CN101143221A

CN101143221A - 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药

Info

Publication number: CN101143221A
Application number: CNA2007101465862A
Authority: CN
Inventors: 理查德·S·布卢姆伯格; 韦恩·I·伦瑟; 尼尔·E·史密斯特尔; 艾伦·J·比通提
Original assignee: Xin Stokes Pharmaceuticals Ltd; Brigham and Womens Hospital Inc; Childrens Medical Center Corp; Brandeis University
Current assignee: Xin Stokes Pharmaceuticals Ltd; Brigham and Womens Hospital Inc; Childrens Medical Center Corp; Brandeis University
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2008-03-19
Also published as: JP2005526769A; CN1671863A; US20030235536A1; AU2002316574A1; JP2010159275A; AU2002316574B2; US20060140907A1; WO2003077834A2; EP1487992A2; WO2003077834A3; EP1487992A4; CA2479212A1; CN100343393C

Abstract

本发明涉及适合透过上皮全身性提供治疗的方法和产品。具体地说，本发明涉及通过包含治疗制剂与FcRn结合配体的共轭物的气溶胶对肺脏中央气道上皮的给药用于治疗剂的全身性递送的方法和组合物。这些方法和产品能适应各式各样的治疗制剂，包括蛋白质和多肽、核苷酸、药物和其它。此外，这些方法和产品具有不需要为了实现全身性递送而给药到深层肺脏的优势。

Description

适合治疗剂全身性递送的中央气道给药

本申请是发明人于2002年7月3日提交的题为“适合治疗剂全身性递送的中央气道给药”的中国专利申请02828942.0的分案申请。

本发明的技术领域

本发明涉及用于透过上皮提供治疗的方法和产品。具体地说，本发明涉及通过给药到肺脏中央气道用于与新生儿的Fc受体(FcRn)结合配体缀合的治疗剂的全身性递送的方法和组合物。这些方法和组合物对于治疗本身在受试者的疾病、病变或其它症状的治疗或预防方面有用的任何适应症都是有用的。

本发明的现有技术

大分子越过上皮屏障的转运可以借助受体非特异性的或受体特异性的机制发生。受体非特异性机制是用效率与被转运分子的分子量成反比关系的薄壁组织细胞筛分事件表现的。诸如免疫球蛋白G(IgG)之类的大分子经由这种薄壁组织细胞路径的转运由于IgG的大的分子质量(ca.150kDa)效率非常低。受体非特异性转运可以包括流体相中的胞吞转运。这与受体介导转运相比效率低得多，因为在流体相中大多数大分子被分类到适合降解的溶酶体。反之，可以提供非常有效的分子转运的受体特异性机制以别的方式被薄壁组织细胞筛分有效地排除。这种受体引导机制依照目的论可以被理解为对于诸如白蛋白、铁传递蛋白和免疫球蛋白之类的合成代谢费用高的大分子有效的清道夫机制。这些和其它的大分子将以别的方式通过它们从身体里面到外面向下游扩散无穷的浓度梯度在上皮屏障遗失。适合大分子越过上皮细胞转运的受体特异性机制仅仅对于为数不多的大分子存在。

限定身体内部和外部世界之间的边界的表面是由叫做上皮的专用组织提供的。按其最简单的形式，上皮是形成覆盖外表面或“内”表面的一层单一类型的细胞。上皮组织起因于内胚层和外胚层，并因此包括皮肤、角膜(眼)的上皮以及胃肠道、泌尿生殖道和呼吸系统的“内部的”衬里表面。这些“内部的”衬里表面与外侧世界沟通，因此，它们形成在身体内部和外侧世界之间的边界。尽管这些各不相同的上皮细胞有特定的结构特征或区分它们的附属物，但是它们也分享许多共有的东西。

在各种不同的上皮细胞之中共有的两个特征是在总水平上的大表面积和在细胞水平上有紧密接合的近距离并置的组合。这两个特征对于上皮用作全身性非侵入提供治疗的部位分别呈现潜在的优点和缺点。例如，成年人的肺脏上皮的表面积被认为是140m²。因此，这个巨大的表面可能呈现适合全身性提供治疗制剂的非常有吸引力的给药部位，当然，这将以治疗制剂能提供给上皮并且能越过上皮转运为前提条件。

另外，对于本发明特别重要的代表各种不同的上皮细胞的第三个特征是由FcRn(新生儿的Fc受体)提供的适合越过上皮屏障转运的受体特异性机制。这种受体是在新生儿的大白鼠和小鼠的肠上皮细胞中首先识别的并且被表示成母鼠的IgG从乳汁到还在吃奶的大白鼠或小鼠的血流的转运媒介。靠这种机制转运给新生儿的IgG对于婴儿的免疫防御是至关紧要的。为了停止跟随新生儿周期，报告在大白鼠和小鼠的肠上皮细胞中的FcRn的表达。在人类中，体液免疫不取决于新生儿的肠IgG转运。然而，人们相信胎盘组织的受体负责IgG转运。负责这种转运的受体已被寻找许多年。一些粘合IgG的蛋白质已从胎盘中分离出来。FcγRII是在胎盘内皮中发现的，而FcγRIII是在合体细胞滋养层中发现的。然而，这两种受体对于单节显性的IgG都表现出比较低的亲和力。在1994年，Simister及其同事报告了从人类胎盘分离给IgG的大白鼠和小鼠Fc受体的人类同系物编码的cDNA。Story CM等人(1994)J Exp.Met180：2377-81。完整的核苷和演绎的氨基酸序列是分别作为基因库新增编号U12255和AAA58958报告的并且都是可用的。

不同于啮齿动物的肠FcRn，人类的FcRn出乎意料地被发现是在成人上皮组织中表达的。见美国专利第6,030,613和6,086,875号。明确地说，业已发现，人类的FcRn被表达在肺的上皮组织和肠的上皮组织上(IsraelEJ等人，(1997)Immunology 92：69-74)、肾的近端管状上皮细胞上(Kobayashi N等人，(2002)Am J Physiol Renal Physiol 282：F358-65)和包括鼻的上皮细胞、阴道表面和胆管树表面在内的其它的粘膜上皮表面上。

美国专利第6,030,613号揭示了适合对肠的上皮、粘膜上皮和肺脏的上皮提供治疗的与FcRn结合配体缀合的方法和组合物。

美国专利第6,086,875号揭示通过将与FcRn结合配体缀合的抗原递送到包括肺脏上皮在内的FcRn表达上皮来刺激对抗原的免疫反应的方法和组合物。

人们普遍地相信适合全身性提供治疗的对肺脏上皮的治疗剂给药需要递送到深层肺脏，即递送到肺脏周边，因为这可以到达最大的可用表面积。见Yu J等人，(1997)Crit Rev Therapeutic Drug Carrier Systems

14：395-453。此外，作为肺脏最深区域(肺泡)衬里的上皮是极薄的单层细胞。反之，肺脏比较接近中央的气道的上皮是相当厚的，而且它们备有纤毛以利于清除否则可能在较远离中央的气道和肺泡中聚积并借此干扰气体交换的物质。所以，气溶胶递送系统和方法已经以使药物最大限度地递送到深层肺脏为目标逐步发展。这通常需要与气溶胶发生器[例如，剂量经过计量的吸入器(MDI)装置]和使用气溶胶发生器时受试者使用的专用吸入技术两者有关的诸因素的组合。例如，典型的MDI可能是为产生可能最小的雾滴或颗粒而设计的，而且为了俘获和除去来自气溶胶的较大的速度较低的颗粒与隔板装置或附件一起使用可能是合适的。使用者通常可能不得不用吸气的开始、吸气的速率和深度、控制呼吸等协调MDI的排放，全部是为了增加活性制剂有效的递送到肺脏的最深区域的可能性。不用说，患者的顺从和治疗效果往往是靠这些技术要求折衷的。

本发明的概述

本发明部份地涉及发明家令人惊讶的发现，即FcRn在肺上皮上的表达在中央气道比在周边气道更广泛。这种FcRn在肺上皮上的密度分布当治疗制剂作为治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物给药的时候实际上支持治疗制剂对中央气道而不是对深层肺脏的气溶胶给药。业已发现，依照本发明，成烟雾状散开的FcRn结合配体共轭物对中央气道的优先给药允许共轭物越过呼吸上皮细胞非常有效的FcRn介导胞吞转运和治疗制剂的全身性递送。不同于其它用于经肺部给药的全身性递送的方法和组合物，本发明有利地实现了最佳的全身性递送，而不需要专门的呼吸技术。因深层肺脏递送的需要所呈现的技术障碍借此得以避免，而且本发明通过将治疗制剂作为与FcRn结合配体的共轭物对肺脏中央气道的气溶胶给药提供对于非侵入性地将治疗制剂全身性递送给受试者有用的有效策略。

本发明在为了治疗或预防可用治疗制剂治疗的受试者的症状需要对受试者完成特定的治疗制剂的给药的所有场合都是有用的。本发明在需要完成治疗制剂的重复的或长期的给药、顺从专用的呼吸技术难以实现的所有场合以及每逢优选避免侵入性给药的时候都特别有用。

依照本发明的一个方面，提供用于治疗制剂的全身性递送的方法。该方法包括有效量的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物气溶胶对肺脏这样给药，以致中央肺脏区域/外围肺脏区域沉积比(C/P比)是至少0.7。如同下面进一步解释的那样，C/P比是这样选择的，以致共轭物被优先递送到中央气道。

在优选实施方案中，C/P比依照本发明的这个方面至少是1.0。在更优选的实施方案中，C/P比至少是1.5。在大多数优选的实施方案中，C/P比至少是2.0。

依照本发明的另一方面，提供用于全身性递送治疗制剂的方法。该方法包括有效量的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物的气溶胶对肺脏的给药，其中气溶胶的颗粒有至少3微米(μm)的质量中值气动力学直径(MMAD)。

依照本发明的第三方面，提供治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物的气溶胶，其中气溶胶的颗粒有至少3μm的MMAD。

依照本发明的第四方面，提供气溶胶递送系统。依照这个方面的气溶胶递送系统包括容器、与容器连接的气溶胶发生器以及放容器里面的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物，其中气溶胶发生器是为了形成有MMAD至少为3μm的颗粒的共轭物气溶胶而构造和安排的。

在一个实施方案中，这个方面提供制造气溶胶递送系统的方法。该方法包括提供容器、提供与容器连接的气溶胶发生器和把有效量的共轭物放进容器的步骤。

在一些依照本发明的这个方面的实施方案中，气溶胶发生器包括与包含共轭物的溶液流体连接的振动元件。

在一些实施方案中，振动元件包括一个构件，该构件有(a)前表面、(b)与溶液流体连接的后表面和(c)众多穿越构件的孔。在优选的实施方案中，在前表面的孔有至少3μm的直径。优选的是，孔是锥形的，以致它们从后表面到前表面逐渐变窄。

在一些依照本发明这个方面的实施方案中，气溶胶发生器是雾化器。在一些实施方案中，雾化器是喷气式雾化器。

在一些依照本发明这个方面的实施方案中，气溶胶发生器是机械泵。

在一些依照本发明这个方面的实施方案中，容器是增压容器。

依照本发明的第四方面，提供气溶胶递送系统。依照这个方面的气溶胶递送系统包括容器、与容器连接的气溶胶发生器和放在容器里面的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物，其中气溶胶发生器包括产生有MMAD至少为3μm的颗粒的共轭物的气溶胶的装置。

在一个实施方案中，这个方面提供制造气溶胶递送系统的方法。该方法包括提供容器、提供与容器连接的气溶胶发生器和将有效量的共轭物放进容器的步骤。

在一些依照本发明这个方面的实施方案中，气溶胶发生器包括与包含共轭物的溶液流体连接的振动元件。

在一些实施方案中，振动元件包含一个构件，该构件有(a)前表面、(b)与溶液流体连接的后表面和(c)众多穿越构件的孔。在优选的实施方案中，在前表面的孔有至少3μm的直径。优选的是，孔是锥形的，以致它们从后表面到前表面逐渐变窄。

在本发明上述的每个方面中，在一些实施方案中，颗粒的MMAD介于3μm和大约8μm之间。在一些实施方案中，颗粒的MMAD大于4μm。在优选的实施方案中，大多数颗粒是不适于呼吸的，即，它们有至少4.8μm的MMAD。不适于呼吸的颗粒被认为不进入深层肺脏中的肺泡空间。

在本发明上述的每个方面中，在一些实施方案中，FcRn结合配体包含FcRn的配体，它的模仿与FcRn结合的IgG的Fc域部分(即，Fc、Fc域、Fc片段、Fc片段同系物)。在优选实施方案中，FcRn结合配体的是非特异性IgG或IgG的FcRn粘合片段。最典型的是FcRn结合配体对应于IgG的Fc片段。

在本发明上述的每个方面中，在一些实施方案中，治疗制剂和FcRn结合配体是通过共价键偶联的。

在本发明上述的每个方面中，，治疗制剂和FcRn结合配体在一些实施方案中是通过连接体偶联的。优选的是连接体是肽连接体。在一些实施方案中，连接体至少包括特异性剪切酶的底物的一部分。

在本发明上述的每个方面中，治疗制剂在一些实施方案中是多肽。在这样的实施方案中，共轭物优选是离体融合蛋白。在某些这样的实施方案中，共轭物的多肽治疗制剂可能是用连接体与FcRn结合配体相连的，只要多肽治疗制剂和FcRn结合配体每个都至少保有它的一些生物活性即可。

在本发明上述的每个方面中，治疗制剂在一些实施方案中是细胞因子。在一些实施方案中，治疗制剂是细胞因子受体或它的细胞因子粘合片段。

在本发明上述的每个方面中，治疗制剂在一些实施方案中是抗原。抗原可能是病原体特有的、自身免疫疾病特有的、过敏原特有的或肿瘤特有的。在某些优选实施方案中，抗原是肿瘤抗原。

在本发明上述的每个方面中，治疗制剂在一些实施方案中是低聚核苷酸。在某些优选实施方案中，低聚核苷酸是抗过敏的低聚核苷酸。

在本发明上述的每个方面中，治疗制剂在一些实施方案中是红细胞生成素(EPO)、生长激素、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、或促卵泡激素(FSH)。在本发明上述的每个方面中，治疗制剂在一些实施方案中是因子VIIa、因子VIII、因子IX、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TNF-α受体[例如，etanercept，ENBREL；参阅美国专利第5,605,690号、PCT/US93/08666(WO94/06476)和PCT/US90/04001(WO91/03553)]、淋巴细胞功能抗原-3(LFA-3)、睫状神经营养因子(CNTF)。在某些优选实施方案中，治疗制剂是EPO。在其它的优选实施方案中，治疗制剂是生长激素。在其它的优选实施方案中，治疗制剂是IFN-α。在另一些其它的优选实施方案中，治疗制剂是IFN-β。在另一些其它的优选实施方案中，治疗制剂是FSH。在一个优选实施方案中，治疗制剂是因子VIII。在另一个优选实施方案中，治疗制剂是因子IX。在另一个优选实施方案中，治疗制剂是TNF-α。在一个优选实施方案中，治疗制剂是TNF受体。在另一个优选实施方案中，治疗制剂是LFA-3。在进一步的优选实施方案中，治疗制剂是CNTF。在每一个这样的和类似的优选实施方案中，治疗制剂是有生物活性的多肽，无论是全部还是其一部分。例如，是TNF受体(TNFR)的治疗制剂包括整个的TNFR和TNF粘合TNF受体的多肽，例如，TNFR的细胞外域。

在本发明上述的每个方面中，共轭物在某些优选实施方案中实质上呈现它天赋的未变性的形式。在一些实施方案中，至少60％的共轭物呈现它天赋的未变性的形式。在更优选的实施方案中，至少70％的共轭物呈现它天赋的未变性的形式。在更加优选的实施方案中，至少80％的共轭物呈现它天赋的未变性的形式。在非常优选的实施方案中，至少90％的共轭物呈现它天赋的未变性的形式。在更加非常优选实施方案中，至少95％的共轭物呈现它天赋的未变性的形式。在最优选的实施方案中，至少98％的共轭物呈现它天赋的未变性的形式。

本发明的这些和其它方面将在下面予以更详细的描述。

附图简要说明

图1给出包括铰合部、C_H2和C_H3域的人类IgGl Fc片段的核苷酸(SEQID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)序列。在氨基酸序列下面的数字对应于使用EU编号惯例的氨基酸标号。

图2给出野生型人类EPO的cDNA可读框核苷酸(Panel A；SEQ ID

NO：3)和演绎的氨基酸(Panel B；SEQ ID NO：4)序列。SEQ ID NO：4中的信号肽加下划线。

图3给出用于表达质粒pED.dC.XFc(Panel A)和Kb信号肽/Fcγl插入片段(Panel B)的核苷酸(SEQ ID NO：5)和氨基酸(SEQ ID NO：6)序列的质粒图。Kb信号肽和Fcγl区域是通过在序列上面加波纹符号(～)指出的。EcoRI、PstI和XbaI限制酶部位加下划线。

图4给出用于表达质粒pED.dC.Epofc(Panel A)和K^b信号肽/EPO/Fcγl插入片段(Panel B)的核苷酸(SEQ ID NO：7)和氨基酸(SEQ ID NO：8)序列的质粒图。K^b信号肽、成熟EPO和Fcγl区域是通过在序列上面加波纹符号(～)指出的。EcoRI、SbfI和XbaI限制酶部位加下划线。

图5给出用于表达质粒pED.dC.natEpofc(Panel A)和天赋EPO/Fcγl插入片段(Panel B)的核苷酸(SEQ ID NO：9)和氨基酸(SEQ ID NO：10)序列的质粒图。成熟EPO(包括天赋EPO信号肽)和Fcγl区域是通过在序列上面加波纹符号(～)指出的。EcoRI、SbfI和XbaI限制酶部位加下划线。

图6是描绘在活体内对作为气溶胶对猕猴类猴子的中央气道给药的EPO-Fc的响应的两张曲线图。Panel A展示九个动物中每个动物的最大的网状细胞响应。成烟雾状散开的EPO-Fc是使用雾化器对自然呼吸的动物给药的。Panel B展示在通过浅的或深的呼吸吸入之后EPO-Fc(天赋的Fc片段)和突变型EPO-Fc(有三个对于FcRn粘合至关紧要的氨基酸突变的Fc片段)的最大血清浓度。

图7是描绘在20％生活力(20％VC，浅呼吸)和75％生活力(75％VC，深呼吸)下气溶胶给药之后在猕猴类猴子中EPO-Fc的最大血清浓度的曲线图。

图8是描绘在20％生活力下以30μg/kg(圆)和10μg/kg(三角形)的剂量气溶胶给药之后在猕猴类猴子中EPO-Fc的血清浓度随时间变化的曲线图。每条曲线表示来自单一动物的数据。

图9是描绘在以20μg/kg的剂量使用浅呼吸完成IFN-α-Fc或INTRONA的气溶胶给药之后在猕猴类猴子中IFN-α-Fc或单独的IFN-α的血清浓度随时间变化的曲线图。每条曲线表示来自单一动物的数据。

图10是描绘在以2μg/kg的剂量使用浅呼吸完成IFN-α-Fc的气溶胶给药之后在猕猴类猴子中IFN-α-Fc的血清浓度随时间变化的曲线图。每条曲线表示来自单一动物的数据。

图11是描绘在以20μg/kg的剂量使用浅呼吸完成IFN-α-Fc的气溶胶给药之后IFN-α生物活性的两种公测度——寡腺苷酸合成酶(OAS)活性(Panel A)和新蝶呤浓度(Panel B)——的两张曲线图。每条曲线表示来自单一动物的数据。

图12是描绘在以0.3-0.5毫克/公斤的估计沉积剂量使用浅呼吸完成IFN-α-Fc的气溶胶给药之后在猕猴类猴子中ENBRELS(人类的TNFR-Fc)的血清浓度随时间变化的曲线图。

本发明的详细描述

每逢需要越过肺脏上皮递送治疗制剂来实现治疗制剂的全身性递送的时候，本发明是有用的。这是通过将治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物给药到中央气道完成的，其中中央气道就其本性而言特别适合FcRn结合配体的FcRn受体介导的跨细胞转运。有利的是，本发明可能被用在全身性提供几乎任何大小的治疗，包括有非常大的分子量的那些。因此，本发明可以用于适合全身性递送的大分子、肽、低聚核苷酸、小分子、药物和诊断剂的肺部给药。

一方面，本发明提供递送治疗制剂的方法，该方法包括将有效量的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物的气溶胶给药到肺脏，以致C/P比至少是0.7。

“治疗制剂”如同在本文中使用的那样指的是对治疗或预防受试者的疾病、失调或症状有用的化合物。如同在本文中使用的那样，术语“治疗”意味着改善受试者的疾病、失调或症状的预兆或征兆，或停止受试者的疾病、失调或症状的进展。受试者的某种特定的疾病、失调或症状的预兆、征兆和进展能使用普通技术人员认可的任何可适用于临床的或实验室的测度进行评估，例如，如同在Fauci AS等人编辑的“Harrison′s Principles ofInternal Medicine(内科学的Harrison原则)”，第14版，McGraw-Hill，New York，1998中描述的那样。如同在本文中使用的那样，术语“受试者”意味着哺乳动物，优选人类。为了治疗或预防特定的疾病、失调或症状，普通技术人员将认可适合那个目的的治疗制剂。

本发明的FcRn结合配体共轭物可以用来全身性递送各式各样的治疗制剂，包括但不限于，抗原，包括肿瘤抗原；适合治疗癌症的化疗制剂；细胞因子；生长因子；核酸分子和低聚核苷酸，包括DNA和RNA；激素；致育药；降钙素、钙三醇和其它有生物活性的类固醇；抗生药，包括抗菌剂、抗病毒制剂、抗霉菌制剂和抗寄生虫制剂；刺激细胞增殖的制剂；脂类；蛋白质和多肽；糖蛋白；碳水化合物；和它们的任何组合。治疗制剂的特殊实例是在本文中其它地方给出的。本发明的FcRn结合配体可以被进一步用于诸如微粒和脂质体之类递送载体的定向递送。

“气溶胶”如同在本文中使用的那样指的是以细小颗粒的形式分散在气体中的液体或固体的悬浮物。如同在本文中使用的那样，术语“颗粒”指的是液体(例如，雾滴)和固体(例如，粉末)。用于将本发明的共轭物递送到肺脏的药物气溶胶优选用嘴而不是用鼻子吸入。作为替代，用于将本发明的共轭物递送到肺脏的药物气溶胶优选通过直接递送引进中央气道，例如经由气管内的插管或气管切开术。

如同下面更详细地描述的那样，“共轭物”如同在本文中使用的那样指的是用任何物理化学方法彼此结合起来的两个或多个实体，其中包括但不限于共价键相互作用、疏水基相互作用、氢键相互作用或离子键相互作用。重要的是注意FcRn结合配体和治疗制剂之间的结合必须有这样的天性和位置，以致它不破坏FcRn结合配体对FcRn的粘合能力。这样的结合对于原本普通技术人员是众所周知的，其实例将在下面更详细地描述。共轭物可以进一步作为融合蛋白形成，也在下面予以更详细的讨论。

共轭物可能包括在治疗制剂和FcRn结合配体之间的中间体或连接体实体，以致治疗制剂和FcRn结合配体相互间接地结合在一起。在一些实施方案中，连接体经受自发的开裂。在一些实施方案中，连接体经历诸如酶或化学制剂之类协助的开裂。例如，蛋白酶可劈开的肽连接体在技术上是众所周知的，而且不受限制地包括胰蛋白酶敏感的序列；纤蛋白溶酶敏感的序列；FLAG肽；牛κ-酪蛋白A的凝乳酶敏感序列(Walsh MK等人，(1996)J Biotechnol45：235-41)；组织蛋白酶B能劈开的连接体(Walker MA等人，(2002)Bioorg Med Chem Lett12：217-9)；嗜热菌蛋白酶敏感的聚(乙二醇)(PEG)-L-丙氨酰基-L-缬胺酸(Ala-Val)(Suzawa T等人，(2000)JControl Release69：27-41)；肠激酶能剪切开的连接体(McKee C等人，(1998)Nat Biotechnol16：647-51)。蛋白酶能劈开的肽连接体可能是为使用而设计的并且是与其它主要类别的蛋白酶[例如，基质金属蛋白酶和促胰液肽酶(sheddases)]联合使用的。Birkedal-Hansen H等人，(1993)Crit Rev OralBiol Med4：197-250；Hooper NM等人，(1997)Biochem J321(Pt2)：265-79。在其它的实施方案中，连接体可能是耐自发剪切、蛋白水解剪切或化学剪切的。这种类型的连接体的例子是无精氨酸-赖氨酸的连接体(耐胰蛋白酶的)。另外连接体实例不受限制地包括聚甘氨酸，(Gly)n；聚丙氨酸，(Ala)n；poly(Gly-Ala)，(Glym-翼)n；聚(Gly-Ser)，(例如，Glym-Ser)n，和它们的组合，其中m和n每个都独立地是介于1和6之间的整数。也见Robinson CR等人，(1998)Proc Natl Acad Sci USA95：5929-34。

“FcRn结合配体”如同在本文中使用的那样指的是能在随后发生的经FcRn结合配体的FcRn的主动转运中被FcRn结合的任何实体。因此，本发明的FcRn结合配体包括，例如，整个的IgG、IgG的Fc片段、IgG的包括用于FcRn的完全的粘合区域的其它片段、和模仿Fc的FcRn粘合部分并且与FcRn结合的其它分子。在某些实施方案中，FcRn结合配体将FcRn特异性的整个抗体排除在外，后者通过抗原特异性的抗原-抗体相互作用专门与FcRn结合。人们将理解在这个思路中抗原特异性的抗原-抗体相互作用意味着用抗体变异度高的区域内的至少一个互补的决定性区域(CDR)，例如Fab、F(ab′)、F(ab′)2和Fv片段内的CDR，规定的抗原粘合。同样地，在某些实施方案中，FcRn结合配体将整个抗体的通过抗原特异性的抗原-抗体相互作用与FcRn结合的FcRn特异性片段和FcRn特异性片段的相似物排除在外。因此，一些这样的实施方案将FcRn特异性的Fv片段、单一的Fv(scFv)链段等排除在外。其它这样的实施方案将FcRn特异性的Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段等排除在外。

“C/P比”是与对肺脏外围的沉积相比较成烟雾状散开的颗粒对肺脏中央气道的沉积的相对分布的测度。“中央气道”指的是对于在气体交换中极少或不起作用的喉在远端的引导和过渡气道。人类的中央气道包括气管、主支气管、肺叶支气管、肺段支气管、小支气管、细支气管、末端细支气管和呼吸性细支气管。因此，中央气道在肺脏中占气道分支最初16-19代，气管是零代(0)，而肺泡囊是23代。Wiebel ER(1963)Morphometry of theHuman Lung，Berlin：Spering-Verlag，pp.1-151。术语“肺脏外围”和等价的“深层肺脏”指的是对于中央气道在远端的肺脏气道。中央气道与主要负责在空气和血液之间的气体交换的肺脏外围相反负责空气的整体运动。总之，中央气道仅仅占肺脏的整个呼吸上皮表面积的大约百分之十。见Qiu Y等人，(1997)，Inhalation Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins，Adi ei AL and Gupta PK，eds.，Lung Biology in Health andDisease，Vol.107，Marcel Dekker：New York，pp.89-131。

值得注意的是，上皮细胞的类型在肺脏的中央区域和周边区域之间变化。中央气道是用有纤毛的柱状上皮细胞和立方体形上皮细胞衬里的，然而呼吸区域是用立方体形上皮细胞和更靠近末梢的肺泡上皮细胞衬里的。然而，横跨肺泡上皮的距离非常小，即，0.1-0.2μm，横跨圆柱状和立方体形上皮细胞的距离要大许多倍，例如，就柱状上皮而言是30-40μm。

普通技术人员通常称P/C比或等价的渗透指数为制剂对深层肺脏有效给药的测度。如同术语建议的那样，P/C比是与对肺脏中央气道的沉积相比较成烟雾状散开的颗粒对肺脏外围的沉积的相对分布的测度；因此，它是C/P比的倒数。P/C比直接随着为了实现吸入性制剂的全身性递送(即，优先对深层肺脏给药)迄今已找到的结果改变。就传统的应用而言已找到的典型的P/C比是在大约1.35到2.2以上的范围内。

不同于这些要求对肺脏外围给药达到最大值并因此要求高的P/C比的比较典型的应用，在本发明中，集中对肺脏中央气道给药是符合要求的。因此，在本发明中，依照对中央气道给药优于对肺脏外围给药这一惊人的发现，实现比较低的P/C比，即，高的C/P比是符合要求的。因此，C/P比直接随着本发明所找到的结果(即，优先对肺脏中央气道给药)改变。因此，优选实施方案包括C/P比至少是0.7-0.9的那些。这些实施方案明确地包括C/P比至少是0.7、0.8和0.9的那些。更优选的实施方案包括C/P比至少是1.0-1.4的那些。这些实施方案明确地包括C/P比至少是1.0、1.1、1.2、1.3和1.4的那些。更优选的实施方案包括C/P比至少是1.5-1.9的那些。这些实施方案明确地包括C/P比至少是1.5、1.6、1.7、1.8和1.9的那些。大多数的优选实施方案包括C/P比至少是2.0-3.0的那些。这些实施方案明确地包括C/P比至少是2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0的那些。不存在C/P比的理论上限。因此，最优选的实施方案包括C/P超过3.0的那些。

C/P比的确定能用任何适当的方法完成，但是通常这样的确定涉及平面成像灰阶闪烁扫描、三维单一光子发射计算机断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)。Newman SP等人，(1998)Respiratory Drug Delivery6：9-15；Fleming JS等人，(2000)J Aerosol Med13：187-98。在典型的P/C比确定中，适当的伽马射线发出的放射性核(例如，99mTc、113mIn、131I或81mKr)被加到药物配方中。在对受试者完成气溶胶给药之后，数据是用γ照相机获得的并且而且分析通过把由此产生的肺脏图像分成两个(中央和周边)或三个(中央、中间和周边)成像区域。Newman SP等人，上述的；Agnew JE等人，(1986)Thorax41：524-30。依据选定的成像方法，中央成像区域或中央和中间成像区域一起代表中央气道。周边的成像区域代表肺脏的外围。考虑到衰减和衰退，来自周边成像区域的计数除以来自中央成像区域的计数(或在适当的场合，除以来自中央和中间成像区域的组合计数)。C/P比的确定遵循刚刚概述的方法，但是该比值是在来自中央成像区域的计数(或在适当的场合，来自中央和中间成像区域的组合计数)除以来自周边区域的计数时计算的。

许多因素对颗粒在肺脏内的沉积部位有贡献，包括呼吸技巧。通常，吸入行为越快、越浅、持续时间越短，对于中央气道的沉积就越有利。相反，吸入行为越慢、越深、持续时间越长，对于肺脏外围的沉积就越有利。因此，例如，正常的(即，潮汐式)呼吸支持中央气道沉积，反之，深深的超常的吸入行为和屏气有利于深层肺脏中的沉积。换一种方式，低流量、低压力的呼吸支持中央气道沉积，反之高流量、高压力的呼吸支持深层肺脏沉积。因此，在机械式呼吸机上设定呼吸作用时，受机械式呼吸机控制的流量和压力参数可以被这样设定，以便要么支持在肺脏中央沉积，要么在肺脏周边沉积。这样的用机械控制或帮助呼吸的参数是根据技术上众所周知的许多临床因素选定的，其中包括体重、潜在的肺病或其它疾病、吸入氧气的分数(FiO₂)、流体体积状态、肺脏顺应性等，以及例如用血液pH、血液中的氧分压和血液中的二氧化碳分压反映的有效的气体交换。

所以，实现至少0.7的C/P比得到使用正常的或潮汐式呼吸方式作为优选的给药方法的一部份的支持。这可能是这样完成的，例如，通过在潮汐式呼吸期间在若干次呼吸的过程中吸入气溶胶。所以，在机械式呼吸机上的呼吸设定中，至少0.7的C/P比是用作为优选的给药方法的一部份的低流量、低压力的辅助供氧支持的。

影响颗粒在气道里面的沉积部位和程度的另一个因素涉及颗粒的物理化学特性。颗粒的重要物理化学特性包括它们的气体力学直径、质量密度、速度和电荷。一些因素是在本发明的下一个方面考虑的。

依照本发明的另一方面，提供用于全身性递送治疗制剂的方法。依照这个方面的方法包括有效量的治疗制剂和和FcRn结合配体的共轭物的气溶胶对肺脏的给药，其中气溶胶中的颗粒有至少3μm的质量中值气动力学直径(MMAD)。依照另外一个方面，本发明提供治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物气溶胶，其中气溶胶中的颗粒有至少3μm的MMAD。颗粒大小和分布被认为是影响气溶胶沉积的重要参数。气溶胶颗粒通常按形状与大小归类。气溶胶的个别颗粒大小可以用显微镜描述其特征，然后，可以估算原始的平均粒度值，后者描述整个尺寸分布的中心趋向。用等价的球形尺寸表示形状不规则的颗粒的粒度是方便的。气体力学直径(D_ae)定义为沉降速度(通常在空气中)与正在研究的颗粒一样的单位密度球的直径。这个尺寸包括颗粒的形状、密度和物理尺寸。颗粒的群体可以根据在每个粒度范围中携带的质量来定义。这个分布可以在质量中值气动力学直径(MMAD)处被平分为两个相等的部分。围绕着MMAD的分布可以按照几何标准偏差(GSD)来表达。如果假定气溶胶粒度分布是对数正态分布，则可以使用这些参数。

因为颗粒大小不可能是均匀的，所以在各种不同的实施方案中，D_ae至少3μm的颗粒可以构成气溶胶中的颗粒的至少50％、至少60％、至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更加优选至少85％、更加优选至少90％、最优选至少95％。

气溶胶颗粒在气道里面的沉积机制包括惯性撞击、拦截、沉降和扩散。惯性撞击发生在大的(高迁移率)颗粒或雾滴按它们的初始方向行进而且在空气运动方向绕过障碍物之时不遵从速度流线的时候。这些大颗粒行进到障碍物处沉积下来。惯性撞击遍及气管支气管树到处发生，但是在最大的气道中尤其容易发生，在那里流速和颗粒尺寸都大得多。拦截与鼻中的沉积和小的气道有关。颗粒在它们进入按流动方向运动的气流离气道壁小于颗粒直径的位置的时候将被拦截。沉降在重力的作用下发生并且影响位于肺泡区域的较小的气道中比较大的颗粒。扩散负责小的、亚微米级的颗粒的沉积。颗粒在气体分子冲击的影响下随机地移动，直到它们行进到气道壁。

已知专用的气溶胶发生器能够形成“单分散”的气溶胶，即，有GSD小于1.2μm的颗粒的气溶胶。Fuchs NA等人，(1966)在：Davies CN，Ed.，Aerosol Science，London：Academic Press，pp.1-30。振动孔口式单分散气溶胶发生器(VOAG)是一种类型的单分散气溶胶发生器的例子，而且它时常被用来准备校准标准。Berglund RN等人，(1973)Environ Sci Technol7：147。这种发生器当浓缩物通过孔口直径尺寸介于5和50μm之间的孔板进料的时候能实现接近1.05的GSD。其它类型的单分散气溶胶发生器包括旋盘式和旋转陀螺式气溶胶发生器。这些也时常被用来准备校准标准。

粒度(即，MMAD和GSD)能使用任何适当的技术进行测量。广泛使用的技术包括单级的和多级的惯性撞击、有效撞击、激光粒度测定、光学显微镜和扫描电子显微镜。就综述而言，见Lalor CB等人，(1997)Inhalation Delivery of Therapeutic Peptide and proteins，Adj ei AL andGupta PK Eds.，New York，Marcel Dekker，pp.235-276。

在2μm到10μm范围中的粒度被普遍地看作对于将治疗制剂递送到气管支气管和肺脏区域是最佳的。Heyder J等人，(1986)J Aerosol Sci17：811-25。业已表明，最大的肺泡沉积发生在颗粒有介于1.5μm和2.5μm之间和2.5μm和4μm之间的直径时候，分别在采用和不采用屏气技术的情况下。Byron PR(1986)J.Pharm.Sci.75：433-38。随着粒度逐渐增加到超过大约3μm，沉积在肺泡中逐渐减少而在中央气道中逐渐增加。超过大约10μm，沉积绝大部分发生在喉部和上呼吸道。

如同先前提到的那样，MMAD至少为4.8μm的颗粒是不适于呼吸的，即，它们被认为将不进入深层肺脏中的肺泡空间。这就解释了为什么迄今还优选用以颗粒的MMAD小于5μm为特征的气溶胶给药。反之，在本发明的某些优选实施方案中，大多数颗粒是不适于呼吸的。

在第三方面中，本发明提供气溶胶递送系统。依照这个方面的气溶胶递送系统包括容器、与容器相连接的气溶胶发生器和放在容器里面的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物，气溶胶发生器是为了产生颗粒的MMAD至少为3μm的共轭物气溶胶而构造和安排的。

在特别优选实施方案中，气溶胶递送系统包括为了振动有众多限定几何形状的小孔的孔板而构造和安排的振动元素，其中孔板的一个侧面或表面与共轭物的溶液或悬浮液流体连接。例如，见美国专利第5,758,637号、美国专利第5,938,117号、美国专利第6,014,970号、美国专利第6,085,740号和美国专利第6,205,999号，在此通过引证将它们的整个内容全部并入。振动元素振动孔板的激活作用使溶液或悬浮液中包含共轭物的液体被抽吸通过众多小孔，形成雾滴(即，颗粒)尺寸范围定义明确的低速的气溶胶。

这个类型的气溶胶发生器的例子是从Aerogen Inc.，Sunnyvale，California购买的。

在另一个实施方案中，气溶胶递送系统包括装共轭物的溶液或悬浮液的增压容器。增压容器通常有与计量阀连接的执行机构，以致执行机构的激活作用使在容器内的溶液或悬浮液中的预定数量的共轭物以气溶胶的形式从容器中分发出去。这个类型的增压容器在技术上被称为压缩气体驱动的计量剂量的吸入器(pMDI或简称MDI)。MDI通常包括执行机构、计量阀和增压容器，后者保存微粉化的药物悬浮液或溶液、液化的压缩气体和表面活性剂(例如，油酸、山梨聚糖三油酸酯、卵磷脂)。在历史上这些MDI通常使用含氯氟烃(CFCs)作为压缩气体，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷和二氯四氟甲烷。当单独的压缩气体是比较差的溶剂时候，诸如乙醇之类的助溶剂可以存在。较新的压缩气体可以包括1，1，1，2-四氟乙烷和1，1，1，2，3，3，3-八氟丙烷。MDI的激活作用通常引起剂量为50微克-5毫克的活性制剂在20-100μL体积中以高速度(30m/sec)在100-200msec内被递送。

在其它的实施方案中，气溶胶递送系统包括与装有共轭物溶液或悬浮液的储罐流体连接的空气喷射式雾化器或超声波雾化器。雾化器(空气喷射式或超声波)主要是用于无法走动的患者、婴儿和孩子的急性病治疗。用于雾化的空气喷射式雾化器因为小型压缩空气泵的可用性被认为是便携的，但是它们是比较大的不便的系统。超声波雾化器因为它们通常不需要压缩空气的来源所以有更容易携带的优势。雾化器提供非常小的雾滴和高质量输出。通过雾化给药的剂量比MDI中的剂量大得多而且液体储罐在尺寸方面受到限制，从而导致短暂的单一持续时间的治疗。

为了产生来自空气喷射式雾化器的气溶胶，压缩空气被迫通过毛细管开口端上的小孔，从而形成低压区域。液体配方通过管子被抽吸出来，与空气射流混合，形成雾滴。在雾化器里面的挡板除去较大的雾滴。气流中的雾滴大小受压缩空气压力的影响。质量中径通常在空气压力介于20到30psig的时候在2到5μm范围内变动。各种市售的空气喷射式雾化器不同样地运行。这将影响成雾状的气溶胶的临床效能，取决于雾滴大小、雾化器的总输出和患者决定因素。

超声波雾化器使用在液体室中用在受激励时机械振动的陶瓷压电晶体聚焦的高频超声波(即，100仟赫以上)产生气溶胶。Dannis JH等人，(1992)JMed Eng Tech16：63-68；O′Doherty MJ等人，(1992)Am Rev Respir Dis146：383-88。在一些例证中，叶轮把颗粒吹出雾化器或气溶胶被患者直接吸入。超声波雾化器能够有大于空气喷射式雾化器的输出，并因此时常被用于气溶胶药物治疗。使用超声波雾化器形成取决于频率的雾滴是比用空气喷射式雾化器递送的那些粗大(即，较高的MMAD)。引进液体的能量能导致温度上升，从而导致蒸发和随着时间流逝浓度变化。这种随着时间流逝浓度变化在喷气式雾化器中也曾遇到，但是那是通过蒸发失去水造成的。

在雾化器中的溶液或悬浮液配方之间选择类似于用于MDI的那种选择。选中的配方将影响总质量输出和粒度。雾化器配方通常包含含有助溶剂(乙醇、丙三醇、丙二醇)的水和为改善溶解度和稳定性而添加的表面活性剂。为了防止来自低渗或高渗溶液的支气管狭窄，通常还添加渗透剂。见Witeck TJ等人，(1984)Chest86：592-94；Desager KN等人，(1990)AgentsActions：225-28。

在另外一些实施方案中，气溶胶递送系统包括与装有呈粉末状的共轭物的储罐流体连接的干粉吸入器。干粉吸入器装置可能为了适应国际性组织控制这些新近的产品中的含氯氟烃的一些指示最后取代MDI。值得注意的是，这种装置在适于呼吸的粒度范围内只能递送一小部分它的负荷。粉末吸入器通常将仅仅把大约10到20％的内部药物分散成适于呼吸的颗粒。典型的干粉吸入器装置有两个部件：把单位剂量的粉末配方分散到吸入气流中的吸入器具和分配这些剂量的粉末配方储罐。储罐通常可能有两种不同的类型。散装储罐允许在个别剂量递送之时把精确数量的粉体分配成多达大约200个剂量。单位剂量储罐提供在需要时吸入的个别剂量(例如，以泡罩包装或明胶胶囊形式提供的)。手持型装置是为操纵砸开胶囊/泡罩包装或在为患者吸入分散之后装载散装粉体而设计的。气流将使粉体不再聚集成团和成烟雾状散开。在大多数情况下，患者吸入的气流使装置激活，提供使干粉分散和不再聚集成团的能量，以及决定将到达肺脏的药剂数量。

干粉发生器因为粉体的物理和化学性质受变异性支配。这些吸入器是为计量在200微克到20毫克范围内变动的剂量设计的。在这些装置中药物粉体的准备非常重要。这些吸入器中的粉体需要有效地减小尺寸，这对于在MDI中的悬浮液也是需要的。微粉化的颗粒流动并且比粗大的颗粒分散得更均匀。所以，微粉化的药物粉体可以与惰性载体混合。这种载体通常是α-乳糖一水合物，因为乳糖有各种各样的粒度范围而且被很好地描述特征。Byron PR等人，(1990)Pharm Res7(suppl)：S81。载体颗粒具有大于治疗制剂的粒度，以阻止赋形剂进入呼吸道。两个颗粒的分离将发生在患者通过口罩吸入时形成湍流的时候。这种吸入行为引起的湍流将提供一定数量的能量克服颗粒间的内聚力和颗粒表面的粘着力使微粉化的颗粒变成空气传播的。在空气中药物颗粒的高浓度容易使用干粉产生过程获得，但是输出的稳定性和成团的和带电的颗粒的存在是普遍的问题。采用非常小的颗粒，因为静电力、范德瓦尔力、毛细管作用和机械力增加它们的缔合能量，分散变得很困难。

适合与本发明一起使用的干粉吸入器气溶胶发生器的例子是适当的是购自Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts的Spinhaler粉体吸入器。

FcRn分子现在被很好地表征。如同前面提到的那样，适合包括人类在内的一些哺乳动物物种的FcRn已被分离。FcRn是作为包括FcRnα链(等价地，FcRn重链)和β₂微球蛋白的异源二聚体出现的。人类FcRn、大白鼠FcRn和小鼠FcRn的α链的序列可以在通过引证在此被全部并入的文献Story，CM等人，(1994)J Exp Med180：2377-81中找到。如同普通技术人员将认可的那样，FcRn能通过克隆或通过使用，例如，非特异性抗体、多克隆抗体或单株抗体的亲和力纯化来分离。然后，这样分离的FcRn能用来识别和分离FcRn结合配体，如同下面描述的那样。

IgG中与FcRn结合的Fc部分的区域已基于X-射线晶体学予以描述(例如，见通过引证被全部并入的Burmeister WP等人，(1994)Nature372：379-83和Martin WL等人，(2001)Mol Cell7：867-77)。Fc与FcRn主要的接触区在CH2域和CH3域的交界附近。潜在的IgG触点是C_H2中的残基248、250-257、272、285、288、290-291、307、308-311和314和C_H3中的残基385-387、428和433-436。这些部位截然不同于借助亚纲比较或定位诱变被识别为对于Fc粘合到白细胞FcγRI和FcγRII上重要的那些。早期研究已涉及鼠科的IgG残基253、272、285、310、311和433-436作为与FcRn的潜在接触。Sields RL等人，(2001)J Biol Chem276：6591-6604。在人类IgG1中，早期研究已涉及到残基253-256、288、307、311、312、380、382和433-436作为与FcRn的潜在接触。Sields RL等人，(2001)J Biol Chem276：6591-6604。上述的Fc-FcRn接触全部在单一的Ig重链之内。人们先前已注意到：两个FcRn能粘合单一的Fc同源二聚体。晶体学数据意味着，在这样的复合体中，每个FcRn分子都有与Fc同源二聚体的一个多肽的主要接触。Martin WL等人，(1999)Biochemistry39：9698-708。

人类的FcRn与人类IgG的全部亚纲结合，但是与小鼠和大白鼠IgG的大多数亚纲的结合则不那么好。见West AP等人，(2000)Biochemistry39：9698-9708；Ober RJ等人，(2001)Int Immunol13：1551-59。因此，就特定的物种而言，将会有可以衍生出FcRn结合配体的优选的IgG物种。在每个物种之内结合亲和力的次序是IgG1＝IgG2>IgG3>IgG4(人类)；IgG1>IgG2b>IgG2a>IgG3(小鼠)；和IgG2a>IgGl>IgG2b＝IgG2c(大白鼠)。Burmeister WP等人，(1994)Nature372：379-83。所以，人们相信，属于任何亚纲的人类IgG(及其包含FcRn接触的片段)作为人类的FcRn结合配体是有用的。

在本发明的实施方案中，FcRn结合配体而不是整个的IgG可以用来越过肺的上皮屏障转运治疗剂。在这样的实施方案中，选择与亲和力高于完整的IgG的FcRn结合的FcRn结合配体是优选的。这样的FcRn结合配体在利用FcRn实现越过上皮的屏障主动转运缀合治疗剂方面和在减少内源性IgG为转运机制竞争方面有效用。这些亲和力较高的FcRn结合配体的FcRn结合活性可以采用普通技术人员已知的标准的化验法测量，包括：(a)使用自然表达FcRn的或已为表达FcRn或FcRn的α链做过基因改造的极化细胞的转运化验；(b)使用可溶的FcRn或其片段或固定FcRn的FcRn配体：蛋白质粘合化验；(c)利用自然表达FcRn的或已为表达FcRn或FcRn的α链做过基因改造的极化的或非极化的细胞的粘合化验。

FcRn结合配体可以借助重组体遗传工程技术生产。给人类FcRn结合配体编码的核苷酸序列在本发明的范围内。FcRn结合配体包括整个IgG、IgG的Fc片段和其它包括用于FcRn的完整粘合区域的IgG片段。主要接触部位包括C_H2域氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314和C_H3域氨基酸残基385-387、428和433-436。所以，给跨越这些氨基酸残基的IgG Fc片段区域编码的核苷酸序列在本发明的优选实施方案之中。

IgG的Fc区域能依照诸如定位诱变之类已被公认的程序进行修饰，以便产生将受FcRn束缚的经修饰的IgG或经修饰的Fc片段或其某些部分。这样的修饰包括远离FcRn接触部位的修饰以及在接触部位内保护或甚至增强对FcRn的粘合的修饰。例如，人类IgGlFc(Fcγ1)的下列单一氨基酸残基能在就FcRn而言Fc的粘合亲和力没有重大损失的情况下替换：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示在位置238被丙氨酸替换的野生型脯胺酸。Shield RL等人，(2001)J Biol Chem276：6591-6604。上面列出的群丛变型中有许多但并非全部是丙氨酸群丛变型，即，野生型残基被丙氨酸取代。然而，除了丙氨酸之外，其它的氨基酸可以在前面指定的位置替换野生型氨基酸。这些突变可能被逐一地引进Fc，从而产生一百种以上在结构上截然不同于土著人的Fcγl的FcRn结合配体。此外，这些个别突变中的两个、三个或更多个的组合可能被一起引进，从而产生另外一些FcRn结合配体。

某些上述的突变可能在FcRn结合配体上赋予新的官能度。例如，优选实施方案将N297A合并，从而除去高度保守的N-糖基化作用部位。这种突变的效果是减少免疫原性，借此提高FcRn结合配体的循环半衰期，和提供本质上不兼顾它对FcRn的亲和力就没有能力粘合到FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA上的FcRn结合配体。Routledge EG等人，(1995)Transplantation 60：847-53；Friend PJ等人，(1999)Transplantation 68：1632-37；Shield RL等人，(2001)J Biol Chem276：6591-6604。作为起因于上述的突变的新官能度的进一步的例子，对FcRn的亲和力在一些例证中可以增加到超过野生型的。这种增加的亲和力可以反映增加的“ON”率、减少的“OFF”率、或增加的“ON”率和减少的“OFF”率两者。确信可能赋予FcRn增加的亲和力的突变包括在特定的T256A、T307A、E380A和N434A中。Shield RL等人，(2001)J BiolChem276：6591-6604。确信可能赋予FcRn增加的亲和力的群丛变型的组合包括特定的E380A/N434A、T307A/E380A/N434A和K288A/N434A中。见Shield RL等人，(2001)J Biol Chem276：6591-6604。

除了前面揭示的FcRn结合配体之外，在一个实施方案中，FcRn结合配体是包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO：11)而且非必选地进一步包括选自HQSLGTQ(SEQ ID NO：12)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：13)、HQNISDGK(SEQ ID NO：14)或VISSHLGQ(SEQ ID NO：15)的序列的多肽。授权给Presta等人的美国专利第5,739,277号。序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO：11)将与对应于Fc的C_H2域中的氨基酸247-257(SEQ ID NO：2)的序列PKDTLMISRTP(SEQ ID NO：16)相比较。后一个序列包括为了相信是与FcRn的主要接触部位先前注意到的九个氨基酸。

本发明不倾向于受选择任何特定的FcRn结合配体的限制。因此，除了刚刚描述的FcRn结合配体以外，其它的结合配体也能被识别和分离。对于FcRn特异的并且一旦被结合就能够被FcRn转运的抗体或其某些部分能使用已建好的技术予以识别和分离。同样，随机产生的形形色色的分子文库能被筛选，而且被FcRn粘合和转运的分子能使用传统的技术予以分离。在区分氨基酸侧链基团的取代时，FcRn结合配体对多肽(即，聚酰胺)主链的合并修饰也是本发明关注的。例如，Bartlett等人报告了胃蛋白酶和青霉天冬酰蛋白酶的包含膦酸酯、亚膦酸酯和膦酸酰胺的假肽抑制剂。见Bartlett等人，(1990)J Org Chem55：6268-74。也见美国专利第5,563,121号。那些抑制剂是包括代替在正常情况下将被那些酶劈开的易切断的酰胺键的包含磷的键的假肽。

用来识别和表征FcRn结合配体的体外筛选法可能以普通技术人员熟悉的技术为基础。这些可能包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其中被分离的FcRn被直接或间接地粘合到作为“俘获抗原”的酶作用物上，随后被暴露在包含试验FcRn结合配体的试样之中；然后，试验FcRn结合配体对到固定FcRn的粘合被直接地或间接地化验。在相关的方法中，竞争ELISA或直接的放射免疫测定法(RIA)可能用来确定相对于标记FcRn结合配体对FcRn的亲和力的非标记试验FcRn结合配体对FcRn的亲和力。这些技术是容易升级的，所以适合候选FcRn结合配体的大规模的高生产能力的筛选。

其它适合识别和表征FcRn结合配体的体外的方法可能以细胞为基础。这些方法测量试验FcRn结合配体的细胞粘合、细胞摄取或细胞胞吞转运。这样的方法可以通过用抗体(例如，FLAG肽)识别的例如同位素(¹³¹I、³⁵S、³²p、¹³C、等等)、生色团、荧光团、生物素或表位给FcRn结合配体加标记变得容易。在这些化验中使用的细胞可以自然地或作为将给FcRn编码的在操作上与适当的调节序列连接的孤立的核酸分子引进细胞的结果表达FcRn。给FcRn编码的在操作上与适当的调节序列连接的核酸通常是用来转化或转染宿主细胞的质粒。用于稳定的瞬时转化和转染的方法是技术上众所周知的，而且它们包括物理的、化学的和病毒的技术，例如磷酸钙沉积、电穿孔、biolistic注射和其它。

另一些适合识别和表征FcRn结合配体的体外的方法可以包括流式细胞计量术(FACS)、电迁移率变动分析(EMSA)、表面胞质基因共振(生物分子相互作用分析；BIAcore)、基于嵌片的表面相互作用分析和其它。

如果FcRn结合配体是整体上由基因编码的氨基酸组成的肽，或其这样组成的一部分，那么肽或相关部分也可以使用传统的重组体遗传工程技术合成。就重组体生产而言，给FcRn结合配体编码的多核苷酸序列被插入适当的表达载体，即包含对于插入的编码序列的转录和翻译必需的元素的载体，或在RNA病毒载体的情况下，对于复制和翻译必需的元素。然后，表达载体被转染到或以其它方式引进将表达肽的适当的靶细胞。然后，依据所用的表达系统，被表达的肽被技术上已确立的程序分离。用于重组蛋白质和肽的生产方法是技术上众所周知的(例如，见Maniatis等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.；Ausubel等人，1989，Current Protocals in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NewYork)。

为了提高生产效率，多核苷酸可以是为了给被酶的卵裂部位分开的FcRn结合配体的多个单元编码而设计的。由此产生的多肽能为了重新获得肽单元而被劈开(例如，借助用适当的酶处理)。这能增加被单一启动子驱动的肽的得率。当用在适当的病毒表达系统中的时候，每个用mRNA编码的肽的翻译在转录物中得到内部指导，例如，得到内部核糖体进入部位的指导。因此，多顺反子的构造指导单一的大的多顺反子mRNA的转录，后者依次指导多重个别肽的翻译。这种方法取消多蛋白的生产和酶加工，而且可以大大增加受单一启动子驱动的肽的得率。

各式各样的宿主表达载体系统可以被用来表达在此描述的FcRn结合配体。这些包括但不限于：微生物，例如用包含适当的编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的细菌；用包含适当的编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用包含适当的编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))感染的或用包含适当的编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。各种不同的宿主表达系统是普通技术人员众所周知的，而且宿主细胞和表达载体的元素可从商业来源获得。

表达系统的表达元素在它们的强度和特异性方面改变。依据所利用的宿主/载体系统，包括组成型和诱导型启动子在内的许多适当的转录和翻译元素中的任何一个都可以被用在表达载体中。例如，当在细菌系统中克隆的时候，可以使用诱导型启动子，例如，噬菌体λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac混合型启动子)等等的pL；当在昆虫细胞系统中克隆的时候，可以使用诸如杆状病毒多角体启动子之类的启动子；当在植物细胞系统中克隆的时候，可以使用起源于植物细胞基因组的启动子(例如，热激启动子；用于RUBISCO的小亚基的启动子；用于叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或起源于植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV的外被蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆的时候，可以使用起源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或起源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子)；当产生包含表达产品的多重副本的细胞系的时候，基于SV40、BPV和EBV的载体可以与可适当选择的标记一起使用。

在使用植物表达载体的情况下，本发明给多肽编码的序列表达可以受许多启动子之中任何一个驱动。例如，可以使用诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子之类的病毒启动子(Koziel MG等人(1984)J Mol ApplGenet2：549-62)，或TMV的外被蛋白启动子；作为替代，可以使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚基(CoruzziG等人(1984)EMBO J3：1671-79；Broglie R等人(1984)Science224：838-43)，或热激启动子，例如，大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B(Gurley WB等人(1986)Mol Cell Biol6：559-65)。这些构造能使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、显微注射、电穿孔等以及植物细胞。就这类技术的综述而言，例如，见Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Acadermic Press，NY，Section VIII，pp.421-463；和Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed，Blackie，London，Ch.7-9。

在可以用来表达FcRn结合配体的昆虫表达系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被用作表达外源基因的载体。病毒在草地夜蛾细胞中生长。编码序列可以被克隆到病毒的非必需区(例如，多角体基因)之中并且被置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)的控制之下。编码序列的成功插入将导致多角体基因的失活和非包含体型重组病毒的生产(即，缺乏用多角体基因编码的蛋白质外壳的病毒)。这些重组体病毒然后用来感染插入其中的基因已被表达的草地夜蛾细胞(例如，见美国专利第4,745,051号)。这种表达系统进一步的例子可以在Current Protocols in MolecularBiology，Vol.2，Ausubel等人编辑，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.中找到。

在哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统可以被利用。在腺病毒被用作表达载体的情形中，编码序列可以被接到腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后，这种嵌合基因可以借助体外或体内重组插进腺病毒基因组。插进病毒基因组的非必需区(例如，区域E1或E3)将导致能存活而且能够表达受感染宿主中的肽的重组体病毒(例如，见Logan J等人(1984)Proc Natl Acad Sci USA81：3655-59)。作为替代，牛痘7.5K启动子可以被使用，(例如，见Mackett M等人(1982)ProcNatl Acad Sci USA79：7415-19；Mackett M等人(1984)J Virol49：857-64；Panicali S等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA79：4927-31)。

另外，对于在哺乳动物中使用，宿主细胞是许多真核表达质粒。这些质粒通常包括可操作地与感兴趣的插入基因或核酸链接的启动子或启动子/增强子元件、置于插入基因下游的多腺苷酸化信号、选择标记和复制起点。这些质粒中有一些是为了在指定位置接受核酸插入片段作为PCR产品或限制酶消化产品而设计的。真核表达质粒的例子包括pRc/CMV、pcDNA3.1、pcDNA4、pcDNA6。pGene/V5(Invitrogen)和pED.dC(GeneticsInstitute)。

FcRn结合配体在与抗原缀合的一些实施方案中。抗原如同在本文中使用的那样分成四类：(1)以病原体为特征的抗原；(2)以自身免疫疾病为特征的抗原；(3)以过敏原为特征的抗原；和(4)以癌症或肿瘤为特征的抗原。抗原大体上包括来自细胞表面、细胞质、细胞核、粒线体等等的多糖、糖脂、糖蛋白、肽、蛋白质、碳水化合物和脂类。

以对病原体为特征的抗原包括起源于病毒、细菌、寄生物或真菌的抗原。重要的病原体的例子包括霍乱弧菌、产肠毒素大肠杆菌、轮状病毒、难辨梭菌、志贺氏菌属物种、伤寒杆菌、副流感病毒、流感病毒、肺炎链球菌、布氏疏螺旋体、爱滋病毒、链球菌突变体、恶性疟原虫、金黄色葡萄球菌、狂犬病病毒和EB病毒。

病毒大体上包括但不限于下列各科中的那些：小RNA病毒科、杯状病毒科、囊膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、棒状病毒科、线状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、嗜肝DNA病毒科、细小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科和痘病毒科。

细菌大体上包括但不限于：假单胞菌亚种，包括铜绿假单胞菌和洋葱假单胞菌；埃希氏菌亚种，包括大肠杆菌，E.faecalis；克雷伯氏菌亚种；沙雷氏菌亚种；不动杆菌亚种；链球菌亚种，包括肺炎链球菌、酿脓链球菌、牛链球菌、无乳链球菌；葡萄球菌亚种，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；嗜血菌亚种；奈瑟氏球菌亚种，包括脑膜炎奈瑟氏球菌；类杆菌亚种；柠檬酸杆菌属亚种；布兰汉氏球菌亚种；沙门氏菌亚种；志贺氏菌亚种；巴斯德氏菌亚种，包括巴斯德氏菌；梭状芽胞杆菌亚种；丹毒杆菌亚种；利斯特菌亚种；多杀巴斯德氏菌；链杆菌亚种；螺旋菌亚种；梭菌螺旋体亚种；梅毒螺旋体；疏螺旋体亚种；放线菌；枝原体亚种；衣原体亚种；立克次氏体亚种；螺旋体；军团菌亚种；分枝杆菌亚种，包括结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆、瘰疬分枝杆菌；尿枝原体亚种；链霉菌亚种；和毛滴虫亚种。

寄生物包括但不限于：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫；鼠弓形体；Leishmania mexicana，热带利什曼原虫、主要利什曼原虫、L.aethiopica，杜氏利什曼原虫；克氏锥虫、布氏锥虫、曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、日本体吸虫；旋毛线虫；班氏吴策线虫；Brugiamalayi；溶组织内阿米巴；蛲虫；Taenia solium、无钩绦虫；阴道毛滴虫、人毛滴虫、口腔毛滴虫；肠兰伯氏鞭毛虫；Cryptosporidium parvum；卡氏肺囊虫；牛巴贝虫、B.divergens、B.microti；贝氏等孢子球虫、人等孢子球虫；脆双核阿米巴；旋盘尾丝虫；人蛔虫；美洲钩虫；十二指肠钩虫；粪类圆线虫；Capillaria philippinensis；Angiostrongylus cantonensis；短膜壳绦虫；阔节裂头绦虫；细粒棘球绦虫、E.multilocularis；肺吸虫、P.caliensis；Chlonorchis sinensis；猫后睾吸虫、麝猫后睾吸虫；肝片吸虫、疥螨、人虱；Phthirlus pubis；和人皮蝇。

真菌大体上包括但不限于：新型隐球菌；皮炎芽生菌；Aiellomycesdermatitidis；荚膜组织胞浆菌；Coccidioidesimmitis；念珠菌属种，包括白念珠菌、C.tropicalis、C.parapsilosis、高里氏念珠菌和克柔氏念珠菌；曲霉属种，包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉；根霉菌属种；根毛霉种；小克银汉霉属种；Apophysomyces species，包括A.saksenaea、A.Mucor和A.absidia；申克氏孢子丝菌；巴西芽生菌；Pseudallescheria boydii；Torulopsisglabrata和皮真菌种。

以自身免疫疾病为特征的抗原通常将起源于哺乳动物组织的细胞表面、细胞质、细胞核、粒线体等。例子包括以葡萄膜炎、糖尿病、多发性硬化、全身性红斑狼疮、慢性甲状腺炎、重症肌无力、原发性粘液水肿、甲状腺毒症、类风湿性关节炎、恶性贫血、阿狄孙氏病、硬皮病、自身免疫萎缩胃炎、早熟的绝经期(少数情形)、男性不育症(少数情形)、少年糖尿病、古德帕斯彻氏综合症、寻常天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体葡萄膜炎、自身免疫性溶血贫血、先天性血小板减少性紫斑、先天性白血球减少症、原发胆汁性肝硬变(少数情形)、溃疡性结肠炎、斯耶格伦氏综合症、韦格纳肉芽肿病、多/皮肌炎和盘状红斑狼疮为特征的抗原(例如，S抗原)。人们将理解，以自身免疫疾病为特征的抗原指的是一种抗原，受试者自己的免疫系统制造反对该抗原的抗体或特殊的T细胞，而且那些抗体或T细胞是以自身免疫疾病为特征的。自身免疫疾病的抗原特性的特异性识别在许多情况下是不知道的而且就本发明的目的而言的确不需要知道。

抗原是通常为蛋白质或糖蛋白的过敏原，虽然过敏原也可以是包括在与蛋白质载体共价结合之后诱发过敏反应性的低分子量过敏原的半抗原(Remington’s Pharmaceutical science)。过敏原包括起源于花粉、粉尘、真菌、孢子、毛屑、昆虫和食物的抗原。特定的例子包括诸如毒叶藤、太平洋漆树和美国毒漆树之类野葛的儿茶酚(十五烷基儿茶酚或十七烷基儿茶酚)和豚草和相关植物的倍半类萜内酯。

以肿瘤抗原为特征的抗原通常将起源于肿瘤组织细胞的细胞表面、细胞质、细胞核、细胞器等等。例子包括以肿瘤蛋白质为特征的抗原，包括用突变的致癌基因编码的蛋白质；与肿瘤相关联的病毒蛋白质；和肿瘤粘蛋白和糖脂。肿瘤包括但不限于来自下列癌症部位和癌症类型的那些：唇、鼻咽、咽和口腔、食道、胃、小肠、大肠、结肠、直肠、肝、胆囊、胆汁树、胰、喉、肺脏和支气管、黑色素瘤、乳房、子宫颈、子宫、卵巢、膀胱、肾脏、脑和神经系统其它部分、甲状腺、前列腺、睾丸、骨、肌肉、霍杰金氏病、非霍杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。与肿瘤相关联的病毒蛋白质将是来自前面注意到的病毒纲的那些。以肿瘤为特征的抗原可能是通常不用肿瘤前身细胞表达的蛋白质，或可能是虽然在肿瘤前身细胞中被正常地表达但是有肿瘤的突变特征的蛋白质。肿瘤的抗原特征可能是有修饰活性或亚细胞分布的正常蛋白质的突变型群丛变型。引起肿瘤抗原的基因突变除了前面指定的那些之外可能在基因的编码区域、5′或3′非编码区域或基因内区中，而且可能是点突变、移码、反向、缺失、添加、重复、染色体重排等等的结果。普通技术人员熟知各式各样引起肿瘤抗原的正常基因结构和表达的变化。

肿瘤抗原的具体例子包括：蛋白质，例如B细胞淋巴瘤的Ig-个体基因型；黑色素瘤的突变型依赖细胞周期蛋白的激酶4；黑色素瘤的Pmel-17(gp100)；黑色素瘤的MART-1(Melan-α)(PCT公开W094/21126)；黑色素瘤的p15蛋白质；黑色素瘤的酪胺酸酶(PCT公开W094/14459)；黑色素瘤、甲状腺髓质的小细胞肺癌、结肠和/或支气管鳞状上皮细胞癌的MAGE1、2和3(PCT/US92/04354)；MAGE-Xp(美国专利第5,587,289号)；膀胱、黑色素瘤、乳房和鳞状上皮细胞癌科的BAGE(美国专利第5,571,711号和PCT公开W095/00159)；GAGE(美国专利第5,610,013号和PCT公开W095/03422)；RAGE家族(美国专利第5,939,526号)；PRAME(从前的DAGE；PCT公开W096/10577)；MUM-1/LB-33B；(美国专利第5,589,334号)；NAG(美国专利第5,821,122号)；FB5(endosialin)(美国专利第6,217,868号)；PSMA(前列腺特异性膜抗原；美国专利第5,935,818号)；黑色素瘤的gp75；黑色素瘤的胎性癌抗原；诸如乳房、胰和卵巢癌的粘蛋白之类的碳水化合物/脂类；黑色素瘤的GM2和GD2神经节甙脂；诸如癌的突变型p53之类的致癌基因；结肠癌的突变型ras；乳房癌的HER2/neu原致癌基因；和诸如子宫颈和食道的鳞状上皮细胞癌的人类乳突病毒蛋白质之类的病毒产品。前面的目录仅仅倾向于作为代表，而不应理解为限制。人们还应该注视蛋白质肿瘤抗原可以被HLA分子作为起源于整个蛋白质的特殊的肽呈现出来。产生抗原性肽的蛋白质新陈代谢过程在技术上是众所周知的(例如，见在此通过引证被全部并入的授权给Boon等人的美国专利第5,342,774号)。因此，现在的方法包括抗原型肽和较大的多肽中这样的肽或引起抗原型肽的整个蛋白质的递送。抗原型肽或蛋白质的递送可以引起体液或细胞的免疫性。

通常，受试者能用下面详细说明的一种或多种方法接受有效量的抗原，包括肿瘤抗原，和/或源自那里的肽。起始剂量之后可以遵从技术上免疫程序标准采用加强剂量。包括肿瘤抗原在内的抗原的递送可以这样刺激溶解细胞的T淋巴细胞的增殖。

在蛋白质和肽治疗剂的情况下，与FcRn结合配体连接的共价键倾向于包括在单一的多肽链中用肽键连接。已建立的方法(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY1989，在此通过引证将其内容全部并入)将用来设计给由蛋白质或肽治疗剂和FcRn结合配体组成的融合蛋白质编码的DNA。这种DNA将用已建立的方法放进表达载体并且引进细菌的，真核状态的或其它适当的宿主细胞。融合蛋白质将用已建立的方法从细胞或培养基纯化。纯化方案可以方便地使用分离的或重组的蛋白质A或蛋白质G来纯化来自宿主细胞产品的包含FcRn结合配体的融合蛋白质。这样产生的共轭物包括FcRn结合配体对蛋白质、肽或蛋白质衍生物(例如，在此列出的那些，包括但不限于抗原、过敏原、病原体)或有潜在治疗利益的其它的蛋白质或蛋白质衍生物(例如，生长因子、集落刺激因子、生长抑止因子、信号分子、激素、类固醇、神经递质或当越过上皮屏障递送的时候将会有用的形态发生素)的融合。

作为例子但不是限制，在融合蛋白质中用来合成共轭物的蛋白质可以包括EPO(美国专利第4,703,008；5,457,089；5,614,184；5,688,679；5,773,569；5,856,298；5,888,774；5,986,047；6,048,971；6,153,407号)、IFN-α(美国专利第4,678,751；4,801,685；4,820,638；4,921,699；4,973,479；4,975,276；5,098,703；5,310,729；5,869,293；6,300,474号)、IFN-β(美国专利第4,820,638；5,460,811号)、FSH(美国专利第4,923,805；5,338,835；5,639,639；5,639,640；5,767,251；5,856,137号)、源自血小板的生长因素(PDGF；美国专利第4,766,073号)、源自血小板的内皮细胞生长因素(PD-ECGF；美国专利第5,227,302号)、人类垂体腺生长激素(hGH；美国专利第3,853,833号)，TGF-β(美国专利第5,168,051号)、TGF-α(美国专利第5,633,147号)、角化细胞生长因素(KGF；美国专利第5,731,170号)、类胰岛素生长因子I(IGF-1；美国专利第4,963,665号)、表皮生长因子(EGF；美国专利第5,096,825号号)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；美国专利第5,200,327号)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF；美国专利第5,171,675号)、集落刺激因子-1(CSF-1；美国专利第4,847,201号)、青灰因子、降血钙素、AP-1蛋白质(美国专利第5,238,839号)、因子VIIa，因子VIII、因子IX、TNF-α、TNF-α受体、LFA-3、CNTF、CTLA-4、leptin(PCT/95/10479，WO96/05309)和源自脑的神经营养因子(BDNF；美国专利第5,229,500号)。前面引证的全部参考文献都在此通过引证被全部并入。

作为例子但不作为限制，在融合蛋白质中用来合成共轭物的肽可以包括红细胞生成素拟态的肽(EPO受体兴奋剂肽；PCT/US01/14310；WO01/83525；Wrighton NC等人(1996)Science 273：458-64；PCT/US99/05842，WO99/47151)、EPO受体拮抗剂肽(PCT/US99/05842，WO99/47151；Mc Connell SJ等人(1998)Biol Chem379：1279-86)和T20(PCT/USOO/35724；WO01/37896)。

在优选实施方案中，本发明的融合蛋白质是这样构造和安排的，以致共轭物的FcRn结合配体部分出现在治疗制剂部分的下游，即，FcRn结合配体部分相对于治疗制剂部分是C-末端的。这种安排以速记方式被表达为X-Fc，其中“X”代表治疗制剂部分，而Fc代表FcRn结合配体部分。在这种速记符号中，“Fc”可以是但不限于IgG的Fc片段。符号“X-Fc”将被理解为包括其中呈现把X成份参加粘合与FcRn结合配体成份结合起来的连接体的融合蛋白质。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白质有这样的构造，其中共轭物由融合到在此列出的多肽治疗制剂之一上的人类IgGl的Fc片段组成(在铰合部的N-末端以氨基酸D-K-T-H为起点(见SEQ ID NO：2，图1)，包括铰合部和C_H2域而且在C_H3域中通过S-P-G-K序列继续)。在一个优选实施方案中，给功能性EPO编码的核苷酸序列在适当的翻译读框5′中被融合到给人类IgGl的恒定不变的重(C_H)链的铰合部、C_H2域和C_H3域编码的核苷酸序列上。这个优选实施方案在实施例3中予以更详细的描述。

公开的欧洲专利申请EP 0464533A揭示EPO-Fc融合蛋白质。

公开的PCT申请PCT/US00/19336(WO01/03737)揭示人类EPO-Fc融合蛋白质。

公开的PCT申请PCT/US98/13930(WO99/02709)揭示EPO-Fc和Fc-EPO的融合蛋白质。

公开的PCT申请PCT/EP00/10843(WO01/36489)揭示若干Fc-EPO的融合蛋白质。

公开的PCT申请PCT/US00/19336(WO01/03737)揭示人类IFN-α-Fc融合蛋白质。

授权给Chang等人的美国专利第5,723,125号揭示人类的IFN-α-Fc融合蛋白质，其中IFN-α域和Fc域通过特定的Gly-Ser连接体(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser；SEQ ID NO：17)连接起来。

公开的PCT申请PCT/USOO/13827(WO00/69913)揭示一种Fc-IFN-α融合蛋白质。

公开的PCT申请PCT/US00/19336(WO01/03737)揭示人类IFN-β-Fc融合蛋白质。

公开的PCT申请PCT/US99/24200(WO00/23472)揭示人类IFN-β-Fc融合蛋白质。

授权给Chang等人的美国专利第5,908,626号揭示人类的IFN-β-Fc融合蛋白质，其中IFN-β域和Fc域通过特定的Gly-Ser连接体(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser；SEQ ID NO：17)连接起来。

授权给Lo等人的美国专利第5,726,044号和公开的PCT申请PCT/US00/19816(WO01/07081)揭示Fc-PSMA融合构造。

FcRn结合配体可以被缀合到多种用于定向全身性递送的治疗制剂上。本发明包括生物活性物质的定向全身性递送。

如同在本文中使用的那样，术语“生物活性物质”指的是真核细胞和原核细胞、病毒、载体、蛋白质、肽、核酸、多糖和碳水化合物、脂类、糖蛋白以及它们的组合，和当对动物给药的时候施加生物效应的自然发生的、合成的和半合成的有机和无机药物。为了易于参考，该术语也用来包括可检测的化合物，例如，包括钡的不透射线化合物，以及磁性化合物。生物活性物质在水中可以是可溶的或不溶的。生物活性物质的例子包括抗血管生成因子、抗体、生长因子、激素、酶和诸如类固醇、抗癌药和抗生素之类的药物。

在诊断实施方案中，FcRn结合配体也可以被缀合到药学上可接受的发射γ射线的部分上，包括但不限于铟和锝、磁性颗粒、诸如钡之类不透射线物质和萤光化合物。

作为例子但不作为，下述类别的药物可以为了越过肺的上皮屏障全身性递送被缀合到FcRn结合配体上：

抗肿瘤化合物：硝基脲，例如，氯化亚硝脲、环己亚硝脲、甲环亚硝脲、链脲霉素；甲苄肼，例如，甲基苄肼、卡巴咪唑；类固醇激素，例如，糖皮质激素、雌激素、孕激素、雄激素、tetrahydrodesoxycaricosterone、细胞因子和生长因素；天冬酰胺酶。

免疫活性化合物：免疫抑制剂，例如，乙胺嘧啶、三甲氧蝶呤、青霉胺、环胞菌素、硫唑嘌呤；免疫刺激剂，例如，左旋咪唑、二乙基二硫氨基甲酸酯、脑啡肽、内啡肽。

抗微生物化合物：抗生素，例如，青霉素、头孢菌素、碳青霉烯和单环内酰胺，β-内酰胺酶抑制剂，氨基糖苷、大环内酯、四环素、壮观霉素；抗疟药；杀阿米巴药；抗原生动物制剂；抗霉制剂，例如，两性霉素B；抗病毒制剂，例如，无环鸟苷、碘苷、病毒唑、三氟脲苷、阿糖腺苷、9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤。

胃肠药物：组胺H₂受体拮抗剂、质子泵抑制剂、promotility制剂。

血液学化合物：免疫球蛋白；凝血蛋白；例如，抗血友病因子、因子IX复合体；抗凝剂，例如，双香豆素、肝素Na；费布罗利辛(fibrolysin)抑制剂、凝血酸。

心血管药物：周边抗肾上腺素功能的药物、中心起作用的抗高血压药物，例如，甲基多巴、盐酸甲基多巴；抗高血压的直接血管扩张剂，例如，氯甲苯噻嗪、盐酸肼苯哒嗪；影响肾素-血管紧缩素系统的药物；周边血管舒张剂、酚妥胺；抗心绞痛药物；强心甙；inodilators；例如，氨吡酮、甲氰吡酮、依诺西酮、甲硫咪唑酮、imazodan、sulmazole；抗节律紊乱药；钙进入阻滞剂；影响血脂的药物。

神经肌肉阻断剂：去极化，例如，阿曲库铵苯磺酸盐、溴化己芴胺、碘甲筒箭毒、氯化琥珀胆、氯化筒箭毒碱、维库溴铵；中心起作用的肌肉弛缓药，例如，氯苯氨丁酸。

神经递质和神经递质剂：乙酰氯、阿糖腺苷、三磷酸腺苷钠、氨基酸神经递质，例如，刺激性氨基酸、GABA、甘氨酸；生物胺神经递质，例如，多巴胺、肾上腺素、组织胺、去甲肾上腺素、对羟苯-β-羟乙胺、5-羟色胺、酪胺；神经肽、一氧化氮、K+通道毒素。

抗帕金森药物：盐酸金刚胺、甲磺酸苄托品、例如，卡比多巴。

利尿剂：双氯磺酰胺、甲醋唑胺、苄氟噻嗪、多噻嗪。

抗偏头痛药：舒马曲坦。

激素：垂体激素，例如，绒膜促性腺激素、二十四肽促皮质素、绝经促性素、生长激素、iorticotropin、促甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、抗利尿激素、赖氨酸加压素；肾上腺素激素，例如，倍氯美松双丙酸酯、倍他米松、地塞米松、去炎松；胰腺的激素，例如，胰高血糖素、胰岛素；甲状旁腺激素，例如，dihydrochysterol；甲状腺激素，例如，降钙素羟乙二磷酸二钠、甲状腺素钠、碘甲腺氨酸钠、liotrix，甲状腺球蛋白，teriparatideacetate；抗甲状腺的药物；雌激素；孕激素和拮抗药、荷尔蒙避孕药、睾丸激素；胃肠激素：胆囊收缩素、肠多糖、galanin，肠抑胃肽、表皮生长因子-尿抑胃素、肠抑胃肽、胃泌素释放肽，胃泌素，五肽胃泌素、四肽胃泌素、促胃动素、肽YY、促胰液素、血管活性肠肽、sincalide；勒帕茄碱。

酶：透明质酸酶、链激酶、组织纤溶酶原活化剂、尿激酶、PGE-腺嘌呤核苷脱氨酶。

静脉注射的麻醉药：氟哌利多、甲苄咪唑、柠檬酸芬太尼/氟哌利多、环己烯巴比妥、氯胺酮HCl、甲己炔巴比妥钠、硫戊巴比妥钠、戊硫巴比妥钠。

抗癫痫药：酰胺咪嗪、氯硝西泮、双丙戊酸钠、乙琥胺、甲基妥因、乙甲双酮、苯妥英、去氧苯巴比妥。

肽和蛋白质：FcRn结合配体可以缀合到肽或多肽上，例如，锚蛋白、视紫红质抑制蛋白、细菌膜蛋白、网格蛋白、[间隙连接]连接蛋白、肌营养不良蛋白、内皮缩血管肽受体、血影蛋白、选择蛋白、细胞因子、趋化因子、生长因子、胰岛素、红细胞生成素(EPO)、肿瘤坏死因子(TNF)、CNTF、神经肽、神经肽Y、神经降压肽、TGF-α、TGF-β、干扰素(IFN)、激素、生长抑制剂，例如，染料木黄酮、类固醇等；糖蛋白，例如，ABC转运蛋白、血小板糖蛋白、GPIb-IX复合体，GPIIb-IIIa复合体、因子VIIa、因子VIII、因子IX、玻连蛋白、凝血调节蛋白、CD4、CD55、CD58、CD59、CD44、CD152(CTLA-4)、淋巴细胞功能相关抗原(LFA)、胞间粘着分子(ICAM)、血管细胞粘着分子(VCAM)、Thy-1、antiporters、CA-15-3抗原、纤连蛋白、层粘连蛋白、髓鞘相关糖蛋白、GAP、GAP-43和上述物质的粘合受体和反受体的结合部分。在本发明的这个实施方案中，多肽治疗剂可以被共价地缀合到FcRn结合配体上，或FcRn结合配体和治疗剂可以使用标准的基因重组技术被表示成融合蛋白质。

细胞因子和细胞因子受体：依照本发明可以经由FcRn结合配体递送的或缀合到FcRn结合配体上的细胞因子及其受体的例子包括但不限于：白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1受体、IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-8受体、IL-9受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-14受体、IL-15受体、IL-16受体、IL-17受体、IL-18受体、淋巴因子的抑制因子(LIF)、M-CSF、PDGF、干细胞因子、转化生长因子β(TGF-βs)、TNF、TNFR、淋巴毒素、Fas、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。

生长因子和蛋白质激素：依照本发明可以经由FcRn结合配体递送的或缀合到FcRn结合配体上的生长因子及其受体和蛋白质激素及其受体的例子包括但不限于：EPO、血管生成素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、角化细胞生长因子、神经生长因子、肿瘤生长因子α、血小板生成素(TPO)、甲状腺刺激因子、甲状腺释放的激素、神经营养蛋白、表皮生长因子、VEGF、睫状神经营养因子、LDL、生长调节素、胰岛素生长因子、胰岛素样生长因子I和II。

趋化因子：依照本发明可以经由FcRn结合配体递送的或缀合到FcRn结合配体上的趋化因子及其受体的例子包括但不限于：ENA-78、ELC、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、HRG、LIF、IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-lα、M1P-1β、MIG、MDC、NT-3、NT-4、SCF、LIF、勒帕茄碱、RANTES、lymphotactin、eotaxin-1、eotaxin-2、TARC、TECK、WAP-1、WAP-2、GCP-1、GCP-2、α-趋化因子受体：CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、β-趋化因子的受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7。

化疗制剂：FcRn结合配体可以被缀合到对包括白血病、淋巴瘤、癌、肉瘤、骨髓瘤等等在内的各种不同类型的人类及其它癌症有效的诸如阿霉素、丝裂霉素、顺二氯二氨铂、柔红霉素、博莱霉素、放线菌素D、新制癌素、长春碱、长春新碱、太平洋紫杉素之类的化疗剂或抗肿瘤药上。

抗病毒药：FcRn结合配体可以被缀合到诸如逆转录酶抑制剂和核苷类似物(例如，ddI、ddC、3TC、ddA、AZT)；蛋白酶抑制剂(例如、Invirase、ABT-538)；在RNA加工中的抑制剂(例如，三氮唑核苷)；和细胞融合抑制剂(例如，T-20)之类的抗病毒药上，(Kilby JM等人，(1998)Nat Med.4：1302-7)。

核酸：FcRn结合配体可以被缀合到诸如抗过敏低聚核苷酸和基因置换核酸之类的核苷酸分子上。在涉及核酸共轭物的实施方案中，人们相信优选的是把可劈开的连接体包括在核酸和FcRn结合配体之间以致核酸能成为细胞内可得的。例如，抗过敏的低聚核苷酸包括但不限于：anti-PKC-α、anti-ICAM-1、anti-H-ras、anti-Raf、anti-TNF-α、anti-VLA-4、anti-clusterin(全来自Isis Pharmaceuticals，Inc.)和anti-Bcl-2(GENASENSE^TM；Genta，Inc.)。

已知可以经由FcRn结合配体递送的治疗剂的具体的例子包括但不限于：

(a)卡托普利、福森普利、帕伐他丁、Avapro、Plavix、头孢齐尔、头孢羟氨苄/羟氨苄头孢菌素、氨曲南Azactam、Videx、Zerit、头孢吡肟、足叶乙苷、卡铂、顺铂、太平洋紫杉素、喃氟啶尿嘧啶、丁螺环酮、Serzone、StadolNS、Estrace、二甲双胍(Bristol-Myers Squibb)；

(b)头孢克罗、氯拉卡比、地红霉素、氟西汀、达而丰、培高利特、Zyprexa、Humalog、尼扎替丁、Gemzar、Evista(EliLilly)；

(c)依那普利/恩那普利、洛伐他丁、塞伐他丁、赖诺普利/Prinizide、非洛地平、Cozaar/Hyzaar、法莫替丁、Prilosec、普立马辛、诺氟沙星、RecombivaxHB、娃力瓦克、噻吗洛尔/XE、Trusopt、芬甾酮、阿仑特罗、Sinemet、Crixivan、Propecia、Vioxx、Singulair、Maxalt、异阿凡曼菌素(Merck & Co)；

(d)氟康唑、舒巴克坦钠-氨苄西林、Sulperazon、阿齐红霉素、Trovan、硝苯地平XL、多沙唑嗪、氨氯地平、Dofetilide、炎痛喜康、舍曲林、Zeldox、GlucotrolXL、西替立嗪、Eletriptan、Viagra、Droloxifene、Aricept、Lipitor(Pfizer)；

(e)头孢多肟吡呋酯、Rescriptor、Vistide、基因重组人生长激素、格列本脲/Glyn./Glyb.、替地肝素、Total Medrol、阿普唑仑/甲基三唑安定、麦角溴烟酯、三唑仑/甲基三唑氯安定、Freedox、Dostinex、Edronax、Mirapex、表阿霉素、阿霉素、Camptosar、Remisar、甲羟孕酮、Caverject、Detrusitol、Estring、Healon、Xalatan、Rogaine(Pharmacia & Upjohn)；

(f)吉非洛齐、Accrupil、大他丁、他克林、加巴喷丁、醋炔诺酮、Dilzem、Fempatch、Estrostep、Rezulin、Lipitor、Omnicef、FemHRT、Suramin、克林沙星(Warner Lambert)。

可以借助本发明的FcRn结合配体递送的治疗制剂的进一步的例子可以在通过引证被全部并入的Goodman和Gilman的“The PharmaceuticalBasis of Therapeutics”(9^th ed.McGraw-Hill 1996)中找到。

在给药的时候、本发明的共轭物是按药学上可接受的制剂给药的。这样的制剂通常可以包含药学可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、兼容的载体、诸如辅药和细胞因子之类补充免疫增强剂和非必选的其它治疗制剂。因此，包括共轭物和制剂的“鸡尾酒”受到关注。治疗制剂本身被缀合到FcRn结合配体上，以增强治疗制剂越过肺的上皮屏障的递送。

本发明的共轭物可以以纯化的形式或以药学可接受的盐的形式给药。在药中使用的时候，盐应该是药学上可接受的，而非药学上可接受的盐可以方便地被用来制备药学上可接受的盐而且不被排除在本发明的范围之外。这样的药学上可接受的盐包括但不限于从下列的酸制备的那些：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，药学上可接受的盐可以作为碱金属或碱土金属的盐来制备，例如，羧酸族的钠盐、钾盐或钙盐。

适当的缓冲剂包括：醋酸和醋酸盐(1-2％w/v)；柠檬酸和柠檬酸盐(1-3％w/v)；硼酸和硼酸盐(0.5-2.5％w/v)；碳酸氢钠(0.5-1.0％w/v)；以及磷酸和磷酸盐(0.8-2％w/v)。适当的防腐剂包括洁尔灭(0.003-0.03％w/v)；三氯叔丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。

在本文中使用的并且在下面将予以更完全的描述的术语“载体”意味着一种或多种适合对人类或其它哺乳动物给药的固体或液体的填料、稀释剂或胶囊物质。“载体”可以是与活性成份合并以利于给药的天然的或合成的有机的或无机的成份。

药学组合物的成份能够以这样的方式与本发明共轭物彼此混合，以致没有将会实质上损害预期的药学效能的相互作用。在某些实施方案中，气溶胶配方的成份包括已溶解的活性成份，和非必选的适合溶液配方的抗氧化剂、混合溶剂和压缩气体；微粉化的和悬浮的活性成份，和非必选的适合悬浮液配方的分散剂和压缩气体。

术语“辅药”倾向于包括被并入本发明的共轭物或与本发明的共轭物同时给药的而且并非特异性地加强受试者的免疫反应的任何物质。辅药包括铝的化合物，例如，凝胶、氢氧化铝和磷酸铝，和Freund的完全的或不完全的辅药。(其中共轭物被并入已稳定的水/石蜡油乳液中的水相)。石蜡油可以用不同类型的油代替，例如，角鲨烯或花生油。有辅药性质的其它材料包括BCG(稀释的牛分枝杆菌)、磷酸钙、左旋咪唑、异丙肌苷、聚阴离子(例如，聚A：U)、leutinan、百日咳菌外毒素、霍乱菌外毒素、类脂A、皂素和肽，例如，胞壁酰二肽。稀土金属(例如，镧和铈)的盐也可以作为辅药使用。辅药的数量取决于受试者和所用的共轭物，而且能由普通技术人员毫不迟疑地决定无需过分的实验。

其它补充的免疫增强剂(例如，细胞因子)可以连同本发明的共轭物一起递送。在一个实施方案中，细胞因子与本发明的共轭物分开给药，以便补充治疗。在另一个实施方案中，细胞因子是缀合到FcRn结合配体上给药的。被注视的细胞因子是将增强由于依照本发明的FcRn结合配体共轭物的给药产生的有益效果的那些。特别优选的细胞因子是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2和TNF-α。其它有用的细胞因子和相关的分子被认为是IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、白血病抑制因子、制癌蛋白-M、睫状神经营养因子、生长激素、催乳激素、CD40配体、CD27配体、CD30配体和TNF-β。其它依照本发明以有可能有用的方式调整T细胞活性的已知的细胞因子是集落刺激因子和生长因子，包括粒细胞和/或粒细胞巨噬细胞的集落刺激因子(CSF-1，G-CSF和GM-CSF)和源自血小板的、表皮性的和像胰岛素一样的转化因子和成纤维细胞生长因子。特定的细胞因子的选择将取决于所需要的免疫系统的特殊调整。细胞因子关于特定的细胞类型的活性是普通技术人员已知的。

上述的用于本发明的细胞因子的精确数量将取决于多种因素，包括选定的共轭物、选定的剂量数量和剂量时间安排、给药的模式和受试者的特征。选定的精确数量不需要过度的实验就能确定，尤其因为底限数量将是将会增强所需要的免疫反应的任何数量。因此，一般相信纳克到毫克数量的细胞因子是有用的，取决于递送模式，但是纳克到微克的数量有可能最有用，因为细胞因子的生理水平是相当低的。

本发明的制剂是按有效数量给药的。“有效数量”是共轭物在需要时将单独或连同进一步的剂量一起刺激治疗反应的数量。在本文中使用的“治疗有效数量”是共轭物在需要时将单独或连同进一步的剂量一起刺激治疗反应的数量。在各种不同的实施方案中，这可以包括受试者的疾病、失调或症状的征兆或症状的预防、减轻或稳定。

FcRn结合配体共轭物在依照本发明制成的所有药学制剂中的优选数量应该是它的治疗有效数量，这也是它医学上可接受的数量。在本发明的药学组合物中FcRn结合配体共轭物的实际剂量水平可能是变化的，以便获得能有效地实现对特定的患者、FcRn结合配体共轭物的药学组合物和给药模式预期的治疗反应而且对患者没有毒性的FcRn结合配体共轭物的数量。

本发明的共轭物的选定的剂量水平和给药频率将取决于多种因素，包括包含FcRn结合配体共轭物的治疗剂的给药方法、给药时间、排泄和新陈代谢的速率、治疗的持续时间、与FcRn结合配体共轭物结合使用的其它药物、化合物和/或材料、正在接受治疗的患者的年龄、性别、体重、症状、一般健康状况和以前的病史以及医学的技术上众所周知的相似的因素。例如，剂量控制有可能因怀孕女人、保姆和孩子相对于健康成人有所改变。选定的精确数量不需要过度的实验就能确定，尤其因为底限数量将是将影响预期的治疗反应的任何数量。因此，一般相信纳克到毫克数量是有用的，取决于特定的治疗制剂和受试者的症状，但是纳克到微克数量有可能是最有用的，因为治疗制剂的生理和药理水平都相当低。

一般地说，相信适合本发明的共轭物的中央气道肺部给药的剂量将会落在10ng/kg到500μg/kg的范围内。例如，0.1-10μg/kg的剂量被认为对IFN-α-Fc是有用的，而剂量1-100μg/kg对EPO-Fc是有用的。在一些例证中，超过25毫克的剂量可能是最好按分开的剂量制造的。

本领域技术人员的医师能毫不迟疑地决定和开出必需的治疗有效量的药学组合物的药方。例如，医师可能从将比实现预期的治疗效果所需要的水平低的FcRn结合配体共轭物剂量用在本发明的药学组合物中开始，然后逐渐增加剂量直到实现预期的效果为止。

组合物可以方便地以单位剂量形式提供，而且可以用药房的技术上众所周知的任何方法制备。所有的方法都包括使共轭物与组成一种或多种附属组份的载体结合的步骤。一般地说，组合物是通过使共轭物与液体载体、磨碎的固体载体或两者均匀地紧密结合制备的，然后，如果必要，使产品成形。

递送系统可以包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统。这样的系统能避免本发明的共轭物的重复给药，从而进一步为受试者和医师提供方便。许多类型的释放递送系统对于普通的技术人员是可得的和已知的。它们包括基于聚合物的系统，例如，聚乳酸和聚羟基乙酸、聚酐和聚己酸内酯、腊涂料等等。

就适合吸入的给药而言，本发明的共轭物能以气溶胶的形式方便地递送。如同前面注意到的那样，气溶胶能从与适当的压缩气体(例如，含氯氟烃、氢化氯氟烃、氢化氟碳化合物和包括二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷的碳氢化合物或其它适当的压缩气体)一起使用的增压包装或吸入器中产生。在优选的实施方案中，气溶胶是通过使包含共轭物的溶液或悬浮液与压电晶体之类和适当的能源连接的振动元件接触产生的。优选的是气溶胶包含并且实质上以它们自然的未变性的形式递送共轭物。在增压的气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门计量递送数量来确定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊和药筒可以被配制成包含化合物和诸如乳糖或淀粉之类适当的粉体成份的粉状混合物。

参照下面的非限制性的实施例可以进一步理解本发明。

实施例

材料：SATA，N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯；硫代-LC-SPDP，硫代琥珀酰亚胺基6-[3′-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酸酯；和硫代-SMCC，硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯都是从Pierce(Rockford，IL)购买的。BALB/c小鼠是从Charles River Laboratories(Wilmingto，MA)购买的。

酶和细胞：所有的限制酶和修饰酶都是从New EnglandBiolabs(Beverly，MA)或InVitrogen(GIBCO，Gaithersburg，MD)购买的，而且是依照制造商的流程使用的。Vent聚合酶是从New EnglandBiolabs(Beverly，MA)获得的，而Expand聚合酶来自Roche MolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)，而且两者都是在它们的制造商提供的缓冲液中与镁一起使用的。虾碱性磷酸酶(SAP)是从Roche MolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)购买的。所有的低聚核苷酸都是由Integrated DNA Techn ologies，Inc-(Coralville，IA)合成和纯化的。DH5α感受态细胞是从InVitrogen(GIBCO，Gaithersburg，MD)购买的，而且是依照制造商的流程使用的。

表达载体：哺乳动物表达载体pED-dC是从GeneticsInstitute(Cambridge，MA)获得的。这种起源于Kaufman RJ等人(1991)在Nucleic Acid Res 19：4485-90中描述的pED4的载体包含被普遍用于适合有效转录的表达载体中的腺病毒主要晚期启动子和提高RNA稳定性和输出的IgG基因内区。该载体还包含腺病毒mRNA前导序列、EMC病毒5′UTR(核糖体进入序列)、SV40polyA信号和腺病毒稳定性元素，以便提高RNA水平并因此导致靶蛋白更大的表达。该载体还包含适合在细菌中生长的复制的colEl起始点以及适合细菌中的氨比西林选择的β-内酰胺酶的基因。最后，该载体给双顺反子(dicistronic)信息编码。第一个顺反子将是靶蛋白，而第二个顺反子是小鼠的二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。dhfr基因考虑到双顺反子信息在dhfr-不足的细胞系中的选择和放大。SchimkeRT(1984)Cell 37：705-13；Urlaub G等人(1986)Somat Cell Mol Genet12：555-566。

DNA模板：载体A₂E/X是由H.Ploegh(Massachusetts Institute ofTechnology，Cambridge，MA)友情提供的，wt EPO-Fc是亲切地由WayneLencer(Harvard Medical School，Boston，MA)提供的。成年的肾cDNA是从Clontech(Palo Alto，CA)购买的。pGEM-T Easy载体是从Promega(Madison，WI)购买的。

低聚核苷酸引物：下列的低聚核苷酸(从左到右展示5′到3′)被用于EPO-Fc表达载体的组成。每个引物中为给相应的cDNA分子或模板退火而设计的部分都有下划线。

PKF：aaaactgcagaccaccatggtaccgtgcacg (SEQ ID NO：18)

KXR：cgtctagagccggcgcgggtctgagtcgg (SEQ ID NO：19)

FCGF：aagaattcgccggcgccgctgcggtcgacaaaactc (SEO ID NO：20)

FCGRM：ttcaattgtcatttacccggagacaggg (SEQ ID NO：21)

EPO-F：aatctagagccccaccacgcctcatctgtgac (SEQ ID NO：22)

EPO-R：ttgaattctctgtcccctgtcctgcaggcc (SEQ ID NO：23)

EPS-F：gtacctgcaggcggagatgggggtgca (SEQ ID NO：24)

EPS-R：cctggtcatctgtcccctgtcc (SEQ ID NO：25)

PCR扩增：聚合酶链式反应是在Idaho Technology RapidCycler或MJ Reseach PTC-200 Peltier Thermal Cycler中完成的。

DNA分离和纯化：PCR产品和所有的限制酶消化都曾经历电泳，而对应于正确尺寸的DNA带是从琼脂糖凝胶切断的；这样切断的DNA是使用Qiagen DNA纯化装备(Valencia，CA)遵照制造商的流程纯化的。来自Life Technologies(Rockville，MD)的1Kb DNA梯或1Kb Plus DNA梯被用于确定DNA片段的大小。洗提后DNA的浓度是借助在琼脂糖凝胶上显象或测量OD₂₆₀估计的。

连接反应和转化作用：连接反应是使用T4DNA连接酶依照已建立的流程(New England Biolabs，Beverly MA)(Sambrook等人(1989)MolecularCloning：A Laboratory Mannual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)或使用Rapid DNA连接装备(Roche，Indianapolis，IN)依照制造商的流程完成的。连接反应产品被用于依照已建立的流程转化大肠杆菌毒株DH5。Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，Second Edition，Cold SpringHarbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press。

DNA排序：双链质粒DNA的序列是用在Dana Farber MolecularBiology Core Facilities(Boston，MA)或Veritas，Inc.分子的生物学[噬菌体]髓部设备或真理，公司(Rockville，MD)完成的双脱氧测序确定的。序列是使用SeqMan(DNAStar，Madison，WI)编译的，而附加的DNA分析是使用程序(DNAStar，Madison，WI)的LaserGene Suite或VectorNTI(Informax，Gaithersburg，MD)完成的。

表达：表达结构被转染到Chinese Hamster Ovary(CHO)dhfr-不足的(dhfr-)细胞系之中。稳定的转染细胞系被产生。为了提高EPO-Fc表达水平，EPO-Fc基因是通过增加生长培养基中的氨甲蝶呤浓度放大的。

实施例1：人类免疫球蛋白G的制备

为了制备在与本发明的化合物(例如，抗原或治疗制剂)接合时使用的人类的IgG或人类的IgG片段，下列的方法可以被采用。纯化的非特异性的人类IgG可以从厂商(例如，Sigma Chemical Co.，Pierce Chemical，HyClone Laboratories，ICN Biomedicals和OrganonTeknika-Cappel)处购买。

免疫球蛋白G也可以借助血清的硫酸铵沉积反应分离。蛋白质沉积物是借助离子交换层析或凝胶过滤层析进一步分级分离的，以便分离出实质上纯化的非特异性IgG。所谓的非特异性IgG指的是没有单一抗原特异性在抗体总体或池内占优势。

免疫球蛋白G也可以借助对诸如蛋白质A-琼脂糖(Pharmacia)、AvidChrom-A蛋白(Sigma)或蛋白质G-琼脂糖(Sigma)之类附着到固相支持体上的蛋白质A的吸附作用被纯化。其它的IgG纯化方法对于熟悉本技术的人是众所周知的而且可以被用于分离非特异性IgG。

为了制备人类IgG的Fc片段，经过分离或纯化的IgG依照制造商推荐的流程与固定的木瓜蛋白酶(Pierce)一起经受消化。其它消化IgG产生能与Fc受体结合的完好无缺的Fc片段的蛋白酶，例如，纤蛋白溶酶(Sigma)或固定化的无花果蛋白酶(Pierce)对于本领域技术人员是已知的，而且可以用来制备Fc片段。然后，经消化的免疫球蛋白与诸如蛋白A-琼脂糖或蛋白G-琼脂糖之类亲和基质一起孵化。IgG的非粘合部分通过逐批或逐柱地彻底洗涤从亲和基质中被洗提出来。然后，IgG的Fc片段通过添加与Fc-吸附剂束缚不相容的缓冲液被洗提出来。在Fc片段的纯化中有效的其它方法也可以被使用。

实施例2：化合物对人类的免疫球蛋白Fc片段的接合作用

为了借助FcRn转运机制递送化合物，这样的化合物能与整个的IgG或Fc片段偶联。就这样的目的而言，交联试剂和有效试剂的化学在技术上是众所周知的。用来缀合待递送的整个的IgG或Fc片段和化合物的交联试剂的性质不受本发明的限制。任何交联剂都可以使用，只要化合物的活性得以保持而且共轭物的Fc部分的FcRn的粘合不受不利的影响即可。

Fc和化合物有效的一步交联的实例是在磷酸钠缓冲液中用高碘酸钠在室温下将Fc氧化30分钟，然后与待缀合的化合物一起在4℃下通宵孵化。接合作用也可以通过化合物和Fc片段两者与sulfo-LC-SPDP一起在室温下衍生18小时得以完成。共轭物也可以通过将待递送的Fc片段和需要的化合物与随后将形成共价键的不同的交联试剂一起衍生来制备。这个反应的实例是Fc片段与sulfo-SMCC一起和待缀合到Fc上的化合物的衍生是用SATA硫醇化的。衍生的诸如成份经过纯化去掉交联剂而且在室温下结合一小时以允许交联。包括醛、酰亚胺、氰基、卤素、羧基、活性羧基、酐和马来酰亚胺官能团的其它的交联试剂对于普通技术人员是已知的，而且也可以用于化合物对Fc片段的缀合。当然，交联试剂的选择将取决于需要缀合到Fc上的化合物的性质。上述的交联试剂对于蛋白质-蛋白质接合是有效的。如果要缀合的化合物是碳水化合物或有碳水化合物部分，那么诸如ABH、M2C2H、MPBH和PDPH之类杂二官能团的交联试剂对于与蛋白质类的FcRn粘合分子(Pierce)的接合是有用的。蛋白质和碳水化合物的另一种缀合方法是由Brumeanu等人(Genetic Engineering News，October，1，1995，p.16)揭示的。如果待缀合的化合物是脂或有脂类部分便作为用于FcRn粘合分子的缀合部位，那么诸如SPDP、SMPB及其衍生物之类的交联剂可以被使用(Pierce)。借助非共价键方式缀合任何要递送的分子也是可能的。一种便于实现非共价键缀合的方法是用技术上众所周知的方法产生待递送的化合物的抗体，例如，单株抗体，以及选择有正确的Fc区域和需要的抗原粘合性质的单株抗体。然后，要递送的抗原或治疗制剂被预先键合到单株抗体载体上。在上述的全部交联反应中，重要的是纯化衍生的化合物去掉交联试剂。另外，纯化最后的共轭物彻底去掉未缀合的反应物也很重要。纯化可以基于共轭物中的任一成份的性质借助亲和力、凝胶过滤或离子交换层析来完成。特别优选的方法是最初的亲和力纯化步骤使用A蛋白-琼脂糖来保有Fc和Fc-化合物缀合，接下来基于Fc共轭物的质量、大小或电荷进行凝胶过滤或离子交换层析。这个纯化方案的初始步骤保证共轭物将粘合到作为本发明的基本要求的FcRn上。

实施例3：一般用途的X-Fc表达载体的构造

K^b信号肽考虑到许多不同的可能与Fcγl融合的蛋白质的有效生产和分泌。所以，一般用途的X-Fc表达载体是通过把在Fcγl的铰合区域中靠13-氨基酸肽连接体与天冬氨酸221(D221，EU编号)融合的K^b信号肽组成的表达盒(GSRPGEFAGAAAV；SEQ ID NO：26)插入pED.dC的第一个顺反子位置构成的。

K^b信号序列是在使用Vent聚合酶的RapidCycler中使用引物PKF和KXR从在95℃下变性15秒，接着28个95℃持续0秒、55℃持续0秒和72℃持续1分20秒的斜率为6.0的周期，再在72℃下扩散3分钟的A2E/X模板获得的。引物PKF包含PstI部位，而引物KXR包含XbaI部位。两个限制部位促进了扩增产品的定向克隆。大约90个碱基对(bp)的PCR产品被凝胶纯化、用PstI和XbaI消化，再一次凝胶纯化和亚克隆变成经PstI/XbaI消化、凝胶纯化的pED.dC载体。一种构造被选为代表性的无性繁殖系，并且被命名为pED.dC.K^b。

Fcγl序列是在使用Expand聚合酶的RapidCycler中使用引物FCGF和FCGMR从在95℃下变性15秒，接着30个95℃持续0秒、55℃持续0秒和72℃持续1分20秒的斜率为6.0的周期，再在72℃下扩散10分钟的EPO-Fc模板获得的。大约720bp的产品被凝胶分离和克隆成pGEM-TEasy载体，然后被测序。然后，正确的编码区域被EcoRI-MfeI消化切除、凝胶纯化和亚克隆成经EcoRI消化、凝胶纯化的pED.dC.K^b构造。按正确的取向有Fcγ编码区域的质粒通过用SmaI消化被确定下来，而且这种构造的序列被确定下来。该构造被命名为pED.dC.XFc。pED.dC.XFc的质粒图和部分序列被展示在图3中。

实施例4：有K ^b 信号肽的EPO-Fc的表达载体的构造

在这个实施例中，成人的EPO序列被插入盒，从而产生接在Fcγl序列前面的cDNA编码的K^b信号肽、3-氨基酸连接体(GSR)、成熟的EPO序列和8-氨基酸连接体(EFAGAAAV，SEQ ID NO：27)。EPO序列是当模板在使用Vent聚合酶的RapidCycler中使用引物EPO-F和EPO-R在95℃下变性15秒，接着28个95℃持续0秒、55℃持续0秒和72℃持续1分20秒的斜率为6.0的周期，再在72℃下扩散10分钟的时候从成年肾脏QUICK-克隆cDNA制剂获得的。引物EPO-F包含XbaI部位，而引物EPO-R包含EcoRI部位。大约514bp的产品被凝胶纯化、用XbaI和EcoRI消化、再一次凝胶纯化和定向亚克隆成经XhaI/EcoRI消化、凝胶纯化的pED.dC.XFc载体。在转化之后，被考核的20个无性繁殖系中的四个拥有正确的插入片段。一个这样的无性繁殖系被发现如同用直接测序确定的那样没有突变。这种构造被命名为pED.dC.EPofc。关于野生型人类EPO的核酸和氨基酸序列，参照图2。pED.dC.Epofc的质粒图和部分序列被展示在图4中。

实施例5：有EPO信号肽的EPO-Fc表达载体的构造

为了在使用内生的EPO信号肽而不是K^b信号肽的时候评估EPO-Fc的生产和分泌，第二个EPO-Fc的表达质粒被产生。这个质粒中的分泌盒给在Fcγl序列前面的包括它与8-氨基酸连接体融合的内因性信号肽(EFAGAAAV，SEQ ID NO：27)在内的人类EPO序列编码。包含内生的信号肽和成熟的序列两者的天然EPO序列是当模板在使用Expand聚合酶的PTC-200中使用引物EPS-F和EPS-R在94℃下变性2分钟，接着32个94℃持续30秒、57℃持续30秒和72℃持续45秒的周期，再在72℃下扩散10分钟的时候从成年肾脏QUICK-克隆cDNA制剂获得的。引物EPS-F包含在开始密码子上游的SbfI部位而引物EPS-R在EPO序列中使内生Sbf7部位的下游退火。大约603bp的产品被凝胶分离和亚克隆成pGEM-T Easy载体。四个独立的构造被完全测序，两个无突变的之一被用于进一步地亚克隆。正确编码的序列被SbfI消化切断、凝胶纯化和克隆成经PstI消化、SAP处理和凝胶纯化的pED.dC.EPofc质粒。在正确的方向上有插入片段的质粒最初是借助KpnI消化确定的。这种构造的XmnI和PvuII消化与pED.dC.Epofc进行比较并且确认正确的取向。序列被确定下来，而且该构造被称为pED.dC.natEpoFc。pED.dC.natEpoFc的质粒图和部分序列被展示在图5中。

实施例6：在体内EPO-Fc的生物活性的保留

为了证明通过FcRn结合配体和感兴趣的蛋白质的融合制成的共轭物能够保有生物活性，上述的示范蛋白质以下述方式就红细胞生成素的生物活性予以表达和化验。包含EPO-Fc融合的哺乳动物表达载体被转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中并且按照技术上的标准流程表达。转染的或未转染的CHO细胞的上清液被收集起来并且被皮下注射到BALB/c小鼠体内。小鼠的网状细胞计数用在本技术领域中已知的技术借助Coulter FACS分析获得的。结果证明用转染细胞上清液注射的小鼠具有比用对照(未转染)上清液注射的小鼠高数倍的网状细胞计数。由于EPO已被证明刺激红血球的生产，所以在此揭示的结果支持本发明合成有生物活性的FcRn结合配体共轭物的能力。

同样，用Fc片段替换上述载体中的替代FcRn结合配体域的融合蛋白质将被期望保有生物活性。

实施例7：EPO-Fc递送到中央气道之后的透过上皮吸收

免疫组织化学研究表明在猕猴类猴子和人类两个方面FcRn在中央气道中都以比肺泡上皮中高的水平被表达。所以，所关心的是确定粘合到FcRn上的EPO-Fc融合蛋白(MW＝112kDa)能否通过肺脏上皮转运以及在肺脏中这种吸收发生在哪里。由天然的人类EPO在其羧基末端融合到人类IgGl的Fc域的氨基末端上组成的人类EPO-Fc融合蛋白质被表达在CHO细胞中而且是使用蛋白A亲和层析从细胞培养基提纯的。纯化的人类EPO-Fc融合蛋白在体外是有生物活性的。EPO-Fc凭借高亲和力(对于天然的huEPO，K_d＝0.25nM对0.2nM)键合到EPO受体(EpoR)上，而且刺激TF-1人类红白血病细胞的增殖(对于天然的huEPO，ED₅₀＝0.07nM对0.03nM)。在Biacore化验中，EPO-Fc还键合到纯化的可溶的huFcRn上(对于IgGl，K_d＝14nM对8nM)。

EPO-Fc的气溶胶(在PBS中，pH7.4)是用各种不同的喷气式雾化器产生的而且是通过气管内的管子对被麻醉的猕猴类猴子给药的。在一些实验中，猴子正在自然地呼吸，而在其它的实验中，呼吸的深度和速率是用BirdMark呼吸机或Spangler盒式装置调节的。循环网状细胞方面的增加被用作对EPO-Fc的生物响应的指示器。EPO-Fc是在血清中使用特异性ELISA定量的。

在被麻醉的自然呼吸的猕猴类猴子方面的初步研究考察对成烟雾状散开的EPO-Fc的生物学响应(图6A)。在这项研究中所有动物在EPO-Fc给药后5-7天都以循环网状细胞的增加回应。后来的研究表明高浓度的EPO-Fc是在以类似的方式单一剂量给药之后在血清中获得的(图6B)。在其FcRn粘合方面减少90％以上的突变的EPO-Fc(在Fc域：I253A、H310A和H435A中有三个关键的氨基酸残基被修饰的Fc)不能被很好地吸收。平均的血清半衰期对于EPO-Fc是大约22小时(与对于EPOGEN(Amgen)的5-6小时相比较)。EPO-Fc和mutEPO-Fc的吸收是用浅的(自然的)呼吸或深的(强制换气)呼吸进行比较的。被迫深呼吸的手法导致比自然的浅呼吸低得多的EPO-Fc吸收，同时在突变的EPO-Fc的吸收方面没有差异。

这些结果在使用γ闪烁扫描法(^99mTc-DTPA作为放射性示踪剂共同给药)的实验中得到确认和增强，以便在强制换气的情况下以20％或75％的生活力比较EPO-Fc的沉积和吸收(图7)。闪烁扫描图像证明放射性示踪剂的沉积是适于20％生活力的气管/中央气道对适于75％生活力的中央气道/深层肺脏。EPO-Fc的吸收在使用20％生活力给药之后是更强健的。此外，EPO-Fc的吸收是在不同的沉积剂量水平下考核的(全部按20％生活力手法完成)，以便找到适合临床应用的EPO-Fc剂量范围。0.01-0.03mg/kg的沉积剂量导致与临床效用一致的药物动力学(图8)。

实施例8：通过人类的IFN-α-Fc对非人类的灵长类动物的中央气道的气溶胶给药考核IFN-α的全身性递送

人类IFN-α-Fc表达结构是使用实施例3的pED.dC.K^b表达载体和人类IFN-α的编码区域产生的。适合人类IFN-α的核苷酸序列可根据编号J00207从GenBank公开地获得。人类IFN-α-Fc被表达在CHO细胞中并且是以类似于上述的EPO-Fc的方式分离的。就这个实验而言六只猕猴类猴子被分为三组。组I的猴子通过类似于在实施例7中就EPO-Fc描述的给药方法的中央气道气溶胶给药完成20μg/kg IFN-α-Fc给药。组II的猴子是以同样的方式完成对中央气道20μg/kg的INTRON(ScheringCorporation，Kenilworth，NJ)(一种重组人类IFN-α)的给药的。组III的猴子是通过中央气道气溶胶给药按组I的IFN-α-Fc给药量的十分之一(即，2μg/kg)给药的。血样在14天里被定期抽取而且IFN-α的血清水平是在每个时间点使用适当的特异性ELISA测定的。也用同样的ELISA确定的处理前的IFN-α水平被从所有后来的IFN-α水平测定中减去。此外，用于IFN-α生物活性的标准化验是使用从组I中的动物获得的序列试样完成的，以便估定被给药的IFN-α-Fc的生物活性。这些化验包括寡腺苷酸合成酶(OAS)活性和新蝶呤浓度的测量。结果被展示在图9-11中。

图9展示组I的猴子(DD030和DD039)实现在160-185纳克/毫升范围内的IFN-α峰值血清浓度，而半衰期(T_1/2)为83.7-109小时。相比之下，以同样的给药方式接受20μg/kg作为INTRON的IFN-α的组II中的猴子(DD029和DD045)实现只有大约13.6纳克/毫升的IFN-α峰值血清水平，而且半衰期(T_1/2)只有4.8-5.9小时。这些结果表明给药到中央气道的成烟雾状散开的IFN-α-Fc对于IFN-α的全身性递送是非常有效的。此外，因此作为IFN-α-Fc给药的IFN-α的延长的半衰期证明与类似地单独给药的IFN-α相比IFN-α能作为FcRn结合配体共轭物给药而且在药物动力学方面有引人注目的改善。

图10展示，IFN-α-Fc的给药量仅仅是组I猴子的十分之一组III的猴子(DD055和DD057)实现成比例地降低的血清浓度而且有相似的药物动力学分布曲线。

图11展示接受IFN-α-Fc的组I的猴子的IFN-α生物活性化验的结果。图11A展示作为时间的函数与图9和图10的药物动力学数据平行的逐渐增加的和保持不变的OAS活性。图11B展示也与图9和图10中的药物动力学数据平行的逐渐增加的和保持不变的新蝶呤浓度。这些数据表明IFN-α-Fc中的IFN-α在依照本发明的方法对中央气道气溶胶给药之后保有生物活性。

实施例9：通过人类的TNFR-Fc对非人类的灵长类动物的中央气道的气溶胶给药考核TNFR-Fc的全身性递送

三只猕猴类猴子中的每一只都依照本发明方法经由中央气道完成成烟雾状散开的ENBREL(etanercept，Immunex Corporation，Seattle，WA)(一种重组人类肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fcγl)的给药。ENBREL是包括在支架中融化到铰合部(人类IgGl的C_H2、C_H3域)的人类TNFR的胞外粘合配体部分的二聚融合蛋白质。ENBREL被表达在CHO细胞中并且有大约150kDa的分子量。在这个实验中对每只猴子估计的沉积剂量是0.3-0.5mg/kg。血样在十天里被定期地抽取，而且TNFR-Fc的血清水平是在每个时间点使用适当的特异性ELISA测定的。就血清ENBREL浓度的测量而言，夹心式ELISA是使用粘合到平板上的TNF-α作为俘获剂、血清或ENBREL分别作为试样或标准和抗TNFR的抗体作为报道剂完成的。结果被展示在图12中。

图12表明三只猕猴类猴子(101、102和103)实现大约200纳克/毫升的TNFR-Fc的类似的峰值血清浓度。TNFR-Fc的半衰期被延长。这个实验证明人类TNFR-Fc能依照本发明的方法经由气溶胶给药被有效地给药到非人类的灵长类动物的中央气道。

实施例10：通过人类IFN-β-Fc对非人类的灵长类动物的中央气道的气溶胶给药考核IFN-β的全身性递送

人类IFN-β-Fc表达结构是使用实施例3的pED.dC.K^b表达载体和人类IFN-β的编码区域产生的。用于人类IFN-β的核苷酸序列可根据编号V00535从GenBank公开地获得。人类IFN-β-Fc被表达在CHO细胞中，并且是以类似于前面就EPO-Fc描述的方式分离的。两只猕猴类猴子和两只恒河猴类猴子每只都借助类似于在实施例7中就EPO-Fc给药描述的方法的中央气道气溶胶给药完成40μg/kg IFN-β-Fc的给药。血样在两天里被定期地抽取，而且IFN-β的血清水平是在每个时间点使用适当的特异性ELISA测定的。也用同样的ELISA测定的处理前的IFN-β水平被从所有后来的IFN-β水平测定中减去。

结果表明经由中央气道完成成烟雾状散开的人类IFN-β-Fc的给药的猕猴类和恒河猴类的猴子都实现值得注意的和保持不变的IFN-β血清浓度。在这个实验中猕猴类猴子实现比恒河猴类猴子高的峰值水平(猕猴的11.0-24.7纳克/毫升对恒河猴的5.4-8.4纳克/毫升)。IFN-β-Fc的半衰期在两组中大体相同，即12.8-14.2小时。这些数据证明给药到两种非人类的灵长类动物的中央气道的成烟雾状散开的IFN-β-Fc对IFN-β的全身性递送是有效的。

实施例11：通过人类FSH-Fc对非人类的灵长类动物的中央气道的气溶胶给药考核FSH的全身性递送

人类FSH-Fc的表达结构是使用实施例3的pED.dC.K^b表达载体和单链人类FSH的编码区域产生的。分子的单链FSH部分包括异源二聚体激素FSH在适当的翻译读框中用SmaI限制核酸内切限制部位(CCCGGG)连接在一起的α链和β链。因此，FSH-Fc构造也被称为hFSHβα-Fc。用于人类FSH的α亚基和β亚基的核苷酸序列可以分别根据编号NM_000735和NM_000510公然通过GenBank获得。人类FSH-Fc被表达在CHO细胞中，并且是以类似于前面就EPO-Fc描述的方式分离的。

两只猕猴类猴子每只都借助与在实施例7中就EPO-Fc的给药描述的方法类似的中央气道气溶胶给药完成100μg/kg的FSH-Fc给药。血样在两个星期里被定期地抽取，而FSH的血清水平是在每个时间点使用适当的特异性ELISA测定的。也用同样的ELISA测定的处理前的FSH水平被从所有后来的FSH水平测定中减去。结果表明两只猴子都实现值得注意的FSH水平，其中峰值血清浓度为21.6和42.8ng/ml，而半衰期为145-153小时。

本发明在范围方面不受倾向于作为本发明个别方面的单一例证的特定的实施方案的限制，而且功能上等价的方法和成份在本发明的范围之内。确实，除了在此展示和描述的之外，本发明各种不同的修改方案对于本领域普通的技术人员从前面的描述和附图将变得明显。这样的修改方案预计将落在权利要求书的范围之内。

在本文中引证的全部参考文献都在此通过引证被全部并入本文。

序列表

<110> 布赖汉姆妇女医院

<120> 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药

<130> S01383/70005WO

<150> US60/364,482

<151> 2002-03-15

<160> 27

<170> PatentIn版本3.1

<210> 1

<211> 681

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

<210> 3

<211> 579

<212> DNA

<213> 人

<400> 3

<210> 4

<211> 193

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

<210> 5

<211> 798

<212> DNA

<213> 人

<400> 5

<210> 6

<211> 261

<212> PTR

<213> 人

<400> 6

<210> 7

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人

<400> 7

<210> 8

<211> 425

<212> PRT

<213> 人

<400> 8

<210> 9

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人

<400> 9

<210> 10

<211> 428

<212> PRT

<213> 人

<400> 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人

<400> 13

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人

<400> 14

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人

<400> 15

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人

<400> 17

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 18

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 19

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 20

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 21

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 22

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 23

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 25

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 26

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的肽

<400> 27

Claims

1.一种FcRn结合配体在制备适用于全身性递送的共轭物的气溶胶的制造中的用途，其中：

FcRn结合配体与治疗制剂共轭；以及

所述治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物的气溶胶对肺脏的有效剂量可受控制，以致肺脏中央区域/肺脏外围区域的沉积比至少是0.7。

2.根据权利要求1的用途，其中肺脏中央区域/肺脏外围区域的沉积比至少是1.0。

3.根据权利要求1的用途，其中肺脏中央区域/肺脏外围区域的沉积比至少是1.5。

4.根据权利要求1的用途，其中肺脏中央区域/肺脏外围区域的沉积比至少是2.0。

5.根据权利要求1的用途，其中治疗制剂是多肽。

6.根据权利要求1的用途，其中治疗制剂是抗原。

7.根据权利要求6的用途，其中抗原是肿瘤抗原。

8.根据权利要求1的用途，其中治疗制剂是低聚核苷酸。

9.根据权利要求8的用途，其中低聚核苷酸是抗过敏的低聚核苷酸。

10.根据权利要求1的用途，其中治疗制剂是红细胞生成素、生长激素、干扰素α、干扰素β或促卵泡生成激素。

11.根据权利要求10的用途，其中治疗制剂是红细胞生成素。

12.根据权利要求10的用途，其中治疗制剂是干扰素β。

13.根据权利要求1的用途，其中治疗制剂是因子IX。

14.一种FcRn结合配体在制备适用于全身性递送的共轭物的气溶胶的制造中的用途，其中：

FcRn结合配体与治疗制剂共轭；以及

治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物的所述气溶胶的颗粒为3-10μm的质量中值气动力学直径。

15.根据权利要求14的用途，其中颗粒的质量中值气动力学直径介于3μm和8μm之间。

16.根据权利要求14的用途，其中颗粒的质量中值气动力学直径大于4μm。

17.根据权利要求14的用途，其中大多数颗粒是不适于呼吸的。

18.根据权利要求14的用途，其中治疗制剂是多肽。

19.根据权利要求14的用途，其中治疗制剂是抗原。

20.根据权利要求19的用途，其中抗原是肿瘤抗原。

21.根据权利要求14的用途，其中治疗制剂是低聚核苷酸。

22.根据权利要求21的用途，其中低聚核苷酸是抗过敏的低聚核苷酸。

23.根据权利要求14的用途，其中治疗制剂是红细胞生成素、生长激素、干扰素α、干扰素β、或促卵泡生成激素。

24.根据权利要求23的用途，其中治疗制剂是红细胞生成素。

25.根据权利要求23的用途，其中治疗制剂是干扰素β。

26.根据权利要求14的用途，其中治疗制剂是因子IX。

27.一种治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物的气溶胶，其中气溶胶中的颗粒具有3-10μm的质量中值气动力学直径。

28.根据权利要求27的气溶胶，其中颗粒的质量中值气动力学直径介于3μm和8μm之间。

29.根据权利要求27的气溶胶，其中颗粒的质量中值气动力学直径大于4μm。

30.根据权利要求27的气溶胶，其中大多数颗粒是不适于呼吸的。

31.根据权利要求27的气溶胶，其中治疗制剂是多肽。

32.根据权利要求27的气溶胶，其中治疗制剂是抗原。

33.根据权利要求32的气溶胶，其中抗原是肿瘤抗原。

34.根据权利要求27的气溶胶，其中治疗制剂是低聚核苷酸。

35.根据权利要求34的气溶胶，其中低聚核苷酸是抗过敏的低聚核苷酸。

36.根据权利要求27的气溶胶，治疗制剂是红细胞生成素，生长激素，干扰素α、干扰素β、或促卵泡生成激素。

37.根据权利要求36的气溶胶，其中治疗制剂是红细胞生成素。

38.根据权利要求36的气溶胶，其中治疗制剂是干扰素β。

39.根据权利要求27的气溶胶，其中治疗制剂是因子IX。

40.一种气溶胶递送系统，其中包括：容器、与容器连接的气溶胶发生器和安排在容器之内的治疗制剂和FcRn结合配体的共轭物，其中气溶胶发生器是为生成含有颗粒的质量中值气动力学直径为3-10μm的共轭物的气溶胶而构成和安排的。

41.根据权利要求40的气溶胶递送系统，其中颗粒的质量中值气动力学直径大于4μm。

42.根据权利要求40的气溶胶递送系统，其中大多数颗粒是不适于呼吸的。

43.根据权利要求40的气溶胶递送系统，其中气溶胶发生器包括与包含共轭物的溶液流体连接的振动元件。

44.根据权利要求40的气溶胶递送系统，其中气溶胶发生器是雾化器。

45.根据权利要求40的气溶胶递送系统，其中气溶胶发生器是机械泵。

46.根据权利要求40的气溶胶递送系统，其中容器是增压容器。

47.一种制造权利要求40的气溶胶递送系统的方法，其中包括：

提供容器；

提供与容器连接的气溶胶发生器；以及

将有效量的共轭物放进容器。

48.根据权利要求47的方法，其中气溶胶发生器包括与包含共轭物的溶液流体连接的振动元件。

49.根据权利要求47的方法，其中气溶胶发生器是雾化器。

50.根据权利要求47的方法，其中气溶胶发生器是机械泵。

51.根据权利要求47的方法，其中容器是增压容器。