JP5200201B2 - 外来抗原に対する宿主の寛容を壊すためのキメラ抗原 - Google Patents

Description

（導入）
（Ａ．関連出願）
本出願は、米国仮出願第６０／４９３，４４９号（２００３年８月８日出願）の優先権を主張し、米国仮出願第６０／４９３，４４９号は、本明細書中に参考として援用される。

（Ｂ．技術分野）
本発明は、免疫応答を引き出すか、または増強させるための方法および組成物、ならびに外来抗原に対して宿主寛容を壊すための方法および組成物に関する。

（Ｃ．背景）
健康な宿主（ヒトまたは動物）が、細菌、ウイルスおよび／または寄生生物由来のタンパク質等の外来抗原に出会うと、宿主は通常は免疫応答を開始する。この免疫応答は体液性応答および／または細胞性免疫応答でありうる。体液性応答において、抗体は、Ｂ細胞により作られ、抗原刺激に対して血液および／またはリンパに分泌される。次に、抗体は、抗原、例えばウイルスを、その表面上の抗原に特異的に結合して、食作用細胞および／もしくは補体仲介機構による破壊のためにそれをマークすることによって、または結合をブロックするか、もしくは循環からの遊離抗原の排除を増強することによって、中和する。細胞性応答は、抗原を含有する細胞を直接または間接的に除去することのできる特定のヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の選択と増殖により特性付けられる。

一部の個体において、免疫系はある種の外来抗原に応答できない。抗原が特定の抗体および／またはキラーＴ細胞の産生を刺激しない場合、免疫系は生じる病気を防止できない。よって、感染因子、例えば、ウイルスは、慢性感染を確立させることができ、宿主免疫系は感染因子により作られる抗原に対して寛容があるものとなる。

感染因子が宿主免疫機構を侵す機構は明確には確立されていないが、宿主免疫系への適当な外来抗原の提示の欠如が慢性的な感染の進展に寄与する因子であろう。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原の局在性に基づきながら出会った抗原を種々に処理する。外因性の抗原はエンドサイトーシスを受け、引き続いて抗原提示細胞のエンドソーム内で処理される。外因性の抗原から生じたペプチドフラグメントは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩと複合した細胞表面に提示される。この複合体のＣＤ４^＋Ｔ細胞への提示は、ＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞を刺激して、外因性の抗原に対して抗体を産生するＢ細胞を刺激するサイトカインを分泌させる（体液性応答）。一方、細胞内抗原は処理され、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩとの複合体として提示される。ＣＤ８^＋Ｔ細胞への抗原提示は、抗原を有する宿主細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫応答をもたらす。

ウイルスまたは寄生生物の慢性的な感染を有する対象において（この生物は生活環中のある時点で宿主細胞内に住む）、抗原は宿主細胞により作られ、宿主細胞中に発現され、そして分泌された抗原は、循環中に存在する。例として、慢性的なヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）キャリアの場合、ビリオンおよびＨＢＶ表面抗原および（ｅ抗原の形態の）コア抗原の代用物が、血液中で検出され得る。

慢性的な感染の効果的な治療は、感染因子に関連した抗原に対する強いＣＴＬ応答を必要とする。これは、抗原を宿主細胞内に作ることによるか、または抗原を適切な細胞区分に送達して、細胞応答を引き出すように抗原が処理および提示されることによって達成することができる。抗原を細胞内に運ぶために、いくつかのアプローチが文献化されている。これらのうち、ウイルスベクター（非特許文献１）、ｃＤＮＡトランスフェクト細胞の使用（非特許文献２）、および注入ｃＤＮＡベクターによる抗原の発現（非特許文献３）；ならびに特許文献１）が文献化されている。さらに、樹状細胞を標的とする抗原を発現させるＤＮＡワクチンが記載されている（非特許文献４）。

ＭＨＣクラスＩ経路プロセシングのために、細胞の細胞質ゾル区画まで抗原を運ぶことができる輸送ビヒクルもまた、利用されてきた。Ｈｉｌｇｅｒｓら（非特許文献５）は、同目標を達成するアジュバントの使用を詳細に説明している。別のアプローチは、オボアルブミンペプチドに対するＴｈ１免疫応答の発生により例示される、抗原の細胞質輸送のための生分解性ミクロスフェアの使用である（非特許文献６；および非特許文献７）。さらに、抗原提示細胞、例えば樹状細胞はＰＬＧＡナノスフェアを取り込む（非特許文献８）。

抗原を捕捉し、処理し、そして提示し、かつナイーブＴ細胞を刺激する樹状細胞の能力から、樹状細胞は治療用ワクチンの開発のために非常に重要な手段となっている（非特許文献９）。抗原を樹状細胞の標的とすることは、抗原提示において重大な工程であり、抗体のＦｃ領域に関して樹状細胞上のいくつかのレセプターの存在が、この目的のために利用されている（非特許文献１０）。このアプローチのさらなる例として、卵巣癌Ｍａｂ−Ｂ４３．１３、抗ＰＳＡ抗体ならびに抗ＨＢＶ抗体抗原の複合体が挙げられる（非特許文献１１）。腫瘍関連抗原を負荷した樹状細胞を用いる癌免疫治療は、腫瘍に特異的な免疫応答と抗腫瘍活性とを作ることが示されている（非特許文献１２；および非特許文献１３）。腫瘍抗原のパルスを受けた樹状細胞を用いたインビボ臨床試験で有望な結果が得られた（非特許文献１４）。これらの研究は、癌抗原に対して免疫応答を作るために樹状細胞を用いる効能を明らかに示している。

抗原提示はまた、抗原提示細胞上のＦｃレセプターの利用の代わり、またはそれに加えてマンノースレセプターによって影響を受けることもできる。ＣＤ２０６としても公知のマクロファージマンノースレセプター（ＭＭＲ）は、樹状細胞（ＤＣ）等の抗原提示細胞上に発現する。この分子は、エンドサイトーシスレセプターのＣ型レクチンファミリーのメンバーである。マンノシル化抗原は、ＣＤ２０６によって、結合し得、そして内在化され得る。一般的に、外因性の抗原は主にＭＨＣクラスＩＩ経路により処理、提示されると考えられる。しかし、ＣＤ２０６を経た標的化の場合、ＭＨＣクラスＩとクラスＩＩとの両方の経路が関わっているとの証拠が存在する（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。
米国特許第５，５８９，４６６号明細書 Ｌｏｒｅｎｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：６２３−６３１（１９９９） Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７（１９９７） Ｌａｉら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４４９−４８４（１９８８） Ｙｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：３７０４−３７１１（２００１） Ｈｉｌｇｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２１９−２２８（１９９９） Ｎｅｗｍａｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５４：４９−５９（１９９８） Ｎｅｗｍａｎら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ ５０：５９１−５９７（２０００） Ｎｅｗｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ ６０：４８０−４８６（２００２） Ｌａｕｐｅｚｅら、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６０：５９１−５９７（１９９９） Ｒｅｇｎａｕｌｔら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：３７１−３８０（１９９９） Ｗｅｎら、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：２５１−２５８（１９９９） ＦｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｍａｎ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９６：１８６５−１９７２（２０００） Ｃａｍｐｔｏｎら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１５：５７−６１（２０００） ＴａｒｔｅおよびＫｌｅｉｎ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：６５３−６６３（１９９９） Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１７１４（２０００） ＡｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：４６９（２００１） Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２８４５−２８５２（２００４）

感染性の病気および癌は、大きな社会的健康問題である。例えば、世界保健機関の統計は、２０億を超える人々がＨＢＶに感染していることを示す。これらのうち、３億７千万人が慢性感染であり、その結果、肝臓の肝硬変および肝臓細胞の癌腫の発症の高い確率を有する。世界中の約１億７千万の人々がＨＣＶの慢性キャリアであり、それに対する効果的な予防ワクチンまたは治療ワクチンは存在しない。世界保健機関は、毎年１千万の人々が癌であると診断されていると報告している。癌は毎年、世界中の死の１２％にあたる６百万人の死を引き起こす。よって、感染および癌に対して免疫応答を引き出すための治療的に有効な新しい組成物および方法、ならびにこのような組成物を生成するための方法に対する必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、免疫応答を引き出すためのキメラ抗原を提供し、このキメラ抗原は、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含み、上記標的結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。

本発明のもう一つの特徴は、抗原提示細胞において抗原提示を増強する方法であって、上記抗原提示細胞を本発明のキメラ抗原を含む組成物と接触させる工程を包含する方法を提供する。

本発明のさらにもう一つの特徴は、抗原提示細胞を活性化する方法であって、上記抗原提示細胞を本発明のキメラ抗原に接触させる工程を包含する方法を提供する。

本発明の一つの特徴は、免疫応答を引き出す方法であって、本発明のキメラ抗原を含有する組成物を対象に投与する工程を包含する方法を提供する。

本発明のもう一つの特徴は、寛容を壊す方法であって、本発明のキメラ抗原を対象に投与する工程を包含する方法を提供する。好ましい実施態様において、上記対象は、ウイルスまたは偏性細胞内寄生生物に慢性感染している。

本発明の一つの特徴は、免疫治療が可能な症状を治療する方法であって、治療的有効量の本発明のキメラ抗原を、治療を必要とする対象に投与する工程を包含する方法を提供する。好ましい実施態様において、免疫治療が可能な症状は感染、特に慢性感染または癌である。

本発明のさらにもう一つの特徴は、感染に対して対象をワクチン接種する方法であって、本発明のキメラ抗原を対象に投与する工程を包含する方法を提供する。上記対象は、予防的または治療的にワクチン接種され得る。好ましい実施態様において、上記対象は、キメラ抗原の二つ以上のエピトープ、そしてより好ましくは免疫応答ドメインの二つ以上のエピトープに対する免疫応答を発達させる。好ましくは、上記感染は、ウイルス感染または偏性細胞内寄生生物の感染である。

本発明のもう一つの特徴は、本発明のキメラ抗原および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。

本発明の一つの特徴は、本発明のキメラ抗原と、治療が必要な対象に対するキメラ抗原を投与するための説明書とを含む製品を提供する。

本発明のもう一つの特徴は、キメラ抗原をコードするポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは免疫応答ドメインをコードする第一のポリヌクレオチド部分と標的結合ドメインをコードする第二ポリヌクレオチド部分とを含み、この標的結合ドメインが抗体フラグメントを含む。また、本発明は、このようなポリヌクレオチドを含む微生物および細胞株を提供する。

本発明のさらにもう一つの特徴は、本発明のキメラ抗原を作製する方法を提供し、この方法は、本発明のキメラ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む微生物または細胞株を提供する工程、および上記キメラ抗原が発現される条件下で上記微生物または細胞株を培養する工程を包含する。

本発明の一つ以上の実施態様の詳細を、添付の図面および下記の説明に示す。本発明の他の特徴、目的および利点は、下記の説明および図面から、および請求の範囲から明らかであろう。

（ＩＶ．詳細な説明）
（Ａ．概説）
抗原に対する免疫応答を引き出すための組成物および方法を、本明細書において開示する。具体的には、この化合物および方法は、本来は宿主により「自己」抗原として認識される外来性の抗原に対して免疫応答を引き出すので、これらの抗原に対する宿主の寛容を壊す。免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン（この標的結合ドメインは、抗体フラグメントを含む）を含むキメラ抗原を、宿主の免疫系に提示することは、外来性または寛容化された抗原に対する免疫応答を増強する。抗原提示細胞は、上記キメラ抗原を取り込み、処理し、そして提示して、所望の抗原に対して体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を引き出す。

（Ｂ．定義）
本発明をさらに詳しく説明する前に、本出願で用いられる用語は、特に示さないかぎり下記のように定義される。

「抗体」とは、抗原（免疫原）によりヒトまたは他の動物に引き起こされた特定のアミノ酸配列を有する、Ｂリンパ系細胞によって産生された免疫グロブリン分子をいう。これらの分子は他の用語で各々定義される抗原と特異的に反応することにより特徴付けられる。

「抗体応答」または「体液性応答」とは、抗体がＢリンパ系細胞により作られ、抗原の刺激により血液および／またはリンパに分泌される、ある型の免疫応答をいう。適切に機能する免疫応答において、上記抗体は、細胞（例えば、病原体）表面上の抗原に特異的に結合し、食細胞および／または補体仲介機構による破壊のために上記細胞にマークする。また、抗体は全身を循環し、遊離ビリオンに結合することができる。この抗体結合は、ビリオンを中和してビリオンが細胞に感染することを妨げ得、そして食作用や腎臓でのろ過によって循環から除去するために、ビリオンをマークする。

「抗原」とは、適当な細胞との接触の結果、感受性および／または免疫応答性の状態を誘導し、インビボまたはエキソビボで感作対象の抗体および／または免疫細胞に明白な方法で反応する任意の物質をいう。

「抗原提示細胞」とは、主に抗原を扱って、これをリンパ球に提示することにより機能する抗原誘導事象の補助細胞をいう。抗原提示細胞の抗原との相互作用は、リンパ球を抗原分子に会わせて認識させ、リンパ球を活性化させることができるので、免疫誘導において必須の工程である。例示的な抗原提示細胞としては、マクロファージ、ランゲルハンス樹状細胞、濾胞樹状細胞およびＢ細胞が挙げられる。

「Ｂ細胞」とは、抗原と相互作用する免疫グロブリンまたは抗体を産生する、ある型のリンパ球をいう。

「Ｃ_Ｈ１領域」とは、抗体の抗原結合フラグメント上の重鎖定常ドメインの領域をいう。

「細胞性応答」とは、ウイルス感染細胞または癌細胞を直接に除去することができる特定のヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞により仲介される、ある型の免疫応答をいう。

本明細書中で使用される場合、「キメラ抗原」との用語とは、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含むポリペプチドをいう。免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインは、共有的手段または非共有的手段により直接的に結合してもよいし、間接的に結合してもよい。

「細胞傷害性Ｔリンパ球」とは、外来細胞、およびウイルス性抗原を作る感染因子に感染した宿主細胞を破壊することのできる、特化された型のリンパ球である。

「エピトープ」とは、複合抗原分子上の最も単純な形の抗原決定基をいう。これは免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターにより認識される抗原の特定部分である。

「融合タンパク質」とは、二つ以上の遺伝子配列を組み合わせることにより作られたハイブリッド遺伝子の発現により形成されるタンパク質をいう。

「ヒンジ領域」とは、ＦａｂフラグメントをＦｃフラグメントに結合させる抗体部分をいう。このヒンジ領域は、二つの重鎖を共有結合させるジスルヒド結合を含有する。

「相同」との用語は、例えば、対応する位置で同じまたは類似である化学残基の配列を有することによって、別の分子と相同性を示す分子をいう。「％相同の」または「％相同性」の語句は、同一または類似である相同性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同一位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセントをいう。例えば、二つのタンパク質中で８０残基のうち７５残基が同一である場合、それら二つのタンパク質は９３．７５％相同性である。％相同性は当業者に公知の多様なソフトウエアプログラムを用いて決めることができる。

「宿主」とは、感染または癌等の免疫治療が可能な症状に苦しむ温血動物（ヒトを含む）をいう。ここで用いる「宿主」はまた、キメラ抗原が投与される温血動物（ヒトを含む）も言及する。

本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴマー化合物の相補鎖が対となることを意味する。本発明において、対となる好ましい機構は、水素結合を伴うもので、これは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基（ヌクレオ塩基）間でのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆向きＨｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であってよい。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成により対となる相補的なヌクレオ塩基である。ハイブリダイゼーションは、多様な状況下で起こりうる。ポリヌクレオチドの文脈において用いられる場合、「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイズしている」等の用語は、慣用的なハイブリダイゼーション条件、好ましくは、ハイブリダイゼーション温度が３７℃超で、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄温度が５５℃超である、５０％ホルムアルデヒド／６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｍＤＮＡでのハイブリダイゼーション等の条件をいう。

「免疫」または「免疫応答」は、抗原に対する体の応答をいう。特定の実施態様において、体が感染疾患に対してそれ自体を抵抗するか、または保護する能力をいう。

「免疫応答ドメイン（ＩＲＤ）」とは、二官能性キメラ抗原分子の多様な構造の抗原性部分をいう。この免疫応答ドメインは、一つ以上の抗原および／または一つ以上の組換え抗原を含む。

本明細書において使用される場合、「免疫治療が可能な症状」との語句は、対象の免疫応答を引き出すか、または調節することにより防止、抑制あるいは緩和することのできる症状または病気をいう。

「リンパ球」とは、特定の免疫応答を仲介する血液中に見られる有核細胞の部分集合をいう。

「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、融合ハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマ細胞のクローンまたは遺伝的に均一な集団から作られた抗体をいう。ハイブッド細胞は、クローニングされて、化学的および免疫学的に均一な（すなわち一つの型のみの抗原を認識する）特定のモノクローナル抗体を産生する細胞株を確立する。

「ペプチド結合」は、１つのアミノ酸のαアミノ基と別のアミノ酸のαカルボキシル基との間の置換アミド結合により共有結合した二つ以上のアミノ基をいう。

「薬学的に受容可能な」とは、ヒトまたは他の動物に生理学的に適合する毒性のない組成物をいう。

「薬学的に受容可能な賦形剤」は、毒性がなく、ヒトまたは他の動物に生理学的に適合性のあるアジュバント、キャリア、ｐＨ調節剤および緩衝剤、浸透圧調節剤、湿潤剤、保存剤等の物質を含む。

本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」との用語は、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドのいずれかの長さのヌクレオチドの多量形をいう。この用語は、分子の一次構造のみをいう。よって、この用語は、二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。また、公知の型の改変、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、一つ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、未荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）による修飾、ペンダント部分（例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）を含む）を含む改変、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）による改変）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例えば、αアノマー核酸等）による改変、ならびにポリヌクレオチドの非改変形態など、公知の種類の改変も挙げられる。

「プロテアーゼ切断部位」とは、タンパク質分解酵素がポリペプチド鎖を加水分解する（壊す）部位をいう。

本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェント条件」との語句は、本発明の化合物がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とのハイブリダイズは最小限とする条件をいう。

「対象」との用語は、温血動物、好ましくはヒトをいう。

「タグ」とは、タグを含む分子を単離または精製するために用いられる、マーカーまたはマーカー配列をいう。例示的なタグとしては６×Ｈｉｓタグが挙げられる。

「Ｔ細胞」とは、抗原特異的な細胞相互作用に関与し、体液性免疫応答および細胞性免疫応答を仲介する型のリンパ球をいう。

「標的結合ドメイン（ＴＢＤ）」とは、抗原提示細胞上、特に樹状細胞上のレセプターに結合することができ、引き続いてレセプター仲介取り込みにより抗原提示細胞内に輸送される、抗体フラグメントを含むタンパク質をいう。

「治療的有効量」とは、抗原に対して効果的なＢ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／またはヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）の応答を引き出して、病気または疾患の症状および／または合併症を阻止するか、または治療するか、もしくは少なくとも部分的に抑制するか、もしくは遅らせるのに十分なキメラ抗原の量またはキメラ抗原をコードするポリヌクレオチドの量をいう。

本明細書中で使用される場合、「治療する」および「治療」との用語は、動物（特に、ヒト）においてキメラ抗原により治療可能な症状の任意の治療を包含し、（ｉ）症状が起こりやすいが、その症状があるとはまだ診断されていない対象にこの症状が起こることを妨ぐ、（ｉｉ）症状の抑制（例えば、その進展を停止または遅らせる）；または（ｉｉｉ）症状の緩和（例えば、症状またはその徴候の低減を引き起こすこと）を含む。

本明細書において使用される場合、「異種型」とは、宿主以外の異なる種に由来することをいう。例えば、マウスのゲノムからクローニングされた組換え発現の抗体は、組換え発現の抗体が細菌、昆虫またはマウスの細胞のいずれで作られるかにかかわらず、ヒトに対して異種型であるが、マウスに対しては異種型ではないということである。

（Ｃ．新規なキメラ抗原）
本発明は、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインを含む免疫応答を引き出すためのキメラ抗原において、この標的結合ドメインが抗体フラグメントを含むキメラ抗原を提供する。本発明に従って、キメラ抗原は好ましくはＦｃレセプターおよび／またはマクロファージマンノースレセプターに結合できる。この抗体フラグメントは宿主に対して異種型であっても、宿主に対して異種型でなくてもよい。

本発明の好ましい実施態様において、キメラ抗原は体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することができる。細胞性免疫応答として、Ｔｈ１応答、Ｔｈ２応答および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を挙げることができる。さらに別の好ましい実施態様において、キメラ抗原は多エピトープ性免疫応答を引き出す。多エピトープ性免疫応答としては、免疫応答ドメインの少なくとも一つのエピトープに対する応答および／または標的結合ドメインの少なくとも一つのエピトープに対する応答を挙げることができる。あるいは、多エピトープ性応答は免疫応答ドメインの二つ以上のエピトープに対する応答に限定してもよい。

本発明のキメラ抗原は、二つの部分、すなわち、抗原性配列（ウイルス抗原等）を含む免疫応答ドメインと、抗体フラグメントを含む標的結合ドメインとを含む（図１）。好ましい実施態様において、上記免疫応答ドメインは、当業者に公知の任意の方法によって標的結合ドメインに結合させることができる。免疫応答ドメインを標的結合ドメインに結合させるためのリンカーとしては、共有ペプチド結合、化学接合、ロイシンジッパーおよびビオチン／アビジンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、上記免疫応答ドメインおよび標的結合ドメインは、単一の融合タンパク質としてクローニングすることができる。融合タンパク質の共有ペプチド結合は、付加的なペプチド配列、例えばＳＲＰＱＧＧＧＳまたはＶＲＰＱＧＧＧＳ（配列番号１）を含んでよい。さらに別の好ましい実施態様において、多様な免疫応答ドメインがビオチン化され、そして標的結合ドメインは、ストレプトアビジンを有する融合タンパク質として作られて、キメラ抗原の広い類別の産生に役立つ。あるいは、免疫応答ドメインと標的結合ドメインはそれぞれ、ロイシンジッパー部分との融合物として発現させることができ、キメラ抗原の二つの部分は混合の際に会合させられる。最後に、免疫応答ドメインと標的結合ドメインを別個に発現させて、次に当業者に公知の方法を用いて化学的に接合させることができる。例示的な方法は、それら２つのドメインを共有結合させるスベルイミノ酸ジメチル等のタンパク質架橋剤の使用を含む。

免疫応答ドメインは主にキメラ抗原の抗原性の部分を提供する。この免疫応答ドメインは、免疫応答が望まれるものの全体の少なくとも一つの抗原性部分を含有する。このキメラ抗原は、必要に応じて二つ以上の免疫応答ドメインを含有してもよい。好ましい実施態様において、上記免疫応答ドメインは、ウイルスまたは偏性細胞内寄生生物等の感染因子、あるいは癌抗原の少なくとも一つの抗原性部分を含有する。より好ましくは、上記免疫応答ドメインは、感染性ウイルスの少なくとも一つの抗原性部分を含む。

好ましい感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩとも称されるヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）；および他の単離物、例えばＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水ほう性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ））；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペルウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘そうウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ））；および分類されていないウイルス（例えば、δ肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｄｅｓ）因子、非Ａ型、非Ｂ型肝炎因子（クラス１、内部伝染）；クラス２、非経口伝染；ノルウォークウイルスと関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられる。本発明の一部実施態様において、キメラ抗原の免疫応答ドメインは、ＨＢＶタンパク質、ＤＨＢＶタンパク質およびＨＣＶタンパク質からなる群から選択される一つ以上のタンパク質の少なくとも一つの抗原性部分を含む。本発明に使用される特に好ましいＨＢＶタンパク質として、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２／Ｓ、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ ｃｔｍ（Ｃ末端改変）、ＨＢＶ ｅ抗原およびＨＢＶポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に使用される特に好ましいＤＨＢＶタンパク質としては、ＤＨＢＶ ＰｒｅＳ／Ｓ、ＤＨＢＶ ＰｒｅＳ、ＤＨＢＶ ＣｏｒｅおよびＤＨＢＶポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に使用される特に好ましいＨＣＶタンパク質としては、ＨＣＶ Ｃｏｒｅ（１−１９１）、ＨＣＶ Ｃｏｒｅ（１−１７７）、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２、ＨＣＶ Ｅ１、ＨＣＶ Ｅ２、ＨＣＶ ＮＳ３、ＨＣＶ ＮＳ５ＡおよびＨＣＶ ＮＳ４Ａが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いられる他の好ましいウイルス抗原としては、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＳＶアルカリヌクレアーゼおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）キャプシドタンパク質Ｌ１およびＬ２、および初期領域タンパク質ＨＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ４、ＨＰＶ Ｅ５、ＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７が挙げられる。

好ましい偏性細胞内寄生生物の例として、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｓｐ．（例えば、Ｔ．ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｉｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｐｒａｇｕｅａ ｓｐ．（例えば、Ｓ．ｌｏｐｈｉｉ）、Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐ．，Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．（例えば、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ、Ｔ．ｃｒｕｚｉ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．（例えば、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｃ．ｂｒｕｎｅｔｔｅ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｅｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．およびＢａｒｔｏｎｅｌｉａ ｓｐ．が挙げられる。好ましい癌抗原として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＭＵＣ１、ＣＡ １２５、ＷＴ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＳＯ−１、ＣＡ１９．９、ＴＡＧ７２、ＣＡ １５．３、ＣＡ ２７．９、ｇｐ１２０、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ヒートショックタンパク質、αフェトタンパク質（ＡＦＰ）、テロメラーゼおよびｒａｓが挙げられる。

本発明のもう一つの実施態様において、キメラ抗原の免疫応答ドメインは、一つ以上の抗原性部分に融合させた６×Ｈｉｓタグを包含する。

本発明にしたがえば、上記キメラ抗原は、抗原提示細胞上、特に樹状細胞上のＦｃレセプターおよび／またはＣＤ２０６に結合することのできるタンパク質であり、このキメラ抗原は、次いでレセプター仲介取り込みにより抗原提示細胞中に輸送される。本発明にしたがえば、抗体フラグメントの存在は、抗原提示細胞上、具体的には樹状細胞上のＦｃレセプターによるキメラ抗原の取り込みを増強する。ウイルスのこの特異的な結合と細胞内への取り込みによって、ウイルス抗原が処理されて、外来物として提示される。よって、免疫応答は、前もって寛容化された抗原に対して効果的に引き出され得る。標的結合ドメインは宿主に対して異種型であっても、異種型でなくてもよい抗体フラグメントを含んでいる。本発明の好ましい実施態様において、上記抗体フラグメントはマウスのＦｃフラグメントを含む。本発明のさらに好ましい実施態様において、標的結合ドメインは、Ｆｃフラグメント、ヒンジ領域、およびＣ_Ｈ１領域の一部を含み、上記キメラ抗原は、標的結合ドメインを免疫応答ドメインに結合させるのに適当なペプチドリンカーを含む。もう一つの好ましい実施態様において、標的結合ドメインは免疫グロブリン重鎖フラグメントを含み、必要に応じてさらにヒンジ領域を含む。特に好ましい実施態様において、重鎖フラグメントは、Ｃ_Ｈ１ドメインのアミノ酸ＶＤＫＫＩ（配列番号２）および／またはＣ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインの一部またはすべてを含む。

上記のように、ＣＤ２０６により結合され、細胞内に取り込まれた抗原は、ＭＨＣクラスＩとクラスＩＩの両方によって提示されて、細胞性と体液性の両方の免疫応答を引き出すことができる。したがって、好ましい実施態様では、キメラ抗原がグリコシル化される。免疫応答ドメインおよび／または標的結合ドメインは、グリコシル化することができる。特に好ましい実施態様において、キメラ抗原は高マンノースグリコシル化（ｈｉｇｈ ｍａｎｎｏｓｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）または低マンノースグリコシル化（ｐａｕｃｉ ｍａｎｎｏｓｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のいずれかによりマンノースグリコシル化されている（Ｊａｒｖｉｓ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１０：１−７（２００３））。

（Ｄ．キメラ抗原を利用する新規な方法）
本発明は、免疫応答を引き出す方法を包含し、この方法は、本発明のキメラ抗原を含有する組成物を、対象に投与する工程を包含する。

抗原の十分な提示を提供するために、本発明者らは、免疫応答ドメインと標的結合ドメインとを含む新規のキメラ抗原を開発している。この標的結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。発明の特別な理論に限定されるわけではないが、この分子は、その抗体フラグメントのおかげで、抗原提示細胞上の特定のレセプターに結合し、ウイルス抗原が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩと複合体化するように処理、提示される。ＭＨＣクラスＩによるそのような処理と抗原提示は、細胞傷害性Ｔリンパ球による増強応答を引き出して、結果として免疫応答ドメインの抗原に会合する任意の感染因子の除去をもたらす。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原提示は、感染細胞および／または循環から抗原のクリアランスをも助ける体液性応答を引き出す。

また、本発明は、寛容を壊す方法を包含し、この方法は、本発明のキメラ抗原を対象に投与する工程を包含する。キメラ抗原を用いることによって細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を引き出すための抗原の提示において、慢性的な感染の間に「自己」として扱われた抗原は、「外来性」として認識される。したがって、宿主の免疫系はＣＴＬ応答を開始させて感染細胞を除去する。同時に、キメラ抗原に対する応答において誘発された抗体は、感染因子に結合し、感染因子を循環から除去するか、または宿主細胞に対する感染因子の結合を阻止する。したがって、本来は宿主免疫系により寛容化される慢性的な感染を有する対象において、広い免疫応答を誘導しうるキメラ抗原を作るように、本発明は設計される。好ましい実施態様において、上記キメラ抗原は、ウイルスまたは寄生生物等の感染因子により慢性的に感染しているか、または癌を有する対象において、抗原に対する寛容を破壊する。さらに好ましくは、感染因子はその生活環中のある時点で宿主細胞に内在する。

好ましい実施態様において、宿主免疫系により認識されないか、寛容化される前選択された抗原の免疫原性は、抗原フラグメントの存在に起因して、ならびに真核細胞（例えば昆虫細胞）発現系に導入されたグリコシル化の存在により増強される。そのようなキメラ抗原は、抗体成分およびグリコシル化の存在に起因して、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および顆粒球等の多様な免疫細胞型に存在する特定のレセプターに結合する。

本発明のさらに別の特徴は、抗原提示細胞を活性化する方法を提供し、この方法は、上記抗原提示細胞を本発明のキメラ抗原に接触させる工程を包含する。また、本発明は、抗原提示細胞において抗原提示を増強する方法を提供し、この方法は、本発明のキメラ抗原を含有する組成物に抗原提示細胞を接触させる工程を包含する。上記キメラ抗原は抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞にインビボまたはエキソビボで接触させることができる。好ましい実施態様において、キメラ抗原を抗原提示細胞に接触させることは、抗原提示細胞を活性化し、二つ以上のエピトープの抗原提示を促進する。この多エピトープ性応答としては、免疫応答ドメインの一つ以上のエピトープの提示および／または標的結合ドメインの一つ以上のエピトープの提示を挙げることができる。

また、本発明は、免疫治療が可能な症状を治療する方法を提供し、この方法は、治療的有効量の本発明のキメラ抗原を、治療を必要とする対象に投与する工程を包含する。好ましい実施態様において、免疫治療が可能な症状は感染または癌である。上記感染は、ウイルス感染、寄生生物感染または細菌感染であってよい。好ましくは、この感染は、感染因子が宿主細胞内に見られる段階を有する。さらに好ましくは、免疫治療が可能な症状は慢性のウイルス感染である。最も好ましくは、免疫治療が可能な症状は慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染または慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染である。ＨＢＶの治療のために、上記免疫応答ドメインは、好ましくは、ＨＢＶ Ｃｏｒｅタンパク質、ＨＢＶ Ｓタンパク質、ＨＢＶ Ｓ１タンパク質、ＨＢＶ Ｓ２タンパク質およびそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一つの抗原性部分を含む。ＨＣＶの治療のために、上記免疫応答ドメインは好ましくはＨＣＶ Ｃｏｒｅ（１−１９１）タンパク質、ＨＣＶ Ｃｏｒｅ（１−１７７）タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１−Ｅ２タンパク質、ＨＣＶ ＮＳ３Ａタンパク質、ＨＣＶ
ＮＳ５Ａタンパク質およびそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一つの抗原性部分を含む。

好ましい実施態様において、キメラ抗原の投与は免疫応答ドメインのみの投与よりもさらに高い免疫応答を引き出す。免疫応答の大きさは、例えば、（ｉ）対象に存在する抗原特異的な抗体の量により、（ｉｉ）キメラ抗原または免疫応答ドメインのみを負荷した抗原提示細胞に対して曝されることに応答してＴ細胞により分泌されたインターフェロンγの量により、または（ｉｉｉ）キメラ抗原または免疫応答ドメインのみを負荷した抗原提示細胞に対して曝されることに応答してもたらされた抗原特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の量により、測定され得る。

キメラ抗原は、免疫応答を生じるその効能について、該キメラ抗原を樹状細胞にエキソビボまたはインビボで提示することによって評価することができる。上記樹状細胞は、Ｔ細胞応答のマーカーとしてＴ細胞の増殖およびインターフェロンγの産生に関して評価されるＴリンパ球に対して、キメラ抗原を処理し、提示する。具体的に、エキソビボ状況で、ナイーブ樹状細胞は、末梢血液から単離される。上記樹状細胞によるＴ細胞の活性化は、マーカー、例えばインターフェロンγレベルを公知の操作で測定することによって評価される。例えば、Ｂｅｒｌｙｎら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０１（３）：２７６−２８３（２００１）を参照のこと。インターフェロンγを分泌するＴ細胞の比率の少なくとも５０％までの増加は、インビボでの効能を予想させる。インビボ状況の場合、上記キメラ抗原は、利用可能な樹状細胞および他の抗原処理細胞が抗原と相互作用でき、よってそれらを処理する能力を有する宿主に直接に非経口で導入される。

さらに、本発明は、感染に対して対象をワクチン接種する方法を包含し、本方法は、本発明のキメラ抗原を対象に投与する工程を包含する。上記対象は、予防的または治療的にワクチン接種され得る。好ましくは、上記感染はウイルス感染である。分子の二官能性の性質は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞を抗原の標的とするのに役立ち、抗体に対して抗原の最も効果的な化学量にて特異的に抗原提示細胞を標的とすることによって、慢性的な感染疾病の治療において独自のアプローチとなる。これは、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルスおよび単純ヘルペスウイルス等の慢性ウイルス感染、偏性細胞内寄生生物感染を治療する治療ワクチンの開発に有用であり、癌および自己免疫疾患等の病気におけるすべての自己抗原に適用可能でもあり得る。これらの融合タンパク質の投与は、細胞性および体液性の両方の応答を含め、宿主から広い免疫応答を引き出すことができる。よって、これら融合タンパク質は、特別な感染を発症させる危険のある対象を免疫するための予防ワクチンとして有用であることに加えて、既存の感染に対して免疫寛容性である対象を治療する治療ワクチンとして使用することができる。

（Ｅ．キメラ抗原の製造方法）
本発明の一つの特徴は、キメラ抗原を作製するための方法を提供し、この方法は、以下、（ａ）キメラ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む微生物または細胞株を提供する工程であって、この微生物または細胞株は、好ましくは真核細胞であって、より好ましくは非哺乳動物の微生物または細胞株である、工程；および（ｂ）上記微生物または細胞株を、キメラ抗原が発現される条件下で培養する工程、を包含する方法である。好ましくは、上記微生物または細胞株は酵母、植物細胞株または昆虫細胞株である。さらに好ましくは、上記細胞株は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）からなる群から選択される昆虫細胞株である。

本発明の一実施態様は、本発明を実施するために必要な選択された抗原と標的結合ドメインとの融合タンパク質を作るために、確立された組換えＤＮＡ技術を使用する。融合タンパク質構築物は、所望のＤＮＡフラグメントを発現ベクターに導入するために利用される特定の制限酵素部位を導入して、ＤＮＡレベルで作られ、これを用いて異種発現系において所望の融合タンパク質を発現させる。ここで用いる「ベクター」との用語は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを運ぶことのできるプラスミドをいう。本発明に使用される好ましいプラスミドベクターとしては、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａおよびＤＨ１０Ｂａｃ（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で作られたその対応する組換え「バクミド（ｂａｃｍｉｄ）」が挙げられるが、これらに限定されない。

標的結合ドメインをコードする遺伝子は、抗体産生細胞、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得ることができる。後者のクローニング工程を容易にするために、独自の制限酵素認識部位を加えるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することが望ましい。同様に、免疫応答ドメインの抗原性部分は、所望の標的の抗原性部分をコードする遺伝子を含む任意の細胞またはウイルスＲＮＡもしくはウイルスＤＮＡから得ることができる。好ましくは、ＰＣＲを用いて、免疫応答ドメインの抗原性部分をコードするＤＮＡを得て、ＰＣＲプライマーを設計して、クローニングを容易にする独自の制限酵素認識部位を付加する。しかし、任意の組換えＤＮＡ法を用いて、免疫応答ドメインの抗原性部分をコードするＤＮＡが得られ得る。次に、標準的なクローニング技術を用いて、標的結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと免疫応答ドメインをコードするポリヌクレオチドとを単一の構築物に組み合わせることができる。もしくは、それら別々のドメインは、ロイシンジッパー、ストレプトアビジンまたはビオチニル化シグナル等のＤＮＡコードリンカーとともにクローニングされ得る。

大量の異種タンパク質が作られるという理由のみならず、真核生物のタンパク質のリン酸化やグリコシル化等の翻訳後改変が感染昆虫細胞内で起こるという理由から、バキュロウイルス系を用いて本発明のキメラ抗原を発現させるのが好ましい。昆虫細胞への直接のクローニングは困難でありうるために、キメラ抗原をコードするポリヌクレオチドを細菌系において作成し、その最終構築物をバキュロウイルス／昆虫細胞発現系に転移させることが好ましい。転移システム、例えば、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は当業者に公知である。このＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）系は、細菌トランスポゾンＴｎ７による部位特異的転位を利用して、所定の遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ−昆虫細胞シャトルベクター（バクミド）に転移させる。得られる組換えバクミドは、昆虫細胞にトランスフェクションされ、組換えタンパク質を発現するバキュロウイルスを作る。

バキュロウイルスを作るために、上記バクミドを、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞にトランスフェクションする。トランスフェクション後、この細胞を、バキュロウイルス集団を増殖させるのに十分な時間インキュベートする。バキュロウイルスを含む培地を集めて、４℃、暗所で保存する。このトランスフェクションは、所望のＤＮＡ挿入物に対して特異的なプライマーを利用するＰＣＲにウイルス培養物を供して、バキュロウイルスＤＮＡの生産を調べることにより実証され得る。上記細胞中の異種タンパク質の発現は、任意の公知の方法、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはウエスタンブロットにより実証され得る。

標準的な感染効率（ＭＯＩ）の組換えバクミドを用いて、昆虫細胞を感染させる。細胞を約３×１０^５細胞／ｍＬの密度で撒き、細胞密度が約２〜３×１０^６細胞／ｍＬに達するまで懸濁培養（２７．５℃、攪拌下）にてインキュベートする。次に、標準化量の各組換えバキュロウイルスを細胞に加える。インキュベーション温度は２７．５℃で、適切な感染時間は個々のタンパク質発現のについて標準化される。細胞を遠心分離により集め、組換えタンパク質の精製に用いる。細胞の使用しない部分は、液体窒素中で瞬時に凍らせて、−７０℃で保存され得る。

キメラ抗原は、好ましくは変性条件下で精製される。キメラ抗原を発現する細胞は変性緩衝液、例えば６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有する緩衝液に可溶化される。可溶化は超音波処理等の機械的手段により高めることができる。溶解物を遠心して、未破壊細胞と細胞破片を除去する。次に、上清を、前もって可溶化緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒ Ｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）ビーズカラムにロードする。ロードした後に、カラムを緩衝性変性溶液、好ましくは、約ｐＨ８の６ＭグアニジンＨＣｌを含有する変性溶液で洗浄する。この時点で、この変性剤を例えば緩衝溶液中の８Ｍ尿素に交換することができる。可溶化緩衝液、ローディング緩衝液および洗浄緩衝液は好ましくは低濃度、例えば１〜４０ｍＭのイミダゾールを含有する。緩衝液の交換後、カラムをＯＤ_２８０が例えば＜０．１に低下するまで緩衝液で洗浄しなければならない。結合タンパク質は、８Ｍ尿素と２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）を含有する緩衝液（溶出緩衝液）で溶出させ得る。タンパク質を含有する画分をプールして、低濃度（例えば、１００ｍＭ）塩の（好ましくは８Ｍ尿素を含有する）変性透析緩衝液に対して緩衝液を数回交換しながら４℃で透析する。次に、透析タンパク質を、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）等のイオン交換カラムにかける。好ましい実施態様において、イオン交換カラムにかける前に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤をタンパク質に加える。キメラ抗原はＤＥＡＥカラムを通過する。したがって、このＤＥＡＥ通過分を集めて、低減した濃度の変性剤を含有する緩衝液に対して段階的な様式で透析する。例示的な方法において、次に上記タンパク質を緩衝性４Ｍ尿素に対して少なくとも１２時間以上、次に緩衝性２Ｍ尿素に対して少なくとも１２時間以上、次に緩衝性１Ｍ尿素に対して少なくとも１２時間以上、次に緩衝性０．５Ｍ尿素に対して少なくとも１２時間以上、そして最後に変性剤を含まない緩衝液に対して少なくとも１２時間以上透析した後に、好ましくは変性剤を含まない新しい緩衝液に対して１２時間の透析をさらに二回行う。精製され再び折りたたまれたタンパク質を濃縮して、例えば、ＳＤＳゲル電気泳動、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）または発現タンパク質の異なるドメインに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析等の標準的な生化学的手法を用いて特性付けることができる。

本発明の実施は、特に他に示さなければ、当業者の技量の範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の技術を用いる。そのような技法は、文献により十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（（著作権）１９９５，２００４年４月、補足６６で補足されたもの）を参照のこと。

（Ｆ．新規なポリヌクレオチド）
本発明のもう一つの特徴は、免疫応答ドメインをコードする第一のポリヌクレオチド部分と標的結合ドメインをコードする第二のポリヌクレオチド部分を含むキメラ抗原をコードするポリヌクレオチドを提供する。第一のポリヌクレオチド部分と第二のポリヌクレオチド部分は同一または異なるヌクレオチド鎖に配置され得る。

本発明は、キメラ抗原をコードする遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列に対応するか、またはこれらに相補的なポリヌクレオチドを、好ましくは単離された形態で提供する。これらとしては、キメラ抗原変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド、キメラ抗原をコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列もしくはその一部に対して相補的であるか、または少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドおよびその関連する分子、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ならびにキメラ抗原をコードする遺伝子、ｍＲＮＡ、またはキメラ抗原をコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドが挙げられる。

さらに、本発明はここに具体的に開示されたキメラ抗原をコードする遺伝子の類似体を包含する。類似体としては、例えば、免疫応答を引き出す能力を保持する変異体であって、キメラ抗原をコードするポリヌクレオチドの、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％の相同性を有する変異体が挙げられる。これらは具体的には、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４４に記載される。典型的には、そのような類似体はわずかに１〜１５コドン変化のみが異なるだけである。例としては、ウイルス抗原または抗体フラグメントの天然アミノ酸配列由来の小さなアミノ酸変化（特に、保存的なアミノ酸の置換）を有するポリペプチドが挙げられる。保存的置換は、側鎖に関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般的に下記の４ファミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、ときどき一緒にされて芳香族アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンへの単離された置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への単離された置換、スレオニンのセリンへの単離された置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸への類似の保存的置換は、生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想することは合理的である。配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９のいずれかに開示されたポリペプチドのいずれかと実質的に同じアミノ酸配列を有するが、免疫応答を引き出すキメラ抗原の能力に実質的に影響を与えない重要でないアミノ酸置換を有するポリペプチド分子は、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９にそれぞれ示された配列を有するキメラ抗原の定義内である。誘導体としては、他のキメラ抗原分子との集合複合体（ａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および関連しない化学部分との共有結合複合体が挙げられる。共有結合誘導体は、キメラ抗原のアミノ酸鎖において、またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基に見られる基に対して、公知の手段によって官能基を結合させることにより調製される。

アミノ酸の略語を表１に示す。

タンパク質のコンフォメーションまたは機能のいずれも変更することなしに、保存的アミノ酸置換をタンパク質中で行うことができる。本発明のタンパク質は、１個〜１５個の保存的置換を含み得る。そのような変化としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）のいずれかの、これらの疎水性アミノ酸のいずれか他のものへの置換；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）による置換およびその逆の置換；グルタミン（Ｑ）のアスパラギン（Ｎ）による置換およびその逆の置換；ならびにセリン（Ｓ）のスレオニン（Ｔ）による置換およびその逆の置換が挙げられる。他の置換も、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えられ得る。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）とがそうであり得るように、しばしば相互交換できる。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシンおよびイソロイシンとしばしば相互交換可能であり得、バリンと置換可能である場合もある。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）とは、アミノ酸残基の顕著な特徴がその電荷であり、これら二つのアミノ酸残基の異なるｐＫが顕著ではないような位置において、しばしば相互交換可能である。さらに他の変化は特定の環境において「保存的」であると考えられ得る（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４版，Ｌｕｂｅｒｔ Ｓｔｒｙｅｒ（編）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．），１８−２３頁；ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；Ｌｅｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０（２０）：１１８８２−６（１９９５）を参照のこと）。

また、本発明は、キメラ抗原をコードするポリヌクレオチドに対して、好ましくはストリンジェント条件下にハイブリダイズする、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４４に具体的に記されたポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者により容易に決定可能であり、通常、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とする一方で、より短いプローブはより低い温度を必要とする。相補鎖がそれらの溶融温度を下回る環境に存在する場合、ハイブリダイゼーションは、通常、変性核酸配列が再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の度合いが高ければ高いほど、使用できる相対温度は高くなる。結果として、より高い相対的温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があるが、より低い温度はそうではない。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細と説明に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、２．９．１〜２．１０．８および４．９．１〜４．９．１３を参照されたい。

本明細書において定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェント条件」とは、（１）低イオン強度および高洗浄温度（例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を用いる条件；（２）ハイブリダイゼーション中、ホルムアミド等の変性剤を用いる条件（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液、超音波処理済サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン、４２℃を用いる条件であって、４２℃での０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）での洗浄と、５５℃での５０％ホルムアミドでの洗浄と、それに引き続く５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣを含む高ストリンジェント洗浄とを用いる条件が挙げられるが、これらに限定されない。「適度なストリンジェント条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）において記載された条件であるが、これに限定されず、そして上記に記載された条件よりも低いストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳ％）の使用を包含する。適度なストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍＬ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、３７℃における一晩のインキュベーション、そしてそれに引き続く約３７〜５０℃における１×ＳＳＣ中でのフィルター洗浄である。当業者らは、必要な場合、プローブの長さ等の因子に適合させるための温度、イオン強度等を調節する方法を認識する。

キメラ抗原をコードするポリヌクレオチドの実施態様としては、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９のいずれかから選択された配列を有するキメラ抗原をコードするポリヌクレオチド、または配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のいずれかから選択されたキメラ抗原のヌクレオチド配列（ここで、Ｔは必要に応じてＵであり得る）が挙げられる。例えば、キメラ抗原ヌクレオチドの実施態様は、限定するものではないが、以下を含む：
（ａ）配列番号２６のヌクレオチド１〜１３２６、配列番号２８のヌクレオチド１〜２００４、配列番号３０のヌクレオチド１〜１３５０、配列番号３２のヌクレオチド１〜１２９３、配列番号３４のヌクレオチド１〜１７９４、配列番号３６のヌクレオチド１〜１５８１、配列番号３８のヌクレオチド１〜１３８９、配列番号４０のヌクレオチド１〜１３４７、配列番号４２のヌクレオチド１〜２１５７、配列番号４４のヌクレオチド１〜１３９５、配列番号４６のヌクレオチド１〜１９０５、または配列番号４８のヌクレオチド１〜２４８４（ここで、Ｔはまた、Ｕでもあり得る）の配列番号に記載された配列を含むか、あるいはこれらの配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６または配列番号４８に記載された配列に対して、少なくとも８０％相同性である配列を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）登録番号０８０５０４−０３、登録番号０８０５０４−０４、登録番号０８０５０４−０５、登録番号０８０５０４−０２および登録番号０８０５０４−０１としてそれぞれカナダ国際寄託当局（Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ）に寄託された、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＢＶ ｃｏｒｅ−ＴＢＤ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ ｃｏｒｅ（１−１７７）−ＴＢＤ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ ＮＳ５Ａ−ＴＢＤおよびｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ ＨＣＶ Ｅ２−ＴＢＤと命名されたプラスミドの一つに含まれるＤＮＡによってコードされる配列を有するキメラ抗原をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）キメラ抗原の配列が、配列番号２７のアミノ酸１〜４４２、配列番号２９のアミノ酸１〜６６８、配列番号３１のアミノ酸１〜４５０、配列番号３３のアミノ酸１〜４３１、配列番号３５のアミノ酸１〜５９８、配列番号３７のアミノ酸１〜５２７、配列番号３９のアミノ酸１〜４６３、配列番号４１のアミノ酸１〜４４９、配列番号４３のアミノ酸１〜７１９、配列番号４５のアミノ酸１〜４６５、配列番号４７のアミノ酸１〜６３５または配列番号４９のアミノ酸１〜８２８の配列である、キメラ抗原をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２７のアミノ酸１〜４４２、配列番号２９のアミノ酸１〜６６８、配列番号３１のアミノ酸１〜４５０、配列番号３３のアミノ酸１〜４３１、配列番号３５のアミノ酸１〜５９８、配列番号３７のアミノ酸１〜５２７、配列番号３９のアミノ酸１〜４６３、配列番号４１のアミノ酸１〜４４９、配列番号４３のアミノ酸１〜７１９、配列番号４５のアミノ酸１〜４６５、配列番号４７のアミノ酸１〜６３５または配列番号４９のアミノ酸１〜８２８により記載される全アミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一性であるキメラ抗原関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）（а）〜（ｄ）のいずれか一つのポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチド；ならびに
（ｇ）（а）〜（ｆ）のポリヌクレオチドに対してストリンジェント条件下で選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド。

また、本発明は、キメラ抗原ポリヌクレオチド、その類似体または相同体を含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を提供する。これらとしては、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ（酵母の人工的染色体）、ＢＡＣ（細菌の人工的染色体）、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、およびこのような組換えのＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子で形質転換されたか、またはトランスフェクションされた細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような分子を作製する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）（１９８９）を参照のこと）。

さらに、本発明は、キメラ抗原ポリヌクレオチド、その類似体または相同体を含む組換えＤＮＡ分子を、適切な原核細胞または真核細胞の宿主細胞内に含む宿主−ベクター系を提供する。適切な真核宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞または、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞等の動物細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）細胞のようなバキュロウイルス感染細胞）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、ＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１等の多様な前立腺癌細胞株、他のトランスフェクション可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株、初代細胞（ＰｒＥＣ）、ならびに組換えタンパク質の発現に日常的に用いられる多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より具体的には、キメラ抗原またはフラグメント、その類似体または相同体のコード配列を含むポリヌクレオチドは、当該分野で日常的に用いられ、広く知られている多くの宿主−ベクター系を用いてそのキメラ抗原を作製するために用いられ得る。

キメラ抗原の発現に適する広い範囲の宿主−ベクター系が利用できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら、１．０．１〜１．１６．１６、９．０１〜９．１７．３および１３．４．１〜１３．６．５を参照のこと）。昆虫細胞発現用の好ましいベクターとしては、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これに限定されない。そのような発現ベクターを用いて、キメラ抗原を、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅを含むいくつかの昆虫細胞株において発現させることができる。もしくは、好ましい酵母発現系としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＰｉｃｈｉａ ａｕｇｕｓｔが挙げられる。本発明の宿主−ベクター系は、キメラ抗原の生産に有用である。

キメラ抗原またはその類似体または相同体は、キメラ抗原をコードする構築物をトランスフェクトした細胞により作ることができる。例えば、Ｓｆ９細胞は、キメラ抗原またはその類似体または相同体をコードする発現プラスミドでトランスフェクションされ得、そのキメラ抗原は、Ｓｆ９細胞において発現され、そしてそのキメラ抗原は、標準的な精製法を用いて単離される。当該分野で周知の多様な他の発現系もまた、用いられ得る。キメラ抗原をコードする配列にフレーム内で連結させたリーダーペプチドをコードする構築物の発現は、分泌型キメラ抗原を作製するために使用され得る。

ここで論じるように、遺伝子コードの重複性が、キメラ抗原遺伝子配列中の変異を可能にする。特に、特定の宿主種はしばしば特定のコドン選択性を有することが当該分野で公知であり、所望の宿主について好ましいように、開示された配列を適合し得る。例えば、望ましい類似体コドン配列は、典型的にはより高い頻度コドンにより置換された稀なコドン（すなわち、所望の宿主の公知配列において、約２０％未満の利用頻度を有するコドン）を有する。特定の種についてのコドン選択性は、例えば、世界的なウェブのＵＲＬ ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ等のインターネット上で利用できるコドン利用表を用いて計算される。

さらなる配列の改変が、細胞宿主中のタンパク質発現を増強することは公知である。これら改変としては、擬似ポリアデニル化シグナル、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピートをコードする配列、および／または遺伝子発現に有害な他のよく特性付けられた配列を排除することを包含する。上記配列のＧＣ含量は、宿主細胞において発現された公知の遺伝子を参照することによって計算された、所与の細胞宿主に対しての平均的なレベルに調節される。可能な場合、上記配列は、予想されるヘアピンの二次ｍＲＮＡ構造を避けるように改変される。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載のような、オープンリーディングフレームの開始点における翻訳開始共通配列の付加を包含する。真核生物のリボゾームが５’付近のＡＵＧコドンにおいてのみ翻訳を開始するという一般的な規則は、稀な条件下においてのみ無効とされることを当業者らは理解する（例えば、Ｋｏｚａｋ Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２（７）：２６６２−２６６６（１９９５）およびＫｏｚａｋ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５（２０）：８１２５−８１４８（１９８７）を参照のこと）。

（Ｇ．本発明の薬学的組成物）
本発明の一つの特徴は、免疫応答ドメインと、抗体フラグメントを含む標的結合ドメインとを含むキメラ抗原および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物に関する。治療利用において、上記薬学的組成物は、抗原に対する効果的なＢ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／またはヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ）の応答を引き起こし、かつ感染を遮断するか、あるいは症状および／もしくは合併症もしくは病気もしくは疾患を治療するか、または少なくとも部分的に抑制または遅らせるのに十分な量で、対象に投与され得る。この使用に効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与方法、処置される病気の段階と重症度、その対象の体重および健康の一般的な状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。

（キメラ抗原による）最初の治療的免疫化のための投薬量は、一般的には、低い値が約１ｎｇ、５ｎｇ、５０ｎｇ、５００ｎｇまたは１，０００ｎｇであり、高い値が約１０，０００μｇ、２０，０００μｇ、３０，０００μｇまたは５０，０００μｇであるような単位投薬量範囲に存在する。ヒト用の投薬量値は、対象７０キログラムあたり典型的には約５００ｎｇ〜約５０，０００μｇの範囲にある。数週間〜数ヶ月にわたる追加免疫レジメンに準じる約１．０ｎｇ〜約５０，０００μｇの間のキメラ抗原の追加免疫投薬量が、対象の応答と状態に基づきながら投与され得る。少なくとも、臨床的な症状または実験室試験から、症状が防止されるか、抑止されるか、遅らされるか、またはなくなることが示されるまで、そしてその後のある期間にわたって、投与は継続されなければならない。投薬量、投与経路および投与計画は、当該分野で公知の方法にしたがって調節される。

キメラ抗原のヒト単位用量形態は、典型的には、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（１つの実施態様においては、水性キャリア）を含有する薬学的組成物中に含まれ、そしてこのようなポリペプチドのヒトへの投与に有用であることが当業者に公知である体積／量で投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２０００を参照）。当業者により理解されるように、多様な因子が、特定の場合における理想的な用量に影響を及ぼしうる。そのような因子としては、例えば、キメラ抗原の半減期、キメラ抗原の結合親和性、組成物の免疫原性、所望の定常状態の濃度レベル、投与経路、治療頻度、および本発明の治療方法と組み合わせて使用される他の物質の影響、ならびに特定の対象の健康状態が挙げられる。

ある実施態様において、本発明の組成物は、深刻な病状（すなわち、生命を脅かすか、または潜在的に生命を脅かす状態）に使用される。そのような場合、本発明の好ましい組成物中のキメラ抗原が比較的毒性のない性質であるという結果として、これら述べられた投薬量に対して実質的に過剰なこれらキメラ抗原を投与することが可能であり、治療を行う医師には望ましいと感じられ得る。

薬学的処方物における本発明のキメラ抗原の濃度は、広く変動し得る。すなわち、約０．１重量％未満、通常は約２重量％、または少なくとも約２重量％から２０〜５０重量％またはそれ以上まで変動し得、選択された投与の具体的な態様にしたがって主に液体容量、粘度等によって選択される。

この薬学的組成物は、非経口、髄腔内、血管内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、皮下、鼻内、局所、経口、直腸、膣、肺または腹腔内等の当該分野で公知の任意の経路を介して送達され得る。好ましくは、上記組成物は、皮下投与または皮膚内投与等の非経口経路により送達される。

上記薬学的組成物は、所望のキメラ抗原を、意図される投与経路に適する適切なビヒクルと混合することによって調製され得る。本発明の薬学的組成物の作製において、このキメラ抗原は、通常賦形剤と混合されるか、賦形剤で希釈されるか、またはカプセル、匂い袋、紙または他の容器の形態であり得るキャリア内に封入される。薬学的に受容可能な賦形剤が希釈剤として役立つ場合、この賦形剤は治療剤用のビヒクル、キャリアまたは媒体として作用する固体、半固体または液体の物質であり得る。よって、上記組成物は、錠剤、丸剤、散薬、ロゼンジ、匂い袋、カシェ剤、エリキシール、懸濁液、乳化液、溶液、シロップ、（固体としてまたは液体媒体中の）エーロゾル、例えば１０重量％までのキメラ抗原を含有する軟膏、軟性または硬性のゼラチンカプセル、座薬、滅菌注射溶液および滅菌包装散薬の形態であり得る。

適当な賦形剤のいくつかの例としては、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。これらの処方物はさらに、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油等の潤滑剤、湿潤剤、乳化懸濁剤、メチルベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート等の保存剤、甘味剤、ならびに調味剤が挙げられ得る。本発明の組成物は、当該分野で公知の操作を用いることにより、対象に投与した後にキメラ抗原の即効性放出、徐放性放出または遅延性放出を提供するように処方され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）の９０３〜９２ページおよび１０１５〜１０５０ページを参照のこと。

錠剤等の固体組成物を調製するために、上記キメラ抗原は、薬学的賦形剤と混合されて本発明のキメラ抗原の均一混合物を含む固体の予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均一であると称する場合、上記キメラ抗原が、その組成物が錠剤、丸剤およびカプセル等の効果の等しい単位投薬形態に容易に再分割され得るように、組成物中に均一に分散していることを意味する。

本発明の錠剤または丸剤は、被覆され得るか、または長期間の作用という利点を与える投薬形態を提供するように配合され得る。例えば、上記錠剤または丸剤は、内投薬成分と外投薬成分とを含み得、後者は前者を被う封筒のような形である。これらの二成分は、腸溶性層によって分離され得る。この層は、胃内の分解に対して抵抗性があり、内成分をそのまま十二指腸に通過させ得るか、または放出を遅らせ得る。多様な物質がそのような腸溶性層または被覆に用いられ得、そのような物質として、多くのポリマー酸およびポリマー酸とセラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような物質との混合物が挙げられる。

本発明の新規組成物が経口または注射による投与で取り込まれ得るような液体形態としては、水性溶液、適当に味付けしたシロップ、水性または油性の懸濁液、およびトウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナッツ油等の食用油を有する味付けした乳化物ならびにエリキシールおよび類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。

非経口投与用組成物の調製において、刺激を減少させる浸透圧調節に対して、厳密な注意を払う必要がある。再構成可能な組成物は、乾燥形態の包装された滅菌固体である。再構成可能な組成物が望ましいのは、乾燥固体として保存した場合、即座に投与するために溶液を準備するよりもさらに安定なためである。通常、乾燥固体は、その固体が最適な湿度範囲に確実に維持されるようにブチルゴムの蓋を有する滅菌容器に包装される。再構成可能な乾燥固体は、乾燥充填法、噴霧乾燥法または凍結乾燥法により形成される。これら方法の説明は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）、６８１〜６８５ページと８０２〜８０３ページに見出され得る。

非経口注射用の組成物は、一般的に希釈されており、高い比率で存在する成分はビヒクルである。通常、このビヒクルは治療活性を持たず、非毒性であるが、吸収に適する形態で、上記キメラ抗原を体組織に提示する。通常、吸収は、キメラ抗原が水溶液として提示される場合に、最も容易かつ完全に起こる。しかし、液体混和性液体によるビヒクルの改変または水非混和性液体による置換は、吸収速度に影響を与えうる。好ましくは、本組成物について最も価値のあるビヒクルは、等張食塩水である。注射に適する組成物の調製において、水性ビヒクル、水混和性ビヒクルおよび非水性ビヒクルを使用し得る。

さらなる物質が、上記組成物の品質を向上または保護するために、本発明の注射可能な組成物中に含まれ得る。したがって、加えられた物質は、溶解性に影響を与え得、対象の快適さを提供し得、化学安定性を増強し得るか、または微生物の増殖に対して調製物を保護し得る。よって、この組成物は、適当な可溶化剤、抗酸化剤として働く物質および微生物の成長を妨げる保存剤として働く物質を含有し得る。これらの物質は、それらの機能に適切であるが、組成物の作用に悪影響を与えないような量で存在する。適当な抗微生物剤の例としては、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンズアルコニウム、フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルが挙げられる。適当な抗酸化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）、１０１５〜１０１７ページに見出され得る。

ある実施態様において、リポソーム、ナノカプセル、マイクロカプセル、液体粒子、ビヒクル等が、本発明のキメラ抗原の投与ために用いられる。特に、本発明の組成物は、送達のために、液体粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェアまたはナノ粒子等にカプセル化されて処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、共有結合または非共有結合のいずれかにより、このようなキャリアビヒクルの表面に結合され得る。

リポソームを介して投与される組成物はまた、以下のように役立ち得る：１）リンパ系組織等の特別な組織に対してキメラ抗原を標的化する；２）抗原提示細胞に対して選択的に標的化する；または３）ペプチド組成物の半減期を増加させる。リポソームとしては、乳化物、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、薄層等が挙げられる。これらの調製物において、送達されるキメラ抗原は、リポソームの一部として、単独またはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体等のリンパ系細胞間に広く認められるレセプターに結合する分子と組み合わせて取り込まれるか、あるいは他の治療組成物または免疫原組成物とともに取り込まれる。よって、本発明の所望のキメラ抗原により充填または装飾されたリポソームは、そのリポソームがキメラ抗原を送達するリンパ系細胞の部位に向かい得る。本発明に従って用いられるリポソームは、中性および負電荷のリン脂質およびコレステロール等のステロールを一般的に包含する、標準的ベシクル形成脂質から形成される。脂質の選択は、例えば、血流中のリポソームの大きさ、酸不安定性と安定性を考慮することにより通常行われる。Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７−５０８（１９８０）および米国特許４，２３５，８７１号、米国特許４，５０１，７２８号、米国特許４，８３７，０２８号および米国特許５，０１９，３６９号に記載されるように、多様な方法がリポソームを調製するために利用できる。キメラ抗原を含むリポソーム懸濁液は、とりわけ投与法、送達されるキメラ抗原および処置される病気の段階にしたがって変動する用量において静脈内、局所的、局部等に投与され得る。

吸入用または吹入れ用の組成物としては、薬学的に受容可能な水性溶媒もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液または懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適当な薬学的に受容可能な賦形剤を含有し得る。この組成物は、局所性効果または全身性効果のために、口または鼻の呼吸経路により投与され得る。薬学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性気体を用いることにより霧状化され得る。霧状化された溶液は、噴霧用装置から直接的に吸入され得るか、またはこの噴霧用装置は顔マスクテント（ｆａｃｅｍａｓｋ ｔｅｎｔ）または間欠的陽圧呼吸装置に装着され得る。溶液、懸濁または粉末組成物は、適切な方法で処方物を送達する装置から、好ましくは経口または経鼻にて投与され得る。

本発明の方法に用いられるもう一つの処方は、経皮送達装置（「パッチ」）を用いる。そのような経皮パッチを用いて、本発明のキメラ抗原の連続的または非連続的な注入を制御された量で提供し得る。薬学的物質の送達のための経皮パッチの構築と使用は、当分野で周知である。例えば、本明細書において参考として援用される米国特許５，０２３，２５２号を参照のこと。そのようなパッチは、薬学的物質の連続的送達、拍動性送達またはオンデマンド送達のために構築され得る。

さらに、キメラ抗原および薬学的賦形剤に加えて、少なくとも一つの抗ウイルス治療剤または化学療法剤を含むことが有利であり得る。抗ウイルス治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：擬似ペプチド（例えば、アンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよびサキナビル）、ポリヌクレオチド（例えば、アンプリゲンおよびホミビルセン）、プリン／ピリミジノン類（例えば、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、シドフォビル、シタラビン、ジダノシン、ジデオキシアデノシン、ジピボキシル、エドクスウジン、エムトリシタビン、エンテコビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、イドクスウリジン、イノシン・プラノベクス、ラミブジン、ＭＡＤＵ、ペンシクロビル、ソリブジン、スタブジン、テノフォビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビダラビン、ザルシタビンおよびジドブジン）、シアル酸類似体（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル）、アセマンナン、アセチルロイシンモノエタノールアミン、アマンタジン、アミジノマイシン、アテビリジン、カプラビリン、デラビルジン、ｎ−ドコサノール、エファビレンズ、ナトリウムフォスカーネット、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ケトキサール、リゾチーム、メチサゾン、モロキシジン、ネビラピン、ペンタフシド、プレコナリル、ポドフィルロトキシン、リバビリン、リマンチジン、スタリマイシン、スタトロン、ターマカムラおよびトラオマンタジン。他の適当な抗ウイルス剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）、８７章、抗感染剤、１５０７〜１５６１ページ、特に１５５５〜１５６０ページに説明されている。本発明の薬学的組成物に包含される好ましい抗ウイルス治療剤として、アデフォビル、ジピボキシル、エンテコビル、ラミブジンおよびリバビリンが挙げられる。

いくつかの実施態様において、Ｂリンパ球またはＴリンパ球を初回刺激する（ｐｒｉｍｅ）少なくとも一つの成分を本発明の薬学的組成物に含むことが望ましい。脂質はＣＴＬをインビボで初回刺激し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基を、リジン残基のεアミノ基とαアミノ基に結合させ、次にこれをＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等の一つ以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結し得る。次に、この脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子のいずれかで直接投与され得るか、リポソームに取り込まれ得るか、またはアジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント中に乳化させ得る。好ましい実施態様において、特に効果的な免疫原性組成物は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に対して例えばＳｅｒ−Ｓｅｒの連結により結合させたＬｙｓのεアミノ基とαアミノ基とに結合させたパルミチン酸を含む。

ＣＴＬ応答の脂質初回刺激のもう一つの例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（Ｐ_３ＣＳＳ）等のＥ．ｃｏｌｉリポタンパク質を用いて、適当なペプチドに共有結合させた場合のウイルス特異的ＣＴＬを初回刺激し得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１（１９８９））。本発明のキメラ抗原は、例えばＰ_３ＣＳＳに結合させ得、リポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対する免疫応答を特異的に初回刺激し得る。

本発明の組成物はアジュバントの使用を必要とすべきではないが、アジュバントを用いることはできる。宿主の種に基づいて、免疫学的応答を高める多様なアジュバントが用いられ得、そのようなアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リソレシチン等の表面活性剤、洗剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳化物、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、免疫促進ポリ塩基配列およびＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。さらなるアジュバントもまた、当該分野において周知である。

（Ｈ．製品）
本発明のもう一つの特徴は、キメラ抗原を含有する組成物を保持する容器を含む製品を提供する。この製品は、上記組成物を非経口（例えば、皮下、筋内、皮内、鼻内または血管内）で、どのように投与するかを説明する印刷されたラベル説明と組み合わせて、注射に適切であるか、または注射用に再構築するためのものである。上記組成物は、この組成物と顕著に相互作用せず、かつそれが非経口使用であることを示す適当なラベルで標識された任意の適当な容器に含まれる。容器に組み合わされるものは、上記の治療方法に合わせたラベル説明である。本発明の組成物を保持する容器は、患者、医師、看護婦またはそれ以外の専門家がキメラ抗原を投与し得るように、注射用の適当な針とシリンジとを有する注射に適する液体組成物を有する容器であり得る。あるいは、上記組成物は、この組成物を溶解または懸濁させる水性ビヒクルまたは非水性ビヒクルと組み合わされるか、またはそれらのビヒクルで希釈されるキメラ抗原の可溶性の種類を含有する乾燥組成物あるいは濃縮組成物であり得る。あるいは、上記容器は、液体中に懸濁剤を有するか、塩の不溶性の種類が懸濁されるビヒクルと組み合わせるための塩の不可溶性の種類であり得る。適当な容器は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）の７８８〜７８９ページ、８０５ページ、８５０〜８５１ページおよび１００５〜１０１４ページに説明されている。

本発明のキットは、典型的には、上記の容器と、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジおよび使用説明書を備える包装挿入物を含む商品と使用者の観点から望ましい材料を含む一つ以上の他の容器を含む。組成物が特定の治療または非治療的利用のために用いられことを示すラベルが容器上に存在してよく、かつそのラベルはインビボまたはエキソビボのいずれかでの使用についての説明、例えば上記のような説明を示すこともできる。説明および／または他の情報は、キットに含まれる挿入物に含ませることもできる。

（Ｖ．実施例）
以下の非限定的な実施例は、本発明のさらなる説明を提供する。

（Ａ．実施例１：ＴＢＤ発現ベクターの構築）
Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３領域の一部のアミノ酸をコードするマウスＩｇＧ１ ＤＮＡ配列を、ＨＢＶ表面抗原（ｓＡｇ）に対してｍＡｂを産生するハイブリドーマ（２Ｃ１２）から単離されたｍＲＮＡから作った。全ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号１５５９６−０２６）を用いて単離し、標的結合ドメイン（ＴＢＤ；マウス免疫グロブリンフラグメント）のｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９０４−０１８）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより作った。このＰＣＲプライマーは、リンカーペプチド（５’末端の−ＳＲＰＱＧＧＧＳ−（配列番号１））をコードするリンカー配列、５’末端の独自のＮｏｔＩ部位および３’末端の独自のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含んだ。得られたｃＤＮＡは（５’ＮｏｔＩ）−リンカー配列−Ｃ_Ｈ１（ＶＤＫＫＩ）（配列番号２）、−ヒンジ領域−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３−（３’ＨｉｎｄＩＩＩ）を含む。各酵素による消化後に、同じ制限酵素部位を用いて、フラグメントをｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ発現ベクタープラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結する。ＰＣＲ増幅に用いられる５’プライマーは（センス）５’ＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧ（配列番号３）であり、そして３’プライマーは（アンチセンス）５’ＡＣＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号４）であり、それぞれＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を有した。以下は、方向性クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）に用いられるプロトコールである。生成したフラグメントを各酵素で消化し、アガロースゲルで精製し、ベクタープラスミドにクローニングした。このＤＮＡ配列とＯＲＦの正しさを標準的な配列決定方法を用いて実証した。

標的結合ドメインをコードするＤＮＡのｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａドナープラスミドへのクローニング後に、組換えタンパク質をＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ^ＴＭバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現させた。クローニングした遺伝子を部位特異的転位によりＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１０Ｂａｃ）株中のバキュロウイルスシャトルベクターに移した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞は、カナマイシン耐性を付与するシャトルベクターと、トランスポザーゼをコードし、かつテトラサイクリンに対する耐性を付与するヘルパープラスミドとを含む。コンピテントなＤＨ１０Ｂａｃ細胞の１００μｌのアリコートを氷上で解凍し、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａベースのプラスミドを加え、その混合物を氷上で３０分間インキュベートした。この混合物を４５秒間４２℃で熱ショックを与え、次に氷上で２分間冷やした。次に、この混合物を９００μＬのＬＢ培地に加え、４時間、３７℃でインキュベートした。この形質転換細胞を、ＬＢで、１０^−１〜１０^−２まで連続的に希釈し、１００μｌの各希釈物を、５０μｌ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌおよび４０μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧを補充したＬＢアガープレートにプレートし、少なくとも３６時間、３７℃でインキュベートした。ゲンタマイシン耐性をｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａにより賦与し、Ｘ−ｇａｌとＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いて、白色コロニー（組換えプラスミド）と青色コロニー（非組換え体）との間を区別した。白色コロニーを取り、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補充した２ｍｌのＬＢに接種し、攪拌下に３７℃で一晩インキュベートした。滅菌ループを用いて少量の一晩培養物を採取し、得られた試料を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌおよび４０μｇ／ｍｌ ＩＰＴＧを補充した新鮮なＬＢ寒天プレートに縞状に塗布し、少なくとも３６時間、３７℃でインキュベートして白色表現型を確認した。組換えバクミドを標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出））により単離し、そのＤＮＡ試料を４０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、トランスフェクションに用いた。

バキュロウイルスを作るために、バクミドをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションした。Ｓｆ９細胞（９×１０^５）を、２ｍｌのＥＳＦ９２１（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中の６ウエル細胞培養皿（３５ｍｍウエル）の各ウエルに撒き、少なくとも１時間、２７℃で付着させた。Ｓｆ９細胞の供給者により提供されたプロトコールにしたがってＣｅｌｌｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３６２−０１０）を用いて、トランススフェクションを行った。トランスフェクション後、その細胞を２７℃で７２時間インキュベートした。バキュロウイルスを含有する培地を集めて、４℃、暗所で保存した。

トランスフェクションの効率はバキュロウイルスＤＮＡの生産について検査することによって実証した。単離されたバキュロウイルスＤＮＡをＰＣＲに供して、ＴＢＤをコードする挿入遺伝子をスクリーニングした。使用されたプライマーは（センス）５’ＴＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＣＧ（配列番号５）および３’（アンチセンス）５’ＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣ（配列番号６）であった。増幅生成物をアガロースゲル（０．８％）で泳動した。細胞中の異種タンパク質の発現を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および６×Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をプローブとして用いたウエスタンブロットにより実証した。

バキュロウイルスの生産とタンパク質の発現を一旦確認したら、ウイルス生産を増幅して、標的結合ドメインをコードする遺伝子を有するバキュロウイルスの濃縮原液を作製した。バキュロウイルスを少なくとも二回増幅することは当分野で標準的な慣行であり、ここに記載のすべてのプロトコールにおいて、この標準的な慣行を遵守した。二回目の増幅の後、作製したバキュロウイルスの濃度を、キットの製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されたプロトコールによるプラークアッセイを用いて定量した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞を感染させるためのウイルスの最も適当な濃度と、所望のタンパク質生産の最適な時間とを設定した。一般的に、ＴＢＤの発現のために、１のＭＯＩと４８時間を用いた。

（Ｂ．実施例２：キメラ抗原発現ベクターの構築）
表２に示した５’センスプライマーと３’アンチセンスプライマーとを用いたＰＣＲ法を使用して、所望のウイルス抗原をコードするＤＮＡを鋳型から作った。得られた増幅フラグメントの５’末端は、独自の制限部位「５’酵素（ｅｎｚｙ）」を含み、そして３’末端は独自の制限部位「３’酵素（ｅｎｚｙ）」を含んでおり、それら各々をライゲーションのために用いた。

増幅ＤＮＡを適当な５’制限酵素および３’制限酵素で消化し、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ発現ベクターに連結して、ウイルス抗原のみの発現プラスミドを作った。各酵素による消化後に、実施例１に記載のように、ＤＮＡの同フラグメントをプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ−ＴＢＤに連結させて、標的結合ドメインに融合させたウイルス抗原の発現プラスミドを作った。得られたプラスミドを用いて、実施例１に記載のように、組換えバキュロウイルスを作り、続いてキメラ抗原の発現に用いた。このキメラ抗原のＤＮＡ配列とアミノ酸配列とを表３に示す。

（Ｃ．実施例３：ＴＢＤ、ウイルス抗原およびキメラ抗原の発現および精製）
標準化感染多重度（ＭＯＩ）の組換えバクミドを用いて、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）昆虫細胞を感染させた。懸濁培養のために、細胞を３×１０^５細胞／ｍＬの密度で撒き、細胞密度が２〜３×１０^６細胞／ｍＬに達するまで２７．５℃、１３８ｒｐｍでの攪拌下にインキュベートした。標準化量の各組換えバキュロウイルスを細胞に加えた。インキュベーション温度は２７．５℃で、適当な感染時間を個々のタンパク質発現について標準化した。これらの細胞を１０分間、４℃で２，５００ｒｐｍにおける遠心分離により集め、組換えタンパク質の精製に用いた。細胞の使用しない部分は液体窒素中に瞬時に凍らせて、−７０℃で保存した。

組換えタンパク質を変性条件下で精製した。この細胞を、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０に６ＭグアニジウムＨＣｌを含有する緩衝液（可溶化緩衝液）中に可溶化した。その懸濁物を６０ワットの出力設定で１分／パルスの５パルスにて氷上で超音波処理し、室温で１時間混合した。この溶解物を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、未破壊細胞と細胞破片を除去した。この上清を、前もって可溶化緩衝液で平衡化させておいたＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）ビーズカラム（１×５ｃｍ／１００ｍＬ細胞溶解物）にロードした。ローディングの後に、カラムを１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０中の６ＭグアニウムＨＣｌ（洗浄緩衝液１）の２０カラム体積分で洗浄し、引き続いて１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０中の８Ｍ尿素（洗浄緩衝液２）の２０カラム体積分で洗浄した。結合タンパク質を、８Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を含有する緩衝液（溶出緩衝液）で溶出した。タンパク質を含有する画分を集めて、４℃で透析緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ）を複数回変えながら透析した。精製タンパク質を、ＳＤＳゲル電気泳動、等電点電気泳動および発現タンパク質の異なるドメインに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析等の標準的な生化学技術を用いて特性付けた。

（Ｄ．実施例４：キメラ抗原融合タンパク質を用いた「自己」タンパク質に対する寛容の破壊）
キメラ抗原融合タンパク質に対する免疫応答を評価するために、精製したＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２、ＴＢＤまたはＳ１／Ｓ２−ＴＢＤタンパク質でマウスを免疫し、個々のタンパク質に対して作られた抗体を定量した。免疫されたマウスから集めた脾臓Ｔ細胞の増殖を、各タンパク質による誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後に評価した。

１５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫に用いた。マウスにＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ（４．１５μｇ）、Ｓ１／Ｓ２（４．１５μｇ）またはＴＢＤ（４．１５μｇ）を二週間の間隔で４回皮下注射した。免疫の開始前と各免疫の一週間後に、血液試料を集めた。血清を凝固血液試料から調製し、注射した各抗原に対して宿主動物により作られた抗体量の予測に用いた。

（１．ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２、ＴＢＤまたはＳ１／Ｓ２−ＴＢＤに対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ）
９６ウエルプレートに、抗原ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２、ＴＢＤまたはＳ１／Ｓ２−ＴＢＤを１．０μｇ／ｍＬの濃度にて一晩、４℃で被覆した。このプレートを２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。各動物からの希釈血清を各ウエルに多様な希釈率（１：１０〜１：５００）で加え、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１：５０００）希釈物をウエルに加えて、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、２−２’アジノ−ジ−（３−エチルベンジルチアゾリン−６−スルフォネート）（ＫＰＬ、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ、ＵＫ）を用いて発色させた。試料中の発色の光学密度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて４０５ｎｍの波長で測定した。実験の陰性対照は、同じ動物の免疫前の血清であり、その値をすべての実験値から引いた。ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤで免疫したマウスに関する結果を表４に示す。このキメラ抗原は、キメラ抗原（Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ）に対する強い抗体応答を引き出す。

ここでの抗体応答は、多価（または多エピトープ）性のものである。表４に示す結果は、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤで免疫したマウスによって作られた抗体はキメラ抗原に結合し、かつプレート上に被覆されたＳ１／Ｓ２タンパク質標的に結合することを示す。したがって、抗体はキメラ抗原のＳ１／Ｓ２成分に対して作られる。同じように、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤで免疫したマウスにより作られた抗体は標的結合ドメインタンパク質に結合する（表４）。マウス起源のタンパク質を含有するキメラ抗体は、マウスに体液性免疫応答を生じさせ得、このキメラ抗原が「自己」抗原を「外来性」に変換し得るという証拠を示す。したがって、本来は「自己」タンパク質として処理されるタンパク質に対する寛容を壊すことが可能である。

（２．Ｔ細胞増殖アッセイ）
四回目の免疫の一週間後に動物を屠殺し、脾臓を切除して単一の細胞懸濁液を作った。細胞を三重で、９６ウエルプレートに４×１０^５細胞／ウエルの細胞密度で撒いた。それらに、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２、ＴＢＤまたはＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの各抗原を０．１μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。陰性対照の細胞は、培地のみであり、Ｔ細胞増殖についての陽性対照は１．０〜５．０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であった。細胞培養物を４日間３７℃で、７％ＣＯ_２の雰囲気下でインキュベートした。細胞の各ウエルに１．０ｍＣｉの^３［Ｈ］チミジンを与え、さらに１８時間インキュベートした。細胞を、ＴＯＭＴＥＣＭＡＣＨ３細胞ハーベスター（Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて採取し、ガラス繊維フィルター（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）に結合した放射活性を、Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ １４５０マイクロベータ液体シンチレーションおよび発光計数器（Ｗａｌｌａｃ、ＵＳＡ）を用いて定量した。その結果を表５に示す。

Ｔ細胞増殖は、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ、Ｓ１／Ｓ２またはＴＢＤで誘発されたときに見られた。このキメラ抗原による免疫は、多価のＴ細胞応答、すなわち同一タンパク質の異なる部分に対する応答を誘導した。マウス起源のタンパク質を含有するキメラ抗原は、マウスにおいて細胞性免疫応答を生じ得、キメラ抗原が「自己」抗原を「外来性」に変換し得るということを証拠付ける。したがって、本来は「自己」タンパク質として処置されるタンパク質に対する寛容を壊すことが可能である。

（Ｅ．実施例５：抗原提示アッセイ）
ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤの免疫応答を引き出す能力を、エキソビボ抗原提示アッセイを用いて測定した。樹状細胞（ＤＣ）等の抗原を負荷された抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞の多刺激後に効果的なＴ細胞応答が発生することを、抗原特異的Ｔ細胞の数の増加ならびにＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γを産生するＴ細胞の能力を定量化することにより評価した。

（１．接着による単球の選択）
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）にＡＩＭ−Ｖを加えて解凍した（１ｍｌの凍結細胞に対して９ｍｌの添加ＡＩＭ−Ｖの比率）。次に、この細胞を２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を、ＡＩＭ−Ｖ／１％調和血清に再懸濁し、１００ｍｍ培養皿またはＴ−２５培養フラスコに加えた。このＰＢＭＣを、７％ＣＯ_２下の加湿インキュベーターで１時間、３７℃でインキュベートした。非接着細胞を除去するために、培養物を数回粉砕し、上清を捨て、細胞をＡＩＭ−Ｖ培地で一回洗浄した。単球を細胞スクレーパーで採取し、３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをＡＩＭ−Ｖ／２．５％調和血清に２×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、２４ウエルプレートに撒いた。サイトカインＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦ（それぞれ１０００ＩＵ／ｍｌ）を加えて、単球の未成熟ＤＣへの分化を誘導した。

（２．迅速または遅延抗原提示アッセイ）
迅速抗原提示アッセイ（ＡＰＡ）のために、抗原を、未成熟ＤＣに単離の４〜２４時間内に加えた。さらに２４時間後に、抗原を負荷した未成熟単球を、ＰＧＥ_２（１μＭ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに２４時間培養することにより誘導して成熟させた。次に、成熟ＤＣを自己のＴ細胞とともに共培養した（一回目の刺激）。このＴ細胞は、磁気Ｔ細胞単離キット（Ｄｙｎａｌ）を製造者の指示に従って用いるネガティブ選択を用いて、ＤＣとして同一のＰＢＭＣから作製された。

次に、Ｔ細胞を、７日後にＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で抗原を負荷した成熟ＤＣにより再刺激した。７日間のインキュベーション後に、Ｔ細胞を抗原を負荷した成熟ＤＣにより三回目の再刺激を行った。この三回目の刺激は６時間続け、この際にＴ細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ８およびＩＦＮ−γ発現について免疫染色し、フローサイトメトリーにより分析した。

遅延ＡＰＡのために、単球を、抗原の添加前の５〜６日間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下において未成熟ＤＣに分化させた。抗原添加の二時間後に、未成熟ＤＣをＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−α（５０ＩＵ／ｍｌ）により成熟させた。単離の７日後に、成熟ＤＣを（上記の）自己Ｔ細胞とともに共培養した（一回目の刺激）。

次に、Ｔ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において抗原を負荷した成熟ＤＣによって７日後に再刺激した。７日間のインキュベーションの後、細胞を抗原を負荷した成熟ＤＣにより三回目の再刺激を行った。１８時間のインキュベーション後に、Ｔ細胞を集めて、ＣＤ３、ＣＤ８およびＩＦＮ−γ発現について免疫染色し、フローサイトメトリーにより分析した。

（２．ＰＢＭＣ抗原提示アッセイ）
このアッセイにおいて、最初の培養物は、抗原とＩＬ−２とともにインキュベートされる全ＰＢＭＣ（すなわち、リンパ球および単球）からなり、ここではすべての細胞タイプが存在して関与するのでこの機構はインビボ免疫応答に似ていることが想定されている（Ｍａｉｎｉ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１２６９−１２８０，２０００）。ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、すぐに抗原とともにインキュベートした。抗原の取り込みと提示とを可能にする４日間の培養後に、ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）を加えて、さらに８日間放置した（すなわち実験の１２日目）。二回目の刺激の２日前（すなわち実験の１０日目）、ＤＣを上記のように接着により単離し、すぐにＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４および抗原とともに２４時間インキュベートする。Ｆａｓｔ ＡＰＡと同じように、未成熟ＤＣを、ＰＧＥ_２、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの添加した後の２４時間分化させる。次に、負荷した成熟ＤＣを、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下においてＰＢＭＣ培養物に加える（二回目の刺激、実験の１２日目）。三回目の刺激は、上記のように二日前に調製された抗原を負荷した成熟ＤＣを用いて、実験の２１日目に行った。６時間のインキュベーション後に、Ｔ細胞を集め、ＣＤ３、ＣＤ８およびＩＦＮ−γ発現について免疫染色し、フローサイトメトリーにより分析した。

上記のすべての抗原提示アッセイのために、アッセイの最後のＴ細胞の一部をさらに３〜５日間インキュベートし、テトラマー分析（下記を参照のこと）により特異的Ｔ細胞について調べた。

（４．ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２はＨＢＶ Ｓ１およびＨＢＶ Ｓ２のペプチドに対してＴ細胞応答を引き出す）
ＰＢＭＣ ＡＰＡを用いてＴ細胞を作り、次にこれを抗原特異性に関して検定した。よって、健康なＨＬＡ−Ａ２個体からのＰＢＭＣを、９６ウエルプレートにて２．５％調和血清を含有するＡＩＭ−Ｖ中、５×１０^５細胞／ｍｌで培養した。抗原（すなわち１０μｇ／ｍｌ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ）を加え、その細胞を４日間、３７℃で培養した。次に、ＩＬ−２を２０ＩＵ／ｍｌで加え、細胞を、２〜３日毎に培地（ＡＩＭ−Ｖ／２．５％調和血清および２０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２）を交換しながらさらに８日間培養した。１２日間の培養の終わりに残る細胞のほとんどはＴ細胞であり、これらのＴ細胞を、ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下において自己抗原を負荷した成熟ＤＣにより再刺激した。

ＡＰＡにおいてＴ細胞の二回目と三回目の刺激のために、抗原を負荷した成熟ＤＣを、下記の操作を用いて４８時間にわたって作った。単球を、プラスチック組織培養皿上への接着により全ＰＢＭＣから単離した。その細胞（そのうち、約８５％がＦＡＣＳ分析により決定された単球である（ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１９−およびＣＤ３−））を、９６ウエルプレートで、１０００ＩＵ／ｍｌのサイトカインＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦとを含む１００μｌのＡＩＭ−Ｖ／２．５％調和血清を含む１×１０^５細胞／ウエルで培養し、４時間後、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ等の抗原を加えた。２０時間のインキュベーション後に、作られた未成熟ＤＣを、ＰＧＥ_２（１×１０^−６Ｍ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でさらに２４時間培養することにより成熟ＤＣに分化させた。

Ｔ細胞を、１〜２日毎に培地（２．５％調和血清と２０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を有するＡＩＭ Ｖ）を交換しながら、二回目の刺激後の７日間培養した。次に、Ｔ細胞（培養の１９日目）を（上記の）ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下において（上記のように２日間の操作にわたって作られた）抗原を負荷した成熟ＤＣによる三回目の刺激を行い、そして６時間培養後のＩＦＮ−γ産生を検定するか、または（１〜２日毎にＡＩＭ−Ｖ／２．５％調和血清および２０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２の培地を変更しながら）５日間培養し、次にＨＢＶ ｐｒｅＳテトラマーを用いてＨＢＶ ｐｒｅＳ抗原に対するＴ細胞特異性に関する検定のいずれかを行った（培養の２４日目）。

カスタム合成ｉＴａｇ ＭＨＣクラスＩテトラマー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を製造者のプロトコールに従って用いてテトラマー分析を行った。すなわち、細胞を採取し、洗浄し、９６ウエルｖ底プレートに、２０μｌ中約２×１０^５細胞／ウエルで移した。２μｌのＰＥ複合ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ ｐｒｅＳ１テトラマー（ＧＭＬＴＰＶＳＴＩ、配列番号５０）またはｐｒｅＳ２テトラマー（ＮＩＡＳＨＩＳＳＩ、配列番号５１）のどちらかとともに、ＣＤ３（抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ）およびＣＤ８（抗ＣＤ８−Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ）に特異的なｍＡｂによって、その細胞を２０℃で３０分間標識した。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで固定し、５ｍｌのＦＡＣＳチューブに移した。この細胞を、一試料あたり８０，０００〜１００，０００個の細胞でＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に得た。生存（ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに基づく）ＣＤ３＋集団上のゲートにより、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析を行い、テトラマーによるＣＤ８＋細胞標識の比率を決定した。ＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌのＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤとともに培養し、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤを負荷した成熟ＤＣにより二回再刺激した場合に、顕著な比率の細胞をＳ１テトラマー（図２）およびＳ２テトラマー（図３）によって陽性標識した。これは、テトラマー陽性細胞の数が顕著でない場合、抗原を負荷していない成熟ＤＣとともに培養されたＴ細胞とは対照的である。よって、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤで負荷したＤＣは、ＨＢＶ Ｓ１およびＨＢＶ Ｓ２抗原の決定基に特異性を有する顕著な数のＴ細胞の生成を誘導することができた。

（Ｆ．実施例６：キメラ抗原融合タンパク質を用いるＤＨＢＶ抗原およびＤＨＢＶ抗原に対する寛容の破壊）
ＤＨＢＶは、ＨＢＶに対する抗ウイルス療法を開発する際の強力な動物模型として役立っている。ウイルスの複製機構の研究を行い、抗ウイルス化合物のスクリーニングのために、ＤＨＢＶに先天的に感染させた北京ダック（アヒル）を用いた。二種類のアヒル模型を本発明に用いた。最初のものは先天的にＤＨＢＶに感染させたアヒルである。これはヒトにおけるＨＢＶ感染の垂直感染に似ている。第二の模型は、新しく孵化したアヒルの子がＤＨＢＶに感染し、これらが感染を有するという持続的な感染模型である。この第二の模型はヒトにおけるＨＢＶ感染の水平感染に似ている。

（１．先天的にＤＨＢＶに感染させたアヒル）
四週齢の先天的にＤＨＢＶに感染させたアヒルを二つの集団に分けた。血液試料（１．０ｍＬ）を免疫前抗体量の参照のために集めて、ワクチン接種の前に、血液試料を毎週集めた。実験集団は、ＤＨＢＶ Ｃｏｒｅ ＴＢＤキメラ抗原融合タンパク質を１９．９５ｍｇ／用量で５週目まで毎週同じ曜日に皮下注射した。６週目は、用量を二倍として、ワクチン接種を２６週目に停止するまで、四週毎に一回注射した。プラセーボ集団には等量の緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）を投与した。

ＤＨＢＶ Ｃｏｒｅ、ＴＢＤまたはＤＨＢＶ Ｃｏｒｅ ＴＢＤの各抗原を１．０μｇ／ｍｌの濃度で一晩４℃にて９６ウエルプレートに被覆した。このプレートを、２％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝性食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。各動物からの希釈血清を各ウエルに多様な希釈度（１：１０〜１：５００）で加え、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄した。ヤギ抗アヒルＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）希釈物をウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、２，２’アジノ−ジ−（３−エチルベンジルチアゾリン−６−スルフォネート）（ＫＰＬ、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ、ＵＫ）を用いて発色させた。試料中の発色の光学密度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて測定した。抗体力価は同一動物からの免疫前血清に対して計算した。

０週目、３週目および６週目のアヒルの対照集団と実験集団とにおける、先天的にＤＨＢＶに感染させたアヒル由来の血清中の抗コア抗体レベルを表６に示す。アヒルは慢性ＤＨＢＶ感染を有するが、感染の慢性的性質と抗原を外来分子として認識しない免疫系に起因して、抗体レベルは低い。ＤＨＢＶ Ｃｏｒｅ−ＴＢＤキメラ抗原による免疫を行うと、宿主の免疫系はウイルス抗原を認識し、宿主に既に存在するコア抗原に対して体液性応答を開始し、ウイルス抗原に対する宿主寛容を壊した。

同様に、アヒルの免疫系は、キメラ抗原のＴＢＤ成分を外来抗原として認識し、融合タンパク質のこの部分に対する免疫応答も同じく生じさせた。プレートをＴＢＤで被覆し、個々のアヒル由来の血清をＥＬＩＳＡによる抗体レベルについて評価した。この研究結果を表６に示す。

（２．孵化後にＤＨＢＶ感染したアヒル）
正常な子アヒルに、子アヒルが孵化した後の日に、ＤＨＢＶ含有アヒル血清を感染させた。これはＤＨＢＶ研究の分野での標準的な操作である。確立された技術を用いて、持続的なウイルス血症の存在を免疫開始の四週前に確認した。ＤＨＢＶ感染アヒルを二つの集団に分けた。血液（１．０ｍＬ）の試料を免疫前抗体レベルの参照のために各アヒルより集めて、ワクチン接種の前に、血液試料を毎週集めた。実験集団はＤＨＢＶ Ｃｏｒｅ−ＴＢＤキメラ抗原融合タンパク質を１９．９５μｇ／用量で５週目まで毎週同じ曜日に皮下注射した。６週目、用量を二倍として、ワクチン接種を３０週目に停止するまで、四週毎に一回注射した。血液試料は、等量の緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）を投与したプラセーボ集団から集めた。

０週目、３週目および６週目にアヒルから集めた血清の抗体レベルを示す。アヒルの対照集団と実験集団とのにおける、孵化後ＤＨＢＶ感染アヒル由来の血清中の抗コア抗体レベルを表７に示す。ＤＨＢＶは持続的感染を確立しているために、免疫系はウイルス抗原を外来分子として認識せず抗体レベルは低い。ＤＨＢＶ Ｃｏｒｅ−ＴＢＤキメラ抗原による免疫を行うと、宿主の免疫系はウイルス抗原を認識し、宿主に既に存在するコア抗原に対して体液性応答を開始し、ウイルス抗原に対する宿主寛容を破壊した。ＴＢＤに対する抗体レベルも増加した（表７）。したがって、同一のキメラ抗原の異なる部分に対する多価（または多エピトープ性）免疫応答が存在する。

（Ｇ．実施例７：化学架橋ＨＢＶ ｓＡｇ−Ｆｃ（マウス））
１００μｇのｓＡｇ（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；カタログ番号Ｈ １９１０−２７）および１００μｇのマウスポリクローナルＩｇＧ Ｆｃフラグメント（Ｈａｒｌａｎ Ｓｅｒａ−Ｌａｂ Ｌｔｄ．、カタログ番号ＰＰ−１９−０１）の溶液を、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．７に対して一晩４℃で透析した。タンパク質溶液を混合して一緒にして、すぐにジメチルスベリミデート（ＤＭＳ；Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２０７００）を１０ｍＭの最終濃度にて加え、この混合物を室温で１時間インキュベートした。この反応を、０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．８を加えることで停止させた。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５カラム（０．７×１２ｃｍ）にかけて、画分をリン酸緩衝性食塩水を用いて溶出させた。０．５ｍｌ画分を集め、各抗体を用いたＥＬＩＳＡにより予測してｓＡｇ／Ｆｃを１：１のモル比で含有する画分をプールした。

プールした画分を抗原提示アッセイに用いた（Ｂｅｒｌｙｎら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：２７６−２８３（２００１））。未成熟樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ４とともに４日間培養し、ｓＡｇ−Ｆｃ複合体とともにインキュベートし、ＴＮＦαとインターフェロンαとの存在下において成熟させた。自己ＣＤ３^＋Ｔ細胞を成熟樹状細胞に加えた。成熟樹状細胞に対して３回曝した後に、Ｔ細胞刺激を、フローサイトメトリーを用いて細胞内インターフェロンγの産生を測定することにより定量した。複合体の存在下においてＴ細胞中に産生された細胞内インターフェロンγのレベルは、ｓＡｇまたはＦｃフラグメントのみの存在下におけるよりも実質的に高かった（表８）。

（Ｈ．実施例８：抗原提示アッセイ）
ヒトＰＢＭＣ由来の樹状細胞を確立されたプロトコール（Ｂｅｒｌｙｎら（前出）（２００１））に従って用いることで抗原提示アッセイを実施した。Ｔ細胞刺激アッセイのプロトコールの要約をスキームの形で示す。

（１．成熟した負荷樹状細胞の調製）
健康なドナーからの白血球搬出の試料から単球を作り、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ５６抗体とともにインキュベートすることによりリンパ球と顆粒球とを枯渇させた。これに続いて、磁気ビーズ複合抗マウスＩｇＧとのインキュベーションと磁石（Ｄｙｎａｌ）による分離を行った。ネガティブ選択細胞は、広いＣＤマーカーパネル（ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１９⁻、ＣＤ３⁻、ＣＤ４⁻、ＣＤ６４^＋、ＣＤ３２^＋、ＣＤ８６^＋、ＣＤ１６⁻）を用いたフローサイトメトリーにより特性付けられたように９５％を超える純度の単球であった。次に、単球を、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、２．５％調和ヒト血清を加えたＡＩＭ Ｖ中で４日間インキュベートして、未成熟樹状細胞を作った。再び、細胞のアリコートを、細胞の純度と同一性を保証する広いＣＤマーカーパネルにより染色した。次に、細胞に、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ（５．０μｇ／ｍｌ）、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２（２．５μｇ／ｍｌ）またはＴＢＤ（２．５μｇ／ｍｌ）を２〜４時間３７℃で負荷し、インターフェロンαとＴＮＦ−αとにより３日間成熟させた。細胞が適切な成熟を受けたことを保証するために、再びフローサイトメトリーを用いてＣＤマーカーのアレイに対する樹状細胞の確認を行った。得られた成熟した負荷樹状細胞をＴ細胞刺激アッセイに用いた。

（２．Ｔ細胞刺激アッセイ：サイトカイン分析）
樹状細胞としてＰＭＢＣの同一の試料から、磁気Ｔ細胞単離キット（Ｄｙｎａｌ）を製造者の指示に従って用いるネガティブ選択により、Ｔ細胞を生じさせた。成熟した負荷樹状細胞（ＤＣ−１）を完全に洗浄し、Ｔ細胞に加えた（０日目）。Ｔ細胞および樹状細胞を７日間インキュベートした。７日目に、このＴ細胞を、成熟した負荷樹状細胞（ＤＣ−２）により再刺激した。細胞のアリコートを二時間後に採取した。この細胞のアリコートを、ブレフェルジンＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに１８時間インキュベートし、次に下記の細胞内サイトカイン染色についてアッセイした。

残っている細胞をさらに７日間インキュベートした。１４日目に、残っている細胞を、第三群の成熟した負荷樹状細胞（ＤＣ−３）で刺激した。細胞のアリコートを二時間後に採取した。この細胞のアリコートをブレフェルジンＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに１８時間インキュベートし、次に下記の細胞内サイトカイン染色についてアッセイした。

細胞内サイトカイン染色のために、細胞を抗ＣＤ３−ＦＩＴＣと抗ＣＤ８−Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅとで３０分間染色し、洗浄し、固定し、浸透化処理し、次に抗インターフェロン−γ−ＰＥで３０分間氷上にて染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。この結果を表９に示す。

１４日目にアリコートを除去した後、残っているＴ細胞をさらに３日間インキュベートし、次にその上清を用いてＥＬＩＳＡ（Ｏｐｔ Ｅ１Ａ ＥＬＩＳＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分泌インターフェロンγのレベルを測定した。Ｔ細胞刺激を、細胞内インターフェロンγおよび分泌インターフェロンγのレベルを測定することにより評価した。この結果を表１０に示す。キメラ抗原Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤは、単独で試験した場合、分子の免疫応答ドメインまたはＴＢＤドメインのいずれかと比較して、等濃度においてより高い量のインターフェロンγの産生を引き起こした。Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤの５μｇの用量は、おおよそ上記成分のそれぞれを２．５μｇ含むことを指摘しておかなければならない。

Ｔ細胞応答に関して、多様な濃度のＳ１／Ｓ２−ＴＢＤを調べた。Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤの効果は、同様な濃度において破傷風トキソイド治療よりも高かった。５μｇ／ｍＬよりも低い濃度において、キメラ抗原はインターフェロンγの産生および分泌の濃度依存的増加を引き出した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞によるインターフェロンγの産生および分泌は、表１１に示されるように、樹状細胞によるＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ抗原の提示後に、濃度依存的様式で増加した。低濃度での陽性応答は、ワクチン接種に必要な用量およびワクチンの製造費用に関して有利である。

（Ｉ．実施例９：キメラ抗原の結合および取り込み）
（１．成熟した負荷樹状細胞の調製）
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、白血球搬出細胞調製物のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）処理から得た（Ｂｅｒｌｙｎら（前出）（２００１））。単球単離キット（Ｄｙｎａｌ）を製造者の指示に従って用いるネガティブ選択により、単球をＰＢＭＣ集団から分離した。単球は、抗体分析およびフローサイトメトリー（ＣＤ１４^＋、ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１９⁻、ＣＤ３⁻、ＣＤ４⁻、ＣＤ６４^＋、ＣＤ３２^＋、ＣＤ８６^＋、ＣＤ１６⁻）による検定で９５％を超える純度であった。単球を、１％のドナー調和血清（Ｂｅｒｌｙｎら（前出）（２００１）による記載のように単離されたもの）を含む、Ｌ−グルタミン、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地で二回洗浄した。次に、この単球を、２．５％ドナー調和血清とサイトカインＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含むＡＩＭ−Ｖ培地中で培養し、細胞を樹状細胞（ＤＣ）系統へと分化させた。この細胞を１２ウエル組織培養皿中、３７℃、７％ＣＯ_２雰囲気でインキュベートした。

単球由来の樹状細胞を１日目〜４日目に集めた。次に細胞を、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地で一回洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＰＢＳＢ）を含むダルベッコリン酸緩衝性食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で二回洗浄した。単球由来の樹状細胞を４℃の標識または結合アッセイまたは３７℃の結合／取り込みアッセイに用いた。

（２．キメラ抗原の成熟樹状細胞への結合）
マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに対してＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの成熟樹状細胞への結合の程度を比較した。樹状細胞を、エキソビボ培養（０日目〜４日目）の種々の日に単離し、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ（１０μｇ／ｍＬ）、またはマウスＩｇＧ１（２Ｃ１２、ＴＢＤが生産された親ｍＡｂ）もしくはＩｇＧ２ａ（Ｇ１５５−１７８、９０μｇ／ｍＬ）で、樹状細胞を１時間、４℃で処理した。この細胞を、ＰＢＳＢ中のＦ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８（１０μｇ／ｍＬ）で２０分間処理した。細胞をＰＢＳＢで二回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦ）を含むＰＢＳＢに再懸濁し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ獲得分析（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウエア（ＢＤ）に適合させたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）ＦＡＣＳｃａｎにより得た。ＦＳＣとＳＳＣ分散プロフィールにより決定された生存細胞集団上にゲートを作り、≧１０，０００細胞を得た。陽性細胞の比率を決定するために、ゲートを、陰性対照処置細胞（Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８のみで標識したアイソタイプ対照または細胞）に基づいて設定した。特異的な陽性細胞の比率は下記のように計算した：

相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、試験試料のＭＦＩから対照試料のＭＦＩを引いたものとして決定した。

培養１日〜４日後のＤＣ上のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに比較したＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの結合を表１２に示す。

Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａのいずれか結合よりも明らかにかなり高く、さらにＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合は４日目よりも１日目で明らかであった。これらの実験は、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤは成熟樹状細胞に対して高い効率で結合したことを示した。

（３．成熟樹状細胞へのキメラ抗原の取り込み）
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに比較した場合のキメラ抗原（例えば、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ）の取り込みの程度を決定するために、０．１％ＢＳＡを含むＡＩＭ Ｖ培地中で１時間、３７℃で多様な濃度の抗原ＩｇＧ１（２Ｃ１２、ＴＢＤが生産された親ｍＡｂ）またはＩｇＧ２ａ（Ｇ１５５−１７８）と共に細胞をインキュベートした。細胞をＰＢＳＢで二回洗浄し、２％ＰＦを含むＰＢＳで一晩４℃にて固定した。続いて、この細胞をＰＢＳＢで二回洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）サポニン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで４０分間、２０℃にて浸透化処理した。

細胞をＰＢＳＢで二回洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）サポニンを含有するＰＢＳＢ中のＦ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８（１０μｇ／ｍＬ）と共に２０分間、４℃にてインキュベートした。ＰＢＳＢで二回洗浄した後、細胞をＰＢＳＢに再懸濁した。このアッセイの変法では、細胞を、キメラ抗原、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａにより１０分間上記のように処理した後に、５０分間Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８（１０μｇ／ｍＬ）を加えた。続いて、細胞を洗浄し、２％ＰＦを含むＰＢＳに再懸濁した。

Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ獲得分析ソフトウエア（ＢＤ）で適合されたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）ＦＡＣＳｃａｎにより細胞を得た。ＦＳＣおよびＳＳＣの分散プロフィールにより決定された生存細胞集団上にゲートを作り、≧１０，０００細胞を得た。陽性細胞の比率を決定するために、ゲートを陰性対照処置細胞（Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８のみで標識されたアイソタイプ対照または細胞）に基づいて設定した。特異的な陽性細胞の比率は下記のように計算した：

相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、試験試料のＭＦＩから対照試料のＭＦＩを引いたものとして決定した。

マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａと比較したＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの取り込みを、樹状細胞の成熟の４日目の濃度の関数と予測した。取り込みを３７℃で１時間定量し、その結果を図４に示す。濃度とともにＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの取り込みは直線的に増加した。ＩｇＧ１はかなり低いレベルで取り込まれ、ＩｇＧ２ａの取り込みはほとんどなかった。したがって、キメラ抗原Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤは、免疫グロブリンよりもさらに効率的に樹状細胞に取り込まれる。

（Ｊ．実施例１０：成熟ＤＣ上でのＦｃ−γレセプターおよびＣＤ２０６の発現）
抗原に結合し、これを取り込む抗原提示細胞上にいくつかのレセプターが存在する。成熟樹状細胞上のこれらレセプターの量を、蛍光標識レセプターに特異的な抗体を用いて評価した。ＦＡＣＳ分析を用いて、樹状細胞の全集団における、特異的レセプターに陽性な細胞の比率を予測した。レセプター発現の程度は、相対的平均蛍光強度の測定により、そして相対的蛍光強度の関数として評価した（表１３）。

ＣＤ６４（ＦｃγレセプターＩ）の発現は培養時間とともに減少し、４日目にほとんど無視できた。対照的に、ＣＤ３２（ＦｃγレセプターＩＩ）、およびさらに低い程度でＣＤ１６（ＦｃγレセプターＩＩＩ）は、ＤＣ培養の４日後まで発現し続けた。培養の０日目では、ＣＤ２０６（マンノースマクロファージレセプター）発現は基本的に存在しなかった。しかし、発現はＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦとの培養により誘導され、４日目までに、ＣＤ２０６は非常に高いレベルで発現した。よって、４日目に抗原を抗原提示アッセイにかけたときに、樹状細胞は、キメラ抗原の結合のための少なくとも二つの潜在的なレセプター（ＣＤ３２およびＣＤ２０６）を有した。さらに、それらのレセプターは共刺激分子の完全な補体を有した（データは示さず）。ＨＬＡ−ＤＲ（クラスＩＩ）およびＨＬＡ−ＡＢＣ（クラスＩ）の発現も培養時間とともに増加した。共刺激分子のＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＣＤ８０（Ｂ７．１）がアッセイの間中発現した。これらの結果は、単球由来の樹状細胞が成熟樹状細胞に分化し、これらが抗原処理とＴ細胞への提示をし得ることを示す。

（Ｋ．実施例１１：ＣＤ３２／ＣＤ２０６発現と成熟ＤＣに対するＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合との相関）
ＣＤ３２／ＣＤ２０６レセプターの発現と成熟樹状細胞へのＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合との間に直接の相関が存在する。マウスＩｇＧ１は、ヒトＣＤ３２へ結合することが公知であるので、ＩｇＧ１のマウスＦｃ成分を含むＳ１／Ｓ２−ＴＢＤはＣＤ３２にも結合することが予測された。さらに、その高いマンノースグリコシル化のために、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤが、ＣＤ２０６レセプターを経て樹状細胞に結合することもまた予測される。

図５のドットプロットは、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合（１０μｇ／ｍＬ）およびＣＤ３２発現、ならびにＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合およびＣＤ２０６発現を示す。Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合の程度とＣＤ３２発現の程度（この発現は比較的不均一であり、すなわち広い程度の発現が存在した）との間には直接の相関があった。これらの結果は、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤはＣＤ３２に結合することを示し、ＣＤ３２の発現が高いほど、キメラ抗原Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤの結合の程度が高いことを示す。Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合とＣＤ２０６発現とのドットプロットは、ＣＤ２０６を発現するほとんど大部分の細胞が、Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤにも結合したことを示す。この細胞集団の低い割合でＣＤ２０６陰性であり、したがってＳ１／Ｓ２−ＴＢＤ結合に対して陰性であった。したがって、ＣＤ３２とＣＤ２０６との両方のレセプターがＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの結合に相関する。

（Ｌ．実施例１２：Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤの結合および取り込みは、主にＣＤ３２によるものであり、ＣＤ２０６はそれよりも低い程度で関与する）
マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａと比較したＳ１／Ｓ２−ＴＢＤの取り込みは、ＤＣ成熟の４日目の濃度の関数と予測した。この取り込みを、３７℃で１時間、培地、マンナン（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）および／またはマウスＦｃγ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下において定量した。マンナンはＣＤ２０６結合の競合的インヒビターであり、よって樹状細胞上のＣＤ２０６による抗原の取り込みのインヒビターである。ＦｃγはＣＤ３２結合の競合的インヒビターであり、よってＣＤ３２が媒介する抗原取り込みのインヒビターである。この結果を表１４に示す。

濃度とともにキメラ抗原の結合の漸進的な増加が存在した。高い濃度のマウスＦｃγフラグメントとの細胞のインキュベーションは、この結合を無効にしたが、ＣＤ２０６レセプター結合のインヒビターであるマンナンは些細な効果を有するのみであった。したがって、ＣＤ３２は、キメラ抗原の結合と取り込みとに関わる主要なレセプターであり得る。

（Ｍ．実施例１３：ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２抗原のグリコシル化は免疫原性を付与する）
昆虫細胞で合成されたタンパク質が、分泌タンパク質において高マンノース含量および末端シアル酸残基の欠如をもたらすグリコシル化を受ける点で、タンパク質グリコシル化の昆虫細胞経路は哺乳動物細胞のものとは異なる（Ａｌｔｍａｎら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇ １６：１０９−１２３（１９９９））。キメラ抗原の抗原成分であるＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２は、Ｅ．ｃｏｌｉ（グリコシル化なし）とＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）昆虫細胞（マンノールグリコシル化）との両方で発現させた。

（１．抗原結合に対するグリコシル化の効果）
樹状細胞に対する結合に関して、これらの抗原を実施例９に記載のように比較した。成熟樹状細胞に、昆虫細胞またはＥ．ｃｏｌｉ．で発現した１０μｇ／ｍｌのＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２を負荷した。グリコシル化タンパク質は樹状細胞による良好な結合を示した（表１５）。

（２．免疫応答を引き出すことに対するグリコシル化の効果）
ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２のグリコシル化は、増強された免疫原性とＴ細胞応答とを引き出す。樹状細胞により提示された場合のＴ細胞応答について、Ｅ．ｃｏｌｉとＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）昆虫細胞との両方で発現させたＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２を比較した。実施例８に記載されたように（２．５μｇ／ｍｌ ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２タンパク質を用いて）細胞内インターフェロンγと分泌インターフェロンγのレベルを測定し、その結果を表１６に示す。

昆虫細胞で発現したＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２は、Ｅ．ｃｏｌｉ．で発現したグリコシル化されていないタンパク質と比較して、細胞内インターフェロンと分泌インターフェロンとの両方をより高いレベルで生じた。

上記明細書に示したすべての公刊物および特許は、本明細書において参考として援用される。本発明の記載された方法と系の多様な改良および変化物は、当業者にとって本発明の精神と範囲から離れることなく明らかであろう。本発明は特定の実施態様との関連において記載されているが、本発明の特許請求の範囲は、そのような特定の実施態様に過度に限定すべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するための記載された態様の多様な改変は、当業者に明らかであり、それらの改変は、以下の請求項の範囲の内にあることが意図される。

図１Ａは、本発明のキメラ抗原の単量体としての構造を示す略図であり、このキメラ抗原は二つの部分（すなわち、免疫応答ドメインおよび標的結合ドメイン）を有する。この略図はまた、ヒンジ領域が存在する好ましい実施態様も示している。 図１Ｂは、二量体として組み立てられた正常な状態での本発明のキメラ抗原の構造を示す略図である。この略図は、キメラ抗原が免疫応答ドメインと標的結合とに加えて６×Ｈｉｓタグおよびペプチドリンカーを含む特に好ましい実施態様を示す。 図２は、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤによるＴ細胞の刺激が、ＨＢＶ Ｓ１タンパク質由来のエピトープに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を特異的に発生させることを示す。 図３は、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤによるＴ細胞の刺激が、ＨＢＶ Ｓ２タンパク質由来のエピトープに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を特異的に発生させることを示す。 図４は、樹状細胞を成熟させることによるＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の取り込みの比較を濃度の関数として示す。 図５は、ＣＤ３２へのＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２−ＴＢＤの結合と樹状細胞上のＣＤ２０６発現との相関を示す。

Claims (49)

1. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する宿主の免疫応答を引き出すための精製されたキメラ抗原であって、該キメラ抗原がポリペプチド免疫応答ドメインおよびポリペプチド標的結合ドメインを含み、ここで
   前記免疫応答ドメインがＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２、ＨＢＶ Ｓ１／Ｓ２／Ｓ、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ、ＨＢＶ Ｃｏｒｅ ｃｔｍおよびＨＢＶポリメラーゼからなる群から選択されるＨＢＶタンパク質の少なくとも一つの抗原性部分を含み；
   前記標的結合ドメインがヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１領域の一部、ならびにＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含む異種型Ｆｃ抗体フラグメントからなり；
   前記免疫応答ドメインと前記標的結合ドメインとがペプチド結合によって結合しており；そして
   非哺乳動物グリコシル化されている、キメラ抗原。
2. 前記キメラ抗原が、二つ以上の免疫応答ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗原。
3. 前記免疫応答ドメインが、前記タンパク質に融合した６×Ｈｉｓタグをさらに含む、請求項１または２に記載のキメラ抗原。
4. 前記ペプチド結合が、配列ＳＲＰＱＧＧＧＳまたは配列ＶＲＰＱＧＧＧＳ（配列番号１）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ抗原。
5. 前記キメラ抗原が、マンノースグリコシル化されている、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラ抗原。
6. 前記免疫応答ドメインが、マンノースグリコシル化されている、請求項５に記載のキメラ抗原。
7. 前記標的結合ドメインが、マンノースグリコシル化されている、請求項５に記載のキメラ抗原。
8. 前記キメラ抗原が、低マンノースグリコシル化されている、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラ抗原。
9. 前記キメラ抗原が、高マンノースグリコシル化されている、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラ抗原。
10. 前記標的結合ドメインが、アミノ酸配列ＳＲＰＱＧＧＧＳ（配列番号１）、ＶＤＫＫＩ（配列番号２）、ならびにマウス免疫グロブリン重鎖定常領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ抗原。
11. 多エピトープ性応答を引き出す請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラ抗原。
12. 前記免疫応答ドメインの少なくとも一つのエピトープに対する免疫応答を引き出す、請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラ抗原。
13. 体液性免疫応答を引き出す、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラ抗原。
14. 細胞性免疫応答を引き出す、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラ抗原。
15. Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、ＣＴＬ応答またはそれらの組合せを引き出す、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラ抗原。
16. 前記キメラ抗原が、Ｆｃレセプターと結合することができる、請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラ抗原。
17. 前記Ｆｃレセプターが、ＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４からなる群から選択される、請求項１６に記載のキメラ抗原。
18. 抗原提示細胞と接触して該抗原提示細胞において抗原提示を増強する医薬を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
19. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１８に記載の使用。
20. 前記医薬が、二つ以上のエピトープの抗原提示を増強する、請求項１８に記載の使用。
21. 前記医薬が、前記免疫応答ドメインの少なくとも一つのエピトープの抗原提示を増強する、請求項１８に記載の使用。
22. 抗原提示細胞と接触して該抗原提示細胞を活性化する医薬を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
23. 前記接触が、エキソビボで行われる、請求項１８または２２に記載の使用。
24. 前記接触が、インビボで行われる、請求項１８または２２に記載の使用。
25. 前記接触が、ヒトにおいて行われる、請求項２４に記載の使用。
26. 対象に投与して免疫応答を引き出す医薬を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
27. 対象に投与して寛容を壊す医薬を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
28. 対象に投与して免疫治療可能な症状を治療する医薬を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
29. 前記免疫応答ドメイン単独の投与が、免疫応答を引き出さない、請求項２６〜２８のいずれかに記載の使用。
30. 前記キメラ抗原の投与が、免疫応答ドメイン単独の投与よりも高い免疫応答を引き出す請求項２６〜２８のいずれかに記載の使用。
31. 前記免疫応答が、前記対象に存在する抗原特異的な抗体の量によって測定される、請求項３０に記載の使用。
32. 前記免疫応答が、前記キメラ抗原または免疫応答ドメインを単独で負荷した抗原提示細胞に曝された応答において、Ｔ細胞により分泌されたインターフェロンγの量によって測定される、請求項３０に記載の使用。
33. 前記免疫応答が、前記キメラ抗原または免疫応答ドメインを単独で負荷した抗原提示細胞に曝された応答において引き出された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量によって測定される、請求項３０に記載の使用。
34. 対象に投与してウイルス感染に対して該対象にワクチン接種する医薬の製造のための、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
35. 前記対象が、既存のウイルス感染に対して治療的にワクチン接種される、請求項３４に記載の使用。
36. 前記対象が、ウイルス感染に対して予防的にワクチン接種される、請求項３４に記載の使用。
37. 前記対象が、前記キメラ抗原の二つ以上のエピトープに対する免疫応答を発達させる、請求項３４に記載の使用。
38. 前記対象が、前記免疫応答ドメインの二つ以上のエピトープに対する免疫応答を発生する、請求項３７に記載の使用。
39. 薬学的に受容可能な賦形剤と請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原とを含む、薬学的組成物。
40. 前記薬学的組成物が、非経口投与のために処方されている、請求項３９に記載の薬学的組成物。
41. 前記薬学的組成物が、経皮投与、皮内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻投与、肺投与または経口投与のために処方されている、請求項３９に記載の薬学的組成物。
42. さらにナノ粒子を含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の薬学的組成物。
43. さらにナノスフェアを含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の薬学的組成物。
44. キメラ抗原が二量体として組み立てられている、請求項３９〜４３のいずれかに記載の薬学的組成物。
45. 請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原と、該キメラ抗原の投与が必要な対象に対して該キメラ抗原を投与するための説明書とを備える、製品。
46. キメラ抗原を作製する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）微生物または細胞株を提供する工程であって、該微生物または細胞株は、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、工程；および
    （ｂ）該微生物または細胞株を、該キメラ抗原が発現される条件下で培養する工程、
    を包含する、方法。
47. 前記微生物または細胞株が、真核細胞の微生物または細胞株である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記微生物または細胞株が、酵母、植物細胞株または昆虫細胞株である、請求項４７に記載の方法。
49. 前記キメラ抗原が、マンノースグリコシル化を含むように翻訳後修飾されている、請求項４８に記載の方法。

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