CN116891534A - 向性修饰的重组病毒粒子和其用于将遗传物质靶向引入至人类细胞中的用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供通过特异性蛋白质:蛋白质结合对重定向重组病毒衣壳粒子的组合物和方法，所述特异性蛋白质:蛋白质结合对形成共价键，例如异肽键以在衣壳蛋白上显示靶向配体，其中所述靶向配体特异性结合在所关注的细胞上表达的细胞表面标记。

Description

向性修饰的重组病毒粒子和其用于将遗传物质靶向引入至人 类细胞中的用途
相关申请的交叉引用
本申请是申请号为201880054254.8、申请日为2018年6月27日、发明名称为“向性修饰的重组病毒粒子和其用于将遗传物质靶向引入至人类细胞中的用途”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为PCT/US2018/039878的国家阶段申请，该国际申请要求于2017年6月27日提交的美国临时申请序列号62/525,708的优先权和权益。
技术领域
本文的公开内容大体上涉及适用于将遗传物质靶向引入至细胞中的向性修饰的重组病毒粒子，和包括其的组合物。
背景技术
将基因递送至特定靶细胞中已成为用于潜在治疗多种慢性和遗传疾病的现代医学中最重要的技术之一。迄今为止，基因疗法的临床应用的进展受到缺乏理想基因递送媒剂的限制。为了实现成功治疗，基因递送媒剂必须能够转导靶细胞，同时避免转导非靶细胞。确切地说，当病毒的天然向性不满足所需的治疗靶组织或细胞类型时，需要重组病毒粒子，其中天然向性被消除或减弱且所需向性被成功地工程化。(Buchholz等人，)
近年来，已使用非包膜病毒(例如包括由无包膜(例如脂质双层)的病毒衣壳蛋白形成的衣壳的病毒)，如腺相关病毒(AAV)和腺病毒(Ad)，以及包膜病毒(例如衣壳被脂质双层包围的病毒)，如逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒实现载体开发的最大进展。基于AAV的载体已成为许多研究的焦点，因为AAV仅具有轻微免疫原性且能够在体内转导大范围的物种和组织而无毒性迹象。
AAV为小的、无包膜的单链DNA病毒。AAV基因组为4.7kb，且其特征在于两个反向末端重复序列(ITR)和两个分别编码Rep蛋白和Cap蛋白的开放阅读框。两个ITR为AAV复制和衣壳化所需的唯一顺式元件。Rep阅读框编码分子量为78kD、68kD、52kD和40kD的四种蛋白质。这些蛋白质主要用于调节AAV基因组的转录和复制。Cap阅读框编码分子量为83-85kD(VP 1)、72-73kD(VP2)和61-62kD(VP3)的三种结构(衣壳)病毒蛋白(VP)。AAV病毒粒子中超过80％的总蛋白包括VP3；在成熟病毒粒子中，以大致1:1:10的相对丰度发现VP1、VP2和VP3。在体外，三种蛋白质自发地组装成病毒粒子样结构，例如病毒衣壳。因此，看起来感染的细胞中的病毒衣壳形成独立于病毒DNA合成而进行(由Kotin等人(1994)《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》5:793综述)。
在所有已知AAV血清型中，AAV2可能是最充分表征的血清型，因为首先制得其感染性克隆。(Samulski等人(1982)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,79:2077-2081)。随后，也已确定了若干AAV血清型的全序列(参见例如Rutledge等人(1998)《病毒学杂志(J.Virol.)》,72:309-319；Gao等人(2005)《当今基因疗法(Curr.Gen.Ther.)》5(3)285-97；Chiorini等人(1997)《病毒学杂志》,71:6823-6833；S.Muramatsu等人,(1996)《病毒学(Virol.)》,221:208-217)。一般来说，所有AAV共用超过80％的鉴别核苷酸序列。
AAV是人类基因疗法的有前景的载体，因为不同于其它病毒载体，尚未显示AAV与任何已知人类疾病相关且一般不被视为致病性的。(Muzyczka等人(1992)《微生物学和免疫学的当前主题(Current Topics in Microbiology and Immunology)》,158:97-129)。此外，AAV以相对较低免疫原性安全地转导有丝分裂期后的组织，且尽管病毒可偶尔整合至宿主染色体中，但其极不频繁地整合至人类染色体19中的安全港基因座中，且仅当Rep蛋白以反式供应时才如此。AAV基因组在感染的细胞中快速循环和串联，且在感染的细胞中以稳定的游离型状态存在，以长期稳定地表达其有效负载。
多种病毒(包含AAV)经由病毒/配体:细胞/受体相互作用感染细胞，最终由感染的细胞引起病毒内吞。这种配体:受体相互作用是许多病毒载体研究的焦点，且可被操纵以将病毒的天然向性从天然地容许被野生型病毒感染的细胞重定向至非天然靶细胞，例如通过由靶细胞表达的受体。
理论上，朝向任何细胞表面蛋白或标记再靶向载体应导致感染，因为大部分细胞表面受体涉及内吞作用的途径，组成型(例如用于再循环)或配体诱导的(例如受体介导的)。这些受体集群在网格蛋白包覆的小窝中，通过网格蛋白包覆的囊泡进入细胞，穿过酸化内体，在所述内体中分选受体，且接着再循环至细胞表面，变为储存于细胞内，或在溶酶体中降解。因此，用于再靶向病毒载体的平台通常旨在消除病毒载体的天然向性且将病毒载体重定向至仅由或主要由靶细胞表达的受体或标记。使用病毒载体进行靶向基因疗法的许多进展可总结为病毒载体的非重组(非基因)或重组(基因)修饰，其引起病毒载体的天然向性的假型化、扩增和/或再靶向。(综述于Nicklin和Baker(2002)《当前基因疗法(Curr.Gene Ther.)》2:273-93；Verheiji和Rottier(2012)《病毒学发展(AdvancesVirol)》2012:1-15中)。
最受欢迎的方法是对病毒衣壳蛋白，且因此对病毒衣壳的表面进行重组基因修饰。另一方面，在间接重组方法中，病毒衣壳经异源“骨架”修饰，所述骨架接着连接至接附子。接附子结合至骨架和靶细胞两者。在直接重组靶向方法中，将靶向配体直接插入至病毒衣壳中或偶联至病毒衣壳，即，蛋白质病毒衣壳经修饰以表达异源配体。配体接着重定向(例如结合)优先或仅仅表达于靶细胞上的受体或标记。
每种方法具有优点和缺点。基因修饰病毒的能力需要维持衣壳的结构，且将靶向配体或骨架置于衣壳蛋白内将耐受并适当地显示靶向配体或骨架的位置。例如，引入至病毒蛋白中的靶向配体或骨架将必须满足尺寸限制以免干扰修饰的衣壳的结构，这使得以下成为可能：直接配体或骨架可能不会由衣壳恰当地呈现和/或限制可供用作靶向配体或骨架的天然存在的分子的谱。另外，直接插入至病毒衣壳中的靶向配体的使用不是模块化的，且必须针对每一目标重新工程化。虽然骨架平台在所用的接附子的灵活性和模块化性质中有利，但病毒粒子和接附子上的骨架以离子方式相互作用且保持两个独立的实体，且其相互作用的固有不稳定性可限制其在体内的效用。可能难以利用此类双组分系统实现最佳转导效率。
明显地，仍需要维持修饰的病毒结构的完整性，同时仍适用于将所关注的核酸靶向转移至多种靶细胞的病毒载体系统。
发明内容
本文描述一种病毒再靶向策略，其通过利用特异性结合对的第一成员和第二同源成员来解决先前再靶向策略中固有的问题，所述第一成员和第二同源成员特异性相互作用，以形成化学(优选地共价)键。当显示于衣壳蛋白上时，第一成员充当与第二同源成员融合的任何靶向配体的骨架，但在第一成员和第二同源成员结合后，形成异肽键，且重组病毒粒子充当单组分靶向载体。
本文提供重组病毒粒子(例如重组病毒衣壳蛋白、包括重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳和/或包括囊封所关注的核苷酸的重组病毒衣壳的重组病毒载体)，其经基因修饰以显示包括特异性结合对的第一成员(例如肽标签)的异源氨基酸序列，其中氨基酸序列的长度为小于50个氨基酸，且其中重组病毒衣壳/粒子蛋白展现减少至消除的天然向性。重组病毒衣壳蛋白/衣壳/载体的向性可在与特异性结合对的同源第二成员形成异肽键后恢复和/或重定向，所述同源第二成员与特异性结合靶细胞的靶向配体融合。此类结合产生显示靶向配体的重组病毒衣壳蛋白/衣壳/载体。当通过重组病毒衣壳/载体经由连接子和/或以有限量在病毒衣壳的表面上显示靶向配体时，转导效率和特异性出人意料地增强。本文提供此类病毒粒子、包括其的组合物以及制造和使用其的方法。
因此，本文描述包括可操作地连接(例如共价连接)于衣壳蛋白的肽标签的重组病毒衣壳蛋白，其中病毒衣壳蛋白衍生自感染真核细胞的病毒的衣壳基因，且其中肽标签为特异性结合对的第一成员，其与特异性结合对的第二同源成员形成异肽键。在一些实施例中，如本文所述的重组衣壳蛋白(其可衍生自感染真核细胞的病毒的衣壳基因，例如为感染真核细胞的病毒的基因修饰的衣壳蛋白)包括可操作地连接于衣壳蛋白的特异性结合对的第一成员(即，肽标签)，并且进一步包括特异性结合对的第二同源成员，其中特异性结合对的第一和第二成员由共价(异肽)键结合，例如衣壳蛋白包括可操作地连接于衣壳蛋白的第一成员，并且进一步包括与第一成员共价结合的特异性结合对的第二同源成员。在一些实施例中，如本文所述的重组衣壳蛋白(其可衍生自感染真核细胞的病毒的衣壳基因，例如为感染真核细胞的病毒的基因修饰的衣壳蛋白)包括可操作地连接于衣壳蛋白的特异性结合对的第一成员(即，肽标签)，并且进一步包括与靶向配体融合的特异性结合对的第二同源成员，其中特异性结合对的第一和第二成员由共价(异肽)键结合，例如衣壳蛋白包括可操作地连接于衣壳蛋白的特异性结合对的第一成员，并且进一步包括与第一成员共价结合的特异性结合对的第二同源成员，且其中特异性结合对的第二同源成员可操作地连接于靶向配体，其特异性结合靶细胞上的细胞表面标记(例如细胞表面低聚糖、细胞表面受体和/或细胞表面标记等)。本文还描述了包括重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳，和包括由本文所述的病毒衣壳囊封的所关注的核苷酸的病毒载体。还描述了包括本文所述的重组病毒粒子(例如重组病毒衣壳蛋白、重组病毒衣壳和/或重组病毒载体)的组合物、使用其靶向递送所关注的核苷酸的方法和其制备方法。
在一些实施例中，肽标签(特异性结合对的第一成员)通过第一或第二连接子，例如长度为至少一个氨基酸的氨基酸间隔子可操作地连接于衣壳蛋白(经其框内翻译、与其化学连接和/或由其显示)。在一些实施例中，肽标签(第一成员)由第一和/或第二连接子，例如第一和/或第二氨基酸间隔子侧接，所述间隔子中的每一个的长度为至少一个氨基酸。
在一些实施例中，第一和/或第二连接子不相同。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一或两个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个或三个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个或四个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸。在一些实施例中，第一和/或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个氨基酸。在一些实施例中，第一和或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。在一些实施例中，第一和或第二连接子的长度各自独立地为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸。
在一些实施例中，第一和第二连接子的序列和/或长度相同，且长度各自为一个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为一个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为两个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为三个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为四个氨基酸，例如连接子为GLSG(SEQ ID NO:40)。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为五个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为六个氨基酸，例如第一和第二连接子各自包括GLSGSG(SEQ ID NO:41)的序列。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为七个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为八个氨基酸，例如第一和第二连接子各自包括GLSGLSGS(SEQ ID NO:42)的序列。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为九个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为十个氨基酸，例如第一和第二连接子各自包括GLSGLSGLSG(SEQ ID NO:43)或GLSGGSGLSG(SEQ ID NO:44)的序列。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度相同，且长度各自为超过十个氨基酸。
一般来说，如本文所述的肽标签和任选地一个或多个连接子(例如肽标签本身或与一个或多个连接子的组合)的长度在5个氨基酸至约50个氨基酸之间。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为至少5个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为6个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为7个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为8个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为9个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为10个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为11个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为12个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为13个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为14个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为15个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为16个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为17个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为18个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为19个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为20个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为21个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为22个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为23个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为24个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为25个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为26个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为27个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为28个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为29个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为30个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为31个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为32个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为33个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为34个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为35个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为36个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为37个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为38个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为39个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为40个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为超过40个氨基酸。在一些实施例中，肽标签本身或与一个或多个连接子的组合的长度为不超过50个氨基酸。
一般来说，本文所述的重组病毒衣壳蛋白可衍生自非包膜病毒的衣壳基因，例如由经修饰以表达非包膜病毒的基因修饰的衣壳蛋白的cap基因编码，其中非包膜病毒感染人类细胞，或通常感染人类细胞的非包膜病毒(例如腺病毒、腺相关病毒等)的血清型。在一些实施例中，本文所述的重组病毒衣壳蛋白衍生自编码AAV的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白(或VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的部分)的AAV衣壳基因，例如由cap基因编码，所述基因经修饰以编码基因修饰的腺相关病毒(AAV)VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，例如选自由以下组成的群组的感染人类的AAV血清型的基因修饰的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV2或AAV9衣壳基因，其分别编码AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白或AAV9 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，例如由经修饰以分别编码基因修饰的AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白或基因修饰的AAV9 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV2或AAV9cap基因编码。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV6衣壳基因，例如由经修饰以编码基因修饰的AAV6VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV6cap基因编码，所述AAV6 VP1衣壳蛋白的野生型氨基酸序列对应地阐述为SEQ ID NO:51。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV2衣壳基因，例如由经修饰以编码基因修饰的AAV2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV2cap基因编码，所述AAV2 VP1衣壳蛋白的野生型氨基酸序列对应地阐述为SEQ ID NO:9。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV9衣壳基因，例如由经修饰以编码基因修饰的AAV9 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV9cap基因编码，所述AAV9 VP1衣壳蛋白的野生型氨基酸序列对应地阐述为SEQ ID NO:31。
在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自嵌合AAV衣壳基因(由其编码)，其中嵌合衣壳基因包括多个核酸序列，其中多个核酸序列中的每一个编码不同AAV血清型的衣壳蛋白的一部分，且其中多个核酸序列在一起编码嵌合AAV衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自嵌合AAV2衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自嵌合AAV6衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自嵌合AAV9衣壳基因。
一般来说，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白经修饰以包括肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)，所述肽标签任选地通过连接子可操作地连接于重组衣壳蛋白(例如插入至其中和/或由其显示)，使得分别相比于缺少肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子的参考衣壳蛋白或包括参考衣壳衣壳的衣壳，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子本身降低和/或消除重组衣壳蛋白或包括其的衣壳的天然向性。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于衣壳蛋白区域(例如插入至其中和/或由其显示)，所述衣壳蛋白区域涉及野生型参考衣壳蛋白的天然向性，例如涉及细胞靶向的衣壳蛋白区域。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子任选地通过连接子可操作地连接于Ad纤维蛋白的杵域(例如插入至其中和/或由其显示)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于Ad纤维蛋白的HI环(例如插入至其中和/或由其显示)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于AAV衣壳蛋白的暴露的可变环(例如插入至其中和/或由其显示)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于AAV2衣壳蛋白的暴露的可变环(例如插入至其中和/或由其显示)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于AAV9衣壳蛋白的暴露的可变环(例如插入至其中和/或由其显示)。
在一些实施例中，(i)病毒衣壳蛋白衍生自编码AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV2衣壳基因，且肽标签任选地通过连接子可操作地连接于AAV2 VP1衣壳蛋白的位置I453或I587(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸(例如插入至其中和/或由其显示)；(ii)病毒衣壳蛋白衍生自AAV6衣壳基因，且肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于AAV6 VP1衣壳蛋白的位置I585(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸(例如插入至其中和/或由其显示)；或(iii)病毒衣壳蛋白衍生自编码AAV9 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV9衣壳基因，且肽标签任选地通过连接子可操作地连接于AAV9 VP1衣壳的位置I453或I589(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸(例如插入至其中和/或由其显示)。
在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)任选地通过连接子可操作地连接于选自由以下组成的群组的位置的氨基酸：AAV2衣壳蛋白VP1的453、AAV2衣壳蛋白VP1的587、AAV6衣壳蛋白VP1的585、AAV9衣壳蛋白VP1的453和AAV9衣壳蛋白VP1的589(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)，例如在选自由以下组成的群组的位置与氨基酸的C端融合：AAV2衣壳蛋白VP1的453、AAV2衣壳蛋白VP1的587、AAV6衣壳蛋白VP1的585、AAV9衣壳蛋白VP1的453和AAV9衣壳蛋白VP1的589(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子紧接在AAV2衣壳蛋白VP1的位置453(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸之后插入(例如与其C端融合)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子紧接在AAV2衣壳蛋白VP1的位置587(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸之后插入(例如与其C端融合)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子紧接在AAV6衣壳蛋白VP1的位置585(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸之后插入(例如与其C端融合)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子紧接在AAV9衣壳蛋白VP1的位置453(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸之后插入(例如与其C端融合)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子紧接在AAV9衣壳蛋白VP1的位置589(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)处的氨基酸之后插入(例如与其C端融合)。在一些实施例中，肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子在AAV2 VP1衣壳蛋白的位置587与588之间(或由相同衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置，或感染人类的不同AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应氨基酸)插入和/或显示。
在一些实施例中，如本文所述的重组衣壳蛋白包括(第二且不同的)突变，其可为除了肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子外加的。在一些实施例中，(第二且不同的突变)包括将异源肽插入至衣壳蛋白中、用一个或多个异源氨基酸取代衣壳蛋白的一个或多个氨基酸、衣壳蛋白的一个或多个氨基酸的缺失或其组合。例如，在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可衍生自AAV2衣壳基因(例如为基因修饰的AAV2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白)，包括肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子，且可进一步包括突变，例如AAV2 VP1衣壳蛋白中的R585A和/或R588A突变(或由相同AAV2衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白中的对应突变)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV2衣壳基因，例如为基因修饰的AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，包括肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子，其紧接在AAV2 VP1蛋白的位置453处的氨基酸(或由AAV2衣壳基因编码的AAV2 VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置处的氨基酸)之后插入(例如与其C端融合)，并且进一步包括选自由R585A和/或R588A组成的群组的突变(或由相同AAV2衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白中的对应突变)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV2衣壳基因，例如为基因修饰的AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，包括肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子，其紧接在AAV2VP1蛋白的位置587处的氨基酸(或由相同AAV2衣壳基因编码的AAV2 VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置处的氨基酸)之后插入(例如与其C端融合)，并且进一步包括选自由以下组成的群组的突变：R585A、R588A和/或由相同AAV2衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白中的对应突变。
在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV9衣壳基因，例如为基因修饰的AAV9 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，包括肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子，其紧接在AAV9 VP1蛋白的位置453处的氨基酸(或由相同AAV9衣壳基因编码的AAV9VP2或VP3衣壳蛋白的对应位置处的氨基酸)之后插入(例如与其C端融合)，并且进一步包括W503A突变(或由相同AAV2衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白中的对应突变)。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV9衣壳基因，例如为基因修饰的AAV9 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，包括肽标签(蛋白质:蛋白质结合对的第一成员)和任选的连接子，其紧接在AAV9 VP1蛋白的位置589处的氨基酸(或由相同AAV9衣壳基因编码的AAV9 VP2和/或VP3衣壳蛋白的对应位置处的氨基酸)之后插入(例如与其C端融合)，并且进一步包括W503A突变(或由相同AAV2衣壳基因编码的VP2和/或VP3衣壳蛋白中的对应突变)。
在一些实施例中，蛋白质:蛋白质结合对可选自由以下组成的群组：SpyTag:SpyCatcher、SpyTag002:SpyCatcher002、SpyTag:KTag、Isopeptag:pilin-C和SnoopTag:SnoopCatcher。在一些实施例中，其中肽标签(第一成员)为SpyTag(或其生物活性部分)，且蛋白质(第二同源成员)为SpyCatcher(或其生物活性部分)。在一些实施例中，其中肽标签(第一成员)为SpyTag(或其生物活性部分)，且蛋白质(第二同源成员)为KTag(或其生物活性部分)。在一些实施例中，其中肽标签(第一成员)为KTag(或其生物活性部分)，且蛋白质(第二同源成员)为SpyTag(或其生物活性部分)。在一些实施例中，其中肽标签(第一成员)为SnoopTag(或其生物活性部分)，且蛋白质(第二同源成员)为SnoopCatcher(或其生物活性部分)。在一些实施例中，其中肽标签(第一成员)为Isopeptag(或其生物活性部分)，且蛋白质(第二同源成员)为Pilin-C(或其生物活性部分)。在一些实施例中，其中肽标签(第一成员)为SpyTag002(或其生物活性部分)，且蛋白质(第二同源成员)为SpyCatcher002(或其生物活性部分)。
在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白包括SpyTag。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的重组病毒载体和/或包括重组病毒衣壳或病毒载体的组合物包括阐述为表1中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列作为重组病毒衣壳蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ IDNO:23的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所述的重组病毒衣壳蛋白包括与特异性结合对的第二同源蛋白成员共价结合的特异性结合对的第一成员(例如肽标签)。在一些实施例中，本文所述的重组病毒衣壳蛋白包括与接附子多肽共价结合的肽标签(第一成员)，所述接附子多肽包括可操作地连接于靶向配体的同源蛋白(第二成员)。在一些实施例中，靶向配体可操作地连接于蛋白质(第二成员)，例如与蛋白质融合，任选地通过连接子。一般来说，靶向配体可为结合部分，例如天然配体、抗体、多特异性结合分子等。在一些实施例中，靶向配体为抗体或其部分。在一些实施例中，靶向配体为包括结合靶细胞上的细胞表面蛋白的可变域和重链恒定域的抗体。在一些实施例中，靶向配体为包括结合靶细胞上的细胞表面蛋白的可变域和IgG重链恒定域的抗体。在一些实施例中，靶向配体为包括结合靶细胞上的细胞表面蛋白的可变域和IgG重链恒定域的抗体，其中IgG重链恒定域例如通过连接子可操作地连接于蛋白质(例如蛋白质:蛋白质结合对的第二成员)，所述蛋白质与肽标签形成异肽共价键。在一些实施例中，本文所述的重组衣壳蛋白包括可操作地连接于病毒衣壳蛋白的SpyTag，和与SpyTag共价连接的接附子多肽，所述接附子多肽包括与包括抗体可变域和IgG重链域的靶向配体连接的SpyCatcher，其中SpyCatcher和IgG重链域通过氨基酸连接子，例如GSGESG(SEQ ID NO:48)连接。在一些实施例中，接附子多肽包括阐述为SEQ ID NO:46的序列，其包括人类IgG4重链的一部分，所述IgG4部分具有阐述为SEQ ID NO:49的序列，通过连接子(SEQ ID NO:48)连接至SpyCatcher(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括与SpyCatcher共价连接的SpyTag，SpyCatcher与靶向配体融合。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为表1中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列(作为编码重组病毒衣壳蛋白质)，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括有包括阐述为SEQ IDNO:13的氨基酸序列的重组病毒衣壳，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和包括阐述为SEQID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:27的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ IDNO:37的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多肽接附子。
一般来说，靶向配体特异性结合在哺乳动物(例如人类)真核细胞，例如靶细胞的表面上表达的细胞表面分子，例如低聚糖、受体、细胞表面标记等。在一些实施例中，靶向配体结合(人类)肝细胞、(人类)脑细胞、(人类)T细胞、(人类)肾细胞、(人类)肠细胞、(人类)肺细胞、(人类)癌细胞或经异源病原体感染的(人类)细胞。
在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)肝细胞表达的受体，例如脱唾液酸糖蛋白受体，例如hASGR1。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)神经元细胞表达的分子，例如GABA、转铁蛋白等。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)T细胞表达的分子，例如CD3，例如CD3ε。在一些实施例中，靶向配体结合CD63。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)造血干细胞表达的分子，例如CD34。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)肾细胞表达的分子。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)肌细胞表达的分子，例如整合素。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)癌细胞表达的分子，例如肿瘤相关抗原，例如亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、α-胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延长因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、E6、E7、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pme117、GPNMB、HAUS3、第二型穿膜丝氨酸蛋白酶(Hepsin)、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠道羧基酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(也称为CCDC110)、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳房珠蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、I类肌球蛋白、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、分离蛋白1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、存活素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-lb/GAGED2a、Kras、NY-ESO1、MAGE-A3、HPV E2、HPV E6、HPVE7、WT-1抗原(在淋巴瘤和其它实体肿瘤中)、ErbB受体、Melan A[MART1]、gp 100、酪氨酸酶、TRP-1/gp 75和TRP-2(在黑素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱癌、头颈癌和非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在宫颈癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中)；前列腺特异性抗原[PSA](在前列腺癌中)；癌胚抗原[CEA](在结肠癌、乳腺癌和胃肠癌中)，以及例如以下的共有肿瘤特异性抗原：MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3TO 7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、TRP2-INT2等。在一些实施例中，靶向配体结合E6和/或E7。在一些实施例中，靶向配体结合Her2。在一些实施例中，靶向配体结合CD63。在一些实施例中，靶向配体结合人类胰高血糖素受体(hGCGR)。在一些实施例中，再靶向配体结合人类外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(hENTPD3)。
一般来说，包括本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳不能在不存在靶向配体的情况下感染靶细胞，例如可操作地连接于靶向配体的第二成员。一般来说，在不存在适当靶向配体的情况下，包括如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳相比于参考病毒衣壳具有减少至消除的天然向性，例如靶向和结合天然地容许转导的参考细胞的能力减弱或不能够靶向和结合所述参考细胞，所述参考病毒衣壳为例如包括参考病毒衣壳蛋白，例如野生型对照病毒衣壳蛋白或除了缺少靶向配体，和任选地蛋白质:蛋白质结合对的一个或两个成员之外将与重组病毒衣壳蛋白相同的病毒衣壳蛋白的衣壳。在一些实施例中，相比于对照野生型病毒衣壳蛋白，包括SpyTag的重组病毒衣壳蛋白的转导效率减少或消除。
在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少10％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少20％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少30％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少40％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少50％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少60％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少70％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少75％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少80％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少85％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少90％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少95％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，相比于例如在表1中列出的对照野生型病毒衣壳，包括本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现至少99％的转导效率降低。在一些实施例中且在不存在适当靶向配体的情况下，对照细胞通过包括如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳的转导被消除，例如不可检测，例如通过测量所关注的核苷酸的表达的方法，例如报告子分析等不可检测。
相反，包括有包括与适当接附子多肽，例如可操作地连接于靶向配体的同源蛋白共价连接的肽标签的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳能够感染靶细胞，例如相比于参考病毒衣壳，例如包括参考病毒衣壳蛋白，例如野生型对照病毒衣壳蛋白的衣壳，具有部分或完全恢复的靶向和结合天然地容许转导的参考细胞的能力。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少10％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少20％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少30％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少40％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少50％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少60％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少70％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少75％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少80％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少85％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少90％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少95％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率为例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳的转导效率的至少99％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现与例如在表1中列出的适当对照野生型病毒衣壳相同的转导效率。
类似地，包括有包括与适当接附子多肽，例如可操作地连接于靶向配体的同源蛋白共价连接的肽标签的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳能够感染靶细胞，例如相比于参考病毒衣壳具有增强的靶向和结合天然地容许转导的参考细胞的能力，所述参考病毒衣壳与重组病毒衣壳蛋白相同，除了其缺少蛋白质:蛋白质结合对的一个或两个成员，例如包括参考衣壳蛋白。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大10％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大20％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大30％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大40％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大50％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大60％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大70％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大75％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大80％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大85％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大90％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大95％。在一些实施例中，包括与适当接附子多肽共价结合的本文所述(例如在表1中列出)的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳展现的转导效率比例如在表1中列出的适当对照参考病毒衣壳的转导效率大99％。
在一些实施例中，包括如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳为嵌合衣壳，例如包括至少两组VP1、VP2和/或VP3蛋白，其中的每一组由不同cap基因编码，例如包括呈某一比率的包括肽标签的重组病毒衣壳蛋白和不含肽标签的参考衣壳蛋白。在一些实施例中，参考衣壳蛋白为野生型参考衣壳蛋白，因为其包括与重组病毒衣壳蛋白具有相同血清型的野生型衣壳蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，参考衣壳蛋白为对照参考衣壳蛋白，因为其包括重组病毒衣壳蛋白的氨基酸序列，除了对照参考衣壳蛋白缺乏肽标签。在一些实施例中，参考衣壳蛋白为突变野生型参考蛋白，因为其包括与野生型衣壳蛋白基本上相同的氨基酸序列，所述野生型衣壳蛋白具有与重组病毒衣壳蛋白相同的血清型，除了降低野生型衣壳蛋白的向性的突变(例如氨基酸序列的缺失、氨基酸序列的插入、嵌合等)。在一些实施例中，本文所述的组合物包括，或本文所述的方法组合比率在1:1至1:15范围内的重组病毒衣壳蛋白与参考衣壳蛋白。在一些实施例中，比率为1:2。在一些实施例中，比率为1:3。在一些实施例中，比率为1:4。在一些实施例中，比率为1:5。在一些实施例中，比率为1:6。在一些实施例中，比率为1:7。在一些实施例中，比率为1:8。在一些实施例中，比率为1:9。在一些实施例中，比率为1:10。在一些实施例中，比率为1:11。在一些实施例中，比率为1:12。在一些实施例中，比率为1:13。在一些实施例中，比率为1:14。在一些实施例中，比率为1:15。
在一些实施例中，本文所述的组合物包括，或本文所述的方法组合比率(重组衣壳蛋白:参考衣壳蛋白)在1:1至1:15范围内的在表1中列出的重组病毒衣壳蛋白与也在表1中列出的其适当参考衣壳蛋白(或其参考衣壳蛋白的组合)。在一些实施例中，比率为1:2。在一些实施例中，比率为1:3。在一些实施例中，比率为1:4。在一些实施例中，比率为1:5。在一些实施例中，比率为1:6。在一些实施例中，比率为1:7。在一些实施例中，比率为1:8。在一些实施例中，比率为1:9。在一些实施例中，比率为1:10。在一些实施例中，比率为1:11。在一些实施例中，比率为1:12。在一些实施例中，比率为1:13。在一些实施例中，比率为1:14。在一些实施例中，比率为1:15。
表1提供阐述以下各者的氨基酸序列的序列识别号(SEQ ID NO)：(1)例示性和非限制性的包括本文所述的肽标签的重组病毒衣壳蛋白，(2)对应的对照(C)野生型病毒衣壳蛋白的例示性和非限制性实例，所述野生型病毒衣壳蛋白可任选地用作测定包括共价蛋白标签的重组衣壳蛋白在不存在靶向载体的情况下减少或消除的转导效率的参考物，和(3)对应的参考病毒衣壳蛋白的例示性和非限制性实例，所述参考病毒衣壳蛋白用于产生嵌合衣壳和/或用作测定包括蛋白质:蛋白质结合对和靶向配体的重组衣壳蛋白的转导效率恢复的参考物。
表1
一般来说，如本文所述的重组病毒载体包括有包括如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳，包含嵌合病毒衣壳，其中病毒衣壳囊封所关注的核苷酸。在一些实施例中，所关注的核苷酸在选自由以下组成的群组的启动子的控制下：病毒启动子、细菌启动子、哺乳动物启动子、禽类启动子、鱼类启动子、昆虫启动子和其任何组合。在一些实施例中，所关注的核苷酸在非人类启动子的控制下。在一些实施例中，启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施例中，启动子为EF1α启动子。在一些实施例中，启动子为CAGG启动子。在一些实施例中，启动子为泛素C(UbC)启动子。
一般来说，所关注的核苷酸可为一种或多种基因，其可编码可检测标记，例如报告子，或治疗性多肽。在一些实施例中，所关注的核苷酸为报告基因。在一些实施例中，所关注的核苷酸为编码选自由以下组成的群组的可检测标记的报告基因：绿色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶等。在一些实施例中，可检测标记为绿色荧光蛋白。在其它实施例中，所关注的核苷酸选自由以下组成的群组：自杀基因、编码抗体或其片段的核苷酸、编码CRISPR/Cas系统或其部分的核苷酸、编码反义RNA的核苷酸、编码siRNA的核苷酸、分泌酶、编码治疗蛋白的基因等。在一个实施例中，所关注的核苷酸编码多域治疗剂，例如包括至少两个提供两种相异功能的域的蛋白质。
本文所述的组合物一般包括有包括如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的病毒载体，例如包括有包括重组病毒衣壳蛋白的衣壳(包含嵌合衣壳)，其中衣壳囊封所关注的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的组合物包括(1)具有包括本文所述的重组病毒衣壳蛋白的衣壳的病毒载体，和(2))药学上可接受的载体。
本文还描述制备和使用重组病毒衣壳蛋白、包括其的病毒载体、组合物等的方法。在一些实施例中，重定向病毒，例如腺病毒、腺相关病毒等；将诊断/治疗货物递送至靶细胞等的方法包括使靶细胞(其可在体外或在体内，例如在人体中)与包括如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的重组病毒载体接触，其中病毒衣壳或病毒载体包括特异性结合在靶细胞表面上表达的蛋白质的靶向配体。此类方法可包含以下作为第一步骤：产生重组病毒载体，例如在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中包装细胞包括质粒，所述质粒在不存在或存在编码参考衣壳蛋白的质粒的情况下编码包括肽标签(第一成员)的衣壳蛋白，将重组衣壳蛋白与可操作地连接于靶向配体的第二同源成员一起培育等。在一些实施例中，靶细胞为(人类)肝细胞，且(嵌合)重组病毒载体包括特异性结合脱唾液酸糖蛋白受体，例如(h)ASGR1的靶向配体。在一些实施例中，靶细胞为(人类)神经元细胞，且(嵌合)重组病毒载体包括特异性结合GABA、转铁蛋白受体等的靶向配体。在一些实施例中，靶细胞为(人类)T细胞，且(嵌合)重组病毒载体包括特异性结合CD3，例如CD3ε的靶向配体。在一些实施例中，靶细胞为(人类)造血干细胞，且(嵌合)重组病毒载体包括特异性结合CD34的靶向配体。在一些实施例中，靶细胞为(人类)肾细胞。在一些实施例中，靶细胞为(人类)肌细胞，且(嵌合)重组病毒载体包括特异性结合整合素的靶向配体。在一些实施例中，靶细胞为(人类)癌细胞，且(嵌合)重组病毒载体包括特异性结合肿瘤相关抗原，例如E6和E7、Her2等的靶向配体。在一些实施例中，靶向配体结合人类胰高血糖素受体(hGCGR)。
本文还描述灭活病毒衣壳和/或产生病毒载体的方法，所述方法通常包括(a)将编码异源蛋白的核酸插入至编码病毒衣壳蛋白的核酸序列中，以形成核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包括肽标签的基因修饰的衣壳蛋白(在不存在或存在编码参考衣壳蛋白的质粒的情况下)，和/或(b)在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中包装细胞包括核苷酸序列。在一些实施例中，包装细胞进一步包括有包括所关注的核苷酸的辅助质粒和/或转移质粒。在一些实施例中，方法进一步包括从培养上清液分离自互补的腺相关病毒载体。在一些实施例中，方法进一步包括溶解包装细胞和将单链腺相关病毒载体与细胞溶解物分离。在一些实施例中，方法进一步包括(a)清除细胞碎片，(b)在MgCl2存在下用核酸酶(例如DNA酶I)处理含有病毒载体的上清液，(c)浓缩病毒载体，(d)纯化病毒载体，和(e)(a)-(d)的任何组合。本文还提供根据本文所述的方法制得的病毒载体，和适用于产生如本文所述的病毒载体的包装细胞，例如包括编码所述重组衣壳蛋白的质粒的包装细胞。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开案的副本。
图1提供获自荧光活化细胞分选(FACS)的散布图，FACS评估通过“未感染的”HER2阳性(+)293hErbB2或HER2阴性(-)293亲本细胞或被“AAV2 N587-SpyTag”粒子感染的细胞或被“AAV2 N587-SpyTag+C6.5-SpyC”粒子感染的细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达。两种病毒的衣壳均含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587(SEQ ID NO:13)之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:1)。C6.5-SpyC粒子通过SpyTag结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2scFv(C6.5)。病毒表达作为转导标记的GFP。
图2提供获自荧光活化细胞分选(FACS)的散布图，FACS评估通过“未感染的”HER2阳性(+)293hErbB2或HER2阴性(-)293亲本细胞或被“AAV2 N587-SpyTag”粒子感染的细胞或被“AAV2N587-SpyTag+SpyC-抗HER2”粒子感染的细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达。两种病毒的衣壳均含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587(SEQ ID NO:13)之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:1)。SpyC-抗HER2粒子通过SpyTag结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体病毒表达作为转导标记的GFP。
图3提供获自荧光活化细胞分选(FACS)的散布图，FACS评估通过被“AAV2野生型”粒子感染的HER2阳性(+)293hErbB2或HER2阴性(-)293亲本细胞或被“AAV2 G453-SpyTag+SpyC-抗HER2”粒子感染的细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达。“AAV2野生型”衣壳不具有突变或修饰(SEQ ID NO:9)，而“AAV2 G453-SpyTag”衣壳为由1:7比率的“SpyTag”衣壳蛋白(其中SpyTag直接插入在由10个氨基酸的连接子(SEQ ID NO:29)侧接的残基G453之后)和“AAV2HBM”衣壳(无SpyTag，但含有突变R585A和R588A(SEQ ID NO:11))构成的嵌合病毒粒子。AAV2 G453-SpyTag嵌合粒子通过SpyTag结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体病毒表达作为转导标记的GFP。
图4A提供使用B1抗体(其识别由AAV2 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白共用的线性表位)的蛋白质印迹，分析了与SpyCatcher融合的抗HER2 scFv“SpyC-抗HER2 scFv”与由具有以下突变的衣壳构成的一组AAV2病毒粒子之间的反应：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽，由不同长度的氨基酸连接子(连接子1、连接子2、连接子4、连接子6、连接子8和连接子10)(SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25)侧接。图4B提供在被由具有以下突变的衣壳构成的AAV2病毒粒子感染后5天，表达GFP的HER2+细胞的百分比(灰色，y轴)相对于表达GFP的HER2细胞的百分比(黑色，y轴)：R585A、delR588、和由指定长度的氨基酸连接子(连接子1、连接子2、连接子4、连接子6、连接子8和连接子10)(分别为SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23和25)侧接的N587-SpyTag(x轴)。AAV2 N587 SpyTag粒子结合至与SpyCatcher(SEQID NO:3)融合的抗HER2 scFv。
图5A提供使用B1抗体(其识别由AAV2 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白共用的线性表位)的蛋白质印迹，分析了与SpyCatcher融合的抗HER2抗体“SpyC-抗HER2抗体”与由具有以下突变的衣壳构成的一组AAV2病毒粒子之间的反应：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽，由不同长度的氨基酸连接子(无连接子、连接子1、连接子2、连接子4、连接子6、连接子8和连接子10)(分别为SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23和25)侧接。图5B提供在被由具有以下突变的衣壳构成的野生型(wt)AAV2粒子或AAV2病毒粒子感染后5天，表达GFP的HER2+细胞的百分比(灰色，y轴)相对于表达GFP的HER2细胞的百分比(黑色，y轴)：R585A、delR588、和由指定长度的氨基酸连接子(无连接子、连接子1、连接子2、连接子4、连接子6、连接子8和连接子10)(分别为SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23和25)侧接的N587-SpyTag(x轴)。AAV2 N587SpyTag粒子结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体
图6A提供使用B1抗体(其识别由AAV2 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白共用的线性表位)的蛋白质印迹，分析了与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2 scFv C6.5“SpyC-抗HER2scFv”与一组嵌合AAV2病毒粒子之间的反应，所述病毒粒子由含有突变R585A、delR588和N587-连接子10-SpyTag的“SpyTag”衣壳蛋白(SEQ ID NO:25)与含有突变R585A和R588A，但无SpyTag的“HBM”衣壳蛋白(SEQ ID NO:11)的混合物构成。“SpyTag”和“HBM”衣壳蛋白以不同比率(1:0、1:1和1:3)混合。图6B提供在用嵌合AAV2病毒粒子感染后5天(x轴)，表达GFP的HER2+293hErbB2细胞(灰色条)和HER2-293亲本细胞(黑色条)的百分比(y轴)，所述病毒粒子由含有突变R585A、delR588和N587-连接子10-SpyTag的“连接子10”衣壳蛋白(SEQ IDNO:25)与含有突变R585A和R588A，但无SpyTag的“HBM”衣壳蛋白(SEQ ID NO:11)的混合物构成。“连接子10”和“HBM”衣壳蛋白以不同比率(1:0、3:1、1:1和1:3)混合，且结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2 scFv。
图7A提供使用B1抗体(其识别由AAV2 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白共用的线性表位)的蛋白质印迹，分析了与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体“SpyC-抗HER2抗体”与一组嵌合AAV2病毒粒子之间的反应，所述病毒粒子由含有突变R585A、delR588和N587-连接子10-SpyTag的“SpyTag”衣壳蛋白(SEQ ID NO:25)与含有突变R585A和R588A，但无SpyTag的“HBM”衣壳蛋白(SEQ ID NO:11)的混合物构成。“SpyTag”和“HBM”衣壳蛋白以不同比率(1:0、3:1、1:1和1:3)混合。图7B提供在用嵌合AAV2病毒粒子感染后5天(x轴)，表达GFP的HER2+293hErbB2细胞(灰色条)和HER2-293亲本细胞(黑色条)的百分比(y轴)，所述病毒粒子由含有突变R585A、delR588和N587-连接子10-SpyTag的“连接子10”衣壳蛋白(SEQ ID NO:25)与含有突变R585A和R588A，但无SpyTag的“HBM”衣壳蛋白(SEQ ID NO:11)的混合物构成。“连接子10”和“HBM”衣壳蛋白以不同比率(1:0、3:1、1:1和1:3)混合，且结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体
图8A提供使用B1抗体(其识别由AAV2 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白共用的线性表位)的蛋白质印迹，分析了与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体“SpyC-抗HER2抗体”与一组嵌合AAV2病毒粒子之间的反应，所述病毒粒子由“SpyTag”衣壳蛋白与含有突变R585A和R588A，但无SpyTag的“HBM”衣壳蛋白(SEQ ID NO:11)的混合物构成。“SpyTag”衣壳蛋白包括“G453 SpyTag”，其含有突变R585A R588A和在残基G453之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:27)，和“G453连接子10SpyTag”，其含有突变R585A、R588A和在残基G453之后直接插入SpyTag肽和在两侧上由10个连接子氨基酸侧接(SEQ ID NO:29)。指示的“G453 SpyTag”和“G453连接子10SpyTag”衣壳与“HBM”衣壳以不同比率(1:0、1:3和1:7)混合。图8B提供在用野生型“wt”或嵌合AAV2病毒粒子感染后5天(x轴)，表达GFP的HER2+293hErbB2细胞(灰色条)和HER2-293亲本细胞(黑色条)的百分比(y轴)，所述病毒粒子由含有突变R585A、delR588和在残基G453之后直接插入SpyTag肽的“G453 SpyTag”衣壳蛋白(SEQ ID NO:27)，或含有突变R585A、R588A和在残基G453之后直接插入SpyTag肽且在两侧上由10个连接子氨基酸侧接的“G453连接子10SpyTag”衣壳蛋白(SEQ ID NO:29)，与含有突变R585A和R588A，但无SpyTag的“HBM”衣壳蛋白(SEQ ID NO:11)的混合物构成。“G453SpyTag”或“G453连接子10SpyTag”和“HBM”衣壳以不同比率(1:0“纯”、1:3和1:7)混合，且结合至与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体
图9提供获自荧光活化细胞分选(FACS)的散布图，FACS通过在用“AAV2 wt”粒子、“AAV2 SpyTag无抗体”粒子或“AAV2 SpyTag抗ASGR1”粒子感染之后，对ASGR1表达呈阳性(+)的细胞评估绿色荧光蛋白(GFP)表达。“AAV2 wt”衣壳为不具有突变或修饰的野生型(SEQ ID NO:9)，而“AAV2 SpyTag”衣壳含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:13)。“AAV2 SpyTag抗ASGR1”粒子结合至特异性结合ASGR1的SpyCatcher融合的抗体。还示出获自荧光活化细胞分选(FACS)的散布图，FACS通过在用“AAV2 wt”粒子、“AAV2 SpyTag无抗体”粒子或“AAV2 SpyTag抗CD63”粒子感染之后，对CD63表达呈阳性(+)的细胞评估绿色荧光蛋白(GFP)表达。“AAV2 wt”衣壳为不具有突变或修饰的野生型(SEQ ID NO:9)，而“AAV2 SpyTag”衣壳含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:13)。“AAV2 SpyTag抗CD63”粒子结合至特异性结合CD63的SpyCatcher融合的抗体。病毒表达作为转导标记的GFP。还示出获自荧光活化细胞分选(FACS)的散布图，FACS通过在用“AAV9 wt”粒子、“AAV2 SpyTag无关抗体”粒子或“AAV2SpyTag抗PTPRN”粒子感染之后，对PTPRN表达呈阳性(+)的细胞评估绿色荧光蛋白(GFP)表达。“AAV9 wt”衣壳为不具有突变或修饰的野生型(SEQ ID NO:31)，而“AAV2 SpyTag”衣壳为嵌合病毒粒子，其由1:7比率的“SpyTag”衣壳蛋白(其中SpyTag直接插入在由10个氨基酸连接子侧接的残基G453之后)(SEQ ID NO:29)与无SpyTag，但含有降低天然受体结合的在残基N587之后直接插入的Myc标签氨基酸序列的衣壳(SEQ ID NO:53)构成。“AAV2 SpyTag无关抗体”粒子结合至不结合PTPRN的SpyCatcher融合的抗体。“AAV2 SpyTag抗PTPRN”粒子结合至特异性结合PTPRN的SpyCatcher融合的抗体。病毒表达作为转导标记的GFP。还示出荧光素酶分析的结果，荧光素酶分析通过在用“AAV2 wt”粒子、“AAV2+无关mAb”粒子、“AAV2+抗ENTPD3”粒子和“AAV2+抗hCD20”粒子感染之后，对hENTPD3呈阳性(+)的细胞评估萤火虫荧光素酶表达。“AAV2 wt”衣壳为不具有突变或修饰的野生型(SEQ ID NO:9)，而“AAV2+抗体”衣壳含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:13)。“AAV2+无关mAb”粒子结合至不结合hENTPD3的SpyCatcher融合的抗体。“AAV2+抗hCD20”粒子结合至特异性结合hCD20的SpyCatcher融合的抗体，hCD20不表达于hENTPD3+细胞上且充当额外阴性对照。“AAV2+抗ENTPD3”粒子结合至特异性结合hENTPD3的SpyCatcher融合的抗体。病毒表达作为转导标记的萤火虫荧光素酶。还示出荧光素酶分析的结果，荧光素酶分析通过在用“AAV2 wt”粒子、“AAV2+无关mAb”粒子、“AAV2+抗ENTPD3”粒子和“AAV2+抗hCD20”粒子感染之后，对hCD20呈阳性(+)的细胞评估萤火虫荧光素酶表达。“AAV2 wt”衣壳为不具有突变或修饰的野生型(SEQ ID NO:9)，而“AAV2+抗体”衣壳含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:13)。“AAV2+无关mAb”粒子结合至不结合hENTPD3的SpyCatcher融合的抗体。“AAV2+抗ENTPD3”粒子结合至特异性结合hENTPD3的SpyCatcher融合的抗体，hENTPD3不表达于hCD20+细胞上且充当额外阴性对照。“AAV2+抗hCD20”粒子结合至特异性结合hCD20的SpyCatcher融合的抗体。病毒表达作为转导标记的萤火虫荧光素酶。
图10A提供使用B1抗体(其识别由AAV9 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白共用的线性表位)的蛋白质印迹，分析了与SpyCatcher(SEQ ID NO:3)融合的抗HER2抗体“SpyC-Herceptin”与一组AAV9病毒粒子之间的反应。这些AAV9病毒粒子由衣壳构成，所述衣壳含有降低受体结合的突变W503A，和在无连接子或侧接10个氨基酸连接子的情况下在残基A589或G453之后直接插入SpyTag肽，或嵌合AAV9病毒粒子，其由1:7比率的含有突变W503A和A589-连接子10-SpyTag或G453-连接子10-SpyTag的“SpyTag”衣壳蛋白与含有突变W503A但无SpyTag的“W503A”衣壳蛋白构成。图10B提供在用结合至与SpyCatcher融合的抗HER2抗体的AAV9病毒粒子感染后5天(x轴)，表达GFP的HER2+293hErbB2细胞(灰色条)和HER2-293亲本细胞(黑色条)的百分比(y轴)。这些AAV9病毒粒子由衣壳构成，所述衣壳含有降低受体结合的突变W503A，和在无连接子或侧接10个氨基酸连接子的情况下在残基A589(或G453)之后直接插入SpyTag肽，或嵌合AAV9病毒粒子，其由1:7比率的含有突变W503A和A589-连接子10-SpyTag或G453-连接子10-SpyTag的“SpyTag”衣壳蛋白与含有突变W503A但无SpyTag的“W503A”衣壳蛋白构成。病毒表达作为转导标记的GFP。
图11提供取自C57BL/6小鼠的肝脏样品的免疫荧光显微镜图像，所述小鼠被转基因修饰以在肝细胞上表达人类ASGR1。在静脉内注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)或2.5×1011病毒基因组(vg)/动物的携有所关注的CAGG eGFP核苷酸的SpyTagged AAV2粒子后十天收集样品，且通过(1)SpyCatcher-抗人类CD3抗体(AAV SpyT-抗hCD3 CAGG eGFP)或(2)SpyCatcher-抗人类ASGR1抗体(AAV SpyT-抗hASGR1CAGG eGFP)修饰。将小鼠处死且经贲门灌注4％ PFA。收集肝脏、肾脏和心脏器官且在15％蔗糖，接着在30％蔗糖中脱水。接着将器官在载玻片上冷冻切片且用鸡抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.WestGrove,PA)和Alexa-488结合的抗鸡二级抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.WestGrove,PA)染色。每个图像代表一只小鼠。“SpyTagged AAV2”衣壳含有以下突变：R585A、delR588和在残基N587之后直接插入SpyTag肽(SEQ ID NO:13)。病毒表达作为转导标记的eGFP。
图12提供不在肝细胞上表达人类ASGR1的个别小鼠(对照)和基因修饰的小鼠的发光图像，所述基因修饰的小鼠在静脉内注射以下各者后14天在肝细胞上表达人类ASGR1(ASGR1人源化小鼠)：磷酸盐缓冲盐水(PBS)或3.0×1011病毒基因组(vg)/动物的野生型(wt)AAV2粒子，或携有所关注的萤火虫荧光素酶核苷酸且通过(1)SpyCatcher-抗人类CD63抗体或(2)SpyCatcher-抗人类ASGR1抗体修饰的SpyTagged AAV2粒子。这些AAV2病毒粒子为嵌合病毒粒子，其由1:7比率的“SpyTag”衣壳蛋白(其中SpyTag直接插入在由10个氨基酸连接子侧接的残基G453之后)(SEQ ID NO:29)与无SpyTag，但含有降低天然受体结合的在残基N587之后直接插入的Myc标签氨基酸序列的衣壳(SEQ ID NO:53)构成。病毒表达作为转导标记的萤火虫荧光素酶。使用异氟醚将小鼠麻醉，注射荧光素底物且在10分钟后使用IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)成像。
图13提供在静脉内注射以下各者后4周取自C57BL/6小鼠的肝脏和胰腺样品的免疫组织化学图像：磷酸盐缓冲盐水(PBS)或1.0×1012病毒基因组(vg)/动物的野生型(wt)AAV9粒子，或1.0×1013病毒基因组(vg)/动物的SpyTagged AAV2粒子，所述SpyTagged AAV2粒子携有所关注的CMV eGFP核苷酸且通过(1)SpyCatcher-抗人类ASGR1抗体(AAV2 SpyTag+无关mAb)或(2)SpyCatcher-抗人类ENTPD3抗体抗体(AAV2 SpyTag+抗ENTPD3)修饰。将小鼠处死，且收集肝脏和胰腺且固定于10％中性缓冲的福尔马林中。接着将器官包埋且在载玻片上冷冻切片且用抗GFP抗体染色。每个图像代表一只小鼠。这些AAV2病毒粒子为嵌合病毒粒子，其由1:7比率的“SpyTag”衣壳蛋白(其中SpyTag直接插入在由10个氨基酸连接子侧接的残基G453之后)(SEQ ID NO:29)与无SpyTag，但含有降低天然受体结合的在残基N587之后直接插入的Myc标签氨基酸序列的衣壳(SEQ ID NO:53)构成。病毒表达作为转导标记的eGFP。ENTPD3据报道表达于胰岛细胞和舌头中，以及其它细胞类型中，但不表达于肝脏中。SpyTagged AAV2粒子从肝脏去靶向；未在注射“AAV2 SpyTag+无关mAb”或“AAV2 SpyTag+抗ENTPD3”粒子的小鼠的肝脏中观察到eGFP表达。在注射“AAV2 SpyTag+抗ENTPD3”粒子的每只小鼠的胰腺样品中检测到胰岛中的阳性染色。
图14提供在静脉内注射以下各者后14天取自C57BL/6小鼠的肝脏和舌头样品的免疫组织化学图像：磷酸盐缓冲盐水(PBS)或2.0×1012病毒基因组(vg)/动物的野生型(wt)AAV9粒子，或携有所关注的CMV eGFP核酸且通过(1)SpyCatcher-抗人类ASGR1抗体(AAV2SpyTag+无关mAb)或(2)SpyCatcher-抗人类ENTPD3抗体，其结合至小鼠ENTPD3(AAV2SpyTag+抗ENTPD3)修饰的SpyTagged AAV2粒子。将小鼠处死，且收集肝脏和舌头且固定于10％中性缓冲的福尔马林中。接着将器官包埋且在载玻片上冷冻切片且用抗GFP抗体染色。每个图像表示一只小鼠；来自“AAV2 SpyTag+无关mAb”和“AAV2 SpyTag+抗ENTPD3”组的三只小鼠被注射和分析，且全部显示类似GFP表达谱。这些AAV2病毒粒子为嵌合病毒粒子，其由1:7比率的“SpyTag”衣壳蛋白(其中SpyTag直接插入在由10个氨基酸连接子侧接的残基G453之后)(SEQ ID NO:29)与无SpyTag，但含有降低天然受体结合的在残基N587之后直接插入的Myc标签氨基酸序列的衣壳(SEQ ID NO:52)构成。病毒表达作为转导标记的eGFP。据报道ENTPD3表达于小鼠舌头中，但不表达于肝脏中(从公共数据库GenePaint.org http:// www.informatics.jax.org/assay/MGI:5423021和Riken FANTOM5项目，成年小鼠数据集提取的数据)。在注射“AAV2 SpyTag+无关mAb”或“AAV2 SpyTag+抗ENTPD3”粒子的小鼠的肝脏中未观察到eGFP表达，但在所有三只注射“AAV2 SpyTag+抗ENTPD3”粒子的小鼠的舌头中检测到eGFP表达。
具体实施方式
WO201611291描述出于疫苗接种的目的，利用特异性结合对(SpyCatcher:SpyTag)从修饰的噬菌体AP205产生病毒样粒子(VLP)，AP205在AP205衣壳上显示高密度的免疫原性抗原。理论上，出于再靶向病毒载体的目的，这样的高程度的病毒衣壳修饰对于确保病毒载体的天然向性大幅减少或消除可为合乎需要的。但是，这样在病毒表面上显示高密度的靶向配体可能干扰转导效率。参见实例4和5。为了实现最佳转导效率，发现当用成员修饰病毒表面的程度降低时出现最佳转导效率。因此，本文提供基因修饰的病毒粒子、包括其的组合物以及其制备和使用方法。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
除非上下文明确地另外指明，否则单数形式“一”和“所述”包括复数个指代物。因此，例如提及“一种方法”包含本文所述类型的和/或在阅读本公开后对所属领域的技术人员将变得显而易见的一种或多种方法和/或一个或多个步骤。
术语“抗体”包含包括通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变域(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包括至少三个域CH1、CH2、CH3和任选地CH4。每条轻链包括轻链可变域(CH)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链可变域可进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插有被称为构架区(FR)的更保守区域。每个重链和轻链可变域包括三个CDR和四个FR，其自氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3。典型的四聚抗体结构包括两个相同的抗原结合域，其中的每一个由VH和VL域的缔合形成，且其中的每一个连同对应的CH和CL域形成抗体Fv区。单域抗体包括单一抗原结合域，例如VH或VL。抗体的的抗原结合域，例如识别且结合至抗原的特异性结合对的第一成员的抗体部分也称为“互补位”。其为抗体的Fv区的小区域(5至10个氨基酸)，片段抗原结合(Fab区)的一部分，且可含有抗体的重链和/或轻链的一部分。当互补位以高亲和力结合特异性结合对的第一成员时，互补位特异性结合特异性结合对的第一成员。术语“高亲和力”抗体是指对于其特异性结合对的目标第一成员具有约10-9M或更低(例如约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或约1×10-12M)的KD的抗体。在一个实施例中，通过表面等离子体共振，例如BIACORETM测量KD；在另一实施例中，通过ELISA测量KD。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包含由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。CDR可由例如种系序列或者重排或未重排序列，以及例如未处理或成熟的B细胞或T细胞编码。CDR可为体细胞突变的(例如，不同于动物的种系中编码的序列)、人源化的和/或用氨基酸取代、添加或缺失修饰的。在一些情况下(例如对于CDR3)，CDR可由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述两个或更多个序列是不邻接的(例如，未重排的核酸序列中)，但在B细胞核酸序列中是邻接的，例如由于剪接或连接序列(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)。
短语“反向末端重复序列”或“ITR”包含有效复制所需的腺相关病毒的基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的每一端处。ITR充当病毒DNA合成的复制起点，并且是用于产生AAV载体的必需的顺式组分。
短语“轻链”包含来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有说明，否则包含人类κ和λ轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有说明，否则轻链可变域通常包含三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般来说，全长轻链从氨基末端到羧基末端包含可变域和轻链恒定区，所述可变域包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。轻链可变域由轻链可变区基因序列编码，所述基因序列一般包括源自种系中存在的V和J区段储库的VL和JL区段。各种生物体的V和J轻链区段的序列、位置和命名法可见于IMGT数据库www.imgt.org中。轻链包含例如不选择性结合特异性结合对的第一或第二第一成员的那些，所述成员由它们在其中出现的特异性结合对结合蛋白的第一成员选择性结合。轻链还包含结合且识别特异性结合对的一个或多个第一成员，或帮助重链或另一轻链结合且识别所述一个或多个第一成员的那些，所述一个或多个第一成员由它们在其中出现的特异性结合对结合蛋白的第一成员选择性结合。常用或通用的轻链包含衍生自人类Vκ1-39Jκ基因或人类Vκ3-20Jκ基因的那些，且包含其体细胞突变的(例如亲和力成熟的)型式。示例性人类VL区段包含人类Vκ1-39基因区段、人类Vκ3-20基因区段、人类Vλ1-40基因区段、人类Vλ1-44基因区段、人类Vλ2-8基因区段、人类Vλ2-14基因区段和人类Vλ3-21基因区段，且包含其体细胞突变的(例如亲和力成熟的)型式。可制备包括来自一种生物体(例如人类或啮齿类动物，例如大鼠或小鼠；或禽类，例如鸡)的可变域和来自相同或不同生物体(例如人类或啮齿类动物，例如大鼠或小鼠；或禽类，例如鸡)的恒定区的轻链。
术语“约”或“大致”包含在值的统计上有意义的范围内。此类范围可在一定数量级内，优选在给定值或范围的50％内，更优选在20％内，更优选在10％内，且更优选在5％内。术语“约”或“大致”涵盖的可允许的变化取决于研究的特定系统，并且所属领域的普通技术人员可容易地理解。
术语“衣壳蛋白”包含作为病毒衣壳的一部分的蛋白质。对于腺相关病毒，衣壳蛋白一般称为VP1、VP2和/或VP3，且由单一cap基因编码。对于AAV，三种AAV衣壳蛋白通过替代mRNA剪接和/或替代翻译起始密码子使用从cap开放阅读框架(ORF)以重叠方式产生，但所有三种蛋白质使用共同的终止密码子。Warrington等人(2004)《病毒学杂志》78:6595，以全文引用的方式并入本文中。AAV2的VP1一般由2.4kb mRNA上的ATG起始密码子(氨基酸M1)翻译，而AAV2的VP2和VP3由较小的2.3kb mRNA产生，使用较弱ACG起始密码子产生VP2(氨基酸T138)，且通读翻译为下一个可用的ATG密码子(氨基酸M203)以产生最丰富的衣壳蛋白VP3。Warrington,前述；Rutledge等人(1998)《病毒学杂志》72:309-19，以全文引用的方式并入本文中。腺相关病毒的衣壳蛋白的氨基酸序列为所属领域中众所周知的且一般为保守的，尤其是在依赖细小病毒内。参见Rutledge等人,前述。例如，Rutledge等人(1998),前述在图4B中为AAV2、AAV3、AAV4和AAV6的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白提供氨基酸序列比对，其中VP1、VP2和VP3衣壳蛋白中的每一个的起始位点由箭头指示，且可变域为加框的。因此，尽管本文提供的氨基酸位置可关于AAV的VP1衣壳蛋白提供，且未进一步指定的本文提供的氨基酸位置是指阐述为SEQ ID NO:1的主要外壳蛋白VP1的AAV2序列，熟练技术人员将能够分别且容易地确定AAV的VP2和/或VP3衣壳蛋白内的相同氨基酸的位置，和不同血清型中的氨基酸的对应位置。因此，尽管本文提供的氨基酸位置可关于AAV的VP1衣壳蛋白提供，且未进一步指定的本文提供的氨基酸位置是指阐述为SEQ ID NO:9的主要外壳蛋白VP1的AAV-2序列，熟练技术人员将能够分别且容易地确定AAV的VP2和/或VP3衣壳蛋白内的相同氨基酸的位置，和不同血清型中的对应氨基酸和位置。另外，熟练技术人员将能够在不同AAV血清型的衣壳蛋白之间交换域，以形成“嵌合衣壳蛋白”。
已描述用于产生“嵌合AAV衣壳蛋白”的两个AAV衣壳蛋白构筑体之间的域交换，参见例如Shen等人(2007)《分子疗法(Mol.Therapy)》15(11):1955-1962，以全文引用的方式并入本文中。“嵌合AAV衣壳蛋白”包含AAV衣壳蛋白，其包括来自两种或更多种不同AAV血清型的氨基酸序列(例如域)且能够形成和/或形成了AAV样病毒衣壳/病毒粒子。嵌合AAV衣壳蛋白由嵌合AAV衣壳基因编码，例如包括多个(例如至少两个)核酸序列的核苷酸，所述多个中的每一个与编码不同AAV血清型的衣壳蛋白的衣壳基因的一部分相同，且所述多个在一起编码功能性嵌合AAV衣壳蛋白。关于特定AAV血清型提及的嵌合衣壳蛋白指示衣壳蛋白包括一个或多个来自血清型的衣壳蛋白的域和一个或多个来自不同血清型的衣壳蛋白的域。例如，AAV2嵌合衣壳蛋白包含包括AAV2 VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的一个或多个域和不同AAV的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的一个或多个域的衣壳蛋白。
“嵌合衣壳”包括至少两组VP1、VP2和/或VP3蛋白，其中的每一组由不同cap基因编码。
在一些实施例中，本文所述的嵌合衣壳包括由cap基因编码的重组VP1、VP2和/或VP3蛋白，所述cap基因经插入编码异源表位的核酸序列基因修饰，并且进一步包括由参考cap基因编码的VP1、VP2和/或VP3蛋白，所述参考cap基因为例如编码与重组VP1、VP2和/或VP3蛋白具有相同AAV血清型的野生型VP1、VP2和/或VP3蛋白的野生型参考cap基因；编码除了不存在异源表位之外与重组VP1、VP2和/或VP3蛋白相同的VP1、VP2和VP3蛋白的对照参考cap基因；编码除了突变(例如插入、取代、缺失)之外与重组VP1、VP2和/或VP3蛋白相同的AAV血清型的基本上野生型VP1、VP2和/或VP3蛋白的突变的野生型参考cap基因，所述突变优选地降低野生型VP1、VP2和VP3蛋白的向性。在一些实施例中，参考cap基因编码嵌合VP1、VP2和/或VP3蛋白。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包含来自任何生物体的免疫球蛋白重链序列，包含免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有说明，否则重链可变域包含三个重链CDR和四个FR区。重链片段包含CDR、CDR和FR以及其组合。典型的重链在可变域之后具有(从N端到C端)CH1域、铰链、CH2域和CH3域。重链的功能片段包含能够特异性识别特异性结合对的第一成员(例如以微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别特异性结合对的第一成员)，即能够由细胞表达和分泌，且包括至少一个CDR的片段。重链可变域由可变区核苷酸序列编码，所述核苷酸序列一般包括源自种系中存在的VH、DH和JH区段储库的VH、DH和JH区段。用于各种生物体的V、D和J重链区段的序列、位置和命名法可在IMGT数据库中找到，所述数据库可通过万维网(www)上的因特网以URL“imgt.org”访问。
术语“仅重链的抗体”、“仅重链的抗原结合蛋白”、“单域抗原结合蛋白”、“单域结合蛋白”等是指包括免疫球蛋白样链的单体或同型二聚免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白样链包括可操作地连接于重链恒定区的可变域，重链恒定区不能与轻链结合，因为其通常缺乏功能性CH1域。因此，术语“仅重链的抗体”、“仅重链的抗原结合蛋白”、“单域抗原结合蛋白”、“单域结合蛋白”等涵盖(i)包括免疫球蛋白样链中的一条的单体单域抗原结合蛋白，所述免疫球蛋白样链包括可操作地连接于缺少功能性CH1域的重链恒定区的可变域，或(ii)包括两条免疫球蛋白样链的同型二聚单域抗原结合蛋白，每条免疫球蛋白样链包括可操作地连接于缺少功能性CH1域的重链恒定区的可变域。在各种方面中，同型二聚单域抗原结合蛋白包括两条相同的免疫球蛋白样链，每条免疫球蛋白样链包括可操作地连接于缺少功能性CH1域的相同重链恒定区的相同可变域。另外，单域抗原结合蛋白的每条免疫球蛋白样链包括可变域，其可衍生自重链可变区基因区段(例如VH、DH、JH)、轻链基因区段(例如VL、JL)或其组合，连接至重链恒定区(CH)基因序列，所述基因序列在重链恒定区基因，例如IgG、IgA、IgE、IgD或其组合的CH1编码序列(和任选地铰链区)中包括缺失或失活性突变。包括衍生自重链基因区段的可变域的单域抗原结合蛋白可称为“VH单域抗体”或“VH单域抗原结合蛋白”，参见例如美国专利第8,754,287号；美国专利公开案第20140289876号；第20150197553号；第20150197554号；第20150197555号；第20150196015号；第20150197556号；和第20150197557号，其中的每一个以全文引用的方式并入。包括衍生自轻链基因区段的可变域的单域抗原结合蛋白可称为或“VL单域抗原结合蛋白”，参见例如以全文引用的方式并入的美国公开案第20150289489号。
短语“轻链”包含来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，且除非另有说明，否则包含人类kappa(κ)和lambda(λ)轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有说明，否则轻链可变域通常包含三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般来说，全长轻链从氨基末端到羧基末端包含可变域和轻链恒定区氨基酸序列，所述可变域包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。轻链可变域由轻链可变区核苷酸序列编码，所述核苷酸序列一般包括源自种系中存在的轻链V和J基因区段储库的轻链VL和轻链JL基因区段。用于各种生物体的轻链V和J基因区段的序列、位置和命名法可在IMGT数据库中找到，所述数据库可通过万维网(www)上的因特网以URL“imgt.org”访问。轻链包含例如不选择性结合特异性结合对的第一或第二第一成员的那些，所述成员由它们在其中出现的特异性结合对结合蛋白的第一成员选择性结合。轻链还包含结合且识别特异性结合对的一个或多个第一成员，或帮助重链结合且识别所述一个或多个第一成员的那些，所述一个或多个第一成员由它们在其中出现的特异性结合对结合蛋白的第一成员选择性结合。轻链还包含结合且识别特异性结合对的一个或多个第一成员，或帮助重链结合且识别所述一个或多个第一成员的那些，所述一个或多个第一成员由它们在其中出现的特异性结合对结合蛋白的第一成员选择性结合。常用或通用的轻链包含衍生自人类Vκ1-39Jκ5基因或人类Vκ3-20Jκ1基因的那些，且包含其体细胞突变的(例如亲和力成熟的)型式。
如本文所用的短语“可操作地连接”包含组分或元件的物理并列(例如在三维空间中)，所述组分或元件彼此直接或间接相互作用，或以其它方式彼此协调以参与生物事件，所述并列实现或准许此类相互作用和/或协调。仅举一个例子，当核酸中的控制序列(例如表达控制序列)相对于编码序列定位以使其存在或不存在影响编码序列的表达和/或活性时，将其称为“可操作地连接”于编码序列。在许多实施例中，“可操作连接”涉及相关组分或元件彼此共价连接。所属领域的技术人员将易于了解，在一些实施例中，实现有效的可操作连接不需要共价连接。例如，在一些实施例中，与核酸控制序列控制的编码序列可操作地连接的核酸控制序列与所关注的核苷酸邻接。或者或另外，在一些实施例中，一个或多个此类控制序列以反式或相隔一定距离起作用以控制所关注的编码序列。在一些实施例中，如本文所用的术语“表达控制序列”是指对于实现与其连接的编码序列的表达和加工而言必需和/或足够的聚核苷酸序列。在一些实施例中，表现控制序列可为或包括适当的转录起始、终止、启动子和/或增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(例如Kozak共同序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和/或在一些实施例中，增强蛋白质分泌的序列。在一些实施例中，一个或多个控制序列优先或仅仅在特定宿主细胞或生物体或其类型中具有活性。仅举一个例子，在原核生物中，控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，在许多实施例中，控制序列通常包含启动子、增强子和/或转录终止序列。所属领域的技术人员应从上下文了解，在许多实施例中，术语“控制序列”是指其存在对表达和加工而言为必需的组分，且在一些实施例中包含其存在对表达有利的组分(包含例如前导序列、靶向序列和/或融合搭配物序列)。
术语“重组衣壳蛋白”包含相比于野生型病毒的对应衣壳蛋白具有至少一个突变的衣壳蛋白，所述野生型可为用于比较研究的参考和/或对照病毒。重组衣壳蛋白包含包括异源氨基酸序列的衣壳蛋白，所述异源氨基酸序列可插入至衣壳蛋白中和/或由其显示。在此上下文中，“异源”意指相比于衍生衣壳蛋白的病毒为异源的。插入的氨基酸可仅插入在衣壳蛋白的两个给定氨基酸之间。氨基酸的插入还可连同在插入位点处衣壳蛋白的给定氨基酸的缺失，例如1个或更多个衣壳蛋白氨基酸被5个或更多个异源氨基酸取代)。
“再靶向”或“重定向”可包含其中野生型载体靶向生物体内的组织和/或若干器官内的若干细胞的情境，组织或器官的一般靶向通过异源表位的插入而减少至消除，且用靶向配体实现再靶向至生物体中的组织或特定器官中的更特定细胞，所述靶向配体结合由特定细胞表达的标记。此类再靶向或重定向还可包含其中野生型载体靶向组织的情境，组织靶向通过异源表位的插入而减少至消除，且用靶向配体实现再靶向至完全不同的组织。
“特异性结合对”、“蛋白质:蛋白质结合对”等包含两种蛋白质(例如第一成员(例如第一多肽)和第二同源成员(例如第二多肽))，其在实现或促进异肽键形成的条件下相互作用以形成共价异肽键，其中术语“同源”是指在一起起作用，即在一起反应以形成异肽键的组分。因此，在实现或促进异肽键形成的条件下有效地在一起反应以形成异肽键的两种蛋白质还可称为“互补”肽连接子对。能够相互作用以形成共价异肽键的特异性结合对综述于Veggiani等人(2014)《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》32:506中，且包含肽:肽结合对，如SpyTag:SpyCatcher、SpyTag002:SpyCatcher002、SpyTag:KTag、isopeptag:pilinC、SnoopTag:SnoopCatcher等。一般来说，肽标签是指蛋白质:蛋白质结合对的成员，其长度一般小于30个氨基酸，且其与第二同源蛋白形成共价异肽键，其中第二同源蛋白一般更大，但长度也可小于30个氨基酸，如在SpyTag:KTag系统中。
术语“异肽键”是指羧基或甲酰胺基与氨基之间的酰胺键，所述基团中的至少一个不衍生自蛋白质主链，或另一种观点，不是蛋白质主链的一部分。异肽键可形成于单一蛋白质内或可出现于两个肽或肽与蛋白质之间。因此，异肽键可分子内地形成于单一蛋白质内，或分子间，即形成于两个肽/蛋白质分子之间，例如两个肽连接子之间。通常，异肽键可出现于赖氨酸残基与天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸残基或蛋白质或肽链的末端羧基之间，或可出现于蛋白质或肽链的α-氨基末端与天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸之间。异肽键中涉及的对的每个残基在本文中称为反应性残基。在本发明的优选实施例中，异肽键可形成于赖氨酸残基与天冬酰胺残基之间或赖氨酸残基与天冬氨酸残基之间。确切地说，异肽键可出现于赖氨酸的侧链胺与天冬酰胺的甲酰胺基或天冬氨酸的羧基之间。
SpyTag:SpyCatcher系统描述于美国专利第9,547,003号和Zakeri等人(2012)《美国国家科学院院刊(PNAS)》109:E690-E697，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中，且衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2域。通过使域分裂，Zakeri等人获得具有序列AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:1)的肽“SpyTag”，SpyTag与其同源蛋白“SpyCatcher”(具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的112个氨基酸的多肽)形成酰胺键。(Zakeri(2012),前述)。衍生自CnaB2域的另一特异性结合对为SpyTag:KTag，其在SpyLigase存在下形成异肽键。(Fierer(2014)《美国国家科学院院刊》111:E1176-1181)SpyLigase通过从含有反应性赖氨酸的SpyCatcher切除β链来工程化，从而产生KTag，具有氨基酸序列ATHIKFSKRD(SEQ ID NO:2)的10个残基的肽标签。SpyTag002:SpyCatcher002系统描述于Keeble等人(2017)《应用化学国际英文版(Angew Chem Int EdEngl)》56:16521-25中，其以全文引用的方式并入本文中。SpyTag002具有阐述为SEQ IDNO:54的氨基酸序列VPTIVMVDAYKRYK，且结合SpyCatcher002(SEQ ID NO:55)。
SnoopTag:SnoopCatcher系统描述于Veggiani(2016)《美国国家科学院院刊》113:1202-07中。RrgA的D4 Ig样域(与肺炎链球菌粘附)被分离以形成SnoopTag(残基734-745；SEQ ID NO:5)和SnoopCatcher(残基749-860)。培育SnoopTag和SnoopCatcher产生在互补蛋白之间具有特异性的自发异肽键。Veggiani(2016)),前述。
isopeptag:pilin-C特异性结合对衍生自来自酿脓链球菌的主要菌毛蛋白蛋白Spy0128。(Zakeir和Howarth(2010)《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》132:4526-27)。Isopeptag具有阐述为SEQ ID NO:7的氨基酸序列TDKDMTITFTNKKDAE，且结合pilin-C(Spy0128的残基18-299)。培育SnoopTag和SnoopCatcher产生在互补蛋白之间具有特异性的自发异肽键。Zakeir和Howarth(2010),前述。
术语“肽标签”包含如下的多肽：(1)与肽标签标记的蛋白质异源，(2)为能够形成异肽键的特异性蛋白质:蛋白质结合对的成员，且(3)长度不超过50个氨基酸。
术语“靶细胞”包含在其中期望所关注的核苷酸的表达的任何细胞。优选地，靶细胞在其表面上展现允许细胞经靶向配体靶向的受体，如下所述。
术语“转导”或“感染”等是指通过病毒载体将核酸引入至靶细胞核中。关于转导等的术语效率，例如“转导效率”是指在与设定数目的包括所关注的核苷酸的病毒载体一起培育之后，表达所关注的核苷酸的细胞的分数(例如百分比)。确定转导效率的众所周知的方法包含用萤光报告基因转导的细胞的荧光激活细胞分选术、用于表达所关注的核苷酸的PCR等。
如本文所用的术语“野生型”包含具有如在“正常”(相对于突变、患病的、改变的等)状态或环境中天然存在的结构和/或活性的实体。所属领域的技术人员应了解，野生型病毒载体，例如野生型衣壳蛋白可用作比较研究中的参考病毒载体。一般来说，除了对于其测试影响的变化之外，参考病毒衣壳蛋白/衣壳/载体与测试病毒衣壳蛋白/衣壳/载体相同。例如，为了确定将特异性结合对的第一成员插入至测试病毒载体中(例如对转导效率)的影响，测试病毒载体的转导效率(在不存在或存在适当靶向配体的情况下)可相比于参考病毒载体的转导效率(必要时在不存在或存在适当靶向配体的情况下)，其在每个实例中与测试病毒载体相同(例如另外的突变、所关注的核苷酸、病毒载体和靶细胞的数目等)，除了存在特异性结合对的第一成员。
本文所述的再靶向策略提供了上文所述的骨架和直接重组方法两者的优点，以及解决了两者固有的许多缺点。所述策略利用特异性结合对，其中第一成员和第二同源成员彼此特异性结合，且在结合后形成共价键，所述共价键将病毒粒子永久地连接至与同源成员融合的任何靶向配体。在此类基因修饰的病毒粒子的情况下，只要病毒衣壳保持完整便可维持向性，例如本文提供的系统相比于其它骨架方法的一种优势为与直接重组方法类似的“接附子”，例如靶向配体结合至重组病毒粒子的永久性。但是，相比于直接重组方法，本文所述的系统维持骨架接附子方法的灵活性，因为重组病毒粒子可在接附子中发现的变化性下保持恒定，例如同源成员可与不同靶向配体融合，且不同融合蛋白接着根据靶细胞偶联至病毒粒子。
重组病毒衣壳蛋白和病毒载体和核酸
本文提供重组病毒粒子(例如病毒衣壳蛋白，和包括重组病毒衣壳蛋白的重组病毒衣壳和/或重组病毒载体)，其经基因修饰以显示包括特异性结合对的第一成员的异源氨基酸序列，其中氨基酸序列的长度为小于50氨基酸，且其中重组病毒衣壳/粒子蛋白展现减少至消除的天然向性。在一些实施例中，病毒粒子进一步包括特异性结合对的第二同源成员，其中第一和第二成员共价结合，且其中第二成员与靶向配体融合。
在一些实施例中，异源氨基酸序列包括特异性结合对的第一成员和一个或多个连接子。在一些实施例中，异源氨基酸序列包括由连接子侧接的特异性结合对的第一成员，例如异源氨基酸序列从N端至C端包括第一连接子、特异性结合对的第一成员和第二连接子。在一些实施例中，第一和第二连接子的长度各自独立地为至少一个氨基酸。在一些实施例中，第一和第二连接子相同。
一般来说，如本文所述的异源氨基酸序列(例如包括特异性结合对的第一成员本身或与一个或多个连接子的组合)的长度为约5个氨基酸至约50个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为至少5个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为6个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为7个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为8个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为9个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为10个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为11个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为12个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为13个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为14个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为15个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为16个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为17个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为18个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为19个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为20个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为21个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为22个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为23个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为24个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为25个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为26个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为27个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为28个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为29个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为30个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为31个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为32个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为33个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为34个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为35个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为36个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为37个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为38个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为39个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为40个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为41个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为42个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为43个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为44个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为45个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为46个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为47个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为48个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为49个氨基酸。在一些实施例中，异源氨基酸序列的长度为50个氨基酸。
在一些实施例中，特异性结合对为SpyTag:SpyCatcher结合对，其中第一成员为SpyTag，且其中第二同源成员为SpyCatcher。在一些实施例中，特异性结合对为SpyTag:KTag，其中第一成员为SpyTag，且其中第二同源成员为KTag。在一些实施例中，特异性结合对为SpyTag:KTag，其中第一成员为Ktag，且其中第二同源成员为SpyTag。在一些实施例中，特异性结合对为isopeptag:pilin-C，其中第一成员为isopeptag，且其中第二同源成员为pilin-C，或其一部分。在一些实施例中，特异性结合对为SnoopTag:SnoopCatcher，且第一成员为SnoopTag，且第二同源成员为SnoopCatcher。
在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白为Ad衣壳蛋白，例如选自由Ad1、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6和Ad7组成的群组的Ad血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自Ad2衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自Ad5衣壳基因。在一些实施例中，如本文所述的重组Ad病毒衣壳蛋白在纤维蛋白域中，例如在纤维蛋白的羧基端、纤维杵和/或纤维杵的HI环处包括特异性结合对的第一成员。
在一些实施例中，本文所述的重组病毒衣壳蛋白衍生自腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白基因，例如选自由以下组成的群组的AAV血清型的衣壳基因：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白衍生自AAV2衣壳基因或AAV9衣壳基因。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白为基因修饰的AAV2 VP1衣壳蛋白，其野生型氨基酸序列被阐述为SEQ ID NO:9。在一些实施例中，重组病毒衣壳蛋白为基因修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白，其野生型氨基酸序列被阐述为SEQ ID NO:31。
一般来说，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白包括插入至衣壳蛋白中和/或由其显示的特异性结合对的第一成员，使得特异性结合对的第一成员降低和/或消除衣壳蛋白或包括其的衣壳的天然向性。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员被插入至涉及野生型参考衣壳蛋白的天然向性的衣壳蛋白区域，例如涉及细胞受体的衣壳蛋白区域中。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员被插入至Ad纤维蛋白的杵域中和/或由其显示。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员被插入至Ad纤维蛋白的HI环中和/或由其显示。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员被插入在选自由以下组成的群组的氨基酸位置之后：AAV2衣壳蛋白VP1的G453、AAV2衣壳蛋白VP1的N587、AAV9衣壳蛋白VP1的G453和AAV9衣壳蛋白VP1的A589。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员被插入和/或显示在AAV2VP1衣壳的氨基酸N587与R588之间。在一些实施例中，重组病毒衣壳、包括重组病毒衣壳的病毒载体和/或包括重组病毒衣壳的组合物包括阐述为SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、35、37或39的氨基酸序列。通过使用AAV2鉴别的其它合适的插入位点为所属领域中众所周知的(Wu等人(2000)《病毒学杂志》74:8635-8647)，且包含I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713和I-716。如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可为AAV2衣壳蛋白，其包括插入至选自由以下组成的群组的位置中的特异性结合对的第一成员：I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、I-716和其组合。通过使用其它AAV血清型鉴别的其它合适的插入位点为众所周知的，且包含I-587(AAV1)、I-589(AAV1)、I-585(AAV3)、I-585(AAV4)和I-585(AAV5)。在一些实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可为AAV2衣壳蛋白，其包括插入至选自由以下组成的群组的位置中的特异性结合对的第一成员：I-587(AAV1)、I-589(AAV1)、I-585(AAV3)、I-585(AAV4)、I-585(AAV5)和其组合。
本文中使用的命名法I-###是指用###命名相对于AAV衣壳蛋白的VP1蛋白的氨基酸编号的插入位点，然而，此类插入可直接位于N端或C端，优选地位于给定氨基酸的5个氨基酸的N端或C端，优选地给定氨基酸的3个、更优选地2个、尤其1个氨基酸的N端或C端的序列中的一个氨基酸的C端。另外，本文中提及的位置是相对于由AAV衣壳基因编码的VP1蛋白，且可通过进行由参考AAV衣壳基因编码的VP1、VP2和VP3蛋白的序列比对而容易地鉴别由衣壳基因编码的VP2和VP3衣壳蛋白的对应位置(和其突变)。
因此，插入至cap基因的这些位点之一的编码核酸的对应位置中使得插入至VP1、VP2和/或VP3中，因为衣壳蛋白由具有交错起始密码子的相同基因的重叠阅读框编码。因此，对于AAV2，举例来说，根据此命名法，插入在氨基酸1与138之间为仅插入至VP1中，插入在138与203之间为插入至VP1和VP2中，且插入在203与C端之间为插入至VP1、VP2和VP3中，对于插入位点I-587情况当然也是如此。因此，本发明涵盖在VP1、VP2和/或VP3蛋白中具有对应插入的AAV的结构基因。
另外，由于至少大型伸长部和紧密相关的家族成员的大型成员的高保守度，可通过进行氨基酸比对或通过衣壳结构比较来鉴别除列举的AAV以外的AAV的对应插入位点。关于不同AAV衣壳蛋白的示例性比对，参见例如Rutledge等人(1998)《病毒学杂志》72:309-19和美国专利第9,624,274号，所述参考文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低或消除病毒载体的天然向性，例如天然地容许被野生型参考病毒载体感染的细胞和/或靶细胞的转导在不存在与结合对的第二同源成员的共价键的情况下不可检测，所述第二同源成员与适当靶向配体融合。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性，例如相比于天然地容许被野生型参考病毒载体感染的细胞的转导。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少5％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少5％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少10％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少20％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少30％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少40％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少50％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少60％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少70％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少80％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少90％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少95％。在一些实施例中，特异性结合对的第一成员的插入(显示)降低病毒载体的天然向性至少90％。在其中特异性结合对的第一成员的插入(显示)不完全消除重组病毒衣壳的天然向性的实施例中，此类重组病毒衣壳的天然向性可通过第二和不同的突变进一步降低。例如，在一个实施例中，如本文所述的重组病毒衣壳蛋白可衍生自AAV9血清型，且可包括特异性结合对的第一成员，且可进一步包括突变，例如W503A突变。
病毒从其天然宿主细胞的这种脱靶向尤其在预期病毒载体的全身性相对于局部或局部区域性施用的情况下重要，因为病毒载体被天然宿主细胞吸收会限制病毒载体的有效剂量。在AAV2和AAV6的情况下，HSPG据报道是大量细胞(尤其是肝细胞)中的病毒吸收的主要受体。对于AAV2，HSPG结合活性取决于一组5种碱性氨基酸，R484、R487、R585、R588和K532(Kern等人,(2003)《病毒学杂志》77(20):11072-81)。因此，优选的点突变是如下的那些：在HSPG作为用于将病毒载体结合至靶细胞的主要受体的情况下，将由天然受体介导的病毒载体针对给定靶细胞的转导活性降低至少50％，优选地至少80％，尤其至少95％。
因此，对于HSPG结合病毒载体优选的另外的突变是如下的那些突变：通过非碱性氨基酸，如A、D、G、Q、S和T，优选地A或存在于缺少此位置处的此类碱性氨基酸的不同但高度保守的AAV血清型的对应位置处的氨基酸使碱性氨基酸缺失或替换碱性氨基酸，所述碱性氨基酸为如R、K或H，优选地R或K，其涉及对应病毒的HSPG结合。因此，优选的氨基酸取代为R484A、R487A、R487G、K532A、K532D、R585A、R585S、R585Q、R585A或R588T，对于AAV2尤其是R585A和/或R588A，且对于AAV6尤其是K531A或K531E。本发明的一个尤其优选的实施例为另外含有两个点突变R585A和R588A的AAV2的此类衣壳蛋白突变体，因为这两个点突变足以在很大程度上消除HSPG结合活性。这些点突变使得能够从表达HSPG的细胞有效脱靶向，这出于靶向目的增加了对应突变病毒针对其新靶细胞的特异性。
靶向配体
本文所述的病毒粒子可进一步包括特异性结合对的第二成员，其与插入至重组病毒衣壳蛋白中/由重组病毒衣壳蛋白显示的特异性结合对的第一成员特异性形成共价键，其中第二成员与靶向配体融合。在一些实施例中，靶向配体结合在细胞表面上表达的受体，例如(人类)真核细胞，例如靶细胞上的细胞表面蛋白。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)肝细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)脑细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)淋巴细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)T细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)B细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)树突状细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)巨噬细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)NK细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)肾细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)癌细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由被异源病原体感染的(人类)细胞表达的受体。
存在大量合适的细胞表面蛋白，例如细胞表面受体，其可被靶向配体靶向，且靶向配体，例如抗体或其部分已可用。此类结构包含但不限于：I类和II类主要组织相容性抗原；用于多种细胞因子的受体(例如用于IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33等的受体)、细胞类型特异性生长激素、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CTNF)、集落刺激生长因子、内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经胶质源性神经营养因子、神经胶质生长因子、gro-beta/mip 2、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、干扰素(α-IFN、β-IFN、γIFN、共同IFN)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14)、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、巨噬细胞/单核细胞趋化性活化因子、神经生长因子、嗜中性粒细胞活化蛋白2、血小板衍生生长因子、干细胞因子、转型生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、脂蛋白(包含另外或其它的1型跨膜受体，如PRLR)、G蛋白偶联受体(如GCGR)、离子通道(如Nav1.7、ASIC1或ASIC2)；细胞粘附分子；用于如氨基酸的代谢物的传输分子；B和T淋巴细胞的抗原受体(例如B细胞受体和相关蛋白(例如CD19、CD20等)和T细胞受体和相关蛋白(例如CD3、CD4、CD8等)；四跨膜蛋白(例如CD63)。本文所述的重组病毒衣壳允许通过采用结合分化细胞表面抗原的靶向配体作为病毒载体复合物的标靶而特异性感染一种细胞类型。
在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)肝细胞表达的蛋白质，即，肝特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)脑细胞表达的蛋白质，脑细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)造血细胞表达的蛋白质，即，造血细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)T细胞表达的蛋白质，即，T细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)B细胞表达的蛋白质，即，B细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)树突状细胞表达的蛋白质，即，树突状细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)巨噬细胞表达的蛋白质，即，巨噬细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)NK细胞表达的蛋白质，即，NK细胞特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)肾细胞表达的蛋白质，即，肾特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)胰腺细胞表达的受体，即，胰腺特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)肠细胞表达的受体，即，肠特异性标记。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由(人类)癌细胞表达的蛋白质，即，肿瘤相关抗原。在一些实施例中，靶向配体结合主要(例如仅)由被异源病原体感染的(人类)细胞表达的蛋白质。(1)由细胞/组织/器官特异性表达，或表达富集于细胞/组织/器官中，且(2)由适用作如本文所述的靶向配体的抗原结合蛋白识别的蛋白质为众所周知的，且也可在www.proteinatlas。org处找到；还参见Uhlen等人(2010) 《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》28:1248-50，其以全文引用的方式并入本文中。下表2提供可适用作靶向配体的抗原结合蛋白可用于的示例性和非限制性器官特异性标记，和表达此类标记的细胞/组织/器官。
表2：示例性组织特异性标记
在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)肝细胞表达的受体，例如脱唾液酸糖蛋白受体，例如hASGR1。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)脑细胞表达的受体。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)T细胞表达的受体，例如CD3，例如CD3ε。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)肾细胞表达的受体，例如。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)肌细胞表达的受体，例如整合素。在一些实施例中，靶向配体结合由(人类)癌细胞表达的受体，例如肿瘤相关抗原，例如E6和E7。在一些实施例中，靶向配体结合人类胰高血糖素受体(hGCGR)。
在一些实施例中，靶向配体结合由肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原。特定肿瘤相关抗原的非限制性实例包含例如AFP、ALK、BAGE蛋白、β-索烃素、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、胱天蛋白酶-8、CCR5、CD19、CD20、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、存活素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3。
在一些实施例中，靶向配体结合至与免疫反应相关的CD标记，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20等。
本发明的一个实施例为包括本发明的重组病毒衣壳蛋白的多聚结构。多聚结构包括至少5个、优选地至少10个、更优选地至少30个、最优选地至少60个包括如本文所述的特异性结合对的第一成员的重组病毒衣壳蛋白。其可形成常规病毒衣壳(空病毒粒子)或病毒载体(囊封所关注的核苷酸的衣壳)。形成能够包装病毒基因组的病毒载体对于使用在本文中描述为病毒载体的重组病毒衣壳而言是高度优选的特征。
本发明的一个实施例为编码如上文所述的衣壳蛋白的核酸。核酸优选为包括所要求的核酸的载体。核酸，尤其载体是以重组方式表达本发明的衣壳蛋白所必需的。
本发明的另一实施例为使用至少一种重组病毒衣壳蛋白和/或编码其的核酸，优选地至少一种多聚结构(例如病毒载体)来制造和用作基因转移载体。
使用和制造方法
本文所述的重组病毒衣壳蛋白的另一实施例为其用于将所关注的核苷酸，例如报告基因或治疗基因递送至靶细胞的用途。一般来说，所关注的核苷酸可为转移质粒，其一般可包括侧接报告基因或治疗基因(当包涵于AAV载体内时，其可在病毒或非病毒启动子的控制下的5'和3'反向末端重复(ITR)序列。在一个实施例中，所关注的核苷酸为自5'至3'包括以下各者的转移质粒：5'ITR、启动子、基因(例如报告基因和/或治疗基因)和3'ITR。
适用启动子的非限制性实例包含例如巨细胞病毒(CMV)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、延长因子1α(EF1a)启动子(1.2kb的EFla启动子或0.2kb的EFla启动子)、嵌合EF 1a/IF4启动子和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。内部增强子也可存在于病毒构筑体中，以增加所关注的基因的表达。例如，可使用CMV增强子(Karasuyama等人1989.《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》169:13，其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，CMV增强子可与鸡β-肌动蛋白启动子组合使用。
多种报告基因(或可检测部分)可囊封于包括本文所述的重组病毒衣壳蛋白的多聚结构中。示例性报告基因包含例如β-半乳糖苷酶(所编码的lacZ基因)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、MmGFP、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、Emerald、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、荧光素酶、碱性磷酸酶或其组合。本文所述的方法展现了利用报告基因编码绿色荧光蛋白的用途来构筑靶向载体，然而，所属领域的技术人员在阅读本公开后将理解，本文所述的非人类动物可在缺乏报告基因的情况下或在所属领域中已知的任何报告基因存在下产生。
多种治疗基因也可囊封于包括本文所述的重组病毒衣壳蛋白的多聚结构中，例如作为转移载体的一部分。治疗基因的非限制性实例包含编码毒素(例如自杀基因)、治疗抗体或其片段、CRISPR/Cas系统或其部分、反义RNA、siRNA、shRNA等的那些。
本发明的另一实施例为一种制备重组衣壳蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在合适的条件下表达编码重组衣壳蛋白的核酸，和
b)分离步骤a)的表达的衣壳蛋白。
在一些实施例中，如本文所述的病毒粒子包括嵌合衣壳，例如包括与参考衣壳蛋白呈某一比率的如本文所述地基因修饰(在不存在或存在与靶向配体的共价键的情况下)的衣壳蛋白的衣壳。一种用于制造此类嵌合病毒粒子的方法包括
a)在合适的条件下以1:1和10:1的比率(wt/wt)表达编码重组衣壳蛋白的核酸和编码参考衣壳蛋白的核苷酸，和
b)分离步骤a)的表达的衣壳蛋白。
一般来说，将认为根据所述方法形成的嵌合衣壳具有修改的衣壳蛋白:参考衣壳蛋白比率，所述比率与用于产生嵌合衣壳的编码其的核酸的比率(wt:wt)类似。因此，在一些实施例中，本文所述的组合物包括，或本文所述的方法组合比率在1:1至1:15范围内的重组病毒衣壳蛋白和参考衣壳蛋白(或参考衣壳蛋白的组合)。在一些实施例中，比率为1:2。在一些实施例中，比率为1:3。在一些实施例中，比率为1:4。在一些实施例中，比率为1:5。在一些实施例中，比率为1:6。在一些实施例中，比率为1:7。在一些实施例中，比率为1:8。在一些实施例中，比率为1:9。在一些实施例中，比率为1:10。在一些实施例中，比率为1:11。在一些实施例中，比率为1:12。在一些实施例中，比率为1:13。在一些实施例中，比率为1:14。在一些实施例中，比率为1:15。
本发明的其它实施例为一种改变病毒的向性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将编码异源氨基酸序列的核酸插入至编码病毒衣壳蛋白的核酸序列中，以形成编码包括异源氨基酸序列的基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列，和/或(b)在足以产生病毒载体的条件下培养包装细胞，其中包装细胞包括核酸。本发明的另一实施例为一种在衣壳蛋白的表面上显示靶向配体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在合适的条件下表达编码如本文所述的重组病毒衣壳蛋白的核酸(和任选地编码参考衣壳蛋白的核苷酸)，其中核酸编码包括特异性结合对的第一成员的衣壳蛋白，(b)分离步骤(a)的包括特异性结合对的第一成员的表达的衣壳蛋白或包括其的衣壳，和(c)在适合于允许在第一与第二成员之间形成异肽键的条件下将衣壳蛋白或衣壳与特异性结合对的第二同源成员一起培育，其中特异性结合对的第二同源成员与靶向配体融合。
在一些实施例中，包装细胞进一步包括有包括所关注的核苷酸的辅助质粒和/或转移质粒。在一些实施例中，方法进一步包括从培养上清液分离自互补的腺相关病毒载体。在一些实施例中，方法进一步包括溶解包装细胞和将单链腺相关病毒载体与细胞溶解物分离。在一些实施例中，方法进一步包括(a)清除细胞碎片，(b)用核酸酶，例如DNA酶I和MgCl2处理含有病毒载体的上清液，(c)浓缩病毒载体，(d)纯化病毒载体，和(e)(a)-(d)的任何组合。
适用于产生本文所述的病毒载体的包装细胞包含例如容许病毒的动物细胞，或被修饰以容许病毒的细胞；或包装细胞构筑体，例如通过使用如磷酸钙的转化剂。适用于产生本文所述的病毒载体的包装细胞系的非限制性实例包含例如人胚肾293(HEK-293)细胞(例如美国菌种保藏中心[ATCC]编号CRL-1573)、含有SV40 Large T-抗原的HEK-293细胞(HEK-293T或293T)、HEK293T/17细胞、人肉瘤细胞系HT-1080(CCL-121)、成淋巴细胞样细胞系Raji(CCL-86)、成胶质细胞瘤-星形细胞瘤上皮样细胞系U87-MG(HTB-14)、T-淋巴瘤细胞系HuT78(TIB-161)、NIH/3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(例如ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、HeLa细胞(例如ATCC编号CCL-2)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RATI细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、HLHepG2细胞、CAP细胞、CAP-T细胞等。
L929细胞、概述于Cosset等人(1995)《病毒学杂志》69,7430-7436中的FLY病毒包装细胞系统、NS0(鼠类骨髓瘤)细胞、人羊水细胞(例如CAP、CAP-T)、酵母细胞(包含但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris))、植物细胞(包含但不限于烟草NTl、BY-2)、昆虫细胞(包含但不限于SF9、S2、SF21、Tni(例如High 5))或细菌细胞(包含但不限于大肠杆菌(E.coli))。
关于其它包装细胞和系统、用于将核酸基因组包装至假型病毒载体中的包装技术和载体，参见例如Polo等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,(1999)96:4598-4603。包装方法包含使用永久性表达病毒组分的包装细胞，或通过用质粒瞬时转染细胞。
其它实施例包含将病毒重定向至靶细胞和/或将报告基因或治疗基因递送至靶细胞的方法，所述方法包括在体外或在体内转导细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使靶细胞与包括本文所述的衣壳的病毒载体接触，其中衣壳包括特异性结合由靶细胞表达的受体的靶向配体。在一些实施例中，靶细胞在体外。在其它实施例中，靶细胞在个体，例如人的体内。
靶细胞
可靶向多种细胞以使用如本文中所公开的重组病毒载体递送所关注的核苷酸。靶细胞一般将基于所关注的核苷酸和所需的效果来选择。
在一些实施例中，可递送所关注的核苷酸以使得靶细胞能够产生蛋白质，所述蛋白质补偿生物体中的缺陷，如酶缺陷或免疫缺陷，如X连锁重症综合性免疫缺陷。因此，在一些实施例中，通常将在动物中产生蛋白质的细胞被靶向。在其它实施例中，在其中蛋白质将最有益的区域中的细胞被靶向。
在其它实施例中，所关注的核苷酸，如编码siRNA的基因可抑制靶细胞中特定基因的表达。所关注的核苷酸可例如抑制病原体生命周期中涉及的基因的表达。因此，可靶向易被病原体感染或被病原体感染的细胞。在其它实施例中，所关注的核苷酸可抑制负责在靶细胞中产生毒素的基因的表达。
在其它实施例中，所关注的核苷酸可编码杀灭细胞的毒性蛋白，所关注的核苷酸表达于所述细胞中。在此情况下，可靶向肿瘤细胞或其它非所需的细胞。
在其它实施例中，所关注的核苷酸编码治疗蛋白。
一旦鉴别出在其中期望所关注的核苷酸的表达的特定靶细胞群体，选择特异性表达于靶细胞群体上的靶受体。靶受体可仅表达于细胞群体上或在比其它细胞群体更大的程度上表达于细胞群体上。表达越有特异性，则可将越有特异性的递送定向至靶细胞。取决于上下文，标记(以及因此基因递送)的特异性的所需量可变化。例如，为了引入毒性基因，高特异性为最优选的，以避免杀死非靶向细胞。为了表达用于收获的蛋白质，或表达在其中期望全域影响的分泌产物，可能需要较少的标记特异性。
如上文所论述，靶受体可为任何受体，可针对所述受体鉴别或产生靶向配体。优选地，靶受体为肽或多肽，如受体。但是，在其它实施例中，靶受体可为碳水化合物或其它可由结合搭配物识别的分子。如果已知用于靶受体的结合搭配物，例如配体，则其可用作亲和分子。但是，如果未知结合分子，则可使用标准程序产生靶受体的抗体。抗体可接着用作靶向配体。
因此，可基于多种因素选择靶细胞，包含例如(1)特定应用(例如疗法、待收集的蛋白质的表达和赋予抗病性)和(2)具有所需量的特异性的标记的表达。
靶细胞不以任何方式限制且包含种系细胞和细胞系以及体细胞和细胞系。靶细胞可为源自任何来源的干细胞。当靶细胞为种系细胞时，靶细胞优选地选自由单细胞胚胎和胚胎干细胞(ES)组成的群组。
药物组合物、剂型和施用
另一实施例提供包括至少一种根据本发明的重组病毒衣壳蛋白和适当靶向配体和/或根据本发明的核酸的药物。优选地，此类药物适用于基因转移粒子。
本文还公开包括本文所述的病毒粒子和药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。另外，本文公开包括本文所述的病毒粒子的药物剂型。
如本文所论述，本文所述的病毒粒子可用于各种治疗应用(体内和离体)和用作研究工具。
本文公开的基于病毒粒子的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体和/或赋形剂以任何常规方式配制。病毒粒子可被配制成用于通过例如注射、吸入或隔离(通过口腔或鼻子)施用，或通过经口、经颊、非经肠或经直肠施用，或通过直接施用至肿瘤。
药物组合物可被配制成用于多种施用模式，包含全身、局部或局部化施用。技术和配制物可见于例如《雷明顿氏药物科学(Remrnington's Pharmaceutical Sciences)》,Meade Publishing Co.,Easton,Pa中。对于全身施用，注射为优选的，包含肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下。出于注射目的，药物组合物可在液体溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hank's solution)或林格氏溶液(Ringer's solution)中配制。另外，药物组合物可以固体形式配制且在使用前立即再溶解或悬浮。药物组合物的冻干形式也是合适的。
对于经口施用，药物组合物可呈例如通过常规方式用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊形式，所述赋形剂例如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂也可通过所属领域中众所周知的方法包覆。用于经口施用的液体制剂可呈例如溶液、糖浆或悬浮液形式，或其可以干燥产品形式呈现，在使用之前用水或其它合适的媒剂复原。此类液体制剂可通过常规方式用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒剂(例如ationd油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制剂在适当时还可含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
药物组合物可被配制成用于通过注射，例如通过快速注射或连续输注进行非经肠施用。用于注射的配制物可以单位剂型呈现于例如安瓿或多剂量容器中，其中任选地添加有防腐剂。药物组合物可进一步配制为油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液，且可含有其它试剂，包含悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
另外，药物组合物还可配制为积存制剂。这些长效配制物可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射施用。因此，举例来说，所述化合物可用合适的聚合材料或疏水性材料(例如呈可接受的油中的乳液形式)或离子交换树脂，或呈微溶性衍生物形式，例如呈微溶性盐形式配制。其它合适的递送系统包含微球，其使得有可能在长时段内局部非侵入性递送药物。此技术可包含具有前毛细管尺寸的微球，其可通过冠状动脉导管注射至器官的任何选定部分中而不引起发炎或缺血。施用的治疗剂从微球缓慢释放且由所选组织中存在的周围细胞吸收。
全身施用还可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在配制物中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂为所属领域中一般已知的，且例如对于经粘膜施用包含胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，清洁剂可用于促进渗透。经粘膜施用可使用鼻喷雾剂或栓剂进行。对于局部施用，本文所述的病毒粒子可配制成所属领域中一般已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。也可局部使用洗涤溶液来治疗损伤或发炎，以加速愈合。
适合于注射使用的药物形式可包含无菌水溶液或分散液；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的配制物；和用于无菌可注射溶液或分散液的即用型制剂的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须为无菌的却必须为流体。其必须在制造条件和某些储存参数(例如制冷和冷冻)下稳定，且必须保藏免受微生物，如细菌和真菌的污染作用。
如果本文公开的配制物用作增强个体的免疫反应的治疗剂，则治疗剂可配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包含酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，且其由例如盐酸或磷酸的无机酸，或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可源自无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体也可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用如卵磷脂的涂层、通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过所属领域中已知的各种抗细菌剂和抗真菌剂实现微生物作用的预防。在许多情况下，将优选地包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射组合物的长期吸收。
可通过将所需量的活性化合物或构筑体与上文列举的各种其它成分一起并入适当溶剂中，视需要接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。
在配制后，溶液可以与剂量配制物相容的方式并且以治疗有效的量施用。配制物易于以多种剂型施用，如上文所述的可注射溶液的类型，但也可采用缓释胶囊或微粒和微球等。
例如，对于在水溶液中的非经肠施用，必要时应适当地缓冲溶液，且首先用足够生理盐水或葡糖使液体稀释剂呈现等渗。这些特定水溶液尤其适合于静脉内、瘤内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在此上下文中，可采用的无菌水性介质将为所属领域的技术人员鉴于本公开所已知的。例如，一个剂量可溶解于1ml等渗NaCl溶液中，且添加至1000ml皮下输液流体或注射于提出的输注部位。
负责施用的人员将在任何情况下确定个别个体的合适剂量。例如，取决于需要或暴露于病原生物体或个体的病况(例如癌症)，可持续一定时段每天或每周，或每月、每年两次或每年向个体施用本文所述的病毒粒子。
除了被调配成用于不经肠施用，如静脉内、瘤内、皮内或肌肉内注射的化合物以外，其它药学上可接受的形式包含例如片剂或用于经口施用的其它固体；脂质体配制物；定时释放胶囊；可生物降解和当前使用任何其它形式。
还可使用鼻内或可吸入溶液或喷雾、气溶胶或吸入剂。鼻用溶液可为被设计成以滴剂或喷雾向鼻通道施用的水溶液。可制备鼻用溶液，以使其在许多方面类似于鼻分泌物。因此，水性鼻用溶液通常为等渗的且被略微缓冲以维持5.5至7.5的pH。另外，必要时可在配制物中包含抗微生物防腐剂(与用于眼用制剂的那些类似)和适当的药物稳定剂。各种商业鼻用制剂为已知的，且可包含例如抗生素和抗组织胺且用于预防哮喘。
口服配制物可包含赋形剂，如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放配制物或粉末的形式。在某些限定的实施例中，口服药物组合物将包含惰性稀释剂或可吸收的可食用载体，或其可封闭于硬壳或软壳明胶胶囊中，或其可压缩成片剂，或其可直接与饮食合并。对于口服治疗施用，活性化合物可与赋形剂合并且以可摄取的片剂、口含片、糖衣片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、粉片等形式使用。
片剂、糖衣片、丸剂、胶囊等还可含有以下：粘合剂，例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；且可添加甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，例如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除了上述类型的材料之外，其可含有液体载体。各种其它材料可以涂层形式存在或用来以其它方式调节剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或两者包覆。酏剂的糖浆可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料以及调味剂，如樱桃或橙味调味剂。
本文公开的其它实施例可涉及与方法和组合物一起使用的试剂盒。试剂盒还可包含合适的容器，例如小瓶、管、微型或微量离心管、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器。当提供额外的组分或试剂时，试剂盒可含有一个或多个可将此试剂或组分放入其中的额外容器。本文的试剂盒通常还将包含用于容纳病毒粒子的装置和任何其它密闭的试剂容器以供商业销售。此类容器可包含注射或吹塑成型塑料容器，其中可存留所需小瓶。任选地，所述组合物可能需要一种或多种额外活性剂，如消炎剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗细菌剂或抗肿瘤剂。
本文公开的组合物可通过所属领域中已知的任何方式施用。例如，组合物可包含静脉内、瘤内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌肉内、鞘内、皮下、结膜下、囊泡内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中向个体施用。
所属领域的技术人员已知的任何方法可用于大规模产生本文所述的病毒粒子、包装细胞和粒子构筑体。例如，可在GMP条件下在合格的原代CEF中或通过其它方法制备母液和工作种子储备液。包装细胞可涂铺于大表面积的烧瓶上，生长至接近汇合且纯化病毒粒子。可收获细胞且将病毒粒子释放至培养基中，分离且纯化，或通过机械破坏释放细胞内病毒粒子(细胞碎片可通过大孔深度过滤去除且用核酸内切酶消化宿主细胞DNA)。病毒粒子可随后通过切向流过滤，接着透滤来纯化和浓缩。所得浓缩的块体可通过用含有稳定剂的缓冲液稀释来配制，填充至小瓶中且冻干。组合物和配制物可储存以供后续使用。为了使用，冻干的病毒粒子可通过添加稀释剂复原。
用于组合疗法的某些额外药剂可通过所属领域中已知的任何方法来配制和施用。
如本文中所公开的组合物还可包含佐剂(如铝盐和其它矿物质佐剂)、表面活性剂、细菌衍生物、媒剂和细胞因子。佐剂还可具有拮抗免疫调节特性。例如，佐剂可刺激Th1或Th2免疫性。如本文中所公开的组合物和方法还可包含辅助疗法。
其他实施方式：
实施方式1.一种重组病毒衣壳蛋白，其包括可操作地连接于所述衣壳蛋白的蛋白质:蛋白质结合对的第一成员，任选地其中所述第一成员为肽标签，且任选地其中所述第一成员和/或突变降低或消除所述衣壳蛋白的天然向性。
实施方式2.根据实施方式1所述的重组病毒衣壳蛋白，其进一步包括所述蛋白质:蛋白质结合对的第二同源成员，其中所述第一和第二成员由共价键结合。
实施方式3.根据实施方式2所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述共价键为异肽键。
实施方式4.根据实施方式2至3中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第二成员可操作地连接于靶向配体，任选地其中所述靶向配体为结合部分。
实施方式5.根据实施方式1至4中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员由将所述第一成员连接至所述衣壳蛋白的第一和/或第二连接子侧接，且其中所述第一和/或第二连接子的长度各自独立地为至少一个氨基酸。
实施方式6.根据实施方式5所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一和第二连接子不相同。
实施方式7.根据实施方式5所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一和第二连接子相同且长度为10个氨基酸。
实施方式8.根据实施方式1至7中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其进一步包括在涉及所述病毒衣壳蛋白与其天然受体的结合的氨基酸位置处的突变，其中所述突变包括将异源肽插入至所述衣壳蛋白中、用异源肽取代所述衣壳蛋白的一个或多个氨基酸、所述衣壳蛋白的一个或多个氨基酸的缺失或其组合。
实施方式9.根据实施方式1至8中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述重组病毒衣壳蛋白的转导效率：
(i)降低10％，
(ii)降低20％，
(iii)降低30％，
(iv)降低40％，
(v)降低50％，
(vi)降低60％，
(vii)降低70％，
(viii)降低80％，
(ix)降低90％，或
(x)被消除。
实施方式10.根据实施方式1至9中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白衍生自腺相关病毒(AAV)的衣壳基因，其中所述衣壳基因编码AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，且任选地进一步包括在涉及所述衣壳的结合的氨基酸位置处的突变。
实施方式11.根据实施方式10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述AAV选自由以下组成的群组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
实施方式12.根据实施方式10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述腺相关病毒为AAV2。
实施方式13.根据实施方式10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述腺相关病毒为AAV9。
实施方式14.根据实施方式1至13中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述蛋白质:蛋白质结合对为：
(i)SpyTag:SpyCatcher，
(ii)SpyTag:KTag，
(iii)Isopeptag:pilin-C，
(iv)SnoopTag:SnoopCatcher，或
(v)SpyTag002:SpyCatcher002。
实施方式15.根据实施方式1至14中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员和任何连接子在一起的长度不超过约50个氨基酸。
实施方式16.根据实施方式1至15中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员为SpyTag。
实施方式17.根据实施方式2至16中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第二同源成员为SpyCatcher。
实施方式18.根据实施方式2至16中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第二同源成员为KTag。
实施方式19.根据实施方式2至15中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员为KTag且所述第二同源成员为SpyTag。
实施方式20.根据实施方式2至15中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员为SnoopTag且所述第二同源成员为SnoopCatcher。
实施方式21.根据实施方式2至15中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员为isopeptag且所述第二同源成员为Pilin-C。
实施方式22.根据实施方式2至15中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第一成员为SpyTag002且所述第二同源成员为SpyCatcher002。
实施方式23.根据实施方式1至22中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中相比于包括适当靶向配体的所述病毒衣壳蛋白或衣壳，所述重组病毒衣壳蛋白或包括所述重组病毒衣壳蛋白的病毒衣壳在不存在所述适当靶向配体的情况下具有减少至消除的对靶细胞的感染。
实施方式24.根据实施方式4至23中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述结合部分为抗体或其部分。
实施方式25.根据实施方式24所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述抗体或其部分与SpyCatcher融合。
实施方式26.根据实施方式25所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述抗体或其部分与连接子在C端融合，且所述连接子与SpyCatcher在所述连接子的C端融合。
实施方式27.根据实施方式26所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述连接子包括阐述为SEQ ID NO:48(GSGESG)的序列。
实施方式28.根据实施方式4至27中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述靶向配体包括阐述为SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
实施方式29.根据实施方式4至28中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述靶向配体特异性结合细胞表面分子，任选地其中细胞表面标记为
(i)脱唾液酸糖蛋白1(ASGR1)，
(ii)ENTPD3，
(iii)PTPRN，
(iv)CD20，
(v)CD63，或
(vi)Her2。
实施方式30.根据实施方式29所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述细胞表面分子为脱唾液酸糖蛋白1(ASGR1)。
实施方式31.根据实施方式29所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述细胞表面分子为CD63。
实施方式32.根据实施方式29所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述细胞表面分子为ENTDP3。
实施方式33.一种重组病毒衣壳，其包括根据实施方式1至32中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白。
实施方式34.根据实施方式33所述的重组病毒衣壳，其进一步包括缺少特异性结合对的任何成员的参考病毒衣壳蛋白。
实施方式35.根据实施方式34所述的重组病毒衣壳，其中所述重组病毒衣壳蛋白和所述参考病毒衣壳蛋白各自包括涉及病毒粒子与其天然配体的结合的至少一个残基的突变。
实施方式36.根据实施方式34至35中任一项所述的重组病毒衣壳，其包括比率在1:1与1:15之间的所述重组病毒衣壳蛋白和所述参考病毒衣壳蛋白。
实施方式37.一种重组病毒载体，其包括由根据实施方式33至36中任一项所述的重组病毒衣壳囊封的所关注的核苷酸。
实施方式38.根据实施方式37所述的重组病毒粒子，其中所述所关注的核苷酸在选自由以下组成的群组的启动子的控制下：病毒启动子、细菌启动子、哺乳动物启动子、禽类启动子、鱼类启动子、昆虫启动子和其任何组合。
实施方式39.根据实施方式37所述的重组病毒粒子，其中所述所关注的核苷酸在人类启动子的控制下。
实施方式40.根据实施方式37所述的重组病毒粒子，其中所述所关注的核苷酸在非人类启动子的控制下。
实施方式41.根据实施方式37至40中任一项所述的重组病毒粒子，其中所述所关注的核苷酸为报告基因。
实施方式42.根据实施方式41所述的重组病毒粒子，其中所述报告基因编码绿色荧光蛋白。
实施方式43.根据实施方式41所述的重组病毒粒子，其中所述报告基因编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶(所编码的lacZ基因)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、MmGFP、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、Emerald、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、荧光素酶、碱性磷酸酶或其组合。
实施方式44.根据实施方式37至40中任一项所述的重组病毒粒子，其中所述所关注的核苷酸选自由以下组成的群组：编码治疗蛋白的基因、自杀基因、编码抗体或其片段的核苷酸、编码CRISPR/Cas系统或其部分的核苷酸、编码反义RNA的核苷酸和编码shRNA的核苷酸。
实施方式45.一种组合物，其包括(a)根据实施方式33至36中任一项所述的病毒衣壳或根据实施方式37至44中任一项所述的病毒载体，和(b)药学上可接受的载体。
实施方式46.一种将所关注的核苷酸递送至靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与根据实施方式37至44中任一项所述的病毒粒子或根据实施方式45所述的组合物接触，且其中所述病毒衣壳包括特异性结合在所述靶细胞的表面上表达的蛋白质的靶向配体。
实施方式47.根据实施方式46所述的方法，其中所述靶细胞在体外。
实施方式48.根据实施方式46所述的方法，其中所述靶细胞在个体的体内。
实施方式49.根据实施方式48所述的方法，其中所述个体为人类。
实施方式50.根据实施方式46至49中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为人类靶细胞。
实施方式51.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶细胞为人类肝细胞，且其中所述靶向配体结合人类脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR1)。
实施方式52.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶细胞为人类神经元细胞，且其中所述靶向配体结合GABA。
实施方式53.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶细胞为人类T细胞，且其中所述靶向配体结合CD3，任选地CD3ε。
实施方式54.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶向配体结合PTPRN。
实施方式55.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶细胞为人类造血细胞，且其中所述靶向配体结合CD34。
实施方式56.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶细胞为人类肾细胞。
实施方式57.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶细胞为人类癌细胞，且其中所述靶向配体结合肿瘤相关抗原。
实施方式58.根据实施方式57所述的方法，其中所述肿瘤抗原为E6、E7或Her2。
实施方式59.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶向配体结合CD20。
实施方式60.根据实施方式50所述的方法，其中所述靶向配体结合人类胰高血糖素受体。
实施方式61.根据实施方式46至50中任一项所述的方法，其中所述靶向配体特异性结合CD63。
实施方式62.根据实施方式46至50中任一项所述的方法，其中所述靶向配体特异性结合人类外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(hENTPD3)。
实施方式63.一种用骨架和/或接附子提供病毒衣壳蛋白的方法，其包括
(a)将编码特异性蛋白质:蛋白质结合对的第一成员和任选地连接子的核酸插入至编码病毒衣壳蛋白的核酸序列中，以形成编码基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列，所述基因修饰的衣壳蛋白包括所述特异性结合对的第一成员和任选地所述连接子，和
(b)在足以产生病毒粒子的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包括所述核酸。
实施方式64.一种产生病毒粒子的方法，其包括在足以产生病毒粒子的条件下培养包装细胞，其中所述包装细胞包括编码基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列，所述基因修饰的衣壳蛋白包括特异性蛋白质:蛋白质结合对的第一成员，和任选地将所述第一成员连接至所述衣壳蛋白的氨基酸连接子。
实施方式65.根据实施方式63或64所述的方法，其中所述包装细胞进一步包括有包括所关注的核苷酸的辅助质粒和/或转移质粒。
实施方式66.根据实施方式63至65中任一项所述的方法，其中所述包装细胞进一步包括编码参考嵌合衣壳的质粒。
实施方式67.根据实施方式63至66中任一项所述的方法，其进一步包括溶解所述包装细胞和将腺相关病毒载体与细胞溶解物分离。
实施方式68.根据实施方式63至67中任一项所述的方法，其进一步包括
a.清除细胞碎片，
b.用核酸酶处理含有病毒粒子的上清液，
c.浓缩病毒粒子，
d.纯化所述病毒粒子，和
e.a.-d.的任何组合。
实施方式69.根据实施方式63至68中任一项所述的方法，其中所述编码基因修饰的衣壳蛋白的核苷酸序列进一步包括在涉及所述衣壳蛋白的天然向性的位置处的氨基酸的突变，其中所述突变包括将异源肽插入至所述衣壳蛋白中、用异源肽取代所述衣壳蛋白的一个或多个氨基酸、所述衣壳蛋白的一个或多个氨基酸的缺失或其组合。
实施方式70.一种病毒粒子，其根据实施方式63至69中任一项所述的方法制得。
实施方式71.一种包装细胞，其用于产生病毒粒子，所述病毒粒子包括编码根据实施方式1至32中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白的质粒。
实施方式72.一种重组载体，其编码根据实施方式1至32中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白。
实例
仅出于说明性目的提供以下实例并且不打算限制本发明的范围。
材料和方法
细胞系和抗体
将所有293细胞系维持于补充有10％ FBS、1％ Pen/Strep和1％ L-谷氨酰胺的DMEM中。通过用表达对应cDNA的载体对亲本293细胞系进行慢病毒转导来产生293hErbB2和293hASGR1/2细胞系。所有细胞系均获自Regeneron TC核心设施。B1抗体识别由AAV VP1、VP2和VP3共用的线性表位。
AAV衣壳蛋白构筑体
编码所需SpyTag插入的GeneBlocks、侧接连接子氨基酸和其它突变体购自IDT且根据制造商的方案(NEB)使用Gibson Assembly克隆至BsiWI和XcmI消化的pAAV2-CAP wt或pAAV9-CAP wt中。
SpyCatcher与抗体的融合
编码SpyCatcher的GeneBlocks购自IDT，且Gibson Assembly用于将编码序列框内克隆至每个构筑体的C末端处用于scFv或抗体重链的表达质粒中，由柔性氨基酸连接子GSGESG(SEQ ID NO:48)分离。
制备AAV病毒载体
通过使用具有以下质粒的PEI Pro转染293T包装细胞来产生病毒：pAd Helper、编码报告蛋白的含有AAV2 ITR的基因组质粒和编码AAV Rep和Cap基因的pAAV-CAP质粒，具有或不具有编码scFv或抗体的重链和轻链的额外质粒。scFv和抗体重链构筑体全部在其C末端与SpyCatcher融合，如上文所述。在OptiMEM中进行转染，且在8小时之后将培养基变为补充有10％ FBS、1％ Pen/Strep和1％ L-Glut的DMEM。
将转染的包装细胞在37℃下培育3天，接着使用标准冻融方案自细胞溶解物收集病毒。简单来说，通过刮削使包装细胞剥落且对其进行粒化。去除上清液，且将细胞再悬浮于50mM Tris-HCl；150mM NaCl；和2mM MgCl2[pH 8.0]的溶液中。通过经由三个连续冻融循环诱导细胞溶解来释放细胞内病毒粒子，所述冻融循环由在剧烈涡旋下使细胞悬浮液在干冰/乙醇浴与37℃水浴之间穿梭组成。通过在37℃下在偶尔混合下用EMD MilliporeBenzonase(50U/ml细胞溶解物)处理溶解物60分钟来降低粘度。接着通过离心使碎片粒化，且将所得上清液过滤通过0.22μm PVDF Millex-GV过滤器，直接进入具有Ultracel-100膜(100KDa MWCO)滤筒的Amicon Ultra-15离心过滤器单元(Centrifugal Filter Unit)的上部腔室中。将过滤器单元以5-10分钟时间间隔离心，直至在上部腔室中达到所需体积，接着将浓缩的粗病毒吸移至低蛋白质结合管中且储存于4C下。通过qPCR使用已知浓度的病毒的标准曲线来测定效价(病毒基因组/毫升vg/mL)。
细胞感染/转导和流式细胞分析
为了感染细胞，将病毒粒子直接添加至培养细胞的培养基中，且将混合物在37℃下培育过夜。在24小时后更换每个孔中的培养基，且将细胞培育5天。在感染后第5天，对细胞进行胰蛋白酶处理，再悬浮于具有2％ FBS的PBS中，且在BD FACSCanto流式细胞仪上收集GFP+细胞的百分比且使用FlowJo软件分析。
蛋白质印迹分析
通过蛋白质印迹分析来监测SpyTagged AAV蛋白VP1、VP2和VP3与SpyCatcher标记的抗体或scFv之间的反应。将具有还原剂的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液添加至相等体积的粗病毒制备物中，且将样品加热至85℃后维持5分钟，接着冷却至室温且装载至预制的4-12％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上。蛋白质通过还原性SDS-PAGE分离且通过湿转印在PVDF上产生印迹。将膜用Li-Cor Odyssey TBS封闭缓冲液封闭且用在4℃下在TBST中1:100稀释过夜的小鼠单克隆B1抗体(ARP American Research Products,Inc.)探测。在TBST中洗涤印迹，用红外结合的抗小鼠二级抗体探测且在Li-Cor Odyssey上成像。
实例1scFv与在残基N587处插入至AAV2衣壳中的肽的结合引导抗原特异性靶向
如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
pAd Helper 8μg
pAAV-CMV-hrGFP 4μg
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4μg
具有或不具有
pCMV-C6.5-SpyCatcher 4μg
通过流式细胞分析对如上文所述的与病毒粒子一起培育的细胞评估感染。
在存在或不存在C6.5-SpyCatcher的情况下产生具有肝素结合突变(HBM)R585A和R588A，以及衣壳位置N587处的SpyTag肽的AAV2，C6.5-SpyCatcher是结合HER2且在其C端与SpyCatcher融合的scFv。与靶向HER2的scFv结合的AAV2特异性感染HER2+细胞，且显示HER2-细胞的极少背景感染。图1。
实例2抗体与在残基N587处插入至AAV2衣壳中的肽的结合引导抗原特异性靶向
如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
pAd Helper 8μg
pAAV-CMV-hrGFP 4μg
pAAV2-CAP wt 4μg
或
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4μg
具有或不具有
p抗HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5μg
p抗HER2 Vk 3μg
在存在或不存在编码SpyCatcher-Herceptin的抗体重链和轻链的情况下产生野生型AAV2和具有肝素结合突变(HBM)R585A和R588A，以及衣壳位置N587处的SpyTag肽的AAV2，SpyCatcher-Herceptin是结合HER2且在重链的C端与SpyCatcher融合的抗体。通过流式细胞分析评估如上文所述的被病毒粒子感染的细胞，以监测转导。与靶向HER2的抗体结合的AAV2特异性感染HER2+细胞，且显示HER2-细胞的极少背景感染。图2。
实例3抗体与在残基G453处插入至AAV2衣壳中的肽的结合引导抗原特异性靶向
残基N587和G453各位于形成远离病毒粒子表面延伸的蛋白质尖峰的AAV2衣壳的暴露区域上。残基位于两个不同尖峰上，因此研究了在残基G453之后插入的SpyTag是否将与在残基N587之后插入的SpyTag以相同方式起作用。如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
或
pAAV2-CAP wt 4μg
具有或不具有
p抗HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1.5μg
p抗HER2 Vk 3μg
在存在或不存在编码SpyCatcher-Herceptin的抗体重链和轻链的情况下产生野生型AAV2和具有肝素结合突变(HBM)R585A和R588A以及衣壳位置G453处的SpyTag肽的AAV2，SpyCatcher-Herceptin是结合HER2且在重链的C端与SpyCatcher融合的抗体。通过混合表达SpyTag的衣壳与HBM衣壳以嵌合体形式产生病毒。通过流式细胞分析评估如上文所述的被病毒粒子感染的细胞，以监测转导。与靶向HER2的抗体结合的AAV2特异性感染HER2+细胞，且显示HER2-细胞的极少背景感染。图3
实例4增加scFv对AAV病毒粒子的修饰降低其感染性
致力于优化SpyTag-SpyCatcher反应的效率，通过在每侧上用柔性连接子氨基酸侧接肽标签来改进病毒表面上的SpyTag的可接近性。产生由增加的连接子长度侧接的一组N587 SpyTag插入突变体，且在存在或不存在C6.5-SpyCatcher(结合HER2且在其C端与SpyCatcher融合的scFv)的情况下使用这些AAV2 Rep-Cap构筑体制备病毒。通过蛋白质印迹法监测SpyTagged AAV2蛋白VP1、VP2和VP3与SpyCatcher标记的C6.5之间的反应；根据SDS-PAGE，与SpyCatcher标记的scFv反应的SpyTagged衣壳蛋白展现尺寸增加。通过流式细胞分析评估如上文所述的被病毒粒子感染的细胞，以测量转导。
如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
pAAV2-CAP N587连接子SpyTag构筑体包含：
pAAV2-CAP N587连接子1SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子2SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子4SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子6SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子8SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子10SpyTag HBM
当SpyTag不由连接子氨基酸侧接时，不可通过蛋白质印迹法检测到VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv复合物，且病毒实现HER2+细胞的低水平的特异性转导。图4。随着连接子长度增加(1-6个氨基酸)，VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv复合物开始可通过蛋白质印迹法检测到，且病毒的转导效率提高。图4。但是，当SpyTag由两个最长连接子(8-10个氨基酸)侧接时，根据蛋白质印迹法，几乎所有VP蛋白与SpyCatcher-Vh反应，但这些完全装饰的病毒不再有效地转导细胞。图4。因此，看起来scFv对AAV粒子的过度修饰对其转导靶细胞的能力不利，且仅需少量结合的scFv来将病毒再靶向至靶细胞。
实例5增加抗体对AAV病毒粒子的修饰降低其感染性
使用由增加的连接子长度侧接的一组N587 SpyTag插入突变体，在存在或不存在编码SpyCatcher-Herceptin(结合HER2且在重链的C端与SpyCatcher融合的抗体)的抗体重链和轻链的情况下使用这些AAV2 Rep-Cap构筑体制备病毒。通过蛋白质印迹法监测SpyTagged AAV蛋白VP1、VP2和VP3与SpyCatcher标记的Herceptin重链(Vh)之间的反应；根据SDS-PAGE，与SpyCatcher标记的抗体反应的SpyTagged衣壳蛋白将展现尺寸偏移。
如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
pAAV2-CAP N587连接子SpyTag构筑体包含：
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子1SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子2SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子4SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子6SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子8SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587连接子10SpyTag HBM
当SpyTag不由连接子氨基酸侧接或由极短氨基酸侧接时，未通过蛋白质印迹法检测到VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物，但病毒以接近野生型水平的效率特异性感染HER2+细胞。图5。相反，当SpyTag由较长连接子(6个氨基酸或更长)侧接时，根据蛋白质印迹法，几乎所有VP蛋白与SpyCatcher-Vh反应，但这些完全装饰的病毒不再具有感染性。图5。增加抗体对AAV粒子的修饰对其转导靶细胞的能力不利，且仅需少量结合的抗体来将病毒再靶向至靶细胞。
实例6嵌合调节病毒粒子的转导效率
由于长的柔性连接子允许SpyTagged AAV衣壳与SpyCatcher融合的scFv的有效反应，但scFv对AAV粒子的过度修饰对其转导靶细胞的能力有害，通过产生嵌合AAV粒子，其为不同比率的高反应性SpyTagged构筑体与非SpyTagged衣壳构筑体的混合物，全部具有R585A R588A肝素结合突变(HBM)，每个病毒粒子上的SpyTag的数目减少，同时SpyTag可接近性和有效反应性得以保留。如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
pAd Helper 8μg
pAAV-CMV-hrGFP 4μg
pCMV-C6.5-SpyCatcher 4μg
与不同比率的：
pAAV2-CAP N587连接子10SpyTag HBM Xμg
pAAV2-CAP R585A R588A Xμg
或
与不同比率的：
pAAV2-CAP N587连接子10SpyTag HBM Xμg
pAAV2-CAP R585A R588A Xμg
或
与不同比率的：
pAAV2-CAP G453连接子X SpyTag HBM Xμg
pAAV2-CAP R585A R588A Xμg
pAAV2-CAP N587连接子10SpyTag HBM与pAAV2-CAP R585AR588A质粒之间的比率为转染混合物中的1:0(4μg:0μg)(其表示纯pAAV2-CAP N587连接子10SpyTag HBM病毒粒子)、3:1(3μg:1μg)、1:1(2μg:2μg)或1:3(1μg:3μg)。pAAV2-CAP G453连接子10SpyTag HBM与pAAV2-CAP R585A R588A之间的比率为转染混合物中的1:0(4μg:0μg)(其表示纯pAAV2-CAP G453连接子10SpyTag HBM病毒粒子)、1:3(1μg:3μg)或1:7(0.5μg:3.5μg)。通过蛋白质印迹法监测SpyTagged AAV蛋白VP1、VP2和VP3与SpyCatcher标记的抗HER scFv或SpyCatcher标记的Herceptin重链(Vh)之间的反应；根据SDS-PAGE，与SpyCatcher标记的scFv或抗体反应的SpyTagged衣壳蛋白将展现尺寸偏移。N587 SpyTag连接子组与SpyCatcher-抗HER2scFv的反应在图6中示出。N587 SpyTag连接子组与SpyCatcher-抗HER2抗体的反应在图7中示出。通过流式细胞分析来评估上文所述的被嵌合病毒粒子感染的细胞，以测量转导图6-7。随着高反应性连接子10侧接的SpyTag衣壳的量减少，且非SpyTagged衣壳的数目增加，通过蛋白质印迹法观察到VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv复合物的量的减少，连同病毒转导效率的增加图6-7。证实了装饰病毒粒子的抗体的数目与再靶向病毒的转导效率之间的反比关系。
G453 SpyTag HBM和G453连接子10SpyTag HBM与SpyCatcher-抗HER2抗体的反应在图8中示出。如根据蛋白质印迹法所测量，G453处的两种SpyTag插入物(单独的SpyTag或由连接子10侧接的SpyTag)均与SpyCatcher标记的Herceptin极有效地反应，表明G453插入位点天然地比N587更可接近，N587除非由连接子氨基酸侧接，否则不易反应。如在N587连接子组的情况下所观察到的，当病毒被SpyCatcher-Herceptin抗体大量修饰时，病毒不再具有感染性。因此，看起来抗体对AAV粒子的高水平的修饰对其转导靶细胞的能力不利，且得出如下结论：在G453之后插入的SpyTag天然地比在N587处插入的SpyTag更可接近。
实例7 SpyTag-SpyCatcher系统可与额外抗体-标靶对一起使用以实现体外特异 性再靶向
检查SpyTag-SpyCatcher方法将AAV再靶向至除HER2以外的标靶的能力。靶向额外细胞表面蛋白的SpyCatcher标记的抗体被克隆，且检查这些抗体将SpyTagged AAV再靶向至表达这些额外标靶的细胞类型的能力。对于以ASGR1和CD63为目标的实验，如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
具有或不具有
SpyCatcher融合的Vh重链质粒 1.5μg
Vk轻链质粒 3μg
对于以PTPRN为目标的实验，如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
具有或不具有
SpyCatcher融合的Vh重链质粒 1.5μg
Vk轻链质粒 3μg
对于以ENTPD3和CD20为目标的实验，如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
pAd Helper 8μg
pAAV-CMV-萤火虫荧光素酶 4μg
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4μg
具有或不具有
SpyCatcher融合的Vh重链质粒 1.5μg
Vk轻链质粒 3μg
测试SpyCatcher-Vh和Vk质粒，其编码识别人类蛋白ASGR1、CD63、PTPRN、ENTPD3和CD20的抗体重链和轻链。为了产生具有少数暴露的SpyTag的嵌合AAV粒子，SpyTag和非SpyTagged质粒以1:7的比率存在于转染混合物中，所述比率被预先确定为对于使用抗体再靶向AAV而言理想的SpyTag与非SpyTag衣壳的比率。表达ASGR1、CD63或PTPRN的细胞被上文所述的嵌合AAV2粒子感染，且通过流式细胞测量术测量转导。与ASGR1、CD63和PTPRN特异性抗体结合的AAV2分别能够特异性感染表达ASGR1、CD63和PTPRN的同源靶细胞，且在不存在抗体的情况下显示极低背景感染。表达ENTPD3或CD20的细胞被上文所述的AAV2粒子感染，且通过荧光素酶分析使用标准方案测量转导。与ENTPD3和CD20特异性抗体结合的AAV2分别能够特异性感染表达ENTPD3和CD20的同源靶细胞，且在不存在抗体的情况下显示极低背景感染。图9
实例8SpyTag-SpyCatcher系统可适合于再靶向AAV9
检查SpyTag-SpyCatcher系统对其它AAV血清型的适合性。AAV9是广泛使用的血清型，其产生高效价病毒，且在转导小鼠组织中非常有效。对于受体结合重要的残基在AAV2与AAV9之间不同，因为AAV2结合硫酸肝素蛋白多糖且AAV9结合半乳糖。从可用的文献(Bell,C.L.,Gurda,B.L.,Van Vliet,K.,Agbandje-McKenna,M.和Wilson,J.M.(2012).鉴别腺相关病毒血清型9衣壳的半乳糖结合域(Identification of the galactose bindingdomain of the adeno-associated virus serotype 9 capsid.)《病毒学杂志(Journalof Virology)》,86(13),7326-7333.http://doi.org/10.1128/JVI.00448-12)确定已知在受体结合中重要的残基，且包含N470、D271、N272、Y446和W503。将W503A突变选择为用于产生突变构筑体的受体结合突变，因为此单一氨基酸突变强烈降低受体结合。还鉴别与AAV2N587和G453位于其内的两个突出部分(可变环)直系同源的AAV9衣壳区域；AAV9中的对应残基为A589和G453。将SpyTag插入至AAV9衣壳内的这两个位点中，具有或不具有侧接连接子氨基酸，且与受体结合突变W503A组合。
如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的一块15cm板来产生每种病毒：
对于AAV9 wt、AAV9-CAP A589SpyT_W503A、AAV9-CAP A589连接子10SpyT_W503A和AAV9-CAP G453连接子10SpyT_W503A，4μg的每种质粒用于每一转染。
对于嵌合病毒，3.5μg的pAAV9-CAP W503A和0.5μg的pAAV9-CAP A589连接子10SpyT_W503A或pAAV9-CAP G453连接子10SpyT_W503A用于每一转染，以实现1:7的SpyTag与非SpyTagged Rep-Cap质粒的比。
如上文所述地进行细胞转导、流式细胞分析和蛋白质印迹分析。
AAV9 RC A589和G453 SpyTag插入物支持与SpyCatcher-Herceptin的反应且介导HER2+细胞的特异性转导。图10。与AAV2类似，无侧接连接子的插入在AAV9 RC A589处的SpyTag不是非常可接近的且与SpyCatcher不佳地反应。图10。相反，在SpyTag的两侧上添加氨基酸连接子使得与SpyCatcher的反应性更稳定，且具有一些高反应性SpyTag的嵌合粒子非常有效地转导靶细胞。图10。
实例9：在体内再靶向SpyTagged AAV粒子-SpyCatcher-Vh复合物
为了确定VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh是否可在体内再靶向至表达hASGR1的肝细胞，小鼠被基因修饰以使其肝细胞表达C57BL/6背景上的hASGR1，且向对照野生型小鼠血管内注射单独的野生型AAV或携有报告基因，例如绿色荧光蛋白或萤火虫荧光素酶的VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh病毒粒子(呈纯粒子或嵌合粒子形式，且具有或不具有氨基酸连接子)。对照包含被注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)的小鼠。为了确定VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh是否可从肝脏去靶向且再靶向至其它器官，向野生型小鼠血管内注射单独的野生型AAV或携有报告基因，例如绿色荧光蛋白的VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh病毒粒子(呈嵌合粒子形式)。为了展示从肝脏去靶向且再靶向至另一器官，选择蛋白质ENTPD3，因为根据公开可用的数据库(从GenePaint.org http://www.informatics.jax.org/assay/MGI:5423021和RikenFANTOM5项目，成年小鼠数据集提取的数据)，已知其不表达于肝脏中，但表达于其它器官，如胰岛细胞(Syed等人2013,《美国生理内分泌学与代谢杂志(Am J PhysiolEndocrinolMetab)》305:E1319-E1326,2013)和舌头中。
克隆靶向人类CD3、人类CD63、人类ASGR1(其中没有一个表达于野生型小鼠中)或人类ENTPD3(其也识别小鼠蛋白)的SpyCatcher标记的抗体，且检查这些抗体在体内再靶向携有eGFP或萤火虫荧光素酶的SpyTagged AAV2的能力。如上文所述地通过用以下质粒和量转染293T包装细胞的15cm板来产生每种病毒：
抗人类CD3/抗人类ASGR1 GFP
pAd Helper 8μg
pAAV-CAGG eGFP 4μg
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4μg
具有或不具有
p抗CD3或抗ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5μg
p抗CD3或抗ASGR1 Vk 3μg
抗人类CD63/抗人类ASGR1荧光素酶
具有或不具有
p抗CD63或抗ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5μg
p抗CD63或抗ASGR1 Vk 3μg
抗人类ENTPD3/抗人类ASGR1 GFP
具有或不具有
p抗ENTPD3或抗ASGR1 SpyCatcher Vh 1.5μg
p抗ENTPD3或抗ASGR1 Vk 3μg
在小鼠中测试SpyCatcher-Vh和Vk质粒，其编码识别人类蛋白ASGR1、CD3或CD63的抗体重链和轻链，所述小鼠被基因修饰以使其肝细胞表达C57BL/6背景上的hASGR1。在野生型小鼠中测试SpyCatcher-Vh和Vk质粒，其编码识别人类蛋白ASGR1(作为非靶向对照)或小鼠和人类蛋白ENTPD3的抗体。感染后十天，将小鼠处死且检查报告基因的表达；将肝脏、脾脏和肾脏固定且用鸡抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)和Alexa-488结合的抗鸡二级抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)染色。为了测试动物的发光，在感染后14天，使用异氟醚将动物麻醉，注射荧光素底物且在10分钟后使用IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)成像。图11和12显示仅在注射hASGR1再靶向的AAV的表达hASGR1的小鼠的肝脏中检测到被AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物感染，且在不表达hASGR1的野生型小鼠的肝脏中未检测到。在其它器官中未检测到阳性EGF(数据未示出)。
图13显示在注射与靶向ENTPD3或hASGR1的抗体结合的AAV后，野生型小鼠的肝脏和胰脏中的eGFP表达的免疫组织化学染色，hASGR1作为非靶向对照，因为hASGR1不表达于野生型小鼠中。在感染后四周，自感染的动物收获器官且固定于10％中性缓冲的福尔马林中48小时，接着通过免疫组织化学进行eGFP染色。图13显示AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物从野生型小鼠肝脏去靶向；所有注射与靶向ENTPD3和hASGR1的抗体结合的AAV的小鼠显示肝脏中类似的eGFP表达的缺乏。注射与靶向ENTPD3的抗体结合的AAV的小鼠具有在胰岛中表达eGFP的细胞，认为ENTPD3表达于胰岛中。
图14显示在注射与靶向ENTPD3或hASGR1的抗体结合的AAV后，野生型小鼠的肝脏和舌头中的eGFP表达的免疫组织化学染色，hASGR1作为非靶向对照，因为hASGR1不表达于野生型小鼠中。在感染后14天，自感染的动物收获器官且固定于10％中性缓冲的福尔马林中48小时，接着通过免疫组织化学进行eGFP染色。
图14显示AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物从野生型小鼠肝脏去靶向；所有注射与靶向ENTPD3和hASGR1的抗体结合的AAV的小鼠显示肝脏中类似的eGFP表达的缺乏。所有三只注射与非靶向无关抗体(抗ASGR1)结合的AAV的小鼠在舌头中未显示染色，而所有三只注射与抗ENTPD3结合的AAV的小鼠在舌头中显示表达eGFP的细胞，认为ENTPD3表达于舌头中。
实例10：将自杀基因递送至表达靶向配体的细胞
还描述VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物将治疗货物，如一个或多个自杀基因、生物治疗剂(例如抗体)、CRISPR/Cas基因编辑系统、shRNA等特异性递送至一种靶细胞类型的能力。
为了测试VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物将自杀基因递送至特定细胞的能力，使用HER2+乳腺癌的异种移植裸小鼠模型，其如由Wang等人((2010)《癌症基因疗法(CancerGene Therapy)》17:559-570)所描述。
与材料和方法中所描述类似地产生携有自杀基因(SG)的VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物。
细胞系：BT474乳腺癌、SK-BR-3乳腺癌和Calu-3肺癌细胞系为HER2阳性人类肿瘤细胞系(Bunn P.A.等人,(2001)《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》7:3239-3250；PegramM等人(1999)《癌基因(Oncogene)》18:2241-2251；Spiridon CI等人,(2002)《临床癌症研究》.8:1720-1730)。A-673横纹肌肉瘤和HeLa宫颈癌为HER2阴性人类肿瘤细胞系且BEAS-2b为永生化支气管上皮HER2阴性细胞系(Jia LT等人(2003)《癌症研究(Cancer Res)》.63:3257-3262；Kern JA等人,(1993)《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志(Am J RespirCell Mol Biol)》9:448-454；Martinez-Ramirez A等人,(2003)《癌症遗传学与细胞遗传学(Cancer Genet Cytogenet.)》2003；141:138-142)。所有这些细胞系均获自美国菌种保藏中心(ATCC,Manassas,VA)且维持于由ATCC推荐的培养基中。
小鼠：获得6至8周龄的雌性裸小鼠且在特定的无病原体条件下饲养。在第0天，小鼠被同时(1)在右侧腹皮下注射107个BT474、SK-BR-3、Calu-3、A-673或HeLa肿瘤细胞，和(2)用携有报告基因(例如EGFP)或自杀基因的VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh复合物静脉内治疗。作为对照的是未治疗的动物(仅注射肿瘤细胞的动物)、注射携有报告基因或自杀基因的野生型AAV粒子的动物、仅注射SpyTag-病毒粒子的动物等。所有动物在注射和治疗后1天用适当前药治疗。每周2次使用卡尺测量每个肿瘤的尺寸，且肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.52。在发病、肿瘤溃疡、15mm的肿瘤直径或1000mm3的肿瘤体积后，将小鼠处死，且将处死日期记录为死亡日期。注射携有报告基因的病毒粒子的动物的肝脏、脾脏、肾脏和肿瘤被固定且观测报告基因表达。
尽管已描述了自杀诱导基因的靶向递送(Zarogoulidis P.等人(2013)《遗传综合症与基因治疗杂志(J.Genet.Syndr.Gene Ther.)》4:16849)，此实例描述使用本文所述的病毒粒子将自杀基因递送至表达靶向的HER2配体的细胞。在另外的实验中，使用本文所述的病毒粒子将自杀基因递送至表达一种或多种其它靶配体的另一细胞类型。适合于靶向的受体的示例性和非限制性实例包含介导病毒粒子的内吞作用的那些受体，例如癌胚抗原(CEA)(Qiu Y等人(2012)《癌症通讯(Cancer Lett)》.316:31-38)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)(Leng A等人(2013)《肿瘤生物学(Tumour Biol.)》32:1103-1111；Liu T等人(2011)《实验与分子病理学(Exp Mol Pathol)》.91:745-752)。可靶向的其它受体包含：表皮生长因子受体(EGFR)(Heimberger AB等人(2009)《生物疗法专家评论(Expert OpinBiol Ther.)》9:1087-1098)、分化簇44s(CD44s)(Heider KH等人(2004)《癌症免疫与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)》.53:567-579)、分化簇133(CD133，也称为AC133)(Zhang SS等人(2012)《BMC医学(BMC Med.)》；10:85)、叶酸受体(FR)(Duarte S等人,(2011)《控释杂志(J Control Release)》149(3):264-72)、转铁蛋白受体(TfR)或分化簇71(CD71)(Habashy HO等人,《乳腺癌研究与治疗(Breast Cancer Res Treat)》.119(2):283-93)、粘蛋白(Torres MP等人,(2012)《当代药物设计(Curr Pharm Des.)》2012；18(17):2472-81)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)(Malecki M.等人,(2012)《干细胞研究与治疗杂志(J Stem Cell Res Ther)》.2(5))、肿瘤抗性抗原1-60(TRA-1-60)(Malecki M.等人,(2013)《干细胞研究与治疗杂志》.3:134)。
尽管已参照多个实施例具体地显示和描述本发明，但本领域的技术人员应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本文所公开的各种实施例的形式和细节作出修改，并且本文所公开的各种实施例不打算用作对权利要求书范围的限制。
尽管现在描述一些优选的方法和材料，但与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料都可用于本发明的实践或测试中。本文引用的所有出版物都以引用的方式并入本文以全文描述。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

Claims (28)

1.一种重组病毒衣壳蛋白，其经基因修饰以显示包括插入所述病毒衣壳蛋白的蛋白质:蛋白质结合对的第一成员的异源氨基酸序列，
其中所述病毒衣壳蛋白衍生自腺相关病毒(AAV)的cap基因，所述cap基因编码AAVVP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白；
其中：
(a)所述蛋白质:蛋白质结合对的第一成员为肽标签且能够与所述蛋白质:蛋白质结合对的第二同源成员形成异肽键，或
(b)所述蛋白质:蛋白质结合对的第一成员为肽标签且所述病毒衣壳蛋白还包含所述蛋白质:蛋白质结合对的第二同源成员，其中所述第一成员和第二同源成员由异肽键结合。
2.根据权利要求1所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白进一步包括所述蛋白质:蛋白质结合对的所述第二同源成员,其中所述第一和第二同源成员由异肽键结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白衍生自嵌合AAV cap基因。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白进一步包括除了所述蛋白质:蛋白质结合对的第一成员之外的突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中：
(a)所述第一成员减少或消除所述衣壳蛋白的天然向性；和/或
(b)所述病毒衣壳蛋白进一步包括除了所述蛋白质:蛋白质结合对的第一成员之外的突变，其减少或消除所述衣壳蛋白的天然向性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中：
(a)所述第一成员由将所述第一成员连接至所述病毒衣壳蛋白的第一和/或第二连接子侧接，且其中所述第一和/或第二连接子的长度各自独立地为至少一个氨基酸；
(b)所述病毒衣壳蛋白进一步包括在涉及所述病毒衣壳蛋白与其天然受体的结合的氨基酸位置处的突变，其中所述突变包括将异源肽插入至所述衣壳蛋白中、用异源肽取代所述衣壳蛋白的一个或多个氨基酸、所述衣壳蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、或其组合；
(c)所述AAV选自由以下组成的群组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9；
(d)所述蛋白质:蛋白质结合对为：
(i)SpyTag:SpyCatcher，
(ii)SpyTag:KTag，
(iii)Isopeptag:pilin-C，
(iv)SnoopTag:SnoopCatcher，
(v)SpyTag002:SpyCatcher002；或
(e)(a)-(d)的任意组合。
7.根据权利要求5或6所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述病毒衣壳蛋白的向性为：
在与所述第二同源成员形成异肽键后
(a)恢复；
(b)重定向；或
(b)恢复和重定向，
所述第二同源成员与特异性结合靶细胞的靶向配体融合。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中：
(a)所述第一成员为SpyTag和所述第二同源成员为SpyCatcher或KTag；
(b)所述第一成员为KTag且所述第二同源成员为SpyTag；
(c)所述第一成员为SnoopTag且所述第二同源成员为SnoopCatcher；
(d)所述第一成员为isopeptag且所述第二同源成员为Pilin-C；或
(e)所述第一成员为SpyTag002且所述第二同源成员为SpyCatcher002。
9.根据权利要求2至7中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述第二同源成员连接于靶向配体。
10.根据权利要求9所述的重组病毒衣壳蛋白，其中：
(a)所述靶向配体为结合部分；
(b)所述靶向配体为抗体，或其部分；
(c)所述靶向配体包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；
(d)所述靶向配体特异性结合细胞表面分子，或
(e)(a)-(d)的任意组合。
11.根据权利要求10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述结合部分为抗体，或其部分，其中：
(a)所述抗体，或其部分，融合至SpyCatcher；
(b)所述抗体，或其部分，融合至SpyCatcher，其中所述抗体，或其部分，在C末端融合至连接子，并且所述连接子在所述连接子的C末端融合至SpyCatcher；或
(c)所述抗体，或其部分，融合至SpyCatcher，其中所述抗体，或其部分，在C末端融合至连接子，并且所述连接子在所述连接子的C末端融合至SpyCatcher，其中所述连接子包含如SEQ ID NO:48(GSGESG)所示的序列。
12.根据权利要求10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述靶向配体特异性结合细胞表面分子，其为：
(i)脱唾液酸糖蛋白1(ASGR1)，
(ii)人类外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(ENTPD3)，
(iii)PTPRN，
(iv)CD20，
(v)CD63，
(vi)Her2；或
(vii)转铁蛋白受体2。
13.根据权利要求10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中：
(a)所述靶向配体特异性结合神经元细胞表达的分子；或者
(b)所述靶向配体特异性结合神经元细胞表达的转铁蛋白受体。
14.根据权利要求10所述的重组病毒衣壳蛋白，其中所述靶向配体特异性结合肌肉细胞表达的分子。
15.一种重组病毒衣壳，其包括根据权利要求1至14中任一项所述的病毒衣壳蛋白。
16.根据权利要求15所述的重组病毒衣壳，其中所述病毒衣壳蛋白进一步包括缺少特异性结合对的任何成员的参考病毒衣壳蛋白。
17.根据权利要求16所述的重组病毒衣壳，其包括比率在1:1与1:15之间的所述病毒衣壳蛋白和所述参考病毒衣壳蛋白。
18.一种重组病毒粒子，其包括由根据权利要求15至17中任一项所述的病毒衣壳蛋白囊封的所关注的核苷酸。
19.一种组合物，其包括(a)根据权利要求15至17中任一项所述的病毒衣壳蛋白或根据权利要求18所述的病毒粒子，和(b)药学上可接受的载体。
20.根据权利要求18所述的病毒粒子或根据权利要求19所述的组合物，用于将所关注的核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括用所述病毒粒子或所述组合物接触所述靶细胞，其中所述病毒衣壳蛋白包含特异性结合所述靶细胞表面表达的蛋白的靶向配体。
21.根据权利要求20所述的用于所述方法的病毒粒子或组合物，其中：
(a)所述靶细胞在受试者体内；
(b)所述靶细胞在人类受试者体内；和/或
(c)所述靶细胞是人类靶细胞。
22.根据权利要求21所述的用于所述方法的病毒粒子或组合物，其中：
(i)所述靶细胞为人类肝细胞，且其中所述靶向配体结合人类脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR1)；
(ii)其中所述靶细胞为人类神经元细胞，且其中所述靶向配体结合GABA；
(iii)所述靶细胞为人类T细胞，且其中所述靶向配体结合CD3；
(iv)所述靶细胞为人类T细胞，且其中所述靶向配体结合CD3ε；
(v)所述靶细胞为人类造血细胞，且其中所述靶向配体结合CD34；
(vi)所述靶细胞为人类肾细胞；
(vii)所述靶细胞为人类癌细胞，且其中所述靶向配体结合肿瘤相关抗原；或
(viii)所述靶细胞为人类癌细胞，且其中靶向配体结合肿瘤相关抗原，其中所述肿瘤抗原为E6、E7或Her2。
23.根据权利要求21所述的用于所述方法的病毒粒子或组合物，其中：
(i)所述靶向配体结合PTPRN(蛋白酪氨酸磷酸酶受体N型)；
(ii)所述靶向配体结合CD20；
(iii)所述靶向配体结合人类胰高血糖素受体；或
(iv)所述靶向配体特异性结合CD63或人类外核苷三磷酸二磷酸水解酶3(hENTPD3)。
24.一种将所关注的核苷酸递送至体外靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与根据权利要求18所述的病毒粒子或根据权利要求19所述的组合物接触，其中所述病毒衣壳蛋白包括特异性结合在所述靶细胞的表面上表达的蛋白质的靶向配体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中：
(i)所述靶细胞为人类肝细胞，且其中所述靶向配体结合人类脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR1)；
(ii)其中所述靶细胞为人类神经元细胞，且其中所述靶向配体结合GABA；
(iii)所述靶细胞为人类T细胞，且其中所述靶向配体结合CD3；
(iv)所述靶细胞为人类T细胞，且其中所述靶向配体结合CD3ε；
(v)所述靶细胞为人类造血细胞，且其中所述靶向配体结合CD34；
(vi)所述靶细胞为人类肾细胞；
(vii)所述靶细胞为人类癌细胞，且其中所述靶向配体结合肿瘤相关抗原；或
(viii)所述靶细胞为人类癌细胞，且其中所述靶向配体结合肿瘤相关抗原，其中所述肿瘤抗原为E6、E7或Her2。
26.根据权利要求24所述的方法，其中：
(i)所述靶向配体结合PTPRN；
(ii)所述靶向配体结合CD20；
(iii)所述靶向配体结合人类胰高血糖素受体；或
(iv)所述靶向配体特异性结合CD63hENTPD3；或
(v)所述靶向配体特异性结合转铁蛋白受体2。
27.一种重组载体，其编码根据权利要求1至14中任一项所述的病毒衣壳蛋白。
28.一种AAV cap基因，其编码根据权利要求1至14中任一项所述的重组病毒衣壳蛋白。
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