JP2022531095A - エキソソーム及びａａｖの組成物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞、例えばエキソソームに関する。一部の態様では、ＡＡＶは、細胞外小胞の内腔中にある。一部の態様では、ＡＡＶは、細胞外小胞の内腔表面に会合している。一部の態様では、ＡＡＶは、細胞外小胞の外表面に会合している。本明細書ではまた、該エキソソームを生産するための方法、及び該エキソソームを使用して、疾患または障害を処置及び／または予防するための方法も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
このＰＣＴ出願は、２０１９年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／８３５，４２５号、２０１９年４月１７日に出願された同第６２／８３５，４３２号、２０２０年３月２日に出願された同第６２／９８４，１６１号、及び２０２０年３月２日に出願された同第６２／９８４，１７３号の優先権の利益を主張するものであり、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
本願で提出された、電子的に提出された配列表（名称：４０００＿０３３ＰＣ０３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２３１，２４９バイト、及び作成日：２０２０年４月１７日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームに関する。本開示のある特定の態様では、細胞外小胞は、足場タンパク質をさらに含む。
ＡＡＶは、遺伝子治療用途に有用なベクターとして浮上している。しかしながら、その多くの利点にもかかわらず、ＡＡＶは、体液性の抗体媒介性免疫応答を刺激する。ＡＡＶ媒介性遺伝子治療が有益な可能性がある全ての潜在患者の半数ほどにも多くが、野生型のＡＡＶ血清型への曝露後に発達した既存の中和抗体を持つため、処置を受けることができない。さらに、ＡＡＶ治療の初回投薬後に、患者は、この処置に対する抗体を発達して、再投薬が受けられず、所望の治療効果を達成し得る用量を設定するための用量漸増レジームを妨げる。再投薬の不能性は、投与された導入遺伝子が患者の生涯を経るうちに発現を失う場合に大きな問題であり、この発現の喪失は、細胞分裂、導入遺伝子の不活性化、または形質導入された細胞の消失により頻繁に生じる。
エキソソームは、真核細胞によって天然に産生される小さな細胞外小胞である。エキソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を取り囲む膜を含む。薬物送達ビヒクルとして、ＥＶ、例えばエキソソームは、多くの治療分野における新たな治療法として、慣習的な薬物送達方法に勝る多くの利点を提示する。特に、エキソソームは、本質的に低い免疫原性を有する。エキソソームに会合したＡＡＶは、形質導入効率を含めて、遊離ＡＡＶよりも改善された送達特性を有する。Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（５）：９６０－７１（２０１２）、Ｇｙｏｒｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５（２６）：７５９８－７６０９（２０１４）。しかしながら、現行の方法を使用したエキソソーム中のＡＡＶパッケージングは、非常に効率が悪く、ＡＡＶの送達におけるエキソソームの潜在的な有用性を制限している。故に、当該技術分野において、ＡＡＶをエキソソームにより効率的に会合させるための技法を開発する必要性が残っている。
Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（５）：９６０－７１（２０１２）、Ｇｙｏｒｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５（２６）：７５９８－７６０９（２０１４）
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを対象とする。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶの内腔中にある。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの膜に会合している。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面に会合している。一部の態様では、エキソソームに会合したＡＡＶは、遊離ＡＡＶ単独と比較して改変された特性を有する。
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、ＥＶの内腔中にあり、エキソソーム中のＡＡＶは、遊離ＡＡＶ単独と比較して改変された特性を有する。
一部の実施形態では、改変された特性は、ＡＡＶ単独よりも良好な治療効果を含む。一部の実施形態では、より良好な治療効果は、より高い活性、増加した形質導入、増加した形質導入効率、より大きな効力、より速い形質導入速度、及び免疫応答の回避のうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶの改変された特性は、ＡＡＶが２回以上の投薬により対象に投与されることを可能にし、ここで、ＡＡＶの活性は、後続の投薬において保持される。
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶを含むＥＶ、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＥＶは、足場タンパク質と、少なくとも１個のＡＡＶとを含み、該少なくとも１個のＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔中にある。
一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、少なくとも１個のＡＡＶ、少なくとも２個のＡＡＶ、少なくとも３個のＡＡＶ、少なくとも４個のＡＡＶ、または少なくとも５個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶの内腔中に少なくとも６個のＡＡＶ、少なくとも７個のＡＡＶ、少なくとも８個のＡＡＶ、少なくとも９個のＡＡＶ、少なくとも１０個のＡＡＶ、少なくとも１１個のＡＡＶ、少なくとも１２個のＡＡＶ、少なくとも１３個のＡＡＶ、少なくとも１４個のＡＡＶ、少なくとも１５個のＡＡＶ、少なくとも１６個のＡＡＶ、少なくとも１７個のＡＡＶ、少なくとも１８個のＡＡＶ、少なくとも１９個のＡＡＶ、少なくとも２０個のＡＡＶ、少なくとも２０１個のＡＡＶ、少なくとも２２個のＡＡＶ、少なくとも２３個のＡＡＶ、少なくとも２４個のＡＡＶ、少なくとも２５個のＡＡＶ、少なくとも２６個のＡＡＶ、少なくとも２７個のＡＡＶ、少なくとも２８個のＡＡＶ、少なくとも２９個のＡＡＶ、少なくとも３０個のＡＡＶ、少なくとも３５個のＡＡＶ、少なくとも４０個のＡＡＶ、少なくとも４５個のＡＡＶ、少なくとも５０個のＡＡＶ、少なくとも６０個のＡＡＶ、少なくとも７０個のＡＡＶ、少なくとも８０個のＡＡＶ、少なくとも９０個のＡＡＶ、または少なくとも１００個のＡＡＶを含む。
一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、少なくとも１個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶの内腔中に少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約７５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約７５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、または少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１５個のＡＡＶを含む。
一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、少なくとも約１個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶを含む。
一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶを含む。
一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、内腔表面及び外部表面を含む脂質二重膜を含み、ここで、ＡＡＶのうちの少なくとも１個は、ＥＶの内腔表面には連結されていない。
一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、内腔表面及び外部表面を含む脂質二重膜を含み、ここで、ＡＡＶのうちの少なくとも１個は、ＥＶの内腔表面に連結されている。
一部の実施形態では、少なくとも１個のＡＡＶは、共有結合または非共有結合によってＥＶの内腔表面に連結されている。
一部の実施形態では、少なくとも１個のＡＡＶは、共有結合及び非共有結合の両方によってＥＶの内腔表面に連結されている。
本開示のある特定の態様は、（ｉ）ＡＡＶと、（ｉｉ）足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、ＥＶの外部表面上の足場タンパク質に会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、細胞外ドメインを含み、ここで、ＡＡＶは、足場タンパク質の細胞外ドメインに会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、膜貫通領域をさらに含み、ここで、膜貫通領域は、ＥＶ、例えばエキソソームの膜に係留されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、細胞内ドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、異種ポリペプチドを含み、ここで、異種ポリペプチドは、足場タンパク質の細胞外ドメインに融合されており、異種ポリペプチドは、ＡＡＶと会合する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質またはＩＩ型膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、足場タンパク質の細胞外ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合されている。
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、受容体、リガンド、抗原結合部分、基質、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、異種ポリペプチドは、ＡＡＶの表面上の１つまたは複数のタンパク質と特異的に相互作用する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、抗体の抗原結合断片、ラクダ抗体またはその抗原結合断片、一本鎖ＦＡＢ、ナノボディ、サメＩｇＮＡＲ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原結合部分を含む。一部の実施形態では、抗原結合部分は、ナノボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合部分は、ＡＡＶの表面上の１つまたは複数のタンパク質に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ＡＡＶの表面上の１つまたは複数のタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶの表面上の１つまたは複数のタンパク質は、ＡＡＶのカプシドタンパク質に融合された非ＡＡＶ配列である。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ２に融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ２のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ２の内部表面に露出したループに融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ３に融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ３のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ３の内部表面に露出したループに融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ１に融合されている。一部の実施形態では、非ＡＡＶ配列は、ＶＰ１の内部表面に露出したループに融合されている。
一部の実施形態では、親和性リガンド（受容体、リガンド、抗原結合部分）の間の相互作用は、ｐＨの変化（例えば、リソソーム内コンパートメントでの減少したｐＨ）、レドックス条件の変化（酸化の増加または減少）、イオン条件の変化、または二価もしくは三価のカチオン性もしくはアニオン性分子の濃度の変化を含めたある特定の条件下で可逆的である。
一部の実施形態では、（ｉ）足場タンパク質は、Ｆｃ受容体を含む異種ポリペプチドに融合されており、（ｉｉ）ＡＡＶは、免疫グロブリン定常領域のＦｃ領域（Ｆｃ）に融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲ１）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＩＩＢ、ＦｃγＩＩＩＡ、及びＦｃγＩＩＩＢから選択されるＦｃガンマ受容体であり、ここで、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲ１であり、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃアルファ受容体Ｉ（ＦｃαＲ１）であり、ここで、Ｆｃは、ＩｇＡのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃイプシロン受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）及びＦｃεＲＩＩから選択されるＦｃイプシロン受容体であり、ここで、Ｆｃは、ＩｇＥのＦｃである。
一部の実施形態では、（ｉ）足場タンパク質は、ナノボディを含む異種ポリペプチドに融合されており、（ｉｉ）ＡＡＶは、免疫グロブリン定常領域のＦｃ領域（Ｆｃ）に融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ナノボディは、カプシドタンパク質に融合されたＦｃに特異的に結合する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ｆｃに融合された少なくとも１個のＶＰ２を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ｆｃに融合されていない少なくとも１個のＶＰ２を含む。一部の実施形態では、Ｆｃは、少なくとも１個のＶＰ２のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、Ｆｃは、少なくとも１個のＶＰ２の内部表面に露出したループに融合されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ｆｃに融合された少なくとも１個のＶＰ３を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ｆｃに融合されていない少なくとも１個のＶＰ３を含む。一部の実施形態では、Ｆｃは、少なくとも１個のＶＰ３のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、Ｆｃは、少なくとも１個のＶＰ３の内部表面に露出したループに融合されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ｆｃに融合された少なくとも１個のＶＰ１を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、Ｆｃに融合されていない少なくとも１個のＶＰ１を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃは、ＶＰ１の表面に露出したループに融合されている。一部の実施形態では、表面に露出したループは、配列ＧＴＴＴＱＳＲ（配列番号４３）を含む。一部の実施形態では、表面に露出したループは、ＶＰ１（配列番号４４）のアミノ酸残基４５３～４５９を含む。一部の実施形態では、表面に露出したループの少なくとも１つのアミノ酸は、Ｆｃで置き換えられる。一部の実施形態では、表面に露出したループは、Ｆｃで置き換えられる。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、抗原結合部分に融合されており、該抗原結合部分が、ＡＡＶの表面上の抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶ受容体を含む異種ポリペプチドに融合されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ表面上の特定の異種配列（エピトープ）を組み込むように設計され、次いで、このエピトープが、特定の抗原結合部分によって認識される。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、目的とする遺伝子を含むヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、分泌タンパク質、受容体、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、感覚タンパク質、制御タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、防御タンパク質、モータータンパク質、凝固因子、増殖因子、抗酸化物質、サイトカイン、ケモカイン、酵素、腫瘍抑制因子遺伝子、ＤＮＡ修復タンパク質、構造タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、アルファグルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質または第ＩＸ因子タンパク質をコードする。一部の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、野生型第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、Ｒａｂタンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ成分Ａ １（ＲＥＰ１）をコードする。一部の実施形態では、ＲＥＰ１は、配列番号４５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３Ａ型ＡＡＶ、３Ｂ型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、ｒｈ７４型ＡＡＶ、ｒｈ３２．３３型ＡＡＶ、ｒｈ１０型ＡＡＶ、Ａｎｃ８０型ＡＡＶ、ＰＨＰ型ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、ヒトＡＡＶ、ブタＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮである。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結されている。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶの内腔表面に会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン、エフェクタードメイン、及び膜貫通ドメインを含み、ここで、ＮＤは、ミリストイル化されており、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及び／またはエフェクタードメイン（ＥＤ）は、ＥＶの内腔表面に会合している。
一部の実施形態では、ＮＤは、ミリストイル化を介してエキソソームの内腔表面に会合している。
一部の実施形態では、ＥＤは、イオン性相互作用によってエキソソームの内腔表面に会合している。
一部の実施形態では、ＥＤは、（ｉ）ある塩基性アミノ酸、または（ｉｉ）連続的に２つ以上の塩基性アミノ酸を含み、該塩基性アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎは、１～１０の整数である。
一部の実施形態では、ＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるか、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるか、またはそれらの任意の組み合わせである。
一部の実施形態では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、アミノ酸であり、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である。
一部の実施形態では、Ｘ３は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＮＤ及びＥＤは、リンカーによって結合している。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、ＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号２１）、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号３０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号３１）、及び（ｘｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＤは、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、長さが少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸である。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３２）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３３）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３５）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３６）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４１）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４２）を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｎ末端にＭｅｔを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、足場タンパク質のＮ末端にミリストイル化アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。一部の実施形態では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、合成である。一部の実施形態では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、グリシン類似体である。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質のＣ末端は、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結されている。一部の実施形態では、ＥＶは、エキソソームである。
本開示のある特定の態様は、カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を対象とし、ここで、カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される少なくとも１つのカプシドタンパク質を含み、該少なくとも１つのカプシドタンパク質が、足場タンパク質に連結されている。
一部の実施形態では、ＥＶは、第２の足場タンパク質をさらに含み、該第２の足場タンパク質は、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ２を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に融合されていない少なくとも１個のＶＰ２を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＶＰ２のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＶＰ２のＣ末端に融合されている。一部の実施形態では、足場タンパク質に融合されたＶＰ２の数は、足場タンパク質に融合されていないＶＰ２の数よりも少ない。一部の実施形態では、足場タンパク質に融合されたＶＰ２の数は、足場タンパク質に融合されていない少なくとも１個のＶＰ２の数よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４６倍、約５０倍、または約１００倍少ない。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質またはＩＩ型膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、Ｉ型膜貫通タンパク質は、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、Ｉ型膜貫通タンパク質のＣ末端またはＩＩ型膜貫通タンパク質のＮ末端は、二量体化剤、例えば、化学誘導二量体（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｍｅｒ）の結合パートナーに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている。一部の実施形態では、化学誘導二量体の結合パートナーは、（ｉ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ＦＫ１０１２）、（ｉｉ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）（ＦＫ５０６）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓ（ＦＫＣｓＡ）、（ｉｖ）ＦＫＢＰ及びＦＲＢ（ラパマイシン）、（ｖ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）、（ｖｉ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）、（ｖｉｉ）スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇ（ＨａＸＳ）、（ｖｉｉｉ）ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇ（ＴＭＰ－ＨＴａｇ）、ならびに（ｉｘ）ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）（ＡＢＴ－７３７）からなる群から選択される結合パートナーのうちの１つを含む。一部の実施形態では、化学誘導二量体は、ＦＲＢ－ＦＫＢＰ融合複合体を含む。一部の実施形態では、ＦＲＢは、ｍＴＯＲのＦＲＢである。一部の実施形態では、ＡＡＶは、化学誘導二量体の結合パートナーのうちの１つに融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含み、それによって結合パートナーが化学化合物に接触するときに二量体複合体を形成する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ２を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、化学誘導二量体の結合パートナーに融合されていない少なくとも１個のＶＰ２を含む。一部の実施形態では、ＶＰ２に融合され化学誘導二量体の結合パートナーの数は、化学誘導二量体の結合パートナーに融合されていない少なくとも１個のＶＰよりも少ない。一部の実施形態では、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されたＶＰ２の数は、結合パートナーに融合されていない少なくとも１個のＶＰ２の数よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４６倍、約５０倍、または約１００倍少ない。
一部の実施形態では、化学誘導二量体の結合パートナーは、ＡＡＶカプシドタンパク質の内部ループ内に挿入される。一部の実施形態では、内部ループは、配列ＧＴＴＴＱＳＲ（配列番号４３）を含む。一部の実施形態では、内部ループは、配列番号４４（ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３１３５）のアミノ酸残基４５３～４５９を含む。一部の態様では、化学誘導二量体の結合パートナーは、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ２のＲ５８５、Ｒ５８７、Ｒ５８８、もしくはそれらの任意の組み合わせから選択される部位、または類似のカプシドタンパク質における相同部位に挿入される（例えば、Ｂｕｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２４８－２６６（Ｍａｒｃｈ ２０１９）を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。一部の実施形態では、内部ループの少なくとも１つのアミノ酸が、化学誘導二量体の結合パートナーで置き換えられる。一部の実施形態では、足場タンパク質は、リンカーによって化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、リンカーによって化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、共有結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶに特異的に結合する親和性物質に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶ受容体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ラクダ類、ＶＨＨ断片、免疫グロブリン新抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）抗体、もしくはそれらの抗原結合部分、またはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、それらの抗原結合部分は、一本鎖Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、親和性物質は、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質に結合する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質である。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶカプシドタンパク質単量体には結合しない。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶ受容体を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、ＡＡＶＲまたはＧＰＲ１０８である。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子カセットをさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、分泌タンパク質、受容体、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、感覚タンパク質、制御タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、防御タンパク質、モータータンパク質、凝固因子、増殖因子、抗酸化物質、サイトカイン、ケモカイン、酵素、腫瘍抑制因子遺伝子、ＤＮＡ修復タンパク質、構造タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、アルファグルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質または第ＩＸ因子タンパク質をコードする。一部の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、野生型第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、Ｒａｂタンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ成分Ａ １（ＲＥＰ１）をコードする。一部の実施形態では、ＲＥＰ１は、配列番号４５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３Ａ型ＡＡＶ、３Ｂ型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、ｒｈ７４型ＡＡＶ、ｒｈ３２．３３型ＡＡＶ、ｒｈ１０型ＡＡＶ、Ａｎｃ８０型ＡＡＶ、ＰＨＰ型ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、ヒトＡＡＶ、ブタＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるＥＶ中のＡＡＶを対象とする。
本開示のある特定の態様は、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含む足場タンパク質に連結されたＶＰ２を含むＡＡＶを対象とし、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、本明細書に開示される足場タンパク質である。
本開示のある特定の態様は、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されたＶＰ２を含むＡＡＶを対象とする。一部の実施形態では、化学誘導二量体の結合パートナーは、開示される結合パートナーのうちのいずれか１つを含む。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示される親和性物質に特異的に結合した１つまたは複数のカプシドタンパク質を含むＡＡＶを対象とする。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソーム、またはＡＡＶと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を対象とする。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソーム、またはＡＡＶを産生する細胞を対象とする。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるような足場タンパク質に連結されたＡＡＶタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、細胞を対象とする。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に開示される目的とする遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列をさらに含む。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるような化学誘導二量体の結合パートナーに連結されたＡＡＶタンパク質をコードする第１のヌクレオチドを含む、細胞を対象とする。一部の実施形態では、細胞は、化学誘導二量体の対応する結合パートナーをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、該化学誘導二量体の対応する結合パートナーは、本明細書に開示される足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に開示される目的とする遺伝子を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含む。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示される足場タンパク質に連結された本明細書に開示される親和性物質をコードする第１のヌクレオチドを含む、細胞を対象とする。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に開示される目的とする遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列をさらに含む。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示される単離されたＥＶ、例えばエキソソームと、使用説明書とを含む、キットを対象とする。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示される細胞を好適な条件下で培養することと、ＥＶを得ることとを含む、ＥＶ、例えばエキソソームを作製する方法を対象とする。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるＥＶ、ＡＡＶ、または薬学的組成物を対象に投与することを含む、疾患の予防または処置を必要とする対象において該疾患を予防または処置する方法を対象とする。一部の実施形態では、疾患は、がん、血友病、糖尿病、増殖因子欠損症、眼疾患、ポンペ病、ゴーシェ病、リソソーム蓄積症、ムコビシドーシス、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、トランスチレチンアミロイドーシス、血友病Ａ、血友病Ｂ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、レーバー先天黒内障、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、ＯＴＣ欠損症、グリコーゲン蓄積症１Ａ、クリグラー・ナジャー症候群、原発性高シュウ酸尿症１型、急性間欠性ポルフィリン症、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、ムコ多糖症ＶＩ型、α１アンチトリプシン欠損症、レット症候群、ドラベ症候群、アンジェルマン症候群、ＤＭ１疾患、脆弱Ｘ疾患、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、ならびに高コレステロール血症から選択される。
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるＥＶを対象に投与することを含む、ＡＡＶを対象に送達する方法を対象とする。一部の実施形態では、ＥＶは、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内投与される。一部の実施形態では、該方法は、追加の治療剤を投与することをさらに含む。
一部の態様では、ＥＶ投与は、眼内投与である。一部の態様では、眼内投与は、硝子体内投与、前房内投与、結膜下投与、網膜下投与、強膜下投与、脈絡膜内投与、及びそれらの任意の組み合わせである。一部の態様では、眼内投与は、ＥＶの注射を含む。一部の態様では、眼内投与は、硝子体内注射である。一部の態様では、眼内投与は、該組成物を含む送達デバイスの埋め込みを含む。一部の態様では、送達デバイスは、眼内送達デバイスである。一部の態様では、眼内送達デバイスは、硝子体内インプラントまたは強膜プラグである。一部の態様では、送達デバイスは、徐放性送達デバイスである。一部の態様では、送達デバイスは、生分解性である。一部の態様では、ＥＶの眼内投与は、黄斑変性症、白内障、糖尿病性網膜症、緑内障、弱視、斜視、網膜症、レーバー先天黒内障、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患を処置するためのものである。
最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のＣ末端に融合されたＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）の図面である。 二量体化剤、例えば、ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）剤に融合されたＡＡＶカプシドＶＰ２の図面である。この結合パートナーは、ＶＰ２カプシドタンパク質のＮ末端に融合されている。対応する結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰ）は、ＰＴＧＦＲＮ、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結されている。 Ａ及びＢは、二量体化剤、例えば、化学誘導二量体の結合パートナーＦＲＢに融合されたＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）の図面である。結合パートナーは、４５５位にて内部ループ（例えば、ＶＰ１）内に挿入される。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＦＲＢの二量体化を誘導するためのラパマイシンの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生される。 Ａ～Ｃは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）に連結された最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）（Ａ）、ここでは足場Ｙを介して連結されて示されるＡＡＶ親和性物質に連結された最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）（Ｃ）、及びＡＡＶ親和性物質に連結された足場Ｘタンパク質（Ｂ）を含む、足場タンパク質を示す。 細胞外ドメインにて抗原結合ドメイン（ナノボディ）に連結された足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の図面である。抗原結合ドメイン（ナノボディ）は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３等のＡＡＶカプシド上のエピトープに特異的に結合する。 ＩｇＧのＦｃ領域に連結されたカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）の図面である。足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）が、Ｆｃに特異的に結合するＦｃγＲ１またはＦｃナノボディのいずれかに連結されている。ＦｃγＲ１またはＦｃナノボディは、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の細胞外ドメインに連結されている。 Ａは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）に連結された足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の図解を示す。ＡＡＶＲは、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の細胞外ドメインに連結されており、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３等のＡＡＶカプシド上のエピトープに結合する。ＡＡＶＲは、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、または一本鎖抗体であり得る。Ｂは、ＡＡＶ受容体を足場Ｘタンパク質に融合させたエキソソーム（「ＡＡＶＲエキソソーム」）が成功裏に構築されたことを例示するゲルである。 Ａ及びＢは、足場タンパク質に融合されたＡＡＶＲを含むエキソソームが固定化ＡＡＶ２に結合する（Ａに例示される）一方で、対照エキソソームは結合しないことを示す、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）データを示す。 Ａは、変性ポリアクリルアミドゲル上にローディングしたサイトゾル（左）及び核（右）からの等量の細胞ライセートのタンパク質ゲルの画像である。Ｂは、αＦＬＡＧタグ（全ての構築物上で発現）に特異的な抗体を使用したＥｔｐ－ＧＦＰ、Ｅｔｐ－ＶＰ２、及びＦＲＢ－ＶＰ２についてのウェスタンブロッティングを示す。Ｃは、サイトゾルライセート及び核ライセートの両方におけるαヒストンＨ４（核マーカー）に特異的な抗体を使用したウェスタンブロッティングを示す。 Ａ～Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び浮遊培養に適応させたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ＳＦ）にトランスフェクトされた種々のＡＡＶカプシド血清型の結果を示す。Ａ～Ｄは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ６カプシドがウェスタンブロットを介して検出されることを示す。 Ａは、超遠心分離を介した混合物の成分の分離を示す。Ｂは、Ａの図解に示されるような収集画分（１～１０）におけるＮＴＡ（粒子／ｍＬ）の結果及びｑＰＣＲ（遺伝子コピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ））の結果を示す。 Ａ～Ｃは、種々の露光時間を使用してＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の存在に関してアッセイした、１０個の収集画分のウェスタンブロットを示す。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３ポリペプチドは、それらがエキソソームに会合していない画分８、９、及び１０において最も顕著に見て取れる。画分１、２、３、及び５もまた検出可能なＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を有し、これらの画分におけるより高いエキソソーム濃度に関連していることが分かる。 トリプルトランスフェクション法を使用してＡＡＶ９でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養回収物の溶出液のクロマトグラムを示す。分離には、２０カラム体積分にわたって１５０ｍＭのＮａＣｌ～１ＭのＮａＣｌの漸増濃度のＮａＣｌを用いた直線勾配溶出（ＬＧＥ）を使用した。 図９に見られるような主溶出ピークにおける画分Ｆ１～Ｆ８の収集物、ならびにエキソソーム計数及び粒径を決定するためのＮＴＡ解析からもたらされたデータを示す。 ＡＡＶ５血清型を含むエキソソームの低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＥＭ）画像を示す。 ＡＡＶ５血清型を含むエキソソームの低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＥＭ）画像を示す。 ＡＡＶ９血清型を含むエキソソームの低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＥＭ）画像を示す。 サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用した個々のＦ１～Ｆ８画分の各々の分離を示す。 細胞を抗ＡＡＶ ＩｇＧの存在下で、遊離ＡＡＶ９－ＧＦＰ（「ＡＡＶ」）または封入ＡＡＶ９－ＧＦＰ（「エキソ」）のいずれかで、固定ＧＣ／ウェル（固定ＭＯＩ：６０００）によりトランスフェクトした実験からの結果を示す。図１２は、３連で実施した、４日間の期間にわたって３時間毎に決定した蛍光強度によって測定したときのＧＦＰ発現量を示す。 漸増濃度の阻害性抗ＡＡＶ９抗体の存在下での細胞培養物中のエキソソーム会合ＡＡＶまたは遊離ＡＡＶからのＧＦＰ発現量を示すグラフ表示である。 種々の希釈率での抗ＡＡＶモノクローナル抗体の存在下で遊離ＡＡＶ９－ＧＦＰまたは封入ＡＡＶ９－ＧＦＰのいずれかの種々の試料（Ｃｈｒｏｍ Ｆ３～Ｃｈｒｏｍ Ｆ９）を使用したＧＦＰ発現量の比較研究を示す。 Ａ～Ｄは、ＨｅＬａ細胞培養物への試料の添加後２４時間（Ａ）、４８時間（Ｂ）、７２時間（Ｃ）、及び９６時間（Ｄ）の時点で測定された、遊離ＡＡＶ９－ＧＦＰ（「ＡＡＶ」）または封入ＡＡＶ９－ＧＦＰ（「エキソソーム－ＡＡＶ」）を使用したＨｅＬａ細胞培養物におけるＧＦＰ発現による蛍光強度の比較を示す、Ｆ７画分に由来する試料の突き合わせた研究の結果を示す。 遊離ＡＡＶ（「遊離ＡＡＶ９」）または封入ＡＡＶ（「エキソソーム－ＡＡＶ」）を使用した、漸増濃度の静注用免疫グロブリン（「ＩＶＩＧ」）に応答したルシフェラーゼ発現の比較研究を示す。 ＰＢＳ対照、分泌型ｎａｎｏＬｕｃをコードする遊離ＡＡＶ９、または分泌型ｎａｎｏＬｕｃをコードするＡＡＶ９を含むエキソソームの投与から２週間後の均質化したマウスの眼におけるｎａｎｏＬｕｃ発現のレベル（ＲＬＵ／タンパク質ｍｇ）を例示する棒グラフである。 ＡＡＶ親和性リガンドに融合された足場Ｙタンパク質とのＡＡＶの相互作用による、エキソソーム膜の内腔表面とのＡＡＶの会合を例示する図面である。 ＡＡＶ親和性リガンドに融合された足場Ｙを使用したエキソソームの内腔負荷が、放出される総ＡＡＶのパーセントとしてのＡＡＶのエキソソームへの局在化の増加につながることを示す棒グラフである。 ＡＡＶ親和性リガンドに融合された足場Ｙを使用したエキソソームの内腔負荷が、足場Ｙ融合構築物を欠いたエキソソーム中のＡＡＶの濃縮度と比べたＡＡＶのエキソソームへの局在化の増加につながることを示す棒グラフである。
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを対象とする。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶの内腔中にある。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの膜に会合している。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面に会合している。一部の態様では、エキソソームに会合したＡＡＶは、遊離ＡＡＶ単独と比較して改変された特性を有する。
本開示のある特定の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、ＥＶの内腔中に存在する。ある特定の実施形態では、エキソソームの内腔中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも多く、ここで、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶは、足場タンパク質を用いずに導入されたものである。ある特定の実施形態では、内腔中にＡＡＶを含有するＥＶのパーセンテージは、ＡＡＶが足場タンパク質を用いずに導入された参照ＥＶのパーセンテージよりも高い。本開示のある特定の態様は、ＥＶの内腔中に少なくとも５個のＡＡＶを含む、ＥＶ、例えばエキソソームを対象とする。本開示の一部の態様は、足場タンパク質に連結された少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を含むＡＡＶを対象とする。一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含む。
本開示のある特定の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、ＥＶの外部表面上の足場タンパク質に会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、細胞外ドメインを含み、ＡＡＶは、足場タンパク質の細胞外ドメインに会合している。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、共有結合によって足場タンパク質に会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、非共有結合性の相互作用によって足場タンパク質に会合している。
本開示の一部の態様は、ＡＡＶ親和性リガンドを含有するように操作されたＥＶを対象とする。
種々の実施形態の非限定的な例が本開示に示される。
Ｉ．定義
本明細書がより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、発明を実施するための形態の全体を通して定められる。
「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、１つまたは複数のその実体を指すことに留意されたく、例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で、互換的に使用され得る。
さらに、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、２つの明記される特徴または構成要素の各々が、他方の有無にかかわらず具体的に開示されていると解釈されるべきである。故に、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、以下の態様の各々、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を包含することを意図する。
態様が「～を含む」という言い回しとともに本明細書に記載される場合はいずれも、「～からなる」及び／または「～から本質的になる」という用語で記載される、その他の点では類似した態様もまた提供されることが理解される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くについての一般辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により承認される形態で表される。数値範囲は、その範囲を画定する数を含む。別途指示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の向きで左から右に記載される。アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に記載される。本明細書に提供される見出しは、本開示の種々の態様の限定ではなく、そのような限定は、本明細書を全体として参照することによって得ることができる。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書を全体的に参照することによってより十分に定義される。
「約」という用語は、本明細書で、およそ、大まかに、前後、またはその領域内を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、それは、定められる数値を上回る境界、及び下回る境界を延長させることによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、述べられる値を、例えば上下に１０パーセント（より高いまたはより低い）の変動幅で上回る数値及び下回る数値を修飾することができる。
本明細書で使用されるとき、「細胞外小胞」及び「ＥＶ」という用語は、互換的に使用され、内部空間（すなわち、内腔）を取り囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞、微小胞）を含む。一部の実施形態では、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内で、細胞外小胞の外部表面上に発現されて、及び／または膜をまたいでのいずれかで、またはそれらの組み合わせで種々の高分子ペイロードを含み得る。一部の実施形態では、ペイロードは、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、ペイロードは、ＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、ＡＡＶ、ならびに核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含む。一部の態様では、細胞外小胞またはＥＶという用語は、細胞外小胞（ＥＶ）の集団を指す。
例として、かつ限定することなく、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、原形質膜の直接出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生きている生物もしくは死んだ生物、外植された組織もしくは臓器、原核細胞もしくは真核細胞、及び／または培養された細胞に由来し得る。一部の実施形態では、細胞外小胞は、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
本明細書で使用されるとき、「エキソソーム」という用語は、２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の直径を有する細胞外小胞（ＥＶ）を指す。エキソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を取り囲む膜を含み、一部の実施形態では、原形質膜の直接出芽によって、または後期エンドソームもしくは多胞体（ＭＶＢ）と原形質膜との融合によって細胞（例えば、プロデューサー細胞）から生成され得る。ある特定の実施形態では、エキソソームは、足場タンパク質を含む。上述したように、エキソソームは、プロデューサー細胞に由来し得、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。一部の実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。ある特定の実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、ＡＡＶを共産生する細胞によって生成される。一部の態様では、エキソソームという用語は、エキソソームの集団を指す。
本明細書で使用されるとき、「ナノ小胞」という用語は、２０～２５０ｎｍ（例えば、３０～１５０ｎｍ）の直径を有する細胞外小胞を指し、ナノ小胞が操作なしでは細胞によって産生されないような直接的操作または間接的操作によって細胞（例えば、プロデューサー細胞）から生成される。ナノ小胞を産生させるための細胞の適切な操作には、連続押出し、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ナノ小胞の産生は、プロデューサー細胞の破壊をもたらし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合により細胞から得られる小胞を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、ナノ小胞は、足場タンパク質を含む。ナノ小胞は、ひとたびプロデューサー細胞から得られると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。
本明細書で使用されるとき、「微小胞」とは、細胞表面からの膜小胞の外への出芽及びその分裂によって生成される細胞外小胞を指す。
本明細書で使用されるとき、「足場タンパク質」という用語は、ペイロードまたは目的とする任意の他の化合物（例えば、ＡＡＶ）をＥＶに係留するために使用することができるポリペプチドを指す。一部の態様では、足場タンパク質は、ＥＶに天然に存在しないポリペプチドである。一部の実施形態では、足場タンパク質は、合成ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、対応する未修飾タンパク質がＥＶ（「ＥＶタンパク質」）、例えばエキソソームに天然に存在する、修飾タンパク質を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、当該タンパク質が天然起源のものよりも高いレベルで発現される、ＥＶに天然に存在するタンパク質、またはその断片、例えば、ＥＶタンパク質の断片を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、非ポリペプチド部分をさらに含む。他の実施形態では、足場タンパク質は、脂質及び／または炭水化物をさらに含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、（ｉ）天然起源のＥＶタンパク質またはその断片と、（ｉｉ）異種ペプチド（例えば、抗原結合ドメイン、カプシドタンパク質、Ｆｃ受容体、化学誘導二量体の結合パートナー、またはそれらの任意の組み合わせ）とを含む、融合タンパク質を含む。
本明細書で使用されるとき、「結合パートナー」または「二量体化剤」という用語は、互いに相互作用して多量体（例えば、二量体）を形成する少なくとも２つの要素のうちの１つのメンバーを指す。一部の実施形態では、結合パートナーは、第２の結合パートナーと相互作用する第１の結合パートナーである。一部の実施形態では、結合パートナーは、第２の結合パートナー及び／または第３の結合パートナーと相互作用する第１の結合パートナーである。本明細書に開示される組成物及び方法においては、任意の結合パートナーまたは二量体化剤を使用することができる。一部の実施形態では、結合パートナーは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、低分子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある特定の実施形態では、結合パートナー（例えば、第１の結合パートナー及び／または第２の結合パートナー）は、（ｉ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ＦＫ１０１２）、（ｉｉ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）（ＦＫ５０６）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓ（ＦＫＣｓＡ）、（ｉｖ）ＦＫＢＰ及びＦＲＢ（ラパマイシン）、（ｖ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）、（ｖｉ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）、（ｖｉｉ）スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇ（ＨａＸＳ）、（ｖｉｉｉ）ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇ（ＴＭＰ－ＨＴａｇ）、ならびに（ｉｘ）ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）（ＡＢＴ－７３７）からなる群から選択される、化学誘導二量体の第１及び第２の結合パートナーから選択される。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、（ｉ）ＥＶに天然に存在するタンパク質（ＥＶタンパク質）またはその断片と、（ｉｉ）第２のポリペプチド配列とを含む、融合体を含む。「足場Ｘ」という用語は、エキソソームの表面上で最近同定されたエキソソームタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＥＶタンパク質は、米国特許第１０，１９５，２９０号に記載されるＥＶタンパク質から選択され、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の実施形態では、ＥＶタンパク質は、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書で使用されるとき、「足場Ｙ」という用語は、エキソソームの内腔内で新たに同定されたエキソソームタンパク質またはその断片を指す。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９号を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。足場Ｙタンパク質の非限定的な例としては、ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳ」または「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）、ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１」または「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）、及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１」または「ＢＡＳＰ１タンパク質」）からなる群から選択されるものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、足場Ｙタンパク質は、ＥＶタンパク質の断片を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１の断片を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含み、ここで、Ｃ末端グリシン残基は、ミリストイル化されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、（ａ）（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰの断片、または（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）と、（ｂ）膜貫通ドメインとを含み、ここで、膜貫通ドメインは、（ａ）（ｉ）または（ａ）（ｉｉ）の配列のＣ末端に（例えば、リンカーによって）連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、（ａ）（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰの断片、または（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）と、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞外ドメインとを含み、ここで、膜貫通ドメインは、（ａ）（ｉ）または（ａ）（ｉｉ）の配列のＣ末端に（例えば、リンカーによって）連結されており、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端に連結されている。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、膜貫通タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「膜貫通タンパク質」とは、細胞外ドメイン（例えば、ＥＶ、例えばエキソソームの膜の外部、例えば、小胞外に位置する少なくとも１つのアミノ酸）、膜貫通ドメイン（例えば、ＥＶの膜内、例えばエキソソームの膜内に位置する少なくとも１つのアミノ酸）、及び細胞内ドメイン（例えば、ＥＶ、例えばエキソソームの膜の内部、例えば、小胞内に位置する少なくとも１つのアミノ酸）を含む、任意のタンパク質を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載の足場タンパク質は、膜貫通タンパク質のＮ末端が、細胞外空間、例えば、ＥＶ、例えばエキソソームを取り囲む膜の外側（またはその外部）、例えば、小胞外に位置する、Ｉ型膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、本明細書に記載の足場タンパク質は、膜貫通タンパク質のＮ末端が、内腔中、例えば、細胞内空間、例えば、ＥＶ、例えばエキソソームを取り囲む膜の内側、例えば、膜の内腔側、例えば、小胞内に位置する、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。
本明細書で使用されるとき、「細胞外」という用語は、「外部」、「外」、及び「小胞外」という用語と互換的に使用され得、ここで、各用語は、ＥＶを取り囲む膜の外側にある要素を指す。本明細書で使用されるとき、「細胞内」という用語は、「内部」、「内」、及び「小胞内」という用語と互換的に使用され得、ここで、各用語は、ＥＶを取り囲む膜の内側にある要素を指す。「内腔」という用語は、ＥＶを取り囲む膜の内側の空間を指す。したがって、ＥＶの内腔の内側にある要素は、本明細書で「内腔中に位置する」または「内腔の」と称され得る。
本明細書で使用される「係留されている」という用語は、膜に会合している要素を指す。一部の実施形態では、膜に係留されている要素は、膜貫通タンパク質に会合しており、該膜貫通タンパク質が、該要素を膜に係留する。一部の実施形態では、膜に係留されている要素は、膜と相互作用し、それによって該要素を膜に係留するモチーフを含む、足場タンパク質（例えば、ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質）に会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、足場タンパク質のＮ末端にミリストイル化アミノ酸残基を含み、該ミリストイル化アミノ酸が、足場タンパク質をＥＶの膜に係留する。要素は、膜に直接的に（例えば、ペプチド結合）またはリンカーによって係留され得る。
本明細書で使用されるとき、「内腔が操作されたエキソソーム」という用語は、操作されたＥＶ、例えばエキソソームの内腔が修飾前のＥＶ、例えばエキソソームまたは天然起源のＥＶ、例えばエキソソームのそれとは異なるように、ＥＶ、例えばエキソソームの膜または内腔の組成が修飾されている、ＥＶ、例えばエキソソームを指す。操作は、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔が変化するように、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔または膜において直接的であり得る。例えば、膜は、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔が修飾されるように、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物等の組成が修飾される。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。一部の実施形態では、内腔が操作されたエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔中に露出させられ得るか、またはＥＶ、例えばエキソソームの内層上に露出した部分のための係留点（結合）であり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えばエキソソームが天然では発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む。他の実施形態では、内腔が操作されたＥＶ、例えばエキソソームは、操作または修飾されていないエキソソームと比較して、エキソソームの内腔に露出させられ得るか、またはエキソソームの内腔中に露出した部分のための係留点（結合）であり得る、天然エキソソームタンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のＥＶタンパク質）またはその断片もしくはバリアントのより高い発現を含む。
本明細書で使用されるとき、「外部表面が操作されたエキソソーム」という用語は、操作されたＥＶ、例えばエキソソームの外部表面が修飾前のＥＶ、例えばエキソソームまたは天然起源のＥＶ、例えばエキソソームのそれとは異なるように、ＥＶ、例えばエキソソームの膜の組成が修飾されている、ＥＶ、例えばエキソソームを指す。例えば、膜は、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面が修飾されるように、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物等の組成が修飾される。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。一部の実施形態では、外部表面が操作されたエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面上に露出させられ得るか、またはＥＶ、例えばエキソソームの外層上に露出した部分のための係留点（結合）であり得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えばエキソソームが天然では発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む。他の実施形態では、外部表面が操作されたＥＶ、例えばエキソソームは、エキソソームの外部表面に露出させられ得るか、またはエキソソームの外部表面上に提示された部分のための係留点（結合）であり得る、天然エキソソームタンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のＥＶタンパク質）またはその断片もしくはバリアントのより高い発現を含む。
「修飾（された）」という用語は、本明細書に記載の足場タンパク質の文脈で使用される場合、タンパク質、例えば、ＥＶタンパク質の改変または操作により、修飾タンパク質、例えば、足場タンパク質が天然起源のタンパク質、例えば、ＥＶタンパク質とは異なるようになることを指す。一部の実施形態では、本明細書に記載の修飾タンパク質、例えば、足場タンパク質は、天然起源のタンパク質、例えば、ＥＶタンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、修飾タンパク質、例えば、足場タンパク質は、天然起源のタンパク質、例えば、ＥＶタンパク質と比べて１つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態では、修飾タンパク質、例えば、足場タンパク質は、ＥＶタンパク質（またはその断片）と、第２のペプチド配列とを含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、修飾タンパク質、例えば、足場タンパク質は、未修飾タンパク質、例えば、ＥＶタンパク質の１つまたは複数の機能を保持する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＥＶ膜の内腔表面または外部表面、例えば、エキソソームの内腔表面または外部表面と会合する未修飾タンパク質、例えば、ＥＶタンパク質の能力のみを保持する。
本明細書で使用されるとき、「改変された特性」という用語は、本明細書に記載のＥＶ、例えばエキソソーム、及び／またはＡＡＶの文脈で使用される場合、未修飾ＥＶ、例えばエキソソーム、及び／またはＡＡＶと比べた、ＥＶ、例えばエキソソーム、及び／またはＡＡＶの物理的特性及び／または機能特性の変化を指す。一部の実施形態では、改変された特性は、より良好な治療効果を含む。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、未修飾ＡＡＶ、例えば、本明細書に開示されるＥＶの内腔中に存在しないＡＡＶよりも高い感染力、それよりも高い活性、それよりも大きな効力、それよりも速い形質導入速度、及び／またはそれよりも低減された免疫原性（例えば、免疫浸潤に対する増加した寛容性）を有する。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、未修飾ＡＡＶ、例えば、本明細書に開示されるＥＶの内腔中に存在しないＡＡＶよりも免疫応答が起こりにくい。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、未修飾ＡＡＶ、例えば、本明細書に開示されるＥＶの内腔中に存在しないＡＡＶと比較して、対象において免疫応答を誘導する可能性がより低い。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、対象の複数回投薬を可能にし、ここで、ＡＡＶの感染力及び／または活性は、１回目の投薬後に保持される。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、ＡＡＶの感染力及び／または活性を喪失することなく用量漸増研究を可能にする。
本明細書で使用されるとき、タンパク質（例えば、足場タンパク質または治療用タンパク質）の「断片」という用語は、天然起源のタンパク質と比較して当該タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端で欠失のある、または当該タンパク質の任意の部分に欠失のある、天然起源の配列よりも短いタンパク質のアミノ酸配列を指す。本明細書で使用されるとき、「機能的断片」という用語は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。したがって、一部の実施形態では、ＥＶタンパク質の機能的断片を含む足場タンパク質は、ある部分を、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面または外部表面上で係留する能力を保持する。断片が機能的断片であるかどうかは、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ解析、及び、例えばＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との断片の融合を含めた、ＥＶ、例えばエキソソームのタンパク質含量を決定するための当該技術分野で既知の方法によって評価することができる。ある特定の実施形態では、ＥＶタンパク質の機能的断片を含む足場タンパク質は、天然起源のＥＶタンパク質の能力、例えば、ある部分を係留する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。機能的断片は、必ずしも完全長タンパク質のあらゆる機能を保持するものではない。むしろ、一部の実施形態では、断片は、ある部分を係留する、天然起源のＥＶタンパク質の能力を保持する場合、たとえ当該断片が完全長タンパク質の任意の他の機能をもはや保持しない場合であっても、機能的断片である。
本明細書で使用されるとき、分子（例えば、足場タンパク質または治療用タンパク質）の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法によって比較した際に、別の分子とある特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、あるタンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト、または再構成を含み得る。
一部の実施形態では、足場タンパク質のバリアントは、完全長の成熟ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４、ＣＤ１３、ＡＮＰＥＰ、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、ＮＲＰ１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４、ＣＤ１３、ＡＮＰＥＰ、ＭＭＥ、ＥＮＰＰ１、ＮＲＰ１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１タンパク質の断片（例えば、機能的断片）と少なくとも約７０％の同一性を有するバリアントを含む。
「保存的アミノ酸置換」とは、当該アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、これらには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。故に、ポリペプチドにおけるアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸と置き換えられる場合、その置換は保存的と見なされる。別の実施形態では、あるアミノ酸の連なりが、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した連なりと保存的に置き換えられ得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列の最適なアライメントを得るために導入する必要のある付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮した上で、比較ウィンドウにわたってそれらの配列によって共有される、同一のマッチした位置の数を指す。マッチした位置は、標的配列及び参照配列の両方において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が提示される、任意の位置である。ギャップはヌクレオチドでもアミノ酸でもないため、標的配列において提示されるギャップは計数されない。同様に、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸が計数されるため、参照配列において提示されるギャップは計数されない。
配列同一性のパーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基または核酸塩基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内にある位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。２つの配列間の配列の比較及び配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用及びダウンロードの両方で容易に利用可能なソフトウェアを使用して遂行され得る。好適なソフトウェアプログラムが、種々のソースから、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアライメントのために利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能なＢＬＡＳＴプログラム集の一部である、ｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラム集の一部であり、またｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも利用可能な、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する、単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域が各々、それらの独自の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は、小数第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方で、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることにも留意されたい。
当業者であれば、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの生成が、もっぱら一次配列データによって駆動される配列対配列のバイナリ比較に限定されないことを理解しよう。配列アライメントは、多重配列アライメントから得ることができる。多重配列アライメントを生成するための１つの好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から利用可能なＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、代替として、例えばＥＢＩから利用可能である。
また、配列アライメントは、配列データを、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の箇所）、または系統発生学的データ等の異種の供給源からのデータと統合することによって生成され得ることも理解されよう。多重配列アライメントを生成するために異種データを統合する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにて利用可能、また代替として、例えばＥＢＩから利用可能な、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを算出するために使用される最終的アライメントは、自動的にまたは手作業でのいずれかで精選され得ることも理解されよう。
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、または両方における改変を含有することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失を生み出すが、コードされたポリペプチドの特性または活性を改変しない改変を含有する。別の実施形態では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって生み出される。他の実施形態では、５～１０個、１～５個、または１～２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されるバリアントである。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由で、例えば、特定の宿主用にコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを他のもの、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌宿主に変化させる）ために、生み出され得る。
天然起源のバリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドレベル及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで様々であり得、本開示に含まれる。代替として、非天然起源のバリアントは、変異誘発技法によって、または直接合成によって生み出され得る。
タンパク質操作及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、バリアントを生成して、ポリペプチドの特性を改善または改変することができる。例えば、生物学的機能の実質的な喪失を伴わずに、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、アミノ末端の３個、８個、または２７個のアミノ酸残基を欠失させた後であってもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質について報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に、最大で１０倍高い活性を表した（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）（参照によりその全体が本明細書に援用される））。
その上、バリアントは、天然起源のタンパク質の生物学的活性と類似した生物学的活性を保持する場合が多いことを十分な証拠が実証している。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に援用される））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの大規模な変異解析を実施した。同研究者らは、ランダム変異誘発を使用して、分子の全長にわたって１つのバリアント当たり平均２．５個のアミノ酸変化を持つ３，５００個を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。可能なアミノ酸位置の各々で複数の変異を検査した。同研究者らは、「分子の［大半］が、［結合活性または生物学的活性］のいずれかに対する影響をほとんど伴わずに改変可能であった」ことを見出した（要約を参照されたい）。実際、検査した３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、２３個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型とは活性が顕著に異なるタンパク質をもたらした。
上述したように、ポリペプチドバリアントは、例えば、修飾ポリペプチドを含む。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される））、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）等のタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が含まれる。一部の実施形態では、足場タンパク質は、任意の好都合な箇所で修飾される。ある特定の実施形態では、足場タンパク質のＮ末端は、ミリストイル化されている。
「～に会合した」、「～に連結された」、または「～にコンジュゲートされた」という用語は、本明細書で、２つ以上の要素間の直接的または間接的相互作用を指して互換的に使用される。２つの要素は、共有結合性または非共有結合性の結合及び／または相互作用によって互いに会合し得る。一部の実施形態では、第１の要素、例えば、ＡＡＶは、ペプチド結合によって第２の要素、例えば、足場タンパク質に会合している。一部の実施形態では、第１の要素、例えば、ＡＡＶは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって第２の要素、例えば、足場タンパク質に会合している。一部の実施形態では、第１の要素、例えば、ＡＡＶは、非共有結合性の相互作用、例えば、静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、イオン誘起双極子、双極子誘起双極子、イオン結合、配位結合、キレート化、またはそれらの任意の組み合わせによって、第２の要素、例えば、足場タンパク質に会合している。第１の要素及び第２の要素は、直接的に会合し得、例えば、足場タンパク質が、足場タンパク質配列（またはその保存的修飾）もしくはＡＡＶカプシドタンパク質（またはその保存的修飾）の存在部分でないいずれのアミノ酸の介在も伴わずに、ペプチド結合によってＡＡＶカプシドタンパク質に連結されるか、または第１の要素は、間接的会合により第２の要素に会合し得、例えば、ＡＡＶが、足場タンパク質の相互作用によりＥＶの内腔膜に会合し、足場タンパク質のＮ末端が、ＥＶの内腔膜と相互作用し、足場タンパク質のＣ末端が、ＡＡＶカプシドタンパク質に共有結合性で連結される。第１の要素は、少なくとも１つのアミノ酸のリンカーが第１の要素と第２の要素との間に位置付けられる場合、第２の要素に「間接的に連結している」。一部の態様では、第１の要素及び第２の要素は、直接的に会合しており、例えば、足場タンパク質が、足場タンパク質とＡＡＶカプシドタンパク質との間のペプチド結合によってＡＡＶに会合しているか、または第１の要素は、間接的会合により第２の要素に会合しており、例えば、ＡＡＶが、足場タンパク質を用いてＥＶの外部表面に会合し、足場タンパク質が、ＥＶの外部表面に係留され、足場タンパク質のＣ末端もしくはＮ末端が、ＡＡＶカプシドタンパク質に共有結合性で連結される。
「封入された」という用語、またはこの用語の文法的に異なる形態（例えば、封入、または封入すること）は、当該２つの部分の化学的または物理的連結を伴わずに、第１の部分（例えば、ＡＡＶ）を第２の部分（例えば、ＥＶ、例えばエキソソーム）の内部に有する状態またはそのプロセスを指す。一部の実施形態では、「封入された」という用語は、「～の内腔中」と互換的に使用され得る。第１の部分（例えば、ＡＡＶ）を第２の部分（例えば、ＥＶ、例えばエキソソーム）の中に封入することの非限定的な例は、本明細書の他の箇所で開示される。本開示の一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの外部表面に会合した第１のＡＡＶと、ＥＶによって封入された第２のＡＡＶとを含む。本開示の一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの外部表面に会合した第１のＡＡＶと、ＥＶによって封入された第２のＡＡＶと、ＥＶの外部表面に会合した標的化部分とを含む。本開示の一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの外部表面に会合したＡＡＶと、ＥＶの外部表面に会合した標的化部分とを含む。本開示の一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔表面に会合したＡＡＶと、ＥＶの外部表面に会合した標的化部分とを含む。
本明細書で使用されるとき、「プロデューサー細胞」という用語は、ＥＶ、例えばエキソソーム、及び／またはＡＡＶの生成に使用される細胞を指す。プロデューサー細胞は、インビトロで培養された細胞、またはインビボの細胞であり得る。プロデューサー細胞には、ＥＶ、例えばエキソソーム、及び／またはＡＡＶの生成に有効であることが知られる細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆体細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、ｓｆ９昆虫細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＳ０細胞、ＨｅＬａ細胞が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＥＶを生成するために使用されるプロデューサー細胞は、ＡＡＶを生成するために使用される同じ細胞である。一部の実施形態では、ＥＶは、第１のプロデューサー細胞を使用して生成され、ＡＡＶは、第２のプロデューサー細胞を使用して生成され、ここで、第１のプロデューサー細胞は、第２のプロデューサー細胞とは異なる種類の細胞である。一部の実施形態では、ＥＶは、第１のプロデューサー細胞を使用して生成され、ＡＡＶは、第２のプロデューサー細胞を使用して生成され、ここで、第１のプロデューサー細胞は、第２のプロデューサー細胞と同じ細胞である。
本明細書で使用されるとき、「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、ならびに「抽出された」及び「抽出すること」という用語は、互換的に使用され、精製、例えば、所望のＥＶ調製物の選択または濃縮の１つまたは複数のプロセスを経た所望のＥＶの調製物の状態（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）を指す。一部の実施形態では、単離することまたは精製することは、プロデューサー細胞を含有する試料からＥＶ（例えば、その画分）を取り出す、部分的に取り出すプロセスである。一部の実施形態では、単離されたＥＶ組成物は、検出可能な望まれない活性を有しないか、または、代替的には、望まれない活性のレベルもしくは量は、許容されるレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離されたＥＶ組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶの量及び／または濃度を有する。他の実施形態では、単離されたＥＶ組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、プロデューサー細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、または少なくとも約９９．９９９９％であり得る。一部の実施形態では、単離されたＥＶ調製物は、残留する生物由来物質を実質的に含まない。一部の実施形態では、単離されたＥＶ調製物は、いかなる混入生物物質も約１００％含まないか、少なくとも約９９％含まないか、少なくとも約９８％含まないか、少なくとも約９７％含まないか、少なくとも約９６％含まないか、少なくとも約９５％含まないか、少なくとも約９４％含まないか、少なくとも約９３％含まないか、少なくとも約９２％含まないか、少なくとも約９１％含まないか、または少なくとも約９０％含まない。残留する生物由来物質には、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物が含まれ得る。残留する生物由来物質を実質的に含まないことはまた、ＥＶ組成物が検出可能なプロデューサー細胞を含有しないこと、及びＥＶのみが検出可能であることを意味し得る。
本明細書で使用されるとき、「ペイロード」という用語は、ＥＶに接触させられる標的（例えば、標的細胞）に作用する薬剤を指す。ＥＶ、例えばエキソソーム上に含めることができるペイロードの非限定的な例は、ＡＡＶである。ＥＶ中、もしくはＥＶ、例えばエキソソームの外部表面上、及び／またはプロデューサー細胞に導入され得るペイロードには、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素等のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または翻訳を妨害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び低分子（例えば、低分子薬及び毒素）等の薬剤が含まれる。ある特定の実施形態では、ペイロードは、ＡＡＶを含む。
本明細書で使用されるとき、「親和性物質」とは、第２の部分に結合することができる部分を指す。一部の実施形態では、親和性物質は、抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、親和性物質は、受容体、例えば、ＡＡＶ受容体である。一部の態様では、ＡＡＶ親和性物質をコードする発現カセットが、ＡＡＶ産生プラスミドと一緒に標的細胞に一過性でトランスフェクトされる。一部の態様では、ＡＡＶが産生される。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、天然であるか、または部分的もしくは全体的に合成的に生産されたかにかかわらず、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し、それを認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらの断片を含むことが意図され、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、ラクダ抗体、サメＩｇＮＡＲ、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、一本鎖Ｆａｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、ミニボディ等の抗体断片、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、それらが所望の生物学的活性または機能を表す限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、ナノボディである。
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の組成物及び方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物であり、他の実施形態では、対象はヒトである。本明細書で使用されるとき、「哺乳類対象」は、限定されないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）を含む、全ての哺乳動物を含む。
本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶ、例えばエキソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度に基づいて約１０％未満の高分子を含むことを意味する。一部の画分は、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、または約１０％（ｍ／ｖ）未満の高分子を含有し得る。
本明細書で使用されるとき、「高分子」という用語は、核酸、混入タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書で使用されるとき、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））及びＭｏｒｉｓら（Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））によって開示されるＡＡＶ血清型及びクレード、ならびに未知のまたは今後発見される任意の他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。ＡＡＶは、パルボウイルス科のウイルス内のディペンドパルボウイルス（属）を指す。例えば、ＡＡＶは、天然起源の「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然起源のｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質に由来するカプシド中にパッケージングされた組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム及び／または非天然カプシドｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質に由来するカプシド中にパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ」は、ウイルス自体またはその誘導体を指して使用され得る。この用語は、別途具体的に指示される場合を除いて、全てのサブタイプならびに天然起源の形態及び組換え形態の両方を網羅する。ＡＡＶには、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ－１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ－２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ－３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ－４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ－５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ－６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ－７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ－８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ－９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」とは、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」とは、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」とは、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、等である。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（３ｄ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。一部の態様では、ＡＡＶは、非複製型ＡＡＶ、例えば、非感染性ＡＡＶである。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ウイルスベクターを含む。
一部の態様では、本開示は、「単離されたＡＡＶ」を提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、その天然環境から（例えば、宿主細胞、組織、または対象から）単離されたか、または人工的に生産されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を使用して生産することができる。かかるＡＡＶは、本明細書で、「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」と称されることがある。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列と置き換えられたＡＡＶゲノムを有する。本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ由来ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶとは異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための目的とする配列を含む、ＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子及びｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。組換えＡＡＶは、好ましくは、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１つまたは複数の既定の組織（複数可）に特異的に送達されるように、組織特異的標的化能力を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する上で重要な要素である。故に、標的化しようとしている組織に適切なカプシドを有するｒＡＡＶが選択され得る。
「カプシド不含」または「無カプシド」（またはその変形）ベクターまたは核酸分子は、カプシドを含まないベクター構築物を指す。一部の実施形態では、無カプシドベクターまたは核酸分子は、例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする配列を含有しない。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１個のＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）及びカプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。ウイルスまたは粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子等の、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは「ｒＡＡＶベクター粒子」と称され得る。故に、ｒＡＡＶ粒子の生産は、ｒＡＡＶベクターの生産を必然的に含み、これはかかるベクターがｒＡＡＶ粒子内に含まれるためである。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、及びワクシニア等のポックスウイルスを含めた、様々なかかるＡＡＶのヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類、及びトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣ等の寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもまたＡＴＣＣ等の寄託機関から入手可能である。
本明細書で使用されるとき、「末端逆位反復配列」（または「ＩＴＲ」）とは、一組のヌクレオチド（最初の配列）、続いて下流にその逆相補鎖を含む、一本鎖核酸配列の５’末端または３’末端のいずれかに位置する核酸の部分配列、すなわち、回文配列を指す。最初の配列と逆相補鎖との間に介在するヌクレオチド配列は、任意の長さであることができる。
本明細書で使用される「指向性」という用語は、第１の構成成分が第２の構成成分を標的化する能力を指す。一部の態様では、指向性は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１つまたは複数の指定の細胞種に形質導入する能力を指すが、ベクターが１つまたは複数の指定の細胞種において細胞に形質導入するように機能する様態もまた包含し得、すなわち、指向性は、ＡＡＶベクターまたはビリオンの、ある特定の細胞種もしくは組織種（複数可）への優先的な進入及び／またはある特定の細胞種もしくは組織種への進入を容易にする細胞表面との優先的な相互作用を指し、任意選択でかつ好ましくは、これに続いて、例えば組換えウイルスによる、異種ヌクレオチド配列（複数可）の発現のために、細胞においてＡＡＶベクターまたはビリオンによって担持される配列の発現（例えば、転写、及び任意選択で翻訳）が起こる。本明細書で使用されるとき、「形質導入」という用語は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１つまたは複数の特定の細胞種に感染する能力を指し、すなわち、形質導入は、ＡＡＶベクターまたはビリオンの細胞への進入、及びＡＡＶベクターまたはビリオン内に含まれる遺伝物質の細胞への導入により、ベクターゲノムからの発現を得ることを指す。全ての場合ではないが、場合によっては、形質導入及び指向性は、相関し得る。
一部の態様では、ＥＶが特定の細胞、組織、または臓器による取り込みを強化させる能力は、ＥＶ上で発現されるように標的化部分を操作することによって修飾され得る。本明細書で使用されるとき、「標的化部分」という用語は、インビボまたはインビトロで細胞外小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）の分布を変更することができる薬剤（すなわち、ペイロード）を指す。一部の態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上で発現される場合、ＥＶの自然の移動を改変及び／または強化する。標的化部分は、タンパク質、ペプチド、脂質、もしくは炭水化物等の生体分子、または合成分子であり得る。例えば、標的化部分は、親和性リガンド（例えば、抗体、ＶＨＨドメイン、ファージディスプレイペプチド、フィブロネクチンドメイン、ラクダ類、ＶＮＡＲ）、合成重合体（例えば、ＰＥＧ）、天然リガンド／分子（例えば、ＣＤ４０Ｌ、アルブミン、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ５９）、組換えタンパク質（例えば、ＸＴＥＮ）であり得るが、これらに限定されない。本開示とともに使用することができる標的化部分の非限定的な例としては、樹状細胞上に特異的に発現するマーカー（例えば、Ｃｌｅｃ９ＡまたはＤＥＣ２０５）またはＴ細胞上に特異的に発現するマーカー（例えば、ＣＤ３）に結合し得るものが挙げられる。
ある特定の態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上に提示される。標的化部分は、（例えば、遺伝子にコードされた融合分子として）足場タンパク質（例えば、足場Ｘ）に融合されることによってＥＶ表面上に提示され得る。一部の態様では、標的化部分は、化学反応により生物標的化（ｂｉｏ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）部分をＥＶ表面分子に結合させることによってＥＶ表面上に提示され得る。本開示とともに使用することができる標的化部分の非限定的な例としては、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３捕捉非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０７、ＣＤ４０、Ｃｌｅｃ６、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＤＥＣ－２０５、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－１（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、ＣＤ３、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある特定の態様では、標的化部分は、Ｃｌｅｃ９ａタンパク質である。一部の態様では、標的化部分は、ＣＤ３分子である。
本明細書で使用されるとき、「Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ」（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質という用語は、活性化受容体として機能し、骨髄系列細胞（例えば、ＤＣ）上に発現しているＶ群Ｃ型レクチン様受容体（ｇｒｏｕｐ Ｖ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＴＬＲ）を指す。Ｈｕｙｓａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３（２４）：１６６９３－７０１（２００８）、米国特許第９，９８８，４３１Ｂ２号（同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される）。Ｃｌｅｃ９ａの同義語が知られており、これにはＣＤ３７０、ＤＮＧＲ－１、５Ｂ５、ＨＥＥＥ９３４１、及びＣ型レクチンドメイン含有９Ａが含まれる。一部の態様では、Ｃｌｅｃ９ａタンパク質は、ヒトｃＤＣ１細胞上に発現している。一部の態様では、Ｃｌｅｃ９ａタンパク質は、マウスｃＤＣ１及びｐＤＣ細胞上に発現している。別途指定されない限り、本明細書で使用されるＣｌｅｃ９ａは、１つまたは複数の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）由来のＣｌｅｃ９ａを指し得る。
本明細書で使用される「投与すること」とは、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームを含む組成物を、薬学的に許容される経路を介して対象に与えることを意味する。投与経路は、静脈内、例えば、静脈内注射及び静脈内注入であり得る。追加の投与経路には、例えば、皮下、筋肉内、経口、鼻腔、及び肺内投与が含まれる。ＥＶ、例えばエキソソームは、少なくとも１つの賦形剤を含む薬学的組成物の一部として投与することができる。
本明細書で使用される「免疫応答」とは、外来性のまたは異常な作用物質、例えば、ＡＡＶに対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、そのような応答は、これらの作用物質及びそれらによって引き起こされる疾患に対して生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つもしくは複数の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、または好中球）、及びこれらの細胞のうちのいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介され、これにより侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性もしくは他の異常な細胞、または、自己免疫状態もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的標的化、それへの結合、それへの損傷、その破壊、及び／または脊椎動物の身体からのその排除をもたらす。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＴｒｅｇ細胞の活性化もしくは阻害、または免疫系の任意の他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化もしくは阻害が含まれる。したがって、免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される）、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞によって媒介される）、または体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を含み得る。一部の実施形態では、免疫応答は、「阻害性」免疫応答である。阻害性免疫応答は、刺激物質（例えば、ＡＡＶ治療）の効果を遮断または減弱させる免疫応答である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫応答は、ＡＡＶに対する阻害性抗体の産生を含む。
本明細書で使用されるとき、「治療用タンパク質」という用語は、対象に投与され得る、当該技術分野で既知の任意のポリペプチドを指す。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、凝固因子、増殖因子、抗酸化物質、酵素、腫瘍抑制因子遺伝子、ＤＮＡ修復タンパク質、構造タンパク質、抗体、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせから選択されるタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、「凝固因子」という用語は、対象において出血エピソードを予防するかまたはその持続期間を減少させる、天然起源のまたは組換えにより生産された分子、またはその類似体を指す。換言すれば、それは凝固促進活性を有する、すなわち、フィブリノゲンを不溶性フィブリンの網目へと変換して、血液の凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｅ）または凝固（ｃｌｏｔ）を引き起こすことを担う分子を意味する。本明細書で使用される「凝固因子」には、活性化された凝固因子、そのチモーゲン、または活性化可能な凝固因子が含まれる。「活性化可能な凝固因子」とは、活性型に変換されることができる不活性型の（例えば、そのチモーゲン型の）凝固因子である。「凝固因子」という用語は、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－２（ＰＡＩ２）、それらのチモーゲン、それらの活性化型、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される凝固活性とは、最終的にフィブリン塊の形成に達する、及び／または出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）もしくは出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）エピソードの重症度、持続期間、もしくは頻度を低減する、生化学反応のカスケードに関与する能力を意味する。
本明細書で使用される「増殖因子」は、サイトカイン及びホルモンを含めた当該技術分野で既知の任意の増殖因子を含む。一部の実施形態では、増殖因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７）、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバー（例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害性因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６））、コロニー刺激因子（例えば、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エフリン（例えば、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３）、ウシ胎子ソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＧＤＮＦファミリーメンバー（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（例えば、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたは肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン（例えば、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）、ニューロトロフィン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ＮＴ－４、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から選択される。
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、Ｘ連鎖性ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファ－グルコシダーゼ）、低密度リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、ＧＢＡ、ＭＥＣＰ２、ＳＣＮ１Ａ、ＵＢＥ３Ａ、ＤＭＰＫ、ＦＭＲ１、ＧＪＢ１、ＣａＭＫ２、ＨＴＴ、ＡＴＸ３、ＰＭＰ２２、ＣＡＰＮ３、ＤＹＳＦ、ＳＧＣＡ、ＳＧＣＢ、ＳＧＣＧ、ＳＧＣＤ、ＴＮＮ、及びＡＮ０５、またはそれらの任意の組み合わせから選択される遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＡ１ＡＴ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトヘモグロビン（β鎖）遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトｐ５３遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＣＨＭ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトアデニルシクラーゼ６遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＣＴＦＲ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトジストロフィン遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトアルファ－ガラクトシダーゼＡ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＢＤＮＦ経路遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトシトシンデアミナーゼ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒト第ＩＸ因子遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトハンチンチン遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトリポタンパク質リパーゼ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＮＤ４遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＡＲＳＡ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＩＤＵＡ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＩＤＳ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＳＧＳＨ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＡＡＤＣ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトコラーゲンＣ７遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＲＰＥ６５遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＳＭＮ１遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＶＥＧＦ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＷＡＳ遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＭＴＭ１遺伝子によりコードされる。一部の態様では、治療用タンパク質は、ヒトＲＰＧＲ遺伝子によりコードされる。
本明細書で使用されるとき、「異種」または「外因性」という用語は、所与の関連、例えば、細胞またはポリペプチドにおいては通常見出されないような分子を指す。例えば、外因性または異種分子が細胞に導入され得、これらは、例えば、トランスフェクションもしくは他の形態の遺伝子操作による細胞の操作後にのみ存在するか、または異種アミノ酸配列が、それが天然では見出されないタンパク質に存在し得る。
本明細書で使用されるとき、「異種ヌクレオチド配列」という用語は、所与のポリヌクレオチド配列で天然には生じないヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質、例えば、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの半減期を延長することができるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質、例えば、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの流体力学的半径を増加させるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質の生物学的活性または機能（例えば、プロコアグラント活性）に顕著に影響を及ぼすことなく、治療用タンパク質の１つまたは複数の薬物動態特性を改善するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、リンカーによって、異種ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに連結またはつなげられる。異種ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド部分の非限定的な例としては、とりわけ、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部分、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、アルブミン結合低分子、ＸＴＥＮ配列、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、完全なＦｃ領域またはＦｃＲｎに結合するその一部分）、一本鎖Ｆｃ領域（ＳｃＦｃ領域、例えば、ＵＳ２００８／０２６０７３８、ＷＯ２００８／０１２５４３、またはＷＯ２００８／１４３９５４５に記載されるようなもの）、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、５０％未満～５０％超の様々な程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）から選択されるアミノ酸のうちの２種類でできた６～４０アミノ酸のペプチド及び短いポリペプチド、またはそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドは、非ポリペプチド部分に連結されている。非ポリペプチド部分の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合低分子、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ領域」という用語は、天然ＩｇのＦｃ領域に対応する、すなわち、その２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるような、ポリペプチドの一部分として定義される。ある天然Ｆｃ領域は、別のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。対照的に、本明細書で使用される「遺伝的に融合されたＦｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、単一のポリペプチド鎖と遺伝的に連結された（すなわち、単一の連続した遺伝子配列においてコードされる）Ｆｃドメインから構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。
一実施形態では、「Ｆｃ領域」とは、抗体のパパイン切断部位（すなわち、ＩｇＧにおける重鎖定常領域の第１残基を１１４としたときの残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域において始まり、Ｃ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の一部分を指す。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
Ｉｇアイソタイプに応じて、Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン、ならびにヒンジ領域を含み得る。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、キメラタンパク質に、増加した安定性、増加した血清半減期（Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５を参照されたい）、ならびに胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）等のＦｃ受容体への結合（米国特許第６，０８６，８７５号、同第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、ＷＯ０３／０７７８３４、ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）（同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）を含めたいくつかの望ましい特性を付与する。
本明細書で使用される「処置する」、「処置」、または「処置すること」とは、例えば、疾患または病態の重症度の低減；疾患過程の継続期間の低減；疾患または病態に関連する１つまたは複数の症状の改善または排除；疾患または病態の治癒を必ずしも伴わない、疾患または病態を有する対象への有益な効果の提供を指す。この用語はまた、疾患もしくは病態またはその症状の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）も含む。
本明細書で使用される「予防する」または「予防すること」とは、特定の転帰の発生または重症度を減少または低減することを指す。いくつかの実施形態では、転帰の予防は、予防的処置により達成される。
ＩＩ．本開示の組成物
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、ＥＶ、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、エキソソームの内腔内にある。一部の実施形態では、該ＥＶは、足場タンパク質を欠いた参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも多いＡＡＶの数を内腔中に含有する。一部の態様では、該ＥＶは、例えば、足場タンパク質を含むか含まないかのいずれかのＥＶの混合集団中で、足場タンパク質を欠いたＥＶよりもＡＡＶを取り込む可能性が高く、内腔中にＡＡＶのみを含むＥＶよりも高いパーセンテージのＥＶが、内腔中に足場タンパク質及びＡＡＶを含む。
ＩＩ．Ａ．細胞外小胞（ＥＶ）
本明細書に記載のＥＶ、例えばエキソソームは、約２０～３００ｎｍの直径を有する細胞外小胞である。ある特定の実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、約２０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２６０ｎｍ、２０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約９０ｎｍ、約２０ｎｍ～約８０ｎｍ、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２０ｎｍ～約６０ｎｍ、約２０ｎｍ～約５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約４０ｎｍ、約２０ｎｍ～約３０ｎｍ、約３０ｎｍ～約３００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約９０ｎｍ、約３０ｎｍ～約８０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約６０ｎｍ、約３０ｎｍ～約５０ｎｍ、約３０ｎｍ～約４０ｎｍ、約４０ｎｍ～約３００ｎｍ、約４０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約４０ｎｍ～約２００ｎｍ、約４０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約９０ｎｍ、約４０ｎｍ～約８０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約６０ｎｍ、約４０ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約３００ｎｍ、約６０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約２００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約３００ｎｍ、約７０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、約７０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約３００ｎｍ、約８０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約８０ｎｍ～約２００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約３００ｎｍ、約９０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２２０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２１０ｎｍ、約９０ｎｍ～約２００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１７０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、約１１０ｎｍ～約２９０ｎｍ、約１２０ｎｍ～約２８０ｎｍ、約１３０ｎｍ～約２７０ｎｍ、約１４０ｎｍ～約２６０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１６０ｎｍ～約２４０ｎｍ、約１７０ｎｍ～約２３０ｎｍ、約１８０ｎｍ～約２２０ｎｍ、または約１９０ｎｍ～約２１０ｎｍの直径を有する。本明細書に記載のＥＶ、例えばエキソソームのサイズは、下記に記載される方法に従って測定することができる。
本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、外部表面（例えば、細胞外表面）及び内部表面（例えば、内腔表面）を含む膜（「ＥＶ膜」）を含む。ある特定の実施形態では、内部表面は、ＥＶ、例えばエキソソームの内部コア（すなわち、内腔）に面する。ある特定の実施形態では、外部表面は、プロデューサー細胞のエンドソーム、多小胞体、または膜／細胞質と接触し得る。
一部の実施形態では、ＥＶ膜、例えばエキソソーム膜は、脂質二重膜、例えば、脂質二重層を含む。一部の実施形態では、ＥＶ膜、例えばエキソソーム膜は、脂質及び脂肪酸を含む。一部の実施形態では、ＥＶ膜、例えばエキソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。
一部の実施形態では、ＥＶ膜、例えばエキソソーム膜は、内葉及び外葉を含む。内葉及び外葉の組成は、当該技術分野で既知の二重層間（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ）分布アッセイによって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。一部の実施形態では、外葉の組成は、およそ７０～９０％がコリンリン脂質、およそ０～１５％が酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％がホスファチジルエタノールアミンである。一部の実施形態では、内葉の組成は、およそ１５～４０％がコリンリン脂質、およそ１０～５０％が酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％がホスファチジルエタノールアミンである。
一部の実施形態では、ＥＶ膜、例えばエキソソーム膜は、グリカン等の１つまたは複数の多糖類を含む。
一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔内に１つまたは複数の多層体を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、多層体内にある。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、多層体内にはない。
一部の態様では、ＥＶは、マクロファージによるＥＶの取り込みを阻害する表面抗原を含む。一部の態様では、表面抗原は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面に会合している。一部の態様では、表面抗原は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。ある特定の態様では、表面抗原は、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０８７２２）を含む。一部の態様では、表面抗原は、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７の断片を含む。ある特定の態様では、表面抗原は、ＣＤ２４、例えば、ヒトＣＤ２４を含む。一部の態様では、表面抗原は、ＣＤ２４、例えば、ヒトＣＤ２４の断片を含む。
ＩＩ．Ａ．１．標的化部分
一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶの取り込みを導く（例えば、標的化部分）一助となり得る追加のタンパク質（またはその断片）を提示するようにさらに修飾される。ある特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶ、例えばエキソソームは、インビボまたはインビトロでＥＶの分布を変更することができる標的化部分をさらに含む。一部の態様では、標的化部分は、タンパク質、ペプチド、脂質、または合成分子等の生体分子であり得る。
一部の態様では、本開示の標的化部分は、樹状細胞のマーカーに特異的に結合する。ある特定の態様では、マーカーは、樹状細胞上にのみ発現している。一部の態様では、樹状細胞は、前駆（Ｐｒｅ）樹状細胞、炎症性単球由来樹状細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｎｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、骨髄系／古典的樹状細胞１（ｃＤＣ１）、骨髄系／古典的樹状細胞２（ｃＤＣ２）、炎症性単球由来樹状細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞、リゾチーム発現樹状細胞（ＬｙｓｏＤＣ）、クッパー細胞、非古典的単球、またはそれらの任意の組み合わせを含む。これらの樹状細胞上に発現しているマーカーは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５４（１）：３－２０（２０１８）を参照されたい。一部の態様では、標的化部分は、タンパク質であり、該タンパク質は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ６、ＤＣＩＲ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＬＯＸ－１、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、Ｃｌｅｃ１０ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－２（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、ランゲリン、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ３０４、ＸＣＲ１、ＡＸＬ、シグレック６、ＣＤ２０９、ＳＩＲＰＡ、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１８２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１０、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるマーカーに特異的に結合することができる抗体またはその断片である。一部の態様では、本開示に有用なマーカーは、Ｃ型レクチン様ドメインを含む。ある特定の態様では、マーカーは、Ｃｌｅｃ９ａであり、樹状細胞は、ｃＤＣ１である。
一部の態様では、本明細書に開示される標的化部分は、ヒトＣｌｅｃ９ａ及びマウスＣｌｅｃ９ａ（それらの任意のバリアントを含む）の両方に結合することができる。一部の態様では、本開示の標的化部分は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ウマ、またはラットを含むがこれらに限定されない他の種由来のＣｌｅｃ９ａに結合することができる。かかるＣｌｅｃ９ａタンパク質の配列は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第８，４２６，５６５Ｂ２号を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示の標的化部分は、Ｔ細胞のマーカーに特異的に結合する。ある特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。一部の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
一部の態様では、本開示の標的化部分は、筋細胞上のマーカーに特異的に結合する。一部の態様では、筋細胞は、平滑筋細胞である。一部の態様では、筋細胞は、骨格筋細胞である。一部の態様では、筋細胞は、心筋細胞である。一部の態様では、筋細胞上のマーカーは、アルファ－平滑筋アクチン、ＶＥ－カドヘリン、カルデスモン／ＣＡＬＤ１、カルポニン１、ヘキシム（ｈｅｘｉｍ）１、ヒスタミンＨ２ Ｒ；モチリンＲ／ＧＰＲ３８、トランスジェリン／ＴＡＧＬＮ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。一部の態様では、筋細胞上のマーカーは、アルファ－サルコグリカン、ベータ－サルコグリカン、カルパイン阻害剤、クレアチンキナーゼＭＭ／ＣＫＭＭ、ｅＩＦ５Ａ、エノラーゼ２／ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン－サルコグリカン、ＦＡＢＰ３／Ｈ－ＦＡＢＰ、ＧＤＦ－８／ミオスタチン、ＧＤＦ－１１／ＧＤＦ－８、インテグリンアルファ７、インテグリンアルファ７ベータ１、インテグリンベータ１／ＣＤ２９、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤、ＮＣＡＭ－１／ＣＤ５６、トロポニンＩ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。一部の態様では、筋細胞上のマーカーは、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、またはそれらの組み合わせである。
一部の態様では、本開示の標的化部分は、肝臓、脳、膀胱、腎臓、肺、または眼等の標的組織に特異的なマーカーに特異的に結合する。一部の態様では、本開示の標的化部分は、腫瘍細胞上に発現するマーカーに特異的に結合する。一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、シュワン細胞、ニューロン、肝細胞、クッパー細胞、骨髄系列細胞（例えば、好中球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ、例えば、単球系ＭＤＳＣまたは顆粒球系ＭＤＳＣ）、筋細胞、単球、マクロファージ、造血幹細胞、好塩基球、好中球、または好酸球）、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする。一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、骨髄系列細胞を標的とする。一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、マクロファージを標的とする。ある特定の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、関節、皮膚、腸、膀胱、膵臓、リンパ節、脾臓、血液、骨髄、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする。
一部の態様では、本明細書に開示される標的化部分は、ヒトＣＤ３タンパク質またはその断片に結合する。ヒトＣＤ３タンパク質の配列は、当該技術分野で既知である。
一部の態様では、本明細書に開示される標的化部分は、ヒトＣＤ３及びマウスＣＤ３（それらの任意のバリアントを含む）の両方に結合することができる。一部の態様では、本開示の標的化部分は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ウマ、またはラットを含むがこれらに限定されない他の種由来のＣＤ３に結合することができる。かかるＣＤ３タンパク質の配列もまた、当該技術分野で既知である。
一部の態様では、本明細書に開示される標的化部分は、標的化部分に特異的なマーカーを発現している細胞（例えば、ＣＤ３：ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞；Ｃｌｅｃ９ａ：樹状細胞；または筋細胞マーカー）によるＥＶ（例えば、エキソソーム）のより高い取り込みを可能にし得る。一部の態様では、ＥＶの取り込みは、参照物（例えば、標的化部分を含まない対応するＥＶまたは非ＥＶ送達ビヒクル）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。一部の態様では、参照物は、本明細書に開示される標的化部分を発現しないＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む。
本明細書に開示される標的化部分は、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、化学化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
一部の態様では、標的化部分は、Ｃｌｅｃ９ａに特異的に結合することができるペプチドである。例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（２６）：４０４３７－４０４５０（２０１６）を参照されたい。例えば、ある特定の態様では、ペプチドは、Ｃｌｅｃ９ａの可溶性断片を含む。かかるペプチドの非限定的な例は、米国特許第９，９８８，４３１Ｂ２号に記載され、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。ある特定の態様では、ペプチドは、Ａｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３６（４）：６３５－４５（２０１２）、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３６（４）：６４６－５７（２０１２）に記載されるもの等の、Ｃｌｅｃ９ａのリガンド（天然または合成）を含む。Ｃｌｅｃ９ａリガンドを含むペプチドの非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１３／０５３００８Ａ２号に記載され、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、標的化部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができるペプチドである。例えば、ある特定の態様では、ペプチドは、ＣＤ３の可溶性断片を含む。ある特定の態様では、ペプチドは、ＣＤ３のリガンド（天然または合成）を含む。
一部の態様では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の態様では、標的化部分は、一本鎖Ｆｖ抗体断片である。ある特定の態様では、標的化部分は、一本鎖Ｆ（ａｂ）抗体断片である。ある特定の態様では、標的化部分は、ナノボディである。ある特定の態様では、標的化部分は、モノボディである。
一部の態様では、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多く）の標的化部分を含む。ある特定の態様では、１つまたは複数の標的化部分は、本明細書に開示される生物学的に活性な他の外因性分子（例えば、治療分子、アジュバント、または免疫調節剤）と組み合わせて発現される。一部の態様では、１つまたは複数の標的化部分は、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面上に発現され得る。したがって、ある特定の態様では、１つまたは複数の標的化部分は、ＥＶ、例えばエキソソームの外表面上の足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結されている。１つまたは複数の標的化部分が、生物学的に活性な他の外因性分子（例えば、治療分子、アジュバント、または免疫調節剤）と組み合わせて発現される場合、生物学的に活性な他の外因性分子は、ＥＶ、例えばエキソソームの表面（例えば、外表面または内腔表面）上または内腔中に発現され得る。
ＩＩ．Ｂ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶを含むＥＶ、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、ＥＶの内腔中に存在する。
ＡＡＶは、パルボウイルス科のエンベロープを持たない一本鎖ＤＮＡウイルスである。パルボウイルス科のほとんどの他のメンバーとは対照的に、ＡＡＶは、複製欠損型であり、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスの存在下でしか効率的に複製することができない。
ＡＡＶは、アデノウイルスのウイルス調製物の混入物として１９６０年代中旬に最初に報告された。Ａｔｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １４９（３６８５），７５４－７５６（１９６５）を参照されたい。それ以来、ＡＡＶを組換えＤＮＡベクターとして使用するための次第により安全でより有効な方法が開発されてきた。例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（２０），６４６６－６４７０（１９８４）、Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，２３（１），６５－７３（１９８３）、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（７），９３８－９４５（１９９８）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２（３）２２２４－２２３２（１９９８）を参照されたい。宿主染色体に組み込まれ得るＡＡＶゲノムは数少ないことが報告されている（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８０；３３：７３９－７４８）。ＡＡＶは、いずれの既知のアデノウイルス抗原とも免疫学的に明確に異なる。ＡＡＶカプシドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを含有する（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６９；６４：８６３－８６９。
ＡＡＶは、２つのＩＴＲが隣接した複製（ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子をコードする４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有する。それは主として非組込み型であり、非分裂組織において安定なエピソームを形成する。成人ヒト集団におけるその高い血清有病率にもかかわらず、それはいずれのヒト疾患にも関連付けられていない。Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｍ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．２，４３（２００５）を参照されたい。組織におけるＡＡＶの安定発現、その病原性の欠如、及びその高力価での生産の容易さにより、それは非常に魅力的で普及した遺伝子導入プラットフォームとなっている。
組換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列と置き換えられた、遺伝子操作されたＡＡＶである。野生型ＡＡＶと同様に、ｒＡＡＶは、有糸分裂後の組織において導入遺伝子の長期的な発現を誘発し得、これはｒＡＡＶの組換えゲノムが核内で主として環状のエピソームとして存続するためである可能性が最も高い。ｒＡＡＶの生産に必要とされるｒＡＡＶの唯一のシスエレメントはＡＡＶ ＩＴＲであるが、一方で、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパー遺伝子がトランスで提供され得る。故に、本明細書に開示される一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＩＴＲが隣接した導入遺伝子ＤＮＡのみを含有し、このゲノムは、血清型特異的カプシド内でカプシド形成される。
ＡＡＶは、外来性ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的なものとする固有の特徴を持つ。培養物中での細胞のＡＡＶ感染は一般に非細胞変性となっており、ヒト及び他の動物の自然感染は、不顕性かつ無症候性である。その上、ＡＡＶは、多くの異なる種類の哺乳類細胞に感染するため、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容する。ＡＡＶはまた、他の形態の遺伝子送達と比較してより軽度の免疫応答の促進、ならびに非組込み型ベクターとしての分裂細胞及び静止細胞の両方における持続的発現を含めた、遺伝子送達のためにそれを特に魅力的なウイルス系とする追加の利点を持つ。また、ＡＡＶは、アデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃～６５℃、数時間）に持ちこたえるため、ｒＡＡＶに基づくワクチンの低温保存の重要性を低くする。
ヘルパーウイルスは、標的細胞中へのＡＡＶ形質導入及びＡＡＶゲノムの進入に必要とされない。さらに、ＡＡＶの複製、ゲノムのカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、故に、内部のおよそ４．７ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、遺伝子治療剤としてのＡＡＶの使用に必要不可欠ないずれの機能性も喪失することなく、プロモーター、目的とするＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセット等の外来性ＤＮＡと置き換えることができる。
ＡＡＶベクターは、シスまたはトランスで機能する追加のエレメントを含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムを含むＡＡＶベクターはまた、ドナー配列の５’末端もしくは３’末端に隣接する１つもしくは複数のＩＴＲ配列；構成的もしくは制御可能な調節エレメント、または組織特異的発現調節エレメント等の、ドナー配列の転写を駆動する発現調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）；イントロン配列、スタッファーもしくはフィラーポリヌクレオチド配列；及び／またはドナー配列の３’側に位置するポリ－アデニン配列も有する。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、ヘルパーウイルスを使用して複製する。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、及びワクシニア等のポックスウイルスを含めた、様々なかかるＡＡＶのヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。個々のアデノウイルス型は、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類、及びトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣ等の寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもまたＡＴＣＣ等の寄託機関から入手可能である。
ＥＶ産生の間、形成中のＥＶの近傍における産生細胞のサイトゾルに存在する分子は、形成中のＥＶによって天然に捕捉される。結果として、ＥＶ及びＡＡＶの両方を産生している細胞は、ＥＶの内腔中に少なくとも１個のＡＡＶを有する一部のＥＶを天然に生み出す。本開示のある特定の態様は、形成中のＥＶによって天然に、例えば受動的に捕捉されるよりも多くのＡＡＶをＥＶの内腔中に有するＥＶを対象とする。一部の実施形態では、該ＥＶの内腔中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも多い。一部の実施形態では、参照ＥＶは、この天然プロセスによりＡＡＶに会合したＡＡＶを含む。形成中のＥＶ、例えば、足場タンパク質を欠いた参照ＥＶの内腔中に天然に捕捉されるＡＡＶの正確な数は、様々であろう。一部の実施形態では、この機構により参照ＥＶに存在するＡＡＶの数は、１つのＥＶ当たり約１個のＡＡＶ、１つのＥＶ当たり約２個のＡＡＶ、１つのＥＶ当たり約３個のＡＡＶ、または１つのＥＶ当たり約４個のＡＡＶである。一部の実施形態では、参照ＥＶに存在するＡＡＶの数は、１つのＥＶ当たり約７個未満、約６個未満、約５個未満、約４個未満、約３個未満、または約２個未満のＡＡＶである。
一部の実施形態では、本開示のＥＶ内腔中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍多い。一部の実施形態では、該ＥＶ中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも約２倍～約１０倍、約３倍～約１０倍、約４倍～約１０倍、約５倍～約１０倍、約２倍～約９倍、約２倍～約８倍、約２倍～約７倍、約２倍～約６倍、約２倍～約５倍、約２倍～約４倍、約２倍～約３倍、約３倍～約９倍、約３倍～約８倍、約３倍～約７倍、約３倍～約６倍、約３倍～約５倍、約３倍～約４倍、約４倍～約９倍、約４倍～約８倍、約４倍～約７倍、約４倍～約６倍、約４倍～約５倍、約５倍～約９倍、約５倍～約８倍、約５倍～約７倍、または約５倍～約６倍多い。一部の実施形態では、本開示のＥＶ中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも少なくとも約２倍多い。一部の実施形態では、本開示のＥＶ中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも少なくとも約３倍多い。一部の実施形態では、本開示のＥＶ中のＡＡＶの数は、参照ＥＶの内腔中のＡＡＶの数よりも少なくとも約４倍多い。一部の実施形態では、ＥＶ及び参照ＥＶは、およそ同じサイズである。
一部の態様では、少なくとも約０．０１％～約１００％のＥＶ、例えばエキソソームが、エキソソームの内腔中にＡＡＶを含む。一部の態様では、少なくとも約０．１％～約１００％、少なくとも約１％～約１００％、少なくとも約５％～約１００％、少なくとも約１０％～約１００％、少なくとも約１５％～約１００％、少なくとも約２０％～約１００％、少なくとも約２５％～約１００％、少なくとも約３０％～約１００％、少なくとも約４０％～約１００％、少なくとも約５０％～約１００％、少なくとも約６０％～約１００％、少なくとも約７０％～約１００％、少なくとも約８０％～約１００％、少なくとも約９０％～約１００％のＥＶ、例えばエキソソームが、エキソソームの内腔中にＡＡＶを含む。一部の態様では、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％のＥＶ、例えばエキソソームが、エキソソームの内腔中にＡＡＶを含む。
一部の態様では、１つよりも多くのＥＶを含む試料中での、足場部分と、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔中の少なくとも１個のＡＡＶ分子とを含む、ＥＶ、例えばエキソソームのパーセントは、ＡＡＶを含むが足場部分を欠いたＥＶ、例えばエキソソームのパーセントと比べて増加する。一部の態様では、少なくとも約０．０１％～約１００％のＥＶ、例えばエキソソームが、エキソソームの内腔中のＡＡＶと、足場部分とを含む。一部の態様では、少なくとも約０．１％～約１００％、少なくとも約１％～約１００％、少なくとも約５％～約１００％、少なくとも約１０％～約１００％、少なくとも約１５％～約１００％、少なくとも約２０％～約１００％、少なくとも約２５％～約１００％、少なくとも約３０％～約１００％、少なくとも約４０％～約１００％、少なくとも約５０％～約１００％、少なくとも約６０％～約１００％、少なくとも約７０％～約１００％、少なくとも約８０％～約１００％、少なくとも約９０％～約１００％のＥＶ、例えばエキソソームが、エキソソームの内腔中のＡＡＶと、足場部分とを含む。一部の態様では、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％のＥＶ、例えばエキソソームが、エキソソームの内腔中のＡＡＶと、足場部分とを含む。
一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約２個のＡＡＶ、少なくとも約３個のＡＡＶ、少なくとも約４個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ、少なくとも約６個のＡＡＶ、少なくとも約７個のＡＡＶ、少なくとも約８個のＡＡＶ、少なくとも約９個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ、少なくとも約１１個のＡＡＶ、少なくとも約１２個のＡＡＶ、少なくとも約１３個のＡＡＶ、少なくとも約１４個のＡＡＶ、少なくとも約１５個のＡＡＶ、少なくとも約１６個のＡＡＶ、少なくとも約１７個のＡＡＶ、少なくとも約１８個のＡＡＶ、少なくとも約１９個のＡＡＶ、少なくとも約２０個のＡＡＶ、少なくとも約２１個のＡＡＶ、少なくとも約２２個のＡＡＶ、少なくとも約２３個のＡＡＶ、少なくとも約２４個のＡＡＶ、少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約２６個のＡＡＶ、少なくとも約２７個のＡＡＶ、少なくとも約２８個のＡＡＶ、少なくとも約２９個のＡＡＶ、少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約６０個のＡＡＶ、少なくとも約７０個のＡＡＶ、少なくとも約８０個のＡＡＶ、少なくとも約９０個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ、少なくとも約１５０個のＡＡＶ、少なくとも約２００個のＡＡＶ、少なくとも約２５０ＡＡＶ、少なくとも約３００個のＡＡＶ、少なくとも約３５０個のＡＡＶ、少なくとも約４００個のＡＡＶ、少なくとも約４５０個のＡＡＶＳ、または少なくとも約５００個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約６００個のＡＡＶ、少なくとも約７００個のＡＡＶ、少なくとも約８００個のＡＡＶ、少なくとも約９００個のＡＡＶ、または少なくとも約１０００個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１０００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約９００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約８００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約７００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約６００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約５００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１０００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約９００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約８００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約７００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約６００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約５００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約４００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約１０００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約９００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約８００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約７００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約６００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約５００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約４００個のＡＡＶ、少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約３００個のＡＡＶ、または少なくとも約１００個のＡＡＶ～少なくとも約２００個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約６０個のＡＡＶ、少なくとも約１０ＡＡＶ～少なくとも約７０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約８０個のＡＡＶ、または少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約９０個のＡＡＶを含む。
一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約７５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約７５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、または少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１５個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約５～少なくとも約２０個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約５～少なくとも約１０個のＡＡＶを含む。
一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約４個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約５個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約６個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約７個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約８個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約９個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１０個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１１個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１２個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１３個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１４個のＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＥＶは、ＥＶの内腔中に少なくとも約１５個のＡＡＶを含む。
一部の実施形態では、本開示のＥＶは、足場タンパク質を用いずに調製された参照ＥＶと比較してより均一な様態（例えば、ＥＶ中のＡＡＶの数）でＥＶ中にＡＡＶを含有する。一部の実施形態では、本開示のＥＶは、ＥＶ中に約５～約１０、約６～約１０、約７～約１０、約８～約１０個のＡＡＶを含有する一方で、参照ＥＶは、ＡＡＶの数が０個から、５個からと様々であり得る。他の実施形態では、本開示のＥＶは、本明細書に開示される足場タンパク質を使用することによって、ＥＶ中のＡＡＶの数を調節することができる。例えば、足場タンパク質の使用は、ＥＶが細胞から産生されるときにＡＡＶがＥＶの内腔表面で結合させられること、及び損傷または標的の部位でＡＡＶがＥＶから切り離されることを可能にする。他の実施形態では、足場タンパク質（例えば、化学誘導二量体パートナー）の使用は、ＥＶが細胞から産生されるときにＡＡＶがＥＶの内腔表面で結合させられること、及び化学物質がＥＶから除去された後にＡＡＶがＥＶから切り離されることを可能にする。したがって、本開示のＥＶは、ＥＶ中のＡＡＶの効率的で均一な負荷を可能にする。
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、ＥＶ、例えばエキソソームを対象とし、ここで、ＡＡＶは、ＥＶの外部表面に会合している。一部の実施形態では、本開示のＥＶは、例えば内腔ペイロードとして、ＡＡＶをＥＶに会合させる他の方法よりも均一な様態で、ＡＡＶの表面に会合したＡＡＶを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶの内腔中に負荷することができるよりも多くのＡＡＶをＥＶ表面に会合させることができるため、対象に送達され得るＡＡＶの数が増加する。一部の実施形態では、少なくとも約１００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約２００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約３００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約４００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約５００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約６００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約７００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約８００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約９００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１０００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１１００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１２００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１３００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１４００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１５００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１６００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１７００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１８００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１９００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約２０００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１～少なくとも約２０００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１～少なくとも約１０００個のＡＡＶが、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、少なくとも約１～少なくとも約９００、少なくとも約１～少なくとも約８００、少なくとも約１～少なくとも約７００、少なくとも約１～少なくとも約６００、少なくとも約１～少なくとも約５００、少なくとも約１～少なくとも約４５０、少なくとも約１～少なくとも約４００、少なくとも約１～少なくとも約３５０、少なくとも約１～少なくとも約３２５、少なくとも約１～少なくとも約３００、少なくとも約１～少なくとも約２７５、少なくとも約１～少なくとも約２５０、少なくとも約１～少なくとも約２２５、少なくとも約１～少なくとも約２００、少なくとも約１～少なくとも約１７５、少なくとも約１～少なくとも約１５０、少なくとも約１～少なくとも約１２５、少なくとも約１～少なくとも約１００、少なくとも約１～少なくとも約９０、少なくとも約１～少なくとも約８０、少なくとも約１～少なくとも約７０、少なくとも約１～少なくとも約６０、少なくとも約１～少なくとも約５０、少なくとも約１～少なくとも約４５、少なくとも約１～少なくとも約４０、少なくとも約１～少なくとも約３５、少なくとも約１～少なくとも約３０、少なくとも約１～少なくとも約２５、少なくとも約１～少なくとも約２０、少なくとも約１～少なくとも約１５、少なくとも約１～少なくとも約１４、少なくとも約１～少なくとも約１３、少なくとも約１～少なくとも約１２、少なくとも約１～少なくとも約１１、少なくとも約１～少なくとも約１０、少なくとも約１０～少なくとも約５００、少なくとも約１０～少なくとも約４５０、少なくとも約１０～少なくとも約４００、少なくとも約１０～少なくとも約３５０、少なくとも約１０～少なくとも約３２５、少なくとも約１０～少なくとも約３００、少なくとも約１０～少なくとも約２７５、少なくとも約１０～少なくとも約２５０、少なくとも約１０～少なくとも約２２５、少なくとも約１０～少なくとも約２００、少なくとも約１０～少なくとも約１７５、少なくとも約１０～少なくとも約１５０、少なくとも約１０～少なくとも約１２５、少なくとも約１０～少なくとも約１００、少なくとも約１０～少なくとも約９０、少なくとも約１０～少なくとも約８０、少なくとも約１０～少なくとも約７０、少なくとも約１０～少なくとも約６０、少なくとも約１０～少なくとも約５０、少なくとも約１０～少なくとも約４５、少なくとも約１０～少なくとも約４０、少なくとも約１０～少なくとも約３５、少なくとも約１０～少なくとも約３０、少なくとも約１０～少なくとも約２５、少なくとも約１０～少なくとも約２０、少なくとも約１００～少なくとも約１０００、少なくとも約１００～少なくとも約９００、少なくとも約１００～少なくとも約８００、少なくとも約１００～少なくとも約７００、少なくとも約１００～少なくとも約６００、少なくとも約１００～少なくとも約５００、少なくとも約１００～少なくとも約４００、少なくとも約１００～少なくとも約３００、少なくとも約１００～少なくとも約２００個のＡＡＶが、ＥＶの外部表面に会合している。
当該技術分野で既知の任意のＡＡＶを本開示の組成物で使用することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶは、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３Ａ型ＡＡＶ、３Ｂ型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、２型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、３Ａ型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ３Ａである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、３Ｂ型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ３Ｂである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、４型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ４である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、５型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ５である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、６型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ６である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、７型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ７である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、８型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、９型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、１０型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１０である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、合成ＡＡＶである。
一部の態様では、ＡＡＶは、特有の組織標的化能力（例えば、組織指向性）を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶはさらに、非バリアント親カプシドポリペプチドと比較して、１つまたは複数のヒト幹細胞種において増加した形質導入または指向性を表す。一部の実施形態では、ヒト幹細胞種には、胚性幹細胞、成体組織幹細胞（すなわち、体性幹細胞）、骨髄、前駆細胞、誘導多能性幹細胞、及び初期化された幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、成体幹細胞は、オルガノイド幹細胞（すなわち、体内の目的とする任意の臓器または臓器系に由来する幹細胞）を含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶの標的組織は、生殖腺、横隔膜、心臓、胃、肝臓、脾臓、膵臓、または腎臓である。一部の実施形態では、ＡＡＶは、皮膚、毛髪、爪、感覚受容器官、汗腺、油腺、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果体、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓（島組織）、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃腺、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、虫垂、腎臓、尿管、膀胱、尿道、精巣、精管（ｄｕｃｔｕｓ ｄｅｆｅｒｅｎｓ）（精管（ｖａｓ ｄｅｆｅｒｅｎｓ））、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、卵管（ｕｔｅｒｉｎｅ ｔｕｂｅ）（卵管（ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ））、膣、外陰、及び乳腺（乳房）を含むがこれらに限定されない身体の臓器を標的とする。身体の臓器系には、外皮系、骨格系、筋系、神経系、内分泌系、心血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、及び生殖系が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、形質導入及び／または指向性は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％増加する。一部の実施形態では、形質導入及び／または指向性は、少なくとも約５％～少なくとも約８０％、少なくとも約１０％～少なくとも約７０％、少なくとも約２０％～少なくとも約６０％、または少なくとも約３０％～少なくとも約６０％増加する。
一部の態様では、本開示のＡＡＶは、本明細書に開示されるように、ＥＶに会合していないＡＡＶと比較して１つまたは複数の改変された特性を有する。一部の実施形態では、改変された特性は、ＡＡＶ単独よりも良好な治療効果を含む。一部の実施形態では、より良好な治療効果は、免疫回避の改善、再投薬の能力の改善、用量を増減する能力の改善、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、対象において免疫応答を誘導する可能性がより低い。これは特に、本開示のＡＡＶが、既存の中和抗体とともに対象に投与されることを可能にする。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶは、本明細書に開示されるように、ＥＶに会合していないＡＡＶと比較してより速い取り込み及び／または改善された形質導入速度を引き出す。
ＩＩ．Ｂ．１．ＡＡＶ融合構築物
一部の実施形態では、ＡＡＶは、本明細書に記載の足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのタンパク質に連結されている。一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含み、ここで、ＡＡＶは、エキソソームの内腔表面に会合している。
一部の態様では、ＥＶ、例えばエキソソームは、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含み、ここで、ＡＡＶは、エキソソームの外部表面に会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、外部ドメイン、例えば、ＥＶ膜の外部に位置するドメインを含み、ここで、ＡＡＶは、足場タンパク質の外部ドメインに会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、膜貫通領域をさらに含み、ここで、膜貫通領域は、ＥＶの膜に係留されている。
ＡＡＶは、足場タンパク質に直接的または間接的に会合し得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは、１つまたは複数の共有結合によって足場タンパク質に会合している。他の実施形態では、ＡＡＶは、１つまたは複数の非共有結合性の相互作用によって足場タンパク質に会合している。
ある特定の実施形態では、足場タンパク質とＡＡＶとの間の会合は、足場タンパク質とＡＡＶのタンパク質との間のものである。
ＡＡＶの一本鎖ゲノムは、ｒｅｐ（複製）、ｃａｐ（カプシド）、及びａａｐ（アセンブリ）の３つの遺伝子を含む。これらの３つの遺伝子は、３種のプロモーター、選択的翻訳開始部位、及び差動スプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）の使用により、３種のカプシドタンパク質を含めた、少なくとも９種の遺伝子産物を生じさせる。
ｃａｐ遺伝子の発現は、ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を生じさせ、これらのウイルスカプシドタンパク質は、細胞結合及び内部移行に能動的に関与すると同時にウイルスゲノムを保護するカプシド外殻を形成する。ウイルスコートは、正二十面体構造に配置された６０個のタンパク質から構成されると推定される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、１：１：１０の比での３種のタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の６０個のコピー、例えば、５個のＶＰ１タンパク質、５個のＶＰ２タンパク質、及び５０個のＶＰ３タンパク質から構成される。
ｒｅｐ遺伝子は、４種のタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードし、これらのタンパク質は、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングに必要とされる。ａａｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子と重複する選択的リーディングフレーム内でアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。この核タンパク質は、カプシドアセンブリに足場機能を提供すると考えられており、一部のＡＡＶ血清型におけるＶＰタンパク質の核小体局在化において役割を果たす。
一部の実施形態では、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはａａｐ遺伝子のうちの１つまたは複数は、天然起源のものであり、例えば、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはａｐｐ遺伝子は、パルボウイルスのｒｅｐ、ｃａｐ、またはａａｐ遺伝子の全てまたは一部分を含む。一部の実施形態では、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはａａｐ遺伝子のうちの１つまたは複数は、合成配列を含む。
一実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、合成配列を含む。一実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、合成配列を含む。一実施形態では、ａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。一実施形態では、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、合成配列を含む。一実施形態では、ｒｅｐ及びａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。一実施形態では、ｃａｐ及びａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。一実施形態では、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。
一部の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＡＡＶゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ１ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ３ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ４ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ５ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ６ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ７ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ８ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ９ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ１０ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｒｅｐは、ＡＡＶ１１ゲノムに由来する。
一部の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＡＡＶゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ１ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ３ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ４ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ５ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ６ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ７ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ８ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ９ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ１０ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ｃａｐは、ＡＡＶ１１ゲノムに由来する。
一部の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＡＡＶゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ１ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ３ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ４ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ５ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ６ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ７ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ８ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ９ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ１０ゲノムに由来する。特定の実施形態では、ａａｐは、ＡＡＶ１１ゲノムに由来する。
本明細書に記載の特定のＡＡＶゲノムが、異なるＡＡＶゲノム（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１由来のゲノム）由来の遺伝子を有する可能性があることを理解されたい。故に、本明細書では、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはａａｐのあらゆる可能性のある順列を含むＡＡＶが開示される。
本明細書に開示される一部の実施形態では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、及びａａｐ遺伝子のうちの１つまたは複数を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｃａｐ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ａａｐ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子を欠いており、かつｃａｐ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子を欠いており、かつａａｐ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｃａｐ遺伝子を欠いており、かつａａｐ遺伝子を欠いている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、及びａａｐ遺伝子を欠いている。
本明細書に開示される一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ遺伝子のうちの１つまたは複数の発現が修飾されるようにｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、及びａａｐ遺伝子のうちの１つまたは複数を変異させるように修飾される。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子が、変異させられる。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子が、変異させられる。一部の実施形態では、ａａｐ遺伝子が、変異させられる。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子が、変異させられる。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子及びａａｐ遺伝子が、変異させられる。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子及びａａｐ遺伝子が、変異させられる。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、及びａａｐ遺伝子が、変異させられる。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ１タンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶの５個のＶＰ１タンパク質の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの４個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの３個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの２個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの１個に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない４個のＶＰ１タンパク質を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ２タンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶの５個のＶＰ２タンパク質の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの４個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの３個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの２個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの１個に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない４個のＶＰ２タンパク質を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ３タンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のサブセットの各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約９個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約８個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約７個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約６個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの１個に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも１０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも１５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも２０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも２５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも３０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも３５個のＶＰ３タンパク質を含む。足場タンパク質．一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも４０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも４５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質に連結または会合したＶＰ３の数は、足場タンパク質に連結または会合していない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質の数よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍少ない。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した４個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した５個のＶＰ２タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した４個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した５個のＶＰ１タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、足場タンパク質に連結または会合した５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、１つまたは複数のペプチド結合によってＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結されている。足場タンパク質は、カプシドタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端で、またはカプシドタンパク質のＮ末端とＣ末端との間でＡＡＶカプシドタンパク質に連結または会合し得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、カプシドタンパク質のＮ末端に連結または会合している。他の実施形態では、足場タンパク質は、カプシドタンパク質のＣ末端に連結または会合している。一部の実施形態では、足場タンパク質のＮ末端は、ＡＡＶのカプシドタンパク質のＣ末端に連結されている。他の実施形態では、足場タンパク質のＣ末端は、ＡＡＶのカプシドタンパク質のＮ末端に連結されている。
足場タンパク質は、直接的に、または間接的に、例えば、リンカーによってのいずれかで、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結または会合し得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、リンカーによってカプシドタンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個のアミノ酸、少なくとも約３個のアミノ酸、少なくとも約４個のアミノ酸、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約６個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、少なくとも約８個のアミノ酸、少なくとも約９個のアミノ酸、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約１１個のアミノ酸、少なくとも約１２個のアミノ酸、少なくとも約１３個のアミノ酸、少なくとも約１４個のアミノ酸、少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約１６個のアミノ酸、少なくとも約１７個のアミノ酸、少なくとも約１８個のアミノ酸、少なくとも約１９個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約３５個のアミノ酸、少なくとも約４０個のアミノ酸、少なくとも約４５個のアミノ酸、または少なくとも約５０である。
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、ＥＶを対象とし、ここで、ＡＡＶは、化学誘導二量体の結合パートナーまたは二量体化剤に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ１タンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶの５個のＶＰ１タンパク質の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの４個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの３個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの２個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの１個に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない４個のＶＰ１タンパク質を含む。
一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ２タンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶの５個のＶＰ２タンパク質の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの４個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの３個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの２個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの１個に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない４個のＶＰ２タンパク質を含む。
一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ３タンパク質に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のサブセットの各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１０個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約９個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約８個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約７個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約６個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約５個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２個の各々に連結または会合している。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの１個に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約１０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約１５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約２０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約２５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約３０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約３５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約４０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも約４５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、結合パートナーに連結または会合したＶＰ３の数は、結合パートナーに連結または会合していない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質の数よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍少ない。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した４個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した５個のＶＰ２タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した４個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した５個のＶＰ１タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結または会合した５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に連結または会合している。他の実施形態では、結合パートナーは、カプシドタンパク質のＣ末端に連結または会合している。他の実施形態では、結合パートナーは、例えば、カプシドタンパク質のＮ末端とＣ末端との間で、カプシドタンパク質内に挿入される。一部の実施形態では、結合パートナーは、カプシドタンパク質内に挿入される。ある特定の実施形態では、結合パートナーは、内部ループ、例えば、カプシドタンパク質の表面上にあるループ構造を形成する一連のアミノ酸内で、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。ある特定の実施形態では、結合パートナーは、アミノ酸４５５（配列番号４４の番号付けに対して）のすぐ下流で、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｇｌｙ４５３（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｔｈｒ４５４（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、結合パートナーは、Ｔｈｒ４５５（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の態様では、第１の結合パートナーは、Ｔｈｒ４５６（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｇｌｎ４５７（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｓｅｒ４５８（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ａｒｇ４５９（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、結合パートナーは、４５３ＧＴＴＴＱＳＲ４５９（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に、または他のＡＡＶ血清型のＶＰタンパク質の相同領域中に挿入される。特定の実施形態では、結合パートナーは、Ｔｈｒ４５５（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、少なくとも１個のＶＰ３タンパク質内に挿入される。特定の実施形態では、結合パートナーは、４５３ＧＴＴＴＱＳＲ４５９（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、少なくとも１個のＶＰ３タンパク質内に、または他のＡＡＶ血清型のＶＰタンパク質の相同領域中に挿入される。一部の態様では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶ２のＶＰ２のアミノ酸配列に対してＡｒｇ５８５、Ａｒｇ５８７、及びＡｒｇ５８８、またはそれらの任意の組み合わせから選択される部位で、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の態様では、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３は、内部ミリスチル化部位を含むように修飾される。一部の態様では、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３は、内部表面ループ内に内部ミリスチル化部位を含むように修飾される。
結合パートナーは、直接的に、または間接的に、例えば、リンカーによってのいずれかで、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結または会合し得る。一部の実施形態では、結合パートナーは、リンカーによってカプシドに連結または会合している。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個のアミノ酸、少なくとも約３個のアミノ酸、少なくとも約４個のアミノ酸、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約６個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、少なくとも約８個のアミノ酸、少なくとも約９個のアミノ酸、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約１２個のアミノ酸、少なくとも約アミノ酸、少なくとも約１３個のアミノ酸、少なくとも約１４個のアミノ酸、少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約１６個のアミノ酸、少なくとも約１７個のアミノ酸、少なくとも約１８個のアミノ酸、少なくとも約１９個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約３５個のアミノ酸、少なくとも約４０個のアミノ酸、少なくとも約４５個のアミノ酸、または少なくとも約５０である。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質に連結または会合した結合パートナーは、（ｉ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ＦＫ１０１２）、（ｉｉ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）（ＦＫ５０６）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓ（ＦＫＣｓＡ）、（ｉｖ）ＦＫＢＰ及びＦＲＢ（ラパマイシン）、（ｖ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）、（ｖｉ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）、（ｖｉｉ）スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇ（ＨａＸＳ）、（ｖｉｉｉ）ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇ（ＴＭＰ－ＨＴａｇ）、ならびに（ｉｘ）ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）（ＡＢＴ－７３７）からなる群から選択される化学誘導二量体の１つの結合パートナーから選択される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結または会合している。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＲＢに連結または会合している。一部の実施形態では、ＦＲＢは、ｍＴＯＲのＦＲＢである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、カルシニューリンＡに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧｙｒＢに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧＡＩに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧＩＤ１に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧＡＩに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、スナップタグに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧＡＩに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＢＣＬ－ｘＬに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｆａｂに連結または会合している。
特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＦＲＢに連結または会合した少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含み、ここで、ＦＲＢは、カプシドタンパク質のＮ末端に連結または会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＦＲＢに連結または会合した少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含み、ここで、ＦＲＢは、カプシドタンパク質のＣ末端に連結または会合している。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＦＲＢに連結または会合した少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含み、ここで、ＦＲＢは、カプシドタンパク質内に挿入される。一部の実施形態では、ＦＲＢは、本明細書に開示される任意の箇所で、カプシドタンパク質内に挿入される。
ＩＩ．Ｂ．２．ＡＡＶ核酸分子
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶを含むＥＶを対象とし、ここで、ＡＡＶは、遺伝子カセット、例えば、目的とする遺伝子をコードする異種配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、凝固因子、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、抗酸化物質をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、酵素をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、腫瘍抑制因子をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、ＤＮＡ修復タンパク質をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、構造タンパク質をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、アルファグルコシダーゼをコードする。一部の実施形態では、目的とする遺伝子は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子をコードする。
ＩＩ．Ｂ．２．ａ．治療用タンパク質
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、１つの治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、１つよりも多くの治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の２つ以上のコピーをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の２つ以上のバリアントをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、２つ以上の異なる治療用タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ＥＶは、少なくとも２個のＡＡＶに会合しており、該少なくとも２個のＡＡＶの各々が、異なる遺伝子カセットを含み、該異なる遺伝子カセットの各々が、異なる治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＥＶは、少なくとも３個のＡＡＶ、少なくとも４個のＡＡＶ、または少なくとも５個のＡＡＶに会合している。
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、凝固因子を含む。一部の実施形態では、凝固因子は、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＦＶ、ＦＶＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ）、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－２（ＰＡＩ２）、それらの任意のチモーゲン、それらの任意の活性型、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩＩまたはそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態では、凝固因子は、ＦＩＸまたはそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態では、凝固因子は、ＦＶＩＩまたはそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態では、凝固因子は、ＶＷＦまたはそのバリアントもしくは断片を含む。
ＩＩ．Ｂ．２．ａ．ｉ．第ＶＩＩＩ因子
本明細書全体を通して「ＦＶＩＩＩ」と略称される、本明細書で使用される「第ＶＩＩＩ因子」とは、別途明記されない限り、凝固におけるその通常の役割での機能的ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。故に、ＦＶＩＩＩという用語は、機能的であるバリアントポリペプチドを含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例としては、凝固作用を活性化する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２＋及びリン脂質の存在下で第ＩＸ因子とテナーゼ複合体を形成し、次いでテナーゼ複合体が第Ｘ因子を活性化型Ｘａに変換する能力が挙げられるが、これらに限定されない。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスＦＶＩＩＩタンパク質であり得る。加えて、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種由来のＦＶＩＩＩとの間の比較により、機能に必要とされる可能性が高い保存残基が同定されている（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７－２２（１９９８）、ＵＳ６，２５１，６３２）。その完全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列は既知であり、同様に多くの機能的断片、変異体、及び修飾バージョンも既知である。種々のＦＶＩＩＩアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、米国公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号、同第２０１４／０３０８２８０Ａ１号、及び同第２０１４／０３７００３５Ａ１号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１５／１０６０５２Ａ１号に開示される。ＦＶＩＩＩポリペプチドには、例えば、完全長ＦＶＩＩＩ、Ｎ末端のＭｅｔを除いた完全長ＦＶＩＩＩ、成熟ＦＶＩＩＩ（シグナル配列を除いた）、Ｎ末端に追加のＭｅｔを有する成熟ＦＶＩＩＩ、及び／またはＢドメインの完全欠失もしくは部分欠失を有するＦＶＩＩＩが含まれる。ＦＶＩＩＩバリアントは、部分欠失であるか完全欠失であるかを問わず、Ｂドメイン欠失を含む。
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。ある特定の実施形態では、遺伝子カセットは、国際出願公開第ＷＯ２０１９／０３２８９８号、同第ＷＯ／２０１７／１３６３５８号、もしくは同第ＷＯ２０１７／１３６３５８号、または米国公開出願第２０１５－０３６１１５８号に開示されるヌクレオチド配列を含み、同文献は参照によりそれらの全体が援用される。
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、完全長ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全てまたは一部分が欠失している、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。
ＩＩ．Ｂ．２．ａ．ｉｉ．第ＩＸ因子
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸまたはそのバリアントもしくは断片を含み、該ＦＩＸまたはそのバリアントもしくは断片は、ＦＩＸ活性を有する。
ヒトＦＩＸは、血液凝固カスケードの内因性経路の重要な構成成分であるセリンプロテアーゼである。本明細書で使用される「第ＩＸ因子」または「ＦＩＸ」とは、凝固因子タンパク質ならびにその種及び配列のバリアントを指し、これには、ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプチド（「プレプロ」）の４６１アミノ酸の一本鎖配列、成熟ヒトＦＩＸの４１５アミノ酸の一本鎖配列、及びＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）のバリアントが含まれるが、これらに限定されない。ＦＩＸには、血液凝固ＦＩＸの典型的な特性を有するいずれの形態のＦＩＸ分子も含まれる（例えば、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９９：１７８－１８０（１９８２）、Ｆａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４－２０４（１９８４）、及びＫｕｒａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４６１－６４６４（１９８２）、ＵＳ７，９３９，６３２を参照されたく、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
多くの機能的ＦＩＸバリアントが当該技術分野で既知である。国際公開第ＷＯ０２／０４０５４４Ａ３号は、４ページ９～３０行目及び１５ページ６～３１行目で、ヘパリンによる阻害に対する増加した耐性を表す変異体について開示している。国際公開第ＷＯ０３／０２０７６４Ａ２号は、表２及び表３（１４～２４ページ）、ならびに１２ページ１～２７行目で、低減されたＴ細胞免疫原性を有するＦＩＸ変異体について開示している。国際公開第ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２号は、４ページ１行目～１９ページ１１行目で、増加したタンパク質安定性、インビボ及びインビトロでの増加した半減期、ならびにプロテアーゼに対する増加した耐性を表す機能的変異体ＦＩＸ分子について開示している。同第ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２号はまた、１９ページ１２行目～２０ページ９行目で、キメラ及び他のバリアントＦＩＸ分子についても開示している。国際公開第ＷＯ０８／１１８５０７Ａ２号は、５ページ１４行目～６ページ５行目で、増加した凝固活性を表すＦＩＸ変異体について開示している。国際公開第ＷＯ０９／０５１７１７Ａ２号は、９ページ１１行目～２０ページ２行目で、増加した数のＮ－結合型及び／またはＯ－結合型グリコシル化部位を有することにより、増加した半減期及び／または回収率をもたらすＦＩＸ変異体について開示している。国際公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号はまた、２ページの段落［００６］～５ページの段落［０１１］、及び１６ページの段落［０４４］～２４ページの段落［０５７］で、増加した数のグリコシル化部位を有する第ＩＸ因子変異体についても開示している。国際公開第ＷＯ０９／１３０１９８Ａ２号は、４ページ２６行目～１２ページ６行目で、増加した数のグリコシル化部位を有することにより、増加した半減期をもたらす機能的変異体ＦＩＸ分子について開示している。国際公開第ＷＯ０９／１４００１５Ａ２号は、１１ページの段落［００４３］～１３ページの段落［００５３］で、重合体（例えば、ＰＥＧ）のコンジュゲーションに使用することができる増加した数のＣｙｓ残基の機能的ＦＩＸ変異体について開示している。２０１１年７月１１日に出願され、２０１２年１月１２日にＷＯ２０１２／００６６２４として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９号に記載されるＦＩＸポリペプチドもまた、参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、アルブミンに融合されたＦＩＸポリペプチド、例えば、ＦＩＸ－アルブミンを含む。ある特定の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ＩＤＥＬＶＩＯＮ（登録商標）またはｒＩＸ－ＦＰである。
一部の実施形態では、ＦＩＸは、米国特許第７，４０４，９５６号、同第９，０６２，２９９号、もしくは同第９，６７０，４７５号、米国公開出願第２０１５－０２５２３４５号、同第２０１６－００００８８８号、もしくは同第２０１７－０２６０５１６号、または国際公開第ＷＯ／２０１７／０２４０６０号に開示されるＦＩＸから選択される。
ＩＩ．Ｂ．２．ａ．ｉｖ．増殖因子
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、増殖因子を含む。増殖因子は、当該技術分野で既知の任意の増殖因子から選択され得る。一部の実施形態では、増殖因子は、ホルモンである。他の実施形態では、増殖因子は、サイトカインである。一部の実施形態では、増殖因子は、ケモカインである。
一部の実施形態では、増殖因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、アンジオポエチン（Ａｎｇ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、自己分泌型運動因子である。一部の実施形態では、増殖因子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。一部の実施形態では、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、及びＢＭＰ７から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーである。一部の実施形態では、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害性因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、コロニー刺激因子である。一部の実施形態では、コロニー刺激因子は、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、エフリンである。一部の実施形態では、エフリンは、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、及びエフリンＢ３から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。一部の実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及びＦＧＦ２３から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、ウシ胎子ソマトトロピン（ＦＢＳ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、ＧＤＮＦファミリーメンバーである。一部の実施形態では、ＧＤＮＦファミリーメンバーは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、及びアルテミンから選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）である。一部の実施形態では、増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、肝癌細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、インスリンである。一部の実施形態では、増殖因子は、インスリン様成長因子である。一部の実施形態では、インスリン様成長因子は、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２である。一部の実施形態では、増殖因子は、インターロイキン（ＩＬ）である。一部の実施形態では、ＩＬは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、及びＩＬ－７から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、遊走刺激因子（ＭＳＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたは肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））である。一部の実施形態では、増殖因子は、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）である。一部の実施形態では、増殖因子は、ニューレグリンである。一部の実施形態では、ニューレグリンは、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、及びＮＲＧ４から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は、ニューロトロフィンである。一部の実施形態では、増殖因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）である。一部の実施形態では、ＮＧＦは、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）またはＮＴ－４である。一部の実施形態では、増殖因子は、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子である。一部の実施形態では、トランスフォーミング増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）またはＴＧＦ－βである。一部の実施形態では、増殖因子は、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）である。一部の実施形態では、増殖因子は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。
ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は、Ｒａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ）複合体のサブユニットを含む。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、Ｒａｂタンパク質ＧＧＴａｓｅ成分Ａ １（ＲＥＰ１）を含む。一部の実施形態では、ＲＥＰ１は、配列番号４５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＲＥＰ１欠損は、眼の脈絡膜、網膜色素上皮、及び光受容体のまれなＸ連鎖性の進行性変性である全脈絡膜萎縮症（ＣＨＭ）に関連付けられる。罹患した男性における典型的な自然経過では、１０代の間に夜盲症が発症し、次いで２０代及び３０代の間に周辺視野が進行性で喪失し、４０代で完全な盲目に至る。女性の保因者は、最も顕著には夜盲症として軽度な症状を有するが、時折、より重度の表現型を有する場合もある。
Figure 2022531095000001
この疾患は、Ｘ染色体２１ｑ領域に位置するＲＥＰ１遺伝子（Ｒａｂエスコートタンパク質１）の変異によって引き起こされる。体内のほとんどの細胞では、ＲＥＰ１に７５％相同であるＲＥＰ２タンパク質が、ＲＥＰ１欠損を補う。しかしながら、眼においては、未だに明確でない理由で、ＲＥＰ２はＲＥＰ１欠損を補うことができない。よって、眼において、ＲＥＰポリペプチド活性は、標的タンパク質（Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅｓ）の正常なプレニル化を維持するのに不十分であり、主に外網膜及び脈絡膜に影響を及ぼしながら細胞機能障害及び最終的には細胞死に至る。
ＩＩ．Ｂ．２．ｂ．ＡＡＶ配列
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、第１のＩＴＲ、例えば、５’ＩＴＲ、及び第２のＩＴＲ、例えば、３’ＩＴＲをさらに含む。典型的には、ＩＴＲは、原核生物プラスミドからのパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）のＤＮＡ複製及びレスキュー、または除去に関与する（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，１９８７、Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９８８）。加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶのプロウイルス組み込み、及びＡＡＶ ＤＮＡのビリオン中へのパッケージングに必要とされる最小限の配列であることが報告されている（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。これらのエレメントは、パルボウイルスゲノムの効率的な複製（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に必須である。
一部の実施形態では、ＩＴＲは、天然起源のＩＴＲを含み、例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスＩＴＲの全てまたは一部分を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、合成配列を含む。一実施形態では、第１のＩＴＲまたは第２のＩＴＲは、合成配列を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲの各々が、合成配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲまたは第２のＩＴＲは、天然起源の配列を含む。別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲの各々が、天然起源の配列を含む。
一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＡＡＶゲノムのＩＴＲである。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲである。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲであり、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ５のカプシドタンパク質である。別の実施形態では、ＩＴＲは、その５’及び３’末端にＡＡＶゲノムのうちの１つまたは複数に由来するＩＴＲまたはその断片を含むように遺伝子操作された合成配列である。一部の実施形態では、ＩＴＲは、同じゲノムに由来する、例えば、同じウイルスのゲノムに由来するか、または異なるゲノムに由来する、例えば、２つ以上の異なるＡＡＶゲノムのゲノムに由来する。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、同じＡＡＶゲノムに由来する。具体的な実施形態では、本開示の核酸分子に存在する２つのＩＴＲは同じであり、特に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、またはＡＡＶ９ ＩＴＲであり得る。１つの特定の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、同一である。
一部の実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピンループ構造を形成する。一実施形態では、第１のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。別の実施形態では、第２のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。依然として別の実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲの両方が、ヘアピン構造を形成する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子におけるＩＴＲは、転写活性化されたＩＴＲである。転写活性化されたＩＴＲは、少なくとも１つの転写活性エレメントの組み込みによって転写活性化された野生型ＩＴＲの全てまたは一部分を含み得る。種々の種類の転写活性エレメントが、この関連における使用に好適である。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、構成的な転写活性エレメントである。構成的な転写活性エレメントは、継続的レベルの遺伝子転写を提供し、導入遺伝子が継続的に発現されることが望まれる場合に好ましい。他の実施形態では、転写活性エレメントは、誘導性の転写活性エレメントである。誘導性の転写活性エレメントは一般に、誘導因子（または誘導条件）の不在下で低い活性を表し、誘導因子（または誘導条件への切り替え）の存在下で上方制御される。誘導性の転写活性エレメントは、ある特定の時点もしくはある特定の箇所でのみ発現が望まれる場合に、または誘導剤を使用して発現レベルを増減することが望ましい場合に好ましい可能性がある。転写活性エレメントはまた組織特異的であり得、すなわち、それらは、ある特定の組織種または細胞種でのみ活性を表す。
転写活性エレメントは、様々な方式でＩＴＲに組み込まれ得る。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、ＩＴＲの任意の部分の５’側またはＩＴＲの任意の部分の３’側で組み込まれる。他の実施形態では、転写活性化されたＩＴＲの転写活性エレメントは、２つのＩＴＲ配列の間にある。転写活性エレメントが、離間されなければならない２つ以上のエレメントを含む場合、それらのエレメントは、ＩＴＲの部分と交互となることができる。一部の実施形態では、ＩＴＲのヘアピン構造が欠失させられ、転写エレメントの逆位反復配列と置き換えられる。この後者の配置により、構造内の欠失部分を模倣するヘアピンが作り出されよう。複数のタンデムに並んだ転写活性エレメントもまた、転写活性化されたＩＴＲに存在し得、これらは隣接し得るか、または離間され得る。加えて、タンパク質結合部位（例えば、Ｒｅｐ結合部位）が、転写活性化されたＩＴＲの転写活性エレメントに導入され得る。転写活性エレメントは、ＲＮＡを形成するためのＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの調節された転写を可能にする任意の配列を含み得、例えば、下記で定義されるような転写活性エレメントを含み得る。
転写活性化されたＩＴＲは、比較的限定されたヌクレオチド配列長で核酸分子に転写活性化及びＩＴＲ機能の両方を提供し、これにより担持され、核酸分子から発現され得る導入遺伝子の長さが有効に最大化される。転写活性エレメントのＩＴＲへの組み込みは、様々な方式で遂行され得る。ＩＴＲ配列、及び転写活性エレメントの配列要件の比較により、ＩＴＲ内で当該エレメントをコードさせる方式に関する洞察が提供され得る。例えば、ＩＴＲ配列において転写活性エレメントの機能的エレメントを複製する特定の変化を導入することにより、転写活性をＩＴＲに付加することができる。特異的部位で特定のヌクレオチド配列を効率的に付加、欠失、及び／または変化させるためのいくつかの技法が、当該技術分野に存在する（例えば、Ｄｅｎｇ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１－８８を参照されたい）。転写活性化されたＩＴＲを作り出すための別の方式は、ＩＴＲの所望の箇所での制限酵素部位の導入を伴う。加えて、当該技術分野で既知の方法を使用して、複数の転写活性化エレメントが、転写活性化されたＩＴＲに組み込まれ得る。
例示説明として、転写活性化されたＩＴＲは、ＴＡＴＡボックス、ＧＣボックス、ＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ１部位、Ｉｎｒ領域、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ制御エレメント）部位、ＡＴＦ－１／ＣＲＥ部位、ＡＰＢβボックス、ＡＰＢαボックス、ＣＡｒＧボックス、ＣＣＡＣボックス、または当該技術分野で既知であるような転写に関与する任意の他のエレメント等の、１つまたは複数の転写活性エレメントの組み込みによって生成され得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、１つよりも多くの治療用タンパク質をコードする遺伝子カセットを含む。１つよりも多くの治療用タンパク質をコードするＡＡＶにおいて、一部の実施形態は、それらを１つのプロモーターから共発現させるためのＩＲＥＳまたは２Ａ等のエレメントを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＩＲＥＳエレメントにより分離されたタンパク質コード領域を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、２Ａエレメントにより分離された２つのタンパク質コード領域を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、タンパク質コード領域の間のＩＲＥＳエレメントにより分離された３つのタンパク質コード領域を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、タンパク質コード領域の間の２Ａエレメントにより分離された３つのタンパク質コード領域を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、制御配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、非コード制御ＤＮＡを含む。一部の実施形態、ＡＡＶゲノムは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を含む。「制御配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））に記載される。制御配列の選択を含めた、ＡＡＶの設計は、形質転換される宿主細胞の選定、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることが当業者には理解されよう。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、ｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター部位を含む。哺乳類宿主細胞での発現に好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー等の、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメントが含まれる。代替として、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーター等の非ウイルス制御配列を使用することができる。依然としてさらに、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有するＳＲａプロモーター系等の、異なる供給源由来の配列から構成される制御エレメント（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。ある特定の実施形態では、制御配列は、組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉、及び幹細胞からなる群から選択される組織において目的とする遺伝子の発現を駆動する。
ＩＩ．Ｂ．２．ｃ．方法及びＡＡＶの使用
所望のカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照されたく、同文献の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。典型的には、該方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ ＩＴＲ及び導入遺伝子から構成される組換えＡＡＶベクターと、組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能とを含有する宿主細胞を培養することを含む。ＡＡＶ産生を増加させるためのヘルパー機能は、プラスミドＤＮＡでのトランスフェクションを介して、またはアデノウイルスとの共感染によって供給され得る。
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドにパッケージングするために宿主細胞において培養される構成成分は、宿主細胞にトランスで提供され得る。代替として、必要とされる構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）のうちのいずれか１つまたは複数は、当業者に既知の方法を使用して必要とされる構成成分のうちの１つまたは複数を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要とされる構成成分（複数可）を含有しよう。しかしながら、必要とされる構成成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあることが可能である。好適な誘導性及び構成的プロモーターの例が、本明細書で、導入遺伝子とともに使用するのに好適な制御エレメントの考察において提供される。依然として別の代替例では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された構成成分（複数可）及び１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成成分（複数可）を含有し得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含有する、安定な宿主細胞が生成され得る。依然として他の安定な宿主細胞が、当業者によって生成され得る。
本開示のｒＡＡＶの産生に必要とされる組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子エレメント（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載の方法を含めた任意の好適な方法によって送達され得る。本開示の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、これには遺伝子操作、組換え操作、及び合成技法が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法が周知であり、好適な方法の選択は、本開示を限定するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、トリプルトランスフェクション法を使用して生産される（米国特許第６，００１，６５０号に詳述される）。典型的には、組換えＡＡＶは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及び補助機能ベクターでトランスフェクトすることによって生産される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶの生産的な複製及びカプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いずれの検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成することなく、ＡＡＶベクターの効率的な生産を支持する。本開示とともに使用するのに好適なベクターの非限定的な例としては、米国特許第６，００１，６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９及び米国特許第６，１５６，３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる（両文献の全体が参照により本明細書に援用される）。補助機能ベクターは、複製のためにＡＡＶが依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（すなわち、「補助機能」）に対するヌクレオチド配列をコードする。補助機能には、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶの複製に必要とされる機能が含まれる。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、バキュロウイルス、及びワクシニアウイルス等の既知のヘルパーウイルスのうちのいずれかに由来し得る。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、本明細書に記載のトリプルプラスミド系でのＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを使用して生産される。
一部の態様では、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指して使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技法が、当該技術分野で一般に既知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。かかる技法を使用して、ヌクレオチド組み込みベクター及び他の核酸分子等の１つまたは複数の外因性核酸を好適な宿主細胞に導入することができる。
「宿主細胞」とは、目的とする物質を保有する、または保有することができる任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は、哺乳類細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、補助機能ベクター、または組換えＡＡＶの生産に関連する他の転移ＤＮＡのレシピエントとして使用することができる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。故に、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指し得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは、一過性発現または安定発現を使用して生産される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、またはｓｆ９細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的、または意図的な変異に起因して、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補配列が元の親と必ずしも完全に同一とは限らないことを理解されたい。
本明細書で使用されるとき、「細胞株」という用語は、インビトロで継続的または長期的な増殖及び分裂が可能である細胞の集団を指す。多くの場合、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。かかるクローン集団の保管または導入中に核型の自然発生的または誘導性の変化が生じ得ることが、当該技術分野でさらに知られている。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でない場合があり、言及される細胞株は、かかるバリアントを含む。
本明細書で使用されるとき、「組換え細胞」という用語は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡ等の生物学的に活性な核酸の生産につながるＤＮＡセグメント等の外因性ＤＮＡセグメントが導入された、細胞を指す。
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、適正な調節エレメントに関連付けられた場合に複製能を持ち、遺伝子配列を細胞間に導入することができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等といった任意の遺伝子エレメントを含む。故に、この用語は、ウイルスベクターのみならず、クローニング及び発現ビヒクルも含む。一部の実施形態では、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置付けられるベクターであることが企図される。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされる細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「作動的に位置付けられる」、「制御下」、または「転写制御下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するためにプロモーターが核酸に対して正しい箇所及び向きにあることを意味する。「発現ベクターまたは構築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である、核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を意味する。一部の実施形態では、発現は、核酸を転写して、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）を生成すること含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶまたはｒＡＡＶは、イオジキサノール密度勾配を使用して精製される。一部の実施形態では、空のカプシドが、約１．３±０．０５ｇ／ｍＬ（例えば、１．３～１．３２ｇ／ｍＬ）の密度で移動する。一部の実施形態では、ゲノム含有カプシドが、約１．４±０．０５ｇ／ｍＬ（例えば、１．３５～１．４２ｇ／ｍＬ）の密度で移動する。
ＩＩ．Ｃ．足場タンパク質
本開示のある特定の態様では、ＥＶは、ＡＡＶと、１つまたは複数の足場タンパク質とを含む。一部の実施形態では、本開示のＥＶは、その組成が修飾された膜を含む。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含量を変化させることによって修飾され得る。
一部の実施形態では、表面が操作されたＥＶ、例えばエキソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合等の化学的方法及び／または物理的方法によって生成される。他の実施形態では、表面が操作されたＥＶ、例えばエキソソームは、遺伝子操作によって生成される。遺伝子改変されたプロデューサー細胞または遺伝子改変された細胞の子孫から産生されたＥＶ、例えばエキソソームは、修飾された膜組成を含有し得る。一部の実施形態では、表面が操作されたＥＶ、例えばエキソソームは、足場タンパク質をより高いもしくはより低い密度（例えば、より多い数）で有するか、または足場タンパク質のバリアントもしくは断片を含む。
一部の実施形態では、表面が操作されたＥＶは、足場タンパク質（例えば、本明細書に開示されるエキソソームタンパク質または足場タンパク質）またはそのバリアントもしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から産生される。外因性配列から発現された足場タンパク質を含むＥＶは、修飾された膜組成を含み得る。
足場タンパク質の種々の修飾体または断片を本開示の実施形態に使用することができる。例えば、結合剤に対して強化された親和性を有するように修飾された足場タンパク質を、結合剤を使用して精製され得る、表面が操作されたＥＶを生成するために使用することができる。ＥＶ及び／または膜により有効に標的化されるように修飾された足場タンパク質を使用することができる。エキソソーム膜への特異的かつ有効な標的化に必要とされる最小限の断片を含むように修飾された足場タンパク質もまた使用することができる。
足場タンパク質は、融合分子、例えば、ＡＡＶとのエキソソーム膜タンパク質の融合分子として発現されるように操作され得る。例えば、融合分子は、直接的にまたは中間体（例えば、化学的に誘導可能な二量体、抗原結合ドメイン、または受容体）を介してのいずれかでＡＡＶのカプシドタンパク質に連結された、本明細書に開示される足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片もしくはバリアント）を含み得る。融合分子の場合、化学的に誘導可能な二量体、抗原結合ドメイン、及び／または受容体は、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の表面が操作されたＥＶは、当該技術分野で既知のＥＶと比較してより優れた特性を示す。例えば、表面が操作されたＥＶは、それらの表面上に、天然起源のＥＶ、または従来のエキソソームタンパク質を使用して産生されたＥＶよりも高度に濃縮された修飾タンパク質を含有する。その上、本開示の表面が操作されたＥＶは、天然起源のＥＶ、または従来のエキソソームタンパク質を使用して産生されたＥＶと比較して、より高い、より特異的な、またはより制御された生物学的活性を有し得る。
本開示の足場タンパク質は、外部または内腔（内側）での係留に使用することができる。一部の実施形態では、足場タンパク質は、異種ポリペプチドをＥＶの外部表面に係留することができ、例えば、足場タンパク質は、細胞外ドメインを有する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、異種ポリペプチドをＥＶの内表面に係留することができ、例えば、足場タンパク質は、細胞内（内腔）ドメインを有する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、異種ポリペプチドを、ＥＶの外部表面もしくはＥＶの内腔表面のいずれか、または両方に係留することができ、例えば、足場タンパク質は、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインを有し、例えば、ＥＶは、膜貫通タンパク質である。
ＩＩ．Ｃ．１．膜貫通型足場タンパク質
一部の実施形態では、足場タンパク質（例えば、足場Ｘ）は、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質はまた、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２－アルファ受容体制御タンパク質、プロスタグランジンＦ２－アルファ受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５とも称され得る。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質の完全長アミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）は、表３で配列番号１として示される。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４～８７９）を含有する。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを含めない配列番号１、すなわち、配列番号１のアミノ酸２６～８７９からなる。一部の実施形態では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびに（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端に少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１５０個のアミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端に少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、もしくは少なくとも約２５個のアミノ酸、または（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。
一部の実施形態では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２６～８７９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号２（配列番号１の６８７～８７８位に対応する）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、足場タンパク質は、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号２のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、ならびに配列番号２のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場タンパク質は、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１のアミノ酸配列、ならびに配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
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一部の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号３によって表される、ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）を含む。ＢＳＧタンパク質は、５Ｆ７、コラゲナーゼ刺激因子、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）、白血球活性化抗原Ｍ６、ＯＫ血液型抗原、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）、またはＣＤ１４７としても知られている。ヒトＢＳＧタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｐ３５６１３である。ＢＳＧタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号３のアミノ酸１～２１である。配列番号３のアミノ酸１３８～３２３は、細胞外ドメインであり、アミノ酸３２４～３４４は、膜貫通ドメインであり、配列番号３のアミノ酸３４５～３８５は、細胞質ドメインである。
他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号３のアミノ酸２２～３８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＳＧポリペプチドの断片は、ＩｇＶ、例えば、配列番号３のアミノ酸２２１～３１５等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１９３、１９４、または１９５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場タンパク質は、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１９３、１９４、または１９５のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１９３、１９４、または１９５のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９３、１９４、または１９５のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩｇＳＦ８またはＩＧＳＦ８タンパク質）を含み、これはＣＤ８１パートナー３、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質２（ＥＷＩ－２）、ケラチノサイト関連膜貫通型タンパク質４（ＫＣＴ－４）、ＬＩＲ－Ｄ１、プロスタグランジン制御様タンパク質（ＰＧＲＬ）、またはＣＤ３１６としても知られている。完全長ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて受託番号Ｑ９６９Ｐ０であり、本明細書で配列番号４として示される。ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号４のアミノ酸１～２７）、細胞外ドメイン（配列番号４のアミノ酸２８～５７９）、膜貫通ドメイン（配列番号４のアミノ酸５８０～６００）、及び細胞質ドメイン（配列番号４のアミノ酸６０１～６１３）を有する。
他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号４のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＧＳＦ８タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１９７、１９８、１９９、または２００と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、足場タンパク質は、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１９７、１９８、１９９、または２００のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号１９７、１９８、１９９、または２００のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９７、１９８、１９９、または２００のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩｇＳＦ３またはＩＧＳＦ３タンパク質）を含み、これはＧｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質３（ＥＷＩ－３）としても知られ、配列番号２０３のアミノ酸配列として示される。ヒトＩＧＳＦ３タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２０３のアミノ酸１～１９）、細胞外ドメイン（配列番号２０３のアミノ酸２０～１１２４）、膜貫通ドメイン（配列番号２０３のアミノ酸１１２５～１１４５）、及び細胞質ドメイン（配列番号２０３のアミノ酸１１４６～１１９４）を有する。
他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＧＳＦ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＳＦ２タンパク質を含む。一部の態様では、ＩＧＳＦ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）を含み、これは、フィブロネクチン受容体サブユニットベータ、糖タンパク質ＩＩａ（ＧＰＩＩＡ）、ＶＬＡ－４サブユニットベータ、またはＣＤ２９としても知られ、配列番号５のアミノ酸配列として示される。ヒトＩＴＧＢ１タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号５のアミノ酸１～２０）、細胞外ドメイン（配列番号５のアミノ酸２１～７２８）、膜貫通ドメイン（配列番号５のアミノ酸７２９～７５１）、及び細胞質ドメイン（配列番号５のアミノ酸７５２～７９８）を有する。
他の実施形態では、足場タンパク質は、配列番号５のアミノ酸２１～７９８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＴＧＢ１タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号６のアミノ酸１～３３）を含めない配列番号６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＴＧＡ４タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＩＴＧＡ４タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２０９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２１０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２１１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の実施形態では、足場タンパク質は、シグナルペプチドを含めない配列番号２１２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質は、ＩｇＶ等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の足場タンパク質タンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第ＵＳ１０１９５２９０Ｂ１号で見出すことができ、同文献は参照によりその全体が援用される。
一部の実施形態では、当該配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、または少なくとも約８００個のアミノ酸を欠いた足場タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、当該配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、または少なくとも約８００個のアミノ酸を欠いた足場タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、当該配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、または少なくとも約８００個のアミノ酸を欠いた足場タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、当該配列は、天然タンパク質の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いた足場タンパク質の断片をコードする。
ＩＩ．Ｃ．２．内腔係留足場タンパク質
一部の実施形態では、足場タンパク質（例えば、足場Ｙ）は、ＥＶ膜の内腔表面と相互作用する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＥＶ膜の内腔表面に係留されている。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」を含み、ここで、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、細胞内（内腔）ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含み、ここで、ＡＡＶは、足場タンパク質の細胞外ドメインに会合しており、足場タンパク質の細胞内（内腔）ドメインは、ＥＶ膜の内腔表面と相互作用する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＥＶ膜の内腔表面に係留されている。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含み、ここで、細胞内ドメインは、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」を含み、ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。
一部の態様では、本開示の足場は、例えば、脂質アンカー（例えば、ミリスチン酸）、及び／または負に帯電した膜リン脂質の頭部と静電的に相互作用する多塩基性ドメインを介して、ＥＶの内腔表面に会合し得る。他の態様では、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、ＮＤは、ＥＶの内腔表面に会合しており、ＥＤは、イオン性相互作用によってＥＶの内腔表面に会合しており、ＥＤは、連続的に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
他の実施形態では、足場タンパク質（例えば、足場タンパク質の細胞内（内腔）ドメイン）は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、ＮＤは、ＥＶの内腔表面に会合しており、ＥＤは、イオン性相互作用によってＥＶの内腔表面に会合しており、ＥＤは、連続的に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
他の実施形態では、ＥＤは、１つまたは複数の低複雑性領域、例えば、ＰＥＳＴモチーフをさらに含む。ＰＥＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）が豊富なペプチド配列である。一部の実施形態では、ＥＤは、負に帯電した残基（例えば、Ｇｌｕ）ならびに一過性のリン酸化を経る多くのＳｅｒ及びＴｈｒをさらに含む（故に、いずれもＥＤからの領域に負電荷を付加する）。
一部の態様では、ＮＤは、脂質化を介して、例えば、ミリストイル化を介して、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。一部の態様では、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。一部の態様では、Ｎ末端のＧｌｙは、ミリストイル化されている。
一部の態様では、ＥＤは、イオン性相互作用によってＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。一部の態様では、ＥＤは、静電相互作用、特に引力静電相互作用によって、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面に会合している。
一部の態様では、ＥＤは、ポリペプチド配列内に（ｉ）ある塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、または（ｉｉ）互いに隣り合った２つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）を含む。一部の態様では、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。一部の態様では、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎは、１～１０の整数である。
一部の実施形態では、ＥＤは、（ｉ）ＥＤ内のリジンリピート、または（ｉｉ）ＮＤとのリジンリピート、例えば、ＮＤのＣ末端におけるＫ及びＥＤのＮ末端におけるＫを含み、ここで、ＮＤ及びＥＤは、直接的に、すなわちペプチド結合によって、連結されている。一部の実施形態では、異種部分、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ、例えばエキソソームの内腔中に係留することが可能なアミノ酸の最小数は、例えば、約７～約１５個、約７～約１４個、約７～約１３個、約７～約１２個、約７～約１１個、約７～約１０個、約７～約９個、または約７～約８個のアミノ酸断片である。
他の態様では、ＥＤのＮ末端がＮＤのＣ末端におけるリジンに直接的に連結されている場合、ＥＤは、少なくとも１つのリジン（ａｔ ｌｅａｓｔ ａ ｌｙｓｉｎｅ）を含み、ＮＤは、Ｃ末端にリジンを含み、すなわち、該リジンは、ＥＤのＮ末端にあり、ＮＤのＣ末端におけるリジンに融合されている。他の実施形態では、ＥＤのＮ末端が、リンカー、例えば、１つまたは複数のアミノ酸によってＮＤのＣ末端に連結されている場合、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。一部の実施形態では、ＥＤは、連続的に少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
一部の態様では、ＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、ＥＤは、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、ＥＤは、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸を表し、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を表す。一部の態様では、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される。
一部の態様では、足場タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６（ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含む）に定められるようなアミノ酸配列を含み、ＥＤは、ペプチド結合によってＸ６に連結されており、ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む。
一部の態様では、足場タンパク質のＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表す。
一部の態様では、Ｘ３アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。
一部の態様では、ＮＤ及びＥＤは、リンカーによって結合している。一部の態様では、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の態様では、「リンカー」という用語は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）、または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。一部の態様では、２つ以上のリンカーがタンデムで連結され得る。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を阻止／改善する。リンカーは典型的には切断されないが、ある特定の態様では、かかる切断が望ましい場合がある。したがって、一部の態様では、リンカーは、プロテアーゼにより切断可能な１つまたは複数の部位を含むことができ、これらの部位は、リンカーの配列内に位置し得るか、またはリンカー配列のそれぞれの末端でリンカーに隣接し得る。ＮＤ及びＥＤがリンカーによって結合している場合、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。
一部の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含み得る。
一部の態様では、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍ（配列番号４６）によるグリシン／セリンリンカーであり、式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である。他の態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚ（配列番号４７）によるものであり、式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、１～５０の整数である。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎ（配列番号４８）を含み、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号４９）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号５０）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。
一部の態様では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然起源のものである。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖状配列を、それが自然界で天然には連結または遺伝的に融合されないアミノ酸の第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然起源または非天然起源のペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然起源のポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換、または欠失等の変異を含む）、非天然起源のポリペプチドを含み得る。
他の態様では、ペプチドリンカーは、非天然起源のアミノ酸を含み得る。なおも他の態様では、ペプチドリンカーは、自然界では存在しない直鎖状配列で存在する、天然起源のアミノ酸を含み得る。依然として他の態様では、ペプチドリンカーは、天然起源のポリペプチド配列を含み得る。
本開示はまた、足場タンパク質に連結された生物学的に活性な分子を含む、単離されたＥＶ、例えばエキソソームも提供し、該足場タンパク質は、ＮＤ－ＥＤを含み、ここで、ａ．ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６（ここで、ｉ．Ｇは、Ｇｌｙを表し；ｉｉ．「：」は、ペプチド結合を表し；ｉｉｉ．Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し；ｉｖ．Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し；ｖ．Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ，Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し；ｖｉ．Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し；ｖｉｉ．Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表す）を含み；ｂ．「－」は、任意選択的なリンカーを表し；ｃ．ＥＤは、（ｉ）ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸によってＸ６に連結されている少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によってＸ６に直接的に連結されている少なくとも１つのリジンを含む、エフェクタードメインである。
一部の態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ３アミノ酸は、Ｌｙｓである。一部の態様では、Ｘ４アミノ酸は、ＬｅｕまたはＧｌｕである。一部の態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓである。一部の態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、Ｘ３アミノ酸は、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ４アミノ酸は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕであり、Ｘ５アミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓである。一部の態様では、「－」リンカーは、ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む。
一部の態様では、足場タンパク質におけるＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の態様では、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、足場タンパク質におけるＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号５１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫ（配列番号５２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫ（配列番号５３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫ（配列番号５４）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含み、足場タンパク質におけるＥＤは、（ｉ）Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＧ（配列番号５５）、ＫＫＫＧＹ（配列番号５６）、ＫＫＫＧＹＮ（配列番号５７）、ＫＫＫＧＹＮＶ（配列番号５８）、ＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号５９）、ＫＫＫＧＹＳ（配列番号６０）、ＫＫＫＧＹＧ（配列番号６１）、ＫＫＫＧＹＧＧ（配列番号６２）、ＫＫＫＧＳ（配列番号６３）、ＫＫＫＧＳＧ（配列番号６４）、ＫＫＫＧＳＧ（配列番号６５）、ＫＫＫＧＳＧＳ（配列番号６６）、ＫＫＫＳ（配列番号６７）、ＫＫＫＳＧ（配列番号６８）、ＫＫＫＳＧＧ（配列番号６９）、ＫＫＫＳＧＧＳ（配列番号７０）、ＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号７１）、ＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号７２）、ＫＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号７３）、及びＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号７４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示の足場タンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号２１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
一部の態様では、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示の足場タンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、本開示の足場タンパク質は、連続的に少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
一部の態様では、足場タンパク質は、長さが少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも約３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約４５、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３３５、少なくとも約３４０、少なくとも約３４５、または少なくとも約３５０アミノ酸である。
一部の態様では、足場タンパク質は、長さが約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、約１９０～約２００、約２００～約２１０、約２１０～約２２０、約２２０～約２３０、約２３０～約２４０、約２４０～約２５０、約２５０～約２６０、約２６０～約２７０、約２７０～約２８０、約２８０～約２９０、約２９０～約３００、約３００～約３１０、約３１０～約３２０、約３２０～約３３０、約３３０～約３４０、または約３４０～約２５０アミノ酸である。
一部の態様では、足場タンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３２）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３３）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３５）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３６）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４１）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４２）を含む。
一部の態様では、本開示の足場タンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３２）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３３）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３５）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３６）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４１）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４２）からなる。
本開示に有用な足場タンパク質の非限定的な例は、下記に列挙される。一部の実施形態では、足場タンパク質は、表４に定められるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、表４に定められるアミノ酸配列からなる。
Figure 2022531095000011
Figure 2022531095000012
Figure 2022531095000013
一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、Ｎ末端のＭｅｔを含有しない。一部の態様では、足場タンパク質は、足場タンパク質のＮ末端に、脂質アンカーとして機能する脂質化アミノ酸、例えば、ミリストイル化アミノ酸を含む。一部の態様では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。Ｎ末端のＧｌｙの存在は、Ｎ－ミリストイル化のための絶対条件である。一部の態様では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、合成である。一部の態様では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである。
他の態様では、脂質アンカーは、当該技術分野で既知の任意の脂質アンカー、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。例えば、ミリスチン酸が制限される培養液を使用することによる、特殊な状況下では、短鎖脂肪酸及び不飽和脂肪酸を含む何らかの他の脂肪酸を、Ｎ末端グリシンに結合させることができる。例えば、ＢＫチャネルにおいて、ミリステートが、ヒドロキシエステル結合を介して内部セリン／トレオニンまたはチロシン残基に翻訳後に結合させられることが報告されている。当該技術分野で既知の膜アンカーが、以下の表に提示される。
Figure 2022531095000014
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、それらの任意の機能的断片、バリアント、もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｓｒｃタンパク質またはその断片を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、例えば、米国特許第９，６１１，４８１号に開示される配列を含み、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
Figure 2022531095000015
一部の実施形態では、本開示の足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９９６６）は、タンパク質キナーゼＣ基質、８０ｋＤａのタンパク質、軽鎖としても知られている。完全長ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は、長さが３３２アミノ酸であり、アミノ酸残基１５２～１７６にてカルモジュリン結合ドメインを含む。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質の断片、バリアント、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質に存在するＮ末端タンパク質を欠いている。
一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９００６）、別名ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１、及びマクロファージミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質を含む。完全長ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、長さが１９５アミノ酸である。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、アミノ酸残基８７～１１０にて、脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインを含む。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質の断片、バリアント、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質に存在するＮ末端タンパク質を欠いている。
一部の態様では、本開示の足場は、ＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８０７２３）、別名２２ｋＤａの神経組織濃縮酸性タンパク質または神経軸索膜タンパク質ＮＡＰ－２２を含む。完全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、長さが２２７アミノ酸である。選択的スプライシングによって生み出される異性体は、異性体１からアミノ酸８８～１４１が欠損している。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質の断片、バリアント、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質に存在するＮ末端タンパク質を欠いている。
一部の態様では、足場タンパク質は、配列番号８（ＭＡＲＣＫＳ）の成熟形態（すなわち、配列番号８に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、足場タンパク質は、配列番号８（ＭＡＲＣＫＳ）の成熟形態（すなわち、配列番号８に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）の機能的断片と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、足場タンパク質は、配列番号９（ＭＡＲＣＫＳＬ１）の成熟形態（すなわち、配列番号９に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、足場タンパク質は、配列番号９（ＭＡＲＣＫＳＬ１）の成熟形態（すなわち、配列番号９に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）の機能的断片と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、足場タンパク質は、配列番号１０（ＢＡＳＰ１）の成熟形態（すなわち、配列番号１０に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、足場タンパク質は、配列番号１０（ＢＡＳＰ１）の成熟形態（すなわち、配列番号１０に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）の機能的断片と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＩＩ．Ｃ．３．足場タンパク質融合構築物
一部の実施形態では、足場タンパク質は、１つまたは複数の異種タンパク質に連結されている。該１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端に連結され得る。該１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＣ末端に連結され得る。一部の実施形態では、該１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端及びＣ末端の両方に連結されている。一部の実施形態では、異種タンパク質は、哺乳類タンパク質である。一部の実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
一部の実施形態では、足場タンパク質を使用して、任意の部分をエキソソームの内腔表面及び／または外部表面に連結することができる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを使用して、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質を、ＥＶ、例えばエキソソームの外部表面に加えて、内腔の内側（例えば、内腔表面上）に連結することができる。したがって、ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、二重目的で、例えば、内腔表面上のＡＡＶ及びＥＶ、例えばエキソソームの外部表面上の第２のペイロード、またはエキソソームの外部表面上のＡＡＶ及びＥＶ、例えばエキソソームの内腔表面上の第２のペイロードのために、使用することができる。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、リンカーによってＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個のアミノ酸、少なくとも約３個のアミノ酸、少なくとも約４個のアミノ酸、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約６個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、少なくとも約８個のアミノ酸、少なくとも約９個のアミノ酸、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約１１個のアミノ酸、少なくとも約１２個のアミノ酸、少なくとも約１３個のアミノ酸、少なくとも約１４個のアミノ酸、少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約１６個のアミノ酸、少なくとも約１７個のアミノ酸、少なくとも約１８個のアミノ酸、少なくとも約１９個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約３５個のアミノ酸、少なくとも約４０個のアミノ酸、少なくとも約４５個のアミノ酸、または少なくとも約５０である。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されており、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、対応する結合パートナーに連結されている。これらの実施形態では、足場タンパク質及びＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、結合パートナーの二量体化を誘導する化学物質の存在下で互いに会合する。一部の実施形態では、結合パートナーは、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、結合パートナーは、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、結合パートナーは、足場タンパク質の内腔ドメインに連結されている。
一部の実施形態では、足場タンパク質に連結された結合パートナーは、（ｉ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ＦＫ１０１２）、（ｉｉ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）（ＦＫ５０６）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓ（ＦＫＣｓＡ）、（ｉｖ）ＦＫＢＰ及びＦＲＢ（ラパマイシン）、（ｖ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）、（ｖｉ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）、（ｖｉｉ）スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇ（ＨａＸＳ）、（ｖｉｉｉ）ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇ（ＴＭＰ－ＨＴａｇ）、ならびに（ｉｘ）ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）（ＡＢＴ－７３７）からなる群から選択される化学誘導二量体の１つの結合パートナーから選択され、ここで、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、本明細書に記載されるような対応する結合パートナーに連結されている。ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＲＢに連結されている。一部の実施形態では、ＦＲＢは、ｍＴＯＲのＦＲＢである。一部の実施形態では、足場タンパク質は、カルシニューリンＡに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＧｙｒＢに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＧＡＩに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＧＩＤ１に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、スナップタグに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＢＣＬ－ｘＬに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｆａｂに連結されている。
ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＲＢに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＦＲＢに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、カルシニューリンＡに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、カルシニューリンＡに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＧｙｒＢに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＧｙｒＢに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＧＡＩに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＧＩＤ１に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＧＩＤ１に連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＧＡＩに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、スナップタグに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、スナップタグに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＢＣＬ－ｘＬに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、Ｆａｂ（ＡＺ１）に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｆａｂ（ＡＺ１）に連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＢＣＬ－ｘＬに連結されている。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、親和性物質に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、足場タンパク質の内腔ドメインに連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶ受容体を含む。一部の実施形態では、親和性物質は、本明細書に開示されるような抗体または抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、親和性物質は、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質に結合する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質である。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶカプシドタンパク質単量体には結合しない。
一部の実施形態では、親和性物質とＡＡＶとの間の相互作用は、一過性である。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ある特定の条件下で親和性物質から解離する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶに対する親和性物質の親和性は、ｐＨに依存する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、または少なくとも約１２のｐＨで親和性物質から解離する。一部の実施形態では、ＡＡＶに対する親和性物質の親和性は、ＡＡＶ及び親和性物質を含む溶液中のカルシウム、マグネシウム、硫酸、リン酸、またはそれらの任意の組み合わせの濃度に依存する。一部の実施形態では、ＡＡＶに対する親和性物質の親和性は、ＡＡＶ及び親和性物質を含む溶液中の塩濃度及び／またはイオン強度に依存する。一部の実施形態では、ＡＡＶ及び親和性物質は、還元条件下で解離可能である。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶ結合ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、足場タンパク質の内腔ドメインに連結されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、「抗原結合ドメイン」を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒト、マウス－霊長類、または霊長類－ヒトモノクローナル抗体）またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体、サメＩｇＮＡＲ、または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、サメＩｇＮＡＲまたはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ’を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ１）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｄＡｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｄ断片を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ダイアボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ミニボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体関連ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、受容体に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、ＡＡＶに結合し、例えば、ＡＡＶ結合ペプチドは、ＡＡＶ受容体である。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質の内腔ドメインに連結されている。
一部の実施形態では、受容体は、ＡＡＶ受容体またはその断片である（例えば、Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３０（７５８８）：１０８－１２（２０１６）を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。当該技術分野で既知の任意のＡＡＶ受容体、またはそのＡＡＶ結合断片が、本明細書に記載の足場タンパク質に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、遺伝子ＫＩＡＡ０３１９ＬによりコードされるＡＡＶ受容体であり、例えば、ＡＡＶ受容体は、ＡＡＶＲである（Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＡＡＶＲは、約１５０ｋＤａのＮ－結合型グリコシル化タンパク質である。完全長ＡＡＶＲは、多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）ドメインと称される５つのＩｇ様ドメインを含む１型膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ２ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ３ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ４ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ５ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１及びＰＫＤ２ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１、ＰＫＤ２、及びＰＫＤ３ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、及びＰＫＤ４ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲのＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、ＰＫＤ４、ＰＫＤ５ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ４ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ２ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ１ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメインまたはＰＫＤ４ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメイン、ＰＫＤ４ドメイン、またはＰＫＤ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメイン、ＰＫＤ４ドメイン、ＰＫＤ３ドメイン、またはＰＫＤ２ドメインを含まない。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｆｃ受容体に連結されており、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、Ｆｃに連結されている。ある特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲ１）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＩＩＢ、ＦｃγＩＩＩＡ、及びＦｃγＩＩＩＢから選択されるＦｃガンマ受容体であり、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。ある特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲ１であり、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃアルファ受容体Ｉ（ＦｃαＲ１）であり、ここで、Ｆｃは、ＩｇＡのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃイプシロン受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）及びＦｃεＲＩＩから選択されるＦｃイプシロン受容体であり、ここで、Ｆｃは、ＩｇＥのＦｃである。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ナノボディに連結されており、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）に連結されている。ある特定の実施形態では、ナノボディは、Ｆｃに特異的に結合する。
ＩＩ．Ｃ．４．追加の会合様式
一部の実施形態では、足場タンパク質及びＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、中間体を介して会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、Ｆｃに連結されており、足場タンパク質は、Ｆｃ受容体に連結されており、該足場タンパク質のＦｃ受容体が、ＡＡＶのＦｃと会合する。他の実施形態では、ＡＡＶは、抗原を含み、足場タンパク質は、ＡＡＶ抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインに連結されている。他の実施形態では、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、Ｆｃに連結されており、足場タンパク質は、Ｆｃに特異的に結合する抗原結合ドメインに連結されている。他の実施形態では、足場タンパク質は、受容体に連結されており、該ＡＡＶが、受容体のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶ受容体に連結されており、該ＡＡＶ受容体が、ＡＡＶ上のリガンドと特異的に相互作用する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗体またはその断片、例えば、ＩｇＧとともにインキュベートされ、足場ドメインは、Ｆｃ受容体に連結されており、該抗体またはその断片が、ＡＡＶに結合し、該Ｆｃ受容体が、抗体のＦｃ部分に結合する。
ＩＩ．Ｃ．４．ｉ．リガンド－受容体
本開示のある特定の態様、足場タンパク質は、受容体に連結されており、ＡＡＶは、リガンドに連結されている。当該技術分野で既知の任意のリガンド－受容体対合を使用することができる。一部の実施形態では、リガンドは、Ｆｃであり、受容体は、Ｆｃ受容体である。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ１タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶの５個のＶＰ１タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない４個のＶＰ１タンパク質を含む。
一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ２タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶの５個のＶＰ２タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない４個のＶＰ２タンパク質を含む。
一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ３タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のサブセットの各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約９個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約８個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約７個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約６個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約１０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約１５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約２０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約２５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約３０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約３５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約４０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも約４５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されたＶＰ３の数は、リガンド、例えば、Ｆｃに連結されていない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質の数よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍少ない。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された４個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された５個のＶＰ２タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された４個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された５個のＶＰ１タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、リガンド、例えば、Ｆｃに連結された５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、Ｆｃに連結されており、足場タンパク質は、Ｆｃ受容体に連結されている。本明細書で使用されるとき、「Ｆｃ受容体」という用語は、限定されないが、天然起源のＦｃ受容体の断片を含み、ここで、断片は、Ｆｃに会合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、足場部分に連結されたＦｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体であり、ＡＡＶに連結されたＦｃは、ＩｇＧのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃガンマ受容体は、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲ１）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＩＩＢ、ＦｃγＩＩＩＡ、及びＦｃγＩＩＩＢから選択される。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃγＲ１に連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＧのＦｃに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＡに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＧのＦｃに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃγＩＩＢに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＧのＦｃに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃγＩＩＩＡに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＧのＦｃに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃγＩＩＩＢに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＧのＦｃに連結されている。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、Ｆｃアルファ受容体Ｉ（ＦｃαＲ１）に連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＡのＦｃに連結されている。
一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃイプシロン受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）及びＦｃεＲＩＩから選択されるＦｃイプシロン受容体であり、Ｆｃは、ＩｇＥのＦｃである。ある特定の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃεＲＩに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＥのＦｃに連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＦｃεＲＩＩに連結されており、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＩｇＥのＦｃに連結されている。
ＩＩ．Ｃ．４．ｉｉ．抗原－抗原結合ドメイン
本開示のある特定の態様、足場タンパク質は、抗原結合ドメインに連結されており、ＡＡＶは、抗原を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶ上の抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＡＡＶ上の抗原は、カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶの表面上のＶＰ１に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶの表面上のＶＰ２に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶの表面上のＶＰ３に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＰ１及びＶＰ２の両方に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＰ２及びＶＰ３の両方に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＰ１及びＶＰ３の両方に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に特異的に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶ上の抗原に特異的に結合し、ここで、ＡＡＶ上の抗原は、天然起源のＡＡＶタンパク質ではない。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶにより異種的に発現される。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのカプシドに存在する。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶタンパク質、例えば、カプシドタンパク質に連結されている。
一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ１タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶの５個のＶＰ１タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない４個のＶＰ１タンパク質を含む。
一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ２タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶの５個のＶＰ２タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない４個のＶＰ２タンパク質を含む。
一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ３タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のサブセットの各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約９個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約８個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約７個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約６個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、抗原は、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約１０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約１５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約２０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約２５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約３０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約３５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約４０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結されていない少なくとも約４５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、抗原に連結されたＶＰ３の数は、抗原に連結されていない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質の数よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍少ない。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された４個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された５個のＶＰ２タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された４個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された５個のＶＰ１タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、抗原に連結された２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、抗原に連結された３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、抗原に連結された４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、抗原に連結された５個のＶＰ３タンパク質を含む。
当該技術分野で既知の任意の抗原結合ドメイン／抗原対合を本開示で使用することができる。一部の実施形態では、抗原は、Ｆｃであり、抗原結合ドメインは、Ｆｃに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、Ｆｃに連結されており、足場タンパク質は、抗原結合ドメインに連結されており、該抗原結合ドメインが、Ｆｃに特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＡのＦｃである。一部の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＥのＦｃである。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒト、マウス－霊長類、または霊長類－ヒトモノクローナル抗体）またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体、サメＩｇＮＡＲ、または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、サメＩｇＮＡＲまたはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ’を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ１）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｄＡｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｄ断片を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ダイアボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ミニボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体関連ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶの表面上の立体構造的エピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＡＡＶが無傷及び／または感染性である場合にのみ存在する、ＡＡＶの表面上の抗原に特異的に結合する。
ＩＩ．Ｃ．４．ｉｉｉ．ＡＡＶ受容体
ある特定の態様では、足場タンパク質は、ＡＡＶ結合ポリペプチドに会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、ＡＡＶ受容体を含む。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶ受容体を介してＡＡＶに会合している。一部の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、リンカーによって足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質の細胞外ドメインに連結されている。
当該技術分野で既知の任意のＡＡＶ受容体またはそのＡＡＶ結合断片が、本明細書に記載の足場タンパク質に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、遺伝子ＫＩＡＡ０３１９ＬによりコードされるＡＡＶ受容体であり、例えば、ＡＡＶ受容体は、ＡＡＶＲである（例えば、Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３０（７５８８）：１０８－１２（２０１６）を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＡＡＶＲは、約１５０ｋＤａのＮ－結合型グリコシル化タンパク質である。完全長ＡＡＶＲは、多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）ドメインと称される５つのＩｇ様ドメインを含む１型膜貫通タンパク質である。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ２ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ３ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ４ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ５ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１及びＰＫＤ２ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１、ＰＫＤ２、及びＰＫＤ３ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲの少なくともＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、及びＰＫＤ４ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲのＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、ＰＫＤ４、ＰＫＤ５ドメインを含む、ＡＡＶＲ断片に連結されている。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ４ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ２ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ１ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメインまたはＰＫＤ４ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメイン、ＰＫＤ４ドメイン、またはＰＫＤ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶＲ断片に連結されており、ここで、ＡＡＶＲ断片は、ＰＫＤ５ドメイン、ＰＫＤ４ドメイン、ＰＫＤ３ドメイン、またはＰＫＤ２ドメインを含まない。
一部の実施形態では、受容体は、ＡＡＶのドッキング受容体である。一部の実施形態では、受容体は、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）硫酸プロテオグリカン、Ｎ－結合型シアル酸、Ｏ－結合型シアル酸、Ｎ－結合型ガラクトース、ＣＤ９、ガングリオシドＧＭ１、ＬａｍＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＨＧＦＲ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
ＩＩ．Ｃ．４．ｉｖ．化学誘導二量体
本開示のある特定の態様は、ＡＡＶと、足場タンパク質とを含む、ＥＶを対象とし、ここで、ＡＡＶは、化学誘導二量体の第１の結合パートナーまたは二量体化剤に連結されており、足場タンパク質は、化学誘導二量体の第２の結合パートナーまたは二量体化剤に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ１タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶの５個のＶＰ１タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ１タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない４個のＶＰ１タンパク質を含む。
一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ２タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶの５個のＶＰ２タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ２タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない４個のＶＰ２タンパク質を含む。
一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶの少なくとも１個のＶＰ３タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のサブセットの各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約１０個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約９個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約８個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約７個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約６個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約５個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約４個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約３個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの少なくとも約２個の各々に連結されている。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、ＡＡＶのＶＰ３タンパク質のうちの１個に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも１０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも１５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも２０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも２５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも３０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも３５個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも４０個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶは、結合パートナーに連結されていない少なくとも４５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、第１の結合パートナーに連結されたＶＰ３の数は、結合パートナーに連結されていない少なくとも１個のＶＰ３タンパク質の数よりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍少ない。
ある特定の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された１個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された２個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された３個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された４個のＶＰ２タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された５個のＶＰ２タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された１個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された２個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された３個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された４個のＶＰ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された５個のＶＰ１タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された１個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された２個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された３個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された４個のＶＰ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＶＶは、第１の結合パートナーに連結された５個のＶＰ３タンパク質を含む。
一部の実施形態では、結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に連結されている。他の実施形態では、第１の結合パートナーは、カプシドタンパク質のＣ末端に連結されている。他の実施形態では、第１の結合パートナーは、例えば、カプシドタンパク質のＮ末端とＣ末端との間で、カプシドタンパク質内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、カプシドタンパク質内に挿入される。ある特定の実施形態では、第１の結合パートナーは、内部ループ、例えば、カプシドタンパク質の表面上にあるループ構造を形成する一連のアミノ酸内で、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。ある特定の実施形態では、第１の結合パートナーは、アミノ酸４５５（配列番号４４の番号付けに対して）のすぐ下流で、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｇｌｙ４５３（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｔｈｒ４５４（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｔｈｒ４５５（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の態様では、第１の結合パートナーは、Ｔｈｒ４５６（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｇｌｎ４５７（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｓｅｒ４５８（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ａｒｇ４５９（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、４５３ＧＴＴＴＱＳＲ４５９（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３内に挿入される。特定の実施形態では、第１の結合パートナーは、Ｔｈｒ４５５（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、少なくとも１個のＶＰ３タンパク質内に挿入されるか、または他のＡＡＶ血清型のＶＰタンパク質の相同領域中に挿入される。特定の実施形態では、第１の結合パートナーは、４５３ＧＴＴＴＱＳＲ４５９（配列番号４４の番号付けに対して）を置き換えることによって、少なくとも１個のＶＰ３タンパク質内に挿入されるか、または他のＡＡＶ血清型のＶＰタンパク質の相同領域中に挿入される。
第１の結合パートナーは、ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結され得る。一部の実施形態では、第１の結合パートナーは、リンカーによってカプシドに連結されている。
一部の実施形態では、第２の結合パートナーは、足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ受容体は、リンカーによって足場タンパク質に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、受容体は、足場タンパク質の細胞外ドメインに連結されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質に連結された第１の結合パートナー及び足場タンパク質に連結された第２の結合パートナーは、（ｉ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ＦＫ１０１２）、（ｉｉ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）（ＦＫ５０６）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓ（ＦＫＣｓＡ）、（ｉｖ）ＦＫＢＰ及びＦＲＢ（ラパマイシン）、（ｖ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）、（ｖｉ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）、（ｖｉｉ）スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇ（ＨａＸＳ）、（ｖｉｉｉ）ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇ（ＴＭＰ－ＨＴａｇ）、ならびに（ｉｘ）ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）（ＡＢＴ－７３７）からなる群から選択される、化学誘導二量体の第１及び第２の結合パートナーから選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、足場タンパク質は、カルシニューリンＡ（ＣＮＡ）に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、カルシニューリンＡ（ＣＮＡ）に連結されており、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、足場タンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＣｙＰ－Ｆａｓに連結されており、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＫＢＰに連結されており、足場タンパク質は、ＦＲＢに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＦＲＢに連結されており、足場タンパク質は、ＦＫＢＰに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧｙｒＢに連結されており、足場タンパク質は、ＧｙｒＢに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧＡＩに連結されており、足場タンパク質は、ＧＩＤ１に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＧＩＤ１に連結されており、足場タンパク質は、ＧＡＩに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、スナップタグに連結されており、足場タンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されており、足場タンパク質は、スナップタグに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されており、足場タンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｅＤＨＦＲに連結されており、足場タンパク質は、ＨａｌｏＴａｇに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＢＣＬ－ｘＬに連結されており、足場タンパク質は、Ｆａｂ（ＡＺ１）に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｆａｂ（ＡＺ１）に連結されており、足場タンパク質は、ＢＣＬ－ｘＬに連結されている。
特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＦＲＢに連結された少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含み、ここで、ＦＲＢは、カプシドタンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＦＲＢに連結された少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含み、ここで、ＦＲＢは、カプシドタンパク質のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＦＲＢに連結された少なくとも１つのカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３）を含み、ここで、ＦＲＢは、カプシドタンパク質内に挿入される。一部の実施形態では、ＦＲＢは、本明細書に開示される任意の箇所で、カプシドタンパク質内に挿入される。
ＩＩ．Ｃ．４．ｖ．親和性物質
一部の実施形態では、足場タンパク質は、親和性物質に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、足場タンパク質の細胞外ドメインに連結されている。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶ結合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶ受容体を含む。一部の実施形態では、親和性物質は、本明細書に開示されるような抗体または抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、親和性物質は、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質に結合する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質である。一部の実施形態では、親和性物質は、ＡＡＶカプシドタンパク質単量体には結合しない。
一部の態様では、親和性物質は、１つよりも多くのＡＡＶ血清型に結合することができる。一部の態様では、親和性物質は、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３Ａ型ＡＡＶ、３Ｂ型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせから選択される、１つよりも多くのＡＡＶ血清型に結合することができる。一部の態様では、親和性物質は、ＡＡＶ９血清型に特異的に結合する。一部の態様では、親和性物質は、任意のＡＡＶ血清型に結合し得る。一部の態様では、親和性物質は、ＡＡＶ２血清型に特異的に結合する。一部の態様では、親和性物質は、ＡＡＶ４血清型に特異的に結合する。一部の態様では、親和性物質は、ＡＡＶ５血清型に特異的に結合する。
一部の実施形態では、親和性物質とＡＡＶとの間の相互作用は、一過性である。一部の実施形態では、ＡＡＶは、ある特定の条件下で親和性物質から解離する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶに対する親和性物質の親和性は、ｐＨに依存する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、または少なくとも約１２のｐＨで親和性物質から解離する。一部の実施形態では、ＡＡＶに対する親和性物質の親和性は、ＡＡＶ及び親和性物質を含む溶液中のカルシウム、マグネシウム、硫酸、リン酸、またはそれらの任意の組み合わせの濃度に依存する。一部の実施形態では、ＡＡＶに対する親和性物質の親和性は、ＡＡＶ及び親和性物質を含む溶液中の塩濃度及び／またはイオン強度に依存する。一部の実施形態では、ＡＡＶ及び親和性物質は、還元条件下で解離可能である。
一部の実施形態では、足場タンパク質は、ＡＡＶ結合ポリペプチドに連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、足場タンパク質のＮ末端に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、足場タンパク質のＣ末端に連結されている。一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、足場タンパク質の細胞外ドメインに連結されている。
一部の実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒト、マウス－霊長類、または霊長類－ヒトモノクローナル抗体）またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体、サメＩｇＮＡＲ、または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、サメＩｇＮＡＲまたはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ’を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ１）２を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｄＡｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆａｂを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆｄ断片を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ダイアボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ミニボディを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体関連ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。
ＩＩ．Ｄ．リンカー
上述したように、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム及びナノ小胞）は、第１の要素を第２の要素に（例えば、足場タンパク質をカプシドタンパク質に、足場タンパク質を結合パートナーに、カプシドタンパク質を結合パートナーに、足場タンパク質をナノボディに、足場タンパク質を受容体（例えば、Ｆｃ受容体）に、Ｆｃを足場タンパク質に、足場タンパク質を抗原結合ドメインに、ＡＡＶＲを足場タンパク質に、抗原をカプシドタンパク質に、Ｆｃをカプシドタンパク質に、またはそれらの任意の組み合わせ）連結する、１つまたは複数のリンカーを含み得る。
リンカーは、２つの要素を結合するための、当該技術分野で既知の任意の化学部分であり得る。本明細書で使用されるとき、「リンカー」という用語は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）、または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。一部の態様では、２つ以上のリンカーがタンデムで連結され得る。複数のリンカーが存在する場合、リンカーの各々は、同じであることも、または異なることもできる。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を阻止／改善する。リンカーは典型的には切断されないが、ある特定の態様では、かかる切断が望ましい場合がある。したがって、一部の態様では、リンカーは、プロテアーゼにより切断可能な１つまたは複数の部位を含むことができ、これらの部位は、リンカーの配列内に位置し得るか、またはリンカー配列のそれぞれの末端でリンカーに隣接し得る。一部の態様では、切断可能なリンカーは、ＡＡＶの放出を可能にする。
一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含み得る。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然起源のものである。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖状配列を、それが自然界で天然には連結または遺伝的に融合されないアミノ酸の第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然起源または非天然起源のペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然起源のポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換、または欠失等の変異を含む）、非天然起源のポリペプチドを含み得る。
リンカーは、切断に感受性がある場合があり（「切断可能なリンカー」）、それによって、ＡＡＶまたは足場タンパク質の放出を容易にする。一部の実施形態では、足場タンパク質は、切断可能なリンカーによってカプシドタンパク質に連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、ＡＡＶを放出する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、切断可能なリンカーによって、本明細書に記載されるような化学誘導二量体の結合パートナーに連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、足場タンパク質を結合パートナーから放出する。一部の実施形態では、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、切断可能なリンカーによって、本明細書に記載されるような化学誘導二量体の結合パートナーに連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、カプシドタンパク質を結合パートナーから放出する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、切断可能なリンカーによってナノボディに連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、足場タンパク質をナノボディから放出する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、切断可能なリンカーによって、本明細書に記載されるような抗原結合ドメインに連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、足場タンパク質を抗原結合ドメインから放出する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、切断可能なリンカーによって、本明細書に記載されるような受容体（例えば、Ｆｃ受容体）に連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、足場タンパク質を受容体（例えば、Ｆｃ受容体）から放出する。一部の実施形態では、足場タンパク質は、切断可能なリンカーによって、本明細書に記載されるようなＡＡＶＲに連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、足場タンパク質をＡＡＶＲから放出する。一部の実施形態では、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、切断可能なリンカーによって、本明細書に記載されるような抗原に連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、カプシドタンパク質を抗原から放出する。一部の実施形態では、ＡＡＶのカプシドタンパク質は、切断可能なリンカーによってＦｃに連結されており、該切断可能なリンカーの切断が、カプシドタンパク質をＦｃから放出する。
一部の態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。一部の態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含有する。一部の態様では、リンカーは、「酸に不安定なリンカー」である。一部の態様では、酸に不安定なリンカーは、ヒドラゾンを含有する。好適な酸に不安定なリンカーにはまた、例えば、シス－アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
一部の態様では、切断可能なリンカーは、ジヌクレオチドもしくはトリヌクレオチドリンカー、ジスルフィド、イミン、チオケタール、ｖａｌ－ｃｉｔジペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の態様では、切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメート、バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメート、または両方を含む。
一部の態様では、切断可能なリンカーは、レドックスで切断可能なリンカー、活性酸素種（ＲＯＳ）で切断可能なリンカー、ｐＨ依存性で切断可能なリンカー、酵素で切断可能なリンカー、プロテアーゼで切断可能なリンカー、エステラーゼで切断可能なリンカー、ホスファターゼで切断可能なリンカー、光活性化される切断可能なリンカー、自壊性リンカー、またはそれらの組み合わせを含む。これらの切断可能なリンカーのうちの１つまたは複数に関する追加の開示は、下記でさらに提供され、また、当該技術分野で既知であり、例えば、ＵＳ２０１８／００３７６３９Ａ１、Ｔｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２６－６２９（１９８２）、Ｕｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．４３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７７－６８４（１９８９）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（２４）：７０２７－７０３７（２０１７）、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８－７８４（２００３）、ＵＳ７，７５４，６８１Ｂ２、ＵＳ２００６／０２６９４８０、ＵＳ２０１０／００９２４９６、ＵＳ２０１０／０１４５０３６、ＵＳ２００３／０１３０１８９、ＵＳ２００５／０２５６０３０を参照されたく、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、リンカーの組み合わせは、レドックスで切断可能なリンカーを含む。ある特定の態様では、かかるリンカーは、還元時または酸化時に切断されるレドックスで切断可能な連結基を含み得る。
一部の態様では、レドックスで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合を含有し、すなわち、それはジスルフィドで切断可能なリンカーである。一部の態様では、レドックスで切断可能なリンカーは、例えば、細胞内メルカプタン、オキシダーゼ、レダクターゼ、またはそれらの組み合わせによって還元され得る。
一部の態様では、リンカーの組み合わせは、例えば、活性化した好中球等の炎症プロセスによって生成される、スーパーオキシド（Ｏｆ）または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等の活性酸素種（ＲＯＳ）によって切断され得る、切断可能なリンカーを含み得る。一部の態様では、ＲＯＳで切断可能なリンカーは、チオケタールで切断可能なリンカーである。例えば、米国特許８，３５４，４５５Ｂ２号を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、リンカーは、酸性条件下（ｐＨ＜７）で選択的に切断される連結基である、酸で切断可能な連結基を含む、酸に不安定なリンカーである。
一部の態様では、酸で切断可能な連結基は、酸性環境、例えば、約６．０、約５．５、約５．０、またはそれ未満で切断される。一部の態様では、ｐＨは、約６．５以下である。一部の態様では、リンカーは、一般酸として作用し得る酵素、例えば、ペプチダーゼ（これは基質特異的であり得る）またはホスファターゼ等の薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソーム及びリソソーム等のある特定の低ｐＨオルガネラは、酸で切断可能な連結基に切断環境を提供することができる。ヒト血清のｐＨは７．４であるものの、細胞内の平均ｐＨは、約７．１～７．３の範囲で若干より低い。また、エンドソームは、５．５～６．０の範囲の酸性ｐＨを有し、リソソームは、さらにより酸性ｐＨで約５．０である。したがって、ｐＨ依存性で切断可能なリンカーは、当該技術分野で、エンドソームで不安定なリンカーと呼ばれることがある。
一部の態様では、酸で切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。別の非限定的な例では、エステル酸素に結合している炭素（アルコキシ基）が、アリール基に結合している場合、例えば、置換アルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチル等の三級アルキル基。酸で切断可能な連結基の例としては、アミン、イミン、アミノエステル、安息香酸イミン（ｂｅｎｚｏｉｃ ｉｍｉｎｅ）、ジオルトエステル（ｄｉｏｒｔｈｏ ｅｓｔｅｒ）、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、シス－アコニット酸、ヒドラジド、チオカルバモイル、イミジン、アジドメチル－メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスクされたエンドソーム分解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）剤、シトラコニル（ｃｉｔｒａｃｏｎｙｌ）基、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ジスルフィド結合もまた、ｐＨに感受性がある。
一部の態様では、リンカーは、低ｐＨに不安定なヒドラゾン結合を含む。かかる酸に不安定な結合は、コンジュゲート、例えば、抗体－薬物コンジュゲートの分野で広範囲に使用されてきた。例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１，１２，１４６０－７、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００８，４，１０２４－３７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００７，６，８３８－５０、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００７，３２１，４６２－８、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６，５８，２２９－３６、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１，７７８－８４を参照されたく、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、リンカーは、以下のもの、すなわち、酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）で不安定で、ジオール及びケトンを形成するケタール；酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）で不安定で、ジオール及びアルデヒドを形成するアセタール；酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）で不安定で、アミン及びアルデヒドもしくはケトンを形成するイミンもしくはイミニウム；酸性条件下で不安定であるケイ素－酸素－炭素結合；ケイ素－窒素（シラザン）結合；ケイ素－炭素結合（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、及びアリルシラン）；マレアメート（ｍａｌｅａｍａｔｅ）（無水マイレン酸誘導体及びアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸触媒加水分解を経るように設計された活性化カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド））；またはビニルエーテルから選択される、低ｐＨに不安定な結合を含む。
さらなる例は、米国特許第９，７９０，４９４Ｂ２号及び同第８，１３７，６９５Ｂ２号に見出すことができ、同文献の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、リンカーの組み合わせは、細胞内または細胞外酵素、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ（ａｍｉｄａｄｅ）によって切断可能なリンカーを含み得る。リンカーの組み合わせにおいて特定のリンカーを切断することができる酵素の範囲は、リンカーの特定の結合及び化学構造に依存する。したがって、ペプチド性リンカーは、例えば、ペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄａｄｅ）によって切断され得、エステル結合を含有するリンカーは、例えば、エステラーゼによって切断され得、アミド結合を含有するリンカーは、例えば、アミダーゼ（ａｍｉｄａｄｅ）によって切断され得る、等である。
一部のリンカーは、エステラーゼによって切断される（「エステラーゼで切断可能なリンカー」）。ある特定のエステルのみが、細胞の内側または外側に存在するエステラーゼ及びアミダーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸及びアルコールの縮合によって形成される。単純エステルは、単純アルコール、例えば、脂肪族アルコール、ならびに小環状及び小芳香族アルコールにより生成されるエステルである。エステルに基づく切断可能な連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステルで切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。
一部の態様では、リンカーの組み合わせは、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される、リン酸に基づく切断可能な連結基を含み得る。細胞内リン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内ホスファターゼ等の酵素である。リン酸に基づく連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ ｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、または－ＯＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。
一部の態様では、Ｒｋは、以下、すなわち、ＮＨ２、ＢＨ３、ＣＨ３、Ｃ１－６アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ１－６アルコキシ、及びＣ６－１０アリール－オキシのうちのいずれかである。一部の態様では、Ｃ１－６アルキル及びＣ６－１０アリールは、非置換である。さらなる非限定的な例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－が挙げられる。
一部の態様では、組み合わせのリンカーは、光活性化される切断可能なリンカー、例えば、ニトロベンジルリンカーまたはニトロベンジル反応性基を含むリンカーを含む。
一部の態様では、リンカーは、切断不可能なリンカーを含む。
ＩＩＩ．操作されたエキソソームの産生のためのプロデューサー細胞
本開示のＥＶ、例えばエキソソームは、インビトロで増殖させた細胞、または対象の体液から産生され得る。エキソソームをインビトロ細胞培養物から産生させる場合、種々のプロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、及びＭＳＣを使用することができる。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のうちのいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。
プロデューサー細胞は、本明細書に記載のエキソソームを産生させるために、１つまたは複数の外因性配列（例えば、ＡＡＶ、足場タンパク質、または治療用タンパク質をコードする）を含むように遺伝子改変され得る。遺伝子改変されたプロデューサー細胞は、一過性または安定な形質転換によって外因性配列を含有し得る。外因性配列は、プラスミドとして形質転換を行うことができる。外因性配列は、標的とする部位でまたはランダムな部位において、プロデューサー細胞のゲノム配列に安定に組み込まれ得る。一部の実施形態では、内腔が操作されたエキソソームの産生のために、安定な細胞株が生成される。
外因性配列は、エキソソームタンパク質をコードする内因性配列内、その上流（５’末端）または下流（３’末端）に位置する、プロデューサー細胞のゲノム配列に挿入され得る。当該技術分野で既知の種々の方法を、外因性配列のプロデューサー細胞への導入に使用することができる。例えば、種々の遺伝子編集法（例えば、相同組換え、トランスポゾン媒介系、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して修飾された細胞が、本開示の範囲内にある。
外因性配列は、本明細書に開示される足場タンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする配列を含み得る。足場タンパク質をコードする配列の余分のコピーを導入して、（例えば、ＥＶ、例えばエキソソームの表面上、例えば、内腔及び／または外部表面上により高い密度の足場タンパク質を有する）本明細書に記載のエキソソームを産生させることができる。足場タンパク質の修飾体または断片をコードする外因性配列を導入して、足場タンパク質の修飾体または断片を含有する内腔が操作された及び／または表面が操作されたエキソソームを産生させることができる。
一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、ＡＡＶのカプシドタンパク質、ＡＡＶ受容体、化学誘導二量体の結合パートナー、抗原結合ドメイン（例えば、ナノボディ）、Ｆｃ受容体、またはそれらの任意の組み合わせに連結された足場タンパク質をコードする１つまたは複数のベクターで修飾、例えば、トランスフェクトされ得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるプロデューサー細胞は、追加の外因性配列を含むようにさらに修飾される。例えば、追加の外因性配列を導入して、内因性遺伝子発現を調節するか、またはペイロード（例えば、ＡＡＶ）を含むエキソソームを産生させることができる。一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、一方が足場タンパク質またはそのバリアントもしくは断片をコードし、他方がペイロード（例えば、ＡＡＶ）をコードする、２つの外因性配列を含むように修飾される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、エキソソームに追加の機能性を付与する追加の外因性配列を含むようにさらに修飾され得る。一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、一方が本明細書に開示される足場タンパク質またはそのバリアントもしくは断片をコードし、他方がＡＡＶをコードする、２つの外因性配列を含むように修飾される。一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれよりも多くの追加の外因性配列を含むようにさらに修飾される。
本明細書に記載の足場部分のうちのいずれも、プラスミド、ゲノムに挿入された外因性配列、または合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等の他の外因性核酸から発現され得る。
一部の実施形態では、ＥＶ及びＡＡＶは、単一の細胞または細胞種の単一の集団によって産生される。一部の実施形態では、ＥＶは、第１の細胞（または第１の細胞集団）によって産生され、ＡＡＶは、第２の細胞（または第２の細胞集団）によって産生される。一部の実施形態では、第１の細胞及び第２の細胞は、同じ種類の細胞である。一部の実施形態では、第１の細胞及び第２の細胞は、同じ種類の細胞ではない。
ＩＶ．薬学的組成物
本明細書では、対象への投与に好適な形態で、所望の程度の純度を有する本開示のＥＶ、例えばエキソソームと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物が提供される。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与されようとしている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定され得る。したがって、複数の細胞外小胞を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照されたい）。薬学的組成物は一般に、滅菌され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。
一部の実施形態では、薬学的組成物は、１つまたは複数の治療剤と、本明細書に記載のエキソソームとを含む。ある特定の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、薬学的に許容される担体中で１つまたは複数の追加の治療剤と共投与される。一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエント（例えば、動物またはヒト）に対し、用いられる投薬量及び濃度で無毒であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体または化合物が本明細書に記載の細胞外小胞と不適合性でない限り、組成物中でのそれらの使用が企図される。補助的な治療剤もまた、組成物に組み込まれ得る。典型的には、薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。ＥＶ、例えばエキソソームは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路によって、または吸入剤として投与することができる。ある特定の実施形態では、エキソソームを含む薬学的組成物は、例えば、注射によって、静脈内投与される。ＥＶ、例えばエキソソームは、任意選択で、ＥＶ、例えばエキソソームが意図される疾患、障害、または病態を処置する上で少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、水、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化合物、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧の調整のための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整され得る。調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアルに封入され得る。
注射用の使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は一般に、滅菌されており、容易なシリンジ注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。所望であれば、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、及び塩化ナトリウムが、組成物に添加され得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射液は、ＥＶ、例えばエキソソームを、有効量で、所望に応じて本明細書に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込むことによって、調製され得る。一般に、分散液は、ＥＶ、例えばエキソソームを、基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末がもたらされる。ＥＶ、例えばエキソソームは、ＥＶ、例えばエキソソームの持続放出またはパルス放出を可能にするような様態で製剤化され得る、デポー注射または埋め込み調製物の形態で投与することができる。
エキソソームを含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与の場合、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤中で使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、点鼻薬の使用により遂行され得る。
ある特定の実施形態では、エキソソームを含む薬学的組成物は、当該薬学的組成物が有益であろう対象に静脈内投与される。ある特定の他の実施形態では、組成物は、例えば、リンパ内注射によってもしくはリンパ節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）注射によってリンパ系に（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照されたい）、または筋肉内注射によって、皮下投与によって、腫瘍内注射によって、胸腺もしくは肝臓への直接注射によって投与される。
ある特定の実施形態では、エキソソームを含む薬学的組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、投与後にデポーを形成することができる製剤として投与される。ある特定の好ましい実施形態では、デポーは、ＥＶ、例えばエキソソームを循環中に緩徐に放出するか、またはデポー形態のまま留まる。
典型的には、薬学的に許容される組成物は、混入物を含まないように高度に精製され、生体適合性かつ無毒であり、対象への投与に適している。水が担体の構成成分である場合、水は高度に精製され、混入物、例えば、内毒素を含まないように処理される。
薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得るが、これらに限定されない。薬学的組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／または防腐剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の薬学的組成物は、本明細書に記載のＥＶ、例えばエキソソームと、任意選択で薬学的に活性な薬剤または治療剤とを含む。治療剤は、生物学的薬剤、低分子薬剤、または核酸薬剤であり得る。
本明細書に記載のＥＶ、例えばエキソソームを含む薬学的組成物を含む剤形が提供される。一部の実施形態では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。一部の実施形態では、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
ある特定の実施形態では、エキソソームの調製物は、複製能のある残留核酸に損傷を与えるために、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝される。
ある特定の実施形態では、エキソソームの調製物は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００ｋＧｙ超、または１００ｋＧｙ超の照射線量を使用してガンマ照射に曝される。
ある特定の実施形態では、エキソソームの調製物は、約０．１、約０．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００ｍＳｖ超、または約１００００ｍＳｖを超える照射線量を使用してＸ線照射に曝される。
Ｖ．キット
本明細書ではまた、本明細書に記載の１つまたは複数のエキソソームを含むキットも提供される。一部の実施形態では、本明細書では、本明細書に提供される１つまたは複数のエキソソーム等の本明細書に記載の薬学的組成物の成分のうちの１つまたは複数が充填された１つまたは複数の容器、任意選択的な使用説明書を含む、医薬品パックまたはキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の薬学的組成物、及び本明細書に記載されるもの等の任意の予防剤または治療剤を収容する。
ＶＩ．エキソソームを生産する方法
一部の態様では、本開示はまた、本明細書に記載のエキソソームを生産する方法も対象とする。一部の実施形態では、該方法は、プロデューサー細胞からＥＶ、例えばエキソソームを得ることと、任意選択で、得られたＥＶ、例えばエキソソームを単離することとを含む。一部の実施形態では、該方法は、本明細書に開示されるエキソソームの２つ以上の構成成分（例えば、足場タンパク質及びＡＡＶ）を導入することによってプロデューサー細胞を修飾することと、修飾されたプロデューサー細胞からＥＶ、例えばエキソソームを得ることと、任意選択で、得られたＥＶ、例えばエキソソームを単離することとを含む。さらなる実施形態では、該方法は、プロデューサー細胞からエキソソームを得ることと、得られたエキソソームを単離することと、単離されたエキソソームを（例えば、ＡＡＶを挿入することによって）修飾することとを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、単離されたエキソソームを薬学的組成物に製剤化することをさらに含む。
ＶＩ．Ａ．プロデューサー細胞を修飾する方法
上述したように、一部の実施形態では、エキソソームを生産する方法は、プロデューサー細胞を１つまたは複数の部分（例えば、足場タンパク質及び／またはＡＡＶ）で修飾することを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＡＡＶを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、本明細書に開示される足場タンパク質をさらに含む。
一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、哺乳類細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、哺乳類細胞株である。哺乳類細胞株の非限定的な例としては、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ－１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ－６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊膜細胞株、上皮細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳類細胞株は、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆体細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、初代細胞である。ある特定の実施形態では、初代細胞は、初代哺乳類細胞、初代植物細胞、初代昆虫細胞、初代真菌細胞、または初代原核細胞であり得る。
一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）等の免疫細胞ではない。他の実施形態では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、またはいずれのかかる細胞に由来する細胞）ではない。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、導入遺伝子またはｍＲＮＡであり得、トランスフェクション、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、押出し、超音波処理、細胞融合、または当業者に既知の他の方法によってプロデューサー細胞に導入され得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、トランスフェクションによってプロデューサー細胞に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、カチオン性脂質及び重合体等の合成高分子を使用して好適なプロデューサー細胞に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、電荷相互作用を通して１つまたは複数の部分と複合体を形成する。これらの実施形態のうちの一部では、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞により取り込まれる。一部の他の実施形態では、カチオン重合体を使用して、プロデューサー細胞をトランスフェクトすることができる。これらの実施形態のうちの一部では、カチオン重合体は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレン等の化学物質を使用して、１つまたは複数の部分をプロデューサー細胞に導入することができる。１つまたは複数の部分はまた、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、または粒子衝撃技術（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））等の物理的方法を使用してプロデューサー細胞に導入され得る。例えば、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子を使用して、プロデューサー細胞のトランスフェクション効率を評価することができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ウイルス形質導入によってプロデューサー細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含めたいくつかのウイルスが、遺伝子導入ビヒクルとして使用され得る。ウイルス媒介性遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びヘルペスウイルス等のＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターを含む。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞膜に一時的な孔を作成して、細胞中への種々の分子の導入を可能にする。一部の実施形態では、ポリペプチド及び非ポリペプチド治療剤と同様にＤＮＡ及びＲＮＡも、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入され得る。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、微量注射によってプロデューサー細胞に導入される。一部の実施形態では、ガラス製マイクロピペットを使用して、微視的レベルで１つまたは複数の部分をプロデューサー細胞に注射することができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、押出しによってプロデューサー細胞に導入される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、超音波処理によってプロデューサー細胞に導入される。一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、高強度の音波に曝露されることにより細胞膜の一時的な破壊を引き起こして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、細胞融合によってプロデューサー細胞に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、電気的細胞融合によって導入される。他の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、プロデューサー細胞を融合するために使用される。さらなる実施形態では、センダイウイルスが、プロデューサー細胞を融合するために使用される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、低張性溶解によってプロデューサー細胞に導入される。かかる実施形態では、プロデューサー細胞は、低イオン強度緩衝液に曝露されることによりそれらの破裂を引き起こして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にすることができる。他の実施形態では、低張液に対する制御された透析を使用して、プロデューサー細胞を膨潤させ、プロデューサー細胞膜に孔を作成することができる。プロデューサー細胞は、その後、膜の再封止を可能にする条件に曝露される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、洗剤処理によってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする孔を作成することによってプロデューサー細胞膜を一時的に損なう穏やかな洗剤で処理される。プロデューサー細胞が負荷された後、洗剤は洗い流され、それによって膜が再封止される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、１つまたは複数の部分が結合すると受容体及び会合した部分の内部移行を誘導する、表面受容体を有する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、濾過によってプロデューサー細胞に導入される。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞及び１つまたは複数の部分は、プロデューサー細胞よりも小さい孔径のフィルターに強制的に通すことにより、プロデューサー細胞膜の一時的な破壊を引き起こし、１つまたは複数の部分がプロデューサー細胞に入ることを可能にすることができる。
一部の実施形態では、プロデューサー細胞は、数回の凍結融解サイクルに供されることにより細胞膜の破壊をもたらして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
ＶＩ．Ｂ．エキソソームを修飾する方法
一部の実施形態では、エキソソームを生産する方法は、１つまたは複数の部分をＥＶに直接的に導入することによって、単離されたエキソソームを修飾することを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＡＡＶを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、本明細書に開示される足場タンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、トランスフェクションによってエキソソームに導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、カチオン性脂質及び重合体等の合成高分子を使用してＥＶに導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレン等の化学物質を使用して、１つまたは複数の部分をＥＶに導入することができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、エレクトロポレーションによってＥＶに導入される。一部の実施形態では、エキソソームは、ＥＶ膜に一時的な穴を引き起こす電界に曝露されることにより、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、微量注射によってＥＶに導入される。一部の実施形態では、ガラス製マイクロピペットを使用して、微視的レベルで１つまたは複数の部分をＥＶに直接的に注射することができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、押出しによってＥＶに導入される。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の部分は、超音波処理によってＥＶに導入される。一部の実施形態では、ＥＶは、高強度の音波に曝露されることによりＥＶ膜の一時的な破壊を引き起こして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＥＶの表面にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、当該技術分野で既知の方法によって、化学的または酵素的に達成され得る。
一部の実施形態では、ＥＶは、化学的にコンジュゲートされている１つまたは複数の部分を含む。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用の有無にかかわらず、１つまたは複数の部分を別の分子に共有結合させることによって遂行され得る。かかるコンジュゲートの形成は当業者の技能の範囲内にあり、コンジュゲーションを遂行するための種々の技法が知られており、このうち特定の技法の選定は、コンジュゲートされる材料によって導かれる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、ＥＶにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、脂質、炭水化物、核酸、及び低分子等の非ポリペプチドが、ＥＶにコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、低張性溶解によってＥＶに導入される。かかる実施形態では、ＥＶは、低イオン強度緩衝液に曝露されることによりそれらの破裂を引き起こして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にすることができる。他の実施形態では、低張液に対する制御された透析を使用して、ＥＶを膨潤させ、ＥＶ膜に孔を作成することができる。ＥＶは、その後、膜の再封止を可能にする条件に曝露される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、洗剤処理によってＥＶに導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする孔を作成することによってＥＶ膜を一時的に損なう穏やかな洗剤で処理される。ＥＶが負荷された後、洗剤は洗い流され、それによって膜が再封止される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってＥＶに導入される。ある特定の実施形態では、ＥＶは、１つまたは複数の部分が結合すると受容体及び会合した部分の内部移行を誘導する、表面受容体を有する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、機械的発火（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｉｒｉｎｇ）によってＥＶに導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、金マイクロキャリア等の重粒子または荷電粒子に結合させた１つまたは複数の部分により衝撃を与えられ得る。これらの実施形態のうちの一部では、粒子は、粒子がＥＶ膜を横断するように機械的または電気的に加速され得る。
一部の実施形態では、細胞外小胞は、数回の凍結融解サイクルに供されることによりＥＶ膜の破壊をもたらして、１つまたは複数の部分の負荷を可能にする。
ＶＩ．Ｃ．ＥＶ、例えばエキソソームを単離する方法
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＥＶを生産する方法は、プロデューサー細胞からＥＶを単離することを含む。ある特定の実施形態では、ＥＶは、プロデューサー細胞によって細胞培養液中に放出される。ＥＶの単離の全ての既知の様態が、本明細書における使用に好適であると見なされることが企図される。例えば、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるい等）、密度（例えば、通常遠心分離または勾配遠心分離）、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ定数（例えば、外力を伴うまたは伴わない沈降等）に基づく分離を含めて、ＥＶの物理的性質を用いて、培地または他の供給源材料からそれらを分離することができる。代替として、または追加として、単離は、１つまたは複数の生物学的性質に基づくことができ、表面マーカーを用い得る方法を含むことができる（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、親和性精製等のために）。
単離及び濃縮は、典型的には連続遠心分離を含む、一般的かつ非選択的様態で行われ得る。代替として、単離及び濃縮は、ＥＶまたはプロデューサー細胞特異的表面マーカーを使用する等、より特異的かつ選択的な様態で行われ得る。例えば、特異的表面マーカーが、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、親和性精製、及びビーズ結合リガンドを用いた磁気分離において使用され得る。
一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、ＥＶを単離することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技法は、当該技術分野で既知である。例となる、非限定的な技法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ボイド容積の画分が単離され、これは目的とするＥＶを含む。さらに、一部の実施形態では、ＥＶは、当該技術分野で一般に既知であるように、クロマトグラフーでの分離後に（１つまたは複数のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技法によってさらに単離され得る。一部の実施形態では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して、細胞外小胞をさらに単離することができる。ある特定の実施形態では、プロデューサー細胞由来のＥＶを、他の起源のＥＶからさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、プロデューサー細胞由来のＥＶは、プロデューサー細胞に特異的な抗原抗体を使用した免疫吸着剤捕捉により、非プロデューサー細胞由来のＥＶから分離され得る。
一部の実施形態では、ＥＶの単離は、分画遠心、サイズに基づく膜濾過、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、及び磁気分離を含むがこれらに限定されない方法の組み合わせを伴い得る。
ＶＩＩ．処置方法
本開示はまた、本明細書に開示されるＥＶを対象に投与することを含む、疾患または障害の予防及び／または処置を必要とする対象において疾患または障害を予防及び／または処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法で処置され得る疾患または障害は、がん、血友病、糖尿病、増殖因子欠損症、眼疾患、ポンペ病、ゴーシェ、リソソーム蓄積症、ムコビシドーシス、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、トランスチレチンアミロイドーシス、血友病Ａ、血友病Ｂ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、レーバー先天黒内障、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、ＯＴＣ欠損症、グリコーゲン蓄積症１Ａ、クリグラー・ナジャー症候群、原発性高シュウ酸尿症１型、急性間欠性ポルフィリン症、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、ムコ多糖症ＶＩ型、α１アンチトリプシン欠損症、レット症候群、ドラベ症候群、アンジェルマン症候群、ＤＭ１疾患、脆弱Ｘ疾患、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、ＣＭＴ病（別名、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性運動感覚性ニューロパチー（ＨＭＳＮ）、または腓骨筋萎縮症）、ＣＭＴ１Ｘ疾患、カテコラミン誘発性多形性心室性頻拍、脊髄小脳失調３型（ＳＣＡ３）疾患、肢帯型筋ジストロフィー、または高コレステロール血症を含む。一部の実施形態では、処置は、予防的である。
一部の実施形態では、疾患または障害は、がんを含む。一部の実施形態では、がんは、進行性、局所進行性、または転移性である。一部の実施形態では、がんは、再発性である。一部の実施形態では、がんは、以前の治療、例えば、以前の標準治療に不応性である。
一部の実施形態では、疾患または障害は、凝固因子欠損症に関連する。一部の実施形態では、疾患または障害は、出血性疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、血友病である。一部の実施形態では、疾患または障害は、血友病Ａである。一部の実施形態では、疾患または障害は、血友病Ｂである。一部の実施形態では、疾患または障害は、フォン・ヴィレブランド病である。
一部の態様では、疾患または障害は、神経変性疾患である。一部の態様では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
ある特定の態様では、疾患または障害は、筋ジストロフィーを含む。一部の態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋強直性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ２Ｂ、ＬＧＭＤ２Ｄ、ＬＧＮＭＤ２Ｌ、ＬＧＭＤ２Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｅ及びＬＧＭＤ２Ａを含むがこれらに限定されない）、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。一部の態様では、ＡＡＶは、～を含む（ｃｏｍｐｒｉ）。
一部の態様では、疾患または障害は、ＡＡＤＣ欠損症（ＣＮＳ）、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、β－サラセミア（重度の鎌状赤血球）、がん（頭頸部扁平上皮細胞）、ニーマン・ピック病Ｃ型、大脳型ＡＬＤ、全脈絡膜萎縮症、うっ血性心不全、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ファブリー病、緑内障、神経膠腫（がん）、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＨｏＦＨ（高コレステロール血症）、ハンチントン病、リポタンパク質リパーゼ欠損症、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー症候群）、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリポ症候群）、パーキンソン病、ポンペ病、劣性栄養障害性表皮水泡症、ＲＰＥ６５欠損症（視力喪失）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ Ｉ）、ウェット型ＡＭＤ（網膜疾患）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）、Ｘ連鎖性筋細管ミオパチー、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
一部の態様では、疾患または障害は、腎症、尿崩症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、腎疾患糸球体腎炎、細菌性もしくはウイルス性糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｄｅｓ）、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、シェーグレン症候群、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症及び関連障害、急性腎不全、急性尿細管間質性腎炎、腎盂腎炎、尿生殖路炎症性疾患、子癇前症（Ｐｒｅ－ｃｌａｍｐｓｉａ）、腎移植拒絶反応、癩病、逆流性腎症、腎結石症、遺伝性腎疾患、髄質嚢胞性、髄質海綿、多発性嚢胞腎疾患、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患、結節性硬化症、フォンヒッペル・リンドウ病、家族性糸球体基底膜菲薄化疾患、ＩＩＩ型コラーゲン糸球体症、フィブロネクチン糸球体症、アルポート症候群、ファブリー病、爪膝蓋骨症候群、先天性泌尿器系異常、単クローン性高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、アミロイドーシス及び関連障害、熱性疾患、家族性地中海熱、ＨＩＶ感染症－ＡＩＤＳ、炎症性疾患、全身性血管炎、結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、多発性動脈炎、壊死性半月体形成性糸球体腎炎、多発性筋炎・皮膚筋炎、膵炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、痛風、血液障害、鎌状赤血球症、血栓性血小板減少性紫斑病、ファンコニ症候群、移植、急性腎障害、過敏性腸症候群、溶血性尿毒症症候群、急性皮質壊死、腎血栓塞栓症、外傷及び外科手術、広範囲の損傷、熱傷、腹部及び血管外科手術、麻酔誘導、薬物使用または薬物乱用の副作用、循環器疾患、心筋梗塞、心不全、末梢血管疾患、高血圧症、冠動脈心疾患、非アテローム動脈硬化性心血管疾患、アテローム動脈硬化性心血管疾患、皮膚疾患、乾癬、全身性硬化症、呼吸器疾患、ＣＯＰＤ、閉塞性睡眠時無呼吸、高地での低酸素症（ｈｙｐｏｉａ）もしくは内分泌（ｅｒｄｏｃｒｉｎｅ）疾患、先端巨大症、真性糖尿病、及び尿崩症、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
一部の態様では、疾患または病態は、がん、例えば、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、乳癌、脳癌、結腸癌、前立腺癌、消化管癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、神経系のがん、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、泌尿生殖器癌及び膀胱癌、黒色腫、白血病、脳癌（例えば、神経膠腫、星細胞腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、ならびに混合性神経膠腫と呼ばれる２つ以上の細胞種の混合を伴う腫瘍、聴神経腫（神経鞘腫、シュワン細胞腫、神経線維腫症）、腺腫、星細胞腫（Ａｓｔｒａｃｙｔｏｍａ）、低悪性度星細胞腫、巨細胞性星細胞腫、中悪性度及び高悪性度星細胞腫、再発性腫瘍、脳幹神経膠腫、脊索腫、脈絡叢乳頭腫、ＣＮＳリンパ腫（原発性悪性リンパ腫）、嚢胞、類皮嚢胞、類表皮嚢胞、頭蓋咽頭腫、上衣腫、退形成性上衣腫、神経節細胞腫（Ｇａｎｇｌｉｏｃｙｔｏｍａ）（神経節細胞腫（Ｇａｎｇｌｉｏｎｅｕｒｏｍａ））、神経節膠腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、悪性星細胞腫（Ａｓｔｒａｃｙｔｏｍａ）、神経膠腫、血管芽細胞腫、手術不可能な脳腫瘍、リンパ腫、髄芽細胞腫（ＭＤＬ）、髄膜腫、転移性脳腫瘍、混合性神経膠腫、神経線維腫症、乏突起神経膠腫、視神経膠腫、松果体領域の腫瘍、下垂体腺腫、ＰＮＥＴ（原始神経外胚葉腫瘍）、脊髄腫瘍、上衣下腫、及び結節性硬化症（ボンネビル病）、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択されるがんを含む。
一部の実施形態では、疾患または障害は、増殖因子欠損症に関連する。一部の実施形態では、増殖因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７）、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバー（例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害性因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６））、コロニー刺激因子（例えば、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エフリン（例えば、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３）、ウシ胎子ソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＧＤＮＦファミリーメンバー（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（例えば、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたは肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン（例えば、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）、ニューロトロフィン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ＮＴ－４、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、疾患または障害は、糖尿病である。一部の実施形態では、疾患または障害は、眼疾患または眼障害である。一部の実施形態では、疾患または障害は、全脈絡膜萎縮症（ＣＨＭ）である。
一部の実施形態では、ＥＶは、対象の循環系に静脈内投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の静脈中に投与される。
一部の実施形態では、ＥＶは、対象の循環系に動脈内投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の動脈中に投与される。
一部の実施形態では、ＥＶは、髄腔内投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、それが脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。
一部の実施形態では、ＥＶは、対象の１つまたは複数の腫瘍中に腫瘍内投与される。
一部の実施形態では、ＥＶは、鼻腔内投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、局所投与または全身投与のいずれかの形態で、鼻を通して吹送され得る。ある特定の実施形態では、ＥＶは、点鼻薬として投与される。
一部の実施形態では、ＥＶは、腹腔内投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の腹膜中に注射される。一部の実施形態では、腹腔内投与は、リンパ管へのＥＶの分布をもたらす。一部の実施形態では、腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／または骨髄へのＥＶの分布をもたらす。一部の実施形態では、腹腔内投与は、１つまたは複数のリンパ節へのＥＶの分布をもたらす。一部の実施形態では、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１つまたは複数へのＥＶの分布をもたらす。一部の実施形態では、腹腔内投与は、膵臓へのＥＶの分布をもたらす。
一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、眼周囲投与によって対象に投与される。一部の実施形態では、ｓは、眼周囲組織中に注射される。眼周囲の薬物投与には、結膜下、前テノン嚢下、後テノン嚢下、及び眼球後投与の経路が含まれる。
一部の実施形態では、ＥＶ、例えばエキソソームは、眼内投与される。したがって、本開示は、ペイロード（例えば、ＡＶＶ）を含む本開示の細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを含む、有効量の組成物を対象に投与することを含み、該組成物の投与が眼内である、眼疾患または眼障害の処置を必要とする対象において眼疾患または眼障害を処置する方法を提供する。
一部の実施形態では、眼内投与は、硝子体内投与、前房内投与、結膜下投与、網膜下投与、強膜下投与、脈絡膜内投与、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、眼内投与は、本開示のＥＶ、例えばエキソソームの注射を含む。一部の実施形態では、眼内投与は、硝子体内注射である。
一部の実施形態では、眼内投与は、本開示のＥＶ、例えばエキソソームを含む送達デバイスの埋め込みを含む。一部の実施形態では、送達デバイスは、眼内送達デバイスである。一部の実施形態では、眼内送達デバイスは、生分解性である。一部の実施形態では、眼内送達デバイスは、硝子体内インプラントまたは強膜プラグである。一部の実施形態では、送達デバイスは、徐放性送達デバイスである。
一部の実施形態では、本開示のＥＶ、例えばエキソソームを含む組成物は、眼内投与前に静注用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）で前処理される。
一部の実施形態では、眼疾患または眼障害は、黄斑変性症、白内障、糖尿病性網膜症、緑内障、弱視、斜視、網膜症、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、眼疾患または眼障害は、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜剥離、糖尿病性網膜症、網膜色素上皮萎縮症、網膜色素上皮肥大、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）疾患、感染症、眼内腫瘍、眼球外傷、ドライアイ、結膜炎、血管新生緑内障、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜網膜静脈閉塞症、黄斑浮腫、前方血管新生（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、角膜血管新生、網膜下浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、黄斑円孔、血管条、網膜色素変性症、シュツットガルト病、炎症性眼疾患、難治性眼奇形、円錐角膜、レーザー誘発性ＡＭＤ、視神経症、または老人性白内障である。
一部の実施形態では、眼疾患または眼障害は、眼癌である。一部の実施形態では、眼癌は、続発性眼癌（例えば、乳癌または肺癌転移に起因する）である。一部の実施形態では、眼癌は、網膜芽細胞腫、眼内黒色腫（例えば、虹彩、脈絡膜、もしくは毛様体のブドウ膜黒色腫、または結膜黒色腫）、非ホジキン原発性眼内リンパ腫、髄様上皮腫、脈絡膜血管腫、脈絡膜転移、脈絡膜母斑、脈絡膜骨腫、結膜カポジ肉腫、眼球上デルモイド、瞼裂斑、翼状片、扁平上皮癌、または結膜上皮内新生物である。
一部の実施形態では、ＡＭＤは、第２区分（早期）、第３区分（中期）、及び第４区分（進行期）ＡＭＤを含むがこれらに限定されない、任意の病期の網膜疾患である。
一実施形態では、ＡＭＤは一般に、ドライ型及びウェット型の２つの種類に類別される。「ドライ型」という用語は、網膜の変質に伴って、黄斑の下に小さな黄色い沈着物（ドルーゼン）の形成が起こる、１つの種類のＡＭＤを指す。一部の実施形態では、ドライ型ＡＭＤには、多くの場合、網膜色素上皮の萎縮に起因する脈絡膜毛細血管萎縮、線維化、ブルッフ膜の肥厚、及び黄斑萎縮が伴う。
「ウェット型」という用語は、黄斑の周りの網膜の下で発生する異常血管を伴うＡＭＤを指す。異常血管は、破壊及び出血時に、黄斑に損傷を与えるとともに、黄斑をその土台から移動させる可能性がある。ウェット型ＡＭＤの症状には、ブルッフ膜の破壊、硝子膜、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜下脈絡膜への血管侵入と、これに続く漿液性または出血性の円形部が含まれる。これには、黄斑網膜色素上皮下または上皮下の血管侵入が含まれるが、これらに限定されず、これは板状剥離を引き起こし、最終的に円盤状瘢痕となる。臨床所見によれば、萎縮型もまたウェット型に変化する可能性がある。
一部の実施形態では、ウェット型ＡＭＤはまた、脈絡膜血管新生（「ＣＮＶ」）とも称される。ＣＮＶ（またはウェット型）は、「古典的（ｃｌａｓｓｉｃ）」ＣＮＶ及び「潜在性（ｏｃｃｕｌｔ）」ＣＮＶにさらに分類され得る。古典的ＣＮＶは一般に、血管造影の移行相にまたがる鮮明で高蛍光性の境界明瞭な領域を特徴とし、早期相及び後期相のフレームにおいて漏出が見られる。潜在性ＣＮＶは、線維血管性の色素上皮剥離を含む。ＣＮＶからもたらされる血管新生は、血液及び体液を漏出する傾向を有し、これにより出血斑及び変形の症状を引き起こす。この新たな血管に伴って、線維組織の増殖が起こる。この新生血管及び線維組織の複合体は、光受容体を破壊し得る。この病変は、黄斑にわたって増殖し続け、進行性で重度の不可逆的な盲目を引き起こす可能性がある。個体の片眼がＣＮＶを発症するとき、５年以内におよそ５０％の確率で他方の眼に類似のＣＮＶ病変が生じる。
一部の実施形態では、本開示のＣＮＶ病変は、潜在性ＣＮＶを含む。一実施形態では、ＣＮＶ病変は、古典的ＣＮＶを含むか、それから本質的になるか、またはさらにそれからなる。別の実施形態では、ＣＮＶ病変は、古典的ＣＮＶ及び潜在性ＣＮＶの両方を含む。
「黄斑浮腫」という用語は、眼疾患の嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）または糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）を指す。ＣＭＥは、眼の中心網膜または黄斑に影響を及ぼす眼疾患である。この病態が存在するとき、流体の複数の嚢胞状（嚢胞様）領域が黄斑に現れ、網膜の膨張または浮腫を引き起こす。ＣＭＥは、網膜静脈閉塞症、ブドウ膜炎、及び／または糖尿病等の様々な疾患に付随し得る。ＣＭＥは、白内障手術の後に生じることが多い。ＤＭＥは、糖尿病患者の網膜の血管が黄斑の中に漏出し始めるときに生じる。これらの漏出は、黄斑の肥厚及び膨張を引き起こして、鋭い視覚を進行性で歪める。膨張は盲目に至らない場合があるが、この影響は、中心視野の重度の喪失を引き起こし得る。
「緑内障」という用語は、視神経が特徴的なパターンで障害を受ける眼疾患を指す。これは、罹患した眼の視力に永久的な障害を与え、未処置のまま放置すると盲目に至る可能性がある。それは通常、眼内液（房水）の増加した圧力に関連する。高眼圧症という用語は、いずれの関連する視神経障害も伴うことなく一貫して上昇した眼内圧（ＩＯＰ）を有する患者に対して使用される。逆に、正常眼圧または低眼圧緑内障という用語は、視神経障害及び関連する視野喪失を有するが、ＩＯＰが正常または低い患者に対して使用される。神経障害は、特異的パターンでの網膜神経節細胞の喪失を伴う。緑内障の多くの異なるサブタイプが存在するが、それらはいずれも視神経症の一種と見なされ得る。上昇した眼圧（例えば、２１ｍｍＨｇまたは２．８ｋＰａを上回る）は、緑内障の最も重要かつ唯一の変更可能な危険因子である。しかしながら、高い眼圧を何年も有しながら障害を決して発症しない場合がある者もいれば、比較的低い眼圧で神経障害を発症し得る者もいる。未処置の緑内障は、視神経の永久的な障害及び結果として生じる視野の喪失に至る可能性があり、これは経時的に盲目へと進行し得る。
「糖尿病性網膜症」という用語は、糖尿病の合併症によって引き起こされる網膜症（すなわち、網膜の疾患）を含み、これは最終的に盲目に至る可能性がある。糖尿病性網膜症は、症状を何ら引き起こさないか、軽度の視力異常、またはさらには盲目を引き起こす可能性がある。糖尿病性網膜症は、網膜微小血管系の変化の結果である。高血糖誘発性の壁内周皮細胞の細胞死及び基底膜の肥厚は、血管壁の機能不全につながる。これらの障害は、血液網膜関門の形成を変化させ、また、網膜血管の透過性を高める。
一部の実施形態では、本開示は、眼内投与用に製剤化された本開示のＥＶ、例えばエキソソームを含む、薬学的組成物を提供する。本開示はまた、眼内投与用に製剤化された本開示のＥＶ、例えばエキソソームを含む、薬学的組成物と、任意選択で、本明細書に開示される方法による使用説明書、例えば、特定の眼疾患または眼障害を処置するための薬学的組成物を投与するための説明書とを含む、キットを提供する。
本開示の実施は、別途指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技法を用いることになり、これらは当業者の技能の範囲内にある。かかる技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
上記に引用される参考文献の全て、ならびに本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
以下の実施例は、限定するものではなく、例示説明として提供される。
実施例１
足場タンパク質を使用した内腔負荷
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の細胞内ドメイン、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のＣ末端に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させた（図１）。足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質を、カプシドタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部部位のいずれかに融合した。ＡＡＶは、エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
実施例２
化学誘導二量体の結合パートナーを使用した内腔負荷
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＦＲＢ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる（図２）。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部部位のいずれかに融合されるか（図２）、または４５５位にて内部ループ（例えば、ＶＰ１）内に挿入される（図３Ａ～３Ｂ）。挿入は、ＦＲＢによりＶＰ１のアミノ酸残基Ｔ４５５（配列番号４４に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰ）を、ＰＴＧＦＲＮ、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＦＲＢ及びＦＫＢＰの二量体化を誘導するためのラパマイシンの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰ、カルシニューリンＡ、ＣｙＰ－Ｆａｓ、ＧｙｒＢ、ＧＡＩ、ＧＩＤ１、スナップタグ、ＨａｌｏＴａｇ、ｅＤＨＦＲ、ＢＣＬ－ｘＬ、またはＦａｂ（ＡＺ１））に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、（例えば、ＦＫＢＰ、カルシニューリンＡ、ＣｙＰ－Ｆａｓ、ＧｙｒＢ、ＧＡＩ、ＧＩＤ１、スナップタグ、ＨａｌｏＴａｇ、ｅＤＨＦＲ、ＢＣＬ－ｘＬ、またはＦａｂ（ＡＺ１）））によりＶＰ１のアミノ酸残基Ｔ４５５（配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、（例えば、ＦＫＢＰ、カルシニューリンＡ、ＣｙＰ－Ｆａｓ、ＧｙｒＢ、ＧＡＩ、ＧＩＤ１、スナップタグ、ＨａｌｏＴａｇ、ｅＤＨＦＲ、ＢＣＬ－ｘＬ、またはＦａｂ（ＡＺ１）））を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰの二量体化を誘導するためのＦＫ１０１２の存在下で；ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡの二量体化を誘導するためのＦＫ５０６の存在下で；ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓの二量体化を誘導するためのＦＫＣｓＡの存在下で；ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢの二量体化を誘導するためのクーママイシンの存在下で）；ＧＡＩ及びＧＩＤ１の二量体化を誘導するためのジベレリンの存在下で）；スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇの二量体化を誘導するためのＨａＸＳの存在下で）；ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇの二量体化を誘導するためのＴＭＰ－ＨＴａｇの存在下で）；ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）の二量体化を誘導するためのＡＢＴ－７３７の存在下で））エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、第１のＦＫＢＰ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、第１のＦＫＢＰ）によりＶＰ１のアミノ酸残基Ｔ４５５（配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、第２のＦＫＢＰ）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、第１のＦＫＢＰ及び第２のＦＫＢＰの二量体化を誘導するためのＦＫ１０１２の存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰまたはカルシニューリンＡ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰまたはカルシニューリンＡ）によりＶＰ１のアミノ酸残基Ｔ４５５（配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰまたはカルシニューリンＡ）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡの二量体化を誘導するためのＦＫ５０６の存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰまたはＣｙＰ－Ｆａｓ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰまたはＣｙＰ－Ｆａｓ）によりＶＰ１のアミノ酸残基Ｔ４５５（配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ＦＫＢＰまたはＣｙＰ－Ｆａｓ）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓの二量体化を誘導するためのＦＫＣｓＡの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＧｙｒＢ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、ＧｙｒＢ）によりアミノ酸残基Ｔ４５５（ＶＰ１の配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ＧｙｒＢ）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢの二量体化を誘導するためのクーママイシンの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＧＡＩまたはＧＩＤ１）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、ＧＡＩまたはＧＩＤ１）によりアミノ酸残基Ｔ４５５（ＶＰ１の配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ＧＡＩまたはＧＩＤ１）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＧＡＩ及びＧＩＤ１の二量体化を誘導するためのジベレリンの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、スナップタグまたはＨａｌｏＴａｇ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、スナップタグまたはＨａｌｏＴａｇ）によりアミノ酸残基Ｔ４５５（ＶＰ１の配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、スナップタグまたはＨａｌｏＴａｇ）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇの二量体化を誘導するためのＨａＸＳの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ｅＤＨＦＲまたはＨａｌｏＴａｇ）に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、ｅＤＨＦＲまたはＨａｌｏＴａｇ）によりアミノ酸残基Ｔ４５５（ＶＰ１の配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ｅＤＨＦＲまたはＨａｌｏＴａｇ）を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇの二量体化を誘導するためのＴＭＰ－ＨＴａｇの存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）が化学誘導二量体の結合パートナー（例えば、ＢＣＬ－ｘＬまたはＦａｂ（ＡＺ１））に融合されている、修飾ＡＡＶを産生させる。結合パートナーは、カプシドタンパク質のＮ末端に融合されるか、または内部ループ内に（例えば、ＶＰ１の４５５位にて）挿入されるかのいずれかである。挿入は、化学的に誘導された結合パートナー（例えば、ＢＣＬ－ｘＬまたはＦａｂ（ＡＺ１））によりＶＰ１のアミノ酸残基Ｔ４５５（配列番号４５に対して）を置き換えるように行う。次いで、対応する結合パートナー（例えば、ＢＣＬ－ｘＬまたはＦａｂ（ＡＺ１））を、ＰＴＧＦＲＮ（またはその機能的断片）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質のいずれかのＣ末端に連結する。ＡＡＶは、二量体化を誘導するために必要な化学物質の存在下で（例えば、ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）の二量体化を誘導するためのＡＢＴ－７３７の存在下で）エキソソームを共産生する細胞において産生され、これによりＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
実施例３
ＡＡＶ受容体を使用した内腔負荷
エキソソームが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）に連結された足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質を含む、修飾エキソソームを生成する。ＡＡＶＲは、ＰＫＤ１－２及び一本鎖抗体を含み得る（図４）。内腔負荷のために、ＡＡＶＲは、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の細胞内ドメイン、または最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質の細胞内ドメインに連結されている。エキソソームは、ＡＡＶを共産生する細胞において産生され、これにより、ＡＡＶ受容体がＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
実施例４
抗原結合ポリペプチドを使用した外表面負荷
細胞外ドメインにて抗原結合ドメイン（例えば、ナノボディ）に連結された足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）を含む、修飾エキソソームを産生させる（図５）。抗原結合ドメイン（例えば、ナノボディ）は、ＡＡＶカプシド上のエピトープに特異的に結合する。エキソソーム及びＡＡＶを、異なる産生細胞から別個に産生させ、精製する。次いで、ナノボディ－足場タンパク質を発現している精製エキソソームを、精製ＡＡＶとともにインキュベートして、ＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。代替として、エキソソームは、ＡＡＶを共産生する細胞において産生され、これにより、ナノボディがＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
実施例５
Ｆｃを使用した外表面負荷
ＩｇＧのＦｃ領域に連結されたカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３）を含む、修飾ＡＡＶを産生させる。ＦｃγＲ１またはＦｃに特異的に結合するナノボディのいずれかに連結された足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）を含む、修飾エキソソームを生成する（図６）。ＦｃγＲ１またはナノボディは、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の細胞外ドメインに連結されている。エキソソーム及びＡＡＶを、異なる産生細胞から別個に産生させ、精製する。次いで、足場融合タンパク質を発現している精製エキソソームを、精製ＡＡＶとともにインキュベートして、ＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。代替として、エキソソームは、ＡＡＶを共産生する細胞において産生され、これにより、足場タンパク質がＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
実施例６
ＡＡＶ受容体を使用した外表面負荷
エキソソームが、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）に連結された足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）を含む、修飾エキソソームを生成した（図７Ａ）。ＡＡＶＲは、足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の細胞外ドメインに連結されている。エキソソーム及びＡＡＶを、異なる産生細胞から別個に産生させ、精製した。次いで、足場融合タンパク質を発現している精製エキソソーム（図７Ｂ）を、精製ＡＡＶとともにインキュベートして、ＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にした。バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）データは、ＡＡＶＲエキソソームが固定化ＡＡＶ２に結合する一方で、対照エキソソームが結合しないことを示す（図８Ａ～８Ｂ）。代替として、エキソソームは、ＡＡＶを共産生する細胞において産生され、これにより、足場タンパク質がＡＡＶのエキソソームへの局在化を容易にする。
実施例７
ＡＡＶ融合構築物は核局在化を保持する
本明細書に記載の種々の技法は、ペプチド配列のＡＡＶのカプシドタンパク質への融合に依存する。ＡＡＶ活性を評価するために、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ２のＮ末端を、最小配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む足場タンパク質（「Ｅｔｐ」）、または化学的に誘導可能な結合パートナーＦＲＢまたはＦＫＢＰに連結した、修飾ＡＡＶを生成した。Ｅｔｐ－ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でＶＰ２カプシドタンパク質を置換した対照である。修飾ＡＡＶが産生細胞の核に局在化する能力を保持することを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞ライセートから単離された精製サイトゾル画分及び精製核画分に対してウェスタンブロッティングを実施した。図９Ａに示されるように、サイトゾル（左）及び核（右）からの等量の細胞ライセートを変性ポリアクリルアミドゲル上にローディングした。サイトゾルライセート及び核ライセートの両方における、αＦＬＡＧタグ（全ての構築物上で発現）（図９Ｂ）、及びαヒストンＨ４（核マーカー）（図９Ｃ）に特異的な抗体を使用したＥｔｐ－ＧＦＰ、Ｅｔｐ－ＶＰ２、及びＦＲＢ－ＶＰ２についてのウェスタンブロッティングにより、これらのエキソトープ（ｅｘｏｔｏｐｅ）－ＶＰ２構築物が発現され、産生細胞の核に局在化することが実証された。具体的に述べると、αＦＬＡＧ抗体プローブを使用した核ライセートにおいてＥｔｐ－ＶＰ２が見て取れる（図９Ｃ）。ＡＡＶカプシドアセンブリ及びゲノム負荷は核内で生じるため、Ｅｔｐ－ＶＰ２が核内で濃縮されるという実証は、エキソソーム負荷を容易にするペプチドタグを担持する、機能的ＡＡＶカプシドを生成する機会を提供する。さらに、ｅｔｐ－ＶＰ２修飾を担持するＡＡＶは、この修飾が核への進入を阻害しないことから、レシピエント細胞の核に進入して遺伝子導入を媒介することができるはずである。
実施例８
培養物中でのエキソソーム－ＡＡＶの発現
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、トリプルトランスフェクション法を介してトランスフェクトして、ＡＡＶを発現させた。この方法は、典型的には、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされる遺伝子導入ベクター（ＩＴＲ要素が隣接した導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、ならびにカプシドタンパク質及び複製関連タンパク質の配列を含有する補助機能ベクターを伴う。図１０Ａ～１０Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び浮遊培養に適応させたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ＳＦ）にトランスフェクトされた種々のＡＡＶカプシド血清型の結果を示す。ＡＡＶ発現試験のためにＡＡＶ発現構築物を得た。図１０Ａ～１０Ｄは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ６カプシドがウェスタンブロットを介して検出されることを示す。使用した抗体プローブは、ＡＡＶ４を認識しないことが報告されており、このことがＡＡＶ４レーンにおけるシグナルの欠如を説明し得る。
トリプルトランスフェクション法を使用してＡＡＶ９を接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において増殖させた。回収物を濾過して、細胞破片を除去し、次いで、接線流濾過により１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中に濃縮及び透析濾過した。５０ｍＬのＴＦＦ濃縮（約１０倍）細胞上清を３時間の超遠心分離（１３３，９００×ｇ）によってペレット状にし、結果として得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。調製物を、１５０，０００×で１６時間の超遠心分離を用いてＯｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配（イオジキサノールに基づく媒体）に適用した。分離後、図１４Ａに見られるような画分１～１０を収集し、ＰＢＳで１０倍希釈し、１３３，９００ｇで３時間の超遠心分離を介してペレット状にし、続いて１００ｕＬ体積のＰＢＳ中に再懸濁した。ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのウェスタンブロット、エキソソームを検出するための粒子計数（ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ））、及びＡＡＶ ＤＮＡ導入遺伝子ゲノムコピーを検出するためのｑＰＣＲを介して画分を分析した。一部の画分は、（ＮＴＡ）解析により検出可能な粒子を含有しなかった。図１１Ａ～１１Ｂは、ＮＴＡ（粒子／ｍＬ）の結果及びｑＰＣＲ（遺伝子コピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ））の結果の詳細を示す。ほとんどのＡＡＶ導入遺伝子ＤＮＡは、より密度の高い画分８～１０における、エキソソームに会合していない遊離ＡＡＶで見出された。ＡＡＶカプシドのウェスタンブロット分析は、図１２Ａ～１２Ｃで見ることができ、これはＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３ポリペプチドが、それらがエキソソームに会合していない画分８、９、及び１０において最も顕著に見て取れることを示す。画分１、２、３、及び５もまた検出可能なＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を有し、これらの画分におけるより高いエキソソーム濃度に関連していることが分かる。
実施例９
エキソソーム－ＡＡＶの精製
トリプルトランスフェクション法を使用してＡＡＶ９を接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において増殖させた。回収物を濾過して、細胞破片を除去し、次いで、接線流濾過を使用して１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液（約１０ｍＳ／ｃｍ）中に濃縮及び透析濾過した。次いで、結合・溶出（ｂｉｎｄ－ａｎｄ－ｅｌｕｔｅ）陰イオン交換クロマトグラフィーを介して調製物を精製した。２０カラム体積分にわたって１５０ｍＭのＮａＣｌ～１ＭのＮａＣｌの漸増濃度のＮａＣｌを用いた直線勾配溶出（ＬＧＥ）を使用。次いで、カラムを５カラム体積分の２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）でストリップしてから、１ＭのＮａＯＨで洗浄及び消毒した。精製クロマトグラムは、図１３に提供される。図１４Ａに見られるように、直線勾配にわたって画分を収集し、エキソソーム計数及び粒径を決定するためにＮＴＡにより解析した。画分２、３、及び４は、ＮＴＡによって測定したときに最も高い粒子溶出濃度を示す。図１４Ｂ～１４Ｄは、ＡＡＶ５（図１４Ｂ～１４Ｃ）及びＡＡＶ９（図１４Ｄ）を負荷されたエキソソームの例となる画像を示す。次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して各画分を精製した。画分２、３、及び４は、テーリングをほとんど伴わずにボイド容積近くの単一ピークとして溶出し、これはエキソソーム等の粒子に特有であり、可溶性タンパク質でもＡＡＶ９（これは体積＝１６．５ｍＬで溶出することが示された）でもない。画分２、３、及び４はまた、ＮＴＡ解析を介して最も高い粒子濃度を含有していた（図１５）。
実施例１０
ＡＡＶ９効力の決定
ＡＡＶ９－ＧＦＰ及びエキソソーム－ＡＡＶ９－ＧＦＰを、実施例６に記載されるように密度勾配超遠心分離または陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、標準的ＡＡＶトリプルプラスミド系でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３接着性細胞培養物から単離した。各試料を、１ｍＬ当たりのウイルスゲノム（ＧＣ／ｍＬ）を決定するためにｑＰＣＲにより３連で定量した。ＨｅＬａ細胞を標準的細胞培養手順によって増殖させ、９６ウェルＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍプレートのウェル中に５０００細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を抗ＡＡＶ ＩｇＧの存在下で、遊離ＡＡＶ９－ＧＦＰまたは封入ＡＡＶ９－ＧＦＰのいずれかで、固定ＧＣ／ウェル（固定ＭＯＩ：６０００）によりトランスフェクトした。ＩｇＧの濃度は、用量漸増研究を生成するために、ＩｇＧ濃度に対する３．１６倍（ｈａｌｆ－ｌｏｇ）間隔でのＰＢＳ中の希釈によって体系的に変化させた。試料をウェルに添加した後、蛍光強度によって測定したときのＧＦＰ発現量を４日間の期間にわたって３時間毎に決定した。各条件は３連で実行した。陰イオン交換クロマトグラフィーから単離された試料であるＦ７の代表的なプロファイルが、図１６に記載される。
エキソソーム－ＡＡＶ試料（「エキソ」）で、ＡＡＶのみの試料（「ＡＡＶ」）と比較してより迅速な形質導入が観察された。達成された最大効力もまた、およそ１５，０００蛍光単位を生み出したＡＡＶのみの試料（「ＡＡＶ」）と比較して、エキソソーム－ＡＡＶ（「エキソ」）試料において４０，０００蛍光単位に近くとなり、より高かった。これらの効力データは、エキソソーム－ＡＡＶが、エキソソーム封入を介して送達される場合であっても遊離ＡＡＶ９の効力及び遺伝子送達能力と一致するかまたはそれを超えることが可能であることを実証する。
実施例１１
抗体による中和に対するエキソソーム－ＡＡＶの耐性
抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、生物学的製剤の送達でよく見られる問題である。反復投与（またはさらには単回投与）を必要とする介入は、生物学的製剤に対する宿主免疫応答によって妨げられ得る。エキソソームへの会合が阻害性抗体に対する耐性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＧＦＰを発現する遊離ＡＡＶ９及びエキソソーム会合ＡＡＶ９を、様々な抗ＡＡＶ９ ｎＡｂにわたってＨｅＬａ細胞とともにインキュベートした。エキソソーム会合ＡＡＶ９は、２つの時点及び全てのｎＡｂ濃度で遊離ＡＡＶ９よりも顕著に優れていた（図１７Ａ）。抗ＡＡＶモノクローナル抗体に対する、遊離ＡＡＶ９と比較したエキソソーム－ＡＡＶ構築物（ＧＦＰ導入遺伝子を担持する）の耐性を、実施例１０に記載されるようにさらに調査し、これは図１７Ｂで見ることができる。ＡＡＶ単独の対照試料を抗ＡＡＶモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の段階希釈物に対して試験し、ＧＦＰシグナルを測定した。ＧＦＰシグナルは、宿主細胞への成功裏のＡＡＶ感染及びＧＦＰ導入遺伝子の送達を示す。これらの結果は、遊離ＡＡＶ９が１０００倍以下の抗ＡＡＶ ｍＡｂの段階希釈で顕著な感染力を示すことを示す。遺伝子コピーｑＰＣＲ分析によって決定したときのＭＯＩに関してマッチさせたとき、エキソソーム－ＡＡＶ試料を遊離ＡＡＶ９－ＭＯＩマッチ済み試料と比較した。Ｃｈｒｏｍ．３、Ｃｈｒｏｍ．５、及びＣｈｒｏｍ．７等の試料は、希釈率１００倍の抗ＡＡＶ ｍＡｂの存在下であっても顕著な感染力を示した。１００時間後、Ｃｈｒｏｍ．３、Ｃｈｒｏｍ．４、及びＣｈｒｏｍ．５は全て、２０，０００を優に上回るＧＦＰシグナルを示し、持続的な感染能力が示された。このシグナルは、遊離ＡＡＶ９－ＭＯＩマッチ済み試料で見られた希釈率１００倍のシグナルよりも顕著に高く、このことは、遊離ＡＡＶ９が抗ＡＡＶ ｍＡｂによって中和されたが、エキソソーム－ＡＡＶ構築物は中和されなかったことを示す。図１８Ａ～１８Ｄにおいて、陰イオン交換クロマトグラフィーに由来する試料のうちの１つであるＦ７についてのデータを抽出して、中和抗体価の関数としての、ＡＡＶのみの試料との突き合わせた比較を可能にした。エキソソーム－ＡＡＶは、ＨｅＬａ細胞培養物への試料の添加後ｔ＝２４、４８、７２、及び９６時間で、ＡＡＶと比較してより迅速な形質導入速度、増加した効力、及び強化された免疫回避を示す。
実施例１２
ラットにおける硝子体内投与後のＡＡＶ９及びエキソソームの体内分布
材料及び用量処方（Ｄｏｓｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）詳細：ＡＡＶ９及びエキソソームは、即時使用可能な製剤中にある。４０μＬのＡＡＶ９及び４０μＬのエキソソームの２つのバイアルが準備される。以下の方法を使用した１つのＡＡＶ９バイアル及び１つのエキソソームバイアルへの添加のために、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）（２５ｍｇバイアル、粉末形態）もまた準備される：（ｉ）２５ｍｇのＩＶＩｇ粉末を０．５ｍＬのＰＢＳ（５０ｍｇ／ｍＬの目標濃度）中に再構成する、（ｉｉ）５０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩｇ原液から、以下を実施する：０．８μＬのＩＶＩｇを１つのＡＡＶバイアルに添加し、ピペット操作により混合し、注射前に４℃で少なくとも１時間インキュベートする；０．８μＬのＩＶＩｇを１つのエキソソームバイアルに添加し、ピペット操作により混合し、注射前に４℃で少なくとも１時間インキュベートする。
動物モデル：ＣＤラット（約６～８週齢）を研究で使用する（ｎ＝購入１５匹、ｎ＝研究中１０匹）。
画像研究設計：
（１）用量投与：
ａ．注射及び経路：
ｉ．群１、ｎ＝２：ＰＢＳの硝子体内注射（約５μＬ）
ｉｉ．群２、ｎ＝２：ＡＡＶ９の硝子体内注射（約５μＬ）
ｉｉｉ．群３、ｎ＝２：ＩＶＩｇとともにプレインキュベートしたＡＡＶ９の硝子体内注射（約５μＬ）。
ｉｖ．群４、ｎ＝２：エキソソーム－ＡＡＶ９の硝子体内注射（約５μＬ）
ｖ．群５、ｎ＝２：ＩＶＩｇとともにプレインキュベートしたエキソソーム－ＡＡＶ９の硝子体内注射（約５μＬ）。
ｂ．両眼に対照／試験品（特定の化合物の投与群を指す）を投与する
（２）組織収集：
１．組織収集の最終時点は、各対照／試験品の注射から２週間後となる。以下の組織を収集する：眼（左右）
２．両眼を全ての動物から収集し、瞬間冷凍し、スポンサーに出荷するまで－２０℃で保管する。
Figure 2022531095000016
実施例１３
エキソソーム封入による中和抗体からのＡＡＶ９の遮蔽
中和抗体は、２０％～５０％の患者がＡＡＶに対する既存の中和抗体を有するため、扱うことのできる患者集団を限定する。ＡＡＶへの曝露後に高力価の交差反応性抗ＡＡＶ抗体が生成されるため、ＡＡＶを用いた再投薬は現在のところ可能でない。したがって、ＡＡＶをエキソソーム封入によって中和抗体から遮蔽した（確率的負荷、例えば、ランダムな局在化）。図１９に示されるように、ＡＡＶ９をエキソソームによって遮蔽した場合、ルシフェラーゼシグナルは、漸増濃度の中和抗体による影響を受けなかった。対照的に、ルシフェラーゼシグナルは、漸増濃度の中和抗体を受けて相当に減衰した。試験した最も低い抗体濃度であっても、エキソソームの保護効果は、エキソソーム封入試料において１５０倍であった（およそ３００，０００ＲＬＵ対およそ２，０００）、ルシフェラーゼシグナルに関する差異によって示されるように実質的であった。
実施例１４
マウスへのエキソソーム－ＡＡＶの投与はＡＡＶによりコードされるレポーターの増加した発現を生み出す
エキソソームに会合したＡＡＶによりコードされるレポーター遺伝子の発現を試験するために、ＣＤラット（６～８週齢）に、分泌型ｎａｎｏＬｕｃをコードする５ｕｌの遊離ＡＡＶ９またはエキソソーム－ＡＡＶ９（約１ｅ１０ｖｇ、図２１Ａに例示される）を硝子体内から注射した（ｎ＝４匹の動物、動物１匹当たり２つの眼）。投与から２週間後、眼を収集し、冷凍し、その後均質化した。ルシフェラーゼ及び総タンパク質のレベルを測定した。エキソソーム－ＡＡＶ群において、遊離ＡＡＶ９群と比較してより高い導入遺伝子発現の傾向が観察される（図２１Ｂ～２１Ｃ）。
本出願に引用された全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文献は、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文献が参照によりあらゆる目的で援用されるように個別に示されるのと同じ程度まで、参照によりそれらの全体があらゆる目的で本明細書に援用される。
種々の具体的な実施形態が例示され、説明されたが、上記の明細書は制限的ではない。本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解されよう。本明細書を査読すれば、当業者には多くの変形形態が明らかとなろう。

Claims (204)

  1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記ＡＡＶが、前記ＥＶの内腔中にあり、前記ＥＶ中の前記ＡＡＶが、前記ＡＡＶ単独と比較して改変された特性を有する、前記細胞外小胞（ＥＶ）。
  2. 前記改変された特性が、ＡＡＶ単独よりも良好な治療効果を含む、請求項１に記載のＥＶ。
  3. 前記より良好な治療効果が、より高い感染力、より高い活性、より大きな効力、より速い形質導入速度、及び免疫浸潤に対する寛容性のうちの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載のＥＶ。
  4. 前記ＡＡＶの前記改変された特性が、前記ＡＡＶが２回以上の投薬により対象に投与されることを可能にし、前記ＡＡＶの前記感染力及び／または前記活性が、後続の投薬において保持される、請求項１～３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  5. ＡＡＶを含むＥＶであって、前記ＥＶが、足場タンパク質と、少なくとも５個のＡＡＶとを含み、前記少なくとも５個のＡＡＶが、前記ＥＶの内腔中にある、前記ＥＶ。
  6. 前記ＥＶの前記内腔中に少なくとも６個のＡＡＶ、少なくとも７個のＡＡＶ、少なくとも８個のＡＡＶ、少なくとも９個のＡＡＶ、少なくとも１０個のＡＡＶ、少なくとも１１個のＡＡＶ、少なくとも１２個のＡＡＶ、少なくとも１３個のＡＡＶ、少なくとも１４個のＡＡＶ、少なくとも１５個のＡＡＶ、少なくとも１６個のＡＡＶ、少なくとも１７個のＡＡＶ、少なくとも１８個のＡＡＶ、少なくとも１９個のＡＡＶ、少なくとも２０個のＡＡＶ、少なくとも２０１個のＡＡＶ、少なくとも２２個のＡＡＶ、少なくとも２３個のＡＡＶ、少なくとも２４個のＡＡＶ、少なくとも２５個のＡＡＶ、少なくとも２６個のＡＡＶ、少なくとも２７個のＡＡＶ、少なくとも２８個のＡＡＶ、少なくとも２９個のＡＡＶ、少なくとも３０個のＡＡＶ、少なくとも３５個のＡＡＶ、少なくとも４０個のＡＡＶ、少なくとも４５個のＡＡＶ、少なくとも５０個のＡＡＶ、少なくとも６０個のＡＡＶ、少なくとも７０個のＡＡＶ、少なくとも８０個のＡＡＶ、少なくとも９０個のＡＡＶ、または少なくとも１００個のＡＡＶを含む、請求項５に記載のＥＶ。
  7. 前記ＥＶの前記内腔中に少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約７５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１５個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約１０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１００個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約７５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約５０個のＡＡＶ、少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約４５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約４０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約３０個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２５個のＡＡＶ、少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶ、または少なくとも約１０個のＡＡＶ～少なくとも約１５個のＡＡＶを含む、請求項５に記載のＥＶ。
  8. 少なくとも約５個のＡＡＶ～少なくとも約２０個のＡＡＶを含む、請求項５～７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  9. 前記ＥＶが、内腔表面及び外部表面を含む脂質二重膜を含み、前記ＡＡＶのうちの少なくとも１個が、前記ＥＶの前記内腔表面には連結されていない、請求項１～８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  10. 前記ＥＶが、内腔表面及び外部表面を含む脂質二重膜を含み、前記ＡＡＶのうちの少なくとも１個が、前記ＥＶの前記内腔表面に連結されている、請求項１～８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  11. 前記少なくとも１個のＡＡＶが、共有結合または非共有結合によって前記ＥＶの前記内腔表面に連結されている、請求項１０に記載のＥＶ。
  12. 前記少なくとも１個のＡＡＶが、共有結合及び非共有結合の両方によって前記ＥＶの前記内腔表面に連結されている、請求項１０または１１に記載のＥＶ。
  13. 前記ＡＡＶが、前記足場タンパク質に連結されている、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  14. 前記足場タンパク質が、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤ及び／または前記ＥＤが、前記ＥＶの前記内腔表面に会合している、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  15. 前記ＮＤが、ミリストイル化を介して前記ＥＶの前記内腔表面に会合している、請求項１４に記載のＥＶ。
  16. 前記ＥＤが、イオン性相互作用によって前記ＥＶの前記内腔表面に会合している、請求項１４または１５に記載のＥＶ。
  17. 前記ＥＤが、（ｉ）ある塩基性アミノ酸、または（ｉｉ）連続的に２つ以上の塩基性アミノ酸を含み、前記塩基性アミノ酸が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  18. 前記塩基性アミノ酸が、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎが、１～１０の整数である、請求項１７に記載のＥＶ。
  19. 前記ＥＤが、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  20. 前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇが、Ｇｌｙを表し、「：」が、ペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６の各々が独立して、アミノ酸であり、前記Ｘ６が、塩基性アミノ酸を含む、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  21. ｉ．前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
    ｉｉ．前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるか、
    ｉｉｉ．前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
    ｉｖ．前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるか、または
    ｖ．（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、
    請求項２０に記載のＥＶ。
  22. 前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６の前記アミノ酸配列を含み、ここで、
    ｉ．Ｇが、Ｇｌｙを表し、
    ｉｉ．「：」が、ペプチド結合を表し、
    ｉｉｉ．前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    ｉｖ．前記Ｘ３が、アミノ酸であり、
    ｖ．前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    ｖｉ．前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    ｖｉｉ．前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である、
    請求項１４～２１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  23. 前記Ｘ３が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される、請求項１８～２２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  24. 前記ＮＤ及び前記ＥＤが、リンカーによって結合している、請求項１４～２３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  25. 前記リンカーが、ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む、請求項２４に記載のＥＶ。
  26. 前記ＮＤが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号２１）、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４～２５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  27. 前記ＮＤが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号３０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号３１）、及び（ｘｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のＥＶ。
  28. 前記ＮＤが、前記アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む、請求項１４～２７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  29. 前記足場タンパク質が、長さが少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸である、請求項１～２８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  30. 前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３２）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３３）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３５）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３６）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４１）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４２）を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  31. 前記足場タンパク質が、前記Ｎ末端にＭｅｔを含まない、請求項１４～３０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  32. 前記足場タンパク質が、前記足場タンパク質の前記Ｎ末端にミリストイル化アミノ酸残基を含む、請求項１４～３１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  33. 前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、Ｇｌｙである、請求項３２に記載のＥＶ。
  34. 前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、合成である、請求項３２または３３に記載のＥＶ。
  35. 前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、グリシン類似体である、請求項３３または３４に記載のＥＶ。
  36. 前記足場タンパク質が、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  37. 前記ＥＶが、第２の足場タンパク質をさらに含み、前記第２の足場タンパク質が、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４～３６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  38. 前記ＡＡＶが、前記足場タンパク質及び／または前記第２の足場タンパク質に融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  39. 前記少なくとも１つのカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される、請求項３８に記載のＥＶ。
  40. ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ２を含む、請求項３８または３９に記載のＥＶ。
  41. 前記ＡＡＶが、前記足場タンパク質及び／または前記第２の足場タンパク質に融合されていない少なくとも１個のＶＰ２を含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  42. 前記足場タンパク質が、前記ＶＰ２の前記Ｎ末端に融合されている、請求項３８～４１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  43. 前記足場タンパク質に融合された前記ＶＰ２の数が、前記足場タンパク質に融合されていない前記少なくとも１個のＶＰ２の数よりも少ない、請求項４１または４２に記載のＥＶ。
  44. 前記足場タンパク質に融合された前記ＶＰ２の数が、前記足場タンパク質に融合されていない前記少なくとも１個のＶＰ２の数よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４６倍、約５０倍、または約１００倍少ない、請求項４１または４２に記載のＥＶ。
  45. 前記足場タンパク質が、Ｉ型膜貫通タンパク質またはＩＩ型膜貫通タンパク質である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  46. 前記Ｉ型膜貫通タンパク質が、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４５に記載のＥＶ。
  47. 前記Ｉ型膜貫通タンパク質のＣ末端または前記ＩＩ型膜貫通タンパク質のＮ末端が、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている、請求項４５または４６に記載のＥＶ。
  48. 前記足場タンパク質が、化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている、請求項１４～３７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  49. 前記化学誘導二量体の前記結合パートナーが、（ｉ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ＦＫ１０１２）、（ｉｉ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）（ＦＫ５０６）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ及びＣｙＰ－Ｆａｓ（ＦＫＣｓＡ）、（ｉｖ）ＦＫＢＰ及びＦＲＢ（ラパマイシン）、（ｖ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）、（ｖｉ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）、（ｖｉｉ）スナップタグ及びＨａｌｏＴａｇ（ＨａＸＳ）、（ｖｉｉｉ）ｅＤＨＦＲ及びＨａｌｏＴａｇ（ＴＭＰ－ＨＴａｇ）、ならびに（ｉｘ）ＢＣＬ－ｘＬ及びＦａｂ（ＡＺ１）（ＡＢＴ－７３７）からなる群から選択される結合パートナーのうちの１つを含む、請求項４７または４８に記載のＥＶ。
  50. 前記化学誘導二量体が、ＦＲＢ－ＦＫＢＰ融合複合体を含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  51. 前記ＦＲＢが、ｍＴＯＲの前記ＦＲＢである、請求項５０に記載のＥＶ。
  52. 前記ＡＡＶが、前記化学誘導二量体の前記結合パートナーのうちの１つに融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含み、それによって前記結合パートナーが化学化合物に接触するときに二量体複合体を形成する、請求項４７～５１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  53. 前記少なくとも１つのカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される、請求項５２に記載のＥＶ。
  54. ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ２を含む、請求項５２または５３に記載のＥＶ。
  55. 前記ＡＡＶが、前記化学誘導二量体の結合パートナーに融合されていない少なくとも１個のＶＰ２を含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載のＥＶ。
  56. 前記化学誘導二量体の結合パートナーに融合された前記ＶＰ２の数が、前記化学誘導二量体の結合パートナーに融合されていない前記少なくとも１個のＶＰよりも少ない、請求項５５に記載のＥＶ。
  57. 前記化学誘導二量体の前記結合パートナーに連結された前記ＶＰ２の数が、前記結合パートナーに融合されていない前記少なくとも１個のＶＰ２の数よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４６倍、約５０倍、または約１００倍少ない、請求項５６に記載のＥＶ。
  58. 前記化学誘導二量体の前記結合パートナーが、ＡＡＶカプシドタンパク質の内部ループ内に挿入される、請求項５２または５３に記載のＥＶ。
  59. 前記内部ループが、配列ＧＴＴＴＱＳＲ（配列番号４３）を含む、請求項５８に記載のＥＶ。
  60. 前記内部ループが、配列番号４４のアミノ酸残基４５３～４５９を含む、請求項５８に記載のＥＶ。
  61. 前記内部ループの少なくとも１つのアミノ酸が、前記化学誘導二量体の結合パートナーで置き換えられる、請求項５９または６０に記載のＥＶ。
  62. 前記足場タンパク質が、リンカーによって化学誘導二量体の結合パートナーに連結されている、請求項３０～４６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  63. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、リンカーによって前記化学誘導二量体の前記結合パートナーに連結されている、請求項３８～４４または５２～６２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  64. 前記リンカーが、共有結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む、請求項６２または６３に記載のＥＶ。
  65. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項６２～６４のいずれか１項に記載のＥＶ。
  66. 前記足場タンパク質が、前記ＡＡＶに特異的に結合する親和性物質に連結されている、請求項１～３７及び４５～４７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  67. 前記親和性物質が、ＡＡＶ受容体、ナノボディ、ラクダ抗体、ＩｇＮＡＲ、単一ドメイン抗体、それらの抗体もしくは抗原結合部分、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６６に記載のＥＶ。
  68. 前記それらの抗原結合部分が、一本鎖Ｆａｂを含む、請求項６７に記載のＥＶ。
  69. 前記親和性物質が、１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質に結合する、請求項６６～６８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  70. 前記１つまたは複数のＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質である、請求項６９に記載のＥＶ。
  71. 前記親和性物質が、ＡＡＶカプシドタンパク質単量体には結合しない、請求項７０に記載のＥＶ。
  72. 前記ＡＡＶが、目的とする遺伝子をコードする異種配列を含む遺伝子カセットをさらに含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  73. 前記遺伝子カセットが、分泌タンパク質、受容体、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、感覚タンパク質、制御タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、防御タンパク質、モータータンパク質、凝固因子、増殖因子、抗酸化物質、サイトカイン、ケモカイン、酵素、腫瘍抑制因子遺伝子、ＤＮＡ修復タンパク質、構造タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、アルファグルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項７２に記載のＥＶ。
  74. 前記遺伝子カセットが、第ＶＩＩＩ因子タンパク質または第ＩＸ因子タンパク質をコードする、請求項７２または７３に記載のＥＶ。
  75. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、野生型第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項７４に記載のＥＶ。
  76. 前記目的とする遺伝子が、Ｒａｂタンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ成分Ａ １（ＲＥＰ１）をコードする、請求項７２または７３に記載のＥＶ。
  77. 前記ＲＥＰ１が、配列番号４５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載のＥＶ。
  78. 前記ＡＡＶが、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３Ａ型ＡＡＶ、３Ｂ型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～７７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  79. 請求項１～７８のいずれか１項に記載のＥＶ中のＡＡＶ。
  80. Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含む足場タンパク質に連結されたＶＰ２を含む、ＡＡＶであって、ここで、Ｇが、Ｇｌｙを表し、「：」が、ペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６の各々が独立して、アミノ酸であり、前記Ｘ６が、塩基性アミノ酸を含む、前記ＡＡＶ。
  81. 前記足場タンパク質が、請求項１４～３７のいずれか１項に記載の足場タンパク質または第２の足場タンパク質である、請求項８０に記載のＡＡＶ。
  82. 化学誘導二量体の結合パートナーに連結されたＶＰ２を含むＡＡＶ。
  83. 前記化学誘導二量体の前記結合パートナーが、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の結合パートナーのうちのいずれか１つを含む、請求項８２に記載のＡＡＶ。
  84. 親和性物質に特異的に結合した１つまたは複数のカプシドタンパク質を含むＡＡＶ。
  85. 前記親和性物質が、請求項６７～７１のいずれか１項に記載のものである、請求項８４に記載のＡＡＶ。
  86. （ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、（ｉｉ）足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記ＡＡＶが、前記ＥＶの外部表面上の前記足場タンパク質に会合している、前記細胞外小胞（ＥＶ）。
  87. 前記足場タンパク質が、細胞外ドメインを含み、前記ＡＡＶが、前記足場タンパク質の前記細胞外ドメインに会合している、請求項８６に記載のＥＶ。
  88. 前記足場タンパク質が、膜貫通領域をさらに含み、前記膜貫通領域が、前記ＥＶの前記膜に係留されている、請求項８６または８７に記載のＥＶ。
  89. 前記足場タンパク質が、細胞内ドメインをさらに含む、請求項８６～８８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  90. 前記足場タンパク質が、異種ポリペプチドを含み、前記異種ポリペプチドが、前記足場タンパク質の細胞外ドメインに融合されており、前記異種ポリペプチドが、前記ＡＡＶと会合する、請求項８６～８９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  91. 前記足場タンパク質が、Ｉ型膜貫通タンパク質またはＩＩ型膜貫通タンパク質である、請求項８６～９０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  92. 前記異種ポリペプチドが、前記足場タンパク質の前記細胞外ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合されている、請求項９０または９１に記載のＥＶ。
  93. 前記異種ポリペプチドが、受容体、リガンド、抗原結合部分、基質、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含み、前記異種ポリペプチドが、前記ＡＡＶの表面上の１つまたは複数のタンパク質と特異的に相互作用する、請求項９０～９２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  94. 前記異種ポリペプチドが、抗体の抗原結合断片、ラクダ抗体またはその抗原結合断片、一本鎖ＦＡＢ、ナノボディ、サメＩｇＮＡＲ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原結合部分を含む、請求項９３に記載のＥＶ。
  95. 前記抗原結合部分が、ナノボディを含む、請求項９３または９４に記載のＥＶ。
  96. 前記抗原結合部分が、前記ＡＡＶの前記表面上の前記１つまたは複数のタンパク質に特異的に結合する、請求項９３～９５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  97. 前記ＡＡＶの前記表面上の前記１つまたは複数のタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるカプシドタンパク質を含む、請求項９３～９６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  98. 前記ＡＡＶの前記表面上の前記１つまたは複数のタンパク質が、前記ＡＡＶのカプシドタンパク質に融合された非ＡＡＶ配列である、請求項９３～９７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  99. 前記カプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項９８に記載のＥＶ。
  100. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ２に融合されている、請求項９９に記載のＥＶ。
  101. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ２の前記Ｎ末端に融合されている、請求項９９または１００に記載のＥＶ。
  102. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ２の内部表面に露出したループに融合されている、請求項９９または１０１に記載のＥＶ。
  103. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ３に融合されている、請求項９９に記載のＥＶ。
  104. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ３の前記Ｎ末端に融合されている、請求項９９または１０３に記載のＥＶ。
  105. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ３の内部表面に露出したループに融合されている、請求項９９または１０３に記載のＥＶ。
  106. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ１に融合されている、請求項９９に記載のＥＶ。
  107. 前記非ＡＡＶ配列が、ＶＰ１の内部表面に露出したループに融合されている、請求項１０６に記載のＥＶ。
  108. （ｉ）前記足場タンパク質が、Ｆｃ受容体を含む異種ポリペプチドに融合されており、
    （ｉｉ）前記ＡＡＶが、免疫グロブリン定常領域のＦｃ領域（Ｆｃ）に融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む、
    請求項８６～９３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  109. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲ１）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＩＩＢ、ＦｃγＩＩＩＡ、及びＦｃγＩＩＩＢから選択されるＦｃガンマ受容体であり、前記Ｆｃが、ＩｇＧのＦｃである、請求項１０８に記載のＥＶ。
  110. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲ１であり、前記Ｆｃが、ＩｇＧのＦｃである、請求項１０８または１０９に記載のＥＶ。
  111. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃアルファ受容体Ｉ（ＦｃαＲ１）であり、前記Ｆｃが、ＩｇＡのＦｃである、請求項１０８に記載のＥＶ。
  112. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃイプシロン受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）及びＦｃεＲＩＩから選択されるＦｃイプシロン受容体であり、前記Ｆｃが、ＩｇＥのＦｃである、請求項１０８に記載のＥＶ。
  113. （ｉ）前記足場タンパク質が、ナノボディを含む異種ポリペプチドに融合されており、
    （ｉｉ）前記ＡＡＶが、免疫グロブリン定常領域のＦｃ領域（Ｆｃ）に融合された少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む、
    請求項８６～９３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  114. 前記ナノボディが、前記カプシドタンパク質に融合された前記Ｆｃに特異的に結合する、請求項１１３に記載のＥＶ。
  115. 前記少なくとも１つのカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される、請求項１０８～１１４のいずれか１項に記載のＥＶ。
  116. 前記ＡＡＶが、Ｆｃに融合された少なくとも１個のＶＰ２を含む、請求項１０８～１１５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  117. 前記ＡＡＶが、Ｆｃに融合されていない少なくとも１個のＶＰ２を含む、請求項１１６に記載のＥＶ。
  118. 前記Ｆｃが、前記少なくとも１個のＶＰ２の前記Ｎ末端に融合されている、請求項１０８～１１７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  119. 前記Ｆｃが、前記少なくとも１個のＶＰ２の内部表面に露出したループに融合されている、請求項１０８～１１７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  120. 前記ＡＡＶが、Ｆｃに融合された少なくとも１個のＶＰ３を含む、請求項１０８～１１９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  121. 前記ＡＡＶが、前記Ｆｃに融合されていない少なくとも１個のＶＰ３を含む、請求項１２０に記載のＥＶ。
  122. 前記Ｆｃが、前記少なくとも１個のＶＰ３の前記Ｎ末端に融合されている、請求項１０８～１２１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  123. 前記Ｆｃが、前記少なくとも１個のＶＰ３の内部表面に露出したループに融合されている、請求項１０８～１２１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  124. 前記ＡＡＶが、Ｆｃに融合された少なくとも１個のＶＰ１を含む、請求項１０８～１２３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  125. 前記ＡＡＶが、Ｆｃに融合されていない少なくとも１個のＶＰ１を含む、請求項１０８～１２３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  126. 前記Ｆｃが、ＶＰ１の表面に露出したループに融合されている、請求項１２４に記載のＥＶ。
  127. 前記表面に露出したループが、配列ＧＴＴＴＱＳＲ（配列番号４３）を含む、請求項１０２、１０５、１０７、１１９、１２３、及び１２６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  128. 前記表面に露出したループが、ＶＰ１のアミノ酸残基４５３～４５９を含む、請求項１０２、１０５、１０７、１１９、１２３、及び１２６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  129. 前記表面に露出したループの前記少なくとも１つのアミノ酸が、前記Ｆｃで置き換えられる、請求項１０２、１０５、１０７、１１９、１２３、及び１２６～１２８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  130. 前記表面に露出したループが、前記Ｆｃで置き換えられる、請求項１０２、１０５、１０７、１１９、１２３、及び１２６～１２９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  131. 前記足場タンパク質が、抗原結合部分に融合されており、前記抗原結合部分が、ＡＡＶの前記表面上の抗原に特異的に結合する、請求項８６～９６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  132. 前記足場タンパク質が、ＡＡＶ受容体を含む異種ポリペプチドに融合されている、請求項８６～９３のいずれか１項に記載のＥＶ。
  133. 前記ＡＡＶが、目的とする遺伝子を含むヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８６～１３２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  134. 前記目的とする遺伝子が、分泌タンパク質、受容体、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、感覚タンパク質、制御タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、防御タンパク質、モータータンパク質、凝固因子、増殖因子、抗酸化物質、サイトカイン、ケモカイン、酵素、腫瘍抑制因子遺伝子、ＤＮＡ修復タンパク質、構造タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、アルファグルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１３３に記載のＥＶ。
  135. 前記目的とする遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子タンパク質または第ＩＸ因子タンパク質をコードする、請求項１３３または１３４に記載のＥＶ。
  136. 前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、野生型第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３５に記載のＥＶ。
  137. 前記目的とする遺伝子が、Ｒａｂタンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ成分Ａ １（ＲＥＰ１）をコードする、請求項１３３または１３４に記載のＥＶ。
  138. 前記ＲＥＰ１が、配列番号４５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１３７に記載のＥＶ。
  139. 前記ＡＡＶが、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３Ａ型ＡＡＶ、３Ｂ型ＡＡＶ、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、１２型ＡＡＶ、１３型ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８６～１３８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  140. 前記足場タンパク質が、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８６～１３９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  141. 前記足場タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮである、請求項８６～１４０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  142. 前記足場タンパク質が、Ｎ末端ドメイン、エフェクタードメイン、及び膜貫通ドメインを含み、前記ＮＤが、ミリストイル化されており、前記Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及び／または前記エフェクタードメイン（ＥＤ）が、前記ＥＶの内腔表面に会合している、請求項８７に記載のＥＶ。
  143. 前記ＥＤが、イオン性相互作用によって前記ＥＶの前記内腔表面に会合している、請求項１４２に記載のＥＶ。
  144. 前記ＥＤが、（ｉ）ある塩基性アミノ酸、または（ｉｉ）配列内で互いに隣り合った２つ以上の塩基性アミノ酸を含み、前記塩基性アミノ酸が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４２または１４３に記載のＥＶ。
  145. 前記塩基性アミノ酸が、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎが、１～１０の整数である、請求項１４４に記載のＥＶ。
  146. 前記ＥＤが、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４２～１４５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  147. 前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇが、Ｇｌｙを表し、「：」が、ペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６の各々が、アミノ酸であり、前記Ｘ６が、塩基性アミノ酸を含む、請求項１４２～１４６のいずれか１項に記載のＥＶ。
  148. （ｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるか、
    （ｉｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
    （ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
    （ｉｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるか、または
    （ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、
    請求項１４７に記載のＥＶ。
  149. 前記足場タンパク質の前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６の前記アミノ酸配列を含み、ここで、
    （ｉ）Ｇが、Ｇｌｙを表し、
    （ｉｉ）「：」が、ペプチド結合を表し、
    （ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    （ｉｖ）前記Ｘ３が、アミノ酸であり、
    （ｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    （ｖｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    （ｖｉｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である、
    請求項１４２～１４８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  150. 前記Ｘ３が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される、請求項１４７～１４９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  151. 前記ＮＤ及び前記ＥＤが、リンカーによって結合している、請求項１４２～１５０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  152. 前記リンカーが、ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む、請求項１５１に記載のＥＶ。
  153. 前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号２１）、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４２～１５２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  154. 前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号３０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号３１）、及び（ｘｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５３に記載のＥＶ。
  155. 前記足場タンパク質及び／または第２の足場タンパク質のＣ末端が、前記ＡＡＶのカプシドタンパク質に連結されている、請求項１４２～１５４のいずれか１項に記載のＥＶ。
  156. エキソソームである、請求項１～７８及び８６～１５５のいずれか１項に記載のＥＶ。
  157. カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記カプシドが、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる群から選択される少なくとも１つのカプシドタンパク質を含み、前記少なくとも１つのカプシドタンパク質が、足場タンパク質に連結されている、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  158. 前記足場タンパク質が、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）、ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５７に記載のＡＡＶ。
  159. 前記足場タンパク質が、Ｎ末端ドメイン、エフェクタードメイン、及び膜貫通ドメインを含み、前記ＮＤが、ミリストイル化されており、前記Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及び／または前記エフェクタードメイン（ＥＤ）が、前記ＥＶの内腔表面に会合している、請求項１５７に記載のＡＡＶ。
  160. 前記ＥＤが、イオン性相互作用によって前記ＥＶの前記内腔表面に会合している、請求項１５９に記載のＡＡＶ。
  161. 前記ＥＤが、（ｉ）ある塩基性アミノ酸、または（ｉｉ）配列内で互いに隣り合った２つ以上の塩基性アミノ酸を含み、前記塩基性アミノ酸が、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５９または１６０に記載のＡＡＶ。
  162. 前記塩基性アミノ酸が、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎが、１～１０の整数である、請求項１６１に記載のＡＡＶ。
  163. 前記ＥＤが、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１５９～１６２のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  164. 前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇが、Ｇｌｙを表し、「：」が、ペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６の各々が、アミノ酸であり、前記Ｘ６が、塩基性アミノ酸を含む、請求項１５９～１６３のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  165. （ｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、及びＨｉｓからなる群から選択されるか、
    （ｉｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
    （ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
    （ｉｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるか、または
    （ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、
    請求項１６４に記載のＡＡＶ。
  166. 前記足場タンパク質の前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６の前記アミノ酸配列を含み、ここで、
    （ｉ）Ｇが、Ｇｌｙを表し、
    （ｉｉ）「：」が、ペプチド結合を表し、
    （ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    （ｉｖ）前記Ｘ３が、アミノ酸であり、
    （ｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    （ｖｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    （ｖｉｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である、
    請求項１６０～１６５のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  167. 前記Ｘ３が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される、請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  168. 前記ＮＤ及び前記ＥＤが、リンカーによって結合している、請求項１５９～１６７のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  169. 前記リンカーが、ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む、請求項１６８に記載のＡＡＶ。
  170. 前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号２１）、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５７～１６９のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  171. 前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号３０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号３１）、及び（ｘｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７０に記載のＡＡＶ。
  172. 細胞外小胞（ＥＶ）の外部表面に会合している、請求項１５７～１７１のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  173. ＥＶの外部表面に会合しており、前記足場タンパク質または第２の足場タンパク質が、前記ＥＶに連結されている、請求項１５７～１７２のいずれか１項に記載のＡＡＶ。
  174. 前記足場タンパク質が、切断可能なリンカーによって、前記ＡＡＶに特異的に結合する親和性物質に連結されている、請求項６６に記載のＥＶ。
  175. 請求項１～７８、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項７９～８５及び１５７～１７３のいずれか１項に記載のＡＡＶと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  176. 請求項１～７８、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載の単離されたＥＶ、または請求項７９～８５及び１５７～１７３のいずれか１項に記載のＡＡＶを産生する、細胞。
  177. 請求項１～７８、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載の足場タンパク質に連結されたＡＡＶタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、細胞。
  178. 請求項７２～７７及び１３３～１５６のいずれか１項に記載の目的とする遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８８に記載の細胞。
  179. 請求項４７～６７のいずれか１項に記載の化学誘導二量体の結合パートナーに連結されたＡＡＶタンパク質をコードする第１のヌクレオチドを含む、細胞。
  180. 請求項９０に記載の化学誘導二量体の対応する結合パートナーをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、前記化学誘導二量体の前記対応する結合パートナーが、請求項１～４７のいずれか１項に記載の足場タンパク質に連結されている、請求項１７９に記載の細胞。
  181. 請求項７２～７７のいずれか１項に記載の目的とする遺伝子を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８０に記載の細胞。
  182. 請求項１～４７のいずれか１項に記載の足場タンパク質に連結された請求項６６～７１のいずれか１項に記載の親和性物質をコードする第１のヌクレオチドを含む、細胞。
  183. 請求項７２～７７のいずれか１項に記載の目的とする遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８２に記載の細胞。
  184. （ｉ）請求項１～７９、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載の単離されたＥＶ、または請求項７９～８５及び１５７～１７３のいずれか１項に記載のＡＡＶと、（ｉｉ）使用説明書とを含む、キット。
  185. ＥＶを作製する方法であって、請求項１７９～１８３のいずれか１項に記載の細胞を好適な条件下で培養することと、前記ＥＶを得ることとを含む、前記方法。
  186. 疾患の予防または処置を必要とする対象において前記疾患を予防または処置する方法であって、請求項１～７８、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項７９～８５もしくは１５７～１７３のいずれか１項に記載のＡＡＶ、または請求項１７６に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  187. 前記疾患が、がん、血友病、糖尿病、増殖因子欠損症、眼疾患、ポンペ病、リソソーム蓄積症、ムコビシドーシス、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、トランスチレチンアミロイドーシス、血友病Ａ、血友病Ｂ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、レーバー先天黒内障、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、ＯＴＣ欠損症、グリコーゲン蓄積症１Ａ、クリグラー・ナジャー症候群、原発性高シュウ酸尿症１型、急性間欠性ポルフィリン症、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、ムコ多糖症ＶＩ型、α１アンチトリプシン欠損症、ならびに高コレステロール血症から選択される、請求項１８６に記載の方法。
  188. ＡＡＶを対象に送達する方法であって、請求項１～７８、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載のＥＶを前記対象に投与することを含む、前記方法。
  189. 前記ＥＶが、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内投与される、請求項１８６～１８８のいずれか１項に記載の方法。
  190. 前記ＥＶ投与が、眼内投与である、請求項１８６～１８８のいずれか１項に記載の方法。
  191. 前記眼内投与が、硝子体内投与、前房内投与、結膜下投与、網膜下投与、強膜下投与、脈絡膜内投与、及びそれらの任意の組み合わせである、請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記眼内投与が、前記ＥＶの注射を含む、請求項１９０または１９１に記載の方法。
  193. 前記眼内投与が、硝子体内注射である、請求項１９０～１９２のいずれか１項に記載の方法。
  194. 前記眼内投与が、前記組成物を含む送達デバイスの埋め込みを含む、請求項１９０～１９３のいずれか１項に記載の方法。
  195. 前記送達デバイスが、眼内送達デバイスである、請求項１９４に記載の方法。
  196. 前記眼内送達デバイスが、硝子体内インプラントまたは強膜プラグである、請求項１９５に記載の方法。
  197. 前記送達デバイスが、徐放性送達デバイスである、請求項１９４～１９６のいずれか１項に記載の方法。
  198. 前記送達デバイスが、生分解性である、請求項１９４～１９７のいずれか１項に記載の方法。
  199. 前記ＥＶの前記眼内投与が、黄斑変性症、白内障、糖尿病性網膜症、緑内障、弱視、斜視、網膜症、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患を処置するためのものである、請求項１９０～１９８のいずれか１項に記載の方法。
  200. 追加の治療剤を投与することを含む、請求項１８６～１９９のいずれか１項に記載の方法。
  201. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と、足場タンパク質とを含む、細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記ＡＡＶが、エキソソームに会合しており、前記ＡＡＶが、前記ＡＡＶ単独と比較して改変された特性を有する、前記細胞外小胞（ＥＶ）。
  202. 前記ＡＡＶが、前記ＥＶの内腔表面に会合している、請求項２０１に記載のＥＶ。
  203. 前記ＡＡＶが、前記ＥＶの外表面に会合している、請求項２０１に記載のＥＶ。
  204. 前記ＥＶが、請求項１～７８、８６～１５６、及び１７４のいずれか１項に記載のＥＶである、請求項２０１～２０３のいずれか１項に記載のＥＶ。
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