KR20110015551A

KR20110015551A - 제ｉｘ인자의 부위-지정 변형

Info

Publication number: KR20110015551A
Application number: KR1020107025563A
Authority: KR
Inventors: 알란 알. 브룩스; 존 이. 머피; 마리안 세토; 샤오캬오 지앙; 데이비드 키유리치; 찬드라 파텔
Original assignee: 바이엘 헬스케어 엘엘씨
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-15
Publication date: 2011-02-16
Also published as: CN102065887A; WO2009140015A2; CA2721362A1; EP2282767A2; JP2011517950A; WO2009140015A3; EP2282767A4

Abstract

본 발명은 변형된 제IX인자 폴리펩티드 예컨대 하나 이상의 시스테인 부위가 도입된 제IX인자 폴리펩티드에 관한 것이다. 변형된 제IX인자 폴리펩티드는 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 또한 본 발명은 변형된 제IX인자 폴리펩티드의 제조 방법, 및 변형된 제IX인자 폴리펩티드의 사용 방법, 예를 들어, B형 혈우병에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

제ＩＸ인자의 부위-지정 변형{SITE-DIRECTED MODIFICATION OF FACTOR IX}

본 출원은 미국 가출원 일련 번호 61/124,568 (2008년 4월 16일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이의 내용은 전문이 거명에 의해 본원에 포함된다.

기술 분야

배경기술

B형 혈우병은 34,500명의 남성 중 1명에서 초래되고, 혈액 내의 낮은 또는 검출불가능한 제IX 응고 인자 (FIX) 단백질을 초래하는 FIX를 코딩하는 유전자에서의 다양한 유전적 결함에 의해 야기된다 ([Kurachi, et al., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6:991-997, 1992]; [Lillicrap, Haemophilia 4:350-357, 1998]). 불충분한 수준의 FIX는 결함이 있는 응고, 및 제어되지 않은 출혈로부터 초래되는 증상에 이른다. B형 혈우병은 이미 시작된 출혈을 정지시키거나 출혈이 발생하는 것을 방지 (예방)하기 위한 혈장-유래 또는 재조합 FIX 단백질의 정맥내 주입에 의해 효과적으로 치료된다 ([Dargaud, et al., Expert Opin. Biol. Ther. 7:651-663]; [Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 효과적인 예방은 정상 수준의 약 1％인 최소 저점 수준의 FIX를 유지하는 것을 필요로 한다 ([Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 천연 FIX (혈장-유래 또는 재조합)의 약 18시간 내지 24시간의 반감기로 인해, FIX 수준이 볼루스(bolus) 주사 후 3일 내지 4일 이내에 정상 수준의 1％ 미만으로 떨어지고, 이는 효과적인 예방을 달성하기 위해 평균적으로 3일마다 주사를 반복하는 것을 필요로 한다 ([Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 이같은 빈번한 정맥내 주사는 환자에게 문제가 되고, 효과적인 예방 달성에 대한 장애물이며 ([Petrini, Haemophilia 13 Suppl 2:16-22, 2007]), 특히 어린이에서 그러하다. 반감기가 더 긴 FIX 단백질은 덜 빈번한 투여를 가능하게 할 것이고, 따라서 상당한 의학적 이점이 있을 것이다.

발명의 개요

본 출원의 한 양상은 하나 이상의 중합체 접합 부위, 예를 들어, 유리 시스테인 잔기를 도입함으로써 변형된 아미노산 서열을 포함하는 FIX 폴리펩티드 (변형된 FIX 폴리펩티드 또는 FIX 변이체로 또한 지칭됨)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 R338A 및 V86A로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이, 및 T148C, V153C, T163C, L165C, N167C, T169C, T172C, F175C, K201C, K247C, K413C, L414C 및 T415C로부터 선택된 1개 이상의 시스테인 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 R338A 및 V86A로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이, 및 T148C, V153C, T163C, L165C, T172C, F175C, K247C, L414C 및 T415C로부터 선택된 1개 이상의 시스테인 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 T169C, K201C, K247C 또는 L414C 치환, 또는 R338A, V86A 또는 R338A과 V86A 양쪽 모두와 조합된 T169C, K201C, K247C 또는 L414C 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 160-164 사이에 도입된 1개 이상의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 160-164 사이에 도입된 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 잔기 A161과 E162 사이에 삽입된 단일 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드 R338A, V86A, 또는 R338A와 V86A 양쪽 모두와 조합된 잔기 A161과 E162 사이에 삽입된 단일 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 160-161 사이에 삽입된 1개 이상의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 161-162 사이에 삽입된 1개 이상의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 162-163 사이에 삽입된 1개 이상의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 163-164 사이에 삽입된 1개 이상의 시스테인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 본원에 기술된 돌연변이들의 조합을 포함한다.

일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 응고 활성을 지닌다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 R338A 및 V86A로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 돌연변이 양쪽 모두를 포함한다.

본 출원의 또다른 양상은 치환된 또는 도입된 시스테인 잔기를 통해 생체적합성 중합체에 접합된, 1개 이상의 시스테인이 치환된 또는 도입된 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 공칭 평균 분자량이 3,000 돌턴 내지 150,000 돌턴 범위이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 공칭 평균 분자량이 5,000 돌턴 내지 85,000 돌턴 범위이다.

일부 실시양태에서, 1개 이상의 시스테인이 치환된 또는 도입된 변형된 폴리펩티드는 기능적으로 정의된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 도입된 또는 치환된 시스테인이 폴리펩티드의 분비량을 1개 이상의 도입된 또는 치환된 시스테인이 없는 폴리펩티드의 분비량에 비해 70％를 초과하는 만큼 감소시키지 않는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다.

일부 실시양태에서, 1개 이상의 도입된 또는 치환된 시스테인이 폴리펩티드와 제VIII인자 (FVIII), 제XI인자 (FXI) 또는 제X인자 (FX) 중 하나 이상의 상호작용을 1개 이상의 도입된 또는 치환된 시스테인이 없는 폴리펩티드와 FVIII, FXI 또는 FX의 상호작용에 비해 50％를 초과하는 만큼 감소시키지 않는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중합체에 대한 접합 (1개 이상의 도입된 또는 치환된 시스테인을 통한 접합)이 폴리펩티드와 FVIII, FXI 또는 FX 중 하나 이상의 상호작용을 접합되지 않은 폴리펩티드와 FVIII, FXI 또는 FX의 상호작용에 비해 50％를 초과하는 만큼 감소시키지 않는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중합체에 대한 접합이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 접합되지 않은 폴리펩티드에 비해 30％ 이상만큼 증가시키는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 비활성이 폴리펩티드 1 ㎎ 당 100 유닛(unit) 이상인 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다.

본 출원은 R338A 및 V86A 돌연변이를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비활성이 폴리펩티드 1 ㎎ 당 700 유닛 이상이다.

본 출원은 변형된 FIX 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 또한 제공하고, 이때 제제에는 발열원이 없다.

본 출원은 B형 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 본원에 기술된 제약 제제를 투여하는 단계를 포함하는, B형 혈우병을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

본 출원은 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 뿐만 아니라 이러한 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포를 또한 제공한다.

도면의 간단한 설명
도 1은 야생형 FIX 또는 FIX 뮤테인(mutein)으로 형질감염된 HKB11 세포로부터의 상등액 내의 FIX의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 나타낸다. 항-제IX인자-HRP 항체를 사용하여 FIX 단백질을 검출하였다.
도 2는 야생형 FIX 또는 다양한 FIX 뮤테인으로 형질감염된 HKB11 세포로부터의 상등액 내의 FIX 발현 수준, 활성, 및 비활성을 나타낸다. 야생형 발현 및 활성의 백분율을 각각의 개별적인 실험에서 야생형 FIX의 발현 및 활성을 기초로 계산하였고, 이는 3회 또는 4회의 독립적인 형질감염의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 야생형 단백질의 발현 수준은 실험들 간에 0.5 내지 2 ㎍/㎖ 사이에서 변했고, 야생형 FIX의 비활성은 실험에 따라 80 내지 150 IU/㎎ 사이에서 변했다.
도 3은 도 2에 기술된 결과를 표 형태로 나타낸다. * Cat = 촉매 도메인, AP = 활성화 펩티드.
도 4는 8가지 종으로부터의 활성화 펩티드 내의 FIX 서열의 다중 서열 정렬을 나타낸다. 8가지 종으로부터의 성숙형 FIX의 아미노산 서열을 벡터(Vector) NTI (Informax) 내의 다중 정렬 알고리즘을 사용하여 정렬하였다. 활성화 펩티드의 영역만 제시된다. 점선은 정렬을 최대화하기 위해 갭(gap)이 삽입되었음을 가리킨다.
도 5는 방법 I (Q-세파로스(Sepharose)™)에 의해 정제된 L414C-PEG의 젤 분석을 나타낸다. 유출물(flow-through) (FT) 및 용출물 (EL)을 수집하고, 센트리콘(Centricon)®으로 더 작은 부피로 농축하였다. 젤 전기영동 후, 동일한 젤을 쿠마시 블루 (도 5a), 이어서 요오드 (도 5b), 이어서 은 (도 5c)으로 염색하였고, 이때 각각 사이에는 탈염 단계가 있었다.

발명의 상세한 설명

순환 단백질의 반감기를 증가시키는 1가지 접근법은 단백질을 분해 및/또는 소거로부터 보호하는 중합체에 화학적으로 접합시키는 것이다 ([Molineux, Cancer Treat. Rev. 28 Suppl A:13-16, 2002]; [Duncan, et al., Clin. Pharmacokinet. 27:290-306, 1994]; [Werle, et al., Amino Acids 30:351-367, 2006]). 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이고, PEG에의 접합이 인터페론, GCSF 및 FVIII가 포함되는 다수의 단백질의 반감기를 증가시키는데 성공적으로사용되었다.

폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 분자에 공유결합으로 부착시키는 것인 PEG화는 단백질의 생체내 수명을 증가시키는 것으로 실연된 한 방법이다. PEG는 선형 또는 분지형 형태일 수 있어, 상이한 특색의 상이한 분자들이 생산된다. 펩티드 또는 단백질의 반감기를 증가시키는 것에 이외에, PEG화는 치료제에 대한 항체 발달을 감소시키기 위해, 단백질을 프로티에이스 소화로부터 보호하기 위해, 및 신장 여과액에서 제거되는 단백질의 양을 감소시키기 위해 사용되었다 ([Harris, et al., Clin. Pharmacokinet. 40:539-551, 2001]). 또한, PEG화는 단백질의 전반적인 안정성 및 용해도를 증가시킬 수 있다. 마지막으로, PEG화 단백질의 지속적인 혈장 농도는 약물의 피크 수준으로 저점을 감소시켜 초기 시점에 초생리학적(super-physiological) 수준의 단백질을 도입할 필요를 없앰으로써 불리한 부작용의 정도를 감소시킬 수 있다.

단백질의 PEG화는 2가지 일반적인 접근법에 의해 달성될 수 있다. 첫번째 접근법에서, 표면에 노출된 잔기, 특히 라이신 잔기의 1차 아민에 PEG가 무작위로 연결된다. PEG와 같은 대형 중합체로 1차 아민 (N-말단 및 라이신)을 표적화함으로써 FIX를 무작위로 변형시키는 것이 시도되었다 (예를 들어, 미국 공개 번호 2005/172459 참조). 무작위 PEG화의 불리한 점은 생성된 분자가 규정된 구조를 지니지 않고 단백질의 활성이 유의하게 감소될 수 있다는 것이다.

부위 특이적 PEG화로 명명된 두번째 접근법에서, 예를 들어, 특히 GM-CSF ([Doherty, et al., Bioconjug. Chem. 16:1291-1298, 2005]), FVIII (미국 공개 번호 2006/0115876) 및 EPO ([Long, et al., Exp. Hematol. 34:697-704, 2006])에 대해 기술된 바와 같이, 주지된 말레이미드 화학을 사용하여 PEG가 부착될 수 있는 유리 시스테인 잔기 (즉, 디설파이드 결합에 수반되지 않은 시스테인)를 도입함으로써 단백질이 변형된다. 부위-특이적 PEG화는 규정된 구조의 분자를 초래하고, 접합 부위의 신중한 선택에 의해 단백질 활성에 대한 음성 효과를 최소화할 기회를 제공한다. 부위 특이적 중합체 접합이 성공적이도록 하기 위해, 단백질 내로 도입된 신규 시스테인이 중합체에의 연결에 이용가능한 유일한 유리 시스테인이도록 단백질에 천연 발생 유리 시스테인 잔기가 없어야 한다. PCT 공개 WO 2007/135182에 중합체에 대한 접합 목적으로 FIX의 시스테인 치환을 제조하는 일반적인 접근법이 기술되어 있지만, 이러한 부위들 중 어느 것이 이러한 목적을 위해 실제로 사용될 수 있는지를 실연하지는 못했다.

아미노산 서열 및 입수가능한 결정 구조를 기초로, FIX에 어떠한 유리 시스테인 잔기도 없는 것으로 보여서, 신규 유리 시스테인을 생성시키는 돌연변이는 중합체 접합을 위한 단일한 규정된 부위를 생성시킬 것이다. 유리 시스테인을 도입하는 것은 유리 설프히드릴의 반응성으로 인해 단백질 발현에 대해 유해한 효과가 있을 수 있는 것으로 기술되었다. 새로운 시스테인 잔기의 도입은 단백질 상의 표면 노출 위치에 있어야 하고, 단백질의 기능을 파괴하거나 단백질 발현을 약화시키지 않아야 한다. 이러한 이유로, 유리 시스테인을 도입하기 위한 적합한 부위의 확인은 명백하거나 사소하지 않다.

일단 발현되면, 천연 FIX는 약 55,000 돌턴의 단일쇄 당단백질이다. 이는 4개의 구조적 도메인을 지닌다: Gla 또는 감마 카르복시글루타메이트-풍부 도메인; EGF-유사 영역; 활성화 펩티드; 및 활성 부위를 함유하는 촉매 도메인 ([Thomson, Blood 67:565-572, 1986]). FIX는 간에서 아미노산 461개의 단일쇄 폴리펩티드로 합성되고, 골지 및 세포질세망을 통과하는 동안 광범위한 번역후 변형을 겪는다 ([Nemerson, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. 9:45-85, 1980]; [Stenflo, et al., Annu. Rev. Biochem. 46:157-172, 1977]). 신호 서열 및 프로펩티드(propeptide) 양쪽 모두가 제거되어, 서열 1에 도해된 아미노산 415개의 성숙형 단백질이 초래된다 ([Choo, et al., Nature 299:178-180, 1982]; [Kurachi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464, 1982]). 효율적인 감마 카르복실화가 FIX의 응고 활성에 필수적이고, 인간의 경우 12개의 Gla 잔기가 N-말단 Gla 도메인 내에 생성되지만, Gla36 및 Gla40 상에서의 감마 카르복실화는 기능에 요구되지 않는다 ([DiScipio, et al., Biochemistry 18:899-904, 1979]; [Gillis, et al., Protein Sci. 6:185-196, 1997]). 또한, 천연 FIX는 2개의 N-연결 글리코실화 부위 (N157, N167), 6개의 O-연결 글리코실화 부위 (S53, S61, T159, T169, T172, T179), 및 Ser 인산화 (S158), 타이로신 황산화 (Y155) 및 β-히드록실화 (D64)를 위한 각각 1개의 부위를 함유한다 ([McMullen, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 115:8-14, 1983]).

활성화된 제VII인자 (FVII)는 혈관벽에 대한 손상의 결과로서 노출된 조직 인자 (TF)와 복합체를 형성함으로써 정상적인 지혈 프로세스를 개시시킨다. 이어서 복합체가 FIX를 활성화시킨다; 활성 형태는 제IXa인자 (FIXa)로 지칭된다. FIX의 활성화 펩티드가 FXIa 또는 조직 인자 (TF)/FVIIa 복합체에 의해 2개의 부위에서 단백질분해성 절단에 의해 제거되어, 촉매적으로 활성인 분자인 FIXa가 생성된다. FIXa 및 제VIIIa인자 (FVIIIa)가 FX를 제Xa인자 (FXa)로 변환시키고, 차례로 이는 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시킨다. 최종적으로 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 변환시켜, 피브린 응괴의 형성이 초래된다.

야생형 FIX에 다수의 번역후 변형이 있고 이들 중 일부는 생체내 약동학 프로파일에서 역할을 하는 것으로 제안되기 때문에, 이러한 다른 변형들에 영향을 미치지 않는 위치들에서 시스테인 잔기가 도입될 수 있다. 일단 생산되면, B형 혈우병에 대한 효과적인 치료이기 위하여 FIX는 효소 활성을 유지하여야 하고 FVIII, FXI, 및 FX와 상호작용하여야 한다. 도입된 시스테인 잔기 또는 접합된 중합체는 이러한 상호작용 및 기능을 교란하지 않아야 한다.

본 출원은 중합체 접합을 위한 부위를 제공하기 위해 시스테인 잔기들이 도입된 다수의 예시적인 FIX 변이체를 제공한다. 또한, 본 출원은 이러한 변이체들이 포유류 세포에서 발현될 수 있고 응고 분석법에서 활성을 나타낼 수 있음을 실연한다. 마지막으로, 이러한 변형 부위들이 R338A 돌연변이 및/또는 V86A 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는, FIX의 비활성을 강화하는 변경과 조합될 수 있다 ([Chang, et al., J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998]; [Chang, et al., J. Biol. Chem. 277:25393-25399, 2002]). R338A 및 V86A 돌연변이 중 하나 또는 양쪽 모두와의 조합은 변형된 폴리펩티드의 비활성이 야생형 FIX의 비활성과 유사하거나 이보다 더 높을 수 있도록 중합체 접합 부위의 부가로부터 초래되는 임의의 활성 감소를 보상한다.

본 출원은, 부분적으로, 기능 교란이 최소인 중합체-접합 FIX 폴리펩티드를 제공하고, 따라서 이는 FIX의 생체이용률을 증가시키는데 유용하다. 이러한 중합체-접합 폴리펩티드들이 R338A 돌연변이 및/또는 V86A 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는, FIX의 비활성을 강화하는 변경과 조합될 수 있다. FIX의 비활성을 강화하는 변경은 서열 변형 또는 중합체 접합으로 인한 응고 활성의 잠재적인 손실을 보상할 수 있고, 또한 더 낮은 단백질 수준에서 효능을 부여함으로써 변형된 분자의 효능을 잠재적으로 연장시킬 수 있다.

변형된 FIX 폴리펩티드

본 출원은 중합체 접합을 위한 하나 이상의 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드, 즉, 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서 사용된 "제IX인자"는 내인성 응고 경로의 구성원이고 혈액 응고에 필수적인 인간 혈장 FIX 당단백질을 지칭한다. 이러한 정의는 천연 형태, 뿐만 아니라 재조합 형태의 인간 혈장 FIX 당단백질을 포함하는 것으로 이해된다. 달리 상술되거나 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 FIX는 응고에서 자신의 정상적인 역할을 하는 임의의 기능성 인간 FIX 단백질 분자를 의미하고, 이의 임의의 단편, 유사체 및 유도체를 포함한다. 용어 "단편", "유도체", "유사체" 및 "변이체"는, 본 출원의 폴리펩티드를 지칭하는 경우에, 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 및 변이체를 의미한다.

FIX 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 FIX, FIXa, 및 FIX 활성이 있는 FIX의 말단절단(truncated) 버젼이 포함된다. 어느 정도 이상의 FIX 활성을 유지하는 상기 물질들 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 단편, 결실 변이체, 치환 변이체, 또는 부가 변이체가 또한 FIX 폴리펩티드의 구실을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 서열 1에 대해 적어도 약 70, 80, 90, 또는 95％ 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 본원에 기술된 응고 분석법에 의해 결정될 수 있다.

변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산의 보존적 치환을 또한 함유할 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산이 성질이 유사한 또다른 아미노산을 치환하는 것으로 당업계에서 인지되고, 예를 들어, 알라닌 → 세린; 아르기닌 → 라이신; 아스파라긴 → 글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트 → 글루타메이트; 시스테인 → 세린; 글루타민 → 아스파라긴; 글루타메이트 → 아스파르테이트; 글리신 → 프롤린; 히스티딘 → 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신 → 류신 또는 발린; 류신 → 발린 또는 이소류신; 라이신 → 아르기닌; 메티오닌 → 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌 → 타이로신, 류신 또는 메티오닌; 세린 → 트레오닌; 트레오닌 → 세린; 트립토판 → 타이로신; 타이로신 → 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린 → 이소류신 또는 류신의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 1의 FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 중합체 접합 부위의 도입에 더하여 1-30개, 1-20개, 또는 1-10개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.

특정 아미노산에 대한 단일 문자 약어, 이의 상응하는 아미노산, 및 3문자 약어는 하기와 같다: A, 알라닌 (Ala); C, 시스테인 (Cys); D, 아스파르트산 (Asp); E, 글루탐산 (Glu); F, 페닐알라닌 (Phe); G, 글리신 (Gly); H, 히스티딘 (His); I, 이소류신 (Ile); K, 라이신 (Lys); L, 류신 (Leu); M, 메티오닌 (Met); N, 아스파라긴 (Asn); P, 프롤린 (Pro); Q, 글루타민 (Gln); R, 아르기닌 (Arg); S, 세린 (Ser); T, 트레오닌 (Thr); V, 발린 (Val); W, 트립토판 (Trp); Y, 타이로신 (Tyr); 및 노르류신 (Nle).

본 출원의 한 양상은 비-내인성 시스테인 잔기를 통해 중합체 접합 부위가 도입된 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 시스테인 잔기는 하나 이상의 내인성 FIX 아미노산 잔기를 치환할 수 있거나, 또는 FIX 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 시스테인을 부가함으로써 존재할 수 있다. 시스테인 잔기는 2개의 현존하는 아미노산 잔기 사이에서, 예컨대 인간 FIX의 아미노산 잔기 160과 161 사이, 161과 162 사이, 162와 163 사이, 또는 163과 164 사이에서 부가될 수 있다.

사용된 아미노산 치환에 대한 용어법은 하기와 같다. 첫번째 문자는 인간 FIX의 소정의 위치에 본래 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 이어지는 숫자는 성숙형 인간 FIX 아미노산 서열 (서열 1)에서의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 천연 아미노산을 치환 (교체/치환)하는 상이한 아미노산을 나타낸다. 예로서, R338A는 서열 1의 위치 338의 아르기닌 잔기가 알라닌 잔기로 교체되었음을 표시한다.

본 문서에서 사용된 FIX 잔기 번호 시스템은 성숙형 인간 FIX 단백질의 시스템을 지칭하고, 이때 잔기 1은 신호 서열 및 프로펩티드 양쪽 모두의 제거 후의 성숙형 FIX 폴리펩티드의 첫번째 아미노산을 나타낸다. 천연 또는 야생형 FIX는 서열 1에 제시된 바와 같은 전장 성숙형 인간 FIX 분자이다.

일부 실시양태에서, 단백질의 기능 또는 세포에서의 이의 발현을 폐지하지 않을 위치에서 접합 부위가 FIX에서 조작된다. 하나 이상의 중합체 접합 부위가 있는 FIX 폴리펩티드를 디자인하기 위해, 여러 기준이 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 부위는 표면에 노출된다. 표면 노출은 [Autin, et al., J. Thromb. Haemost. 3:2044-2056, 2005]에서 결정된 바와 같이 용매 접근가능 표면적을 기초로 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 부위의 도입은 B형 혈우병과 관련된 것으로 공지된 돌연변이를 도입하지 않는다. 공지된 돌연변이들을 kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.html의 월드와이드웹 및 표 1에서 확인할 수 있다.

하나 이상의 중합체 접합 부위가 도입된 변형된 FIX 폴리펩티드의 성질을 대조군 폴리펩티드와 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 비교용 성질에는, 예를 들어, 용해도, 활성, 혈장 반감기, 중합체 접합, 및 결합 성질이 포함된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드가 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 비교를 위한 가장 적합한 대조군 폴리펩티드를 선택하는 것은 당업자의 영역 내에 속한다. 일부 실시양태에서, 대조군 폴리펩티드는 하나 이상의 도입된 중합체 접합 부위를 제외하고는 변형된 폴리펩티드와 동일하다. 일부 실시양태에서, 대조군 폴리펩티드는 중합체에 접합되지 않았다는 것을 제외하고는 대조군 폴리펩티드는 변형된 폴리펩티드와 동일하다. 예시적인 폴리펩티드에는 야생형 FIX 폴리펩티드 및 하나 이상의 활성화 돌연변이, 예컨대 R338A 및/또는 V86A를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 포함된다.

본 출원의 한 양상은 대조군 폴리펩티드에 비해 시험관내 또는 생체내 안정성이 증가된 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 강화된 혈청 반감기 및 생체내 안정성은 치료 효과를 달성하는데 필요한 투약 빈도를 감소시키는데 바람직할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 혈청 반감기가 대조군 폴리펩티드에 비해 약 20, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000％만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 혈청 반감기는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 10일, 또는 적어도 20일 이상이다. 일부 실시양태에서, 증가된 혈청 반감기를 나타내는 FIX 폴리펩티드가 PEG화된다.

폴리펩티드 약물을 환자에게 투여하는 정황에서 본원에서 사용된 용어 "반감기"는 환자 내의 약물의 혈장 농도가 1/2로 감소되는데 필요한 시간으로 정의된다. 약동학 분석 및 반감기 및 생체내 안정성 결정을 위한 방법이 당업자에게 익숙할 것이다. [Kenneth, et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters, et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 상세사항을 확인할 수 있다. t-알파 및 t-베타 반감기 및 곡선하 면적 (AUC)과 같은 약동학 파라메터가 기술되어 있는 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]를 또한 참조한다.

변형된 FIX 폴리펩티드의 활성은 절대값으로, 예컨대 유닛으로, 또는 대조군 폴리펩티드의 활성의 백분율로서 기술될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 대조군 단백질에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않을 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군의 비활성과 비교하여 약 20％ 이상의 비활성을 유지한다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하여 감소되지 않은 비활성을 지닐 수 있다. 제IX인자 비활성은 응고 케스케이드에서 기능하거나, 활성화된 혈소판 상에서 FVIIIa와의 상호작용을 통해 FXa의 형성을 유도하거나, 또는 혈병의 형성을 지지하는 능력으로 정의될 수 있다. [McCarthy, et al., Thromb. Haemost. 87(5):824-830, 2002]에 예를 들어 기술된 바와 같은 혈병 분석과 같은 기술, 및 당업자에게 공지된 기타 기술에 의해 시험관 내에서 활성을 평가할 수 있다. 계통으로부터 생성된 동물이 FIX에 대해 결핍성이도록 B형 혈우병에 대한 유전 돌연변이가 있는 의도적으로 사육된 여러 동물 계통들 중 하나를 사용하여 생체 내에서 활성을 또한 평가할 수 있다. 이같은 계통들은 <Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, N.Y.> 및 <Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, N.C.>와 같은 비제한적인 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들어, 이러한 공급원 양쪽 모두 개 B형 혈우병을 앓고 있는 개를 제공한다. 별법적으로, FIX가 결핍성인 마우스가 또한 입수가능하다 ([Sabatino, et al., Blood 104:2767-2774, 2005]). FIX 활성에 대해 테스트하기 위해, 테스트 폴리펩티드를 병에 걸린 동물에게 주사하고, 작게 절개하고, 출혈 시간을 건강한 대조군과 비교한다.

인간 야생형 FIX는 비활성이 약 200 유닛/㎎이다. 제IX인자 1 유닛은 1 ㎖의 정상 (풀링됨(pooled)) 인간 혈장 내에 존재하는 FIX의 양으로 정의되었다 (100％의 FIX 수준에 상응함). 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 FIX 폴리펩티드 1 ㎎ 당 100 유닛 이상이다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 FIX 폴리펩티드 1 ㎎ 당 약 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260 유닛 이상이거나, 또는 이를 초과한다. 일부 실시양태에서, FIX의 비활성이 APTT 또는 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 분석법 (예를 들어, [Proctor, et al., Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961]에 기술되어 있고, 실시예를 참조한다)을 사용하여 측정된다.

세포, 예컨대 간 또는 신장 세포에서 발현될 때, FIX 폴리펩티드는 세포 기계에 의해 합성될 수 있고, 번역후 변형을 겪은 후, 세포에 의해 세포외 환경 내로 분비된다. 따라서, 세포로부터 분비되는 FIX 폴리펩티드의 양은 단백질 번역 프로세스 및 세포외 분비 프로세스 양쪽 모두에 좌우된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 단백질의 분비량에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않은 양으로 분비될 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군과 비교하여 약 20％ 이상의 양으로 분비된다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하는 만큼 감소되지 않은 양으로 분비될 수 있다. 예를 들어, 임의의 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포외 배지 내의 단백질 수준을 결정함으로써, FIX 폴리펩티드의 분비량을 측정할 수 있다. 전통적인 단백질 정량 방법에는 2-D 젤 전기영동, 질량 분광법, 및 항체 결합이 포함된다. 생물학적 샘플 내의 단백질 수준을 분석하기 위한 예시적인 방법에는 항체-기반 기술, 예컨대 면역블롯팅 (웨스턴 블롯팅), 면역조직화학적 분석법, 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 또는 방사성면역분석법 (RIA)이 포함된다.

일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 대조군 단백질의 상호작용에 비해 약 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않은 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군과 비교하여 약 20％ 이상의 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하는 만큼 감소되지 않은 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다. [Chang, et al., J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998]에 기술된 방법이 예를 들어 포함되는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 응고 케스케이드의 다른 구성원에 대한 FIX의 결합을 결정할 수 있다.

본 출원은, 부분적으로, 하나 이상의 중합체 접합 부위를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 접합 부위는 유리 시스테인 잔기이다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) T148C, V153C, T163C, L165C, N167C, T169C, T172C, F175C, K201C, K247C, K413C 및 T415C로부터 선택된 1개 이상의 시스테인 치환, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) T148C, V153C, T163C, L165C, T172C, F175C, K247C 및 T415C로부터 선택된 1개 이상의 시스테인 치환, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) T148C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) V153C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) T163C, (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) L165C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) T172C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) F175C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) K247C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 (i) T415C, 및 (ii) R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 포함한다.

일부 실시양태에서, 도입된 시스테인 잔기 상에서 FIX 폴리펩티드가 PEG화된다. 일부 실시양태에서, PEG화는 상응하는 비-PEG화 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 약 20, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000％만큼 FIX 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다.

일부 실시양태에서, T169C, K201C, K247C, 또는 L414C 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드들은 R338A 돌연변이, V86A 돌연변이 또는 양쪽 모두를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드들이 도입된 시스테인 잔기 상에서 PEG화되고, PEG화는 상응하는 비-PEG화 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 약 20, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000％만큼 FIX 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다.

FIX의 활성화 펩티드 (AP)는 이러한 도메인이 단백질의 촉매 활성을 감소시키지 않으면서 제거될 수 있는 것으로 나타났기 때문에, 그리고 AP가 FIX → FIXa 활성화 시 제거되기 때문에, 중합체의 부위 특이적 접합에 대한 매력적인 도메인이다 (Begbie, et al., Thromb. Haemost. 94:1138-1147, 2005). 따라서, AP 도메인의 변형, 예컨대 중합체 접합에 의한 변형은 FIXa의 촉매 활성을 덜 방해할 것이다. AP의 결정 구조가 없기 때문에, 이러한 도메인 내의 잔기의 용매 접근성을 결정하는 것이 불가능하다. 그러나, AP가 6개의 글리코실화 부위를 함유한다는 사실은 이러한 도메인의 대부분이 용매에 노출된다는 것을 가리켜서, 이를 부위 특이적 중합체 변형 (부위 특이적 PEG화 포함)을 위한 매력적인 영역으로 만든다. AP가 촉매 활성을 감소시키지 않으면서 결실될 수 있다는 것이 보고되었지만, 이러한 도메인은 N-연결 글리코실화 부위 양쪽 모두 (Asn157, Asn167), 타이로신 황산화 부위 (Tyr155), 세린 인산화 (Ser158), 뿐만 아니라 O-연결 글리코실화를 위한 4개의 부위 (Thr159, Thr169, Thr172, Thr179)가 포함되는, 천연 FIX 상에서 발생하는 대다수의 번역후 변형을 함유한다.

번역후 변형은 단백질의 기능에 중요한 것으로 공지되어 있고, 특히 생체내 약동학을 결정하는 것에서 중요한 역할을 할 수 있다. FIX의 경우에, AP에서의 특정한 번역후 변형이 B형 혈우병 환자에서의 치료 효능에 영향을 미칠 수 있는 단백질의 생체내 회수율 (주사 직후에 혈액 내에 존재하는 단백질의 백분율)의 중요한 결정인자임을 시사하는 증거가 있다 ([White, et al., Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997]). 따라서, FIX의 AP 내의 천연 발생 번역후 변형을 유지시키는 것이 바람직하다.

본 출원은, 부분적으로, FIX의 활성화 펩티드 내에, 특히 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에 도입된 하나 이상의 중합체 접합 부위, 예를 들어, 유리 시스테인 잔기를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 8가지 종으로부터의 FIX 서열의 다중 서열 정렬은 마우스, 래트 및 기니피그 서열 모두에 다른 종 (인간, 붉은털 원숭이, 개, 토끼, 돼지)에서는 발견되지 않는 추가적인 아미노산 (7개 내지 10개 사이의 잔기)이 활성화 펩티드 내에 있음을 나타냈다 (도 4). 이러한 추가적인 서열은 E160과 E162 사이에 위치한다. 이는 10개 이상의 아미노산 잔기의 삽입이 이러한 부위에서 FIX 구조 내에서 허용된다는 것을 시사한다. 일부 실시양태에서, 30개, 25개, 20개, 18개, 16개, 14개, 또는 12개까지의 아미노산 잔기가 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에서 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 10개까지의 아미노산이 삽입된다. 일부 실시양태에서, 9개까지의 아미노산이 삽입된다.

8가지 종으로부터의 FIX 사이의 다중 서열 정렬을 수행하는데 사용된 기준에 따라, 래트, 마우스 및 기니피그 내의 추가적인 아미노산이 발견되는 명확한 부위는 인간 FIX의 E160과 A161 사이, A161과 E162 사이, E162와 T163 사이, 또는 T163과 I164 사이에 이러한 부위가 있을 수 있도록 바뀔 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 하나 이상의 시스테인 잔기가 E160과 A161 사이에 삽입될 수 있고, 하나 이상의 아미노산이 A161과 E162 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 하나 이상의 시스테인 잔기가 E160과 A161 사이에 삽입될 수 있고, 하나 이상의 아미노산이 E162와 T163 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)이 A161과 E162 사이에 삽입될 수 있고, 하나 이상의 아미노산 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)이 E162와 T163 사이에 삽입될 수 있다. 상기 기술된 실시양태들 중 일부에서, 하나 이상의 아미노산 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)이 T163과 I164 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 30개, 25개, 20개, 18개, 16개, 14개, 또는 12개까지의 아미노산 잔기 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)가 인간 FIX의 아미노산 잔기 161 내지 164 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 총 10개까지의 아미노산 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)이 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 총 9개까지의 아미노산 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)이 인간 FIX의 아미노산 잔기 160 내지 164 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 사이의 시스테인 잔기가 도입된다.

일부 실시양태에서, 10개까지의 아미노산이 E160과 A161 사이, A161과 E162 사이, E162와 T163 사이, 또는 T163과 I164 사이에 삽입될 수 있고, 이때 삽입된 서열은 1개 내지 5개 사이의 시스테인 잔기를 함유하고 나머지 잔기는 Ala, Ser, Gly, Asp 및 Ile의 혼합물로 구성된다. 일부 실시양태에서, 변형된 단백질이 환자에게 투여되는 경우에 인간 면역계가 삽입된 서열을 인식하는 기회를 감소시키기 위해, 삽입된 서열은 예상되는 인간 T 세포 에피토프를 피하도록 디자인될 수 있다.

일부 실시양태에서, 단일 시스테인 잔기가 A161과 E162 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 R338A, V86A 또는 양쪽 모두를 더 포함한다.

본 출원의 한 양상은 적어도 하나 이상의 도입된 중합체 접합 부위 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함), 및 하나 이상의 FIX의 활성을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 활성화 FIX 돌연변이의 예로는 R338A 및 V86A 돌연변이가 포함된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 R338A 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 V86A 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 돌연변이 양쪽 모두를 포함할 수 있다.

본 출원의 추가적인 양상은 비활성이 증가된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 R338A 및 V86A 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비활성이 폴리펩티드 1 ㎎ 당 적어도 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000 유닛이다. 예를 들어, APTT 분석법을 사용하여, 비활성을 결정할 수 있다. 이러한 폴리펩티드들은, 예를 들어, B형 혈우병에 걸린 환자에서, 치료제로서 유용하다. 이러한 폴리펩티드들은 추가적인 돌연변이 또는 변형, 예컨대 본원에 기술된 중합체 접합 부위 (1개 이상의 시스테인 잔기 포함)를 포함할 수 있다.

변형된 FIX 폴리펩티드의 생산

중합체 접합 부위를 도입하기 위해 아미노산 잔기들이 삽입 또는 치환될 수 있다. 예를 들어, FIX의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 시스테인 잔기가 도입될 수 있다. 아미노산 서열 변경은 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 변형이 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발을 위한 기술은 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, [Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984] 또는 [Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989, pp. 61-68]에 기술되어 있다. 따라서, FIX의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하여, 선택한 변경(들)을 도입할 수 있다. 유사하게, 특이적 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 DNA 구축물을 제조하기 위한 절차가 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, [PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA] 참조).

FIX 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물을 확립된 표준 방법, 예를 들어, [Beaucage, et al., Gene Amplif. Anal. 3:1-26, 1983]에 기술된 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성적으로 또한 제조할 수 있다. 포스포르아미다이트 방법에 따르면, 올리고뉴클레오티드가, 예를 들어, 자동 DNA 합성기에서, 합성되고, 정제되고, 어닐링(annealing)되고, 결찰되며, 적절한 벡터 내에 클로닝된다. 인간 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,202; 또는 [Saiki, et al., Science 239:487-491, 1988]에 기술된 바와 같이, 특이적 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 또한 제조할 수 있다. 또한, 핵산 구축물은, 표준 기술에 따라, 전체 핵산 구축물의 다양한 부분에 상응하는 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편들을 (적합하게) 결찰시킴으로써 제조된 혼합형 합성 및 게놈, 혼합형 합성 및 cDNA, 또는 혼합형 게놈 및 cDNA 기원일 수 있다.

FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 재조합 DNA 절차를 사용하여 재조합 벡터 내로 삽입할 수 있다. 벡터의 선택은 벡터가 내부로 도입될 숙주 세포에 종종 좌우될 것이다. 벡터는 자가 복제 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다. 자가 복제 벡터는 염색체외 개체로서 존재하고, 이의 복제는 염색체 복제와 관계없으며, 예를 들어, 플라스미드이다. 통합 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되어, 자신이 내부로 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터이다.

벡터는 변형된 FIX를 코딩하는 DNA 서열이 DNA의 전사, 번역 또는 프로세싱에 필요한 추가적인 절편들, 예컨대 프로모터, 종결인자 및 폴리아데닐화 부위에 작동가능하게 연결된 발현 벡터일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래될 수 있거나, 또는 양쪽 모두로부터의 요소들을 함유할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 절편들이 협력하여 자신들의 의도된 목적을 위해 기능하도록, 예를 들어, 전사가 프로모터에서 시작되어 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 지나 진행되도록 절편들이 배열되는 것을 가리킨다.

FIX 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용하기 위한 발현 벡터는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종성 또는 이종성인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다.

포유류 세포에서 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 지시하기 위한 적절한 프로모터의 예는, 예를 들어, SV40 프로모터 ([Subramani, et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981]), MT-I (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 ([Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]), CMV 프로모터 ([Boshart, et al., Cell 41:521-530, 1985]), 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 ([Kaufman et al., Mol. Cell Biol, 2:1304-1319, 1982])이다.

또한 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은, 필요하다면, 적절한 종결인자, 예컨대 인간 성장 호르몬 종결인자 ([Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]) 또는 TPI1 ([Alber et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:419-434, 1982]) 또는 ADH3 ([McKnight, et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985]) 종결인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 벡터는 삽입 부위의 하류에 위치하는 폴리아데닐화 신호를 또한 함유할 수 있다. 폴리아데닐화 신호에는 SV40으로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 EIb 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 종결인자 ([DeNoto, et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981]), 또는 인간 FIX 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 발현 벡터는 인핸서 서열, 예컨대 SV40 인핸서를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 FIX 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 지시하기 위해, 천연 FIX 분비 신호 서열을 사용할 수 있다. 별법적으로, 분비 신호 서열 (리더(leader) 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리(pre) 서열로 또한 알려짐)이 재조합 벡터 내에 제공될 수 있다. 정확한 리딩 프레임 내의 FIX 유사체를 코딩하는 DNA 서열에 분비 신호 서열이 연결될 수 있다. 통상적으로 분비 신호 서열은 펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에 위치한다. 예시적인 신호 서열에는, 예를 들어, MPIF-1 신호 서열 및 스타니오칼신 신호 서열이 포함된다.

FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터, 및 임의적으로 종결인자 및/또는 분비 신호 서열을 결찰시키고, 이들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터 내로 삽입하기 위해 사용되는 절차는 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 참조).

포유류 세포를 형질감염시키고 세포 내로 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법이, 예를 들어, [Kaufman, et al., J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982]; [Southern, et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982]; [Loyter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426, 1982]; [Wigler, et al., Cell 14:725-731, 1978]; [Corsaro, et al., Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981], [Graham, et al., Virology 52:456-467, 1973]; 및 [Neumann, et al., EMBO J. 1:841-845, 1982]에 기술되어 있다. 클로닝된 DNA 서열을 배양된 포유류 세포 내로, 예를 들어, 리포펙션(lipofection), DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 미세주입, 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 레트로바이러스 전달, 전기천공, 초음파천공, 레이저 조사, 마그네토펙션(magnetofection), 천연 형질전환, 및 생체탄도(biolistic) 형질전환에 의해 도입할 수 있다 (예를 들어, [Mehier-Humbert, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 57:733-753, 2005] 참조). 외인성 DNA를 발현하는 세포를 확인 및 선별하기 위해, 선별성 표현형을 부여하는 유전자 (선별성 마커)가 관심 유전자 또는 cDNA와 함께 세포 내로 일반적으로 도입된다. 선별성 마커에는, 예를 들어, 약물 예컨대 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 선별성 마커는 서열들이 연결된 경우 마커 및 외인성 DNA의 증폭을 허용하는 증폭성 선별성 마커일 수 있다. 예시적인 증폭성 선별성 마커에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 및 아데노신 탈아미노효소가 포함된다. 적절한 선별성 마커를 선택하는 것은 당업자의 영역 내에 속한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,238,820 참조).

세포들을 DNA로 형질감염시킨 후, 이들을 관심 유전자를 발현하도록 적합한 성장 배지에서 성장시킨다. 본원에서 사용된 용어 "적합한 성장 배지"는 세포의 성장 및 활성 FIX 폴리펩티드의 발현에 요구되는 영양소 및 기타 성분을 함유하는 배지를 의미한다.

일반적으로 배지는, 예를 들어, 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장 인자를 포함하고, FIX와 같은 비타민 K 의존적 단백질의 경우에는, 비타민 K가 또한 제공될 수 있다. 그후, 안정적인 방식으로 선별성 마커를 발현하는 세포의 성장에 대해 선별하기 위해 약물 선별을 적용한다. 증폭성 선별성 마커로 형질감염된 세포에 대해, 클로닝된 서열의 증가된 카피수에 대해 선별하기 위해 약물 농도를 증가시킬 수 있고, 이에 의해 발현 수준이 증가된다. 그후, 안정적으로 형질감염된 세포의 클론을 FIX 폴리펩티드의 발현에 대해 스크리닝한다.

본 발명에서 사용하기 위한 포유류 세포주의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장 (BHK), HKB11 세포 ([Cho, et al., J. Biomed. Sci, 9:631-638, 2002]), 및 HEK-293 (ATCC CRL 1573; [Graham, et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977]) 세포주이다. 또한, 래트 Hep I (래트 간세포암; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (래트 간세포암; ATCC CRL 1548), TCMK-1 (ATCC CCL 139), Hep-G2 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 및 CHO-DUKX 세포 ([Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980])이 포함되는 다수의 또다른 세포주가 본 발명에서 사용될 수 있다.

FIX 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 회수할 수 있고, 그후 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 분취용 등전 포커싱 (IEF), 차등 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전)), 추출 (예를 들어, [Protein Purification, Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조), 또는 이들의 다양한 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 이를 정제할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 폴리펩티드를 항-FIX 항체 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 통상적인 화학적 정제 수단, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가적인 정제가 달성될 수 있다. 또다른 정제 방법들이 당업계에 공지되어 있고, 변형된 FIX 폴리펩티드의 정제에 적용될 수 있다 (예를 들어, [Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982] 참조).

일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분들을 제거하기 위해 분획화에 적용되었고, 자신의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 유지하는 단백질 또는 펩티드 조성물을 지칭할 것이다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 지시는 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주성분을 형성하는, 예컨대 조성물 내의 단백질의 약 50％, 약 60％, 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 95％, 약 99％ 이상을 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.

폴리펩티드의 정제 정도를 정량하기 위한 다양한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 활성 분획의 비활성을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 예시적인 방법은 본원에서 "정제 배수"에 의해 평가되는, 분획의 비활성을 계산하고, 이러한 활성을 초기 추출물의 비활성과 비교하여, 순도의 정도를 계산하는 것이다. 물론, 활성의 양을 나타내도록 사용되는 실제 단위는 특정 분석법 기술에 좌우될 것이다.

중합체 접합

변형된 FIX 폴리펩티드는 중합체 모이어티(moiety)를 부착시키는데 사용될 수 있는 하나 이상의 중합체 접합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드가 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 생체적합성 중합체는 약동학에서의 원하는 개선을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, FIX 활성이 있는 폴리펩티드의 순환 반감기를 개선하도록 또는 활성에서의 허용되지 않는 감소 없이 폴리펩티드의 항원성을 감소시키도록 중합체의 신원, 크기 및 구조를 선택할 수 있다.

본 발명에서 유용한 중합체의 예로는 폴리(알킬렌 글리콜) 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀산 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 다당류, 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로모르폴린), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 옥시드, 알킬-폴리에틸렌 옥시드, 비스폴리에틸렌 옥시드, 폴리알킬렌 옥시드의 공중합체 또는 블럭 공중합체, 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜), 폴리(N-2-(히드록시프로필)메타크릴아미드), 및 덱스트란이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

중합체는 특정 구조에 한정되지 않고, 선형 (예를 들어, 알콕시 PEG 또는 2관능성 PEG), 또는 비-선형 예컨대 분지형, 포크형, 다지형 (예를 들어, 폴리올 코어(core)에 부착된 PEG), 및 수지모양일 수 있다. 또한, 중합체의 내부 구조는 임의의 가짓수의 상이한 패턴으로 구성될 수 있고, 단독중합체, 교대 공중합체, 무작위 공중합체, 블럭 공중합체, 교대 3원중합체, 무작위 3원중합체, 및 블럭 3원중합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

FIX 폴리펩티드 상의 원하는 부위에 대한 커플링에 적합한 적절한 활성화 기로 PEG 및 기타 수용성 중합체 (즉, 중합체성 시약)가 활성화될 수 있다. 따라서, 중합체성 시약은 FIX 폴리펩티드와의 반응을 위한 반응성 기를 지닐 것이다. 대표적인 중합체성 시약 및 이러한 중합체를 활성 모이어티에 접합시키는 방법이 당업계에 공지되어 있고, [Zalipsky, et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)], 및 [Zalipsky, Adv. Drug Rev. 16:157-182, 1995]에 추가로 기술되어 있다.

중합체의 중량 평균 분자량은 약 100 돌턴 내지 약 150,000 돌턴일 수 있다. 그러나, 예시적인 범위에는 약 5,000 돌턴 초과 내지 약 100,000 돌턴 범위, 약 6,000 돌턴 내지 약 90,000 돌턴 범위, 약 10,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위, 약 10,000 돌턴 초과 내지 약 85,000 돌턴 범위, 약 20,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위, 약 53,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위, 약 25,000 돌턴 내지 약 120,000 돌턴 범위, 약 29,000 돌턴 내지 약 120,000 돌턴 범위, 약 35,000 돌턴 내지 약 120,000 돌턴 범위, 및 약 40,000 돌턴 내지 약 120,000 돌턴 범위의 중량 평균 분자량이 포함된다.

생체적합성 중합체에 대한 예시적인 중량 평균 분자량에는 약 100 돌턴, 약 200 돌턴, 약 300 돌턴, 약 400 돌턴, 약 500 돌턴, 약 600 돌턴, 약 700 돌턴, 약 750 돌턴, 약 800 돌턴, 약 900 돌턴, 약 1,000 돌턴, 약 1,500 돌턴, 약 2,000 돌턴, 약 2,200 돌턴, 약 2,500 돌턴, 약 3,000 돌턴, 약 4,000 돌턴, 약 4,400 돌턴, 약 4,500 돌턴, 약 5,000 돌턴, 약 5,500 돌턴, 약 6,000 돌턴, 약 7,000 돌턴, 약 7,500 돌턴, 약 8,000 돌턴, 약 9,000 돌턴, 약 10,000 돌턴, 약 11,000 돌턴, 약 12,000 돌턴, 약 13,000 돌턴, 약 14,000 돌턴, 약 15,000 돌턴, 약 20,000 돌턴, 약 22,500 돌턴, 약 25,000 돌턴, 약 30,000 돌턴, 약 35,000 돌턴, 약 40,000 돌턴, 약 45,000 돌턴, 약 50,000 돌턴, 약 55,000 돌턴, 약 60,000 돌턴, 약 65,000 돌턴, 약 70,000 돌턴, 및 약 75,000 돌턴이 포함된다. 전체 분자량이 상기의 것들 중 임의의 것인 분지형 버젼의 생체적합성 중합체 (예를 들어, 2개의 20,000 돌턴 중합체로 구성된 분지형 40,000 돌턴 중합체)가 또한 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 중합체는 PEG이다. PEG는 시판되거나 또는 당업계에 주지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 주지된 수용성 중합체이다 ([Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG의 끝부분에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하도록 광범위하게 사용되고, 화학식 X―O(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂OH [식중 n은 20 내지 2300이고, X는 H 또는 말단 변형, 예를 들어, C₁ _-4 알킬이다]로 표시될 수 있다. PEG는 결합 반응에 필요하거나, 분자의 화학적 합성으로부터 초래되거나, 또는 분자의 일부분들의 최적의 거리를 위한 스페이서로서 작용하는 추가적인 화학기를 함유할 수 있다. 또한, 이같은 PEG는 서로 연결된 하나 이상의 PEG 측쇄로 구성될 수 있다. 1개를 초과하는 PEG 사슬이 있는 PEG는 다지형 또는 분지형 PEG로 칭해진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드를 글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨이 포함되는 다양한 폴리올에 부가함으로써 분지형 PEG가 제조될 수 있다. 예를 들어, 팔이 4개인 분지형 PEG가 펜타에리트리올 및 에틸렌 옥시드로부터 제조될 수 있다. 분지형 PEG의 예가, 예를 들어, 유럽 출원 공개 번호 473084A 및 미국 특허 번호 5,932,462에 기술되어 있다. PEG의 한 형태는 라이신의 1차 아미노 기를 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄 (PEG2)를 포함한다 ([Monfardini, et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995]).

한 실시양태에서, 중합체는 끝부분이 캡핑된(capped) 중합체, 즉 1개 이상의 말단이 비교적 불활성인 기, 예컨대 저급 C₁ _-6 알콕시 기 (그러나 히드록실 기도 또한 사용될 수 있음)로 캡핑된 중합체일 수 있다. 중합체가 PEG인 경우, 예를 들어, 중합체의 1개의 말단은 메톡시 (--OCH3) 기인 한편 다른쪽 말단은 히드록실 또는 또다른 관능기 (임의적으로 화학적으로 변형될 수 있음)인 선형 형태의 PEG인 메톡시-PEG (일반적으로 mPEG로 지칭됨)가 사용될 수 있다.

다지형 또는 분지형 PEG 분자, 예컨대 미국 특허 번호 5,932,462에 기술된 것들이 또한 PEG 중합체로 사용될 수 있다. 또한, PEG는 포크형 PEG를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서 사용할 수 있는 다양한 포크형 PEG 구조가 개시되어 있는 PCT 공개 번호 WO 1999/45964 참조). Z 관능기를 분지화 탄소 원자에 연결하는 원자들의 사슬이 속박기(tethering group) 구실을 하고, 여기에는, 예를 들어, 알킬 사슬, 에테르 사슬, 에스테르 사슬, 아미드 사슬 및 이들의 조합이 포함된다.

PEG 중합체는 PEG 사슬의 끝부분보다는 PEG의 길이를 따라 반응성 기, 예컨대 카르복실이 공유결합으로 부착되어 있는 펜던트(pendant) PEG 분자를 또한 포함할 수 있다. 펜던트 반응성 기는 PEG에 직접적으로 또는 스페이서 모이어티, 예컨대 알킬렌 기를 통해 부착될 수 있다.

폴리펩티드에 대한 중합체 분자(들)의 공유결합 부착을 달성하기 위해, 중합체 분자의 히드록실 말단기가 활성화된 형태로 즉, 반응성 관능기 (이의 예로는 1차 아미노 기, 히드라지드 (HZ), 티올, 숙시네이트 (SUC), 숙신이미딜 숙시네이트 (SS), 숙신이미딜 숙신아미드 (SSA), 숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA), 숙신이미딜 부타노에이트 (SBA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트 (SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트 (BTC), N-히드록시숙신이미드 (NHS), 알데히드, 니트로페닐카르보네이트 (NPC), 및 트레실레이트 (TRES)가 포함된다)와 함께 제공되어야 한다. 적절하게 활성화된 중합체 분자가, 예를 들어, NOF (Japan); 넥타 테라퓨틱스 인코포레이티드(Nektar Therapeutics, Inc.; Huntsville, Ala.); 폴리엠에이에스씨 파마슈티컬스 피엘씨(PolyMASC Pharmaceuticals plc; UK); 또는 선바이오 코포레이션(SunBio Corporation; Anyang City, South Korea)로부터 시판된다. 별법적으로, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 중합체 분자가 활성화될 수 있다 (예를 들어, WO 90/13540 참조). 본 발명에서 사용하기에 적절한 활성화된 선형 또는 분지형 중합체 분자의 구체적인 예가, 예를 들어, NOF (Japan); 넥타 테라퓨틱스 인코포레이티드 (Huntsville, Ala.)로부터 시판된다. 활성화된 PEG 중합체의 구체적인 예로는 하기의 선형 PEG들이 포함된다: NHS-PEG, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG, 및 분지형 PEG, 예컨대 PEG2-NHS, PEG2-MAL, 및 미국 특허 번호 5,932,462 및 미국 특허 번호 5,643,575 (양쪽 모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에 예를 들어 개시된 것들.

한 실시양태에서, 중합체는 FIX 폴리펩티드 상의 유리 시스테인과 반응하여 공유결합 연결을 형성할 수 있는 반응성 설프히드릴 모이어티를 지닌다. 이같은 반응성 설프히드릴 모이어티에는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜, 또는 말레이미드 모이어티가 포함된다. 추가로, 거명에 의해 본원에 포함된 하기의 간행물에 유용한 중합체 분자 및/또는 PEG화 화학이 개시되어 있다: US 특허 번호 6,113,906; 7,199,223; 5,824,778; 5,476,653; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,219,564; 5,736,625; 5,473,034; 5,516,673; 5,629,384; 5,382,657; WO 97/32607; WO 92/16555; WO 94/04193; WO 94/14758; WO 94/17039; WO 94/18247; WO 94/28024; WO 95/00162; WO 95/11924; WO95/13090; WO 95/33490; WO 96/00080; WO 97/18832; WO 98/41562; WO 98/48837; WO 99/32134; WO 99/32139; WO 99/32140; WO 96/40791; WO 98/32466; WO 95/06058; WO 97/03106; WO 96/21469; WO 95/13312; WO 98/05363; WO 96/41813; WO 96/07670; EP809996; EP921131; EP605963; EP510356; EP400472; EP183503; EP154316; EP229108; EP402378; 및 EP439508.

시스테인 잔기의 PEG화를 위해, PEG화 전에 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DDT)로 폴리펩티드를 처리할 수 있다. 이어서 임의의 통상적인 방법에 의해, 예컨대 탈염에 의해 환원제를 제거할 수 있다. 시스테인 잔기에 대한 PEG의 접합은 약 16시간까지의 기간 동안 4℃ 내지 25℃의 온도에서 pH 6-9의 적절한 완충제에서 전형적으로 일어난다. 시스테인 잔기에 커플링시키기 위한 활성화된 PEG 중합체의 예로는, 예를 들어, 하기의 선형 및 분지형 PEG가 포함된다: 비닐설폰-PEG (PEG-VS), 예컨대 비닐설폰-mPEG (mPEG-VS); 오르토피리딜-디설피드-PEG (PEG-OPSS), 예컨대 오르토피리딜-디설피드-mPEG (MPEG-OPSS); 및 말레이미드-PEG (PEG-MAL), 예컨대 말레이미드-mPEG (mPEG-MAL) 및 분지형 말레이미드-mPEG2 (mPEG2-MAL).

한 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 접합 부위가 도입된 FIX 폴리펩티드가디설피드 결합을 형성함으로써 폴리펩티드의 시스테인 잔기를 "캡핑(capping)"하는 시스테인을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장된 세포에서 발현될 수 있다. 중합체 접합체를 FIX 폴리펩티드에 부가하기 위해, 캡을 방출시키는 가벼운 반응에 의해 시스테인 캡이 제거될 수 있고, 그후 시스테인-특이적 중합체 시약이 부가된다.

본 출원은 중합체 접합 부위, 즉 시스테인 잔기를 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입하는 단계; 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 도입된 중합체 접합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 폴리펩티드를 정제하는 단계; 폴리펩티드를 환원된 시스테인 잔기에서 폴리펩티드와 반응하도록 활성화된 생체적합성 중합체와 반응시켜, 접합체가 형성되는 단계; 및 접합체를 정제하는 단계를 포함하는, 중합체가 접합된 FIX 폴리펩티드의 제조 방법을 또한 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 출원은 (a) 도입된 중합체 접합 부위, 즉, FIX 폴리펩티드의 노출된 표면 상에 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 발현시키고, 이때 시스테인이 캡핑되어 있는 단계; (b) 도입된 시스테인을 가볍게 환원시키고 캡을 방출시키는 조건 하에 FIX 폴리펩티드를 환원제와 접촉시키는 단계; (c) 캡 및 환원제를 FIX 폴리펩티드에서 제거하는 단계; 및 (d) 환원제를 제거하고 나서 적어도 약 5분, 15분, 또는 30분 후에, FIX 폴리펩티드를 PEG화 FIX 폴리펩티드가 생산되도록 하는 조건 하에 설프히드릴 커플링 모이어티를 포함하는 PEG로 처리하는 단계를 포함하는 FIX 폴리펩티드 뮤테인의 부위-지정 PEG화 방법을 제공한다. PEG의 설프히드릴 커플링 모이어티는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 및 말레이미드 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된다.

PEG화 FIX 폴리펩티드의 예시적인 제조 방법이 하기에 기술된다. 약 1 μM의 도입된 비-천연 시스테인 잔기를 포함하는 정제된 FIX 폴리펩티드를 환원제 예컨대 0.7 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 또는 0.07 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 30분 동안 4℃에서 가볍게 환원시켜, "캡"을 방출시킨다. 도입된 시스테인은 환원된 유리 상태이게 하는 한편 디설피드가 재형성되도록 샘플을 스핀 칼럼에 러닝(running)시키는 것과 같은 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 방법에 의해 환원제를 "캡"과 함께 제거한다. 환원제를 제거하고 나서 적어도 30분 후에, FIX 폴리펩티드를 4℃에서 1시간 이상 동안 10배 이상의 몰 과량의 크기가 5 내지 85 kD 범위인 PEG-말레이미드로 처리한다.

FIX의 중합체 접합을 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 중합체가 접합된 FIX를 6％ 트리스-글리신 SDS 폴리아크릴아미드 환원 젤 상에서의 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 전기영동 후, 접합되지 않은 FIX 폴리펩티드와 비교하여 밴드 분자량에서의 이동을 확인하기 위해, 젤을 쿠마시 블루로 염색하여 모든 단백질을 확인할 수 있거나, 또는 표준 웨스턴 블롯 프로토콜에 적용할 수 있다. PEG에 대해 특이적인 요오드화바륨 염색을 사용하여 분자량 이동이 있는 밴드가 PEG화 단백질을 포함한다는 것을 확증할 수 있다. 중합체 접합의 정도 및 효율을 결정하기 위해, 중합체 접합 전 및 접합 후에, FIX 폴리펩티드를 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 질량 분광법에 의해 또한 분석할 수 있다.

제약 조성물

본 출원은, 부분적으로, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 중합체 접합 부위가 도입된 FIX 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 중합체에 접합된 FIX 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 생체내 투여에 적절하고, 발열원이 없다. 조성물은 제약상 허용되는 담체를 또한 포함할 수 있다. "제약상 또는 약리학상 허용되는"이라는 구절은 동물 또는 인간에게 투여되었을 때 유해 반응, 알러지 반응 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 분자 본체 및 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용된 "제약상 허용되는 담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등이 포함된다. 제약상 활성인 물질을 위해 이같은 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당업계에 주지되어 있다. 보완적인 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 고전적인 제약 제제가 포함된다. 이러한 본 발명에 따른 조성물은 표적 조직이 경로를 통해 이용가능한 한 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 제약 조성물은 임의의 관례적인 방법에 의해, 예를 들어, 정맥내, 피내, 근육내, 유선내, 복강내, 수막강내, 눈뒤, 피하, 폐내, 경구, 설하, 비강내, 항문, 질 또는 경피 전달에 의해, 또는 특정 부위에서의 수술 이식에 의해 대상 내로 도입될 수 있다. 치료는 단일 투약 또는 일정 기간에 걸친 다중 투약으로 구성될 수 있다.

계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적절하게 혼합되어, 물 내의 유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염의 용액으로서 활성 화합물이 투여용으로 제조될 수 있다. 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 내에서, 및 오일 내에서 분산액이 또한 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에, 이러한 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유할 수 있다.

주사 용도에 적절한 제약 제형에는 무균성 수성 용액 또는 분산액 및 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말이 포함된다. 제형은 무균성이어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제작 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 수크로스, L-히스티딘, 폴리소르베이트 80, 또는 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅물, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 미생물 작용의 방지가 초래될 수 있다. 주사용 조성물은 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용함으로써 주사용 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다.

필요한 대로 상기 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적합한 용매 내에 필요한 양의 활성 화합물 (예를 들어, FIX 폴리펩티드)을 혼입시킨 후, 멸균 여과함으로써 무균성 주사용 용액이 제조될 수 있다.

일반적으로, 다양한 멸균 활성 성분들을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조될 수 있다. 무균성 주사 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 이의 앞서 무균성-여과된 용액으로부터 산출되는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 예를 들어 포함한다.

제형 시, 투약 제형과 상용성인 방식으로, 그리고 치료적 유효량으로 용액이 투여될 수 있다. "치료적 유효량"은 혈류 또는 표적 조직 내에 원하는 수준의 폴리펩티드를 제공하는데 필요한 폴리펩티드의 양을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 정확한 양은 다수의 요인, 예를 들어, 특정 FIX 폴리펩티드, 치료 조성물의 성분 및 물리적 특성, 의도되는 환자 집단, 전달 방식, 개별적인 환자 고려사항 등에 좌우될 것이고, 본원에서 제공된 정보를 기초로 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.

다양한 투약 형태, 예컨대 주사 용액 등으로 제형이 쉽게 투여될 수 있다. 수용액의 경구 투여를 위해, 예를 들어, 필요하다면 용액이 적절하게 완충되어야 하고, 먼저 액체 희석제가 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적절하다.

FIX의 투여량은 일반적으로 유닛으로 표현된다. 체중 1 ㎏ 당 1 유닛의 FIX는 혈장 수준을 0.01 U/㎖, 즉 1％만큼 상승시킬 수 있다. 다르게는, 건강한 환자에는 혈장 1 ㎖ 당 1 유닛의 FIX, 즉 100％가 있다. B형 혈우병의 경도 사례는 6-60％ 사이의 FIX 혈장 농도로 정의되고, 중도 사례는 1-5％ 사이로 정의되며, B형 혈우병 사례의 약 절반을 차지하는 고도 사례는 FIX가 1％ 미만이다. 예방 치료 또는 경증 출혈의 치료는 일반적으로 FIX 수준을 15-30％ 사이로 상승시키는 것을 필요로 한다. 중등도 출혈의 치료는 일반적으로 수준을 30-50％ 사이로 상승시키는 것을 필요로 하는 한편, 중증 외상의 치료는 수준을 50 내지 100％로 상승시키는 것을 요구할 수 있다. 환자의 혈액 수준을 상승시키는데 필요한 유닛의 총수를 하기와 같이 결정할 수 있다: 1.0 유닛/㎏ × 체중 (㎏) × 원하는 백분율 증가 (정상의 ％). 최초의 볼루스에 이어지는 약물 제품의 치료적 순환 수준을 유지하기 위한 연속 주입으로 비경구 투여가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 15 내지 150 유닛/㎏의 FIX 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 당업자는 좋은 진료(good medical practice) 및 개별적인 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 계획을 쉽게 최적화할 것이다.

투약 빈도는 작용제의 약동학 파라메터 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자는 최적의 제약 제형을 결정할 수 있다 (예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20^th edition, 2000] 참조). 이같은 제형은 투여된 작용제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 소거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 투여 경로에 따라, 적절한 용량을 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산할 수 있다. 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 분석법, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 임상 시험에서 관찰되는 약동학 데이터의 견지에서, 적합한 치료 용량을 결정하기 위해 필요한 계산의 추가적인 개량이 과도한 실험 없이 당업자에 의해 일상적으로 이루어진다. 예시적인 투약 스케줄에는 1일 5회, 1일 4회, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 매주 3회, 매주 2회, 매주 1회, 매월 2회, 매월 1회, 및 이의 임의의 조합으로 투여하는 것이 비제한적으로 포함된다.

관련된 용량 응답 데이터와 함께 혈액 응고 수준을 결정하기 위한 확립된 분석법을 사용하여 적합한 투여량을 확인할 수 있다. 약물의 작용을 변형시키는 요인, 예를 들어, 약물의 비활성, 손상의 중증도, 및 환자의 응답, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간, 및 기타 임상 요인을 고려하여, 주치의가 최종 투여량 계획을 결정할 수 있다.

조성물은 미생물 성장을 방지 또는 방해하기 위한 항균제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적절한 항균제의 비제한적인 예로는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 티메로솔, 및 이들의 조합물이 포함된다.

항산화제가 또한 조성물 내에 존재할 수 있다. 산화를 방지함으로써 제제의 열화를 방지하기 위해 항산화제가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 항산화제에는, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 중아황산나트륨, 소듐 포름알데히드 설폭실레이트, 메타중아황산나트륨, 및 이들의 조합물이 포함된다.

계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제에는 폴리소르베이트 예컨대 트윈(Tween)®-20 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트) 및 트윈®-80 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트) 및 플루로닉(pluronic) 예컨대 F68 및 F88 (양쪽 모두 BASF (Mount Olive, N.J.)에서 입수가능); 소르비탄 에스테르; 지질 예컨대 인지질 예컨대 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 지방산 및 지방산 에스테르; 스테로이드 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이팅제 예컨대 EDTA, 아연 및 기타 적절한 양이온이 포함된다.

산 또는 염기가 조성물 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비-제한적인 예로는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 조합물이 포함된다. 적절한 염기의 예로는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸메르산칼륨 및 이들의 조합물이 포함된다.

조성물 내의 임의의 개별적인 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 요구사항에 따라 변할 수 있다. 전형적으로, 일상적인 실험을 통해, 즉 다양한 양의 부형제 (낮은 양 내지 높은 양 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 기타 파라메터를 시험한 후, 유의한 유해 효과 없이 최적의 성능이 달성되는 범위를 결정함으로써 임의의 개별적인 부형제의 최적량을 결정할 수 있다. 일반적으로, 부형제는 약 1 내지 약 99 중량％, 약 5 내지 약 98 중량％, 약 15 내지 약 95 중량％의 양으로 30 중량％ 미만의 농도로 조성물 내에 존재할 수 있다. 이러한 상기 제약 부형제들이 기타 부형제들과 함께 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19 ed., Williams & Williams, (1995)]; ["Physician's Desk Reference", 52 ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]; 및 [Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기술되어 있다.

예시적인 용도

본원에 기술된 조성물은 FIX의 기능 결함 또는 FIX의 결핍 예컨대 FIX의 짧아진 생체내 반감기, FIX의 변경된 결합 성질, FIX의 유전적 결함, 및 FIX의 감소된 혈장 농도와 관련된 임의의 출혈 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. FIX의 유전적 결함은, 예를 들어, FIX를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 염기의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 출혈 장애는 B형 혈우병일 수 있다. 이같은 출혈 장애의 증상에는, 예를 들어, 심한 코피, 구강 점막 출혈, 출혈관절증, 혈종, 지속적인 혈뇨, 위장관 출혈, 복막뒤 출혈, 혀/인두뒤 출혈, 두개내 출혈, 및 외상-관련 출혈이 포함된다.

본 발명의 조성물은 예방 용도를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대상 자신의 응고 능력을 강화하기 위해 질환 상태 또는 손상의 여지가 있거나 다른 방식으로 질환 상태 또는 손상의 위험에 있는 대상에게 투여될 수 있다. 이같은 양은 "예방적 유효 용량"으로 정의될 수 있다. 예방을 위한 변형된 FIX 폴리펩티드의 투여는 B형 혈우병을 앓고 있는 환자가 수술을 받을 예정이고 폴리펩티드가 수술 1시간 내지 4시간 전에 투여되는 상황을 포함한다. 또한, 임의적으로는 혈우병을 앓고 있지 않는 환자에서, 폴리펩티드는 제어되지 않는 출혈에 대한 예방제로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩티드가 수술 전에 제어되지 않는 출혈에 대한 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.

본원에 기술된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법은 본 발명의 대표적인 예인 것으로 의도되고, 본 발명의 범주가 예의 범주에 의해 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 당업자는 개시된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법이 변동되면서 본 발명이 실행될 수 있고 이같은 변동이 본 발명의 영역 내인 것으로 간주된다는 것을 인지할 것이다.

하기의 실시예들은 본원에 기술된 본 발명을 설명하기 위해 제시되지만, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

본 발명이 더 잘 이해될 수 있기 위하여, 하기의 예들이 기재된다. 이러한 예들은 오직 설명의 목적만을 위한 것이고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.

실시예 1: 인 실리코 (in Silico ) 분석

부위 특이적 중합체 접합의 목적을 위한 시스테인 치환에 대한 성공적인 부위일 것 같은 FIX의 잔기를 평가하기 위해 인 실리코 분석을 수행하였다. 분석은 라이신, 페닐알라닌, 및 류신 잔기에 초점을 맞추었는데, 이는 이러한 전하를 띤 잔기들이 더욱 종종 용매에 노출되기 때문이고, FVIII의 경우에 이러한 잔기들이 시스테인으로 변화되었을 때 중합체 접합을 위한 가장 성공적인 부위였기 때문이다 (예를 들어, US 공개 번호 2006/0115876 참조). FIX 내의 라이신, 페닐알라닌, 및 류신 잔기의 용매 노출을 FIX 결정 구조 ([Hopfner, et al., Structure 7:989-996, 1999])로부터의 데이터를 사용하여 결정하였다. 용매에 노출될 것 같은 또다른 잔기들이 시스테인 치환을 위한 가능한 부위로서 또한 간주되었다. 컴퓨터 알고리즘 폴드X(FoldX)를 사용하여, 개별적인 잔기 및 전체적인 FIX 단백질 구조 양쪽 모두의 자유 에너지에 대한 시스테인으로의 각각의 잔기의 돌연변이의 효과를 예측하였다. 폴드X는 단백질 공학 실험의 구조-활성 데이터를 기초로 개발된 실험적 역장(force field)이다 ([Guerois, et al., J. Mol. Biol. 320:369-387, 2002]; [Schymkowitz, et al., Nucleic Acids Res. 33:W382-388, 2005]; [Schymkowitz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:10147-10152, 2005]). Lys, Phe 또는 Leu → Cys의 단일 돌연변이가 있는 FIXa는 안정성 에너지가 23.3 내지 27.1 kcal/몰 범위이고, 평균 24.9 kcal/몰이다. 에너지 범위가 -2.82 내지 -0.39 kcal/몰이고 평균 -0.30 kcal/몰인 야생형 구조의 것과 비교하여, 돌연변이된 잔기가 단백질의 안정성에 기여하는 에너지 범위는 -0.76 내지 1.63 kcal/몰이고, 평균 0.56 kcal/몰이다. 시스테인으로의 돌연변이 후 자유 에너지에서의 감소를 초래하였거나 자유 에너지를 거의 변화시키지 않은 잔기가 더욱 바람직한 것으로 간주되었다. 자유 에너지에서의 증가 (덜 음성인 값)를 초래한 시스테인 돌연변이는 덜 바람직한 것으로 간주되었다.

응고 케스케이드에서 기능하기 위해, FIX 단백질은 FVIIIa와 상호작용하여야 한다. 따라서, FVIIIa와의 상호작용에 수반되지 않는 FIX의 잔기가 시스테인으로의 치환에 대한 좋은 후보인데, 이는 이러한 부위에서의 돌연변이 단독 또는 중합체 접합이 FVIIIa와의 상호작용을 방해하지 않을 것이기 때문이다. FIXa 구조 (1RFN), FVIIIa의 상동성 모델, 및 단백질-단백질 도킹(docking) 툴(tool)을 사용하여 FVIIIa - FIXa 복합체에 대한 모델들을 만들었다 ([Autin, et al., J. Thromb. Haemost. 3:2044-2056, 2005]). 10개의 대표적인 모델 중에서, 실험 데이터가 시사하는 모든 주요 접촉과의 일치를 기초로 2개의 복합체 (T4 및 T5)가 최상의 모델인 것으로 간주되었다. T5 모델이 이러한 분석에서 사용된 복합체이다. 이러한 모델을 기초로 FVIIIa와의 계면으로부터 8 Å보다 먼 것으로 예측되는 FIX의 잔기들이 바람직한 것으로 간주되었다. 환자에서 B형 혈우병을 초래하는 FIX에서의 천연 발생 치환 돌연변이 (그러나, 정지 코돈 또는 프레임 이동을 초래하는 돌연변이는 아님)는 이러한 특정 잔기들이 FIX의 기능에 중요함을 시사한다. B형 혈우병 돌연변이 데이터베이스 (kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.html에서 입수가능)를 사용하여, 표 1에 지시된 바와 같이 이같은 돌연변이들을 확인하고 이같은 잔기들을 시스테인으로의 돌연변이에 대한 후보로서 제외하였다.

상기 기술된 것과 동일한 분석 (용매 접근성, 자유 에너지에 대한 시스테인으로의 돌연변이의 효과, FVIII와의 계면에 대한 근접성 및 B형 혈우병 돌연변이)을 FIX- FVIIIa 복합체의 T5 모델을 사용하여 반복하였다. FIXa 구조 내에 단일 돌연변이 (Cys로 변화된 Lys, Phe, 또는 Leu)가 있는 T5 모델에 대해, 안정성 에너지 범위는 177.0 내지 180.9 kcal/몰이고, 평균 178.7 kcal/몰이다. 에너지 범위가 -2.90 내지 1.08 kcal/몰이고, 평균 0.55 kcal/몰인 야생형 구조와 비교하여, 돌연변이된 잔기가 기여하는 에너지 범위는 -0.76 내지 1.67 kcal/몰이고, 평균 0.55 kcal/몰이다. 일반적으로, 도킹된 복합체 내의 FIX에 대한 잔기들이 기여하는 에너지는 결합되지 않은 FIX의 것과 거의 유사하다. 또다른 용매 노출 잔기 (Lys, Phe, 또는 Leu가 아닌 잔기)에 대해, 안정성 에너지 범위는 169.7 내지 174.4 kcal/몰이고, 평균 170.8 kcal/몰이다. 돌연변이된 잔기가 기여하는 에너지 범위는 -0.57 내지 1.61 kcal/몰이고, 평균 0.99 kcal/몰이며, 이는 에너지 범위가 -0.63 내지 1.48 kcal/몰이고 평균 0.82 kcal/몰인 야생형 구조의 것과 유사하다.

중합체로의 부위-특이적 변형에 대한 가능한 후보 잔기를 선택하기 위해, 여러 인자들이 고려되었다. 잔기들의 공지된 및 예측된 기능적 중요성을 하기의 4가지 인자를 기초로 결정하였다: 1) 용매 접근성, 2) 폴드X 에너지, 3) B형 혈우병 돌연변이 데이터베이스 ([Hemophilia B mutation database, Kings College London, 2004])를 기초로 FIX 유전자에서 발생하는 돌연변이, 및 4) EGF2 도메인 (FIXa와 공동-결정화된 구조적 도메인이기 때문에 엄격할 수 있음) 및 FVIIIa (단백질-단백질 도킹에 의한 모델링)로부터 8 Å 이내인 잔기 내의 임의의 원자의 근접성. 0.5 kcal/몰 이하의 폴드X 에너지 차단값 및 100 Å2 이상의 용매 접근성 (ASA)이 고려되면, 2개의 Lys 잔기 (Lys201 및 Lys247)만이 적격일 것이다. 이러한 기준을 기초로 Phe 및 Leu 잔기는 적격이지 않을 것이다. 그러나, 1가지 또는 2가지 기준 (예를 들어, 또다른 도메인 계면에 대한 근접성 또는 폴드X 에너지)의 엄격한 문턱값이 변형되면, 추가적인 잔기, 예를 들어, Leu 414, Lys 188, 및 Lys 392가 적격일 것이다. 이들 중에서, Leu 414가 단백질의 카르복실 말단에 가깝게 있기 때문에 추가적으로 흥미로운 것으로 간주되었다. 유사하게, Lys, Phe 또는 Leu이 아닌 또다른 용매 노출 잔기들 중에서, 부위 특이적 변형에 대해 고려될 수 있는 가능한 후보가 있다 (예를 들어, Asp203, Asn249, Arg318).

실시예 2: 활성화 펩티드

번역후 변형을 파괴하지 않을 활성화 펩티드 내에서의 가능한 변형에 대한 부위를 확인하기 위해, 8가지 종으로부터의 활성화 펩티드의 아미노산 서열들을 정렬하여 진화적으로 보존된 영역을 확인하였다 (도 4). 종들 간에 보존되지 않은 아미노산은 번역후 변형이 포함되는 FIX 기능에 덜 요구될 것이고, 따라서 이들을 시스테인으로의 돌연변이에 선택하였다. 또한, 2개의 N-연결 글리코실화 부위 및 Tyr155에서의 타이로신 황산화, 뿐만 아니라 O-연결 글리코실화 및 인산화를 위한 부위를 위한 컨센서스(consensus) 서열의 일부분인 잔기들을 피하였다. 이러한 분석을 기초로, 4개의 아미노산 잔기 (V153, T163, L165, F175)가 시스테인으로의 돌연변이에 대해 선택되었다.

FIX의 부위 특이적 변형을 위한 추가적인 접근법으로서, 활성화 펩티드 내의 7개의 글리코실화 부위 중 4개 (T148, N167, T169, T172)가 시스테인으로 변환되어, 글리코실화 부위를 중합체 접합을 위한 가능한 부위로 변환시켰다. 이러한 글리코실화 부위들이 용매 노출되고 일반적으로 탄수화물로 변형되는 것을 고려하여, 더욱 중합체의 부착에 의한 변형이 이러한 부위에서 허용될 것이다.

다중 서열 정렬은 인간, 붉은털 원숭이, 돼지, 개 및 토끼 FIX에 비해 마우스, 래트, 및 기니피그에 잔기 A161과 E162 사이에 추가적인 아미노산이 있음을 드러냈다 (도 4). 이러한 추가적인 아미노산들은 3가지 종 간에 크기가 7개 내지 10개로 다양하고, Asp의 과잉 표시 및 어느 정도의 Ile 잔기를 함유한다. 이러한 관찰은 7개 내지 10개 사이의 추가적인 잔기가 FIX 활성에 대한 유의한 효과 없이 래트, 마우스, 및 기니피그에서 이러한 부위 (인간 FIX에서 A161과 E162 사이)에서 허용될 수 있다는 것을 실연한다. 8가지 종으로부터의 FIX 간의 다중 서열 정렬을 수행하기 위해 사용된 기준에 따라, 래트, 마우스, 및 기니피그에서의 추가적인 아미노산이 발견되는 명백한 위치는 이러한 부위가 인간 FIX의 E160과 A161 사이, A161과 E162 사이, E162와 T163 사이, 또는 T163과 I164 사이일 수 있도록 변할 수 있다. 따라서, 삽입된 시스테인이 변형된 폴리펩티드의 위치 162가 되도록 아미노산 161과 162 사이에 삽입된 단일 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 인간 FIX 폴리펩티드가 생성되었다.

실시예 3: 발현 및 활성

상기 기술된 인 실리코 분석을 기초로, 총 14개의 잔기가 변형을 위한 가능한 부위로 선택되었고, 14개의 잔기 모두가 발현 벡터 pAGE16 내로 클로닝된 인간 FIX 코딩 영역을 함유하는 플라스미드 pAGE16-FIX의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 시스테인으로 변화되었다 (도 3). 162C 뮤테인이 생성되도록 단일 시스테인 잔기가 A161과 E162 사이에 삽입된 추가적인 FIX 뮤테인이 생성되었다. 컨센서스 코작(Kozak) 서열이 모든 플라스미드에서 ATG 개시 코돈의 바로 5'에 부가되어, 효율적인 번역 개시를 확실하게 하였다. 변경된 FIX 코딩 서열의 서열을 전체 코딩 영역의 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 확증하였다. 야생형 pAGE16-FIX 플라스미드 및 다양한 돌연변이된 플라스미드를 HEK293 세포와 B 세포 림프종의 융합에 의해 생성된 인간 세포주인 HKB11 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 야생형 FIX를 발현하는 다양한 세포주 (CHO, BHK21, HKB11)의 능력을 pAGE16-FIX 플라스미드의 일시적인 형질감염 후에 테스트했을 때, HKB11에서만 웨스턴 블롯에 의해 배지 내에 검출가능한 FIX 단백질이 생산되었다. FIX에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 형질감염된 HKB11 세포로부터의 배지의 웨스턴 블롯 분석은 14개의 치환 뮤테인 모두가 측정가능한 수준으로 발현되고 배지 내로 분비되었음을 실연하였다 (도 1). 동일한 배지를 FIX 응고 활성에 대해 aPTT 분석법에 의해 분석하였고, FIX 단백질 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 각각의 뮤테인의 비활성을 ELISA 및 aPTT 분석법 데이터로부터 계산하였다. 각각의 치환 뮤테인에 대한 FIX 활성, 발현, 및 비활성 데이터가 야생형 FIX의 백분율로서 표현되는 3회 이상의 독립적인 실험으로부터의 평균값으로서 도 3에서 요약된다. 이와 동일한 데이터가 그래프 양식으로 도 2에서 제시된다.

발현 수준 및 비활성을 R338A 돌연변이를 포함하는 FIX 폴리펩티드 및 162C 및 R338A 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드에 대해 결정하였다. HKB11 세포를 변형된 FIX 폴리펩티드로 형질감염시키고, 단백질 수준 및 비활성을 결정하기 위해 상등액을 수집하였다. 162C 및 R338A 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드는 R338A 돌연변이만 포함하는 폴리펩티드에 비해 38％로 발현되었고, 83％의 비활성을 나타냈다. 데이터는 2회의 독립적인 형질감염의 평균을 나타낸다. R338A 단백질의 발현 수준은 실험들 간에 1.1 내지 3.9 ug/㎖로 변했고, R338A의 활성은 0.5 내지 0.33 IU/㎖ 사이에서 변했다.

실시예 4: R338A 및 V86A 돌연변이의 조합

야생형 (WT)-FIX 또는 FIX-R338A의 정황에서 부위 지정 돌연변이유발에 의해 FIX의 아미노산 V86이 알라닌으로 변화되었다. 이러한 구축물을 함유하는 발현 벡터들을 HKB11 세포 내로 형질감염시키고, 배지를 3일 후 수집하여, ELISA에 의해 FIX 단백질 수준에 대해, aPTT 분석법에 의해 FIX 응고 활성에 대해 분석하였다. 양쪽 뮤테인 모두 WT-FIX 및 FIX-R338A와 유사한 수준으로 발현되었다. 단일 실험으로부터의 데이터가 표 2에서 요약된다. 표 3에는 3회의 실험의 평균이 요약된다.

결과는 V86A 돌연변이 단독은 비활성에서의 약 1.8배 증가를 초래하는 한편, R338A 단독은 비활성에서의 4.5배 증가를 초래하였음을 나타낸다. R338A와 V86A의 조합은 야생형 FIX와 비교하여 비활성에서의 8.1배 증가를 초래하였다. 이러한 결과들은 R338A 및 V86A 돌연변이의 양성 효과가 부가적인 것보다 크고, WT-FIX에 비교하여 비활성이 8배 증가된 FIX 뮤테인을 초래한다는 것을 나타낸다. R338A-V86A 뮤테인은 8배 더 낮은 용량의 단백질이 현재 이용가능한 재조합 WT-FIX와 동일한 치료 효과를 달성하도록 할 것이기 때문에 B형 혈우병 환자에 대한 치료 이점이 개선될 수 있다. 또한, R338A-V86A의 증가된 비활성은 접합으로부터 활성 감소가 초래될 수 있는 중합체 접합체 형태의 FIX를 생성시키는 경우에 이로울 수 있다 .

실시예 5. 인간 FIX cDNA 의 클로닝

인간 FIX cDNA의 코딩 영역의 5' 및 3' 끝부분의 서열에 상보적인 한 쌍의 PCR 프라이머를 공개된 cDNA 서열 (NM_000133)로부터 디자인하였다. 5' 프라이머

, FIX의 시작 코돈은 볼드체)는 컨센서스 코작(Kozak) 서열 (밑줄) 및 HindIII 제한 부위가 선행하는 ATG 시작 코돈을 포함하는 FIX 코딩 영역의 최초의 18개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 3' 프라이머

는 HindIII 부위가 선행하는 FIX 코딩 영역의 끝부분의 45개 뉴클레오티드 3'에 있는 FIX 서열의 22개의 뉴클레오티드를 함유하였다. 이러한 프라이머들 및 고-충실도 프루프리딩(proofreading) 중합효소 (Invitrogen (Carlsbad, CA))를 사용한 정상인 간으로부터의 제1 가닥 cDNA (Stratagene (San Diego CA))의 증폭으로 인간 FIX cDNA에 대한 예상 크기 (1464 bp)의 단일 밴드가 생성되었다. HindIII로의 소화 후, PCR 생성물을 젤 정제하고 나서, 플라스미드 pAGE16의 HindIII 부위 내로 클로닝하였다. 벡터 내의 CMV 프로모터에 대해 전방향 배향으로 FIX cDNA가 삽입된 클론이 제한 소화에 의해 확인되었다. 여러 클론의 삽입물에 대해 이중 가닥 DNA 서열분석을 수행하였고, 공개된 FIX 서열에 대한 유래된 서열의 정렬은 cDNA가 성숙형 단백질의 아미노산 148에 트레오닌이 있는 인간 FIX를 코딩한다는 것을 나타냈다. 위치 148은 FIX의 통상적인 다형성인 T148/A148의 위치이고, 이는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 이러한 플라스미드를 pAGE16-FIX로 지정하였다.

실시예 6: FIX 시스테인 뮤테인의 생성

인간 FIX 서열 내의 다양한 아미노산이 시스테인으로의 돌연변이를 위해 선택되었다. 각각의 단일 아미노산 돌연변이를 위해, 한 쌍의 프라이머를 스트라타진(Stratagene)으로부터 입수가능한 퀵체인지(Quickchange)™ 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 디자인하였다. 이러한 프라이머들을 사용하여, 퀵체인지™ II XL 부위 지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene (San Diego, CA))를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 pAGE16-FIX 플라스미드 내에 돌연변이를 생성시켰다. 원하는 돌연변이를 함유하는 클론이 전체 FIX 코딩 영역의 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 하기의 표 4은 돌연변이를 생성시키는데 사용된 센스 가닥 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다.

실시예 7: PEG 화를 위한 시스테인의 삽입

시스테인 잔기를 활성화 펩티드 내로 잔기 A161과 E162 사이에 삽입하기 위해, 프라이머 t8216c_g8218a 및 t8188c로의 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여, 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 Y155 및 I164에 SnaB1 및 XbaI에 대한 독특한 제한 부위가 생성되었다. 생성된 플라스미드를 SnaB1 및 XbaI로 소화시켜 잔기 V156 내지 I164에 상응하는 27 bp 단편을 제거한 후, 올리고뉴클레오티드 CF1 및 CR1 (표 5)의 어닐링에 의해 생성된 이중 가닥 단편에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드의 서열은 1개의 시스테인 잔기를 코딩하는 3 bp의 삽입이 있는 것으로 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 결정되었다. 적합한 프라이머들을 디자인함으로써 E160과 A161 사이에 또는 E160과 I164 사이의 임의의 곳에서 1개 내지 5개 사이의 시스테인을 함유하는 아미노산 12개까지의 더 긴 서열이 삽입된다. 시스테인에 더하여, 삽입된 잔기는 Ala, Gly, Ser, Asp, 및 Ile 잔기의 조합으로 구성될 수 있고, 인 실리코 분석에 의해 예측되는 바와 같은 고친화력 T 세포 에피토프를 피하도록 디자인될 수 있다.

실시예 8. FIX 의 시스테인 뮤테인과 R338A 의 조합

벡터 pAGE16 내에 각각의 FIX의 시스테인 돌연변이체를 보유하는 플라스미드들이 성숙형 FIX 단백질의 아미노산 위치 338의 아르기닌을 코딩하는 서열을 알라닌을 코딩하는 서열로 변경시키도록 디자인된 프라이머들을 사용하는 부위 지정 돌연변이유발을 위한 주형으로서 사용되었다. 프라이머들의 서열은 하기와 같았다: 전방향 프라이머;

, 역방향 프라이머;

. 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 아르기닌 코돈 (CGA)을 알라닌 (GCA)으로 변경시키는 야생형 FIX 서열로부터의 변화를 가리킨다. 이러한 돌연변이의 생성이 전체 FIX 코딩 영역의 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 확증되었다.

실시예 9. 세포 배양 및 일시적인 형질감염

HKB11 세포 (HEK293 및 버킷(Burkitt) B세포 림프종 세포주 2B8의 하이브리드)를 10 ng/㎖ 가용성 비타민 K₃ (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))가 보충된 무혈청 배지 (RF#277) 내에서 37℃의 CO₂ (5％) 인큐베이터 내의 궤도형 진탕기 (100-125 rpm) 상에서 현탁 배양으로 성장시키고, 0.25 내지 1.5×10⁶개의 세포/㎖의 밀도로 유지시켰다.

형질감염용 세포를 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 수집한 후, 프리스타일(FreeStyle)™ 293 발현 배지 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내에 1.1×10⁶개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포를 6웰 플레이트에 파종하고 (4.6 ㎖/웰), 37℃ CO₂ 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대해, 5 ㎍ 플라스미드 DNA를 0.2 ㎖ Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen)와 혼합하였다. 각각의 웰에 대해, 7 ㎕ 293펙틴(fectin)™ 시약 (Invitrogen)을 0.2 ㎖ Opti-MEM® I 배지와 서서히 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 293펙틴™을 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 서서히 혼합하고, 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션한 후, 5×10⁶개 (4.6 ㎖)의 HKB11 세포가 파종되어 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 그후, 세포를 37℃의 CO₂ 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 3일 동안 인큐베이션하고 나서, 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고, 상등액을 수집하고, 4℃에서 보관하였다.

실시예 10. FIX 시스테인 뮤테인의 발현 및 정제

FIX-R338A/L414C (338의 아르기닌이 알라닌으로 치환되고 위치 414의 류신이 시스테인으로 치환된 인간 FIX) 또는 FIX-R338A/162C (338의 아르기닌이 알라닌으로 치환되고 시스테인 잔기가 서열 1에 제시된 서열의 아미노산 161과 162 사이에 삽입된 인간 FIX)를 코딩하는 포유류 발현 벡터를 HKB11 세포 내로 형질감염시키고, 안정적인 클론을 하이그로마이신으로의 선별에 의해 수득하였다. FIX 단백질을 이러한 세포들의 컨디셔닝 배지로부터 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다.

실시예 11. PEG 화 및 정제

PEG화 반응을 R338A-L414C, R338A-162C 상에서, 그리고 병행하여 비-특이적 PEG화에 대한 대조군으로서의 R338A 상에서 수행하였다. 2 M CaCl₂ 모액을 10 mM CaCl₂의 최종 농도에 도달하도록 각각의 FIX 단백질에 첨가하였다. 500 ㎕의 단백질 용액에 60 ㎕ 10× 반응 완충제 (500 mM HEPES, pH 7.0, 1M NaCl, 100 mM CaCl₂), 6 ㎕ 100× 산화된 글루타티온 (GSSG)/환원된 글루타티온 (GSH) (5 mM GSH, 0.2 mM GSSG), 20 ㎕ 글루타레독신 (Grx2) (0.149 mg/㎖) 및 14 ㎕ 물을 첨가하여 최종 부피가 600 ㎕이도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 스핀(Spin)-6 이온 교환 칼럼 (Bio-Rad (Hercules, CA)) (10× 반응 완충제로 예비-평형화됨)에 통과시켜 GSSG/GSH를 제거하였다. 그후, 혼합물을 4℃에서 하룻밤 동안 유지시키고 나서 100 ㎕ 1× 반응 완충제 내의 25 mg PEG-말레이미드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 추가적인 정제 및 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다.

PEG화 FIX를 2가지 방법 중 하나를 사용하여 반응 혼합물로부터 정제하였다. 방법 I에서는, L414C-PEG 반응 혼합물을 5 kD의 MW 차단값으로 투석 카셋트 (Pierce (Rockford, IL))를 사용하여 완충제 A (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl)에 대해 하룻밤 동안 4℃에서 투석하였다. 완충제 A로의 샘플 로딩 및 세정, 및 0.5 ㎖/분 속도의 완충제 B (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 20 mM CaCl₂)로의 용출을 사용하여 1 ㎖ HiTrapQ™ HP 칼럼 (GE Healthcare (Piscataway, NJ)) 상에서 단백질을 정제하였다. 젤 분석은 미반응 PEG-말레이미드는 칼럼으로부터 세정되어 제거되는 한편 PEG화 및 비-PEG화 R338A-L414C는 용출물 내에 있었음을 나타냈다. 방법 II를 위해, R338A-162C-PEG 반응 혼합물을 완충제 C (25 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl)로 4배 희석한 후, 1 ㎖ HiTrapQ™ 헤파린 HP 칼럼 (GE Healthcare (Piscataway, NJ)) 상에 로딩하였다 (로딩 속도 0.2 ㎖/분). 급격한 구배 (1분 내에 100％ D, 세정 및 용출 속도 0.5 ㎖/분)를 사용하여, 칼럼을 완충제 C로 세정하였고, PEG화 및 비-PEG화 R338A-L414C를 완충제 D (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 600 mM NaCl, 20 mM CaCl₂)로 용출시켰다. 분획 (유출물, 세정물, 피크-1, 및 피크-2)를 수집하였고, 센트리콘®-10 kD (Millipore (Billerica, MA)) 상에서 농축하고, 젤 상에서 분석하였다. 유리 PEG는 헤파린 칼럼에 결합하지 않았고, PEG화 및 비-PEG화 R338A-L414C는 칼럼이 제공하는 적합한 칼슘 구배 조건 상에서 분리될 수 있었음이 발견되었다.

HKB11 세포에서 발현된 정제된 R338A-L414C 및 R338A-162C 단백질은 인간 FIX 결핍 혈장에서의 aPTT 분석법에서의 활성 및 단백질 농도 (OD280)로부터 결정 시 비활성이 600 내지 1,000 IU/㎎ 사이였다.

R338A-L414C의 PEG화 및 Q-세파로스™ (GE Healthcare (Piscataway, NJ)) 상에서의 정제 후, 유출물 및 용출물을 단백질 검출을 위한 쿠마시 염색 및 은 염색, 및 PEG 검출을 위한 요오드 염색으로 젤 전기 영동에 의해 분석하였다 (도 5). FIX 단백질 (PEG화 및 비-PEG화 양쪽 모두)은 칼럼에 결합된 한편, 유리 PEG는 유출물 내에 있었다. 그후, 결합된 FIX 단백질을 20 mM CaCl₂를 함유하는 완충제로 용출시켰다. 결과는 R338A-L414C에서는 414 위치의 도입된 시스테인에서의 PEG의 부위 특이적 부착을 가리키는, 요오드로 염색된 겉보기 분자량 250 KDa의 고분자량 단백질 밴드가 생성되었지만 R338A에서는 그렇지 않았음을 나타냈다.

R338A-162C의 PEG화 및 헤파린 칼럼 상에서의 정제 후, 칼럼에 결합된 FIX 단백질은 2개의 피크 (피크 1 및 피크 2) 내에 용출된 한편, 유리 PEG는 칼럼에 결합하지 않았다. 이러한 2개의 피크는 PEG화 및 비-PEG화 R338A-162C에 각각 상응한다. 피크-1 내의 단백질 (FIX-R338A-162C-PEG) 및 피크-2 내의 단백질 (FIX-R338A-162C) 양쪽 모두를 이들의 활성에 대해 aPTT 분석법에서 분석하였다. 항-FIX 폴리클로날 항체를 사용하여 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 단백질 질량에 대한 aPTT 유닛의 비율을 결정함으로써 비활성이 계산되었다. FIX-R338A-162C에 대한 비활성은 440±60 IU/㎎이었다. FIX-R338A-162C-PEG에 대해서는, ELISA를 기초로 하는 비활성이 400 IU/㎎이었지만, ELISA 값이 칼럼 상의 피크 크기와 잘 상관되지 않았고, 이는 ELISA에서 사용된 항체가 PEG화 단백질에 잘 결합하지 않았고, 따라서 단백질 질량이 과소평가되었음을 시사한다. 피크 면적을 기초로, FIX-R338A-162C-PEG의 비활성은 120 IU/㎎로 추정되었고, 이는 R338A-162C의 PEG화가 분자의 비활성을 약 70％만큼 감소시켰음을 시사한다. 그러나, PEG화 R338A-162C의 비활성은 분자의 촉매 활성을 증가시키는 R338A 돌연변이의 존재로 인해 여전히 혈장-유래 FIX (비활성 약 200 IU/㎎)의 약 60％이다. 따라서, R338A FIX 뮤테인의 증가된 비활성이 촉매 활성에 대한 PEG화의 유해한 효과를 극복하도록 돕는다.

실시예 12: FIX 에 대한 웨스턴 블롯

세포 배양 상등액 (50 ㎕)을 20 ㎕ 4× SDS-PAGE 로딩 염료와 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, NuPAGE® 4-12％ SDS PAGE 젤 상에 로딩한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5％ 분유로 30분 동안 차단한 후, 막을 인간 FIX에 대한 HRP-표지 염소 폴리클로날 항체 (US Biological (Swampscott, Massachusetts), 카탈로그 번호 F0017-07B)와 함께 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 포스페이트-완충 염수 + 0.1％ 트윈®-20 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트) 완충제로 세정한 후, 수퍼시그널(SuperSignal)® 피코(Pico) (Pierce (Rockford, IL)) 및 x선 필름에의 노출을 사용하여 HRP로부터의 신호를 검출하였다.

실시예 13: FIX ELISA

세포 배양 상등액 내의 FIX 항원 수준을 FIX ELISA 키트 (Hyphen Biomed/Aniara (Mason, OH))를 사용하여 결정하였다. 표준 곡선의 범위 내의 신호를 달성하도록 세포 배양 상등액을 샘플 희석 완충제 (키트에서 공급됨)에서 희석하였다. 샘플 희석제 내에 희석된 인간 혈장으로부터 정제된 FIX 단백질 (Hyphen Biomed/Aniara, 카탈로그 번호 RK032A, 비활성 196 U/㎎)을 사용하여 100 ng/㎖ 내지 0.2 ng/㎖의 표준 곡선이 생성되었다. 희석된 샘플 및 표준물을 폴리클로날 항-FIX 포획 항체로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 폴리클로날 검출 항체를 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 광범위하게 세정하고, 키트 제조사가 기술한 바와 같이 TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 사용하여 발색시키고, 신호를 450 nM에서 스펙트라맥스(SpectraMax)® 플레이트 판독기 (Molecular Devices (Sunnyvale, CA))를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 2-성분 플롯에 맞추고, 미지물의 값을 곡선으로부터 외삽하였다.

실시예 14: FIX 응고 분석법

일렉트라(Electra)™ 1800C 자동 응고 분석기 (Beckman Coulter (Fullerton, CA)) 상에서 실행된 FIX 결핍 인간 혈장에서의 aPTT 분석법을 사용하여 FIX 응고 활성을 결정하였다. 간략하게, 응고 희석제 내의 상등액 샘플의 3가지 희석물을 장치에 의해 생성시킨 후, 100 ㎕를 100 ㎕ FIX 결핍 혈장 (Aniara (Mason, OH)) 및 100 ㎕ 자동 aPTT 시약 (토끼 뇌 인지질 및 미분화 실리카 (bioMerieux, Inc. (Durham, NC))과 혼합하였다. 100 ㎕의 25 mM CaCl₂ 용액을 첨가한 후, 응괴 형성 시간을 기록하였다. ELISA 분석법에서 표준물로 사용된 동일한 정제된 인간 FIX (Hyphen Biomed/Aniara)의 단계 희석물을 사용하여 각각의 실행에 대해 표준 곡선이 생성되었다. 표준 곡선은 일상적으로 상관 계수가 0.95 이상인 직선이었고, 이를 사용하여 미지 샘플의 FIX 활성을 결정하였다.

상기 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 거명에 의해 본원에 포함된다. 기술된 본 발명의 방법의 다양한 변형 및 변동이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명이 특정 실시양태들과 관련하여 기술되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이같은 특정 실시양태들에 과도하게 한정되지 않아야 함을 이해하여야 한다. 실제로, 생화학 분야 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 상기 기술된 방식들의 다양한 변형이 하기의 청구항의 범주 내인 것으로 의도된다. 당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 또는 이를 단지 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물들은 하기의 청구항에 포함되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare LLC Brooks, Alan Murphy, John E. Seto, Marian Jiang, Xiaoqiao Kiewlich, David Patel, Chandra <120> SITE-DIRECTED MODIFICATION OF FACTOR IX <130> MSB-7323 <150> US 61/124,568 <151> 2008-04-16 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Tyr 405 410 415 1 Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu 5 10 15 Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30 Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp 50 55 60 65 Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn 70 75 80 Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln 85 90 95 Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu 100 105 110 Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro 115 120 125 Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg 130 135 140 145 Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala 150 155 160 Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp 165 170 175 Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro 180 185 190 Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser 195 200 205 Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr 210 215 220 225 Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr 230 235 240 Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His 245 250 255 Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu 260 265 270 Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys 275 280 285 Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly 290 295 300 305 Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu 310 315 320 Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu 325 330 335 Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe 340 345 350 His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His 355 360 365 Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp 370 375 380 385 Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val 390 395 400 Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer FIXF1 <400> 2 atcataagct tgccaccatg cagcgcgtga acatg 35 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer FIXR3 <400> 3 atcataagct tgattagtta gtgagaggcc ctg 33 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - 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T148C <400> 10 agctcacccg tgctgagtgt gtttttcctg atgtgg 36 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - V153C <400> 11 cccgtgctga gactgttttt cctgattgcg actatgtaaa ttctactga 49 <210> 12 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - T163C <400> 12 ctatgtaaat tctactgaag ctgaatgcat tttggataac atcactcaaa gc 52 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - L165C <400> 13 ctactgaagc tgaaaccatt tgcgataaca tcactcaaag cacc 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - N167C <400> 14 gaagctgaaa ccattttgga ttgcatcact caaagcaccc aatc 44 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - T169C <400> 15 gctgaaacca ttttggataa catctgtcaa agcacccaat catttaatga 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand Oligonucleotide Sequence - 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Claims

R338A 및 V86A로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이, 및 T148C, V153C, T163C, L165C, N167C, T169C, T172C, F175C, K201C, K247C, K413C, L414C 및 T415C로부터 선택된 1개 이상의 시스테인 치환을 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 돌연변이 R338A 및 V86A를 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1개 이상의 치환된 시스테인이 생체적합성 중합체에 접합된 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀산 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 다당류, 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 옥시드, 알킬-폴리에틸렌 옥시드, 비스폴리에틸렌 옥시드, 및 덱스트란으로부터 선택되는 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 폴리(알킬렌 글리콜)이 폴리에틸렌 글리콜인 제IX인자 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 선형 또는 분지형인 제IX인자 폴리펩티드.
제5항 또는 제6항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 공칭 평균 분자량이 3,000 돌턴 내지 150,000 돌턴 범위인 제IX인자 폴리펩티드.
제5항 또는 제6항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 공칭 평균 분자량이 5,000 돌턴 내지 85,000 돌턴 범위인 제IX인자 폴리펩티드.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체에 대한 접합이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 접합되지 않은 폴리펩티드에 비해 30％ 이상만큼 증가시키는 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 비활성이 폴리펩티드 1 ㎎ 당 100 유닛(unit) 이상인 제IX인자 폴리펩티드.
T169C, K201C, K247C 또는 L414C 치환을 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제11항에 있어서, R338A 및 V86A로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이를 더 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제11항 또는 제12항에 있어서, 돌연변이 R338A 및 V86A를 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 169, 201, 247 및 414로부터 선택된 시스테인 잔기가 생체적합성 중합체에 접합된 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제14항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀산 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 다당류, 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 옥시드, 알킬-폴리에틸렌 옥시드, 비스폴리에틸렌 옥시드, 및 덱스트란으로부터 선택되는 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제15항에 있어서, 폴리(알킬렌 글리콜)이 폴리에틸렌 글리콜인 제IX인자 폴리펩티드.
제15항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 선형 또는 분지형인 제IX인자 폴리펩티드.
제16항 또는 제17항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 공칭 평균 분자량이 3,000 돌턴 내지 150,000 돌턴 범위인 제IX인자 폴리펩티드.
제16항 또는 제17항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 공칭 평균 분자량이 5,000 돌턴 내지 85,000 돌턴 범위인 제IX인자 폴리펩티드.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체에 대한 접합이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 접합되지 않은 폴리펩티드에 비해 30％ 이상만큼 증가시키는 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 비활성이 폴리펩티드 1 ㎎ 당 100 유닛 이상인 제IX인자 폴리펩티드.
아미노산 잔기 160-164 사이에 도입된 1개 이상의 시스테인 아미노산을 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제22항에 있어서, 아미노산 잔기 160-161 사이, 아미노산 잔기 161-162 사이, 아미노산 잔기 162-163 사이, 및 아미노산 잔기 163-164 사이에 도입된 1개 내지 5개의 시스테인 아미노산을 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제22항 또는 제23항에 있어서, R338A 및 V86A로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이를 더 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제24항에 있어서, 돌연변이 R338A 및 V86A를 포함하는 제IX인자 폴리펩티드.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 치환된 시스테인이 생체적합성 중합체에 접합된 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제26항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀산 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 다당류, 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 옥시드, 알킬-폴리에틸렌 옥시드, 비스폴리에틸렌 옥시드, 및 덱스트란으로부터 선택되는 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 폴리(알킬렌 글리콜)이 폴리에틸렌 글리콜인 제IX인자 폴리펩티드.
제28항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 선형 또는 분지형인 제IX인자 폴리펩티드.
제28항 또는 제29항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 공칭 평균 분자량이 3,000 돌턴 내지 150,000 돌턴 범위인 제IX인자 폴리펩티드.
제28항 또는 제29항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 공칭 평균 분자량이 5,000 돌턴 내지 85,000 돌턴 범위인 제IX인자 폴리펩티드.
제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체에 대한 접합이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 접합되지 않은 폴리펩티드에 비해 30％ 이상만큼 증가시키는 것인 제IX인자 폴리펩티드.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 비활성이 폴리펩티드 1 ㎎ 당 100 유닛 이상인 제IX인자 폴리펩티드.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 제IX인자 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 제제.
B형 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 제34항의 제약 제제를 투여하는 단계를 포함하는, B형 혈우병을 치료하는 방법.
제35항에 있어서, 제약 제제를 정맥내, 피내, 근육내 또는 피하 투여하는 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열.
숙주 세포가 제IX인자 폴리펩티드를 발현하도록 하는 방식으로 제37항에 따른 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포.