIRD、および異種Fcフラグメントを含むTBDを有する融合タンパク質である。異種マウスFcフラグメントは、APC、具体的には樹状細胞上の特異的受容体に結合する。すなわち、キメラ抗原の結合領域は、抗原提示細胞を特異的にターゲッティングする。次いで、APCの内部機構はキメラ抗原をプロセッシングし、MHCクラスIおよびクラスII分子上に特異的ペプチドを提示することにより、T細胞と接触させてそれを活性化し、体液性および細胞性免疫応答を発生させることにより、感染細胞またはこれに適した他の望ましくない細胞、例えば癌細胞を除去する。
さらなる実施態様では、キメラ抗原は、2部分、すなわち一修飾ウイルス性抗原または複数の同抗原、抗原性タンパク質フラグメントまたはペプチド、または特異的部位にグリコシル化を伴うこれらのいずれか、および同じくグリコシル化され得る異種マウスFcフラグメントを有する融合タンパク質であり得る。
さらに別の実施態様において、本発明は、さらなる修飾キメラ抗原であって、抗原(IRD)がビオチニル化され、TBD(例、Fcフラグメント)が、例えば融合タンパク質でアビジン(例、ストレプトアビジン)とコンジュゲートされているキメラ抗原を提供する。かかるアビジン−コンジュゲートTBDにより、IRD−TBDコンジュゲートの広範な寄せ集めの生成が促進される。当然、IRDはアビジンとコンジュゲートされ得(例、融合タンパク質形態で)、TBD(例、Fcフラグメント)はビオチニル化され得るものとする。
さらに別の実施態様において、本発明は、化学的コンジュゲーションを介したIRD(抗原)およびTBD(例、抗体Fcフラグメント)間の会合をもたらす。
本発明の一実施態様は、分子生物学的技術により抗体フラグメントに融合されたHCVの組換え抗原の使用、バキュロウイルス発現系における融合タンパク質の製造、および慢性HCV感染に対する治療用ワクチンとしてのそれらの使用を含む。本発明では、インビボにおけるAPCへのHCV抗原の有効な送達方法を提供することにより、広範な免疫応答、CTLを含むTh1応答およびTh2(抗体)応答を発生させる。予め選択されたウイルス性抗原(例、宿主免疫系により認識されないもの)の免疫原性は、異種抗体フラグメントの存在により、また昆虫細胞発現系で導入された特異的グリコシル化の存在により増強され得る。抗原−抗体フラグメント融合タンパク質は、抗体成分が存在することから、樹状細胞、マクロファージ、単球、B細胞および顆粒球を含む免疫系の様々な細胞(例、APC)上に存在する特異的受容体に結合する。ヒトまたは動物に投与された融合タンパク質は、APC、特にDCにより内在化され、小ペプチドに加水分解され、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスII分子との複合体として細胞表面上で、適切な特異性をもつ抗原特異的T細胞受容体(TCR)を有するT細胞に提示される。この方法で、キメラ抗原(融合タンパク質)は、広範な免疫応答を誘導し、ウイルス感染を除去し得る。
本明細書で使用されている「標的結合ドメイン(TBD)」の語は、APC上のFc受容体に結合し得る抗体フラグメントである、免疫グロブリン重鎖定常域の全部または一部をいう。本発明によると、TBDは、APC、特に樹状細胞上のFc受容体に結合し得るタンパク質であり、それに続いて受容体を介した取込みによりAPCへ輸送される。本発明によると、Fcフラグメントの存在により、APC、特にDC上のFc受容体を通じたキメラ抗原の取込みは増加する。特異的取込みにより、ウイルス性抗原は外来のものとしてプロセッシングおよび提示される。すなわち、それだけでは宿主が寛容を起こすか、または宿主で誘導する免疫応答が非常に弱いものであったウイルス性抗原に対して免疫応答が効果的に誘導される。
また、本発明によると、キメラ抗原は、好ましくは、マクロファージマンノース受容体/C型レクチン受容体に結合する能力を有する。マクロファージマンノース受容体(MMR)はまた、CD206としても知られ、APC、例えばDC上で発現される。この分子は、エンドサイトーシス受容体のC型レクチンファミリーの一員である。マンノシル化キメラ抗原は、CD206により結合および内在化され得る。一般に、外因性抗原は、主としてMHCクラスII経路を通じてプロセッシングおよび提示されると考えられる。しかしながら、CD206を通したターゲッティングの場合、MHCクラスIおよびクラスIIの両経路が関与しているという証拠がある[Apostolopoulos et al.(2000)Eur.J.Immunol.30:1714;Apostolopoulos et al.(2001)Curr.Mol.Med.1:469;Ramakrishna et al.(2004)J.Immunol.172:2845−2852]。すなわち、CD206を特異的にターゲッティングするキメラ抗原をローディングした単球由来の樹状細胞は、強力なクラスI−依存的CD8+CTL応答およびクラスII−依存的増殖性Tヘルパー応答の両方を誘導する[Ramakrishna et al.(2004)J.Immunol.172:2845−52]。
典型的TBDは、pFastBac HTa 発現ベクターでクローン化されたマウス抗HBVsAg mAb(ハイブリドーマ2C12)から誘導され、昆虫細胞発現系(Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア、米国)で発現される。このTBDは、CH1の部分(アミノ酸配列VDKKI;配列番号2を有する)、およびマウス抗HBV sAg mAbのN−末端からC−末端のヒンジ−CH2−CH3により構成される。本発明の実施にあたり、IgG1分子の定常域は、リンカーペプチド、CH1−ヒンジの部分および領域CH2およびCH3を含み得る。モノマーTBDのヒンジ領域部分は、第2TBD分子とのジスルフィド結合を形成し得る。このタンパク質は、6xHis標識、7アミノ酸rTEV(組換えタバコエッチウイルス)プロテアーゼ開裂部位およびHBV sAg(ハイブリドーマ2C12)に対して産生した異種(マウス)mAbの標的結合ドメイン(TBD)のN−末端融合を伴うタンパク質として発現され得る。典型的TBDは、8アミノ酸ペプチドリンカー、CH1領域の5アミノ酸を含むアミノ酸の配列、ヒンジ配列、CH2およびCH3領域配列および、所望により発現ベクターから誘導されたヌクレオチドによりコードされた10追加アミノ酸のC−末端ペプチドを伴う2C12からのIgG1 mAbの定常鎖のフラグメントである。本明細書で定義されている典型的TBDフラグメントは、HCVウイルスに由来する抗原との融合タンパク質の生成に関する親分子を形成する。
D.新規ポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、本明細書に開示されているキメラ抗原の全てをコード化するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、免疫応答ドメインをコード化する第1ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメインをコード化する第2ポリヌクレオチド部分を含む。第1および第2ポリヌクレオチド部分は、同一または異なるヌクレオチド鎖上に配列され得る。
本発明の別の態様は、本明細書に開示されているキメラ抗原の全てをコード化するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、免疫応答ドメインをコード化する第1ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメインをコード化する第2ポリヌクレオチド部分を含む。第1および第2ポリヌクレオチド部分は、同一または異なるヌクレオチド鎖上に配列され得る。
本発明のキメラ抗原の上記領域に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、一般的に、キメラ抗原を産生する細胞(例、酵母または昆虫細胞)からのその分泌を促すリーダーペプチドをコード化するリーダー配列を含む。関連のあるリーダー配列は、一般的に細胞からの分泌前にキメラ抗原から開裂される。リーダー配列は、本明細書に開示されているものおよび当業界で公知の他のもののいずれか、例えば、昆虫細胞での発現に有用なヌクレオチド配列ATGCCCTTGTACAAATTGTTAAACGTTTTGTGGTTGGTCGCCGTTTCTAACGCGATT(配列番号38)によりコード化されるアミノ酸配列MPLYKLLNVLWLVAVSNAI(配列番号37)を有するAcNPVキチナーゼシグナル配列および酵母細胞(例、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母細胞)での発現に有用なアルファ交配因子リーダーであり得る、
本発明は、キメラ抗原変異型タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む、好ましくは単離形態である、キメラ抗原をコード化する遺伝子、mRNA、および/またはコーディング配列に対応するかまたは相補的であるDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、および関連分子、ポリヌクレオチド、キメラ抗原をコード化する遺伝子またはmRNA配列またはその一部と相補的であるか、または少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、およびキメラ抗原をコード化する遺伝子、mRNA、またはキメラ抗原エンコーディングポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、本明細書で具体的に開示されているキメラ抗原をコード化する遺伝子の類似体を包含する。類似体は、例えば、免疫応答誘発能力を保持し、好ましくは配列番号39および41〜51に示された配列により具体的に記載されている、キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドのいずれかと少なくとも80%、さらに好ましくは90%、および最も好ましくは95%の相同性を有する突然変異体を包含する。典型的には、上記類似体は、1〜10個のコドン変化のみが異なる。例としては、ウイルス性抗原または抗体フラグメントの天然アミノ酸配列からの小さなアミノ酸変異、特に同類アミノ酸置換を伴うポリペプチドがある。同類置換は、側鎖が同類であるアミノ酸の一ファミリー内で行われるものである。遺伝子コード化アミノ酸は、一般的に4つのファミリー:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン、(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および(4)非荷電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として合わせて分類されることもある。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンにより、アスパラギン酸をグルタミン酸により、トレオニンをセリンにより単発的に置換するか、またはアミノ酸を構造的に関連したアミノ酸により類似同類置換しても、生物活性に大した影響を及ぼすことはないと予測することは妥当である。本明細書に開示されているポリペプチドのいずれかと実質的に同じ配列を有するが、キメラ抗原の免疫応答誘発能力に実質的に影響することのない小さなアミノ酸置換を有するポリペプチド分子は、キメラ抗原の定義の範囲内に含まれる。誘導体は、他のキメラ抗原分子との集合性コンジュゲートおよび非関連化学的部分との共有結合コンジュゲートを包含する。共有結合誘導体は、当業界で公知の手段によりキメラ抗原アミノ酸鎖またはN−またはC−末端残基で見出される基への官能基の結合により製造される。
同類アミノ酸置換は、タンパク質の立体配座または機能を改変することなくタンパク質中で行われ得る。本発明の、または本発明に有用なタンパク質は、15個未満(例、未満:14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個)の同類置換(複数も可)を含み得る。上記変化には、イソロイシン(I)、バリン(V)、およびロイシン(L)のいずれかをこれらの疎水性アミノ酸の他のいずれかの代わりに用いるか、グルタミン酸(E)の代わりにアスパラギン酸およびその逆、アスパラギン(N)の代わりにグルタミン(Q)およびその逆、およびトレオニン(T)の代わりにセリン(S)およびその逆といった置換がある。また、他の置換も、タンパク質の三次元構造における特定アミノ酸の環境およびその役割によって、同類であるとみなされ得る。例えば、グリシン(G)およびアラニン(A)は、アラニン(A)およびバリン(V)の場合と同様、交換可能であり得る場合が多い。比較的疎水性であるメチオニン(M)は、ロイシンおよびイソロイシンと置き換えられ得ることが多く、バリンと置き換えられる場合もある。リシン(K)およびアルギニン(R)は、アミノ酸残基の顕著な特徴がその電荷であり、これら2種のアミノ酸残基のpKの相違が著しくはない状況では置換可能であることが多い。さらに他の変化も特定の環境では「同類」であるとみなされ得る[例、Biochemistry 第4版、Lubert Stryer編(W.H.Freeman and Co.)、18〜23頁;Henikoff et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:10915−10919;Lei et al.(1995)J.Biol.Chem.270:11882−11885参照]。
追加的類似体ポリヌクレオチドは、例えば、適切なキメラ抗原の溶解度を増加させる役割を果たすTBDのいずれかおよび/またはIRDのいずれかにおける1個またはそれ以上(例、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15または20個)の付加または欠失を伴うものを含む。付加または欠失は、ポリヌクレオチドによりコード化されるキメラ抗原における1個またはそれ以上(例、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれ以上)のアミノ酸(およびポリヌクレオチド自体における相当数のヌクレオチド)によるものであり得る。
本発明はまた、キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で配列番号39および41〜51に示された配列の一つまたはそれ以上とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者により容易に決定され得るもので、一般的にはプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に左右される経験的な計算である。一般に、プローブが長いとき、適正なアニーリングに要求される温度も高くなり、プローブが短いとき、低温を必要とする。相補鎖がそれらの融解温度より低い環境に存在するとき、ハイブリダイゼーションは、一般的に変性した核酸配列が再アニーリングする能力に左右される。プローブおよびハイブリダイゼーション可能な配列間の所望の相同性の度合が高いとき、使用され得る相対温度も高くなる。その結果として、相対温度が高いと、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーも高くなり、温度が低いと同ストリンジェンシーも低くなる傾向が示される。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、例えばAusubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience Publishers(著作権1995、2004年4月増補、補遺66)2.9.1−2.10.8および4.9.1−4.9.13参照。
本明細書で定義されている「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、必ずしも限定されるわけではないが、(1)低イオン強度および高い洗浄温度、例えば0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウム、50℃を使用するもの;(2)ハイブリダイゼーション中、変性剤、例えばホルムアミド、例えば0.1%ウシ血清アルブミンを含む50%(v/v)ホルムアミド/0.1%Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5、750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム含有、42℃を使用するもの、または(3)42℃で50%ホルムアミド、5XSSC(0.75MのNaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5Xデンハート溶液、音波処理したサケ精液DNA(50μg/mL)、0.1%SDS、および10%硫酸デキストラン、42℃で0.2XSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)、および55℃の50%ホルムアミド中での洗浄、次いで55℃でEDTA含有0.1XSSCから成る高ストリンジェンシー洗浄液を使用するものをいう。「緩和なストリンジェント条件」は、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、ニューヨーク:Cold Spring Harbor Press(1989)に記載されているが、これに限定されるわけではなく、上記条件よりストリンジェンシーの低い洗浄液およびハイブリダイゼーション条件(例、温度、イオン強度およびSDSの%)の使用も包含する。緩和なストリンジェント条件の一例は、20%ホルムアミド、5XSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5Xデンハート溶液、10%硫酸デキストラン、および20mg/mL変性せん断サケ精液DNAを含む溶液中37℃での一晩インキュベーション、次いで約37〜50℃で1XSSC中でのフィルター洗浄である。当業者であれば、例えばプローブ長などの因子を適応させるため必要に応じて温度、イオン強度などを調節する方法を認識しているはずである。
本発明ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号40および52〜62で示される配列のいずれかから選択される配列を有するキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド、配列番号39および41〜51に示された配列のいずれかから選択されるキメラ抗原のヌクレオチド配列であって、TヌクレオチドがUヌクレオチドにより置換されたものを含む。例えば、キメラ抗原ヌクレオチドの具体例は、制限するわけではないが、以下のものを含む:
(a)配列番号39および41〜51に示された配列(ただし、TはUでもあり得る)のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれにより構成されるポリヌクレオチド;
(b)配列が配列番号39および41〜51に示された配列のいずれかから選択される配列と少なくとも80%相同性であるポリヌクレオチド;
(c)配列が、本明細書で開示されているプラスミドのいずれかに含まれるDNAによりコード化されるキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド;
(d)配列が配列番号40および52〜62に示された配列のいずれかから選択される配列であるキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド;
(e)配列が配列番号40および52〜62に示された配列のいずれかから選択される全アミノ酸配列と少なくとも90%同一であるキメラ抗原関連タンパク質をコード化するポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか一つのポリヌクレオチドと完全に相補的であるポリヌクレオチド;
(g)(a)〜(f)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
(h)配列番号39および41〜51に示された配列のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれにより構成されるが、IRD(例、本明細書で挙げられているHCVタンパク質)およびTBD以外の配列の全部または一部を欠き、所望により例えば1個またはそれ以上のオルターナティブリンカーおよび/またはオルターナティブ分泌(リーダー)ペプチドを含んでいてもよいポリヌクレオチド。さらに、追加的配列(例、TBDのC−末端にあるアミノ酸をコード化するベクター由来の配列)が、本発明のポリヌクレオチドから欠失され得る。上記追加的配列は、1〜15個(例、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個)のアミノ酸をコード化するものであり得る。
(a)配列番号39および41〜51に示された配列(ただし、TはUでもあり得る)のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれにより構成されるポリヌクレオチド;
(b)配列が配列番号39および41〜51に示された配列のいずれかから選択される配列と少なくとも80%相同性であるポリヌクレオチド;
(c)配列が、本明細書で開示されているプラスミドのいずれかに含まれるDNAによりコード化されるキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド;
(d)配列が配列番号40および52〜62に示された配列のいずれかから選択される配列であるキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチド;
(e)配列が配列番号40および52〜62に示された配列のいずれかから選択される全アミノ酸配列と少なくとも90%同一であるキメラ抗原関連タンパク質をコード化するポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか一つのポリヌクレオチドと完全に相補的であるポリヌクレオチド;
(g)(a)〜(f)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
(h)配列番号39および41〜51に示された配列のいずれかから選択される配列を含むかまたはそれにより構成されるが、IRD(例、本明細書で挙げられているHCVタンパク質)およびTBD以外の配列の全部または一部を欠き、所望により例えば1個またはそれ以上のオルターナティブリンカーおよび/またはオルターナティブ分泌(リーダー)ペプチドを含んでいてもよいポリヌクレオチド。さらに、追加的配列(例、TBDのC−末端にあるアミノ酸をコード化するベクター由来の配列)が、本発明のポリヌクレオチドから欠失され得る。上記追加的配列は、1〜15個(例、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個)のアミノ酸をコード化するものであり得る。
本発明はまた、限定されるわけではないが、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工染色体)、並びに当業界でよく知られている様々なウイルス性および非ウイルス性ベクターを含む、キメラ抗原ポリヌクレオチド、その類似体または相同体を含む組換えDNAまたは転写RNA分子、および上記組換えDNAまたはRNA分子により形質転換またはトランスフェクションされた細胞を提供する。上記分子の生成方法はよく知られている[例えば、Sambrook et al.、1989、前出、参照]。
さらに本発明は、適切な原核生物または真核生物宿主細胞内におけるキメラ抗原ポリヌクレオチド、その類似体または相同体を含む組換えDNA分子を含む宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例には、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞、例えば哺乳類細胞または昆虫細胞(例、バキュロウイルス感染性細胞、例えばSf9、Sf21、expresSF+(登録商標)、Drosophila S2またはHigh Five(商標)細胞)がある。適切な哺乳類細胞の例には、様々な前立腺癌セルライン、例えばDU145およびTsuPr1、他のトランスフェクション可能または形質導入可能な前立腺癌セルライン、一次細胞(PrEC)、および組換えタンパク質の発現に常用される若干の哺乳類細胞(例、COS、CHO、293、293T細胞)がある。さらに具体的には、キメラ抗原のコーディング配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、類似体または相同体は、当業界で常用され、広く知られているかなり多数の宿主−ベクター系を用いてそのキメラ抗原を生成するのに使用され得る。
キメラ抗原の発現に適切な広い範囲の宿主−ベクター系が利用可能である、例えば、Sambrook et al.、1989、前出;Ausubel、Current Protocols in Molecular Biology、1995(前出)参照。昆虫細胞発現に好ましいベクターには、トランスファーベクタープラスミドpFastBac HTa(Invitrogen)があるが、限定されるわけではない。上記トランスファーベクタープラスミドを用いると、組換えバキュロウイルスが昆虫細胞で生産され得、これらを、例えばSf9、Sf21、expresSF+(登録商標)、Drosophila S2またはHigh Five(商標)を含む、幾つかの昆虫セルラインの感染に用いることにより、キメラ抗原を発現させ得る。これの一例は、Bac〜Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen)である。別法として、好ましい酵母発現形には、サッカロマイシス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイシス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・アウグスト(Pichia august)がある。本発明の宿主−ベクター系は、キメラ抗原の製造に有用である。
キメラ抗原またはその類似体または相同体はまた、適切なプロモーター(例、昆虫細胞プロモーター)を含み、キメラ抗原をコード化するプラスミド構築物による細胞(例、昆虫細胞)の安定したトランスフェクションにより製造され得る。例えば、キメラ抗原またはその類似体または相同体をコード化する組換えプラスミドpMIB−V5(Invitrogen)は、Sf9昆虫細胞の安定したトランスフェクションに使用され得る。キメラ抗原または関連タンパク質は、Sf9細胞で発現され、キメラ抗原は標準精製方法を用いて単離される。当業界で公知の様々な他の発現系もまた使用され得る。キメラ抗原コーディング配列と枠内で連結されたリーダーペプチドをコード化する発現構築物は、キメラ抗原の分泌形態の生成に使用され得る。
本明細書で検討したところによると、遺伝コードの重複性により、キメラ抗原遺伝子配列は変更され得る。特に、特定の宿主種には多くの場合特定のコドン優先性が決まっていることが当業界では知られているため、所望の宿主に好適であるように開示された配列を適合させることができる。例えば、好ましい類似体コドン配列では、典型的には稀なコドン(すなわち、所望の宿主の既知配列における使用頻度が約20%未満であるコドン)が高頻度のコドンにより置き換えられている。特定種についてのコドン優先性は、例えば、インターネット上、例えばワールド・ワイド・ウェブURL www.kazusa.or.jp/codon.で入手可能なコドン使用表を用いることにより計算される。
追加的な配列修飾は、細胞宿主におけるタンパク質発現を高めることが知られている。これの例には、擬似ポリアデニル化シグナル、エキソン/イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコード化する配列、および/または遺伝子発現に有害である十分に特性確認された他の配列の排除がある。宿主細胞で発現された既知遺伝子を基準にして算出された、所定の細胞宿主に関する平均レベルに配列のGC含有率を調節する。可能な場合、配列に修飾を加えることにより、予測されるヘアピン二次mRNA構造を回避する。他の有用な修飾には、Kozak[(1989)Mol.Cell Biol.9:5073−5080]により報告された、読み枠の開始点での翻訳開始共通配列の付加がある。当業者であれば、真核生物リボソームが排他的に5'近位AUGコドンで翻訳を開始させるという一般的規則が稀な条件下でのみ排除されることは理解できるはずである[例えば、Kozak(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:2662−2666;Kozak(1987)Nucl.Acids Res. 15:8125−8148参照]。
各々下記に列挙したプラスミドの一つにより形質転換された、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)クローンを、カナダ国R3E 3R2、マニトバ、1015アーリントン・ストリート・ウィニペグ(電話番号:(204)789−6030;ファクシミリ番号:(204)789−2018)の、インターナショナル・デポジトリー・オーソリティー・オブ・カナダ(IDAC)にブタペスト条約のもと、2006年10月11日に寄託した。各クローンは、示されたIDAC受託番号により容易に同定され得る。
IDACに寄託されたサンプルは、本願出願前に ViRexx Medical Corporationにより維持されている同寄託物から採取されたものである。寄託物は、30年間、または最新請求後5年間、または特許の有効期間中、IDAC受託所で制限無く維持され、その期間中に寄託物が生育不能になった場合には交換される。
E.本発明の医薬組成物
本発明の一態様は、医薬上許容される賦形剤および免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、特に抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を含む医薬組成物に関するものである。治療適用において、医薬組成物は、抗原に対して有効なB細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)および/またはヘルパーTリンパ球(Th)応答を誘発し、感染を阻止するかまたは感染の症状および/または合併症を治癒または少なく部分的に停止させるか遅らせるのに十分な量で対象に投与され得る。この用途に有効な量は、例えば投与される特定組成物、投与方法、処置されている疾患の段階および重症度、対象の体重および全般的健康状態、および担当医の判断に左右される。
本発明の一態様は、医薬上許容される賦形剤および免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、特に抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を含む医薬組成物に関するものである。治療適用において、医薬組成物は、抗原に対して有効なB細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)および/またはヘルパーTリンパ球(Th)応答を誘発し、感染を阻止するかまたは感染の症状および/または合併症を治癒または少なく部分的に停止させるか遅らせるのに十分な量で対象に投与され得る。この用途に有効な量は、例えば投与される特定組成物、投与方法、処置されている疾患の段階および重症度、対象の体重および全般的健康状態、および担当医の判断に左右される。
初回治療的免疫(キメラ抗原による)についての投薬は、一般的に、低い方の値が約1、5、50、500または1000ngであり、高い方の値が約10000、20000、30000または50000μgである単位投薬量範囲で行われる。ヒトに関する投薬量の値は、典型的には70キログラムの対象に対して約500ng〜約50000μgの範囲である。対象の応答および状態によって、日単位から月単位の期間に及ぶブースタープログラムに準じてキメラ抗原約1.0ng〜約50000μgの促進薬量が投与され得る。上記状態が阻止、停止、緩和または排除されたことを少なくとも臨床症状または試験結果が示すまで、およびその後の一定期間投与は続行すべきである。投薬量、投与経路、および投薬スケジュールは、当業界で公知の方法にしたがって調節される。
キメラ抗原のヒト単位用量形態は、典型的には許容される担体、一具体例では水性担体のヒト単位用量を含む医薬組成物に含まれ、ヒトへの上記ポリペプチドの投与に有用であることが当業者に知られている体積/分量で投与される(例、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第20版、A.Gennaro、編集者、Lippincott Williams & Wilkins、バルチモア、メリーランド(2000)参照)。当業者が認めるところによると、様々な因子が特定の症例における理想用量に影響を及ぼし得る。上記因子には、例えば、キメラ抗原の半減期、キメラ抗原の結合親和力、組成物の免疫原性、所望の定常状態濃度レベル、投与経路、処置頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される他の薬剤の影響、並びに特定対象の健康状態がある。
一般的に、キメラ抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分なキメラ抗原を対象に投与する。TBDは、キメラ抗原をAPC、例えばDC上の特異的受容体にターゲッティングする。キメラ抗原は、抗原提示経路を介して内在化され、プロセッシングされることにより、体液性および細胞性の両免疫応答を誘発する。
実施態様によっては、本発明組成物を、深刻な病状、すなわち生命を脅かすかまたは生命を脅かす可能性がある状況で使用する場合もある。そのような場合、本発明の好ましい組成物におけるキメラ抗原は比較的非毒性であることから、これらのキメラ抗原を上記で述べた用量に対して過剰な量で投与することが可能であり、担当医が望ましいと感じる処置でもあり得る。
医薬製剤中における本発明キメラ抗原の濃度は、広範に、すなわち、重量にして約0.1%未満から、通常約2%または少なくとも約2%から20%〜50%またはそれ以上に及ぶ範囲で変動し得、選択された特定投与方法にしたがって、主として液量、粘稠性などにより選択される。
医薬組成物は、当業界で公知の経路を介して、例えば非経口、鞘内、脈管内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、皮下、鼻腔内、局所、経口、直腸、膣、肺または腹腔内経路により送達され得る。好ましくは、組成物は、非経口経路、例えば皮下または皮内投与により送達される。
医薬組成物は、意図した投与経路に適切な賦形剤と所望のキメラ抗原を混合することにより製造され得る。本発明医薬組成物を製造する場合、キメラ抗原を、通常賦形剤と混合するか、賦形剤により希釈するか、またはカプセル、サシェ、紙または他の容器の形態であり得る担体内に封入する。医薬上許容される賦形剤を希釈剤として使用するとき、それは、固体、半固体、または液体材料であり得、治療剤用の賦形剤、担体または媒質として作用する。すなわち、組成物は、錠剤、丸薬、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル(固体または液体媒質として)、例えば10重量%以下の割合でキメラ抗原を含有する軟膏、ソフトおよびハードゼラチンカプセル剤、座薬、滅菌注射可能溶液、および滅菌パッケージ粉末の形態であり得る。
適切な賦形剤の若干の例には、デキストロース、蔗糖、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカントゴム、ゼラチン、珪酸カルシウム、微晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースがあるが、これらに限定されるわけではない。製剤は、さらに滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油、湿潤剤、乳化および懸濁剤、保存剤、例えばメチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエート、甘味料、および風味剤を含み得る。本発明組成物は、当業界で公知の手順を用いることにより、対象への投与後キメラ抗原の迅速、持続または遅延放出を可能にするように製剤化され得る。例えば、Remington、前出、903−92頁および1015−1050頁参照。
固体組成物、例えば錠剤を製造する場合、キメラ抗原を医薬用賦形剤と混合することにより、本発明キメラ抗原の均一混合物を含む固体プレフォーミュレーション組成物を形成する。均一なものとしてこれらのプレフォーミュレーション組成物に言及するとき、キメラ抗原を組成物全体に均等に分散させることにより、組成物が容易に均等有効単位用量形態、例えば錠剤、丸薬およびカプセルに小分割され得ることを意味する。
本発明の錠剤または丸薬をコーティングまたは他の方法で調合することにより、長時間作用という利点をもたらす用量形態が提供され得る。例えば、錠剤または丸薬は、内側投薬および外側投薬成分を含み得、後者は前者全体を覆うエンベロープ形態である。これら2成分は、胃での分解に抵抗し、内側成分を十二指腸まで無傷のまま通過させるかまたは放出を遅延させるべく機能する腸溶層により分離され得る。上記腸溶層またはコーティングには様々な材料、例えば若干のポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースといった材料との混合物を含む材料が使用され得る。
本発明の新規組成物が経口または注射による投与用に組み込まれ得る液体形態には、水溶液、好適に調味したシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油、例えばコーン油、綿実油、ゴマ油、ココヤシ油または落花生油による調味したエマルジョン、並びにエリキシルおよび同様の医薬用賦形剤がある。
非経口投与用組成物を製造する場合、刺激を減らすため張度調節に厳格な注意を払わなければならない。再構成可能組成物は、乾燥形態でパッケージされた滅菌固体である。即座に投与できる溶液中よりも乾燥固体として貯蔵する方が、安定性が高いことから、再構成可能組成物が好ましい。乾燥固体は、通常、固体が確実に最適湿度範囲に保たれるようにブチルゴム閉め具の付いた滅菌容器にパッケージされている。再構成可能乾燥固体は、乾燥充填、噴霧乾燥、または凍結乾燥方法により形成される。これらの方法は、例えばRemington、前出、681〜685頁および802〜803頁に記載されている。
非経口注射用組成物は、一般的に希釈されており、高い比率で存在する成分は賦形剤である。賦形剤は、通常治療活性を持たず、非毒性であるが、吸収に適切な形態で身体組織にキメラ抗原を提示する。キメラ抗原が水溶液として提示されると、吸収は、通常非常に迅速かつ完全に行われる。しかしながら、水混和性液体で賦形剤を修飾するか、水混和性液体と置き換えることにより、吸収速度に影響を与えることは可能である。好ましくは、この組成物に関して最も価値のある賦形剤は等張性食塩水である。注射に適切な組成物を製造する際、水性賦形剤、水混和性賦形剤および非水性賦形剤が使用され得る。
組成物の品質を改良または保護するため、追加的物質を本発明の注射可能組成物中に含ませ得る。すなわち、追加される物質は、溶解性に影響し、対象を快適にし、化学的安定性を高めるか、または微生物増殖から製品を防御し得る。すなわち、組成物は、適切な可溶化剤、酸化防止剤として作用する物質、および微生物増殖を阻止する保存剤として作用する物質を含み得る。これらの物質は、それらの機能に適切な量で存在するが、組成物の作用に悪影響を及ぼすことはない。適切な抗菌剤の例には、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、p−ヒドロキシ安息香酸メチル、およびp−ヒドロキシ安息香酸プロピルがある。適切な酸化防止剤は、Remington、前出、1015〜1017頁に記載されている。
若干の具体例では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などが本発明キメラ抗原の投与に使用される。特に、本発明組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体、ナノ粒子などに封入された形での送達用に処方され得る。別法として、本発明組成物は、共有結合または非共有結合的に上記担体賦形剤の表面に結合され得る。
リポソームを介して投与される組成物はまた、1)キメラ抗原を特定組織、例えばリンパ系組織にターゲッティングする、2)APCへ選択的にターゲッティングする、3)追加的な刺激性または調節性分子を担う、または4)キメラ抗原組成物の半減期を増加させるべく機能し得る。リポソームは、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるキメラ抗原は、リポソームの一部として、単独またはリンパ系細胞間で優勢な受容体に結合する分子、例えばCD45抗原に結合するモノクローナル抗体と、または他の治療用または免疫原性組成物と連係的に組み込まれる。すなわち、所望の本発明キメラ抗原を充填または装飾したリポソームは、リンパ系細胞部位へ指向され得、次いでリポソームがキメラ抗原を送達する。本発明にしたがって使用されるリポソームは、一般的に中性および負に荷電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む、標準小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般的に例えばリポソームサイズ、所望の投与経路に関する、例えば血流中におけるリポソームの酸不安定性および安定性を考慮することにより異なってくる。リポソームの製造については様々な方法が利用可能である[例、Szoka et al.(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467−508;および米国特許第4235871号、同第4501728号、同第4837028号および同第5019369号に記載]。キメラ抗原を含むリポソーム懸濁液は、特に投与方法、送達されるキメラ抗原、および処置されている病気の段階にしたがって変動する用量で静脈内、局部、局所などの経路で投与され得る。
吸入または通気用組成物には、医薬上許容される水性または有機溶媒、またはそれらの混合物中での溶液および懸濁液、および粉末がある。液体または固体組成物は、本明細書記載の適切な医薬上許容される賦形剤を含み得る。組成物は、局所または全身効果を目的として経口または鼻腔呼吸器経路により投与され得る。医薬上許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧され得る。噴霧液は、噴霧装置から直接吸入され得るか、または噴霧装置はフェースマスクテント、または間歇陽圧呼吸器に取り付けられ得る。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な方法で処方物を送達する装置から、好ましくは経口または鼻腔内投与され得る。
本発明方法で使用される別の製剤は、経皮送達装置(「パッチ」)を使用する。上記経皮パッチを使用することにより、本発明キメラ抗原を制御された量で連続的または不連続的に注入させ得る。医薬製剤を送達するための経皮パッチの構築および使用は当業界ではよく知られている。例えば、米国特許第5023252号参照、これについては出典明示で援用する。上記パッチは、医薬製剤の連続的、拍動的、またはオンデマンド式送達用に構築され得る。
さらに、キメラ抗原および医薬用賦形剤に加えて少なくとも1種の抗ウイルス治療薬または化学療法薬を含ませることが有利であり得る。例としては、インターフェロン−α2a/b、および抗ウイルス剤、例えばリバビリンがあるが、これらに限定されるわけではない。
実施態様によっては、本発明医薬組成物中に、B−リンパ球またはTリンパ球を初回感作する少なくとも1種の成分を含ませることが望ましい場合もあり得る。脂質は、インビボでCTLを初回感作し得る作用物質として認識されている。例えば、パルミチン酸残基を、リシン残基のε−およびα−アミノ基に結合させ、次いで、例えば、1個またはそれ以上のリンキング残基、例えばGly、Gly−Gly−、Ser、Ser−Serなどを介して免疫原性ペプチドに連結させ得る。次いで、脂質化ペプチドを、直接ミセルまたは粒子中で投与するか、リポソームに組み込むか、またはアジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント中で乳化させ得る。好ましい実施態様では、特に有効な免疫原性組成物は、Lysのε−およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含んでおり、これを連鎖、例えばSer−Serを介して免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合させる。
CTL応答の脂質初回感作の別の例として、エシェリキア・コリ(E.coli)リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−S−グリセリルシステインリセリル−セリン(P3CSS)を、適切なペプチドに共有結合させた場合、ウイルス特異的CTLの初回感作にこれを使用することができる[例、Deres et al.(1989)Nature 342:561参照]。本発明のキメラ抗原を、例えばP3CSSにカップリングさせ、リポペプチドを個体に投与することにより、標的抗原に対し免疫応答を特異的に誘発させ得る。
本発明組成物は当然アジュバントの使用を要求するものではないが、アジュバントを使用することは可能である。宿主の種によって免疫学的応答を高めるのに様々なアジュバントが使用され得、それらの例としては、フロイント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、デタージェント、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、免疫刺激性ポリヌクレオチド配列、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG(bacille Calmette-Guerin、カルメット-ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)があるが、これらに限定されるわけではない。追加的アジュバントもまた当業界では公知である。
F.キメラ抗原の使用方法
本発明の別の態様は、APCによる抗原提示を増強する方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント(例、異種抗体フラグメント)を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原をAPCに投与することを含む方法を提供する。好ましい具体例では、APCは樹状細胞である。
本発明の別の態様は、APCによる抗原提示を増強する方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント(例、異種抗体フラグメント)を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原をAPCに投与することを含む方法を提供する。好ましい具体例では、APCは樹状細胞である。
本発明の一態様は、APCの活性化方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント(例、異種抗体フラグメント)を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原とAPCを接触させることを含む方法に関するものである。好ましい具体例では、APCをインビボでキメラ抗原と接触させる。別の好ましい具体例では、接触はヒトで行われる。
本発明のさらに別の態様は、免疫応答誘発方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメント(例、異種抗体フラグメント)を含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を哺乳類に投与することを含む方法を提供する。免疫応答は、体液性および/または細胞性免疫応答であり得る。好ましい具体例において、細胞性免疫応答は、Th1、Th2および/またはCTL応答である。
本発明の別の態様は、免疫治療可能な状態の処置方法であって、処置を必要とする動物に、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし異種抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、免疫治療可能な状態は、慢性C型肝炎ウイルス感染である。HCVの処置の場合、好ましくは、免疫応答ドメインは、HCVコア(1−191)タンパク質、HCVコア(1−177)タンパク質、HCV E1タンパク質、HCV E2タンパク質、HCV E1−E2タンパク質、HCV NS2タンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4Aタンパク質、HCV NS4Bタンパク質、HCV NS5Aタンパク質、HCV NS5Bタンパク質、HCV p7タンパク質、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されるタンパク質を含む。
本発明の別の態様は、ウイルス感染に対して動物にワクチン投与する方法であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン、ただし抗体フラグメントを含む標的結合ドメインを含むキメラ抗原を動物に投与することを含む方法を提供する。本発明方法は、ウイルス感染に対して動物に予防的または治療的にワクチンを投与し得る。
本発明はまた、本発明組成物を用いることにより、APC、例えばDCに結合し、それらを活性化する方法を含む。本発明はまた、本発明組成物の使用によるT細胞の活性化方法を含む。本発明はまた、免疫系細胞、例えばAPCへの抗原の送達方法を含む。本発明はまた、動物またはヒトにおいて体液性および/または細胞性免疫応答を活性化する組成物および方法であって、1種またはそれ以上の本発明キメラ抗原を投与することを含む方法を包含する。
クローニングおよび発現後、免疫応答誘発におけるその効力についてキメラ抗原を評価する。評価は、エクスビボまたはインビボでのDCへのキメラ抗原の提示を含む。キメラ抗原の結合および内在化についてDCを評価する。キメラ抗原をローディングしたナイーブDCをTリンパ球に提示し、T細胞応答のマーカーとしてインターフェロン−γの産生について評価する。具体的には、エクスビボ状況の場合、単球を末梢血から単離し、DCに分化させる。DCは抗原と結合し、それを内在化し、プロセッシングし、ナイーブオートロガスTリンパ球に提示する。DCによりプロセッシングされ、提示された抗原を認識するT細胞は、エフェクター細胞、例えばヘルパーT細胞または細胞傷害性Tリンパ球へ活性化される。次いで、樹状細胞によるT細胞の活性化を、公知手順[例、Berlyn et al.(2001)Clin.Immunol.101(3):276−283]によりマーカー、例えばインターフェロン−γレベルの測定により評価する。バックグラウンドを少なくとも50%の割合で超えるインターフェロン−γを産生するT細胞のパーセンテージの増加によりインビボでの効力が予測される。好ましい具体例において、パーセンテージ増加は、少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%または100%である。インビボ状況の場合、キメラ抗原を直接宿主において非経口的に導入するが、宿主において利用可能な樹状細胞および他の抗原プロセッシング細胞は、全抗原と相互作用することにより、それらをプロセッシングする能力を有する。
G.多剤併用療法
本発明の別の態様は、キメラ抗原および抗ウイルス剤を含むウイルス感染処置用組成物を提供する。本発明はまた、キメラ抗原および抗ウイルス剤を同時に、または連続して投与することを含むウイルス感染処置方法を提供する。
本発明の別の態様は、キメラ抗原および抗ウイルス剤を含むウイルス感染処置用組成物を提供する。本発明はまた、キメラ抗原および抗ウイルス剤を同時に、または連続して投与することを含むウイルス感染処置方法を提供する。
抗ウイルス剤とキメラ抗原、例えばヌクレオシド類似体の併用は、慢性C型肝炎に罹患している対象の処置において持続的応答を誘導するのに非常に有効であることが証明され得る。併用される2薬剤の作用機序は、C型肝炎対象の処置において相乗効果を生み出しうる。例えば、本明細書記載のHCVキメラ抗原とHCV抗ウイルス剤、例えばリバビリンの組み合わせは、抗原特異的な細胞性および体液性免疫応答を発生させるため、慢性感染症対象におけるHCV感染は取り除かれる。
H.キメラ抗原の製造方法
本発明の一態様は、キメラ抗原の製造方法であって、(a)キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む、微生物またはセルライン(または細胞)、好ましくは真核生物、さらに好ましくは非哺乳類微生物またはセルライン(または細胞)を準備し、(b)キメラ抗原が発現される条件下で微生物またはセルライン(または細胞)を培養することを含む方法を提供する。好ましくは、微生物またはセルライン(または細胞)は、酵母、植物セルライン(または細胞)または昆虫セルライン(または細胞)である。さらに好ましくは、セルライン(または細胞)は、Sf9、Sf21、expresSF(商標)、Drosophila S2、および High Five(商標)セルラインまたは細胞から成る群から選択される昆虫セルライン(または細胞)である。
本発明の一態様は、キメラ抗原の製造方法であって、(a)キメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む、微生物またはセルライン(または細胞)、好ましくは真核生物、さらに好ましくは非哺乳類微生物またはセルライン(または細胞)を準備し、(b)キメラ抗原が発現される条件下で微生物またはセルライン(または細胞)を培養することを含む方法を提供する。好ましくは、微生物またはセルライン(または細胞)は、酵母、植物セルライン(または細胞)または昆虫セルライン(または細胞)である。さらに好ましくは、セルライン(または細胞)は、Sf9、Sf21、expresSF(商標)、Drosophila S2、および High Five(商標)セルラインまたは細胞から成る群から選択される昆虫セルライン(または細胞)である。
本発明は、本発明を実施するにあたり必要とされる選択された抗原(複数も可)およびTBDの融合タンパク質の製造を目的とする確立された組換えDNA技術を使用する。融合タンパク質構築物は、発現ベクターへの所望のDNAフラグメントの組み込みで利用される特異的制限酵素部位を組み込むものとしてDNAレベルで生成され、異種発現系における所望の融合タンパク質の発現に使用される。本明細書で使用されている「ベクター」の語は、所望のタンパク質(複数も可)をコード化するDNAを運び得るプラスミドを意味する。本発明で使用するプラスミドベクターには、pFastBac HTaおよびDH10Bac(商標)エシェリキア・コリ(E.coli)(Invitrogen)で調製される対応する組換え「BACMIDS」(バクミド、細菌性人工染色体)があるが、これらに限定されるわけではない。所望のタンパク質のORFを起動させ、本発明で使用する、Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系(Invitrogen)に加えて、他の系(細菌または哺乳類)でタンパク質を発現させる他の組換えプラスミドを製造することは可能である。使用されている「発現」の語は、DNA配列のmRNAへの転写、mRNA転写物の融合タンパク質への翻訳を意味する。
これは、バクミドへ目的遺伝子を転位させ、Sf9昆虫細胞へトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスを作製することにより達成される。これらを用いてSf9またはHigh Five(商標)昆虫細胞を感染させ、目的タンパク質を生産させる。生産された組換えタンパク質は、N−末端6xHis標識を有し得、これはNi−NTAアガロース(Qiagen、ヒルデン、ドイツ国)を用いることによるタンパク質の精製で利用される。これらのタンパク質はまた、N−末端rTEVプロテアーゼまたはクローン化された他の開裂部位を有し得る。Ni−精製タンパク質を、同じくN−末端6xHis標識を有する、例えばrTEVプロテアーゼ(Invitrogen)による消化にかける。プロテアーゼ消化後、混合物をNi−NTAアガロースカラムにローディングし得、純粋タンパク質を洗浄し得、6xHis標識フラグメントはカラムに結合される。この精製方法は標準手順であり、当業者であればそれ以上の説明が無くても本方法について理解できるはずである。
ウイルス性抗原およびマウスモノクローナル抗体のFcフラグメントをコード化することによりキメラ抗原を生成するDNA配列のクローニングおよび発現は、2方法を通じて達成され得る。第1法では、融合タンパク質として2種のタンパク質をクローニングし、第2法では分子のいずれか一方に特異的「バイオ-リンカー」、例えばビオチンまたはストレプトアビジンを組み込み、それらを別々に精製し、キメラ抗原を生成させる。
具体例として、B型肝炎ウイルス表面抗原に対してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ2C12を、マウス免疫グロブリンGに関する全RNAの供給源として使用した。全RNAを分離し、マウスFcフラグメントのクローニングに使用した。具体的には、マウスIgGを発現するハイブリドーマ細胞からの全RNAを、Trizol(登録商標)試薬(Invitrogen/Gibco BRL、製品カタログ番号10551−018、10298−016;フェノールおよびグアニジンイソチオシアネート(isothiocyante)の単相溶液、米国特許第5346994号)を用いて分離する。オリゴ−dTカラム(Invitrogen/Gibco BRL、製品カタログ番号15939−010)でのアフィニティー・クロマトグラフィーにより、mRNAを全RNAから精製した。ポリメラーゼ連鎖反応において逆転写酵素を用いることにより、相補的DNA(cDNA)を調製した。特有な制限酵素認識部位を付加してクローニングし易くするようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系(Invitrogen/Gibco BRL、製品カタログ番号15939−010)を用いて、このcDNAをクローン化した。
大量の異種タンパク質が製造されるだけでなく、タンパク質の翻訳後修飾、例えばリン酸化およびグリコシル化も感染昆虫細胞内で行われるため、バキュロウイルス系を優先的に使用する。この発現系では、DNAを、pFastBac(商標)(Invitrogen/Gibco BRL、製品カタログ番号15939−010)と呼ばれるベクターにクローン化し得る。Bac-to-Bac(登録商標)系では、組換え体の調製は、細菌性トランスポゾンTn7による部位特異的転位に基づいている。目的遺伝子を、クローニング部位の両端に隣接してミニTn7エレメントを有する、pFastBac(商標)にクローン化する。プラスミドを、LacZ遺伝子内にTn7の付着部位を含むバキュロウイルスシャトルプラスミド(バクミド)を有する、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)株DH10Bac(商標)(Invitrogen/Gibco BRL、製品カタログ番号10361−012)に形質転換する。転位によってLacZ遺伝子が破壊されることにより、組換え体のみが白色コロニーを生産し、容易に選択される。エシェリキア・コリ(E.coli)での転位を用いる利点は、単コロニーが組換え体のみを含むため、プラーク精製およびスクリーニングが要求されないことである。組換えバクミドを昆虫細胞でトランスフェクションすることにより、組換えタンパク質を発現するバキュロウイルスを作製する。
Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系はInvitrogenから市販されており、使用される手順は、例えば、www.invitrogen.comで入手可能な会社のプロトコルに記載されている通りである。目的遺伝子は、例えばpFastBac HTaドナープラスミドへクローン化され、組換えタンパク質の製造は、Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系(Invitrogen)に基づいている。
次の段階で、目的遺伝子を含むpFastBac HTaドナープラスミドを、部位特異的転位で使用することにより、クローン化された遺伝子をバキュロウイルスシャトルベクター(バクミド)へ移入する。これは、エシェリキア・コリ(E.coli)株DH10Bac(商標)で達成される。目的遺伝子を伴う組換えpFastBac HTaプラスミドを、転位させるためDH10Bac(商標)細胞へ形質転換することにより、組換えバクミドを作製する。
組換えバクミドを標準プロトコル(Sambrook、前出)により分離する。DNAサンプルをトランスフェクションに使用した。
バキュロウイルスを作製するため、バクミドをSf9昆虫細胞へトランスフェクションする。トランスフェクション後、細胞を適切な条件下でインキュベーションし、バキュロウイルスを含む培地を集め、貯蔵する。
バキュロウイルスの作製およびタンパク質の発現が確認されると、ウイルスストックを増幅することにより、目的遺伝子をもつバキュロウイルスの濃縮ストックを調製する。バキュロウイルスを少なくとも2回増幅することが当業界での標準的実施法であり、本明細書記載の全プロトコルでも、この標準的実施法を厳守した。第2ラウンドの増幅後、キットの製造業者(Invitrogen)が記載したプロトコルによるプラーク検定法を用いて、作製されたバキュロウイルスの濃度が定量され得る。昆虫細胞に感染させるウイルスの最も適切な濃度および所望のタンパク質製造の最適な時点もまた一般的に確立されている。
目的タンパク質をコード化するDNAを、1コピーの完全ウイルスゲノムを含むプラスミドから特有な制限酵素部位をもつオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにより調製し、融合タンパク質としてFc DNAと共にクローン化する。Ni−NTA、レクチン、プロテインAまたはプロテインGアフィニティー・クロマトグラフィーまたは当業者に熟知されている他の標準的精製方法により、このキメラタンパク質を精製する。
IRDおよびTBDを連結する第2方法では、分子のいずれか一方に特異的「バイオ-リンカー」、例えばビオチンまたはアビジン(例、ストレプトアビジン)を組み込み、それらを別々に精製し、キメラ抗原を作製する。目的ウイルス性抗原を、バクテリオファージT7プロモーターによりタンパク質の発現を制御するプラスミドへクローン化する。次いで、組換えプラスミドを、lacプロモーターにより調節されるT7 RNAポリメラーゼの生産能を有する、エシェリキア・コリ(E.coli)株、例えばBL21(DE3)Codon Plus(商標)RIL細胞(Stratagene、製品カタログ番号230245)へ形質転換する。T7 RNAポリメラーゼは、T7プロモーターについて高度に特異的であり、エシェリキア・コリ(E.coli)宿主のRNAポリメラーゼより生産性がかなり高い(〜8倍速い)。T7 RNAポリメラーゼの生成をイソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)により誘導した場合、T7 RNAポリメラーゼの特異性および生産性は、T7プロモーターの制御下における遺伝子の高レベルの転写をもたらす。2種のタンパク質をカップリングするため、ビオチンおよびアビジン(例、ストレプトアビジン)間の堅固な結合を利用する。エシェリキア・コリ(E.coli)では、BirA酵素が、特異的認識配列における特定リシン残基へのビオチンの共有結合を触媒する。マウスFcフラグメントを、アビジンとの融合タンパク質として上記要領でバキュロウイルス系において発現させる。これら2種のタンパク質を混合することにより、ビオチン−ストレプトアビジン結合による2量体タンパク質複合体を形成し得る。
本発明の実施法は、特に断らなければ、当業界の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の慣用的技術を用いる。上記技術は文献で詳細に説明されている。例えば、Sambrook、前出、およびAusubel、前出参照。
I.製品およびキット
本発明の別の態様は、組成物の非経口的、例えば皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内または脈管内投与方法の解説を載せた使用指示書を印刷したラベルと組み合わせて注射または注射用の再構成に適切なキメラ抗原を含む組成物を内包する容器を含む製品を提供する。組成物は、組成物と重大な相互作用を起こすことのない適切な容器に含まれ得、それが非経口用であることを示す適切なラベルが貼付され得る。前述した処置方法と一致する使用指示書のラベルが容器に貼付され得る。本発明組成物を内包する容器は、注入に適切な液体組成物を有する容器であり得る。容器は、注射針を刺し込むように適合化され得る。製品は、患者、医師、看護士または他の従業者がキメラ抗原を投与できるように適切な針および注入用注射器を包含し得る。別法として、組成物は、キメラ抗原の可溶性バージョンを含む乾燥または濃縮組成物であり、水性または非水性賦形剤と合わせるかまたはそれで希釈することにより、組成物を溶解または懸濁させ得る。別法として、容器は、液中懸濁液を有し得るか、または不溶性バージョンが懸濁される賦形剤と組み合わせた形の塩の不溶性バージョンであり得る。適切な容器については、Remington、前出、788−789、805、850−851および1005−1014頁で検討されている。
本発明の別の態様は、組成物の非経口的、例えば皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内または脈管内投与方法の解説を載せた使用指示書を印刷したラベルと組み合わせて注射または注射用の再構成に適切なキメラ抗原を含む組成物を内包する容器を含む製品を提供する。組成物は、組成物と重大な相互作用を起こすことのない適切な容器に含まれ得、それが非経口用であることを示す適切なラベルが貼付され得る。前述した処置方法と一致する使用指示書のラベルが容器に貼付され得る。本発明組成物を内包する容器は、注入に適切な液体組成物を有する容器であり得る。容器は、注射針を刺し込むように適合化され得る。製品は、患者、医師、看護士または他の従業者がキメラ抗原を投与できるように適切な針および注入用注射器を包含し得る。別法として、組成物は、キメラ抗原の可溶性バージョンを含む乾燥または濃縮組成物であり、水性または非水性賦形剤と合わせるかまたはそれで希釈することにより、組成物を溶解または懸濁させ得る。別法として、容器は、液中懸濁液を有し得るか、または不溶性バージョンが懸濁される賦形剤と組み合わせた形の塩の不溶性バージョンであり得る。適切な容器については、Remington、前出、788−789、805、850−851および1005−1014頁で検討されている。
本発明キットは、典型的には上記容器および商業的および使用者の立場から望ましい物質、例えば緩衝液、希釈液、充填剤、針、注射器、およびパッケージ挿入物を使用指示書と共に含む1個またはそれ以上の他の容器を含む。組成物が特異的治療または非治療的適用に使用されることを示すためのラベルが容器上に貼付され得、上記ラベルはまた、インビボまたはエクスビボでの使用法、例えば上記の使用法を示し得る。使用法および/または他の情報もまた、キットに包含される挿入物に含まれ得る。
V.実施例
以下、非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
実施例1.材料および方法
材料
これらの実施例で記載しているChimigen3 分子で使用するTBD(便宜上、実施例では
「TBD」と称す)は、マウスHBsAg−特異的mAbを産生し、カナダ国アルバータ、エドモントンのユニバーシティー・オブ・アルバータを通してTyrrell研究室から許可を得たハイブリドーマ2C12から誘導される。HCV抗原をコード化するDNAを含むプラスミドpCV−H77Cを、ユニバーシティー・オブ・アルバータの Tyrrell 研究室から入手した。
以下、非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
実施例1.材料および方法
材料
これらの実施例で記載しているChimigen3 分子で使用するTBD(便宜上、実施例では
「TBD」と称す)は、マウスHBsAg−特異的mAbを産生し、カナダ国アルバータ、エドモントンのユニバーシティー・オブ・アルバータを通してTyrrell研究室から許可を得たハイブリドーマ2C12から誘導される。HCV抗原をコード化するDNAを含むプラスミドpCV−H77Cを、ユニバーシティー・オブ・アルバータの Tyrrell 研究室から入手した。
pFastBac−HTaクローニングベクター、昆虫セルラインSf9、Cellfectin(商標)試薬、リン酸緩衝食塩水(PBS)、Platinum Pfx DNAポリメラーゼ、TRizol 試薬、Superscript First-Strand Synthesis 逆転写酵素、X−gal、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)および胎児ウシ血清(FBS)を、Invitrogen(米国カリフォルニア、カールスバッド)から購入した。
昆虫細胞培養および発現培地ESF921を、Expression Systems(米国カリフォルニア、ウッドランド)から購入した。制限酵素EcoR I、Spe I、HindIII、Rsr II、Ava II およびNot Iを、New England Biolabs(米国マサチューセッツ、イプスウィッチ)から購入した。
Expression Systems Baculovirus Titering Assay を用いてウイルスストックをタイトレーションした。IgG2A−PE(米国カリフォルニア、サンディエゴ、BD Biosciences)を、1:10に希釈し、イソタイプ対照として使用した。FACS捕捉および分析を用いて、バキュロウイルス力価を測定した。Becton Dickinson Biosciences FACSCalibur3(4色、デュアルレーザー)で細胞を捕捉し、CELLQuest Pro3ソフトウェア(BD Biosciences)を用いてデータを分析した。Expression Systemsが提供したMicrosoft Excel スプレッドシートにデータを入力し、標準曲線に基づいてウイルス力価を測定した。Ni−NTA Superflow3(Quiagen、ドイツ国ヒルデン)および Toyopearl Super Q3 650C(Tosoh Biosciences、米国オハイオ、グローブシティー)により精製を実施した。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)ゲル調製用の30%アクリルアミド溶液を、Bio-Rad(米国カリフォルニア、ハーキュラス)から購入した。PageBlue3 染料、5xローディング緩衝液、PageRuler3 前染色タンパク質ラダーおよび20x還元剤を、Fermentas(カナダ国オンタリオ、バーリントン)から購入した。
Hybond3 ECLニトロセルロースおよびECL Western Detectionキット(GE Healthcare)をウエスタン・ブロッティングに使用した。
Tween20、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、抗マウスIgG(Fc特異的)ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体、抗マウス(Fab特異的)ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート2次抗体、ヤギ抗ウサギホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート2次抗体および抗生物質カナマイシン、アンピシリンおよびゲンタマイシンを、Sigma(米国ミズーリ、セントルイス)から購入した。
ウサギ抗NS5A、ヤギ抗NS3、およびヤギ抗NS4ポリクローナル抗体およびマウス抗NS5Aモノクローナル抗体を、Abcam(米国マサチューセッツ、キャンブリッジ)から入手した。6xHisホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲートモノクローナル抗体を、Clontech(米国カリフォルニア、パロアルト)から購入した。
Slide-a-lyzer3 カセットおよび Micro BCA3アッセイキットを、Pierce(米国イリノイ、ロックフォード)から購入した。
Pro-Q(登録商標)Emerald 300 Glycoprotein GelおよびBlot Stain Kitを、Molecular Probes(米国カリフォルニア、カールスバッド)から購入した。
健康なドナーからの白血球搬出サンプルを、SeraCare Life Sciences(米国カリフォルニア、オーシャンサイド)から購入した。T細胞ネガティブ・アイソレーション用のDynal Dynabeads3を、Invitrogen(米国カリフォルニア、カールスバッド)から購入した。L−グルタミン、硫酸ストレプトマイシン(50μg/mL)および硫酸ゲンタマイシン(10μg/mL)を含む AIM V(商標)培地を、Invitrogenから購入した。適合ドナー血清を、フィコール−ハイパーク血液調製物の遠心分離後の血清画分から入手した。AIM V(商標)培地中50%の血清を加熱不活化し、アリコートに分け、−20℃で貯蔵した。ダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS)をInvitrogenから入手した。
以下の特異性をもつコンジュゲートモノクローナル抗体(mAb)を、BD Biosciences(カリフォルニア、サンディエゴ)から入手した:CD64−フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)、CD32−R−フィコエリスリン(PE)、CD16−PE、CD206−PE−Cy5、CD80−PE、CD86−FITC、CD83−PE、CD40−FITC、CD11c−PE、CD14−FITC、CD19−FITC、CD3−FITC、CD3−PE、CD3−アロフィコシアニン(APC)、CD8−PE−Cy5、CD4−APC、CD69−FITC、CD69−APC、HLA−ABC−FITC、HLA−DR−PE、IFN−γ−PE、TNF−α−PE、grB−FITC、pfn−FITCおよびマウスIgG1−ビオチン。ビオチニル化抗6xHisを、Qiagen(カナダ国オンタリオ、ミッシサウガ)から入手した。ヤギ抗ウサギIgG−ビオチン抗体を、Jackson ImmunoResearch Laboratories(ペンシルベニア、ウエストグローブ)から入手した。マウスイソタイプmAbおよびSA−PE−Cy5を、BD Biosciencesから入手した。混合異性体5−(および6)−カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル(5(6)−CFDA、SE;CFSE)を、Invitrogenから入手した。
抗原に対するT細胞の特異性を、特異的PE−コンジュゲート四量体(Beckman Coulter、カナダ国オンタリオ、ミッシサウガ)または五量体(ProImmune、バージニア、スプリングフィールド)の使用により測定した。使用した五量体は、HCV NS5AペプチドVLSDFKTWL(配列番号3)/HLA−A2およびHCV NS3ペプチドCINGVCWTV(配列番号4)/HLA−A2を含んでいた。使用した四量体は、EBVペプチドGLCTLVAML(配列番号5)/HLA−A2、HCV NS3ペプチドKLVALGINAV(配列番号6)/HLA−A2および負の対照四量体(複対立遺伝子)を含んでいた。
以下のサイトカインを、R & D Systems(ミネソタ、ミネアポリス)から購入した:インターロイキン−1β(IL−1β)、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、腫瘍壊死因子−I(TNF−α)、インターフェロン−K(IFN−γ)、およびインターフェロン−I(IFN−α)。製造業者の使用指示書にしたがって、サイトカインを再構成し、アリコートに分け、−70℃で貯蔵した。ポリICを、Sigmaから購入した。
Wave Bioreactor System23/10EH および Cellbag 10L/Oを、Wave Biotech(米国ニュージャージー、ソマーセット)から購入した。
方法
発現プラスミド構築
pFastBacHTa-TBD、親プラスミド構築物
HBV表面抗原(sAg)に対してmAbを産生するハイブリドーマ2C12から分離したmRNAから、CH1−ヒンジ−CH2−CH3領域のアミノ酸をコード化するマウスIgG1 DNA配列を作製した。TRizol試薬を用いて全mRNAを単離し、Superscript First-Strand Synthesis を用いるRT−PCRによりTBDのcDNAを調製した。PCRプライマーは、5'末端にリンカーペプチド−SRPQGGGS−(配列番号1)をコード化するリンカー配列、5'末端に特有なNot I部位および3'末端に特有なHind III制限部位を含んでいた。生成したcDNAは、(5'Not I)−リンカー配列−CH1(VDKKI:配列番号2)の部分−CH2−CH3(3'Hind III)を含む。制限酵素で消化後、同じ制限酵素部位を用いてフラグメントをpFastBac−HTa発現プラスミドベクターと連結した。PCR増幅に用いた5'プライマーは、(センス)5'−TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCAGG−3'(配列番号7)であり、3'プライマーは、(アンチセンス)5'−ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG−3'(配列番号8)であり、Not IおよびHind III部位をそれぞれ含んでいた。増幅したDNAをNot IおよびHind IIIで消化し、フラグメントをアガロースゲルにより精製し、同じ制限酵素で消化したpFastBac−HTa発現ベクタープラスミドと連結することにより、発現プラスミドpFastBacHTa−TBDを調製した。この生成物を用いて、融合タンパク質6xHis標識−rTEVプロテアーゼ開裂部位−TBDを発現させた。DNA配列および読み取り枠(ORF)の正確さを、標準配列決定方法により証明した。pFastBacHTa−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号9)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号10)を図2に示す。
発現プラスミド構築
pFastBacHTa-TBD、親プラスミド構築物
HBV表面抗原(sAg)に対してmAbを産生するハイブリドーマ2C12から分離したmRNAから、CH1−ヒンジ−CH2−CH3領域のアミノ酸をコード化するマウスIgG1 DNA配列を作製した。TRizol試薬を用いて全mRNAを単離し、Superscript First-Strand Synthesis を用いるRT−PCRによりTBDのcDNAを調製した。PCRプライマーは、5'末端にリンカーペプチド−SRPQGGGS−(配列番号1)をコード化するリンカー配列、5'末端に特有なNot I部位および3'末端に特有なHind III制限部位を含んでいた。生成したcDNAは、(5'Not I)−リンカー配列−CH1(VDKKI:配列番号2)の部分−CH2−CH3(3'Hind III)を含む。制限酵素で消化後、同じ制限酵素部位を用いてフラグメントをpFastBac−HTa発現プラスミドベクターと連結した。PCR増幅に用いた5'プライマーは、(センス)5'−TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCAGG−3'(配列番号7)であり、3'プライマーは、(アンチセンス)5'−ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG−3'(配列番号8)であり、Not IおよびHind III部位をそれぞれ含んでいた。増幅したDNAをNot IおよびHind IIIで消化し、フラグメントをアガロースゲルにより精製し、同じ制限酵素で消化したpFastBac−HTa発現ベクタープラスミドと連結することにより、発現プラスミドpFastBacHTa−TBDを調製した。この生成物を用いて、融合タンパク質6xHis標識−rTEVプロテアーゼ開裂部位−TBDを発現させた。DNA配列および読み取り枠(ORF)の正確さを、標準配列決定方法により証明した。pFastBacHTa−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号9)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号10)を図2に示す。
pFastBacHTa−gp64の構築
分泌については、アウトグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角病ウイルス(AcNPV)gp64タンパク質からのシグナル配列を、pFastBacHTaにクローン化した。2つのオリゴヌクレオチドを合成し、一緒にアニーリングした。オリゴヌクレオチド配列は、5'−GCATGGTCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATCTGCAGGTACGGTCCGATGC−3'(配列番号11)および5'−GCATCGGACCGTACCTGCAGATCCGCAAAGGCAGAATGCGCCGCCGCCGCCAAAAGCACATATAAAACAATAGCGCTTACCATGGACCATGC−3'(配列番号12)である。オリゴヌクレオチドは、5'Ava II部位および3'Rsr II部位を含む。Ava IIおよびRsr IIで消化後、フラグメントを、6xHis標識の上流に隣接してgp64シグナル配列を置くRsr II消化pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBac−HTa−gp64を作製した。
分泌については、アウトグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角病ウイルス(AcNPV)gp64タンパク質からのシグナル配列を、pFastBacHTaにクローン化した。2つのオリゴヌクレオチドを合成し、一緒にアニーリングした。オリゴヌクレオチド配列は、5'−GCATGGTCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATCTGCAGGTACGGTCCGATGC−3'(配列番号11)および5'−GCATCGGACCGTACCTGCAGATCCGCAAAGGCAGAATGCGCCGCCGCCGCCAAAAGCACATATAAAACAATAGCGCTTACCATGGACCATGC−3'(配列番号12)である。オリゴヌクレオチドは、5'Ava II部位および3'Rsr II部位を含む。Ava IIおよびRsr IIで消化後、フラグメントを、6xHis標識の上流に隣接してgp64シグナル配列を置くRsr II消化pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBac−HTa−gp64を作製した。
pFastBacHTa HCVNS5A Chimigen(商標)ワクチン融合タンパク質発現ベクタープラスミドの構築
PCR方法を用いて、HCV NS5Aフラグメントをコード化するDNAを、プラスミドpCV−H77C鋳型から調製した。PCRに使用した5'プライマーは、制限酵素EcoR I部位を含む(センス)5'−CCGGAATTCTCCGGTTCCTGGCTAAGG−3'(配列番号13)であった。3'末端についてのPCRプライマーは、制限酵素Spe I部位を含む(アンチセンス)5'−GGACTAGTCCGCACACGACATCTTCCGT−3'(配列番号14)であった。増幅DNAを制限酵素で消化し、pFastBac−HTa−TBDに連結することにより、発現プラスミドpFastBacHTa HCV NS5A Chimigen(商標)ワクチン(またはpFastBacHTa−NS5A−TBD)を調製した。pFastBacHTa−NS5A−TBDにおけるヌクレオチド配列(配列番号39)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号40)を図3に示す。NS5A単独の場合、NS5Aフラグメントを、EcoR I/Spe I消化pFastBac−HTaへ連結することにより、pFastBacHTa−NS5Aを調製した。
PCR方法を用いて、HCV NS5Aフラグメントをコード化するDNAを、プラスミドpCV−H77C鋳型から調製した。PCRに使用した5'プライマーは、制限酵素EcoR I部位を含む(センス)5'−CCGGAATTCTCCGGTTCCTGGCTAAGG−3'(配列番号13)であった。3'末端についてのPCRプライマーは、制限酵素Spe I部位を含む(アンチセンス)5'−GGACTAGTCCGCACACGACATCTTCCGT−3'(配列番号14)であった。増幅DNAを制限酵素で消化し、pFastBac−HTa−TBDに連結することにより、発現プラスミドpFastBacHTa HCV NS5A Chimigen(商標)ワクチン(またはpFastBacHTa−NS5A−TBD)を調製した。pFastBacHTa−NS5A−TBDにおけるヌクレオチド配列(配列番号39)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号40)を図3に示す。NS5A単独の場合、NS5Aフラグメントを、EcoR I/Spe I消化pFastBac−HTaへ連結することにより、pFastBacHTa−NS5Aを調製した。
分泌に関するpFastBacHTa−gp64 NS5A Chimigen(商標)ワクチン発現プラスミドの構築
pFastBacHTa−gp64へNS5A Chimigen(商標)ワクチンをクローン化するため、プラスミドpFastBacHTa HCVNS5A Chimigen(商標)ワクチン(上記)を、Rsr IIおよびHind IIIで消化し、NS5A Chimigen(商標)ワクチンフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により精製した。NS5A Chimigen(商標)ワクチンフラグメントを、Rsr IIおよびHind III消化pFastBacHTa−gp64プラスミドに連結することにより、pFastBacHTa−gp64 HCV NS5A Chimigen(商標)ワクチン(pFastBacHTa−gp64−NS5A−TBD)発現プラスミド(IDAC受入番号111006−04)を生成した。pFastBacHTa−gp64−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号41)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号52)を図4に示す。
pFastBacHTa−gp64へNS5A Chimigen(商標)ワクチンをクローン化するため、プラスミドpFastBacHTa HCVNS5A Chimigen(商標)ワクチン(上記)を、Rsr IIおよびHind IIIで消化し、NS5A Chimigen(商標)ワクチンフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により精製した。NS5A Chimigen(商標)ワクチンフラグメントを、Rsr IIおよびHind III消化pFastBacHTa−gp64プラスミドに連結することにより、pFastBacHTa−gp64 HCV NS5A Chimigen(商標)ワクチン(pFastBacHTa−gp64−NS5A−TBD)発現プラスミド(IDAC受入番号111006−04)を生成した。pFastBacHTa−gp64−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号41)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号52)を図4に示す。
分泌に関するpPSC12−NS5A−TBD Chimigen(商標)ワクチン発現プラスミドの構築
NS5A Chimigen(商標)ワクチン分子の分泌を促進するため、プラスミドpPSC12(Protein Sciences Corporation)へのクローニングを実施した。このプラスミドは、バキュロウイルスのアウトグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)からのキチナーゼ遺伝子に関するシグナルペプチドを有する。4つのPCRプライマーが、目的遺伝子をトランスファーベクターへクローン化するのに必要とされた。2種の特有なプライマー(プライマー1 GTTTCTAACGCGTCGTACTACCATCACCATCAC(配列番号15)および2 CCGGGGTACCTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG(配列番号16))を用いて、目的遺伝子を増幅した。別々の2種のプライマーが、上流多面体プロモーターおよびシグナルペプチド配列を含む、多面体上流領域を増幅するのに必要とされた(プライマー3 CTGGTAGTTCTTCGGAGTGTG(配列番号17)および4 GGTAGTACGACGCGTTAGAAACGGCGACCAAC(配列番号18))。最後に、2種の外側プライマー(プライマー3および2、上記配列)を、不可欠なオーバーラップ伸長PCRで使用した。プライマー4の5'末端にアニーリングする配列を含むプライマー1およびベクターへクローニングするための特有な3'Kpn I部位を付加するプライマー2を用いるPCRにより、NS5A−TBDをpFastBacHTa−NS5A−TBDから増幅した。pPSC12の上流多面体領域を、オーバーラップ伸長PCR中にプライマー1の5'末端にアニーリングさせ得るプライマー4およびプライマー3で増幅した。この上流領域はまた、ベクターへのクローニングに使用される特有なNgoM IV 部位を含む。上流多面体プロモーター、シグナルペプチド配列、および所望の遺伝子を、プライマー2および3を用いるオーバーラップ伸長PCRによりシームレス融合した。完全長融合生成物を、NgoM IVおよびKpn Iで消化し、生じたフラグメントを、同様に消化したpPSC12へ連結することにより、pPSC12−NS5A−TBDを生成した。pPSC12−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号42)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号53)を、図5に示す。
NS5A Chimigen(商標)ワクチン分子の分泌を促進するため、プラスミドpPSC12(Protein Sciences Corporation)へのクローニングを実施した。このプラスミドは、バキュロウイルスのアウトグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)からのキチナーゼ遺伝子に関するシグナルペプチドを有する。4つのPCRプライマーが、目的遺伝子をトランスファーベクターへクローン化するのに必要とされた。2種の特有なプライマー(プライマー1 GTTTCTAACGCGTCGTACTACCATCACCATCAC(配列番号15)および2 CCGGGGTACCTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG(配列番号16))を用いて、目的遺伝子を増幅した。別々の2種のプライマーが、上流多面体プロモーターおよびシグナルペプチド配列を含む、多面体上流領域を増幅するのに必要とされた(プライマー3 CTGGTAGTTCTTCGGAGTGTG(配列番号17)および4 GGTAGTACGACGCGTTAGAAACGGCGACCAAC(配列番号18))。最後に、2種の外側プライマー(プライマー3および2、上記配列)を、不可欠なオーバーラップ伸長PCRで使用した。プライマー4の5'末端にアニーリングする配列を含むプライマー1およびベクターへクローニングするための特有な3'Kpn I部位を付加するプライマー2を用いるPCRにより、NS5A−TBDをpFastBacHTa−NS5A−TBDから増幅した。pPSC12の上流多面体領域を、オーバーラップ伸長PCR中にプライマー1の5'末端にアニーリングさせ得るプライマー4およびプライマー3で増幅した。この上流領域はまた、ベクターへのクローニングに使用される特有なNgoM IV 部位を含む。上流多面体プロモーター、シグナルペプチド配列、および所望の遺伝子を、プライマー2および3を用いるオーバーラップ伸長PCRによりシームレス融合した。完全長融合生成物を、NgoM IVおよびKpn Iで消化し、生じたフラグメントを、同様に消化したpPSC12へ連結することにより、pPSC12−NS5A−TBDを生成した。pPSC12−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号42)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号53)を、図5に示す。
pFastBacHTa HCV NS3 Chimigen(商標)ワクチンプラスミドの構築
以下のプライマーを用いるHCVポリタンパク質のアミノ酸1027〜1652(nt3420〜5294)のプラスミドpCV−H77C鋳型からのPCRにより、NS3をコード化するDNAを調製した。NS3の最終C−末端6アミノ酸はNS3のセリンプロテアーゼ活性に関する標的配列であるため、それらの配列を構築物には含ませなかった。使用した5'末端プライマーは、Eco RI制限部位を含む5'−CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA−3'(配列番号19)であり、3'末端プライマーは、Spe I制限部位を含む5'−CCGGACTAGTCC GGCCGACATGCATGTCATGAT−3'(配列番号20)であった。Eco RIおよびSpe Iによる二重消化による生成物を、プラスミドpFastBacHTa−TBDと連結することにより、pFastBacHTa NS3−TBDを調製した。
以下のプライマーを用いるHCVポリタンパク質のアミノ酸1027〜1652(nt3420〜5294)のプラスミドpCV−H77C鋳型からのPCRにより、NS3をコード化するDNAを調製した。NS3の最終C−末端6アミノ酸はNS3のセリンプロテアーゼ活性に関する標的配列であるため、それらの配列を構築物には含ませなかった。使用した5'末端プライマーは、Eco RI制限部位を含む5'−CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA−3'(配列番号19)であり、3'末端プライマーは、Spe I制限部位を含む5'−CCGGACTAGTCC GGCCGACATGCATGTCATGAT−3'(配列番号20)であった。Eco RIおよびSpe Iによる二重消化による生成物を、プラスミドpFastBacHTa−TBDと連結することにより、pFastBacHTa NS3−TBDを調製した。
pFastBacHTa HCV NS3 Chimigen(商標)ワクチンプラスミドベクターの突然変異導入
細胞性プロテアーゼ(複数も可)により伝達されると思われる、昆虫細胞での発現時におけるNS3タンパク質の内部開裂については、Shoji et al.[(1999)Virology 254:315−323]により報告されており、1488位にアルギニン残基をもたらす。オーバーラップ伸長(OE)PCRを用いて、アミノ酸アルギニンからアラニンへの突然変異を導入することにより、NS3 Chimigen3タンパク質のNS3部分の上記開裂を回避した。2つのNS3 DNAフラグメントを、親pFastBacHTa NS3−TBDプラスミドから調製した。Eco RI制限部位を含むプライマー5'−CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA−3'(配列番号19)および突然変異プライマー(アルギニンからアラニンへの突然変異を含む)5'−CTGCCAGTCCTGCCCGCGCGTTGAGTCCTGGAG−3'(配列番号21)により、5'NS3フラグメントを調製した。3'NS3フラグメントを、5'プライマー5'−GGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCAT−3'(配列番号22)およびSpe I制限部位を含む3'プライマー5'−CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT−3'(配列番号20)により調製した。OE PCRを5'および3'NS3フラグメントに2種の外側プライマーを加えて実施した。Eco RIおよびSpe Iでの二重消化による生成物を、プラスミドpFastBacHTa−TBDと連結することにより、pFastBacHTa NS3mut−TBD(IDAC受入番号111006−05)を調製した。pFastBacHTa NS3mut−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号44)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号55)を図7に示す。タンパク質の推定分子量は98.3KDaである。NS3mut単独の場合、NS3mutフラグメントをEco RIおよびSpe Iでの消化により分離し、pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBacHTa−NS3mutを調製した。
細胞性プロテアーゼ(複数も可)により伝達されると思われる、昆虫細胞での発現時におけるNS3タンパク質の内部開裂については、Shoji et al.[(1999)Virology 254:315−323]により報告されており、1488位にアルギニン残基をもたらす。オーバーラップ伸長(OE)PCRを用いて、アミノ酸アルギニンからアラニンへの突然変異を導入することにより、NS3 Chimigen3タンパク質のNS3部分の上記開裂を回避した。2つのNS3 DNAフラグメントを、親pFastBacHTa NS3−TBDプラスミドから調製した。Eco RI制限部位を含むプライマー5'−CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA−3'(配列番号19)および突然変異プライマー(アルギニンからアラニンへの突然変異を含む)5'−CTGCCAGTCCTGCCCGCGCGTTGAGTCCTGGAG−3'(配列番号21)により、5'NS3フラグメントを調製した。3'NS3フラグメントを、5'プライマー5'−GGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCAT−3'(配列番号22)およびSpe I制限部位を含む3'プライマー5'−CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT−3'(配列番号20)により調製した。OE PCRを5'および3'NS3フラグメントに2種の外側プライマーを加えて実施した。Eco RIおよびSpe Iでの二重消化による生成物を、プラスミドpFastBacHTa−TBDと連結することにより、pFastBacHTa NS3mut−TBD(IDAC受入番号111006−05)を調製した。pFastBacHTa NS3mut−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号44)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号55)を図7に示す。タンパク質の推定分子量は98.3KDaである。NS3mut単独の場合、NS3mutフラグメントをEco RIおよびSpe Iでの消化により分離し、pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBacHTa−NS3mutを調製した。
pFastBacHTa−gp64 HCV NS3mut Chimigen(商標)ワクチンベクタープラスミドの構築
pFastBacHTa HCV NS3mut−TBDプラスミドを、Rsr IIおよびHind III 制限酵素で消化し、NS3mut−TBDフラグメントを、Rsr IIおよび Hind III消化pFastBacHTa−gp64へクローン化することにより、pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBD(受入番号111006−02)を調製した。pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号45)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号56)を図8に示す。タンパク質の推定分子量は、101.5KDaである。また、pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBD(ただし、1つの自然突然変異を欠き、別のものを有する)を作製するのに使用したのと類似した突然変異NS3mut−TBDフラグメントのクローンを、pFastBacHTa−gp64に連結することにより、pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBDの第2クローンを調製した。pFastBacHTa−gp64−NS3−TBDの第2クローンにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号43)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号54)を図6に示す。
pFastBacHTa HCV NS3mut−TBDプラスミドを、Rsr IIおよびHind III 制限酵素で消化し、NS3mut−TBDフラグメントを、Rsr IIおよび Hind III消化pFastBacHTa−gp64へクローン化することにより、pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBD(受入番号111006−02)を調製した。pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号45)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号56)を図8に示す。タンパク質の推定分子量は、101.5KDaである。また、pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBD(ただし、1つの自然突然変異を欠き、別のものを有する)を作製するのに使用したのと類似した突然変異NS3mut−TBDフラグメントのクローンを、pFastBacHTa−gp64に連結することにより、pFastBacHTa−gp64−NS3mut−TBDの第2クローンを調製した。pFastBacHTa−gp64−NS3−TBDの第2クローンにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号43)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号54)を図6に示す。
pFastBacHTa HCV多抗原Chimigen(商標)融合タンパク質発現ベクタープラスミドの構築
HCV多抗原ベクタープラスミドを作製するため、まずNS4B−NS5A配列をクローン化した。NS4B−NS5Aをコード化するDNA配列を、プライマー、5'末端についての5'−GCGCACTAGTGTCTCAGCACTTACCGTACATC−3'(配列番号23)および3'末端についての5'−CGGCGCGGCCGCCCGCAGCACACGACATCTTCCG−5'(配列番号24)を用いるプラスミドpCV−H77CからのPCRにより調製した。これらのプライマーでのPCRにより、5'末端にSpe I部位および3'末端にNot I部位の特有な制限酵素部位をもつ生成物を得た。PCR産物をSpe IおよびNot Iで消化し、Spe IおよびNot I消化pFastBacHTa−gp64に連結することにより、pFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5Aを得た。次に、TBD部分を構築物に付加した。プラスミドpFastBacHTa−TBDおよびpFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5Aを、Spe IおよびHind IIIで消化した。Spe I/Hind III消化TBDフラグメントを分離し、消化されたpFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5Aに連結することにより、pFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5A−TBDを調製した。
HCV多抗原ベクタープラスミドを作製するため、まずNS4B−NS5A配列をクローン化した。NS4B−NS5Aをコード化するDNA配列を、プライマー、5'末端についての5'−GCGCACTAGTGTCTCAGCACTTACCGTACATC−3'(配列番号23)および3'末端についての5'−CGGCGCGGCCGCCCGCAGCACACGACATCTTCCG−5'(配列番号24)を用いるプラスミドpCV−H77CからのPCRにより調製した。これらのプライマーでのPCRにより、5'末端にSpe I部位および3'末端にNot I部位の特有な制限酵素部位をもつ生成物を得た。PCR産物をSpe IおよびNot Iで消化し、Spe IおよびNot I消化pFastBacHTa−gp64に連結することにより、pFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5Aを得た。次に、TBD部分を構築物に付加した。プラスミドpFastBacHTa−TBDおよびpFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5Aを、Spe IおよびHind IIIで消化した。Spe I/Hind III消化TBDフラグメントを分離し、消化されたpFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5Aに連結することにより、pFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5A−TBDを調製した。
NS3活性部位セリン残基の突然変異導入
NS3では、活性部位セリン(ser1165)からアラニンへの突然変異を導入することにより、プロテアーゼ活性を排除した。内側2種および5'および3'末端に相補的なもの2種の4種の異なるプライマーを用いて、鋳型としてのpFastBacHTa−gp64 NS3mut−TBDによるOE PCRにより2つのNS3フラグメントを作製した。制限酵素Eco RI部位を含む、5'末端プライマー(センス)5'CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA−3'(配列番号19)および突然変異プライマー(serからalaへの突然変異を含む)(アンチセンス)5'−CAACAGCGGACCCCCCGCGGAGCCTTTCAAGTAG−3'(配列番号25)を用いて、5'NS3フラグメントを作製した。5'末端プライマー(センス)5'GTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGACACG−3'(配列番号26)および制限酵素Spe I部位を含む、3'末端プライマー(アンチセンス)5'−CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCA−3'(配列番号27)を用いて、3'NS3フラグメントを作製した。5'および3'フラグメントおよび2種の外側プライマーからのOE−OCRにより、完全長NS3(ser1165→ala)を調製した。Arg1488からAlaおよびSer1165からAlaへの突然変異を伴うこの生成物をNS3mutSと呼ぶ。このフラグメントをpFastBacHTa−gp64へクローン化することにより、pFastBacHTa−gp64 NS3mutS−TBD(IDAC受入番号111006−001)を作製した。
NS3では、活性部位セリン(ser1165)からアラニンへの突然変異を導入することにより、プロテアーゼ活性を排除した。内側2種および5'および3'末端に相補的なもの2種の4種の異なるプライマーを用いて、鋳型としてのpFastBacHTa−gp64 NS3mut−TBDによるOE PCRにより2つのNS3フラグメントを作製した。制限酵素Eco RI部位を含む、5'末端プライマー(センス)5'CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA−3'(配列番号19)および突然変異プライマー(serからalaへの突然変異を含む)(アンチセンス)5'−CAACAGCGGACCCCCCGCGGAGCCTTTCAAGTAG−3'(配列番号25)を用いて、5'NS3フラグメントを作製した。5'末端プライマー(センス)5'GTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGACACG−3'(配列番号26)および制限酵素Spe I部位を含む、3'末端プライマー(アンチセンス)5'−CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCA−3'(配列番号27)を用いて、3'NS3フラグメントを作製した。5'および3'フラグメントおよび2種の外側プライマーからのOE−OCRにより、完全長NS3(ser1165→ala)を調製した。Arg1488からAlaおよびSer1165からAlaへの突然変異を伴うこの生成物をNS3mutSと呼ぶ。このフラグメントをpFastBacHTa−gp64へクローン化することにより、pFastBacHTa−gp64 NS3mutS−TBD(IDAC受入番号111006−001)を作製した。
pFastBacHTa−gp64 HCV NS3−NS4B−NS5A 多抗原融合タンパク質ベクタープラスミドの構築
融合タンパク質HCV NS3mutS−NS4B−NS5の発現に使用され得る構築物を作製するため、NS3mutS OE−PCR産物を、制限酵素Eco RIおよびSpe Iで消化した。消化されたNS3mutSを、Eco RIおよびSpe I消化プラスミドpFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5A−TBDへ連結することにより、pFastBacHTa−gp64 HCV多抗原プラスミドである、pFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBD(IDAC受入番号111006−06)を作製した。pFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号46)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号57)を図9に示す。
融合タンパク質HCV NS3mutS−NS4B−NS5の発現に使用され得る構築物を作製するため、NS3mutS OE−PCR産物を、制限酵素Eco RIおよびSpe Iで消化した。消化されたNS3mutSを、Eco RIおよびSpe I消化プラスミドpFastBacHTa−gp64 NS4B−NS5A−TBDへ連結することにより、pFastBacHTa−gp64 HCV多抗原プラスミドである、pFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBD(IDAC受入番号111006−06)を作製した。pFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号46)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号57)を図9に示す。
pFastBacHTa−gp64 HCV NS3−NS5A 多抗原融合タンパク質ベクタープラスミドの構築
HCV NS5AおよびTBDについてのDNAを、鋳型pFastBacHTa−gp64 HCV NS3−NS4B−NS5A−TBDからのPCRにより調製した。Chimigen(商標)ワクチン融合タンパク質発現ベクタープラスミド。PCR用の5'プライマーは、制限酵素Spe Iの認識部位を含む(センス)5'−GAGGGACTAGTGTCCGGTTCCTGGCTAAGGGAC−3'(配列番号28)であった。3'末端についてのPCRプライマーは、(アンチセンス)5'−CCGGTCTAGATTATGATCCTCTAGTACTTCTCGAC−3'(配列番号29)であった。PCR産物(NS5A−TBD)をゲル精製し、それに続いてSpe IおよびHind III制限酵素で消化した。プラスミドpFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBDを、制限酵素Spe IおよびHind IIIで消化すると、HCV NS4B−NS5AおよびTBDをコード化する配列から成るフラグメントが遊離した。生じたpFastBacHTa−gp64 HCV NS3ベクターバックボーンをゲル精製し、NS5A−TBDフラグメントに連結することにより、発現プラスミドpFastBacHTa−gp64 HCV NS3−NS5A Chimigen(商標)ワクチン(pFastBacHTa−gp64−NS3−NS5A−TBD)(IDAC受入番号111006−03)を生成した。pFastBacHTa−gp64−NS3−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号47)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号58)を図10に示す。
HCV NS5AおよびTBDについてのDNAを、鋳型pFastBacHTa−gp64 HCV NS3−NS4B−NS5A−TBDからのPCRにより調製した。Chimigen(商標)ワクチン融合タンパク質発現ベクタープラスミド。PCR用の5'プライマーは、制限酵素Spe Iの認識部位を含む(センス)5'−GAGGGACTAGTGTCCGGTTCCTGGCTAAGGGAC−3'(配列番号28)であった。3'末端についてのPCRプライマーは、(アンチセンス)5'−CCGGTCTAGATTATGATCCTCTAGTACTTCTCGAC−3'(配列番号29)であった。PCR産物(NS5A−TBD)をゲル精製し、それに続いてSpe IおよびHind III制限酵素で消化した。プラスミドpFastBacHTa−gp64 NS3−NS4B−NS5A−TBDを、制限酵素Spe IおよびHind IIIで消化すると、HCV NS4B−NS5AおよびTBDをコード化する配列から成るフラグメントが遊離した。生じたpFastBacHTa−gp64 HCV NS3ベクターバックボーンをゲル精製し、NS5A−TBDフラグメントに連結することにより、発現プラスミドpFastBacHTa−gp64 HCV NS3−NS5A Chimigen(商標)ワクチン(pFastBacHTa−gp64−NS3−NS5A−TBD)(IDAC受入番号111006−03)を生成した。pFastBacHTa−gp64−NS3−NS5A−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号47)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号58)を図10に示す。
pFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBD融合タンパク質プラスミドおよびpFastBacHTa HCVコア(1−177)の構築
HCVポリタンパク質のアミノ酸1−177(nt342−872)をコード化するHCVコアDNA配列を、pCV−H77Cからの5'プライマー CGGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC(配列番号30)および3'プライマー GGACTAGTCCGAAGATAGAGAAAGAGC(配列番号31)でのPCRにより増幅した。使用したプライマーは、特有な5'EcoR Iおよび3'Spe I部位を付加した。PCR産物をEcoRIおよびSpeIで消化し、pFastBacHTa−TBDおよびpFastBac−HTaに連結することにより、Chimigen(商標)ワクチン構築物pFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBDおよびpFastBacHTa HCVコア(1−177)をそれぞれ調製した。pFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号48)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号59)を図11に示す。
HCVポリタンパク質のアミノ酸1−177(nt342−872)をコード化するHCVコアDNA配列を、pCV−H77Cからの5'プライマー CGGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC(配列番号30)および3'プライマー GGACTAGTCCGAAGATAGAGAAAGAGC(配列番号31)でのPCRにより増幅した。使用したプライマーは、特有な5'EcoR Iおよび3'Spe I部位を付加した。PCR産物をEcoRIおよびSpeIで消化し、pFastBacHTa−TBDおよびpFastBac−HTaに連結することにより、Chimigen(商標)ワクチン構築物pFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBDおよびpFastBacHTa HCVコア(1−177)をそれぞれ調製した。pFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号48)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号59)を図11に示す。
HCVコア(1−177)を、pFastBacHTa−gp64およびpPSC12へクローン化することにより、タンパク質を分泌形態で製造した。pFastBacHTa−gp64へクローニングするため、HCVコア(1−177)−TBDフラグメントを、Rsr IIおよびHind III消化によりpFastBacHTa HCVコア(1−177)−TBDから分離し、同様に消化されたpFastBacHTa−gp64へクローン化することにより、pFastBacHTa−gp64HCVコア(1−177)−TBDを生成した。
pPSC12へのクローン化については、プライマー2が特有な3'Bgl II部位(AGTAAGATCTTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGA;配列番号32)をコード化すること以外、NS5A−TBDについて記載したのと類似したスキームを使用した。生成した構築物は、pPSC12−HCVコア(1−177)−TBDである。
pFastBacHTa HCV E1−TBD融合タンパク質プラスミドおよびpFastBacHTa−E1の構築
HCVポリタンパク質のアミノ酸192−369(914−1452)をコード化するDNA配列を、特有な5'EcoRI部位および特有な3'Spe I部位を加える5'プライマーCCGGAATTCTACCAAGTGCGCAATTCCT(配列番号33)および3'プライマーGCGCACTAGTCCCTTCGCCCAGTTCCCCACC(配列番号34)でpCV−H77Cから増幅した。全E1読み取り枠はアミノ酸383で終わるが、アミノ酸370および383間の領域は、E2についてのシグナル配列であるため、増幅されなかった。PCR産物をEcoRIおよびSpeIで消化し、同様に消化したpFastBacHTa−TBDへ連結することにより、HCV E1 Chimigen(商標)構築物pFastBacHTa−E1−TBDを生成した。E1を単独で発現するため、消化したPCR産物を、EcoRIおよびSpeI消化pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBacHTa−E1を生成した。pFastBacHTa−E1−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号49)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号60)を図12に示す。
HCVポリタンパク質のアミノ酸192−369(914−1452)をコード化するDNA配列を、特有な5'EcoRI部位および特有な3'Spe I部位を加える5'プライマーCCGGAATTCTACCAAGTGCGCAATTCCT(配列番号33)および3'プライマーGCGCACTAGTCCCTTCGCCCAGTTCCCCACC(配列番号34)でpCV−H77Cから増幅した。全E1読み取り枠はアミノ酸383で終わるが、アミノ酸370および383間の領域は、E2についてのシグナル配列であるため、増幅されなかった。PCR産物をEcoRIおよびSpeIで消化し、同様に消化したpFastBacHTa−TBDへ連結することにより、HCV E1 Chimigen(商標)構築物pFastBacHTa−E1−TBDを生成した。E1を単独で発現するため、消化したPCR産物を、EcoRIおよびSpeI消化pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBacHTa−E1を生成した。pFastBacHTa−E1−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号49)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号60)を図12に示す。
pFastBacHTa E2−TBD融合タンパク質プラスミドおよびpFastBacHTa−E2の構築
アミノ酸384〜718(HCVポリタンパク質のnt1494〜2495)のE2配列を、特有な5'SpeI部位および特有な3'NotI部位を付加する5'プライマーGCGCACTAGTCACCCACGTCACCGGGGGAAATG(配列番号35)および3'プライマーGCGCGCGGCCGCCCGTACTCCCACTTAATGGC(配列番号36)を用いてpCV−H77CからPCRにより増幅した。アミノ酸719〜746は、p7についてのシグナル配列であるため、構築物には含まれなかった。PCR産物をSpeIおよびNotIで消化し、同様に消化したpFastBacHTa−TBDへ連結することにより、HCV E2 Chimigen(商標)構築物pFastBacHTa E2−TBDを生成した。また、E2タンパク質を単独で発現させるため、消化したE2を、pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBacHTa−E2を生成した。pFastBacHTa E2−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号50)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号61)を図13に示す。
アミノ酸384〜718(HCVポリタンパク質のnt1494〜2495)のE2配列を、特有な5'SpeI部位および特有な3'NotI部位を付加する5'プライマーGCGCACTAGTCACCCACGTCACCGGGGGAAATG(配列番号35)および3'プライマーGCGCGCGGCCGCCCGTACTCCCACTTAATGGC(配列番号36)を用いてpCV−H77CからPCRにより増幅した。アミノ酸719〜746は、p7についてのシグナル配列であるため、構築物には含まれなかった。PCR産物をSpeIおよびNotIで消化し、同様に消化したpFastBacHTa−TBDへ連結することにより、HCV E2 Chimigen(商標)構築物pFastBacHTa E2−TBDを生成した。また、E2タンパク質を単独で発現させるため、消化したE2を、pFastBac−HTaへクローン化することにより、pFastBacHTa−E2を生成した。pFastBacHTa E2−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号50)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号61)を図13に示す。
pFastBacHTa−E1−E2−TBD融合タンパク質プラスミドおよびpFastBacHTa−E1−E2の構築
pFastBacHTa−E1におけるE1配列をpFastBacHTa−E2へサブクローニングすることにより、E1およびE2タンパク質の融合体を調製した。pFastBacHTa−E1プラスミドを、EcoRIおよびSpeIで消化し、フラグメントをEcoRIおよびSpeI消化pFastBacHTa−E2へクローン化することにより、pFastBacHTa−E1−E2を調製した。E1−E2 Chimigen(商標)構築物を作製するため、pFastBacHTa−E1−E2を、EcoRIおよびNotIで消化し、同様に消化したpFastBacHTa−TBDへクローン化することにより、pFastBacHTa−E1−E2−TBDを調製した。pFastBacHTa−E1−E2−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号51)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号62)を図14に示す。
pFastBacHTa−E1におけるE1配列をpFastBacHTa−E2へサブクローニングすることにより、E1およびE2タンパク質の融合体を調製した。pFastBacHTa−E1プラスミドを、EcoRIおよびSpeIで消化し、フラグメントをEcoRIおよびSpeI消化pFastBacHTa−E2へクローン化することにより、pFastBacHTa−E1−E2を調製した。E1−E2 Chimigen(商標)構築物を作製するため、pFastBacHTa−E1−E2を、EcoRIおよびNotIで消化し、同様に消化したpFastBacHTa−TBDへクローン化することにより、pFastBacHTa−E1−E2−TBDを調製した。pFastBacHTa−E1−E2−TBDにおけるORFのヌクレオチド配列(配列番号51)およびORFによりコード化されたアミノ酸配列(配列番号62)を図14に示す。
Bac-to-Bac(登録商標)発現系における組換えバキュロウイルスの製造
エシェリキア・コリ(E.coli)の形質転換
連結させたプラスミドを用いて、エシェリキア・コリ(E.coli)DH5αを形質転換し、プラスミドを標準プロトコルにより分離した。配列および読み取り枠を配列決定により立証し、組換えバキュロウイルスの製造に使用した。
エシェリキア・コリ(E.coli)の形質転換
連結させたプラスミドを用いて、エシェリキア・コリ(E.coli)DH5αを形質転換し、プラスミドを標準プロトコルにより分離した。配列および読み取り枠を配列決定により立証し、組換えバキュロウイルスの製造に使用した。
転位
組換え体の作製は、細菌性トランスポゾンTn7による部位特異的転位を用いるBac-to-Bac(登録商標)クローニング系(Invitrogen)に基づく。これをエシェリキア・コリ(E.coli)株DH10Bacで遂行する。DH10Bac細胞は、カナマイシン耐性を付与するバクミドpMON14272、およびトランスポザーゼをコード化し、テトラサイクリン耐性を付与するヘルパープラスミド(pMON7124)を含む。
組換え体の作製は、細菌性トランスポゾンTn7による部位特異的転位を用いるBac-to-Bac(登録商標)クローニング系(Invitrogen)に基づく。これをエシェリキア・コリ(E.coli)株DH10Bacで遂行する。DH10Bac細胞は、カナマイシン耐性を付与するバクミドpMON14272、およびトランスポザーゼをコード化し、テトラサイクリン耐性を付与するヘルパープラスミド(pMON7124)を含む。
クローニング部位の両端に隣接するミニTn7エレメントを有するpFastBacプラスミドへ目的遺伝子をクローン化する。LacZα遺伝子内にTn7の付着部位を含むバキュロウイルスシャトルプラスミド(バクミド)を有する、エシェリキア・コリ(E.coli)株DH10Bacへプラスミドを形質転換する。この転位により、LacZα遺伝子が破壊されるため、組換え体のみが白色コロニーを生じることから、容易に選択される。
エシェリキア・コリ(E.coli)での転位を用いる利点は、単一コロニーが組換え体のみを含むことである。標準プラスミド分離プロトコルを用いて組換えバクミドを分離し、昆虫細胞でのトランスフェクションに使用することにより、組換えタンパク質を発現するバキュロウイルスを作製する。
ドナープラスミドおよびpFastBacHTa−gp64 Chimigen(商標)ワクチンベクターを、バキュロウイルスシャトルベクター(バクミド)へのクローン化遺伝子の部位特異的転位に使用した。目的遺伝子を伴う組換えpFastBacHTa−gp64プラスミドを、転位用のDH10Bac細胞へ形質転換することにより、組換えバクミドを調製した。40μLアリコートの形質転換能DH10Bac細胞を氷上で解凍し、pFastBacHTa−gp64に基づくプラスミドを加え、電気穿孔により形質転換を遂行した。形質転換混合物を1mLのSOC培地に加え、4時間37℃でインキュベーションした。形質転換細胞をLBで10−1および10−2に系列希釈し、各希釈液100μLを、カナマイシン(50μg/mL)、ゲンタマイシン(7μg/mL)、テトラサイクリン(10μg/mL)、X−gal(200μg/mL)およびIPTG(40μg/mL)を補ったLB寒天プレートで培養し、少なくとも36時間37℃でインキュベーションした。
ゲンタマイシン耐性は、pFastBacHTa−gp64プラスミドにより付与され、X−galおよびIPTGは、白色コロニー(組換えバクミド)と青色コロニー(非組換え体)間を区別するのに使用された。白色コロニーを採取し、カナマイシン(50μg/mL)、ゲンタマイシン(7μg/mL)、およびテトラサイクリン(10μg/mL)を補ったLB2mLに接種し、振とうしながら37℃で一晩インキュベーションした。滅菌ループを用いて、少量の一晩培養物の試料を採取し、カナマイシン(50μg/mL)、ゲンタマイシン(7μg/mL)、テトラサイクリン(10μg/mL)、X−gal(100μg/mL)およびIPTG(40μg/mL)を補った新鮮なLB寒天プレートへ線状に接種し、少なくとも36時間37℃でインキュベーションし、白色表現型を確認した。
組換えバクミドを標準プロトコル[Sambrook et al.(2001)In Molecular Cloning、A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー・プレス]により単離し、DNA試料を40μLのTE(10mMのトリス−HCl、pH8、1mMのEDTA)に溶かし、トランスフェクションに使用した。
トランスフェクション:組換えバキュロウイルスの作製
組換えバキュロウイルスを作製するため、適切なバクミドをSf9昆虫細胞にトランスフェクションした。Sf9細胞(9×105)を、2mLのESF921中の6ウェル細胞培養皿(35mmウェル)の各ウェルに播種し、少なくとも1時間27℃で付着させた。Sf9細胞の供給者が提供したプロトコルにより、Cellfectin(商標)試薬を用いて、トランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、細胞を27℃で72時間インキュベーションした。バキュロウイルスを含む培地を集め、暗所中4℃で貯蔵した。
組換えバキュロウイルスを作製するため、適切なバクミドをSf9昆虫細胞にトランスフェクションした。Sf9細胞(9×105)を、2mLのESF921中の6ウェル細胞培養皿(35mmウェル)の各ウェルに播種し、少なくとも1時間27℃で付着させた。Sf9細胞の供給者が提供したプロトコルにより、Cellfectin(商標)試薬を用いて、トランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、細胞を27℃で72時間インキュベーションした。バキュロウイルスを含む培地を集め、暗所中4℃で貯蔵した。
バキュロウイルスDNAの生成についてチェックすることにより、トランスフェクションの有効性を証明した。単離したバキュロウイルスDNAを、PCRにかけ、挿入した目的遺伝子についてスクリーニングした。SDS−PAGEおよびプローブとして6xHis標識−HRPコンジュゲートモノクローナル抗体または抗マウスIgG(Fc特異的)ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いるウエスタン・ブロッティングにより、細胞における異種タンパク質の発現を証明した。
組換えバキュロウイルスストックの増幅
バキュロウイルスの生成および所望のタンパク質の発現が確認されると、ウイルス濃度を増幅することにより、興味の対象である遺伝子をもつバキュロウイルスの濃縮ストックを製造した。本明細書記載の全プロトコルでは、少なくとも2回バキュロウイルスを増幅する標準的実践法に従った。第2ラウンドの増幅後、生成したバキュロウイルスの濃度を、バキュロウイルスタイトレーションアッセイ(Expression Systems)を用いて定量した。Sf9細胞を感染させるのに最も適切なウイルス濃度および目的タンパク質の最適な生成時間についても確立された。Sf9細胞の単層および懸濁培養物の両方に関する発現についてのプロトコルを、標準手順にしたがって展開した。
バキュロウイルスの生成および所望のタンパク質の発現が確認されると、ウイルス濃度を増幅することにより、興味の対象である遺伝子をもつバキュロウイルスの濃縮ストックを製造した。本明細書記載の全プロトコルでは、少なくとも2回バキュロウイルスを増幅する標準的実践法に従った。第2ラウンドの増幅後、生成したバキュロウイルスの濃度を、バキュロウイルスタイトレーションアッセイ(Expression Systems)を用いて定量した。Sf9細胞を感染させるのに最も適切なウイルス濃度および目的タンパク質の最適な生成時間についても確立された。Sf9細胞の単層および懸濁培養物の両方に関する発現についてのプロトコルを、標準手順にしたがって展開した。
バキュロウイルスタイトレーションアッセイ
Expression Systems バキュロウイルスタイトレーションアッセイを用いて、全ウイルスストックをタイトレーションする。ウイルスストックを10−1から10−4まで系列希釈した。各希釈試料の100μLアリコートを、Costar Low Attachment3 96ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、2×106細胞/mLの濃度で、100μLのSf9細胞を各ウェルに加え、プレートを27℃で18時間、200〜250rpmでのオービタル振とうインキュベーター中においてインキュベーションした。
Expression Systems バキュロウイルスタイトレーションアッセイを用いて、全ウイルスストックをタイトレーションする。ウイルスストックを10−1から10−4まで系列希釈した。各希釈試料の100μLアリコートを、Costar Low Attachment3 96ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、2×106細胞/mLの濃度で、100μLのSf9細胞を各ウェルに加え、プレートを27℃で18時間、200〜250rpmでのオービタル振とうインキュベーター中においてインキュベーションした。
インキュベーション後、gp64−PEコンジュゲート抗体を、1:200に希釈し、イソタイプ対照(IgG2A−PE)を1:10に希釈した。プレートを、3分間1800rpmでの遠心分離にかけた。培地をプレートの転置により除去し、50μLのgp64−PEコンジュゲート抗体または50μLのイソタイプ対照をウェルに加えた。次いで、プレートを暗所中4℃で20分間インキュベーションした。
150μLの冷PBSを各ウェルに加え、上記要領でプレートを遠心分離にかけることにより、細胞を洗浄した。次に、200μLの冷PBSを各ウェルに加え、もう一度スピンさせ、最後に200μLのPBS/0.1%BSAを各ウェルに加えて細胞を再懸濁し、分析用のFACS管へ移した。イソタイプ対照を用いて、蛍光フローサイトメーターにおけるゲートを設定した。提供された Excel スプレッドシートへ発現について陽性である細胞集団のパーセンテージを挿入し、対照ウイルスに基づいて標準曲線を作成することにより、ウイルス力価を測定した。
タンパク質発現の最適化
Chimigen(商標)タンパク質発現を、ある一定範囲のMOIおよび時間にわたって最適化した。ESF921中のSf9細胞の4×50mL培養物を、2×106細胞/mLで播種し、0.5、1、5および10のMOIで感染させ、感染後様々な時点で1mLの培養物を採取した。試料採取した培養物を、1分間12000×gでの遠心分離にかけ、上清および細胞を分離した。細胞および上清を、SDS−PAGE分析用にその場で調製した。細胞を500μLのPBSに再懸濁し、150μLの懸濁液を40μLの5×ローディング緩衝液および10μLの20×還元剤に加えた。また、150μLの上清を、40μLの5×ローディング緩衝液および10μLの20×還元剤と混合した。試料を5分間沸騰させ、ウエスタン・ブロット分析用に12%SDS−PAGEゲルへローディングした。タンパク質生産を評価したところ、NS5A Chimigen(商標)タンパク質については36時間および0.5のMOIで最良であり、NS3 Chimigen(商標)タンパク質については48時間および2のMOIで最良であり、多抗原Chimigen(商標)タンパク質については36時間および1.5のMOIで最良であった。
Chimigen(商標)タンパク質発現を、ある一定範囲のMOIおよび時間にわたって最適化した。ESF921中のSf9細胞の4×50mL培養物を、2×106細胞/mLで播種し、0.5、1、5および10のMOIで感染させ、感染後様々な時点で1mLの培養物を採取した。試料採取した培養物を、1分間12000×gでの遠心分離にかけ、上清および細胞を分離した。細胞および上清を、SDS−PAGE分析用にその場で調製した。細胞を500μLのPBSに再懸濁し、150μLの懸濁液を40μLの5×ローディング緩衝液および10μLの20×還元剤に加えた。また、150μLの上清を、40μLの5×ローディング緩衝液および10μLの20×還元剤と混合した。試料を5分間沸騰させ、ウエスタン・ブロット分析用に12%SDS−PAGEゲルへローディングした。タンパク質生産を評価したところ、NS5A Chimigen(商標)タンパク質については36時間および0.5のMOIで最良であり、NS3 Chimigen(商標)タンパク質については48時間および2のMOIで最良であり、多抗原Chimigen(商標)タンパク質については36時間および1.5のMOIで最良であった。
細胞内Chimigen(商標)ワクチンの精製
NS5A Chimigen(商標)タンパク質の大規模発現および細胞ライゼートの調製
ESF921培地中〜2×106細胞/mlの密度で、5リットルのSf9細胞培養物を、0.5のMOIでバキュロウイルスにより感染させた。細胞生存能が〜95%である感染開始の〜36時間後、細胞を採取した。発現時間が長いとき、細胞生存能の損失は増大し、NS5A Chimigen(商標)タンパク質の分解は激しくなる。感染細胞を遠心分離により集め、使用時まで−80℃で貯蔵した。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質の大規模発現および細胞ライゼートの調製
ESF921培地中〜2×106細胞/mlの密度で、5リットルのSf9細胞培養物を、0.5のMOIでバキュロウイルスにより感染させた。細胞生存能が〜95%である感染開始の〜36時間後、細胞を採取した。発現時間が長いとき、細胞生存能の損失は増大し、NS5A Chimigen(商標)タンパク質の分解は激しくなる。感染細胞を遠心分離により集め、使用時まで−80℃で貯蔵した。
1L感染細胞培養物からの冷凍ペレットを、高濃度のTween 20(6MのGuHCl、50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1%Tween 20、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.0)を含む200mlの溶菌緩衝液中、氷上で渦状に混合することにより、迅速に再懸濁した。高濃度のTween20が、Ni−NTA樹脂へのNS5A Chimigen(商標)タンパク質の有効な結合には必要であった。再懸濁した懸濁液を、3×1分間各音波処理パルス間は2分間隔として、氷上で音波処理した。次いで、音波処理したライゼートを室温で2時間攪拌した。攪拌したライゼートを遠心分離(〜27000×g、15分間、10℃)により澄明にし、上清をNi−NTAスーパーフローでのアフィニティー・クロマトグラフィーに使用した。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質の発現および細胞ライゼートの調製
標準化感染多重度(MOI)のHCV NS3 Chimigen(商標)タンパク質をコード化する組換えバキュロウイルスを用いて、細胞発現用にSf9細胞を感染させた。Sf9細胞を、2Lのエルレンマイヤーフラスコ中のESF921培地500mL中、6×105細胞/mLの密度で播種した。細胞密度が2〜3×106細胞/mLに達するまで、細胞培養物を120rpmで振とうしながら27.5℃でインキュベーションした。HCV NS3 Chimigen(商標)タンパク質については、細胞を48時間2のMOIで感染させた。細胞ライゼートでのウエスタン・ブロット分析を実施して、興味の対象であるタンパク質の発現をモニターした。4℃で10分間、3000rpmでの遠心分離(1593×g、JA10、Beckman Coulter Avanti(商標)J 25)により細胞を採取し、新鮮な細胞ペレットを組換えタンパク質の精製に使用した。別法として、細胞ペレットを条件培地により再懸濁し、50mLの円錐管(各管には250mLの細胞培養物)へ分配し、Beckman GS-6R 遠心分離機中4℃で8分間、2200rpmでスピンさせた。細胞ペレットを液体窒素中急速冷凍し、−80℃で貯蔵した。
標準化感染多重度(MOI)のHCV NS3 Chimigen(商標)タンパク質をコード化する組換えバキュロウイルスを用いて、細胞発現用にSf9細胞を感染させた。Sf9細胞を、2Lのエルレンマイヤーフラスコ中のESF921培地500mL中、6×105細胞/mLの密度で播種した。細胞密度が2〜3×106細胞/mLに達するまで、細胞培養物を120rpmで振とうしながら27.5℃でインキュベーションした。HCV NS3 Chimigen(商標)タンパク質については、細胞を48時間2のMOIで感染させた。細胞ライゼートでのウエスタン・ブロット分析を実施して、興味の対象であるタンパク質の発現をモニターした。4℃で10分間、3000rpmでの遠心分離(1593×g、JA10、Beckman Coulter Avanti(商標)J 25)により細胞を採取し、新鮮な細胞ペレットを組換えタンパク質の精製に使用した。別法として、細胞ペレットを条件培地により再懸濁し、50mLの円錐管(各管には250mLの細胞培養物)へ分配し、Beckman GS-6R 遠心分離機中4℃で8分間、2200rpmでスピンさせた。細胞ペレットを液体窒素中急速冷凍し、−80℃で貯蔵した。
冷凍した細胞ペレット(均等内容の2×500mLの細胞培養培地)を、78W(6.5に設定)で1分間音波処理により氷冷溶菌緩衝液(6MのGuHCl、150mMのNaCl、20mMのトリス−HCl、pH8.00)200mLに氷上で再懸濁した。混合物を250mLのガラス製ビーカーに移し、5分の冷却中断期間をおいて、1分間毎回78Wでさらに4回音波処理した。混合物を室温に戻し、CTABを1%(w/v)の最終濃度となるように加えた。pHをチェックし、pH8.00に調節し、ライゼートを2時間インキュベーションした。Beckman Avanti J−25遠心分離機中JA25.50ローターを用いて、ライゼートを10℃で30分間、15000rpm(27000×g)での遠心分離にかけ、上清をNi−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
多抗原Chimigen(商標)タンパク質の大規模発現および細胞ライゼートの調製
4リットルのESF921培地を、セルバッグ(Cellbag)中に移し入れ、Wave Bioreactor System2/10EH において27.5℃まで温めた。6×106細胞/mLのSf9細胞培養物1リットルをセルバッグに加えた。次いで、1分間に0.3Lの空気を注入しながら、バッグを27.5℃でインキュベーションし、130rpmで振動させた。細胞密度が2×106細胞/mlに達したとき、組換えバキュロウイルスを1.5のMOIで接種した。感染の36時間後、バッグを氷上で冷却し、4℃で10分間、4500×gでの遠心分離により細胞を採取した。細胞ペレットを氷冷PBSに懸濁し、次いで50mL円錐管に移し入れた(1管当たり300mL培養物からのペレット)。細胞ペレットを4℃で15分間、2800×gでの遠心分離により回収した。ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、使用時まで−80℃冷凍庫中で貯蔵した。
4リットルのESF921培地を、セルバッグ(Cellbag)中に移し入れ、Wave Bioreactor System2/10EH において27.5℃まで温めた。6×106細胞/mLのSf9細胞培養物1リットルをセルバッグに加えた。次いで、1分間に0.3Lの空気を注入しながら、バッグを27.5℃でインキュベーションし、130rpmで振動させた。細胞密度が2×106細胞/mlに達したとき、組換えバキュロウイルスを1.5のMOIで接種した。感染の36時間後、バッグを氷上で冷却し、4℃で10分間、4500×gでの遠心分離により細胞を採取した。細胞ペレットを氷冷PBSに懸濁し、次いで50mL円錐管に移し入れた(1管当たり300mL培養物からのペレット)。細胞ペレットを4℃で15分間、2800×gでの遠心分離により回収した。ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、使用時まで−80℃冷凍庫中で貯蔵した。
250ml培養物からの冷凍Sf9細胞ペレットを、20mlの1XPBS、1%Tween 20、50mMのDTT、5mMのEDTA、pH8.0に懸濁し、氷上で30分間インキュベーションした。ライゼートのpHをNaOHによりpH12.0に調節し、室温で30分間攪拌した。pHをHClにより8.0まで下げ、30分間39191×gで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを20mlの1XPBS、1%Tween 20、10mMのDTT、1mMのEDTA、pH8.0に懸濁した。上記要領で、pHを12.0まで上昇させ、8.0まで低下させた。上清をプールし、サイズ排除および疎水性相互作用クロマトグラフィーで使用するため、20mMのトリス、0.05%Tween 20、0.1mMのEDTA、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.0に対して透析した。
Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーについては、500ml培養物からの冷凍Sf9細胞ペレットを、50mLの氷冷溶菌緩衝液(6Mのグアニジン−HCl、50mMの炭酸ナトリウム、20%のエタノール、pH10)に懸濁した。細胞ライゼートを、80Wで1分間、Sonicator 3000(Misonic Inc.)により氷上で5回音波処理した。Tween 20をライゼートに加え(最終濃度1%)、ライゼートを室温で2時間攪拌した。ライゼート中の不溶性粒子を、4℃で30分間、39191×gでの遠心分離により除去し、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
HCV コアChimigen(商標)タンパク質の発現および細胞ライゼートの調製
HCVコアChimigen(商標)を2つの系で発現させた。Sf9細胞におけるpPSC12−HCVコア(1−177)−TBDおよび線状バキュロウイルスゲノムのコ-トランスフェクションにより、組換えウイルスを作製し、プラーク精製し、増幅した。最適化後、Sf9培養物を5のMOIで感染させ、27.5℃で50時間のインキュベーション後に採取した。また、Bac-to-Bac(登録商標)系を用いて、pFastBacHTa−gp64 HCVコア(1−177)−TBDによるエシェリキア・コリ(E.coli)DH10Bac細胞のトランスフェクションにより組換えウイルスを作製した。組換えバクミドを単離し、これを用いてSf9細胞をトランスフェクションすることにより、組換えバキュロウイルスを作製した。Sf9培養物を、27.5℃で49時間、5のMOIで感染させた後、遠心分離により採取した。本質的に他のChimigen(商標)タンパク質について記載したのと同じ方法でライゼートを調製し、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
HCVコアChimigen(商標)を2つの系で発現させた。Sf9細胞におけるpPSC12−HCVコア(1−177)−TBDおよび線状バキュロウイルスゲノムのコ-トランスフェクションにより、組換えウイルスを作製し、プラーク精製し、増幅した。最適化後、Sf9培養物を5のMOIで感染させ、27.5℃で50時間のインキュベーション後に採取した。また、Bac-to-Bac(登録商標)系を用いて、pFastBacHTa−gp64 HCVコア(1−177)−TBDによるエシェリキア・コリ(E.coli)DH10Bac細胞のトランスフェクションにより組換えウイルスを作製した。組換えバクミドを単離し、これを用いてSf9細胞をトランスフェクションすることにより、組換えバキュロウイルスを作製した。Sf9培養物を、27.5℃で49時間、5のMOIで感染させた後、遠心分離により採取した。本質的に他のChimigen(商標)タンパク質について記載したのと同じ方法でライゼートを調製し、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにかけた。
Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィー
細胞ライゼートを、10ベッド容量の溶菌緩衝液で平衡させておいたNi−NTAスーパーフローカラム(細胞培養ペレット2.5Lにつき10mlの樹脂ベッド容量)にローディングした。低%のTween 20(6MのGuHCl、50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、0.1%Tween 20、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.0)を含む洗浄緩衝液で、カラムをA280<0.01となるまで洗浄し、次いで、15mMのイミダゾールを含む同じ洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、標的タンパク質を、1ベッド容量フラクション中、10mlベッド容量の溶離緩衝液(6MのGuHCl、50mMのNaH2PO4、250mMのイミダゾール、0.1%Tween 20、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.0)で溶離した。溶離したタンパク質を含むフラクションをプールし、透析緩衝液3×4L(8Mの尿素、20mMのトリス、0.1%のTween 20、25mMのエチレンジアミン、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.5)に対して透析した。尿素含有緩衝液を全て脱イオン化尿素で調製することにより、タンパク質のカルバミル化を阻止した。尿素をAmberlite(商標)MB−1(Supelco、米国ペンシルベニア)(10g/L/時)で脱イオン化し、シアン酸スカベンジャーのエチレンジアミンを緩衝液に加えた(25mM最終濃度)。
細胞ライゼートを、10ベッド容量の溶菌緩衝液で平衡させておいたNi−NTAスーパーフローカラム(細胞培養ペレット2.5Lにつき10mlの樹脂ベッド容量)にローディングした。低%のTween 20(6MのGuHCl、50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、0.1%Tween 20、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.0)を含む洗浄緩衝液で、カラムをA280<0.01となるまで洗浄し、次いで、15mMのイミダゾールを含む同じ洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、標的タンパク質を、1ベッド容量フラクション中、10mlベッド容量の溶離緩衝液(6MのGuHCl、50mMのNaH2PO4、250mMのイミダゾール、0.1%Tween 20、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.0)で溶離した。溶離したタンパク質を含むフラクションをプールし、透析緩衝液3×4L(8Mの尿素、20mMのトリス、0.1%のTween 20、25mMのエチレンジアミン、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.5)に対して透析した。尿素含有緩衝液を全て脱イオン化尿素で調製することにより、タンパク質のカルバミル化を阻止した。尿素をAmberlite(商標)MB−1(Supelco、米国ペンシルベニア)(10g/L/時)で脱イオン化し、シアン酸スカベンジャーのエチレンジアミンを緩衝液に加えた(25mM最終濃度)。
イオン交換クロマトグラフィー
次に、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにより得た透析NS5A Chimigen3タンパク質含有試料を、透析緩衝液で平衡させておいたToyopearl(商標)Super Q3樹脂カラム(2.5mlベッド容量/2.5L細胞培養物ペレット)に通した。イオン交換カラムを、A280<0.01となるまでイオン交換洗浄緩衝液(8Mの尿素、20mMのトリス、0.05%のTween 20、25mMのエチレンジアミン、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.5)で洗浄した。次いで、タンパク質が、増加濃度の塩(75mM、150mMおよび500mMのNaCl)を含む洗浄緩衝液10ベッド容量を有するカラムから溶離された。1ベッド容量フラクションを集めた。NS5A Chimigen(商標)タンパク質が、主として150mMのNaClフラクションで溶出した。僅かに低いMWの汚染タンパク質が75mMのNaClで溶離した。溶離したタンパク質フラクションをプールし、4℃で最終透析緩衝液(150mMのNaCl、10mMのNaH2PO4、0.05%のTween 20、pH8.5)に対して直ちに透析した。透析1回当たり2L、透析緩衝液を5回交換した。タンパク質が付着するのを阻止するため予め湿らせておいた0.2μmフィルターで、透析タンパク質を濾過した。精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質を4℃で貯蔵した。
次に、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにより得た透析NS5A Chimigen3タンパク質含有試料を、透析緩衝液で平衡させておいたToyopearl(商標)Super Q3樹脂カラム(2.5mlベッド容量/2.5L細胞培養物ペレット)に通した。イオン交換カラムを、A280<0.01となるまでイオン交換洗浄緩衝液(8Mの尿素、20mMのトリス、0.05%のTween 20、25mMのエチレンジアミン、10mMの9−メルカプトエタノール、pH8.5)で洗浄した。次いで、タンパク質が、増加濃度の塩(75mM、150mMおよび500mMのNaCl)を含む洗浄緩衝液10ベッド容量を有するカラムから溶離された。1ベッド容量フラクションを集めた。NS5A Chimigen(商標)タンパク質が、主として150mMのNaClフラクションで溶出した。僅かに低いMWの汚染タンパク質が75mMのNaClで溶離した。溶離したタンパク質フラクションをプールし、4℃で最終透析緩衝液(150mMのNaCl、10mMのNaH2PO4、0.05%のTween 20、pH8.5)に対して直ちに透析した。透析1回当たり2L、透析緩衝液を5回交換した。タンパク質が付着するのを阻止するため予め湿らせておいた0.2μmフィルターで、透析タンパク質を濾過した。精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質を4℃で貯蔵した。
NS3 Chimigen3 タンパク質をさらに精製するため、CM−Sepharose3 Fast Flowマトリックスを、8Mの尿素(脱イオン化)、25mMのNaH2PO4、5mMのエチレンジアミン、0.05%(v/v)のTween 20、10mMのDTT、pH6.50により平衡状態にした。同緩衝液中、1mL/分の流速で直線勾配(0〜0.6M)の塩化ナトリウムを用いて、タンパク質を溶離させた。タンパク質含有フラクション(25〜50mMのNaCl)をプールした。
Ni−NTAカラムにより捕捉された多抗原Chimigen3 タンパク質含有試料を、AKTAexplorer3 100FPLCシステムを用いてHiTrap3 QXL1mlカラムによりさらに精製した。Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィーからの溶離緩衝液中のタンパク質を、Amicon Ultra-15(MWCO3000Da)により濃縮し、次いで緩衝液を、バファーA(8Mの尿素、50mMの炭酸ナトリウム、25mMのエチレンジアミン、1%のTween 20、pH10)に交換した。タンパク質を、60mL/時の流速で、50mlのバファーAにより平衡させておいた、HiTrap Q(商標)XLカラムにローディングした。溶離のA280が0.01未満になるまで、カラムをバファーAで洗浄した。タンパク質が、20カラム容量中、100%バファーAから100%バファーB(バファーAに1M塩化ナトリウムを含む)への、直線勾配溶離により溶離された。HCV多抗原 Chimigen(商標)タンパク質が、フロー・スルーフラクション中、および40から50%間のバファーBに溶出したフラクション中で溶離された。
サイズ排除クロマトグラフィー
Superdex3 200調製用を、AKTAexplorer 100FPLCシステム(GEヘルスケア)を用いて3MPaの圧力下でTricon3 カラム10/300(1×30cm、Pharmacia Biotech)に詰めた。カラムを100mlの6Mグアニジン、50mM炭酸ナトリウム、pH10で洗浄した。Chimigen3 多抗原タンパク質を含むライゼート0.5mLを、Superdex 200カラムにローディングした。タンパク質を、30mL/時の流速により溶離させ、0.5mLフラクションを集めた。タンパク質溶離を280nmでの吸光度によりモニターした。
Superdex3 200調製用を、AKTAexplorer 100FPLCシステム(GEヘルスケア)を用いて3MPaの圧力下でTricon3 カラム10/300(1×30cm、Pharmacia Biotech)に詰めた。カラムを100mlの6Mグアニジン、50mM炭酸ナトリウム、pH10で洗浄した。Chimigen3 多抗原タンパク質を含むライゼート0.5mLを、Superdex 200カラムにローディングした。タンパク質を、30mL/時の流速により溶離させ、0.5mLフラクションを集めた。タンパク質溶離を280nmでの吸光度によりモニターした。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
フェニル−650C Toyopearl(商標)(0.5mL、TOSOH Corp.)を、Poly-prep カラム(Bio-Rad)に詰めた。カラムを20mLのHIC結合緩衝液(0.1Mのトリス、2Mの塩化ナトリウム、pH8)により平衡状態にした。最終濃度2Mの塩化ナトリウムを、Chimigen3 多抗原タンパク質を含む0.5mLのライゼートに加え、抽出物を3.5mLのHIC結合緩衝液で希釈した。20分間18000rpmでの遠心分離(39191×g、JA25.50ローターによる、Beckman Coluter Avanti(商標)J−25遠心分離機)により、不溶性粒子を除去した。重力流により30mL/時の流速で、上清をカラムにローディングした。次いで、カラムを10mLのHIC結合緩衝液で洗浄し、カラムに結合されたタンパク質を5mLのHIC溶離緩衝液(8Mの尿素、50mMのエチレンジアミン、0.5%のTween 20、pH10.5)で溶離した。
フェニル−650C Toyopearl(商標)(0.5mL、TOSOH Corp.)を、Poly-prep カラム(Bio-Rad)に詰めた。カラムを20mLのHIC結合緩衝液(0.1Mのトリス、2Mの塩化ナトリウム、pH8)により平衡状態にした。最終濃度2Mの塩化ナトリウムを、Chimigen3 多抗原タンパク質を含む0.5mLのライゼートに加え、抽出物を3.5mLのHIC結合緩衝液で希釈した。20分間18000rpmでの遠心分離(39191×g、JA25.50ローターによる、Beckman Coluter Avanti(商標)J−25遠心分離機)により、不溶性粒子を除去した。重力流により30mL/時の流速で、上清をカラムにローディングした。次いで、カラムを10mLのHIC結合緩衝液で洗浄し、カラムに結合されたタンパク質を5mLのHIC溶離緩衝液(8Mの尿素、50mMのエチレンジアミン、0.5%のTween 20、pH10.5)で溶離した。
精製Chimigen(商標)タンパク質の生化学的評価
Micro BCA3タンパク質アッセイ試薬キットを用いて、製造業者が提供したプロトコルによるマイクロプレート手順でタンパク質濃度を評価した。
Micro BCA3タンパク質アッセイ試薬キットを用いて、製造業者が提供したプロトコルによるマイクロプレート手順でタンパク質濃度を評価した。
SDS−PAGE分析については、精製タンパク質のアリコートを、5xタンパク質ローディング緩衝液および20x還元剤を加えることにより変性させ、5分間沸騰させた。変性タンパク質を12%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、ゲルを、製造業者が提供した条件下においてPageBlue3で染色した。
ウエスタン・ブロット分析については、タンパク質を12%SDS−PAGEにより分離し、48mMのトリス基剤、39mMのグリシン、20%メタノールおよび0.0375%SDSを含む緩衝液を用いて Hybond3 ECL3 ニトロセルロース膜へエレクトロブロッティングした。膜を、まず室温で1時間、ブロッキング緩衝液(PBS中1%脱脂乳、0.1%Tween20)中でインキュベーションした。検出用抗体をブロッキング緩衝液中で所望の濃度に希釈した。膜を、室温で1時間絶えず混合しながら希釈抗体とインキュベーションした。各抗体とインキュベーション後、室温で洗浄1回につき10分間、膜をブロッキング緩衝液で3回洗浄した。ECL3 ウエスタン・ブロッティング検出キットでの化学発光および Kodak Biomax XAR X線フィルムへの暴露によりタンパク質の検出を実施した。
タンパク質のグリコシル化の定性的検出については、Molecular Probes が開発したPro-Q(登録商標)エメラルド 300 グリコプロテイン・ゲルおよびブロット・ステイン・キットを使用した。このキットは、ゲルでのSDS−PAGEにより分離されたタンパク質およびブロットにおける炭水化物の検出に使用され得る。染料は、ほとんどの全タンパク質染色および所望ならば、質量分析法による分析と適合し得る。染料が過ヨウ素酸−酸化炭水化物基と反応したとき、明緑色蛍光シグナルが発生し、1バンドにつき0.5ngほどの僅かな糖タンパク質が検出される。染色は、過ヨウ素酸およびシッフ法の修正法であり、製造業者は50倍高い感度レベルを主張している。キットには、CandyCane(商標)分子量標準が含まれる。この標準は、それぞれ陽性および陰性対照として機能する交互のグリコシル化および非グリコシル化タンパク質により構成される。タンパク質試料のSDS−PAGE後、ゲルを一晩50%MeOHおよび5%酢酸に固定した。ゲルを、3%氷酢酸中で20分間2回洗浄し、次いで30分間酸化溶液過ヨウ素酸中でグリカン酸化した。ゲルを、3%氷酢酸で20分間3回洗浄し、次いで暗所中で最大120分間、新鮮なPro-Q3 エメラルド300染色液で染色した。さらに暗所中での3%氷酢酸による20分洗浄が追加的に2回、イメージング前に必要とされる。染料の励起/放射最大値は、280/530nmであり、最適な視覚化は〜300nmでもたらされる。GeneGenius(Syngene)トランスイルミネーターおよび対応するソフトウェアを用いて、ゲルを視覚化し、走査した。
Chimigen(商標)ワクチンの免疫学的特性検定
ヒトPBMC(末梢血単核細胞)
HLA−A2ハプロタイプを有する非HCV感染個体からの白血球搬出製品(Biological Specialty Corporation)のフィコール-ハイパーク勾配遠心分離により、PBMCを得た。PBMCを、冷凍培地(50%ヒトAB血清、40%AIM-V(商標)、および10%DMSO)中、3×107細胞/クリオバイアルで液体窒素中において貯蔵した。
ヒトPBMC(末梢血単核細胞)
HLA−A2ハプロタイプを有する非HCV感染個体からの白血球搬出製品(Biological Specialty Corporation)のフィコール-ハイパーク勾配遠心分離により、PBMCを得た。PBMCを、冷凍培地(50%ヒトAB血清、40%AIM-V(商標)、および10%DMSO)中、3×107細胞/クリオバイアルで液体窒素中において貯蔵した。
単球の単離および未成熟DC(樹状細胞)への分化
PBMCを、2.5%適合血清含有AIM V(商標)培地中、37℃で1時間100mm組織培養皿(BD Biosciences)において培養した。培養後、非接着細胞を除去し、プレートをAIM V(商標)培地で洗浄した。次いで、接着細胞を、2mLのAIM V(商標)/IL−4およびGM−CSF含有(各々100IU/mL)2.5%適合血清中で培養した。
PBMCを、2.5%適合血清含有AIM V(商標)培地中、37℃で1時間100mm組織培養皿(BD Biosciences)において培養した。培養後、非接着細胞を除去し、プレートをAIM V(商標)培地で洗浄した。次いで、接着細胞を、2mLのAIM V(商標)/IL−4およびGM−CSF含有(各々100IU/mL)2.5%適合血清中で培養した。
未成熟DCへのHCV Chimigen(商標)タンパク質の結合
未成熟DCを、24〜72時間IL−4およびGM−CSFの存在下で培養中の単球から入手した。培養後、細胞を採取し、2.5%適合血清含有AIM V(商標)培地で1回洗浄し、次いで0.1%(w/v)BSA含有ダルベッコリン酸緩衝食塩水(Invitrogen)(PBSB)で2回洗浄した。上記細胞を用いて、Chimigen(商標)タンパク質の結合および内在化を評価した。未成熟DCの表現型を、CD64、CD32、CD16、CD206、HLA−ABC、HLA−DR、CD14、CD11c、CD86、CD80、CD40、CD83、CD19、CD3およびCD4を含む様々な細胞表面マーカーについての標識により評価した。
未成熟DCを、24〜72時間IL−4およびGM−CSFの存在下で培養中の単球から入手した。培養後、細胞を採取し、2.5%適合血清含有AIM V(商標)培地で1回洗浄し、次いで0.1%(w/v)BSA含有ダルベッコリン酸緩衝食塩水(Invitrogen)(PBSB)で2回洗浄した。上記細胞を用いて、Chimigen(商標)タンパク質の結合および内在化を評価した。未成熟DCの表現型を、CD64、CD32、CD16、CD206、HLA−ABC、HLA−DR、CD14、CD11c、CD86、CD80、CD40、CD83、CD19、CD3およびCD4を含む様々な細胞表面マーカーについての標識により評価した。
結合検定法については、全段階を4℃で実施し、インキュベーション後には洗浄した。細胞を、様々な濃度のChimigen(商標)タンパク質または対応する透析緩衝液を含むPBSB中で60分間インキュベーションした(25μLの容量中、96ウェルv底プレートにおいて2×105細胞/ウェル)。細胞を、PBSB中で20分間ビオチニル化抗マウスIgG1または抗6xHis抗体、次いで20分間SA−PE−Cy5とインキュベーションすることにより、タンパク質結合を検出した。細胞を、2%パラホルムアルデヒド(PF)含有PBSBに再懸濁した。NS5A Chimigen(商標)タンパク質を用いる実験では、ウサギ抗NS5Aポリクローナル抗体、ヤギ抗ウサギIgG−ビオチン、SA−PE−Cy5組み合わせにより結合を検出した。細胞を2%パラホルムアルデヒド(PF)含有PBSBに再懸濁し、細胞結合を蛍光フローサイトメトリー(FFC)により評価した。
結合阻害剤を用いるChimigen(商標)ワクチンについてのDC受容体の特性検定
未成熟DCを、4℃で60分間、PBSB中抗CD32mAb(IgG2bイソタイプ)、抗CD206(IgG1イソタイプ)、またはイソタイプ対照マウスIgG2bまたはIgG1 mAbとインキュベーションした。それに続いて、細胞を、4℃で60分間PBSB中のChimigen(商標)ワクチンとインキュベーションした。洗浄後、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbまたはビオチニル化抗6xHis mAb、次いでSA−PE−Cy5を用いるFFC分析により、細胞への結合を検出した。
未成熟DCを、4℃で60分間、PBSB中抗CD32mAb(IgG2bイソタイプ)、抗CD206(IgG1イソタイプ)、またはイソタイプ対照マウスIgG2bまたはIgG1 mAbとインキュベーションした。それに続いて、細胞を、4℃で60分間PBSB中のChimigen(商標)ワクチンとインキュベーションした。洗浄後、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbまたはビオチニル化抗6xHis mAb、次いでSA−PE−Cy5を用いるFFC分析により、細胞への結合を検出した。
蛍光フローサイトメトリー(FFC)分析
CellQuest Pro 捕捉手段を取り付けたFACSCalibur および解析ソフトウェア(BD Biosciences)で、細胞を捕捉した。FSCおよびSSC散乱プロファイルにより測定された生存可能細胞集団についてゲートを設定し、20000以上の事象を捉えた。特異的陽性細胞のパーセンテージを次式で計算した:(陽性細胞試験試料%−陽性細胞対照%)/(100−対照の陽性細胞%)×100。相対平均蛍光強度(MFI)を次式で決定した:試験試料のMFI−対照試料のMFI。
CellQuest Pro 捕捉手段を取り付けたFACSCalibur および解析ソフトウェア(BD Biosciences)で、細胞を捕捉した。FSCおよびSSC散乱プロファイルにより測定された生存可能細胞集団についてゲートを設定し、20000以上の事象を捉えた。特異的陽性細胞のパーセンテージを次式で計算した:(陽性細胞試験試料%−陽性細胞対照%)/(100−対照の陽性細胞%)×100。相対平均蛍光強度(MFI)を次式で決定した:試験試料のMFI−対照試料のMFI。
抗原提示検定法(APA)
APAを用いて、APCにより提示された抗原に対するT細胞の免疫応答を測定する。この検定法では、機能的T細胞免疫応答および抗原付加成熟DCの抗原特異的T細胞増殖誘導能力を定量する。この手順では、PBMC由来の単球を未成熟DCに分化させ、未成熟DCに抗原(Chimigen(商標)タンパク質またはTT)を載せ、未成熟DCを成熟DCに分化させ、次いで成熟抗原付加DCをオートロガスナイーブT細胞と一緒に培養する。活性化および増殖検定法については、7日間の培養後、T細胞を分析した。T細胞機能および特異性の分析については、T細胞をさらに2回抗原付加成熟DCで刺激し、IFN−γ、TNF−α、グランザイムB(grB)およびパーフォリン(pfn)の産生を評価した。抗原に対するT細胞の特異性を、特異的MHCクラスI四量体または五量体で評価した。
APAを用いて、APCにより提示された抗原に対するT細胞の免疫応答を測定する。この検定法では、機能的T細胞免疫応答および抗原付加成熟DCの抗原特異的T細胞増殖誘導能力を定量する。この手順では、PBMC由来の単球を未成熟DCに分化させ、未成熟DCに抗原(Chimigen(商標)タンパク質またはTT)を載せ、未成熟DCを成熟DCに分化させ、次いで成熟抗原付加DCをオートロガスナイーブT細胞と一緒に培養する。活性化および増殖検定法については、7日間の培養後、T細胞を分析した。T細胞機能および特異性の分析については、T細胞をさらに2回抗原付加成熟DCで刺激し、IFN−γ、TNF−α、グランザイムB(grB)およびパーフォリン(pfn)の産生を評価した。抗原に対するT細胞の特異性を、特異的MHCクラスI四量体または五量体で評価した。
抗原付加成熟DCの作製
未成熟DCを上記要領で作製し、抗原または緩衝液(対照)と8時間インキュベーションした。次いで、細胞を成熟促進剤polyIC(20μg/mL)、組換えヒト(rh)IL−1β(10ng/mL)、rhTNF−α(10ng/mL)、rhIL−6(10ng/mL)、rhIFN−αA(1000U/mL)、およびrhIFN−γ(1000U/mL)と16時間培養した。DCの成熟程度を表現型解析により評価した。CD64、CD32、CD16、CD205、CD206、CD209、HLA−ABC、HLA−DR、CD14、CD11c、CD86、CD80、CD83、CD40、CD19、CD3、CD8およびCD4を含む様々な細胞表面マーカーについて細胞を標識した。
未成熟DCを上記要領で作製し、抗原または緩衝液(対照)と8時間インキュベーションした。次いで、細胞を成熟促進剤polyIC(20μg/mL)、組換えヒト(rh)IL−1β(10ng/mL)、rhTNF−α(10ng/mL)、rhIL−6(10ng/mL)、rhIFN−αA(1000U/mL)、およびrhIFN−γ(1000U/mL)と16時間培養した。DCの成熟程度を表現型解析により評価した。CD64、CD32、CD16、CD205、CD206、CD209、HLA−ABC、HLA−DR、CD14、CD11c、CD86、CD80、CD83、CD40、CD19、CD3、CD8およびCD4を含む様々な細胞表面マーカーについて細胞を標識した。
ヒトPBMC(末梢血単核細胞)由来T細胞の単離
製造業者の手順にしたがって、Dynal Biotech T細胞負の選択キット(Invitrogen)を用いる負の選択法により、T細胞をPBMCから単離した。適合血清をBSAおよびFBSの代わりに使用した。様々な細胞マーカーに関する表現型標識により、単離細胞の表現型を評価した。T細胞(CD3+細胞)は、98%を超える割合の単離集団を含んでいた。T細胞をCFSE(下記参照)で標識するか、またはDCとの細胞培養に直接加えた。
製造業者の手順にしたがって、Dynal Biotech T細胞負の選択キット(Invitrogen)を用いる負の選択法により、T細胞をPBMCから単離した。適合血清をBSAおよびFBSの代わりに使用した。様々な細胞マーカーに関する表現型標識により、単離細胞の表現型を評価した。T細胞(CD3+細胞)は、98%を超える割合の単離集団を含んでいた。T細胞をCFSE(下記参照)で標識するか、またはDCとの細胞培養に直接加えた。
T細胞のCFSE標識
新鮮な単離T細胞(1〜5×107細胞)を、500μlのPBSBに懸濁し、CFSEの新たに製造した10μg/ml調製用ストック溶液500μlと混合した。37℃で10分間インキュベーション後、細胞を血清含有培地(AIM V(商標)/10%適合血清)で十分に洗浄することにより、組み込まれていないCFSEを除去した。T細胞のCFSE標識をFFCにより確認した。
新鮮な単離T細胞(1〜5×107細胞)を、500μlのPBSBに懸濁し、CFSEの新たに製造した10μg/ml調製用ストック溶液500μlと混合した。37℃で10分間インキュベーション後、細胞を血清含有培地(AIM V(商標)/10%適合血清)で十分に洗浄することにより、組み込まれていないCFSEを除去した。T細胞のCFSE標識をFFCにより確認した。
ヒトPBMC由来T細胞の培養
T細胞を、AIM V(商標)/25%適合血清中、1ウェルにつき1〜20×104T細胞〜1〜5×104DCの割合で抗原付加成熟DCとインキュベーションした。T細胞活性化および増殖APA実験については、4日および7日培養後にT細胞を採取した(下記参照)。T細胞機能および特異性APA実験については、T細胞を7日間培養し、次いで抗原付加成熟DCにより再刺激し、さらに7日間培養した。次いで、14日培養T細胞を、2群(細胞内サイトカイン(ICC)プレートおよび四量体プレート)に分け、抗原付加DCで3回目の刺激を加えた。1μg/mLのBrefeldin A(BD Biosciences)をICC IFN−γプレートのウェルに加え、細胞を6時間培養した。IFN−γ、TNF−α、grBおよびpfnの発現を下記で概略を示した要領により評価した。下記で概略を示したとおり、四量体分析を刺激の5〜6日後に実施した。
T細胞を、AIM V(商標)/25%適合血清中、1ウェルにつき1〜20×104T細胞〜1〜5×104DCの割合で抗原付加成熟DCとインキュベーションした。T細胞活性化および増殖APA実験については、4日および7日培養後にT細胞を採取した(下記参照)。T細胞機能および特異性APA実験については、T細胞を7日間培養し、次いで抗原付加成熟DCにより再刺激し、さらに7日間培養した。次いで、14日培養T細胞を、2群(細胞内サイトカイン(ICC)プレートおよび四量体プレート)に分け、抗原付加DCで3回目の刺激を加えた。1μg/mLのBrefeldin A(BD Biosciences)をICC IFN−γプレートのウェルに加え、細胞を6時間培養した。IFN−γ、TNF−α、grBおよびpfnの発現を下記で概略を示した要領により評価した。下記で概略を示したとおり、四量体分析を刺激の5〜6日後に実施した。
T細胞活性化および増殖分析
活性化/増殖APAについては、抗原付加DCとの4または7日培養後にT細胞を採取した。CD69(初期活性化マーカー)の発現およびCFSE強度(増殖の程度)について、T細胞を評価した。採取した細胞を、抗CD3−PE、抗CD8−PE−Cy5および抗CD69−APCにより標識した。緩衝液対照試料を用いて、倍加に至らなかったT細胞の集団を同定した。高度の蛍光で標識したこの集団は、FL1チャンネルで検出され、CFSEhiと命名された。1回分裂が行われた細胞集団は、CFSEhi集団のMFIの半分を有していた。同様に、2回分裂が行われた集団は、CFSEhi集団の約25%(4分の1)のMFIを有していた。CFSE蛍光がCFSEhi蛍光より低い細胞をCFSEloと命名した。細胞集団の中には、バックグラウンド付近のFL1チャンネル蛍光を有するものもあり、CFSE−(CFSEマイナス)と命名され得た。しかしながら、ここで概説した実験の目的に関して、T細胞は、CFSEhi(細胞分裂無し)またはCFSElo(少なくとも1細胞分裂)であるとみなされた。
活性化/増殖APAについては、抗原付加DCとの4または7日培養後にT細胞を採取した。CD69(初期活性化マーカー)の発現およびCFSE強度(増殖の程度)について、T細胞を評価した。採取した細胞を、抗CD3−PE、抗CD8−PE−Cy5および抗CD69−APCにより標識した。緩衝液対照試料を用いて、倍加に至らなかったT細胞の集団を同定した。高度の蛍光で標識したこの集団は、FL1チャンネルで検出され、CFSEhiと命名された。1回分裂が行われた細胞集団は、CFSEhi集団のMFIの半分を有していた。同様に、2回分裂が行われた集団は、CFSEhi集団の約25%(4分の1)のMFIを有していた。CFSE蛍光がCFSEhi蛍光より低い細胞をCFSEloと命名した。細胞集団の中には、バックグラウンド付近のFL1チャンネル蛍光を有するものもあり、CFSE−(CFSEマイナス)と命名され得た。しかしながら、ここで概説した実験の目的に関して、T細胞は、CFSEhi(細胞分裂無し)またはCFSElo(少なくとも1細胞分裂)であるとみなされた。
CD69の発現を評価することにより、T細胞活性化を定量した。若干の実験では、高FSCおよびSSC強度CD3+T細胞の集団でのゲーティングにより、T芽細胞を定量した。すなわち、細胞集団における相対数の芽細胞が、(これらの試験について)集団における小さな(G0)休止細胞と比べて直径が大きく(FSChi)、細胞コンプレキシティーが大きい(SSChi)細胞集団として発現された。
細胞内IFN−γ、TNF−α、grBおよびpfnの検出
IFN−γおよびTNFαの産生およびセリンプロテアーゼグランザイムB(grB)[Lobe et al.(1986)Science 232:858−861]並びに穿孔型タンパク質パーフォリン(pfn)[Hameed et al.(1992)Am.J.Pathol. 140:1025−1030]の発現を、標準ICC(細胞内サイトカイン)プロトコル(BD Biosciences)を用いることにより定量した。簡単に述べると、これは、細胞を、CD3(抗CD3−APC)およびCD8(抗CD8−PE−Cy5)検出用の特異的蛍光色素コンジュゲートmAbで標識し、固定および透過性にすることから成る。次いで、細胞試料を、一方は抗IFN−γ−PE抗体および抗grB−FITC抗体とインキュベーションしたもの、および他方は抗TNF−α−PEおよび抗パーフォリン−FITCとインキュベーションしたものである、2試料に分割した。1試料あたり平均して20000〜100000細胞がBD FACSCaliburを用いて捕捉された。
IFN−γおよびTNFαの産生およびセリンプロテアーゼグランザイムB(grB)[Lobe et al.(1986)Science 232:858−861]並びに穿孔型タンパク質パーフォリン(pfn)[Hameed et al.(1992)Am.J.Pathol. 140:1025−1030]の発現を、標準ICC(細胞内サイトカイン)プロトコル(BD Biosciences)を用いることにより定量した。簡単に述べると、これは、細胞を、CD3(抗CD3−APC)およびCD8(抗CD8−PE−Cy5)検出用の特異的蛍光色素コンジュゲートmAbで標識し、固定および透過性にすることから成る。次いで、細胞試料を、一方は抗IFN−γ−PE抗体および抗grB−FITC抗体とインキュベーションしたもの、および他方は抗TNF−α−PEおよび抗パーフォリン−FITCとインキュベーションしたものである、2試料に分割した。1試料あたり平均して20000〜100000細胞がBD FACSCaliburを用いて捕捉された。
四量体および五量体分析
T細胞を、抗CD−8PE−Cy5、抗CD4−APC、および抗CD69−FITC抗体および以下のPEコンジュゲートiTag(商標)四量体(Beckman Coulter)または五量体(ProImmune)の一つで標識した:HCV NS5A(VLSDFKTWL;配列番号3)HLA−A*0201、EBV(GLCTLVAML;配列番号5)HLA−A*0201、HCV NS3ペプチド(CINGVCWTV;配列番号4)HLA−A*0201、HCV NS3ペプチド(KLVALGINAV;配列番号6)HLA−A*0201、および陰性対照四量体(複対立遺伝子)。FACSCaliburを用いることにより、約100000細胞が捕捉された。
T細胞を、抗CD−8PE−Cy5、抗CD4−APC、および抗CD69−FITC抗体および以下のPEコンジュゲートiTag(商標)四量体(Beckman Coulter)または五量体(ProImmune)の一つで標識した:HCV NS5A(VLSDFKTWL;配列番号3)HLA−A*0201、EBV(GLCTLVAML;配列番号5)HLA−A*0201、HCV NS3ペプチド(CINGVCWTV;配列番号4)HLA−A*0201、HCV NS3ペプチド(KLVALGINAV;配列番号6)HLA−A*0201、および陰性対照四量体(複対立遺伝子)。FACSCaliburを用いることにより、約100000細胞が捕捉された。
共焦点顕微鏡によるChimigen(商標)タンパク質結合、内在化およびプロセッシングの分析
未成熟DCによるChimigen(商標)タンパク質の結合、内在化およびプロセッシングを、共焦点顕微鏡を用いて試験した。これらの試験で使用した未成熟DCは、2.5%ドナー適合血清を含むAIM V(商標)培地中、GM−CSFおよびIL−4の存在下で2日間、接着PBMC由来単球を分化させることにより得られた。2日目、未成熟DCをチャンバースライドへ移し、使用前にさらに1日インキュベーションした。適切な細胞表面受容体および形態を有する細胞間における中間物として3日目のものを選択した。
未成熟DCによるChimigen(商標)タンパク質の結合、内在化およびプロセッシングを、共焦点顕微鏡を用いて試験した。これらの試験で使用した未成熟DCは、2.5%ドナー適合血清を含むAIM V(商標)培地中、GM−CSFおよびIL−4の存在下で2日間、接着PBMC由来単球を分化させることにより得られた。2日目、未成熟DCをチャンバースライドへ移し、使用前にさらに1日インキュベーションした。適切な細胞表面受容体および形態を有する細胞間における中間物として3日目のものを選択した。
DC表面へのChimigen(商標)タンパク質の結合を試験するため、細胞を、4℃で1時間、PBSB中において5Tg/mLのChimigen(商標)タンパク質または陰性対照として緩衝液のみとインキュベーションした。1時間後、細胞をPBSBで洗浄し、次いでビオチニル化抗マウスIgG1抗体、次いでストレプトアビジンAlexaFluor(商標)546により標識した。各工程間でPBSB洗浄を実施した。標識および洗浄後、細胞を、4℃で10分間、4%パラホルムアルデヒド(PBSB中で調製)により固定した。次いで、スライドに、4´−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI;Invitrogen)と共にSlowFade(商標)ゴールド褪色防止剤を載せ、マニキュア液を用いてカバーグラスでスライドを密閉した。
DCによるChimigen(商標)タンパク質(5Tg/mL)の内在化について、37℃(7%CO2)で、Chimigen(商標)タンパク質含有培地中において細胞を直接インキュベーションするか、またはまずPBSB中4℃で表面受容体を標識し、非結合タンパク質を洗い流し、次いでAIM V(商標)/2.5%適合血清培地中37℃(7%CO2)で時間経過にともなって(0分、15分、60分および240分)受容体結合タンパク質の取り込みを調べることにより試験した。37℃でインキュベーションした細胞を、PBSBで洗浄し、次いで10分間BD Biosciences Cytofix/Cytoperm(商標)溶液により固定し、透過性にした。次いで、細胞を洗浄し、BD Biosciences Perm/Wash(商標)溶液中ビオチン抗マウスIgG1で標識し(1時間)、続いてストレプトアビジンAlexa Fluor(商標)546で標識した。他の抗体による共標識も必要に応じて実施した。細胞の最終洗浄後、スライドに上記と同じ要領で載せた。
Chimigen(商標)タンパク質が貪食作用を受けたことを確認するため、パルスチェイス実験を実施した。未成熟DCを、氷上で30分間、Chimigen(商標)タンパク質(5Tg/mL)によりパルスした。細胞をPBSBで洗浄し、Chimigen(商標)タンパク質不含有のAIM V(商標)/2.5%適合血清培地中でチェイスし、37℃(7%CO2)で15分間インキュベーションした。パルスチェイス細胞をPBSBで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、MHCクラスII抗体で標識することにより、原形質膜のみを標識した。Chimigen(商標)タンパク質がエンドソームに存在するか否かを測定するため、原形質膜標識細胞を、10分間BD Biosciences Cytofix/Cytoperm(商標)溶液により固定し、透過性にした。BD Biosciences Perm/Wash(商標)で洗浄後、上記と同じ要領で、抗マウスIgG1ビオチン/ストレプトアビジンによりChimigen(商標)タンパク質を検出した。
マクロ飲作用試験については、FITCデキストラン(MW70000、アニオン性、リシン固定可能、Invitrogen)を、Chimigen(商標)タンパク質(5Tg/mL)の存在または非存在下、AIM V(商標)/2.5%適合血清培地中で流動相マーカーとして使用した。
受容体伝達貪食作用を試験するため、Alexa Fluor(商標)488トランスフェリンコンジュゲート(Invitrogen)を、Chimigen(商標)タンパク質(5Tg/mL)含有PBSB中20Tg/mLで使用した。システインプロテアーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤の両方として、ラクタシスチン(Sigma)を使用した(最終濃度5Tg/mL)。
インビボ動物モデルにおける免疫応答の評価
これらの試験は、2種の同系交配実験動物(マウスおよびラット)および1種の異系交配大型動物(子ブタ)種を使用する。特に、BALB/cマウス(6〜8週齢、Charles River Laboratoriesから)、Wistarラット(4〜6週齢、Charles River Laboratoriesから)および異系交配子ブタ(4〜6週齢、University of Saskatchewan、Prairie Swine Centerから)を使用する。この試験では、Chimigen(商標)タンパク質の免疫応答および防御効力を調べる。
これらの試験は、2種の同系交配実験動物(マウスおよびラット)および1種の異系交配大型動物(子ブタ)種を使用する。特に、BALB/cマウス(6〜8週齢、Charles River Laboratoriesから)、Wistarラット(4〜6週齢、Charles River Laboratoriesから)および異系交配子ブタ(4〜6週齢、University of Saskatchewan、Prairie Swine Centerから)を使用する。この試験では、Chimigen(商標)タンパク質の免疫応答および防御効力を調べる。
安全性評価
HCV Chimigen(商標)タンパク質を、皮下(s.c.)または皮内(i.d.)投与する。以下のプロトコルおよび用量を注射に使用する。0日目、14日目、28日目および42日目で2週間ごとに皮下または皮内注射により動物を4回免疫化する。マウスについては、皮下および皮内注射、0.1Tg、1μgまたは10Tg/マウスの用量を使用する。ラットの免疫用量は、0.15Tg、1.5Tgまたは15Tg/ラットであり、子ブタについては、0.2Tg、2Tgまたは20Tg/子ブタである。
HCV Chimigen(商標)タンパク質を、皮下(s.c.)または皮内(i.d.)投与する。以下のプロトコルおよび用量を注射に使用する。0日目、14日目、28日目および42日目で2週間ごとに皮下または皮内注射により動物を4回免疫化する。マウスについては、皮下および皮内注射、0.1Tg、1μgまたは10Tg/マウスの用量を使用する。ラットの免疫用量は、0.15Tg、1.5Tgまたは15Tg/ラットであり、子ブタについては、0.2Tg、2Tgまたは20Tg/子ブタである。
ELISA技術による特異抗体の量およびIgG1/IgG2a比の分析用に、血液試料を免疫前(−1日目)および各注射の7日後(7、21、35、49日目)に採取する。
最終免疫の2週間後に動物を殺す。免疫後、週に少なくとも3回動物の理学的診断により、HCV Chimigen(商標)タンパク質の安全性プロフィールを評価する。これは、体重および有害事象の観察を含む。全身的毒物学については、一定間隔で集めた血液試料を用いて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)レベルを含む血清化学作用における変化をモニターする。さらに、実験の最後に、剖検時点で脾臓、肝臓、腎臓、心臓、肺、筋肉、および脳から採取した組織を、将来の潜在的病理学的変化の分析用に、10%ホルマリン緩衝液に固定し、パラフィンに埋封する。年齢適合動物を対照として使用する。
Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答
Chimigen(商標)タンパク質は、強い細胞性および体液性免疫応答を誘導すると予測される。動物試験を実施することにより、子ブタにおけるHCV Chimigen(商標)Caccinesに対する宿主免疫応答を測定する。これらの試験では、コア、NS5A、NS3、および多抗原Chimigen(商標)タンパク質を使用する。第1ラウンドでは、HCV Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答を評価する。上記要領で、タンパク質を皮下および皮内投与する。
Chimigen(商標)タンパク質は、強い細胞性および体液性免疫応答を誘導すると予測される。動物試験を実施することにより、子ブタにおけるHCV Chimigen(商標)Caccinesに対する宿主免疫応答を測定する。これらの試験では、コア、NS5A、NS3、および多抗原Chimigen(商標)タンパク質を使用する。第1ラウンドでは、HCV Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答を評価する。上記要領で、タンパク質を皮下および皮内投与する。
マウスまたはラットの脾臓細胞、および子ブタからの末梢血単核細胞(PBMC)を用いて、下記要領で、皮下および皮内経路による投与後のHCV Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答の量および質を測定する。これらの試験により、どのChimigen(商標)ワクチンおよび投与経路が最大の免疫応答を誘導するかが決定され得る。HCV Chimigen(商標)タンパク質の標的指向送達は、強い体液性応答に加えてTh1に偏った強力な免疫応答を誘発し得る。HCVワクチンに関するVIDOからの試験は、DNAワクチンによる初回免疫、次いでタンパク質追加刺激により、Th1/Th2で均衡のとれた強い免疫応答が誘発され得ることを立証した[Yu et al.(2004)J.Gen.Virol.85:533−1543]。
免疫応答の評価
i)抗体応答。全IgG並びにIgG1およびIgG2a抗体レベルを試験するELISAにより、HCV抗原特異的抗体の存在を測定する。IgGレベルは、免疫応答の量を立証し、IgG1およびIgG2aの相対レベルは、免疫応答の質(Th1またはTh2)を立証する。確立されたプロトコルを用いてこれらの実験を実施する。
i)抗体応答。全IgG並びにIgG1およびIgG2a抗体レベルを試験するELISAにより、HCV抗原特異的抗体の存在を測定する。IgGレベルは、免疫応答の量を立証し、IgG1およびIgG2aの相対レベルは、免疫応答の質(Th1またはTh2)を立証する。確立されたプロトコルを用いてこれらの実験を実施する。
ii)リンパ球増殖検定法。マウスまたはラットの脾臓細胞、子ブタからの末梢血単核細胞(PBMC)を、インビトロでHCV抗原により刺激する。分裂中の細胞のDNAへの[メチル−3H]チミジン取込みにより増殖性応答を測定する。
iii)サイトカインELISPOT検定法。免疫応答の質をさらに確認するため、我々の確立されたプロトコルにしたがって、脾臓細胞(マウスおよびラット)またはPBMC(子ブタ)におけるインターフェロン−γおよびインターロイキン−4分泌細胞の数を、HCV抗原による刺激後にELISPOT検定法で測定する。
HCV Chimigen(商標)タンパク質により誘導される防御的抗ウイルス免疫
HCVの宿主範囲は、非常に狭い。それは、ヒトおよびチンパンジーでのみ複製する。チンパンジーは高価であり、供給も限られていることから、生HCVによるワクチン接種動物の攻撃は実際的ではない。しかしながら、ワクチン接種後のHCV抗原をコード化する組換えワクシニアウイルスによる攻撃は、動物モデルにおいてHCV予防ワクチンにより誘導される防御能力を評価するための代替モデルである。Chimigen(商標)タンパク質を個々に、または組み合わせとして使用することにより、動物を免疫化する。ワクチン接種後に誘導される防御的免疫を評価するため、予め定められた戦略を用いてスケジュール通りにワクチン接種を完了させた2週間後、関連したChimigen3 タンパク質と同じHCV抗原をコード化する組換えワクシニアウイルスにより動物を腹腔内経路で攻撃する。攻撃用量は、マウスの場合1X107プラーク形成単位(PFU)、ラットの場合2X107PFU、および子ブタの場合1X109PFUである。5日後、動物を殺し、確立されたプロトコルにしたがってワクシニアウイルス力価をプラーク検定法により測定する。
HCVの宿主範囲は、非常に狭い。それは、ヒトおよびチンパンジーでのみ複製する。チンパンジーは高価であり、供給も限られていることから、生HCVによるワクチン接種動物の攻撃は実際的ではない。しかしながら、ワクチン接種後のHCV抗原をコード化する組換えワクシニアウイルスによる攻撃は、動物モデルにおいてHCV予防ワクチンにより誘導される防御能力を評価するための代替モデルである。Chimigen(商標)タンパク質を個々に、または組み合わせとして使用することにより、動物を免疫化する。ワクチン接種後に誘導される防御的免疫を評価するため、予め定められた戦略を用いてスケジュール通りにワクチン接種を完了させた2週間後、関連したChimigen3 タンパク質と同じHCV抗原をコード化する組換えワクシニアウイルスにより動物を腹腔内経路で攻撃する。攻撃用量は、マウスの場合1X107プラーク形成単位(PFU)、ラットの場合2X107PFU、および子ブタの場合1X109PFUである。5日後、動物を殺し、確立されたプロトコルにしたがってワクシニアウイルス力価をプラーク検定法により測定する。
HCV治療用および予防用ワクチンに最適な候補(複数も可)の同定
治療用ワクチンは、HCVウイルスの非構造タンパク質(NS5A、NS3)に基づき、予防用ワクチンは、構造タンパク質(例、E1、E2)および非構造タンパクに基づいている。1種またはそれ以上のChimigen(商標)ワクチンの組み合わせを、エクスビボDC/T細胞抗原提示検定法および動物モデルの両方で使用し、免疫学的結果を評価する。
治療用ワクチンは、HCVウイルスの非構造タンパク質(NS5A、NS3)に基づき、予防用ワクチンは、構造タンパク質(例、E1、E2)および非構造タンパクに基づいている。1種またはそれ以上のChimigen(商標)ワクチンの組み合わせを、エクスビボDC/T細胞抗原提示検定法および動物モデルの両方で使用し、免疫学的結果を評価する。
治療用および予防用Chimigen(商標)ワクチンの免疫化プロトコルおよび投与経路については、現在試験されている。抗体レベル、リンパ球増殖およびサイトカイン産生を測定することにより、免疫応答を評価する。予防用HCV Chimigen(商標)ワクチン候補により誘導される防御的抗ウイルス免疫についても上記と同様、攻撃実験で評価する。
実施例2.NS5A Chimigen3 タンパク質による結果
NS5A Chimigen(商標)タンパク質を精製および特性確認した
精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質の予測分子量は、〜81kDaであるが、このタンパク質はSDS−8%PAGEにより〜105kDaのバンドとして移動した。実測および予測分子量間の不一致は、主にタンパク質の高いプロリン含有率(〜11%)、グリコシル化および他の可能な翻訳後修飾に起因し得る。マウスIgG1 Fc、6xHis標識およびNS5Aに対する抗体により、精製タンパク質を検出した。精製タンパク質(ゲルから切断したバンド)に関するMS/MS ID(質量分析法)分析により、NS5A、マウスIgG1重鎖およびHCVポリタンパク質について顕著なヒットが出たことから、それが実際にNS5A Chimigen(商標)タンパク質であることが示された。精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質を8%SDSゲルで分離し、Pro-Q(登録商標)エメラルド300糖タンパク質ゲルおよびブロット染色キットを用いてグリコシル化について染色し、UV照明により検出した。この手順により、精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質のグリコシル化が示された。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質を精製および特性確認した
精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質の予測分子量は、〜81kDaであるが、このタンパク質はSDS−8%PAGEにより〜105kDaのバンドとして移動した。実測および予測分子量間の不一致は、主にタンパク質の高いプロリン含有率(〜11%)、グリコシル化および他の可能な翻訳後修飾に起因し得る。マウスIgG1 Fc、6xHis標識およびNS5Aに対する抗体により、精製タンパク質を検出した。精製タンパク質(ゲルから切断したバンド)に関するMS/MS ID(質量分析法)分析により、NS5A、マウスIgG1重鎖およびHCVポリタンパク質について顕著なヒットが出たことから、それが実際にNS5A Chimigen(商標)タンパク質であることが示された。精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質を8%SDSゲルで分離し、Pro-Q(登録商標)エメラルド300糖タンパク質ゲルおよびブロット染色キットを用いてグリコシル化について染色し、UV照明により検出した。この手順により、精製NS5A Chimigen(商標)タンパク質のグリコシル化が示された。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質は未成熟CDに結合する
NS5A Chimigen(商標)タンパク質を、未成熟DCへのその結合能力について調べた。細胞を、4℃で1時間、様々な濃度のNS5A Chimigen(商標)タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションした。ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbおよびSA−PE−Cy5により結合したワクチンを検出した。ワクチンと結合している細胞のパーセンテージ(陽性細胞%)および結合タンパク質の相対量(MFI)をフローサイトメトリーにより測定した(図15)。4〜50μg/mLのNS5A Chimigen(商標)タンパク質では、ほとんどのDCが結合について陽性であり、結合タンパク質の量は用量依存的に増加していた(図15および16)。タンパク質の結合は、未成熟DCへの結合が飽和可能であることを示す50μg/mLと比べて20μg/mLではそれほど大きくなかった。観察された結合の高いMFIは、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が非常に有効にかつ高レベルで未成熟DCに結合することを示している。4℃での結合が飽和可能であったことは、その過程に受容体が介在していることを示唆している。結合はまた、4℃での5分インキュベーション後に検出される結合タンパク質では非常に急速であり、結合のMFIは1時間インキュベーション後に観察されたものの約半分であった(データは示さず)。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質を、未成熟DCへのその結合能力について調べた。細胞を、4℃で1時間、様々な濃度のNS5A Chimigen(商標)タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションした。ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbおよびSA−PE−Cy5により結合したワクチンを検出した。ワクチンと結合している細胞のパーセンテージ(陽性細胞%)および結合タンパク質の相対量(MFI)をフローサイトメトリーにより測定した(図15)。4〜50μg/mLのNS5A Chimigen(商標)タンパク質では、ほとんどのDCが結合について陽性であり、結合タンパク質の量は用量依存的に増加していた(図15および16)。タンパク質の結合は、未成熟DCへの結合が飽和可能であることを示す50μg/mLと比べて20μg/mLではそれほど大きくなかった。観察された結合の高いMFIは、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が非常に有効にかつ高レベルで未成熟DCに結合することを示している。4℃での結合が飽和可能であったことは、その過程に受容体が介在していることを示唆している。結合はまた、4℃での5分インキュベーション後に検出される結合タンパク質では非常に急速であり、結合のMFIは1時間インキュベーション後に観察されたものの約半分であった(データは示さず)。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質は未成熟DC上の特異的受容体に結合する
それに含まれるFcフラグメントにより、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は、そのTBD領域を介して未成熟DC上のCD32(FcγRII)に結合すると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は、C型レクチン受容体、例えばCD206(MMR)に結合すると予測される。ワクチン候補の結合特異性を測定するため、未成熟DCを、遮断性抗CD32および/または抗CD206mAbの存在下で、NS5A Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。
それに含まれるFcフラグメントにより、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は、そのTBD領域を介して未成熟DC上のCD32(FcγRII)に結合すると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は、C型レクチン受容体、例えばCD206(MMR)に結合すると予測される。ワクチン候補の結合特異性を測定するため、未成熟DCを、遮断性抗CD32および/または抗CD206mAbの存在下で、NS5A Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。
未成熟DCを、緩衝液対照、または5μg/mlのイソタイプ対照mAb、抗CD32mAb、抗CD206mAb、または抗CD32および抗CD206の両方と4℃で1時間インキュベーションした後、NS5A Chimigen(商標)タンパク質と4℃で1時間インキュベーションした。結合したNS5A Chimigen(商標)タンパク質を、ビオチニル化抗6xHis mAb、次いでSA−PE−Cy5により検出した。イソタイプ対照mAb(マウスIgG1およびIgG2b)は、緩衝液対照と比べて結合を阻害しなかった。しかしながら、緩衝液対照と比べた場合、抗CD32および抗CD206は両方とも、それぞれ約60%および40%の割合で結合を阻害した。
両mAbを加えると、NS5A Chimigen(商標)タンパク質結合が阻害され、80%阻害がもたらされた。これらのデータは、NS5A Chimigen(商標)タンパク質の結合におけるCD32およびCD206の両方に関する一定の役割を示している。共焦点顕微鏡観察により、4℃でNS5A Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした細胞は、緩衝液のみの対照と比べてそれらの表面で強い標識を示したことから、Chimigen(商標)タンパク質は細胞表面に結合していることが示された。
未成熟CDによるNS5A Chimigen(商標)タンパク質の内在化を37℃で評価した。37℃で1時間、Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした未成熟DCは、多くの場合核付近で断続的な標識パターンを示したことから、Chimigen(商標)タンパク質は内在化され、あるとしてもごく小さな表面標識しか存在しないことを示唆していた。
DCは、食作用、マクロ飲作用、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよび非クラスリン/カベオラエンドサイトーシスを含む幾つかの経路による抗原取り込み能力をもつ。マクロ飲作用は、未成熟DCにおける構成的プロセスであると報告されている(Trombetta および Mellman 2005)。37℃でのマクロ飲作用により未成熟DCがNS5A Chimigen(商標)タンパク質を内在化する能力について、マクロ飲作用マーカーFITCデキストランを用いて評価した[Hewlett et al.(1994)J.Cell Biology 124:689−703]。Chimigen(商標)タンパク質およびFITCデキストランと15分間および60分間未成熟DCをインキュベーションした後、タンパク質およびFITCデキストランの両方を含む小胞様構造が観察されたことから、37℃でChimigen(商標)タンパク質がマクロ飲作用により取り込まれ得ることがわかる。また、FITCデキストランは、マクロファージマンノース受容体(CD206)に結合し得るため、Chimigen(商標)タンパク質およびFITCデキストランの両方を含むエンドソームは、場合によっては受容体介在性食作用により形成された可能性があることに留意するべきである。
Chimigen(商標)タンパク質の取り込みにおける受容体介在エンドサイトーシスの役割を、パルスチェイス実験により試験した。未成熟DCを、4℃で蛍光標識Chimigen(商標)タンパク質によりパルスし、洗浄し、37℃で15分間インキュベーションした。細胞を固定し、透過性にし、抗体で標識することにより、Chimigen(商標)タンパク質およびトランスフェリン受容体を検出した。トランスフェリン受容体は、受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれ、次いで初期エンドソームから原形質膜に再循環で戻る。4℃で、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は細胞表面に結合し、トランスフェリン受容体は主として細胞内に存在していた。37℃に切り替えると、エンドソームの形成が観察され、中にはChimigen(商標)タンパク質およびトランスフェリン受容体の両方を含むものもあった。実験開始時(4℃)での多数の既存の細胞内トランスフェリン受容体は、Chimigen(商標)タンパク質とは共存していない多くのトランスフェリン含有エンドソームに関与していると思われる。
DCによるNS5A Chimigen(商標)タンパク質の取り込み、およびトランスフェリン受容体に対する抗体での共標識による、トランスフェリンとのその共存について、共焦点顕微鏡により評価した。トランスフェリンはトランスフェリン受容体と結合し、受容体介在プロセスにより内在化されることが知られている。この分析が2分子の共存を示していることから、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれることがわかる。
Chimigen(商標)タンパク質およびトランスフェリン受容体シグナル間の重複を増加させる試みにおいて、細胞を、ヒトトランスフェリンとコンジュゲートしたAlexa Fluor 488とインキュベーションすることにより、細胞中の全トランスフェリン受容体ではなく、エンドサイトーシスが行われたばかりのトランスフェリン受容体のみが間接的に検出された。未成熟DCを、Chimigen(商標)タンパク質およびトランスフェリンにコンジュゲートしたAlex Fluor 488の混合物により4℃で表面標識した。僅かなAlexa Fluor 488トランスフェリン陽性エンドソームしか観察されなかったが、存在時にはそれらがNS5A Chimigen(商標)タンパク質を含むことから、Chimigen(商標)タンパク質が実際に受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれていることがわかる。これらの結果は、Chimigen3 タンパク質が、主として受容体介在エンドサイトーシスにより内在化されることを示している。
未成熟DCによるNS5A Chimigen(商標)タンパク質のプロセッシングについて試験した。特に、慢性感染症を処置するためのワクチンを設計するためには、CD8+細胞の活性化およびMHCクラスI受容体を介した抗原クロスプレゼンテーションが要求される。抗原クロスプレゼンテーションについては2種の異なるプロセッシング経路が提案されている[Lizee et al.(2005)Trends Immunol.26(3):141−149]。第1経路は、食作用により取り込まれた抗原のプロセッシングを含み、第2経路は、他のエンドサイトーシス経路、例えば受容体介在エンドサイトーシスにより取り込まれた抗原のプロセッシングを含む。第2経路の場合、タンパク質は、初期エンドソームへ取り込まれ、次いで後期エンドソームへターゲッティングされ、そこでカテプシンにより分解され、次いでMHCクラスI受容体へ載せられる。すなわち、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が後期エンドソームで検出され得るか否かを測定し、またそれが上記構造においてMHCクラスI受容体と共存しているか否かを測定する実験を実施した。4℃でNS5A Chimigen(商標)タンパク質によりパルスされ、次いで37℃でチェイスされた細胞を、共標識することにより、Chimigen(商標)タンパク質およびLAMP1(後期エンドソーム/リソソームのマーカー)の両方が検出された。4時間および24時間後、少数の細胞で、NS5A Chimigen タンパク質およびLAMP1間に重複が観察されたことから、NS5A Chimigen タンパク質は後期エンドソーム/リソソームにあることがわかった。別の共標識実験において、NS5A Chimigen(商標)タンパク質は、MHCクラスI分子との類似構造で存在することが見出されたことから、Chimigen(商標)タンパク質はMHCクラスI分子を介した提示用にプロセッシングされていることがわかる。
プロテアソームは、ファゴリソソーム経路によるクロスプレゼンテーションについての抗原破壊に関与していると考えられている。5μg/mLの濃度の細胞透過性プロテアソーム阻害剤ラクタシスチンで細胞を処理した。最近、ラクタシスチンは、リソソームプロテアーゼ、カテプシンAの阻害で以前に考えられていたよりも特異性が低いことが示された[Kozlowski et al.(2001)Tumour Biol.22(4):211−215]。NS5A Chimigen(商標)タンパク質のプロセッシングがファゴリソソーム経路の場合と同様にプロテアソームを伴うとすれば、細胞質ゾルにおける不完全分解ペプチドの部分的蓄積が予測されるが、上記蓄積は、後期エンドソームでのプロセッシングについては予測されない[Lizee et al.(2005)前出]。4時間のチェイス後、5μg/mLのラクタシスチンで処理(パルスおよびチェイス)したパルス細胞は、NS5A Chimigen(商標)タンパク質を含む多数のエンドソームを示した。さらに、エンドソームは、対照細胞の場合よりタンパク質の多くを含むと思われた。細胞質NS5A Chimigen(商標)タンパク質の増加は、マウスIgG1に対するモノクローナル抗体では検出され得なかった。これらのデータもまた、ファゴリソソーム経路ではなく受容体介在エンドサイトーシスを、Chimigen3 タンパク質がDCで内在化される機構であると指摘している。
DCによるNS5A Chimigen(商標)タンパク質提示により、CD8+およびCD4+の両T細胞の活性化および増殖が誘発される
NS5A Chimigen(商標)タンパク質に対する機能的免疫応答を、エクスビボAPAにより評価した。この検定法は、抗原付加DCによるT細胞刺激後の機能的T細胞免疫応答の様々なパラメーターを測定するのに使用され得る。この検定法は、まずIL−4およびGM−CSFの添加によりPBMC由来の単球から未成熟DCを生成させることから成る。次いで、未成熟DCを、ワクチン候補、担体緩衝液(陰性対照)またはテタヌス・トキソイド(TT)(陽性対照)とインキュベーションする。次いで、DCをサイトカインで処理することにより成熟させ、洗浄し、オートロガスナイーブT細胞とインキュベーションする。サイトカイン産生、細胞傷害性顆粒成分の存在、およびNS5A特異的T細胞の生成を測定するため、T細胞にさらに2回刺激を加えることにより、Chimigen(商標)タンパク質特異的T細胞を拡大させた。初期T細胞活性化マーカーCD69を測定することにより、活性化を評価し、CFSE標識T細胞の蛍光を追跡することにより、増殖を測定した。抗原付加DCとの4日および7日培養後に、CD69発現およびCFSE蛍光を両方とも評価した。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質に対する機能的免疫応答を、エクスビボAPAにより評価した。この検定法は、抗原付加DCによるT細胞刺激後の機能的T細胞免疫応答の様々なパラメーターを測定するのに使用され得る。この検定法は、まずIL−4およびGM−CSFの添加によりPBMC由来の単球から未成熟DCを生成させることから成る。次いで、未成熟DCを、ワクチン候補、担体緩衝液(陰性対照)またはテタヌス・トキソイド(TT)(陽性対照)とインキュベーションする。次いで、DCをサイトカインで処理することにより成熟させ、洗浄し、オートロガスナイーブT細胞とインキュベーションする。サイトカイン産生、細胞傷害性顆粒成分の存在、およびNS5A特異的T細胞の生成を測定するため、T細胞にさらに2回刺激を加えることにより、Chimigen(商標)タンパク質特異的T細胞を拡大させた。初期T細胞活性化マーカーCD69を測定することにより、活性化を評価し、CFSE標識T細胞の蛍光を追跡することにより、増殖を測定した。抗原付加DCとの4日および7日培養後に、CD69発現およびCFSE蛍光を両方とも評価した。
予備分析は、培養物中のDCおよびT細胞の濃度が、T細胞免疫応答の測定における重要なパラメーターであることを示していた。すなわち、6つの異なるT細胞:DC比が評価されるようにAPAを設計した。5×104DC/ウェルの高濃度および1×104DC/ウェルの低濃度という、2セットのDC濃度を使用した。48時間の培養後、未成熟DCを、緩衝液(陰性対照)、5μg/mLでのNS5A Chimigen(商標)タンパク質(5AC)の2種の異なる調製物、TT(陽性対照)、またはPBSとインキュベーションした。次いで、DCを8時間培養し、polyIC、IL−1、IL−6、TNF−α、IFN−αおよびIFN−γを加えることにより成熟させた。一晩(16時間)培養後、PBS対照群からのDCを洗浄し、様々な成熟DCマーカーの発現について調べた。高濃度および低濃度の両DCは、高レベルのHLA−ABC(MHCクラスI)、HLA−DR(MHCクラスII)、CD86、CD80、およびCD83を発現した(図17)。一般に、高濃度のDCの方が、僅かに高レベルのDC成熟マーカーを発現した。
オートロガスT細胞を負の選択手順により単離し、細胞分裂を測定するためCFSEで標識した。96ウェルプレートにおける100μl/ウェルのDCに、100μl/ウェルのT細胞を、1ウェルにつき20×104、5×104、または2×104の濃度として加えた。高DC濃度ウェル(5×104DC/ウェル)については、1ウェルあたりのT細胞対DC比の組み合わせは、20×104:5×104(4:1)、5×104:5×104(1:1)、および2×104:5×104(0.4:1)であった。低DC濃度ウェル(1×104DC/ウェル)については、1ウェルあたりのT細胞対DC比の組み合わせは、20×104:1×104(20:1)、5×104:1×104(5:1)、および2×104:1×104(2:1)であった。T細胞を、外性サイトカインの非存在下でDCに加えた。対照として、培養の3日目に、1μg/mLのPHAを、PBS処理DC群に載せられたT細胞に加えた。
4日の培養後、細胞培養物の半分(100μl)を活性化および増殖の分析用に採取した。細胞培養物の残り半分に、100μlの新鮮なAIM V(商標)/2.5%適合血清を加え、細胞をさらに3日間培養した。4日間培養後のT細胞におけるCD69の発現を図18A〜Cに示す。図18Aは、異なるT細胞:DC比についてのCD69を発現するCD3+細胞のパーセンテージを示す。PHA処理細胞の大多数は、T細胞:DC比とは関係なくCD69を発現した。CD69はまた、高DC濃度により培養したT細胞から検出されたが、低DC濃度により培養したT細胞からはほとんど検出されなかった。緩衝液対照と比べると、抗原刺激T細胞は、高レベルのCD69を発現した。NS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCは、4日目にCD69発現性CD8+T細胞の方をCD4+T細胞よりも高いパーセンテージで誘導した(図18BおよびC)。CD8+細胞のCD69発現のパーセンテージは、リコール抗原TTと比べてChimigen3 タンパク質について同等であるかまたは大きかった。これは、NS5A Chimigen(商標)タンパク質がナイーブCD8+T細胞の強力な活性化因子であることを示していた。
4日間培養後に少なくとも1回分裂が行われた細胞(CFSElo)のパーセンテージを図19A〜Cに示す。PHAで処理したT細胞は、24時間早く分裂を始めていた(図19A)。TT付加DCで処理したCD8+およびCD4+T細胞は、4日間の培養後に検出可能な増殖を示したが、これは、高DC濃度で明白であったに過ぎない(図19BおよびC)。4日目、Chimigen(商標)タンパク質処理群においてT細胞増殖はほとんど検出されなかった。すなわち、CD69の発現により立証されたところによると、ナイーブT細胞は、培養4日目にNS5A Chimigen(商標)タンパク質付加DCにより活性化されたが、これらのT細胞はまだ分裂していないか、または使用した検定法では検出され得ない程度の分裂であった。
7日間の培養後、細胞を活性化および増殖分析用に採取した。7日間培養後のT細胞におけるCD69の発現を、図20A〜Cに示す。図20Aは、異なるT細胞:DC比についてのCD69発現性CD3+細胞のパーセンテージを示す。PHAで処理したT細胞のCD69発現は著しく増加していた。しかしながら、CD69発現性細胞のパーセンテージは、4日目に観察されたものからは減少しており、PHA応答から予測されること;CD69の急速な誘導、次いで時間の経過に伴う発現の減少と一致している。Chimigen3 タンパク質刺激T細胞については、CD69は、高DC濃度で培養したT細胞において5%を超えるレベルで検出されたが、低DC濃度で培養したT細胞からはほとんど検出されなかった。すなわち、低DC濃度(1×104DC/ウェル)では、抗原特異的T細胞活性化に十分ではなかった。緩衝液対照と比べると、5×104T細胞および2×104T細胞:5×104DC比に関して、多数のChimigen3タンパク質刺激T細胞がCD69を発現した。7日目、リコールTT応答についてCD69の発現は低下していた。d4T細胞とは対照的に、NS5A Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、7日目にCD69発現性CD4+T細胞の方をCD8+T細胞よりも高いパーセンテージで誘導した(図20BおよびC)。高いDC濃度(5×104/ウェル)については、CD8+およびCD4+T細胞のCD69発現のパーセンテージは、緩衝液またはリコール抗原TTの場合と比べると Chimigen(商標)タンパク質については同等であるかまたは大きかった。すなわち、NS5A Chimigen(商標)は、最初にナイーブCD8+T細胞、次いでCD4+T細胞を活性化する。
7日間培養後に少なくとも1回分裂が行われた細胞(CFSElo)のパーセンテージを図21A〜Cに示す。結果は、本質的にどのPHA処理T細胞も分裂していたことを示す(図21A)。Chimigen3タンパク質またはTTを載せたDCは、7日間培養後に著しいT細胞増殖を呈したが、これは高DC濃度で最も明白であった。高DC濃度ウェルでのみ、抗原付加の結果として著しいCD8+T細胞増殖が誘導された(図21B)。しかしながら、低濃度の抗原付加DCでも、CD4+T細胞増殖の誘導には十分であった(図21C)。特に、高DC濃度では、Chimigen3 タンパク質付加DCは、TT付加DCに匹敵するレベルまでT細胞増殖を誘導した。
T細胞増殖の別の尺度は、T細胞集団におけるTリンパ芽球の相対比率である。Tリンパ芽球は、フローサイトメトリーでの評価によると、リンパ球ゲートにおける休止リンパ球よりも高いFSC(前方光散乱)およびSSC(側面光散乱)を有する細胞として定義される。培養物中のTリンパ芽球のパーセンテージを図22に示す。これらの結果は、図21Aで示されているように分裂が行われている細胞のパーセンテージと非常に良好な相関関係を示す。したがって、集団におけるTリンパ芽球の評価は、CFSE検定法に代わるものとして使用され得る。全般的に、これらの発見は、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が、T細胞活性化および増殖により測定される1次T細胞応答の誘導に非常に有効であったことを示している。
DCによるNS5A Chimigen(商標)タンパク質提示により、IFN−γおよびTNF−αを産生するCD8+およびCD4+T細胞が生成される
NS5A Chimigen(商標)ワクチンに対する機能的免疫応答を、3回刺激エクスビボAPAにより評価した。4×104DC/ウェル(高濃度)または2×104DC/ウェル(低濃度)の未成熟DCに、対照担体緩衝液、PBS、TT(陽性対照)、またはNS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せた。次いで、DCを成熟させ、それらの表現型を評価した。DC成熟は、MHCクラスI、MHCクラスII、CD86、CD80およびCD83の高レベル発現を用いて確立された(図23)。オートロガスT細胞を、成熟抗原付加DCと20×104T細胞/ウェル:4×104DC/ウェルまたは4×104T細胞/ウェル:2×104DC/ウェルの比でインキュベーションした。T細胞に3回刺激を加え、Th1サイトカインIFN−γおよびTNF−αの細胞内レベルの検出により、3回目の刺激6時間後にT細胞機能を評価した。さらに、Tリンパ芽球のレベルについても評価した。
NS5A Chimigen(商標)ワクチンに対する機能的免疫応答を、3回刺激エクスビボAPAにより評価した。4×104DC/ウェル(高濃度)または2×104DC/ウェル(低濃度)の未成熟DCに、対照担体緩衝液、PBS、TT(陽性対照)、またはNS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せた。次いで、DCを成熟させ、それらの表現型を評価した。DC成熟は、MHCクラスI、MHCクラスII、CD86、CD80およびCD83の高レベル発現を用いて確立された(図23)。オートロガスT細胞を、成熟抗原付加DCと20×104T細胞/ウェル:4×104DC/ウェルまたは4×104T細胞/ウェル:2×104DC/ウェルの比でインキュベーションした。T細胞に3回刺激を加え、Th1サイトカインIFN−γおよびTNF−αの細胞内レベルの検出により、3回目の刺激6時間後にT細胞機能を評価した。さらに、Tリンパ芽球のレベルについても評価した。
図24は、高および低DC濃度でのTリンパ芽球のパーセンテージを示す。2:1のT細胞:DC比は、5:1比の場合と比べて低いバックグラウンド(緩衝液)T細胞増殖応答をもたらした。その結果、2:1比では、緩衝液および抗原誘導T細胞増殖応答間にさらに著しい差異があった。
IFN−γ応答を、5:1および2:1のT細胞:DC比で測定した。データは、群の各ウェルの応答として、および平均の標準偏差と共に3ウェルの平均として示されている(図25)。T細胞IFN−γ応答の比較結果は、5:1および2:1のT細胞:DC比間で著しい差異を示した。高いDC濃度では、対照緩衝液の場合を凌ぐChimigen3 誘導IFN−γ応答の証拠は無かった。しかしながら、DC濃度が低い場合、対照緩衝液付加DCと培養したT細胞でIFN−γを産生したのはごく僅かに過ぎなかったが、Chimigen3 タンパク質付加DCと培養したT細胞については高いパーセンテージでIFN−γを産生した。NS5A Chimigen(商標)タンパク質2.5μg/mLの場合と比べて5μg/mLを載せたDCにより刺激したT細胞ではIFN−γ産生細胞が多かった。CD8+およびCD4+集団におけるIFN−γを発現するT細胞のパーセンテージについても測定した(図26および27)。低DC濃度群は、Chimigen3−DCによる刺激の結果としてIFN−γを発現するCD8+T細胞の高いパーセンテージを示した。IFN−γを発現するCD8+T細胞のパーセンテージは、Chimigen3タンパク質付加DCにより刺激されたT細胞についての方がTT付加DCによる場合と比べて高かった(図26)。同様に、対照緩衝液による場合と比べてNS5A Chimigen(商標)タンパク質による刺激時にIFN−γを発現するCD4+T細胞のパーセンテージも高かった(図27)。IFN−Kを発現するCD4+T細胞のパーセンテージは、TT付加DCの場合と比べて Chimigen3 タンパク質付加DCにより刺激されたT細胞については匹敵し得るものであった(図27)。これらの結果は、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が、CD8+およびCD4+T細胞集団の両方において著しいIFN−γ応答を誘導することを示しており、分子が、MHCクラスIおよびクラスIIの両経路においてDCによりプロセッシングされることを示唆している。
図28は、抗原付加成熟DCによる6時間刺激の結果としてTNF−αを産生したT細胞のパーセンテージを示す。これらの結果は、IFN−γ結果と類似している。高DC濃度(5:1比)によるT細胞の抗原刺激の結果としてTNF−αを産生する細胞のパーセンテージは増加していたが、低DC濃度(2:1比)ではさらに大きな差異があった。5μg/mLのChimigen3 タンパク質を載せたDCにより刺激したときの方が、2.5μg/mLのタンパク質による場合よりもTNF−αを産生したT細胞のパーセンテージは高かった。TNF−α応答は、TTと比べるとNS5A Chimigen(商標)タンパク質についての方が大きかった。TT付加DCで刺激すると、TNF−αを発現するCD4+T細胞のパーセンテージの方がCD8+T細胞の場合よりも高くなった(図29)。しかしながら、NS5A Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、CD8+およびCD4+T細胞の両集団において類似した程度のTNF−α産生を誘導した(図29)。
DCによるNS5A Chimigen(商標)抗原提示により、3回目の刺激の6時間後にgrBおよびpfn+を発現するCD8+T細胞およびCD4+T細胞が生成される
T細胞の細胞傷害性顆粒タンパク質grBおよびpfnの産生能力についても、エクスビボ抗原提示検定法により評価した。未成熟DCに、対照緩衝液、TT(陽性対照)または様々な濃度のNS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せ、成熟させた後、オートロガスT細胞とインキュベーションした。grBの発現は、酵素検定法を含む種々の方法で特異抗体により検出され得る[Ewen et al.(2003)J.Immunol.Meth.276:89−101;Spaeny-Dekking et al.(1998)J.Immunol.160:3610;Hamann et al.(1997)J.Exp.Med. 186:1407]。抗grBおよび抗pfn mAbをそれぞれ用いる細胞内染色法により、GrBおよびpfn発現を検出した。図30は、抗原付加成熟DCによる3回刺激後にgrBおよびpfnを発現するCD8+細胞のパーセンテージを示す。NS5A Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、無抗原対照と比べてCD8+T細胞においてgrBおよびpfn発現の増加を誘導した。これらの結果は、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が、CD8+T細胞においてgrBおよびpfnの発現を誘導することを示しており、このことは、このタンパク質が、クラスI経路でDCによりプロセッシングされることにより、T細胞への有効な提示が行われ、ナイーブCD8+T細胞から細胞傷害性Tリンパ球(CTL)への分化を誘導することを示唆している。
T細胞の細胞傷害性顆粒タンパク質grBおよびpfnの産生能力についても、エクスビボ抗原提示検定法により評価した。未成熟DCに、対照緩衝液、TT(陽性対照)または様々な濃度のNS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せ、成熟させた後、オートロガスT細胞とインキュベーションした。grBの発現は、酵素検定法を含む種々の方法で特異抗体により検出され得る[Ewen et al.(2003)J.Immunol.Meth.276:89−101;Spaeny-Dekking et al.(1998)J.Immunol.160:3610;Hamann et al.(1997)J.Exp.Med. 186:1407]。抗grBおよび抗pfn mAbをそれぞれ用いる細胞内染色法により、GrBおよびpfn発現を検出した。図30は、抗原付加成熟DCによる3回刺激後にgrBおよびpfnを発現するCD8+細胞のパーセンテージを示す。NS5A Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、無抗原対照と比べてCD8+T細胞においてgrBおよびpfn発現の増加を誘導した。これらの結果は、NS5A Chimigen(商標)タンパク質が、CD8+T細胞においてgrBおよびpfnの発現を誘導することを示しており、このことは、このタンパク質が、クラスI経路でDCによりプロセッシングされることにより、T細胞への有効な提示が行われ、ナイーブCD8+T細胞から細胞傷害性Tリンパ球(CTL)への分化を誘導することを示唆している。
成熟DCによるNS5A Chimigen(商標)抗原提示により、CD8+およびCD4+T細胞が生成され、活性化が維持される
T細胞をAPAで3回抗原付加DCにより刺激した。3回目の刺激後の6日間培養後、T細胞を採取し、増殖の尺度として芽細胞のパーセンテージについて、および活性化マーカーCD69の発現についてFFCにより検査した。さらに、培養物から回収されたT細胞の絶対数を評価する手段として、FSCおよびSSCフローサイトメトリー分析に基づいたリンパ球ゲート(R1ゲート)にはまるゲート細胞の数を測定した。
T細胞をAPAで3回抗原付加DCにより刺激した。3回目の刺激後の6日間培養後、T細胞を採取し、増殖の尺度として芽細胞のパーセンテージについて、および活性化マーカーCD69の発現についてFFCにより検査した。さらに、培養物から回収されたT細胞の絶対数を評価する手段として、FSCおよびSSCフローサイトメトリー分析に基づいたリンパ球ゲート(R1ゲート)にはまるゲート細胞の数を測定した。
緩衝液対照と比べると、TTおよび Chimigen(商標)タンパク質刺激細胞からのT細胞の収率には著しい差異があった(図31)。TT刺激細胞は、Chimigen3 タンパク質刺激細胞よりも高いT細胞収率を示した。しかしながら、TT応答は、リコール応答であるため、TTに対して特異的応答性を示すT細胞の出発集団は、NS5Aに特異的なナイーブT細胞の出発集団よりも収率が高いと予測される。特に、芽細胞集団の評価において、芽細胞/増殖細胞のパーセンテージは、TT培養物と比べてNS5A Chimigen3タンパク質培養物における方が現実に高かった。緩衝液対照培養物には、芽細胞/増殖細胞はごく僅かしか存在しなかった。CD69発現により評価した活性化CD8+およびCD4+T細胞のパーセンテージを図32に示す。緩衝液対照と比べると、Chimigen3 タンパク質付加DCで刺激したT細胞ではCD69を発現するCD4+およびCD8+の両T細胞のパーセンテージが高かった。これらの結果は、Chimigen3 タンパク質による刺激は、3回目の刺激の6日後(T細胞培養の20日目)でも明白である顕著なT細胞活性化および増殖をもたらすことを示している。したがって、Chimigen3 タンパク質は、CD8+およびCD4+T細胞の両方の活性化および拡大において非常に有効である。
成熟DCによるNS5A Chimigen(商標)タンパク質提示により、NS5A特異的CD8+T細胞の生成が誘導される
NS5A Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答の抗原特異性を評価するため、HLA−A2の状況において免疫優性NS5Aエピトープに特異的なT細胞のパーセンテージを定量した。T細胞を、PEにコンジュゲートしたNS5Aペプチド/HLA−A2五量体で標識することによりこれを測定した。異なる濃度のNS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCにより、ナイーブT細胞に3回刺激を加え、APAにおいて抗原を伴わない(緩衝液)各対照DCの場合と比較した。3回目の刺激の6日後にT細胞を採取し、NS5A−特異的T細胞またはEBV−特異的T細胞(対照)を、四量体標識およびFFCにより検出した。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答の抗原特異性を評価するため、HLA−A2の状況において免疫優性NS5Aエピトープに特異的なT細胞のパーセンテージを定量した。T細胞を、PEにコンジュゲートしたNS5Aペプチド/HLA−A2五量体で標識することによりこれを測定した。異なる濃度のNS5A Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCにより、ナイーブT細胞に3回刺激を加え、APAにおいて抗原を伴わない(緩衝液)各対照DCの場合と比較した。3回目の刺激の6日後にT細胞を採取し、NS5A−特異的T細胞またはEBV−特異的T細胞(対照)を、四量体標識およびFFCにより検出した。
負の四量体標識(陰性対照)およびEBV四量体標識(陽性対照)CD8+およびCD4+T細胞のパーセンテージを図33に示す。試験した3ウェルのうち1ウェルは、CD8+T細胞集団におけるEBV四量体標識(陽性四量体)について陽性であった。評価したT細胞は、緩衝液対照処理ウェルからのものであったため、EBV四量体標識T細胞の数は比較的低いと予測される。APAによるNS5A五量体でのCD8+T細胞標識のパーセンテージを図34に示す。NS5A Chimigen(商標)タンパク質をDCに載せることにより、NS5AエピトープVLSDFKTWL(配列番号3)に対する特異性をもつT細胞が生成された。この特異性をもつCD8+T細胞の著しい拡大は、高DC濃度ウェルのうちの2ウェルおよび低DC濃度ウェルのうちの3ウェルで明白であった。すなわち、NS5A Chimigenタンパク質は、このNS5A免疫優性エピトープに特異的なT細胞の生成を誘導する能力をもち、T細胞は他のNS5Aエピトープに対する特異性を伴って存在すると思われる。
実施例3.NS3 Chimigen3 タンパク質による結果
NS5A Chimigen(商標)タンパク質を精製し、特性検定した
Sf9細胞で発現されたNS3 Chimigen(商標)タンパク質を、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。10%SDS−PAGEゲルを用いて精製試料を分析した。電気泳動後、ゲルをウエスタン・ブロッティング用にニトロセルロースへ移した。SDS−PAGEゲルをPageBlueで染色し、NS3 Chimigen(商標)タンパク質の種々の成分に特異的な抗体でウエスタン・ブロットを展開した。精製タンパク質は、約110KDaおよび120KDaで二重線として現れた。両種類とも、抗体、すなわちN−末端(抗6xHis)、TBD(抗Fc)およびNS3(ポリクローナル抗NS3)に対する抗体により検出され、精製タンパク質が無傷であることを示していた。
NS5A Chimigen(商標)タンパク質を精製し、特性検定した
Sf9細胞で発現されたNS3 Chimigen(商標)タンパク質を、Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。10%SDS−PAGEゲルを用いて精製試料を分析した。電気泳動後、ゲルをウエスタン・ブロッティング用にニトロセルロースへ移した。SDS−PAGEゲルをPageBlueで染色し、NS3 Chimigen(商標)タンパク質の種々の成分に特異的な抗体でウエスタン・ブロットを展開した。精製タンパク質は、約110KDaおよび120KDaで二重線として現れた。両種類とも、抗体、すなわちN−末端(抗6xHis)、TBD(抗Fc)およびNS3(ポリクローナル抗NS3)に対する抗体により検出され、精製タンパク質が無傷であることを示していた。
Pro-Q(登録商標)エメラルド300糖タンパク質ゲルおよびブロット染色キットを用いて、精製NS3 Chimigen(商標)タンパク質のグリコシル化の定性的評価を実施した。8%SDSポリアクリルアミドゲルでの精製タンパク質の電気泳動後、製造業者のプロトコルを用いてゲルを染色し、UV照明下で走査した。精製タンパク質は二重線であることから、分子量の差は、グリコシル化のレベルが異なるためであると推測される。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質は未成熟DCに結合する
NS3 Chimigen(商標)タンパク質を、その未成熟DCへの結合能力について調べた。細胞を、4℃で1時間、様々な濃度のNS3 Chimigen(商標)タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションした。結合タンパク質を、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbおよびSA−PE−Cy5で検出した。Chimigen3 タンパク質と結合している細胞のパーセンテージ(陽性細胞%)および結合タンパク質の相対量(MFI)をFFCにより測定した。4〜55μg/mLのNS3 Chimigen(商標)タンパク質では、ほとんどのDCが結合について陽性であり、結合タンパク質の量は、用量依存的に増加していた(図35および36)。タンパク質の結合は、55μg/mLの場合と比べて22μg/mLではそれほど大きくはなかったことから、未成熟DCへの結合は飽和し得ることが示された。観察された結合の高いMFIは、NS3 Chimigen(商標)タンパク質が非常に有効にかつ高レベルで未成熟DCに結合することを示していた。4℃での結合は飽和し得るものであり、それが受容体介在性であることを示していた。結合はまた、4℃で5分のインキュベーション後に検出された結合タンパク質では非常に急速に進んでおり、結合のMFIは60分インキュベーション後に観察されたものの約半分であった(データは示さず)。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質を、その未成熟DCへの結合能力について調べた。細胞を、4℃で1時間、様々な濃度のNS3 Chimigen(商標)タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションした。結合タンパク質を、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbおよびSA−PE−Cy5で検出した。Chimigen3 タンパク質と結合している細胞のパーセンテージ(陽性細胞%)および結合タンパク質の相対量(MFI)をFFCにより測定した。4〜55μg/mLのNS3 Chimigen(商標)タンパク質では、ほとんどのDCが結合について陽性であり、結合タンパク質の量は、用量依存的に増加していた(図35および36)。タンパク質の結合は、55μg/mLの場合と比べて22μg/mLではそれほど大きくはなかったことから、未成熟DCへの結合は飽和し得ることが示された。観察された結合の高いMFIは、NS3 Chimigen(商標)タンパク質が非常に有効にかつ高レベルで未成熟DCに結合することを示していた。4℃での結合は飽和し得るものであり、それが受容体介在性であることを示していた。結合はまた、4℃で5分のインキュベーション後に検出された結合タンパク質では非常に急速に進んでおり、結合のMFIは60分インキュベーション後に観察されたものの約半分であった(データは示さず)。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、未成熟DC上の特異的受容体に結合する
Fcフラグメントの存在により、NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、未成熟DC上のCD32(FcγRII)にTBD領域を介して結合すると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、C型レクチン受容体、例えばCD206(MMR)に結合すると予測される。タンパク質の結合の特異性を測定するため、未成熟DCを、遮断性抗CD32および/または抗CD206 mAbの存在下でNS3 Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。
Fcフラグメントの存在により、NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、未成熟DC上のCD32(FcγRII)にTBD領域を介して結合すると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、C型レクチン受容体、例えばCD206(MMR)に結合すると予測される。タンパク質の結合の特異性を測定するため、未成熟DCを、遮断性抗CD32および/または抗CD206 mAbの存在下でNS3 Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。
未成熟CDを、4℃で1時間、緩衝液対照、または5μg/mLのイソタイプ対照mAb、抗CD32 mAb、抗CD206mAb、または抗CD32および抗CD206の両方とインキュベーションした後、4℃で1時間NS3 Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。結合したNS3 Chimigen(商標)タンパク質を、ビオチニル化抗6xHis mAb、次いでSA−PE−Cy5により検出した。イソタイプ対照mAb(マウスIgG1およびIgG2)は、緩衝液対照と比べると結合を阻害しなかった。しかしながら、緩衝液対照との比較において、抗CD32および抗CD206は両方とも、それぞれ約70%および60%の割合で結合を阻害した(図36)。両遮断性mAbの追加により、さらにNS3 Chimigen(商標)タンパク質結合を阻害したところ、90%阻害が起こった(図36)。すなわち、データは、未成熟DCに結合しているNS3 Chimigen(商標)タンパク質の結合におけるCD32およびCD206の両方についてのある一定の役割を示唆している。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質の結合を、共焦点顕微鏡により視覚化した。未成熟DCを、4℃でNS3 Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。緩衝液のみの対照と比べて強い細胞表面での標識は、Chimigen(商標)タンパク質が細胞の表面、おそらくは受容体に結合していることを示すものであった。
内在化を調べるため、未成熟DCを37℃で1時間、Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。細胞は、表面標識(原形質膜輪郭)をあるとしてもごく僅かしか示さなかったが、代わりに多くの場合核付近で斑点状の標識パターンを示しており、Chimigen(商標)タンパク質が内在化されていることを示していた。
DCによるNS3 Chimigen(商標)タンパク質提示により、CD8+およびCD4+の両T細胞の活性化および増殖が誘発される
NS3 Chimigen(商標)タンパク質への機能的免疫応答を、エクスビボ抗原提示検定法(APA)により評価した。この検定法は、抗原付加DCでのT細胞刺激後における機能的T細胞免疫応答の様々なパラメーターを測定するのに使用され得る。この検定法は、まずIL−4およびGM−CSFの添加によりPBMC由来の単球から未成熟DCを生成させることから成る。次いで、未成熟DCを、ワクチン候補、担体緩衝液(陰性対照)またはTT(陽性対照)とインキュベーションする。それに続いて、DCをサイトカインで処理することにより成熟させ、洗浄し、オートロガスナイーブT細胞とインキュベーションする。サイトカイン産生、細胞傷害性顆粒成分の存在、およびNS3特異的T細胞の生成を測定するため、T細胞にさらに2回刺激を加えることにより、Chimigen(商標)タンパク質特異的T細胞を拡大させる。しかしながら、1回の刺激でナイーブT細胞集団からの拡大が開始されると予測される。初期T細胞活性化マーカーCD69を測定することにより、活性化を評価し、CFSE標識T細胞の蛍光を追跡することにより、増殖を測定した。抗原付加DCとの4日および7日培養後に、CD69発現およびCFSE蛍光を両方とも評価した。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質への機能的免疫応答を、エクスビボ抗原提示検定法(APA)により評価した。この検定法は、抗原付加DCでのT細胞刺激後における機能的T細胞免疫応答の様々なパラメーターを測定するのに使用され得る。この検定法は、まずIL−4およびGM−CSFの添加によりPBMC由来の単球から未成熟DCを生成させることから成る。次いで、未成熟DCを、ワクチン候補、担体緩衝液(陰性対照)またはTT(陽性対照)とインキュベーションする。それに続いて、DCをサイトカインで処理することにより成熟させ、洗浄し、オートロガスナイーブT細胞とインキュベーションする。サイトカイン産生、細胞傷害性顆粒成分の存在、およびNS3特異的T細胞の生成を測定するため、T細胞にさらに2回刺激を加えることにより、Chimigen(商標)タンパク質特異的T細胞を拡大させる。しかしながら、1回の刺激でナイーブT細胞集団からの拡大が開始されると予測される。初期T細胞活性化マーカーCD69を測定することにより、活性化を評価し、CFSE標識T細胞の蛍光を追跡することにより、増殖を測定した。抗原付加DCとの4日および7日培養後に、CD69発現およびCFSE蛍光を両方とも評価した。
予備分析は、培養物中のDCおよびT細胞の濃度が、T細胞免疫応答の測定における重要なパラメーターであることを示していた。すなわち、6つの異なるT細胞:DC濃度が評価されるようにAPAを設計した。5×104DC/ウェルの高濃度および1×104DC/ウェルの低濃度という、2セットのDC濃度を使用した。48時間の培養後、未成熟DCを、緩衝液(陰性対照)、5μg/mLでのNS3 Chimigen(商標)タンパク質(3C)、TT(陽性対照)、またはPBSとインキュベーションした。次いで、DCを8時間培養し、polyIC、IL−1、IL−6、TNF−α、IFN−αおよびIFN−γを加えることにより成熟させた。一晩(16時間)培養後、PBS対照群からのDCを洗浄し、様々な成熟DCマーカーの発現について調べた。高および低濃度DCは両方とも、高レベルのHLA−ABC(MHCクラスI)、HLA−DR(MHCクラスII)、CD86、CD80、およびCD83を発現した。
オートロガスT細胞を負の選択手順により単離し、細胞分裂を測定するためCFSEで標識した。96ウェルプレートにおける100μl/ウェルのDCに、100μl/ウェルのT細胞を、1ウェルにつき20×104、5×104、または2×104の濃度として加えた。高DC濃度ウェル(5×104DC/ウェル)については、1ウェルあたりのT細胞対DC比の組み合わせは、20×104:5×104(4:1)、5×104:5×104(1:1)、および2×104:5×104(0.4:1)であった。低DC濃度ウェル(5×104DC/ウェル)については、1ウェルあたりのT細胞対DC比の組み合わせは、20×104:1×104(20:1)、5×104:1×104(5:1)、および2×104:1×104(2:1)であった。T細胞を、外性サイトカインの非存在下でDCに加えた。対照として、培養の3日目に、1μg/mLのPHAを、PBS処理DC群に載せられたT細胞に加えた。
4日の培養後、細胞培養物の半分(100μl)を活性化および増殖の分析用に採取した。細胞培養物の残り半分に、100μlの新鮮なAIM V(商標)/2.5%適合血清を加え、細胞をさらに3日間培養した。4日間および7日間培養後の5×104T細胞/ウェル:5×104DC/ウェル比(1:1)でのT細胞におけるCD69の発現を図37に示す。PHA処理細胞の大多数は、T細胞:DC比とは関係なくCD69を発現した。CD69は、高DC濃度により培養したT細胞から検出されたが、低DC濃度により培養したT細胞からはほとんど検出されなかった(データは示さず)。緩衝液対照と比べると、抗原刺激T細胞は、高レベルのCD69を発現した。NS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCは、4日目にCD69発現性CD8+T細胞の方をCD4+T細胞よりも高いパーセンテージで誘導した。4日間培養後に少なくとも1回分裂が行われた細胞(CFSElo)のパーセンテージを図38に示す。結果は、PHA処理T細胞が24時間早く分裂を始めることを示していた。TT付加DCで処理したCD8+およびCD4+T細胞は、4日間の培養後に検出可能な増殖を示したが、これは、高DC濃度で明白であったに過ぎない(データは示さず)。4日目、ワクチン候補処理群においてT細胞増殖はほとんど検出されなかった。すなわち、CD69の発現により立証されたところによると、ナイーブT細胞は、培養4日目にNS3 Chimigen(商標)タンパク質付加DCにより活性化されるが、これらのT細胞はまだ分裂していなかった。
7日間の培養後、細胞を活性化および増殖分析用に採取した。7日間培養後のT細胞におけるCD69の発現を、図37に示す。Chimigen3 タンパク質刺激T細胞については、CD69は、高DC濃度で培養したT細胞において5%を超えるレベルで検出されたが、低DC濃度で培養したT細胞からはほとんど検出されなかった(データは示さず)。すなわち、低DC濃度(1×104DC/ウェル)では、抗原特異的T細胞活性化に十分ではなかった。7日目、リコールTT応答についてCD69の発現は低下していた。d4T細胞とは対照的に、NS3 Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、7日目にCD69発現性CD4+T細胞の方をCD8+T細胞よりも高いパーセンテージで誘導した。7日目のCD8+およびCD4+T細胞のCD69発現のパーセンテージは、リコール抗原TTの場合と比べると Chimigen(商標)タンパク質については大きかった。すなわち、NS3 Chimigen(商標)は、最初にナイーブCD8+T細胞、次いでCD4+T細胞を活性化する。7日間培養後に少なくとも1回分裂が行われた細胞(CFSElo)のパーセンテージを図38に示す。Chimigen3タンパク質またはTTを載せたDCは、7日間培養後に著しいCD8+およびCD4+T細胞増殖を呈したが、これは高DC濃度で最も明白であった(データは示さず)。
DCによるNS3 Chimigen(商標)タンパク質提示により、IFN−γおよびTNF−αを産生するCD8+およびCD4+T細胞が生成される
NS3 Chimigen(商標)タンパク質に対する機能的免疫応答を、3回刺激エクスビボAPAにより評価した。4×104DC/ウェル(高濃度)または2×104DC/ウェル(低濃度)の未成熟DCに、対照担体緩衝液、PBS、TT(陽性対照)、またはNS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せた。次いで、DCを成熟させ、それらの表現型を評価した。DCについては、それらが高レベルのMHCクラスI、MHCクラスII、CD86、CD80およびCD83を発現したとき成熟したものとして評価した。オートロガスT細胞を、成熟抗原付加DCと20×104T細胞/ウェル:4×104DC/ウェルまたは4×104T細胞/ウェル:2×104DC/ウェルの比でインキュベーションした。T細胞に3回刺激を加え、Th1サイトカインIFN−γおよびTNF−αの細胞内レベルの検出により、3回目の刺激6時間後にT細胞機能を評価した。さらに、Tリンパ芽球の程度についても評価した。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質に対する機能的免疫応答を、3回刺激エクスビボAPAにより評価した。4×104DC/ウェル(高濃度)または2×104DC/ウェル(低濃度)の未成熟DCに、対照担体緩衝液、PBS、TT(陽性対照)、またはNS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せた。次いで、DCを成熟させ、それらの表現型を評価した。DCについては、それらが高レベルのMHCクラスI、MHCクラスII、CD86、CD80およびCD83を発現したとき成熟したものとして評価した。オートロガスT細胞を、成熟抗原付加DCと20×104T細胞/ウェル:4×104DC/ウェルまたは4×104T細胞/ウェル:2×104DC/ウェルの比でインキュベーションした。T細胞に3回刺激を加え、Th1サイトカインIFN−γおよびTNF−αの細胞内レベルの検出により、3回目の刺激6時間後にT細胞機能を評価した。さらに、Tリンパ芽球の程度についても評価した。
T細胞集団におけるTリンパ芽球のパーセンテージの測定結果は、T細胞増殖の程度の尺度として使用され得る。Tリンパ芽球は、フローサイトメトリーでの評価によると、リンパ球ゲートにおける休止リンパ球よりも高いFSCおよびSSC光散乱を有する細胞として定義される。14日培養後の培養物中のTリンパ芽球のパーセンテージを図39に示す。NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、T細胞増殖(芽細胞生成)の誘導に有効であり、2:1のT細胞:DC比は、5:1比の場合と比べて低いバックグラウンド(緩衝液)T細胞増殖応答をもたらした。その結果、2:1のT細胞:DC比では、緩衝液と比べてNS3 Chimigen(商標)タンパク質による刺激時にはT細胞増殖に著しい差異があった。
IFN−γ応答を、5:1および2:1の両T細胞:DC比で測定した。データを、群の各ウェルの応答として、および平均の標準偏差と共に3ウェルの平均として示す(図40)。T細胞IFN−γ応答の比較結果は、5:1および2:1のT細胞:DC比間で著しい差異を示した。高いDC濃度では、対照緩衝液の場合を凌ぐワクチン候補誘導IFN−γ応答の証拠はほとんど無かった。しかしながら、DC濃度が低い場合、対照緩衝液付加DCと培養したT細胞でIFN−γを産生したのはごく僅かに過ぎなかったが、ワクチン候補付加DCと培養したT細胞については高いパーセンテージでIFN−γを産生した。NS3 Chimigen(商標)タンパク質5Tg/mLの場合と比べて同2.5μg/mLを載せたDCにより刺激したT細胞ではIFN−γ産生細胞の減少は無かった。CD8+およびCD4+集団におけるIFN−γを発現するT細胞のパーセンテージを定量し、図41に示す。IFN−γを発現するCD8+T細胞のパーセンテージに関して、2.5μg/mLのワクチン候補付加DCにより刺激されたT細胞はTT付加DCによる場合と類似していた。同様に、NS3 Chimigen(商標)タンパク質による刺激時にIFN−γを発現するCD4+T細胞のパーセンテージも、対照緩衝液による場合と比べて高かった。IFN−γを発現するCD4+T細胞のパーセンテージについては、ワクチン候補付加DCにより刺激されたT細胞による場合とTT付加DCの場合は類似していた。これらの結果は、NS3 Chimigen(商標)タンパク質が、CD8+およびCD4+T細胞集団の両方において著しいIFN−γ応答を誘導することを示しており、分子が、MHCクラスIおよびクラスIIの両経路においてDCによりプロセッシングされることを示唆している。
図42は、抗原付加成熟DCによる6時間刺激の結果としてTNF−αを産生したT細胞のパーセンテージを示す。これらの結果は、IFN−γ結果と類似している。TNF−α応答は、TTによる場合と比べるとNS3 Chimigen(商標)タンパク質による方が大きいか、またはほぼ同等であった。TTまたはNS3 Chimigen(商標)タンパク質付加DCで刺激すると、TNF−αを発現するCD4+T細胞のパーセンテージの方が同CD8+T細胞の場合よりも高くなった。
DCによるNS3 Chimigen(商標)タンパク質提示により、grBおよびpfnを発現するCD8+T細胞が生成される
T細胞の細胞傷害性顆粒タンパク質grBおよびpfnの産生能力についても、エクスビボAPAにより評価した。未成熟DCに、対照緩衝液、TT(陽性対照)または様々な濃度のNS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せ、成熟させた後、オートロガスT細胞とインキュベーションした。抗grBおよび抗pfn mAbをそれぞれ用いる細胞内染色法により、GrBおよびpfn発現を検出した。図43は、抗原付加成熟DCによる3回刺激後にgrBおよびpfnを発現するCD8+細胞のパーセンテージを示す。NS3 Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、緩衝液対照処理DCと比べてCD8+T細胞においてgrBおよびpfn発現の増加を誘導した。これらの結果は、NS3 Chimigen(商標)ワクチンが、CD8+T細胞においてgrBおよびpfnの発現を誘導することを示していた。この発見は、ワクチン候補が、MHCクラスI経路でDCによりプロセッシングされることにより、T細胞への有効な提示が行われ、ナイーブCD8+T細胞から細胞傷害性Tリンパ球(CTL)への分化を誘導することを示している。
T細胞の細胞傷害性顆粒タンパク質grBおよびpfnの産生能力についても、エクスビボAPAにより評価した。未成熟DCに、対照緩衝液、TT(陽性対照)または様々な濃度のNS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せ、成熟させた後、オートロガスT細胞とインキュベーションした。抗grBおよび抗pfn mAbをそれぞれ用いる細胞内染色法により、GrBおよびpfn発現を検出した。図43は、抗原付加成熟DCによる3回刺激後にgrBおよびpfnを発現するCD8+細胞のパーセンテージを示す。NS3 Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、緩衝液対照処理DCと比べてCD8+T細胞においてgrBおよびpfn発現の増加を誘導した。これらの結果は、NS3 Chimigen(商標)ワクチンが、CD8+T細胞においてgrBおよびpfnの発現を誘導することを示していた。この発見は、ワクチン候補が、MHCクラスI経路でDCによりプロセッシングされることにより、T細胞への有効な提示が行われ、ナイーブCD8+T細胞から細胞傷害性Tリンパ球(CTL)への分化を誘導することを示している。
成熟DCによるNS3 Chimigen(商標)タンパク質提示により、CD8+およびCD4+T細胞が生成され、活性化が維持される
T細胞をAPAで3回抗原付加DCにより刺激した。3回目の刺激後の6日間培養後、T細胞を採取し、増殖の尺度として芽細胞のパーセンテージについて、および活性化マーカーCD69の発現についてフローサイトメトリーにより検査した。さらに、培養物から回収されたT細胞の絶対数を評価する手段として、FSCおよびSSC FFC分析に基づいたリンパ球ゲート(R1ゲート)にはまるゲート細胞の数を測定した。
T細胞をAPAで3回抗原付加DCにより刺激した。3回目の刺激後の6日間培養後、T細胞を採取し、増殖の尺度として芽細胞のパーセンテージについて、および活性化マーカーCD69の発現についてフローサイトメトリーにより検査した。さらに、培養物から回収されたT細胞の絶対数を評価する手段として、FSCおよびSSC FFC分析に基づいたリンパ球ゲート(R1ゲート)にはまるゲート細胞の数を測定した。
CD69発現により評価した活性化CD8+およびCD4+T細胞のパーセンテージを図44に示す。緩衝液対照と比べた場合、Chimigen3 タンパク質付加DCで刺激したT細胞ではCD69を発現するCD4+およびCD8+の両T細胞のパーセンテージが増加していた。緩衝液対照と比べると、TTおよび Chimigen(商標)タンパク質刺激ウェルからのT細胞の収率には著しい差異があった(図45)。TT刺激細胞は、ワクチン候補刺激ウェルよりも高いT細胞収率をもたらした。しかしながら、TT応答はリコール応答であるため、TTに対して特異的反応性を示すT細胞の出発集団は、NS3に特異的なナイーブT細胞の出発集団よりも収率が高いと予測される。培養物中に存在するTリンパ芽球を調べると、特に、芽細胞/増殖細胞のパーセンテージは、TT培養物と比べてNS3 Chimigen(商標)タンパク質含有培養物における方が高かった。緩衝液対照培養物には、芽細胞/増殖細胞はごく僅かしか存在しなかった。すなわち、Chimigen3 タンパク質による刺激は、3回目の刺激の6日後(T細胞培養の20日目)でも明白である顕著なT細胞活性化および増殖をもたらした。したがって、NS3 Chimigen(商標)タンパク質は、CD8+およびCD4+T細胞の両方の活性化および拡大において非常に有効である。
成熟DCによるNS3 Chimigen(商標)タンパク質提示により、NS3特異的CD8+T細胞の生成が誘導される
NS3 Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答の抗原特異性を評価するため、HLA−A2の状況において2つの免疫優性NS3エピトープに特異的なT細胞のパーセンテージを定量した。T細胞を、PEにコンジュゲートしたNS3ペプチド/HLA−A2五量体で標識することによりこれを測定した。異なる濃度のNS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCにより、ナイーブT細胞に3回刺激を加え、APAにおいて抗原を伴わない(緩衝液)各対照DCの場合と比較した。3回目の刺激の6日後にT細胞を採取し、NS3−特異的T細胞またはEBV−特異的T細胞(対照)を、四量体標識により検出し、フローサイトメトリーにより分析した。試験した3ウェルの緩衝液対照群うち1ウェルは、CD8+T細胞集団におけるEBV四量体標識(陽性四量体)について陽性であり、負の四量体標識について陽性のウェルは無かった(データは示さず)。評価したT細胞は、緩衝液対照処理ウェルからのものであったため、EBV四量体標識T細胞の数は比較的低いと予測される。APAによるNS3五量体でのCD8+T細胞標識のパーセンテージを図46に示す。NS3 Chimigen(商標)タンパク質をDCに載せることにより、NS3エピトープに対する特異性をもつT細胞が生成された。この特異性をもつCD8+T細胞の著しい拡大は、低DC濃度群の6ウェルのうちの4ウェルで明白であった。すなわち、NS3 Chimigenタンパク質は、NS3免疫優性エピトープに特異的なT細胞の生成を誘導する能力をもち、他のNS3エピトープに対する特異性をもつT細胞も存在したと思われる。
NS3 Chimigen(商標)タンパク質に対する免疫応答の抗原特異性を評価するため、HLA−A2の状況において2つの免疫優性NS3エピトープに特異的なT細胞のパーセンテージを定量した。T細胞を、PEにコンジュゲートしたNS3ペプチド/HLA−A2五量体で標識することによりこれを測定した。異なる濃度のNS3 Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCにより、ナイーブT細胞に3回刺激を加え、APAにおいて抗原を伴わない(緩衝液)各対照DCの場合と比較した。3回目の刺激の6日後にT細胞を採取し、NS3−特異的T細胞またはEBV−特異的T細胞(対照)を、四量体標識により検出し、フローサイトメトリーにより分析した。試験した3ウェルの緩衝液対照群うち1ウェルは、CD8+T細胞集団におけるEBV四量体標識(陽性四量体)について陽性であり、負の四量体標識について陽性のウェルは無かった(データは示さず)。評価したT細胞は、緩衝液対照処理ウェルからのものであったため、EBV四量体標識T細胞の数は比較的低いと予測される。APAによるNS3五量体でのCD8+T細胞標識のパーセンテージを図46に示す。NS3 Chimigen(商標)タンパク質をDCに載せることにより、NS3エピトープに対する特異性をもつT細胞が生成された。この特異性をもつCD8+T細胞の著しい拡大は、低DC濃度群の6ウェルのうちの4ウェルで明白であった。すなわち、NS3 Chimigenタンパク質は、NS3免疫優性エピトープに特異的なT細胞の生成を誘導する能力をもち、他のNS3エピトープに対する特異性をもつT細胞も存在したと思われる。
実施例4.NS3−NS4B−NS5A多抗原 Chimigen3 タンパク質による結果
HCV HCV NS3−NS4B−NS5A Chimigen(商標)タンパク質の発現
Sf9細胞におけるHCV 多抗原Chimigen(商標)タンパク質の発現の時間推移を、SDS−PAGE後にウエスタン・ブロットにより分析した。HCV多抗原Chimigen(商標)タンパク質の発現および分解の両因子を考慮に入れることにより、最良のタンパク質発現条件が、感染後36時間1.5のMOIとして測定された。
HCV HCV NS3−NS4B−NS5A Chimigen(商標)タンパク質の発現
Sf9細胞におけるHCV 多抗原Chimigen(商標)タンパク質の発現の時間推移を、SDS−PAGE後にウエスタン・ブロットにより分析した。HCV多抗原Chimigen(商標)タンパク質の発現および分解の両因子を考慮に入れることにより、最良のタンパク質発現条件が、感染後36時間1.5のMOIとして測定された。
Sf9細胞ペレットの澄明なライゼートからのHCV NS3−NS4B−NS5A Chimigen(商標)タンパク質の精製
Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィー
精製の第1段階として、HCV NS3−NS4B−NS5A Chimigen(商標)タンパク質をNi−NTA Superflow3 カラムで捕捉した。Ni−NTA Superflow3 カラムに結合したタンパク質を、SDS−PAGEおよびウエスタン・ブロットにより分析した。ウエスタン・ブロットは、Chimigen(商標)タンパク質の優勢なバンドを示したが、ニトロセルロース膜の銀染色は、非免疫反応性タンパク質のさらなるバンドを示していた。
Ni−NTAアフィニティー・クロマトグラフィー
精製の第1段階として、HCV NS3−NS4B−NS5A Chimigen(商標)タンパク質をNi−NTA Superflow3 カラムで捕捉した。Ni−NTA Superflow3 カラムに結合したタンパク質を、SDS−PAGEおよびウエスタン・ブロットにより分析した。ウエスタン・ブロットは、Chimigen(商標)タンパク質の優勢なバンドを示したが、ニトロセルロース膜の銀染色は、非免疫反応性タンパク質のさらなるバンドを示していた。
HiTRap Q-XL イオン交換クロマトグラフィー
Ni−NTA Superflow カラムにより捕獲されたタンパク質を、HiTrap Q XL 1mLカラムクロマトグラフィーによりさらに分離した。タンパク質をフロー・スルーフラクション中で溶離し、フラクションを0.4および0.5M間のNaClの塩濃度で溶離した。カラムに結合した、HCV NS3−NS4B−NS5A多抗原Chimigen(商標)タンパク質は、フロー・スルーフラクション中のタンパク質よりも汚染度が低かった。少なくとも6本の免疫反応性バンドが銀染色により観察された。
Ni−NTA Superflow カラムにより捕獲されたタンパク質を、HiTrap Q XL 1mLカラムクロマトグラフィーによりさらに分離した。タンパク質をフロー・スルーフラクション中で溶離し、フラクションを0.4および0.5M間のNaClの塩濃度で溶離した。カラムに結合した、HCV NS3−NS4B−NS5A多抗原Chimigen(商標)タンパク質は、フロー・スルーフラクション中のタンパク質よりも汚染度が低かった。少なくとも6本の免疫反応性バンドが銀染色により観察された。
Superdex 200クロマトグラフィー
ライゼート中のタンパク質を、Superdex 200カラムにより分画した。HCV NS3−NS4B−NS5A多抗原Chimigen(商標)タンパク質は、最初のピークで溶離された。フラクションのウエスタン・ブロットおよび銀染色を実施した。タンパク質は、銀染色では優勢なバンドとして示されるが、汚染物質の多数のバンドも見られた。ウエスタン・ブロットの結果は、精製中におけるタンパク質の凝集を示唆している。
ライゼート中のタンパク質を、Superdex 200カラムにより分画した。HCV NS3−NS4B−NS5A多抗原Chimigen(商標)タンパク質は、最初のピークで溶離された。フラクションのウエスタン・ブロットおよび銀染色を実施した。タンパク質は、銀染色では優勢なバンドとして示されるが、汚染物質の多数のバンドも見られた。ウエスタン・ブロットの結果は、精製中におけるタンパク質の凝集を示唆している。
フェニル−650C Toyopearlでの疎水性相互作用クロマトグラフィー
HCV NS3−NS4B−NS5A多抗原Chimigen(商標)タンパク質を含む細胞ライゼートを、フェニル−650C Toyopearl(商標)に載せ、非吸収および吸収フラクションの両方で溶離した。フラクションのウエスタン・ブロットおよび銀染色を実施した。両フラクションでは、HCV多抗原Chimigen(商標)タンパク質が、ウエスタン・ブロットおよびニトロセルロース膜の銀染色における優勢なバンドとして観察された。
HCV NS3−NS4B−NS5A多抗原Chimigen(商標)タンパク質を含む細胞ライゼートを、フェニル−650C Toyopearl(商標)に載せ、非吸収および吸収フラクションの両方で溶離した。フラクションのウエスタン・ブロットおよび銀染色を実施した。両フラクションでは、HCV多抗原Chimigen(商標)タンパク質が、ウエスタン・ブロットおよびニトロセルロース膜の銀染色における優勢なバンドとして観察された。
実施例5.HCVコア Chimigen3 タンパク質による結果
HCVコアChimigen(商標)タンパク質を精製および特性検定した
HCVコアChimigen3 タンパク質を、変性条件下Niキレート化クロマトグラフィー(Ni−NTAスーパーフロー)により、次いでカチオン交換クロマトグラフィー(CMセファロース)により精製した。精製タンパク質を12%SDS−PAGEゲルで分析した。主要バンドは融合タンパク質(〜55KDa)であり、28kDaで認められる第2バンドは分解産物であると思われる。12%SDS−PAGEゲルで分離後、精製タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。抗6xHis−HRPコンジュゲート抗体、抗Fc特異的HRPコンジュゲート抗体および抗HCVコア抗体、二次抗体として抗Fab特異的HRPコンジュゲート抗体により、ウエスタン・ブロッティングを実施した。結合抗体を化学発光により検出した。ブロットへの抗体の結合は、精製HCVコア−TBDが無傷のN−末端、コアおよびTBD部分を有することを示していた。さらに、低分子量バンドが全3抗体により検出されたことから、それが、完全長HCVコアChimigen(商標)分子由来のタンパク質であり、分解の結果である可能性が高いことを示していた。
HCVコアChimigen(商標)タンパク質を精製および特性検定した
HCVコアChimigen3 タンパク質を、変性条件下Niキレート化クロマトグラフィー(Ni−NTAスーパーフロー)により、次いでカチオン交換クロマトグラフィー(CMセファロース)により精製した。精製タンパク質を12%SDS−PAGEゲルで分析した。主要バンドは融合タンパク質(〜55KDa)であり、28kDaで認められる第2バンドは分解産物であると思われる。12%SDS−PAGEゲルで分離後、精製タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。抗6xHis−HRPコンジュゲート抗体、抗Fc特異的HRPコンジュゲート抗体および抗HCVコア抗体、二次抗体として抗Fab特異的HRPコンジュゲート抗体により、ウエスタン・ブロッティングを実施した。結合抗体を化学発光により検出した。ブロットへの抗体の結合は、精製HCVコア−TBDが無傷のN−末端、コアおよびTBD部分を有することを示していた。さらに、低分子量バンドが全3抗体により検出されたことから、それが、完全長HCVコアChimigen(商標)分子由来のタンパク質であり、分解の結果である可能性が高いことを示していた。
HCVコアChimigen(商標)タンパク質は未成熟DCに結合する
HCVコアChimigen(商標)ワクチンを、その未成熟DCへの結合能力について調べた。4℃で1時間、細胞を様々な濃度のHCVコアChimigen(商標)タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションし、結合をFFCまたは共焦点顕微鏡により検出した。FFC分析については、結合HCVコアChimigen(商標)タンパク質を、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbおよびSA−PE−Cy5により検出した。
HCVコアChimigen(商標)ワクチンを、その未成熟DCへの結合能力について調べた。4℃で1時間、細胞を様々な濃度のHCVコアChimigen(商標)タンパク質の存在および非存在下でインキュベーションし、結合をFFCまたは共焦点顕微鏡により検出した。FFC分析については、結合HCVコアChimigen(商標)タンパク質を、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbおよびSA−PE−Cy5により検出した。
HCVコアChimigen(商標)タンパク質と結合している細胞のパーセンテージ(陽性細胞%)および結合タンパク質の相対量(MFI)をFFCにより測定した。5〜40μg/mLのHCVコアChimigen(商標)タンパク質では、細胞のほぼ100%が結合に関して陽性であり、結合HCVコアChimigen(商標)タンパク質の量は用量依存的に増加していた(図47)。観察された結合の高いMFIは、HCVコアChimigen(商標)タンパク質が非常に有効かつ高レベルで未成熟DCに結合することを示唆していた。
HCVコアChimigen(商標)タンパク質の結合を、同様に共焦点顕微鏡を用いて試験した。結合を、FITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgGで検出した。青色蛍光染料DAPIを用いて、核を映像化した。共焦点画像および対応する光造影は、タンパク質が、4℃で1時間パルス後、未成熟DCの膜に結合していることを示していた。
HCVコアChimigen(商標)タンパク質は未成熟DC上の特異的受容体に結合する
Fcフラグメントの存在により、HCVコア Chimigen(商標)タンパク質は、未成熟DC上のCD32(FcγRII)にTBD領域を介して結合し得ると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、HCVコア Chimigen(商標)タンパク質は、C型レクチン受容体、例えばCD206(MMR)に結合すると予測される。HCVコアChimigen(商標)タンパク質の結合の特異性を測定するため、未成熟DCを、CD32またはCD206に特異的な遮断性mAbの存在下でHCVコア Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。また、競合リガンド、Fcγ受容体についてのマウスIgG Fcフラグメント、およびC型レクチン受容体についてのマンノシル化BSA(mBSA)の存在下でも結合を調べた。
Fcフラグメントの存在により、HCVコア Chimigen(商標)タンパク質は、未成熟DC上のCD32(FcγRII)にTBD領域を介して結合し得ると予測される。さらに、そのマンノースグリコシル化故に、HCVコア Chimigen(商標)タンパク質は、C型レクチン受容体、例えばCD206(MMR)に結合すると予測される。HCVコアChimigen(商標)タンパク質の結合の特異性を測定するため、未成熟DCを、CD32またはCD206に特異的な遮断性mAbの存在下でHCVコア Chimigen(商標)タンパク質とインキュベーションした。また、競合リガンド、Fcγ受容体についてのマウスIgG Fcフラグメント、およびC型レクチン受容体についてのマンノシル化BSA(mBSA)の存在下でも結合を調べた。
未成熟DCを、4℃で1時間、PBS(緩衝液対照)、マウスIgG Fcフラグメント(500μg/mL)、CD32mAb(200μg/mL)、マンノシル化BSA(500μg/mL)、または抗CD206(200μg/mL)とインキュベーションした後、4℃で1時間HCVコア Chimigen(商標)タンパク質(30μg/mL)とインキュベーションした。結合したタンパク質を、ビオチニル化抗マウスIgG1 mAbまたはビオチニル化抗HCVコアmAb、次いでSA−PE−Cy5で検出した。結合したHCVコア Chimigen(商標)タンパク質の相対量(MFI)をFFCにより測定した。結合および阻害試験からの結果は、HCVコア Chimigen(商標)タンパク質が、Fcγ受容体、例えばCD32およびC型レクチン受容体、例えばCD206に結合していることを示した(図48)。
DCによるHCVコア Chimigen(商標)タンパク質提示により、CD8+およびCD4+T細胞において細胞内IFN−γレベルは増加する
HCVコア Chimigen(商標)タンパク質に対する機能的免疫応答を、エクスビボ抗原提示検定法により評価した。未成熟DCに、PBS(緩衝液対照)、テタヌス・トキソイド(陽性対照)、または様々な濃度のHCVコア Chimigen(商標)タンパク質を載せた。DCが成熟すると、それらをオートロガスT細胞とインキュベーションした。Th1サイトカインIFN−γの細胞内レベルの検出により、T細胞機能を評価した。細胞のCD3およびCD8表現型についてもFFCにより測定した。図49AおよびBは、それぞれ抗原付加成熟DCによる3回目の刺激の12時間後にIFN−γを発現するCD8+およびCD4+T細胞のパーセンテージを示す。テタヌス・トキソイドを有効な抗原提示についての陽性対照として用いた。HCVコア Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、無抗原対照と比べるとCD8+T細胞においてIFN−γ発現の著しい増加を誘発した。HCVコア Chimigen(商標)タンパク質付加DCで刺激後、CD4+T細胞集団におけるIFN−γの発現は増加していた。これらの結果は、CD8+およびCD4+の両T細胞集団においてHCVコア Chimigen(商標)タンパク質がIFN−γ応答を誘導することを示しており、分子がMHCクラスIおよびクラスIIの両経路でDCによりプロセッシングされることを示唆している。
HCVコア Chimigen(商標)タンパク質に対する機能的免疫応答を、エクスビボ抗原提示検定法により評価した。未成熟DCに、PBS(緩衝液対照)、テタヌス・トキソイド(陽性対照)、または様々な濃度のHCVコア Chimigen(商標)タンパク質を載せた。DCが成熟すると、それらをオートロガスT細胞とインキュベーションした。Th1サイトカインIFN−γの細胞内レベルの検出により、T細胞機能を評価した。細胞のCD3およびCD8表現型についてもFFCにより測定した。図49AおよびBは、それぞれ抗原付加成熟DCによる3回目の刺激の12時間後にIFN−γを発現するCD8+およびCD4+T細胞のパーセンテージを示す。テタヌス・トキソイドを有効な抗原提示についての陽性対照として用いた。HCVコア Chimigen(商標)タンパク質付加DCは、無抗原対照と比べるとCD8+T細胞においてIFN−γ発現の著しい増加を誘発した。HCVコア Chimigen(商標)タンパク質付加DCで刺激後、CD4+T細胞集団におけるIFN−γの発現は増加していた。これらの結果は、CD8+およびCD4+の両T細胞集団においてHCVコア Chimigen(商標)タンパク質がIFN−γ応答を誘導することを示しており、分子がMHCクラスIおよびクラスIIの両経路でDCによりプロセッシングされることを示唆している。
成熟DCによるHCVコア Chimigen(商標)タンパク質提示は、HCVコア特異的CD8+T細胞の生成を誘導する
HCVコアに対する免疫応答の特異性を評価するため、HLA−B7の状況において免疫優性HCVコアエピトープに特異的なT細胞のパーセンテージを定量した。T細胞を、PEにコンジュゲートしたHCVコアペプチド/HLA−B7四量体で標識することにより、これを達成した。さらに、T細胞をCD4およびCD8特異的mAbで標識した。
HCVコアに対する免疫応答の特異性を評価するため、HLA−B7の状況において免疫優性HCVコアエピトープに特異的なT細胞のパーセンテージを定量した。T細胞を、PEにコンジュゲートしたHCVコアペプチド/HLA−B7四量体で標識することにより、これを達成した。さらに、T細胞をCD4およびCD8特異的mAbで標識した。
HCVコアナイーブT細胞に、異なる濃度のHCVコア Chimigen(商標)タンパク質を載せたDCにより3回刺激を加え、無抗原、テタヌス・トキソイドまたはTBD付加の各対照DCと比較した。3回目の刺激の5日後、T細胞を採取し、HCVコア特異的T細胞を二次元FFCにより検出した。図50における二次元FFCドットプロットは、HCVコア Chimigen(商標)タンパク質を付加したDCとインキュベーションしたT細胞が、コア四量体陽性T細胞で僅かに増加したことを示している。
添付書類を全て含め、米国仮出願第60/726701号の開示を、本明細書では出典明示で援用する。
上記明細書で挙げた出版物、特許出願、および特許については全て、本明細書では出典明示で援用する。記載されている本発明の方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱しなければ当業者には容易に理解できるはずである。本発明について、好ましい実施態様と関連付けて説明したが、請求の範囲で主張されている本発明は、上記実施態様に限定されるわけではないものと理解すべきである。事実、記載されている本発明実施方法の様々な修飾も、当業者には明白なものであり、請求の範囲内に含まれるものとする。
Claims (49)
- 免疫応答を誘導するキメラ抗原であって、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含み、免疫応答ドメインがC型肝炎(HCV)抗原を含み、標的結合ドメインが抗体フラグメントを含む、キメラ抗原。
- 抗体フラグメントが異種抗体フラグメントである、請求項1記載のキメラ抗原。
- キメラ抗原が、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導する、請求項1または請求項2記載のキメラ抗原。
- キメラ抗原が、Th1免疫応答、Th2免疫応答またはTh1およびTh2の両免疫応答を誘導する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 免疫応答がインビボ免疫応答である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 免疫応答ドメインが2個以上のタンパク質を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 免疫応答ドメインが、HCVコア(1〜191)タンパク質、HCVコア(1〜177)タンパク質、HCVp7タンパク質、HCV E1タンパク質、HCV E2タンパク質、HCV E1−E2タンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4Bタンパク質、およびHCV NS5Aタンパク質から成る群から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の1個またはそれ以上の免疫原性部分を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 標的結合ドメインが抗原提示細胞(APC)に結合し得る、請求項1〜7のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 抗体フラグメントがFcフラグメントである、請求項2〜8のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- さらに、6xHis標識、プロテアーゼ開裂部位、および免疫応答ドメインと標的結合ドメインを連結するリンカーのうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- リンカーが、ロイシンジッパー、アビジンに結合したビオチン、および共有結合的ペプチド結合から成る群から選択される、請求項10記載のキメラ抗原。
- キメラ抗原がグリコシル化されている、請求項1〜11のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- キメラ抗原がマンノースグリコシル化されている、請求項1〜12のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 抗体フラグメントが免疫グロブリン重鎖フラグメントを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキメラ抗原。
- 免疫グロブリン重鎖フラグメントがヒンジ領域を含む、請求項14記載のキメラ抗原。
- 免疫グロブリン重鎖フラグメントが、CH1、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインから成る群から選択される抗体フラグメントの全部または一部分を含む、請求項14記載のキメラ抗原。
- 抗原提示細胞への抗原の送達方法であって、抗原提示細胞に請求項1〜16のいずれか1項に記載のキメラ抗原を投与することを含む方法。
- 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項17記載の方法。
- 抗原提示細胞の活性化方法であって、抗原提示細胞を請求項1〜16のいずれか1項に記載のキメラ抗原と接触させることを含む方法。
- 接触がエクスビボ(生体外)で行われる、請求項19記載の方法。
- 接触がインビボ(生体内)で行われる、請求項19記載の方法。
- 接触が人体で行われる、請求項21記載の方法。
- 請求項1記載のキメラ抗原を含む組成物を対象に投与することを含み、抗原提示細胞が対象中に存在する、請求項21または22記載の方法。
- 接触が、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発する、請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞性免疫応答が、Th1応答、Th2応答、およびCTL応答のうちの一つまたはそれ以上である、請求項24記載の方法。
- 対象が、免疫治療可能な状態を有するか、または有すると思われる、請求項23〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫治療可能な状態が急性感染である、請求項26記載の方法。
- 免疫治療可能な状態が慢性感染である、請求項26記載の方法。
- 慢性感染が慢性C型肝炎ウイルス感染である、請求項28記載の方法。
- 免疫治療可能な状態がC型肝炎ウイルス感染であり、免疫応答ドメインが、HCVコア(1〜191)タンパク質、HCVコア(1〜177)タンパク質、HCV E1タンパク質、HCV E2タンパク質、HCV E1−E2タンパク質、HCV P7タンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4Bタンパク質、およびHCV NS5Aタンパク質から成る群から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の1個またはそれ以上の免疫原性部分を含む、請求項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 対象に、ウイルス感染に対するワクチンを接種する、請求項23〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 対象に、ウイルス感染に対するワクチンを予防的に接種する、請求項23〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 対象に、既存のウイルス感染に対するワクチンを治療的に接種する、請求項31または32に記載の方法。
- (a)微生物または細胞、特にキメラ抗原をコード化するポリヌクレオチドを含む微生物または細胞を準備し、次いで
(b)キメラ抗原を発現させる条件下で微生物または細胞を培養する
ことを含むキメラ抗原の製造方法。 - 微生物または細胞が真核生物の微生物または細胞である、請求項34記載の方法。
- 細胞が、酵母細胞、植物細胞または昆虫細胞である、請求項34または35記載の方法。
- キメラ抗原が、グリコシル化を含むように翻訳後修飾されている、請求項34〜36のいずれか1項に記載の方法。
- キメラ抗原が、マンノースグリコシル化を含むように翻訳後修飾されている、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
- キメラ抗原をコードし、免疫応答ドメインをコード化する第1ポリヌクレオチド部分および標的結合ドメインをコード化する第2ポリヌクレオチド部分を含むポリヌクレオチドであって、標的結合ドメインが抗体フラグメントを含むポリヌクレオチド。
- 抗体フラグメントが異種抗体フラグメントである、請求項39記載のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号39および41〜51に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項39〜40のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号40および52〜62に示されたアミノ酸配列から成る群から選択される全アミノ酸配列と少なくとも90%同一であるキメラ抗原をコード化する、請求項39〜41のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号39および41〜51に示されたヌクレオチド配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイゼーションする、請求項39〜42のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項39〜43のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ポリヌクレオチドが、転写調節エレメント(TRE)に機能し得るように結合されている、請求項44記載のベクター。
- 請求項39〜43のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む微生物または細胞。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載のキメラ抗原およびそれを必要とする対象へのキメラ抗原投与に関する指示書を含む製品。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載のキメラ抗原および医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- (a)微生物または細胞、特に標的結合ドメイン−リンカー分子をコード化するポリヌクレオチドを含み、その標的結合ドメイン−リンカー分子がリンカー分子に結合された標的結合ドメインを含んでいる微生物または細胞を準備し、
(b)標的結合ドメイン−リンカー分子が発現される条件下で微生物または細胞を培養し、次いで
(c)免疫応答ドメインへリンカーを結合させ得、その結合によりキメラ抗原を生じさせる条件下で標的結合ドメイン−リンカー分子および免疫応答ドメインを接触させる
ことを含む、キメラ抗原の製造方法。
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A02 | Decision of refusal |
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