JP2003532686A - 抗原−抗体複合体化および樹状細胞による提示を利用する治療法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫療法で使用するための方法および組成物が開示される。これらの方法および組成物は、患者へ抗原を提示するための樹状細胞を開発するために特に有用であり、ここで患者は抗原に関連する疾患を有する。本発明は、抗原に関連する疾患を有する患者を処置するための方法を提供する。本発明に従った方法は、抗原および抗原に特異的な抗原提示細胞結合剤をex vivoで混ぜ、および抗原に関連する疾患を患っている患者に組成物を投与することから成っており、ここで患者は治療的利益を受ける。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は免疫療法に関する。特に、本発明は免疫療法における抗原提示細胞、
特に樹状細胞の使用に関する。

【０００２】 背景技術 Tリンパ球（即ち、T細胞）は、Bリンパ球（即ち、B細胞）と異なり、典型的に
は抗原が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）との関係で提示された場合にのみ、
それらの抗原を認識する。それ故、Tヘルパー細胞および細胞障害性T細胞を含む
Tリンパ球へ抗原を提示するには、抗原提示細胞表面上のMHC分子との関係で抗原
が提示されなければならない。

【０００３】 特に、抗原提示細胞の一つの型、樹状細胞が癌免疫療法の分野において最近興
味を持たれるようになってきた。Steinman, Annu. Rev. Immunol. 9：271-296（
1991）は、樹状細胞は骨髄を起源とし、体中に分布することが観察できる稀な白
血球であることを教えている。Bjork, Clinical Immunology 92：119-127（1999
）は、樹状細胞が腫瘍ワクチンにおいて、生物学的アジュバントとして可能性の
ある包含物であるため、注目を集めることが多くなっていることを教えている。
樹状細胞は免疫グロブリンIgGのFc部分に対するいくつかのレセプターを発現し
、それは抗原-IgG複合体（IC）の内部移行を媒介する。この能力において、T細
胞へ腫瘍抗原を提示するために樹状細胞が使用される。Avigan, Blood Reviews
13：51-64（1999）は、成熟樹状細胞上への腫瘍ペプチドのパルス化を含んだ、
いくつかの試みが樹状細胞上へ腫瘍抗原を直接的に負荷するために採用されてき
たことを教えている。Timmerman et al., Annu. Rev. Med. 50：507-529（1999
）は、ex vivoで腫瘍抗原を負荷され、および細胞性ワクチンとして投与された
単離樹状細胞が、実験動物において保護的および治療的抗腫瘍免疫性を誘導する
のを観察したことを教えている。欧州特許番号EP0553244は、抗原に対する応答
を刺激するための抗原／二重特異性結合剤複合体を記載しており、ここで、結合
剤は抗原および抗原提示細胞上の細胞表面レセプターの両方へ特異的に結合する
が、細胞表面レセプターへの結合剤の結合はレセプターの天然リガンドをブロッ
クしない。

【０００４】 樹状細胞抗原提示の作用機構はまだ調べられていない。Coughlan et al., Vet
erinary Immunology and Immunopathology 49：321-330（1996）は、Fcγレセプ
ターを介する樹状細胞による抗原取り込みが、in vitroでのヒツジ系において、
抗原提示およびT細胞増殖の機能的増大を生じさせたことを記載する。Regnault
et al., J. Exp. Med. 189：371-380（1999）は、マウス系において、Fcγレセ
プターが樹状細胞成熟を誘導し、および外因性、免疫グロブリン（Ig）複合体化
抗原からのペプチドの有効なMHCクラスI拘束性提示を促進することを教えている
。

【０００５】 それ故、樹状細胞を利用してヒト疾患を処置するためのアプローチを発見する
必要性が残されている。癌のような疾患を処置するための樹状細胞に基づいた方
法の有望性から、有効な治療的処置として、そのようなアプローチを実際に発展
させる必要性が強調される。

【０００６】 発明の簡単な説明 本発明は、抗原に関連する疾患を処置するため、治療的に有効な、樹状細胞に
基づいたアプローチを提供する。本発明に従った方法は、疾患に関連する抗原お
よび抗原に特異的な樹状細胞結合剤を、樹状細胞とともに、または樹状細胞なし
で、ex vivoで混合して組成物を提供し、および抗原に関連する疾患を有する患
者に組成物を投与することを含み、ここで組成物が投与される患者は治療的利益
を受ける。

【０００７】 従って、第一の観点において、本発明は抗原に関連する疾患を患っている患者
を処置するための方法であって、疾患を患っている患者へ、疾患に関連した抗原
および抗原に特異的な樹状細胞結合剤から成る組成物を投与することを含む方法
を提供し、ここで抗原は樹状細胞結合剤に複合体化され、およびここで組成物を
投与される患者は治療的利益を受ける。好ましくは、患者はヒトである。

【０００８】 第二の観点において、本発明は抗原に関連する疾患を患っている患者を処置す
るための方法であって、前記患者へ、疾患に関連した抗原、抗原に特異的な樹状
細胞結合剤、および患者自己由来の樹状細胞から成る組成物を投与することを含
む方法を提供し、ここで組成物を投与される患者は治療的利益を受ける。好まし
くは、患者はヒトである。

【０００９】 第三の観点において、本発明は抗原に関連する疾患を患っている患者を処置す
るための方法であって、前記患者へ、宿主抗異種型抗体および疾患に関連する抗
原に特異的な異種型抗体を含む組成物を投与することを含む方法を提供し、ここ
で組成物を投与される患者は治療的利益を受ける。

【００１０】 第四の観点において、本発明は疾患に関連する抗原に特異的である精製された
樹状細胞結合剤、および疾患に関連する抗原を含む治療的組成物を提供する。好
ましい態様において、樹状細胞上のレセプターへの樹状細胞結合剤の結合は、レ
セプターへの天然のリガンドの結合をブロックする。本発明の第四の観点でのあ
る態様において、疾患を患っている患者への組成物の投与は、患者へ治療的利益
を提供する。好ましくは、患者はヒトである。好ましくは、樹状細胞結合剤は抗
体である。

【００１１】 第五の観点において、本発明は疾患に関連する抗原に特異的である精製された
樹状細胞結合剤、樹状細胞および疾患に関連する抗原から成る治療的組成物を提
供する。好ましい態様において、樹状細胞上のレセプターへの樹状細胞結合剤の
結合は、レセプターへの天然のリガンドの結合をブロックする。ある態様におい
て、疾患を患っている患者への組成物の投与は、患者へ治療的利益を提供し、こ
こで樹状細胞は患者自己由来のものである。好ましくは、患者はヒトである。

【００１２】 第六の観点において、本発明は疾患に関連する抗原に特異的である精製された
異種型抗体および宿主抗異種型抗体から成る治療的組成物を提供する。ある態様
において、疾患を患っている患者への組成物の投与は、患者へ治療的利益を提供
し、ここで樹状細胞は患者自己由来のものである。好ましくは、患者はヒトであ
る。

【００１３】 発明の詳細な説明 本発明は免疫療法に関する。特に、本発明は免疫療法における抗原提示細胞、
特に樹状細胞の使用に関する。本発明は、抗原に関連する疾患を処置するための
治療的に有効な樹状細胞に基づいたアプローチを提供する。本明細書中で引用し
た特許および刊行物は当業者のレベルを反映しており、各々が特別におよび個々
に参照文献として組み入れられると示される場合には、その場合と同じ程度でそ
の全体が参照文献として組み入れられる。引用された参照文献および本明細書間
に矛盾がある場合、本明細書が優先されるであろう。

【００１４】 本発明は抗原に関連した疾患を有する患者を処置するための方法を提供する。
本発明に従った方法は、疾患に関連した抗原および抗原に特異的な樹状細胞結合
剤をex vivoで混合して組成物を提供し、前記組成物を抗原に関連した疾患を患
っている患者へ投与することを含み、ここで患者は治療的利益を受ける。

【００１５】 従って、本発明の第一の観点において、本発明は、抗原に関連する疾患を患っ
ている患者を処置するための方法を提供し、それは疾患を患っている患者へ、疾
患に関連した抗原および抗原に特異的な樹状細胞結合剤の組成物を投与すること
を含み、ここで抗原は樹状細胞結合剤に複合体化され（即ち、それにより特異的
に結合され）、およびここで組成物を投与される患者は治療的利益を受ける。

【００１６】 ある態様において、抗原／樹状細胞結合剤複合体は、例えば、抗原および樹状
細胞結合剤をex vivoで混合することにより形成される。“ex vivoで混合する”
とは、体の外側で、物理的に近い位置に持ってくることを意味する。

【００１７】 ある好ましい態様において、患者はヒトである。他の態様において、患者は好
ましくは非ヒト哺乳類、特に実験動物である。本発明の好ましい非ヒト患者には
、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、アカ
ゲザル）、イヌ、ネコ、ブタ、およびアルマジロが含まれるが、それらに限定さ
れるわけではない。

【００１８】 本発明に従った方法は抗原に関連する疾患を有する患者を治療的に処置するた
めに有用である。本明細書中で使用される場合、用語”抗原に関連する疾患”と
は、抗原がある濃度で患者の体内に存在する場合、患者の多数に病気の徴候また
は症状を呈する状態であるが、しかし、患者に抗原が存在しないまたは患者の体
内により低い濃度で存在する場合、病気の徴候または症状が存在しないかまたは
軽減される状態を意味する。“病気の徴候または症状”は臨床的に認められる疾
患の発現または指標である。

【００１９】 本発明の“抗原に関連する疾患を患っている患者”は疾患の症状がまだ出てい
なくてもよいことが理解されるであろう。従って、BRCA-1が循環している患者は
、その患者が乳癌またはアデノカルシノーマの症状がまだ出ていなくても本発明
の患者である。

【００２０】 疾患に関連する限定的ではないそのような抗原例のいくつかには、前立腺特異
的抗原（前立腺癌に関連する）、BRCA-1およびBRCA-2抗原（乳癌、肺癌および膵
臓癌を含む多くのアデノカルシノーマに関連する）、CA125（卵巣癌に関連する
）、異所性ミエリン塩基性タンパク質（アルツハイマー病に関連する）、gp 120
（HIV感染およびAIDSに関連する）、MUC-1（乳癌に関連する）、EBNA-1（エプス
タインバーウイルス感染に関連する）、CA19.9（結腸直腸、胃および膵臓癌に関
連する）、およびTAG-72（卵巣、間質および膵臓癌に関連する）、p53（種々の
癌に完成する）が含まれる。

【００２１】 それ故、ある好ましい態様において、抗原は腫瘍関連抗原である。“腫瘍関連
抗原”とは、腫瘍細胞により作られ、および腫瘍表面上に提示されるかまたは循
環しているか、またはその両方の患者体内の抗原である。好ましい腫瘍関連抗原
には、CA125、PSA、MUC-1、CA19.9およびTAG-72が含まれるが、それらに限定さ
れるわけではない。一般的には、約0.1〜約50μgの抗原が使用される。

【００２２】 ある好ましい態様において、抗原は病原体由来のものである。“病原体”は疾
患を起こすことができる病因論的因子（etiolytic agent）である。好ましい病
原体には、ウイルス（例えば、B型肝炎、C型肝炎、ヘルペスおよびHIV-1）、ウ
イロイド、細菌、菌類、プリオンおよび寄生虫が含まれるが、それらに限定され
るわけではない。

【００２３】 “抗原に特異的に結合された”または“抗原に対して特異的な”とは、樹状細
胞結合剤が、関連のないタンパク質を結合する場合よりも大きな親和性で抗原を
結合することを意味する。好ましくは、そのような親和性は、関連のないタンパ
ク質への結合剤の親和性よりも少なくとも10倍は強く、より好ましくは少なくと
も100倍は強く、および最も好ましくは少なくとも1000倍は強い。好ましくは、
抗原に特異的である抗原提示細胞結合剤は、水中で、生理学的条件下かまたはイ
オン強度に関して生理学的に近い条件下（例えば、140 mM NaCl、5 mM MgCl₂）
、少なくとも10⁶ M^-1、より好ましくは少なくとも10⁷ M^-1、さらにより好ましく
は少なくとも10⁸ M^-1、さらにより好ましくは少なくとも10⁹ M^-1、最も好ましく
は少なくとも10¹⁰ M^-1の親和性で抗原との会合を形成する。

【００２４】 循環抗原と複合体形成した注入樹状細胞結合剤は、樹状細胞の表面上に提示さ
れたFcレセプターを通して、in vivoで樹状細胞（好ましくは未成熟樹状細胞）
を標的とする。好ましくは、抗原を未成熟樹状細胞へ標的化し、MHCクラスIおよ
びクラスII分子両方にこれらの抗原を提示することにより、結合剤／抗原の免疫
複合体は効率的に樹状細胞を感作し、in vivoでCD4（＋）ヘルパーT細胞およびC
D8（＋）細胞障害性T細胞両方の活性化を誘導する。

【００２５】 本発明の“樹状細胞結合剤”は、樹状細胞のいずれかの発生段階において、樹
状細胞表面上のレセプターのリガンド結合部位を結合する。好ましくは、一度樹
状細胞結合剤が樹状細胞レセプターのリガンド結合部位へ結合されたら、樹状細
胞結合剤がレセプターへ結合する時と同時には、天然リガンドはレセプターへ結
合できない。好ましくは、結合剤が特異的に抗原へ結合される場合、樹状細胞結
合剤は樹状細胞表面上のレセプターを結合する。好ましくは、そのような結合は
、結合剤／抗原複合体の内部移行を引き起こす。さらにより好ましくは、未成熟
または前駆体樹状細胞による結合剤／抗原複合体の結合および／または内部移行
は樹状細胞の成熟および／または活性化を引き起こす。

【００２６】 好ましくは、本発明の樹状細胞結合剤は、好中球上には稀であるCD64（FcγRI
）またはCD32（FcγRIIA）のような活性化Fcγレセプターへ結合する。 本明細書中で使用される場合、“レセプターのリガンド結合部位”とは、レセ
プターの天然リガンドが結合するレセプター上の部位を意味する。例えば、もし
レセプターがFcγタイプIIレセプターであれば、レセプターの天然のリガンドは
IgG抗体である。本発明の樹状細胞結合剤は、レセプターに結合される場合、レ
セプターの天然リガンドがレセプターに結合できないように、レセプターのリガ
ンド結合部位をブロックする。一つの限定的ではない実施例において、もし、レ
セプターがFcγタイプIIレセプターであり、および本発明の樹状細胞結合剤がIg
G抗体であれば、レセプターへの本発明の樹状細胞結合剤の結合は、他のIgG抗体
がレセプターへ結合するのを妨げる。

【００２７】 従って、本発明の樹状細胞結合剤は容易に本分野で既知の方法により同定され
る。一つの限定的ではない実施例において、樹状細胞結合剤がIgG抗体の場合、
前駆、未成熟または成熟樹状細胞は以下に記載されるように精製される。次に、
細胞はFITC-標識IgG抗体（抗体が特異的に結合する抗原とともに、または抗原な
しで）とインキュベートされる。次に、フィコエリトリン（PE）-標識天然リガ
ンド（即ち、別のIgG抗体）が細胞に加えられる。本発明のFITC-標識IgG抗体が
、樹状細胞上のレセプターへのPE-標識抗体の結合をブロックすることができる
かどうかを決定するため、フローサイトメトリーによる分析に細胞を供すること
ができる。

【００２８】 ある好ましい態様において、樹状細胞結合剤は、一つは本発明の抗原に特異的
であり、および他は樹状細胞表面上のレセプターに特異的である（例えば、その
リガンド結合部位で）、二つの抗原結合部位を持つ二重特異性抗体ではない。

【００２９】 “患者に組成物を投与する”とは、組成物を結果として患者の体の内部に存在
させるような様式で患者に組成物を提供することを意味する。そのような投与は
、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内および筋肉内を含むが、これらには限定
されるものではない、いずれかの経路によるものであろう。“治療的利益を受け
る”とは、患者が病気の徴候または症状の軽減または減少を経験することを意味
しており、特には生存の延長が含まれるが、これらには限定されるものではない
。本発明に従った方法のある好ましい態様において、CD8＋IFN-γ産生T細胞を活
性化して、組成物を投与された患者に細胞障害性Tリンパ球（CTL）免疫応答を誘
導する。本発明に従った方法のある態様において、CD4＋IFN-γ産生T細胞を活性
化して、組成物を投与された患者にヘルパーT細胞免疫応答を誘導する。これら
の活性化されたCD4＋IFN-γ産生T細胞（即ち、ヘルパーT細胞）は、必要な免疫
学的補助（例えば、サイトカインの放出による）を提供し、CTLのみでなく、B細
胞により媒介される体液性免疫応答も誘導および維持する。それ故、本発明に従
った方法のある態様において、組成物を投与された患者では、抗原に対する体液
性応答が活性化される。

【００３０】 CD8＋および／またはCD4＋IFN-γ産生T細胞の活性化とは、IFN-γを実際に産
生する能力を有するT細胞に、実際にIFN-γを産生させるかまたはIFN-γ産生を
増加させることを意味する。“CTLの誘導”とは、潜在的細胞障害性Tリンパ球に
、抗原特異的細胞傷害性を示させるか、またはそのような抗原特異的細胞傷害性
を増加させることを意味する。“抗原特異的細胞傷害性”とは、抗原を提示す細
胞に対する細胞傷害性が、抗原を提示していない細胞に対する細胞傷害性よりも
大きいことを意味する。“細胞傷害性”とは、標的細胞を殺す、細胞障害性Tリ
ンパ球の能力を示す。好ましくは、そのような抗原特異性細胞傷害性は、抗原を
提示していない細胞に対する細胞傷害性よりも少なくとも3倍、より好ましくは1
0倍以上、より好ましくは100倍よりも大きい。

【００３１】 ある好ましい態様において、本発明の樹状細胞結合剤は抗原および樹状細胞上
のFcγタイプIIまたはタイプIレセプターへ結合する。好ましくは、FcγタイプI
IまたはタイプIレセプターへの結合剤の結合は、各々FcγタイプIIまたはタイプ
Iレセプターへの天然リガンドの結合をブロックする。従って、ある態様におい
て、樹状細胞結合剤は組成物が投与された患者において、抗原に対しておよび樹
状細胞上のFcγタイプI（CD64）レセプターに対して結合する。ある態様におい
て、樹状細胞結合剤は組成物が投与された患者において、抗原に対しておよび樹
状細胞上のFcγタイプIIA（CD32A）レセプターまたはFcγタイプIIB（CD32B）レ
セプターのようなFcγタイプII（CD32）レセプターに対して結合する。ある態様
において、樹状細胞結合剤は組成物が投与された患者において、抗原に対してお
よび樹状細胞上のFcγタイプIICD16（FcγRIII）レセプターに対して結合する。

【００３２】 ある好ましい態様において、本発明の樹状細胞結合剤は抗体である。好ましく
は、抗体は約1-10μg/mlの濃度で提供される。“抗体”には、抗体の活性部分を
含む分子が含まれる。“抗体の活性部分”とは、抗原に特異的である抗原結合部
位、およびリガンド結合部位上のFcレセプター（例えば、重鎖定常領域に含まれ
る抗体のFc部分）を結合するレセプター結合部位が含まれる分子である。従って
、本発明の抗体とは、抗体が抗原に特異的に結合できる限り、および抗体にリガ
ンド結合部位上のFcレセプターを結合する部分が含まれる限り、例えば、キメラ
、一本鎖、変異体または抗体断片であってもよい。

【００３３】 従って、抗体はレセプター結合部位をコード化する遺伝子の一部に特異的点変
異を有する免疫グロブリンによりコード化されていてもよい。一つの限定的では
ない実施例において、抗-PSA抗体、Alt-6、をコード化する遺伝子が、レセプタ
ー結合部位をコード化する遺伝子の一部に点変異が導入できる。生じた抗体変異
体はFcγタイプI（CD64）レセプター、FcγタイプII（CD32）レセプターまたはF
cγタイプIICD16（FcγRIII）レセプターをコード化する遺伝子でトランスフェ
クトした細胞（例えば、COSまたはHeLa細胞）上でスクリーニングできる。本発
明の好ましい変異体Alt-6抗体は、FcγタイプI（CD64）レセプター、Fcγタイプ
II（CD32）レセプターおよび／またはFcγタイプIICD16（FcγRIII）レセプター
を発現する細胞に対して、これらのレセプターを発現していない細胞と比較する
とより良好に結合する（より大きな数でまたはより高い親和性で）。

【００３４】 ある態様において、組成物の樹状細胞結合剤には、ヒト抗異種型抗体（HAXA）
応答を惹起する部分が含まれる。 ある態様において、樹状細胞結合剤は異種型抗体である。“異種型抗体”とは
、患者の種以外の種に由来する抗体である。例えば、もし患者がヒトであるなら
ば、マウス抗体である本発明の樹状細胞結合剤は異種型抗体である。同様に、も
し患者がマウスであるならば、ラット抗体である本発明の樹状細胞結合剤は異種
型抗体である。好ましい異種型抗体には、マウスモノクローナル抗体を含むモノ
クローナル抗体が含まれるが、これに限定されるものではない。特に好ましいモ
ノクローナル抗体には、Alt-1（マウスIgG1、特異的にMUC-1へ結合する；ATCC番
号PTA-975；American Type Culture Collection, Manassas, VA）、Alt-2（マウ
スIgG1、特異的にCA125へ結合；ATCC番号PTA-1883）、Alt-3（マウスIgG3、特異
的にCA19.9へ結合；ATCC番号PTA-2691）、Alt-4（マウスIgM、特異的にCA19.9へ
結合；ATCC番号PTA-2692）、Alt-5（マウスIgG1、特異的にCA19.9へ結合；ATCC
番号PTA-2690）；およびAlt-6（マウスIgG1、特異的に前立腺特異的抗原（PSA）
へ結合；ATCC番号HB-12526）が含まれる。

【００３５】 ある態様において、異種型抗体は患者において宿主抗異種型抗体（HAXA）応答
を惹起する。 ある好ましい態様において、患者に投与される組成物にはさらに、宿主抗異種
型抗体（HAXA）が含まれる。“宿主抗異種型抗体（HAXA）”とは、本発明の組成
物中に含有される異種型抗体に結合する宿主動物種の抗体である。例えば、もし
患者がヒトであり、および異種型抗体がウサギ抗体であるとしたら、HAXAはヒト
抗ウサギ抗体である。好ましくは、HAXAは約1-10μg/mlの濃度で組成物中に提供
される。好ましいHAXAにはヒト抗マウス抗体（HAMA）が含まれるが、これに限定
されるものではない。

【００３６】 ある態様において、患者に投与される組成物にHAXAが含まれないとしたら、HA
XAは、好ましくは、すでに患者の血液中に存在する。例えば、もし患者が以前に
本発明の樹状細胞結合剤として同一種の非特異的抗体で処置されるならば、その
ような患者はすでにHAXAを有するであろう。例えば、樹状細胞結合剤および抗原
を含む本発明の組成物の投与に先立って、ヒト患者に対して、限定された特異性
を伴わないポリクローナルマウス抗体（または、例えば、ヒトでは発現されない
卵殻タンパク質に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体）を投与すること
ができる。ひとたび患者の血液にHAXAが検出可能になれば、組成物が患者に投与
される。

【００３７】 さらなる態様において、第一の観点の組成物はさらに樹状細胞を含む。好まし
くは、樹状細胞は患者自己由来のものである。 本明細書中で使用される場合、“樹状細胞”とは、抗原を内部移行でき、およ
び抗原（または抗原由来のペプチド）がMHCクラスI複合体およびMHCクラスII複
合体両方の文脈で提示されるように抗原を処理できる、骨髄由来の細胞を意味す
る。従って、本発明の樹状細胞はCD8＋T細胞（主として細胞障害性Tリンパ球で
ある）およびCD4＋T細胞（主としてヘルパーT細胞である）の両方を活性化でき
る。クラスI MHCおよびクラスII MHC両方に内部移行抗原に由来するペプチドを
提示できるいずれかの細胞が本発明の樹状細胞であることを理解しなければなら
ない。好ましくは、本発明の樹状細胞は、Steinman, Annu. Rev. Immunol. 9：2
71-296（1991）に記載される樹状細胞の表現型および特性を有する。

【００３８】 ある好ましい態様において、樹状細胞は、組成物に添加される場合、未成熟樹
状細胞である。本明細書中で使用される場合、“未成熟樹状細胞”とは、好まし
くは、一つまたはそれ以上の下記の細胞表面抗原を示された発現レベルで有する
樹状細胞の集団を意味する：集団中の約90％より多くの樹状細胞上にCD11cを提
示し、集団中の約90％より少ない樹状細胞上に、しかし集団中の約70％より多く
の樹状細胞上にHLA-DRを提示し、集団中の約80％から約90％の樹状細胞上にHLA-
ABCを提示し、集団中の約20％より少ない樹状細胞上にCD14を提示し、集団中の
約10％から約40％の樹状細胞上にCD16を提示し、集団中の約50％から約70％の樹
状細胞上にCD80を提示し、集団中の約40％より多くから約70％の樹状細胞上にCD
86を提示し、集団中の約10％より多くから約20％の樹状細胞上にCD83を提示し、
集団中の約40％より多くから約60％の樹状細胞上にCD64を提示し、および集団中
の約70％から約95％の樹状細胞上にCD32を提示し、および集団中の約10％未満の
樹状細胞はCD3/CD19陽性である（即ち、約10％未満がCD3／CD19発現を有する）
。

【００３９】 ある好ましい態様において、樹状細胞は、組成物に添加される場合、前駆樹状
細胞である。本明細書中で使用される場合、“前駆樹状細胞”とは、その各々が
樹状細胞になることができる複数の細胞の集団を意味しており、ここで、集団の
80％より多くがCD64およびCD32抗原提示を有し、集団の約70％がCD14陽性である
。

【００４０】 樹状細胞が、組成物に添加される場合、未成熟樹状細胞であるかまたは前駆樹
状細胞である本発明の態様において、好ましくは、組成物は患者への組成物の投
与に先立って、未成熟樹状細胞または前駆樹状細胞の成熟を可能にする条件下（
例えば、細胞培養）、ex vivoでインキュベートされる。未成熟または前駆樹状
細胞からの成熟樹状細胞の形成を可能にするそのような条件は以下の実施例に記
載される。

【００４１】 樹状細胞が組成物中に含まれており、および患者がヒトである本発明の態様に
おいて、好ましくは、樹状細胞はその異なった成熟段階で下記表Iに記載された
細胞表面分子を発現する。DCが成熟するにつれて、Fcレセプター、特にCD64（Fc
γRI）の発現が典型的には減少することに注目されたい。

【００４２】

【表１】

【００４３】 本発明に従った樹状細胞を得るための一つの限定的ではない方法は以下の実施
例Iに記載される。 従って、一つの限定的ではない方法において、10μgのCA125および5μgのCA12
5に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体、Alt-2、が一緒にex vivoで混
合される。方法の変法において、ヒト抗マウス抗体が混合物に添加される。次に
、混合物は、疾患を患っている患者から下記のように調製された未成熟樹状細胞
に添加される。抗原（この場合、CA125＋αCA125抗体、Alt-2）の添加は未成熟
樹状細胞の成熟を促進する。（全体を通して使用される記号“α”は“抗”を意
味することに注意されたい。したがって、“αCA125”は、“抗CA125”を意味す
る。）次に、CA125およびAlt-2（いくつかの場合、HAMA）で“負荷された”また
はそれらを“武装化した”（armed）成熟樹状細胞が培養物から回収され、患者
に投与される。

【００４４】 本発明で使用される樹状細胞は、好ましくは本発明の組成物が投与される患者
自己由来である。“自己由来”とは、全く同じに適合したMHC座位（クラスIおよ
びクラスII両方）を有することを意味する。それ故、同一の兄弟は患者に自己由
来樹状細胞を提供できる。同様に、近い親戚も、患者と近い親戚が全く同じに適
合したMHC座位を有する限り、患者に自己由来樹状細胞を提供できる。もちろん
、実験動物の近交系の二個体（例えば、近交系Balb/cマウス）はお互いに自己で
ある。

【００４５】 ある好ましい態様において、もし本発明の組成物が投与される患者が抗原に対
する免疫応答をすでに有したとしたら、投与後、免疫応答は大部分はヘルパーか
ら細胞障害性T細胞応答へ移行し、従って、投与後、患者に治療的利益を提供す
る。

【００４６】 それ故、一つの限定的ではない実施例において、前立腺癌を伴う本発明の患者
はすでに、前立腺特異的抗原（PSA）に特異的である抗体、および／またはPSAに
特異的であるヘルパーT細胞を有するであろう。しかしながら、本発明の組成物
の投与後、組成物のPSAは内部移行され、およびPSAに特異的である細胞障害性T
細胞が刺激され、それにより、組成物の投与に先立った患者の状態と比較して患
者に治療的利益を提供するような様式で（例えば、MHCクラスIの文脈において）
、抗原提示細胞上に提示される。

【００４７】 本発明は第二の観点において、抗原に関連する疾患を患っている患者を処置す
るための方法であって、患者へ、疾患に関連した抗原、抗原に特異的な樹状細胞
結合剤、および患者自己由来の樹状細胞から成る組成物を投与すること含む方法
を提供し、ここで組成物を投与される患者は治療的利益を受ける。好ましくは、
患者はヒトである。

【００４８】 いくつかの態様において、樹状細胞は、抗原および樹状細胞結合剤と混合され
る場合、前駆樹状細胞または未成熟樹状細胞のいずれかである。これらの態様に
おいて、組成物は患者への組成物の投与に先立って、未成熟樹状細胞の成熟を可
能にする条件下、ex vivoでインキュベートされる。

【００４９】 いくつかの態様において、抗原および樹状細胞結合剤は樹状細胞と同時に混合
して組成物を作製してもよい。いくつかの態様において、樹状細胞結合剤および
抗原をお互いに混合し、その後樹状細胞と混合して、最終組成物が作製される。
これらの態様において、樹状細胞を含んでいる組成物はその後疾患を患っている
患者へ投与される。

【００５０】 ある態様において、樹状細胞結合剤は異種型抗体であり、および組成物はさら
にヒト抗異種型抗体を含む。 第三の観点において、本発明は抗原に関連する疾患を患っている患者を処置す
るための方法であって、患者へ、宿主抗-異種型抗体および疾患に関連する抗原
に特異的な異種型抗体から成る組成物を投与することを含む方法を提供し、ここ
で組成物を投与される患者は治療的利益を受け取る。

【００５１】 第四の観点において、本発明は疾患に関連する抗原に特異的である精製された
樹状細胞結合剤、および疾患に関連する抗原を含む治療的組成物を提供する。好
ましくは、樹状細胞上のレセプターへの樹状細胞結合剤の結合は、レセプターへ
の天然のリガンドの結合をブロックする。

【００５２】 第五の観点において、本発明は疾患に関連する抗原に特異的である精製された
樹状細胞結合剤、樹状細胞および疾患に関連する抗原を含む治療的組成物を提供
する。好ましくは、樹状細胞上のレセプターへの樹状細胞結合剤の結合は、レセ
プターへの天然のリガンドの結合をブロックする。好ましくは、組成物の樹状細
胞は組成物が投与される患者自己由来である。

【００５３】 第六の観点において、本発明は疾患に関連する抗原に特異的である精製された
異種型抗体および宿主抗異種型抗体を含む治療的組成物を提供する。 本明細書中で使用される場合、“精製された”とは、示された剤（例えば、精
製された樹状細胞結合剤または異種型抗体）が、天然にそれに付随する成分から
分離されることを意味する。例えば、タンパク質の場合（例えば、樹状細胞結合
剤）、精製されたタンパク質は、細胞中でそれに付随する他のタンパク質または
細胞膜断片のような成分から分離される。もちろん、分子生物学における当業者
は水、緩衝液および他の小分子が精製されたタンパク質調製物中に追加的に存在
してもよいことを理解するであろう。本発明の精製されたタンパク質（例えば、
精製された樹状細胞結合剤）は、少なくとも重量で95％、より好ましくは少なく
とも重量で98％、さらにより好ましくは少なくとも重量で99％、最も好ましくは
重量で100％、天然に付随する核酸分子またはポリペプチド成分を含んでいない
。

【００５４】 本発明に従うと、本発明の精製樹状細胞結合剤が、例えば、樹状細胞結合剤が
天然には存在しない細胞中、樹状細胞結合剤をコード化する核酸分子の組換え発
現により生成されてもよい。もちろん、本発明の精製樹状細胞結合剤を得るため
の他の方法には、ペプチド合成機上での樹状細胞結合剤の人工合成、および例え
ば、樹状細胞結合剤へ特異的に結合する抗体を使用する、樹状細胞結合剤が天然
に存在する細胞からの樹状細胞結合剤の単離が含まれるが、これらに限定される
ものではない。樹状細胞結合剤がモノクローナル抗体である場合、精製された樹
状細胞結合剤は、樹状細胞結合剤を分泌するハイブリドーマの培養上清から、ま
たはそのハイブリドーマを注射した動物からの腹水から得ることができる。

【００５５】 好ましくは、本発明の第四、第五および第六の観点の治療組成物はさらに医薬
的に許容可能な担体を含む。“医薬的に許容可能な担体”とは、投与される患者
にとって生理学的に許容可能であり、および共に投与される樹状細胞結合剤およ
び抗原（および／または樹状細胞）の治療特性を存続させる担体を意味する。医
薬的に許容可能な担体の一つの例は、生理学的塩類溶液である。他の医薬的に許
容可能な担体およびその製剤はよく知られており、例えば、Remington's Pharma ceutical Sciences （18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co., Eastorn, PA,
1990）に一般的に説明される。

【００５６】 好ましくは、疾患を患っている患者への本発明の第四、第五および第六の観点
の治療組成物の投与は、患者に治療的利益を提供する。好ましくは、患者はヒト
である。

【００５７】 以下の実施例は本発明のある特別に好ましい態様をさらに例示することを意図
しており、本発明の範囲を制限することを意図していない。 実施例I 樹状細胞の単離 樹状細胞を単離するため、末梢血単核細胞（PBMC）がフィコール-ハイパック
（Histopaque 1.077、Sigma, St. Louis, MO、から市販品として入手可能）勾配
遠心法により正常ボランティア由来の部分切除生成物から単離され、40％ヒト抗
体血清（Gemini Bio-Products, Woodland, CA、から市販品として入手可能）お
よび10％DMSO（Sigma）を含有するRPMI（Life Technologies, Frederick, MD、
から市販品として入手可能）中、自動化細胞凍結機（Gordinier Electronics, R
oseville, MI、から市販品として入手可能）を使用して生存能力があるように凍
結した。細胞は使用するまで液体窒素の気相で保存した。DNAを細胞の一部から
調製し、分子HLAタイピングのために使用した。

【００５８】 次に、樹状細胞（DC）を陰性選択（negative selection）により単離した。こ
れを行うため、DC前駆体を、免疫磁気ビーズ枯渇を使用する陰性選択により、新
しく融解したPBMCから調製した。具体的には、PBMCをチューブ内に置き、マウス
抗ヒトCD3、CD16およびCD19抗原（Caltag, Burlingame, CA、から市販品として
入手可能）と氷上で30分間インキュベートした。過剰の抗原を、1％のウシ血清
アルブミンを含有するリン酸緩衝塩類溶液（PBS／0.1％BSA）で細胞を洗浄する
ことにより除去し、洗浄した細胞は次にPan Mouse IgG免疫磁気ビーズ（Dynal,
Lake Success, NY、から市販品として入手可能）と氷上で30分間インキュベート
した。細胞に加えて特異的マウス抗ヒト抗原およびPan Mouse IgG免疫磁気ビー
ズを含有するチューブを、細胞：ビーズ複合体を除去するために磁石に向けて置
いた。磁石に結合された細胞はT細胞、B細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞
のいずれかであった。従って、上清は系列枯渇DC前駆体を含有した（即ち、チュ
ーブ中で液体に残っている単球はCD3、CD16またはCD19抗原を発現しておらず、
およびそのため磁石に結合されない）。これらの陰性選択細胞は、広範囲のCDマ
ーカーパネル（上記表I参照）を使用するフローサイトメトリーにより特徴付け
られたように、約70％純粋な単球であり、それらが集められた。

【００５９】 次に、陰性選択細胞を洗浄し、GM-CSF（1000 U/ml）およびIL-4（1000 U/ml）
（両方ともR＆D Systems, Minneapolis, MNから市販品として入手可能）を含有
するcRPMI（1％グルタミンおよび10％熱非働化ヒト血清（血液型ABのヒト由来）
を補充したRPMI）に再懸濁し、24ウェルプレート中、0.5×10⁶細胞／ウェルで、
5％CO₂、37℃にて4日間培養した。これらの細胞は4日目までは未成熟樹状細胞で
あり、フローサイトメトリーにより多数の細胞表面抗原の表面発現が分析された
（上記表I参照）。

【００６０】 培養4日目に、細胞を抗原（例えば、前立腺特異的抗原（PSA））でパルス化し
、さらに3日インキュベートした。（DC細胞がパルス化された抗原は、DC細胞が
最終的に何に使用されるかに依存していたことに注目されたい。例えば、もしDC
細胞を使用してPSAに対するT細胞応答を発生させるならば、DC細胞はPSA抗原で
パルス化されるであろう。）DC前駆体から成熟DC細胞へ成熟させることが知られ
るいくつかの試薬を、抗原添加8時間後に培養物へ添加した。これらの試薬には
、TNFα（10μg/ml）および／またはIFNα（50μg/ml）が含まれる。成熟DCは培
養7日目に採取し、フローサイトメトリーにより表現型マーカーを分析し、機能
研究に使用した。

【００６１】 フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー発現についてDCを分析するため
、標準法を用いた。簡単には、細胞の一部をポリスチレンチューブに入れ、蛍光
色素標識マウス抗体で表面マーカーを染色した。完全DC細胞表面マーカーパネル
には：HLA-A、HLA-AB、HLA-AC、HLA-DR、CD14、CD11c、CD123、CD4、CD40、CD83
、CD86、CD80、CD16、CD32、CD64が含まれる（これらに対する特異的に検出可能
な標識抗体はBecton Dickinson, San Jose, CA、から市販品として入手可能であ
る）。氷上での30分のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、遠心分離に
よりペレット化した。細胞ペレットは250μlの固定液（2％パラホルムアルデヒ
ド）に再懸濁した。データはFACSCanフローサイトメーター（Becton Dickinson,
Sau Jose, CA）を使用して取得し、Cellquestソフトウェアー（Becton-Dickins
on, San Jose, CA）で分析した。

【００６２】 実施例II 樹状細胞上の表現型マーカー 最初の研究はAlt-2存在下または不在下での、単球および樹状細胞におけるCA1
25の取り込みに焦点が合わされた。この目的のため、CA125はNIH：OVCAR-3細胞
（AltaRex Corp.）の組織培養上清から精製した。高度に精製されたCA125はフル
オレセイン（Flourescein-EX, Molecular Probes）で標識し、種々の条件下、単
球、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞とインキュベートした。いくつかの実験
において、MAb-Alt-2の取り込みも追跡し、ここで、MAb-Alt-2はFlourescein-EX
またはCy-3で標識されていた。

【００６３】 上記表Iに示されるように、単球、未成熟DCおよび成熟DCは、種々の細胞表面
抗原の発現に基づいて容易に区別できた。 実施例III 単球と未成熟樹状細胞とのCA125抗原取り込みの比較 これらの研究において、高度に精製されたCA125をフルオレセインで標識し、1
000 U/ml、37℃で1時間、単球または未成熟樹状細胞インキュベートした。いく
つかの場合、二つの抗原提示細胞による取り込みに対する複合体形成の影響を研
究するため、標識抗原と同時に非標識抗体を添加した。細胞への結合はフローサ
イトメトリーにより定量し、結果は図1A（パーセント陽性事象）および図1B（平
均チャンネル強度）に示される。図1Aおよび1Bに示されるように、未成熟樹状細
胞は、MAb Alt-2なしと比較してMAb Alt-2存在下ではずっと高い抗原の取り込み
を示した。単球および未成熟樹状細胞両方とも、MAb Alt-2存在下で、CA125の取
り込みの増加を示した（各々図1Aおよび1B参照）。未成熟樹状細胞に対しては、
抗体効果の検出を可能にするため、CA125濃度は1000 U/mlより低くする必要があ
った（CA125取り込みの飽和点以下の濃度）。

【００６４】 未成熟DCは、MAb Alt-2濃度を増加するにつれて、CA125抗原を取り込むことが
できる細胞数（図1A、％陽性細胞）、ならびに各々の細胞内抗原濃度（図1B、平
均チャンネル強度）の増加を示したことは興味深い。単球において、抗体濃度の
増加は、CA125抗原を取り込むことができる細胞のパーセントのみを上げること
ができた。これらの結果は、免疫複合体は単球および未成熟DCにおいて異なった
レセプターにより取り込まれるか、または免疫複合体は単球および未成熟DCにお
いて同一のレセプターにより取り込まれるが、レセプターは未成熟DCにおいてよ
り高い頻度でリサイクルされることを示すことができる。レセプターは確かに単
球よりも未成熟DCにおいてより豊富であり、および／またはより迅速に内部移行
されており、それはDCにおける標的化細胞のより高いパーセンテージにより示さ
れる（図1A参照）。

【００６５】 次に、抗体特異性の必要条件が試験された。これを行うため、高度に精製され
たCA125フルオレセインで標識し、非標識MAb Alt-2またはMOPC-21（CA125抗原へ
結合しない対照マウスIgG1）の不在下および存在下、1000 U/ml、37℃で1時間、
未成熟樹状細胞とインキュベートした。細胞への結合はフローサイトメトリーに
より評価し、結果は図2に示される。図2が示すように、CA125の抗体促進取り込
みはMAb Alt-2に特異的であり、CA125へ結合しない対照抗体では達成できなかっ
た。この結果、抗体促進取り込みはDCにおいてのより有効な取り込み経路による
ものであり、結合MOPC-21抗体によるレセプター進入機序の際の、樹状細胞の細
胞内取り込み活性の刺激によるものではない。

【００６６】 実施例IV CA125抗原取り込みに対するマウスAlt-2およびキメラAlt-2の影響 MAb Alt-2のマウスおよびヒト化型の存在下でのCA125の取り込みを別の結合研
究で比較した。この研究においては、フルオレセイン標識CA125は1000 U/mlを、
37℃で1時間、マウスAlt-2（mAlt-2）およびキメラAlt-2（cAlt-2（ヒトIgG3定
常領域とのキメラ））存在下、単球および未成熟DCとインキュベートした。細胞
への結合はフローサイトメトリーにより評価した。

【００６７】 図3Aおよび3Bに示されたように、キメラ抗体はマウスAlt-2よりも単球に対す
るわずかに良好なCA125結合の促進を示した；未成熟樹状細胞に対しては、マウ
スおよびキメラ抗体は等しく有効であった。マウス抗体に関しては、キメラAlt-
2は単球および樹状細胞集団内のCA125-標的細胞のパーセンテージを増加させた
が（図3A）、樹状細胞においてのみ細胞当たりのCA125量を増加させた。

【００６８】 実施例V CA125抗原取り込みに対するHAMAの影響 特異的抗原またはHAMAとの抗体の複合体化および樹状細胞への結合を測定した
。これを行うため、ヒト抗マウス抗体（HAMA）を、MAb Alt-2注射後に高いHAMA
濃度を伴う患者血清試料から、プロテインGおよびMAb AR20.5カラムでのアフィ
ニティークロマトグラフィー、続いて、Ab2（即ち、MAb Alt-2抗体のイディオタ
イプへ結合するヒト抗体）を除くためのMAb Alt-2カラムでの陰性選択により精
製した。

【００６９】 5マイクログラム（5μg）FITC標識Alt-2（抗CA125）またはAlt-6（抗PSA）マ
ウスモノクローナル抗体を、対応する抗原（1μg）および／またはHAMA（2.5μg
）および5×10⁵樹状細胞と一緒に、37℃で60分インキュベートした。その後、混
合物は一度洗浄し、0.5％ホルマリン＋PBSに再懸濁し、FACSCalibur装置（Beckt
on-Dickinson）上でFACScanにかけた。Alt-2およびCA125に対する結果は図4A、4
Bおよび4Cに示される。これらの結果は、樹状細胞への抗体の結合が、抗体のそ
の抗原への複合体化、抗体とHAMAの複合体化、またはHAMA存在下での抗体のその
抗原への複合体化により促進されることを示す。

【００７０】 HAMA存在下および不在下での単球または未成熟樹状細胞によるCA-125-MAb Alt
-2複合体の取り込みを比較するため、さらなる結合研究が実施された。この研究
においては、フルオレセイン標識CA125＋マウスMAb-Alt-2を、1000 U/mlのCA125
およびある範囲のMAb-Alt-2濃度で、単球または未成熟樹状細胞とともに37℃に
て1時間インキュベートした。結合研究はヒト抗マウス抗体（HAMA）不在下およ
び存在下で実施した。HAMA濃度は、HAMA濃度およびMAb Alt-2の等モル複合体を
形成させるため、MAb Alt-2濃度と等価にした。細胞への結合はフローサイトメ
トリーにより評価された。

【００７１】 図5A（パーセント陽性細胞）および5B（平均蛍光強度）に示されたように、HA
MAはヒト単球および樹状細胞へのCA125の結合をさらに促進した。HAMAを伴う免
疫複合体は、単球および樹状細胞集団内のCA-125標的化細胞のパーセンテージを
増加させたが（図5A）、細胞当たりのCA125濃度は主として樹状細胞において増
加した（図5B）。

【００７２】 実施例VI 発生および成熟の異なった段階での、DCに対するAlt-6抗体およびAlt-6-PSA免 疫複合体の結合 発生および成熟の異なった段階のDCは、最初にそのFcγレセプター発現レベル
を決定するため、フローサイトメトリーにより分析した。このことを行うには、
DCを上記のようにPBMCから単離し、0日、GM-CSF／IL-4で4日培養後、およびTNF
αおよびIFNαによる成熟後（7日）に、蛍光標識抗体を用いてFcγレセプター発
現について試験した。結合はCD11c＋、HLA-DR＋細胞上で決定され、ゲート内で
の陽性細胞のパーセントとして表II（下記）に表現される。

【００７３】 表IIで下に示したように、DCはFcγタイプIおよびタイプIIレセプター（CD64
およびCD32）、および低レベルのFcγRIII（CD16）を発現した。

【００７４】

【表２】

【００７５】 これらのFcγレセプターを発現するDCのパーセントは、成熟／分化の段階に依
存して異なった。表IIに示したように、CD16を発現するDCの数はGM-CSF／IL-4で
4日培養後最も高く、成熟後のDC（即ち、GM-CSF／IL-4で7日培養後）にはほとん
ど存在しなかった。CD32およびCD64は大多数のDC前駆体で観察された。CD32は未
成熟DCの70-95％で発現されたが、成熟DCでは約40％に減少した。加えて、CD64
発現細胞の数は、DCが分化および成熟するにつれて減少した。

【００７６】 次に、抗PSAモノクローナル抗体Alt-6およびAlt-6-PSA免疫複合体がDCに結合
するかどうか、およびDC分化および成熟の段階が結合に影響するかどうかを決定
するため、ある範囲の濃度のフルオレセイン標識Alt-6ならびにAlt-6-PSA-FITC
複合体をDCの三つの異なった集団に添加した：I）新しく単離された骨髄DC前駆
体（表面表現型-CD11c＋、HLA-DR＋、CD14＋）、II）GM-CSF／IL-4で4日培養後
のDC（表面表現型-CD11c＋、HLA-DR＋、CD14-、CD86＋）およびIII）TNFαおよ
びIFNαとさらに3日培養することによりさらに成熟されたDC（表面表現型-CD11c
＋、HLA-DR＋、CD86＋、CD40＋、CD80＋、CD83＋）（上記表I参照）。

【００７７】 これを行うため、PSAはScripps Laboratories（San Diego, CA）から購入し、
マウスモノクローナル抗PSA抗体Alt-6（ProstaRex^TM）はAltaRex Corporation,
Edmonton, Alberta, Canadaから親切にも提供を受けた（ATCC番号HB-12526；Ame
rican Type Culture Collection, Manassas, VA）。Alt-6はPSAのアミノ酸残基1
37-146（配列 EPEEFLTPKK）の領域に位置付けされたエピトープと特異的に反応
するIgG1抗体である。PSAおよびAlt-6は各々、5および25μg/mlの濃度にcRPMI中
で希釈した。これらの濃度で混合した場合、PSAおよび抗PSAのほぼ等モル量が達
成された。

【００７８】 Alt-6は製造者の指示書に従い、Fluorescein-EX（Molecular Probes, Eugene,
OR、から市販品として入手可能）で標識した。PSAの等モル濃度を、1.25μg/ml
、2.5μg/ml、5.0μg/mlおよび25μg/mlのAlt-6-FITCと混合し、新しく単離した
DC前駆体、GM-CSF／IL-4存在下で4日培養されたDC、および成熟したDCへ加えた
。

【００７９】 抗体-PSA組成物は37℃で1時間インキュベートし、洗浄し、ペレット化し、2％
パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより分析した。DCは、
完全DCマーカーパネルと同時染色されたDC調製物（実施例I参照）に基づいて、
横向き／前向き散乱においてゲート化された。Alt-6およびAlt-6-PSA複合体と反
応する細胞のパーセントを、CD11c＋、HLA-DR＋細胞への結合に基づいて計算し
た。表III（下記）はゲート内の陽性細胞のパーセンテージを示す。

【００８０】

【表３】

【００８１】 表IIIに示されるように、試験された濃度において、Alt-6は低いパーセンテー
ジの新しく単離されたDC前駆体へ結合した。抗体を結合する細胞数はGM-CSFおよ
びIL-4で4日培養した後に増加した。興味あることに、Alt-6-FITCを結合する細
胞数はPSA存在下で著しく高く、このことからFcレセプターは抗体単独よりも免
疫複合化抗体への結合を上昇させること、または免疫複合体はDC前駆体および未
成熟DC上の異なったおよび／またはより豊富なレセプターへ結合すること、が示
される。成熟DCに対しては、Alt-6または免疫複合体の結合が起こらなかった。

【００８２】 実施例VII PSAまたはPSA／抗PSAを武装化した（armed）DCに対するTリンパ球応答 Tリンパ球はPSAまたはPSA／抗PSA抗体の組み合わせを武装化したDCで刺激され
た。

【００８３】 これを行うため、単球を健常ドナーからの白血球搬出試料（Biological Speci
alty Corp., Colmar, PA）から生成させ、抗CD3、CD19およびCD16抗体とのイン
キュベーション、続いての磁気ビーズ結合抗マウスIgGとのインキュベーション
および磁石（Dynal）上の分離により系列細胞を枯渇させた。陰性選択細胞は、
広範囲のCDマーカーパネルを使用するフローサイトメトリーにより特徴付けられ
たように、約70％純粋であった（実施例I参照）。単球を、RPMI＋10％適合ヒト
血清中、IL-4およびGM-CSF（R＆D Systems）と4日インキュベートして未成熟DC
を生成させた。再び、細胞の一部を広範囲のCDマーカーパネルで染色し、細胞の
純度および同一性を確かめた。その後これらの細胞を採取し、抗原の組合せ（例
えば、PSA、抗PSAモノクローナル抗体および抗体-PSAの組合せ）を、37℃で2-8
時間負荷し、続いてIFNαおよびTNFαで3日間成熟させた。樹状細胞を再び、フ
ローサイトメトリーによりCDマーカー群で検査し、細胞の適切な成熟を確かめた
。

【００８４】 特に、未成熟DCはPSA（25μg/mL）、Alt-6（5μg/mL）およびPSA＋Alt-6（25
μg/mLのPSA；5μg/mLのAlt-6）により負荷した。これらの未成熟DCを、磁気T細
胞単離キット（Dynalから市販品として入手可能）を使用した陰性選択を経て、D
Cと同一の単球から生成させたT細胞（即ち、自己由来T細胞）へ添加した。簡単
には、T細胞を単離するため、CD3＋Tリンパ球を陰性選択（Dynal, Lake Success
, NY、から市販品として入手可能な磁気ビーズを使用して）により融解したPBMC
（実施例I参照）から単離した。簡単には、細胞をCD14、CD16、CD56およびHLAク
ラスII DR／DPに対する抗体の混合物と氷上で30分インキュベートした。過剰の
抗体はPBS／0.1％BSAで洗浄することにより除去した。細胞を、抗マウスIgG抗体
で被覆された免疫磁気ビーズ（Dynal）と、室温で30分インキュベートした。細
胞を磁石に向けて置き、磁石に結合しない（即ち、CD14、CD16、CD56およびHLA
クラスII DR/DPを発現しない）Tリンパ球を上清から単離した。

【００８５】 T細胞およびDCは7日間インキュベートし（一次刺激）、成熟DCを負荷および成
熟DCで再刺激してさらに7日間インキュベートした。刺激のため、Tリンパ球は1
×10⁶細胞／ウェルの濃度で24ウェルプレートに置き、それらに抗原処理されて
いない（antigen naive）、またはPSA、抗PSAモノクローナル抗体およびPSAとモ
ノクローナル抗体の組合せに暴露された5×10⁴ DCを加えた。24時間後に細胞の
一部を取り、細胞内サイトカイン染色のために調製し（15日；一次刺激）、一方
、残りの細胞はさらに7日インキュベートして（二次刺激）22日目に細胞内サイ
トカイン染色のために調製した。第二のまたは第三のDC調製に先立って、細胞上
清の一部をIFN-γELISA（Pharmingen DouSet）で試験するために採取した。

【００８６】 細胞内サイトカイン染色のために、DC添加後2時間、細胞をGolgi Plug（R＆D
Systems）とインキュベートし、さらに16-18時間インキュベートした。細胞を抗
CD3-FITCおよび抗CD8-Cy-Chromeで30分、氷上で染色し、洗浄し、透過性とし、
抗IFN-γ-PEで30分氷上で染色した。細胞を洗浄し、固定し、フローサイトメト
リーにより分析した（FACS Calibur, Becton Dickinson）。

【００８７】 T細胞応答は、細胞内IFNγを産生するCD4＋およびCD8＋T細胞の数として測定
された。これを行うためにはフローサイトメトリーが使用された。簡単には、ブ
レフェルディンA（10μg/ml）（Pharmingen, San Diego, CA、から市販品として
入手可能）またはGolgi Plug（R＆D Systemsから市販品として入手可能）を、抗
原を武装化したDCでの再刺激2時間後にT細胞培養液へ添加した。さらに16-18時
間培養後、細胞を抗CD3-FITCおよび抗CD8-Cytochromeで30分、氷上で染色し、洗
浄し、透過性とし（例えば、パーム／固定溶液（Pharmingen）と20分、氷上でイ
ンキュベートすることにより）、および染色緩衝液（1％ヒトAB血清（即ち、AB
血液型のヒト由来の血清）（Becton Dickinson, San Jose, CAから市販品として
入手可能な抗体）が加えられたPBS）中、抗IFN-γ-PEで30分、氷上で染色した。
細胞を洗浄し、2％パラホルムアルデヒドを含有する染色バッファー中に再懸濁
し、そしてフローサイトメトリー（FACS Calibur, Becton Dickinson）。

【００８８】 この実験において、成熟、“武装化した”または“武装化していない”（unar
med）（即ち、サイトカインのみで成熟された）DCは、武装化したまたは武装化
していないDCで再刺激した自己由来T細胞と共に培養し、IFNγを産生するCD4＋
およびCD8＋細胞の数を決定した。代表的実験の結果が図6に示される。

【００８９】 図6に示されるように、抗原に暴露されていないDC（陰性対照）との共培養、
またはモノクローナル抗体（即ち、一次刺激としてα-PSA）に暴露しそして続い
て武装化したまたは武装化していないDCで再刺激されたDCと培養されたT細胞と
の共培養において、IFNγを産生するCD4＋およびCD8＋T細胞の数は相違していな
いかまたはわずかな相違しか観察されなかった。一次刺激および再刺激のすべて
の組合せにおいて、PSAを武装化したDC刺激CD4＋T細胞応答は、一貫してCD8＋T
細胞応答より大きかった。注目に値するには、強いCD8＋T細胞応答が、免疫複合
体を武装化したDCによる再刺激で観察された（即ち、再刺激は複合体によるもの
であり、および一次刺激はPSA/αPSAの複合体によるものであった）。T細胞が抗
原-抗体を武装化したDCと培養され（すなわち、一次刺激がPSA／αPSAである）
、およびPSAを武装化したDCで再刺激された場合、CD4＋T細胞応答はCD8＋応答よ
り実質的に大きかった。

【００９０】 一方、一貫したCD4＋およびCD8＋IFNγ応答は、抗原-抗体を武装化したDCに暴
露されおよびそれにより再刺激されたT細胞においてのみ生成された（即ち、一
次刺激および再刺激が両方ともPSA/αPSAであった場合）。IFNγT細胞応答はAlt
-6抗体に対して生成されなかったので（即ち、一次刺激および再刺激としてα-P
SA単独）、複合体への応答はPSAで方向付けられることが予想される。遊離PSA単
独による応答と比較し、抗体との組合せで提示されたPSAに対するCD8＋T細胞応
答の増加は、免疫複合体が抗原プロセシング、特にHLAクラスI経路を経るプロセ
シング、を促進することを示す。

【００９１】 実施例VIII CA125またはCA125／αCA125複合体を武装化したDCに対するTリンパ球応答 上清内へのIFNγ放出の小さなチェッカー盤アッセイ（small checkboard assa
y）で、広い範囲のT細胞刺激のための機能的CA125およびMAb Alt-2濃度を同定し
た後、細胞内サイトカイン染色アッセイを、2.5μgのMAb-Alt-2不在下および存
在下、50、500および5000 U/mlのCA125を使用して実施した。成熟DC細胞およびT
細胞を7日インキュベートし、負荷および成熟DCで再刺激した。負荷DCでの刺激
後（図7、ラウンド1）および再刺激後（図7、ラウンド2）の7日後、細胞上清の
一部を採取し、IFN-γ ELISA（Pharmingen DouSet）で試験した。

【００９２】 陽性対照として、PMA＋イオノマイシンが培養でのT細胞の刺激に使用された。
培地のみ中で負荷したDCを使用して、アッセイのバックグラウンドを決定した。 図7に示されたように、細胞上清のIFN-γ ELISAにより検出した場合、CA125単
独での刺激は実質的なIFNγ放出を生じなかった（図7）。

【００９３】 細胞内染色検出のため、未成熟DCにCA125（50、500、5000 U/mL）、Alt-2（2.
5μg/mL）およびCA125＋Alt-2（50、500、5000 U/mLのCA125；2.5μg/mlのAlt-2
）を負荷し、成熟させた。T細胞およびDCを7日インキュベートし、負荷および成
熟DCで再刺激した。24時間後に細胞の一部を採取して細胞内サイトカイン染色の
ために調製し（15日目；図8A）、一方、残りの細胞はさらに7日間インキュベー
トした。これらの細胞は別のバッチの負荷および成熟DCで刺激し、22日目に細胞
内サイトカイン染色のために調製した（図8B）。細胞内サイトカイン染色のため
、DC添加2時間後、細胞をGolgi Plug（R＆D Systems）とインキュベートし、さ
らに16-18時間インキュベートした。細胞を抗CD3-FITCおよび抗CD8-Cy-Chromeで
30分、氷上で染色し、洗浄し、透過性とし、抗IFN-γ-PEで30分氷上で染色した
。細胞を洗浄し、固定し、フローサイトメトリーにより分析した（FACS Calibur
, Becton Dickinson）。

【００９４】 図7、8Aおよび8Bに示されたように、CA125に対する応答は2回の刺激ラウンド
後、および試験された最も高い濃度でのみ検出できた。図8Aおよび8Bに示された
ように、抗原単独では、細胞内染色結果により示されたように、主にCD4応答を
刺激した。図7に示されたように、ヒトDCにより、MAb-Alt-2との複合体で提示さ
れたCA125に応答して、著しく増加したIFN-γ放出が観察された。IFN-γ ELISA
により検出された、細胞上清内へのIFN-γ放出、ならびに細胞内サイトカイン産
生（ICC）は1回目の刺激ラウンドですでに検出でき、刺激の2回目のラウンド後
にはさらに増加した（各々、図7および8B）。50 U/mL程度のCA125濃度がT細胞を
刺激でき、2回の刺激ラウンドで500 U/mLが最適であった（図7、8Aおよび8B）。

【００９５】 特に注目されるのは、CA125-MAb Alt-2免疫複合体が最初に強いCD4応答を（図
8A）、追加の刺激でも強いCD8応答（図8B）を誘導するという知見である。これ
らの観察は、CA125がもし免疫複合体の形で提示されるならば、MHCクラスIおよ
びII上に提示できるが、細胞外抗原に期待されるように単独で取り込まれるなら
ば、MHCクラスII分子上でのみ提示されることを示す。抗原または抗体-抗原複合
体の取込みに関与するレセプターは、内部移行タンパク質のプロセシングの経路
に影響するであろう。抗原-抗体複合体は細胞質ゾルへの増加した漏出を示し、
およびそのため、不変鎖を経てMHCクラスI分子上へペプチドを輸送するプロセシ
ング装置であるプロテアソーム、によりプロセシングされるよりよい機会を有す
る。

【００９６】 実施例IX PSA／抗PSA複合体を武装化したDCはHLA-A^*0201ペプチド特異的Tリンパ球応答
を生成する HLA-A^*0201対立遺伝子により拘束されることが知られる二つのPSAペプチドへ
のTリンパ球応答を生成する、PSA／抗PSA免疫複合体およびPSAを武装化したDCの
能力を次に比較した。これを行うため、二つのHLA-A2特異的PSAペプチド（pep1
、FLTPKKLQCV；pep2、KLQCVDLHV）およびHIV-1ペプチド（SYNTVAVL）がBiopolym
er Laboratory, University of Maryland, Baltimore, MD、により合成され、cR
PMI中で希釈され、5μg/mlの濃度でDC調製物に加えられ、約1時間インキュベー
トされた。

【００９７】 DCは実施例Iに記載したように調製し、GM-CSF／IL-4で4日培養後、PSAおよびP
SA／抗PSA複合体へ暴露した。CD40LまたはTNFαおよびIFNαで成熟後、武装化し
たDCを自己由来CD3＋選択Tリンパ球と7日間培養した。次に、T細胞を回収し、新
しく武装化させたDCを細胞培養へ添加し、IL-2（10 U/ml）およびIL-7（5 ng/ml
）を補充した培地中でさらに7日細胞培養した（実施例III参照）。

【００９８】 14日目、T細胞を回収し、二つのPSA由来ペプチドでパルスした成熟DCにより再
刺激し、そしてIFNγ放出について分析した。 代表的実験（3回の内の1回）の結果を図9に示す。PSAを武装化したDCで2週間
培養されたT細胞において、低レベルのCD4＋応答がPSA由来ペプチドでの再刺激
により検出された。ペプチド2（KLQCVDLHV）もまた、一次刺激がPSA単独であっ
た場合、小さなCD8＋応答を誘導した。実施例IIIに記載した前の結果と一致して
、PSAを武装化したDCでのT細胞の再刺激（ここで、一次刺激はPSAであった）は
、CD4＋T細胞応答、および低レベルの応答するCD8＋T細胞を生じた。PSA／抗PSA
複合体による再刺激（ここで、一次刺激はPSAであった）は、CD4＋ならびにCD8
＋INFγ応答の同様な活性化を示した。

【００９９】 図9の下半分が示すように、PSA／抗PSAを武装化したDCと2週間培養したT細胞
は、両方のPSA由来ペプチドに応答できた。ペプチド拘束性応答は、PSAを武装化
したDCによるペプチドに対する応答と比較し（即ち、一次刺激がPSA単独であっ
たT細胞）、再刺激前にPSA／抗PSAを武装化したDCで培養したT細胞においては約
2倍強かった。

【０１００】 PSAを武装化したDC存在下で増殖したT細胞はペプチド2（KLQCVDLHV）へ弱く応
答できたが、CD8＋T細胞はPSAを武装化したDCでの再刺激に際してIFNγを放出し
なかったことに注目されたい。この結果は、このペプチドはHLAクラスII分子な
らびにクラスIにより提示されるであろうが、このペプチドに特異的なT細胞の生
成は、PSAを負荷されたDCによっては有効に生成されないことを示唆する。免疫
複合体と培養されたT細胞が、HLA-A^*0201拘束性HIV-1 gagペプチドでパルスされ
た成熟DCで刺激された場合には、応答は観察されなかった（データは示されてい
ない）。

【０１０１】 実施例X PSAまたはPSA-mを武装化したDCに対するT細胞応答 DCは、マンノースおよび関連炭化水素を結合するレセプターを発現する。従っ
て、PSAまたはマンノースとコンジュゲートさせたPSAを武装化したDCに対するT
細胞応答を比較するために実験を行った。これを行うため、PSAはScripps Labor
atories（San Diego, CA）から購入された。PSAは以下のようにマンノシル化し
た：100μgのPSAを100μgのα-D-マンノピラノシルフェニルイソチオシアネート
（α-D-M）および2μlのN-メチルモルホリンと460μlのPBS中で混合し、室温で
一夜撹拌した。過剰のα-D-Mは、100μlの1 Mトリズマ-塩基（pH9.5）の添加に
より加水分解した。非コンジュゲート化マンノース残余はPBSに対して透析する
ことにより除去し、4℃で保存した。

【０１０２】 T細胞を、PSAまたはPSA-mを武装化したDCへの2回の週ラウンドで暴露し、武装
化したDCでの再刺激後、CD4＋およびCD8＋IFNγ応答を測定した。これを行うた
め、実施例IIIに記載されるように、T細胞をPSAまたはマンノシル化-PSA（PSA-M
）を武装化したDCに暴露し、培養した。14日目、T細胞を何も備えてない、また
は抗原を武装化したDCで再刺激し、IFNγを産生するCD4＋およびCD8＋T細胞の数
をフローサイトメトリーにより決定した。結果は表IVに示される。

【０１０３】

【表４】

【０１０４】 表IVに示されるように、3回の別々の実験において、CD4＋T細胞応答は活性化
細胞集団内で優勢であり、PSAを武装化したDCに対する応答と比較して、DCにPSA
-mが負荷された場合で一貫してより高かった。活性化CD8＋T細胞の数に少しから
中程度の増加（対照に対して）が観察された。しかしながら、PSA-mへのCD8＋T
細胞応答は、Alt-6-PSA免疫複合体で観察された応答よりはるかに低かった（図6
参照）。

【０１０５】 実施例XI 臨床研究 再発性卵巣癌を患っている患者に1日当たり2 mgのモノクローナル抗体Alt-2を
注射し、総計で1から10回のそのような処置を行い、疾患進行および生存を追跡
した。Alt-2はCA125に対するマウスモノクローナルIgG1抗体である。抗体は高い
親和性（1×10¹⁰ M^-1）を有しており、光活性化などにより修飾した（ジスルフ
ィド結合の部分的還元、米国特許第6,086,873号を参照されたい）。すべての患
者は、各々の注射の前および後に、ELISAによりHAMAおよびCA125を試験した（HA
MA、Medac, Germany、から市販品として入手可能；CA125、Centocor, USA、から
市販品として入手可能）。75人の患者がELISAによりAlt-2に対する抗イディオタ
イプ抗体（Ab₂）（AltaRex Corp., USA、から市販品として入手可能）およびELI
SAにより抗CA125抗体（AltaRex；また、Schultes et al., Cancer Immunol. Imm
unother. 46：201（1998）も参照されたい）について試験された。17人の患者に
ついて、注射の前および後に、末梢血単核細胞（PBMC）が入手可能であった。

【０１０６】 いかに迅速に注射されたAlt-2抗体が遊離CA125と免疫複合体を形成できるかを
決定するため、MAb Alt-2と異なったエピトープを認識する抗CA125抗体MAb-B27.
1で血清試料（MAb Alt-2注射後の種々の時点で得られた）からCA125を捕捉した
。洗浄後、チューブを¹²⁵I-MAb Alt-2または¹²⁵I-MAb OC125とインキュベートし
た。この方法は、血清中のCA125結合MAb Alt-2の検出を可能にし、注射前試料と
比較した¹²⁵I-MAb Alt-2のトレーサー結合の減少、ならびに、¹²⁵I-MAb OC125と
比較した結合の減少により示される。図10Aおよび10Bに示されたように、MAb-Al
t-2は抗体の注射後30分以内に、CA125と複合体を形成することが観察された。こ
れらの複合体は、最初のMAb Alt-2注射で循環系から非常にゆっくりとクリアラ
ンスされた（図10Bの右半分を参照されたい）。結果は、MAb Alt-2は循環系にお
いてCA125と結合でき、永く循環する免疫複合体を形成することを示す。その結
果、そのような複合体が免疫系に取り上げられ、プロセシングを受けおよびT細
胞に提示される機会が存在する。

【０１０７】 加えて、抗体が注射された患者のPBMCが、in vitro感作なしで、標準³H-チミ
ジン取込みアッセイにおいて、CA125に対するT細胞増殖について分析された（ア
ッセイ法については、例えば、Current Protocols in Immunology, John E. Col
igan編, John Wiley ＆ Sons, Inc. 1993；Current Protocols in Molecular Bi ology , Ausubel et al.編, John Wiley ＆ Sons, Inc. 2000、を参照されたい）
。結果は図11A-13Bに示される。

【０１０８】 体液性（ピアソンr＝0.8335、p＜0.001）および細胞性（p＝0.037）抗CA125応
答の誘導は、Alt-2注射時点で、存在する循環CA125抗原の量と相関することが示
された（図11A-11C）。注射前試料では、CA125に特異的なBまたはT細胞応答は検
出されなかった。患者の抗CA125抗体の分析は、それらがCA125の多エピトープへ
方向付けられたことを明らかにした（図12）。この分析は、CA125上の異なった
エピトープへ特異的に結合された種々のα-CA125モノクローナル抗体によりヒト
α-CA125抗体を阻害することにより行われた。

【０１０９】 加えて、最初の抗体注射の時点からの生存は、抗CA125応答者対非応答者につ
いて、Alt-2注射後の抗CA125抗体の生成（平均生存22.9対13.5月、p＝0.0089；
図13A）およびCA125特異的T細胞の生成（84対13.2月、p＝0.0202；図13B）と相
関した。これらの結果は以下のことを示す。Alt-2注射時点での循環CA125のレベ
ルは、抗体の注射後のCA125に対して誘導される免疫応答の頻度および量に対す
る影響を示した。患者の抗CA125抗体は多エピトープ性であることが見出された
（図12参照）。図13Aおよび13Bが示すように、Alt-2の最初の注射後の生存（Cap
lan-Meier曲線でプロットされる）は、CA125特異的抗体を有する患者（力価が注
射前値の＞3倍増加）、およびCA125特異的T細胞を有する患者（SI＞1.5）におい
て著しく延長された（ログ-ランク試験、各々、p＜0.01およびp＜0.05）。

【０１１０】 実施例XII 抗原提示に対する複合体形成の影響 CA125はNIH：OVCAR-3細胞（AltaRex Corp.から市販品として入手可能）の組織
培養上清から精製し、PSAは標準法を使用してヒト精漿（Scripps, La Jolla, CA
、から市販品として入手可能）から精製した。光活性化Alt-2抗体は前に記載し
たものであった（実施例VII参照）。抗PSA抗体、Alt6（AltaRex Corp.から市販
品として入手可能）はPSAのアミノ酸135から150の領域に結合するマウスIgG1で
ある。HAMAは前に記載したものであった（実施例VI参照）。ヒト樹状細胞は、フ
ィコール-ハイパックおよび抗CD3、CD16およびCD19での陰性選択、続いての抗マ
ウスIgG磁気ビーズ（Dynal）によりバフィーコートから調製した。細胞は1000 U
/ml GM-CSFおよび1000 U/ml IL-4中、4日培養した。

【０１１１】 マウスマクロファージはBalb/cマウスの腹腔から単離した。特異的B細胞は、
抗体被覆ペトリ皿上のパニングにより、免疫されたマウスから単離した。4日目
に樹状細胞に抗原、抗体または抗原-抗体複合体を添加し、4時間後、10 ng/ml T
NF-αおよび50 U/ml IFN-αで成熟させた。CD4およびCD8 T細胞のいずれかに対
する細胞内IFN-γ染色、または培養上清内へのIFN-γの放出について細胞を分析
する前に、2回の刺激ラウンドを実行した。

【０１１２】 結果は図14A-14Bに示される。これらの結果は、特異的抗体と複合体化された
抗原は、マクロファージ（図14A）およびB細胞（図14B）のような専門的APCによ
り優先的に提示できることを示す。樹状細胞でのPSAおよびCA125との抗原-抗体
系からの結果は、免疫複合体として提供された場合におけるMHCクラスI上の細胞
外抗原の提示が亢進されることを支持する（図6、8Aおよび8B参照）。また、こ
れらの結果は表IV（上記）に示された結果をさらに追認する；即ち、マウスIgG1
単独では樹状細胞に弱くしか結合しないが（図2）、特異的抗原の結合により結
合が亢進され、およびHAMA存在下では実質上亢進される（図3A-5B）。最後に、
これらの結果は、樹状細胞は非複合体化抗原よりも免疫複合体をよりよく提示し
（図6、8Aおよび8B）、および刺激が繰り返された際に、免疫複合体は免疫応答
をヘルパー（CD4＋）から細胞溶解性（CD8＋）T細胞応答へ移行させること（図6
および8B参照）を示しており、これはMHCクラスIおよびクラスII両者上での抗原
由来ペプチドの提示を示す。

【０１１３】 実施例XIII Ex vivo治療的処置 ヒト-PBL-SCID/BGマウスモデルを、Schultes et al., Hybridoma 18：47-55（
1999）に一般的に記載されるように使用した。ヒト卵巣癌細胞NIH：OVCAR-NU-3
はヌードマウスを通して継代し、2 mM L-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清（L
ife-Technologies, Gaithersburg, MD）を補充したRPMI1640培地を使用し、37℃
および5％CO₂で維持した。SCID/BGマウスはTaconic（Germantown, NY）から得た
。4×10⁶ NIH：OVCAR-NU-3腫瘍細胞の皮下注射および3週間のインキュベーショ
ンによりSCID/BGマウスに腫瘍を発生させる。樹状細胞にCA125抗原またはCA125
抗原および実施例IIIに記載したAlt-2抗体を、HAMAとともに、またはなしで負荷
した。次にこの組合せを、腹腔内かまたは静脈内でマウスに投与した。この処置
を2から3週間毎に繰り返した。腫瘍負担および生存日数をモニターした。抗原-
抗体複合体を負荷した樹状細胞が、抗原単独を負荷した樹状細胞よりも大きな抗
腫瘍効果を有すること、および抗原-抗体-HAMA複合体が負荷された樹状細胞が投
与される場合に最も大きな効果が観察されることが予想される。

【０１１４】 実施例XIV マウス動物モデルにおける抗原特異的モノクローナル抗体のin vivo効能 in vivoでのAlt-1、Alt-2およびAlt-2モノクローナル抗体（MAb）の効能、お
よび免疫応答および抗腫瘍応答の誘導における抗体-抗原複合体の役割をマウス
動物モデルで研究した。Alt-1、Alt-2およびAlt-6 MAbによるマウスの免疫化を
研究して、Alt-1、Alt-2およびAlt-6が（a）特異的抗原、各々MUC1、CA125また
はPSA、に対する特異的免疫性を誘導できるか、（b）続いての腫瘍誘発に対して
マウスを保護できるか；および（c）確立された腫瘍を根絶および／または生存
を延長できるか；を決定した。

【０１１５】 これらの実験は、DBAおよびBalb/cおよびヒトPBL-SCID/bgマウスを使用して実
施し、それは将来の実験のための、最良の動物モデルを選ぶことを可能にした。
5群のマウスを各々MAb、対照MAbおよびMAb／抗原複合体で免疫した。抗原および
PBS対照も研究した。免疫化および腫瘍誘導法は前の研究で使用された方法と同
一であった。生存曲線はMeir Kaplanアルゴリズムを使用してプロットした。種
々の群間の応答比較は、標準統計法を使用して分析した。

【０１１６】 特に、これらの研究を行うため、表Vに記載した処置群をSCID/bgマウスを使用
して設定した：

【０１１７】

【表５】

【０１１８】 群1-5は最初に2回の腹腔内注射、および次に4回の静脈内注射を受けた。 群6-7は最初に2回の腹腔内注射、および次にアジュバントQuil Aと共に4回の
皮下注射を受けた。

【０１１９】 処置スケジュールは表VIに従うものであった：

【０１２０】

【表６】

【０１２１】 22日目、ヒトIgGレベルを測定した（mg/mlとして）。図15に見られるように、
PBSのみを注射されたマウス（即ち、群1）が最も高いレベルのヒトIgG抗体を有
した。

【０１２２】 マウスにおけるヒトPBL再構築の成功を測定するため、血清ヒトIgG抗体が測定
された。これらの結果は表VIIに示される。

【０１２３】

【表７】

【０１２４】 すべての群におけるすべてのマウスが腫瘍を成長させた（即ち、LnCap接種か
ら）。これらの腫瘍は接種17日後（即ち、35日目）には明白であった。腫瘍は週
に2回測定した。

【０１２５】 図16に示されるように、Alt-6＋PSAをi.v.で注射されたマウス群は最良の腫瘍
抑制を示した（Alt-6＋PSA i.v.対PSA i.v.；P＝0.0477）。Alt-6 i.v.群もまた
腫瘍抑制を示した（腫瘍容量で測定された）。

【０１２６】 これらの結果は、最良の抗腫瘍効果が、マウスを抗体-抗原複合体で処置した
場合に達成されたことを示した。 体液性免疫応答はELISAでAb2およびAb3の血清レベルを測定することによりモ
ニターした。

【０１２７】 細胞性免疫応答はリンパ球増殖を測定することによる日常的な実験室法に従っ
てモニターした。 実施例XV 組織病理学的および毒物学的研究 Alt1およびAlt2の組織抗原特異性を、正常および腫瘍ヒト組織両方との組織病
理学的反応性により試験した。反応性における不均質性の程度が記録された。こ
の研究は、GLP条件下、商業的組織（Impath Inc.）により実施された。

【０１２８】 裸のAlt1およびAlt2の急性および亜急性毒性は、アルバータ大学の動物サービ
ス部門により、2つの種（ラットおよびウサギ）で調べられた。急性および亜急
性研究において、毒性が観察された。

【０１２９】 実施例XVI フェーズI臨床試験 ヒトへ投与されたマウス抗体の“安全性”について利用できるデータが存在し
たので、副作用が用量限定的問題であることは予想されなかった。しかしながら
、主要器官毒性および患者徴候のような標準的基準がGCPを利用して追跡された
。抗体用量は毒性までは押しやられなければならないことはなかったので（最大
耐用量）、主たる成果は、所望の定義された免疫応答を惹起した抗体の最も有効
な量を明確にすることになった。

【０１３０】 研究されるべき患者集団は免疫適格であり、および標的疾患を有する必要があ
った。MUC1を発現する腫瘍を持つ患者群を、Alt-1による3用量フェーズI試験に
組み入れた。

【０１３１】 他の免疫療法での研究に基づいて、有効用量は1-4 mg用量であることが予想さ
れた。1、2および4 mgの用量を上記の患者集団で研究した。毒性基準を免疫応答
と一緒にモニターした（一次終了点）。治療活性の証拠は、患者MUC1レベルをモ
ニタリングすることにより検出された（二次終了点）。用量レベル当たり6人の
患者が処置された。2 mg用量がHAMA、Ab2、抗MUC1抗体およびMUC1特異的T細胞を
誘導する際に最も有効であり、MUC1血清レベル安定化または減少の最も高い発生
を示した。

【０１３２】 均等物 当業者は、わずかのルーチン実験を使用して、本明細書に具体的に説明される
特定の態様の多くの均等物を認識するか、または確かめることができるであろう
。そのような均等物は以下の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1Aおよび1Bは、単球（青い棒）および未成熟樹状細胞（赤い棒）
での抗原結合研究の結果を示す。図1Aは、1000 U/mlのFITC標識CA125抗原および
示された量のAlt-2抗体とのインキュベーション後の単球または未成熟樹状細胞
の陽性事象のパーセンテージを示す棒グラフである。図1Bは、1000 U/mlのFITC
標識CA125抗原および示された量のAlt-2抗体とのインキュベーション後の単球ま
たは未成熟樹状細胞の平均チャンネル強度を示す棒グラフである。

【図２】 図2は、0、0.2または0.4μg/mlのAlt-2抗体（赤い棒）または対照M
OPC-21抗体（黄色の棒）存在下、1000 U/mlのFITC標識CA125抗原の取り込みを示
す棒グラフである。

【図３】 図3Aおよび3Bは、1000 U/mlのFITC標識CA125抗原および示された量
のマウスAlt-2（青ベタおよび縞を付けた棒）またはキメラAlt-2（赤ベタおよび
縞を付けた棒）とインキュベートした、単球（縞を付けた棒）または未成熟樹状
細胞（ベタ棒）の陽性事象のパーセンテージ（図3A）および平均チャンネル強度
（図3B）を示す棒グラフである。

【図４】 図4A、4Bおよび4Cは、樹状細胞への抗体結合に対する、HAMA（図4A
）、特異的抗原（図4Aおよび4B）または両方（図4C）との複合体化の影響を示す
棒グラフである。図4Aは、抗原存在下または不在下、またはHAMA存在下または不
在下での樹状細胞へのFITC標識抗CA125抗体、Alt-2またはFITC標識抗PSA抗体Alt
-6の結合を示す。図4Bは、Alt-2の濃度が0、0.313、0.625、1.25および2.5μg/m
lの場合、8000 U/mlのCA125存在下でのFITC標識Alt-2の結合を示す。図4Cは、0.
33、1および2μg/mlのヒト抗マウス抗体（HAMA）とともに、または無しでの、80
00 U/mlのCA125存在下での1μg/mlのFITC標識Alt-2の結合を示す。

【図５】 図5Aおよび5Bは、単球（縞を付けた棒）または未成熟樹状細胞（ベ
タ棒）に対して、陽性事象のパーセンテージ（図5A）および平均チャンネル強度
（図5B）により測定された、HAMA存在下（赤ベタおよび縞を付けた棒）および不
在下（青ベタおよび縞を付けた棒）での、単球および未成熟樹状細胞におけるCA
125-Alt-2免疫複合体の取り込みを示す棒グラフである。

【図６】 図6は、10⁶細胞当たりのIFNγ産生細胞数により決定された、示さ
れた一次刺激および再刺激により“武装化した”樹状細胞による、（CD4＋（白
棒）およびCD8＋T細胞（黒棒）両方の）in vitro T細胞活性化を示す棒グラフで
ある。

【図７】 図7は、CA125、Alt-2またはCA125／Alt-2複合体（即ち、CA125／α
CA125複合体）で負荷されたDCを用い、示された濃度で7日のインキュベーション
期間（ラウンド1；青い棒）または最初の7日および新しく負荷されたDCと追加の
7日（ラウンド2；赤い棒）、刺激されたT細胞からのIFN-γ放出を示す棒グラフ
である。

【図８】 図8Aおよび8Bは、CA125、Alt-2またはCA125-Alt-2複合体（即ち、C
A125／αCA125複合体）で負荷されたDCを用い、示された濃度で7日のインキュベ
ーション期間（図8A）または最初の7日および新しく負荷されたDCと追加の7日（
図8B）、刺激されたCD4＋T細胞（赤い棒）またはCD8＋T細胞（青い棒）の細胞内
IFN-γ産生を示す棒グラフである。

【図９】 図9は、示された一次刺激および再刺激により“武装化した”樹状
細胞により発生されたペプチドに対するin vitro T細胞活性化（CD4＋およびCD8
＋T細胞両方）を示す棒グラフである。T細胞活性化は、10⁶細胞当たりのIFNγ産
生細胞数により決定された。

【図１０】 図10Aおよび10Bは、Alt-2注射後の、循環CA125への抗CA125抗体
、Alt-2、の複合体化の速度を示す。特に、図10Aは、遊離循環CA125のレベル（
点を付けた棒）と比較されたCA125／αCA125複合体のレベル（黒棒）を比べてい
る棒グラフである。図10Bは、Alt-2注射後の、循環CA125への抗CA125抗体、Alt-
2、の複合体化の速度（グラフの左側）、および注射量のパーセンテージ（％ID
）で測定された、注射時点後にクリアランスされた遊離Alt-2抗体量（緑の丸）
、を示す線グラフである。時間とともに、複合体化されたCA125は増加するのに
対し、遊離循環CA125のパーセンテージは減少する。

【図１１】 図11A、11Bおよび11Cは、CA125抗原特異的B細胞（図11A）および
T細胞（図11Bおよび11C）応答、CA125レベル、および患者生存間の関係を示すグ
ラフである。特に、図11Aは、抗CA125抗体、Alt-2、の注射時点に存在する循環C
A125抗原のレベル（x軸）と比較された体液性抗CA125応答（y軸）の誘導を示す
。図11Bは、循環CA125抗原のレベル（x軸）と比較された細胞性抗CA125応答（y
軸）の誘導を示しており、注射前のAlt-2（白三角）と注射後Alt-2（黒三角）を
比較する。図11CはAlt-2注射前（前）または後（後）の患者（ここで105 U/mlよ
り多いCA125を有する患者は最も大きなT細胞応答を有した）における、T細胞の
刺激指数（CA125特異的T細胞増殖）を示す散乱グラフである。

【図１２】 図12は、13人の患者により産生された抗CA125抗体からの応答の
多-エピトープ特性を示す棒グラフである。

【図１３】 図13Aおよび13BはAlt-2の注射を受けている患者の生存曲線であ
る。特に、図13Aは、Alt-2注射後に抗CA125抗体応答の増加が3×未満しか発生し
ない患者（実線）と比較された、Alt-2注射後に抗CA125抗体応答に3×の増加が
起こる患者（点線）における増加した生存を示す生存曲線である。図13Bは、Alt
-2注射後にCA125特異的T細胞応答が発生しない患者（実線）と比較して、Alt-2
注射後にCA125特異的T細胞応答を発生する患者（点線）における増加した生存を
示す生存曲線である。

【図１４】 図14A-14Bは、マクロファージおよびB細胞のような抗原提示細胞
による、抗体と複合体化した抗原の優先的提示を示す。特に、図14Aは、0.1μg/
ml（白棒に黒点）、1μg/ml（黒棒に白点）および10μg/ml（黒棒）での、CA125
、Alt-2、B27.1、mIgG1、CA125＋Alt-2、CA125＋B27.1およびCA125＋mIgG1によ
る刺激後、抗原提示細胞としてマクロファージを使用する刺激指数（SI）により
測定されたT細胞増殖レベルを示す棒グラフである。図14Bは、0.1μg/ml（白棒
に黒点）、1μg/ml（黒棒に白点）および10μg/ml（黒棒）での、CA125、Alt-2
、B27.1、mIgG1、CA125＋Alt-2、CA125＋B27.1およびCA125＋mIgG1による刺激後
、抗原提示細胞としてB細胞を使用する刺激指数（SI）により測定されたT細胞刺
激レベルを示す棒グラフである。

【図１５】 図15は、再構築されたSCID/bgマウスにおける、ヒトIgGの異なっ
たレベルを示す棒グラフである。

【図１６】 図16は、対照IgG1（黄棒）、Alt-6のみ（緑棒）、PSAのみ（青棒
）およびPSA/α-PSA免疫複合体（赤棒）で処置されたマウスにおける異なった腫
瘍容量を示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 1/18 1/18 11/00 11/00 13/08 13/08 15/00 15/00 25/28 25/28 31/12 31/12 31/18 31/18 35/00 35/00 37/00 37/00 (31)優先権主張番号 ６０／２５３，６７１ (32)優先日 平成12年11月28日(2000．11．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マン，ディーン アメリカ合衆国メリーランド州21201，バ ルチモア，サウス・グリーン・ストリート 22，ユニバーシティ・オブ・メリーラン ド・メディカル・システム，デパートメン ト・オブ・パソロジー，ルーム・ピー３ジ ー112 Ｆターム(参考） 4C084 AA22 MA02 MA66 NA14 ZA161 ZA162 ZA591 ZA592 ZA661 ZA662 ZA811 ZA812 ZB071 ZB072 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 ZC551 ZC552 4C085 AA13 AA14 BA01 BB01 BB24 EE03 GG01 4C087 BB63 MA02 MA66 NA14 ZA16 ZA59 ZA66 ZA81 ZB07 ZB09 ZB26 ZB33 ZC55

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原に関連する疾患を患っている患者を処置するための方法
   であって、前記患者に対して、前記疾患に関連した抗原、前記抗原に特異的な樹
   状細胞結合剤、および患者自己由来の樹状細胞を含む組成物を投与することを含
   む方法であり、ここで前記組成物を投与された前記患者は治療的利益を受ける、
   前記方法。
2. 【請求項２】 抗原が結合剤に対して複合体化される、請求項1に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 組成物に対して添加された樹状細胞が、未成熟樹状細胞であ
   る、請求項1に記載の方法。
4. 【請求項４】 患者に対する組成物の投与に先立って、未成熟樹状細胞の成
   熟を可能にする条件下、組成物をex vivoでインキュベートする、請求項3に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 組成物に対して添加された樹状細胞が、樹状細胞前駆体であ
   る、請求項1に記載の方法。
6. 【請求項６】 患者に対する組成物の投与に先立って、樹状細胞前駆体の成
   熟を可能にする条件下、組成物をex vivoでインキュベートする、請求項5に記載
   の方法。
7. 【請求項７】 患者がヒトである、請求項1に記載の方法。
8. 【請求項８】 CD8＋IFN-γ産生T細胞を活性化して、組成物を投与した患者
   においてCTL免疫応答を誘導する、請求項1に記載の方法。
9. 【請求項９】 CD4＋IFN-γ産生T細胞を活性化して、組成物を投与した患者
   においてヘルパーT細胞免疫応答を誘導する、請求項1に記載の方法。
10. 【請求項１０】 体液性免疫応答が組成物を投与された患者において活性化
    される、請求項1に記載の方法。
11. 【請求項１１】 樹状細胞結合剤が抗原に対して特異的に結合し、そして組
    成物を投与された患者において樹状細胞上のFcγレセプターに対して結合し、Fc
    γレセプターがFcγタイプI（CD64）レセプター、FcγタイプII（CD32）レセプ
    ター、およびFcγタイプII CD16（FcγRIII）レセプターからなる群から選択さ
    れる、請求項1に記載の方法。
12. 【請求項１２】 樹状細胞結合剤が抗体である、請求項1に記載の方法。
13. 【請求項１３】 樹状細胞結合剤が患者に対する異種型抗体である、請求項
    12に記載の方法。
14. 【請求項１４】 異種型抗体が患者において宿主抗異種型抗体を惹起させる
    、請求項13に記載の方法。
15. 【請求項１５】 組成物の投与に先立って、宿主抗異種型抗体（HAXA）が患
    者の血液中に存在する、請求項13に記載の方法。
16. 【請求項１６】 異種型抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項13
    に記載の方法。
17. 【請求項１７】 マウスモノクローナル抗体がAlt-1、Alt-2、Alt-3、Alt-4
    、Alt-5およびAlt-6から成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
18. 【請求項１８】 組成物がさらにヒト抗異種型抗体（HAXA）を含む、請求項
    13に記載の方法。
19. 【請求項１９】 疾患に関連した抗原に対して特異的な精製樹状細胞結合剤
    、樹状細胞、および疾患に関連した抗原を含む、治療用組成物。
20. 【請求項２０】 樹状細胞結合剤の、樹状細胞上のレセプターへの結合がレ
    セプターに対する天然のリガンドの結合をブロックする、請求項19に記載の組成
    物。