MXPA06001449A

MXPA06001449A - Antigenos quimericos para alterar la tolerancia del anfitrion a antigenos ajenos.

Info

Publication number: MXPA06001449A
Application number: MXPA06001449A
Authority: MX
Inventors: Allan Ma
Original assignee: Virexx Medical Corp
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2006-08-25
Also published as: EP1664270A4; EP1664270B1; CN1845995A; AU2004263561A1; NO20061071L; CA2534911A1; EP2213742B1; EP1664270A1; CN1845995B; JP2007501602A; CA2534911C; EP2213742A1; US20050031628A1; EA013070B1; IL173302A0; WO2005014838A1; EA200600390A1; KR101327719B1; TW200515916A; JP5200201B2

Abstract

Se describen aqui composiciones y metodos para producir respuestas inmunes contra antigenos. En particular, los compuestos y metodos producen respuestas inmunes contra antigenos ajenos que son, en otras circunstancias, reconocidos por el anfitrion como antigenos "propios", alterando de este modo la tolerancia del anfitrion a aquellos antigenos. Presentar al sistema inmune del anfitrion con un antigeno quimerico comprende un dominio de respuesta inmune y un dominio de union del blanco, donde el dominio de union del blanco comprende un fragmento de anticuerpo, mejora la respuesta inmune contra el antigeno ajeno o tolerado. Las celulas presentadoras de antigenos absorben, procesan y presentan el antigeno quimerico, presentando una respuesta inmune humoral y una celular contra el antigeno deseado.

Description

ANTIGENOS QUIMÉRICOS PARA ALTERAR LA TOLERANCIA DEL ANFITRIÓN A ANTIGENOS AJENOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para producir o mejorar una respuesta inmune y para alterar la tolerancia del anfitrión a antigenos ajenos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cuando un anfitrión sano (humano o animal) encuentra un antigeno ajeno, como una proteina derivada de una bacteria, virus y/o parásito, el anfitrión normalmente inicia una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede ser una respuesta humoral y/o una respuesta celular. En la respuesta humoral, los anticuerpos son producidos por células B y son secretados de la sangre y/o linfa en respuesta a un estimulo antigénico. El anticuerpo neutraliza entonces el antigeno, por ejemplo, un virus, uniéndose específicamente a los antigenos sobre su superficie, marcando estos para su destrucción por células fagociticas y/o mecanismos mediados por el complemento, o bloqueando la unión o mejorando la eliminación del antigeno libre de la circulación. La respuesta celular se caracteriza por la selección y expansión de linfocitos T auxiliares y citotóxicos específicos capaces de eliminar de manera directa o indirecta las células que contienen el antigeno. Ref. 169627 En algunos individuos, el sistema inmune no responde a ciertos antígenos ajenos. Cuando un antígeno no estimula la producción de anticuerpos específicos y/o células T asesinas, el sistema inmune es incapaz; de evitar la enfermedad resultante. De este modo, el agente infeccioso, por ejemplo un virus, puede establecer una infección crónica y el sistema inmune anfitrión se vuelve tolerante a los antígenos producidos por el agente infeccioso. Aunque el mecanismo mediante el cual el agente infeccioso evade la maquinaria inmune del anfitrión no está claramente establecido, la falta de una presentación apropiada de antígenos ajenos al sistema inmune del anfitrión puede ser un factor que contribuye al desarrollo de infecciones crónicas . Las células presentadoras de antígenos (APCs) procesan los antígenos encontrados de manera diferente dependiendo de la localización del antígeno. Los antígenos exógenos son endocitosados y posteriormente procesados dentro de los endosomas de la célula presentadora de antígeno. Los fragmentos peptídicos generados a partir de los antígenos exógenos son presentados sobre la superficie de la célula complejada con Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC) de la Clase II. La presentación de este complejo a células T CD4+ estimula a las células auxiliares T CD4+ más a secretar citocinas que estimulan a las células B para producir anticuerpos contra el antígeno exógeno (respuesta humoral) .

Los antígenos intracelulares, por otro lado, son presentados y procesados como complejos con MHC de la Clase I sobre la superficie de las células presentadoras de antígenos. La presentación de antígenos a las células T CD8+ da como resultado una respuesta inmune de células T citotóxicas (CTL) contra la células del anfitrión que contienen el antígeno. En sujetos con infecciones virales o parasitarias crónicas (donde el organismo reside dentro de la célula anfitriona en algún punto durante su ciclo de vida) , los antígenos serán producidos y expresados en la célula anfitriona y los antígenos secretados estarán presentes en la circulación. Como un ejemplo, en el caso de un portador del virus de la hepatitis B (HBV) humana crónica, los viriones y los antígenos de la superficie del HBV y un sustituto de los antígenos centrales (en forma del antígeno e) pueden ser detectados en la sangre. Una terapia efectiva para una infección crónica requiere una respuesta fuerte de la CTL contra antígenos asociados con el agente infeccioso. Esto puede ser logrado produciendo el antígeno dentro de la célula anfitriona, o liberando el antígeno al compartimiento celular apropiado, de modo que sea procesado y presentado para producir una respuesta celular. En la literatura han sido documentados varios métodos para liberar un' antígeno intracelularmente. Entre esos, vectores virales, (Lorenz et al., Huía. Gen . Ther. 10:623-631 (1999)), el uso de células transfectadas con ADNc (Donnelly et al., Ann . Rev. Immunol . 15:617 (1997)) así como la expresión del antígeno a través de vectores de ADNc inyectados (Lai et al., Cri t . Rev. Immunol . 18:449-484 (1988); y la Patente Estadounidense No. 5,589,466), han sido documentados. Además, han sido descritas vacunas de ADN que expresan antígenos dirigidos a células dendríticas (You, et al., Cáncer Res 61:3704-3711 (2001)). También han sido usados vehículos de liberación capaces de llevar los antígenos al compartimiento citosólico de la célula para el procesamiento vía el MHC de la Clase I . Hilgers, et al. {Vaccine 17:219-228 (1999)) ha descrito con detalle el uso de adyuvantes para lograr la misma meta. Otro método es el uso de microesferas biodegradables para la liberación citoplásmica de antígenos, ejemplificado por la generación de una respuesta inmune de Thl contra el péptido ovalbúmina (Newman, et al., " Control Reléase 54:49-59 (1998); y Newman, et al., J Biomed Mater Res 50:591-597 (2000)). Adicionalmente, las células presentadoras de antígenos, por ejemplo, las células dendríticas, absorben las nanoesferas de PLGA (Newman, et al., J" Biomed Mater Res 60:480-486 (2002) ) . La capacidad de las células dendríticas para capturar, procesar y presentar los antígenos para estimular células T nativas las ha convertido en herramientas muy importantes para el desarrollo de vacunas terapéuticas (Laupeze, et al., Hum Immunol 60:591-597 (1999)). La dirección del antígeno a las células dendríticas es un paso crucial en la presentación de antígenos y la presencia de varios receptores sobre las células dendríticas para la región Fc de anticuerpos han sido explotadas para este propósito (Regnault, et al., J" Exp Med 189: 371-380 (1999)). Los ejemplos adicionales de este método incluyen al Acm de cáncer de ovario de B43.13, anticuerpo Anti-PSA así como complejos de antígeno con anticuerpo Anti-HBV ( en, et al., Znt Rev Im unol 18:251-258 (1999)). La inmunoterapia del cáncer usando células dendríticas cargadas con a?tígenos asociados con tumor ha mostrado producir respuestas inmunes específicas del tumor y actividad antitumoral (Fong y Engleman, Ann Rev Immunol 96: 1865- 1972 (2000); y Campton, et al. J Invest Dermatol 115:57-61 (2000)). Se obtuvieron resultados prometedores en ensayos clínicos in vivo usando células dendríticas impulsadas con antígenos tumorales (Tarte y Klein, Leukemia 13:653-663 (1999)). Esos estudios demuestran claramente la eficacia de usar células dendríticas para generar respuestas inmunes contra antígenos de cáncer. La presentación de antígenos también puede ser afectada vía receptores de mañosa, en lugar de, o además de, utilizar el receptor de Fc o células presentadoras de antígenos. El receptor de mañosa de macrófago (MMR), también conocido como CD206, es expresado sobre células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas (DC) . Está molécula es un miembro de la familia de la lectina tipo C y de receptores endocitícos . Los antígenos manosilados pueden ser unidos e internalizados por el CD206. En general, se piensa que los antígenos exógenos son presentados y procesados principalmente a través de la vía del MHC de la clase II. Sin embargo, en el caso de dirección a través del CD206, existe evidencia de que están implicadas ambas vías del MHC de la clase I y la clase II (Apostolopoulos et al . , ' Eur. J. I munol . 30: 1714 (2000); Apostolopoulos y McKenzie, Curr. Mol . Med. 1:469 (2001); Ramakrishna et al., ". Immunol . 172: 2845-2852 (2004) ) . Las enfermedades infecciosas y el cáncer son problemas de salud pública mayores. Por ejemplo, las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud muestran que más de 2 billones de personas han sido infectadas por el HBV. Entre esas, 370 millones están infectados de manera crónica, y como resultado, tienen una alta probabilidad de desarrollar cirrosis del hígado y carcinoma hepatocelular . Aproximadamente 170 millones de personas en todo el mundo son portadores crónicos de HCV, para el cual no existe una vacuna profiláctica o terapéutica efectiva. La Organización Mundial de la Salud reporta que 10 millones de personas son diagnosticadas con cáncer cada año. El cáncer produce 6 millones de muertes cada año, 12% de las muertes en todo el mundo . Por lo tanto existe la necesidad de nuevas composiciones terapéuticamente efectivas y métodos para producir respuestas inmunes contra infecciones y el cáncer, así como nuevos métodos para producir esas composiciones . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona antígenos quiméricos para producir una respuesta inmune, comprendiendo los antígenos quiméricos un dominio de respuesta inmune y un dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo. Otro aspecto de la invención proporciona métodos para mejorar la presentación de antígenos en una célula presentadora de antígenos que comprende poner en contacto la célula presentadora de antígenos con una composición que comprende un antígeno quimérico de la invención. Incluso otro aspecto más de la invención proporciona métodos para activar células presentadoras de antígenos que comprende poner en contacto las células presentadoras de antígenos con un antígeno quimérico de la invención. Un aspecto de la invención proporciona métodos para producir una respuesta inmune que comprende administrar a un sujeto, una composición que comprende un antígeno quimérico de la invención.

Otro aspecto de la invención proporciona métodos para alterar la tolerancia que comprende administrar un antígeno quimérico de la invención a un sujeto. En una modalidad preferida, el sujeto es infectado crónicamente con un virus o un parásito intracelular obligado. Un aspecto de la invención proporciona métodos para tratar una condición tratable de manera inmune que comprende administrar, a un sujeto que necesite de los mismos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antígeno quimérico de la invención. En una modalidad preferida, la condición tratable de manera inmune es una infección, especialmente una infección crónica, o cáncer. Incluso otro aspecto más de la invención proporciona métodos para vacunar a un sujeto contra una infección, caracterizado porque comprende administrar un antígeno quimérico de la presente invención al sujeto. El sujeto puede ser vacunado profiláctica o terapéuticamente. En una modalidad preferida, el sujeto desarrolla una respuesta inmune a más de un epítope del antígeno quimérico, y de manera más preferible a más de un epítope del dominio de la repuesta inmune. Preferiblemente, la infección es una infección viral o una infección parasital intracelular obligada.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un antígeno quimérico de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un aspecto de la invención proporciona artículos de manufactura que comprenden un antígeno quimérico de la invención e instrucciones para administrar el antígeno quimérico a un sujeto que necesite del mismo. Otro aspecto de la invención proporciona polinucleótidos que codifican para un antígeno quimérico, comprendiendo el polinucleótido una primer porción polinucleotídica que codifica para un primer dominio a la respuesta inmune y una segunda porción polinucleotídica que codifica para un dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo. La invención también proporciona microorganismos y líneas celulares que comprenden esos polinucleótidos. Incluso otro aspecto más de la invención proporciona métodos para producir un antígeno quimérico de la invención que comprende proporcionar un microorganismo o línea celular, que comprende un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico de la invención, y cultivar el microorganismo o línea celular bajo condiciones por las cuales el antígeno quimérico sea expresado . Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y en la descripción siguiente. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B. La figura ÍA proporciona un diagrama esquemático que ilustra la estructura de un antígeno quimérico de la presente invención como un monómero donde el antígeno quimérico tiene dos porciones, a saber un dominio de respuesta inmune y un dominio de unión del blanco. El esquema también ilustra una modalidad preferida, en la cual está presente una región de bisagra. La Figura IB proporciona un diagrama esquemático que ilustra una estructura de un antígeno quimérico de la invención en su estado normal, montado como un dímero. El esquema ilustra una modalidad particularmente preferida, en la cual el antígeno quimérico comprende una marca 6xHis y un enlazante peptídico además de los dominios de respuesta inmune y unión del blanco. La Figura 2 demuestra que la estimulación de las células T con HBV S1/S2TBD genera células T citotóxicas (CTL) en respuesta específica contra un epítope de la proteína SI del HBV. La Figura 3 demuestra que el estímulo de las células T con HBV S1/S2-TBD genera una respuesta de células T citotóxicas (CTL) específicamente contra el epítope de la proteína S2 de HBV. La Figura 4 muestra la comparación de la absorción de HBV S1/S2-TBD, IgGl e IgG2 por células dendríticas en maduración como función de la concentración. La Figura 5 muestra la correlación de la unión de HBV S1/S2-TBD a CD32 y la expresión de CD206 sobre las células dendríticas . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INCENCION A. Vista General Se describen aquí composiciones y métodos para producir respuestas inmunes contra antígenos. En particular, los compuestos y métodos producen respuestas inmunes contra antígenos ajenos que son, en otras circunstancias, reconocidos por el anfitrión como antígenos "propios" , quebrando de este modo la tolerancia del anfitrión a aquellos antígenos. La presentación al sistema inmune del anfitrión de un antígeno quimérico que comprende dominios de respuesta inmune y un dominio de unión al blanco, donde el dominio de unión al blanco comprende un fragmento de anticuerpo, mejora la respuesta inmune contra el antígeno ajeno o tolerado. Las células presentadoras de antígenos absorben, procesan y presentan el antígeno quimérico, produciendo una respuesta inmune humoral y una celular contra el antígeno deseado.

B. Definiciones Antes de describir la invención con mayor detalle, los términos usados en esta solicitud son definidos como sigue a menos que se indique otra cosa. "Anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina producida por células linfoides B con una secuencia de aminoácidos específica evocada en humanos u otros animales por un antígeno (inmunógeno) . Esas moléculas se caracterizan porque reaccionan específicamente con el antígeno, siendo cada uno definido en términos del otro. "Respuesta del anticuerpo" o "respuesta humoral" se refiere a un tipo de respuesta inmune en la cual son producidos anticuerpos por células linfoides B y son secretadas hacia la sangre y/o linfa en respuesta a un estímulo antigénico. En una respuesta inmune que funcione apropiadamente, el anticuerpo se une específicamente a antígenos sobre la superficie de células (por ejemplo, un patógeno) , marcando la célula para su destrucción por células fagocíticas y/o mecanismos mediados por el complemento. Los anticuerpos también circulan sistémicamente y pueden unirse a viriones libres. Esta unión del anticuerpo puede neutralizar al virión y evitar que infecte a células así como marcar al virión para su eliminación de la circulación por fagocitosis o filtración en los ríñones.

"Antígeno" se refiere a cualquier sustancia que, como resultado de entrar en contacto con las células apropiadas, induce un estado de sensibilidad y/o respuesta inmune y que reacciona en una forma demostrable con anticuerpos y/o células inmunes del sujeto sensibilizado in vivo o ex vivo. "Célula presentadora de antígeno" se refiere a las células accesorias de eventos inductivos de antígeno que funciona principalmente para manejar y presentar el antígeno a los linfocítos. La interacción de las células presentadoras de antígenos con antígenos es el paso esencial en la inducción inmune debido a que permite que los linfocitos encuentren y reconozcan moléculas antigénicas y sean activados. Las células presentadoras de antígenos ejemplares incluyen macrófagos, células dendríticas de Langerhans, células dendríticas Foliculares y células B. "Células B" se refiere a un tipo de linfocitos que produce inmunoglobulinas con anticuerpos que interactúan con antígenos. "Región CH1" se refiere a una región del dominio constante de cadena pesada sobre el fragmento de unión del antígeno de un anticuerpo. "Respuesta celular" se refiere a un tipo de respuesta inmune mediada por células T auxiliares o asesinas específicas capaces de eliminar directamente células infectadas viralmente o cancerosas.

Como se usa aquí, el término "antígeno quimérico" se refiere a un polipéptido que comprende un dominio de respuesta inmune y un dominio de unión del blanco. El dominio de respuesta inmune y los dominios de unión del blanco pueden estar ligados directa o indirectamente por medios covalentes o no covalentes . El "linfocito T citotóxico" es un tipo especializado de linfocito capaz de destruir células ajenas y células anfitrionas infectadas con los agentes infecciosos que producen antígenos virales. "Epítope" Se refiere a la forma más simple de un determinante antigénico, sobre una molécula de antígeno compleja; este es la porción específica de un antígeno que es reconocida por una inmunogobulina o receptor de célula T. "Proteína de fusión" se refiere a una proteína formada por la expresión de un gen híbrido producida combinando dos o más secuencias genéticas . "Región de bisagra" se refiere a una porción de un anticuerpo que conecta el fragmento Fab al fragmento Fc; la región de bisagra contiene enlaces disulfuro que enlazan covalentemente las dos cadenas pesadas . El término "homologa" se refiere a una molécula que exhibe homología con otra molécula, por ejemplo, que tiene secuencias de residuos químicos que son los mismos o similares en posiciones correspondientes. La frase "% homólogo" o "% de homología" se refiere al por ciento de nucleótidos o aminoácidos en la misma posición que polinucleótidos o polipéptidos homólogos que son idénticos o similares. Por ejemplo, si 75 de 80 residuos en dos proteínas son idénticos, las dos proteínas son 93.75% homologas. El por ciento de homología puede ser determinado usando varios programas y sistemas de programación conocidos por aquellos expertos en la técnica. "Anfitrión" se refiere a un animal de sangre caliente, incluyendo un humano, el cual padece de una condición tratable de manera inmune, como una infección o un cáncer. Como se usa aquí, el "anfitrión" también se refiere a un animal de sangre caliente, incluyendo un humano, al cual se administró un antígeno quimérico. En el contexto de esta invención, "hibridación" significa el apareamiento de hebras complementarias de compuestos oligoméricos. En la presente invención, el mecanismo preferido de apareamiento implica enlaces de hidrógeno, el cual puede ser de atson-Crick, enlaces de hidrógeno de Hoogsteen o de Hoogsteen invertido, entre bases nucleosídicas o nucleotídicas (nucleobases) complementarias de las hebras de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La hibridación puede ocurrir bajo circunstancias variables. El término "híbrida", "hibridación" , "se hibrida" y similares, usados en el contexto de polinucleótidos, se refieren a condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente como la hibridación en formamida al 50%/6X SSC/SDS al 0.1%/100 µg/ml de ADNm, en las cuales las temperaturas para la hibridación son superiores a 37°C y las temperaturas para el lavado en 0. IX SSC/SDS al 0.1% son superiores a 55°C. "Inmunidad" o "respuesta inmune" se refiere a la respuesta del cuerpo a un antígeno. En modalidades, particulares, se refiere a la capacidad del cuerpo para resistir o protegerse a sí mismo contra una enfermedad infecciosa. "Dominio de Respuesta Inmune (IRD, por sus siglas en inglés) " se refiere a la porción antigénica configurada de manera variable de la molécula del antígeno quimérico bifuncional . El dominio de respuesta inmune comprende uno o más antígenos y/o uno o más antígenos recombinantes. Como se usa aquí, la frase "condición tratable de manera inmune" se refiere a una condición o enfermedad que puede ser prevenida, inhibida o aliviada produciendo o modulando una respuesta inmune en el sujeto. "Linfocitos" se refiere a un sujeto de células nucleadas encontradas en la sangre, que media respuestas inmunes específicas . "Anticuerpo monoclonal" o "Acm" se refiere a un anticuerpo producido a partir de un clon o población genéticamente homogénea de células híbridas fusionadas, es decir, una célula de hibridoma. Las células híbridas son clonadas para establecer líneas celulares que producen un anticuerpo monoclonal específico que es química o inmunológicamente homogéneo, es decir, que reconoce solo un tipo de antígeno. "Enlace peptídico" se refiere a dos o más aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida sustituido entre el grupo amino alfa de un aminoácido y el grupo carboxilo alfa de otro aminoácido. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no - tóxica que es fisiológicamente compatible con humanos u otros animales. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" comprende un material como un adyuvante, un vehículo, un ajustador de pH y agentes amortiguadores, agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes, preservativos, y similares, el cual no es tóxico y fisiológicamente compatible con humanos u otros animales . El término "polinucleótido" como se usa aquí se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos . Este término se refiere únicamente a la estructura primaria de la molécula. De este modo, este término incluye ADN y ARN de una sola y doble hebra. También incluye los tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcas que son conocidas en la técnica, metilación, "caps", sustitución de una o más nucleótidos naturales con modificaciones internucleotídicas, análogas, como por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fósforotioatos, fósforo ditioatos, etc.), aquéllos que contienen porciones pendientes, como por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-glicina, etc.), aquéllos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquéllos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc), aquéllos que contienen alquilantes, aquéllos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos nanoméricos alfa) , así como formas no modificadas del polinucleótido. "Sitio de escisión de proteasa" se refiere a un sitio donde las enzimas proteolíticas hidrolizan (rompen) cadenas polipeptídicas . En la presente invención la frase "condiciones de hidridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones bajo las cuales un compuesto de la invención se hibridará a su secuencia blanco, pero a un número mínimo de otras secuencias.

El término "sujeto" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. "Marca" se refiere a un marcador o secuencia marcadora usada para aislar o purificar una molécula que contiene la marca. Una marca ejemplar incluye una marca de 6xHis. "Célula T" se refiere a un tipo de linfocito responsable de las interacciones celulares específicas del antígeno, y que media las respuestas inmunes humoral y celular. "Domino de Unión del Blanco (TBD, por sus siglas en inglés) " se refiere a una proteína que comprende un fragmento de anticuerpo, la cual es capaz de unirse a un receptor sobre una célula presentadora de antígenos, particularmente sobre una célula dendrítica y la cual es posteriormente transportada a la célula presentadora de antígenos por absorción mediada por el receptor. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de antígeno quimérico o polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico, suficiente para producir una respuesta de célula B, linfocito T citotóxico (CTL) y linfocito T auxiliar (Th) efectiva al antígeno y para bloquear o para curar o al menos contrarrestar parcialmente o aletargar los síntomas y/o complicaciones de una enfermedad o trastorno.

Los términos "tratar" y "tratamiento" como se usan aquí cubren cualquier tratamiento de una condición tratable por un antígeno quimérico en un animal, particularmente un humano, e incluyen: (i) evitar que ocurra la condición en un sujeto que puede estar predispuesto a la condición pero que no haya sido aún diagnosticado como poseedor de esta; (ii) inhibir la condición, por ejemplo, contrarrestar o aletargar su desarrollo; o (iii) aliviar la condición, por ejemplo, produciendo regresión de la condición o sus síntomas . "Xenotípico" como se usa aquí, se refiere a que se origina de una especie diferente a la del anfitrión. Por ejemplo, el anticuerpo expresado de manera recombinante clonado de un genoma de ratón sería xenotípico a un humano pero no a un ratón, sin importar si el anticuerpo expresado de manera recombinante fue producido en una célula de bacteria, insecto o ratón. C. Antígenos Quiméricos Novedosos La invención proporciona antígenos quiméricos para producir una respuesta inmune que comprende un dominio de respuesta inmune y un dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo. De acuerdo con la presente invención, el antígeno quimérico, preferiblemente, es capaz de unirse a un receptor de Fc y/o a un receptor de mañosa de macrófago. El fragmento de anticuerpo puede ser xenotípico al anfitrión o no xenotípico al anfitrión.

En modalidades preferidas de la invención, el antígeno quimérico es capaz de inducir respuestas inmunes humoral y/o celular. La respuesta inmune celular puede incluir una respuesta de Thl, una respuesta de Th2 , y/o una respuesta de linfocito T citotóxico (CTL) . En otra modalidad preferida más, el antígeno quimérico produce una respuesta inmune multiepitópica. La respuesta inmune multiepitópica puede incluir una respuesta a al menos un epítope del dominio de respuesta inmune y/o una respuesta a al menos un epítope del dominio de unión del blanco. De manera alternativa, la respuesta multiepitópica puede limitarse a una respuesta a más de un epítope del dominio de respuesta inmune . El antígeno quimérico de la presente invención comprende dos porciones, a saber, un dominio de respuesta inmune que contiene una secuencia antigénica (como un antígeno viral) , y un dominio de unión del blanco que contiene un fragmento de anticuerpo (Figura 1) . En una modalidad preferida, el dominio de respuesta inmune puede ser ligado al dominio de unión del blanco por cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica. Los enlazantes para enlazar el dominio de respuesta inmune al dominio de unión del blanco pueden incluir, pero no se limitan a, enlaces peptídicos covalentes, conjugación química, cremalleras de leucina y biotina/avidina. En una modalidad preferida, el dominio de respuesta inmune y el dominio de unión del blanco son clonados como una sola proteína de fusión. El enlace peptídico covalente de la proteína de fusión puede comprender secuencias peptídicas adicionales, como SRPQGGGS o VRPQGGGS (SEQ ID NO: 1) . En otra modalidad preferida más, varios dominios de respuesta inmune son biotinilados y el dominio de unión del blanco es generado con estreptavidina como una proteína de fusión para facilitar la producción de una amplia variedad de antígenos quiméricos. De manera alternativa, el dominio de respuesta inmune y el dominio de unión del blanco pueden ser cada uno expresados como una fusión a la porción de una cremallera de leucina, lo cual hará que las dos porciones del antígeno quimérico se asocien tras mezclarse. Finalmente, el dominio de respuesta inmune y los dominios de unión del blanco pueden ser expresados por separado y entonces conjugados químicamente usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen el uso de reticuladores de proteína, como el suberimidato de dimetilo, para unir covalentemente los dos dominios . El dominio de repuesta inmune proporciona principalmente la porción antigénica del antígeno quimérico. El dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de la entidad a la cual se desea la respuesta inmune. El antígeno quimérico, opcionalmente, puede comprender más de un dominio de respuesta inmune. En modalidades preferidas, el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de un agente infeccioso, como un virus o un parásito intracelular obligado, o de un antígeno del cáncer. De manera más preferible, el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de un virus infeccioso. Los ejemplos de virus infecciosos preferidos incluyen: Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, como el Virus de la Inmunodeficiencia Humana-1 (VIH-1) , también conocido como HTLV-III, LAV o HTLV-IIl/LAV, o VIH-III; y otros aislados, como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus de coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus) ; Calciviridae (por ejemplo, cepas que producen gastroenteritis) ; Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola) ; Flaviridae (por ejemplo, virus de la Hepatitis C, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla) ; Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus) ; Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ebola) ; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio) ; Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza) ; Bungaviridae (por ejemplo, virus de Hantaan, virus de bunga, flebovirus y virus de Nairo) ; Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica) ; Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus) ; Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B humana (HBV) , virus de la Hepatitis B del - pato (DHBV) ) ; Parvoviridae (parvovirus) ; Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma) ; Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus) ; Herperviridae (virus del herpes simple (HSV) 1 y 2 , virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV) , virus de Epstein-Barr, virus del herpes) ; Poxviridae (virus de la varicela, vaccinia virus, virus de la viruela) ,- e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina Africana); y virus no clasificados (por ejemplo, el agente de la hepatitis delta, los agentes de la hepatitis no A, no B (clase 1-transmitidos internamente) ; clase 2- transmitidos parenteralmente; virus de Norwalk y relacionados, y astrovirus) . En algunas modalidades de la invención, el dominio de respuesta inmune del antígeno quimérico incluye al menos una porción antigénica de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de HBV, proteínas de DHBV, y proteínas de HCV. Las proteínas de HBV particularmente preferidas para usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, HBV S1/S2, HBV S1/S2/S, Núcleo de HBV, Núcleo de HBV ctm (modificado C-terminal) , antígeno e de HBV, y polimerasa de HBV. Las proteínas de DHBV particularmente preferidas para usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a DHBV PreS/S, DHBV PreS, Núcleo de DHBV, polimerasa de DHBV. Las proteínas de HCV particularmente preferidas para usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a núcleos de HCV (1- 191), núcleo de HCV (1-177), HCV E1-E2, HCV El, HCV E2, HCV NS3 , HCV NS5A y NS4A. Otros antígenos virales preferidos para usarse en la presente invención incluyen al HIV gpl20, nucleasa alcalina de HSV y proteínas de la cápside del virus del papiloma humano (HPV) Ll y L2 , y proteínas de la región inicial HPV El, HPV E2 , HPV E4 , HPV E5, HPV E6, y HPV E7. Los ejemplos de parásitos intracelulares obligados preferidos incluyen: Tetrahymena sp. (por ejemplo T. pyrifor is) , Plasmodium sp. (por ejemplo P. falciparum) , Cryptospiridium sp., Spraguea sp. (por ejemplo S. lophii) , Giardia sp., Toxoplasma sp. (por ejemplo T. gondii, T. cruz i) , Leish ania sp., Riakettsia sp. (por ejemplo R. prowazekii) , Chlamydia sp . , Mycobacterium sp. (por ejemplo M. tuberculosis) , Legionella sp. , Listeria sp. , (por ejemplo L. monocytogenes) , Coxiella sp . (por ejemplo C. brunette) , Shigella sp., Erlichia sp., y Bartonelia sp. Los antígenos del cáncer preferidos incluyen: antígeno específico de la próstata (PSA) , antígeno de membrana específica de la próstata (PSMA) , MUC1, CA 125, T1, Her-2/neu, antígeno carcinoembriónico (CEA), MAGE-3, MART-1, gplOO, NY-ESSO-1, CA19.9, TAG72, CA 15.3, CA 27.9, gp 120, fosfatasa acida prostática (PAP) , proteínas de Choque Térmico, alfa-fetoproteína (AFP) , Telomerasa, y ras. En otra modalidad de la invención, el dominio de respuesta inmune del antígeno quimérico incluye la marca 6xHis fusionada a una o más porciones antigénicas . De acuerdo con la presente invención, el antígeno quimérico es una proteína capaz de unirse a un receptor de Fc y/o CD206 sobre una célula presentadora de antígenos, particularmente una célula dendrítica, y es posteriormente transportado a la célula presentadora de antígenos por absorción mediada por el receptor. De acuerdo con la presente invención, la presencia de un fragmento de anticuerpo aumenta la absorción del antígeno quimérico a través del receptor de Fc sobre células presentadoras de antígenos, especialmente células dendríticas. En virtud de esta- unión específica e internalización, el antígeno viral es procesado y presentado como ajeno. De este modo, puede ser producida una respuesta inmune efectiva contra un antígeno previamente tolerado. El dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo que puede ser xenotípico al anfitrión o no xenotípico al anfitrión. En una modalidad preferida de la invención, el fragmento de anticuerpo comprende un fragmento de Fc murino. En una modalidad preferida más de la invención, el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de Fc, una región de bisagra, y una porción de la región CH1, y el antígeno quimérico comprende un enlazante peptídico adecuado para enlazar el dominio de unión del blanco al dominio de respuesta inmune. En otra modalidad preferida, el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina, y opcionalmente, comprende además una región de bisagra. En una modalidad particularmente preferida, el fragmento de cadena pesada comprende los aminoácidos, VDKKI (SEQ ID NO: 2) del dominio CH1 y/o parte de todos los dominios CH2 y CH3. Como se discutió anteriormente, los antígenos que son unidos e internalizados por el CD206 pueden ser presentados por ambas del MHC de la Clase I y la Clase II, produciendo de este modo una respuesta inmune celular y una humoral. En consecuencia, en una modalidad preferida, el antígeno quimérico es glicosilado. El dominio de respuesta inmune y/o el dominio de unión del blanco pueden ser glicosilados . En una modalidad particularmente preferida, el antígeno quimérico es glicosilado con mañosa por glicosilación alta en mañosa o por glicosilación pobre en mañosa (Jarvis, Virology 310: 1-7 (2003)). D. Métodos Novedosos para Utilizar Antígenos Quiméricos La invención incluye métodos para producir una respuesta inmune que comprenden administrar, a un sujeto, una composición que comprende un antígeno quimérico de la-invención. Para proporcionar una presentación eficiente de los antígenos, los inventores han desarrollado un antígeno quimérico novedoso que comprende un dominio de respuesta inmune, y un dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo. Aunque no se limita a una teoría particular de la invención esta molécula, en virtud del fragmento de anticuerpo se une a receptores específicos sobre células presentadoras de antígenos, y el antígeno viral es procesado y presentado complejado con complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC) de la Clase I y de la Clase II. Ese procesamiento y presentación del antígeno por el MHC de la Clase I produce una mayor respuesta por linfocito T citotóxico, dando como resultado la eliminación de cualquier agente infeccioso asociado con el antígeno del dominio de respuesta inmune. Además, la presentación del antígeno por moléculas MHC de la Clase II, produce una respuesta humoral que también ayuda a eliminar el antígeno de la célula infectada y/o de la circulación. La invención también incluye métodos para alterar la tolerancia que comprende en administrar un antígeno quimérico de la invención a un sujeto. En la presentación de antígenos para producir una respuesta inmune celular y/o humoral mediante el uso de antígenos quiméricos, los antígenos que fueron tratados como "propios" durante una infección crónica, son reconocidos como "ajenos". En consecuencia, el sistema inmune del anfitrión montará una respuesta de CTL para eliminar células infectadas. Al mismo tiempo, los anticuerpos producidos en respuesta al antígeno quimérico se unirán al agente infeccioso y removerán este de la circulación o bloquearan la unión del agente infeccioso a las células anfitrionas . En consecuencia, la presente invención se diseñó para producir antígenos quiméricos que pueden inducir una respuesta inmune amplia en sujetos que tienen infecciones crónicas que son en otras circunstancias toleradas por el sistema inmune del anfitrión. En una modalidad preferida, el antígeno quimérico quiebra la tolerancia a un antígeno en un sujeto que está infectado crónicamente con un agente infeccioso, como un virus o parásito, o que tiene cáncer. De manera más preferible, el agente infeccioso reside dentro de la célula anfitriona en algún punto durante su ciclo de vida. En una modalidad preferida, la inmunogenicidad del antígeno preseleccionado no reconocido o tolerado por el sistema inmune del anfitrión se incrementa debido a la presencia del fragmento de anticuerpo así como por la presencia de glicosilación inducida en un sistema de expresión de célula eucariótica, por ejemplo, de insecto. Ese antígeno quimérico debido a la presencia del componente del anticuerpo y la glicosilación se unirá a receptores específicos presentes sobre varios tipos de células inmunes incluyendo células dendríticas, macrófagos, células B y granulocitos . Otro aspecto más de la invención proporciona métodos para activar células presentadoras de antígenos, que comprenden poner en contacto las células presentadoras de antígenos, con un antígeno quimérico de la invención. La invención también proporciona métodos para mejorar la presentación de antígenos en una célula presentadora de antígenos, que comprenden poner en contacto la célula presentadora de antígenos con una composición que comprende un antígeno quimérico de la invención. El antígeno quimérico puede ser puesto en contacto con las células presentadoras de antígeno, preferiblemente células dendríticas, in vivo o ex vivo . En una modalidad preferida, el contacto del antígeno quimérico con las células presentadoras de antígenos activa las células presentadoras de antígeno y mejora la presentación de antígenos de más de un epítope. Esta respuesta multiepitópica puede incluir la presentación de uno o más epítopes del dominio de respuesta inmune y/o presentación de uno o más epítopes del dominio de unión del blanco. La invención también proporciona métodos para tratar una condición tratable de manera inmune, que comprende administrar a un sujeto que necesite de los mismos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antígeno quimérico de la invención. En una modalidad preferida, la condición tratada de manera inmune es una infección o un cáncer. La infección puede ser una infección viral, una infección parasitaria o una infección bacteriana. Preferiblemente, la infección tendrá una etapa durante la cual el agente infeccioso se encuentra dentro de una célula anfitriona. De manera más preferible, la condición tratable de manera inmune es una infección viral crónica. De manera más preferible, la condición tratable de manera inmune es una infección viral por hepatitis B crónica (HBV) o una infección viral por hepatitis C crónica (HCV) . Para el tratamiento del HBV, el dominio de respuesta inmune preferiblemente comprende al menos una porción antigénica de una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína del Núcleo de HBV, una proteína S HBV, una proteína SI de HBV, y una proteína S2 de HBV, y combinaciones de las mismas. Para el tratamiento del HCV, el dominio de respuesta inmune preferiblemente comprende al menos una porción antigénica de una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína del Núcleo HCV (1-191) , una proteína del Núcleo de HCV (1-177) , una proteína El de HCV, una proteína E2 de HCV, una proteína E1-E2 de HCV, una proteína NS3A de HCV, una proteína de NS5A de HCV y combinaciones de las mismas.

En una modalidad preferida, la administración del n antígeno quimérico produce una respuesta inmune mayor que la administración del dominio de respuesta inmune solo. La amplitud de la respuesta inmune puede ser medida, por ejemplo, (i) por la cantidad de anticuerpo específico para el antígeno presente en el sujeto; (ii) por la cantidad de interferón ? secretado por las células T en respuesta a la exposición a células presentadoras de antígeno cargadas con el antígeno quimérico o dominio de respuesta inmune únicamente; o (iii) por la cantidad de células CD8+ T específicas para el antígeno producidas en respuesta a la exposición a células presentadoras de antígenos cargadas con antígeno quimérico o dominio de respuesta inmune únicamente. El antígeno quimérico puede ser evaluado por su eficacia en la generación de una respuesta inmune presentando el antígeno quimérico a células dendríticas ex vivo o in vivo . Las células dendríticas presentan y procesan el antígeno quimérico a los linfocitos T las cuales son evaluadas por la profileración de células T y por la producción de interferón ? como marcadores de respuesta de células T. Específicamente, en la situación ex vivo, son aisladas células dendríticas candidas de sangre periférica. La activación de las células T por las células dendríticas es evaluada midiendo los marcadores, por ejemplo niveles de interferón ? por un procedimiento conocido. Véase por ejemplo Berlyn, et al., Clin Immunol 101 (3) :276-283 (2001). Un incremento en el porcentaje de células T que secretan interferón ? en al menos un 50% predice la eficacia in vivo . En el caso de una situación in vivo, el antígeno quimérico es introducido directamente de manera parenteral en el anfitrión donde las células dendríticas disponibles u otras células procesadoras de antígeno tienen la capacidad de interactuar con los antígenos y procesarlos en consecuencia. Adicionalmente, la invención incluye métodos para vacunar a un sujeto contra una infección, que comprende administrar un antígeno quimérico de la presente invención al sujeto. El sujeto puede ser vacunado profiláctica o terapéuticamente. Preferiblemente, la infección es una infección viral. La naturaleza bifuncional de la molécula ayuda a dirigir el antígeno a las células presentadoras de antígenos, por ejemplo células dendríticas, haciendo esto un método único en la terapia de enfermedades infecciosas crónicas dirigiendo específicamente las células presentadoras de antígeno con la estequiometría más efectiva del antígeno al anticuerpo. Esto es útil para el desarrollo de vacunas terapéuticas para curar infecciones virales crónicas como la Hepatitis B, la Hepatitis C, Virus de Inmunodeficiencia Humana, Virus del Papiloma Humano y Virus del Herpes Simple, parásitos intracelulares obligados y también puede ser aplicable a todos los antígenos autólogos en enfermedades como el cáncer y trastornos autoinmunes. La administración de esas proteínas de fusión puede producir una respuesta inmune amplia del anfitrión, incluyendo respuestas celulares y humorales. De este modo, pueden ser usadas como vacunas terapéuticas para tratar a sujetos que sean inmunotolerantes a una infección existente, además de ser útiles como vacunas profilácticas para inmunizar sujetos en riesgo de desarrollar una infección particular. E. Métodos para Producir Antígenos Quiméricos Un aspecto de la invención proporciona métodos para producir un antígeno quimérico que comprende (a) proporcionar un microorganismo o línea celular, preferiblemente eucariótico, de manera más preferible, no mamífero que comprende un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico; y (b) cultivar el microorganismo o línea celular bajo condiciones mediante las cuales el antígeno quimérico es expresado. Preferiblemente, el microorganismo o línea celular es una levadura, una línea celular de planta o una línea celular de insecto. De manera más preferible, la línea celular es una línea celular de insecto seleccionada del grupo que consiste de Sf9, Sf21, Drosophila S2 , y High Five1^. Una modalidad de la presente invención usa la tecnología del ADN recombinante establecida para producir las proteínas de fusión de antígenos seleccionados y el dominio de unión del blanco que son necesarios en la práctica de la invención. Los constructos o plásmidos recombinantes de proteína de fusión son generados a nivel de ADN incorporando sitios de enzima de restricción específicos, los cuales son explotados en la incorporación del fragmento de ADN deseado en los vectores de expresión, y usados para expresar las proteínas de fusión deseadas en un sistema de expresión heterólogo . Como se usa aquí , el término "vector" denota plásmidos que son capaces de contener el ADN, los cuales codifican para las proteínas deseadas. Los vectores plasmídicos preferidos para usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, pFastBac HTa y los "bacmidos" recombinantes correspondientes generados en E. coli DHlOBac"11 (Invitrogen) . Un gen que codifica para un dominio de unión del blanco puede ser obtenido a partir de cualquier célula productora de anticuerpos, por ejemplo un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal, vía la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Para facilitar los pasos de clonación posteriores, es preferible diseñar los cebadores oligonucleotídicos para sumar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción únicos. De manera similar, las porciones antigénicas del dominio de respuesta inmune pueden ser obtenidas de cualquier ARN o ADN de célula o virus que contengan un gen que codifique para una porción antigénica del blanco deseado. Preferiblemente, se usa PCR para obtener el ADN que codifica para las porciones antigénicas del dominio de respuesta inmune y los cebadores de PCR son diseñados para agregar los sitios de reconocimiento a la enzima de restricción únicos para facilitar la clonación. Sin embargo, cuando sea usado cualquier método de ADN recombinante para obtener el ADN que codifique para las porciones antigénicas del dominio de respuesta inmune. Los polinucleótidos que codifican para el dominio de unión del blanco y el dominio de respuesta inmune pueden entonces ser combinados en un solo constructo o plásmido recombinante usando técnicas de clonación estándar. De manera alternativa, los dominios separados pueden ser clonados con ADN que codifique para enlazantes, como la cremallera de leucina, estreptavidina o señales de biotinilación. Preferiblemente, un sistema de baculovirus se usa para expresar el antígeno quimérico de la invención no únicamente debido a que se producen ' grandes cantidades de proteínas heterólogas, sino también debido a las modificaciones postraslacionales, como la fosforilación y glicosilación, de las proteínas eucarióticas que ocurre dentro de las células de insecto infectadas . Puesto que la clonación directa en células de insecto puede ser difícil, se prefiere generar el polinucleótido que codifica para el antígeno quimérico en un sistema bacteriano y transferir el constructo o plásmido recombinante final a un sistema de expresión de baculovirus/célula de insecto. Los sistemas de transferencia, por ejemplo, el sistema Bac-To-Bacm (Invitrogen) , son conocidos por aquellos expertos en la técnica. El sistema Bac-to-BacMR utiliza la transposición específica al sitio con el transposon bacteriano Tn7 para transferir el gen de interés a un vector de lanzamiento de JE?, coli-célula de insecto (bac id) . Los bacmidos recombinantes resultantes son transfectados a células de insecto para generar baculovirus que expresen proteínas recombinantes . Para producir baculovirus, el bacmido es transfectado a células de insecto, como las células Sf9. Después de la transfección, las células son incubadas durante un periodo de tiempo suficiente para expandir la población baculoviral . El medio que contiene baculovirus es recolectado y almacenado a 4°C en la oscuridad. La transfección puede ser verificada, verificando la producción de ADN baculoviral sometiendo el cultivo viral a PCR utilizando cebadores específicos para el inserto de ADN deseado. La expresión de la proteína heteróloga en las células puede ser verificada por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, electroforesis sobre gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) o electroinmunotransferencia Western. Son usados bacmidos recombinantes de multiplicidad de infección (MOI) estandarizada para infectar las células de insecto. Las células son sembradas a una densidad de aproximadamente 3 x 105 células/mL e incubadas en cultivo en suspensión a 27.5°C con agitación hasta que la densidad celular alcanza aproximadamente 2-3 x 106 células/mL. Las cantidades estandarizadas del baculovirus recombinante respectivo son entonces agregadas a las células . La temperatura de incubación es de 27.5°C y el periodo de infección apropiado es estandarizado para la expresión de proteína individual . Las células son cosechadas por centrifugación y usadas para la purificación de las proteínas recombinantes . Las porciones no usadas de células pueden ser congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido y almacenadas a -70°C. Los antígenos quiméricos, preferiblemente, son purificados bajo condiciones desnaturalizantes. Las células que expresan antígenos quiméricos son usadas en un amortiguador desnaturalizante, por ejemplo un amortiguador que contiene guanidinio-HCl 6 M. La lisis puede ser incrementada por medios mecánicos, como la sonicación. El lisado es centrifugado para remover células no rotas y restos celulares. El sobrenadante es entonces cargado a una columna de perlas Ni-NTA Super Flow (Qiagen) preequilibrada con amortiguador de lisis. Después de la carga, la columna es lavada con una solución desnaturalizante amortiguada, que contiene preferiblemente guanidinio-HCl 6 M a aproximadamente pH 8. En este punto el desnaturalizante puede ser intercambiado a", por ejemplo, urea 8 M en una solución amortiguada. Los amortiguadores de lisis, carga y lavado preferiblemente contienen una baja concentración, por ejemplo, 1-40 mM de imidazol. Después del intercambio del amortiguador, la columna será lavada con amortiguador hasta que la D028o caiga a, por ejemplo <0.1. La proteína de unión puede ser eluída con un amortiguador que contenga urea 8 M, e imidazol 250 mM, pH 8 (Amortiguador de Elución) . Las fracciones que contienen la proteína son reunidas y dializadas a 4°C contra cambios múltiples de amortiguador de diálisis desnaturalizante bajo en sal (por ejemplo 100 mM) , que contiene preferiblemente urea 8 M. La proteína dializada es entonces cargada sobre una columna de intercambio iónico, como DEAE (dietilaminoetilo) . En una modalidad preferida, se agrega ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor a la proteína antes de cargarla sobre la columna de intercambio iónico. El antígeno quimérico pasará a través de una columna de DEAE. Por lo tanto, el flujo que pasa a través del DEAE es recolectado y dializado en una forma gradual contra amortiguadores que contienen concentraciones decrecientes de desnaturalizante. En un método ejemplar, la proteína es entonces dializada contra urea 4 M amortiguada durante al menos 12 horas, entonces contra urea 2 M amortiguada durante al menos 12 horas, entonces contra urea 1 M amortiguada durante al menos 12 horas, entonces contra urea 0.5 M amortiguada durante al menos 12 horas y finalmente dializada contra un amortiguador que no contiene desnaturalizante durante al menos 12 horas, preferiblemente seguido por dos periodos adicionales de 12 horas de diálisis con amortiguador fresco que no contenga desnaturalizante. Las proteínas replegadas, purificadas, pueden ser concentradas y caracterizadas usando técnicas bioquímicas estándar, incluyendo, por ejemplo, electroforesis sobre gel con SDS, enfoque isoeléctrico, o análisis de electroinmuno transferencia western usando anticuerpos contra diferentes dominios de la proteína expresada. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Esas técnicas son explicadas completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed. , New York: Cold Spring Harbor Press, 1989; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (®1995, suplementado en Abril 2004, Suplemento 66) . F. Polinucleótidos Novedosos Otro aspecto de la invención proporciona polinucleótidos que codifican para un antígeno quimérico que comprende una primera porción polinucleotídica que codifica para un dominio de respuesta inmune y una segunda porción polinucleotídica que codifica para un dominio de unión del blanco. La primera y segunda porciones polinucleotídicas pueden localizarse sobre la misma o diferentes cadenas nucleotídicas . La invención proporciona polinucleótidos que corresponden a o son complementarios a genes que codifican para antígenos quiméricos, ARNm, y/o secuencias codificadoras, preferiblemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican para proteínas variantes del antígeno quimérico; ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios o que tienen al menos 90% de homología con los genes que codifican para un antígeno quimérico o secuencias de ARNm o partes de las mismas, y polinculeótidos u oligonucleótidos que se hibrinden a los genes que codifican para un antígeno quimérico, ARNm, o polinculeótidos que codifican para un antígeno quimérico . Adicionalmente, la invención incluye análogos de los genes que codifican para un antígeno quimérico descrito específicamente aquí. Los análogos incluyen, por ejemplo, mutantes que retienen la capacidad de producir una respuesta inmune, y que tienen preferiblemente una homología de al menos el 80%, de manera más preferible el 90%, y de manera más preferible del 95%, con cualquiera de los polinucleótidos que codifican para un antígeno quimérico, como es descrito específicamente por las SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 32, 34,36, 38, 40, 42, 44, 46, y 44. Típicamente, esos análogos difieren únicamente de 1 a 15 cambios de codón. Los ejemplos incluyen polipéptidos con variaciones de aminoácidos menores de la secuencia de aminoácido natural de un antígeno viral o de un fragmento de anticuerpo, en particular, reemplazos de aminoácidos conservativos. Los reemplazos conservativos son aquellos que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que estén relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en 4 familias: (1) acídico=aspartato, glutamato; (2) básicos=lisina, arginina, histidina; (3) no polares=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados=glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptófano, y la tirosina son algunas veces clasificados conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservativo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tenga un efecto mayor sobre la actividad biológica. Las moléculas polipeptídicas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que cualquiera de los polipéptidos descritos en cualquiera de las SEQ ID NOs : 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49 pero que posean sustituciones de aminoácidos menores que no afecten sustancialmente la capacidad de los antígenos quiméricos para producir una respuesta inmune, están dentro de las definiciones de un antígeno quimérico que tiene la secuencia como se expone en las SEQ ID NOs : 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 y 49, respectivamente. Los derivados incluyen conjugados de agregación con otras moléculas de antígeno quimérico y conjugados covalentes con porciones químicas no relacionadas. Los derivados covalentes son preparados enlazando funcionalidades con grupos que se encuentran en cadenas de aminoácidos de antígenos quiméricos o en los residuos N o C terminales por medios conocidos en la técnica. Las abreviaturas de los aminoácidos se proporcionan en la tabla 1.

TABLA 1 : Abreviaturas de Aminoácidos Las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden ser hechas en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender de 1 a 15 sustituciones conservativas . Esos cambios incluyen sustituir cualquiera de la isoleucina (I) , valina (V) y leucina (L) por cualquiera de esos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) , por ácido glutámico (E) y viceversa. Glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden ser consideradas conservativas, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su papel de su estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) puede con frecuencia ser intercambiable, como puede ser la alamina (A) y valina (V) . La metionina (M) , la cual es relativamente hidrofóbica, puede con frecuencia ser intercambiada por leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son con frecuencia intercambiables en lugares en los cuales la característica significativa del aminoácido residual es su carga y los diferentes pKs esos dos aminoácidos residuales no son significativos. Otros cambios más pueden ser considerados como "conservativos" en ambientes particulares (véase por ejemplo, Biochemistry 4th Ed. , Lubert Stryer ed. (W. H. Freeman y Co.), páginas 18-23; Henikoff y Henikoff, Proc Nat 'l Acad Sci USA 89: 10915-10919 (1992); Lei et al., J Biol Chem 270 (20) : 11882-6 (1995) ) .

Las invenciones también proporcionan poli nucleótidos que se hibridan, preferiblemente bajo condiciones rigurosas, a un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico, como es descrito de manera específica por la SEQ ID NOS: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, y 44. La rigurosidad de las reacciones de hibridación es determinable fácilmente por un experto en la técnica y generalmente es el cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general las sonda, más largas requieren temperaturas mayores para ser recocidas de manera apropiada, mientras que ' las sondas más cortas necesitan temperaturas más baj as . La hibridación generalmente depende de la capacidad de las secuencias de ácido nucleico desnaturalizadas para, recocerse cuando estén presentes hebras complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. A mayor el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia híbrida, mayor la temperatura relativa que puede ser usada. Como resultado, se sigue que una temperatura relativa mayor tendería a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas más bajas las disminuyen. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase por ejemplo Ausubel et al., supra, en las páginas 2.9. 1-2.10.8 y 4.9.1-4.9.13.

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones altamente rigurosas", como se definen aquí, son identificadas con, pero no se limitan a, aquellas que (1) emplean una fuerza iónica baja y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio 0.1% a 50°C; (2) empleo durante la hibridación de un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficol al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/ amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) empleo de formamida al 50%, 5X SSC (0.75 M NaCI, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, solución de Denhardt ' s 5X, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0.1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0.2X SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido por lavado altamente riguroso consistente de 0. IX SSC que contiene EDTA a 55°C. Las "condiciones moderadamente rigurosas" son descritas por, pero no se limitan a, aquellas en Sambrook et al., supra, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, a temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas como aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5X SSC (150 mM NaCI , citrato trisódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), Solución de Denhardt ' s 5X, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/mL de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros IX SSC a aproximadamente 37-50°C. El experto en la técnica reconocerá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. cuando sea necesario para acomodar factores como la longitud de la sonda y similares . Las modalidades de un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico incluyen: un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico que tiene una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOs : 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 47 y 49, o una secuencia nucleotídica de un antígeno quimérico seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, donde T, opcionalmente, puede ser U; por ejemplo las modalidades de nucleótidos de antígeno quimérico comprenden, sin limitación: (a) un polinucleótido que comprende o consiste de una secuencia de acuerdo a lo descrito por la SEQ ID NOs.: nucleótidos 1 a 1326 de la SEQ ID NO:26, nucleótidos 1 a 2004 de la SEQ ID NO: 28, nucleótidos 1 a 1350 de la SEQ ID NO: 30 nucleótidos 1 a 1293 de la SEQ ID NO: 32, nucleótidos 1 a 1794 de la SEQ ID NO:34, nucleótidos 1 a 1581 de la SEQ ID NO:36, nucleótidos 1 a 1389 de la SEQ ID NO: 38, nucleótidos 1 a 1347 de la SEQ ID NO: 40, nucleótidos 1 a 2157 de la SEQ ID NO: 42, nucleótidos 1 a 1395 de la SEQ ID NO:44, nucleótidos 1 a 1905 de la SEQ ID NO: 46, o nucleótidos 1 a 2484 de la SEQ ID NO:48, donde T también puede ser U; (b) un polinucleótido cuya secuencia es al menos 80% homologa a una secuencia descrita por las SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 ó 48; (c) un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico cuya secuencia es codificada por " un ADN contenido en uno de los plásmidos designados como pFastBacHTa HBV SI/ S2-TBD, pFastBacHTa HBV núcleo-TBD, pFastBacHTa HCV núcleo (1-177) -TBD, pFastBacHTa HCV NS5A-TBD, y pFastBacHTa HCV E2- TBD depositados con la Autoridad Depositaría Internacional de Canadá (Agencia de Microbiología y Salud de Canadá) Nos. de accesos 080504-03,080504-04, 080504-05, 080504-02 y 080504-01 respectivamente; (d) un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico cuya secuencia de los aminoácidos 1 a 442 de la SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 668 de la SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 431 de la SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 598 de la SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 527 de la SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 463 de la SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 719 de la SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 465 de la SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 635 de la SEQ ID NO: 47, o aminoácidos 1 a 828 de la SEQ ID NO: 49; (e) un polinucleótido que codifica para una proteína relacionada con un antígeno quimérico que es al menos 90% idéntico al de una secuencia de aminoácidos completa descrita por los aminoácidos 1 a 442 de la SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 668 de la SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 431 de la SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 598 de la SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 527 de la SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 463 de la SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 719 de la SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 465 de la SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 635 de la SEQ ID NO: 47, o aminoácidos 1 a 828 de la SEQ ID NO: 49; (f) un polinucleótido que es completamente complementario a un polinucleótido de cualquiera de (a) - (d) y (g) un polinucleótido que se híbrida selectivamente bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido de la (a) - (f) . La invención también proporciona moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de antígeno quimérico, un análogo u homólogo de las mismas, incluyendo pero sin limitarse a fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YACs (cromosomas artificiales de levadura) , BACs (cromosomas artificiales de bacterias) , así como varios vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con esas moléculas de ADN o ARN recombinante . Los métodos para generar esas moléculas son bien conocidos (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) . La invención proporciona además un sistema anfitrión-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido de antígeno quimérico, análogo u homólogo del mismo dentro de una célula anfitriona procariótica o eucariótica adecuada. Los ejemplos de células anfitrionas eucarióticas adecuadas incluyen un célula de levadura, una célula de planta o una célula de animal, como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por baculovirus como una célula Sf9, Sf21, Drosophila S2 o High Fivem) . Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen varias líneas celulares de cáncer de próstata como la DU145 y TsuPrl, otras líneas celulares de cáncer de próstata transfectables o transducibles, principalmente células (PrEC) , así como un número de células de mamífero usadas de rutina para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T) . De manera más particular, un polinucleótido que comprende la secuencia que codifica para el antígeno quimérico o fragmento, análogo u homologo del mismo puede ser usado para generar el antígeno quimérico del mismo usando cualquier número de sistemas anfitrión-vector usados de rutina y ampliamente conocidos en la técnica. Una amplia gama de los sistemas anfitrión-vector adecuados para la expresión de antígenos quiméricos de los mismos se encuentran disponibles, véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Ausubel, supra, en las páginas 1.0.1-1.16.16, 9.01-9.17.3, y 13.4.1-13.6.5). Los vectores preferidos para la expresión en células de insecto incluyen pero no se limitan al pFastBac HTa (Invitrogen) . Usando esos vectores de expresión, los antígenos quiméricos pueden ser expresados en varias líneas celulares de insecto, incluyendo por ejemplo Sf9, Sf21, Drosophila S2 , y High Five. De manera alternativa, los sistemas de expresión de levadura preferida incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Pichia august . Los sistemas anfitrión-vector de la invención son útiles para la producción de un antígeno quimérico. Un antígeno quimérico o un análogo u homólogo del mismo puede ser producido por células transfectadas con un constructo o plásmido recombinante que codifique para un antígeno quimérico. Por ejemplo, las células Sf9, pueden ser transfectadas por un plásmido de expresión que codifique para un antígeno quimérico o análogo u homologo del mismo, el antígeno quimérico es expresado en células Sf9, y el antígeno quimérico es aislado usando métodos de purificación estándar.

También pueden ser empleados otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Los constructos o plásmidos recombinantes de expresión que codifican para un péptido líder unido en el marco a la secuencia que codifica para el antígeno quimérico pueden ser usados para la generación de una forma secretada de un antígeno quimérico. Como se discute aquí, la redundancia en el código genético permite variaciones en las secuencias del gen del antígeno quimérico. En particular, se sabe en la técnica que especies anfitrionas específicas con frecuencia tienen preferencias por codones específicos, y de este modo uno puede adaptarse a la secuencia descrita preferida para un anfitrión deseado. Por ejemplo, las secuencias de codones analógicos preferidos típicamente tienen codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso de menos que aproximadamente el 20% en las secuencias conocidas del anfitrión deseado) reemplazados con codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codón para una especie específica son calculadas, por ejemplo, usando las tablas de uso de codones disponibles en la INTERNET como URL en la red mundial www.kazusa.or.jp/codón. Se conocen modificaciones de secuencia adicionales para mejorar la expresión de proteína en un anfitrión celular. Esas incluyen la eliminación de secuencias que codifican para señales de poliadenilación espúreas o falsas, señales de sitio de empalme exon/intron, repeticiones similares a transposon, y/u otras secuencias bien caracterizadas que son dañinas a la expresión del gen. El contenido de GC de la secuencia es ajustado a niveles promedio a un anfitrión celular dado, de acuerdo a lo calculado con referencia a genes conocidos expresados en la célula anfitriona. Donde es posible, la secuencia es modificada para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia de consenso de inicio de la traducción al inicio del marco de lectura abierta, como se describe en Kozak, Mol . Cell Biol . , 9:5073-5080 (1989). Los expertos en la técnica comprenden que en la regla general de que los ribosomas eucarióticos inician la traducción exclusivamente en el codón 5' proximal AUG es abrogado únicamente bajo condiciones raras (véase, por ejemplo Kozak Proc Nat 'l Acad Sci USA 92 (7) :2662-2666 (1995) y Kozak Nucí Acids Res 15 (20): 8125-8148 (1987)). G. Composiciones Farmacéuticas de la Invención Un aspecto de la invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y un antígeno quimérico que comprende un dominio de respuesta inmune y un. dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas a un sujeto en una cantidad suficiente para producir una respuesta efectiva de célula B, linfocito T citotóxico (CTL) y/o linfocito T auxiliar (Th) al antígeno y para bloquear la infección o para curar o al menos contrarrestar parcialmente o aletargar los síntomas y/o complicaciones de una enfermedad o trastorno. Las cantidades efectivas para este uso dependerán, por ejemplo de la composición particular administrada, la forma de administración, la etapa y severidad de la enfermedad que esté siendo tratada, el peso y estado general de salud del sujeto, y el juicio del médico que prescriba. La dosis para una inmunización terapéutica inicial (con antígeno quimérico) generalmente ocurre en un intervalo de dosis unitaria donde el valor inferior es de aproximadamente 1, 5, 50, 500, o 1,000 ng y el valor superior es de aproximadamente 10,000; 20,000; 30,000; o 50,000 µg. Los valores de la dosis para un humano típicamente fluctúan de aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 50,000 µg por sujeto de 70 kilogramos. Pueden ser administradas dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1.0 ng hasta aproximadamente 50,000 µg de antígeno quimérico de acuerdo a un régimen de refuerzo durante semanas a meses dependiendo de la respuesta y condición del sujeto. La administración continuará hasta que los síntomas clínicos o pruebas de laboratorio indiquen al menos que la condición ha sido prevenida, contrarrestada, disminuida o eliminada durante un periodo posterior. Las dosis, rutas de administración y programas de dosificación son ajustados de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica. Una forma de dosis unitaria humana de un antígeno quimérico se incluye típicamente en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un vehículo o excipiente aceptable, en una modalidad de un vehículo acuoso, y se administra en un volumen/cantidad que es conocida por aquellos expertos en la técnica como útil para la administración de esos polipéptidos a humanos (véase, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ava Edición, A. Gennaro, Editor, Lippincott Williams & Wiikins, Baltimore, Md. , 2000) . Como es apreciado por aquellos expertos en la técnica, varios factores pueden tener influencia sobre la dosis ideal en un caso particular. Esos factores incluyen, por ejemplo, la vida media del antígeno quimérico, la afinidad de unión del antígeno quimérico, .la inmunogenicidad de la composición, el nivel de concentración en estado estacionario deseado, la ruta de administración, frecuencia del tratamiento y la influencia de otros agentes usados en combinación con los métodos de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un sujeto particular.

En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención son empleadas en estados de enfermedades serios, es decir, situaciones que amenacen la vida o que amenacen potencialmente la vida. En esos casos, como resultado de la naturaleza relativamente no tóxica del antígeno quimérico en las composiciones preferidas de la invención, es posible y puede ser considerado deseable por el médico tratante administrar un exceso sustancial de esos antígenos quiméricos en relación a esas cantidades de dosis establecidas . La concentración de antígeno quimérico de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.1%, usualmente en o al menos aproximadamente 2% hasta del 20% al '50% o más en peso, y será seleccionada principalmente por volúmenes del fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Las composiciones farmacéuticas pueden ser proporcionadas vía cualquier ruta conocida en la técnica como parenteral, intratecal, intravascular, intravenosa, intramuscular, transdérmica, intradérmica, subcutánea, intranasal, tópica, oral, rectal, vaginal, pulmonar o intraperitonealmente . Preferiblemente, la composición es proporcionada por rutas parenterales, como la administración subcutánea o intradérmica.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas mezclando los antígenos quiméricos deseados con un vehículo apropiado adecuado para la ruta de administración pretendida. En la elaboración de las composiciones farmacéuticas de esta invención, el antígeno quimérico usualmente es mezclado con un excipiente, diluido con un excipiente o encerrado dentro de un portador que puede estar en forma de una cápsula, saco, papel u otro recipiente. Cuando el excipiente farmacéuticamente aceptable sirve como diluente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido, el cual actúa como vehículo, excipiente o medio para el agente terapéutico. De este modo, las composiciones pueden estar en forma de tabletas, pildoras, polvos, pastillas, sacos, grageas, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido) , ungüentos que contengan, por ejemplo, hasta 10% en peso del antígeno quimérico, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos empaquetados estériles . Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, sucrosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, jarabe y metil celulosa. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente: agentes lubricantes como el talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsificantes y suspensores; agentes preservativos como los metil- y propilhidroxi-benzoatos; agentes edulcorantes; y agentes saborizantes. Las composiciones de la invención pueden ser formuladas para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retrasada del antígeno quimérico después de la administración al sujeto empleando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, supra, en las páginas 903-92 y páginas 1015-1050. Para preparar composiciones sólidas como tabletas, el antígeno quimérico es mezclado con un excipiente farmacéutico para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un antígeno quimérico de la presente invención. Cuando se hace referencia a esas composiciones de preformulación como homogéneas, significa que el antígeno quimérico es disperso uniformemente a través de la composición, de modo que la composición puede ser subdividida fácilmente en forma de dosificación unitaria igualmente efectivas como tabletas, pildoras y cápsulas. Las tabletas o pildoras de la presente invención pueden ser recubiertas o compuestas de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de la acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender el componente de dosis interna y uno de dosis externa, estando el último en forma de una envoltura sobre el primero . Los dos componentes pueden ser separados por una capa entérica, la cual sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o sea retrasado en su liberación . Puede ser usada una variedad de materiales para esas capas o recubrimientos entéricos, como materiales que incluyen un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales como la laca selladora, alcohol cetílico y acetato de celulosa . Las formas líquidas en las cuales las composiciones novedosas de la presente invención pueden ser incorporadas para la administración oral o por inyección incluyen soluciones acuosas, jarabes saborizados de manera adecuada, suspensiones acuosas u oleosas, y emulsiones saborizadas con agentes comestibles como el aceite de maíz , aceite de algodón, aceite de aj onj olí , aceite de coco, aceite de cacahuate , así como elíxires y vehículos farmacéuticos similares . En la preparación de una composición para la administración parenteral , debe ponerse estricta atención al ajuste de la tonicidad para reducir la irritación . Una composición reconstituible es un sólido estéril empaquetado en forma seca . Una composición reconstituible es preferida debido a que es más estable cuando es almacenada como un sólido seco en lugar de estar en solución lista para su administración inmediata. El sólido seco usualmente es empaquetado en un recipiente estéril con un cierre de caucho de butilo para asegurar que el sólido se mantenga en un intervalo de humedad óptima. Un sólido seco reconstituible se forma por métodos de llenado en seco, secado por rocío o secado por congelamiento o liofilización. Las descripciones de esos métodos pueden encontrarse, por ejemplo en Remington, supra, las páginas 681- 685 y 802-803. Las composiciones para inyección parenteral generalmente están diluidas, y el componente presente en la proporción mayor es del vehículo. El vehículo normalmente no tiene actividad terapéutica y no es tóxico, pero presenta el antígeno quimérico a los tejidos corporales en una forma apropiada para la absorción. La absorción normalmente ocurrirá más rápida y completamente cuando el antígeno quimérico sea presentado como una solución acuosa. Sin embargo, la modificación del vehículo con líquidos miscibles en agua o la sustitución con líquidos inmiscibles en agua puede afectar la velocidad de absorción. Preferiblemente, el vehículo de mayor valor para esta composición es la solución salina isotónica. En la preparación de las composiciones que son adecuadas para inyección, se pueden usar vehículos acuosos, vehículos miscibles en agua y vehículos no acuosos. Pueden ser incluidas sustancias adicionales en las composiciones inyectables de esta invención para mejorar o salvaguardar la calidad de la composición. De este modo, una sustancia agregada puede afectar la solubilidad, proporcionar comodidad al sujeto, mejorar la estabilidad química, o proteger la preparación contra el crecimiento de microorganismos. De este modo, la composición puede incluir un solubilizante apropiado, sustancias que actúen como antioxidantes, y sustancias que actúen como preservativos para evitar el crecimiento de microorganismos . Esas sustancias estarán presentes en una cantidad que es apropiada para su función, pero no afectarán de manera adversa la acción de la composición. Los ejemplos de agentes microbianos apropiados incluyen al timerosal, cloruro de benzetonio, cloruro de benzalconio, fenol, p-hidroxibenzoato de metilo, y p-hidroxibenzoato de propilo. Los antioxidantes apropiados pueden encontrarse en Remington, supra, at p. 1015-1017. En ciertas modalidades, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas, y similares para la administración de los antígenos quiméricos de la presente invención. En particular, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para proporcionarse ya sea encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similares. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención pueden ser unidas, ya sea covalente o no covalente a la superficie de esos vehículos portadores.

Las composiciones administradas vía liposomas también pueden servir: 1) para dirigir el antígeno quimérico a un tejido particular, como un tejido linfoide; 2) para dirigir selectivamente a las células presentadoras de antígenos; o 3) para incrementar la vida media de la composición peptídica. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones fosfolipídicas, monocapas laminares y similares. En esas preparaciones, el antígeno quimérico a ser proporcionado es incorporado como parte de un liposoma, solo o en conjunto con una molécula que se une a un receptor prevalesciente entre células linfoides como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas . De este modo, los liposomas llenos o decorados con un antígeno quimérico deseado de la invención pueden ser dirigidos al sitio de las células linfoides, donde los liposomas liberan entonces los antígenos quiméricos . Los liposomas para usarse de acuerdo a la invención son formados de lípidos que forman vesículas estándar, los cuales generalmente incluyen fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol, como el colesterol. La selección de los lípidos es guiada generalmente por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad y estabilidad a ácidos de los liposomas en el flujo sanguíneo. Está disponible una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 9:467-508 (1980), y las Patentes Estadounidenses Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369. Una suspensión de liposoma que contiene un antígeno quimérico puede ser administrada intravenosa, local, tópicamente, etc. en una dosis que varía de acuerdo a, inter alia, la forma de administración, el antígeno quimérico que sea liberado, y la etapa de la enfermedad que esté siendo tratada. Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en solventes acuosos u orgánicos, farmacéuticamente aceptables o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente adecuados como se describe aquí. Las composiciones pueden ser administradas por la ruta respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en solventes farmacéuticamente aceptables pueden ser nebulizadas mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden ser inhaladas directamente del dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador puede ser unido a una máscara, o una máquina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo pueden ser administradas, de manera preferible oral o nasalmente, de dispositivos que proporcionen la formulación en una forma apropiada.' Otra formulación empleada en los métodos de la presente invención emplea dispositivos de liberación transdérmica ("parches") . Esos parches transdérmicos pueden ser usados para proporcionar una infusión continua o discontinua del antígeno quimérico de la presente invención en cantidades controladas . La construcción y uso de parches transdérmicos para la liberación de agentes farmacéuticos es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,023,252, incorporada aquí como referencia. Esos parches pueden ser construidos para la liberación continua, pulsátil o a demanda de los agentes farmacéuticos . Adicionalmente, puede ser ventajoso incluir al menos un agente terapéutico o quimioterapéutico antiviral además del antígeno quimérico y el excipiente farmacéutico. Los agentes terapéuticos antivirales incluyen, pero no se limitan a, peptidomiméticos (como el amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir, y saquinavir) , poli nucleótidos (como el ampligen y el fomivirsen) , purina/ pirimidinonas (como abacavir, aciclovir, adefovir, cidofovir, citarabina, didanosina, didesoxiadenosina, dipivoxil, edoxudina, emtricitabina, entecovir, famciclovir, ganciclovir, idoxuridina, inosina, pranobex, lamivudina, MADU, penciclovir, sorivudina, stavudina, tenofovir, trifluridina, valaciclovir, valganciclovir, vidarabina, zalcitabina, y zidovudina) , análogos del ácido siálico (como el oseltamivir y zanamivir) , acemanano, acetilleucina monoetanolamina, amantadina, amidinomicina, ateviridina, capravirina, delavirdina, n-docosanol, efavirenz, foscarnet sódico, interferón-a, interferón-ß, interferón~?, cetoxal, lisozima, metisazona, moroxidina, nevirapina, pentafusida, pleconaril, podofilotoxina, ribavirina, rimantidina, estalimicina, estatolon, termacamra, y traomantadina . Otros agentes antivirales apropiados son discutidos en Remington: supra, en el Capítulo 87: Anti-Infecciosos, pp. 1507-1561, particularmente pp. 1555-1560. Los agentes terapéuticos antivirales preferidos para incluirse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen al adefovir, dipivoxil, entecovir, lamivudina y ribavirina. En algunas modalidades, puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que cebe linfocitos B o linfocitos T. Los lípidos han sido identificados como agentes capaces de cebar CTL irt vivo . Por ejemplo, pueden ser unidos residuos de ácido ' palmítico a los grupos amino e y a de un residuo de lisina y entonces ligados, por ejemplo, vía uno o más residuos enlazantes como Gly, Gly- Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico . El péptido lipidado puede entonces ser administrado ya sea directamente en una micela o partícula, incorporado en un liposoma o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante de Freund incompleto. En una modalidad preferida, una composición inmunogénica particularmente efectiva comprende ácido palmítico unido a los grupos amino e y a de Lys, el cual es unido vía el enlace, por ejemplo, Ser-Ser, al amino terminal del péptido inmunogénico . Como otro ejemplo de lípido cebador de respuestas de CTL, pueden ser usadas lipoproteínas de E. coli como la tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS) para cebar CTL específicos de virus cuando se unen covalentemente al péptido apropiado (véase, por ejemplo Deres, et al., Nature 342:561 (1989)). Los antígenos quiméricos de la invención pueden ser acoplados a P3CSS, por ejemplo y el lipopéptido administrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta inmune al antígeno objetivo. Aunque las composiciones de la presente invención no requerirá el uso de adyuvantes, puede ser usado un adyuvante . Pueden ser usados varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie anfitriona, incluyendo, pero sin limitarse al de Freund (completo e incompleto) , geles minerales, hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas como la lisolecitina, detergentes, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de cangrejo bayoneta, dinitrofenol, secuencias polinucleotídicas inmuno estimuladoras y adyuvantes humanos potencialmente útiles como el BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebac teri um parvum . También son conocidos en la técnica adyuvantes adicionales. H. Artículo de Manufactura Otro aspecto de esta invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente que contiene una composición, que comprende un antígeno quimérico, que es adecuado para inyección o reconstitución por inyección en combinación con instrucciones impresas en una etiqueta que proporcionan una discusión de cómo administrar la composición parenteralmente, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica, nasal o intravascularmente . La composición estará contenida en cualquier recipiente adecuado que no interactúe de manera significativa con la composición y estará etiquetado con la etiqueta apropiada que indique que se da para uso parenteral . Asociadas con el recipiente se encontrarán las instrucciones en la etiqueta consistentes con el método de tratamiento como se describió aquí anteriormente. El recipiente que contiene la composición de esta invención puede ser un recipiente que tenga una composición líquida adecuada para inyección que tenga una aguja apropiada para inyección en una jeringa, de modo que el paciente, médico, enfermera u otro practicante pueda administrar el antígeno quimérico. De manera alternativa, la composición puede ser una composición seca o concentrada que contenga una versión soluble del antígeno quimérico, para ser combinada o diluida con un vehículo acuoso o no acuoso para disolver o suspender la composición. De manera alternativa, el recipiente puede tener una suspensión en un líquido o puede ser una versión insoluble de la sal para combinarse con un vehículo en el cual se suspenderá la versión insoluble. Los recipientes apropiados son discutidos en Remington, supra, páginas 788-789, 805, 850-851 y 1005-1014. El equipo de la invención típicamente comprenderá el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que contengan los materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo amortiguadores, diluentes, filtros, agujas, jeringas, insertos de paquete con instrucciones de uso. Puede estar presente una etiqueta sobre el recipiente para indicar que la composición es usada para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar indicaciones para su uso in vivo o ex vivo, como aquellas descritas anteriormente. Las indicaciones y otra información también pueden ser incluidas en un inserto que sea incluido en el equipo. V. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes proporcionan información adicional de la invención.

A. Ejemplo 1: Construcción del Vector de Expresión de TBD Se generaron secuencias de ADN de IgGl de ratón que codifican para los aminoácidos de una porción de la región CH1-Bisagra-CH2-CH3 a partir del ARNm aislado del hibridoma (2C12) , que produce Acm contra el antígeno de superficie (Ags) de HBV. El ARNm total fue aislado usando el reactivo Trizol® (Gibco BRL cat. No. 15596-026) y el ADNc del dominio de unión del blanco (TBD; fragmento de inmunoglobulinas de ratón) fue generado por RT-PCR usando la Síntesis de la Primera Hebra Superscript (Invitrogen Cat. No. 11904-018) . Los cebadores de la PCR tuvieron secuencias enlazantes que codifican para el péptido enlazante -SRPQGGGS- (SEQ ID NO: 1) en el 5' terminal, un sitio Not I único en 5' y un sitio de restricción de Hind III único en el extremo 3' . El ADNc resultante contiene (5 'Not I) - secuencia del enlazante-Cal (VDKKI) (SEQ ID NO: 2) . -Región de Bisagra-CH2-CH3- (3' Hind III) . Después de la digestión con las enzimas respectivas, el fragmento es ligado con el plásmido del vector de expresión pFastBac HTa (Invitrogen) usando los mismos sitios de enzima de restricción. El cebador 5' usado para la amplificación por PCR fue (sentido) 5' TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGATCCGTGGACAA GAAAATTGTGCCCAGG (SEQ ID NO: 3) y el cebador 3' fue (antisentido) 5' ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG (SEQ ID NO: 4) , los cuales contenían los sitios de Not I y Hind III, respectivamente. El siguiente es el protocolo usado para la clonación direccional . El fragmento generado fue digerido con las enzimas respectivas, purificado sobre gel de agarosa y clonado en el plásmido del vector. La secuencia de ADN y exactitud del ORF fueron verificados por métodos de secuenciamiento estándar . Después de la clonación del ADN que codifica para el dominio de unión del blanco en el plásmido donador pFastBac HTa, las proteínas recombinantes fueron expresadas usando el sistema de expresi n de baculovirus Bac- to-BacMR (Invitrogen) . El gen clonado fue transferido a un vector de lanzamiento de baculovirus vía transposición específica del sitio en una cepa de E. coli, DHlOBac. Las células de DHlOBac que contienen el vector de lanzamiento, el cual confiere resistencia a la kanamicina y un plásmido auxiliar, el cual codifica para la transposasa y confiere resistencia a la tetraciclina. Se congeló una alícuota de 100 µl de células DHlOBac competentes sobre hielo, se agregaron plásmidos basados en pFastBac HTa y la mezcla se incubó sobre hielo durante 30 minutos. La mezcla fue sometida a choque térmico durante 45 segundos a 42 °C y entonces enfriada sobre hielo durante 2 minutos. La mezcla fue entonces agregada a 900 µl de medios LB e incubada durante 4 horas a 37°C. Las células transformadas fueron diluidas en serie con LB a 10"1 y 10"2 y 100 µl de cada dilución fueron sembradas sobre placas de agar LB suplementadas con 50 µg/ml de kanamicina, 7 µg/ml de gentamicina, 10 µg/ml de tetraciclina, 100 µg/ml de X-gal, y 40 µg/ml de IPTG e incubadas durante al menos 36 horas a 37°C. La resistencia a la gentamicina fue conferida por el pFastBac HTa y el X-gal y el IPTG (isopropiltio-ß-D-galactósido) fueron usados para diferenciar entre las colonias blancas (plásmidos recombinantes) y las colonias azules (no recombinantes) . Las colonias blancas fueron retiradas e inoculadas en 2ml de LB suplementado con 50 µg/ml de kanamicina, 7 µg/ml de gentamicina y 10 µg/ml de tetraciclina e incubadas durante la noche a 37°C, con agitación. Se usó un asa estéril para muestrear una pequeña cantidad del cultivo nocturno y la muestra fue sembrada sobre una placa de agar LB fresco suplementado con 50 µg/ml de kanamicina, 7 µg/ml de gentamicina, 10 µg/ml de tetraciclina, 100 µg/ml de X-gal, y 40 µg/ml de IPTG e incubada durante al menos 36 horas a 37°C para confirmar un fenotipo blanco. Se aislaron bacmidos recombinantes por protocolos estándar (Sambrook, supra) , la muestra de ADN fue disuelta en 40 µl de TE (Tris-HCL 10 mM, pH 8, EDTA lmM) y usada para las transfecciones .

Para producir baculovirus , el bacmido fue transferido a células de insecto Sf 9 . Las células Sf9 (9 x 105) fueron sembradas en cada pozo de un disco de cultivo celular de 6 pozos (pozos de 35 mm) en 2 ml de ESF 921 (Sistemas de Expresión) y se dej ó unido durante al menos 1 hora a 27 °C . Las transf ecciones se llevaron a cabo usando el reactivo Cellfection® (Invitrogen, Cat . No . 10362-010 ) como por los protocolos proporcionados por el distribuidor de las células Sf9. Después de la transfección, las células fueron incubadas a 27°C durante 72 horas . El medio que contenía baculovirus fue recolectado y almacenado a 4°C en la oscuridad. La eficiencia de la transfección fue verificada verificando la producción de ADN baculoviral . El ADN de baculovirus aislado fue sometido a PCR para seleccionar el gen insertado que codifica para TBD. Los cebadores usados fueron (sentido) 5' TATTCCGGAT TTCATACCG (SEQ ID NO : 5) y 3 ' (antisentido) 5 ' CTCTACAAATGTGGTATGGC (SEQ ID NO : 6) . Los productos amplificados fueron ensayados sobre gel de agarosa ( 0 . 8%) . La expresión de la proteína heteróloga en las células fue verificada por electroforesis sobre gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y electroinmunotransf erencias Western usando el anticuerpo monoclonal con la marca de 6xHis (Clonetech) como sonda . Una vez confirmada la producción de baculovirus y la expresión de la proteína, la producción de virus fue amplificada para producir un patrón concentrado de baculovirus que contiene el gen que codifica para el dominio de unión del blanco. Es una práctica estándar en la técnica amplificar el baculovirus al menos dos veces, y en todos los protocolos descritos aquí nos adherimos a esta práctica estándar. Después de la segunda ronda de amplificación, se cuantificó la concentración del baculovirus generado usando un ensayo de placa de acuerdo a los protocolos descritos por el fabricante del equipo (Invitrogen) . La concentración más apropiada del virus para infectar células High Five y también se estableció el punto en el tiempo óptimo para la producción de la proteína deseada. Generalmente, para la expresión de TBD se usaron una MOI de 1 y un periodo de tiempo de 48 horas . B. Ejemplo 2: Construcción de Vectores de Expresión de Antígeno Quimérico El ADN que codifica para un antígeno viral deseado fue generado a partir del patrón o molde usando la metodología PCR usando los cebadores sentido 5' y antisentido 3' indicados en la Tabla 2. El extremo 5' del fragmento amplificado resultante contenía el sitio de restricción único "5'enzi", y el extremo 3' contenía el sitio de restricción único "3'enzi" cada uno de los cuales fue usado para ligaciones.

Tabla 2 : Construcción de Vectores de Antígeno Quimérico El ADN amplificado fue digerido con las enzimas de restricción 5' y 3' y ligado con un vector de expresión pFastBac HTa para generar el plásmido de expresión para el antígeno viral solo. El mismo fragmento de ADN también fue ligado con el plásmido pFastBac HTa-TBD, descrito en el Ejemplo 1, seguido por la digestión con las enzimas respectivas para producir el plásmido de expresión para el antígeno viral fusionado al dominio de unión del blanco. El plásmido resultante fue usado para producir baculovirus recombinante, como se describe en el Ejemplo 1, para su uso posterior en la expresión del antígeno quimérico. Las secuencias de ADN y aminoácidos de los genes quiméricos se proporcionan en la Tabla 3.

TABLA 3 : Secuencias de antígeno quimérico TABLA 3 : Secuencias de antígeno quimérico (Continuación) C. Ejemplo 3: Expresión y Purificación de TBD, Antígenos Virales y Antigenos Quiméricos Se usaron bacmidos reco binantes de multliplicidad de infección (MOI) estandarizada para infectar células de infecto High FiveMR. Para cultivos en suspensión, las células fueron sembradas a una densidad de 3 x 105 células/mL e incubadas a 27.5° C con agitación a 138 rpm hasta que la densidad celular alcanzo 2-3 x 106 células/mL. Se agregaron cantidades estandarizadas del baculovirus recombinante respectivo a las células. La temperatura de incubación fue de 27.5°C y el período de infección apropiado fue estandarizado para la expresión de la proteína individual. Las células fueron cosechadas por centrifugación a 2,500 rpm durante 10 minutos a 4°C y usadas para la purificación de las proteínas recombinantes. Las porciones no usadas de células fueron congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido y almacenadas a -70°C.

Las proteínas recombinantes fueron purificadas bajo condiciones desnaturalizantes. Las células fueron usadas en un amortiguador que contenía Guanidinio-HCl 6 M en NaH2P04, 10 M Tris, 300 mM NaCl, Imidazol 10 nM, pH 8.0 (amortiguador de lisis) . La suspensión fue sonicada sobre hielo de 5 impulsos de 1 minuto por impulso a una potencia fija de 60 watts, y se mezcló a temperatura ambiente durante 1 hora. El usado fue centrifugado a 10,000 x g durante 10 min para remover las células no rotas y los restos celulares . El sobrenadante fue cargado sobre una columna de perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) (1 x 5 cm/lOOmL de usado celular) , preequilibrada con amortiguador de lisis. Después de la carga, la columna fue lavada con 20 volúmenes de columna de 6 M guadidinio-HCl en NaH2P04, 100 M, Tris 10 nM, NaCl, 300 nM, Imidazol 40 nM, pH '8.0 (amortiguador de lavado 1), seguido por lavados con 20 volúmenes de columna de urea 8 M en NaH2P04 100 nM. Tris 10 mM, NaCl 300 nM, Imidazol 40 nM, pH 8.0 (amortiguador de lavado 2) . La proteína unida fue eluída con un amortiguador que contenía urea 8 M, NaH2P04 100 nM, Tris 10 mM, NaCl 300 nM, Imidazol 250 mM, pH 8 (amortiguador de Elusión) . Las fracciones que contenían la proteína fueron reunidas y dializadas a 4°C contra cambios múltiples de amortiguador de lisis (NaH2P0 , lOmM, NaCl 300mM) . Las proteínas purificadas fueron caracterizadas usando técnicas bioquímicas estándar incluyendo electróforesis sobre gel SDS, enfoque isoeléctrico y análisis de electroinmuno transferencia western usando anticuerpos contra diferentes dominios de la proteína de expresión. D. Ejemplo 4: Tolerancia a la Alteración a una Proteína "Propia" Usando Proteína de Fusión de Antígeno Quimérico Para evaluar la respuesta inmune a las proteínas de fusión de antígeno quimérico, fueron inmunizados ratones con proteínas HBV S1/S2, TBD o S1/S2-TBD purificas y los anticuerpos producidos contra las proteínas individuales fueron cuantificados. La proliferación de células T esplénicas cosechas de ratones inmunes fue evaluada después del desafío con las proteínas respectivas. Se usaron ratones BALB/c de 15 semanas de edad para las inmunizaciones. Los ratones fueron inyectados subcutáneamente con S1/S2-TBD (4.15 µg) , S1/S2 (4.15 µg) o TBD (4.15 µg) cuatro veces a intervalos de dos semanas. Se recolectaron muestras de sangre antes del inicio de las inmunizaciones y una semana después de cada una de las inmunizaciones. El suero se preparó a partir de muestras de sangre coagulada y se uso para estimación de los niveles de anticuerpo producidos por el animal anfitrión contra los antígenos respectivos inyectados . 1. ELISA para la detección de anticuerpos contra HBV S1/S2, TBD o S1/S2-TBD Se recubrió una placa de 96 pozos con antígenos HBV S1/S2, TBD o S1/S2-TBD a una concentración de 1.0 µg/mL durante la noche a 4°C. La placa fue lavada con PBS que contenía 2% de BSA. Se agregó suero diluido del animal respectivo a cada uno de los pozos a varias diluciones (1:10-1:500) y se incubo a 37°C durante 1 hr. La placa fue lavada con PBS que contenía 0.05% de Tween 20 (amortiguador de lavado) . Se agregó una dilución (1:5000) de anti-Fab de IgG de ratón de cabra-peroxidasa de rábano (HRP) a los pozos y se incubo a 37°C durante 1 hr. La placa fue lavada con amortiguador de lavado y se desarrollo color usando 2-2' acino-di- (6-sulfonato benciltiazonil 3-etilo) (KPL, Guilford RU) . La densidad óptica del color resultante en las muestras fue medida usando un lector de placas de ELISA (molecular Devices, EUA) a una longitud de onda de 405 nm. El control negativo para el experimento fue suero preinmune del mismo animal, el cual fue sustraído de todos los valores experimentales. Los resultados para los ratones inmunizados con HBV S1/S2-TBD se presentan en la Tabla 4. El antígeno quimérico produce unas respuesta de anticuerpo fuerte con el antígeno quimérico (S1/S2-TBD) .

TABLA 4: Respuesta Humoral a S1/S2-TBD La respuesta del anticuerpo aquí es de naturaleza multivalente (o multiepitópica) . Los resultados presentados en la Tabla 4 muestran que los anticuerpos producidos por ratones inmunizados con HBV S1/S2-TBD se unen al antígeno quimérico y a la proteína blanco S1/S2 recubierta sobre la placa. Por lo tanto, los anticuerpos son producidos contra el componente S1/S2 del antígeno quimérico. De igual modo, los anticuerpos producidos por los ratones inmunizados con HBV S1/S2-TBD se unen a la proteína del dominio de unión del blanco (Tabla 4) . El antígeno quimérico que contiene proteína de origen de ratón puede generar una respuesta inmune humoral en un ratón, evidencia de que el antígeno quimérico puede convertir un antígeno "propio" en uno "ajeno". En consecuencia, es posible quebrar la tolerancia a una proteína tratada de otro modo como proteína "propia" . 2. Ensayo de proliferación de células T Los animales fueron sacrificados una semana después de la cuarta inmunización, se les removió el vaso y se produjo una suspensión de una sola célula. Las células fueron ' sembradas por triplicado a una densidad celular de 4xl05 células/pozo en una placa de 96 pozos. Fueron cargadas con los antígenos respectivos HBV S1/S2, TBD o S1/S2-TBD, concentraciones de 0.1 µg/mL, 1.0 µg/mL, y 10 µg/mL. Las células de control negativo recibieron medios únicamente y el control positivo para la proliferación, de células T fue Fitohemaglutinina (PHA) a 1.0 - 5.0 µg/mL. Los cultivos celulares fueron incubados durante 4 días a 37°C bajo una atmósfera de 7% C02. Cada uno de los pozos de células fue impulsado con 1.0 mCi de 3 [H] -timidina e incubado durante 18 horas adicionales. Las células fueron cosechadas usando el cosechador celular TOMTEC MACH 3 (Hamden CT, EUA) y la radioactividad unida al filtro de fibra de vidrio (Wallac Oy, Turku, Finlandia) fue cuantificada usando el contador de destellos sin luminiscencia en estado líquido Wallac Trilux 1450 Microbeta (Wallac, EUA) . Los resultados de muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Respuesta celular a HBV S1/S2-TBD La proliferación se observó cuando se desafió HBV S1/S2-TBD, S1/S2 o TBD. La inmunización con el antígeno quimérico indujo una respuesta de célula T equivalente, es decir una respuesta contra diferentes partes de la misma proteína. El antígeno quimérico que contiene proteína de origen de ratón puede generar una respuesta inmune celular en un ratón evidencia de que al antígeno quimérico puede convertir un antígeno "propio" en uno "ajeno". Por lo tanto, es posible quebrar la tolerancia a una proteína de otro modo tratada como proteína "propia" .

E. Ejemplo 5: Ensayos de Presentación de Antígeno La capacidad de HBV S1/S2-TBD para producir una respuesta inmune se midió un ensayo de presentación de antígeno ex vivo . La generación de una respuesta de células T efectiva después de estímulos múltiples de células T candidas con células presentadoras de antígenos cargadas con antígeno (APC, por sus siglas en inglés-) como las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) fue evaluada cuantificando el incremento y el número de células T específicas para el antígeno así como la capacidad de las células T para producir la citosina IFN-?. 1. Selección de los Monocitos por Adhesión Se descongelaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante la adición de AIM-V (relación de 9 ml de AIM-V agregados a lml de células congeladas) . La células fueron entonces centrifugadas a 200x durante 5 min, el sobrenadante removido en las células suspendidas, el AIM-V1% de suero igualado y se agregaron a disco de cultivo 100 mm o a un matraz de cultivo T-25. Las PBMC fueron incubadas durante 1 hora a 37°C en un incubador humidificado bajo 7% de C02. Para remover las células no adherentes, un cultivo fue triturado varia veces, el sobrenadante desechado, y las células lavadas una vez con medio AIM-V. Los monocitos fueron cosechados con un dispositivo para desprender células y centrifugadas a 300x g durante 5 min. El sedimento celular fue resuspendido en AIM-V/2.5% de suero igualado a 2 x 10s células/mL y sembrado en un disco de 24 pozos. Se agregaron las citocinas IL-4 y GMCSF (1000 IU/ml cada una) para llevar la diferenciación de los monocitos a DC inmaduras . 2. Ensayo Rápido o Lento de Presentación de Antígeno Para el ensayo rápido de presentación de antígeno (APA) , Se agregó antígeno a DC maduras dentro de las 4 a 24 horas del aislamiento. Después de 24 hr adicionales, los monocitos inmaduros cargados con antígeno fueron inducidos a madurar cultivando con PGE2 (1 µM) , IL-lß (10 ng/ml) , y TNF-a (10 ng/ml) durante 24 hr. Las DC maduras fueron entonces procultivadas (primer estímulo) con células T autólogas. Las células T fueron generadas a partir de las mismas PBMC que las DC por medio de selección negativa usando el equipo de aislamiento magnético de células T (Dynal) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células T fueron entonces reestimuladas 7 días más tarde con DC maduras cargadas con antígeno en presencia de IL-2 (20 Ul/ml) , IL-7 (10 ng/ml) , e IL-15 (5 ng/ml) . Después de 7 días de incubación, las células T fueron reestimuladas una tercera vez con DC maduras cargadas con antígeno. El tercer estímulo duró 6 hr después de lo cual las células T fueron cosechadas e inmunoteñidas para la expresión de CD3, CD8 e IFN-? y analizadas por citometría de flujo.

Para el APA lento, los monocitos se dejaron diferenciar en DC inmaduras en presencia de GM-CSF e IL-4 durante 5 a 6 días antes de la adición de antígeno. Dos horas después de la adición de antígeno, las DC inmaduras fueron maduradas con TNF-a (10 ng/ml) e IFN-a (50 Ul/ml) . Siete días después del aislamiento, las DC maduras fueron cocultivadas (primer estímulo) con células T autólogas (descritas anteriormente) . Las células fueron entonces reestimuladas 7 días más tarde con DC maduras cargadas con antígeno en presencia de IL-2, IL-7, e IL-15. Después de 7 días de incubación, las células fueron reestimuladas una tercera vez con DC maduras cargadas con antígeno. Después de 18 horas de incubación las células T fueron cosechadas en inmunoteñidas para la expresión de CD3, CD8 e IFN-?, y analizadas por citometría de flujo. 2. Ensayo de Presentación de Antígeno de PBMC En este ensayo, el cultivo inicial consiste de PBMC totales (es decir linfocitos y monocitos) que se incuban con antígeno IL-2 con la suposición de que el sistema de asemeja a la respuesta inmune in vivo puesto que están presentes todos los tipos de células para participar (Maini, M. K et . al J. Exp. Med. 191: 1269-1280, 2000). Las PBMC se descongelaron, lavaron e incubaron inmediatamente con antígeno. Después de 4 días de cultivo para permitir la absorción y presentación del antígeno, se agregó IL-2 (20 Ul/ml) y se dejó durante 8 días adicionales (es decir el día 12 del experimento) . Dos días antes del segundo estímulo (es decir, el día 10 del experimento) , las DC son aisladas por adhesión como se describió anteriormente, e incubadas inmediatamente con GM-CSF, IL-4 y antígeno durante 24 hr. Como con el APA rápido, las DC inmaduras se ' dejaron diferenciar durante 24 horas después de la adición de PGE2, IL-lß, y TNF-a. Las DC maduras cargadas son entonces agregadas al cultivo de PBMC (segundo estímulo, día 12 del experimento) en presencia de IL-2, IL-7, e IL-15. El tercer estímulo ocurrió el día 21 del experimento con DC maduras cargadas con antígeno preparadas dos días antes como se describió. Después de una incubación de 6 horas, las células fueron cosechadas e inmunoteñidas para la expresión de CD3 , CD8 e IFN-?, y analizadas por citometría de flujo. Para todos los ensayos de presentación de antígeno discutidos anteriormente, se incubó una porción de las células T al final del ensayo durante 3-5 días adicionales y se examinaron para células T específicas por análisis del tetrámero (véase más adelante) . 4. El HBV S1/S2 produce una Respuesta de célula T contra los Péptidos SI y S2 de HBV Se usó APA de PBMC para generar células T las cuales fueron entonces evaluadas por su especificidad para el antígeno. De este modo, las PBMC de individuos HLA-A2 sanos fueron cultivadas en AIM-V que contenía 2.5% de sueros igualados en placas de 96 pozos a 5 x 105 células/ml. Se agregó antígeno (es decir, 10 µg/ml de S1/S2-TBD) y las células fueron cultivadas durante 4 días a 37°C. Entonces se agregó IL-2 a 20 Ul/ml y las células fueron cultivadas durante 8 días adicionales, con cambios de medios (AIM-V/2.5% de suero igualado y 20 Ul/ml de IL-2)' cada 2-3 días . La mayoría de las células que permanecieron hasta el final de los 12 días de cultivo fueron células T, y esas células T fueron estimuladas con DC maduras cargadas con antígeno autólogo en presencia de IL-2 (20 Ul/ml) , IL-7 (10 ng/ml) , e IL-15 (5 ng/ml) . Las DC maduras cargadas con antígeno para el segundo y tercer estímulos de las células T en el APA fueron generadas durante un periodo de 48 horas usando el procedimiento descrito más adelante . Los monocitos fueron aislados de las PBMC totales por adherencia sobre discos de cultivo tisular de plástico. Las células, aproximadamente 85% de las cuales fueron monocitos de acuerdo a lo determinado por el análisis FACS (CDllc+, CD14+, CD19-, y CD3-) , fueron cultivadas en una placa de 96 pozos a 1 x 105 células/pozo que contenía 100 µl de AIM-V/2.5% de suero igualado con las citocinas IL-4 y GM-CSF a 1000 Ul/ml, y 4 hr más tarde se agregó antígeno como el S1/S2-TBD. Después de 20 horas de incubación, las DC inmaduras generadas fueron diferenciadas a DC maduras cultivando durante 24 horas adicionales en presencia de PGE2 (1 x 10"6M) , IL-lß (10 ng/ml) , y TNF-a (10 ng/ml) . Las células T fueron cultivadas durante 7 días después del segundo estímulo, con cambios de medios (AIM V con 2.5% de suero igualada a 20 Ul/ml IL-2) cada 1-2 días. Las células T (día 19 del cultivo) fueron entonces estimuladas una tercera vez con DC maduras cargadas con antígeno (generadas durante un procedimiento de 2 días como se expuso anteriormente) en presencia de IL-2, IL- 7, e IL-15 (como anteriormente) y evaluadas para la producción de IFN-? después de 6 horas de cultivo o cultivadas durante 5 días (con cambios de medios cada 1-2 días con AIM-V/2.5% de suero igualado y 20 Ul/ml de IL-2) y entonces evaluadas para la especificidad de las células T al antígeno HBV preS usando tetrámeros de HBV preS (día 24 de cultivo) . El análisis del tetrámero se efectuó con los tetrámeros de MHC de la clase I iTag sintetizados acostumbrados (Beckman Coulter) de acuerdo al protocolo del fabricante. De este modo las células fueron cosechadas, lavadas y transferidas a una placa de fondo en v de 96 pozos a -2 x 105 células/pozo en 20 µl . Las células fueron marcadas a 20°C durante 20 min con Acm específico para CD3 (anti-CD3-FITC) y CD8 (anti-CD8-Cy-Cromo) junto con 2 µl de tetrámero HLA-A*0201 preSI conjugado con PE (GMLTPVSTI, SEQ ID NO: 50) o un tetrámero de preS2 (NIASHISSI, SEQ ID NO: 51) . Las células fueron entonces descongeladas, fijadas con paraformaldehído al 2% en PBS y transferidas a tubos de FACS de 5 mL. Las células fueron adquiridas sobre un FACSCalibur (BD Biosciences) con 80,000-100,000 eventos por muestra. Los análisis se efectuaron usando los programas o sistemas de programación CellQuest (BD Biosciences) con un puente sobre la población de CD3+ disponible (sobre la base del perfil de FSC/SSC) y se determinó el porcentaje de células CD8+ marcando el tetrámero. Cuando las PBMC fueron cultivadas con HBV S1/S2-TBD a 10 µg/ml y estimuladas dos veces con DC maduras marcadas con HBV S1/S2-TBD, un porcentaje marcado de las células se marcó como positivo con el tetrámero SI (Fig. 2) y el tetrámero S2 (Fig. 3) . Esto constrasta con las células T cultivadas con DC maduras no cargadas con antígeno, donde el número de células positivas al tetrámero no fue significativo. De este modo, las DC maduras cargadas con S1/S2-TBD fueron capaces de inducir la generación de un número significativo de células T con especificidad a determinantes de antígeno HBV SI y HBV S2. F. Ejemplo 6: Alteración de la Tolerancia a los Antígenos DHBV y de DHBV usando Proteína de Fusión de Antígeno Quimérico . El DHBV sirvió como modelo animal poderoso en el desarrollo de la terapia antiviral para la DHBV. Han sido usados patos de Pequín, infectados de manera congénita con DHBV para estudiar el mecanismo de la replicación del virus y para la separación de compuestos antivirales. Se usaron dos tipos de modelos de pato en la siguiente invención. El primero es el de patos infectados con DHBV congénitamente . Este se asemeja a la transmisión vertical de la infección por HBV en el hombre. El segundo modelo es el modelo de infección persistente donde son infectados patos recién cazados con DHBV y esos portan la infección. Este segundo modelo se asemeja a la transmisión horizontal de la infección por HBV en el hombre. 1. Patos infectados con DHBV congénitamente En patos infectados por DHBV congénitamente, de cuatro semanas de edad fueron divididos en dos grupos. Se recolecto una muestra de sangre (1.0 mL) como referencia de los niveles de anticuerpo antes de la inmunización y se recolectaron muestras de sangre cada semana antes de las vacunaciones . El grupo experimental recibió el 19.95 mg/de proteína de fusión de DHBV-quimérica/dosis inyectadas cada semana en un día hasta la semana 5. Durante la semana 6, la dosis fue duplicada e inyectada una vez cada cuatro semanas hasta que se descontinuaron las vacunaciones en la semana 26. El grupo placebo recibió el volumen equivalente de amortiguador (fosfato de sodio 20mM pH 8.0, NaCl 300mM) . Una placa de 96 pozos fue recubierta con antígenos, núcleo de DHBV, TBD o núcleos de DHBV, a una concentración de 1.0 µg/mL durante la noche a 4°C. La placa fue lavada con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contenía 2% de BSA. Se agregó suero diluido del animal respectivo a cada uno de los pozos a varias diluciones (1:10- 1:500) y se incubo a 37°C durante 1 hr . La placa fue lavada con PBS que contenía 0.05% de Tween 20 (amortiguador de lavado) . Se agregó dilución de anti-IgG de pato de cabra-HRP (1:5000) a los pozos, y se incubó a 37°C durante 1 hr . La placa fue lavada con amortiguador de lavado y se desarrollo color usando 2-2 ' -azino-di- (3 -etilbenciltiazolin- 6- sulfonato) (KPL, Guildford, RU) . Se midió la densidad óptica del color resultante en las muestras usando un lector de las placas de ELISA (Molecular Devices, EUA) . Los títulos de anticuerpos fueron calculados en relación del suero preinmune del mismo animal . Los niveles de anticuerpo anti-núcleo fueron para patos infectados con DHBV congénitamente en los grupos de patos control y experimental, a la semana 0, 3 y 6 se muestran en la Tabla 6. Aunque los patos tienen una infección' crónica por DHBV, los niveles de anticuerpo son bajos, debido a la naturaleza crónica de la infección y a que el sistema inmune no reconoce el antígeno como una molécula ajena. Tras la inmunización con antígeno quimérico núcleo de DHBV-TBD, el sistema inmune del anfitrión reconoció el antígeno viral y montó una respuesta humoral contra el antígeno del núcleo que ya esta presente en el anfitrión, alterando de este modo la tolerancia del anfitrión a un antígeno viral. TABLA 6 : Respuesta humoral al núcleo DHBV-TBD Unión de Anticuerpo (OD405) Anti-núcleo Anti-TBD de DHBV Patos Semana 0 0.058±0.005 0.005±0.003 Vacunados Semana 3 0.131±0.029 0.092+0.059 Semana 6 0.166±0.021 0.147±0.038 Grupo Semana 0 0.062±0.016 0.003+0.002 Control Semana 3 0.074±0.015 0.010+0.005 Semana 6 0.087+0.012 0.035+0.017 De manera similar, el sistema inmune del pato reconoció el componente de TBD del antígeno quimérico como un antígeno ajeno y generó una respuesta inmune contra esta parte de la proteína de fusión también. Las placas fueron recubiertas con TBD y el suero de patos individuales es evaluado por los niveles de anticuerpo por ELISA. Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 6. 2. Patos Infectados con DHBV Después de su Captura Patos normales fueron infectados con suero de pato que contenía DHBV un día después de que los patos fueron capturados. Este es una táctica estándar en la investigación del DHBV. La presencia de epidemia persistente fue verificada usando técnicas establecidas cuatro semanas antes del inicio de las inmunizaciones. Los patos infectados con el DHBV fueron divididos en dos grupos. Se recolectó una muestra de sangre (1.0 mL) de cada pato como referencia de los niveles de anticuerpo previo a la inmunización y se recolectaron muestras de sangre cada semana antes de las vacunaciones. El grupo experimental recibió 19.95 µg de proteína de fusión de antígeno quimérico del núcleo DHBV-TBD/dosis inyectada subcutáneamente cada semana el mismo día hasta la semana 5. Durante la semana 6, la dosis se duplicó y se inyectó una vez cada cuatro semanas hasta que se descontinuaron las vacunaciones en la semana 30. Se recolectaron muestras de sangre del grupo placebo, el cual recibió el volumen equivalente de amortiguador (fosfato de sodio 20 M pH 8.0, NaCl 300mM) .

Se presentan los niveles de anticuerpo en sueros recolectaos de patos a la semana 0, 3 y 6. Los niveles de anticuerpo anti-núcleo en el suero de patos infectados por DHBV después de su captura en los grupos de patos control y experimental se muestran en la Tabla 7. Puesto que el DHBV ha establecido una infección persistente, los niveles de anticuerpos son bajos, puesto que el sistema inmune no reconoce el antígeno viral como una molécula ajena. La inmunización con antígeno quimérico núcleo DHBV en TBD, el sistema inmune del anfitrión reconoció en antígeno viral y monto una respuesta humoral contra el antígeno del núcleo que ya está presente en el anfitrión, alterando de este modo la tolerancia del anfitrión a un antígeno viral. Los niveles de anticuerpo contra TBD también se incrementaron (Tabla 7) . Por lo tanto existe una respuesta inmune multivalente (multiepitópica) contra las diferentes partes del mismo antígeno quimérico. TABLA 7: Respuesta humoral al núcleo DHBV-TBD TABLA 7 : Respuesta humoral al núcleo DHBV-TBD (Continuación) G . Ejemplo 7 : HBV sAg-Fc (Murino) Retisulado Químicamente Se dializaron soluciones de 100 µg de sAg (US Biologicals ; Cat#H 1910-27) y 100 µg de fragmento de Fc IgG policlonal de ratón (Harían Sera-Lab Ltd. , Cat# PP-19-01) contra 100 mM HEPES pH 8.7 durante la noche. Las soluciones de proteínas fueron mezcladas juntas, se le agregó suberimidato de dimetil (EMS; Pierce Cat# 20700) inmediatamente a una concentración final de 10 mM, y la mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante 1 hr. La reacción se detuvo mediante la adición de Tris HCl 0.1 M pH 7.8. La mezcla de reacción fue cargada sobre una columna Sephadex G 75 ( 0 . 7 x 12 cm) , y las fracciones fueron eluídas usando solución salina amortiguada con fosfato . Se recolectaron fracciones de 0 . 5 ml y las fracciones que contenían sAg/Fc a una relación molar de 1 : 1 , de acuerdo a lo estimado por ELISA usando los anticuerpos respectivos fueron reunidas .

Las fracciones reunidas fueron usadas para ensayos de presentación de antígeno. (Berlyn, et al., Clin Immunol . 101:276-283, (2001)). Se cultivaron células dendríticas inmaduras durante cuatro días con GM-CSF/IL4, incubadas con el conjugado sAg-Fc y maduradas en presencia de TNFa e interferon-a. Se agregaron células CD3+ T autólogas a las células dendríticas maduras. Después de tres rondas de exposición a las células dendríticas maduras, se cuantificó la estimulación de las células T midiendo la producción de interferon-T intracelular, usando citometría de flujo. Los niveles de interferon-? intracelular producido en las células T en presencia de conjugado fueron sustancialmente mayores que en presencia del sAg o el fragmento Fc solo (Tabla 8) . TABLA 8 : Respuesta de células T al conjugado HbsAg-Fc DMS H. Ejemplo 8: Ensayos de Presentación de Antígeno Los ensayos de presentación de antígeno se efectuaron usando células dendríticas derivadas de PBMC humanas de acuerdo a los protocolos establecidos (Berlyn, et al., supra (2001)). Un resumen del protocolo para el ensayo de estímulo de las células T se presenta en forma esquemática.

BrefeldinaA (18 hrs) BrefeldinaA (18 h?s) Ensayo de y y interferón-? Ensayo de tinción de Ensayo de tinción de secretado citocina intracelular citocina intracelular 1. Preparación de Células Dendríticas Cargadas , Í5 Maduras Los monocitos se generaron a partir de muestras de leucaféresis de donadores sanos y fueron empobrecidos en linfocitos y granulocitos por incubación con anticuerpos anti-CD2, CD7, CD16, CD19, 20 y CD56. Esto fue seguido por incubación con anti-IgG de ratón conjugado con perlas magnéticas y separación sobre un imán (Dynal) . Las células seleccionadas de manera negativa fueron más de 95% monocitos puros de acuerdo a lo caracterizado por citometría de flujo 25 usando un panel marcador de CD amplio (CD14+, CDllc+, CD19", CD3", CD4", CD64+, CD32+, CD86+, CD16") . A continuación, fueron los monocitos fueron incubados con IL-4 y GM-CSF (R&D Systems) durante 4 días en AIM V más 2.5% de suero humano igualado para generar células dendríticas inmaduras. Nuevamente, se tiñó una alícuota de células con el panel marcador de CD amplio para asegurar la pureza e identidad de las células. Las células fueron entonces cargadas con HBV S1/S2-TBD (5.0 µg/ml), HBV S1/S2 (2.5 µg/ml), o TBD (2.5 µg/ml) durante 2-4 horas a 37°C, y maduradas con interferon-a y TNF-a durante 3 días. Las células dendríticas fueron modificadas nuevamente usando citometría de flujo para un arreglo de marcadores de CD para asegurar que las células hubieran experimentado la maduración apropiada. Las células dendríticas cargadas, maduras resultante fueron usadas para el ensayo de estimulación de células T. 2. Ensayo de Estimulación de células T: Análisis de Citocina Las células T fueron generadas a partir de la misma muestra de PMBC que las células dendríticas por medio de una selección negativa usando un equipo de aislamiento magnético de células T (Dynal) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células dendríticas cargadas, maduras (DC-1) fueron lavadas perfectamente y agregadas a las células T (Día 0) . Las células T y las células dendríticas fueron incubadas durante 7 días. El día 7, las células T fueron reestimuladas con células dendríticas cargadas, maduras (DC-2) . Dos horas más tarde se tomó una alícuota de las células. La alícuota de células fue incubada con Brefeldin A (GolgiPlugMR, R&D Systems) durante 18 horas y entonces se ensayó por tinción de citócina intracelular como se describe más adelante. Las células restantes fueron incubadas durante otros 7 días. El día 14, las células restantes fueron estimuladas con un tercer lote de células dendríticas, (DC-3) . Dos horas más tarde se tomó una alícuota de las células. La alícuota de células fue incubada con Brefeldin A (GolgiPlug, R&D Systems) durante 18 horas y entonces se ensayó por tinción de citocina intracelular como se describe más adelante. Para la tinción de citocina intracelular, las células fueron teñidas con anti-CD3 -FITC y anti-CD8-Cy-Cromo durante 30 minutos, lavadas, filtradas, permeabilizadas y entonces teñidas con anti-interferon-?-PE durante 30 minutos sobre hielo. Las células fueron lavadas y analizadas por citometría de flujo (FACScan, BD Biosciences) . Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: células T CD3+/lFN-?+ Después de la remoción de la alícuota el día 14, las células T restantes fueron incubadas durante 3 días adicionales y el sobrenadante fue entonces usado para medir el nivel de interferon-? secretado por ELISA (Equipo de ELISA Opt E1A, BD Biosciences) . La estimulación de las células T fue evaluada midiendo los niveles de interferón-? intracelular y secretado. Los resultados se presentan en la Tabla 10. El antígeno quimérico S1/S2-TBD indujo la producción de niveles de interferón-? mayores en comparación con cualquiera del dominio de respuesta inmune o el dominio de TBD de la molécula cuando se probaron solos, a concentraciones equivalentes. Deberá señalarse que una dosis de 5 µg de S1/S2-TBD contiene aproximadamente 2.5 µg de cada uno de los componentes .

Tabla 10 : Niveles Intracelulares y Secretados de Interferon-? Se probaron varias concentraciones de S1/S2-TBD por la respuesta de células T. El efecto del S1/S2-TBD fue mayor que el del tratamiento con toxoide tetánico a concentraciones similares. A concentraciones menores de 5 µg/mL, el antígeno quimérico produjo un incremento dependiente de la concentración en la producción y secreción de interferón-?. La producción de interferón-? y la secreción por células T CD3+ se incrementó en una forma dependiente de la concentración después de la presentación del antígeno S1/S2-TBD por las células dendríticas, como se muestra en la Tabla 11. La respuesta positiva a bajas concentraciones sería benéfica con respecto a la dosis necesaria para la vacunación y el costo de fabricación de una vacuna.

Tabla 11: Dependencia de la Concentración de la Respuesta al Antígeno Quimérico I. Ejemplo 9: Unión y Absorción de Antígenos Quiméricos 1. Preparación de Células Dendrí icas Cargadas , Maduras Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir del tratamiento con Ficoll/Histopaque (Sigma) de una preparación celular de leucaféresis (Berlyn, et al., supra (2001)). Se separaron los monocitos de la población de PBMC por selección negativa usando un equipo de aislamiento de monocitos (Dynal) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los monocitos fueron más del 95%, de acuerdo a lo evaluado por el análisis de anticuerpo y citometría de flujo (CD14+, CDllc+, CD19", CD3", CD4~, CD64+, CD32+, CD86+, CD16") . Los monocitos fueron lavados dos veces con medios AIM-V (Invitrogen) que contenían L-glutamina, sulfato de estreptomicina (50 µg/mL) y sulfato de gentamicina (10 µg/mL) con 1% de suero igualado de donador (aislado de acuerdo a lo descrito en Berlyn, et al . , supra (2001)). A continuación los monocitos fueron cultivados en medios AIM-V que contenían 2.5% de suero igualado de donador y citocinas GM-CSF e IL-4 para diferenciar las células hacia el linaje de células dendríticas (DC) . Las células fueron incubadas en placas de cultivo tisular de 12 pozos a 37°C bajo una atmósfera de 7% de C02. Las células dendríticas derivadas de los monocitos fueron cosechadas los días 1 hasta 4. Las células fueron lavadas secuencialmente una vez con medios AIM-V con BSA al 0.1% (Sigma), y dos veces con solución salina amortiguada con fosfatos de Dulbecco (Invitrogen) con 0.1% (p/v) (PBSB) . Las células dendríticas derivadas de monocitos fueron usadas en la marcación a 4°C o ensayos de unión o en ensayos de unión/absorción a 37°C. 2. Unión de Antígenos Quiméricos a Células Dendríticas en Maduración Se comparó el grado de unión S1/S2-TBD en relación a la IgGl murina y de IgG2a a células dendríticas en maduración. Las células dendríticas fueron aisladas a diferentes días de cultivo ex vivo (del día 0 al día 4) y tratadas con S1/S2-TBD (10 µg/mL) o con IgGl murina (2C12, el Acm original del cual se produjo TBD) o IgG2a (G155-178, 90 µg/mL) durante 1 hora a 4°C. Las células fueron tratadas con anti-Alexa-488 de ratón de cabra F(ab')2 (10 µg/mL) en PBSB durante 20 minutos. Las células fueron lavadas dos veces con PBSB y resuspendidas en PBSB con paraformaldehído (PF) al 2% y adquiridas por un Becton Dickínson (BD) FACScan equipado con adquisición CellQuest y programas y sistemas de programación de análisis (BD) . Se produjo una entrada sobre la población celular viable de acuerdo a lo determinado por el perfil de difracción de FSC y SSC y se adquirieron >10,000 eventos. Para determinar el porcentaje de células positivas, se fijó una entrada sobre las células tratadas, control negativas (isotipo control marcado con células marcadas con anti- Alexa-488 de ratón de cabra F(ab')2 únicamente) . El porciento de células positivas específicas fue calculado como: % de células positivas en la muestra de prueba-% de células positivas control xlOO 100-% de células positivas del control La intensidad fluorescente media relativa (MFI) fue determinada como la MFI de la muestra de prueba menos MFI de la muestra control . La unión de S1/S2-TBD en relación a la IgGl e IgG2a sobre DC después de 1 a 4 días de cultivo se muestra en la Tabla 12.

Tabla 12 : Unión del Antígeno o Anticuerpo Quimérico a Células Dendríticas en Maduración La unión de S1/S2-TBD fue claramente mucho mayor que la unión de cualquiera de IgGl o IgG2a con más unión de S1/S2-TBD evidente el día 1 que el día 4. Esos experimentos demostraron que el S1/S2-TBD se unión con una alta eficiencia a las células dendríticas en maduración. 3. Absorción de Antígenos Quiméricos a Células Dendríticas en Maduración Para determinar el grado de absorción de antígenos quiméricos (por ejemplo HBV S1/S2-TBD) en comparación con la IgGl e IgG2a, las células fueron incubadas con varias concentraciones del antígeno, IgGl (2C12, el Acm original del cual se produjo TBD) o IgG2a (G155-178) durante 1 hora a 37 °C en medios AIM V con 0.1% de BSA. Las células fueron lavadas dos veces en PBSB y fijadas con PBS con 2% de PF durante la noche a 4°C. Posteriormente, las células fueron lavadas dos veces en PBSB y permeabilizadas con PBS que contenía 0.1% (p/v) de saponina (Sigma) durante 40 minutos a 20 °C. Las células fueron lavadas dos veces con PBSB e incubadas con anti-Alexa-488 de ratón de cabra de F(ab')2 (10 µg/mL) en PBSB con 0.1% (p/v) de saponina durante 20 minutos a 4°C. Después de lavar dos veces en PBSB, las células fueron resuspendidas en PBSB. Una variante de este ensayo implicó tratar las células como anteriormente como antígeno quimérico, IgGl, o IgG2a durante 10 minutos seguido por la adición de anti-Alexa-488 de ratón de cabra F(ab')2 (10 µg/mL) durante 50 minutos. Posteriormente, las células fueron lavadas y resuspendidas en PBS con 2% de PF. Las células fueron adquiridas por un Becton Dickinson (BD) FACScan equipado con adquisición CellQuest y programas y sistemas de programación de análisis (BD) . Se produjo una entrada sobre la población celular viable de acuerdo a lo determinado por el perfil de difracción de FSC y SSC y se adquirieron >10,000 eventos. Para determinar el porcentaje de células positivas, se fijó una entrada sobre las células tratadas, control negativas (isotipo control marcado con células marcadas con anti-Alexa-488 de ratón de cabra F(ab')2 únicamente). El por ciento de células positivas específicas fue calculado como: % de células positivas en la muestra de prueba-% de células positivas control xlOO 100-% de células positivas del control La intensidad fluorescente media relativa (MFI) fue determinada como la MFI de la muestra de prueba menos MFI de la muestra control . La absorción de S1/S2-TBD en comparación con la IgGl e IgG2a se estimó como función de la concentración el día 4 de maduración de las células dendríticas. La absorción se cuantificó a 37°C durante 1 hora y los resultados se muestran en la Figura 4. Hubo un incremento lineal en la absorción de S1/S2-TBD con la concentración. La IgGl fue absorbida a un nivel mucho menor y hubo muy poca absorción de IgG2a. Por lo tanto, el antígeno quimérico S1/S2-TBD es absorbido por las células dendríticas de manera más eficiente que las inmunoglobulinas .

J. Ejemplo 10: Expresión de los Receptores de Fc-? y CD206 sobre DC en Maduración Existen varios receptores sobre las células presentadoras de antígenos que se unen y absorben antígenos. La abundancia de esos receptores sobre las células dendríticas en maduración fue evaluada usando anticuerpos específicos para el receptor marcado de manera fluorescente. Se usó el análisis FACS para estimar el porcentaje de células positivas al receptor específico y la población total de células dendríticas. El grado de expresión del receptor se evaluó mediante la determinación de la intensidad fluorescente media relativa y como función de la intensidad fluorescente relativa (Tabla 13) . Tabla 13 : Expresión de los Receptores de Unión de Antígeno Sobre Células Dendriticas en Maduración La expresión de CD64 (receptor I de Fc?) disminuyó con el tiempo en cultivo y al día 4 fue casi despreciable. En contraste, el CD32 (Receptor II de Fc?) , y en un grado menor el CD16 (receptor III de Fc?) , continuó expresándose después de 4 días de cultivo de las DC. El día 0 del cultivo, no existió esencialmente expresión de CD206 (receptor de macrófago de mañosa) . Pero se indujo expresión tras el cultivo con IL-4 y GM-CSF, y al día 4 se expresó CD206 a niveles muy altos. De este modo, al día 4, cuando el antígeno recargado en los ensayos de presentación de antígeno, las células dendríticas tuvieron al menos dos receptores potenciales para la unión de antígenos quiméricos: CD32 y CD206. Además, tuvieron el complemento completo de las moléculas coestimuladoras (no se muestran los datos) . La expresión de HLA-DR (Clase II) y HLA-ABC (Clase I) también se incrementó con el tiempo en el cultivo. Las moléculas coestimuladoras CD86 (B7.2) y CD80 (B7.1) se expresaron a través del periodo de ensayo . Esos resultados indican que las células dendríticas derivadas de los monocitos se diferencian hacia células dendríticas maduras y fueron capaces de procesar y presentar antígenos a las células T. K. Ejemplo 11: Correlación de la Expresión de CD32/CD206 en el S1/S2-TBD que se una a DC en maduración Existe una correlación directa entre la expresión de los receptores CD32/CD206 y la unión de S1/S2-TBD a las células dendríticas en maduración. Puesto que se sabía que la IgGl murina se une al CD32 humano, se esperaba que el S1/S2-TBD, el cual contiene el componente Fc murino de la IgGl, también se uniera al CD32. Además, también se esperaría, que el S1/S2-TBD en virtud de su alta glicosilación de mañosa se uniera a las células dendríticas a través del receptor de CD206. Las gráficas de puntos en la Figura 1 muestran la unión del S1/S2-TBD (10 µg/mL) y la expresión de CD32 así como la unión de S1/S2-TBD y la expresión de CD206. Hubo una correlación directa entre el grado de unión de S1/S2-TBD y el grado de expresión de CD32, la cual fue relativamente heterogénea, es decir, que hubo un amplio grado de expresión. Los resultados demuestran que el S1/S2-TBD se une al CD32, y que a mayor la expresión de CD32, mayor fue el grado de unión del antígeno quimérico S1/S2-TBD. La gráfica de puntos de la unión de S1/S2-TBD y la expresión de CD206 muestra que la vasta mayoría de células que expresan CD206 también se unieron a S1/S2-TBD. Un porcentaje menor de la población celular fue negativa al CD206 y en consecuencia fue negativa a la unión de S1/S2-TBD. Por lo tanto ambos receptores de CD32 y CD206 se correlacionan con la unión de S1/S2-TBD. L. Ejemplo 12: La Unión y Absorción del S1/S2-TBD es Principalmente Vía el CD32 con el CD206 Implicado en un Menor Grado Se estimó la absorción de S1/S2-TBD en comparación con la IgGl e IgG2a murinas como función de la concentración al día 4 de la maduración de las DC. La absorción se cuantificó a 37°C durante 1 hora en presencia de medios, mañano (2 mg/ml, Sigma) , y/o Fc? de ratón (2 mg/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories) . El mañano es un inhibidor competitivo de la unión de CD206 y por lo tanto de la absorción de antígenos vía el CD206 sobre las células dendríticas . El Fc? es un inhibidor competitivo de la unión de CD32 y por lo tanto la absorción de antígeno mediada por CD32. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14 : Inhibición de la Unión de Antígeno Quimérico por Fc o Mañano Hubo un incremento progresivo en la unión del antígeno quimérico con su concentración. La incubación de las células con una alta concentración de fragmento de Fc? de ratón abolió está unión, mientras que el mañano, un inhibidor de la unión del receptor de CD206, tuvo solo un efecto marginal. Por lo tanto, el CD32 puede ser el receptor principal implicado en la unión y absorción del antígeno quimérico. M. Ejemplo 13: La Glicosilación del Antígeno HBV S1/S2 Imparte Imnunogenicidad La vía de la glicosilación de proteína en células de insecto es diferente a la de las células de mamífero en que las proteínas sintetizadas en las células de insecto experimentan glicosilación que da como resultado un alto contenido de mañosa y ausencia de residuos de ácido siálico terminales en la proteína secretada (Altman, et al., Glycoconjug 16:109-123 (1999)). El HBV S1/S2, el antígeno componente del antígeno quimérico se expresó en células E. coli (sin glicosilación) y células de insecto High Five™ (glicosilación de mañosa) . 1. Efecto de la Glicosilación Sobre la Unión del Antígeno Esos antígenos fueron comparados por su unión a células dendríticas, como se describe en el Ejemplo 9. Las células dendríticas en maduración fueron cargadas con 10 µg/ml de HBV S1/S2 expresado en células de insecto o en E. coli . La proteína glicosilada mostró mejor unión por las células dendríticas (Tabla 15) . Tabla 15 : Efecto de la Glicosilación sobre la Unión de HBV S1/S2 2. Efectos de la glicosilación sobre la producción en la respuesta inmune La glicosilación de HBV S1/S2 produce un incremento en la inmunogenicidad y respuesta de células T. El HBV S1/S2, expresado en E. coli y células de insecto High FiveMR, fue comparado por su respuesta de células T cuando es presentado por células dendríticas. Se midieron ambos niveles de interferón-? intracelular y secretado, como se describe en el Ejemplo 8 (usando 2.5 µg/ml de proteína HBV S 1/S2) , y los resultados son presentados en la Tabla 16. Tabla 16: Efecto de la Glicosilación sobre los Niveles de Interferón-? Tabla 16: Efecto de la Glicosilación sobre los Niveles de Interferón-? (Continuación) El HBV S1/S2 expresado en células de insecto generó un nivel mayor de inteferón intracelular y secretado, en comparación con la proteína no glicosilada expresada en E. coli . Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan aquí como referencia. Las diferentes modificaciones y variaciones del método y sistema descritos de la invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en relación con modalidades preferidas, específicas, deberá comprenderse que la invención como se reclama no deberá ser limitada indebidamente a esas modalidades específicas. En realidad, se pretende que las diferentes modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, los cuales son obvios a un experto en la técnica, estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido ' en las siguientes reivindicaciones :

1. Un antígeno quimérico para producir una respuesta inmune caracterizado porque comprende un dominio de respuesta inmune y un dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo.

2. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo xenotípico.

3. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo no es un fragmento de anticuerpo xenotípico.

4. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno quimérico comprende más de un dominio de respuesta inmune .

5. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína de HBV, una proteína de DHBV y una proteína de HCV.

6. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína de HBV seleccionada del grupo que consiste de HBV S1/S2, HBV S1/S2/S, Núcleo de HBV, Núcleo de HBV ctm y polimerasa de HBV.

7. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína de DHBV seleccionada del grupo que consiste de PreS/S de DHBV, PreS de DHBV, Núcleo de DHBV y polimerasa de DHBV.

8. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína de HCV seleccionada del grupo que consiste de Núcleo de HCV (1-191) , Núcleo de HCV (1-177) , E1-E2 de HCV, El de HCV, E2 de HCV, NS3 de HCV, NSSA de HCV y NS4A de HCV.

9. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende además una marca de 6xHes fusionada a la proteína.

10. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende una o más porciones antigénicas de una proteína de HPV, HIV, HSV, un parásito intracelular obligado o un antígeno del cáncer.

11. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el dominio de unión del blanco es capaz de unirse a una célula presentadora de antígenos .

12. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo comprende un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina .

13. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina comprende una región de bisagra.

14. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el antígeno quimérico comprende además los aminoácidos, VDKKI (SEQ ID NO: 2) .

15. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina comprende los dominios CH2 y CH3.

16. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de Fc .

17. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo comprende una porción de una región CH1 y una región de bisagra del anticuerpo.

18. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque comprende además un enlazante para enlazar el dominio de respuesta inmune y el dominio de unión del blanco.

19. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el enlazante es un enlace peptídico covalente.

20. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el enlace peptídico comprende la secuencia SRPQGGGS o VRPQGGGS (SEQ ID NO: 1) .

21. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el enlazante es seleccionado del grupo que consiste de cremalleras de leucina y biotina/avidina .

22. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el antígeno quimérico es mañosa glicosilada .

23. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune es mañosa glicosilada.

24. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el dominio de unión del blanco es mañosa glicosilada.

25. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el antígeno quimérico es pobre en mañosa glicosilada.

26. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el antígeno quimérico es rico en mañosa glicosilada.

27. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de unión del blanco comprende las secuencias de aminoác ido s SRPQGGGS (SEQ ID NO : 1) , VDKKI (SEQ ID NO : 2) y dominios los CH2 y CH3 de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina murina.

28. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizado porque produce una respuesta multiepitópic .

29. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque produce una respuesta inmune a al menos un epítope del dominio de respuesta inmune.

30. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizado porque produce una respuesta inmune humoral .

31. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizado porque produce una respuesta inmune celular .

32. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizado porque produce una respuesta inmune de Thl , una respuesta inmune de Th2 , una respuesta de CTL, o una combinación de las mismas.

33. Un método para mejorar la presentación de antígenos en una célula presentadora de antígenos, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula presentadora de antígenos con una composición que comprende un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el método mejora la presentación de antígenos de más de un epítope .

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el método mejora la presentación de antígenos de al menos un epítope del dominio de respuesta inmune.

37. Un método para activar una célula presentadora de antígenos, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula presentadora de antígenos con un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

38. El método de conformidad con la reivindicación 33 ó 37, caracterizado porque el contacto toma lugar ex vi vo .

39. El método de conformidad con la reivindicación 33 ó 37, caracterizado porque el contacto toma lugar in vivo .

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el contacto toma lugar en un humano.

41. Un método para producir una respuesta inmune, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una composición que comprende un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

42. Un método para alterar la tolerancia, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula presentadora de antígenos con un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

43. Un método para tratar una condición tratable de manera inmune, caracterizado porque comprende administrar, a un sujeto que necesite del mismo, un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-43, caracterizado porque la administración del dominio de respuesta inmune solo no produce una respuesta inmune .

45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-43, caracterizado porque la administración del antígeno quimérico produce a respuesta inmune mayor que la de la administración del dominio de respuesta inmune solo.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la respuesta inmune es medida por la cantidad de anticuerpo específico para el antígeno presente en el sujeto.

47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la respuesta inmune es medida por la cantidad de interferón y secretado por las células T en respuesta a la exposición a células presentadoras de antígenos cargadas con el antígeno quimérico o dominio de respuesta inmune solo .

48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la respuesta inmune es medida por la cantidad de células T CD8+ específicas para el antígeno producidas en respuesta a la exposición a células presentadoras de antígenos cargadas con el antígeno quimérico o dominio de respuesta inmune solo.

49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-43, caracterizado porque el sujeto tiene una infección o un cáncer.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la infección es una infección viral o una infección parasitaria.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la infección es una infección viral crónica.

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la infección viral crónica es una infección viral crónica por hepatitis B o una infección viral crónica por hepatitis C, una infección viral crónica por papiloma humano, una infección viral crónica por inmunodeficiencia humana, o una infección viral crónica por herpes simple.

53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la infección es una infección viral por hepatitis B y el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína de Núcleo de HBV, una proteína S de HBV, una proteína SI de HBV y una proteína S2 de HBV y combinaciones de las mismas.

54. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la infección es una infección viral por hepatitis C y el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína de Núcleo de HCV (1-191) , una proteína de Núcleo de HCV (1-177), una proteína El de HCV, una proteína E de 2HCV, una proteína E1-E2 de HCV, una proteína NS3 de HCV, una proteína NSSA de HCV y combinaciones de las mismas.

55. Un método para vacunar un sujeto contra una infección viral, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el sujeto es vacunado terapéuticamente contra una infección viral existente .

57. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el sujeto es vacunado profilácticamente contra una infección viral .

58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el sujeto desarrolla una respuesta inmune a más de un epítope del antígeno quimérico.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el sujeto desarrolla una respuesta inmune a más de un epítope del dominio de respuesta inmune.

60. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

61. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición farmacéutica es formulada para la administración parenteral.

62. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición farmacéutica es formulada para la administración transdérmica, intradérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, nasal, pulmonar u oral.

63. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32 e instrucciones para administrar el antígeno quimérico a un sujeto que necesite del mismo.

64. Un método para producir un antígeno quimérico, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un microorganismo o línea celular, que comprende a polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32; y (b) cultivar el microorganismo o línea celular bajo condiciones en las cuales el antígeno quimérico sea expresado .

65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el microorganismo o línea celular es a microorganismo eucariótico o línea celular.

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el microorganismo o línea celular es una levadura, una línea celular de planta o una línea celular de insecto.

67. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el antígeno quimérico es modificado postranslationalmente para comprender una glicosilación de mañosa.

68. Un polinucleótido que codifica para un antígeno quimérico, caracterizado porque el polinucleótido comprende una primera porción del polinucleótido que codifica para un dominio de respuesta inmune y una segunda porción del polinucléotido que codifica para un dominio de unión del blanco, donde el dominio de unión del blanco comprende un fragmento de anticuerpo.

69 . El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el dominio de respuesta inmune comprende al menos una porción antigénica de una proteína viral .

70. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la proteína viral es una proteína de HBV o una proteína de HCV.

71. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento xenotípico.

72. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo no es un fragmento no xenotípico.

73. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de los nucleótidos 1 a 1326 de la SEQ ID NO: 26, nucleótidos 1 a 2004 de la SEQ ID NO: 28, nucleótidos 1 a 1350 de la SEQ ID NO: 30, nucleótidos 1 a 1293 de la SEQ ID NO: 32, nucleótidos 1 a 1794 de la S?Q ID NO: 34, nucleótidos 1 a 1581 de la SEQ ID NO: 36, nucleótidos 1 a 1389 de la SEQ ID NO: 38, nucleótidos 1 a 1347 de la SEQ ID NO: 40, nucleótidos 1 a 2157 de la SEQ ID NO: 42, nucleótidos 1 a 1395 de la SEQ ID NO: 44, nucleótidos 1 a 1905 de la SEQ ID NO: 46 y nucleótidos 1 a 2484 de la SEQ ID NO: 48.

74. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el polinucleótido codifica para un antígeno quimérico que es al menos 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos completa seleccionada del grupo que consiste de los aminoácidos 1 a 442 de la SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 668 de la SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 450 de la SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 431 de la S?Q ID NO: 33, aminoácidos 1 a 598 de la SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 527 de la SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 463 de la S?Q ID NO ¿39, aminoácidos 1 a 449 de la SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 719 de la SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 465 de la SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 635 de la SEQ ID NO: 47 y aminoácidos 1 a 828 de la SEQ ID NO: 49.

75. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el polinucleótido se híbrida selectivamente bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 26, 28, 30,32, 34,36, 38, 40,42, 44,46 y 48.

76. Un microorganismo o línea celular, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68.

77. Un vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 68.