CN1845995B - 用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原 - Google Patents

用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原 Download PDF

Info

Publication number
CN1845995B
CN1845995B CN2004800227471A CN200480022747A CN1845995B CN 1845995 B CN1845995 B CN 1845995B CN 2004800227471 A CN2004800227471 A CN 2004800227471A CN 200480022747 A CN200480022747 A CN 200480022747A CN 1845995 B CN1845995 B CN 1845995B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pro
ser
thr
leu
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN2004800227471A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1845995A (zh
Inventor
拉詹·乔治
洛恩·蒂勒尔
安托万·努杰姆
王大坤
马友伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kemi Biomedical Chengdu Co ltd
Original Assignee
Virexx Medical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virexx Medical Corp filed Critical Virexx Medical Corp
Publication of CN1845995A publication Critical patent/CN1845995A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1845995B publication Critical patent/CN1845995B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4634—Antigenic peptides; polypeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/517—Plant cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。尤其是，该组合物和方法引发针对被宿主识别为“自我”抗原的外来抗原的免疫应答，由此破坏宿主对这些抗原的耐受性。将包括免疫应答结构域和目标结合结构域的嵌合抗原呈递给该宿主的免疫系统，其中该目标结合结构域包括抗体片段，提高了针对该外来抗原或耐受抗原的免疫应答。抗原呈递细胞摄取、处理、以及呈递该嵌合抗原，引发针对所希望的抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答。

Description

用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原 
相关申请 
本申请要求于2003年8月8日提交的美国临时申请第60/493,449号的优先权，其内容以引用方式结合于此作为参考。 
技术领域
本发明涉及用于引起或增强免疫应答(免疫反应)并且用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的方法和组合物。 
背景技术
当健康宿主(人类或动物)遭遇外来抗原(如衍生自细菌、病毒和/或寄生生物的蛋白质)时，该宿主通常启动免疫应答。该免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在体液免疫应答中，由B细胞产生抗体并且将抗体分泌到血液和/或淋巴液中以应答抗原刺激。随后该抗体中和该抗原(如病毒)，途径是通过特异性地结合到抗原表面，标记该抗原以便使该抗原被吞噬细胞和/或补体介导的机制破坏，或通过阻断结合或通过加强将游离抗原从循环中的清除。细胞免疫应答的特征是通过选择和增加能够直接或间接清除包含该抗原的细胞的特异性辅助T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞。 
在一些个体中，免疫系统不能对某些外来抗原产生应答。当抗原没有促使特异性抗体和/或杀伤T细胞的生成时，免疫系统就不能 防止随之产生的疾病。因此，感染物，如病毒，能够形成慢性感染并且该宿主的免疫系统对该感染物产生的抗原变为耐受。 
当该感染物逃避该宿主的免疫系统的机制尚未明确建立时，外来抗原没有被正确的呈递给宿主的免疫系统可能是慢性感染发展的影响因素。抗原呈递细胞(APC)依据该抗原的位置以不同的方式处理所遇到的抗原。外源性抗原被内吞并且随后在该抗原呈递细胞的内吞小体内被处理。由该外源性抗原生成的肽片段与II类主要组织相容性复合体(MHC)复合并被呈递在该细胞的表面。该复合物被呈递给CD4+T细胞从而刺激CD4+T辅助细胞分泌细胞因子，该细胞因子可以刺激B细胞产生针对该外源性抗原的抗体(体液应答)。另一方面，胞内抗原被处理并与I类MHC组成复合物呈递在抗原呈递细胞的表面。抗原被呈递给CD8+T细胞从而导致细胞毒性T细胞(CTL)产生针对携带该抗原的宿主细胞的免疫应答。 
在患有慢性病毒或寄生虫感染(其中生物体在其生命周期的某个时刻停留在宿主细胞内)的患者中，宿主细胞将生成抗原并且在其内表达抗原，并且循环中将出现分泌的抗原。例如，在慢性人类乙型肝炎病毒(HBV)携带者的血液中将会检测到病毒体、HBV表面抗原和核心抗原的替代物(以e抗原的形式)。 
慢性感染的有效治疗需要针对与该感染物相关的抗原的较强的CTL应答。这可以通过以下方式实现：通过在该宿主细胞内生成抗原或将该抗原递送到合适的细胞区室以便使它得到处理并呈递从而引起细胞应答。文献中已经报导了细胞内递送抗原的多种途径。其中，病毒载体(Lorenz et al.，Hum.Gen.Ther.10：623-631(1999))，cDNA转染的细胞的利用(Donnelly et al.，Ann.Rev.Immunol.15：617(1997))以及通过注入cDNA载体表达抗原(Lai etal.，Crit.Rev.Immunol.18：449-484(1998)；以及美国专利第5,589,466 号)已有文献报导。此外，表达针对树突细胞的抗原的DNA疫苗也已有报导(You，et al.，Cancer Res 61：3704-3711(2001))。 
能够运载抗原到细胞的胞质区室进行MHC I类途径处理的递送载体也已经得到利用。Hilgers，et al.(Vaccine 17：219-228(1999))已经详细地描述了佐剂的使用以便获得同样的目的。另一途径是利用可生物降解的微球进行抗原的细胞质递送，这已经通过针对卵白蛋白肽的Th1免疫应答的产生而得到说明(Newman，et al.，J ControlRelease 54：49-59(1998)；以及Newman，et al.，J Biomed Mater Res50：591-597(2000))。另外，抗原呈递细胞，如树突细胞，摄取PLGA纳米球(nanosphere)(Newman，et al.，J Biomed Mater Res60：480-486(2002))。 
树突细胞捕获、处理和呈递抗原以及刺激原始T细胞的能力已经使其成为治疗性疫苗开发中非常重要的工具(Laupeze，et al.，Hum Immunol 60：591-597(1999))。将抗原靶向树突细胞是抗原呈递中的关键步骤，为此目的已经开发了用于抗体的Fc区的树突细胞上存在的许多受体(Regnault，et al.，J Exp Med 189：371-380(1999))。这种途径的另外的实例包括卵巢癌Mab-B43.13、抗PSA抗体以及抗HBV抗体抗原复合物(Wen，et al.，Int Rev Immunol18：251-258(1999))。已经显示利用负载有肿瘤相关抗原的树突细胞的癌症免疫疗法可以产生肿瘤特异性免疫应答和抗肿瘤活性(Fong and Engleman，Ann Rev Immunol 96：1865-1972(2000)；以及Campton，et al.J Invest Dermatol 115：57-61(2000))。利用肿瘤抗原冲击的(tumor-antigen-pulsed)树突细胞在体内的临床实验中获得了较好的结果(Tarte and Klein，Leukemia 13：653-663(1999))。这些研究清楚地表明了利用树突细胞来产生针对癌抗原的免疫应答的效果。 
还可以通过抗原呈递细胞上的甘露糖受体代替Fc受体或者同Fc受体一起影响抗原呈递。巨噬细胞甘露糖受体(MMR)，也称作CD206，表达在抗原呈递细胞例如树突细胞(DC)上。该分子是内吞受体的C型凝集素家族的成员。甘露糖化的抗原(mannosylatedantigens)可以被CD206连接并且内在化。通常认为外源性抗原主要通过MHC II类途径被处理和呈递。然而，当通过CD206靶向目标时，有证据表明MHC I类途径和MHC II类途径均参与在内(Apostolopoulos et al.，Eur.J.Immunol.30：1714(2000)；Apostolopoulos and McKenzie，Curr.Mol.Med.1：469(2001)；Ramakrishna et al.，J.Immunol.172：2845-2852(2004))。 
传染病和癌症是主要的公众健康问题。例如，世界卫生组织的统计数据表明超过20亿人感染有HBV。其中，3.7亿人为慢性感染，因此具有高度的可能性发展为肝硬化和肝细胞癌。全世界有大约1.7亿人为HCV慢性携带者，对此没有有效的预防性或治疗性疫苗。据世界卫生组织报导每年有1千万人诊断有癌症。癌症每年导致6百万人死亡，占全世界死亡人数的12％。因此，需要有可以引发针对感染和癌症的免疫应答的新型的、治疗有效的组合物和方法，以及用于生产这类组合物的新方法。 
发明内容
本发明提供了用于引发免疫应答的嵌合抗原，该嵌合抗原包括免疫应答结构域(immune reponse domain)和目标结合区(targetbinding domain)，其中该目标结合结构域包括抗体片段。 
本发明的另一方面提供了增强抗原呈递细胞中抗原呈递的方法，该方法包括将抗原呈递细胞与包括本发明的嵌合抗原的组合物接触。 
本发明的另一方面还提供了激活抗原呈递细胞的方法，该方法包括将抗原呈递细胞与本发明的嵌合抗原接触。 
本发明的一方面提供了引发免疫应答的方法，该方法包括将包括本发明的嵌合抗原的组合物给患者施用。 
本发明的另一方面提供了破坏耐受性的方法，该方法包括将本发明的嵌合抗原给患者施用。在优选的实施例中，该患者为病毒或专性细胞内寄生虫的慢性感染者。 
本发明的一方面提供了治疗免疫-可治疗的疾病的方法，该方法包括将有效治疗剂量的本发明的嵌合抗原给所需要的患者施用。在优选的实施例中，该免疫-可治疗疾病是指感染，尤其是慢性感染或癌症。 
本发明的另一方面还提供了给受试者接种疫苗以防治感染的方法，该方法包括将本发明的嵌合抗原给受试者施用。可以对受试者进行预防性或治疗性的疫苗接种。在优选的实施例中，该受试者对嵌合抗原的一个以上的表位出现免疫反应，以及更优选地，对该免疫反应区的一个以上的表位出现免疫反应。优选地，该感染为病毒感染或专性的细胞内寄生虫感染。 
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，该组合物包括本发明的嵌合抗原和药学上可接受的赋形剂。 
本发明的一方面提供了包括本发明的嵌合抗原的制品和用于将该嵌合抗原给所需要的患者施用的说明。 
本发明的另一方面提供了编码嵌合抗原的多聚核苷酸，该多聚核苷酸包括编码免疫应答结构域的第一多聚核苷酸部和编码目标 结合结构域的第二多聚核苷酸部，其中该目标结合结构域包括抗体片段。本发明还提供了包括此类多聚核苷酸的微生物和细胞系。 
本发明的另一方面还提供了生成本发明的嵌合抗原的方法，该方法包括提供微生物或细胞系(该微生物或细胞系包含编码本发明的嵌合抗原的多聚核苷酸)，以及在能够表达该嵌合抗原的条件下培养该微生物或细胞系。 
下面将结合附图和说明书详细描述本发明的一个或多个实施例。通过说明书、附图、以及权利要求，本发明的其它特征、目标、以及优点将变得显而易见。 
附图说明
图1A提供了作为单体的本发明的嵌合抗原的结构示意图，其中该嵌合抗原具有两个部分，即免疫应答结构域和目标结合结构域。该示意图还示出了优选的实施例，其中存在铰链区。图1B提供了本发明的嵌合抗原在通常状态下，即装配为二聚体时的结构示意图。该示意图示出了特别优选的实施例，其中该嵌合抗原除了该免疫应答结构域和目标结合结构域外还包括6xHis标记和连接肽。 
图2示出了用HBV S1/S2-TBD刺激T细胞生成特异性针对来自HBV S1蛋白的表位的细胞毒性T细胞(CTL)应答。 
图3示出了用HBV S1/S2-TBD刺激T细胞生成特异性针对来自HBV S2蛋白的表位的细胞毒性T细胞(CTL)应答。 
图4示出了以浓度的函数来比较成熟树突细胞对HBVS1/S2-TBD、IgG1和IgG2的摄取。 
图5示出了HBV S1/S2-TBD的结合与树突细胞上CD32的表达之间的相关性以及与CD206的表达之间的相关性。 
具体实施方式
A.总述 
本发明公开了用于引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。尤其是，该化合物和方法可以引发针对外来抗原的免疫应答(该抗原被宿主认为是“自我”抗原)，由此破坏宿主对这些抗原的耐受。将包括免疫应答结构域和目标结合结构域(其中该目标结合结构域包括抗体片段)的嵌合抗原呈递给宿主的免疫系统，增强了针对外来抗原或耐受抗原的免疫应答。抗原呈递细胞摄取、处理以及呈递嵌合抗原，引发针对希望的抗原的体液和细胞免疫应答。 
B.定义 
在进一步详细描述本发明前，除非另有说明，本申请所用的术语定义如下。 
“抗体”指的是人类或其它动物体内由抗原(免疫原)所致的由B淋巴细胞生成的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。这些分子的特征是可以特异性地与该抗原反应，每一个都根据另一个来定义。 
“抗体应答”或“体液应答”指的是一类免疫应答，其中抗体由B淋巴细胞生成并被分泌到血液和/或淋巴中以应答抗原刺激。在正常的机能免疫应答中，该抗体在细胞(例如病原体)的表面特异性地与抗原结合，标记该细胞以便其被吞噬细胞(phagocytoticcell)和/或补体介导的机制破坏。抗体还可以全身循环并结合游离的病毒粒子。该抗体的结合可以中和该病毒粒子并防止它感染细 胞，并且可以标记该病毒粒子以便通过吞噬作用或肾脏中的过滤作用将该病毒粒子清除出循环。 
“抗原”指的是任何进入体内并与适当的细胞接触，导致敏感和/或免疫应答状态的物质，该物质可以在体内或体外以可证明的方式与敏化的受试者的抗体和/或免疫细胞反应。 
“抗原呈递细胞”指的是抗原诱导过程的辅助细胞，其功能主要是将抗原处理并呈递给淋巴细胞。抗原呈递细胞与抗原的相互作用是免疫诱导中的关键步骤，原因是它能够使淋巴细胞遭遇并识别抗原分子并且使该淋巴细胞活化。示例性的抗原呈递细胞包括巨噬细胞、朗格汉斯-树突细胞、小结树突细胞(滤泡树突样细胞)、以及B细胞。 
“B细胞”指的是能够产生与抗原相互作用的免疫球蛋白或抗体的淋巴细胞。 
“CH1区”指的是抗体的抗原结合片段上的重链恒定结构域的区域。 
“细胞应答”指的是一种由特异性辅助T细胞和杀伤T细胞介导的免疫应答，杀伤T细胞能够直接清除病毒感染的细胞或癌细胞。 
本文所用的术语“嵌合抗原”指的是包括免疫应答结构域和目标结合结构域的多肽。该免疫应答结构域和目标结合结构域可以通过共价或非共价方式直接或间接连接。 
“细胞毒性T淋巴细胞”是一种特殊的淋巴细胞，它能够破坏外来细胞和感染有能产生病毒抗原的感染物的宿主细胞。 
“表位”指的是复合抗原分子上形式最简单的抗原决定簇；它是能够被免疫球蛋白或T细胞受体识别的抗原的特定部分。 
“融合蛋白”指的是通过由两个或多个基因序列组合而成的杂合基因表达所形成的蛋白。 
“铰链区”指的是抗体中将Fab片段连接到Fc片段的部分；铰链区包含共价连接两条重链的二硫键。 
术语“同系物”指的是通过，例如，在相应的部位具有相同或相似的化学残基序列而表现出与另一分子的同源性的分子。用语“％同源的”或“％同源”指的是在同源多聚核苷酸或多肽的相同部位相同或相似的核苷酸或氨基酸的百分数。例如，如果两个蛋白质中80个残基中有75个相同，那么这两个蛋白质具有93.75％的同源性。对本领域的技术人员来说可以利用各种已知的软件程序决定同源性的百分数。 
“宿主”指的是温血动物，包括人类，其患有免疫-可治疗的疾病，如感染或癌症。本文所用的“宿主”还指施用了嵌合抗原的温血动物，包括人类。 
在本发明的上下文中，“杂交”指的是低聚化合物的互补链的配对。在本发明中，优选的配对机制包括低聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键结合，该氢键结合可以为Watson-Crick氢键结合、Hoogsteen氢键结合、或反向的Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补核碱基，它们通过形成氢键配对。杂交可以在不同情况下发生。在多聚核苷酸的上下文中术语“杂交”及其类似用语指的是通常的杂交条件，优选地如在50％甲酰胺/6X SSC/0.1％SDS/100μg/ml mDNA条件下进行杂交，其中 用于杂交的温度高于37℃并且用于在0.1X SSC/0.1％SDS中冲洗的温度高于55℃。 
“免疫”或“免疫应答”指的是机体对抗原的应答。在特定实施例中，它指的是机体抵抗或保护自己免于传染病的能力。 
“免疫应答结构域(IRD)”指的是双功能嵌合抗原分子中不同构造的抗原部分。该免疫应答结构域包括一个或多个抗原和/或一个或多个重组抗原。 
本文所用的用语“免疫-可治疗的疾病“指的是可以通过在患者体内引发或调节免疫应答来防止、抑制或减轻的疾病或病变。 
“淋巴细胞”指的是血液中存在的有核细胞的亚类，其介导特异性免疫应答。 
“单克隆抗体”或“mAb”指的是由融合的杂交细胞，即杂交瘤细胞的克隆或遗传性同源群体产生的抗体。克隆杂交细胞以便建立产生特定的单克隆抗体的细胞系，该抗体具有化学和免疫学的同源性，即，其仅能识别一种类型的抗原。 
“肽键”指的是一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基之间通过取代的酰胺键共价连接的两个或多个氨基酸。 
“药学上可接受的”指的是与人类或其它动物具有生理学的相容性的无毒组合物。 
“药学上可接受的赋形剂”包括无毒并且与人类或其它动物具有生理学上的相容性的物质，例如佐剂、载体、pH-调节和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、防腐剂及其类似物。 
本文所用的术语“多聚核苷酸”指的是任何长度的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指该分子的初级结构。因此，该术语包括双链和单链的DNA和RNA。它还包括一个或多个天然存在的核苷酸与类似物的已知类型的修饰，例如，本领域已知的标记、甲基化、“加帽”、取代；核苷酸间的修饰，如以不带电荷的键合修饰(例如，磷酸甲酯、磷酸三脂、磷酸酰胺、氨基甲酸酯(盐)等)以及以带电荷的键合修饰(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，包含附属部分的修饰，例如蛋白质(包括例如核酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)，带嵌加物(intercalator)的修饰(例如吖啶、补骨脂素等)包含螯合剂的修饰(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)，包含烷化物(alkylator)的修饰，具有改性键合的修饰(例如α端基异构核酸等)，以及未修饰形式的多聚核苷酸。 
“蛋白酶切位点”指的是蛋白水解酶水解(断开)多肽链。 
在本发明中用于“严格的杂交条件”或者“严格的条件”指的是本发明的化合物与其目标序列杂交而与极小量(最小量)的其它序列杂交的条件。 
术语“目标对象”指的是任何温血动物，优选人类。 
“标签”指的是用于分离或纯化包含该标签的分子的标记物或标记序列。示例性的标签包括6xHis标签。 
“T细胞”指的是负责抗原特异性的细胞相互作用的一类淋巴细胞，它介导体液和细胞免疫应答。 
“目标结合结构域(TBD)”指的是包含抗体片段的蛋白，其能够结合抗原呈递细胞尤其是树突细胞上的受体，并且其随后被受体介导的摄取转运到抗原呈递细胞内。 
用语“有效治疗量”指的是嵌合抗原或编码嵌合抗原的多聚核苷酸的量，该量足以引起针对抗原的有效的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或辅助T淋巴细胞(Th)应答，并且足以阻断或治疗或至少部分的抑制或减缓疾病或病症的症状和/或并发症。 
本文所用的术语“治疗”包括可利用嵌合抗原治疗动物，尤其是人类的疾病的任何治疗，并且包括：(i)防止疾病在目标对象体内发生，该目标对象可以为易患有该疾病但是还未诊断出患有该疾病的对象；(ii)抑制疾病，例如抑制或减慢它的发展；(iii)减轻该疾病，例如，引起该疾病或者其症状的缓解。 
本文所用的“异种型”指的是起源于与宿主不同的物种。例如，从鼠基因组克隆的重组表达抗体是人而非鼠的异种型，而不管该重组表达抗体是否产自细菌、昆虫或鼠的细胞。 
C.新颖的嵌合抗原 
本发明提供了用于引发免疫应答的嵌合抗原，该抗原包括免疫应答结构域和目标结合结构域，其中该目标结合结构域包括抗体片段。根据本发明，该嵌合抗原，优选地，能够结合到Fc受体和/或巨噬细胞甘露糖受体上。该抗体片段对宿主可以是异种型或非异种型。 
在本发明的优选实施例中，该嵌合抗原能够引起体液和/或细胞免疫应答。细胞免疫应答可以包括Th1应答、Th2应答、和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。在另一优选的实施例中，该嵌合抗原引发多表位免疫应答。该多表位免疫应答可以包括对免疫应答结构域的至少一个表位的应答和/或对目标结合结构域的至少一个表位的应答。可选地该多表位应答可被限于对免疫应答结构域的多于一个表位的应答。 
本发明的嵌合抗原包括两个部分，即包含抗原序列(如病毒抗原)的免疫应答结构域，以及包含抗体片段的目标结合结构域(图1)。在优选的实施例中，该免疫应答结构域可以通过本领域技术人员已知的任何方法连接到目标结合结构域。用于将该免疫应答结构域连接到目标结合结构域上的连接方式可以包括，但不限于，共价肽键、化学连接、亮氨酸拉链和生物素/抗生物素蛋白。在优选的实施例中，该免疫应答结构域和目标结合结构域作为单一的融合蛋白克隆。该融合蛋白的共价肽键可以包括其它的肽序列，例如SRPQGGGS或VRPQGGGS(SEQ ID NO：1)。在另一优选的实施例中，各种免疫应答结构域被生物素化，并且该目标结合结构域借助作为融合蛋白的链酶抗生物素产生，以便促进多种嵌合抗原的生成。可选地，该免疫应答结构域和目标结合结构域中的每个都可以表达为对亮氨酸拉链部分的融合，其将导致该嵌合抗原的两部分通过混合结合。最终，该免疫应答结构域和目标结合结构域可以独立表达，并且随后通过本领域技术人员已知的方法化学结合。示例性的方法包括利用蛋白交联剂(例如二甲基辛二酰亚胺化物(dimethylsubermidate)共价连接这两个结构域。 
该免疫应答结构域主要提供了该嵌合抗原的抗原部分。该免疫应答结构域包括免疫应答所需的整体的至少一个抗原部分。该嵌合抗原，可选地，可以包括多于一个的免疫应答结构域。在优选的实施例中，该免疫应答结构域包括感染物(例如病毒或专性胞内寄生虫)的至少一个抗原部分或癌抗原的至少一个抗原部分。更优选地，该免疫应答结构域包括感染病毒的至少一个抗原部分。 
优选的感染性的病毒的实例包括：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，如人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)，还指的是HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III；以及其它分离的病毒，如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒，人类柯萨奇病毒、鼻病毒、艾可病毒)；卡里西病毒科 (Calciviridae)(如，引起胃肠炎的菌株)；囊膜病毒科(如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(如丙型肝炎病毒、登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(如冠状病毒属)；棒状病毒科(如水疱性口腔炎病毒、狂犬病病毒)；线状病毒科(如埃博拉病毒)；副粘病毒科(如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(如流感病毒)；布尼亚病毒科(如汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和纳伊罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(人类乙型肝炎病毒(HBV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV))；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；以及虹彩病毒科(如非洲猪热病毒)；以及未分类的病毒(如δ肝炎物质、非A非B肝炎物质(类1-内部传播)；类2-胃肠外传播；诺沃克病毒及相关病毒、以及星状病毒)。在本发明的一些实施例中，该嵌合抗原的免疫应答结构域包括一个或多个蛋白的至少一个抗原部，该蛋白选自：HBV蛋白、DHBV蛋白以及HCV蛋白。用于本发明的特别优选的HBV蛋白包括，但不限于，HBV S1/S2、HBV S1/S2/S、HBV核心、HBV核心ctm(C-末端修饰)、HBV e抗原、以及HBV聚合酶。本发明中所用的特别优选的DHBV蛋白包括，但不限于，DHBV PreS/S、DHBVPreS、DHBV核心、以及DHBV聚合酶。本发明中所用的特别优选的HCV蛋白包括，但不限于，HCV核心(1-191)、HCV核心(1-177)、HCV E1-E2、HCV E1、HCV E2、HCV NS3、HCV NS5A和NS4A。本发明中所用的其他优选的病毒抗原包括HIV gp120、HSV碱性核酸酶以及人类乳头瘤病毒(HPV)壳体蛋白L1和L2、以及早期区域蛋白HPV E1、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6和HPV E7。 
优选的专性胞内寄生虫的实例包括：四膜虫(如梨形四膜虫)、疟原虫(如恶性疟原虫)、隐胞子虫(Cryptospiridium sp.)、微胞子虫(Spraguea sp.)(如S.lophii)、贾第鞭毛虫、弓形虫(如刚地弓形虫、枯氏锥虫)、利什曼原虫、立克次氏体(如普氏立克次体)、衣原体、分支杆菌(如人型结核杆菌)、军团菌、李斯特菌(如单核细胞增生性李斯特菌)、考克斯体(如伯氏考克斯体)、志贺氏菌、埃里希体、以及巴尔通氏体(Bartonelia sp.)。优选的癌抗原包括：前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、MUC1、CA 125、WT1、Her-2/neu、癌胚抗原(CEA)、MAGE-3、MART-1、gp100、NY-ESSO-1、CA19.9、TAG72、CA15.3、CA27.9、gp120、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、热激蛋白、α-胎蛋白(AFP)、端粒酶、以及网状激活系统(ras)。 
在本发明的另一实施例中，该嵌合抗原的免疫应答结构域包括与一个或多个抗原部分融合的6xHis标签。 
根据本发明，该嵌合抗原为一种能够与抗原呈递细胞(尤其是树突细胞)上的Fc受体和/或CD206结合的蛋白，并且随后通过受体介导的摄取被转运到该抗原呈递细胞内。根据本发明，抗体片段的存在增强了该嵌合抗原通过抗原呈递细胞(尤其是树突细胞)上的Fc受体的摄取。借助这种特异性结合和内在化，病毒抗原被作为外来抗原处理和呈递。因此可以有效地引发针对先前耐受的抗原的免疫应答。该目标结合结构域包括对宿主为异种型或非异种型的抗体片段。在本发明优选的实例中，该抗体片段包括鼠Fc片段。在本发明的更优选的实施例中，该目标结合结构域包括Fc片段、铰链区、CH1区的部分，并且该嵌合抗原包括适于将目标结合结构域连接到免疫应答结构域的肽键。在更优选的实施例中，该目标结合结构域包括免疫球蛋白重链片段，可选地，进一步包括铰链区。在特别优选的实施例中，该重链片段包括氨基酸、CH1结构域的VDKKI(SEQ ID NO：2)和/或部分或全部CH2和CH3结构域。 
如上所述，被CD206连接和内在化的抗原可以被I类MHC和II类MHC呈递，因此引发细胞和体液免疫应答。因此，在优选的实施例中，该嵌合抗原被糖基化。该免疫应答结构域和/或目标结合结构域可以被糖基化。在特别优选的实施例中，该嵌合抗原可以通过高甘露糖糖基化或通过寡甘露糖糖基化(pauci mannoseglycosylation)而被甘露糖糖基化(mannose glycosylated)(Jarvis，Viurlogy 310：1-7(2003))。 
D.利用嵌合抗原的新颖方法 
本发明包括引发免疫应答的方法，该方法包括将包括本发明的嵌合抗原的组合物施用于目标对象。 
为了提供该抗原的有效呈递，发明人开发了新颖的包括免疫应答结构域和目标结合结构域的嵌合抗原，其中该目标结合结构域包括抗体片段。虽然不限于本发明的特定理论，该分子借助抗体片段结合到抗原呈递细胞的特定受体上，而病毒抗原被处理并与I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)复合而被呈递。这样的处理和借助I类MHC的抗原呈递引发了增强的细胞毒性T淋巴细胞应答，导致与免疫应答结构域的该抗原相关的任何感染物的清除。此外，通过II类MHC分子呈递的抗原引发了体液应答，该应答也有助于从感染细胞和/或从循环中清除该抗原。 
本发明还包括破坏耐受性的方法，该方法包括将本发明的嵌合抗原施加给目标对象。在呈递抗原以便借助嵌合抗原引发细胞和/或体液免疫应答的过程中，在慢性感染中作为“自我”处理的抗原被识别为“外来”抗原。因此，该宿主的免疫系统将产生CTL应答以便清除感染的细胞。同时，在应答该嵌合抗原的过程中，引发的抗体将结合到感染物上并且从循环中清除它或者阻断该感染物与宿主细胞的结合。因此，本发明被设计为产生嵌合抗原，该嵌合抗 原能够在患有慢性感染(该感染被宿主的免疫系统耐受)的目标对象导致广泛的免疫应答。在优选的实施例中，该嵌合抗原在目标对象中破坏对抗原的耐受性，其中该目标对象被感染物(如病毒或寄生虫)慢性感染或患有癌症。更优选地，该感染物在其生命周期的某个时间点停留在宿主细胞内。 
在优选的实施例中，由于抗体片段的存在以及在真核生物(如昆虫)的细胞表达系统中引入的糖基化的存在，宿主免疫系统未识别或耐受的预先选择的抗原的免疫原性被增强。由于抗体成分和糖基化的存在，这样的嵌合抗原将结合到各种免疫细胞类型(包括树突细胞、巨噬细胞、B细胞以及粒细胞)上存在的特定受体上。 
本发明的又一方面提供了激活抗原呈递细胞的方法，该方法包括将抗原呈递细胞与本发明的嵌合抗原接触。本发明还提供了提高抗原呈递细胞中的抗原呈递的方法，该方法包括将抗原呈递细胞与包括本发明的嵌合抗原的组合物接触。该嵌合抗原可以在体内或体外与抗原呈递细胞(优选树突细胞)接触。在优选的实施例中，将该嵌合抗原与抗原呈递细胞接触可以激活该抗原呈递细胞并提高多于一个表位的抗原呈递。这种多表位应答可以包括免疫应答结构域的一个或多个表位的呈递和/或目标结合结构域的一个或多个表位的呈递。 
本发明还提供了治疗免疫-可治疗的疾病的方法，该方法包括将有效治疗量的本发明的嵌合抗原施用给所需要的目标对象。在优选的实施例中，该免疫-可治疗的疾病为感染或癌症。该感染可以为病毒感染、寄生虫感染、或细菌感染。优选地，该感染将会有感染物存在于宿主细胞内的阶段。更优选地，该免疫-可治疗的疾病为慢性病毒感染。更优选地，该免疫-可治疗的疾病为慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染或慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染。为了治疗HBV，该免疫应答结构域优选包括选自以下组的蛋白的至少一个抗原部 分，该组包括：HBV核心蛋白、HBV S蛋白、HBV S1蛋白、HBVS2蛋白、及其组合物。为了治疗HCV，该免疫应答结构域优选包括选自以下组的蛋白的至少一个抗原部分，该组包括HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCV E1蛋白、HCV E2蛋白、HCV E1-E2蛋白、HCV NS3A蛋白、HCV NS5A蛋白、及其组合物。 
在优选的实施例中，该嵌合抗原的施用引发了比施用单独的免疫应答结构域更大的免疫应答。该免疫应答的程度可以通过以下方式测量，例如通过(i)存在于目标对象内的抗原特异性抗体的量；(ii)由暴露于抗原呈递细胞引起的应答中的T细胞分泌的干扰素-γ的量，该抗原呈递细胞负载有该嵌合抗原或仅免疫应答结构域；或者(iii)由暴露于抗原呈递细胞所引发的免疫应答中的抗原特异性CD8+T细胞的量，该抗原呈递细胞负载有该嵌合抗原或仅免疫应答结构域。 
可以通过在体内或体外将该嵌合抗原呈递给树突细胞产生免疫应答来评估该嵌合抗原的效能。树突细胞处理并呈递该嵌合抗原给T淋巴细胞，该T淋巴可以作为T细胞应答的标志物来评估T细胞的增值和干扰素-γ的生成。特殊地，在体外环境下，原始树突细胞从周围血液中分离处理。通过已知的方法测量标记物(如干扰素-γ)的水平来评估借助树突细胞的T细胞的活化。参见，如Berlyn，et al.，Clin.Immunol 101(3)：276-283(2001).分泌至少达50％的干扰素-γ的T细胞的百分数的增加预示了体内的效果。在体内情况下，该嵌合抗原被直接经肠胃外导入宿主，在该宿主内可获得的树突细胞和其它抗原处理细胞具有与抗原相互作用并由此处理它们的能力。 
因此，本发明包括给目标对象接种疫苗以防止感染的方法，该方法包括将本发明的嵌合抗原施加给该目标对象。该目标对象可以 被预防性或治疗性地接种疫苗。优选地，该感染为病毒感染。该分子的双功能性质有助于将抗原靶向抗原呈递细胞(如树突细胞)，通过将具有最有效的化学计量的抗原的抗原呈递细胞靶向抗体，使它成为治疗慢性感染性疾病的独特的方法。这在治疗慢性病毒感染(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒、专性胞内寄生虫)的治疗性疫苗的开发中很有用，并且还可以应用于如癌症和自身免疫疾病等疾病中的所有自体同源抗原。这些融合蛋白的施加可以引发来自宿主的广泛的免疫应答，包括细胞和体液免疫应答。因此，它们可以用作治疗性疫苗以治疗对现存的感染表现为免疫耐受的目标对象，还可以在特定感染扩展的风险下用作预防性疫苗以使目标对象产生免疫。 
E.制备嵌合抗原的方法 
本发明的一方面提供了用于生成嵌合抗原的方法，该方法包括(a)提供包括编码嵌合抗原的多聚核苷酸的微生物或细胞系，优选地为真核生物，更优选地为非哺乳动物微生物或细胞系；以及(b)将所述微生物或细胞系在一定条件下培养，在该条件下嵌合抗原被表达。优选地，该微生物或细胞系为酵母、植物细胞系或昆虫细胞系。更优选地，该细胞系为选自Sf9、Sf21、Drosophila S2、High FiveTM 的昆虫细胞系。 
本发明的一个实施例利用已建立的重组DNA技术来生成本发明实施中必需的所选抗原和目标结合结构域的融合蛋白。融合蛋白的结构在DNA水平结合特异性限制酶切位点生成，其通过将所希望的DNA片段引入表达载体来生成，并用于在异源表达系统中表达所希望的融合蛋白。本文所用的术语“载体”指的是能够携带编码所希望蛋白质的DNA的质粒。本发明中所用的优选的质粒载体包括，但不限于，pFastBac HTa和在DH10BacTM E.coli(invitrogen)中生成的相应重组“杆粒”。 
编码目标结合结构域的基因可以通过聚和酶链反应(PCR)从任何抗体生成细胞(例如生成单克隆抗体的杂交瘤细胞)中获得。为了促进随后的克隆步骤，优选设计加入单一的限制酶识别位点的低聚核苷酸引物。类似地，该免疫应答结构域的抗原部分可以从包含编码所希望的靶标的抗原部分的基因的任何细胞或病毒RNA或DNA获得。优选地，PCR用于获得编码该免疫应答结构域的抗原部分的DNA，而设计PCR引物以便加入独特的限制酶识别位点用于促进克隆。然而，任何重组DNA方法可以用于获得编码该免疫应答结构域的抗原部分的DNA。随后编码该目标结合结构域和免疫应答结构域的多聚核苷酸可以利用标准克隆技术以单一的结构组合。可选地，该独立的结构域可以借助编码连接体(如亮氨酸拉链、链霉抗生物素或生物素化信号)的DNA克隆。 
优选地，杆状病毒系统用于表达本发明的嵌合抗原，不仅是因为生成大量的异源蛋白质，而且还因为在感染的昆虫细胞内发生的真核生物蛋白的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化。由于直接在昆虫细胞内克隆会比较困难，优选在细菌系统中生成编码该嵌合抗原的多聚核苷酸并且将最终的结构转运到杆状病毒/昆虫细胞表达系统中。对本领域的技术人员来说，转运系统，如Bac-To-BacTM系统(Invitrogen)是已知的。Bac-to-BacTM系统利用借助细菌转座子Tn7的位点特异性转座以便将相关的基因转运到大肠杆菌-昆虫细胞穿梭载体(杆粒)内。生成的重组杆粒被转染到昆虫细胞内以便产生表达重组蛋白的杆状病毒。 
为了生成杆状病毒，杆粒被转染到昆虫细胞(如Sf9细胞)内。转染后，该细胞被孵育足够长的一段时间以扩大该病毒载体群体间。收集包含该杆状病毒的培养基并将其在4℃黑暗中贮存。可以通过检查杆状病毒DNA的生成来证明该转染，该DNA的生成是通过利用对所想要的DNA插入片段具有特异性的引物使该病毒培养物经历PCR来完成的。可以通过本领域技术人员已知的任何方法 (如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或蛋白质印迹)来证实该细胞内异源蛋白质的表达。 
将标准化的感染复数(MOI)的重组杆粒用于感染昆虫细胞。将细胞以大约3×105细胞/mL的密度接种并于27.5℃的悬浮培养基中摇动地孵育直到细胞密度达到大约2-3×106细胞/mL。随后将标准化数量的各重组杆状病毒加入到细胞内。孵育温度为27.5℃并且合适的感染期对于独立的蛋白表达是标准化的。通过离心收集该细胞并将其用于重组蛋白的纯化。细胞中未使用的部分可以快速冷冻在液氮中并贮存在-70℃。 
嵌合抗原，优选地，在变性条件下纯化。表达嵌合抗原的细胞在变性缓冲剂(如包含6M胍盐-HCl的缓冲剂)作用下溶解。可以通过机械方法(如超声处理)增加溶解。将溶解产物离心以清除未破碎的细胞和细胞碎屑。随后将上清液加载在用溶解缓冲剂预先平衡的Ni-NTA Super Flow(Qiagen)玻珠柱(bead column)上。加载后，用缓冲的变性溶液(优选包含pH约为8的6M胍盐-HCl)冲洗该柱。在这点上该变性剂可以在缓冲溶液中交换为如8M脲。溶解、加载和冲洗缓冲液优选包含低浓度(如1-40mM)的咪唑。缓冲液交换后，该柱应当用缓冲液冲洗直到OD280降至例如＜0.1。可以用包含8M脲以及250mM咪唑，pH为8的缓冲剂(洗提缓冲剂)洗提结合的蛋白质。包含该蛋白质的片段被集中起来并在4℃相对于复合变化的低(如100mM)盐变性透析缓冲剂(优选包含8M脲)进行透析。透析的蛋白质随后被加载到离子交换柱(如DEAE(二乙氨乙基))上。在优选的实施例中，在加载到离子交换柱之前，二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂被加入到该蛋白中。该嵌合抗原将通过DEAE柱。随后，收集DEAE流过物并将其相对于包含浓度降低的变性剂的缓冲液逐步透析。在示例性的方法中，随后将该蛋白相对于缓冲的4M脲透析至少12小时，随后相对缓冲的2M脲透析至少12小时，随后相对缓冲的1M脲透析至少12小时，随 后相对缓冲的0.5M脲透析至少12小时，最后相对不包含变性剂的缓冲液透析至少12小时，优选地，随后相对不包含变性剂的新鲜的缓冲液另外透析两个12小时。可以纯化的、重新折叠的蛋白并利用标准生物化学技术(包括如，SDS凝胶电泳、等电聚焦、或蛋白质印记分析)通过针对该表达的蛋白的不同结构域的抗体描绘其特征。 
除非另外指明，本发明的实施将采用本领域内分子生物学、微生物学、重组DNA、以及免疫学的常用技术。这类技术在文献中有充分的说明，参见，如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.，New York：Cold Spring Harbor Press，1989；以及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience Publishers，( 1995，as Supplemented April 2004，Supplement 66)。 
F.新颖的多聚核苷酸 
本发明的另一方面提供了编码嵌合抗原的多聚核苷酸，该多聚核苷酸包括编码免疫应答结构域的第一多聚核苷酸部(分)和编码目标结合结构域的第二多聚核苷酸部(分)。给第一和第二多聚核苷酸部可以位于相同或不同的核苷酸链上。 
本发明提供了与编码嵌合抗原、mRNA、和/或编码序列相应或互补的多聚核苷酸(优选以独立的形式)，该多聚核苷酸包括编码嵌合抗原变异蛋白(variant protein)的多聚核苷酸；DNA、RNA、DNA/RNA杂合体、以及相关分子；与编码嵌合抗原的基因或mRNA序列或其部分互补或具有至少90％的同源性的多聚核苷酸或寡核苷酸；以及与编码嵌合抗原、mRNA的基因或与编码嵌合抗原的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸或寡核苷酸。 
另外，本发明包括编码本文特别公开的嵌合抗原的基因的类似物。类似物包括，如，突变体，该突变体保持引发免疫应答的能力，并且优选地与编码嵌合抗原的任何多聚核苷酸具有至少80％、更优选90％，最优选95％的同源性，该编码嵌合抗原的多聚核苷酸如SEQ ID Nos：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、以及48所特别描述。通常，这样的类似物仅有1到15个密码子的差异。实例包括这样的多肽，其与病毒抗原或抗体片段的天然氨基酸序列相比具有较小的氨基酸变化，尤其是保守的氨基酸置换。保守的置换是指那些侧链相关的氨基酸家族内发生的置换。基因编码的氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电的极性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被一起分为芳香族氨基酸。例如，这样的预期是合理的，即亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸的单独置换、天冬氨酸被谷氨酸的单独置换、苏氨酸被丝氨酸单独置换、或氨基酸被结构相关的氨基酸的类似的保守置换将不会对生物活性产生较大的影响。具有与SEQ ID Nos：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中任何一个披露的任何多肽基本上相同的氨基酸序列但具有较小的氨基酸取代(其基本上不影响嵌合抗原引发免疫应答的能力)的多肽分子，是在分别具有SEQ ID Nos：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49所述的序列的嵌合抗原的定义范围内。衍生物包括与其它嵌合抗原分子的聚集接合体和与不相关的化学部分的共价接合体。共价衍生物通过本领域已知的方法通过将官能度连接到嵌合抗原氨基酸链内发现的基团或在N-末端或C-末端的残基基团来制备。 
表1中提供了氨基酸的缩写。 
表1：氨基酸的缩写 
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酸   Glu   E
  谷胺酰胺   Gln   Q
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   Ile   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  蛋氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
保守的氨基酸取代可以在蛋白质内进行而不改变该蛋白质的构象或功能。本发明的蛋白质可以包括1至15的保守的取代。这样的改变包括：将异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、和亮氨酸(L)中的任何一种取代为这些疏水性氨基酸的任何其它一种；将天冬氨酸(D)取代为谷氨酸(E)，反之亦然；将谷氨酰胺(Q)取代为天冬酰胺(N)，反之亦然；以及将将丝氨酸(S)取代为苏氨酸(T)，反之亦然。其它的取代也被认为是保守的取代，取决于特定的氨基酸的环境和它在蛋白质的三维空间结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可以如此。相对疏水的蛋氨酸(M)经常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时可以与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)通常在一定的位置可以互换，在该位置该氨基酸残基的重要特征是它的电荷，而 这两个氨基酸残基的不同pK是不重要的。还有其它的交换在特定环境中可以认为是“保守的”(参见，如，Biochemistry 4th Ed.，LubertStryer ed.(W.H.Freeman and Co.)，pages 18-23；Henikoff andHenikoff，Proc Nat’l Acad Sci USA 89：10915-10919(1992)；Lei etal.，J Biol Chem 270(20)：11882-6(1995))。 
本发明还提供了优选在严格的条件下，与编码嵌合抗原的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸，该编码嵌合抗原的多聚核苷酸如SEQ IDNOs：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、和48所具体描述。杂交反应的严格条件易于由本领域的普通技术人员所决定并且通常根据探针的长度、冲洗温度、以及盐浓度凭经验来考虑。通常较长的探针需要较高的温度用于正确的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于它们的熔融温度的环境中时，杂交通常依赖于变性的核酸序列再次退火的能力。探针和杂交序列之间所希望的同源性的程度越高，所使用的相对温度就越高。因此，随之而来的是较高的相对温度将会导致该反应条件更严格，而较低的温度将会导致该反应条件更宽松。杂交反应的严格条件的更多细节和描述参见，例如Ausubel et al.，supra，at pages 2.9.1-2.10.8和4.9.1-4.9.13。 
这里所限定的“严格的条件”或“高度严格的条件”指的是但不限于那些条件：(1)采用低离子强度和高温用于冲洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH 6.5的磷酸钠缓冲液与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)采用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt′s溶液、声波处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、以及10％硫酸葡聚糖，42℃，以及在42℃在0.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中冲洗和在55℃ 50％甲酰胺中冲洗，随后用包含EDTA的0.1X SSC在55℃进行高度严格的冲洗。“中等严格的条件”是指(但不限于)Sambrook etal.supra中的那些条件，并且包括利用比上述条件严格度低的冲洗溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格的条件的实例是指在特定溶液中37℃过夜孵育，该溶液包括：20％甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20mg/mL变性的剪切过的鲑鱼精子DNA，随后以约37-50℃ 1X SSC冲洗过滤物。本领域的技术人员可以认识到必要时如何调整温度、离子强度等以适应如探针长度之类的因素。 
编码嵌合抗原的多聚核苷酸的实施例包括：具有选自SEQ IDNOs：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中的任何一个序列的编码嵌合抗原的多聚核苷酸，或者选自SEQ IDNOs：26、28、30、32、34、36、38、40、42、46和48中任何一个的嵌合抗原的核苷酸序列，其中T可选地可以为U；例如，嵌合抗原的核苷酸的实例包括，但不限于： 
(a)包括或由下述序列组成的多聚核苷酸：SEQ ID NOs：SEQID NO：26的第1到1326个核苷酸、SEQ ID NO：28的第1到2004个核苷酸、SEQ ID NO：30的第1到1350个核苷酸、SEQ ID NO：32的第1到1293个核苷酸、SEQ ID NO：34的第1到1794个核苷酸、SEQ ID NO：36的第1到1581个核苷酸、SEQ ID NO：38的第1到1389个核苷酸、SEQ ID NO：40的第1到1347个核苷酸、SEQ ID NO：42的第1到2157个核苷酸、SEQ ID NO：44的第1到1395个核苷酸、SEQ ID NO：46的第1到1905个核苷酸、或者SEQ ID NO：48的第1到2484个核苷酸，其中T可以为U； 
(b)具有与SEQ ID NOs：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48所述的序列具有至少80％同源性的序列的多聚核苷酸； 
(c)编码嵌合抗原的多聚核苷酸，其序列由包含在下述质粒之一中的DNA编码，所述质粒指定为保藏在加拿大国际保藏机构(International Depository Authority of Canada)(加拿大卫生部微生物办公室(Bureau of Microbiology at Health Canada))中保藏登记号分别为080504-03、080504-04、080504-05、080504-02、080504-01的pFastBacHTa HBV S1/S2-TBD、pFastBacHTa HBV核心-TBD、pFastBacHTa HCV核心(1-177)-TBD、pFastBacHTa HCVNS5A-TBD、和pFastBacHTa HCV E2-TBD。 
(d)编码嵌合抗原的多聚核苷酸，该抗原序列为：SEQ ID NO：27的第1到442个氨基酸、SEQ ID NO：29的第1到668个氨基酸、SEQ ID NO：31的第1到450个氨基酸、SEQ ID NO：33的第1到431个氨基酸、SEQ ID NO：35的第1到598个氨基酸、SEQ ID NO：37的第1到527个氨基酸、SEQ ID NO：39的第1到463个氨基酸、SEQ ID NO：41的第1到449个氨基酸、SEQ ID NO：43的第1到719个氨基酸、SEQ ID NO：45的第1到465个氨基酸、SEQ ID NO：47的第1到635个氨基酸、或SEQ ID NO：49的第1到828个氨基酸。 
(e)编码嵌合抗原相关蛋白的多聚核苷酸，该蛋白与下述的整个氨基酸序列至少90％相同，该整个氨基酸序列为：SEQ ID NO：27的第1到442个氨基酸、SEQ ID NO：29的第1到668个氨基酸、SEQ ID NO：31的第1到450个氨基酸、SEQ ID NO：33的第1到431个氨基酸、SEQ ID NO：35的第1到598个氨基酸、SEQ ID NO：37的第1到527个氨基酸、SEQ ID NO：39的第1到463个氨基酸、SEQ ID NO：41的第1到449个氨基酸、SEQ ID NO：43的第1到 719个氨基酸、SEQ ID NO：45的第1到465个氨基酸、SEQ ID NO：47的第1到635个氨基酸、或SEQ ID NO：49的第1到828个氨基酸。 
(f)与(a)-(d)中任何一个的多聚核苷酸完全互补的多聚核苷酸；以及 
(g)在严格的条件下选择性地与(a)-(f)的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。 
本发明还提供了包含嵌合抗原多聚核苷酸的重组DNA或RNA分子，及其类似物或同源物，包括但不限于噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、以及本领域已知的各种病毒和非病毒载体，以及转化或转染有这种重组DNA或RNA分子的细胞。用于生成这类分子的方法是公知的(参见，例如，Sambrook et al.，1989，supra)。 
本发明还提供了在合适的原核或真核宿主细胞内的包括含有嵌合抗原多聚核苷酸的重组DNA分子的宿主-载体系统，及其类似物或同源物。合适的真核宿主细胞的实例包括：酵母细胞、植物细胞、或动物细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞(如，杆状病毒感染的细胞，如Sf9、Sf21、Drosophila S2或High FiveTM细胞)。合适的哺乳动物细胞的实例包括各种前列腺癌细胞系，如DU145和TsuPr1，其它可感染或可转换的前列腺癌细胞系、初级细胞(PrEC)、以及通常用于重组蛋白表达的大量哺乳动物细胞(如COS、CHO、293、293T细胞)。更具体地，包括该嵌合抗原的编码序列的多聚核苷酸或其片段、类似物或同源物可以利用本领域常规使用并且公知的任何数量的宿主-载体系统用于生成其嵌合抗原。 
适于其嵌合抗原表达的广泛范围的宿主-载体系统是可以获得的，参见例如，Sambrook et al.，1989，supra；Ausubel，supra，at pages1.0.1-1.16.16，9.01-9.17.3，以及13.4.1-13.6.5)。用于昆虫细胞表达的优选的载体包括但不限于pFastBac HTa(Invitrogen)。利用这样的表达载体，可以在多个昆虫细胞系(包括如Sf9、Sf21、DrosophilaS2、以及High Five)中表达嵌合抗原。可选地，优选的酵母表达系统包括：酿酒酵母、人体酵母菌探针、巴氏毕赤酵母、以及Pichiaaugust。本发明的宿主-载体系统用于生成嵌合抗原。 
可以通过转染有编码嵌合抗原的结构的细胞来生成嵌合抗原或其类似物或同源物。例如，Sf9细胞可以被编码嵌合抗原或其类似物或同源物的表达质粒转染，该嵌合抗原在Sf9细胞中表达，并利用标准的纯化方法分离该嵌合抗原。可以采用本领域公知的各种其它表达系统。编码加入嵌合抗原编码序列的框架中的前导肽的表达结构可以被用于分泌形式的嵌合抗原的生成。 
如本文所述，遗传密码的冗余允许嵌合抗原基因序列的变化。尤其是，本领域中已知特定的宿主种类通常具有特定的密码子偏好性，因此技术人员可以根据期望宿主的偏好性修改披露的序列。例如，优选的类似物密码子序列通常具有被较高频率的密码子置换的稀有密码子(即在所希望的宿主的已知序列中的使用频率小于约20％的密码子)。对于特定种类的密码子偏向可以通过例如，利用在互联网上(如在环球网URL www.kazusa.or.jp/codon)可以获得的密码子使用表来计算。 
已知另外的序列修饰可以提高细胞宿主种的蛋白表达。这些包括清除编码假性聚腺苷酸化信号、外显子/内含子剪接位点信号、转座子-类似的重复的序列，和/或对基因表达不利的其它这样的特征明显的序列。该序列的GC含量被调节为特定细胞宿主的平均水平，该水平参照宿主细胞中表达的已知基因来计算。其中可能的，该序 列被修饰以避免预期的发卡状二级mRNA结构。其它可用的修饰包括如在Kozak，Mol.Cell Biol.，9：5073-5080(1989)中所述的在开放阅读框的起始处的翻译起始共有序列的添加。本领域的技术人员可以理解这个通常规则，即真核生物核糖体专有地在5’端的AUG密码子处启动翻译，仅在极少情况下被取消(参见，如Kozak Proc Nat’lAcad Sci USA 92(7)：2662-2666(1995)以及Kozak Nucl Acids Res15(20)：8125-8148(1987))。 
G.本发明的药物组合物 
本发明的一方面涉及药物组合物，该组合物包括药学上可接受的赋形剂和包括免疫应答结构域和目标结合结构域的嵌合抗原，其中该目标结合结构域包括抗体片段。在治疗的应用中，该药物组合物可以以一定的数量施用给患者，该数量足以引起针对抗原的有效的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或辅助T淋巴细胞(Th)的应答并阻止感染或者足以治疗或至少部分地抑制或缓解疾病或病症的症状和/或并发症。用于这种用途的有效的数量将依赖于例如所施用的特定组合物、给药方式、要治疗的疾病的阶段和严重性、目标对象的体重和总的健康状态、以及开处方的医师的判断。 
初始治疗性免疫(用嵌合抗原)的剂量通常在单位剂量范围内，其中较低值为约1，5，50，500，或1,000ng，而较高值为约10,000μg；20,000μg；30,000μg；或50,000μg。用于人类的剂量值通常为每70公斤体重的目标对象施用约500ng到约50,000μg。根据持续数周到数月的递增用法，施用的嵌合抗原的递增剂量从约1.0ng到约50,000μg，这取决于该目标对象的反应和疾病。施用应该持续进行直到至少临床症状或实验室检测表明该疾病已被预防、抑制、缓解或消除并且在其后的期间也是如此。可以根据本领域已知的方法学调整剂量、施用途径、以及剂量日程表。 
人类单位剂量形式的嵌合抗原通常包括在药物组合物中，该药物组合物包括可接受的载体(在一个实施例中为含水载体)的人类单位剂量并且以本领域技术人员已知的体积/数量施用以便用于将这类多肽施用于人类(参见，例如，Remington：The science andPractice of Pharmacy，20th Edition，A.Gennaro，Editor，LippincottWilliams & Wilkins，Baltimoe，Md.，2000)。如本领域的技术人员所明了的，各种因素可以影响具体情况下的理想剂量。这样的因素包括，例如，嵌合抗原的半衰期、该嵌合抗原的结合亲和力、该组合物的免疫原性、所希望的稳态的浓度水平、施用途径、治疗频率、与本发明的治疗方法联用的其它物质的影响，以及特定目标对象的健康状态。 
在一些实施例中，本发明的组合物用在严重的疾病状态中，即，威胁生命或潜在威胁生命的状况。在这种情况下，由于本发明的优选的组合物的嵌合抗原的相对非毒性，施用比这些所述的剂量超过很多的嵌合抗原是可能的并且被治疗医师认为是理想的。 
在药物配方中本发明的嵌合抗原的浓度可以广泛的变化，即，从少于按重量的约0.1％、通常在或至少约2％至多达20％到50％或更多，并且将根据所选的具体施用方式主要按照流体容积、粘度等选择。 
该药物组合物可以通过本领域已知的任何途径递送，例如肠胃外、鞘内、血管内、静脉内、肌肉内、经皮、真皮内、皮下、鼻内、局部、经口、直肠、阴道、肺、腹膜内途径递送。优选地，该组合物通过肠胃外途径递送，例如皮下或真皮内给药。 
该药物组合物可以通过将所想要的嵌合抗原与合适的适于所希望的给药途径的赋形剂混合来制备。在本发明的药物组合物的制备中，通常将该嵌合抗原与赋形剂混合、通过赋形剂稀释或封装在 载体内，该载体的形式可以为胶囊、小袋、纸或其它容器。当药学上可接受的赋形剂作为稀释剂时，它可以为固态、半固态、或液态物质，其作为治疗剂的赋形剂、载体、或介质。因此，该组合物的形式可以为：片剂、丸剂、粉剂、锭剂、袋剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或者在液态介质中)、包含如达到按重量10％的嵌合抗原的软膏剂、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌注射液、以及无菌包装粉。 
合适的赋形剂的一些实例包括，但不限于，右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、以及甲基纤维素。该配方可以另外包括：润滑剂，如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，如甲基苯甲酸酯和羟丙基苯甲酸酯；甜味剂；以及芳香剂。本发明的组合物可以这样配方以便在采用本领域已知的方法将该嵌合抗原施加给目标对象后提供该嵌合抗原的速释、持续释放或延迟释放。(参见，如，Remington，supra，at pages 903-92 and pages 1015-1050)。 
为了制备固态组合物(如片剂)，将该嵌合抗原与药物赋形剂混合以形成包含本发明的嵌合抗原的均匀混合物的固态预制剂组合物。当说到这些预制剂组合物是均匀的时，意味着该嵌合抗原在整个组合物中被均匀分散以便该组合物可以容易地再分入同等有效的单位剂量形式中，如片剂、丸剂和胶囊。 
本发明的片剂或丸剂可以被涂覆或以其他形式复合以提供具有延长作用的优点的剂量形式。例如，该片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量成分，后者以前者的外壳形式存在。这两种成分可以被肠层(enteric layer)分离，该层起到防止在胃中崩解的作用并且允许内部成分完好地进入十二指肠或延迟释放。多种物质可以用于这 种肠层或包衣，这种物质包括大量聚合酸和聚合酸与这类物质(如虫胶、鲸蜡醇以及醋酸纤维素)的混合物。 
本发明的新颖组合物可以被并入液体形式，用于经口腔或经注射施加，该液态形式包括含水溶液、适合口味的糖浆、含水或油的混悬液、以及用食用油(如玉米油、棉花籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)调味的乳剂、以及酏剂和类似的药物赋形剂。 
在制备用于肠胃外施用的组合物的过程中，要严格注意必需进行张力调整以便减少刺激。可复水的组合物是以干燥形式包装的无菌固体。可复水的组合物是优选的，原因是它作为干燥固体贮存时比在准备用于直接施用的液体中更稳定。该干燥固体通常封装在用丁基橡胶闭合的无菌容器内以确保该固体以最佳的湿度范围保存。通过干燥填充、喷雾干燥、或冷冻-干燥方法形成可复水的干燥固体。这些方法的描述可以在如Remington，supra，at pages 681-685 and802-803中找到。 
用于肠胃外注射的组合物通常被稀释，并且以较高比例存在的成分是赋形剂。该赋形剂通常无治疗活性并且无毒，但是以适合吸收的形式将嵌合抗原递送给机体组织。当该嵌合抗原作为水溶液被递送时吸收通常最快速和完全。然而，具有可与水混溶的液体的赋形剂改变为或取代为具有不与水混溶的液体的赋形剂可以影响吸收率。优选地，用于该组合物的最大值的赋形剂为等渗盐水。在制备适于注射的该组合物的过程中，人们可以使用含水的赋形剂、与水混溶的赋形剂、以及不含水的赋形剂。 
另外的物质可以包含在本发明的可注射的组合物中，以便提高或保证该组合物的质量。因此，添加的物质可以影响溶解度、为目标对象提供舒适感、提高化学稳定性或者防止制剂中微生物的生长。因此，该组合物可以包括合适的增溶剂、起着抗氧化剂作用的 物质、以及起着防腐剂作用以防止微生物生长的物质。这些物质可以以适于它们的功能的数量存在，但是不会不利地影响该组合物的作用。合适的抗微生物剂的实例包括：硫柳汞、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、以及对羟基苯甲酸丙酯。合适的抗氧化剂可以在Remington，supra，at p.1015-1017中找到。 
在某些实施例中，脂质体、毫微囊剂、微粒、脂质颗粒、囊泡及类似物可以用于本发明的嵌合抗原的施用。尤其是，本发明的组合物可以被配置用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、或毫微粒或类似物中递送。可选地，本发明的组合物可以共价地或非共价地连接到这样的运载赋形剂的表面。 
通过脂质体施加的组合物还可以用来：1)将嵌合抗原靶向特定的组织，如淋巴组织；2)将嵌合抗原选择性地靶向抗原呈递细胞；或3)提高肽组合物的半衰期。脂质体包括：乳状液、泡沫、胶团、不溶单层、液晶、磷脂分散体、片层和类似物。在这些制剂中，要被递送的嵌合抗原作为脂质体的成分，单独地或与结合到淋巴细胞中占优势的(prevalent)受体上的分子(例如结合到CD45抗原上的单克隆抗体)或与其它治疗性或免疫原性组分联合并入。因此，被本发明的所期望的嵌合抗原填充或修饰的脂质体可以直接到达淋巴细胞的位点，随后在该处脂质体递送嵌合抗原。根据本发明所用的脂质体形成于标准的囊泡形成脂质，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。脂质的选择通常要考虑如，脂质体的大小、血流中脂质体的酸不稳定性和稳定性。多种方法可以用于制备脂质体，如Szoka，et al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467-508(1980)以及美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、第5,019,369号中所描述的。包含嵌合抗原的脂质体混悬液可以以一定剂量静脉内、局部地等方式施用，其中该剂量根据施用方式、被递送的嵌合抗原、以及被治疗的疾病的阶段等改变。 
用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的含水或有机溶剂的溶液和混悬液或其混合物及粉末。该液态或固态组合物可以包含合适的如本文所述的药学上可接受的赋形剂。可以经口或经鼻吸入途径施加该组合物用于局部或全身作用。药物上可接受的溶剂中的组合物可以借助惰性气体雾化。雾化的溶液可以直接从雾化装置吸入或者该雾化装置可以连接到面罩支管上或间歇正压呼吸机上。溶液、混悬液、或粉末组合物可以从以合适方式递送该制剂的装置中优选地经口或经鼻施加。 
本发明的方法中所用的另一配方采用经皮递送装置(“块状物(patches)”)。这样的经皮块状物可以用于以可控的数量提供本发明的嵌合抗原的连续或不连续的注入。用于递送药物制剂的经皮块状物的组成和使用在本领域是公知的。参见，例如，以引用方式结合于本文的美国专利第5,023,252号。这样的块状物可以被构造用于药物制剂的持续的、脉动的、或根据需要的递送。 
此外，除了包括嵌合抗原和药物赋形剂外还包括至少一种抗病毒治疗药或化学治疗药可能是有利的。抗病毒治疗药包括，但不限于，仿多肽类药物(peptidomimetics)(如安普那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦以及沙奎那韦)、多聚核苷酸(如阿普林津(ampligen)和福米韦生)、嘌呤/嘧啶酮(pyrimidinones)(例如阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、西多福韦、阿糖胞苷、地达诺新、双脱氧阿糖腺苷、阿德福韦酯(dipivoxil)、依度尿苷、恩曲他滨、恩替卡韦、法昔洛韦、更昔洛韦、碘苷、异丙肌苷、拉米夫定、MADU、戊昔洛韦、索利夫定、司他夫定、替诺福韦、三氟尿苷、伐昔洛韦、瓦更昔洛韦、阿糖腺苷、扎西胞苷以及齐多夫定)、唾液酸类似物(如奥塞米韦和扎那米韦)、乙酰吗喃、乙酰亮氨酸单乙醇胺、金刚烷胺、胺地洛霉素、阿的维定、capravirine、地拉韦定、正二十二烷醇、依非韦伦、膦甲酸钠、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、凯托沙、溶菌酶、甲吲噻腙、吗啉胍、奈韦拉平、pentafuside、 普可那利、普达非伦毒素、利巴韦林、金刚乙胺、司他霉素、匐枝青霉素、termacamra、以及traomantadine。其它合适的抗病毒剂描述在Remington：supra，at Chapter 87：Anti-Infectives，pp.1507-1561，尤其是pp.1555-1560中。用于包含在本发明的药物组合物中的优选的抗病毒治疗药包括：阿德福韦、阿德福韦酯、恩替卡韦、拉米夫定以及利巴韦林。 
在一些实施例中希望在本发明的药物组合物中包括至少一种引发B淋巴细胞或T淋巴细胞的组分。脂质被认为是能在体内引发CTL的物质。例如，棕榈酸残基可以被连接到赖氨酸残基的ε-氨基和α-氨基上，随后可例如通过一个或多个连接残基(如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser、或类似物)被连接到免疫原性肽上。随后可以施加脂质化的肽，该肽可以在微团或微粒内直接施加、或者并入脂质体内施加、或者在佐剂(如不完全的弗氏佐剂)中乳化施加。在优选的实施例中，特别有效的免疫原性组合物包括连接到赖氨酸的ε-氨基和α-氨基上的棕榈酸，其通过键合(如Ser-Ser)连接到免疫原性肽的氨基端。 
作为引发CTL应答的脂质的另一实施例，大肠杆菌脂蛋白(如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)在共价连接到合适的肽上时可以用于引发病毒特异性CTL(参见，如，Deres，et al.，Nature 342：561(1989))。本发明的嵌合抗原可以被连接到，例如，P3CSS上，并且脂肽被施用给个体以特异性地引发针对目标抗原的免疫应答。 
虽然本发明的组合物不应当需要利用佐剂，但是佐剂是可以利用的。各种佐剂可以用于增强免疫应答，这依赖于宿主种类，而佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、清洁剂、复合多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝素、二硝基酚)免疫刺激性多核苷 酸序列、以及潜在有效的人类佐剂(如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌)。其它的佐剂在本领域也是公知的。 
H.制品 
本发明的另一方面提供了一种制品，该制品包括容纳含嵌合抗原的组合物的容器，其适于注射或重新构成用于注射，结合有打印的标记指示，该打印的标记指示提供怎样在肠胃外(如皮下、肌内、真皮内、经鼻或静脉内)施用该组合物的说明。该组合物将被容纳在任何合适的容器内，该容器不会与组合物起显著的相互作用，并且被贴上合适的标签，该标签说明了该组合物用于肠胃外使用。与该容器相关的标记指示将与上文所述的治疗方法一致。容纳本发明的组合物的容器可以是具有适于注射的液态组合物的容器，该容器具有合适的注射针和注射器以便患者、医生、护士、或其它实施者能够施用嵌合抗原。可选地，该组合物可以为包含可溶形式的嵌合抗原的干燥或浓缩的组合物，该嵌合抗原与含水或不含水的媒介物结合或者被含水或不含水的媒介物稀释，以便溶解或悬浮该组合物。可选地，该容器可以具有液体中的悬浮液或者可以是与媒介物结合的不可溶形式的盐，在媒介物中不可溶形式的盐可以被悬浮。在Remington，supra，pages 788-789，805，850-851 and 1005-1014中论述了合适的容器。 
本发明的试剂盒通常包括上述容器和一个或多个包括从商业和使用者立场上所希望的材料(包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、注射针、注射器、以及具有使用说明的包装插入物)的其它容器。该容器上可以有标签来指示该组合物用于特定治疗或非治疗性应用，并且还可以指示用于体内或体外应用(如上所述的那些)的使用说明。使用说明和/或其它信息也可以包括在该试剂盒内的插入物上。 
V.实施例 
下面的非限制性实施例提供了对本发明的进一步说明。 
A.实施例1：TBD表达载体的构建 
编码CH1-铰链-CH2-CH3区部分的氨基酸的鼠IgG1 DNA序列由分离自杂交瘤(2C12)的mRNA产生，其生成针对HBV表面抗原(sAg)的mAb。利用Trizol 试剂(Gibco BRL cat.No.15596-026)分离全部mRNA并且利用Superscript First-strand Synthesis(Invitrogen Cat.No.11904-018)通过反转录-PCR(RT-PCR)生成目标结合结构域(TBD；鼠免疫球蛋白片段)的cDNA。PCR引物包含编码连接肽的连接序列-5’端的SRPQGGGS-(SEQ ID NO：1)，5’端独特的Not I位点和3’端独特的Hint III限制位点。生成的cDNA包含(5’NotI)-连接序列-CH1(VDKKI)(SEQ ID NO：2).-铰链区-CH2-CH3-(3’Hind III)。在相应的酶消化之后，利用相同的限制性酶切位点，该片段与pFastBac HTa表达载体质粒(Invitrogen))连接。用于PCR扩增的5’端引物是(有义)5’TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG(SEQ ID NO：3)并且3’端引物是(反义)5’ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG(SEQID NO：4)，其分别包含了Not I和Hind III位点。随后是用于定向克隆的方案。产生的片段被相应的酶消化，在琼脂糖凝胶上被纯化并被克隆进入载体质粒。DNA序列和ORF的正确性通过标准的测序方法验证。 
编码目标结合结构域的DNA的克隆进入pFastBac HTa供体质粒后，利用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统(Invitrogen)表达重组蛋白。克隆的基因通过在大肠杆菌菌株DH10Bac中的位点特异性转位被转入杆粒。DH10Bac细胞包含了该穿梭载体，其赋予卡那霉 素抗性和辅助质粒，该辅助质粒编码转座酶并赋予四环素抗性。100μl合适的DH10Bac细胞的等分试样在冰上融化，基于pFastBacHTa的质粒被加入，并且混合物在冰上孵育30分钟。将该混合物在42℃热击45秒，然后在冰上冷却2分钟。随后将该混合物加入到900μl LB培养基中并在37℃孵育4小时。将转化的细胞连续地用LB稀释到10-1和10-2，并且将每个稀释液100μl置于LB琼脂板上(该琼脂板添加有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml的四环素、100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG)并且在37℃孵育至少36小时。由pFastBac HTa、X-gal和IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)给予的庆大霉素抗性被用于区分白色菌落(重组质粒)和蓝色菌落(非重组质粒)。挑出白色菌落并将其接种于2ml LB培养基中(该培养基添加有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素)并在37℃振荡孵育一整夜。用无菌环取少量的过夜培养物的试样并且将该试样划线接种在新鲜的LB琼脂板上(该琼脂板添加有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml的四环素，100μg/ml X-gal以及40μg/ml IPTG)并在37℃孵育至少36小时以便确认白色表现型。通过标准方法(Sambrook，supra)分离重组的杆粒，DNA样品被溶解在40μl TE(10mM Tris-HCL pH8，1mM EDTA)中，并用于转染。 
为了生成杆状病毒，将杆粒转染到Sf9昆虫细胞中。将Sf9细胞(9×105)接种在2ml ESF921(表达体系)中的6孔细胞培养皿(35mm孔)的每个孔中，并且能够在27℃附着至少1小时。利用 试剂(Invitrogen，Cat.No.10362-010)按照由Sf9细胞的供应者提供的方案进行转染。转染后，将细胞在27℃孵育72小时。收集包含杆状病毒的培养基并将其在4℃下避光(在黑暗中)贮存。 
通过检测杆状病毒DNA的生成来证实转染的效率。将分离出的杆状病毒DNA进行PCR以筛选编码TBD的插入基因。所用的 引物为(有义)5’TATTCCGGATTATTCATACCG(SEQ ID NO：5)和3’(反义)5’CTCTACAAATGTGGTATGGC(SEQ ID NO：6)。扩增的产物在琼脂糖凝胶(0.8％)上跑胶。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和利用6xHis标记的单克隆抗体(克隆技术)作为探针的蛋白质印迹来证实细胞中异源蛋白的表达。 
一旦杆状病毒的生成和蛋白的表达被证实，就扩增病毒的生成以产生携带编码目标结合结构域的基因的杆状病毒的浓缩的原种。将杆状病毒扩增至少两倍是本领域中的标准做法，并且在本文所述的全部方案中都坚持了该标准做法。在扩增的第二循环之后，根据试剂盒(Invitrogen)制造者所述的方案利用噬菌斑测定可将生成的杆状病毒的浓度定量。同时还确立了病毒感染High Five细胞的最适浓度和所希望的蛋白生成的最佳时间点。通常，对于TBD的表达采用MOI 1和48小时的时间段。 
B.实施例2：嵌合抗原表达载体的构建 
编码所希望的病毒抗原的DNA利用PCR方法利用表2中5’有义和3’反义引物从模板生成。得到的扩增片段的5’端包含独特的限制位点“5’酶”，以及3’端包含独特的限制位点“3’酶”，以上每个位点都用于连接。 
表2：嵌合抗原载体的构建 
  病毒抗原   有义引物   反义引物   模板   5’酶   3’酶
  HBV S1/S2   SEQ ID NO：7   SEQ ID NO：8   pRSET BHV S1/S2   Bam HI   Not I
  HBV S1/S2/S   SEQ ID NO：9   SEQ ID NO：10   pAlt HBV 991   Nco I   Not I
  HBV核心   SEQ ID NO：11   SEQ ID NO：12   pAlt HBV 991   Nco I   Not I
  DHBV PreS/S   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：13   pFastBac Hta PreS/S   Eco RI   Not I
  DHBV PreS   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：14   pFastBac HTa PreS/S   Eco RI   Not I
  DHBV核心   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：16   pRSETB DHBV核心   Nco I   Not I
  HCV核心(1-191)   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：18   pCV-H77c   Eco RI   Spe I
  HCV核心(1-177)   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：19   pCV-H77c   Eco RI   Spe I
  HCV NS5A   SEQ ID NO：20   SEQ ID NO：21   pCV-H77c   Eco RI   Spe I
  HCV E1   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：23   pCV-H77c   Eco RI   Spe I
  HCV E2   SEQ ID NO：24   SEQ ID NO：25   pCV-H77c   Eco RI   Spe I
  HCV E1/E2   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：25   pCV-H77c   Eco RI   Spe I
将扩增的DNA用合适的5’和3’限制酶消化，并且与pFastBacHTa表达载体连接，以产生仅用于病毒抗原的表达质粒。同样的DNA片段也与质粒pFastBac HTa-TBD连接，如实施例1所述，随后用相应的酶消化以产生用于与目标结合结构域融合的病毒抗原的表达质粒。得到的质粒用于产生重组杆状病毒，如实施例1所述，该重组杆状病毒用于随后在嵌合抗原表达中的使用。该嵌合抗原的DNA和氨基酸序列如表3所示。 
表3：嵌合抗原的序列 
  构建   DNA序列   表达的蛋白
  HBV S1/S2-TBD   SEQ ID NO：26   SEQ ID NO：27
  HBV S1/S2/S-TBD   SEQ ID NO：28   SEQ ID NO：29
  HBV核心-TBD   SEQ ID NO：30   SEQ ID NO：31
  DHBV PreS-TBD   SEQ ID NO：32   SEQ ID NO：33
  DHBV PreS/S-TBD   SEQ ID NO：34   SEQ ID NO：35
  DHBV核心-TBD   SEQ ID NO：36   SEQ ID NO：37
  HCV核心(1-191)-TBD   SEQ ID NO：38   SEQ ID NO：39
  HCV核心(1-177)-TBD   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41
  HCV NS5A-TBD   SEQ ID NO：42   SEQ ID NO：43
  HCV E1-TBD   SEQ ID NO：44   SEQ ID NO：45
  HCV E2-TBD   SEQ ID NO：46   SEQ ID NO：47
  HCV E1/E2-TBD   SEQ ID NO：48   SEQ ID NO：49
[0161] C.实施例3：TBD、病毒抗原和嵌合抗原的表达和纯化 
标准化的感染复数(MOI)的重组杆粒被用于感染High FiveTM 昆虫细胞。为了悬浮培养，将细胞以3×105个细胞/mL的密度接种并且在27.5℃以138rpm振荡孵育直到细胞密度达到2-3×106个细胞/mL。将标准量的相应的重组杆状病毒加入到细胞中。孵育温度为27.5℃，并且合适的感染期被标准化以用于单个的蛋白表达。通过在4℃，2500rpm离心10分钟来收集细胞并且将其用于重组蛋白的纯化。将细胞中未使用的部分迅速冷冻在液氮中并贮存在-70℃。 
在变性条件下纯化重组蛋白。将该细胞在缓冲液(裂解缓冲液)(在100mM磷酸二氢钠，10mM Tris，300mM氯化钠，10mM咪唑中包含6M胍盐-HC1(guanidinium-HCl，盐酸胍)，pH值8.0)中裂解。将悬浮液在60瓦的功率设置下在冰上以5个脉冲(每个脉冲1分钟)超声，随后在室温下持续混合1小时。将裂解液以10,000×g离心10分钟，以去除未破裂的细胞和细胞残渣。将上清液加载到Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)玻珠柱上(1×5cm/100mL细胞裂解液)，用裂解缓冲液预平衡。加载后，用20柱体积6M胍盐-HCl(在100mM NaH2PO4、10mM Tris、300mM NaCl、40mM咪唑中，pH8.0)(冲洗缓冲液1)冲洗该柱，随后用20柱体积的8M脲(在100mMNaH2PO4、10mM Tris、300mM NaCl、40mM咪唑中，pH8.0)(冲洗缓冲液2)冲洗该柱。用包含8M脲、100mM NaH2PO4、10mM Tris、300mM NaCl、250mM咪唑、pH8的缓冲液(洗脱缓冲液)洗脱该结合蛋白质。将包含该蛋白的片段聚集并在4℃相对透析缓冲液(10mM NaH2PO4、300mM NaCl)的多个变化透析。利用标准的生化技术来描述纯化蛋白的特征，该技术包括SDS凝胶电泳、等电聚焦、以及利用针对表达的蛋白的不同结构域的抗原的蛋白印记分析。 
D.实施例4：利用嵌合抗原融合蛋白破坏对“自我”蛋白的耐受性 
为了评估对嵌合抗原融合蛋白的免疫应答，用纯化的HBVS1/S2、TBD或S1/S2-TBD蛋白使小鼠产生免疫，量化针对各个蛋白产生的抗体。在与各自的蛋白的刺激之后，收集自免疫的小鼠的脾T细胞的增殖被评估。 
年龄为15周的BALB/c小鼠用于免疫。以两周的间隔用S1/S2-TBD(4.15μg)、S1/S2(4.15μg)或TBD(4.15μg)皮下注射小鼠四次。在开始免疫前和每次免疫之后一周收集血样。从凝结的血样中制备血清并且将该血清用于估计由宿主动物产生的针对注射的各个抗原的抗体的水平。 
1.用于检测针对HBV S1/S2、TBD或S1/S2-TBD的抗体的ELISA 
以1.0μg/mL浓度的抗原HBV S1/S2、TBD或S1/S2-TBD涂覆96孔板并在4℃过夜。用包含2％BSA的PBS冲洗该板。来自各个动物的稀释的血清以不同的稀释比例(1∶10-1∶500)被加入到每个孔中并在37℃温育1小时。用包含0.05％吐温20的PBS(冲洗缓冲液)冲洗该板。将山羊抗鼠IgG Fab-辣根过氧化物酶(HRP)(1∶5000)稀释液加入到该孔中并在37℃温育1小时。用冲洗缓冲液冲洗该板并且利用2-2’连氮基-二(3-乙基苯甲基噻唑啉-6-磺酸酯)(KPL，Guildford，UK)显色。利用ELISA板读出器(MolecularDevices，USA)在405nm波长测量样品中所产生的颜色的光密度。用于该实验的阴性对照是来自同一动物的预先免疫的血清，其从所有的实验值中减去。用HBV S1/S2-TBD使小鼠产生免疫的结果如表4所示。嵌合抗原引发了针对嵌合抗原(S1/S2-TBD)的强烈的抗体应答。 
表4：针对S1/S2-TBD的体液应答 
Figure S04822747120060220D000441
这里所述的抗体应答具有多价(或多表位)的性质。表4中所示的结果表明用HBV S1/S2-TBD免疫小鼠产生的抗体结合到该板上涂覆的嵌合抗原和S1/S2蛋白靶上。因此，产生了针对嵌合抗原的S1/S2组分的抗体。同样地，由HBV S1/S2-TBD免疫小鼠产生的抗体结合到目标结合结构域蛋白上(表4)。包含鼠源性的蛋白的嵌合抗原可以在鼠中产生体液免疫应答，表明该嵌合抗原可以将“自我”抗原转变为“外来”抗原。因此，可以破坏对作为“自我”蛋白处理的蛋白的耐受性。 
2.T细胞增殖实验 
在第四次免疫后一周将动物处死，摘除脾，以及产生单独的细胞悬浮液。将细胞以4×105细胞/孔的细胞密度接种在96孔板中，一式三份。它们被分别加载0.1μg/mL HBV S1/S2、1.0μg/mL TBD或10μg/mL S1/S2-TBD抗原。阴性对照(negative control)细胞仅接受培养基而用于T细胞增殖的阳性对照为1.0-5.0μg/mL的植物凝集素(PHA)。在7％CO2的气氛中，将该细胞培养物在37℃温育四天。将每个孔的细胞用1.0mCi的3[H]-胸腺嘧啶核苷脉冲并另外培育18小时，利用TOMTEC MACH 3细胞收集器(Hamden，CT，USA)收集该细胞，并且利用Wallac Trilux 1450Microbeta液体闪烁和发光计数仪(Wallac，USA)将结合到玻璃纤维滤器(Wallac Oy，Turku，Finland)上的放射性活度定量。结果如表5所示。 
表5：针对HBV S1/S2-TBD的细胞应答 
Figure S04822747120060220D000451
当用HBV S1/S2-TBD，S1/S2或TBD刺激时观察到T细胞增殖。用嵌合抗原产生的免疫导致多价的T细胞应答，即，针对相同蛋白的不同部位的应答。包含鼠源性蛋白的嵌合抗原可以在鼠中产生细胞免疫应答，表明该嵌合抗原可以将“自我”抗原转变为“外来”抗原。因此，可以破坏对作为“自我”蛋白处理的蛋白的耐受性。 
E.实施例5：抗原呈递实验 
利用体外抗原呈递实验来测量HBV S1/S2-TBD引发免疫应答的能力。在用抗原加载的抗原呈递细胞(APC)(如树突细胞(DC))多次刺激原始T细胞之后有效T细胞应答的产生通过计数(量化)抗原特异性T细胞数量的增长以及T细胞产生Th1细胞因子IFN-γ的能力来估算。 
1.通过粘附选择单核细胞 
通过添加AIM-V融解外周血单核细胞(PBMC)(比率为9mlAIM-V添加到1ml冷冻细胞中)。随后将该细胞以200×g离心5分钟，去除上清液，然后将该细胞再次悬浮在AIM-V/1％相配的血清(matched serum)中并将其加入到100ml培养皿或T-25培养瓶中。在37℃7％的CO2下，在潮湿的培养箱中将PBMC温育1小时。为了去除未粘附的细胞，将该培养物研磨数次，弃去上清液，并且用AIM-V培养基将该细胞冲洗一次。用细胞刮器收集单核细 胞并以300×g离心5分钟。将细胞沉淀以2×106细胞/ml重新悬浮在AIM-V/2.5％相配的血清中，并接种在24孔皿中。将细胞因子IL-4和GM-CSF(每个1000IU/ml)加入以促使单核细胞分化为未成熟的DC。 
2.快速或缓慢抗原呈递实验 
对于快速抗原呈递实验(APA)，将抗原加入到未成熟的DC中在4-24小时内分离。另外的24小时后，通过与PGE2(1μM)，IL-1β(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)培养24小时将抗原负载的未成熟单核细胞诱发为成熟的单核细胞。随后将成熟的DC与自体同源的T细胞共同孵育(首次刺激)。利用磁性T细胞分离试剂盒(Dynal)根据制造者的说明借助阴性选择从与DC相同的PBMC产生T细胞。 
随后在IL-2(20IU/ml)，IL-7(10ng/ml)和IL-15(5ng/ml)的存在下用抗原负载的成熟DC重新刺激T细胞7天。7天的孵育以后，用抗原负载的成熟DC第三次重新刺激T细胞。第三次刺激持续6小时，随后T细胞被收集并为CD3、CD3和IFN-γ表达进行免疫染色，通过流式细胞术分析。 
对于缓慢APA，在添加抗原前在GM-CSF和IL-4存在5到6天的情况下单核细胞被允许分化为未成熟的DC。抗原添加后2小时，通过TNF-α(10ng/ml)和INF-α(50IU/ml)使未成熟的DC成熟。分离后七天，将成熟的DC与自体同源T细胞共同培养(首次刺激)(如上所述)。 
随后，在IL-2，IL-7和IL-15存在的情况下，T细胞被抗原负载的成熟DC重新刺激7天。7天孵育后，用抗原负载的成熟DC第 三次重新刺激该细胞。18个小时的孵育后，该T细胞被收集并为CD3，CD8和IFN-γ表达进行免疫染色，并且通过流式细胞术分析。 
3.BMC抗原呈递实验 
在该实验中，初始培养物包括总体的PBMC(即淋巴细胞和单核细胞)，其与抗原和IL-2一起孵育，假定该系统类似于体内免疫应答，其原因是所有细胞类型存在并参与(Maini，M.K et.al J.Exp.Med.191：1269-1280，2000)。PBMC被融解、冲洗和迅速与抗原孵育。在培养四天以允许抗原摄取和呈递之后，IL-2(20IU/ml)被加入并停留另外的8天(即该实验的第12天)。在第二次刺激前两天(即该实验的第10天)，通过以上所述的粘附分离DC，并且迅速将其与GM-CSF，IL-4和抗原一起孵育24小时。至于快速API，不成熟的DC被允许在加入PGE2，IL-1β和TCF-α后，分化24小时。随后在IL-2，IL-7和IL-15的存在下将加载的成熟DC加入到PBMC培养物中(第二次刺激，该实验的第12天)。第三次刺激发生在该实验的第21天，用该实验第21天的前两天制备的抗原负载的成熟DC。在6小时孵育后，该T细胞被收集并为CD3，CD8和IFN-γ表达进行免疫染色，并且通过流式细胞术分析。 
对于所有上述抗原呈递实验，在实验的末尾，部分T细胞被孵育另外的3到5天并通过四聚物分析检查特异性T细胞(参见下文)。 
4.HBV S1/S2引发针对HBV S1和S2肽的T细胞应答 
PBMC APA用于产生T细胞，其随后被评估它们的抗原特异性。因此，来自健康HLA-A2个体的PBMC以5×105细胞/ml在96孔板中包含2.5％相配的血清的AIM-V中培养。抗原(即10μg/mlS1/S2-TBD)被加入并且细胞在37℃培养4天。随后将IL-2以20IU/ml加入并且该细胞被培养另外的8天，同时每2-3天更换培 养基(AIM-V/2.5％相应的血清和20IU/ml IL-2)。在12天培养的末期保留的大部分细胞为T细胞，并且在IL-2(20IU/ml)，IL-7(10ng/ml)，和IL-15(5ng/ml)的存在下用自体同源的抗原负载的成熟DC重新刺激这些T细胞。 
在APA中用于第二次和第三次刺激T细胞的抗原负载的成熟DC利用如下所述的方法48小时后产生。通过粘附在塑料的组织培养皿上从总体的PBMC中分离出单核细胞。该细胞(通过FACS测定其约85％为单核细胞(CD11c+，CD14+，CD19-，和CD3-))在96孔板中以1×105细胞/孔培养，该孔包含具有1000IU/ml的细胞因子IL-4和GM-CSF的100μl AIM-V/2.5％相配的血清，4小时后将抗原如S1/S2-TBD加入。20小时孵育后，通过在PGE2(1×10-6M)，IL-1β(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)的存在下培养另外的24小时，生成的不成熟的DC分化为成熟的DC。 
第二次刺激后将T细胞培养7天，每1-2天更换培养基(具有2.5％相配的血清的AIM V和20IU/ml IL-2)。随后在IL-2、IL-7和IL-15(如上所述)存在的情况下将T细胞(培养19天)用抗原负载的成熟DC(通过上述2天的过程生成)刺激第三次，并且在6小时的培养后评估IFN-γ的生成或者培养5天(每1-2天用AIMV/2.5％对应的血清和20IU/ml IL-2更换培养基)，随后利用HBVpreS四聚物评估T细胞对HBV preS抗原的特异性(培养的第24天)。 
根据制造者的方案用按惯例合成的iTag MHC I类四聚物(Beckman Coulter)进行四聚物分析。因此将细胞收集、冲洗并以～2×105细胞/孔，20μl转移到96孔v-底板上。用对CD3(抗CD3-FITC)和CD8(抗CD8-半胱氨酸-铬)特异性的mAb和2μl PE接合的HLA-A*0201preS1四聚物(GMLTPVSTI，SEQ ID NO：50)或preS2四聚物(NIASHISSI，SEQ ID NO：51)一起在20℃标记该细胞30分 钟。随后将该细胞冲洗、用PBS中2％低聚甲醛(paraformaldyde)固定并转移到5ml FACS管中。在FACSCalibur流式细胞仪(BDBioscience)上每个样品中获取80,000-100,000细胞。利用CellQuest软件(BD Biosciences)进行分析(该软件在有活性的(基于FSC/SSC方面)CD3+群体上设门)，并且确定用四聚物标记的CD8+细胞的百分比。当PBMC用10μg/ml的HBV S1/S2-TBD培养并且用HBVS1/S2-TBD负载的成熟DC重新刺激两次时，标出的百分比的细胞用S1四聚物(图2)和S2四聚物(图3)标记为阳性。这与用未经抗原负载的成熟DC培养的T细胞(其中四聚物阳性的细胞的数量不显著)形成对比。因此，负载S1/S2-TBD的成熟DC能够诱导对HBV S1和HBV S2抗原的决定因子具有特异性的显著数目的T细胞的生成。 
F.实施例6：利用嵌合抗原融和蛋白破坏对DHBV和DHBV抗原的耐受性 
DHBV在HBV的抗病毒治疗的发展中被用作有效的动物模型。先天感染有DHBV的Pekin鸭已被用于研究病毒复制的机制和用于筛选抗病毒成分。在本发明中用到了两种鸭模型。第一种是先天感染DHBV的鸭。这类似于人类HBV感染者的垂直传播。第二种为持续感染模型，其中新孵育的小鸭感染有DHBV并且这些小鸭携带感染。第二种模型类似于人类HBV感染者的水平传播。 
1.先天感染有DHBV的鸭子 
先天感染有DHBV的鸭子在出生四周时被分为2组。收集血液样品(1.0mL)作为免疫前抗体水平的对照，并且在疫苗接种前每周收集血液样品。试验组在每周同一天接受19.95mg/剂量皮下注射的DHBV核心-TBD嵌合抗原融和蛋白直到第5周。在第六周，剂量加倍并且每四周注射一次直到疫苗接种在第26周中断。对照组 (placebo group)接受同等量的缓冲液(20mM磷酸钠pH8.0，300mMNaCl)。 
将96孔板涂以1.0μg/mL浓度的抗原、DHBV核心、TBD或DHBV核心-TBD并在4℃过夜。用包含2％BSA的磷酸缓冲盐(PBS)冲洗该板。将来自各个动物的不同稀释度(1∶10-1∶500)稀释的血清加入到每个孔中并在37℃孵育1小时。用包含0.05％吐温20的PBS(冲洗缓冲液)冲洗该板。将山羊抗鸭IgG-HRP(1∶5000)稀释液加入到该孔中并在37℃孵育1小时。用冲洗缓冲液冲洗该板并用2-2’连氮基-二(3-乙基苯甲基噻唑啉-6-磺酸盐)(KPL，Guildford，UK)显色。利用ELISA板读出器(MolecularDevices，USA)测量样品中产生的颜色的光密度。相对于来自相同动物的免疫前的血清计算抗体的滴定度。 
在0、3、和6周来自对照组和实验组的鸭中先天感染有DHBV的鸭的血清中的抗-核心抗体的水平示于表6中。虽然该鸭患有慢性DHBV感染，但是由于感染的慢性性质以及免疫系统不能将该抗原作为外来分子识别，所以抗体水平较低。在用DHBV核心-TBD嵌合抗原免疫后，宿主的免疫系统识别病毒抗原并产生针对已经存在于宿主体内的核心抗原的体液免疫应答，由此破坏宿主对病毒抗原的耐受性。 
表6：针对DHBV核心-TBD的体液免疫应答 
同样地，鸭的免疫系统将该嵌合抗原的TBD成分识别为外来抗原并同样产生针对融合蛋白的这部分的免疫应答。用TBD和来自个体鸭的血清涂板用于通过ELISA评估抗体水平。这项研究的结果示于表6中。 
2.孵化后感染DHBV的鸭 
在小鸭孵化后一天用包含DHBV的鸭血清感染正常的小鸭。这在DHBV研究领域是标准的做法。在免疫开始前4周利用已建立的技术确证持续的病毒血症的存在。将感染DHBV的鸭分成两组。从每只鸭收集血液样品(1.0mL)作为免疫前抗体水平的对照，并且在疫苗接种前每周收集血液样品。试验组在每周同一天接受19.95μg/剂量皮下注射的DHBV核心-TBD融和蛋白直到第5周。在第六周，剂量加倍并且每四周注射一次直到疫苗接种在第30周中断。从对照组收集血液样品，该对照组接受同等量的缓冲液(20mM磷酸钠pH8.0，300mM NaCl)。 
已检测出在第0、3、和6周时从鸭中收集的血清中的抗体水平。在对照组和试验组的鸭中孵育后感染DHBV的鸭的血清中抗核心抗体的水平示于表7中。虽然DHBV已经建立了持续的感染，但是由于免疫系统不能将该病毒抗原作为外来分子识别，所以抗体水平较低。在用DHBV核心-TBD嵌合抗原免疫后，宿主的免疫系统识别病毒抗原并产生针对已经存在于宿主体内的核心抗原的体液免疫应答，由此破坏宿主对病毒抗原的耐受性。针对TBD的抗体水平也升高(表7)。因此，存在针对同一嵌合抗原的不同部位的多价(或多表位)免疫应答。 
表7：针对DHBV核心-TBD的体液免疫应答 
Figure S04822747120060220D000521
G.实施例7：嵌合交联的HBV sAg-Fc(鼠) 
在4℃相对100mM HEPES(pH8.7)透析100μg sAg(USBiologicals；Cat # H1910-27)和100μg鼠多克隆IgG Fc片段(HarlanSera-Lab Ltd.，Cat # PP-19-01)的溶液一整夜。将该蛋白溶液混合到一起，并将二甲基辛二酰亚胺化物(DMS；Pierce Cat # 20700)立即加入到10mM的最终浓度，随后在室温下将该混合物孵育1小时。通过加入0.1M Tris HCl pH7.8将该反应终止。将反应混合物加载在Sephadex G75柱(0.7×12cm)上，并利用磷酸缓冲盐洗脱片段。收集0.5ml片段并集中包含摩尔比例为1∶1(其利用相应的抗体通过ELISA估计)的sAg/Fc的片段。 
将集中起来的片段用于抗原呈递实验(Berlyn，et al.，Clin.Immunol.101：276-283，(2001))。将未成熟的树突细胞用GM-CSF/IL4培养4天，与sAg-Fc接合体孵育，并在TNFα和干扰素-α存在的条件下成熟。将自体同源的CD3+T细胞加入到成熟的树突细胞中。在暴露于成熟的树突细胞三个循环后，通过利用流式细胞术测量胞内干扰素-γ的生成将T细胞刺激物定量。在接合体存在的情况下T细胞中生成的胞内干扰素-γ的水平比仅仅sAg或Fc片段存在的情况下要高的多(表8)。 
表8：针对HbsAg-Fc DMS接合体的T细胞应答 
  ％IFN-γ阳性T细胞
  没有抗原   0.19
  鼠Fc(2.5μg/mL)   0.46
  HBsAg(2.5μg/mL)   0.04
  HBsAg(2.5μg/mL)+mAb(2C12)  (2.5μg/mL)   0.12
  HBsAg-Fc DMS接合体(5.0μg/mL)   0.74
H.实施例8：抗原呈递实验 
根据建立的方案(Berlyn，et al.，supra(2001))利用人类PBMC来源的树突细胞进行抗原呈递实验。用于T细胞刺激实验的方案总结以示意形式如下所示。 
Figure S04822747120060220D000531
1.成熟的加载的树突细胞的制备 
从健康捐赠者的白细胞去除的样品中产生单核细胞并且通过与抗-CD2、CD7、CD16、CD19以及CD56抗体孵育来消耗掉淋巴细胞和粒细胞。随后将其与磁性玻珠结合的抗鼠IgG孵育并在磁体 (Dynal)上分离。阴性选择的细胞大于95％的纯单核细胞，通过流式细胞术利用广泛的CD标记物板(CD14+、CD11c+、CD19-、CD3-、CD4-、CD64+、CD32+、CD86+、CD16-)确定其特征。随后，将单核细胞与GM-CSF(R&D系统)在AIM V加2.5％相应的人类血清中孵育4天以生成未成熟的树突细胞。再次，将该细胞的等分试样通过广泛的CD标记物板染色以确保该细胞的纯度和同一性。随后在37℃用HBV S1/S2-TBD(5.0μg/ml)、HBV S1/S2(2.5μg/ml)、或TBD(2.5μg/ml)将该细胞加载2-4小时，随后用干扰素-α和TNF-α使细胞成熟3天。利用流式细胞仪(一批CD标记物)再次检查树突细胞，以确保该细胞已经历恰当的成熟。所生成的成熟的加载的树突细胞用于T细胞刺激实验。 
2.T细胞刺激实验：细胞因子分析 
利用磁性T细胞分离试剂盒(Dynal)根据制造者的说明借助阴性选择从与树突细胞相同的PMBC样品中生成T细胞。成熟的加载的树突细胞(DC-1)被彻底冲洗并加入T细胞中(第0天)。将该T细胞与树突细胞孵育7天。在第7天，该T细胞被成熟的、加载的树突细胞(DC-2)重新刺激。2小时后取该细胞的等分试样。将该细胞的等分试样与布雷菲德菌素A(GolgiPlugTM，R&D系统)孵育18小时并且随后用于下述的胞内细胞因子染色实验。 
将残余的细胞孵育另外7天。在第14天，用第三批成熟的、加载的树突细胞(DC-3)刺激残余的细胞。2小时后取该细胞的等分试样。将该细胞的等分试样与布雷菲德菌素A(GolgiPlugTM，R&D系统)孵育18小时并且随后用于下述的胞内细胞因子染色实验。 
对于胞内细胞因子染色，将细胞用抗-CD3-FITC和抗CD8-半胱氨酸-铬染色30分钟，冲洗、固定、透化处理，随后用抗干扰素-γ-PE 在冰上染色30分钟。将细胞冲洗并通过流式细胞仪(FACScan，BD Biosciences)分析。结果示于表9中。 
表9：CD3+/IFN-γ+T细胞 
  第21天
  HBV S1/S2-TBD   6.2±4.6
  HBV S1/S2   1.9±1.7
  TBD   1.6±0.9
  没有抗原   0.58±0.21
在第14天去除等分试样后，将剩余的T细胞孵育另外三天并且随后将上清液用于通过ELISA(Opt E1A ELISA kit，BDBiosciences)测量分泌的干扰素-γ的水平。通过测量细胞内和分泌的干扰素-γ的水平来评估T细胞刺激。结果示于表10中。在相同浓度下，嵌合抗原S1/S2-TBD诱导的干扰素-γ生成的水平高于当单独用分子的免疫应答结构域或TBD结构域实验时该分子的免疫应答结构域或TBD结构域诱导的干扰素-γ生成的水平。应当指出5μg剂量的S1/S2-TBD大约包含2.5μg每个该组分。 
表10：胞内和分泌的干扰素-γ的水平 
  ％IFN-γ阳性T细胞   分泌的干扰素-γ  (pg/ml)
  HBV S1/S2-TBD   3.5   60
  HBV S1/S2   2.1   18.9
  TBD   2.5   11.9
  没有抗原   0.77   4.4
  单独的T细胞   0.21   1.6
为T细胞应答检测了S1/S2-TBD的各种浓度。S1/S2-TBD的作用大于类似浓度下破伤风类毒素处理的效果。在浓度低于5μg/mL时，该嵌合抗原引发了干扰素-γ的生成和分泌的浓度依赖性(即与S1/S2-TBD抗原浓度正相关)的增加。在S1/S2-TBD抗原被树突细胞呈递后，由CD3+T细胞生成和分泌的干扰素-γ以浓度依赖性的 方式增加，如表11所示。低浓度的阳性应答相对疫苗接种必要的剂量和制造疫苗的成本来说将是有利的。 
表11：针对嵌合抗原的浓度依赖性的应答 
 ％IFN-γ阳性T细胞   分泌的IFN-γ   (pg/ml)
  HBV S1/S2-TBD(1.25μg/ml)  1.5   18
  HBV S1/S2-TBD(2.5μg/ml)  4.3   40
  HBV S1/S2-TBD(5μg/ml)  3.5   60
  HBV S1/S2-TBD(10μg/ml)  4.3   20
  破伤风类毒素  3.3   33
  没有抗原  0.77   4.4
  单独的T细胞  0.21   1.6
I.实施例9：嵌合抗原的结合和摄取 
1.成熟的加载的嵌合抗原的制备 
从白细胞除去的细胞(leukapheresis cell)制备(Berlyn，et al，supra(2001))的Ficoll/Histopaque(Sigma)的处理中获得外周血单核细胞(PBMC)。利用单核细胞分离试剂盒(Dynal)按照制造者的说明通过阴性选择从PBMC群体中分离单核细胞。通过抗体分析和流式细胞术(CD14+，CD11c+，CD19-，CD3-，CD4-，CD64+，CD32+，CD86+，CD16-)估计的单核细胞的纯度大于95％。用具有1％供血者相匹配的血清(如Berlyn，et al.，supra(2001)中所述分离)的AIM-V(Invitrogen)培养基冲洗单核细胞两次，该培养基包含L-谷氨酰胺、硫酸链霉素(50μg/mL)以及硫酸庆大霉素(10μg/mL)。随后，在包含2.5％供血者相匹配的血清以及细胞因子GM-CSF和IL-4的AIM-V培养基中培养该单核细胞，以使该细胞朝向树突细胞(DC)系分化。在7％CO2气氛中37℃下在12孔组织培养板中孵育该细胞。 
在第1天至第4天收集单核细胞起源的树突细胞。随后用具有0.1％BSC(Sigma)的AIM-V培养基冲洗该细胞一次，并用具有0.1％(w/v)BSA(PBSB)的Dulbecco’s磷酸缓冲盐(Invitrogen)冲洗该细胞两次。单核细胞起源的树突细胞用在4℃标记或结合实验中或用作37℃结合/摄取实验中。 
2.嵌合抗原结合到成熟的树突细胞 
比较S1/S2-TBD相对于鼠IgG1和IgG2a结合到成熟树突细胞上的程度。在体外培养的各天中(从第0天到第4天)分离树突细胞并将其用S1/S2-TBD(10μg/mL)或用鼠IgG1(2C12，生成TBD的亲本mAb)或用IgG2a(G155-178，90μg/Ml)在4℃处理1小时。将该细胞在PBSB中与F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)处理20分钟。将该细胞用PBSB冲洗两次，并将其重新悬浮在具有2％多聚甲醛(PF)的PBSB中，并且被配置有CellQuest获取和分析软件(BD)的Becton Dickinsion(BD)FACScan获取。门(gate)形成在可变的细胞群体上，其通过FSC和SSC分散分布图(scatterprofile)决定并且获得了≥10,000事件(events)。为了决定阳性细胞的百分比，基于阴性对照处理的细胞(标记的同种型对照或仅用F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)标记的细胞)设置了门。 
特异性阳性细胞的百分比计算如下： 
(检测样品的阳性细胞百分数-对照的阳性细胞百分数)/(100-对照的阳性细胞百分数)×100 
相对平均的荧光密度(MFI)是由检测样品的MFI减去对照样品的MFI所决定的。 
在培养1到4天后S1/S2-TBD相对于IgG1和IgG2a与DC的结合如表12所示。 
表12：嵌合抗原或抗体与成熟的树突细胞的结合 
Figure S04822747120060220D000581
S1/S2-TBD结合比IgG1或IgG2a的结合明显大的多，并且S1/S2-TBD的结合在第1天比在第4天更明显。这些实验表明S1/S2-TBD被高效地结合到成熟树突细胞上。 
3.成熟树突细胞对嵌合抗原的摄取 
为了确定嵌合抗原(如，HBV S1/S2-TBD)相对于IgG1和IgG2a的摄取的程度，将细胞与不同浓度的该抗原、IgG1(2C12，亲本mAb，TBD从其中生成)或IgG2a(G155-178)在37℃下在具有0.1％BSA的AIM V培养基中孵育1小时。细胞在PBSB中冲洗两次并用具有2％PF的PBS在4℃固定一整夜。随后，该细胞在PBSB中冲洗两次并用包含0.1％(w/v)皂角苷(Sigma)的PBS在20℃渗透处理40分钟。 
该细胞用PBSB冲洗两次，并在具有0.1％(w/v)皂角苷的PBSB中4℃下与F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)孵育20分钟。在PBSB中冲洗两次后，将该细胞悬浮在PBSB中。这个实验的另一种方式包括如上所述处理细胞与嵌合抗原、IgG1、或IgG2a10分钟，随后加入F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)处理50分钟。随后将该细胞冲洗并悬浮在具有2％PF的PBS中。 
通过配置有Cellquest获取和分析软件(BD)的Becton Dickinson(BD)FACScan可以获取细胞。在由FSC和SSC分散分布图确定的可变细胞群体上设门并且获得≥10,000事件。为了决定阳性细胞 的百分比，基于阴性对照处理的细胞(标记的同种型对照或仅用F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)标记的细胞)来设门。特异性阳性细胞的百分比计算如下： 
(检测样品的阳性细胞百分数-对照的阳性细胞百分数)/(100-对照的阳性细胞百分数)×100 
相对平均的荧光密度(MFI)是由检测样品的MFI减去对照样品的MFI所决定的。 
S1/S2-TBD相对于鼠和IgG2a的摄取作为树突细胞成熟的第4天的浓度的函数被评估。在37℃将1小时内的该摄取量化，结果示于图4中。S1/S2-TBD的摄取(量)随着浓度呈现线性增加。IgG1的摄取水平低的多，而IgG2a仅有很少量的摄取。因此，嵌合抗原SI/S2-TBD比免疫球蛋白更高效地被树突细胞摄取。 
J.实施例10：在成熟DC上的Fc-γ受体和CD206的表达 
在抗原呈递细胞上有许多结合并摄取抗原的受体。利用荧光标记的受体特异性抗体来评估成熟树突细胞上受体的丰富程度。FACS分析用于估计树突细胞的总群体中特异性受体阳性细胞的百分比。受体表达程度通过确定相对平均荧光密度以及作为相对荧光密度的函数(表13)来评估。 
表13：在成熟树突细胞上的抗原结合受体的表达 
Figure S04822747120060220D000591
培养中CD64(Fcγ受体I)的表达随着时间减少并且在第4天几乎可忽略。相反，CD32(Fcγ受体II)在DC培养4天后继续表达，以及CD16(Fcγ受体III)在DC培养4天后以较小的程度继续表达。在培养的第0天，基本上没有CD206(甘露糖巨噬细胞受体)的表达。但是在与IL-4和GM-CSF一起培养时被诱导，并且在第4天CD206以很高的水平表达。因此在第4天，当抗原在抗原呈递实验中被加载时，树突细胞具有至少两个用于结合嵌合抗原CD32和CD206的潜在受体。此外，它们与共刺激分子完全互补(数据未示出)。在培养中HLA-DR(II类)和HLA-ABC(I类)的表达也随着时间增加。在整个实验期间共刺激分子CD86(B7.2)和CD80(B7.1)也被表达。这些结果表明单核细胞起源的树突细胞朝向成熟的树突细胞分化并且能够为T细胞处理和呈递抗原。 
K.实施例11：CD32/CD206的表达和S1/S2-TBD结合到成熟DC的相关性 
CD32/CD206受体的表达和S1/S2-TBD结合到成熟树突细胞之间存在直接的相关性。由于已知鼠IgG1与人CD32结合，可以预期包含鼠IgG1的Fc成分的S1/S2-TBD也将结合CD32。此外，S1/S2-TBD借助其高甘露糖糖基化，将也被预期通过CD206受体结合到树突细胞上。 
图5中的点图表明S1/S2-TBD结合(10μg/mL)和CD32的表达以及S1/S2-TBD结合和CD206的表达。S1/S2-TBD结合程度和CD32的表达程度(这是相对异质的，即具有广泛的表达程度)之间存在直接的相关性。这些结果表明S1/S2-TBD结合到CD32，并且CD32的表达越高，嵌合抗原S1/S2-TBD的结合程度越高。S1/S2-TBD的结合与CD206的表达的点图表明表达CD206的绝大多数细胞也结合S1/S2-TBD。少量百分比的该细胞群体为CD206 阴性并因此对于S1/S2-TBD的结合呈现阴性。因此，CD32和CD206受体均与S1/S2-TBD的结合相关。 
L.实施例12：S1/S2-TBD的结合和摄取主要通过CD32，通过CD206的较少 
作为DC成熟的第4天的浓度的函数，S1/S2-TBD相较于鼠IgG1和IgG2a的摄取被评估。在37℃在培养基、甘露聚糖(2mg/ml，Sigma)、和/或鼠Fcγ(2mg/ml，Jackson免疫研究实验室)存在的情况下将1小时内的该摄取量化。甘露聚糖是CD206结合的竞争性抑制剂，因此抗原经由树突细胞上的CD206摄取。Fcγ是CD32结合的竞争性抑制剂，因此CD32介导抗原的摄取。结果示于表14中。 
表14：嵌合抗原通过Fc或甘露聚糖结合的抑制 
Figure S04822747120060220D000611
嵌合抗原的结合随其浓度逐步增加。细胞与高浓度鼠Fcγ片段的孵育抑制了这种结合，而甘露聚糖(CD206受体结合的抑制剂)仅具有边缘效应。因此，CD32可以为该嵌合抗原结合和摄取中的主要受体。 
M.实施例13：HBV S1/S2抗原的糖基化提供了免疫原性 
昆虫细胞蛋白糖基化的途径不同于哺乳动物细胞的途径，因为昆虫细胞中合成的蛋白经历的糖基化导致分泌的蛋白中较高的甘 露糖含量和末端唾液酸残基的缺乏(Altman，et al.，Glycoconjug16：109-123(1999))。HBV S1/S2(嵌合抗原的抗原成分)在大肠杆菌(没有糖基化)和High FiveTM昆虫细胞(甘露糖糖基化)中均表达。 
1.糖基化对抗原结合的影响 
如实施例9中所述，比较了这些抗原与树突细胞的结合。成熟的树突细胞被加载昆虫细胞或大肠杆菌中表达的10μg/mL HBVS1/S2。糖基化的蛋白表现出与树突细胞更好的结合(表15)。 
表15：糖基化对HBV S1/S2结合的影响 
  特异的阳性细胞％   相对MFI
  昆虫细胞   69.9   40.3
  大肠杆菌   12.2   3.9
2.糖基化对引发免疫应答的影响 
HBV S1/S2的糖基化引发了增强的免疫原性和T细胞应答。比较大肠杆菌和High FiveTM昆虫细胞中表达的HBV S1/S2被树突细胞呈递时的T细胞应答。如实施例8所述(利用2.5μg/M HBV S1/S2蛋白)测量细胞内和分泌的干扰素-γ的水平，结果示于表16中。 
表16：糖基化对干扰素-γ的水平的影响 
细胞内IFNγ(IFNγ阳性的T细胞％)  分泌的IFNγ (pg/ml)
  杆状病毒HBV S1/S2 2.1  18.9
  大肠杆菌HBV S1/S2 0.83  4.3
  没有抗原 0.77  4.4
  仅T细胞 0.21  1.6
与大肠杆菌中表达的未糖基化的蛋白相比，昆虫细胞中表达的HBV S1/S2生成了更高水平的胞内和分泌的干扰素。 
在上述说明书中提及的所有出版物和专利以引用方式结合于此作为参考。对于本领域的技术人员来说，本发明的方法和系统可以有各种显而易见的更改和变化而不偏离本发明的精神和范围。虽然结合特定的优选实施例描述了本发明，但是应该明了本发明的保护范围不应当不恰当地局限于这些特定实施例。实际上，所述用于实施本发明的方式可以有各种更改，这对本领域的技术人员来说是显而易见的，而这些都在本发明的权利要求的范围内。 
                               I7506.006W01 seq listing. ST25(1).txt                                           SEQUENCE LISTING
<110>Virexx Research，Inc。
        George，Rajan
        Tyrrell，Lorne
        Noujaim，Antoine
        Wang，DaKun
        Ma，Allall
 
<120>CHIMERIC ANTIGENS FOR BREAKING HOST TOLERANCE TO FOREIGN ANTIGENS
 
<130>17506-006wo1
 
<150>US 60/493,449
<151>2004-08-08
 
<160>51
 
<170>PatentIn version 3.2
 
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>Actificial
 
<220>
<223>linker peptide
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa can be Val or Ser
 
<400>1
 
Xaa Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser
1               5
 
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>Mus musculus 
 
<400>2
Val Asp Lys Ile
1           5
 
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>3
tgtcattctg cggccgcaag gcggcggatc tgtggacaag aaaattgtgc ccagg          55
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>4
acgaatcaag ctttgcagcc caggagagtg ggagag                              36
 
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>5
tattccggat tattcatacc g                                              21
 
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>6
ctctacaaat gtggtatggc                                                20
 
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>7
ggatctgtac gacgatgacg                                               20
 
<210>8
<211>39
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>8
agtcattctg cggccgcgag ttcgtcacag ggtccccgg                          39
 
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>9
gataaggatc ctatgggagg ttggtcatca aaac                                 34
 
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>10
gtcatactgc ggccgcgaaa tgtataccca gagacaaaag                           40
 
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>11
tgcgctacca tggacattga cccttataaa g                                    31
 
<210>12
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>12
tgtcattctg cggccgcgaa cattgagatt cccgagattg ag                        42
 
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>13
tgtcattcag cggccgcgaa ctcttgtaaa aaagagcaga                           40
 
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>14
tgtcattctg cggccgcgtt ttcttcttca aggggggagt                           40
 
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>15
tgcgctacca tggatatcaa tgcttctaga gcc                                  33
 
<210>16
<211>43
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>16
tgtcattctg cggccgcgat ttcctaggcg agggagatct atg                       43
 
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>17
cggaattcat gagcacgaat cctaaac                                         27
 
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>18
ggactagtcc ggctgaagcg ggcacagtca ggcaagag                             38
 
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>19
ggactagtcc gaagatagag aaagagc                                   27
 
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>20
ccggaattct ccggttcctg gctaagg                                   27
 
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>21
ggactagtcc gcacacgaca tcttccgt                                  28
 
<210>22
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>22
ccggaattct accaagtgcg caattcct                                  28
 
<210>23
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>23
ggactagtcc ttccgcgtcg acgccggcaa at                             32
 
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>24
gcggaattca cccacgtcac cgggggaaat gc                             32
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>artificial sequence
 
<220>
<223>primer sequence
 
<400>25
ggactagtcc agccgcctcc gcttgggata tgagt                                35
 
<210>26
<211>1359
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>HBV plus TBD
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1359)
 
<400>26
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat cct atg aaa aaa tgg       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Lys Lys Trp
            20                  25                  30
tca tca aaa cct cgc aaa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aac      144
Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
        35                  40                  45
cct ctg gga ttc ttt ccc gat cat cag ttg gac cct gta ttc gga gcc      192
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala
    50                  55                  60
aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc atc aag gac cac tgg      240
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
65                  70                  75                  80
cca gca gcc aac cag gta gga gtg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc      288
Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
                85                  90                  95
cct cca cac ggc ggt gtt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc atg      336
Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met
            100                 105                 110
ttg acc cca gtg tca aca att cct cct cct gcc tcc gcc aat cgg cag      384
Lcu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln
        115                 120                 125
tca gga agg cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat      432
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
    150                 135                 140
cct cag gcc atg cag tgg aat tcc act gcc ttc cac caa gct ctg caa      480
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
gac ccc aga gtc agg ggt ctg tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tca       528
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
                165                 170                 175
gga aca gta aac cct gct ccg aat att gcc tct cac atc tcg tca atc       576
Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile
            180                 185                 190
tcc gcg agg acc ggg gac cct gtg acg aac tcg cgg ccg caa ggc ggc       624
Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Ser Arg Pro Gln Gly Gly
        195                 200                 205
gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct       672
Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
    210                 215                 220
tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca       720
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg tgt       768
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
                245                 250                 255
gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg       816
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
            260                 265                 270
ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag       864
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
        275                 280                 285
gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg       912
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
    290                 295                 300
cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt       960
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305                 310                 315                 320
gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc      1008
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
                325                 330                 335
aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag cag      1056
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
            340                 345                 350
atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc      1104
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
        355                 360                 365
cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag      1152
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
    370                 375                 380
aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac ttc      1200
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385                 390                 395                 400
gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga aat    1248
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
                    405                 410                 415
act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat act    1296
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
            420                 425                 430
gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg aga agt    1344
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser
        435                 440                 445
act aga gga tca taa                                                1359
Thr Arg Gly Ser
    450
 
<210>27
<211>452
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>27
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Lys Lys Trp
            20                  25                      30
Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
        35                  40                  45
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
65                  70                  75                  80
Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
                85                  90                  95
Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met
            100                 105                 110
Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln
        115                 120                 125
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
    130                 135                 140
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro ASn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile
            180                 185                 190
Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Ser Arg Pro Gln Gly Gly
        195                 200                 205
Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
    210                 215                 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
                245                 250                 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
            260                 265                 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
        275                 280                 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
    290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305                 310                 315                 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
                325                 330                 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
            340                 345                 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
        355                 360                 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
    370                 375                 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
                405                 410                 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
            420                 425                 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser
        435                 440                 445
Thr Arg Gly Ser
    450
 
<210>28
<211>2037
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis B Virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2037)
 
<400>28
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat cct atg gga ggt tgg       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Gly Gly Trp
            20                  25                  30
tca tca aaa cct cgc aaa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aac      144
Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
        35                 40                 45
cct ctg gga ttc ttt ccc gat cat cag ttg gac cct gta ttc gga gcc      192
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala
    50                  55                  60
aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc atc aag gac cac tgg      240
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
65                  70                  75                  80
cca gca gcc aac cag gta gga gtg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc      288
Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
                85                  90                  95
cct cca cac ggc ggt gtt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc atg      336
Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met
            100                 105                 110
ttg acc cca gtg tca aca att cct cct cct gcc tcc gcc aat cgg cag      384
Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln
        115                 120                 125
tca gga agg cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat        432
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
    130                 135                 140
cct cag gcc atg cag tgg aat tcc act gcc ttc cac caa gct ctg caa        480
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160 
gac ccc aga gtc agg ggt ctg tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tca        528
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
                165                 170                 175
gga aca gta aac cct gct ccg aat att gcc tct cac atc tcg tca atc        576
Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile
            180                 185                 190
tcc gcg agg act ggg gac cct gtg acg aac atg gag aac atc aca tca        624
Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser
        195                 200                 205
gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg        672
Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu
    210                 215                 220
aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct        720
Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser
225                 230                 235                 240 
ctc aat ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt ctt ggc caa aat tcg cag        768
Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln
                245                 250                 255
tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc tgt cct cca att tgt cct        816
Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro
            260                 265                 270
ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc        864
Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile
        275                 280                 285
ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt ctt ctg gat tat caa ggt        912
Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly
    290                 295                 300
atg ttg ccc gtt tgt cct cta att cca gga tca aca aca acc agt acg        960
Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr
305                 310                 315                 320 
gga cca tgc aaa acc tgc acg act cct gct caa ggc aac tct atg ttt       1008
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe
                325                 330                 335
ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cct acg gat gga aat tgc acc tgt att       1056
Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile
            340                 345                 350
ccc atc cca tcg tct tgg gct ttc gca aaa tac cta tgg gag tgg gcc       1104
Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala
        355                 360                 365
tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg       1152
Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp
    370                 375                 380
ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt tca gct ata tgg atg atg        1200
Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met
385                 390                 395                 400 
tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac agc atc gtg agt ccc ttt ata ccg        1248
Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro
                405                 410                 415
ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc tgg gta tac att tcg cgg ccg caa        1296
Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Ser Arg Pro Gln
            420                 425                 430
ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt        1344
Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
        435                 440                 445
aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc        1392
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
    450                 455                 460
ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc        1440
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
465                 470                 475                 480 
acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc        1488
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
                485                 490                 495
agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc        1536
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
            500                 505                 510
cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc        1584
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
        515                 520                 525
atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc        1632
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
    530                 535                 540
aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc        1680
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
545                 550                 555                 560
aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag        1728
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
                565                 570                 575
gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac        1776
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
            580                 585                 590
ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca        1824
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
        595                 600                 605
gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct        1872
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
    610                 615                 620
tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca        1920
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
625                 630                 635                 640
gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac        1968
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
                645                 650                 655
cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg        2016
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser
            660                 665                 670
aga agt act aga gga tca taa                                            2037
Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        675
 
<210>29
<211>678
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>29
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Gly Gly Trp
            20                  25                  30
Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn
        35                  40                  45
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
65                  70                  75                  80
Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr
                85                  90                  95
Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met
            100                 105                 110
Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln
        115                 120                 125
Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His
    130                 135                 140
Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile
            180                 185                 190
Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser
        195                 200                 205
Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu
    210                 215                 220
Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser
225                 230                 235                 240
Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln
                245                 250                 255
Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro
            260                 265                 270
Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile
        275                 280                 285
Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly
    290                 295                 300
Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr
305                 310                 315                 320
Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe
                325                 330                 335
Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile
            340                 345                 350
Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala
        355                 360                 365
Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp
    370                 375                 380
Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met
385                 390                 395                 400
Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro
                405                 410                 415
Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Ser Arg Pro Gln
            420                 425                 430
Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
        435                 440                 445
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
    450                 455                 460
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
465                 470                 475                 480
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
                485                 490                 495
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
            500                 505                 510
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
        515                 520                 525
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
    530                 535                 540
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
545                 550                 555                 560 
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
                565                 570                 575
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
            580                 585                 590
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
        595                 600                 605
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
    610                 615                 620
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
625                 630                 635                 640 
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
                645                 650                 655
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser
            660                 665                 670
Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        675
 
<210>30
<211>1383
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis B Virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1383)
 
<400>30
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg         48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
 1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gac att gac cct tat aaa         96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys
             20                  25                  30
gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg cct tct gac ttc        144
Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe
         35                  40                  45
ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac acc gcc tcg gct ctg tat cgg        192
Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg
     50                  55                  60
gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc tca cct cac cat acc gca ctc        240
Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu
65                  70                  75                  80
agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa ttg atg act cta gct acc tgg        288
Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp
                 85                  90                  95
gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca tcc agg gat cta gta gtc aat        336
Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn
            100                 105                 110
tat gtt aat act aac atg gga tta aag atc agg caa ctc ttg tgg ttt        384
Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
cat atc tct tgc ctt act ttt gga aga gaa act gta ctt gaa tat ttg        432
His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu
    130                 135                 140
gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gcc tat aga cca cca        480
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
145                 150                 155                 160 
aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg gaa act act gtt gtt aga cga        528
Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg
                165                 170                 175
cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga aga act ccc tcg cct cgc aga        576
Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga aga tct caa tct cgg gaa tct        624
Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser
        195                 200                 205 
caa tgt tcg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg        672
Gln Cys Ser Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val
    210                 215                 220
ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta        720
Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val
225                 230                 235                 240
tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att        768
Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile
                245                 250                 255
act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat        816
Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp
            260                 265                 270
gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac        864
Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His
        275                 280                 285
aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc        912
Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
    290                 295                 300
tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag        960
Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320 
gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag       1008
Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac       1056
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
acc att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg       1104
Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu
        355                 360                 365
acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg       1152
Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp
    370                 375                 380
cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc       1200
Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile
385                 390                 395                 400 
atg gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag       1248
Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln
                405                 410                 415
aag agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat        1296
Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His
            420                 425                 430
gag ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct        1344
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
        435                 440                 445
ggg ctg caa agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                    1383
Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
    450                 455                 460
 
<210>31
<211>460
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>31
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
 1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys
             20                  25                  30
Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe
         35                  40                  45
Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg
     50                  55                  60
Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp
                 85                  90                  95
Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn
            100                 105                 110
Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu
    130                 135                 140
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser
        195                 200                 205
Gln Cys Ser Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val
    210                 215                 220
Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile
                245                 250                 255
Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His
        275                 280                 285
Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
    290                 295                 300
Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp
    370                 375                 380
Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile
385                 390                 395                 400
Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln
                405                 410                 415
Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His
            420                 425                 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
    450                 455                 460
 
<210>32
<211>1326
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Duck hepatitis B Virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1326)
 
<400>32
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg         48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
 1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg ggg         96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Gly
             20                  25                  30
caa cat cca gca aaa tca atg gac gtc aga cgg ata gaa gga gga gaa        144
Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly Gly Glu
         35                  40                  45
ata ctg tta aac caa ctt gcc gga agg atg atc cca aaa ggg act ttg        192
Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly Thr Leu
     50                  55                  60
aca tgg tca ggc aag ttt cca aca cta gat cac gtg tta gac cat gtg        240
Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val
 65                  70                  75                  80
caa aca atg gag gag ata aac acc ctc cag aat cag gga gct tgg cct        288
Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala Trp Pro
                 85                  90                  95
gct ggg gcg gga agg aga gta gga tta tca aat ccg act cct caa gag        336
Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gln Glu
            100                 105                 110
att cct cag ccc cag tgg act ccc gag gaa gac caa aaa gca cgc gaa        384
Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala Arg Glu
        115                 120                 125
gct ttt cgc cgt tat caa gaa gaa aga cca ccg gaa acc acc acc att        432
Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr Ile
    130                 135                 140
cct ccg tct tcc cct cct cag tgg aag cta caa ccc ggg gac gat cca        480
Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp Asp Pro
145                 150                 155                 160 
ctc ctg gga aat cag tct ctc ctc gag act cat ccg cta tac cag tca        528
Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gln Ser
                165                 170                 175
gaa cca gcg gtg cca gtg ata aaa act ccc ccc ttg aag aag aaa acg        576
Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys Lys Thr
            180                 185                 190
cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat        624
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
        195                 200                 205
tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc        672
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
    210                 215                 220
ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act        720
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
225                 230                 235                 240
cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag        768
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
                245                 250                 255
gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag        816
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
            260                 265                 270
acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt        864
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
        275                 280                 285
gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa        912
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
    290                 295                 300
tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc        960
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
305                 310                 315                 320
tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca       1008
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
                325                 330                 335
cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg       1056
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
            340                 345                 350
ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat       1104
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
        355                 360                 365
ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca       1152
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
    370                 375                 380
gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac       1200
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
385                 390                 395                 400
tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg        1248
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
                405                 410                 415
cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa        1296
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
            420                 425                 430
agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                                1326
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        435                 440
<210>33
<211>441
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>33
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
 1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Gly
             20                  25                  30
Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly Gly Glu
         35                  40                  45
Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly Thr Leu
     50                  55                  60
Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val
 65                  70                  75                  80
Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala Trp Pro
                 85                  90                  95
Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gln Glu
            100                 105                 110
Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala Arg Glu
        115                 120                 125
Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr Ile
    130                 135                 140
Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp Asp Pro
145                 150                 155                 160
Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gln Ser
                165                 170                 175
Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys Lys Thr
            180                 185                 190
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
    210                 215                 220
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
225                 230                 235                 240
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
                245                 250                 255
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
            260                 265                 270
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
        275                 280                 285
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
    290                 295                 300
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
305                 310                 315                 320
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
                325                 330                 335
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
            340                 345                 350
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
        355                 360                 365
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
    370                 375                 380
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
                405                 410                 415
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
            420                 425                 430
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        435                 440
 
<210>34
<211>1827
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Duck hepatitis B virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1824)
 
<400>34
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg         48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
 1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg ggg         96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Gly
             20                  25                  30
caa cat cca gca aaa tca atg gac gtc aga cgg ata gaa gga gga gaa        144
Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly Gly Glu
         35                  40                  45
ata ctg tta aac caa ctt gcc gga agg atg atc cca aaa ggg act ttg        192
Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly Thr Leu
     50                  55                  60
aca tgg tca ggc aag ttt cca aca cta gat cac gtg tta gac cat gtg        240
Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val
 65                  70                  75                  80
caa aca atg gag gag ata aac acc ctc cag aat cag gga gct tgg cct        288
Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala Trp Pro
                 85                  90                  95
gct ggg gcg gga agg aga gta gga tta tca aat ccg act cct caa gag        336
Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gln Glu
            100                 105                 110
att cct cag ccc cag tgg act ccc gag gaa gac caa aaa gca cgc gaa        384
Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala Arg Glu
        115                 120                 125
gct ttt cgc cgt tat caa gaa gaa aga cca ccg gaa acc acc acc att        432
Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr Ile
    130                 135                 140
cct ccg tct tcc cct cct cag tgg aag cta caa ccc ggg gac gat cca        480
Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp Asp Pro
145                 150                 155                 160
ctc ctg gga aat cag tct ctc ctc gag act cat ccg cta tac cag tca        528
Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gln Ser
                165                 170                 175
gaa cca gcg gtg cca gtg ata aaa act ccc ccc ttg aag aag aaa atg        576
Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys Lys Met
            180                 185                 190
tct ggt acc ttc ggg gga ata cta gct ggc cta atc gga tta ctg gta        624
Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu Val
        195                 200                 205
agc ttt ttc ttg ttg ata aaa att cta gaa ata ctg agg agg cta gat        672
Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Leu Asp
    210                 215                 220
tgg tgg tgg att tct ctc agt tct cca aag gga aaa atg caa tgc gct        720
Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln Cys Ala
225                 230                 235                 240
ttc caa gat act gga gcc caa atc tct cca cat tac gta gga tct tgc        768
Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly Ser Cys
                245                 250                 255
ccg tgg gga tgc cca gga ttt ctt tgg acc tat ctc agg ctt ttt atc        816
Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu Phe Ile
            260                 265                 270
atc ttc ctc tta atc ctg cta gta gca gca ggc ttg ctg tat ctg acg        864
Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu Thr
        275                 280                 285
gac aac ggg tct act att tta gga aag ctc caa tgg gcg tcg gtc tca        912
Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser Val Ser
    290                 295                 300
gcc ctt ttc tcc tcc atc tct tca cta ctg ccc tcg gat ccg aaa tct        960
Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys Ser
305                 310                 315                 320
ctc gtc gct tta acg ttt gga ctt tca ctt ata tgg atg act tcc tcc       1008
Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr Ser Ser
                325                 330                 335
tct gcc acc caa acg ctc gtc acc tta acg caa tta gcc acg ctg tct       1056
Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr Leu Ser
            340                 345                 350
gct ctt ttt tac aag agt tcg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac       1104
Ala Leu Phe Tyr Lys Ser Ser Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp
        355                 360                 365
aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca       1152
Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
    370                 375                 380
gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat       1200
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
385                 390                 395                 400
gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac       1248
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
                405                 410                 415
atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat        1296
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
            420                 425                 430
gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac        1344
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        435                 440                 445
agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg        1392
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
    450                 455                 460
ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct        1440
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro 
465                 470                 475                 480
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct        1488
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala
                485                 490                 495
cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat        1536
Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp
            500                 505                 510
aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att        1584
Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile
        515                 520                 525
act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac        1632
Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn
    530                 535                 540
act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag        1680
Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys
545                 550                 555                 560
ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc        1728
Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys
                565                 570                 575
tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc        1776
Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu
            580                 585                 590
tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg aga agt act aga gga tca        1824
Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        595                 600                 605
taa                                                                    1827
 
<210>35
<211>608
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic construct
 
<400>35
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Gly
            20                  25                  30
Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly Gly Glu
        35                  40                  45
Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly Thr Leu
    50                  55                  60
Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val
65                  70                  75                  80
Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala Trp Pro
                85                  90                  95
Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gln Glu
            100                 105                 110
Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala Arg Glu
        115                 120                 125
Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr Ile
    130                 135                 140
Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp Asp Pro
145                 150                 155                 160
Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr Gln Ser
                165                 170                 175
Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys Lys Met
            180                 185                 190
Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu Val
        195                 200                 205
Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Leu Asp
    210                 215                 220
Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln Cys Ala
225                 230                 235                 240
Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly Ser Cys
                245                 250                 255
Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu Phe Ile
            260                 265                 270
Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu Thr
        275                 280                 285
Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser Val Ser
    290                 295                 300
Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr Ser Ser
                325                 330                 335
Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr Leu Ser
            340                 345                 350
Ala Leu Phe Tyr Lys Ser Ser Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp
        355                 360                 365
Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
    370                 375                 380
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
385                 390                 395                 400
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
                405                 410                 415
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
            420                 425                 430
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
        435                 440                 445
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
    450                 455                 460
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro
465                 470                 475                 480
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala
                485                 490                 495
Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp
            500                 505                 510
Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile
        515                 520                 525
Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn
    530                 535                 540
Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys
545                 550                 555                 560
Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys
                565                 570                 575
Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu
            580                 585                 590
Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        595                 600                 605
 
<210>36
<211>1614
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Duck hepatitis B virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1614)
 
<400>36
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat atc aat gct tct aga       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Ile Asn Ala Ser Arg
            20                  25                  30
gcc tta gcc aat gtg tat gat cta cca gat gat ttc ttt cca aaa ata      144
Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile
        35                  40                  45
gat gat ctt gtt aga gat gct aaa gac gct tta gag cct tat tgg aaa      192
Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys
    50                  55                  60
tca gat tca ata aag aaa cat gtt ttg att gca act cac ttt gtg gat      240
Ser Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu Ile Ala Thr His Phe Val Asp
65                  70                  75                  80
ctc att gaa gac ttc tgg cag act aca cag ggc atg cat gaa ata gcc      288
Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr Gln Gly Met His Glu Ile Ala
                85                  90                  95
gaa tca tta aga gct gtt ata cct ccc act act act cct gtt cca ccg      336
Glu Ser Leu Arg Ala Val Ile Pro Pro Thr Thr Thr Pro Val Pro Pro
            100                 105                 110
ggt tat ctt att cag cac gag gaa gct gaa gag ata cct ttg gga gat      384
Gly Tyr Leu Ile Gln His Glu Glu Ala Glu Glu Ile Pro Leu Gly Asp
        115                 120                 125
tta ttt aaa cac caa gaa gaa agg ata gta agt ttc caa ccc gac tat      432
Leu Phe Lys His Gln Glu Glu Arg Ile Val Ser Phe Gln Pro Asp Tyr
    130                 135                 140
ccg att acg gct aga att cat gct cat ttg aaa gct tat gca aaa att      480
Pro Ile Thr Ala Arg Ile His Ala His Leu Lys Ala Tyr Ala Lys Ile
145                 150                 155                 160
aac gag gaa tca ctg gat agg gct agg aga ttg ctt tgg tgg cat tac      528
Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Leu Trp Trp His Tyr
                165                 170                 175
aac tgt tta ctg tgg gga gaa gct caa gtt act aac tat att tct cgt      576
Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Ala Gln Val Thr Asn Tyr Ile Ser Arg
            180                 185                 190
ttg cgt act tgg ttg tca act cct gag aaa tat aga ggt aga gat gcc      624
Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Gly Arg Asp Ala
        195                 200                 205
ccg acc att gaa gca atc act aga cca atc cag gtg gct cag gga ggc      672
Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro Ile Gln Val Ala Gln Gly Gly
    210                 215                 220
aga aaa aca act acg ggt act aga aaa cct cgt gga ctc gaa cct aga      720
Arg Lys Thr Thr Thr Gly Thr Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg
225                 230                 235                 240
aga aga aaa gtt aaa acc aca gtt gtc tat ggg aga aga cgt tca aag      768
Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys
                245                 250                 255
tcc cgg gaa agg aga gcc cct aca ccc caa cgt gcg ggc tcc cct ctc      816
Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser Pro Leu
            260                 265                 270
cca cgt agt tcg agc agc cac cat aga tct ccc tcg cct agg aaa tcg      864
Pro Arg Ser Ser Ser Ser His His Arg Ser Pro Ser Pro Arg Lys Ser
        275                 280                 285
cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat      912
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
    290                 295                 300
tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc      960
Cys Gly Cys Lys Pro cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
305                 310                 315                 320
ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act     1008
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
                325                 330                 335
cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag     1056
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
            340                 345                 350
gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag     1104
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
        355                 360                 365
acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt     1152
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
    370                 375                 380
gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa     1200
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
385                 390                 395                 400
tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc     1248
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
                405                 410                 415
tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca     1296
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
            420                 425                 430
cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg     1344
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
        435                 440                 445
ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat     1392
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
    450                 455                 460
ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca     1440
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
465                 470                 475                 480
gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac     1488
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
                485                 490                 495
tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg     1536
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
            500                 505                 510
cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa     1584
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
        515                 520                 525
agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                             1614
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
    530                 535
 
<210>37
<211>537
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>37
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Ile Asn Ala Ser Arg
            20                  25                  30
Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile
        35                  40                  45
Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys
    50                  55                  60
Ser Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu Ile Ala Thr His Phe Val Asp
65                  70                  75                  80
Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr Gln Gly Met His Glu Ile Ala
                85                  90                  95
Glu Ser Leu Arg Ala Val Ile Pro Pro Thr Thr Thr Pro Val Pro Pro
            100                 105                 110
Gly Tyr Leu Ile Gln His Glu Glu Ala Glu Glu Ile Pro Leu Gly Asp
        115                 120                 125
Leu Phe Lys His Gln Glu Glu Arg Ile Val Ser Phe Gln Pro Asp Tyr
    130                 135                 140
Pro Ile Thr Ala Arg Ile His Ala His Leu Lys Ala Tyr Ala Lys Ile
145                 150                 155                 160
Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Leu Trp Trp His Tyr
                165                 170                 175
Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Ala Gln Val Thr Asn Tyr Ile Ser Arg
            180                 185                 190
Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Gly Arg Asp Ala
        195                 200                 205
Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro Ile Gln Val Ala Gln Gly Gly
    210                 215                 220
Arg Lys Thr Thr Thr Gly Thr Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg
225                  230                235                 240
Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys
                245                 250                 255
Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser Pro Leu
            260                 265                 270
Pro Arg Ser Ser Ser Ser His His Arg Ser Pro Ser Pro Arg Lys Ser
        275                 280                 285
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
    290                 295                 300
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
305                 310                 315                 320
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Tle Thr Leu Thr
                325                 330                 335
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
            340                 345                 350
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
        355                 360                 365
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
    370                 375                 380
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
385                 390                 395                 400
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
                405                 410                 415
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
            420                 425                 430
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
        435                 440                 445
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
    450                 455                 460
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
465                 470                 475                 480
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
                485                 490                 495
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
            500                 505                 510
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
        515                 520                 525
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
    530                 535
 
<210>38
<211>1422
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis C virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1422)
 
<400>38
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg agc       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ser
            20                  25                  30
acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgt cgc      144
Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
        35                  40                  45
cca cag gac gtc aag ttc ccg ggt ggc ggt cag atc gtt ggt gga gtt      192
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val
    50                  55                  60
tac ttg ttg ccg cgc agg ggc cct aga ttg ggt gtg cgc gcg acg agg      240
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg
65                  70                  75                  80
aag act tcc gag cgg tcg caa cct cga ggt aga cgt cag cct atc ccc      288
Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro
                 85                  90                  95
aag gca cgt cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc ggg tac cct      336
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro
            100                 105                 110
tgg ccc ctc tat ggc aat gag ggt tgc ggg tgg gcg gga tgg ctc ctg      384
Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu
        115                 120                 125
tct ccc cgt ggc tct cgg cct agc tgg ggc ccc aca gac ccc cgg cgt      432
Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg
    130                 135                 140
agg tcg cgc aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt acg tgc ggc ttc      480
Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe
145                 150                 155                 160
gcc gac ctc atg ggg tac ata ccg ctc gtc ggc gcc cct ctt gga ggc      528
Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu ValGly Ala Pro Leu Gly Gly
                165                 170                 175
gct gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac ggc gtg      576
Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val
            180                 185                 190
aac tat gca aca ggg aac ctt cct ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctt      624
Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu
        195                 200                 205
ctg gcc ctg ctc tct tgc ctg act gtg ccc gct tca gcc gga cta gtg      672
Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Gly Leu Val
    210                 215                 220
cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat      720
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
225                 230                 235                 240
tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc      768
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
                245                 250                 255
ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act      816
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
            260                 265                 270
cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag      864
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
        275                 280                 285
gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag      912
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
    290                 295                 300
acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt      960
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
305                 310                 315                 320
gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa     1008
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
                325                 330                 335
tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc     1056
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
            340                 345                 350
tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca     1104
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
        355                 360                 365
cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg     1152
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
    370                 375                 380
ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat     1200
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
385                 390                 395                 400
ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca     1248
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
                405                 410                 415
gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac     1296
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
            420                 425                 430
tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg     1344
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
        435                 440                 445
cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa     1392
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
    450                 455                 460
agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                             1422
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
465                 470
 
<210>39
<211>473
<2112>PRT
<2113>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>39
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ser
            20                  25                  30
Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
        35                  40                  45
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val
    50                  55                  60
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg
65                  70                  75                  80
Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro
                     85                  90                  95
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro
                100                 105                 110
Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu
            115                 120                 125
Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg
        130                 135                 140
Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr LeugThr Cys Gly Phe
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly
                165                 170                 175
Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val
            180                 185                 190
Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu
        195                 200                 205
Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Gly Leu Val
    210                 215                 220
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
225                 230                 235                 240
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val
                245                 250                 255
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
            260                 265                 270
Pro Lys Val Thr cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
        275                 280                 285
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
    290                 295                 300
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
305                 310                 315                 320
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
                325                 330                 335
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
            340                 345                 350
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
        355                 360                 365
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
    370                 375                 380
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
385                 390                 395                 400
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
                405                 410                 415
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
             420                 425                 430
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
        435                 440                 445
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
465                 470
 
<210>40
<211>1380
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis C Virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1380)
 
<400>40
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg agc       96
Thr Glu Asn Leu Tyr phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ser
            20                  25                  30
                                                                                                                                                                           
acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgt cgc      144
Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
        35                  40                  45
cca cag gac gtc aag ttc ccg ggt ggc ggt cag atc gtt ggt gga gtt      192
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile ValGly Gly Val
    50                  55                  60
tac ttg ttg ccg cgc agg ggc cct aga ttg ggt gtg cgc gcg acg agg      240
Tyr Leu Leu pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg
65                  70                  75                  80
aag act tcc gag cgg tcg caa cct cga ggt aga cgt cag cct atc ccc      288
Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro
                85                  90                  95
aag gca cgt cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc ggg tac cct      336
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro
            100                 105                 110
tgg ccc ctc tat ggc aat gag ggt tgc ggg tgg gcg gga tgg ctc ctg      384
Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu
        115                 120                 125
tct ccc cgt ggc tct cgg cct agc tgg ggc ccc aca gac ccc cgg cgt      432
Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg
    130                 135                 140
agg tcg cgc aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt acg tgc ggc ttc      480
Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe
145                 150                 155                 160
gcc gac ctc atg ggg tac ata ccg ctc gtc ggc gcc cct ctt gga ggc      528
Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly
                165                 170                 175
gct gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac ggc gtg      576
Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val
            180                 185                 190
aac tat gca aca ggg aac ctt cct ggt tgc tct ttc tct atc ttc gga      624
Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Gly
        195                 200                 205
cta gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc      672
Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
210                 215                 220
agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca      720
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
225                 230                 235                 240
tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act      768
Sar Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
                245                 250                 255
ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat      816
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Sar Lys Asp Asp
            260                 265                 270
ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca      864
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
        275                 280                 285
gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca      912
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Sar
    290                 295                 300
gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag      960
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca act ttc cct gcc ccc atc gag aaa     1008
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                    325                 330                 335
acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc     1056
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr
                340                 345                 350
att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc     1104
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Sar Leu Thr
            355                 360                 365
tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag     1152
Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln
    370                 375                 380
tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg     1200
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
385                 390                 395                 400
gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag     1248
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
                405                 410                 415
agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag     1296
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr cys ser Val Leu His Glu
            420                 425                 430
ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg     1344
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
        435                 440                 445
ctg caa agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                    1380
Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
    450                 455
 
<210>41
<211>459
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>synthetic Construct
 
<400>41
 
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu ASn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ser
            20                  25                  30
Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
        35                  40                  45
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val
    50                  55                  60
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg
65                  70                  75                  80
Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro
                85                  90                  95
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro
            100                 105                 110
Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg
    130                 135                 140
Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe
145                 150                 155                 160
Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly
                165                 170                 175
Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val
            180                 185                 190
Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Gly
        195                 200                 205
Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
    210                 215                 220
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
                245                 250                 255
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
        275                 280                 285
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
    290                 295                 300
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln
    370                 375                 380
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
385                 390                 395                 400
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
                405                 410                 415
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
            420                 425                 430
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
    450                 455
 
<210>42
<211>2190
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis C virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
 
<222>(1)..(2190)
<400>42
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
                                                                                                                                                                                                                                                         
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tcc ggt       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ser Gly
            20                  25                  30
tcc tgg cta agg gac atc tgg gac tgg ara tgc gag gtg ctg agc gac      144
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp
        35                  40                  45
ttt aag acc tgg ctg aaa gcc aag ctc atg cca caa ctg cct ggg att      192
Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile
    50                  55                  60
ccc ttt gtg tcc tgc cag cgc ggg tat agg ggg gtc tgg cga gga gac      240
Pro Phe Val Ser cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp
65                  70                  75                  80
ggc att atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct gag atc act gga cat      288
Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His
                85                  90                  95
gtc aaa aac ggg acg atg agg atc gtc ggt cct agg acc tgc agg aac      336
Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn
            100                 105                 110
atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc tgt      384
Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys
        115                 120                 125
act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg ctg tgg agg gtg tct      432
Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn TyrLys Phe Ala Leu Trp Arg Val  Ser
    130                 135                 140
gca gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg gac ttc cac tac gta      480
Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Pne His Tyr Val
145                 150                 155                 160
tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag atc cca tcg      528
Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
                165                 170                 175
ccc gaa ttt ttc aca aaa ttg gac ggg gtg cgc cta cac agg ttt gcg      576
Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Pue Ala
               180                 185                 190
ccc cct tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta gga      624
Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly
        195                 200                 205
ctc cac gag tac ccg gtg ggg tcg caa tta cct tgc gag ccc gaa ccg      672
Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro
    210                 215                 220
gac gta gcc gtg ttg acg tcc atg ctc act gat ccc tcc cat ata aca      720
Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp pro Ser His Ile Thr
225                 230                 235                 240
gca gag gcg gcc ggg aga agg ttg gcg aga ggg tca ccc cct tct atg      768
Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met
                245                 250                 255
gcc agc tcc tcg gct agc cag ctg tcc gct cca tct ctc aag gca act      816
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Aer Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr
            260                 265                 270
tgc acc gcc aac cat gac tcc cct gac gcc gag ctc ata gag gct aac      864
Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn
        275                 280                 285
ctc ctg tgg agg cag gag atg ggc ggc aac atc acc agg gtt gag tca      912
Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser
    290                 295                 300
gag aac aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat ccg ctt gtg gca gag      960
Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu
305                 310                 315                 320
gag gat gag cgg gag gtc tcc gta cct gca gaa att ctg cgg aag tct     1008
Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser
                325                 330                 335
cgg aga ttc gcc cgg gcc ctg ccc gtc tgg gcg cgg ccg gac tac aac     1056
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn
            340                 345                 350
ccc ccg cta gta gag acg tgg aaa aag cct gac tac gaa cca cct gtg     1104
Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val
        355                 360                 365
gtc cat ggc tgc ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct ccg     1152
Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro
    370                 375                 380
cct cgg aaa aag cgt acg gtg gtc ctc acc gaa tca acc cta tct act     l200
Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr
385                 390                 395                 400
gcc ttg gcc gag ctt gcc acc aaa agt ttt ggc agc tcc tca act tcc     1248
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Aer Thr Ser
                405                 410                 415
ggc att acg ggc gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct tct     1296
Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser
            420                 425                 430
ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc ccc     1344
Gly Cys Pro Pro Asp Aer Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro
        435                 440                 445
ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc agc gac ggg tca tgg tcg     1392
Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Aer Trp Ser
    450                 455                 460
acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc gga cta gtg     1440
Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Gly Leu Val
465                 470                 475                 480
cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat     1488
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp
                485                 490                 495
tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc     1536
Cys Gly Cys Lys Pro cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Aer Val
            500                 505                 510
ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act     1584
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
        515                 520                 525
cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag     1632
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
    530                 535                 540
gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag     1680
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
545                 550                 555                 560
acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt     1728
Tnr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
                565                 570                 575
gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa     1776
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
            580                 585                 590
tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc     1824
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
        595                 600                 605
tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca     1872
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
    610                 615                 620
cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg     1920
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
625                 630                 635                 640
ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat     1968
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
                645                 650                 655
ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca     2016
Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
            660                 665                 670
gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac     2064
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
        675                 680                 685
tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg     2112
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
    690                 695                 700
cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa     2160
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
705                 710                 715                 720
agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                             2190
Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
                725
 
<210>43
<211>729
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>43
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe ser Gly
            20                  25                  30
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile cys Glu Val Leu Ser Asp
        35                  40                  45
Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile
    50                  55                  60
Pro Phe Val Ser cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp
65                  70                  75                  80
Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His
                85                  90                  95
Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn
            100                 105                 110
Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Tle Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys
        115                 120                 125
Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser
    130                 135                 140
Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val
145                 150                 155                 160
Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
                165                 170                 175
Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala
            180                 185                 190
Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly
        195                 200                 205
Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro
    210                 215                 220
Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr
225                 230                 235                 240
Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met
                245                 250                 255
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr
            260                 265                 270
Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn
        275                 280                 285
Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser
    290                 295                 300
Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu
305                 310                 315                 320
Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser
                325                 330                 335
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn
            340                 345                 350
Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val
        355                 360                 365
Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro
    370                 375                 380
Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr
385                 390                 395                 400
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Aer Aer Thr Ser
                405                 410                 415
Gly Tle Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Aer Glu Pro Ala Pro Ser
            420                 425                 430
Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro
        435                 440                 445
Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser
    450                 455                 460
Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val cys Gly Leu Val
465                 470                 475                 480
Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Tle Val Pro Arg Asp
                485                 490                 495
Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Aer Ser Val
            500                 505                 510
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
        515                 520                 525
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu
    530                 535                 540
Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
545                 550                 555                 560
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
                565                 570                 575
Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys
            580                 585                 590
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
        595                 600                 605
Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro
    610                 615                 620
Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met
625                 630                 635                 640
Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn
                645                 650                 655
Gly Gln Pro Ala Glu Asr Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
            660                 665                 670
Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn
        675                 680                 685
Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
    690                 695                 700
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln
705                 710                 715                 720
5er Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
                725
 
<210>44
<211>1428
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis C virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1428)
 
<400>44
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tac caa       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln
            20                  25                  30
gtg cgc aat tcc tcg ggg ctt tac cat gtc acc aat gat tgc cct aac    144
Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn
        35                  40                  45
tcg agt att gtg tac gag gcg gcc gat gcc atc ctg cac act ccg ggg    192
Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly
    50                  55                  60
tgt gtc cct tgc gtt cgc gag ggt aac gcc tcg agg tgt tgg gtg gcg    240
Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala
65                  70                  75                  80
gtg acc ccc acg gtg gcc acc agg gac ggc aaa ctc ccc aca acg cag    288
Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln
                85                  90                  95
ctt cga cgt cat atc gat ctg ctt gtc ggg agc gcc acc ctc tgc tcg    336
Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser
            100                 105                 110
gcc ctc tac gtg ggg gac ctg tgc ggg tct gtc ttt ctt gtt ggt caa    384
Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu cys Gly Ser Val Pne Leu Val Gly Gln
        115                 120                 125
ctg ttt acc ttc tct ccc agg cgc cac tgg acg acg caa gac tgc aat    432
Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn
    130                 135                 140
tgt tct atc tat ccc ggc cat ata acg ggt cat cgc atg gca tgg gat    480
Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp
145                 150                 155                 160
atg atg atg aac tgg tcc cct acg gca gcg ttg gtg gta gct cag ctg    528
Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu
                165                 170                 175
ctc cgg atc cca caa gcc atc atg gac atg atc gct ggt gct cac tgg    576
Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp
            180                 185                 190
gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac tgg gcg    624
Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala
        195                 200                 205
aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc gtc gac gcg gaa gga    672
Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Gly
    210                 215                 220
cta gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc    720
Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
225                 230                 235                 240
agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca    768
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
                245                 250                 255
tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act    816
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
            260                 265                 270
ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat    864
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
        275                 280                 285
ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca     912
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
    290                 295                 300
gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca     960
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
305                 310                 315                 320
gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag    1008
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa    1056
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            340                 345                 350
acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc    1104
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr
        355                 360                 365
att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc    1152
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag    1200
cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln
385                 390                 395                 400
tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg    1248
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
                405                 410                 415
gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag    1296
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Vat Gln Lys
               420                 425                 430
agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag    1344
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
         435                 440                 445
ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg    1392
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
    450                 455                 460
ctg caa agc ttg tcg aga agt act aga gga tca taa                    1428
Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
465                 470                 475
 
<210>45
<211>475
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic construct
 
<400>45
 
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln
            20                  25                  30
Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly
    50                  55                  60
Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala
65                  70                  75                  80
Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln
                85                  90                  95
Leu Arg Arg His Tle Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser
            100                 105                 110
Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln
        115                 120                 125
Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn
    130                 135                 140
Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp
145                 150                 155                 160
Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu
                165                 170                 175
Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp
            180                 185                 190
Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala
        195                 200                 205
Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Gly
    210                 215                 220
Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
225                 230                 235                 240
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
                245                 250                 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
            260                 265                 270
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
        275                 280                 285
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
    290                 295                 300
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
305                 310                 315                 320
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr
        355                 360                 365
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln
385                 390                 395                 400
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
                405                 410                 415
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
            420                 425                 430
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Ihr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
        435                 440                 445
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
    450                 455                 460
Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser
465                 470                 475
 
<210>46
<211>1938
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis C virus plus murine
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1938)
<400>46
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc acc cac       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Thr His    
            20                      25                      30
gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt ctc      144
Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu
        35                      40                      45
ctt aca cca ggc gcc aag cag aac atc caa ctg atc aac acc aac ggc      192
Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly
    50                      55                      60
agt tgg cac atc aat agc acg gcc ttg aat tgc aat gaa agc ctt aac      240
Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn
65                  70                      75              80
acc ggc tgg tta gca ggg ctc ttc tat caa cac aaa ttc aac tct tca      288
Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser
                85                  90                  95
ggc tgt cct gag agg ttg gcc agc tgc cga cgc ctt acc gat ttt gcc      336
Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala
            100                 105                 110
cag ggc tgg ggt cct atc agt tat gcc aac gga agc ggc ctc gac gaa      384
Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp Glu
        115                     120                     125
cgc ccc tac tgc tgg cac tac cct cca aga cct tgt ggc att gtg ccc      432
Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro
    130                 135                 140
gca aag agc gtg tgt ggc ccg gta tat tgc ttc act ccc agc ccc gtg      480
Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
gtg gtg gga acg acc gac agg tcg ggc gcg cct acc tac agc tgg ggt      528
Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly
                165                 170                 175
gca aat gat acg gat gtc ttc gtc ctt aac aac acc agg cca ccg ctg      576
Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu
            180                 185                 190
ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac tca act gga ttc acc aaa      624
Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys
        195                 200                 205
gtg tgc gga gcg ccc cct tgt gtc atc gga ggg gtg ggc aac aac acc      672
Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr
    210                 215                 220
ttg ctc tgc ccc act gat tgc ttc cgc aaa cat ccg gaa gcc aca tac      720
Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
tct cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg att aca ccc agg tgc atg gtc gac      768
Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp
                245                 250                 255
tac ccg tat agg ctt tgg cac tat cct tgt acc atc aat tac acc ata      816
Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile
            260                 265                 270
ttc aaa gtc agg atg tac gtg gga ggg gtc gag cac agg ctg gaa gcg      864
Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala
        275                 280                 285
gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaa cgc tgt gat ctg gaa gac agg gac      912
Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp
    290                 295                 300
agg tcc gag ctc agc ccg ttg ctg ctg tcc acc aca cag tgg cag gtc      960
Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val
305                 310                 315                 320
ctt ccg tgt tct ttc acg acc ctg cca gcc ttg tcc acc ggc ctc atc     1008
Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile
                325                 330                 335
cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta ggg     1056
His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly
            340                 345                 350
tca agc atc gcg tcc tgg gcc att aag tgg gag tac gtc gtt ctc ctg     1104
Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu
        355                 360                 365
ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc gtc tgc tcc tgc ttg tgg atg atg     1152
Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met
    370                 375                 380
tta ctc ata tcc caa gcg gag gcg gct gga cta gtg cgg ccg caa ggc     1200
Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly
385                 390                 395                 400
ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag     1248
Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
                405                 410                 415
cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc     1296
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
            420                 425                 430
cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg     1344
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
        435                 440                 445
tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc agc     1392
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
    450                 455                 460
tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg     1440
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
465                 470                 475                 480
gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc     1488
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
                485                 490                 495
atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac     1536
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
            500                 505                 510
agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa     1584
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
        515                 520                 525
ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag     1632
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
    530                 535                 540
cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc     1680
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
545                 550                 555                 560
ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg     1728
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
                565                 570                 575
gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac     1776
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
            580                 585                 590
ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga     1824
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
        595                 600                 605
aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat     1872
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
    610                 615                 620
act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg aga     1920
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg
625                 630                 635                 640
agt act aga gga tca taa                                             1938
Ser Thr Arg Gly Ser
                645
 
<210>47
<211>645
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>synthetic construct
 
<400>47
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Thr His
            20                  25                  30
Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly
    50                  55                  60
Ser Trp His Ile Asn ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu ser Leu Asn
65                  70                  75                  80
Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser
                85                  90                  95
Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe Ala
            100                 105                 110
Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp Glu
        115                 120                 125
Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro
    130                 135                 140
Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly
                165                 170                 175
Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Leu
            180                 185                 190
Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys
        195                 200                 205
Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr
    210                 215                 220
Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp
                245                 250                 255
Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile
            260                 265                 270
Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala
        275                 280                 285
Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp
    290                 295                 300
Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val
305                 310                 315                 320
Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile
                325                 330                 335
His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly
            340                 345                 350
Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu
        355                 360                 365
Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met
    370                 375                 380
Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly
385                 390                 395                 400
Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
                405                 410                 415
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
            420                 425                 430
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
        435                 440                 445
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
    450                 455                 460
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
465                 470                 475                 480
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
                485                 490                 495
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
            500                 505                 510
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
        515                 520                 525
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
    530                 535                 540
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
545                 550                 555                 560
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
                565                 570                 575
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
            580                 585                 590
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
        595                 600                 605
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
    610                 615                 620
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg
625                 630                 635                 640
Ser Thr Arg Gly Ser
                645
 
<210>48
<211>2517
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>Hepatitis C virus plus murine
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2517)
 
<400>48
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg       48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tac caa       96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln
            20                  25                  30
gtg cgc aat tcc tcg ggg ctt tac cat gtc acc aat gat tgc cct aac      144
Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn
        35                  40                  45
tcg agt att gtg tac gag gcg gcc gat gcc atc ctg cac act ccg ggg      192
Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly
    50                  55                  60
tgt gtc cct tgc gtt cgc gag ggt aac gcc tcg agg tgt tgg gtg gcg      240
cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala
65                  70                  75                  80
gtg acc ccc acg gtg gcc acc agg gac ggc aaa ctc ccc aca acg cag    288
Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln
                85                  90                  95
ctt cga cgt cat atc gat ctg ctt gtc ggg agc gcc acc ctc tgc tcg    336
Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser
            100                 105                 110
gcc ctc tac gtg ggg gac ctg tgc ggg tct gtc ttt ctt gtt ggt caa    384
Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln
        115                 120                 125
ctg ttt acc ttc tct ccc agg cgc cac tgg acg acg caa gac tgc aat    432
Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn
    130                 135                 140
tgt tct atc tat ccc ggc cat ata acg ggt cat cgc atg gca tgg gat    480
Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp
145                 150                 155                 160
atg atg atg aac tgg tcc cct acg gca gcg ttg gtg gta gct cag ctg    528
Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu
                165                 170                 175
ctc cgg atc cca caa gcc atc atg gac atg atc gct ggt gct cac tgg    576
Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp
            180                 185                 190
gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac tgg gcg    624
Gly Vgl Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala
        195                 200                 205
aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc gtc gac gcg gaa acc    672
Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr
    210                 215                 220
cac gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt    720
His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly
225                 230                 235                 240
ctc ctt aca cca ggc gcc aag cag aac atc caa ctg atc aac acc aac    768
Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn
                245                 250                 255
ggc agt tgg cac atc aat agc acg gcc ttg aat tgc aat gaa agc ctt    816
Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu
            260                 265                 270
aac acc ggc tgg tta gca ggg ctc ttc tat caa cac aaa ttc aac tct    864
Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser
        275                 280                 285
tca ggc tgt cct gag agg ttg gcc agc tgc cga cgc ctt acc gat ttt    912
Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe
    290                 295                 300
gcc cag ggc tgg ggt cct atc agt tat gcc aac gga agc ggc ctc gac    960
Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp
305                 310                 315                 320
gaa cgc ccc tac tgc tgg cac tac cct cca aga cct tgt ggc att gtg   1008
Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val
                325                 330                 335
ccc gca aag agc gtg tgt ggc ccg gta tat tgc ttc act ccc agc ccc     1056
Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro
            340                 345                 350
gtg gtg gtg gga acg acc gac agg tcg ggc gcg cct acc tac agc tgg     1104
Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp
        355                 360                 365
ggt gca aat gat acg gat gtc ttc gtc ctt aac aac acc agg cca ccg     1152
Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro
    370                 375                 380
ctg ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac tca act gga ttc acc     1200
Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr
385                 390                 395                 400
aaa gtg tgc gga gcg ccc cct tgt gtc atc gga ggg gtg ggc aac aac     1248
Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn
                405                 410                 415
acc ttg ctc tgc ccc act gat tgc ttc cgc aaa cat ccg gaa gcc aca     1296
Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr
            420                 425                 430
tac tct cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg att aca ccc agg tgc atg gtc     1344
Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val
        435                 440                 445
gac tac ccg tat agg ctt tgg cac tat cct tgt acc atc aat tac acc     1392
Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr
    450                 455                 460
ata ttc aaa gtc agg atg tac gtg gga ggg gtc gag cac agg ctg gaa     1440
Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu
465                 470                 475                 480
gcg gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaa cgc tgt gat ctg gaa gac agg     1488
Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg
                 485                 490                 495
gac agg tcc gag ctc agc ccg ttg ctg ctg tcc acc aca cag tgg cag     1536
Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln
            500                 505                 510
gtc ctt ccg tgt tct ttc acg acc ctg cca gcc ttg tcc acc ggc ctc     1584
Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu
        515                 520                 525
atc cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta     1632
Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val
    530                 535                 540
ggg tca agc atc gcg tcc tgg gcc att aag tgg gag tac gtc gtt ctc     1680
Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu
545                 550                 555                 560
ctg ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc gtc tgc tcc tgc ttg tgg atg     1728
Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser cys Leu Trp Met
                565                 570                 575
atg tta ctc ata tcc caa gcg gag gcg gct gga cta gtg cgg ccg caa     1776
Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln
            580                 585                 590
ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt     1824
Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
        595                 600                 605
aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc     1872
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
    610                 615                 620
ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc     1920
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
625                 630                 635                 640
acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc     1968
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
                645                 650                 655
agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc     2016
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
            660                 665                 670
cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc     2064
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
        675                 680                 685
atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc     2112
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
    690                 695                 700
aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc     2160
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
705                 710                 715                 720
aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag     2208
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
                725                 730                 735
gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac     2256
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
            740                 745                 750
ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca     2304
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
        755                 760                 765
gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct     2352
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
    770                 775                 780
tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca     2400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
785                 790                 795                 800
gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac     2448
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
                805                 810                 815
cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg     2496
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln ser Leu Ser
            820                 825                 830
aga agt act aga gga tca taa                                         2517   Arg Ser Thr Arg Gly Ser
       835
 
<210>49
<211>838
<212>PRT
<213>Artificial
 
<220>
<223>Synthetic Construct
 
<400>49
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln
            20                  25                  30
Val Arg Asn ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Tle Leu His Thr Pro Gly
    50                  55                  60
Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala
65                  70                  75                  80
Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln
                85                  90                  95
Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser
            100                 105                 110
Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln
         115                 120                 125
Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn
    130                 135                 140
Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp
145                 150                 155                 160
Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu
                165                 170                 175
Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp
            180                 185                 190
Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala
        195                 200                 205
Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr
    210                 215                 220
His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Ihr Ala Gly Leu Val Gly
225                 230                 235                 240
Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn
                245                 250                 255
Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu
            260                 265                 270
Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser
        275                 280                 285
Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe
    290                 295                 300
Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp
305                 310                 315                 320
Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val
                325                 330                 335
Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro
            340                 345                 350
Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp
        355                 360                 365
Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro
    370                 375                 380
Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr
385                 390                 395                 400
Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn
                405                 410                 415
Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr
            420                 425                 430
Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val
        435                 440                 445
Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr
    450                 455                 460
Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu
465                 470                 475                 480
Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg
                485                 490                 495
Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln
            500                 505                 510
Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu
        515                 520                 525
Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val
    530                 535                 540
GlV Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu
545                 550                 555                 560
Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met
                565                 570                 575
Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln
            580                 585                 590
Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
        595                 600                 605
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
    610                 615                 620
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
625                 630                 635                 640
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
                645                 650                 655
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
            660                 665                 670
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
        675                 680                 685
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
    690                 695                 700
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
705                 710                 715                 720
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
                725                 730                 735
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
            740                 745                 750
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
       755                 760                 765
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
    770                 775                 780
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
785                 790                 795                 800
Gly Asn Thr Phe Thr Cys ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
                805                 810                 815
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser
            820                 825                 830
Arg Ser Thr Arg Gly Ser
        835
 
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>Hepatitis B Virus
 
<400>50
 
Gly Met Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile
1               5
 
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>Hepatitis B Virus
 
<400>51
 
Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile
1               5

Claims (87)

1.一种用于引发免疫应答的嵌合抗原，所述嵌合抗原包括
免疫应答结构域和目标结合结构域，其中所述目标结合结构域包括抗体片段，以及
昆虫细胞产生的翻译后修饰，以提高宿主内的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原包括多于一个的免疫应答结构域。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括蛋白的至少一个抗原部分，所述蛋白选自：HBV蛋白、DHBV蛋白和HCV蛋白。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括HBV蛋白的至少一个抗原部分，所述HBV蛋白选自：HBVS1/S2、HBV S1/S2/S、HBV核心蛋白、HBV核心C-末端修饰和HBV聚合酶。
5.根据权利要求3所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括DHBV蛋白的至少一个抗原部分，所述DHBV蛋白选自：DHBV PreS/S、DHBV PreS、DHBV核心蛋白和DHBV聚合酶。
6.根据权利要求3所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括HCV蛋白的至少一个抗原部分，所述HCV蛋白选自：HCV核心蛋白(1-191)、HCV核心蛋白(1-177)、HCV E1-E2、HCV E1、HCV E2、HCV NS3、HCV NS5A和HCV NS4A。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域进一步包括融合到所述蛋白上的6xHis标签。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括来自HPV、HIV、HSV、专性胞内寄生虫或癌抗原的蛋白的一个或多个抗原部分。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原，其中所述目标结合结构域能够结合到抗原呈递细胞上。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原，其中所述抗体片段包括免疫球蛋白重链片段。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原，其中所述免疫球蛋白重链片段包括铰链区。
12.根据权利要求10所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原进一步包括氨基酸、VDKKI(SEQ ID NO：2)。
13.根据权利要求10所述的嵌合抗原，其中所述免疫球蛋白重链片段包括CH2和CH3结构域。
14.根据权利要求1-6或11-13中任一项所述的嵌合抗原，其中所述抗体片段为Fc片段。
15.根据权利要求1-6或11-13中任一项所述的嵌合抗原，其中所述抗体片段包括部分CH1区和抗体铰链区。
16.根据权利要求1-6或11-13中任一项所述的嵌合抗原，进一步包括用于连接所述免疫应答结构域和所述目标结合结构域的连接体。
17.根据权利要求16所述的嵌合抗原，其中所述连接体为共价肽连接体。
18.根据权利要求17所述的嵌合抗原，其中所述肽连接体包括序列XRPQGGGS(SEQ ID NO：1)，其中X是V或S。
19.根据权利要求16所述的嵌合抗原，其中所述连接体选自亮氨酸拉链和生物素/抗生物素蛋白。
20.根据权利要求1-6、11-13或17-19中任一项所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原被甘露糖糖基化。
21.根据权利要求20所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域被甘露糖糖基化。
22.根据权利要求20所述的嵌合抗原，其中所述目标结合结构域被甘露糖糖基化。
23.根据权利要求20所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原被寡甘露糖糖基化。
24.根据权利要求20所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原被高甘露糖糖基化。
25.根据权利要求1所述的嵌合抗原，其中所述目标结合结构域包括氨基酸序列SRPQGGGS(SEQ ID NO：1)、VDKKI(SEQ IDNO：2)以及鼠免疫球蛋白重链恒定区的CH2和CH3结构域。
26.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其引发多表位应答。
27.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其引发体液免疫应答。
28.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其引发细胞免疫应答。
29.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其引发Th1免疫应答、Th2免疫应答、CTL应答或其组合。
30.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原在制备用于提高抗原呈递细胞内抗原呈递的药剂中的应用。
31.根据权利要求30所述的应用，其中所述抗原呈递细胞为树突细胞。
32.根据权利要求31所述的应用，其中所述应用提高了多于一个表位的抗原呈递。
33.根据权利要求31所述的应用，其中所述应用提高了所述免疫应答结构域的至少一个表位的抗原呈递。
34.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原在制备用于活化抗原呈递细胞的药剂中的应用。
35.根据权利要求30或34所述的应用，其中所述抗原呈递细胞与所述嵌合抗原的接触发生在体外。
36.根据权利要求30或34所述的应用，其中所述抗原呈递细胞与所述嵌合抗原的接触发生在体内。
37.一种活化抗原呈递细胞的方法，所述方法包括将所述抗原呈递细胞与根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原接触，其中所述接触发生在体外。
38.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原在制备用于引发免疫应答的药剂中的应用。
39.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项的嵌合抗原在制备用于打破耐受性的药剂中的应用。
40.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原在制备用于治疗免疫-可治疗的疾病的药剂中的应用。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的应用，其中所述免疫应答结构域的单独施加不引发免疫应答。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的应用，其中所述嵌合抗原的施加所引发的免疫应答大于单独的免疫应答结构域的施加所引发的免疫应答。
43.根据权利要求42所述的应用，其中所述免疫应答通过存在于目标对象中的抗原特异性抗体的数量来测量。
44.根据权利要求42所述的应用，其中所述免疫应答通过T细胞响应于被暴露于加载有所述嵌合抗原或仅免疫应答结构域的抗原呈递细胞所分泌的干扰素-γ的数量来测量。
45.根据权利要求42所述的应用，其中所述免疫应答通过响应于被暴露于加载有所述嵌合抗原或仅免疫应答结构域的抗原呈递细胞而引发应答的抗原特异性CD8+T细胞的数量来测量。
46.根据权利要求38-40中任一项所述的应用，其中所述目标对象患有感染或癌症。
47.根据权利要求46所述的应用，其中所述感染为病毒感染或寄生虫感染。
48.根据权利要求47所述的应用，其中所述感染为慢性病毒感染。
49.根据权利要求48所述的应用，其中所述慢性病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染或慢性丙型肝炎病毒感染、慢性人类乳头瘤病毒感染、慢性人类免疫缺陷病毒感染或慢性单纯疱疹病毒感染。
50.根据权利要求49所述的应用，其中所述感染为乙型肝炎病毒感染并且所述免疫应答结构域包括选自HBV核心蛋白、HBVS蛋白、HBV S1蛋白和HBV S2蛋白及其组合物的蛋白的至少一个抗原部分。
51.根据权利要求49所述的应用，其中所述感染为丙型肝炎病毒感染并且所述免疫应答结构域包括选自HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCV E1蛋白、HCV E2蛋白、 HCV E1-E2蛋白、HCV NS3蛋白、HCV NS5A蛋白及其组合物的蛋白的至少一个抗原部分。
52.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原在制备用于为目标对象接种针对病毒感染的疫苗的药剂中的应用。
53.根据权利要求52所述的应用，其中为所述目标对象治疗性地接种针对存在的病毒感染的疫苗。
54.根据权利要求52所述的应用，其中为所述目标对象预防性地接种针对存在的病毒感染的疫苗。
55.根据权利要求52所述的应用，其中所述目标对象产生针对所述嵌合抗原的多于一个表位的免疫应答。
56.根据权利要求52所述的应用，其中所述目标对象产生针对所述免疫应答结构域的多于一个表位的免疫应答。
57.一种药物组合物，包括药学上可接受的赋形剂和根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原。
58.根据权利要求57所述的药物组合物，其中所述药物组合物配置为用于胃肠外施用。
59.根据权利要求57所述的药物组合物，其中所述药物组合物配置为用于经皮给药、真皮内给药、静脉内给药、皮下给药、肌内给药、经鼻腔给药、经肺给药或口腔内给药。
60.一种制品，包括根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原和用于将所述嵌合抗原施用于需要该嵌合抗原的目标对象的说明书。
61.一种生成嵌合抗原的方法，包括：
(a)提供微生物或细胞系，其包括编码根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原的多聚核苷酸；以及
(b)在所述嵌合抗原被表达的条件下培养所述微生物或细胞系。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述微生物或细胞系是真核微生物或细胞系。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述微生物或细胞系是酵母、植物细胞系或昆虫细胞系。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述嵌合抗原被翻译后修饰以包括甘露糖糖基化。
65.一种编码嵌合抗原的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包括编码免疫应答结构域的第一多聚核苷酸部和编码目标结合结构域的第二多聚核苷酸部，其中所述目标结合结构域包括抗体片段，具有昆虫细胞产生的翻译后修饰以提高宿主内的免疫原性，以及其中所述多聚核苷酸包括选自下述序列的核苷酸序列：SEQID NO：26的第1到1326个核苷酸、SEQ ID NO：28的第1到2004个核苷酸、SEQ ID NO：30的第1到1350个核苷酸、SEQ ID NO：32的第1到1293个核苷酸、SEQ ID NO：34的第1到1794个核苷酸、SEQ ID NO：36的第1到1581个核苷酸、SEQ ID NO：38的第1到1389个核苷酸、SEQ ID NO：40的第1到1347个核苷酸、SEQ ID NO：42的第1到2157个核苷酸、SEQ ID NO：44的第1到1395个核苷酸、SEQ IDNO：46的第1到1905个核苷酸或者SEQ ID NO：48的第1到2484个核苷酸。
66.根据权利要求65所述的多聚核苷酸，其中所述免疫应答结构域包括病毒蛋白的至少一个抗原部分。
67.根据权利要求66所述的多聚核苷酸，其中所述病毒蛋白为HBV蛋白或HCV蛋白。
68.一种编码嵌合抗原的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包括编码免疫应答结构域的第一多聚核苷酸部和编码目标结合结构域的第二多聚核苷酸部，其中所述目标结合结构域包括抗体片段，具有昆虫细胞产生的翻译后修饰以提高宿主内的免疫原性，以及其中所述多聚核苷酸在严格的条件下选择性地与具有选自下述序列的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交：SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48。
69.根据权利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述免疫应答结构域包括病毒蛋白的至少一个抗原部分。
70.根据权利要求69所述的多聚核苷酸，其中所述病毒蛋白为HBV蛋白或HCV蛋白。
71.包括根据权利要求65或68所述的多聚核苷酸的微生物或细胞系。
72.包括根据权利要求65或68所述的多聚核苷酸的载体。
73.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其中所述翻译后修饰包括糖基化。
74.根据权利要求73所述的嵌合抗原，其中所述糖基化包括甘露糖糖基化。
75.根据权利要求74所述的嵌合抗原，其中所述甘露糖糖基化包括高甘露糖糖基化。
76.根据权利要求74所述的嵌合抗原，其中所述糖基化包括寡甘露糖糖基化。
77.根据权利要求73所述的嵌合抗原，其中所述翻译后修饰能够结合内吞受体的C型凝集素家族的成员。
78.根据权利要求81所述的嵌合抗原，其中所述内吞受体的C型凝集素家族的成员是巨噬细胞甘露糖受体。
79.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括正黏病毒的至少一个抗原部分。
80.根据权利要求79所述的嵌合抗原，其中所述正黏病毒是流感病毒。
81.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其中所述免疫应答结构域包括痘病毒的至少一个抗原部分。
82.根据权利要求81所述的嵌合抗原，其中所述痘病毒是天花病毒。
83.根据权利要求9所述的嵌合抗原，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
84.根据权利要求1-6、11-13、17-19或21-25中任一项所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原能够结合Fc受体。
85.根据权利要求84所述的嵌合抗原，其中所述Fc受体选自由CD16、CD32、和CD64组成的组。
86.根据权利要求57所述的组合物，进一步包括纳米颗粒。
87.根据权利要求57所述的组合物，进一步包括纳米球。
CN2004800227471A 2003-08-08 2004-08-06 用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原 Expired - Lifetime CN1845995B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49344903P 2003-08-08 2003-08-08
US60/493,449 2003-08-08
PCT/CA2004/001469 WO2005014838A1 (en) 2003-08-08 2004-08-06 Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1845995A CN1845995A (zh) 2006-10-11
CN1845995B true CN1845995B (zh) 2011-04-27

Family

ID=34135247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800227471A Expired - Lifetime CN1845995B (zh) 2003-08-08 2004-08-06 用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8007805B2 (zh)
EP (2) EP2213742B1 (zh)
JP (1) JP5200201B2 (zh)
KR (2) KR101327719B1 (zh)
CN (1) CN1845995B (zh)
AU (1) AU2004263561A1 (zh)
BR (1) BRPI0413314A (zh)
CA (1) CA2534911C (zh)
EA (1) EA013070B1 (zh)
HK (1) HK1091512A1 (zh)
IL (1) IL173302A0 (zh)
MX (1) MXPA06001449A (zh)
NO (1) NO20061071L (zh)
NZ (1) NZ545048A (zh)
TW (1) TWI364294B (zh)
WO (1) WO2005014838A1 (zh)
ZA (1) ZA200600804B (zh)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
AU2005304624B2 (en) * 2004-11-12 2010-10-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
ZA200804078B (en) * 2005-10-13 2009-09-30 Virexx Medical Corp Chimeric hepatitis C virus antigens for eliciting an immune response
GB0605735D0 (en) * 2006-03-22 2006-05-03 Immunobiology Ltd Composition and method for mediating an immune response
GB0615266D0 (en) * 2006-08-01 2006-09-06 Immunobiology Ltd Composition and method for mediating an immune response
US7709010B2 (en) * 2007-03-09 2010-05-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Papillomavirus vaccine compositions
NZ584306A (en) * 2007-08-30 2012-10-26 Paladin Labs Inc Antigenic compositions and use of same in the targeted delivery of nucleic acids
US20090305611A1 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Flow International Corporation Device and method for improving accuracy of a high-pressure fluid jet apparatus
US9393299B2 (en) * 2009-08-07 2016-07-19 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
EP2335721A1 (en) * 2009-12-21 2011-06-22 Institut Pasteur Streptavidin and Biotin-based antigen delivery system
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
JP6017422B2 (ja) 2010-08-10 2016-11-02 エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） 赤血球結合療法
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9238679B2 (en) * 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
US9238683B2 (en) 2011-02-23 2016-01-19 University Of Maryland College Park Efficient mucosal vaccination mediated by the neonatal Fc receptor
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
JP6373836B2 (ja) 2012-07-26 2018-08-15 ザ・ヘンリー・エム・ジャクソン・ファンデイション・フォー・ジ・アドヴァンスメント・オヴ・ミリタリー・メディシン、インコーポレイテッド 多量体融合タンパク質ワクチン及び免疫療法
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
ES2874884T3 (es) 2014-02-21 2021-11-05 Ecole Polytechnique Fed De Lausanne Epfl Epfl Tto Compuestos terapéuticos dirigidos a la glucosa
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
WO2015190885A1 (ko) * 2014-06-12 2015-12-17 중앙대학교 산학협력단 면역원성 복합 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 이로부터 수득된 면역원성 복합 단백질
US10441649B2 (en) 2015-02-02 2019-10-15 The University Of Birmingham Targeting moiety peptide epitope complexes having a plurality of T-cell epitopes
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
CN104829732A (zh) * 2015-03-25 2015-08-12 温州医科大学 一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法
AU2016336150B2 (en) 2015-10-08 2023-08-10 The Governors Of The University Of Alberta Hepatitis C virus E1/E2 heterodimers and methods of producing same
CN112807429A (zh) 2015-11-19 2021-05-18 雷维托普有限公司 用于对非所要细胞进行重定向杀灭的两组分系统的功能性抗体片段互补作用
US11253579B2 (en) 2017-06-16 2022-02-22 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
WO2021007070A2 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Akshaya Bio Inc. Chimeric antigens for treating viral infection
JP2022546592A (ja) 2019-09-03 2022-11-04 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド ゲノム組込みのための方法および組成物
BR112022011339A2 (pt) * 2019-12-11 2022-10-04 Myeloid Therapeutics Inc Composições de células terapêuticas e métodos para fabricação e usos das mesmas
JP2023549140A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4088748A (en) * 1976-11-02 1978-05-09 Merck & Co., Inc. Hepatitis B surface antigen
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4181713A (en) * 1978-10-30 1980-01-01 Merck & Co., Inc. Isolation of HBs Ag
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
US5196194A (en) * 1979-05-24 1993-03-23 The Regents Of The University Of California Vaccines containing Hepatitis B S-protein
US4433059A (en) * 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
US4816249A (en) * 1981-11-17 1989-03-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monoclonal anti-idiotype antibodies
US4501728A (en) * 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5053224A (en) * 1983-11-07 1991-10-01 Hilary Koprowski Induction of antibody response to solid tumors with anti-idiotype antibodies
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US6808901B1 (en) * 1984-09-03 2004-10-26 Celltech R&D Limited Production of chimeric antibodies
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US5019369A (en) * 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US5023252A (en) * 1985-12-04 1991-06-11 Conrex Pharmaceutical Corporation Transdermal and trans-membrane delivery of drugs
CA1304886C (en) * 1986-07-10 1992-07-07 Heinz Dobeli Metal chelate resins
US5047513A (en) * 1986-07-10 1991-09-10 Hoffmann-La Roche Inc. Metal chelate resins
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US6710169B2 (en) * 1987-10-02 2004-03-23 Genentech, Inc. Adheson variants
US5336603A (en) * 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5750375A (en) 1988-01-22 1998-05-12 Zymogenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions
ES2092468T3 (es) 1988-01-22 1996-12-01 Zymogenetics Inc Metodos para producir analogos de receptores secretados.
US6004781A (en) * 1988-01-22 1999-12-21 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins
US6018026A (en) 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
AU3342689A (en) * 1988-03-24 1989-10-16 Igen Incorporated Luminescent chimeric proteins
US5098833A (en) * 1989-02-23 1992-03-24 Genentech, Inc. DNA sequence encoding a functional domain of a lymphocyte homing receptor
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US6406697B1 (en) * 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5216131A (en) * 1989-02-23 1993-06-01 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptors
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
KR927003613A (ko) * 1989-08-23 1992-12-18 더 제너랄 호스피탈 코오퍼레이숀 비-인체 영장동물의 cd4폴리텝타이드, 글리코실화할 수 있는 인체 cd4분자, 그것의 단편, 그것의 융합 단백질, 유전자 서열 및 그것의 용도
US5969109A (en) * 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
ES2094231T3 (es) 1990-07-20 1997-01-16 Pharmacia & Upjohn Ab Conjugados de anticuerpos superantigenos especificos de una diana y su preparacion.
ES2129029T5 (es) 1990-10-05 2005-10-16 Celldex Therapeutics, Inc. Inmunoestimulacion dirigida con reactivos biespecificos.
US6248332B1 (en) * 1990-10-05 2001-06-19 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
JP3011510B2 (ja) * 1990-12-20 2000-02-21 株式会社東芝 相互連結回路基板を有する半導体装置およびその製造方法
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
US5928902A (en) * 1992-02-27 1999-07-27 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg
EP0992581B2 (en) * 1993-11-04 2011-05-25 Innogenetics N.V. Immunodominant human T-cell epitopes of hepatitis C virus
US5817308A (en) * 1994-02-14 1998-10-06 University Of Rochester Tolerogenic fusion proteins of immunoglobulins and methods for inducing and maintaining tolerance
US5686600A (en) * 1994-06-28 1997-11-11 Novartis Finance Corporation Antibodies which bind to insect gut proteins and their use
SE9402430L (sv) 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
JPH10511846A (ja) * 1994-12-28 1998-11-17 ユニバーシティ オブ ケンタッキー ヒトガン胎児性抗原に関連する組換えモノクローナル抗イディオタイプ抗体３ｈ１配列
DE69637523D1 (de) 1995-06-07 2008-06-26 Sanofi Pasteur Ltd Chimäre antikörper zur abgabe von antigenen an selektierte zellen des immunsystems
GB9516760D0 (en) 1995-08-16 1995-10-18 Sandoz Ltd Organic compounds
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
ES2193240T3 (es) * 1996-05-15 2003-11-01 Altarex Inc Metodo y composicion para reconformar antigenos multi-epitopicos para iniciar una respuesta inmune.
ATE403001T1 (de) * 1996-05-22 2008-08-15 Viventia Biotech Inc Antigenbindungsfragmente die spezifisch krebszellen nachweisen, nukleotide die für diese fragmente kodieren, und deren verwendung zur vorbeugung und zum nachweis von krebs
EP0839915A1 (en) 1996-11-01 1998-05-06 Institut Suisse De Recherches Experimentales Sur Le Cancer Isrec Secretory immunoglobulin A as a mucosal vaccine delivery system
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP4458556B2 (ja) * 1997-05-06 2010-04-28 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Ｃ型肝炎のｅ２短縮型ポリペプチドの細胞内生成
US6242195B1 (en) * 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US7090976B2 (en) * 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
WO1999061630A2 (en) * 1998-05-26 1999-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric molecules comprising an extracellular ligand binding domain of a receptor and an ige fc or constant region, and their use in an assay system
IL139832A0 (en) 1998-06-15 2002-02-10 Altarex Inc Therapeutic compositions that produce an immune response by altering the antigen
EP1117691A1 (en) 1998-10-05 2001-07-25 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for producing human tumor antigen specific antibodies
KR100922809B1 (ko) * 1999-05-06 2009-10-21 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) * 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6716966B1 (en) 1999-08-18 2004-04-06 Altarex Corp. Therapeutic binding agents against MUC-1 antigen and methods for their use
GB9925966D0 (en) 1999-11-02 1999-12-29 Petrik Juraj Threapeutic vaccines against variable viruses and other targets
GB9926084D0 (en) 1999-11-03 2000-01-12 King S College London Recombinant fusion molecules
CA2405557C (en) * 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001267780B2 (en) * 2000-05-11 2006-07-13 Altarex Medical Corp. Therapeutic method and composition utilizing antigen-antibody complexation and presentation by dendritic cells
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1487992A4 (en) * 2002-03-15 2007-10-31 Brigham & Womens Hospital CENTRAL AIRWAY DELIVERY FOR SYSTEMIC DRUG DELIVERY
US20040063912A1 (en) * 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
AU2003232081B2 (en) 2002-07-03 2009-02-05 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
CA2522690A1 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050281829A1 (en) 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
ATE497783T1 (de) 2003-05-06 2011-02-15 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor vii-fc chimäre proteine zur behandlung von hämostatischen krankheiten
BRPI0507174A (pt) 2004-01-28 2008-04-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc proteìnas de fusão hormÈnio-fc (fsh-fc) heterodiméricas estimuladoras de folìculo para o tratamento da infertilidade
ZA200804078B (en) * 2005-10-13 2009-09-30 Virexx Medical Corp Chimeric hepatitis C virus antigens for eliciting an immune response

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOU Z等.TARGETING DENDRITIC CELLS TO ENHANCE DNAVACCINE POTENCY.CANCER RESEARCH61.2001,613704-3711. *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ545048A (en) 2009-06-26
JP5200201B2 (ja) 2013-06-05
KR20060089719A (ko) 2006-08-09
US8007805B2 (en) 2011-08-30
CN1845995A (zh) 2006-10-11
EP1664270A1 (en) 2006-06-07
TW200515916A (en) 2005-05-16
MXPA06001449A (es) 2006-08-25
KR101327719B1 (ko) 2013-11-12
AU2004263561A1 (en) 2005-02-17
HK1091512A1 (zh) 2007-01-19
KR20120102167A (ko) 2012-09-17
EP2213742B1 (en) 2016-01-06
ZA200600804B (en) 2007-04-25
BRPI0413314A (pt) 2006-10-10
TWI364294B (en) 2012-05-21
EA200600390A1 (ru) 2006-08-25
US20050031628A1 (en) 2005-02-10
EA013070B1 (ru) 2010-02-26
IL173302A0 (en) 2006-06-11
EP1664270B1 (en) 2014-05-21
WO2005014838A1 (en) 2005-02-17
EP2213742A1 (en) 2010-08-04
NO20061071L (no) 2006-05-08
CA2534911C (en) 2018-10-02
EP1664270A4 (en) 2006-09-06
JP2007501602A (ja) 2007-02-01
CA2534911A1 (en) 2005-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1845995B (zh) 用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原
US8465745B2 (en) Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) Chimeric antigens for eliciting an immune response
KR101650364B1 (ko) 항원-특이적인 t 세포 반응을 유도하는 면역 강화제로서 사용을 위한 융합 단백질
CN101287487B (zh) 基于使用纤连蛋白eda结构域的试剂和方法
JP2009511024A (ja) 免疫応答を誘導するためのＣ型肝炎ウイルスポリペプチドおよびＦｃフラグメントを含むキメラ抗原
TWI358301B (en) Hcv vaccines
AU2006301171B2 (en) Immunostimulatory combination for the prophylactics and treatment of hepatitis C
AU2012200998B2 (en) Chimeric Antigens for Breaking Host Tolerance to Foreign Antigens
CA2158461A1 (en) Stimulation of immune response by viral protein
CN1737147B (zh) 热休克蛋白65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原重组融合蛋白（HSP65-HBcAg）
Bergamin et al. Porcine B-cell activating factor promotes anti-FMDV antibodies in vitro but not in vivo after DNA vaccination of pigs

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: PERRAUDIN LAB CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: VIREXX MEDICAL CORP.

Effective date: 20120517

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20120517

Address after: alberta canada

Patentee after: Paladin Laboratories

Address before: alberta canada

Patentee before: Virexx Medical Corp.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221020

Address after: Alberta Canada

Patentee after: Aikesha Yabaio Co.

Address before: alberta canada

Patentee before: Paladin Laboratories

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230423

Address after: Chengdu Tianfu international biological city, Chengdu, Sichuan Province (No.18, Section 2, middle biological Road, Shuangliu District)

Patentee after: Kemi Biomedical (Chengdu) Co.,Ltd.

Address before: Alberta Canada

Patentee before: Aikesha Yabaio Co.

CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20110427