TWI364294B - Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens - Google Patents

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1364294 九、發明說明： 相關申請案 本申請案主張美國專利臨時申請案第60/493,449號（申 請曰2003年8月8曰，其以引用方式納入本文中）之榷 利。 【發明所屬之技術領域】 本發明關於用以引發或增強免疫反應及用以破壞宿主 對外來抗原之耐受性的方法及組成物。 【先前技術】 當健康宿主（人類或動物）遭遇外來抗原，例如衍生 自細菌、病毒及/或寄生蟲之蛋白質時，宿主便正常地啟發 一種免疫反應。Λ免疫反應可為體液反應與/或細胞反應。 於體液反應中，在對抗原性刺激產生反應時係由β細胞製 ::體並分泌至血液及/或淋巴中。然後抗體會藉由特異性 -表面上之各抗原、’使其經由吞嗟性細胞及/或補體 -介導之機制遭受破壞，哎 4丄由阻斷結合或錯由促進游離皞 抗原從循環清除而中和 〜 亥抗原（例如病毒）。細胞反應特 被在於筛選及擴展能夠 ^ j罝接或間接漓除含有該抗原之細胞 寺異性輔助及細胞毒性T-淋巴細胞。 於某些個體中，Φ、危么β & a 免疫糸、，先無法對特定外來抗原產生反

尤° §抗原不會刺激特里 M _ ,.. "性抗脰及/或殺手T細胞製造時， s亥免疫糸統便無法預防 止 (例如病毒病。因此，感染性抗原 丙t )月匕夠建立慢性感染，而宿主 得對該耸由硌染性浐 免焱糸、.克逐漸變 .^丨生心原所產生之抗原具耐受性。 1364294 雖然感染性抗原係藉由何種機制逃避宿主免疫機構目 前尚未明確’但缺乏對宿主免疫系統適當展現外來抗原可 能是發展成慢性感染的主要因素。抗原展現細胞（APCS)視 該抗原之所在位置而分別加工處理所遭遇的抗原。外部抗 原經胞吞作用並後續於抗原展現細胞之内體中進行加工。 從外源性抗原所產生之肽片段被展現於與主要組織相容性 複合體（MHC) II類複合之細胞表面上。將此複合體展現於 CD4+ T細胞’會刺激該CD4+ T輔助細胞分泌出可刺激b 細胞製造對抗該外源性抗原之抗體（體液反應）的細胞因 子。另一方面，胞内抗原係經加工並於抗原展現細胞表面 上展現呈與MHC I類複合之複合體。將抗原展現於cd8+ T 細胞會導致一種對抗攜帶該抗原之宿主細胞的細胞毒性τ 細胞（CTL)免疫反應。 於罹患慢性病毒或寄生蟲感染（該生物體於其生命週 期的某些點會駐留在宿主體内）之患者中，抗原會由宿主 細胞製造及表現且所分泌之抗原會存在循環中。例如，在 慢性人類B型肝炎病毒（HBV)載體之個案中，可於血液中 偵測到病毒顆粒及HBV表面抗原與核心抗原之替代物（呈 e-抗原形式）。 對於慢性感染之有效治療需要對抗與感染性物質相關 之抗原的強CTL反應。此可藉由在宿主細胞内製造該抗 原，或藉由將抗原遞送至適當細胞區室，以使其經加工及 展現而引發細胞反應來達成。文獻中已發表數種用以在細 胞内遞送抗原之策略。其中，已發表病毒載體（勞倫茲等 1364294 人，好謂.Ga 772α，ι〇:623·631 (1999))、使用經 cDNA-轉^之細胞（唐納利等人，Μ㈣⑽/ 15:6i7 (1997))以及經由所注射之cDNA載體表現抗原（賴等人， CV". /m則⑽/· 18:449_484 (1988);及美國專利案 5,5 89’466號）。而且，已有描述表現被靶定至樹狀細胞之 抗原的DNA疫苗（尤爾等人，。如以及以61:37〇4_3711 (2001)) 〇 已經使用能夠將抗原攜帶至供MHC I類途徑加工之細 胞貝區至的遞送載體。希爾格等人（邊若17: 219_228 (1999))已詳細描述利用佐劑達到相同的目的。另一項策 略係使用供細胞質遞送抗原之生物可分解性微球體，例如 產生對抗卵清蛋白肽之Thl免疫反應（紐曼等人，y 54:49-59 (1998);及紐曼等人，j扪⑽w施⑽心 5〇_591_597 (2〇〇〇))。此外’抗原展丨見細胞（例如樹狀細 胞）會攝取PLGA奈米球體（紐曼等人，J扪⑽d 60:480-486 (2002)) 〇 樹狀細胞可捕捉、加工並展現抗原以及刺激原初T細 胞之此力’已使其成為用於治療性疫苗研發方面非常重要 的工具（勞培茲等人，7/ww W則⑽/ 6〇:591597 (1999)) 〇 對樹狀細胞靶定抗原係抗原展現作用中的必要步驟，而且 已針對此目的開發出將數種報導蛋白展現於對應抗體Fc 區域之樹狀細胞上（雷諾特等人，j五印从以189:371 38〇 (1999))。此策略之其他實例包括卵巢癌Mab_B4313、抗_ PSA抗體及抗_HBV抗體抗原複合體（溫等人，及⑼ 1364294 /mmwo/ 18:25 1-258 (1999))。使用裝載有腫瘤相關抗原 之樹狀細胞的癌症免疫療法已顯示可產生腫瘤-特異性免疫 反應及抗-腫瘤活性（方恩與英格曼，心„‘及⑼ 96:1865-1972 (2000);及坎普頓等人，乃以所如〇/ 1 15:57-61 (2000))。於使用添加腫瘤_抗原之樹狀細胞的 活體内臨床試驗中已獲得有希望之結果。此等結果明確證 實使用樹狀細胞產生對抗癌症抗原之免疫反應的功效。 抗原展現亦可經由甘露糖受體替代（或額外）利用位 於抗原展現細胞上之Fc受體而完成。巨噬細胞甘露糖受 體（MMR)，亦已知稱為CD206，經表現於諸如樹狀細胞（dc) 等抗原展現細胞上。此分子為胞内受體c_型凝集素家族之 成員。經甘露糖糖苷化之抗原可被CD2〇6結合及内在化。 一般，外源性抗原被認為係透過MHC „類途徑加工及展 現。然而，在經由CD206靶定之個案中，已證實mhc工 類與11類皆有涉入（亞波托包羅斯等人，心义/顚_/_ 3〇.m4 (2〇〇〇)，亞波托包羅斯與麥肯尼兹，c游协厂施乂 1:469 (2001)； Λ Immunol. 172:2845-2 852 (2000)) 〇 感染性疾病與癌症矣士平殺λ /正马大眾醫療之主要課題。例如，世 界衛生組織統计辟+ 4«。Λ Τ，，肩不超過20億人已感染HBV。其中3億 7千萬為’反性感染而杜果且女技s二、。 一 、·°果具有發展成肝硬化及肝細胞癌的 高度可能性。全世界士的 大、力〗7千萬人為HCV慢性帶原 者’對其並無有效的 的預防或治療性疫苗。世界衛生組織報 夺母年有I千萬人經珍 • °〆网惟思瘤症。癌症每年造成6百萬 1364294 人死亡’佔全球死亡人數之丨2%。因此，需要用以引發對 抗感染及癌症之免疫反應的新顆治療性組成物與方法，以 及供製造此類組成物之方法。 【發明内容】 發明概述 本發明提供用於引發免疫反應之嵌合抗原，該嵌合抗 原包含免疫反應功能域及標靶物結合功能域，其中該標靶 物結合功能域包含一段抗體片段。 本發明另一方面係提供增進抗原展現細胞之抗原展現 的方法，λ包含將該抗原展現細胞與包含本發明嵌合抗原 之組成物接觸。 本發明又一方面係提供活化抗原展現細胞之方法其 包含將該抗原展現細胞與包含本發明嵌合抗原之組成物接 個體投藥 本發 本發明之 該個體係 本發 包含對有 抗原。於 症（特別 本發 明—方面係提供引發免疫反應之方法，其包含對 予包含本發明嵌合抗原之組成物。 月另方面係提供破壞耐受性之方法，其包含將 嵌合，原投藥予個體。於-項較佳具體態樣中， 受病秦或專性胞内寄生蟲慢性感染。 =方面係提供治療免疫-可治療病況之方法，其 f需要之個體投藥予治療上有效量的本發明嵌合 ::較佳具體態樣中，該免疫-可治療病況為感染 疋忪性感染症）或為癌症。 B月叉^ 夕 乃面係提俣疫苗接種個體對抗感染症之方 1364294 法，其包含將本發明之嵌合抗原投藥予個體。該個體可施 予預防性或治療性疫苗接種^較佳地該感染為病毒感染或 專性胞内寄生蟲感染。 本發明另一方面係提供一種醫藥組成物，其包含本發 明之換合抗原及醫藥上可接受之賦形劑。 本4明一方面係提供其包含本發明之嵌合抗原及用以 將本發明嵌合抗原投藥予個體之指示說明的製品。 本發明另一方面係提供編碼嵌合抗原之聚核苷酸，該 聚核苷酸包含編碼免疫反應功能域之第一聚核苷酸部份與 編碼標靶物結合功能域之第二聚核苷酸部份，其中該標靶 物結合功能域包含一段抗體片段。本發明亦提供包含此類 聚核穿酸之微生物與細胞系。 本發明又一方面係提供製造本發明嵌合抗原之方法， '、包3提供一種包含編碼本發明嵌合抗原之聚核苷酸的微 生物或細胞系’並將該微生物或細胞系培養於藉其可表現 该嵌合抗原之條件下。 本發明一或多項.具體態樣係列述於所附圖式及下文敘 述中本發明之其他特性、標的及優點將由該敘述及圖式， 以及由申請專利範圍而彰顯出。 發明詳述 A.概論 、本文係揭示用於引發對抗抗原之免疫反應的組成物及 :法：尤，其’該等組成物及方法係引發對抗會被宿主辨識 :㈢身抗原^'外來饥原的免疫反應s而因此破壞宿主 1364294 對-亥等抗原之耐党性。_宿主免疫系統展現以包含免疫反 應功能域及標乾物結合功能域之嵌合抗原，其中該標乾物 m合功i域包含_段抗體m ’可增強對抗外來或所对受 :原之免疫反應。&原展現細胞攝取、加工處理並展現該 瓜口 #几原引發對抗所希望抗原之體液及細胞免疫反應。 B.定義 在進一步詳細描述本發 術語經定義如下，除非另行指示 意指一種於人類或其他動物因抗原（免疫原） 引發而由B淋巴細胞所製造具有料胺基酸序列之免疫球 U Μ 子特徵在於可特異地與該抗原反應，分 別以個別術語定義。 或意指一類其中在對抗原 .刺激產生反應時係由B細胞製造抗體並分泌至血液及/或 中之免疫反應。於適當功能性免疫反應中，抗體特異 也，、存在細胞（例如症原结、本； έ Λ 』届原函）表面上之抗原結合，標記該 =以供由巨嗟細胞及/或補體—介導機制執行破壞。抗體 仃全身循環並可結合至游離態病毒顆粒。此抗體結合 田貞中和病毒顆粒而防止其感染細⑯，並且標記該病毒 福叔二供由巨嗟細胞將其從循環消除或於腎臟中渡除。 敏咸血‘組” f、指任何其結果與適當細胞接觸，誘導呈現 或免疫反應性狀態，及其以可證明方式與受敏感個 體及/或免疫細胞於活體内或得自活體地反應之物 1364294 ‘ 見細胞”意指抗原誘導事件之輔佐細胞，其 功能主要為持有並展現抗原予淋巴細胞。抗原展現細胞與 抗原之相互作用為免疫誘導之必要步驟，因為其能夠使淋 巴細胞遭遇並辨識抗原性分子而轉變成受活化形式。例舉 性抗原展現細胞包括巨噬細胞、朗氏_樹狀細胞、濾泡樹狀 細胞及B細胞。 “ g-每胞，，意指一類製造可與抗原相互反應之免疫球 蛋白或抗體的淋巴細胞。 C-hJ—思4a位於抗體之彳几原結合片段上的重键悝 定功能域區域。 “細-14應”意指一類由能夠直接消除病毒感染或癌 症細胞之由特異性辅助及殺手T細胞所介導的免疫反應。 用於本文’盘.舍抗原”意指包含免疫反應功能域及 標乾物結合功能域之多肽。該免疫反應功能域與標乾物結 合功能域可直接或間接地以共價或非-共價方式鍵聯。 |gj包，毒性T -淋（V細瞭”意指一類能夠摧毀外來細胞 及其製造病毒抗原之受感染劑感染宿主細胞的特化淋巴細 胞。 決定基意指複雜抗原分子上抗原決定基之最 簡單形式，此為抗原由免疫球蛋白或τ細胞受體辨識之特 異性部份。 “ 蛋白質__意指—種藉由表現由二或多段基因序 列所組合成之雜合體基因而形成的蛋白質。 “ 意指抗體上將Fab片段與Fc片段連結之部 12 份；鉸鏈區含有共價鍵聯兩重鏈之雙硫鍵。 術。。恩j[意指_分子其 例如，彼等在相對應位置且有子呈現同源性’ 列。月笋“。/且η t ” 、相问或相似之化學殘基序 00 ° -、同源性，或“ ％同源立 酸或多肽類在同一位置上盆 $ ^日同源聚核穿 同二:]如’若兩蛋白質之8。個殘基中…相 、J。亥一蛋白質為93 75%同源。 種習於兮T5 1 白刀比同源性可使用各 ;°"員技藝人士已知之軟體測定得。. 渔主-意指罹患免疫-可；厶& Γ*· ·σ 之、、θ Α私A / 口療病況，例如感染或癌症 原二予、.包括人類）。用於本文“宿主”亦指嵌合抗 、斤才又予之溫血動物（包括人類）。 於本發明内文中’“歧”意指寡聚物化合物互補股 ^對。於本發明中，配對之較佳機制涉及氣鍵，其在 來化合物股之互補卿或核穿酸驗基（核驗基）間可 :華生-克里克、胡格斯汀或反轉胡格斯汀氫鍵。例如，腺 Γ令與胸腺㈣為經由形成氫鍵而配對之互補核驗基。雜 父可於各種情況下發生。術語“继1” 、“雜交作用”等 用於聚核伽方面意指習用之雜交條件，較佳^^ 5 〇 % 甲酿胺/6XSSC/0.1% SDS/1〇〇 gg/ml祕财進行雜交其 中雜交溫度係高於3rc且於0 lxssc/〇」sds中之漂洗溫 度係高於55。(：。 兔A或“-免羞反應/意指身體對抗原所產生之反 應。於特別具體態樣中，係指身體抵抗或保護自身對抗感 染性疾病之能力。 13 1364294 “免疫反應功能域（IRD)”意指雙功能性抗原分子之具 各種不同構型的抗原性部分。免疫反應功能域包含一或多 抗原及/或一或多種重組抗原。 用於本文，片語“ 1疫-可治意指可藉由引發 或調節患者體内免疫反應而受到預防、抑制或緩解之病況 或疾病。 “ I巴細胞”意指經發現於血液中介導特定免疫反應 之次組有核細胞。 J- # ^ 或 mAb意指從經融合雜交體細胞（亦 即融合瘤細胞）純系或遺傳上同源之族群所製造的抗體。 雜合體細胞經選殖而建立可產生在化學及免疫學上為均一 (亦即僅辨識單一類抗原）的特定單株抗體之細胞系。 肢类員1建聯”意指二或多個藉由位於一胺基酸之阿伐_ 胺基與另一胺基酸之阿伐_羧基間的經取代鍵聯而共價接合 之胺基酸。 jg·藥上可接受者意指其在生理學上可與人類或其 他動物相容之無毒性組成物。 “置上可包含其不具無毒性且在生 理i上可與人類或其他動物相容之物質，例如佐劑、載劑、 pH-調整及緩衝劑、張力調整劑、溼潤劑、防腐劑等類。 術語“ I核苻酸...”用於本文意指一種具有任何長度之 核¥酸（核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸）的聚合形式。此 術語僅指該分子之初級結構。因此，此術語包括雙股與單 股DNA及RNA »其亦包括已知之修飾類型，例如，該項 14 1364294 技蟄已知之標記物、甲基化、“帽結構”、 a 類似物取代 一或夕個天然核苷酸、諸如該等具有未帶 甲美贐咏此 兔何鍵聯（例如 〒丞膦自义酉曰、磷酸三酯、磷酸醯胺、胺甲 %寺）、含右 側鍵部分例如蛋白質（包括例如核酸酶、 tt . 來I、抗體、兮fl 號狀、聚-L-賴胺酸等）、具有嵌入物（例 去笙、a 丫 °定、補骨脂 ’、)、έ有螯合物（例如金屬、放射活性么屈 孟屬、爛、氧 化金屬等）、含有烷化劑、具有經修飾鍵聯 〜，〈例如阿伐端 基異構核酸等）之核苷酸間修飾作用以及聚 欲雜r 來核苷酸脂未經 修飾形式。 “饵點”.意指蛋白分解性酵素水解（斷裂） 多肽鏈之位置。 於本發明中片語“交蓋丄牛”或»g條件”意 指於其下本發明化合物會與其標靶序列，但僅與最少數其 他序列雜交之條件。 術語“個1”意指任何溫體動物，較佳為人類。 ‘‘整意指用於單離或純化含有該標誌之分子的標 δ己物或標記序列。一種例舉性標誌包括6 X His標誌。 “ 意指一種包含能夠結合 至位於抗原展現細胞（尤其是樹狀細胞）上之受體並接 者藉由受體-介導之攝取而轉送入該抗原展現細胞内的抗體 片段之蛋白質。 片語造療上有效I，’意指嵌合抗原或編碼嵌合抗原 之聚核苷酸量足以引發有效對抗原之B細胞、細胞毒性τ •淋巴細胞（CTL)及/或輔助τ梂巴細胞（Th)反應並阻斷或 15 1364294 治癒或至4、AR 、e . 。 。卩刀遏止或減緩疾病或失調症病徵及/或併發 症。 術言五“、厶庆，， •及，用於本文涵蓋任何於動物（特 ; 類）體内對可藉由嵌合抗原治療之病況所進行的治 療二包括：⑴預防該病況於可能預先暴露至該病況但尚 ^ : 9斷出之個體内發生；（ii)抑制該病況，例如遏止或減 緩/、1展，或（U1)緩解該病況，例如使該病況或其病徵消 退。 ϋ_”用於本文意指起源自宿主以外之其他不同物 種。例如，選殖自小鼠基因組之經重組表現抗體對人類為 異型而對小鼠則否，不論該經重組表現之抗體係於細菌、 昆蟲或小鼠細胞中製得。 c.新穎嵌合抗原 本發明提供用於引發免疫反應之嵌合抗原，其包含免 疫反應功能域及標靶物結合功能域’其中該標靶物結合功 能域包含一段抗體片段。根據本發明，該嵌合抗原（較佳 地）能夠結合至Fc受體及/或結合至巨噬細胞甘露糖受體。 該抗體片段可對宿主為異型或對宿主不為異型。 於本發明較佳具體態樣中，該嵌合抗原能夠誘發體液 及/或細胞免疫反應。細胞免疫反應可包括Thl反應、Th2 反應及/或細胞毒性T淋巴細胞（CTL)反應。於另一本發明 較佳具體態樣中，該嵌合抗原引發一種多重-抗原決定基免 疫反應。多重-抗原決定基免疫反應可包括對該免疫反應功 能域之至少一個抗原決定基之反應及/或對標靶物結合功能 16 1364294 域之至少一個抗原決定基之反應。或者，多重-抗 免疫反應彳限定為對免疫反應功能域之一個以上抗原決二 基之反應。 本發明之嵌合抗原包含兩部分，，即含有抗原性序列（例 如病毒抗原）之免疫反應功能域，及含有一段抗體片段之 ‘靶物結合功能域（圖！）。於—項較佳具體態樣中，免 疫反應功能域可藉由任何習於該項技藝人士已知之方法與 標把物結合功能域鍵聯。用於將免疫反應功能域與標靶物 結合功能域鍵聯之連接物可包括（但不限定於）共價肽類 鍵聯、化學共1¾、亮胺酸拉鍊及生物素/親和素^於一項較 佳具體態樣中，免疫反應功能域與標靶物結合功能域係經 選殖呈-種單-融合蛋白。融合蛋白之共價肽類鍵聯可包 含額外肽序列’例如SRPQGGGS或VRPQGGGS (SEQ m n〇: 1)。於另—項較佳具體態樣巾，係將各種免疫反應功能域 生物素化，而所產·生之標靶物結合功能域具有鏈親和素， 而呈一種有助於製造多樣化嵌合抗原之融合蛋白。或者， 免疫反應功能域與標靶物結合功能域各可經表現呈一種與 壳胺酸拉鍊部分之融合，其會在混合時促使嵌合抗原之該 一部分締合。最後，可將免疫反應功能域與標靶物結合功 能域分別表現，然後使用習於該項技藝人士已知之方法以 化學方式共軛。例舉方法包括使用蛋白質交聯劑，例如亞 胺基辛二酸二甲酯使該二功能域共價接合。 免疫反應功能域主要提供該嵌合抗原之抗原性部分。 免疫反應功能域包含至少—個免疫反應所需之完整抗原性 1364294 &抗原（視需要地）可包含至—個以上免疫反應 力fa域於較佳具體態樣中，免疫反應功能域包含至少一 個感木^ (例如病毒或專性胞内寄生蟲）或癌症抗原之抗 原性部分。争# α 行 也’免疫反應功能域包含至少—個感染性 病毒之抗原性部分。 較佳感染性病毒之實例包括：反轉錄病毒科（例如人 類免疫缺陷病毒如人類免疫缺陷病毒-1 (ΗΠΜ)，亦稱為 ητιλμπ、LAV或htlv iii/lav、或咖出；與其他單 離:例如HIV_LP);小RNA病毒科（例如脊髓灰質炎 :二a S肝炎病毒、腸道病毒、人類柯薩奇病毒、鼻病 :膜：：病毒）；杯狀病毒科(例如引起胃腸炎之種系）； ；! c ™ 狀病毒科Γ例Γ冠ΓΛ病)毒.、腦炎病4、黃熱病毒）；冠 炎病毒、狂犬，5早狀病毒科（例如疱疹性口 狂大病毋·）；線狀病毒科（例如 副黏病毒科（例如副流感病毒、、病毒）； 吸道多核病毒）……必，脲人“麻疹病毒、呼 毒科（例如漢他病主^ = 1例如流感病毒）；本亞病 溟他病毋、本亞病毒、白蛉熱 沙粒病毒科（出血熱病毒）；呼腸病 厂羅病毒）； 環狀病毒與輪狀病毒）；雙節段RNA病/;如呼腸病毒、 毒科(人類B型肝炎病毒(HBV)、，B型肝：：▲肝DNA病 細小病毒科（細小病毒）；乳頭多二毒⑽”))； 病毒、多瘤病毒L腺病毒（大多數^病^科（乳頭瘤 (單崎病毒(HSV)i與2、水殖帶狀病病毒 ^'阳胞病毒 1364294 (CMV)、伊斯坦巴爾病毒、®疹病毒）；痘病毒科（天花 病毒、牛痘病毒、痘病毒）；及虹彩病毒科（例如非洲豬 熱病毒）；以及未經分類之病毒（例如D型肝炎劑、非-A、 非-B肝采劑（第1類=經腸道傳染；第2類二非經腸道傳 染，亦即C型肝炎）；諾瓦克與相關病毒，及星狀病毒）。 於本發明一些具體態樣中，嵌合抗原之免疫反應功能域包 括至少一個一或多種選自 HBV蛋白質、DHBV蛋白質及 HCV蛋白質之蛋白質的抗原性部分。用於本發明之特別較 .佳 HBV蛋白質包括（但不限定於）HBV S1/S2、HBV S 1/S2/S、HBV核心、HBV核心ctm (C-末端經修飾）、HBV e-抗原及HBV聚合酶。用於本發明之特別較佳DHBV蛋白 質包括（但不限定於）DHBV PreS/S、DHBV PreS、DHBV 核心及DHBV聚合酶。用於本發明之特別較佳HCV蛋白 質包括（但不限定於）11(：¥核心（1-191)、：《(：¥核心（1-17 7)、 HCV E1-E2、HCV El、HCV E2、、HCV NS3、HCV NS5A 及NS4A。其他用於本發明之特別較佳病毒劑包括HIV gpl20、HSV鹼性核酸酶及人類乳頭瘤病毒（HPV)殼體蛋白 L1 與 L2、及早期區域蛋白 HPV El、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6 與 HPV E7。 較佳專性胞内寄生蟲之實例包括：四膜蟲屬（例如Γ pyW/ormb )、癔原蟲屬（例如惡性癔原蟲）、隱孢子蟲屬、 裂頭蚴屬（例如S. !oPhii)、賓第鞭毛A屬、弓漿螽屬（例 如非洲弓漿蟲、厂)、利什曼原蟲屬、立克次體屬（普 氏，立克二欠體） '衣原體屬 ' 分技桿菌屬 (ϊ列士σ、结核分枝桿 19 1364294 2 軍團菌屬、李斯特菌屬（例如單核細胞增生李斯特 囷）考克斯氏體g (例如柏氏考克斯氏體）、志賀氏菌 hc/zw屬及巴爾通氏體屬。較佳之癌症抗原包括前 列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、 CA 125、\νΉ、Her-2/neu、致癌胚源性抗原（CEA)、 MAGE-3、MART-卜 gpi〇〇、NY_ess〇]、CA199、TAG72、 15·3、CA 27.9、gpl20、前列腺烷酸磷酸酶（pAp)、熱 休克蛋白、甲胎蛋白（AFP)、端粒酶及ras。 於本發明另一具體態樣中，嵌合蛋白之免疫反應功能· 域包括融合至一或多個抗原性部分之6XHis標誌。 根據本發明，嵌合抗原為一種能夠與存在抗原展現細 胞（尤其是樹狀細胞）之Fc受體及/或CD2〇6結合，並 接著藉由受體-介導之攝取而轉送入該抗原展現細胞内的蛋 白質。根據本發明’抗體片段之存在可增加截合抗原透過 存在抗原展現細胞（尤其是樹狀細胞）上之Fc受體的攝 取。由於此特異性結合及胞吞作用，可將病毒抗原加工並 展現呈外來物。因此，可有效引發對原先已耐受抗原之免 儀 疫反應》標乾物結合功能域包含一段對宿主可為異型或對 宿主並非異型之抗體片段。於本發明一項較佳具體態樣 中，該抗體片段包含鼠類Fc片段。於本發明更佳具體熊 樣中’標革巴物結合功能域包含Fc片段、鉸鏈區、與—部 份CH1區，而嵌合抗原包含一段適於將標靶物結合功能域 鍵聯至免疫反應功能域之連接肽。於一項較佳具體態樣 中’標靶物結合功能域包含免疫球蛋白重鏈片段，且視需 20 1364294 要地，進一步包含一個鉸鏈區。於一項特別較佳具體態樣 中’重鏈片段包含CH1功能域之胺基酸VDKKI (SEQ ID >10:2)及/或部分或倉部之（^2與（：„3功能域。 如上所論述，結合並經由CD206胞吞之抗原可由MHC Ϊ類與Π類一者展現’因而引發細胞及體液免疫反應。於 是，於一項較佳具體態樣中，係將嵌合抗原糖苷化。可將 免疫反應功能域及/或標靶物結合功能域糖芽化。於一項特 別較佳具體態樣中，係藉由高度甘露糖糠苦化作用或藉由 少置甘露糖糖苦化作用（賈維斯’病毒學3 1〇: U (2〇〇3)) 將嵌合抗原甘露糖糖穿化。 D.新穎嵌合抗原之使用方法 本發明包括引發免疫反應之方法，其包含對個體投藥 予包含本發明嵌合抗原之組成物。 為提供抗原之有效展現，本發明已研發出一種包含免 疫反應功能域與標靶物結合功能域之嵌合抗原，其中該標 靶物結合功能域包含一段抗體片段。雖然未受限於本發明 之特別理論’此分子係依據抗體片段會結合至存在抗原展 現細胞上之特異性受體，及病毒抗原經加工並與主要組織 相谷性複合體（MHC) I類及II類複合而展現的事實。此加 工及藉由MHC I類之抗原展現作用可引發經由細胞毒性τ_ '巴細胞執行的增加反應，導致將任何與該免疫反應功能 域之抗原締合的感染劑消除。此外，藉由MHC I類之抗原 展現作用則引發亦有助於將抗原從受感染細胞及/或從循環 清除之體液反應。 义 21 1364294 本發明亦包括用以破壞耐受性之方法’其包含將本發 之瓜S抗原技藥予個體。於藉由使用嵌合抗原展現抗原 以引發細胞及/或體液免疫反應時’該抗原（在慢性感染時 期被當作“自我”處理）經辨識為“外來”。於是，宿主 =免疫系統會呈現CTL反應而消除受到感染之細胞。同 時，在對該嵌合抗原反應中所引發之抗體會與感染劑結合 並將其從循環移除，或阻斷該感染劑與宿主細胞結合。於 疋，本發明係經設計製造一種能於具有慢性感染或不然受 伯主免疫系統耐受之個體中誘導廣泛免疫反應之嵌合抗 原方、、項較佳具體態樣_，嵌合抗原於受感染劑慢（例 如病毒或寄生蟲）性感染或罹患癌症之個體中破壞對某一 抗原之耐叉性。更佳地，該感染劑係於其生命週期的某些 時期會駐留在宿主細胞内。 ^於一項較佳具體態樣中，係由於抗體片段之存在以及 %由存在V入真核（例如昆蟲）細胞表現系統中之糖穿化 作用而使預選未被宿主免疫系統辨識或經耐受之抗原增 加。此類嵌合抗原，由於存在抗體成份及糖苷化作用，會 與存在各種不同類包括樹狀細胞、巨噬細、B細胞及粒細 胞等免疫細胞上之特異性受體結合。 本發明又一方面係提供活化抗原展現細胞之方法，其 包含將该抗原展現細胞與本發明之嵌合抗原接觸。本發明 亦提供增進抗原展現細胞之抗原展現的方法，其包含將該 抗原展現細胞與包含本發明嵌合抗原之組成物接觸。可將 t/ν σ抗原丹彳几原敬現細胞（較佳地樹狀細胞）於活體内或 22 U04294 得自活體地接觸。於 觸於一項較佳具體態樣中，將嵌合抗原與 抗原展現細胞接觸，可活化抗原展現細胞並增進一種以上 抗原決定基之抗原展現。此多重抗原衫基反應可包括免 疫反應功能域一種以卜γ 抗原決疋基之抗原展現及/或標靶物 結合功能域—種以上抗原決定基之抗原展現。 本發明亦提供治療免疫-可治療病況之方法，其包含對 有其需要之個體投藥予治療上有效量的本發㈣合抗原。 於-項較佳具體態樣中，該免疫_可治療病況為感染症（特 別是慢性感染症）< 為癌症。該感染可為病毒感染、寄生 蟲感染或細菌感染。較佳地，該感染將具有可於細胞内發 現4感木剡之h 。更佳地，該免疫_可治療病況為慢性病 毒感染。最佳地，該免疫-可治療病況為慢性B型肝炎病 毒（HBV)感染或為慢性c型肝炎病毒（HCV)感染。對於hbv 之治療’免疫反應功能域較佳地包含選自HBV核心蛋白' HBV S蛋白、HBV S 1蛋白、HBV S2蛋白及其組合等蛋白 質之至少一個抗原性部分。對於HCV之治療，免疫反應 功能域較佳地包含選自HCV核心（1-177)蛋白、HBV E1蛋 白、HBV E2 蛋白、HBV E1-E2 蛋白、HCV NS3A 蛋白、Hcv NS5A蛋白、HCV NS5A蛋白及其組合等蛋白質之至少一 個抗原性部分。 於一項較佳具體態樣中，投藥嵌合抗原可引發較單獨 投藥免疫反應功能域時更大的免疫反應。免疫反應之增加 玎例如（丨）藉由存在個體中之抗原-特異性抗體之量；（ij^藉 由在暴露至載負有嵌合抗原或單獨免疫反應功能域之抗原、 23 1364294 壬現細胞時之反應中由τ細胞所分泌干擾素-γ的量；或（iii) 藉由在暴露至載負有鼓合抗原或單獨免疫反應功能域之抗 原呈現細胞時之反應中抗原特異性CD8+ T細胞的含量而 進行測量。 可藉由將嵌合抗原得自活體地或於活體外展現至樹狀 細胞而評估嵌合抗原產生免疫反應之功效。樹狀細胞將嵌 合抗原加工並呈現予T-淋巴細胞，其可評估T細胞之增殖 及作為T細胞反應標記物之干擾素_γ的產量。尤其，在得 自活體之狀況下’係將原初樹狀細胞從周邊血液單離出。 τ細胞受樹狀細胞之活化作用係藉由測量標記物，例如干 擾素-γ濃度’以已知程序進行評估。參見，例如，貝來恩 等人，C7/«. 1〇1(3):276_283。分泌干擾素 _γ 的 τ 細胞百分比增加50%則預測在活體内有效。於活體内狀況 之個案中，係直接將嵌合抗原以非經腸道方式導入宿主體 内’而可利用之樹狀及其他抗原展現細胞具有與抗原相互 反應並因而將彼等加工之能力。 此外’本發明包括疫苗接種個體對抗感染症之方法， 其包含將本發明之嵌合抗原投藥予個體。該個體可施予預 防性或治療性疫苗接種。較佳地該感染為病毒感染或專性 胞内寄生蟲感染。該分子之雙功能特質有助於將抗原靶定 至抗原展現細胞例如樹狀細胞，使其藉由特異性靶定具有 對抗體之最有效化學劑量抗原的抗原展現細胞，而於慢性 感染疾病療法中成為獨特提案。此可用於研發治癒慢性病 毒感染症例如Β型肝炎、C型肝炎、人類免疫缺陷病毒、 24 1364294 人類乳頭瘤病毒與單純疱疹病毒、專性胞内寄生蟲感染之 治療性疫苗，且亦可應用於諸如癌症及自體免疫失調症之 自身抗原。投藥此等融合蛋白質可自宿主引發廣泛免疫反 應，包括細胞及體液反應。因此，彼等除了可用於預防性 疫苗免疫具有發展呈特定感染症危險之個體外，尚可用作 為用於治療對現存感染呈現免疫耐受性之個體的治療性疫 由 〇 E·嵌合抗原之製造方法 本發明一方面係提供製造嵌合抗原之方法，其包含（a) 提供一種包含編碼嵌合抗原之聚核苷酸的微生物或細胞 系，較佳地為真核細胞，更佳地為非—哺乳動物微生物或細 胞系；及（b)將該微生物或細胞系培養於藉其可表現該傲合 抗原之條件下。較佳地，該微生物或細胞系為酵母、植物 細胞系或昆蟲細胞系。更佳地，該微生物或細胞系為選自 Sf9 ' Sf2 1、果绳S2及High Five™之昆蟲細胞系。 本發明之一項較佳具體態樣使用已建立用於製造所選 抗原與實施本發明所需標靶物結合功能域之融合蛋白質的 重組DNA技術。融合蛋白質構築體係於併入特定限制酵 素切位（其用於將所希望DNA片段併入表現載體中）， 及用於使所希望融合蛋白質於異源性表現系統表現之dna 層次所產生。用於本文，術語“載體”意指能夠攜帶編碼 所希望蛋白質之DNA的質體。較佳用於本發明之質體載 體包括（但不限定於）pFastBac Hta及於DH1〇BacTM大腸 桿菌（Invitrogen)中所產生之相對應重組型“桿粒”。 25 1364294 編碼標靶物結合功能域之基因可經由聚合酶鏈反應 (CR)而自任何製&抗體的細^^例如製造單株抗體之融合 瘤得。為有助於後續之選殖步驟，較佳地將寡核苷酸引 子設計為可添加獨特限制酵素辨識位點 竭之抗原性部分可得自任何含有編碼所：望 &原性部分之基因的細胞或病毒跳或DNA。較佳地， 係使用PCR獲得編碼免疫反應功能域之抗原性部分的 舰’ I PCR引子係經設計可添加獨特限制酵素辨識位點 以助於選殖。然而，可使用任意重組型膽A方法以獲得 編碼免疫反應功能域之抗原性部分的DNa後可使用標 準選殖技術將編碼標乾物結合功能域與免疫反 ^ 聚核苷酸組合於單一構筚物中。4去 ^ 一 早稱㈣中或者，可將分別之功能域 與編碼連接肽（例如亮胺酸拉鍊、親和素或生物素化訊號） 之DNA —起選殖。 較佳地’使用桿狀病毒系統表現本發明之嵌合抗原， 其不僅係因為可製得大量異源性蛋白質，亦因為在受感毕 昆蟲細胞中可進行真核蛋白之轉譯後修飾作用（例如碌酸 化及糖替化作用）。因為在昆蟲細胞直接進行選殖可能較 困難’故較佳地於細菌系統產生編碼嵌合抗原之聚核穿 酸，並將最終構築體轉移至桿狀病毒/昆蟲系統中。轉移系 統（例如BaC-T〇-Bac™系統（Invitr〇gen))為習於該項技蓺 人士已知。Bac-T〇-Bac™系統利用以細菌轉位子進行 之位點-特異性轉位作用，將所興趣基因轉移至大腸桿菌丁 昆蟲細胞穿梭載體（桿粒）中。將所成之重組型桿粒轉4 26 1364294 染入昆蟲細胞中以產生表現重組蛋白質之桿狀病毒。 如：9了二產:旱狀病毒’遂將桿粒轉感染入昆蟲細胞，例 如Sf9s細胞中。接著於轉❹❹ 以擴展才干狀病毒族群之時間。收集含有桿狀病毒之培養基 並儲放於4°C黑暗中。可藉由 物η 田使用特異於所希望DNA插入 物之引子將病毒培養物進行 ,^ 丁 FLR檢查桿狀病毒DNA之萝 造而確認達成轉感染。異源性蛋 製 由任何該項技藝已知之方法，例如似聚現可糟 泳術（SDS-PAGE)或西方轉潰法確認。Λ㈣㈣膝電 使用具有標準化感染複數(Μ〇ι)之 細胞。細胞係以大約3 χ ln5加 干饵U木昆虫虫 胞/毫升之密度接種並於 迎晃培育於懸浮培養物中 約.2-3X1〇6個細胞/毫 ^度到達 化量ϋ纟各別重組桿狀病毒之標準 各別蛋白表現而標準化。以 糸對 質之純化。未使用之部八。…田胞並用於重組蛋白 放於-7〇t：下。 中並儲 較佳地嵌合抗原係於變性條件下純化得。將人 才几原之細胞於變性緩衝液（例如含有心胍_肥二口 作用。將胞、、容產物齡 式’例如超音波震盈增進溶解 ㈣將上·”去除未破裂之細胞及細皰碎片。 Λ、、後將上〉月液加樣至預杏…—& 預先以溶解緩衝液平衡之Νί·ΝΤΛ Ρ一，㈣珠粒管柱上。於加樣後，將管柱以； 緩衝之變性溶液（較佳地含有όΜ請】於大約心 27 1364294

沖洗。此時可將變性劑換成例如存在經緩衝溶液中之8 Μ 尿素。該溶解、加樣及沖洗緩衝液較佳地含有低濃度（例 如則之口米。坐。待緩衝液交換後，應將管柱以緩衝 冲洗直到OD280值降到（例如）< 〇]。已結合蛋白質可以 ^ 8 Μ尿素及250 mM咪。坐，pH 8之緩衝液（溶析緩衝 液）進行溶析。匯集含有該蛋白質之流份並於4。〇下對多 次更換之低（例如100 mM)鹽類變性溶析緩衝液（較= 地含有8 Μ尿素）進行溶析。然後將經溶析之蛋白質加樣 於離子交換管柱，例如DEAE (二乙胺基乙基）上。於二 項較佳具體態樣中，係於加樣至離子交換管柱上之前先將 二硫蘇糖醇（DTT)或其他還原劑加入該蛋白質中。於是’ 收集DEAE流通物並以逐步方式對含有遞減濃度變性：之 =衝溶液進行透析。於-項例舉性方法中，係接著將蛋白 質對已緩衝之4 Μ尿素進行透析達至少12小時，然後對 已緩衝之2 Μ尿素進行透析達至少12小時，然後對已緩 衝之1 Μ尿素進行透析達至少12小時，然後對已緩衝之〇 5 Μ尿素進行透析達至少12小時，最後再對不含任何變性 劑之緩衝液進行透析達至少12小時，較佳地隨後再額外 進行兩次對不含任何變性劑新鮮之緩衝液透析達12小時。 可將經純化、再折疊之蛋白質濃縮並使用包括（例如）sds 凝膠電泳術、等電聚焦、或使用對抗所表現蛋白質不同功 能域之抗體的西方轉潰法等標準生化學技術特徵化。 本發明之實施將利用（除非另行指定）習於該項技藝 人士領域所知之分子生物學、微生物學、重組DNA及免 28 1364294 疫學的習知技術。此類技術完整解說於文獻中。參見例如 山姆布克等人，第2版，紐約. 冷泉港出版，1989 ;及奥斯貝爾等人，現今分子生物^ 皇威利國際科學出版社，（@1995,2〇〇4年4月増 叮’補充本6 6 )。 F.新穎聚核苷酸類 本發明另一方面提供編碼嵌合抗原之聚核苷酸，发包 含編碼免疫反應功能域之第一聚核苹酸部份與編碼標乾物 結合功能域之第二聚核伽部份。該第—與第二聚核苦酸 部分可位於相同或不同核苦鏈上。 本發明提供對應或互補於編碼嵌合抗原之基因、 mRNA、及/或編碼序列的聚核㈣，其較佳係呈單離形式， =括編碼嵌合抗原變體蛋白之聚核苷酸；互補性或具有愈 ==合抗原之基因或其咖A序列或其部分達至少卿 ^的DNA、RNA、DNA/RNA雜交體及相關分子、聚 二：或养核苦酸，及與編喝嵌合抗原之基因、领s或 類Γ5抗原'編媽聚核每酸雜交的聚核芽酸類或寡核苦酸 此外，本發明包括於本 ― 基因的類似物。類似物^ 碼敗合抗原之 能力，且（例如）仍保有引發免疫反應 …所描述者二：34、36、38、40、42，、 且最… ”有至y 8()%同源性，更佳地為90%， --匈95%之突變體。代表性地’此等類似物之差異 29 1364294 僅在1至15個密碼子改變。實例包括具有來自病毒抗原 或4几體片段天然胺基酸序列之次要胺基酸變異形式，尤其 是保守性置換。保守性置換為發生於彼等側鏈彼此相關之 胺基酸家族中者。由基因編碼之胺基酸一般可分成四家 族：（1)酸性=天冬胺酸、谷胺酸；鹼性=賴胺酸、精胺 酸、組胺酸；（3)非-極性=丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異 亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及（4)未 帶電荷極性=甘胺酸 '天冬醯胺、榖胺醯胺、半胱胺酸、 絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有 時共同被分類為芳香族胺基酸。例如，合理地預期亮胺酸 以異亮胺酸或纈胺酸、天冬胺酸以谷胺酸、蘇胺酸以絲胺 酸之獨立置換，或胺基酸以構造上相關之胺基酸的類似保 守性置換不會對生物活性產生主要影響。具有與⑴

Nos:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47 及 49 所描述多肽中任一者實質上相同之胺基酸序列但擁有不實 負上影響s玄後合抗原引發免疫反應之能力次要胺基酸取代 的多肽分子係包含於具有分別於SEQ ID Nos:27、29、3 1、 33、35、37、39、41、43、45、47 及 49 中所列胺基酸序 列之敌合抗原的定義内。衍生物包括與其他嵌合抗原分子 之聚集共輛物’及與非相關化學部分之共價共軛物。共價 衍生物係藉由將官能性以該項技藝已知之方式鍵聯至發現 於嵌合抗原胺基酸鏈中或位於Ν·或c·端殘基之基團上。 胺基酸縮寫列示於表1中。 30 1364294

表1 :胺基酸縮寫 丙胺酸 '~ΑΪΓ~ A 精胺酸 Arg R 天冬醢胺 N 天冬胺 Asp D 半胱胺酸 Cys C 谷胺酸 Glu E 榖胺醯胺 ~~GhT~ Q 甘胺酸 G 組胺酸 His H 異亮胺酸 '~~ηί I 党胺酸 Leu L 賴胺酸 Lys κ 甲硫胺酸 Met M 苯丙胺酸 Phe 「F 脯胺酸 P 絲胺酸 S er S 蘇胺酸 I'hr T 色胺酸 Trp w 酪胺酸 i'yr Y 纈胺酸 Val V 保守性胺基酸取代可於不會改變該蛋白質構型或功能 之蛋白質中進行。本發明蛋白質可包含1至15保守性取 代。此類改變包括將任何異亮胺酸⑴、缔胺酸（V)及亮胺 酸（L)取代以任意其他此等厭水性胺基酸；天冬胺酸（〇)取 代以谷胺酸（E)及反之取代；榖胺醢胺（Q)取代以天冬醯胺（N) 及反之取代；以及絲胺酸（S)取代以蘇胺酸及反之取代。 其他取代亦可認為是保守性，端視特定胺基酸所處環境及 其在該蛋白質之三維結構中所扮演的角色而定。例如，甘 胺酸（G)與丙胺酸（Α)通常可相互交換5誠如丙胺酸（Α)可與 31 1364294

纈胺酸（v)互換者。曱硫胺酸（M)(相對上較厭水）通常可 舁冗胺S夂及異売胺酸相互交換，而有時則與纈胺酸互換。 賴胺酸（K)及精胺酸⑻通常可於其中胺基酸殘基之顯著特 質為其所帶電荷且此二胺基酸殘基之PKS差異不顯著㈣ 2上相互交換。又其他改變可在特殊環境中被認為係“保 ( >見例如生物化學第4版，Lubert 編著（W Η.福利曼公司），第18_23頁；亨尼可夫與亨尼可夫 勤ν 如⑽89:109 W (1992);賴等人，化σ/c/_ 270(20):1 1882-6 (1995))。 本毛明亦提供（較佳地於嚴苛條件下）與編碼嵌合抗 原之聚核苷酸（特別係以seq m Nos:26、28、3〇、32、34、 36、38、40、42、44、46及44所描述者）雜交之聚核芽 酸。雜交反應之嚴苛性可容易地由習於該項技藝人士決 定’且其一般視探針長度、漂洗溫度及鹽類濃度而做實驗 性調整。通常較長探針需要較高溫度以進行適當黏合，而 較短探針則需要較低溫度。雜交作用一般取決於經變性核 酸序列在互補股存在低於祈炫點之環境中時而與其黏合的 能力。探針與可雜交序列間之所希望同源程度越高，可使 ::相對溫度亦越高 '结果，較高相對溫度將傾向使反應 =更嚴苛’而較低溫度則使之較不嚴苛。關於雜交反應 厫：性之進一步詳述及其他例舉說明，請參見奥斯貝爾等 人（如前述）S 2.9.^0.8頁及4 9 1-4 9 13頁。 嚴苛條件’’ < “高度嚴苛條件”於本文所定義者為 、但非喂定於）該等⑴使周低離子強度及高溫進行漂洗 32 1364294

者’例如0.015 Μ氣化鈉/0.0015 Μ檸檬酸鈉/Ο·1%十二烷 基硫酸納於50。(：下；（2)於雜交作用時使用變性劑如甲醯 胺者’例如.50% (ν/ν)甲醯胺具有〇. 1 %牛血清白蛋白/0.10/〇 Fico 11/0·%聚乙烯基砸洛。定酮/5〇 mM鱗酸鈉緩衝液，pH 6.5，含75 0 mM氣化鈉、75 mM檸檬酸鈉於42°C下；或（3) 使用 50%甲醯胺、5 xssc ( 〇.75 μ NaCM、0.075 Μ 檸檬酸 鈉）、50 mM 磷酸鈉（ΡΗ 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 XDenhardt，s 溶液、經超音波震碎之鮭魚精子DNA (50 pg/ml)、0.1% SDS 及1 〇%葡聚糖硫酸鹽於42°C下，並於42°C下於0.2 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉）中及於5〇0/。甲醯胺於55〇c下漂洗， 隨後以含有EDTA之0.1 XSSC於55°C下進行高度-嚴苛性 你洗。十度嚴苛條件”經描述於（但不限定於）山姆布 克等人（如前述）中且包括使用較上述之條件不嚴苛的漂 洗溶液與雜交條件（例如溫度、離子強度及％ SDS)。一 項中度嚴苛條件實例為於37t:下於包含：2〇%曱醯胺、5χ SSC ( 150 M Naa、15 mM檸檬酸三鈉鹽）、5.0 磷酸 納（PH 7.6)、5xDenhardt，s溶》夜、1〇%葡聚糖硫酸鹽及⑽ mg/mL經變性剪斷之鞋魚精子舰之溶液中培育過夜， 隨後將濾'器於！XSSC中於37_5代下漂洗。f於該項技藝 人士將瞭解如何調整為適應諸如探針長度等類因素所需之 溫度、離子強度等。 編碼嵌合抗原之聚核|酸實例包括··編碼具有選自 中任一酸序列之提合抗原的聚核普酸，或具有選自 33 1364294 SEQ ID Nos:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46及48中任一者之嵌合抗原榨苷酸序列，其中τ視需要 可為U ;例如，嵌合抗原之具體態樣包含（不限定於）： (a) 包含或由如SEQ ID Nos : SEQ ID No: 26之核苷酸 1 至 1326、SEQ ID No: 28 之核苷酸 1 至 2004、SEQ ID No: 30之核苷酸1至1350、SEQ ID No: 32之核苷酸1至1293、 SEQ ID No: 34 之核苷酸 1 至 1794、SEQ ID No: 36 之核苦 酸 1 至 158 卜 SEQ ID No: 38 之核每酸 1 至 1389、SEQ ID No: 40之核苷酸1至1347、SEQ ID No: 42之核苷酸1至2157、 SEQ ID No: 44 之核苷酸 1 至 1395、SEQ ID No: 46 之核普 酸1至1905或SEQ ID No: 48之核苷酸1至2484所描述 之序列所組成的聚核苷酸，其中T亦可為U ; (b) 其序列對由 SEQ ID Nos:26、28、30、32、34、36、 38、40、42、44、46或48所描述者為至少80%同源性之 聚核苷酸；

(c) 編碼其序列係由包含於命；g為pFastBacHTa HBV S1/S2-TBD、pFastBacHTa HBV 核心-TBD、pFastBacHTa HCV 核心（1-177)-TBD、pFastBacHTa HCV NS5A-TBD 及 pFastBacHTa HCV E2-TBD (寄存於力口拿大官方國際寄存機 構’寄存編號分別為 080504-03、080504-04、080504-05 ' 〇8〇5〇4-02及080504-01 )之任一種質體中的DNA所編碼 之嵌合抗原的聚核苦酸。 (d) 編碼其序列為SEQ ID No: 27之胺基酸1至442、SEQ ID No: 29之胺基酸1至608、SEQ ID No: 31之胺基酸1 1364294 至 450、SEQ ID No: 33 之胺基酸 1 至 431、SEQ ID No: 35 之胺基酸1至598、SEQ ID No: 37之胺基酸1至527、SEQ ID No: 39之胺基酸1至463、SEQ ID No: 41之胺基酸1 至 449、SEQ ID No: 43 之胺基酸 1 至 719、SEQ ID No: 45 之胺基酸1至465、SEQ ID No: 47之胺基酸1至635或SEQ ID No: 49之胺基酸1至828之嵌合抗原的聚核苷酸； (e)編碼其對由SEQ ID No: 27之胺基酸1至442、SEQ ID No: 29之胺基酸1至668、Seq id No: 31之胺基酸1 至 450、SEQ ID No: 33 之胺基酸 1 至 431、SEQ ID No: 35 之胺基酸1至598、SEQ ID No: 37之胺基酸1至527、SEQ ID No: 39之胺基酸1至463、SEQ ID No: 41之胺基酸1

至 449、SEQ ID No: 43 之胺基酸 1 至 719、SEQ ID No: 45 之胺基酸1至465、SEQ ID No:47之胺基酸1至635或SEQ ID No: 49之胺基酸！至828所描述完整胺基酸序列具至少 9〇%同一性之嵌合抗原-相關蛋白質的聚核苷酸； (0與（a)-(d)任一種聚核苦酸完全互補之聚核苦酸； (g)於嚴苛條件下選擇性地與（a)·⑺之聚核苷酸雜交的 聚核^酸。 本發明亦提供含有嵌合抗原聚核苷酸、其類似物或同 源物之重組DNA或RNA分子，其包括（但不限定於）噬 菌體、質體、噬菌粒、黏粒、YACs (酵母人造染色體）、 BACs (細菌人造染色體）以及該項技藝已熟知之各種病毒 與非-病毒載體、與經此類重組DNA或RNA分子轉形或= 感染之細胞。罔於製造此類分子之方法為已知（參見 > … 35 1364294 如，山姆布克等人，1989，如前述）。 本發明進一步提供存在於適宜原核或真核宿主細胞 内’而包含其含有嵌合抗原聚核苷酸、其類似物或同源物 之重組DNA分子的宿主-載體系統。適宜宿主細胞包括酵 母細胞、植物細胞或動物細胞，例如哺乳動物細胞或昆蟲 細胞（例如可以桿狀病毒感染之細胞如S f 9、S f 21、果绳S 2 及High Five™之細胞）。適宜哺.乳動物細胞包括各種前列 腺癌細胞系如DU145與TsuPrl、其他可轉感染或可轉導 之前列腺癌細胞系、原代培養細胞（prEC)以及許多慣常用 於表現重組蛋白質之哺乳動物細胞（例如COS、CHO、293、 293T細胞）。更特別地，可.使用其包含嵌合抗原之編碼序 列或其片段、類似物或同源物之聚核苷酸，利用任意慣常 用於且已熟知於該項技藝中之宿主-載體系統以產生其嵌合 抗原。 廣泛適用於表現其嵌合抗原之宿主載體系統可見於 (例如）山姆布克等人，1989 (如前述）；奥斯貝爾（如 刖述），第 1.0.1-1.16· 16、9.01-9.17.3 及 13.4.1-13.6.5)。 用於昆蟲細胞表現之較佳載體包括（但不限定於）

Hta (Invitrogen)。使用此類表現載體，可將嵌合抗原表現 於數種昆蟲細胞系，包括例如Sf9、Sf2i、果蠅s2及出幼⑽ 中。另供選擇地’車交佳之味名μ么M —丨i .. 心醇母糸統包括釀酒酵母、裂殖酵 母、巴斯德畢赤酵母及八月裘I胁 月畢赤酵母。本發明之宿主-載體 系統可用於製造嵌合抗原。 嵌合抗原或其類似物吱司肛& ^ 4鬥鄉《柳q碏由經編碼嵌合抗原 36 ㈣轉感染的細胞製得。例如，可將Sf9，細胞以編碼 =原或其類似物或同源物之表現載體麵，使該欲 :^於Sf9細胞中表現，並使用標準純化方法將該嵌合 早離出。亦可使用各種其他於該項技藝已熟知之表現 ㈣°編心符合讀框方式接合至嵌合抗原編碼序列之引 導狀的表現構築體可用於產生嵌合抗原之分泌形式。 本文所°w述者’遺傳密碼之豐餘性可使嵌合抗原基 列產生變異。尤其，該項技藝已知特定宿主物種常具 特別密碼子偏好，而因此可使所揭示之序列如較佳適應 於所希望宿主。例如，較佳之類似物密碼子序列代表性地 、有稀有在瑪+(亦即，在所希望宿主之已知序列中具有· 夕於、、勺20%之使用頻率）取代以較高頻率密碼子。藉由使 ^可於諸如於世界寬頻網路URL www.kazusa.or.jp/c〇d〇n =internet網際網路上取得之密碼子使用表計算出特定 宿主物種的密碼子偏好。 /、他序列修飾已知可增強於細胞宿主令之蛋白質表 見此等包括消除序列編碼偽造聚胸苷酸化訊號、外顯子/ 内3子剪接位點訊號、類轉位子重複段及/或其他此類對基 因表現有害之已特徵化序列。序列之GC纟量經調整為二 合所給定細胞宿主的平均程《，其藉由參照已表現於該宿 主細胞之已知基因而計算得。若可能，對序列進行修改以 避免產生所推測之髮夾次級mRNA結構◊其他可用之修飾 包括於開放讀框之起始端添加轉譯起始連續序列，如柯薩 凡；Afo/· Ce// 5/0/. ; 9:5073-5080 (1989)中所述。習於該 37 1364294

項技藝人士應瞭解真核細胞核糖體係排他地於5 ’近側AUG 密碼子處開始進行轉錄作用之一般規則僅在極少條件下不 適用（參見’例如，柯薩克5W t/M 92(7).2662-2666 (1995)及柯薩克 Nucl Acids Res 15(20):8125-8148 (1987))。 G.本發明之醫藥組成物 本發明一方面係關於一種醫藥組成物，其包含醫藥上 可接党之賦形劑及包含免疫反應功能域及標靶物結合功能 域之肷合抗原’其中該標靶物結合功能域包含一段抗體片 &。於治療應用上，可將該醫藥組成物以足夠引發對抗原 之有效B細胞、細胞毒性T淋巴細胞（CTL)及/或輔助τ淋 巴細胞（Th)反應並阻斷或治癒或至少部分遏止或減緩病徵 及/或併發症或疾病或失調症之量投藥予個體。對於此用途 之有效量將取決於（例如）戶斤投予之特別組成物、投藥方 式、欲受治療疾病之階段及嚴重性、個體之體重與一般健 康狀況及處方醫師之判斷。 用於最初治療性免疫接種（施予嵌合抗原）之劑量一 般係呈其中含下限值為約卜5、50、5〇〇或woo ng而上 ^ ^ 1〇，_、20,000、30,0〇〇 或 5 0,000 之單位劑 犯用於人類之劑量值代表性地範圍介於約5G0 ng至 約50,〇〇〇邮备八匕/ 日3 “個體。可視個體之反應及病況而依 原、之二二予約U Μ至約5〇，°〜_咖抗 病伐—1=達數週至數個θ °應持續投藥直到至少臨床 室試驗指出該病況已獲預防、遏止、減緩或消 1364294 陈亚於其後持績—段時間。投藥劑量、途徑及投藥規劃係 根據該項技藝之方法加以調整。 嵌合抗原之人類單位劑量形式代表性地包括於其包含 可接受載it (於-項具體態樣係水性載體），並已習於該 項技《人士已知可用於將此等多肽投藥與人類之體積/含量 進行投藥的人類單位劑量中（參見，例如雷明賴 干及應』’弟2G版’ ^吉奈羅’編著’里賓柯特威廉斯& 威爾金斯，巴的摩，Md，2〇〇〇)。誠如習於該項技藝人 士所哮解’各種因素可能影響特別個案中之理想劑量。此 等因素包例如）嵌合抗原之半衰期、嵌合抗原之結合 親和性、組成物夕Aβ σ 免性、所希望之穩定態濃度、投藥途 技、治療頻數及其他與本 、 影響，特定個體之二:…組合使用之藥劑的 -二2=中威:二發明組成物用於嚴“病 又威脅或可此生命-受威脅之狀況。於 此類個”，由於存在本發明較佳組成 相 :上較不具毒性特質，治療醫師可能認為可希望投率對 等所指定劑量而+在廢所， ~I望ί又樂對此 σ係戶、貝上過量的此等嵌合抗原。 化，二?：嵌合抗原存在醫藥調合物中之量可廣泛地變 化亦即為少於約0.1 % (诵堂蛊+ Ε , 至5〇0/式审夕 （通吊為或至少約2%)至多達20% 。或更夕（重量百分比）， 箄舻播新，a 見主要依流體體積、黏度 專根據料之特定投藥形式進行選擇。 又 醫藥組成物可經由該項技蓺 經腸道、黏膜内、血管内、，二t任何途徑’例如非 脈〇、肌肉内、穿皮、真皮 39 1364294 内、舌下、菖内 Λ 或腹膜内進行遞送。二:服、經直腸、經陰道、經肺部 途徑，例如舌下或穿朴華，西樂組成物係經由非經腸道 較― 4芽皮叙樂方式遞送。 醫"藥組成物可藉由蔣 藥途徑之適當载劑混合而製備得==適用於所欲投 物時，通常係將後合抗原與賦形劑混;藥组成 當醫藥上可2 或其他容器形式之載體中。 …麖劑之載劑、載體或介質 乍用為 m ,, , , m 牛固體或液體物質。 因此，組成物可呈片劑、丸劑、粉 糖衣膠囊、酏劑、懸浮液 二 '藥囊' ίϋ栌十六 孔成命液、糖漿、噴霧劑（呈 固體或存於液體介質中）、含有（例如）至多 爾：抗原之軟膏、軟式或硬式明膠勝囊、检劑、滅= 可庄射溶液及滅菌包裝粉末等形式。 -些適宜賦形劑實例包括（但不限定於）葡萄糖 糖 '山梨糖醇 '甘露糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣:、 藻酸鹽、黃耆膠、明膠、矽酸鈣、微晶形纖維素' 聚乙烯 mum μ及甲基纖維素。調合 物可額外包括：潤滑劑例如滑石、硬脂酸鎂與礦務由；1 潤劑；乳化劑與懸浮劑·’防腐劑例如曱基_與丙基羥基-笨 甲酸酿；肖味劑；及香味劑。本發明组成物可經調配土而使 之在投藥予個體後可藉由使用該項技藝已知之程序提供該 欲合抗原之快速、持續或延遲釋放。參見，例如雷明頓 前述）第903-9/·只汉ιυι5-1050頁。 ^04294 為製備諸如片劑之固體組成物，係將嵌合抗原與醫藥 賦形劑混合而形成含有本發明嵌合抗原之均質混合物的固 態預調合物組成物。當稱此等預調合物組成物為均質時， 其意指嵌合抗原係均勾地分散遍佈於組成物中以使該組成 物可容易再均分成同等有效單位劑量形式例如片劑、丸劑 可將本發明之片劑或丸劑塗布或不然包封以提供可认 予長期作用優點的劑量形式。例如，片劑或丸劑可包含内° 部劑量與外部劑量組成 无苓你至包封刖者之覆膜形式。 = 可乂腸衣層分開，其作用為阻抗胃部消化並使内 I 且成I保持原狀通過而進人十二指腸或延 種材料可用於此類腸衣層 有各 酸類及聚合酸類與此類材才料包括許多聚合 素之混合物。 触膠、鯨蠟醇及醋酸纖維 荜之新_組成物以供口服或藉由注射投 ===液、經適當調味之糖漿、水性或油 性b /于液及以诸如玉米油、 用油調和之乳液、以及酏”伽’’、椰子油或花生油等食 以及酏劑與類似醫 在製備供非經腸道投藥之 4 Μ Λ 力調整以減少刺激。可重勿時’必須非常注意張 菌固體。以可重建且物為以乾燥形式包裝之滅 放時較以立即可投藥溶液儲放時J為其在呈乾燥固體儲 裝於具有丁基橡膠封蓋之滅菌容=°通常將乾燦固體包 在最適溼度範圍下。可土 4 ^ ’以確保該固體保持 里逆乾燥故辟4 _ 肢乐错由乾燥充填、噴 41 1364294 霧乾燥或冷;東·乾燥方法形成。此等方法之描述可見於雷明 頓（如如述）第681-685頁及802-803頁。 供非經腸道注射之組成物—般為稀釋液，且其中之所 存在組成以載劑佔較大部分。載劑通常不具有治療活性且 為無毒性，但是其係以適於吸收之形式將嵌合抗原展現予 身體··且織°及il文般將在嵌合抗原係、呈水溶液存在時最快 且完整地發生。然而，载體以水-可溶混液體修飾或以水_ 可溶混液體取代可能影響吸收。較佳地，最有價值用於本 發明組成物之載劑為等張食鹽水。於製備適於注射之組成 物t。#可使用水性載劑、水_可溶混載劑及非水性載劑。 其他物質亦可包括於本發明可注射組成物中以改善或 防衛該組成物之品f。因此，所添加物質可能影響溶解度、 提供個體舒適、增進化學物安定性或保護製劑防止微生物 生長。因A，組成物可包括適當溶解劑、作用為抗氧化劑 之物質及作用為預防微生物生長之防腐劑的物質。此物質 :、對於其功此為適當之量存在，而不會有害地影響組成 ，之功效。適當抗微生物劑之實例包括硫柳汞、苯索氣錢、 苯札氯錄、齡、對-經苯曱酸曱醋及對_經苯甲酸丙酶。適 當抗氧化劑可見於雷明頓（如前述）f 10i5]017頁。 “於特定具體態樣中，係將微脂粒、奈米膠囊、微粒子、 脂質粒子、微泡等類用於本發明嵌合抗原之投藥。尤苴， 本發明組成物可經調配用於遞送包封於脂質粒子、微脂 或奈❹子等。或者’本發明組成物共 視％非共價地結合至此等攜帶載劑之表面上。 42 1364294 經由微脂粒投藥之組成物亦可作用於：υ將嵌合抗原 靶定至特定組織例如淋巴組織，· 2)選擇性地靶定至.抗原展 胞；或3)增加肽類組成物之半衰期。微脂粒包括乳液 現細 泡沐、不可溶性單層、脂質結晶、磷脂質分散液、多層膜 等。於此等製劑中，係將欲遞送之嵌合抗原併入而成為部 份脂質體，單獨或與結合至淋巴細胞普及受體結合之分 子，例如結合i CD45抗房、之單株抗體，或與其他治療性 或致免性組成物組合。因此，可將充填或塗覆以本發明所 希望嵌合抗原之微脂粒導引至淋巴細胞所在位置，然後微 脂粒於該處遞送嵌合抗原。用於根據本發明之微脂粒係由 標準微泡-形成脂質所形成，其一般包括中性及帶負電荷之 鱗脂質與固醇類（例如膽固醇）。脂質之選擇一般係根據 考量（例如）微脂粒粒徑、酸不安定性及微脂粒存在血液 中的穩定性。有各種方法可用於製備微脂粒，士口（例如） 索克等人，如，9:467 5()8 〇_)及 美國專利案 4,235,871、4,5G1，728、4,837，g2^ $別9,⑽ 所述。含有嵌合抗原之微脂粒懸浮液可經靜脈内、局部、 皮膚2，以其根據（尤其是）投藥方式、欲遞送之嵌：抗 原及欲治療疾病之階段而變化的劑量進行投藥。 用於吸入或吹入之組成物包括#在醫藥上可接受 性或有機溶劑或其混合物中之溶液與懸浮液及粉末 或固體組成物可含有適宜的醫藥上可接受之賦形劑，如本 。組成物可藉由口部或鼻部呼吸道投藥 …周。存在醫藥上可接受溶劑中之組成物可藉由使用 43 1364294 N性氣體噴霧化。經喷霧化之溶液可直接從喷霧裝置吸 入’或者喷霧裳置可接附於面罩篷或間歇性正壓呼吸器 上。’谷液、懸浮液或粉末組成物可（較佳地經口部、鼻部）， 攸可將调配物以適當方式遞送的裝置進行投藥。 另種用於本發明方法之調配物係使用穿皮遞送穿 (“罗占 ’’ 、 ^ ^ 曰 J 。此類穿皮貼布可用於提供連續或間斷輪入 又控里之本發明嵌合抗原。用於第送醫藥試劑之穿皮貼布

二建構.、使用微該項技藝所熟知。參見，例如美_專利 5,〇23,252 (以引用方式併人本文）。此類貼布可建構 連、·只性、規律性或依要求遞送醫藥試劑。 此外，可有利地除了嵌合抗原與醫藥上可接受之 劑外，尚包括$ ,丨、 ^ 花主—種抗病毒治療劑或化學治療劑。 毒劑包括（作不ρρ〜狄、 、不限疋於）肽類模擬物（例如安普那 地那為、洛賓那盔士 — 為、不务那為、利托那為、及沙奎那為） =⑽類（例如安普利珍及福米為生）、w定海 (例如阿巴卡盔 J ^

马、阿曰洛為、阿德福為、阿糖胞穿、去 ΗΓ7 ±f N - + /r ^ 一乳腺苷、dipivoxil、依度尿苷、依昔他 entecovir、法 ,、々认 曰洛為、更昔洛為、碘去氧尿啶、肌 pranobex、拉半土 — ° 水夫疋、MADU、喷昔洛為、索利夫定、司 他夫疋、替'^ tS λ(, ° …曲氟尿苷、伐昔洛為、伐更洛為、阿 樨腺牙、扎西#准 —=胸们、唾液酸類似物（例如 胺、金剛貌胺、胺乙m乙醯亮胺酸單乙醇 /醯霉素、阿替為咬、卡拉為林、地拉為 一丁 4醇、efavirenz、構甲酸鈉、干擾 44 1364294 擾素·β、干擾素-γ、凱托沙、溶菌酶、甲吲噻腙、嗎啉胍、 不為拉平、五呋喃糖苦、plec〇naril、鬼臼毒素、利巴為林、 甲金胺、司他霉素、維司托隆、termacamra及塔金剛胺。 其他適當抗菌劑經論述於雷明頓（如前述）第87章：抗· 感染劑’ 1 507-1 561頁，，尤其是1555-1560頁。用於納入 本發明醫藥組成物中之較佳抗病毒治療劑包括阿德福為、 dipivoxil、entecovir、拉米夫定及阿糖腺苷。 於某些具體態樣中，可希望地於本發明醫藥組成物中 包括至少一種活化淋巴細胞或丁_淋巴細胞之組成。脂質 已經確定微能夠於活體内活化CTL之試劑。例如，棕櫚酸 殘基可接附至賴胺酸殘基之卜及心胺基上然後（例如）藉 由一或多個諸如Gly、Gly_Gly、Ser、Ser-Ser等鍵聯殘^ 與致免性肽類鍵聯。然後可將經脂質化肽類直接存在泡囊 或顆粒中、併入微脂粒中、或置於佐齊丨（例如完全佛氏佐 劑）中乳化而進行投藥。於—項較佳具體態樣+，特別有 效之致免性組成物包含棕棚酸接附至賴胺酸殘基之心_ 胺基上’其再藉由鍵聯（例如Ser_Se〇鍵聯至致免性狀類 之胺基末端。 作為另種引發CTL反 白質，例如三棕櫚醯基_ s 絲胺酸（PsCSS)當共價接附至適當肽類時 應之脂質實例，大腸桿菌脂質蛋 甘胺酿基半胱胺醯基絲胺醯基_ 特異性C T L(參見’例如迪瑞斯等人 可用於引發病毒 ^ Μ 342:561 (1989) ) 〇 可將本發明之嵌合抗原 藥予個體以特異地引發 與PsCSS偶合’並將該脂質肽類投 針對標辑抗原之免疫反應。 45 林月、且成物應垓不需要使用佐劑’但仍可使用 —可使用任何佐劑以增加免疫反應，端視於宿主物種 =，且包括但不限定於佛氏佐齊"完全與不完全）無機 政膠例如氫氧化銘、界面活性物質例如溶血㈣脂、清潔 P uronic系夕醇類、聚陰離子肽類、油性乳液、匙 孔戚血藍蛋白、二硝基盼、免疫刺激性聚核苦酸序列、及 可能有用之人類佐劑例如BCG (卡介苗）及小棒桿菌。其 他佐劑亦為該項技藝所熟知。 H.製品 本叙明另一方面係提供其包含其中裝載包含適用於注 射或供注射時重建之欲合抗原之組成物的容器組合與提供 說明如何以非經腸道，例如舌下、肌肉内、穿皮、經鼻或 血：内方式技藥忒組成物之印刷標籤說明書的製品。組成 物將包含於任何不會顯著與該組成物相互作用之適宜容器 中，並且將標註指示其係用於非經腸道使用之適當標藏。 該容器係結合與前述治療方法一致之標記說明書。裝載本 發明組成物之容器可為具有適於進行注射的液體組成物之 容益’其具有適當注射針頭及注射筒以使患者、醫師、護 士或其他醫事人員可遞送嵌合抗原。或者，組成物可為含 有可溶性嵌合抗原之乾燥或濃縮組成物，可以水性或非水 性載劑組合或稀釋以溶解或懸浮該組成物。另供選擇地， 容器可具有呈液體之懸浮液或可為不可溶性鹽類以與可使 不可溶部份懸浮於其中之載劑組合。適當容器係論述於雷 明頓（如前述）第 788-798、805、850-851 及 1005-1014 頁。 46 本發明套組將代表性地包 他包含以商業或使用者m 述之…-或多種其 液、稀經㈤ 者立场為可希望之物質，其包括緩衝 稀釋劑、充填劑、斜 沒衡 插頁的容哭P 1、注射清及具有使用說明書之 八q合态。標籤可貼於交D 〜 定治療或非-治療性岸用上 指示該組成物係用於特 =方向(如上所述者）。内含於該套組之插頁上亦 Gί日不或其他資訊。 【實施方式】 下列非·限制性實施例提供進-步例舉說明本發明。 實施例1 : TBD表現載體之構築 伙單離自製造抗HBV表面抗原（sAg)單株抗體之融合 = C12)的mRNA產生編碼Ch1_欽鍵_Ch2_Ch3區域胺基酸 部分之小鼠IgGl DNA序列。使用ΤΗζ〇1⑧試劑（瓶 錄.扁说1 5596-026 )單離得總體RNA.並藉由RTpCR使 uperscript First-strand Synthesis (Invitrogen 目錄編號 1 1 904-0 1 8 )產生標靶物結合功能域（TBD ;小鼠免疫球蛋 白片段）之cDNA。PCR引子含有位於5，末端之編碼連接 B太-SRPQGGGS - (SEQ ID ΝΟ:1)的連接子序列、位於5,之 獨特Not I切位點及位於3，端之獨特Hin(1 ΠΙ切位點。所

成之 cDNA 含有（5，Not I)-連接子序列_cHl(VDKKI) (SEQ ID NO:2)-鉸键區-CH2-CH3-(3，Hind III)。接著以分別酵素 分解’使用相同限制酵素切位點將片段與pFastBac Hta表 現載體質體（Invitrogen)接合。用於pcr擴增之5,引子為 (有義）5’TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGATCCGTGGAC 47 1364294 AAGAAAATTGTGCCCAGG(SEQIDNO:3)且 3’引子為（反義） 5，ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG (SEQ ID NO:4)，其分別含有Not I與Hind III切位。下述為用於定 向選殖之程序。將所產生之片段以各別限制酵素分解，於 瓊脂糖凝膠上進行純化並選殖入載體質體中。藉由標準定 序方法確定DNA序列及ORF之正確性。 隨後將編碼標靶物結合功能域之DNA選殖入pFastBac HTa供者質體中，使用 Bac-to-BacTM桿狀病毒表現系統 (Invitrogen)表現重組蛋白質。經由於大腸桿菌株DHlOBac 中進行之位點-特異性轉位作用，將所選殖之基因轉移至桿 狀病毒穿梭載體中。該DHlOBac細胞含有穿梭載體，其提 供肯那霉素抗性及編碼轉位酶並給予四環霉素抗性之輔助 質體。將100微升等量勝任DHlOBac細胞置於冰上融解， 將以pFastBac HTa為主之質體加入並將混合物置於冰上30 分鐘。將混合物於42°C下進行熱休克45秒然後置於冰上 冷卻2分鐘。然後將混合物加至900微升LB培養基中並 於3 7°C下培育4小時。將經轉形細胞以LB系列稀釋成10·1 及10_2，並將100微升各稀釋液塗抹於補充以50 pg/ml肯 那霉素、7 pg/ml慶大霉素、10 pg/ml四環霉素、100 pg/ml X-gal及40 pg/ml IPTG之LB璦脂平板培養基上並於37°C 下培育至少36小時。慶大霉素抗性係由pFastBac HTa所 給予，而X-gal及IPTG (異丙基硫-β-D-半乳糖苷）係用 於在白色選殖株（重組質體）與藍色選殖株（非-重組者） 間產生差異。挑取白色選殖株並接種入2毫升補充以5 0 1364294

Mg/m丨月那每素、7叫/ml慶大霉素及10 pg/ml四環霉素之 σ養基中並於37C下伴隨搖晃培育過夜。使用滅菌接 囷％取樣小$的過夜培養物並將樣本晝線培養於補充以5〇 料/ml肯那霉素、7μ§/ηι1慶大霉素、i〇^/m丨四環霉素、 100, gg/ml〇X-gai 及 4。pg/ml IPTG 之 LB 瓊脂平板培養基 ；/ 匸下培育至少3 6小時以確定白色外表型β將重 組桿粒藉由標準_ γ & 程序（山姆布克等人，如前述）單離出， 將腿樣本溶於40微升TE ( lOmMTris-HClpHS，1 mM EDTA ：) tiM於轉染作用。 為生產桿狀病毒，遂將桿粒轉染至Sf9昆蟲細胞中。 將Sf9田l (9 X ι〇5)接種入6_槽細胞培養盤（35mm槽）内 έ 2耄升ESF 921 (表現系統）之各槽中並使其於27。〇下 附者達至少1小時。使用Cellfection®試劑（Invitr〇gen目 錄編號10362-010 )依照Sf9細胞製造廠商所提供之每一 v驟7C成轉感染。待轉感染後，將細胞培育於。匸下 小時。收集含有桿狀病毒之培養基並儲放於4<>c黑暗中。 藉由檢查桿狀病毒DNA產量確定轉感染之效率。將 經單離之桿狀病毒DNA進行PCR以篩選所插入編碼TBD 之基因。所使用之引子為（有義）5，tattccggattattcat ACCG (SEQ id NO:5)及 3,（反義）5，CTCTACAAATGTGGtat GGC (SEQ ID NO:6)。將經擴增產物於瓊脂糖凝膠（〇 8%)上 進行電泳。異源性蛋白於細胞中之表現係藉由SDS聚丙烯 酿胺凝膠電泳術（SDS-PAGE)及使用6XHis標誌單株抗體 、lionetech )作為探針之西方轉潰法加以確認。 49 1364294 一旦確定製得桿狀病毒及蛋白質表現後，將病毒產量 擴增以製造攜帶編碼標靶物結合功能域之基因的桿狀病毒 濃縮儲備液。該項技藝中之標準程序係將桿狀病毒擴增至 少兩次’而於本文所述所有程序皆墨守此標準慣例。待進 行弟一次擴增後，使用根據套組製造商（Invitrogen )所述 程序進行之溶菌斑分析定量所產生桿狀病毒的濃度。如所 述確立用於感染High Five細胞最適當之病毒濃度及製造 所希望蛋白質之最適時間點。一般，對於TBD之表現係使 用MOI為1且時間為48小時。 實施例2 :嵌合抗原表現載體之構築 利用使用列示於表2之5,有義與3’反義引子進行之 PCR方法從模板產生編碼所希望病毒抗原之DNA。所成之 經擴增片段的5 ’端含有獨特限制酶切位“5，enzy”，而3，端 含有獨特限制酶切位“3 ’ enzy”，各分別用於接合作用。 表2 :嵌合抗原表現載體之構築

病毒彳/L原 有義引子 反義引子 模板 55 enzy 3 ’ enzy HBV S1/S2 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 pRSETBHBV S1/S2 Bam HI Not I HBV S1/S2/S SEQ ID NO :9 SEQ ID NO: 10 pAlt HBV 991 Ncol Not I HBV核心 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 pAlt HBV 991 Nco I Not I DHBV PreS/S SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 13 pFastBac Hta PreS/S Eco RI Not I DHBV PreS SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 14 pFastBac HTa PreS/S Eco RI Not I DHBV核心 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 pRSETBDHBV核心 Nco I Not I HCV核心 (1-191) SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 pCV-H77c Eco RI Spe I HCV核心 (1-177) SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 19 pCV-H77c Eco RI Spe I HCV NS5A SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 pCV-H77c Eco RI Spe I HCV El SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 pCV-H77c EcoRI Spe I HCVE2 SEQ ID NO： 24 SEQ ID NO： 25 pCV-H77c Eco RI Spe I HCV E1/E2 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 25 pCV-H77c Eco RI Spe I 50 1364294 將經擴增之DNA以適當之5’及3’限制酵素分解並與 pFastBac HTa表現載體接合而產生單獨病毒抗原之表現質 體。將同一 DNA月段與質體pFastBac HTa-TBD (描述於 實施例1 )接合，隨後以各別酵素分解而產生經融合至標 靶物結合功能域之病毒抗原的表現質體。將所成之質體用 於製造重組桿狀病毒（如實施例1所述），其後續用於表 現嵌合抗原。嵌合抗原之DNA與胺基酸序列經列示於表3。

表3 :嵌合抗原序列 構築體 DNA序列 所表現之蛋白質 HBV S1/S2-TBD SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 HBV S1/S2/S-TBD SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 HBV 核心-TBD SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 DHBV PreS-TBD SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 DHBV PreS/S-TBD SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 DHBV 核心-TBD SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37 HCV 核心（1-191)-TBD SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39 HCV 核心（1-177)-TBD SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41 HCV NS5A-TBD SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43 HCV El-TBD SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 HCV E2-TBD SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 HCV E1/E2-TBD SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49

實施例·3 : TBD '病毒抗原與嵌合抗原之表現及純化 使用具有標準化感染複數（ΜΟΙ)之重組桿粒感染 High Five™昆蟲細胞。對於懸浮培養物，細胞係以大 約3 X 105個細胞/毫升之密度接種，並於27_5t下伴隨 設定1 3 8 rpm之搖晃進行培育直到細胞密度到達約2-3 51 個細胞/毫升。蚨後蔣久 毒力 开…傻财各別標準化量之重組桿狀病 =至細胞中。培育溫度為27 rc且適當感染時間係 跳^蛋白表現而標準化。藉由於4〇C ’ 2,500 rpm下 離心 1 ft八# 用立刀$收集細胞並用於重组蛋白質之純化。未使 刀胞可於液態氮中急速冷凍並儲放於_ 7 〇 下。 將重組蛋白質於變性條件進行純化。將細胞於含有 脈 HC1 存於 1〇〇πιΜΝ&Η2ρ〇4、ι()ιη]ν[ΤΆ、300 πιΜ

0 mM咪峻之緩衝液（溶解緩衝液）中進行溶 解。將懸浮液置於冰上α 5二欠脈衝（每次脈衝長度i 刀鈿力買設定於6〇瓦特）進行超音波震盪，並於室溫 下混合1小時。將胞溶產物於丨0,000 X ^下離心1 〇分 在里以去除未破裂細胞及細胞碎片。將上清液加樣至預 先以溶解緩衝液平衡之Ni-NTA Super Flow (Qiagen)珠 粒管柱上（1 χ 5 cm/100 mL細胞溶解產物）。於加樣 後’將管柱以20管柱體積之6 Μ胍-HC1存於1〇〇 mM

NaH2P〇4 ' 1〇 mM Tris、300 mM NaCl、40 mM 咪唑，pH

8·〇 (沖洗缓衝液1 )沖洗，隨後以20管柱體積之8 M 尿素存於 100 mM NaH2P04、10 mM Tris、300 mM NaCl、 4 0 m M味吐，p H 8 · 0 (沖洗緩衝液2 )沖洗。將已結合 蛋白質以含有 8M 尿素、100 mM NaH2P04、10 mM Tris、 300 mM NaC卜250 mM咪唑，pH 8之緩衝液（溶析緩 衝液）進行溶析。匯集含有該蛋白質之流份並於41：下 封多次更換之透析緩衝液（1 〇 〇 111Μ N a Η 2 P 〇 4、3 0 0 m Γνί 52 1364294

NaC1)進行透析。使用包肖SDS a膠電泳術、等電聚 焦2使用對抗所表現蛋白質不同功能域之抗體的西 方轉清法等標準生化學技術將經純化蛋白質特徵化。 實施例4 :使用嵌合抗原融合蛋白質破壞對“自我，， 白質之耐受性 、為評估對嵌合抗原融合蛋白質之免疫反應，遂將小 鼠以、、‘工純化HBV S1/S2、TBD或si/s2_tbd蛋白質進 行免疫，並定量所產生對抗各別蛋白質之抗體。在以 各別蛋白質激發後估計採收自受免疫小鼠之脾臟τ 胞增殖量。 ' 將15週齡之BALB/c小鼠用於進行該項免疫作用。 將小鼠以皮下注射 S1/S2_TBD ( 415 μ§)、S1/S2 ( 4 15 pg)或TBD ( 4.15 μβ)四次，每次間隔兩週。於開始 免疫前收集血液樣本，接著於每次免疫後一週採血取 樣。從凝集樣本製備血清並用於估算由該宿主所製造 對抗各別所注射抗原之抗體含量。

1.用於偵測抗 HBV S1/S2、TBD 或 S1/S2-TBD 之 ELISA 將96-槽平盤於4°C下塗覆以濃度為1.0 pg/mL之 抗原HBV S1/S2、TBD或S1/S2-TBD過夜。將平盤以 含有2% BSA之PBS漂洗。將經稀釋得自各別動物之 血清以各種不同稀釋度（1:10 - 1:500)加至各槽中並培 育於37°C下1小時。將平盤以含有0.05% Tween 20之 PBS (漂洗缓衝液）進行漂洗。將山羊抗-小鼠igG Fab- 53 1364294 山辣根過氧化酶（HRP) (1:5〇〇〇)稀釋溶汸4 ” 干/合仪加至各槽並於 3 7 C下培育1小時。將平盤以漂洗緩衝液進行漂洗並 使用2_2 ’疊氮-二-(3-乙基苄基噻唑林_6_磺酸酯）(=pL ,

Guildford ’ UK)呈色。使用ELISA平盤讀取儀（分子 裝置，USA)於波長405 nm下測量樣本中所成顏色之 光學密度。該實驗之陰性對照組為得自同—動物之免 疫前血清，其值從所有實驗數值扣除。以HBv Sl/s2_

TBD免疫之小鼠的結果呈現於表4中。該嵌合抗原引 發強的抗嵌合抗原（S1/S2-TBD)之抗體反應。 表4:對S1/S2-TBD之體液反應 所結合抗體之冬| HBV S1/S2-TBD HBV S1/S2 TBD 小鼠 HBV S1/S2-TBD 0.192 0.059 0.048 免疫以 HBV S1/S2 0.073 0.015 0.025 TBD 0.076 0.0 1 7 0.036 在此所呈現之抗體反應具有多價（或多-抗原決定基） 特質。列示於表4之結果顯示由經HBV S1/S2-TBD免疫的 小鼠所產生之抗體可與塗覆於平盤上之嵌合抗原及S 1 /S2 蛋白質標把物結合。因此，抗體產生係為對抗嵌合抗原之 S1/S2組成。同樣，由經HBV S1/S2-TBD免疫的小鼠所產 生之抗體可與標靶物結合功能域結合（表4 )。含有小鼠 來源蛋白質之嵌合抗原可於小鼠體内產生體液免疫反應， 證明嵌合抗原能將“自身”抗原轉變成“外來”。於是， 54 1364294 可能破壞對原先視為“自身 性。 蛋白質處理之蛋 白質的耐受 2· T細胞增殖分析 於第四次免疫接種後-週將動物犧牲，取出脾臟 備單細胞懸浮液。將細胞成三重複以細胞密度為4 X 個 細胞/槽接種於96-槽平盤中。將彼等加樣以各別抗原 S1/S2、TBD 或 S1/S2-TBD)

濃度為〇. 1 pg/mL

及10 Hg/mL。陰性對照組細胞僅接受培養基，而對於丁細 胞增殖之陽性對照組係接受濃度！ 〇_5 〇 pg/mL之植物凝集 素（PHA)。將細胞培養物培育於3<rc下於含7% c〇2之大 氣下培育4天。將各槽細胞施予1〇 mCi之3[}€]_胸腺嘧啶 脈衝並再另培育18小時。使用T〇MTEC MACH 3細胞採 收益（Hamden ’ CT，USA )採集細胞並使用wallac Trilux 1450 Microbeta液體閃爍及發光計數器（WaUac ’ USA ) 定量結合至玻璃纖維濾器上之放射活性。結果列示於表5。 表5 :對HBV S1/S2-TBD之細胞反應 __巧結合抗體之含量 0-1 μβ/mL 1 ug/mL 10 \iglmL HBV S1/S2-TBD 36.7±1 7.0 32.7 士 5.0 21.3±7.0 HBV S1/S2 1〇.7±2.1 26.7±9.6 25.7土10.3 TBD 32.7±19.1 17.0士2.6 35.7 土 27.2 細胞單獨 21.3±12.5 1.0 mg/ml PHA 39.3±18.6 — 55 1364294 當以HBV S1/S2-TBD、S1/S2或TBD激發時觀察到丁 細胞增殖。以嵌合抗原致免可誘導多價τ細胞反應，亦即 對抗同一種蛋白質之不同部位的反應。含有小鼠來源蛋白 貝之肷合k原可於小鼠體内產生細胞免疫反應，證明嵌合 抗原能將“自身，，抗原轉變成“外來”。因此，可能破壞 對原先視為“自身”蛋白質處理之蛋白質的耐受性。 實施例5:抗原展現分析 使用得自活體抗原展現分析測量HBV S1/S2-TBD引發 免疫反應之自b力。藉由疋置抗原-特異性τ細胞增加數量以 _ 及T細胞製造Thl細胞因子INF-γ之能力，分析原初τ細 胞經抗原-載負之抗原展現細胞（APCs)例如樹狀細胞（DCs) 刺激後所產生的有效T細胞反應。 1 ·經由黏附作用選擇單核細胞 藉由添加AIM-V (添加比例為9毫升AIM-V對1毫 升冰凍細胞）將周邊血液單核細胞（PBMC.)融解。然後將細 胞於200 X g下離心5分鐘’將上清液去除，並將細胞再懸 浮於AIM-V/1%配合血清中，並加至1 〇〇 mm培養皿或T-25 4 培養燒瓶中。將PBMCs細胞於37。(：下於潤度化培養箱中 於7% C〇2下培育1小時。為去除非-黏附性細胞遂將細胞 培養物沖刷數次’將上清液丟棄並將細胞以AIM-V培養基 漂洗一次。以細胞刮取器採收單核細胞並於3 00 X g下離心 5分鐘。將細胞丸粒以2 X 106個細胞/mi之濃度再懸浮於 AIM-V/2.5%配合血清中並接種入24-槽培養盤中。將細胞 因子IL-4及GM-CSF (各1000 IU/ml)加入，以驅動單核 細胞分化成為DCs。 56 1364294 2.快或慢抗原展現分析 對於快速抗原展現分析（APA)，係將抗原於單離之4 至24小時内加入未成熟DCs中。再經24小時後，載負有 抗原之未成熟單核細胞藉由與PGA (1 μΜ)、IL_ip (ι〇 ng/ml)及TNF-a (10 ng/mi)培養24小時而被誘導至成熟。 然後將成熟DCs與本身τ細胞共-培養（第一次刺激）。τ 細胞係從與DCs相同之PBMCs藉由使用磁性τ細胞單離 套組（Dynal )根據廠商指示而產生。 然後將T細胞於7天後以载負抗原之成熟DCs於IL-2 (20 IU/ml ) ' IL-7 ( 10 ng/ml )及 IL-15 ( 5 ng/ml )存在 下進行再刺激。經7天培育後，將T細胞以載負抗原之成 熟DCs進行第三次刺激。第三次刺激持續逹6小時，然後 採收T細胞並進行CD3、CD8及INF-γ表現之免疫染色， 及藉由流式細胞計量術分析。 對於慢速APA，係在添加抗原前先令單核細胞於GM-CSF及IL-4存在下分化成未成熟DCs達5至6天。將抗 原加入兩小時後，將未成熟DCs以TNF-α ( 10 ng/ml)及 IFN-a ( 50 IU/ml )熟化。單離後七天，將成熟DCs與本 身T細胞（如上所述）共-培養（第一次刺激）。 然後將T細胞於7天後以載負抗原之成熟DCs於IL-2、IL-7及IL-15存在下進行再刺激。經7天培育後，將T 細胞以載負抗原之成熟DCs進行第三次刺激。第三次刺激 持續達6小時，然後採收T細胞並進行CD3、CD8及INF-γ表現之免疫染色，及藉由流式細胞計量術分析。 57 1364294 3. PBMC抗原展現分析 於此項分析中’最初培養物係由曾與抗原及IL-2培育 之總體PBMCs (亦即淋巴細胞與單核細胞）所組成，而因 為所有類型細胞存在於沈澱物中故假設該系統類似於活體 内免疫反應（麥尼，M.K.等人 J. Exp. Med. 191:1269-1280， 2000 )。將PBMC解凍、漂洗並立即與抗原進行培育。進 行4天培養以令抗原攝取及展現後，將IL_2 ( 20 IU/ml ) 加入並再另靜置8天（亦即至實驗期第12天）。在第二 次刺激前兩天（亦即實驗期第1 〇天）藉由上述之黏附法 將DCs單離，並立刻與GM-CSF、IL-4及抗原培育24小 時。如快速APA所述，在添加pge2、IL-Ιβ及TNF-α後令 未成熟DCs進行分化達24小時。然後將已載負之成熟DCs 於IL-2、IL-7及IL-15存在下加至PBMC培養物中（第二 次刺激’實驗期第1 2天）。第三次刺激發生於實驗期第2 j 天，即於製備得载負抗原之成熟DCs後2天。經6小時培 育後’採收T細胞並進行CD3、CD8及INF-γ表現之免疫 染色’及藉由流式細胞計量術分析。 對於上述之所有抗原展現分析，係將一部份T細胞在 分析結束後再額外培育3-5天，並藉由四聚體分析（參見 f述）檢驗具特異性之T細胞。 4. HBV S1/S2引發對抗HBV S1及S2肽之T細胞反 β 使用PBMC APA產生Τ細胞然後測量其抗原特異性。 因此，將得自徤康HLA-A2個體之PBMCs與含有2.5°/〇配 58 1364294 合血清之AIM-V以5 X 105細胞/毫升培養於96-槽平盤中。 將抗原（即1 〇 Hg/ml S1/S2-TBD )加入並將細胞培養於3 7 艽下4天。然後將濃度20 IU/ml之IL-2加入並將細胞再 另培養8天’期間每2-3天更換培養基（AIM-V/2.5°/❶配合 血清之與20 IU/ml IL-2 )。於12天培養結束時大多數殘 餘之細胞為T細胞’並將此等T細胞以載負抗原之成熟DCs 於 IL-2 ( 20 IU/ml)、IL-7 ( 10 ng/ml)及 IL-15 ( 5 ng/ml) 存在下進行再刺激。 使用下述程序歷時48小時產生用於APA中T細胞之 第一次及第二次刺激的抗原-載負成熟DCs。藉由其於塑膠 組織培養皿上之黏附性而從總體PBMC單離得單核細胞。 將細胞（以 FACS 分析（CD1 lc、CD14+、CD19-、CD3-)測 定:時其約85%為單核細胞）以1 X 1 〇5細胞/槽含有1 〇〇微 升含濃度為1000 IU/ml之細胞因子il-4及GM-CSF的 AIM-V/2.5%配合培養基培養於9.6-槽平盤中，並於4小時 後將諸如S1/S2-TBD等抗原加入。經20小時培育後，將 所產生之未成熟DCs藉由於PGE2 (1 μΜ)、IL-Ιβ (10 ng/ml) 及TNF-α (10 ng/ml)存在下培養24小時而被分化成為成熟 DCs 〇 將T細胞培養7天後進行第二次刺激，期間每1 _2天 更換培養基（AIM V含2.5%配合血清及20 IU/ml IL-2)。 然後將T細胞（培育期第19天）以抗原-載負之成熟DC (如上所述歷經2天程序所產生）於IL_2、IL_7及il-15 (如上述）存在下進行刺激，並於6小時培養後進行inf- 59 1364294 γ分析或經5天培養（期間每1-2天以AIM V/2.5%配合血 清及20 IU/ml IL-2更換培養基）然後使用HBV preS四聚 體分析對HBV preS抗原之T細胞特異性。 四聚體分析係以慣用合成型iTag MHC I類四聚體 (Backman Coulter )根據廠商提案流程而完成。因此將細-胞採收、漂洗、並以〜2Xl05細胞/槽2微升之量轉移至96-槽V-底平盤中。將細胞於20°C下以特異於CD3 (抗-CD3-FITC)及 CD8 (抗-CD8-Cy-Chrome)之 mAb 共同與 2 微 升 PE-共輛之 HLA-A*0201 preSl 四聚體（GMLTPVSTI，SEQ ID NO: 50)或 preS2 四聚體（NIASHISSI，SEQ ID NO: 51 ) 進行標定達30分鐘。然後將細胞漂洗、以2%存在PBS之 低聚甲醛固定並轉移至5毫升FACS試管中。將細胞以每 樣本80,000-100,000項次於FACSCalibur ( BD生物科學公 司）上獲得。使用CellQuest軟體（BD生物科學公司）以 存活（基於FSC/SSC圖譜）CD3 +族群為門檻，並測量標 記以四聚體之CD8+細胞百分比值。當PBMC與濃度10 pg/ml 之 HBV S1/S2-TBD 培養並以載負 HBV S1/S2-TBD 之成熟DC再刺激兩次時，有顯著百分比之細胞量以S 1四 聚體（圖2)及S3四聚體（圖3 )標記為陽性。此和與未 載負抗原之成熟DC培養之T細胞恰巧相反，其四聚體陽 性細胞數量並不明顯。因此，已載負HBV S1/S2-TBD之成 熟DC能夠誘導產生顯著量對HBV S1及HBV S2抗原之抗 原決定基具有待異性的T細胞。 實施例6 :使周嵌合抗原融合蛋白質破壞對DHBV及 60 1364294 DHB V抗原之耐受性 DHBV已用作為研發HBV抗病毒療法之有力動物模 式。先天感染DHBV之北京鴨已被用於研究病#複製機制 以及篩選出抗病毒化合物。本發明使用兩類鴨子模式。第 一類為先天受DHBV感染之鴨子。此類似人類HBV之垂 直傳染。第二種模式為持續感染模式，其中係將新標記之 鴨子感染以DHBV且此等攜帶該感染。此第二種模式類似 人類HB V感染之平行傳染。 1.先天受DHBV感染之鴨子 將先天受DHBV-感染之鴨子（四週齡）分成兩組。收 集血液樣本（1.0毫升）作為免疫前抗體濃度參考值，並 於疫苗接種前每週收集血液樣本。實驗組係於每週同一天 以皮下/主射接受DHBV核心-TBD谈合抗原融合蛋白質 19.95毫克/劑持續5週。於第6週期間，將劑量加倍並於 每四週注射一次直到第26週終止疫苗接種。安慰組接受 等量之緩衝液（20mM磷酸鈉PH 8.0，300mM NaCl)。 將96-平盤於4°C下塗覆以濃度為i.o μ§/ηιι之抗原 (DHBV核心、TBD或DHBV核心-TBD )過夜。將平盤以 含有2% BSA之磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)漂洗。將得自各動 物之已稀釋血清以各種稀釋度（1:10_1:500 )加至各槽並 於下培育1小時。將平盤以含有〇,〇5%Tween2〇之pbs (漂洗）漂洗。將山羊抗-鴨子IgG-HRP (1:5000)稀釋液加 至各槽並於3 7 °C下培育1小時。將平盤以漂洗緩衝液漂洗 i仗用签卞基罐'd坐嚇_6_石黃酸g旨）（κρ乙， 61 1364294

Guildford’ UK)呈色。使用Elisa平盤讀取儀（分子裝置， USA )測量樣本令所成顏色之光學密度。計算相對於得自 同一動物之免疫前血清的抗體力價。 於得自對照組及實驗組先天受DHBV_感染鴨子之血清 中的抗-核心抗體濃度（於第〇、3及6週）列示於表6中。 雖然該等鴨子具有慢性DHBV感染，但是抗體濃度低，此 係由於感染之慢性特質且免疫系統不將該抗原辨識為外來 分子所致。當以DHB V核心-TBD嵌合抗原免疫時，宿主 免疫系統會辨識該病毒抗原而呈現對抗該已呈現於宿主之 核心抗原的體液反應，因此破壞宿主對病毒抗原的耐受 性0 表ό :對DHBV核心-TBD之體液反應 抗體結合（0 D 4 n s) 抗-D Η B V核心 抗- TBD 受疫苗接種 之鴨子 週0 0.058±0.005 0.005±〇.〇〇3 週3 0.1 3 1±0·〇29 0.092±〇.〇59 週6 0· 1 66±0.〇2 1 0.1 47±0.〇38 對照組 週0 0.062±〇·〇1 6 0.003±0.002 週3 0.074±0.01 5 0_0 1 0±0.005 週6 0.087±0.01 2 0.03 5±0.0 1 7 同樣地’鴨子免疫系統將嵌合抗原之TBD組成辨識為 外來抗原並且產生對抗融合蛋白質此部份的免疫反應。將 平盤塗覆以TBD並藉由ELISA評估得自各別鴨子之血清 的抗體含量。此項研究之結果列示於表6 .中。 62 1364294 2.孵化後受DHBV感染之鴨子 ； 在小鴨解化後1天以含有DHBV之鴨子血清感染正常 小鴨。此為DHBV研究領域之標準實施步驟。使用已確立 技術於開始免疫前第四週證實已出現持續性病毒血症。將 受DHBV感染之鴨子分成兩組。從各鴨子收集血液樣本（1 〇 mL)作為免疫前抗體濃度參考值，並於疫苗接種前每週收 集血液樣本。實驗組係於每週同一天以皮下注射接受dhbv 核心-TBD嵌合抗原融合蛋白質19 95毫克/劑持續5週。鲁 於第6週期間，將劑量加倍並於每四週注射一次直到第 週終止疫苗接種。安慰組接受等量之緩衝液（2〇mM磷酸 鈉 pH 8.0，300mM NaCl) 〇 列不於第0' 3及6週所收集鴨子血清中之抗體含量。 於得自對照組·及實驗組孵化後受DHBV_感染鴨子之血清中 的抗-核心抗體濃度列示於表7中。因為dhbv具有已確 疋之持續性感染，故抗體濃度低，此係由於感染之慢性考存籲 質且免疫系統不將該抗原辨識為外來分子所致。當以dhbv 核…TBD嵌合抗原免疫時，宿主免疫系統會辨識該病毒 抗原而呈現對抗該已呈現於宿主之核心抗原的體液反應， 因此破壞伟主對病毒抗原的耐受性。對抗TBD之抗體濃度 亦牦加（表7)。於是有對抗同一嵌合抗原不同部份之多 價（或多重-抗原決定基）免疫反應存在。 63 1364294 表7 :對DHBV核心-TBD之體液反應 抗體結合至： 抗-DHBV核心 抗-TBD 受疫苗接種 之鴨子 週0 0·066±0·01 1 0.003±0.002 週3 0.145±0·014 0.072±0.043 …週6 . 0.170±0.009 0.163±0.052 對照組 週0 0.083±0.016 0.008±0·010 週3 0.112±0.042 0.011土0.007 週6 0.1 38±0.041 0.026±0.013 實施例7 :經化學交聯之HBV sAg-Fc (鼠類） 書 將含 100 pg sAg(US Biologicals;目錄編號 Η 1910-27 )及 100 pg 小鼠多株 IgG Fc 片段（Harlan Sera-Lab股份有限公司，目錄編號PP-19-01)之溶液 分別於4°C下對100 mM HEPES pH 8.7透析過夜。將 蛋白質溶液混合在一起，立刻將二甲基辛二亞醯胺 (DMS ; Pierce目錄編號20700 )加入使最終濃度達1〇 mM，並將混合物於室溫下培育1小時。藉由添加〇. 1 μ Tris HC1 pH 7.8而終止反應。將反應混合物加樣至 _ Sephadex G 75管柱（0.7X12 cm)上，使用磷酸鹽緩衝 食鹽水將流份溶析出。收集0 · 5毫升流份並匯集其中使 用各別抗體進行E LIS A評估時含有s A g / F c莫耳比例為 1 :1之流份。 將匯集得之流份用於抗原展現分析。（柏來恩等人，

Clin. Immunol. 1 01 : 276-283 (2001))。將未成熟樹狀 細胞與GM-CSF/IL4培養四天，與s_A_g-Fc共軛物培育 64 1364294 並於TNFtx及干擾素-α存在下進行熟化。待經三回暴露 至成熟樹狀細胞後’藉由使用流式細胞計量術測量細 胞内干擾素-γ之產量而定量Τ細胞刺激作用。於共耗 物存在下Τ細胞中所製造細胞内干擾素之含量實質 上較僅有sAg或Fc片段單獨存在時高（表8 )。 表8 :對HbsAg-Fc DMS共軛物之T細胞反應 % IFN-γ陽性T細胞 無抗原 •— — ， 0.19 i 4 鼠 Fc (2.5 pg/mL) 0.46 HbsAg (2.5 Kg/mL) 0.04 (2.5 pg/mL)+mAb(2C12、(2.5 pg/mL) 0.12 l^sAg-Fc DMS共軛物（5.0 pg/mL) 0.74 實施例8 :抗原展現分析 抗原展現分析係使用人類PBMC_衍生得樹狀細胞根據 已確立之程序（柏來恩等人’如前述（2〇〇1))完成。關於

丁細胞刺激作用之程序概要係以流程圖形式列示於下。 成熟已 成熟已^ 成熟已 載負之'DCs 載負之DCs .載負之DCs:

染色分析 染色分析 65 1364294 成熱已載負之樹狀細胞之製備 仗得自健康供者之去白細胞術樣本產生單核細胞並藉 由與杬-CD2、CD7、CD16、CD19及CD56抗體培育而耗 f淋巴細胞與粒細胞。接著與經磁珠共輛之抗-小鼠IgG培 月並於磁鐵（Dynal)上分離。經陰性選擇之細胞以使用廣cd 標記系列（CD14+、 CDl lc+ . CD19' ' CD3' ' CD4' ' CD64+ '

CD32 CD86、CD16 )之流式細胞計量術特徵化時，其 中大於95 /〇為純單核細胞。其次，將單核細胞與〗及 GM-CSF ( R&D系統）於AIM v加2.5〇/。配合人類血清中 培育4天而產生未成熟樹狀細胞。再次，將等量細胞以該 廣CD 示§己系列染色以確保細胞的純度與同一性。然後將 細胞於 37。(：下載負以 HBV S1/S2-TBD ( 5.0 pg/ml) 、HBV S1/S2 (2_5 pg/ml)或 TBD (2.5 Mg/ml)達 2_4 小時，並 以TNFa及干擾素-α進行熟化3天。再次使用流式細胞計 里術對樹狀細胞檢查一系列CD標記以確保細胞已進行適

當熟化作用。所得達成熟、已載負之樹狀細胞係用於τ細 胞刺激分析中。 2 · T細胞刺激分析：細胞因子分析 如同樹狀細胞所述，藉由使用磁性T細胞分離套組 (Dynal )根攄製造廠商指示之陰性選擇方法自同_ pMBCs 樣本製得τ細胞。將成熟、已載負之樹狀細胞（Dc_丨）充分 漂洗並加至T細胞中（第0天）。將T細胞與樹狀細胞培 育7天。於第7天’將T細胞以成熟、已載負之樹狀細胞（CD_2) 再刺激。2小時後採收等小量細胞。將該等小量細胞與布 66 1364294 田菲德菌素A ( GolgiPiUgTM，R&D系統）培育18小時然 後如下述進行胞内細胞因子染色分析。

將剩餘細胞再另培育7天。於第14天，將剩餘細胞以 第二批成熟、已載負之樹狀細胞（CD_3)刺激^ 2小時後採 收等小里細胞。將該等小量細胞與布雷菲德菌素A (G〇lgiPlugTM，R&D系統）培育i8小時然後如下述進行 胞内細胞因子染色分析。 關於胞内細胞因子染色分析，係將細胞以抗_CD3 FiTc 及抗-CD8-Cy-Chrome染色3〇分鐘，漂洗、固定、透化處 理、然後置於冰上以抗-干擾素个pE染色3〇分鐘。將細胞 漂洗並經流式細胞計量術（FACScan，BD生物科學公司） 分析。結果列示於表9中。 表 9 : CD3 + /IFN-y+ T細胞 第2 1天 HBV S1/S2-TBD 6*2 ± 4.6 HBV S1/S2 」-ig 土 1.7 TBD 1.6 ± 0.9 無抗原 ± 0.21 待於第 1 4天時取出等 小量後將剩餘T細胞再另培育 三天’然後將上清液用於以ELISA(〇ptEIAEusA套組， BD生物科學公司）測量分泌型干擾素_γ之含量。藉由測量 胞内及分泌型干擾素-γ含眚而啤#下 r 3 1而β平估Τ細胞刺激作用。結果 列示於表10中。嵌合抗屌ςι/ςο 丄 席S1/S2-TBD相較於該分子之免 疫反應功能域或TBD單猶在力η士广认丄μ Λ 干领孖在岭（於相等濃度下）可誘導 67 1364294 製造較尚a：的干擾素-γ。應指出，5 pg劑量之s 1 /S2-TBD 含有大約各2.5 pg該等組成。 表10 :胞内及分泌型干擾素-γ之含量 % IFN-γ陽性τ細胞 分泌型 IFN-γ (pg/ml) HBV S1/S2-TBD 3.5 」 60 HBV S1/S2 2.1 18.9 TBD 2.5 1 1.9 無抗原 0.77 4.4 僅Τ細胞 0.21 1.6 對各種濃度之S1/S2-TBD測試其τ_細胞反應。於相同 濃度下S1/S2-TBD之功效較破傷風毒素.處理大❶濃度低於 5 pg/ml時，嵌合抗原引發一種濃度依賴型干擾素_γ.之製造 及分泌增加。由CD3 +細胞產生之干擾素_γ製造及分泌係隨 者由樹狀細胞之S 1 / S 2 - T B D抗原展現而以濃度依賴形式辦 加’如表11所示。於低濃度下之陽性反應在關於疫苗接 種之劑量需求及疫苗之製造成本方面是有益的。 表1 1 :對嵌合抗原反應之濃度依賴性 % IFN-γ陽性Τ細胞 分泌型IFN-γ HBV S1/S2-TBD (1.25 pg/ml) 1.5 1 8 HBV S1/S2-TBD (2.5 pg/ml) 4.3 40 HBV S1/S2-TBD (5 pg/ml) 3.5 60 HBV S1/S2-TBD (10 pg/ml) 4.3 2〇 破傷風毒素 3.3 ' 3 3 無抗原 0.77 --——~~~_ 4.4 僅T細胞 0.21 HZUT— 68 1364294 實施例9 :嵌合抗原之結合與攝取 1 ·成熟、已栽負之樹狀細胞之製備 伙去白細胞之細胞製劑經 Ficoll/Histopaque (Sigma)處理獲得周邊血液單核細胞（PbmC)。藉由使 用單核細胞單離套組（Dynal )根據製造廠商指示之陰 性選擇方法自PMBC細胞族群分離出單核細胞。該等 單核細胞當以抗體分析及流式細胞計量術（CD 1 4+、 CDllc+、CD19·、CD3_、CD4·、CD64+、CD32+、CD86+、 CD 1 6_ )進行分析時其純度大於95。/(^將單核細胞以含 有L-谷胺酸、鏈霉素硫酸鹽（5〇 μβ/ηιι )及慶大霉素 硫酸鹽（10 pg/ml )與1%供者配合血清（如Berlyn等 人，如前述（2001)所述單離得）之AIm-V ( Invitrogen ) 培養基漂洗兩次。其次，將單核細胞置於含有2.5%供 者配合血清及細胞因子GM-CSF與IL-4之AIM-V培養 基中培養以促使細胞分化成為樹狀細胞（DC)譜系。將 細胞於37°C下於7% C02大氣下培育於12-槽組織培養 盤中。 於第1至第 4天採收自單核細胞衍生得之樹狀細 胞。接著將細胞以含 0.1% (w/v) BSA ( PBSB )之 Dulbecco’s峨酸鹽緩衝食鹽水（Invitrogen)漂洗兩次， 及以含0.1 % B S A ( S i g m a )之漂洗兩次。將自單核細 胞衍生得之樹狀細胞用於4。(：標記或結合分析或3 7 °C 結合/攝取分析中。 2 ·歲合抗原與成熟期樹狀細胞之結合 69 1364294 2 ·嵌合抗原與成熟期樹狀細胞之結合 比較S1/S2-TBD相對於鼠類IgGl及Ig(J2a與成熟 期樹狀細胞之結合程度。於不同得自活體培養天數（從 第0天至第4天）單離出樹狀細胞並以s i/S2_tbD ( 1 〇 或以鼠類IgGl (2C12’為從其製造tbd之母 本 mAb)或 IgG2a ( G1 55- 1 78 ’ 90 μ/πι1)於 4充下處 理1小時。將細胞以存在PBSB中之F(ab，）2山羊抗-小 鼠Alexa-488 ( 10 pg/ml)處理20分鐘。將細胞以pBSB 漂洗兩次並再懸浮於含2%低聚甲酸（pf)之ρβ§β中並 藉由配合以CellQuest獲得與分析軟體（BD)之Bect〇n Dickinson (BD) FACSan擷取。門檻設定於以FSC及SSC 散射圖譜測定時為存活之細胞族群並獲得g 1 〇，〇 〇 〇項 次。為測定陽性細胞百分比值，遂將門檻設定以陰性 對照組處理細胞（以同型對照組標定或單獨以F(ab，）2 山羊抗-小鼠Alexa-488標定之細胞）為基準。依下式 計算具特異性陽性細胞百分比值： _%」黃性細胞測試樣本一 ％陽枓細胞對照組 X 100 1 0 0 - %陽性細胞對照組 測定相對平均螢光強度（MFI)以測試樣本之MFI減 去對照組樣本之MFI值表示》 於培養1至4天後S 1 /S2-TBD相對於鼠類1gG 1 ·及 I g G 2 a兴u l之結合係列示於表i 2。 70 1364294 表1 2 :嵌合抗原或抗體與成熟期樹狀細胞之結入 - - -..........口 〇 w σ %具特異性陽性樹狀細胞 第1天 第2天 第3天 第4天 HBV S1/S2-TBD 91.9 98.5 88.3 IgGl 21.2 19.5 29.3 49Τ~~ IgG2a 28.0 17.4 14.3 ------ 13.5 於第1天之S1/S2-TBD結合較igGl或IgG2a於第4 天之結合顯者因此結論S1 / S 2 - T B D結合明顯較I g g 1成 IgG2a之結合大許多。此等實驗證明S1/S2-TBD與成熟樹 狀細胞之結合效率高。 3 ·嵌合抗原至與成熟期樹狀細胞之攝取 為測定嵌合抗原（例如HBV S1/S2-TBD )相較於IgG1 及IgG2a之攝取程度，遂將細胞與各種濃度之抗原、 (2C12’為從其製造 TBD 之母本 rnAb)或 IgG2a(G155-178) 於含0.1% BSA之AIM V培養基中於37。(：下培育1小時。 將細胞置於PBSB中漂洗兩次並以含2% PF之PBS於4°C 下固定過夜。接著’將細胞置於Pbsb中漂洗兩次並以含 0.1% (w/v)4苷（Sigma)之PBS於2(TC下進行透化40分鐘。 將細胞以PBSB漂洗兩次並與存於含〇」％ (w/v)皂芽 之 PBSB 中的 F(ab’）2 山羊抗-小鼠 Alexa-488 ( 1〇 gg/mi) 於4°C下培育20分鐘。待於pBSB中漂洗兩次後，將細胞 再懸浮於PBSB中。此項分析之變異型包含如上述以嵌合 抗原、IgGl或IgG2a處理細胞1〇分鐘隨後以F(ab，）2山羊 抗-小鼠Alexa-488 ( 10 pg/ml)處理5〇分鐘。接著將細胞 漂洗並再懸浮於含2% PF之PBS中。 71 1364294 藉由配合以CellQuest獲得與分析軟體（BD)之Bect〇n ’

Dickinson (BD) FACSan擷取細胞。門檻設定於以Fsc及 SSC散射圖譜測定時為存活之細胞族群並獲得ε i 〇 〇〇〇項 次。為測定陽性細胞百分比值’遂將門檻設定以陰性對照 組處理細胞（以同型對照組標定或單獨以F(ab，）2山羊抗_ 小鼠Alexa-488標定之細胞）為基準。依下式計算具特異 性陽性細胞百分比值： %陽性細胞測試樣本一％陽性細胞對照組 χ · 100-%陽性細胞對照組 測定相對平均螢光強度（MFI)以測試樣本之MFI減去 對:照組樣本之MFI值表示。 以於樹狀細胞熟化第4天時之濃度函數評估s 1 /S2_ TBD相較於IgGl及IgG2a之攝取。攝取係於37。(：下定量 1小時且結果列示於圖4中。S1/S2-TBD之攝取隨濃度呈 線性增加。IgG 1被攝取量低甚多而IgG2a之攝取量則非常 儀 少。因此，樹狀細胞對嵌合抗原之攝取較免疫球蛋白有效 率 〇 實施例10 : Fc-γ受體及CD2〇6於成熟期DC上之表現 於結合並攝取抗原之抗原展現細胞上有數種受體。此 等受體於成熟期樹狀細胞上之豐度係使用以螢光素標定之 受體-特異性抗體進行評估。使用FACS分析估計總體樹狀 細胞族群中具特笋性受體陽性細胞所佔之百分比。藉由澍 72 1364294 定相對平均螢光強度並以相 受體表現程度（表丨3 )。 對螢光強度之函數呈現而分析 表1 3 &原' M + t 成熟期樹狀細胞上之表現

CD64 ( Fq叉體I )之表現隨培養時間而減少且於第4 天最少。相反地’ CD32 (FcY受體Π)及程度較小之cm6 (⑽受體m)在DC料4天後仍持續表現。於培養第〇 天封，基本上並無CD206 (甘露糖巨噬細胞受體）表現。 但是與IL-4及GM_CSF培養時誘發表現，且於第4天前 CD206表現量非常高。因此於第4天，當抗原載負於抗原 展現系統中時，樹狀細胞表現至少兩種供嵌合抗原結合之 鲁 可能文體.CD23及CD206。此外，彼等具有共_刺激分子 之元全互補性（數據未示）。HLA-DR ( II類）及HLA-ABC (I類）亦隨著培養時間而增加。共刺激分子CD86 (B7.2) 及CD80 (B7.1)表現於整個分析期間。此等結果指示由單 核細胞-衍生之樹狀細胞正分化成為成熟樹狀細胞，且能夠 進行抗原加工並展現予T細胞。 實施例11 : CD32/CD206表現和S1/S2-TBD與成熟期 DCs之結合間的關係 73 1364294 CD32/CD206表現和S1/S2-TBD與成熟期DCs之結合 存在著直接關係。因為已知鼠類IgGl會與人類CD32結合， 故預期含有鼠類IgGl之Fc組成的S1/S2-TBD亦與CD32 結合。而且，由於S1/S2-TBD具有高度甘露糖糖苷化，因 此亦預期會經由CD206受體而與樹狀細胞結合。 圖5之點狀分布圖顯示S1/S2-TBD結合（10 pg/ml ) 與CD32表現以及S1/S2-TBD結合與CD206表現。S1/S2-TBD結合程度與CD32表現度（其相對上為異源性亦即有 廣度的表現）之間存在直接關係。此等結果證明S 1 /S2-TBD 與CD32結合，且CD32表現度越大則嵌合抗原S1/S2-TBD 之結合度亦越大。S1/S2-TBD結合與CD206表現之點狀圖 顯示極大多數表現CD206之細胞亦與S1/S2-TBD結合。 細胞族群中小百分比為CD206陰性且結果對S1/S2-TBD 結合亦呈現陰性。因此CD32及CD206受體二者皆與 S1/S2-TBD之結合相關。 實施例12 : S1/S2-TBD之結合與攝取主要係經由CD32 而CD206參與程度較小 S1/S2-TBD相較於IgGl及IgG2a之攝取係以於DC熟 化第4天時之濃度函數進行評估。攝取係於培養基、甘露 聚糖（2 mg/ml，Sigma )及/或小鼠Fey ( 2 mg/ml，傑克森 免疫研究實驗室）於37°C下定量1小時。甘露聚糖為CD206 結合之競爭抑制劑而因此亦為經由樹狀細胞上CD206之抗 原攝取的抑制劑。Fey為CD32結合之競爭抑制劑而因此亦 為CD32-所介導抗原攝取的抑制劑。結果列示於表14 = 1364294 表14.由Fc或甘露聚糖之嵌合抗原結合抑制作用 相對MFI 甘露 聚糖 小鼠Fey 甘露聚糖 與FcY 培養基 0.5 μβ/πι1 HBV S1/S2-TBD 7.6 0.5 0.6 3 0 2_5 pg/ml HBV S1/S2-TBD 21.5 2.0 3.3 22 6 6 gg/ml HBV S1/S2-TBD 41.6 5.7 5.0 49.2 嵌合抗原之結合隨著其濃度而逐漸增加。細胞與高濃 度小鼠Fq片段培育時會廢止此結合，而甘露聚糖（cd2〇6籲 受體結合之抑制劑）僅具有邊緣效應。因此，cd32可能 為涉及嵌合抗原結合與攝取之主要受體。 實施例13 . HBV S1/S2抗原之糖穿化作用授與免疫原 性 蛋白質糖苷化作用之昆蟲細胞途徑與哺乳動物中之差 異在於’昆蟲細胞中所合成之蛋白質會進行糖普化而導致 高甘露糖含量且在分泌出之蛋白質中缺乏末端唾液酸殘基 (亞特曼等人，16:1〇9 123 (1999))。將 S1/S2 (攸合抗原之抗原組成）表現於大腸桿菌（無糖苷化 作用）及High Five™昆蟲細胞（甘露糖糖苷化作用）中。 1 _糖苷化作用對抗原結合之影響 比較此等抗原與樹狀細胞之結合，如實施例9所述。 成月树狀細胞載負以1 0 Mg/ml於昆蟲細胞或大腸桿菌 中所表現之HBV S1/S2。經㈣化之蛋白質顯示其與樹狀 細脱結合較佳（表} 5 )。 75 1364294 表1 5 :糖苦化作用對HBV S 1/S2結合之影響 %具特異性陽性細胞 相對MIF 昆蟲細胞 69.9 40.3 大腸桿菌 12.2 3.9 2.糖芽化作用對引發免疫反應之影響 HBV S1 /S2之糖苦化作用引起免疫原性與τ細胞反應 增加。比較HBV S1/S2 (表現於大腸桿菌及High FiveTlvSl 籲 蟲細胞中者）當藉由樹狀細胞展現時之T細胞反應。如實 施例8所述（使用2.5 pg/ml HBV S1/S2蛋白質）測量胞 内及分泌型干擾素-γ濃度，而結果列示於表1 6。 表16:糖穿化作用對干擾素-γ含量之影響 胞内IFNy (% IFNy陽性T細胞） 分泌型IFNy (pg/ml) 桿狀病毒HBVS1/S2 2.1 18.9 大腸桿菌HBVS1/S2 0.83 4.3 無抗原 0.77 4.4 僅Τ細胞 0.21 1.6 表現於昆蟲細胞之HBV S 1 /S2相較於表現於大腸桿菌 之未經糖苷化蛋白質，可產生較高量的胞内及分泌型干擾 素。 以上說明書中所述及之公開案及專利案皆以引用方式 納八本文中15本發明所述方法及系統之各種修飾及變異型 76 在不偏離本發明範圍與精神 而且Λ··»· 白〜〇茨項技藝人士 而易知者。雖然本發明已結 係屬顯 逑，仍瘅腠Μ太鉻— 父佳具體態樣加以描 仍應瞭解本發所宣稱之範 特別具體態樣。事實上，所述用”：r地限定於此等 種修鋅（其對習於該項技藝人士 冑明之方法的各 於下述申請專利範圍内。 .·而易知者）欲包含 【圖式簡單說明】 圖1A提供說明本發明歲合抗原呈單體之結構的概圖， L錢合抗原具有兩部份，即免疫反應功能域與標纪物 結合功能域。該圖式亦例舉說明—種具體態樣，其中存在 处個鉸鏈區。ϋ 1B提供說明本發明嵌合抗原呈其正常狀 怎下（組合成雙體）之結構的概圖。此圖式例舉說明一種 特别較佳之具體態樣，纟中嵌合抗原除免疫反應與標靶物 結合功能域以外尚包含6xHis標誌及一段連接肽。 圖2證明T細胞以HBV S1/S2-TBD刺激會產生一種 特異對抗源自HBV S 1蛋白之抗原決定基的細胞毒性丁細 胞（CTL)反應。 圖3證明τ細胞以HBV S1/S2-TBD刺激會產生一種 特異對抗源自HBV S2蛋白之抗原決定基的細胞毒性T細 胞（CTL)反應。 圖4列示比較HBV S1/S2-TBD、IgGl與IgG2由成熟 態樹狀細胞呈濃度函數攝取之情形。 圖5列示HBV S1/S2-TBD結合與樹狀細胞上CD32及 CD206表現間之關連。 77 1364294 序列表 <110〉 <120> <130〉 <150> <151> <160〉 <170〉 <210〉 <211> <212〉 <213> <220〉 <223〉 王 馬 用於破壞宿主對外來抗原之耐受性的嵌合抗原 17506-006TW1 US 60/493,449 2004-08-08 51 Patentln 第 3.2 版 ΛΧ 連接肽 <220〉 <221> <222> <223〉 錯編_特徵 laa Val 或 Ser <400〉 1 Xaa Arg Pro Gin Gly Gly Gly Ser <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213>小家鼠 <400〉 2

Val Asp Lys Lys lie <210〉 3 <211> 55 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400> 3 tgtcattctg cggccgcaag gcggcggatc cgtggacaag aaaattgtgc ccagg

<210〉 4 <212> DNA <213>人工序列 1364294 <220〉 <223>引子序列 <400> 4 acgaatcaag ctttgcagcc caggagagtg ggagag <210〉 <211〉 <212> <213〉

5 21 DNA 人工序列 引子序列 <400> 5 tattccggat tattcatacc g 21 <210〉 <211〉 <212> <213>

6 20 DNA 人工序列

引子序列 <400〉 6 ctctacaaat gtggtatggc 20 <210> <211〉 <212〉 <213>

DNA 人工序列 織 引子序列 <400> 7 ggatctgtac gacgatgacg 20 <210〉 8 <211> 39 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子序列 <400〉 8

agtcattctg cggccgcgag ttcgtcacag ggtccccgg 39 <210〉 <211〉 <212〉 <213> 9 34

DNA 人工序列 <223>引子序列 <400〉 9 gataaggatc ctatgggagg ttggtcatca aaac <210> 10 2 34 1364294 <211> 40 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400> 10 gtcatactgc ggccgcgaaa <210〉 11 <211〉 31 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400〉 '11 tgcgctacca tggacattga <210〉 12 <211〉 42 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400〉 12 tgtcattctg cggccgcgaa <210〉 13 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400〉 13 tgtcattcag cggccgcgaa <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213〉 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400〉 14 tgtcat tctg cggccgcgtt <210〉 15 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220〉 <223> 引子，序列 <400> 15 tgtataccca gagacaaaag cccttataaa g cattgagatt cccgagattg ag ctcttgtaaa aaagagcaga ttcttcttca aggggggagt 40 31 42 40 40

3 1364294 tgcgctacca tggatatcaa tgcttctaga gcc 33 <210> 16 <211> 43 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子序列 <400〉 16 0 tgtcattctg cggccgcgat ttcctaggcg agggagatct atg 43 <210〉 17 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <223>引子序列 <400〉 17 cggaatteat gageaegaat cctaaac

27

<210〉 18 <211> 38 <212〉 DNA <213>人工序列 <223>引子序列 <400〉 18 ggactagtcc ggctgaagcg ggcacagtca ggcaagag 38 <210〉 <211> <212〉 <213>

19 27 DNA 人工序列 <223>引子序列 <400〉 19 ggactagtcc gaagatagag aaagage

27 <210〉 20 <211> 27 <212〉 DNA <213>人工序列 引子序列 <400〉 20 ccggaattct ccggttcctg getaagg <210> 21 <211> 28 1 9-¾ Γ)ΝΔ L·^ Λ. Λ 'Λ Λ <213>人工序列 4 27 1364294 <220〉 <223>引子序列 <400> 21 ggactagtcc gcacacgaca tcttccgt <210> 22 <211〉 <212> <213> 28 DNA 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400〉 22 ccggaattct accaagtgcg caattcct <210〉 23 <211> <212> <213> 32 DNA 人工序列 <220〉 <223> 引子序列 <400〉 23 ggactagtcc ttccgcgtcg acgccggcaa at <210> 24 <211> <212〉 <213> 32 DNA 人工序列 <220> <223> 引子序列 <400〉 24 gcggaattca cccacgtcac cgggggaaat gc <210> 25 <211〉 <212〉 <213> 35 DNA 人工序列 <220> <223> 引子序列 <400> 25 ggactagtcc agccgcctcc gcttgggata tgagt

<210〉 26 <211〉 <212> <213> 1359 DNA 人工 <220> <223> HBV 力口 TBD <220> <222> 0)..(1359) 481364294 <400〉 26 atg teg tac Met Ser Tyr tac cat cac Tyr His His cat cac cat cac His His His at tac gat ate cca aeg His Asp Tyr Asp lie Pro Thr 15 acc gaa aac Thr Glu Asn tea tea aaa Ser Ser Lys 35 ctg tat ttt Leu Tyr Phe 20 cct ege aaa Pro Arg Lys cag see gee Gin Gly Ala 25§fyC ii? m 40 atg gat cct atg aaa aaa tgg Met Asp Pro Met Lys Lys Trp 96 aeg aat Thr Asn ett tet Leu Ser 45 11 ccc aac al Pro Asn 144 cct ctg eg Pro Leu Gly 50 a ttc ttt ccc Phe Phe Pro aac tea aac Asn Ser Asn 65 aat cca Asn Pro gat cat cag Asp His Gin gat tgg gac ttc Asp Trp Asp Phe ttg gac cct gta ttc gga gee Leu Asp Pro val Phe Gly Ala 60 192 cca gca gee aac cag eta gga gtg gg£ Pro Ala Ala Asn Gin Val Gly Val GI5 85 cct cca cac Pro Pro His aac ccc Asn Pro 75 gca ttc Ala Phe 90 age cct Ser Pro ate aag lie Lys gff蹈 jac cac (sp His

IP 240 ggg ttc acc Gly Phe Thr 95 ttg acc cca Leu Thr Pro 115 tea gga agg Ser GI^ Arg cct cag gee Pro Gin Ala 145 gac ccc aga Asp Pro Arg gtg tea aca val Ser Thr cag cct act Gin Pro Thr atg cag tgg Met Gin Trg gtc agg ggt Val Arg Gly 165 att cct cct lie Pro Pro 120 ccc ate tet Pro lie Ser 135 aat tee act Asn Ser Thr cct gee Pro Ala cca cct Pro Pro Ϊ cc ttc la Phe 155 tee gee Ser Ala 125 eta aga Leu Arg 140 cac caa His Gin 110 aat egg cag Asn Arg Gin 288 336 384

ctg tat ttt cct get Leu

Tyr Phe cct get ggt eg Pro Ala Gly GI 170 »ac isp agt cat Ser His 432 g£a aca gta Thr Val aac cct get Asn Pro Ala 180 ccg aat att Pro Asn lie 185 Ϊ cc tet la Ser cac ate His lie get ctg caa Ala Leu Gin 160 tee agt tea Ser Ser Ser 175 teg tea ate Ser Ser lie 190 480 528 576

tee geg agg Ala Arg 195 gga tee gtg gac aag aaa Gly Ser Val Asp Lys Lys 210

Ser acc ggg gac Thr Gly Asp cct gtg aeg aac teg Pro val Thr Asn Ser 200 lie faf Pro 215 cgg ms m s?

Arg 205 agg gat Arg Asp tgt aag cct Cys Lys Pro 624 672 720 gaa gta tea tet gtc Ser Val 235 ctg act Leu Thr 250

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<210> 29 <211> 678 <212〉 PRT <213>人工 <220〉 <223>合成的構築體 <400〉 29

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Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu Val Leu 290 295

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Arg Ser Thr Arg Gly Ser 675 14 1364294 <210〉 30 <211> 1383 <212〉 DNA <213〉人工 B型肝炎病毒加鼠類 <220〉 <221〉 CDS <222〉 （1)..(1383) <400> 30 atg teg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca aeg 48

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Arg Gin Ala He Leu Cys Trp Gly Glu Leo Met Thr Leu Ala Thr Trp

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Duck B型肝炎病毒加鼠類 <220〉 <221> CDS <222> (1)..(1326) <400〉 32 18 481364294 atg teg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca aeg Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp lie Pro Thr 1 5 10 15 acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gee atg gat ccg gaa ttc atg ggg Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met GTy 20 25 30 caa cat cca gca aaa tea atg gac gtc aga egg ata gaa gga gga gaa Gin His Pro Ala Lys Ser Met Asp val Arg Arg lie Glu GTy Gly Glu 35 40 45 ata ctg tta aac caa ett gee gga agg atg ate cca aaa geg act ttg He Leu Leu Asn Gin Leu Ala GTy Arg Met lie Pro Lys GTy Thr Leu 50 55 60 aca tgg tea ggc aag ttt cca aca eta gat cac gtg tta gac cat gtg Thr Trp Ser GTy Lys Phe Pro Thr Leu Asp His val Leu Asp His Val 65 70 75 80 caa aca atg gag gag ata aac acc etc cag aat cag gga get tgg cct Gin Thr Met Glu Glu lie Asn Thr Leu Gin Asn Gin Gly Ala Trp Pro 85 90 95 get ggg geg gga agg aga gta gga Ala GTy Ala GT^ Arg Arg val Gly tta tea aat Leu Ser Asn 105 act cct caa Thr Pro Gin 110 att cct cag ccc cag tgg act ccc gag gaa gac caa aaa gca ege gaa lie Pro Gin Pro Gin Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gin Lys Ala Arg Glu 115 120 125 get ttt ege cgt tat caa gaa gaa aga cca ccg gaa acc acc acc att Ala Phe Arg Arg Tyr Gin Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr lie 130 135 140 cct ccg tet tee cct cct cag tgg aag eta caa ccc ggg gac gat cca Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gin Trp Lys Leu Gin Pro Gly Asp Asp Pro 145 · 150 155 160 etc ctg gga aat cag tet etc etc gag act cat ccg eta tac cag tea Leu Leu GTy Asn Gin Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gin Ser 165 170 175 gaa cca geg gtg cca gtg Glu Pro Ala Val Pro val 180 ata aaa act ccc ccc ttg lie Lys Thr Pro Pro Leu 185 aag aag Lys協 aaa aeg Lys Thr egg ccg caa ggc ggc gga tee Arg Pro Gin Gly GTy GTy Ser 195 gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat val Asp Lys Lys lie val Pro Arg Asp 200 205 tgt egt tgt aag Cys Gl^ Cys Lys cct tgc Pro Cys ata tgt aca gtc cca gaa gta tea tet gtc lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val 215 220 ttc ate ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg etc acc att act ctg act Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp val Leu Thr lie Thr Leu Thr 225 230 235 240 cct aag gtc aeg tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat ccc gag Pro Lys Val Thr Cys val val Val Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu 245 250 255 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 768

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Sga tea taa Ty Ser 440 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1326 <210> 33 <211> 441 <212〉 PRT <213>人工 <223>合成的構築體 <400〉 33

Met Ser Tyr Tyr His H.s Hh Hh H.s H,s Asp Tyr Asp He Pro Thr

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Gin His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg lie Glu Gly Gly Glu 35 40 45

He Leu Leu Asn Gin Leu Ala Gly Arg Met He Pro Lys Gly Thr Leu 20 1364294 50 55 60

Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp H,s Val Leu Asp His Val

GlnThr Met Glu Glu lie Asn Thr Leu Gin Asn Gin Gly Ala Trp Pro

Ala Gly Ala Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gin Glu 105 110 lie Pro Gin Pro Gin Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gin L^s Ala Arg Glu 115 120

Ala Phe Arg Arg Tyr Gin Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr lie 130 135 140

Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gin Trp Lys Leu Gin Pro Gly Asp Asp Pro 145 150 155 160

Leu Leu Gly Asn Gin Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gin Ser 165 170 175

Glu Pro Ala Val Pro Val lie Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys Lys Thr 180 185 190

Arg Pro Gin Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp 195 200 205

Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val 210 215 220

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Lvs 230 235 240

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Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp Ag Val Glu Val H.s Thr Ala Gin

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Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro 21 1364294 325 330 335

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Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Glv Ser <210〉 <211〉 <212〉 <213> <220〉 <223〉 ^dnaax 鴨B型肝炎病毒加鼠類 <220> <221〉 CDS <222〉 （1)..(1824) <400〉 34 atg teg tac tac cat cac cat cac cat cac gat Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp 1 5 10 acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Met Asp 20 25 caa cat cca gca aaa tea atg gac gtc aga egg Gin His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg ata ctg tta aac caa ctt gcc gga agg atg ate lie Leu Leu Asn Gin Leu Ala Gly Arg Met lie 50 55 aca tgg tea ggc aag ttt cca aca eta gat cac Thr Trp Ser GTy Lys Me Pro Thr Leu Xsp His 65 70 75 caa aca atg gag gag ata aac acc etc cag aat Gin Thr Met Slu Slu lie Asn Thr Leu Gin Asn 85 90

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Ala Phe Arg Arg Tyr Gin Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr lie 130 135 140 cct ccg tet tee cct cct cag tgg aag eta caa ccc ggg gac gat cca 480

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Leu Leu GTy Asn Gin Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gin Ser 165 170 175 gaa cca geg gtg cca gtg Glu Pro Ala Val Pro val 180

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Thr Gin Pro lie Met Asg Thr Asp Gly Ser T^r Phe Val Tyr Ser L^s etc aat gtg ca£ aag age aac tgg gag gca gga aat act ttc acc 丄gc

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Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Met- Asp Pro Glu Phe Met Gly

Gin His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg lie Glu Gly Gly Glu lie Leu Leu Asn Gin 乙eu Ala Gly Arg Met lie Pro Lys Gly Thr Leu 50 55 60

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Ala Gly Ala Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gin Glu 105 110 lie Pro G|n Pro Gin Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gin L^s Ala Arg Glu

Ala Phe Arg Arg Tyr Gin Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr lie 130 135 140

Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gin Trp Lys Leu Gin Pro Gly Asp Asp Pro 145 150 155 160

Leu Leu Gly Asn Gin Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gin Ser 165 170 175

Glu Pro Ala Val Pro Val He Lys Thr Pro Pro Leu Lys L?s Lys Met

Ser Gly Thr Phe Gly Gly He Leu Ala Gly Leu He Gl? Leu Leu Val

Ser Phe Phe Leu Leu lie Lys lie Leu Glu lie Leu Arg Arg Leu Asp 210 215 220

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Pro Trp Gly C^s Pro Gly Phe Leu Trg Thr Tyr Leu Arg Leu Phe lie 26! 270 lie Phe Leu Leu lie Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu Thr 275 280 285

Asp Asn Gly Ser Thr lie Leu Gly Lys Leu Gin Trg Ala Ser Val Ser 290 295

Ala Leu Phe Ser Ser lie Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys Ser 305 310 315 320

Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu lie Trp Met Thr Ser Ser

Ser Ala Thr Gin Thr Leu Val Thr Leu Thr Gin Leo Ala Thr Leu Ser

Ala Leu Phe Tyr Lys Ser Ser Arg Pro Gin Gly Gly Gly Ser Val Asp 355 360 365

Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr 370 375 380

Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe Pro .Pro Lys Pro Lys As 385 390 395 ASD 400

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Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gin Asp Trp 450 455 460

Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro 465 470 475 480

Ala-Pro He Glu L^s Thr He Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro L^s Ala

Pro Gin Val Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp

Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp He 26 1364294

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<210〉 37 <211> 537 <212〉 PRT <213〉人工 <220>

<223>合成的構築體 <400〉 37

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp lie Pro Thr 15 10 15

Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Met Asp He Asn Ala Ser Arg

Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Lys lie 35 40 45

Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys 50 55 60

Ser Asp Ser He Lys L^s H.s Val Leo He Ala Thr H.s Phe Val Asp

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Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val As§ He Ser Lys Asp

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Ser Leu Ser Arg Ser Thr Ar§ Gly Ser <210> 38 <211> 1422 <212> DNA <213>人工 纖 C型肝炎病毒加鼠類 <220> <221> CDS <222> (1)..(1422) <400〉 38 atg teg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca aeg 48

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<210〉 39 <211〉 473 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223>合成的構築體 <400〉 39

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<210〉 40 <211> 1380 <212> DNA <213>人工 C型肝炎病毒加鼠類 <220> <221> CDS <222> (1)..(1380) <400> 40 atg teg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg 48 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp lie Pro Thr 1 5 10 15 acc Thr gaa Slu aac Asn ctg Leu tat Tyr ttt Phe cag Gin m gcc Ala atg Met eat Asp ccg Pro gaa Glu ttc Phe atg Met age Ser 96 20 25 30 acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgt ege 144 Thr Asn Pro 35 Lys Pro Gin Arg Thr Lys Arg Asn Thr 45 Asn Arg Arg cca Pro cag Gin gac Asp gtc Val aag Lys ttc Phe ccg Pro cag Gin ate lie 192 35 240 1364294 50 55 60 tac ttg ttg ccg Tyr Leu Leu Pro 65 aag act tcc gag Lys Thr Ser Glu cgc agg ggc cct aga ttg Arg Arg Gly Pro Arg Leu ggt gtg cgc gcg acg agg Gly Val Arg Ala Thr Arg egg teg caa cct ega ggt „ Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 85 90 aga cgt cag aag gca Lys Ala cgt Arg egg Arg 100 105 1' ct cag ccc la Gin Pro cct ate ccc Pro lie Pro 95 ggg tac cct G|^ Tyr Pro tgg ccc Trp Pro etc tat Leu Tyr 115 tet ccc Ser Pro Arg 130 cgt m agg teg .g Ser 145

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Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asg Gly Val 180 185

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Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys 325 330 335

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<210〉 42 <211> 2190 <212〉 DNA <213>人工 C型肝炎病毒加鼠類 <220〉 <221> CDS <222> (1)..(2190) <400〉 42 atg teg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca aeg 48

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp lie Pro Thr 15 10 15

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41 1364294

Gly Gin gat ggc Asp Gly

Pro Ala 660 tct tac Ser Tyr 675

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<210> 43 <211> 729 <212> PRT <213〉人工 合成的構築體 <400〉 43

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Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ser Gly 20 25 30

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50 55 60

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Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro lie Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys 115 120 125

Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser 130 135 140

Ala Glu Glu Tyr Val Glu lie Arg Arg Val Asp Phe His Tyr Val 145 150 160 42 1364294

Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys C^s Pro Cys Gin lie Pro Ser 165 175

Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leo Asp Gl? Val Arg Leu H.s Ar§ Phe Ala

Pro Pro C^s Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly 210

Leu ms Glu Tyr Pro Val Gj^ Ser Gin Leu Pro C,s Glu Pro Glu Pro

Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr As§ Pro Ser H1S He Thr

Ala Glu Ala Ala Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met 25( 255

Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr 260 265 LYS 270

Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu lie Glu Ala Asn 275 280 285

Leu Leu Trp Arg Gin Glu Met Gly Gly Asn He Thr Arg Val Glu Ser

Glu Asn Lys Val Val lie Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu 305 310 315 320

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Stgg ΤΓΡ cac tac cct cca aga cct His Tyr Pro Pro Arg Pro 330 tgt ggc att stg Cys GTy lie Val 335 ccc gca aag age gtg tgt ggc ccg gta tat tgc ttc act ccc age ccc Pro Ala Lys Ser val Cys Gly Pro val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro 340 345 350 gtg gtg gtg gga acg acc gac agg teg ggc geg cct acc tac age tgg val val Val GTy Thr Thr Asp Arg Ser GTy Ala Pro Thr Tyr Ser Trp 355 360 365 sgt gca aat gat acg gat gtc ttc gtc ett aac aac acc agg cca ccg Gly Ala Asn Asp Thr Asp val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro 370 375 380 ctg ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac tea act gga ttc acc Leu GTy Asn Trp Phe GTy Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr 385 390 395 400 aaa gtg tgc gga geg ccc cct tgt gtc ate sga ggg gtg ggc aac aac Lys Val Cys GTy Ala Pro Pro Cys val lie Gly Gly Val GTy Asn Asn 405 410 415 576 624 672 720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248

acc ttg etc tgc ccc act gat tgc ttc cgc aaa cat ccg gaa gcc aca Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr 55 1296 1364294 420 425 430 tac tct egg tgc ggc tee ggt ccc tgg att aca ccc agg tgc atg gtc 1344

Tyr Ser Arg Cys GTy Ser 5ly Pro Trp lie Thr Pro Are Cys Met Val 435 440 445 gac tac ccg tat agg ett tgg cac tat cct tgt acc ate aat tac acc 1392

Asp T^r Pro Tyr Arg Leu Tg His Tyr Pro Cys Thr He Asn Tyr Thr ata ttc aaa etc agg atg tac gtg ega ggg gtc gag cac agg ctg gaa 1440 lie Phe Lys val Arg Met Tyr val GTy GTy val Glu His Arg Leu Glu 465 470 475 480 geg gcc tgc aac tgg aeg egg ggc gaa ege tgt gat ctg gaa gac agg 1488

Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg GTy Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg 485 490 495 gac agg tee gag etc age ccg ttg ctg ctg tee acc aca cag tgg cag 1536

Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gin Trp Gin 500 505 510

gtc ett ccg tgt tct ttc aeg acc ctg cca gcc ttg tee acc ggc etc 1584 val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr GTy Leu 515 520 525 ate cac etc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta 1632 lie His Leu His Gin Asn lie val Asp Val Gin Tyr Leu Tyr GTy val 530 535 540 ggg tea age ate geg tee tgg gcc att aag tgg gag tac gtc gtt etc 1680 GTy Ser Ser lie Ala Ser Trp Ala lie Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 545 550 555 560 ctg ttc ett ctg ett gca gac geg ege gtc tgc tee tgc ttg tgg atg 1728

Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg val Cys Ser Cys Leu Trp Met 565 570 575 atg tta etc ata tee caa geg gag geg get gga eta gtg egg ccg caa 1776

Met Leu Leu lie Ser Gin Ala Glu Ala Ala GTy Leu Val Arg Pro Gin 580 585 590 ggc ggc gga tee gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt 1824

GTy GTy uly Ser Val Asp Lys L^s lie val Pro Arg As^ Cys GTy Cys aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tea tct gtc ttc ate ttc 1872

Lys Pro Cys lie Cys Thr val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe 610 615 620 ccc Pro 625 cca aag Pro Lys ccc Pro aag Lys gat Asp 630 etc Leu acc Thr att lie act Thr 635 ctg Leu act Thr cct Pro aag Lys gtc Val 640 1920 aeg Thr tgt gtt Cys Val gtg gta Val Val 645 gac Asp ate lie age Ser aag Lys gat Asp 650 eat Asp ccc Pro cag Gin 655 ttc Phe 1968 age Ser tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His 660 665 aca Thr get Ala cag Gin Sf 670 caa Gin ccc Pro 2016 egg Arg cag Gin ttc Phe aac Asn age Ser act Thr ttc Phe ege Arg tea Ser gtc Val agt Ser gaa Glu ett Leu ccc Pro 2064 675 680 685 ate lie atg cac Met His cag Gin gac Asp etc Leu aat Asn m aag Lys ttc Phe aaa Lys tgc Cys agg Arg gtc Val 2112 56 1364294 690 695 700 aac agt gca get ttc cct gee ccc ate gag aaa acc ate tee aaa acc Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr 705 710 715 720 aaa ggc aga ccg aag get cca cag gtg tac acc Lys Gly Arg Pro Lvs Ala Pro Gin VaT T^r Thr att cca cct ccc aag lie Pro Pro Pro Lys 735

Sag cag atg gee aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca g lu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr A 740 745 750 ac sp ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca Phe Phe Pro Glu Asp He Thr val Glu Trp Gin Trp Asn uly Gin Pro 755 760 765 geg gag aac tac aag aac act cag ccc ate atg gac aca gat ggc tet Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser 770 775 780 tac ttc gtc tac T^r Phe Val Tyr age aag Ser Lys 790 etc aat Leu Asn gtg cag aag age aac tgg gag gca VaT Gin Lvs Ser Asn Trp Glu Ala 795 800 ;ga aat act ttc acc tgc tet gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac lly Asn Thr Phe Thr Cys Ser VaT Leu His Glu Gly Leu His Asn His 805 810 815 cat act His Thr gag aag age Glu Lys Ser 820 etc tee cac tet cct Leu Ser His Ser Pro 825 ggg ctg caa age Gly Leu Gin Ser 830 ilgu teg Ser aga Arg agt act aga gga tea taa Ser Thr Arg Gly Ser 835 2160 2208 2256 2304 2352 2400 2448 2496 2517

<210〉 49 <211> 838 <212> PRT <213>人工

<220〉 <223>合成的構築體 <400〉 49

Met Ser Tyr Tyr H1S Hn H.s Has H.s H,s Asp Tyr Asp He Pro Thr

Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gin 20 25 30

Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu T^r His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn

Ser Ser lie Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala lie Leu His Thr Pro Gly 50 55 60

Val Pro Cys Val

Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala 57 1364294

Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gin 85 90 95

Leu Arg Arg His lie Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser 100 105 110

Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu C^s Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gin 115 125

Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gin Asp Cys Asn 130 13 140

Cys Ser He Tyr Pro Gly His lie Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp 145 150 155 160

Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gin Leu 165 170 175

Leu Arg He Pro Gin Ala lie Met Asp Met lie Ala Gly Ala His Trp 180 185 190 195

Gly Val Leu Ala Gly lie Ala T^r Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala

Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr

His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val G1 225 230 235 ϋΐν 240

Leu Leu Thr Pro Ala Lys Gin Asn lie Gin Leu lie Asn Thr Asn 250 255

Gly Ser Trp His lie Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu 260 265 270

Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gin His Lys Phe Asn Ser 275 280 285

Ser Giv Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe 290 295 300

Ala Gin Gly Trp Gly Pro lie Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu As 305 310 315 ASD 320

Glu Arg Pro Tyr C^s Trp H.s Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly lie Val

Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro 58 1364294

Val Val Val Gly Thr Thr Asp Ar§ Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp

Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro 370 375 380

Leu Gly Asn Trp Phe Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr 385 395 400

Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val lie Gly Gly Val Gly Asn Asn

Thr Leu Leu C^s Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys H.s Pro Glu Ala Thr

Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp lie Thr Pro Arg Cys Met Val 435 440 445

Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr lie Asn Tyr Thr 450 455 460

He Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu 465 470 475 480 49!

Ala Ala Cys Asn Tr^ Thr Arg Gly Glu Ar^ Cys Asp Leu Glu Asg Arg

Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gin Trp Gin

Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu 515 520 525 lie His Leu His Gin Asn lie Val Asp Val Gin Tyr Leu Tyr Gly Val 530 535 540

Gly Ser Ser He Ala Ser Trp Ala lie Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 550 55? 560

Leu Phe Leu Leu Leu Ala-Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met 565 570 575

Met Leu Leu lie Ser Gin Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gin 580 585 590

Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 595 600 605

Lys Pro Cvs lie Cvs Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe 610 ' 615 620 59 1364294

Pro Pro Lys Pro Lys Asg Val Leu Thr He Thr Leu Thr Pro Lys Val

Thr Cys Val Val Val Asp He Ser Lys Asg Asp Pro Glu Val Gin Phe

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val H1S Thr Ala Gin Thr Gin Pro

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met H.s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Thr 705 710 715 720

Lys Gly Arg Pro L^s Ala Pro Gin Val Tj;r Thr lie Pro Pro Pro Lys 730 735

Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp 740 745 750

Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro 755 760 765

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asg Thr Asp Gly Ser 770 775

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin L^s Ser Asn Trp Glu Ala 785 800

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu Hjs Glu Gly Leu H.s Asn H.s H:s Thr Glu L^s Ser Leu Ser H1S Ser Pro Gly Leu Gin Ser Leu Ser

Arg Ser Thr Arg Gly Ser 835 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> B型肝炎病毒 <400〉 50

Gly Met Leu Thr Pro Val Ser thr lie 1 5 60 1364294 Λ

51 9 PRT Β型肝炎病毒 <210〉 <211> <212> <213> <400> 51

Asn lie Ala Ser His lie Ser Ser lie

61

Claims (1)

136429^ 公告本 年月’日¥(更)正本 101年1月日替換修正百 ι·一種用於在宿主中引發免疫反應之嵌合抗原，其中該 嵌合抗原包含： 一或多個免疫反應功能域，其中該一或多個免疫反應 功能域包含至少一個選自由HBV Sl/2、HBV S1/S2/S、HBV 核心、HB V核心ctm及HB V聚合酶所組成之群組的b型肝 炎病毒（HBV)蛋白質之抗原性部分及 標輕物結合功能域’其中該標靶物結合功能域包含錢 鏈區、至少一個CH1區域之部分及異型Fc抗體片段，其包 含至少CH2與CH3功能域之部分， 其中該一或多個免疫反應功能域及該標靶物結合功能 域係以肽類鍵聯連接，且 其中該嵌合抗原包含昆蟲細胞產生之轉譯後修飾以在 宿主中增加免疫原性。 2. 根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其中該免疫反 應功能域進一步包含融合至該蛋白質之6xHis標誌。 3. 根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其中該標靶物 結合功能域能夠結合至抗原展現細胞。 4 ·根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其中連接物為 共價肽類鍵聯。 5 ·根據申請專利範圍第4項之後合抗原，其中該肽類鍵 聯包含序列 SRPQGGGS 或 VRPQGGGS (SEQ ID NO: 1)。 6·根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其中連接物係 ^自由免胺酸拉鍊及生物素/親和素所組成之群組。 1364294 Ιϊ^~年1 月 7.根據申請專利範圍第i項之嵌合抗原，其中該嵌合抗 原係經甘露糖糖苷化。 几 8_根據巾請專㈣圍第7項之嵌合抗原，其巾該免疫反 應功能域係經甘露糖糖苦化。 9. 根據申請專利範圍第7項之嵌合抗原，其中該標靶物 結合功能域係經甘露糖糖苦化。 10. 根據申請專利範圍第7項之嵌合抗原，其中該嵌合 抗原係經少量甘露糖糖穿化。 1 1 ·根據申請專利範圍第7項之嵌合抗原，其中該嵌合 才几原係經兩度甘露糖糖韦t化。 12 ·根據申5青專利範圍第！項之嵌合抗原，其中該標粗 物結合功能域包含胺基酸序列SRPQGGGS (SEQ ID NO: 1)、VDKKI (SEQ ID NO:2)及小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區之 CH2與CH3功能域。 1 3.根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其引發多重-抗原決定基反應。 14.根據申請專利範圍第i項之嵌合抗原，其引發對該 免疫反應功flb域之至少一種抗原決定基的免疫反應。 1 5 ·根據申請專利範圍第丨項之嵌合抗原，其引發體液 免疫反應。 16. 根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其引發細胞 免疫反應。 17. 根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原，其引發Thl 免疫反應、Th2免疫反應、ctl反應或其纽·合。 1364294 [ιοί年i月修正頁I 18 · —種用以增進抗原展現細胞之抗原展現的醫藥組成 物，其包含治療上有效量之包含根據申請專利範圍第〖至 17項令任一項之嵌合抗原的組成物。 19. 根據申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其中該抗 原展現細胞為樹狀細胞。 20. 根據申請專利範圍第19項之醫藥組成物，其中該醫 藥組成物増進多於一種抗原決定基之抗原展現。 21. 根據申請專利範圍第19項之醫藥組成物，其中該醫 藥組成物增進該免疫.反應功能域之至少一種抗原決定基之 抗原展現。 22. —種用以活化抗原展現細胞之醫藥組成物，其包含 治療上有效量之根據申請專利範圍第1至17項中任一項之 嵌合抗原。 23. —種用以引發個體内免疫反應之醫藥組成物，其包 含醫藥上有效量之包含根據申請專利範圍第1項之嵌合抗 原的組成物。 24. —種用以破壞個體内耐受性之醫藥組成物，其包含 療上有效量之根據申請專利範圍第1項之嵌合抗原。 25. —種用於治療個體内免疫-可治療病況之醫藥組成 物，其包含治療上有效量之根據申請專利範圍第丨項之嵌 合抗原。 26. 根據申凊專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組 成物，其中單獨投藥該免疫反應功能域不會引發免疫反應。 27·根據申請專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組 1364294 5Ϊ年1月日替換修正f 成物，其中投藥該嵌合抗原可引發較單獨投藥該免疫反應 功能域時更大之免疫反應。 28. 根據申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該免 疫反應係藉由存在該個體内之抗原-特異性抗體含量而測量 得。 29. 根據申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該免 疫反應係藉由T細胞於暴露至載負以該嵌合抗原或單獨免 疫反應功能域之抗原展現細胞的反應中所分泌出的干擾素 -γ含量而測量得。 3〇·根據申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其中該免 疫反應係藉由於暴露至載負以該嵌合抗原或單獨免疫反應 功能域之抗原展現細胞的反應中所引發抗原-特異性CD8 + T細胞之含量而測量得。 3 1.根據申請專利範圍第23至25項中任一項之醫藥組 成物，其中該個體罹患有感染。 3 2.根據申請專利範圍第3丨項之醫藥組成物，其中該感 染為慢性病毒感染。 3 3.了種用於免疫接種宿主以對抗病毒感染之醫藥組成 物，其包含治療上有效量之根據申請專利範圍第丨至17項 中任一項之嵌合抗原。 34. 根據申請專利範圍第33項之醫藥組成物，其係用於 治療性免疫接種個體以對抗現存病毒感染。 35. 根據申請專利範圍第33項之醫藥組成物，其係用於 預防性免疫接種個體以對抗病毒感染。 1364294 [101 年1 月 3 6 ·根據申請專利範圍第3 3項之醫藥組成物，其中投藥 該醫藥組成物予個體引發對抗該嵌合抗原之多於一種的抗 原決定基的免疫反應。 3 7.根據申請專利範圍第3 6項之醫藥組成物，其係用於 免疫接種個體以對抗該免疫反應功能域之多於一種的抗原 決定基。 38,一種醫藥組成物’其包含醫藥上可接受之賦形劑及 根據申請專利範圍第1至丨7項中任一項之嵌合抗原。 3 9.根據申請專利範圍第3 8項之醫藥組成物，其中該醫 藥組成物係經調配用於非經腸道投藥。 4〇.根據申請專利範圍第38項之醫藥組成物，其中該醫 C組成物係經g周配用於穿皮、真皮内、靜脈内、皮下、肌 肉内、鼻内、經肺部或口服投藥。 41 · 一種製品’其包含裝有包含根據申請專利範圍第1 至17項中任一項之嵌合抗原的組成物之容器及用以將該嵌 合抗原投藥予需要其的宿主之指示說明。 42. —種製造嵌合抗原之方法，其包含： (a) 提供一種包含編碼根據申請專利範圍第1至丨7項中 任—項的嵌合抗原之聚核苷酸的微生物或細胞系；及 (b) 將該微生物或細胞系培養於藉其可表現該嵌合抗原 之條件下》 43. 根據申請專利範圍第42項之方法，其中該嵌合抗原 係經轉譯後修飾而包含甘露糖糖穿化。 44. 一種用於在宿主中引發免疫反應的聚核普酸，其編 1364294 * 101年1月日替換修正貧 ' 碼根據申請專利範圍第1至1 7項中任一項之嵌合抗原。 45. —種微生物或細胞系，其包含根據申請專利範圍第 44項之聚核苷酸。 46. —種載體，其包含根據申請專利範圍第44項之聚核 穿酸。 Η、圖式： 如次頁。 6