ES2943020T3 - Partículas virales recombinantes con tropismo modificado y usos de las mismas para la introducción selectiva de material genético en células humanas - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para redirigir partículas de la cápside viral recombinante a través de un par de unión proteína:proteína específico que forma un enlace covalente, por ejemplo, isopéptido, para mostrar un ligando de direccionamiento en la proteína de la cápside, en el que el ligando de direccionamiento se une específicamente a un marcador de superficie celular. expresado en la celda de interés. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas virales recombinantes con tropismo modificado y usos de las mismas para la introducción selectiva de material genético en células humanas
REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO COMO UN ARCHIVO DE TEXTO MEDIANTE EFS-WEB
La memoria descriptiva abarca el listado de secuencias escrito en el archivo 10359WO01_ST25.txt que tiene 183 kilobytes, creado el 27 de junio de 2018.
Campo técnico
La divulgación en el presente documento se refiere generalmente a partículas virales recombinantes con tropismo modificado y composiciones que las comprenden, útiles para la introducción selectiva de material genético en las células. En particular, la presente invención se refiere a una cápside viral recombinante, una cápside viral que la comprende, una partícula viral recombinante que comprende un nucleótido de interés encapsulado por la proteína de la cápside viral recombinante, y varios aspectos relacionados.
Antecedentes de la invención
La administración de genes en células diana particulares se ha convertido en una de las tecnologías más importantes de la medicina moderna para el tratamiento potencial de una variedad de enfermedades crónicas y genéticas. Hasta ahora, el progreso en la aplicación clínica de la terapia génica se ha visto limitado por la falta de vehículos de administración de genes ideales. Para lograr el éxito terapéutico, los vehículos de administración de genes deben ser capaces de transducir células diana mientras evitan la transducción de células no diana. Específicamente, cuando el tropismo nativo del virus no está dirigido a los tejidos diana terapéuticos deseados o tipos de células, existe la necesidad de partículas virales recombinantes en las que el tropismo natural se elimine o disminuya y el tropismo deseado se diseñe con éxito. (Buchholz) et al.,)
En los últimos años, la mayor parte del progreso en el desarrollo de vectores se ha logrado utilizando virus sin envoltura (por ejemplo, virus que comprenden una cápside formada por proteínas de la cápside viral sin envoltura (por ejemplo, bicapa lipídica)) tales como virus adenoasociados (AAV) y adenovirus (Ads), así como virus con envoltura (p. ej., virus en los que la cápside está rodeada por una bicapa lipídica) tales como los retrovirus, lentivirus y virus del herpes simple. Los vectores basados en AAV han sido el foco de muchas investigaciones, ya que los AAV son solo levemente inmunogénicos y son capaces de transducir una amplia gama de especies y tejidos in vivo sin signos de toxicidad.
Los AAV son pequeños virus de ADN monocatenarios sin envoltura. El genoma del AAV tiene 4,7 kb y se caracteriza por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) y dos marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas Rep y las proteínas Cap, respectivamente. Las dos ITR son los únicos elementos cis esenciales para la replicación y encapsidación del AAV. El marco de lectura Rep codifica cuatro proteínas de peso molecular 78 kD, 68 kD, 52 kD y 40 kD. Estas proteínas funcionan principalmente en la regulación de la transcripción y replicación del genoma del AAV. El marco de lectura Cap codifica tres proteínas virales (VP) estructurales (cápside) que tienen pesos moleculares de 83-85 kD (VP 1), 72-73 kD (VP2) y 61-62 kD (VP3). Más del 80 % de las proteínas totales en un virión AAV comprenden VP3; en viriones maduros VP1, VP2 y VP3 se encuentran en una abundancia relativa de aproximadamente 1:1:10. In vitro, las tres proteínas se ensamblan espontáneamente en estructuras similares a viriones, p. ej., las cápsides virales. Parece, por lo tanto, que la formación de la cápside viral en células infectadas procede independientemente de la síntesis de ADN viral (revisado por Kotin et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:793).
Entre todos los serotipos de AAV conocidos, AAV2 es quizás el serotipo mejor caracterizado, porque su clon infeccioso fue el primero que se creó. (Samulski et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2077-2081). Posteriormente, también se han determinado las secuencias completas de varios serotipos de AAV. (véase, p. ej., Rutledge et al. (1998) J. Virol., 72:309-319; Gao et al. (2005) Curr. Gen. Ther. 5(3)285-97; Chiorini et al. (1997) J. Virol., 71:6823-6833; S. Muramatsu et al., (1996) Virol., 221:208-217). En general, todos los AAV comparten más del 80 % de la secuencia de nucleótidos de identificación.
El AAV es un vector prometedor para la terapia génica humana ya que, a diferencia de otros vectores virales, no se ha demostrado que los AAV estén asociados con ninguna enfermedad humana conocida y, en general, no se consideran patógenos. (Muzyczka, et al. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129). También, El AAV transduce con seguridad tejidos postmitóticos con una inmunogenicidad relativamente baja, y aunque el virus puede integrarse ocasionalmente en los cromosomas del hospedador, lo hace con muy poca frecuencia en un locus seguro en el cromosoma humano 19, y solo cuando las proteínas Rep se suministran en trans. Los genomas del AAV se circularizan y se concatemerizan rápidamente en las células infectadas, y existen en un estado episomal, estable en las células infectadas para proporcionar una expresión estable a largo plazo de sus cargas útiles.
Diferentes virus, incluidos los AAV, infectan células a través de una interacción virus/ligando:célula/receptor que finalmente da como resultado la endocitosis del virus por parte de la célula infectada. Esta interacción ligando: receptor es el foco de gran parte de la investigación en vectores virales, y puede manipularse para redirigir el tropismo natural de un virus de una célula naturalmente permisiva a la infección por el virus de tipo silvestre a una célula diana no nativa, p. ej., a través de un receptor expresado en la célula diana.
T eóricamente, el redireccionamiento de un vector hacia cualquier proteína o marcador de la superficie celular debería provocar una infección, ya que la mayoría de los receptores de la superficie celular están involucrados en las vías de endocitosis, ya sean constitutivas (p. ej., para reciclar) o inducidas por ligando (p. ej., mediado por receptor). Estos receptores se agrupan en fosas recubiertas de clatrina, penetran en la célula a través de vesículas recubiertas de clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se seleccionan los receptores y luego se reciclan a la superficie celular, se almacenan intracelularmente o se degradan en los lisosomas. Por ello, las plataformas para el redireccionamiento de vectores virales a menudo tienen como objetivo eliminar el tropismo natural del vector viral y redirigir el vector viral a un receptor o marcador expresado única o principalmente por la célula diana. Muchos de los avances en la terapia génica dirigida utilizando vectores virales pueden resumirse como modificación no recombinatorio (no genética) o recombinatorio (genética) del vector viral, que dan como resultado la pseudotipificación, expansión y/o redireccionamiento del tropismo natural del vector viral. (Revisado en Nicklin y Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji and Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15).
El enfoque más popular es una modificación genética recombinatoria de las proteínas de la cápside viral y, por lo tanto, de la superficie de la cápside viral. Por otra parte, en enfoques recombinatorios indirectos, una cápside viral se modifica con un "andamio" heterólogo, que luego se vincula a un adaptador. El adaptador se une tanto al andamio como a la célula diana. En el enfoque de direccionamiento recombinatorio directo, un ligando de direccionamiento se inserta directamente en, o se acopla a, una cápside viral, es decir, las cápsides virales de proteínas se modifican para expresar un ligando heterólogo. El ligando que redirige, p. ej., se une a, un receptor o marcador expresado preferencial o exclusivamente en una célula diana.
Cada uno de los enfoques tiene ventajas y desventajas. La capacidad de modificar genéticamente el virus requiere que se mantenga la estructura de la cápside, y que el ligando o armazón de direccionamiento se coloque en una posición dentro de la proteína de la cápside que tolere y muestre apropiadamente el ligando o armazón de direccionamiento. Por ejemplo, el ligando o andamio dirigido introducido en la proteína viral tendrá que cumplir con las limitaciones de tamaño para no interferir con la estructura de la cápside modificada, lo que abre la posibilidad a que la cápside no presente correctamente el ligando o andamio directo y/o limite el espectro de moléculas naturalmente existentes disponibles para su uso como ligandos o andamios de direccionamiento. Asimismo, el uso de ligandos de direccionamiento insertados directamente en la cápside del virus no es modular y debe rediseñarse para cada diana. Aunque la plataforma de andamio es ventajosa por la flexibilidad y la naturaleza modular del adaptador utilizado, el andamiaje en la partícula del virus y el adaptador interactúan iónicamente y siguen siendo dos entidades separadas, y la inestabilidad inherente de sus interacciones puede limitar su utilidad in vivo. Las eficiencias de transducción óptimas pueden ser difíciles de lograr con tales sistemas de dos componentes.
Evidentemente, sigue existiendo la necesidad de sistemas de vectores virales que mantengan la integridad de la estructura viral modificada sin dejar de ser adaptables para la transferencia dirigida de ácidos nucleicos de interés a una variedad de células diana.
También se hace referencia a los siguientes documentos:
• Santiago-Ortiz et al (2016) Journal of Controlled Release, 240: 287-301 que se refiere a vectores de virus adenoasociados (AAV) en la terapia génica del cáncer;
• WO 2016/112921 que se refiere a una partícula similar a un virus con una presentación de epítopo eficiente; • Reid et al (2002) Journal of Virology, 76(9): 4559-4566 que se refiere a cápsides de virus adenoasociados que muestran dominios de unión a inmunoglobulina;
• Veggiani et al (2014) TIBS, 32(10): 506-512 que se refiere al superpegamento de bacterias; y
• Veggiani et al (2016) PNAS UsA, 113(5): 1202-1207 que se refiere a poliproteínas programables construidas utilizando superpegamentos de péptidos gemelos.
Sumario
La invención
La presente invención proporciona una proteína de la cápside viral recombinante que se modifica genéticamente para presentar una secuencia de aminoácidos heteróloga que comprende un primer miembro de un par de unión proteína:proteína insertado en la proteína de la cápside viral,
en donde la proteína de la cápside viral se deriva de un gen cap de un virus adenoasociado (AAV) que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV;
en donde:
(a) el primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y es capaz de formar un enlace isopeptídico con un segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína; o
(b) el primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y la proteína de la cápside viral comprende además el segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína, en donde el primer miembro y el segundo miembro afín están unidos por un enlace isopeptídico.
La presente invención proporciona además una cápside viral recombinante que comprende una proteína de la cápside viral de la presente invención.
La presente invención también proporciona una partícula viral recombinante que comprende un nucleótido de interés encapsulado por la proteína de la cápside viral de la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición que comprende: (a) una proteína de la cápside viral o una partícula viral de la presente invención; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona además una partícula o composición viral de la presente invención para su uso en un método de administración de un nucleótido de interés a una célula diana que comprende poner en contacto la célula diana con dicha partícula viral o dicha composición, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana.
La presente invención también proporciona un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana in vitro que comprende poner en contacto la célula diana con una partícula viral o la composición de la presente invención, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana.
La presente invención proporciona además un vector recombinante que codifica una proteína de la cápside viral de la presente invención.
La presente invención también proporciona un gen cap de un AAV que codifica una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención.
Realizaciones específicas y detalles técnicos
La divulgación técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo, a saber, para situar la invención real reivindicada en un contexto técnico más amplio.
En el presente documento se describe una estrategia de redireccionamiento viral que resuelve los problemas inherentes a las estrategias de redireccionamiento anteriores mediante la utilización de un primer miembro y un segundo miembro afín de un par de unión específica, cuyo primer miembro y segundo miembro afín interactúan específicamente para formar un enlace isopeptídico. El primer miembro, cuando se presenta en una proteína de la cápside, actúa como un andamio para cualquier ligando de direccionamiento fusionado con el segundo miembro afín, pero al unir el primer miembro y el segundo miembro afín, se forma un enlace isopeptídico y la partícula viral recombinante actúa como un vector de direccionamiento de un componente.
En el presente documento se proporciona una partícula viral recombinante (por ejemplo, una proteína de la cápside viral recombinante, una cápside viral recombinante que comprende la proteína de la cápside viral recombinante y/o un vector viral recombinante que comprende una cápside viral recombinante que encapsula un nucleótido de interés) que se modifica genéticamente para mostrar una secuencia de aminoácidos heteróloga que comprende un primer miembro de un par de unión específica, una etiqueta peptídica, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una longitud inferior a 50 aminoácidos, y en donde la partícula/proteína de la cápside viral recombinante muestra un tropismo natural de reducido a anulado. El primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y es capaz de formar un enlace isopeptídico con un segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína. El tropismo de una proteína/cápside/vector de la cápside viral recombinante puede restaurarse y/o redirigirse tras la formación de un enlace isopeptídico con el segundo miembro afín del par de unión específica, cuyo segundo miembro afín se fusiona con un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una célula diana. Tal unión da como resultado que la proteína/cápside/vector de la cápside viral recombinante presente el ligando de direccionamiento. Las eficacias y especificidades de transducción se potencian sorprendentemente cuando el ligando de direccionamiento se muestra mediante una cápside/vector viral recombinante a través de un enlazador y/o en cantidades limitadas en la superficie de la cápside viral. Tales partículas virales, las composiciones que las comprenden y los métodos para prepararlas y usarlas se proporcionan en el presente documento.
Por consiguiente, en el presente documento se describe una proteína de la cápside viral recombinante que comprende una etiqueta peptídica insertada en la proteína de la cápside, en donde la proteína de la cápside viral se deriva de un gen cap de un virus adenoasociado (AAV) que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV, y en donde la etiqueta peptídica es un primer miembro de un par de unión específica que forma un enlace isopeptídico con un segundo miembro afín del par de unión específica. En particular, la presente invención proporciona una proteína de la cápside viral recombinante que se modifica genéticamente para presentar una secuencia de aminoácidos heteróloga que comprende un primer miembro de un par de unión proteína:proteína insertado en la proteína de la cápside viral, en donde la proteína de la cápside viral se deriva de un gen cap de un virus adenoasociado (AAV) que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV; en donde: (a) el primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y es capaz de formar un enlace isopeptídico con un segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína; o (b) el primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y la proteína de la cápside viral comprende además el segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína, en donde el primer miembro y el segundo miembro afín están unidos por un enlace isopeptídico. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside recombinante comprende además el segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína, en donde el primer miembro y el segundo miembro afín están unidos por un enlace isopeptídico. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside recombinante comprende el segundo miembro afín del par de unión específica unido covalentemente al primer miembro, en donde el segundo miembro afín del par de unión específica se une operativamente a un ligando de direccionamiento que se une específicamente a un marcador de superficie celular (p. ej., un oligosacárido de superficie celular, un receptor de superficie celular y/o marcador de superficie celular, etc.) en una célula diana. También se describen en el presente documento cápsides virales que comprenden las proteínas recombinantes de la cápside viral y vectores virales que comprenden un nucleótido de interés encapsulado por las cápsides virales descritas en el presente documento. También se describen composiciones que comprenden las partículas virales recombinantes descritas en el presente documento (por ejemplo, las proteínas de la cápside viral recombinantes, cápsides virales recombinantes y/o vectores virales recombinantes), métodos de uso de los mismos para la administración in vitro dirigida de un nucleótido de interés, métodos para su fabricación, así como las partículas virales y las composiciones para usar en un método de administración de un nucleótido de interés.
En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión específica) se inserta en la proteína de la cápside a través de un primer o segundo enlazador, p. ej., un espaciador de aminoácidos que tiene al menos un aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro) está flanqueada por un primer y/o segundo enlazador, p. ej., un primer y/o segundo espaciador de aminoácidos, cada uno de los cuales espaciadores tiene al menos un aminoácido de longitud.
En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazadores no son idénticos. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno o dos aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos o tres aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres o cuatro aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tienen cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en secuencia y/o en longitud, y cada uno tiene un aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene un aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene dos aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene tres aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene cuatro aminoácidos de longitud, p. ej., el enlazador es GLSG (SEQ ID NO:40). En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene cinco aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene seis aminoácidos de longitud, p. ej., cada uno del primer y segundo enlazadores comprende una secuencia de GLSGSG (SEQ ID NO:41). En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene siete aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene ocho aminoácidos de longitud, p. ej., cada uno del primer y segundo enlazadores comprende una secuencia de GLSGLSGS (SEQ ID NO:42). En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene nueve aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene diez aminoácidos de longitud, p. ej., cada uno del primer y segundo enlazadores comprende una secuencia de GLSGLSGLSG (SEQ ID NO:43) o GLSGGSGLSG (SEQ ID NO:55). En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos en longitud, y cada uno tiene más de diez aminoácidos de longitud.
En general, una etiqueta de péptido y, opcionalmente, uno o más enlazadores como se describe en el presente documento, p. ej., etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores, está entre aproximadamente 5 aminoácidos y 50 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 6 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 7 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 8 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 9 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 11 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 13 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 15 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 16 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 17 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 18 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 19 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 21 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 22 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 23 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 24 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 25 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 26 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 27 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 28 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 29 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 30 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 31 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 32 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 33 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 34 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 35 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 36 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 37 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 38 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 39 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene una longitud de 40 aminoácidos. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores tiene más de 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, una etiqueta peptídica por sí misma o en combinación con uno o más enlazadores no tiene más de 50 aminoácidos de longitud.
Una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención se deriva de un gen cap de un virus adenoasociado (AAV) que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV. Por tanto, una proteína de la cápside viral recombinante descrita en el presente documento se deriva de un gen de la cápside de AAV que codifica las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV (o porciones de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3), p. ej., está codificada por un gen cap modificado para codificar una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de virus adenoasociado (AAV) modificada genéticamente, p. ej., una proteína de la cápside de un serotipo AAV modificada genéticamente que infecta a humanos seleccionados del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2 o AAV9 que codifica respectivamente una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 o una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV9, p. ej., está codificada por un gen cap de AAV2 o AAV9 modificado para codificar respectivamente una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 modificada genéticamente o una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV9 modificada genéticamente. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV6, p. ej., está codificada por un gen cap de AAV6 modificado para codificar una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV6 modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína de la cápside VP1 de AAV6 está establecida respectivamente como SEQ ID NO:51. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, p. ej., está codificada por un gen cap de AAV2 modificado para codificar una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 está establecida respectivamente como SEQ ID NO:9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, p. ej., está codificada por un gen cap de AAV9 modificado para codificar una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV9 modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína de la cápside VP1 de AAV9 está establecida respectivamente como SEQ ID NO:31.
En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de (está codificada por) un gen de la cápside de AAV quimérico, en donde el gen de la cápside quimérico comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, en donde cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifica una parte de una proteína de la cápside de un serotipo de AAV diferente, y en donde la pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifican juntas una proteína de la cápside de AAV quimérica. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2 quimérico. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV6 quimérico. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9 quimérico.
Una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención es una proteína de la cápside viral recombinante que se modifica genéticamente para presentar una secuencia de aminoácidos heteróloga que comprende un primer miembro de un par de unión proteína:proteína insertado en la proteína de la cápside viral. En general, una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento se modifica para comprender una etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) unida operativamente (insertada en), opcionalmente a través de un enlazador, a la proteína de la cápside recombinante de manera que la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional reducen y/o anulan el tropismo natural de la proteína de la cápside recombinante o la cápside que comprende la misma, en comparación con una proteína de la cápside de referencia que carece de la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y un enlazador o cápside opcional que comprende la cápside de referencia, respectivamente. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) está unida operativamente (p. ej., insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, a una región de la proteína de la cápside implicada en el tropismo natural de la proteína de la cápside de referencia de tipo silvestre, p. ej., una región de la proteína de la cápside implicada en el direccionamiento celular. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional están unidos operativamente (p. ej., insertados y/o presentados), opcionalmente a través de un enlazador, a un dominio knob de una proteína de la fibra Ad. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) está unida operativamente (p. ej., insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, al bucle HI de una proteína de la fibra Ad. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) está unida operativamente (p. ej., insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, a un bucle variable expuesto en una proteína de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) está unida operativamente (p. ej., insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, a un bucle variable expuesto de una proteína de la cápside de AAV2. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína: proteína) está unida operativamente (p. ej., insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, a un bucle variable expuesto de una proteína de la cápside de AAV9.
En algunas realizaciones (i) la proteína de la cápside viral se deriva de un gen de la cápside de AAV2 que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de a AV2 y la etiqueta peptídica está unida operativamente a (por ejemplo, insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, un aminoácido en la posición I453 o I587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9); (ii) la proteína de la cápside viral se deriva de un gen de la cápside de AAV6 y la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) está unida operativamente a (por ejemplo, insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, un aminoácido en la posición I585 de la proteína de la cápside VP1 de AAV6 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 y AAV9); o (iii) la proteína de la cápside viral se deriva de un gen de la cápside de AAV9 que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV9 y la etiqueta peptídica está unida operativamente a (por ejemplo, insertada y/o presentada), opcionalmente a través de un enlazador, un aminoácido en la posición I453 o I589 de la VP1 de la cápside de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8).
En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) está unida operativamente, opcionalmente a través de un enlazador, a un aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en 453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, 587 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, 585 de la proteína VP1 de la cápside de AAV6, 453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 y 589 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, y AAV9), p. ej., se fusiona con el extremo C-terminal de un aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en 453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, 587 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, 585 de la proteína VP1 de la cápside de AAV6, 453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 y 589 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside de VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional se insertan inmediatamente después de (p. ej., se fusionan con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2 (o las posiciones correspondientes de la proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional se insertan inmediatamente después de (p. ej., se fusionan con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 587 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2 (o las posiciones correspondientes de la proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional se insertan inmediatamente después de (p. ej., se fusionan con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 585 de la proteína VP1 de la cápside de AAV6 (o las posiciones correspondientes de la proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., a Av 1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional se insertan inmediatamente después de (p. ej., se fusionan con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 (o las posiciones correspondientes de la proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, a Av 4, AAV5, AAv 6, AAV7 y AAV8). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional se insertan inmediatamente después de (p. ej., se fusionan con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 589 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 (o las posiciones correspondientes de la proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional se inserta y/o presenta entre las posiciones 587 y 588 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a humanos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8).
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside recombinante como se describe en el presente documento comprende una (segunda y diferente) mutación, que puede ser adicional a la etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y el enlazador opcional. En algunas realizaciones, la (segunda y diferente mutación) comprende una inserción de un péptido heterólogo en la proteína de la cápside, una sustitución de uno o más aminoácidos de la proteína de la cápside con uno o más aminoácidos heterólogos, una deleción de uno o más aminoácidos de la proteína de la cápside, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, en alguna realización, una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento puede derivarse de un gen de la cápside de AAV2 (p. ej., es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 modificada genéticamente, comprende una etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y un enlazador opcional, y puede comprender además una mutación, p. ej., una mutación R585A y/o R588A en la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o la mutación correspondiente en las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV2). En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, p. ej., es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 modificada genéticamente, comprende una etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y un enlazador opcional insertado inmediatamente después de (p. ej., fusionado con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 453 de la proteína VP1 de AAV2 (o aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV2 codificadas por el gen de la cápside de AAV2), y además comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en R585A y/o R588A (o mutaciones correspondientes en las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV2). En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, p. ej., es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 modificada genéticamente, comprende una etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y un enlazador opcional insertado inmediatamente después de (por ejemplo, fusionado con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV2 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV2), y además comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en R585A, R588A y/o mutaciones correspondientes en las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV2.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, p. ej., es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV9 modificada genéticamente, comprende una etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y un enlazador opcional insertado inmediatamente después de (p. ej., fusionado con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 453 de la proteína VP1 de AAV9 (o el aminoácido en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 o VP3 de AAV9 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV9), y además comprende una mutación W503A (o una mutación correspondiente en las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV2). En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, p. ej., es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV9 modificada genéticamente, comprende una etiqueta peptídica (primer miembro de un par de unión proteína:proteína) y un enlazador opcional insertado inmediatamente después de (p. ej., fusionado con el extremo C-terminal de) un aminoácido en la posición 589 de la proteína VP1 de AAV9 (o los aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV9 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV9), y además comprende una mutación W503A (o una mutación correspondiente en las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas por el mismo gen de la cápside de AAV2).
En algunas realizaciones, el par de unión proteína:proteína se puede seleccionar del grupo que consiste en SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002, SpyTag:KTag, Isopeptag:pilina-C y SnoopTag:SnoopCatcher. En algunas realizaciones, en donde la etiqueta peptídica (primer miembro) es SpyTag (o una parte biológicamente activa de la misma) y la proteína (segundo miembro afín) es SpyCatcher (o una parte biológicamente activa de la misma). En algunas realizaciones, en donde la etiqueta peptídica (primer miembro) es SpyTag (o una parte biológicamente activa de la misma) y la proteína (segundo miembro afín) es KTag (o una parte biológicamente activa de la misma). En algunas realizaciones, en donde la etiqueta peptídica (primer miembro) es KTag (o una parte biológicamente activa de la misma) y la proteína (segundo miembro afín) es SpyTag (o una parte biológicamente activa de la misma). En algunas realizaciones, en donde la etiqueta peptídica (primer miembro) es SnoopTag (o una parte biológicamente activa de la misma) y la proteína (segundo miembro afín) es SnoopCatcher (o una parte biológicamente activa de la misma). En algunas realizaciones, en donde la etiqueta peptídica (primer miembro) es Isopeptag (o una parte biológicamente activa de la misma) y la proteína (segundo miembro afín) es Pilina-C (o una parte biológicamente activa de la misma). En algunas realizaciones, en donde la etiqueta peptídica (primer miembro) es SpyTag002 (o una parte biológicamente activa de la misma) y la proteína (segundo miembro afín) es SpyCatcher002 (o una parte biológicamente activa de la misma).
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante comprende una SpyTag. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, un vector viral recombinante que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante o un vector viral que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como cualquier SEQ ID NO enumerada en la Tabla 1 como una secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside viral recombinante. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:13. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:15. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:17. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID n O:19. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:21. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:23. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:25. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:27. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:29. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:35. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:37. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:39.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante descrita en el presente documento comprende un primer miembro de un par de unión específica (una etiqueta peptídica) unido covalentemente a un segundo miembro de proteína afín del par de unión específica mediante un enlace isopeptídico. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante descrita en el presente documento comprende una etiqueta peptídica (primer miembro) unida covalentemente a un polipéptido adaptador que comprende una proteína afín (segundo miembro) unido operativamente a un ligando de direccionamiento. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento está unido operativamente a la proteína (segundo miembro), p. ej., fusionado a la proteína, opcionalmente a través de un enlazador. En general, un ligando de direccionamiento puede ser un resto de unión, p. ej., un ligando natural, anticuerpo, una molécula de unión multiespecífica, etc. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo o una parte del mismo. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a una proteína de la superficie celular en una célula diana y un dominio constante de la cadena pesada. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a una proteína de la superficie celular en una célula diana y un dominio constante de la cadena pesada de la IgG. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento es un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a una proteína de la superficie celular en una célula diana y un dominio constante de la cadena pesada de la IgG, en donde el dominio constante de la cadena pesada de la IgG está unido operativamente, p. ej., a través de un enlazador, a una proteína (p. ej., segundo miembro de un par de unión proteína:proteína) que forma un enlace covalente isopeptídico con una etiqueta peptídica. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside recombinante descrita en el presente documento comprende una SpyTag unida operativamente a la proteína de la cápside viral y unida covalentemente a la SpyTag, un polipéptido adaptador que comprende SpyCatcher unido a un ligando de direccionamiento que comprende un dominio variable de anticuerpo y un dominio de la cadena pesada de IgG, en donde SpyCatcher y el dominio de la cadena pesada de IgG están unidos a través de un enlazador de aminoácidos, p. ej., GSGESG (SEQ ID NO:48). En algunas realizaciones, el polipéptido adaptador comprende la secuencia establecida como SEQ ID NO:46, que comprende una parte de una cadena pesada de IgG4 humana, teniendo dicha parte de IgG4 tiene una secuencia establecida como s Eq ID NO:49, unida a través del enlazador (SEQ ID NO:48) a SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende SpyTag unida covalentemente a una SpyCatcher fusionada con un ligando de direccionamiento. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como cualquier SEQ ID NO enumerada en la Tabla 1 que codifica una proteína de la cápside viral recombinante y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencias de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una cápside viral recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 13 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como s Eq ID NO: 15 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 17 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:19 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como s Eq ID NO: 21 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:23 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:25 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:27 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:29 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:35 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 37 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:39 y un adaptador polipeptídico que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46.
En general, un ligando de direccionamiento se une específicamente a una molécula de la superficie celular, p. ej., un oligosacárido, un receptor, marcador de superficie celular, etc., expresada en la superficie de una célula eucariota de mamífero (p. ej., humana), p. ej., una célula diana. En algunas realizaciones, un ligando de direccionamiento se une a una célula hepática (humana), una célula cerebral (humana), un linfocito T (humano), una célula renal (humana), una célula intestinal (humana), una célula pulmonar (humana), una célula cancerosa (humana), o una célula (humana) infectada con un patógeno heterólogo.
En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en una célula hepática (humana), p. ej., un receptor de la asialoglicoproteína, p. ej., hASGR1. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una molécula expresada en una célula neuronal (humana), p. ej., GABA, transferrina, etc. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una molécula expresada en un linfocito T (humano), p. ej., CD3, p. ej., CD3e. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a CD63. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una molécula expresada en una célula madre hematopoyética (humana), p. ej., CD34. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una molécula expresada en una célula renal (humana). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una molécula expresada en una célula muscular (humana), p. ej., una integrina. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una molécula expresada en una célula cancerosa (humana), p. ej., un antígeno asociado a tumor, p. ej., adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (AFP), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusión BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-l25, CALCA, antígeno carcinoembrionario ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-AI, proteína de fusión dek-can, DKK1, EFTUD2, Factor 2 de elongación, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno tumoral epitelial ("ETA"), proteína de fusión ETV6-AML1, EZH2, E6, e 7, FGf 5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, Carboxil esterasa intestinal, K-ras, Calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 también conocido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, Ma Ge -A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mammaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina clase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipéptido P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusión pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica ("PEM"), PPP1R3B, PRAMA, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerasa, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosafosfato isomerasa, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinasa, tirosinasa ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, Antígeno WT-1 (en linfoma y otros tumores sólidos), receptores de ErbB, Melan A [MARTI], gp 100, tirosinasa, TRP-1/gp 75 y TRP-2 (en melanoma); MAGE-1 y MAGE-3 (en vejiga, cabeza y cuello, y carcinoma de células no pequeñas); proteínas HPV EG y E7 (en cáncer de cuello uterino); Mucina [MUC-1] (en cánceres de mama, páncreas, colon y próstata); antígeno prostático específico [PSA] (en el cáncer de próstata); antígeno carcinoembrionario [CEA] (en cánceres de colon, mama y gastrointestinales), y antígenos específicos de tumores compartidos como Ma g E-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 a 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2, etc. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a E6 y/o E7. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a Her2. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a CD63. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une al receptor de glucagón humano (hGCGR). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une al ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 3 humano (hENTPD3).
En general, una cápside viral que comprende la proteína de la cápside viral recombinante descrita en el presente documento no puede infectar una célula diana en ausencia de un ligando de direccionamiento, p. ej., el segundo miembro unido operativamente a un ligando de direccionamiento. En general, en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento tiene tropismo natural de reducido a anulado, p. ej., tiene una capacidad reducida o es incapaz de dirigirse y unirse a una célula de referencia naturalmente permisiva para la transducción en comparación con la de una cápside viral de referencia, p. ej., una cápside que comprende una proteína de la cápside viral de referencia, p. ej., una proteína de la cápside viral de tipo silvestre de control o una proteína de la cápside viral que sería idéntica a la proteína de la cápside viral recombinante salvo por la ausencia de ligando de direccionamiento, y opcionalmente uno o ambos miembros del par de unión proteína:proteína. En algunas realizaciones, la eficiencia de la transducción de una proteína de la cápside viral recombinante que comprende SpyTag está reducida o anulada en comparación con una proteína de la cápside viral de tipo silvestre de control.
En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 10 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 20 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 30 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 40 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 50 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 60 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 70 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 75 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 80 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 85 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 90 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 95 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, una cápside viral que comprende una proteína de cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., enumerada en la Tabla 1, presenta al menos un 99 % de disminución en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside viral de tipo silvestre de control, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones y en ausencia de un ligando de direccionamiento apropiado, la transducción de una célula de control por una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento se anula, p. ej., es indetectable, p. ej., mediante métodos que miden la expresión del nucleótido de interés, p. ej., ensayos de indicador, etc.
Por el contrario, una cápside viral que comprende la proteína de la cápside viral recombinante que comprende una etiqueta peptídica unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado, p. ej., una proteína afín unida operativamente a un ligando de direccionamiento, es capaz de infectar una célula diana, p. ej., tiene una capacidad parcial o completamente restaurada para dirigirse y unirse a una célula de referencia naturalmente permisiva para la transducción en comparación con la de una cápside viral de referencia, p. ej., una cápside que comprende una proteína de la cápside viral de referencia, p. ej., una proteína de la cápside viral de tipo silvestre de control. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 10 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 20 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 30 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 40 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 50 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 60 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 70 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 75 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 80 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 85 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 90 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 95 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es al menos el 99 % de la eficiencia de transducción de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción idéntica a la de una cápside viral de tipo silvestre de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1.
De modo similar, una cápside viral que comprende la proteína de la cápside viral recombinante que comprende una etiqueta peptídica unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado, p. ej., una proteína afín unida operativamente a un ligando de direccionamiento, es capaz de infectar una célula diana, p. ej., tiene una mayor capacidad para dirigirse y unirse a una célula de referencia naturalmente permisiva para la transducción en comparación con la de una cápside viral de referencia que es idéntica a la proteína de la cápside viral recombinante excepto que carece de uno o ambos miembros del par de unión proteína:proteína, p. ej., comprende una proteína de la cápside de referencia. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 10 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 20 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 30 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 40 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 50 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 60 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 70 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 75 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 80 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 85 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 90 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 95 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe aquí, p. ej., enumerada en la Tabla 1, unida covalentemente a un polipéptido adaptador apropiado presenta una eficiencia de transducción que es un 99 % mayor que la eficiencia de transducción de una cápside viral de referencia de control apropiada, p. ej., enumerada en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento es una cápside en mosaico, p. ej., comprende al menos dos conjuntos de proteínas VP1, VP2 y/o VP3, cada conjunto de los cuales está codificado por un gen cap diferente, p. ej., comprende una proteína de la cápside viral recombinante que comprende una etiqueta peptídica y una proteína de la cápside de referencia que no comprende la etiqueta peptídica en una proporción determinada. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de referencia es una proteína de la cápside de referencia de tipo silvestre porque comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de tipo silvestre que tiene el mismo serotipo que la proteína de la cápside viral recombinante. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de referencia es una proteína de la cápside de referencia de control porque comprende una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside viral recombinante excepto que la proteína de la cápside de referencia de control carece de la etiqueta peptídica. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de referencia es una proteína de referencia de tipo silvestre mutada que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la de una proteína de la cápside de tipo silvestre que tiene el mismo serotipo que la proteína de la cápside viral recombinante salvo por una mutación, (por ejemplo, una deleción de una secuencia de aminoácidos, una inserción de una secuencia de aminoácidos, quimerización, etc.) que reduce el tropismo de la proteína de la cápside de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento combina, una proteína de la cápside viral recombinante y una proteína de la cápside de referencia en una relación que varía de 1:1 a 1:15. En algunas realizaciones, la relación es 1:2. En algunas realizaciones, la relación es 1:3. En algunas realizaciones, la relación es 1:4. En algunas realizaciones, la relación es 1:5. En algunas realizaciones, la relación es 1:6. En algunas realizaciones, la relación es 1:7. En algunas realizaciones, la relación es 1:8. En algunas realizaciones, la relación es 1:9. En algunas realizaciones, la relación es 1:10. En algunas realizaciones, la relación es 1:11. En algunas realizaciones, la relación es 1:12. En algunas realizaciones, la relación es 1:13. En algunas realizaciones, la relación es 1:14. En algunas realizaciones, la relación es 1:15.
En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento combina una proteína de la cápside viral recombinante enumerada en la Tabla 1 y su proteína de la cápside de referencia apropiada (o una combinación de sus proteínas de la cápside de referencia), también enumeradas en la Tabla 1, en una proporción (proteína de la cápside recombinante:proteína(s) de la cápside de referencia) que varía de 1:1 a 1:15. En algunas realizaciones, la relación es 1:2. En algunas realizaciones, la relación es 1:3. En algunas realizaciones, la relación es 1:4. En algunas realizaciones, la relación es 1:5. En algunas realizaciones, la relación es 1:6. En algunas realizaciones, la relación es 1:7. En algunas realizaciones, la relación es 1:8. En algunas realizaciones, la relación es 1:9. En algunas realizaciones, la relación es 1:10. En algunas realizaciones, la relación es 1:11. En algunas realizaciones, la relación es 1:12. En algunas realizaciones, la relación es 1:13. En algunas realizaciones, la relación es 1:14. En algunas realizaciones, la relación es 1:15.
La Tabla 1 proporciona los números de identificación de secuencia (SEQ ID NO) que establecen las secuencias de aminoácidos de (1) proteínas de la cápside viral recombinantes ilustrativas y no limitantes que comprenden una etiqueta peptídica descrita en el presente documento, (2) proteínas de la cápside viral de tipo silvestre de control (C) ilustrativas y no limitantes correspondientes que pueden usarse opcionalmente como referencia para determinar la reducción o la anulación de la eficiencia de la transducción de una proteína de la cápside recombinante que comprende una etiqueta de proteína covalente en ausencia de un vector de direccionamiento, y (3) proteínas de la cápside viral de referencia correspondientes ilustrativas y no limitantes para producir cápsides en mosaico y/o uso como referencia para determinar la restauración de las eficiencias de transducción de una proteína de la cápside recombinante que comprende un par de unión proteína:proteína y un ligando de direccionamiento.
Tabla 1
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continuación
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En general, los vectores virales recombinantes como se describe en el presente documento comprenden una cápside viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, incluyendo cápsides virales en mosaico, en donde la cápside viral encapsula un nucleótido de interés. La presente invención también proporciona una partícula viral recombinante que comprende un nucleótido de interés encapsulado por una proteína de la cápside recombinante de la presente invención. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés está bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor viral, un promotor bacteriano, un promotor de mamífero, un promotor aviar, un promotor de pez, un promotor de insectos, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés está bajo el control de un promotor no humano. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV). En algunas realizaciones, el promotor es un promotor EF1a. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor CAGG. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de ubiquitina C (UbC).
En general, un nucleótido de interés puede ser uno o más genes, que pueden codificar un marcador detectable, p. ej., indicador, o un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés es un gen indicador. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés es un gen indicador que codifica un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en proteína fluorescente verde, luciferasa, p-galactosidasa, etc. En algunas realizaciones, el marcador detectable es proteína verde fluorescente. En otras realizaciones, el nucleótido de interés se selecciona del grupo que consiste en un gen suicida, un nucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, un nucleótido que codifica un sistema CRISPR/Cas o parte(s) del mismo, un nucleótido que codifica ARN antisentido, un nucleótido que codifica ARNpi, una enzima secretada, un gen que codifica una proteína terapéutica, etc. En una realización, el nucleótido de interés codifica un agente terapéutico multidominio, p. ej., una proteína que comprende al menos dos dominios que proporcionan dos funciones distintas.
Las composiciones descritas en el presente documento generalmente comprenden un vector viral que comprende una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento, p. ej., comprende una cápside que comprende la proteína de la cápside viral recombinante (incluida una cápside en mosaico), en donde la cápside encapsula un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende (1) un vector viral que tiene una cápside que comprende una proteína de la cápside viral recombinante descrita en el presente documento, y (2)) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona una composición que comprende: (a) una proteína de la cápside viral o una partícula viral de la presente invención; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describen en el presente documento métodos para producir y usar las proteínas de la cápside viral recombinantes, vectores virales que comprenden las mismas, composiciones, etc. La presente invención también proporciona una partícula viral o una composición de la presente invención para su uso en un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana que comprende poner en contacto la célula diana con dicha partícula viral o dicha composición, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana. La presente invención proporciona además un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana in vitro que comprende poner en contacto la célula diana con una partícula viral o composición de la presente invención, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana. En algunas realizaciones, los métodos in vitro de redireccionamiento de un virus, p. ej., un adenovirus, virus adenoasociado, etc.; la administración de la carga diagnóstica/terapéutica a una célula diana, etc. comprende poner en contacto una célula diana con un vector viral recombinante que comprende una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención, en donde la cápside viral o el vector viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana. La presente invención también proporciona un virus de la presente invención para su uso en métodos de redireccionamiento de un virus, p. ej., un adenovirus, virus adenoasociado, etc.; la administración de la carga diagnóstica/terapéutica a una célula diana, etc. que comprende poner en contacto una célula diana con un vector viral recombinante que comprende una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención, en donde la cápside viral o el vector viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana. Dichos métodos pueden incluir, y los vectores virales de la presente invención pueden usarse en métodos que incluyen, como primera etapa producir un vector viral recombinante, p. ej., cultivar una célula de empaquetamiento en condiciones suficientes para la producción de vectores virales, en donde la célula de empaquetamiento comprende un plásmido que codifica la proteína de la cápside que comprende la etiqueta peptídica (primer miembro) en ausencia o presencia de un plásmido que codifica una proteína de la cápside de referencia, incubar la proteína de la cápside recombinante con un segundo miembro afín unido operativamente a un ligando de direccionamiento, etc. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula hepática (humana) y el vector viral recombinante (mosaico) comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente al receptor de asialoglicoproteína, p. ej., (h)ASGR1. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula neuronal (humana), y el vector viral recombinante (mosaico) comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a GABA, receptor de transferrina, etc. En algunas realizaciones, la célula diana es un linfocito T (humano), y el vector viral recombinante (mosaico) comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a CD3, p. ej., CD3e. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula madre hematopoyética (humana), y el vector viral recombinante (mosaico) comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a CD34. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula renal (humana). En algunas realizaciones, la célula diana es una célula muscular (humana), y el vector viral recombinante (mosaico) comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una integrina. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula cancerosa (humana), y el vector viral recombinante (mosaico) comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor, p. ej., E6 y E7, Her2, etc. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une al receptor de glucagón humano (hGCGR).
También se describen en el presente documento métodos para inactivar una cápside viral y/o producir vectores virales, métodos que generalmente comprenden (a) insertar un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside viral para formar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside modificada genéticamente que comprende la etiqueta peptídica (en ausencia o presencia de un plásmido que codifica una proteína de la cápside de referencia) y/o (b) cultivar una célula de empaquetamiento en condiciones suficientes para la producción de vectores virales, en donde la célula de empaquetamiento comprende la secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, la célula de empaquetamiento comprende además un plásmido auxiliar y/o un plásmido de transferencia que comprende un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además aislar vectores virales adenoasociados autocomplementarios del sobrenadante del cultivo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además lisar la célula de empaquetamiento y aislar vectores virales adenoasociados monocatenarios del lisado celular. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además (a) eliminar los restos celulares, (b) tratar el sobrenadante que contiene vectores virales con nucleasas, p. ej., ADNasa I en presencia de MgCb, (c) concentrar vectores virales, (d) purificar los vectores virales, y (e) cualquier combinación de (a)-(d). También se proporcionan en el presente documento vectores virales elaborados de acuerdo con el método descrito en el presente documento, y células de empaquetamiento útiles para producir un vector viral como se describe en el presente documento, p. ej., células de empaquetamiento que comprenden un plásmido que codifica una proteína de la cápside recombinante descrita.
Breve descripción de los dibujos
El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
La Figura 1 proporciona diagramas de dispersión obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúa la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células 293 hErbB2 HER2 positivas (+) o 293 parentales HER2 negativas (-), ya sea "no infectadas" o células infectadas con partículas "AAV2 N587-SpyTag" o células infectadas con partículas "AAV2 N587-SpyTag C6.5-SpyC". Las cápsides de ambos virus contienen las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag (SEQ ID NO: 1) directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Las partículas C6.5-SpyC se conjugaron con un scFv anti-HER2 (C6.5) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3) a través de SpyTag. Los virus expresan GFP como un marcador de transducción.
La Figura 2 proporciona diagramas de dispersión obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúa la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células 293 hErbB2 HER2 positivas (+) o 293 parentales HER2 negativas (-), ya sea "no infectadas" o células infectadas con partículas "AAV2 N587-SpyTag" o células infectadas con partículas "AAV2 N587-SpyTag SpyC-anti-HER2". Las cápsides de ambos virus contienen las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag (SEQ ID NO: 1) directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Las partículas SpyC-anti-HER2 se conjugaron con un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3) a través de SpyTag. Los virus expresan GFP como un marcador de transducción.
La Figura 3 proporciona diagramas de dispersión obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúa la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células 293 hErbB2 HER2 positivas (+) o 293 parentales h ER2 negativas (-) infectadas con partículas "AAV2 tipo silvestre" o células infectadas con partículas "AAV2 G453-SpyTag SpyC-anti-HER2". Las cápsides "AAV2 tipo silvestre" no tienen mutaciones ni modificaciones (SEQ ID n O:9), mientras que la cápside "AAV2 G453-SpyTag" es una partícula viral en mosaico que comprende una proporción de 1:7 entre las proteínas de la cápside "SpyTag" en donde se inserta la SpyTag directamente después del residuo G453 flanqueada por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO: 29) y cápsides "AAV2 HBM" sin SpyTag pero que contienen las mutaciones R585A y R588A (SEQ ID NO:11). Las partículas de mosaico AAV2 G453-SpyTag se conjugaron con un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3) a través de SpyTag. Los virus expresan GFP como un marcador de transducción. La Figura 4A proporciona una transferencia western usando el anticuerpo B1, que reconoce un epítopo lineal compartido por las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2, analizando la reacción entre un scFv anti-HER2 fusionado con SpyCatcher "SpyC-anti-Her2 scFv" y un panel de partículas virales AAV2 que comprende cápsides con las siguientes mutaciones: R585A, delR588, y la inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587, flanqueadas por enlazadores de aminoácidos de diferentes longitudes (Enlazador 1, Enlazador 2, Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8 y Enlazador 10) (SEQ ID NO:13,15,17,19,21,23,25). La Figura 4B proporciona el porcentaje de células HER2+ (gris, eje y) que expresan GFP frente al porcentaje de células HER2-que expresan GFP (negro, eje y) 5 días después de la infección con partículas virales AAV2 que comprenden cápsides con las siguientes mutaciones: R585A, delR588 y N587-SpyTag flanqueadas por enlazadores de aminoácidos de las longitudes indicadas (Enlazador 1, Enlazador 2, Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8 y Enlazador 10) (SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21,23 y 25, respectivamente) (eje x). Las partículas AAV2 N587 SpyTag se conjugaron con un scFv anti-HER2 fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
La Figura 5A proporciona una transferencia western usando el anticuerpo B1, que reconoce un epítopo lineal compartido por las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2, analizando la reacción entre un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher "SpyC-anticuerpo anti-Her2", y un panel de partículas virales AAV2 que comprende cápsides con las siguientes mutaciones: R585A, delR588, y la inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587, flanqueadas por enlazadores de aminoácidos de diferentes longitudes (Sin enlazador, Enlazador 1, Enlazador 2, Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8 y Enlazador 10) (SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, respectivamente). La Figura 5B proporciona el porcentaje de células HER2+ (gris, eje y) que expresan GFP frente al porcentaje de células HER2- que expresan GFP (negro, eje y) 5 días después de la infección con partículas AAV2 de tipo silvestre (wt) o partículas virales AAV2 que comprenden cápsides con las siguientes mutaciones: R585A, delR588 y N587-SpyTag flanqueadas por enlazadores de aminoácidos de las longitudes indicadas (sin enlazador, Enlazador 1, Enlazador 2, Enlazador 4, Enlazador 6, Enlazador 8 y Enlazador 10) (SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, respectivamente) (eje x). Las partículas AAV2 N587 SpyTag se conjugaron con un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
La Figura 6A proporciona una transferencia western usando el anticuerpo B1, que reconoce un epítopo lineal compartido por las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2, analizando la reacción entre un scFv anti-HER2 scFv C6.5 fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO: 3) "SpyC-scFv anti-HER2" y un panel de partículas virales AAV2 en mosaico que comprende mezclas entre proteínas de la cápside "SpyTag" que contienen mutaciones R585A, delR588 y N587-enlazador 10-SpyTag (s Eq ID NO: 25), y proteínas de la cápside "HBM" que contienen mutaciones R585A y R588A, pero no SpyTag (SEQ ID NO:11). Las proteínas de la cápside "SpyTag" y "HBM" se mezclaron en proporciones variables (1:0, 1:1 y 1:3). La Figura 6B proporciona el porcentaje de células 293 hErbB2 HER2+ (barras grises) y células 293 parentales HER2-(barras negras) que expresan GFP (eje y) 5 días después de la infección con partículas virales AAV2 en mosaico (eje x) que comprenden mezclas entre proteínas de la cápside "Enlazador 10" que contienen mutaciones R585A, delR588 y N587-enlazador 10-SpyTag (SEQ ID NO: 25), y proteínas de la cápside "HBM" que contienen mutaciones R585a y R588A, pero no SpyTag (SEQ ID NO:11). Las proteínas de la cápside "Enlazador 10" y "HBM" se mezclaron en proporciones variables (1:0, 3:1, 1:1 y 1:3), y se conjugaron con un scFv anti-HER2 fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
La Figura 7A proporciona una transferencia western usando el anticuerpo B1, que reconoce un epítopo lineal compartido por las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2, analizando la reacción entre un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3) "SpyC-anticuerpo anti-HER2" y un panel de partículas virales AAV2 en mosaico que comprende mezclas entre proteínas de la cápside "SpyTag" que contienen mutaciones R585A, delR588 y N587-enlazador 10-SpyTag (SEQ ID NO: 25), y proteínas de la cápside "HBM" que contienen mutaciones R585A y R588A, pero no SpyTag (SEQ ID NO:11). Las proteínas de la cápside "SpyTag" y "HBM" se mezclaron en proporciones variables (1:0, 3:1, 1:1 y 1:3). La Figura 7B proporciona el porcentaje de células 293 hErbB2 HER2+ (barras grises) y células 293 parentales HER2-(barras negras) que expresan GFP (eje y) 5 días después de la infección con partículas virales AAV2 en mosaico (eje x) que comprenden mezclas entre proteínas de la cápside "Enlazador 10" que contienen mutaciones R585A, delR588 y N587-enlazador 10-SpyTag (SEQ ID NO: 25), y proteínas de la cápside "HBM" que contienen mutaciones R585a y R588A, pero no SpyTag (SEQ ID NO:11). Las proteínas de la cápside "Enlazador 10" y "HBM" se mezclaron en proporciones variables (1:0, 3:1, 1:1 y 1:3) y se conjugaron con un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (Se Q ID NO:3).
La Figura 8A proporciona una transferencia western usando el anticuerpo B1, que reconoce un epítopo lineal compartido por las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2, analizando la reacción entre un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO: 3) "SpyC-anticuerpo anti-HER2" y un panel de partículas virales AAV2 en mosaico que comprende mezclas entre proteínas de la cápside "SpyTag" y proteínas de la cápside "HBM" que contienen mutaciones R585A y R588A, pero no SpyTag (SEQ ID NO:11). Las proteínas de la cápside "SpyTag" incluyen "G453 SpyTag", que contiene mutaciones R585A, R588A e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo G453 (SEQ ID NO:27), y "G453 Enlazador10 SpyTag", que contiene mutaciones R585A, R588A e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo G453 y flanqueado a ambos lados por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO:29). Las cápsides "G453 SpyTag" y "G453 Enlazador10 SpyTag" indicadas se mezclaron con cápsides "HBM" en proporciones variables (1:0, 1:3 y 1:7). La Figura 8B proporciona el porcentaje de células 293 hErbB2 HER2+ (barras grises) y células 293 parentales HER2-(barras negras) que expresan GFP (eje y) 5 días después de la infección con partículas virales AAV2 de tipo silvestre "wt" o en mosaico (eje x) que comprenden mezclas entre proteínas de la cápside "G453 SpyTag" que contienen mutaciones R585A, R588A, y la inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo G453 (SEQ ID NO:27), o proteínas de la cápside "G453 Enlazador 10 SpyTag" que contienen mutaciones R585A, R588A, y la inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo G453 y flanqueado a ambos lados por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO: 29), y proteínas de la cápside "HBM" que contienen mutaciones R585A y R588A, pero no SpyTag (SEQ ID NO:11). Las cápsides "G453 SpyTag" o "G453 Linker10 SpyTag" y "HBM" se mezclaron en proporciones variables (1:0 "puro", 1:3 y 1:7), y se conjugaron con un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3).
La Figura 9 proporciona diagramas de dispersión obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células positivas (+) para la expresión de ASGR1 después de la infección con partículas "AAV2 wt", Partículas "AAV2 SpyTag sin anticuerpo" o partículas "AAV2 SpyTag Anti-ASGR1". Las cápsides "AAV2 wt" son de tipo silvestre sin mutaciones ni modificaciones (SEQ ID NO:9), mientras que la cápside "AAV2 SpyTag" contiene las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Las partículas "AAV2 SpyTag Anti-ASGR1" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a ASGR1. También se muestran gráficos de dispersión obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúa la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células positivas (+) para la expresión de CD63 después de la infección con partículas "AAV2 wt", partículas "AAV2 SpyTag sin anticuerpo" o partículas "AAV2 SpyTag Anti-CD63". Las cápsides "AAV2 wt" son de tipo silvestre sin mutaciones ni modificaciones (SEQ ID NO:9), mientras que la cápside "AAV2 SpyTag" contiene las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Las partículas "AAV2 SpyTag Anti-CD63" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a CD63. Los virus expresan GFP como un marcador de transducción. También se muestran gráficos de dispersión obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúa la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en células positivas (+) para la expresión de PTPRN después de la infección con partículas "AAV9 wt", partículas "AAV2 SpyTag anticuerpo irrelevante" o partículas "AAV2 SpyTag Anti-PTPRN". Las cápsides "AAV9 wt" son de tipo silvestre sin mutaciones ni modificaciones (SEQ ID NO:31), mientras que las cápsides "AAV2 SpyTag" son partículas virales en mosaico que comprenden una proporción de 1:7 entre las proteínas de la cápside "SpyTag" en donde SpyTag se inserta directamente después del residuo G453 flanqueado por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO:29) y entre cápsides sin SpyTag pero que contienen una secuencia de aminoácidos de etiqueta Myc insertada directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:53) que reduce la unión al receptor natural. Las partículas "AAV2 SpyTag anticuerpo irrelevante" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que no se une a PTPRN. Las partículas "AAV2 SpyTag Anti-PTPRN" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a PTPRN. Los virus expresan GFP como un marcador de transducción. También se muestran los resultados de un ensayo de luciferasa que evalúa la expresión de luciferasa de luciérnaga en células positivas (+) para hENTPD3 después de la infección con partículas "AAV2 wt", partículas "AAV2 mAb irrelevante", partículas "AAV2 Anti-ENTPD3" y partículas "AAV2 Anti-hCD20". Las cápsides de "AAV2 wt" son de tipo silvestre sin mutaciones ni modificaciones (SEQ ID NO:9), mientras que las cápsides de "AAV2 anticuerpo" contienen las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Las partículas de "AAV2 mAb irrelevante" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que no se une a hENTPD3. Las partículas "AAV2 anti-hCD20" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a hCD20, que no se expresa en las células hENTPD3+ y sirve como control negativo adicional. Las partículas "AAV2 anti-ENTPD3" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a hENTPD3. Los virus expresan la luciferasa de luciérnaga como un marcador de transducción. También se muestran los resultados de un ensayo de luciferasa que evalúa la expresión de luciferasa de luciérnaga en células positivas (+) para hCD20 después de la infección con partículas "AAV2 wt", partículas "AAV2 mAb irrelevante", partículas "AAV2 Anti-ENTPD3" y partículas "AAV2 Anti-hCD20". Las cápsides de "AAV2 wt" son de tipo silvestre sin mutaciones ni modificaciones (SEQ ID NO:9), mientras que las cápsides de "AAV2 anticuerpo" contienen las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Las partículas de "AAV2 mAb irrelevante" se conjugaron con una SpyCatcheranticuerpo fusionado que no se une a hENTPD3. Las partículas "AAV2 anti-ENTPD3" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a hENTPD3, que no se expresa en las células hCD20+ y sirve como control negativo adicional. Las partículas "AAV2 anti-hCD20" se conjugaron con una SpyCatcher-anticuerpo fusionado que se une específicamente a hCD20. Los virus expresan la luciferasa de luciérnaga como un marcador de transducción.
La Figura 10 A proporciona una transferencia western usando el anticuerpo B1, que reconoce un epítopo lineal compartido por las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV9, analizando la reacción entre un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (SEQ ID NO:3) "SpyC-Herceptin" y un panel de partículas virales AAV9. Estas partículas virales AAV9 comprenden cápsides que contienen la mutación W503A, que reduce la unión al receptor, y la inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo A589 o g 453 sin un enlazador o flanqueado por un enlazador de 10 aminoácidos, o partículas virales AAV9 en mosaico que comprenden una proporción de 1:7 entre proteínas de la cápside "SpyTag" que contienen mutaciones W503A y A589-Enlazadorl0-SpyTag o G453-Enlazador10-SpyTag, con proteínas de la cápside "W503A" que contienen la mutación W503A, pero no SpyTag. La Figura 10B proporciona el porcentaje de células 293 hErbB2 HER2+ (barras grises) y células 293 parentales HER2- (barras negras) (eje y) que expresan GFP cinco días después de la infección con partículas virales AAV9 conjugadas con un anticuerpo anti-HER2 (HERCEPTIN®) fusionado con SpyCatcher (eje x). Estas partículas virales AAV9 comprenden cápsides que contienen la mutación W503A, que reduce la unión al receptor, y la inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo A589 (o G453) sin un enlazador o flanqueado por un enlazador de 10 aminoácidos, o partículas virales AAV9 en mosaico que comprenden una proporción de 1:7 entre las proteínas de la cápside "SpyTag" que contienen mutaciones W503A y A589-Enlazador10-SpyTag o G453-Enlazador10-SpyTag, con proteínas de la cápside "W503A" que contienen la mutación W503A, pero no SpyTag. Los virus expresan GFP como un marcador de transducción.
La Figura 11 proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de hígado tomadas de ratones C57BL/6 modificados transgénicamente para expresar ASGR1 humano en células hepáticas. Las muestras se recogieron diez días después de la inyección intravenosa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o con 2,5 x10 11 genoma viral (vg)/animal de partículas AAV2 etiquetadas con SpyTag que portan un nucleótido CAGG eGFP de interés y modificadas por (1) SpyCatcher-anticuerpo anti-CD3 humano (a Av SpyT-anti-hCD3 CAGG eGFP) o (2) SpyCatcher-anticuerpo anti-ASGR1 humano (AAV SpyT-anti-hASGR1 CAGG eGFP). Los ratones se sacrificaron y se perfundieron transcardiacamente con PFA al 4 %. Se recogieron los órganos hígado, riñón y corazón y se deshidrataron en sacarosa al 15 % seguido de sacarosa al 30 %. A continuación, los órganos se crioseccionaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpo anti-EGFP de pollo (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) y anticuerpo secundario antipollo conjugado con Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). Cada imagen representa un ratón. La cápside de "AAV2 etiquetada con SpyTag" contiene las siguientes mutaciones: R585A, delR588, e inserción del péptido SpyTag directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:13). Los virus expresan eGFP como un marcador de transducción.
La Figura 12 proporciona imágenes de luminiscencia de ratones individuales que no expresan ASGR1 humano en células hepáticas (control) y ratones modificados genéticamente que expresan ASGR1 humano en células hepáticas (ratones humanizados ASGR1) 14 días después de la inyección intravenosa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o con 3,0 x 1011 genomas virales (vg)/animal de partículas AAV2 de tipo silvestre (wt), o partículas AAV2 etiquetadas con SpyTag que llevan el nucleótido de luciferasa de luciérnaga de interés y modificadas por (1) SpyCatcher-anticuerpo anti-CD63 humano o (2) SpyCatcher-anticuerpo anti-ASGR1 humano. Estas partículas virales AAV2 son partículas virales en mosaico que comprenden una proporción de 1:7 entre proteínas de la cápside "SpyTag" en donde SpyTag se inserta directamente después del residuo G453 flanqueado por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO: 29) y entre cápsides sin SpyTag pero que contienen una secuencia de aminoácidos de etiqueta Myc insertada directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:53) que reduce la unión al receptor natural. Los virus expresan la luciferasa de luciérnaga como un marcador de transducción. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano, inyectados con un sustrato de luciferina y fotografiados 10 minutos más tarde usando el IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer).
La Figura 13 proporciona imágenes de inmunohistoquímica de muestras de hígado y páncreas tomadas de ratones C57BL/64 semanas después de la inyección intravenosa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o con 1,0 x 1012 genoma viral (vg)/animal de partículas AAV9 de tipo silvestre (wt), o con 1,0 x 1013 genoma viral (vg)/animal de partículas AAV2 etiquetadas con SpyTag que contienen un nucleótido eGFP de CMV de interés y están modificadas por (1) SpyCatcher-anticuerpo anti-ASGR1 humano (AAV2 SpyTag mAb irrelevante) o (2) SpyCatcher-anticuerpo anti-ENTPD3 humano (AAV2 SpyTag anti-ENTPD3). Se sacrificaron los ratones y se recogieron el hígado y el páncreas y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. A continuación, los órganos se incluyeron y se crioseccionaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpos anti-GFP. Cada imagen representa un ratón. Estas partículas virales AAV2 son partículas virales en mosaico que comprenden una proporción de 1:7 entre proteínas de la cápside "SpyTag" en donde SpyTag se inserta directamente después del residuo G453 flanqueado por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO: 29) y entre cápsides sin SpyTag pero que contienen una secuencia de aminoácidos de etiqueta Myc insertada directamente después del residuo N587 (s Eq ID NO:53) que reduce la unión al receptor natural. Los virus expresan eGFP como un marcador de transducción. Se describe la expresión de ENTPD3 en las células de los islotes pancreáticos y en la lengua, entre otros tipos celulares, pero no en el hígado. Las partículas de AAV2 etiquetadas con SpyTag se eliminaron del hígado; no se observó la expresión de eGFP en los hígados de ratones inyectados con partículas "AAV2 SpyTag mAb irrelevante" o "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3". Se detectó una tinción positiva en los islotes pancreáticos en la muestra de páncreas de uno de los ratones inyectados con partículas "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3".
La Figura 14 proporciona imágenes de inmunohistoquímica de muestras de hígado y lengua tomadas de ratones C57BL/6 14 días después de la inyección intravenosa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o con 2,0 x 1012 genoma viral (vg)/animal de partículas AAV9 de tipo silvestre (wt), o partículas AAV2 etiquetadas con SpyT ag que llevan un ácido nucleico eGFP de CMV de interés y modificado por (1) SpyCatcher-anticuerpo anti-ASGR1 humano (AAV2 SpyTag mAb irrelevante) o (2) SpyCatcher-anticuerpo anti-ENTPD3 humano, que se une a ENTPD3 de ratón (AAV2 SpyTag anti-ENTPD3). Se sacrificaron los ratones y se recogieron los hígados y las lenguas y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. A continuación, los órganos se incluyeron y se crioseccionaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpos anti-GFP. Cada imagen representa un ratón; se inyectó y analizó a tres ratones de los grupos "AAV2 SpyTag mAb irrelevante" y "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3" y todos mostraron patrones de expresión de GFP similares. Estas partículas virales AAV2 son partículas virales en mosaico que comprenden una proporción de 1:7 entre proteínas de la cápside "SpyTag" en donde SpyTag se inserta directamente después del residuo G453 flanqueado por un enlazador de 10 aminoácidos (SEQ ID NO: 29) y entre cápsides sin SpyTag pero que contienen una secuencia de aminoácidos de etiqueta Myc insertada directamente después del residuo N587 (SEQ ID NO:52) que reduce la unión al receptor natural. Los virus expresan eGFP como un marcador de transducción. Se describe la expresión de ENTPD3 en la lengua de ratón pero no en el hígado (datos extraídos de bases de datos públicas GenePaint.org http://www.informat¡cs.iax.org/assav/MGI:5423021 y el proyecto Riken FANTOM5, conjunto de datos de ratones adultos). No se observó expresión de eGFP en los hígados de ratones inyectados con partículas "AAV2 SpyTag mAb irrelevante" o "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3", pero se detectó en la lengua de los tres ratones inyectados con partículas "AAV2 SpyTag anti-ENTPD3".
Descripción detallada
La divulgación técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo, a saber, para situar la invención real reivindicada en un contexto técnico más amplio.
El documento WO2016112921 describe la utilización de un par de unión específica (SpyCatcher:SpyTag) para generar partículas similares a virus (VLP) a partir de un bacteriófago AP205 modificado que presenta antígenos inmunogénicos a una alta densidad en la cápside AP205 con fines de vacunación. Teóricamente, con el fin de redireccionar un vector viral, tal alto grado de modificación de la cápside viral puede ser deseable para asegurar que el tropismo natural del vector viral se reduzca o anule sustancialmente. Sin embargo, dicha presentación de ligandos de direccionamiento a una alta densidad en la superficie viral puede interferir con las eficiencias de transducción. Véase, Ejemplos 4 y 5. Para lograr eficiencias de transducción óptimas, se descubrió que se producen eficiencias de transducción óptimas cuando se reduce el grado de modificación de la superficie viral con el miembro. Por ello, en el presente documento se proporcionan las partículas virales modificadas genéticamente, composiciones que comprenden las mismas, y métodos para producir y usar las mismas.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.
Las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que llegará a ser evidente para los expertos en la materia tras leer esta divulgación.
El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de cadena pesada comprende al menos tres dominios, Ch1, Ch2, Ch3 y opcionalmente Ch4. Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera (Ch) y una región constante de cadena ligera (Cl). Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada dominio variable de cadena pesada y cadena ligera comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDr 3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las estructuras típicas de anticuerpos tetraméricos comprenden dos dominios de unión a antígeno idénticos, cada uno de los cuales está formado por asociación de los dominios Vh y Vl, y cada uno de los cuales junto con sus respectivos dominios Ch y Cl forman la región Fv del anticuerpo. Los anticuerpos de un solo dominio comprenden un solo dominio de unión a antígeno, p. ej., una Vh o una Vl. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, p. ej., la parte de un anticuerpo que reconoce y se une al primer miembro de un par de unión específica de un antígeno, también se conoce como "parátopo". Es una pequeña región (de 5 a 10 aminoácidos) de la región Fv de un anticuerpo, parte del fragmento de unión al antígeno (región Fab), y puede contener partes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo. Un parátopo se une específicamente a un primer miembro de un par de unión específica cuando el parátopo se une al primer miembro de un par de unión específica con una alta afinidad. La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd con respecto a su primer miembro diana de un par de unión específica de aproximadamente 10-9 M o inferior (p. ej., aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). En una realización, Kd se mide por resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™; en otra realización, Kd se mide por ELISA.
La expresión "región determinante de complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia del ácido nucleico de los genes de la inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparecen entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (p. ej., un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de la línea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T virgen o maduro. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar a partir de una secuencia codificada en una línea germinal de un animal), humanizada, y/ modificada con sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (p. ej., para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (p. ej., secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (p. ej., en una secuencia del ácido nucleico no reordenada) pero que son contiguas en una secuencia del ácido nucleico de un linfocito B, p. ej., como resultado del corte y empalme o de la conexión de las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).
La expresión "Repetición terminal invertida" o "ITR" incluye secuencias de ácido nucleico simétricas en el genoma de virus adenoasociados necesarios para una replicación eficiente. Las secuencias de ITR están localizadas en cada extremo del genoma de ADN del AAV. Las ITR sirven como los orígenes de replicación para la síntesis de ADN viral y son componentes en cis esenciales para generar vectores de AAV.
La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique lo contrario incluye las cadenas ligeras k y A humanas y una VpreB, así como cadenas ligeras subrogadas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen normalmente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región constante de cadena ligera. Un dominio variable de cadena ligera está codificado por una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera, que comprende generalmente segmentos de Vl y Jl, derivados de un repertorio de segmentos V y J presentes en la línea germinal. Las secuencias, las localizaciones y la nomenclatura de los segmentos de cadena ligera V y J para varios organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, www.imgt.org. Las cadenas ligeras incluyen aquellas, p. ej., que no se unen selectivamente ni a un primer ni a un segundo primer miembro de un par de unión específica unido selectivamente por el primer miembro de una proteína de unión al par de unión específica en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada o a otra cadena ligera con la unión y el reconocimiento, de uno o más primeros miembros de un par de unión específica unidos selectivamente por el primer miembro de una proteína de unión al par de unión específica en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes o universales incluyen las derivadas de un gen Vk1-39Jk humano o un gen Vk3-20Jk humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (p. ej., maduradas por afinidad) de las mismas. Los segmentos Vl humanos ilustrativos incluyen un segmento del gen Vk1-39 humano, un segmento del gen Vk3-20 humano, un segmento del gen VA1-40 humano, un segmento del gen VA1-44 humano, un segmento del gen VA2-8 humano, un segmento del gen VA2-14 humano y un segmento del gen VA3-21 humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (por ejemplo, maduradas por afinidad) del mismo. Se pueden fabricar cadenas ligeras que comprendan un dominio variable de un organismo (p. ej., humano o roedor, p. ej., rata o ratón; o pájaro, p. ej., pollo) y una región constante del mismo u otro organismo diferente (p. ej., humano o roedor, p. ej., rata o ratón; o pájaro, p. ej., pollo).
El término "sobre" o "aproximadamente" incluye estar dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Tal intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro del 50 %, más preferentemente dentro del 20 %, aún más preferentemente dentro del 10 %, e incluso más preferentemente dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. La variación permisible abarcada por el término "sobre" o "aproximadamente" depende del sistema particular que se esté estudiando, y puede apreciarse fácilmente por un experto en la materia.
El término "proteína de la cápside" incluye una proteína que forma parte de la cápside del virus. En los virus adenoasociados, las proteínas de la cápside generalmente se denominan VP1, VP2 y/o VP3, y están codificadas por un solo gen cap. En los AAV, las tres proteínas de la cápside de AAV se producen de forma superpuesta a partir del marco de lectura abierto (ORF) cap mediante corte y empalme de ARNm alternativo y/o uso del codón de inicio de traducción alternativo, aunque las tres proteínas usan un codón de parada común. Warrington et al. (2004) J. Virol.
78:6595. La VP1 de AAV2 generalmente se traduce desde un codón de inicio ATG (aminoácido M1) en un ARNm de 2,4 kb, mientras que VP2 y VP3 de AAV2 provienen de un ARNm más pequeño de 2,3 kb, usando un codón de inicio ACG más débil para la producción de VP2 (aminoácido T138) y la traducción de lectura completa hasta el siguiente codón ATG disponible (aminoácido M203) para la producción de la proteína de la cápside más abundante, VP3. Warrington, citado anteriormente; Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309-19. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside de los virus adenoasociados son bien conocidas en la técnica y generalmente se conservan, particularmente dentro de los dependoparvovirus. Véase, Rutledge et al., citado anteriormente. Por ejemplo, Rutledge et al. (1998), citado anteriormente, proporciona en la Figura 4B alineaciones de secuencias de aminoácidos para las proteínas de la cápside VP1, VP2 y Vp3 de AAV2, AAV3, AAV4 y AAV6, en donde los sitios de inicio para cada una de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 se indican con flechas y los dominios variables están recuadrados. Por consiguiente, aunque las posiciones de aminoácidos proporcionadas en el presente documento pueden proporcionarse en relación con la proteína de la cápside VP1 del AAV, y las posiciones de aminoácidos proporcionadas en el presente documento que no se especifican más se refieren a la secuencia de AAV2 de la proteína de cubierta principal VP1 establecida como SEQ ID NO:1, un experto en la materia podría determinar respectivamente y fácilmente la posición de ese mismo aminoácido dentro de la proteína de la cápside VP2 y/o VP3 del AAV, y la posición correspondiente de los aminoácidos entre diferentes serotipos. Por consiguiente, aunque las posiciones de aminoácidos proporcionadas en el presente documento pueden proporcionarse en relación con la proteína de la cápside VP1 del AAV, y las posiciones de aminoácidos proporcionadas en el presente documento que no se especifican más se refieren a la secuencia de AAV-2 de la proteína de la cubierta principal VP1 establecida como SEQ ID NO:9, un experto en la materia podría determinar respectivamente y fácilmente la posición de ese mismo aminoácido dentro de la proteína de la cápside VP2 y/o VP3 del AAV, y el aminoácido correspondiente y la posición entre diferentes serotipos de AAV. Además, un experto en la materia podría intercambiar dominios entre proteínas de la cápside de diferentes serotipos de AAV para la formación de una "proteína de la cápside quimérica".
Se ha descrito el intercambio de dominios entre dos construcciones de proteínas de la cápside de AAV para la generación de una "proteína de la cápside de AAV quimérica", véase, p. ej., Shen et al. (2007) Mol. Therapy 15(11):1955-1962. Una "proteína de la cápside de AAV quimérica" incluye una proteína de la cápside de AAV que comprende secuencias de aminoácidos, p. ej., dominios, de dos o más serotipos de AAV diferentes y que es capaz de formar y/o forma una cápside viral/partícula viral similar a AAV. Una proteína de la cápside de AAV quimérica está codificada por un gen de la cápside de AAV quimérico, p. ej., un nucleótido que comprende una pluralidad, p. ej., al menos dos, secuencias de ácido nucleico, cada una de cuya pluralidad es idéntica a una parte de un gen de la cápside que codifica una proteína de la cápside de distintos serotipos de AAV, y cuya pluralidad en conjunto codifica una proteína de la cápside de AAV quimérica funcional. La referencia a una proteína de la cápside quimérica en relación con un serotipo de AAV específico indica que la proteína de la cápside comprende uno o más dominios de una proteína de la cápside de ese serotipo y uno o más dominios de una proteína de la cápside de un serotipo diferente. Por ejemplo, una proteína de la cápside quimérica de AAV2 incluye una proteína de la cápside que comprende uno o más dominios de una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 y uno o más dominios de una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un a Av diferente.
Una "cápside en mosaico" comprende al menos dos conjuntos de proteínas VP1, VP2 y/o VP3, cada conjunto de los cuales está codificado por un gen cap diferente.
En algunas realizaciones, una cápside en mosaico descrita en el presente documento comprende proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes codificadas por un gen cap modificado genéticamente con una inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo heterólogo, y además comprende proteínas VP1, VP2 y/o VP3 codificadas por un gen cap de referencia, p. ej., un gen cap de referencia de tipo silvestre que codifica las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 de tipo silvestre del mismo serotipo AAV que las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes, un gen cap de referencia de control que codifica proteínas VP1, VP2 y VP3 idénticas a las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes excepto por la ausencia del epítopo heterólogo, un gen cap de referencia de tipo silvestre mutado que codifica sustancialmente proteínas VP1, VP2 y/o VP3 de tipo silvestre, proteínas del mismo serotipo AAV que las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes excepto por una mutación (p. ej., inserción, sustitución, deleción), mutación que reduce preferentemente el tropismo de las proteínas VP1, VP2, y VP3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen cap de referencia codifica una proteína VP1, VP2 y/o VP3 quimérica.
La expresión "cadena pesada", o "cadena pesada de la inmunoglobulina" incluye una secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina, incluida la secuencia de región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, procedente de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones f R, a menos que se especifique lo contrario. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de las mismas. Una cadena pesada típica tiene, después del dominio variable (desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal), un dominio Ch1, una bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un primer miembro de un par de unión específica (p. ej., reconocer el primer miembro de un par de unión específica con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR. Los dominios variables de cadena pesada están codificados por una secuencia de nucleótidos de región variable, que comprende generalmente segmentos Vh, Dh, y Jh derivados de un repertorio de segmentos Vh, Dh, y Jh presentes en la línea germinal. Las secuencias, las localizaciones y la nomenclatura para los segmentos V, D y J de cadena pesada para varios organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, a la que se puede acceder a través de Internet en la world wide web (www) en la URL "imgt.org".
La expresión "anticuerpo de cadena pesada solamente", "proteína de unión a antígeno de cadena pesada solamente", "proteína de unión a antígeno de dominio único", "proteína de unión de dominio único" o similares se refiere a una molécula de inmunoglobulina monomérica u homodimérica que comprende una cadena similar a una inmunoglobulina que comprende un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada, que es incapaz de asociarse a una cadena ligera debido a que la región constante de cadena pesada normalmente carece de un dominio Ch1 funcional. Por consiguiente, la expresión "anticuerpo de cadena pesada solamente", "proteína de unión a antígeno de cadena pesada solamente", "proteína de unión a antígeno de dominio único", "proteína de unión a dominio único" o similar abarca tanto (i) una proteína de unión a antígeno de dominio único monomérica que comprende una de las cadenas similares a inmunoglobulinas que comprende un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional, o (ii) una proteína una proteína de unión a antígeno de dominio único homodimérica que comprende dos cadenas similares a inmunoglobulinas, comprendiendo cada una de ellas un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional. En diferentes aspectos, una proteína de unión a antígeno de dominio único homodimérica comprende dos cadenas tipo inmunoglobulina idénticas, comprendiendo cada una de ellas un dominio variable idéntico unido operativamente a una región constante de cadena pesada idéntica que carece de un dominio Ch1 funcional. Asimismo, cada cadena tipo inmunoglobulina de una proteína de unión a antígeno de dominio único comprende un dominio variable, el cual puede ser derivado de segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (por ejemplo, Vh, Dh, Jh), segmentos génicos de cadena ligera (por ejemplo, Vl,, Jl), o una combinación de los mismos, unidos a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada (Ch) que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia codificante de Ch1 (y, opcionalmente, una región bisagra) de un gen de la región constante de cadena pesada de, p. ej., IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos. Una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena pesada puede denominarse "anticuerpo de dominio único Vh" o "proteína de unión a antígeno de dominio único Vh", véase, p. ej., Patente de EE. UU. N.° 8.754.287; publicaciones de patente de Estados Unidos números 20140289876; 20150197553; 20150197554; 20150197555; 20150196015; 20150197556 y 20150197557. Una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena ligera puede denominarse "proteína de unión a antígeno de dominio único Vl", véase, p. ej., la publicación de Estados Unidos N.° 20150289489.
La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique lo contrario incluye las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) y una VpreB, así como cadenas ligeras subrogadas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen normalmente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera. Los dominios variables de cadena ligera están codificados por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera, que generalmente comprenden los segmentos génicos de la cadena ligera Vl y cadena ligera Jl, derivados de un repertorio de segmentos génicos V y J de cadena ligera presentes en la línea germinal. Las secuencias, las localizaciones y la nomenclatura de los segmentos génicos V y J de cadena ligera para varios organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, a la que se puede acceder a través de Internet en la world wide web (www) en la URL "imgt.org". Las cadenas ligeras incluyen aquellas, p. ej., que no se unen selectivamente ni a un primer ni a un segundo primer miembro de un par de unión específica unido selectivamente por el primer miembro de una proteína de unión al par de unión específica en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más primeros miembros de un par de unión específica unidos selectivamente por el primer miembro de una proteína de unión al par de unión específica en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más primeros miembros de un par de unión específica unidos selectivamente por el primer miembro de una proteína de unión al par de unión específica en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes o universales incluyen las derivadas de un gen Vk1-39Jk5 humano o un gen Vk3-20Jk1 humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (p. ej., maduradas por afinidad) de las mismas.
La expresión "unido operativamente", como se usa en el presente documento, incluye una yuxtaposición física (p. ej., en un espacio tridimensional) de componentes o elementos que interactúan, directa o indirectamente entre sí, o coordinarse entre sí para participar en un acontecimiento biológico, cuya yuxtaposición logra o permite tal interacción y/o coordinación. Por proporcionar un solo ejemplo, se dice que una secuencia de control (p. ej., una secuencia de control de la expresión) en un ácido nucleico está "unida operativamente" a una secuencia de codificación cuando está localizada en relación con la secuencia de codificación de tal manera que su presencia o ausencia afecta a la expresión y/o la actividad de la secuencia de codificación. En muchas realizaciones, el "enlace operable" implica el enlace covalente de componentes o elementos relevantes entre sí. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que, en algunas realizaciones, no se requiere enlace covalente para lograr un enlace operable efectivo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las secuencias de control de ácidos nucleicos que están unidas operativamente con las secuencias de codificación que controlan son contiguas al nucleótido de interés. Como alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, una o más de tales secuencias de control actúan en trans o a distancia para controlar una secuencia de codificación de interés. En algunas realizaciones, la expresión "secuencia de control de la expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a las secuencias de polinucleótidos que son necesarias y/o suficientes para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que están ligadas. En algunas realizaciones, las secuencias de control de la expresión pueden ser o comprender un inicio de transcripción apropiado, las secuencias de terminación, del promotor y/o del potenciador; señales de procesamiento del ARN eficientes tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (p. ej., secuencia de consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y/o, en algunas realizaciones, secuencias que potencian la secreción de proteínas. En algunas realizaciones, una o más secuencias de control son preferentemente o exclusivamente activas en una célula hospedadora u organismo particular, o en un tipo de los mismos. Por proporcionar un solo ejemplo, en procariotas, las secuencias de control incluyen normalmente promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, en muchas realizaciones, las secuencias de control incluyen normalmente promotores, potenciadores y/o secuencias de terminación de la transcripción. Los expertos en la materia apreciarán a partir del contexto que, en muchas realizaciones, la expresión "secuencias de control" se refiere a componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y en algunas realizaciones incluye componentes cuya presencia es ventajosa para la expresión (incluyendo, por ejemplo, secuencias líderes, secuencias de direccionamiento y/o secuencias de compañero de fusión).
La expresión "proteína de la cápside recombinante" incluye una proteína de la cápside que tiene al menos una mutación en comparación con la proteína de la cápside correspondiente del virus de tipo silvestre, tipo silvestre que puede ser un virus de referencia y/o de control para un estudio comparativo. Una proteína de la cápside recombinante incluye una proteína de la cápside que comprende una secuencia de aminoácidos heteróloga, que puede ser insertada y/o presentada por la proteína de la cápside. "Heterólogo" en este contexto significa heterólogo en comparación con el virus, del que se deriva la proteína de la cápside. Los aminoácidos insertados pueden insertarse simplemente entre dos aminoácidos dados de la proteína de la cápside. Una inserción de aminoácidos también puede ir acompañada de una eliminación de determinados aminoácidos de la proteína de la cápside en el sitio de inserción, p. ej., 1 o más aminoácidos de la proteína de la cápside están sustituidos por 5 o más aminoácidos heterólogos).
"El "redirecdonamiento" o "reorientación" puede incluir un escenario en el que el vector de tipo silvestre se dirige a varias células dentro de un tejido y/o varios órganos dentro de un organismo, direccionamiento general del tejido u órganos que se reduce o anula mediante la inserción del epítopo heterólogo, y cuyo redireccionamiento a una célula más específica en el tejido o un órgano específico en el organismo se logra con el ligando de direccionamiento que se une a un marcador expresado en la célula específica. Dicho redireccionamiento o reorientación también puede incluir un escenario en el que el vector de tipo silvestre se dirige a un tejido, direccionamiento al tejido que se reduce o anula mediante la inserción del epítopo heterólogo, y cuyo redireccionamiento a un tejido completamente diferente se logra con el ligando de direccionamiento.
"Par de unión específica", "par de unión proteína:proteína" y similares incluye dos proteínas (p. ej., un primer miembro (p. ej., un primer polipéptido) y un segundo miembro afín (p. ej., un segundo polipéptido)) que interactúan para formar un enlace isopeptídico covalente en condiciones que permiten o facilitan la formación de enlaces isopeptídicos, en donde el término "afín" se refiere a componentes que funcionan juntos, es decir, reaccionan juntos para formar un enlace isopeptídico. Así, dos proteínas que reaccionan juntas de forma eficaz para formar un enlace isopeptídico en condiciones que permiten o facilitan la formación de enlaces isopeptídicos también pueden denominarse un par "complementario" de enlazadores peptídicos. Los pares de unión específica capaces de interactuar para formar un enlace isopeptídico covalente se revisan en Veggiani et al. (2014) Trends Biotechnol. 32:506, e incluyen pares de unión péptido:péptido tal como SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002; SpyTag:KTag; isopeptag:pilina C, SnoopTag:SnoopCatcher, etc. En general, una etiqueta peptídica se refiere a un miembro de un par de unión proteína:proteína, que generalmente tiene menos de 30 aminoácidos de longitud, y que forma un enlace isopeptídico covalente con la segunda proteína afín, en donde la segunda proteína afín es generalmente más grande, pero también puede tener menos de 30 aminoácidos de longitud, tal como en el sistema SpyTag:KTag.
La expresión "enlace isopeptídico" se refiere a un enlace amida entre un grupo carboxilo o carboxamida y un grupo amino del cual al menos uno no deriva de una cadena principal de proteína o, como alternativa, no forma parte del esqueleto de la proteína. Un enlace isopeptídico puede formarse dentro de una sola proteína o puede ocurrir entre dos péptidos o un péptido y una proteína. Así, un enlace isopeptídico puede formarse intramolecularmente dentro de una sola proteína o intermolecularmente, es decir, entre dos moléculas de péptido/proteína, p. ej., entre dos enlazadores peptídicos. Normalmente, un enlace isopeptídico puede ocurrir entre un residuo de lisina y un residuo de asparagina, ácido aspártico, glutamina o ácido glutámico o el grupo carboxilo terminal de la cadena peptídica o proteica o puede ocurrir entre el extremo alfa-amino de la cadena peptídica o proteica y una asparagina, ácido aspártico, glutamina o ácido glutámico. Cada residuo del par implicado en el enlace isopeptídico se denomina en el presente documento residuo reactivo. En realizaciones preferidas de la invención, se puede formar un enlace isopeptídico entre un residuo de lisina y un residuo de asparagina o entre un residuo de lisina y un residuo de ácido aspártico. Particularmente, los enlaces isopeptídicos pueden ocurrir entre la amina de la cadena lateral de la lisina y el grupo carboxamida de la asparagina o el grupo carboxilo de un aspartato.
El sistema SpyTag:SpyCatcher se describe en la Patente de EE. UU. N.° 9.547.003 y Zakeri et al. (2012) PNAS 109:E690-E697, y se deriva del dominio CnaB2 de la proteína de unión a fibronectina FbaB de Streptococcus pyogenes. Al dividir el dominio, Zakeri et al. obtuvieron un péptido "SpyTag" que tiene la secuencia AHIVMVDAYKPTK (SEQ ID NO:1) que forma un enlace amida con su proteína afín "SpyCatcher", un polipéptido de 112 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:3. (Zakeri (2012), citado anteriormente). Un par de unión específica adicional derivado del dominio CnaB2 es SpyTag:KTag, que forma un enlace isopeptídico en presencia de SpyLigase. (Fierer (2014) PNAS 111:E1176-1181) SpyLigase se diseñó escindiendo la hebra p de SpyCatcher que contiene una lisina reactiva, dando como resultado KTag, etiqueta peptídica de 10 residuos que tiene la secuencia de aminoácidos ATHIKFSKRD (SEQ ID NO:2). El sistema SpyTag002:SpyCatcher002 se describe en Keeble et al (2017) Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25. SpyTag002 tiene la secuencia de aminoácidos VPTIVMVDAy Kr YK, establecida como SEQ ID NO:54, y se une a SpyCatcher002 (SEQ ID NO:55).
El sistema SnoopTag:SnoopCatcher se describe en Veggiani (2016) PNAS 113:1202-07. El dominio D4 similar a Ig de RrgA, una adhesina de Streptococcus pneumoniae, se dividió para formar SnoopTag (residuos 734-745; SEQ ID NO:5) y SnoopCatcher (residuos 749-860). La incubación de SnoopTag y SnoopCatcher da como resultado un enlace isopeptídico espontáneo que es específico entre las proteínas complementarias. Veggieni (2016)), citado anteriormente.
El par de unión específica isopeptag:pilina-C se derivó de la principal proteína pilina Spy0128 de Streptococcus pyogenes. (Zakeir y Howarth (2010) J. Am. Chem. Soc. 132:4526-27). Isopeptag tiene la secuencia de aminoácidos TDKDMTITFTNKKDAE, establecida como SEQ ID NO:7, y se une a pilina-C (residuos 18-299 de Spy0128). La incubación de SnoopTag y SnoopCatcher da como resultado un enlace isopeptídico espontáneo que es específico entre las proteínas complementarias. Zakeir y Howarth (2010), citado anteriormente.
La expresión "etiqueta peptídica" incluye polipéptidos que son (1) heterólogos con la proteína que está etiquetada con la etiqueta peptídica, (2) un miembro de un par de unión proteína:proteína específica capaz de formar un enlace isopeptídico, y (3) no más de 50 aminoácidos de longitud.
La expresión "células diana" incluye cualquier célula en la que se desee la expresión de un nucleótido de interés.
Preferentemente, las células diana presentan un receptor en su superficie que permite que la célula sea dirigida con un ligando de direccionamiento, como se describe a continuación.
El término "transducción" o "infección" o similar se refiere a la introducción de un ácido nucleico en el núcleo de una célula diana por un vector viral. El término eficiencia en relación con la transducción o similar, p. ej., "eficiencia de transducción" se refiere a la fracción (por ejemplo, porcentaje) de células que expresan un nucleótido de interés después de la incubación con un número determinado de vectores virales que comprenden el nucleótido de interés. Los métodos bien conocidos para determinar la eficiencia de la transducción incluyen la clasificación de células activadas por fluorescencia de células transducidas con un gen indicador fluorescente, PCR para la expresión del nucleótido de interés, etc.
La expresión "tipo silvestre", como se usa en el presente documento, incluye una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado "normal" (en contraposición a un estado mutante, afectado, alterado, etc.) o contexto. Los expertos en la materia apreciarán que los vectores virales de tipo silvestre, p. ej., proteínas de la cápside de tipo silvestre, pueden utilizarse como vector viral de referencia en estudios comparativos. En general, una proteína/cápside/vector de la cápside viral de referencia son idénticos a la proteína/cápside/vector de la cápside viral de prueba, excepto por el cambio para el cual se va a probar el efecto. Por ejemplo, para determinar el efecto, p. ej., en la eficacia de transducción, de insertar un primer miembro de un par de unión específica en un vector viral de prueba, las eficiencias de transducción del vector viral de prueba (en ausencia o presencia de un ligando de direccionamiento apropiado) se pueden comparar con las eficiencias de transducción de un vector viral de referencia (en ausencia o presencia de un ligando de direccionamiento apropiado si es necesario) que es idéntico a el vector viral de prueba en todos los casos (p. ej., mutaciones adicionales, nucleótido de interés, número de vectores virales y células diana, etc.) excepto por la presencia de un primer miembro de un par de unión específica.
La estrategia de redireccionamiento descrita en el presente documento proporciona las ventajas de los enfoques de andamiaje y recombinatorio directo descritos anteriormente, además de resolver muchas de las desventajas inherentes a ambos. La estrategia utiliza un par de unión específica, en donde el primer miembro y el segundo miembro afín se unen específicamente entre sí, y al unirse, formar un enlace covalente que une permanentemente la partícula viral a cualquier ligando diana que esté fusionado con el miembro afín. Con tal partícula viral modificada genéticamente, el tropismo se mantiene mientras la cápside viral permanece intacta, p. ej., una ventaja del sistema proporcionado en el presente documento en comparación con otros enfoques de andamiaje es la permanencia con la que el "adaptador", p. ej., ligando de direccionamiento, se une a la partícula viral recombinante de manera similar a un enfoque recombinatorio directo. Sin embargo, al contrario que el enfoque recombinatorio directo, el sistema descrito en el presente documento mantiene la flexibilidad de los enfoques del adaptador de andamiaje en el sentido de que la partícula viral recombinante puede permanecer constante con la variabilidad que existe con el adaptador, p. ej., el miembro afín puede fusionarse con diferentes ligandos de direccionamiento y acoplarse a continuación las diferentes proteínas de fusión a la partícula viral de acuerdo con la célula diana.
Proteínas de la cápside viral recombinantes y vectores virales y ácidos nucleicos
En el presente documento se proporciona una partícula viral recombinante (p. ej., una proteína de la cápside viral y una cápside viral recombinante y/o un vector viral recombinante que comprende la proteína de la cápside viral recombinante) que se modifica genéticamente para mostrar una secuencia de aminoácidos heteróloga que comprende un primer miembro de un par de unión específica, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una longitud inferior a 50 aminoácidos, y en donde la partícula/proteína de la cápside viral recombinante muestra un tropismo natural de reducido a anulado. En algunas realizaciones, la partícula viral comprende además un segundo miembro afín del par de unión específica, en donde el primer y el segundo miembro están unidos covalentemente mediante un enlace isopeptídico, y en donde el segundo miembro está fusionado con un ligando de direccionamiento.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende un primer miembro de un par de unión específica y uno o más enlazadores. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos comprende un primer miembro de un par de unión específica flanqueado por un enlazador, p. ej., la secuencia heteróloga de aminoácidos comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal un primer enlazador, un primer miembro de un par de unión específica y un segundo enlazador. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores tienen cada uno independientemente una longitud de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, el primer y segundo enlazadores son idénticos.
En general, una secuencia de aminoácidos heteróloga como se describe en el presente documento, p. ej., que comprende un primer miembro de un par de unión específica solo o en combinación con uno o más enlazadores, está entre aproximadamente 5 aminoácidos y 50 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 6 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 7 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 8 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 9 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 11 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 13 aminoácidos. En algunas rea lizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 14 aminoácidos . En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 15 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 16 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 17 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 18 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 19 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 21 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 22 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 23 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 24 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 25 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 26 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 27 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 28 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 29 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 30 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 31 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 32 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 33 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 34 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 35 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 36 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 37 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 38 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 39 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 40 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 41 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 42 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 43 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 44 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 45 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 46 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 47 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 48 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga de aminoácidos tiene una longitud de 49 aminoácidos. En algunas
En algunas realizaciones, el par de unión específica es un par de unión SpyTag:SpyCatcher, en donde el primer miembro es SpyTag, y en donde el segundo miembro afín es SpyCatcher. En algunas realizaciones, el par de unión específica es SpyTag:KTag, en donde el primer miembro es SpyTag y en donde el segundo miembro afín es KTag. En algunas realizaciones, el par de unión específica es SpyTag:KTag, en donde el primer miembro es KTag y en donde el segundo miembro afín es SpyTag. En algunas realizaciones, el par de unión específica es isopeptag:pilina-C, en donde el primer miembro es isopeptag, y en donde el segundo miembro afín es pilina-C, o una parte de la misma. En algunas realizaciones, el par de unión específica es SnoopTag:SnoopCatcher y el primer miembro es SnoopTag y el segundo miembro afín es SnoopCatcher.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento es una proteína de la cápside Ad, p. ej., una proteína de la cápside de un serotipo Ad seleccionado del grupo que consiste en Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6 y Ad7. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside Ad2. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside Ad5. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside viral Ad recombinante como se describe en el presente documento comprende un primer miembro de un par de unión específica en un dominio de proteína de la fibra, p. ej., en el extremo carboxi de la proteína de la fibra, dominio knob de la fibra y/o bucle HI del dominio knob de la fibra.
La proteína de la cápside viral de la presente invención se deriva de un gen cap de un virus adenoasociado (AAV) que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV), p. ej., un gen de la cápside de un serotipo AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, a AV5, Aa V6, AAV7, AAV8 y AAV9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2 o un gen de la cápside de AAV9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos de tipo silvestre se establece como SEQ ID NO:9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos de tipo silvestre se establece como SEQ ID NO:31.
En general, una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento comprende un primer miembro de un par de unión específica insertado en la proteína de la cápside de manera que el primer miembro de un par de unión específica reduce y/o anula el tropismo natural de la proteína de la cápside o la cápside que comprende la misma. En algunas realizaciones, el primer miembro de un par de unión específica se inserta en una región de la proteína de la cápside involucrada con el tropismo natural de la proteína de la cápside de referencia de tipo silvestre, p. ej., una región de la proteína de la cápside involucrada con el receptor celular. En algunas realizaciones, el primer miembro de un par de unión específica se inserta (por ejemplo, se presenta) mediante un dominio knob de una proteína de la fibra Ad. En algunas realizaciones, el primer miembro de un par de unión específica se inserta (por ejemplo, se presenta) en el bucle HI de una proteína de la fibra Ad. En algunas realizaciones, el primer miembro de un par de unión específica se inserta después de una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en G453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, N587 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, G453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 y A589 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9. En algunas realizaciones, el primer miembro de un par de unión específica se inserta (por ejemplo, se presenta) entre los aminoácidos N587 y R588 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2. En algunas realizaciones, una cápside viral recombinante, un vector viral que comprende una cápside viral recombinante, y/o composiciones que comprenden una cápside viral recombinante comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 35, 37 o 39. Los sitios de inserción adecuados adicionales identificados mediante el uso de AAV2 son bien conocidos en la técnica (Wu et al. (2000) J. Virol. 74:8635-8647) e incluyen I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 y I-716. Una proteína de la cápside de virus recombinante como se describe en el presente documento puede ser una proteína de la cápside de AAV2 que comprende un primer miembro de un par de unión específica insertado en una posición seleccionada del grupo que consiste en I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716 y una combinación de las mismas. Los sitios de inserción adecuados adicionales identificados mediante el uso de serotipos AAV adicionales son bien conocidos e incluyen I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4) y I-585 (AAV5). En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de virus recombinante como se describe en el presente documento puede ser una proteína de la cápside de AAV2 que comprende un primer miembro de un par de unión específica insertado en una posición seleccionada del grupo que consiste en I-587 (AAV1), I-589 (AAv 1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585 (AAV5) y una combinación de los mismos.
La nomenclatura I-### usada en el presente documento se refiere al sitio de inserción con ### nombrando el número de aminoácido relativo a la proteína VP1 de una proteína de la cápside de AAV, sin embargo, dicha inserción puede ubicarse directamente en el extremo N-terminal o C-terminal, preferentemente en el extremo C-terminal de un aminoácido en la secuencia de 5 aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal del aminoácido dado, preferentemente 3, más preferentemente 2, especialmente 1 aminoácido(s) del extremo N-terminal o C-terminal del aminoácido dado. Asimismo, las posiciones a las que se hace referencia en el presente documento son relativas a la proteína VP1 codificada por un gen de la cápside de AAV, y las posiciones correspondientes (y sus mutaciones) pueden identificarse fácilmente para las proteínas de la cápside VP2 y VP3 codificadas por el gen de la cápside realizando un alineamiento de secuencias de las proteínas VP1, VP2 y VP3 codificadas por el gen de la cápside de AAV de referencia.
Por consiguiente, una inserción en la posición correspondiente del ácido nucleico codificante de uno de estos sitios del gen cap conduce a una inserción en VP1, VP2 y/o VP3, ya que las proteínas de la cápside están codificadas por marcos de lectura superpuestos del mismo gen con codones de inicio escalonados. Por lo tanto, para AAV2, por ejemplo, de acuerdo con esta nomenclatura, las inserciones entre los aminoácidos 1 y 138 solo se insertan en VP1, las inserciones entre 138 y 203 se insertan en VP1 y VP2, y las inserciones entre 203 y el extremo C-terminal se insertan en VP1, VP2 y VP3, lo que, por supuesto, también es el caso del sitio de inserción I-587. Por lo tanto, la presente invención abarca genes estructurales de AAV con inserciones correspondientes en las proteínas VP1, VP2 y/o VP3.
Asimismo, debido a la alta conservación de al menos grandes tramos y la gran cantidad de miembros de la familia estrechamente relacionados, los sitios de inserción correspondientes para AAV distintos del AAV enumerado pueden identificarse realizando una alineación de aminoácidos o por comparación de las estructuras de la cápside. Véase, p. ej., Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309-19 y la patente de EE. Uu . N.° 9.624.274 para ejemplos de alineaciones de diferentes proteínas de la cápside de AAV.
En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce o anula el tropismo natural del vector viral, p. ej., la transducción de una célula naturalmente permisiva a la infección por vectores virales de referencia de tipo silvestre y/o una célula diana es indetectable en ausencia de un enlace covalente con el segundo miembro afín del par de unión, el cual se fusiona con un ligando de direccionamiento apropiado. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral, p. ej., en comparación con la transducción de una célula naturalmente permisiva a la infección por vectores virales de referencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 5 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 5 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 10 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 20 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 30 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 40 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 50 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 60 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 70 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 80 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 90 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 95 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica reduce el tropismo natural del vector viral en al menos un 90 %. En las realizaciones en donde la inserción (presentación) del primer miembro de un par de unión específica no anula por completo el tropismo natural de las cápsides virales recombinantes, el tropismo natural de tales cápsides virales recombinantes puede reducirse aún más mediante una segunda y diferente mutación. Por ejemplo, en una realización, una proteína de la cápside viral recombinante como se describe en el presente documento puede derivar de un serotipo AAV9 y puede comprender un primer miembro de un par de unión específica y puede comprender además una mutación, p. ej., una mutación de W503A.
Esta eliminación del direccionamiento del virus de su célula hospedadora natural es importante, especialmente si se pretende la administración sistémica frente a local o loco-regional de los vectores virales, ya que la captación de los vectores víricos por las células hospedadoras naturales limita la dosis eficaz de los vectores virales. En el caso de AAV2 y AAV6, se ha descrito que HSPG es el principal receptor para la captación viral en una gran cantidad de células, especialmente las células del hígado. Para AAV2, la actividad de unión a HSPG depende de un grupo de 5 aminoácidos básicos, R484, R487, R585, R588 and K532 (Kern et al., (2003) J Virol. 77(20): 11072-81). Por consiguiente, las mutaciones puntuales preferidas son aquellas que reducen la actividad de transducción del vector viral para una célula diana determinada mediada por el receptor natural en al menos un 50 %, preferentemente al menos un 80 %, especialmente al menos un 95 %, en el caso de HSPG como receptor principal para la unión de los vectores virales a las células diana.
En consecuencia, otras mutaciones preferidas para los vectores virales de unión a HSPG son aquellas mutaciones que eliminan o reemplazan un aminoácido básico como R, K o H, preferentemente R o K que está involucrado en la unión de HSPG del virus respectivo, por un aminoácido no básico, tal como A, D, G, Q, S y T, preferentemente A o un aminoácido que está presente en la posición correspondiente de un serotipo de AAV diferente pero altamente conservado que carece de dicho aminoácido básico en esta posición. En consecuencia, las sustituciones de aminoácidos preferidas son R484A, R487A, R487G, K532A, K532D, R585A, R585S, R585Q, R585A o R588T, especialmente R585A y/o R588A para AAV2, y K531A o K531E para AAV6. Una realización especialmente preferida de la invención son tales mutantes de la proteína de la cápside de AAV2 que además contienen las dos mutaciones puntuales R585A y R588A ya que estas dos mutaciones puntuales son suficientes para suprimir en gran medida la actividad de unión de HSPG. Estas mutaciones puntuales permiten una eliminación eficaz del direccionamiento eficaz de las células que expresan HSPG lo que, con fines de selección, aumenta la especificidad del virus mutante respectivo para su nueva célula diana.
Ligandos de direccionamiento
Una partícula viral descrita en el presente documento puede comprender además un segundo miembro del par de unión específica que forma específicamente un enlace isopeptídico covalente con el primer miembro del par de unión específica que se inserta en una proteína de la cápside viral recombinante, en donde el segundo miembro está fusionado con un ligando de direccionamiento. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en la superficie de una célula, p. ej., una proteína de la superficie celular en una célula eucariota (humana), p. ej., una célula diana. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en células hepáticas (humanas). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en células cerebrales (humanas). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos (humanos). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos T (humanos). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos B (humanos). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en células dendríticas (humanas). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en macrófagos (humanos). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos NK (humanos). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en células renales (humanas). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en una célula cancerosa (humana). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en una célula (humana) infectada con un patógeno heterólogo.
Hay un gran número de proteínas de la superficie celular, p. ej., receptores de la superficie celular, adecuadas que pueden ser la diana de un ligando de direccionamiento, y para las cuales ya existe un ligando de direccionamiento, p. ej., anticuerpos o partes de los mismos. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a: los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y clase II; receptores para una variedad de citocinas (p. ej., receptores para IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, etc.), hormonas de crecimiento específicas de tipo celular, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CTNF), factores de crecimiento estimulantes de colonias, factores de crecimiento endotelial, factores de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento de fibroblastos, factor neurotrófico derivado de la glía, factores de crecimiento glial, gro-beta/mip 2, factores de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de tipo insulina, interferones (a-IFN, p-IFN, y IFN, consenso IFN), interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14), factor de crecimiento de queratinocitos, factores inhibidores de leucemia, factor activador quimiotáctico de macrófagos/monocitos, factor de crecimiento nervioso, proteína activadora de neutrófilos 2, factor de crecimiento procedente de plaquetas, factor de células madre, factor de crecimiento transformante, factores de necrosis tumoral, factor de crecimiento endotelial vascular, lipoproteínas, incluyendo receptores transmembrana de tipo 1 adicionales o de otro tipo tales como PRLR, receptores acoplados a la proteína G tal como GCGR, canales iónicos tales como Nav1.7, ASIC1 o ASIC2; moléculas de adhesión celular; moléculas de transporte de metabolitos tales como aminoácidos; los receptores de antígenos de linfocitos B y T (p. ej., receptores de linfocitos B y proteínas asociadas (p. ej., CD19, CD20, etc.) y receptores de linfocitos T y proteínas asociadas (p. ej., CD3, CD4, CD8, etc.); una proteína tetraspanina (p. ej., CD63). Una cápside viral recombinante descrita en el presente documento permite la infección específica de un tipo de célula mediante el empleo de un ligando de direccionamiento que se une a antígenos de diferenciación de la superficie celular como dianas para el complejo de vector viral.
En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en células hepáticas (humanas), es decir, un marcador específico del hígado. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en células cerebrales (humanas), un marcador específico de células cerebrales. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en células hematopoyéticas (humanas), es decir, un marcador específico de células hematopoyéticas. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos T (humanos), es decir, un marcador específico de linfocitos T. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos B (humanos), es decir, un marcador específico de linfocitos B. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en células dendríticas (humanas), es decir, un marcador específico de células dendríticas. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en macrófagos (humanos), es decir, un marcador específico de macrófagos. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en linfocitos NK (humanos), es decir, un marcador específico de linfocitos NK. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en células renales (humanas), es decir, un marcador específico de riñón. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en células pancreáticas (humanas), es decir, un marcador específico del páncreas. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (p. ej., únicamente) en células intestinales (humanas), es decir, un marcador específico del intestino. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en una célula cancerosa (humana), es decir, un antígeno asociado a un tumor. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (p. ej., únicamente) en una célula (humana) infectada con un patógeno heterólogo. Las proteínas que (1) se expresan específicamente en, o para las cuales se enriquece la expresión en, una célula/tejido/órgano, y (2) reconocidas por una proteína de unión a antígeno útil como ligando de direccionamiento como se describe en el presente documento son bien conocidos y también se pueden encontrar en www.proteinatlas.org; véase también Uhlen et al. (2010) Nat. Biotech. 28:1248-50. La Tabla 2 a continuación proporciona ejemplos de marcadores específicos de órganos y no limitantes para los cuales existen proteínas de unión a antígeno, que pueden ser útiles el direccionamiento de ligandos, y las células/tejidos/órganos que expresan tales marcadores.
T l 2: E m l m r r ífi i
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continuación
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En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en una célula hepática (humana), p. ej., un receptor de la asialoglicoproteína, p. ej., hASGR1. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en una célula cerebral (humana). En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en un linfocito T (humano), p. ej., CD3, p. ej., CD3e. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en una célula renal (humana), p. ej., . En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en una célula muscular (humana), p. ej., una integrina. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un receptor expresado en una célula cancerosa (humana), p. ej., un antígeno asociado a tumor, p. ej., E6 y E7. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une al receptor de glucagón humano (hGCGR).
En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor expresado en una célula tumoral. Los ejemplos no limitantes de antígenos específicos asociados a tumores incluyen, p. ej., AFP, ALK, proteínas BAGE, p-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, Cc R5, Cd 19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-BI, CYP1B1, EGFR, EGFRvIlI, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por ejemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLACI, PRLR, PRAMA, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-p, Tm PRs S2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinasa y uroplaquina-3.
En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento se une a los marcadores de CD asociados con la respuesta inmunitaria, p. ej., CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, etc.
Una realización de la presente invención es una estructura multimérica que comprende una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención. Una estructura multimérica comprende al menos 5, preferentemente al menos 10, más preferentemente al menos 30, lo más preferentemente, al menos 60 proteínas de la cápside viral recombinantes que comprenden un primer miembro de un par de unión específica como se describe en el presente documento. Pueden formar cápsides virales regulares (partículas virales vacías) o vectores virales (cápsides que encapsulan un nucleótido de interés). La formación de vectores virales capaces de empaquetar un genoma viral es una característica altamente preferida para el uso de las cápsides virales recombinantes descritas en el presente documento como vectores virales.
Una realización de la presente invención es un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside como se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico es preferentemente un vector que comprende el ácido nucleico. Los ácidos nucleicos, especialmente los vectores son necesarios para expresar recombinantemente las proteínas de la cápside de esta invención.
También se menciona el uso de al menos una proteína de la cápside viral recombinante y/o un ácido nucleico que la codifica, preferentemente al menos una estructura multimérica (p. ej., vector viral) para la fabricación y uso como vector de transferencia génica.
Métodos de uso y elaboración
Una realización adicional de las proteínas de la cápside viral recombinantes descritas en el presente documento es su uso para administrar un nucleótido de interés, p. ej., un gen indicador o un gen terapéutico, a una célula diana. Así, la presente invención proporciona una partícula viral o una composición de la presente invención para su uso en un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana que comprende poner en contacto la célula diana con dicha partícula viral o dicha composición, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana. La presente invención proporciona además un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana in vitro que comprende poner en contacto la célula diana con la partícula viral de la reivindicación 18 o la composición de la reivindicación 19, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana. En general, un nucleótido de interés puede ser un plásmido de transferencia, que generalmente puede comprender secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en 5' y 3' que flanquean el gen o los genes indicadores o el gen o los genes terapéuticos (que pueden estar bajo el control de un promotor viral o no viral, cuando está incluido dentro de un vector AAV. En una realización, un nucleótido de interés es un plásmido de transferencia que comprende de 5' a 3': una ITR de 5', un promotor, un gen (p. ej., un gen indicador y/o terapéutico) y una 3'ITR.
Los ejemplos no limitativos de promotores útiles incluyen, p. ej., promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus formador de focos esplénicos (SFFV), el promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1a) (el promotor EFla de 1,2 kb o el promotor EFla de 0,2 kb), el promotor quimérico EF1a/IF4 y el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK). Un potenciador interno también puede estar presente en la construcción viral para aumentar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, puede usarse el potenciador de CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13). En algunas realizaciones, el potenciador de CMV se puede usar en combinación con el promotor de p-actina de pollo.
Se puede encapsular una variedad de genes indicadores (o fracciones detectables) en una estructura multimérica que comprende las proteínas de la cápside viral recombinantes descritas en el presente documento. Los genes indicadores de ejemplo incluyen, por ejemplo, p-galactosidasa (codificada por el gen lacZ), Proteína fluorescente verde (GFP), Proteína fluorescente verde potenciada (eGFP), MmGFP, proteína azul fluorescente (BFP), proteína fluorescente azul potenciada (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrina, Venus, YPet, proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP), Emerald, CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Zafiro, luciferasa, fosfatasa alcalina o una combinación de las mismas. Los métodos descritos en el presente documento demuestran la construcción de vectores de direccionamiento que emplean el uso de un gen indicador que codifica la proteína fluorescente verde, sin embargo, los expertos al leer esta divulgación comprenderán que los animales no humanos descritos en el presente documento pueden generarse en ausencia de un gen indicador o con cualquier gen indicador conocido en la técnica.
También se puede encapsular una variedad de genes terapéuticos en una estructura multimérica que comprende las proteínas de la cápside viral recombinantes descritas en el presente documento, p. ej., como parte de un vector de transferencia. Los ejemplos no limitantes de un gen terapéutico incluyen aquellos que codifican una toxina (p. ej., un gen suicida), un anticuerpo terapéutico o fragmento del mismo, un sistema CRISPR/Cas o parte(s) del mismo, ARN antisentido, ARNip, ARNhc, etc.
Una realización adicional de la presente invención es un proceso para la preparación de una proteína de la cápside recombinante, comprendiendo el método las etapas de:
a) expresar un ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside recombinante en condiciones adecuadas, y
b) aislar la proteína de la cápside expresada de la etapa a).
En algunas realizaciones, una partícula viral como se describe en el presente documento comprende una cápside en mosaico, p. ej., una cápside que comprende proteínas de la cápside modificadas genéticamente como se describe en el presente documento (en ausencia o presencia de un enlace covalente con un ligando de direccionamiento) en una cierta proporción con las proteínas de la cápside de referencia. Un método para fabricar una partícula viral de mosaico de este tipo comprende
a) expresar un ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside recombinante y un nucleótido que codifica una proteína de la cápside de referencia en una relación (peso/peso) de 1:1 y 10:1 en condiciones adecuadas, y
b) aislar la proteína de la cápside expresada de la etapa a).
En términos generales, se considerará que una cápside en mosaico formada de acuerdo con el método tiene una relación proteína de la cápside modificada:proteína de la cápside de referencia similar a la relación (peso:peso) de los ácidos nucleicos que codifican las mismas utilizados para producir la cápside en mosaico. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento combina, una proteína de la cápside viral recombinante y una proteína de la cápside de referencia (o una combinación de proteínas de la cápside de referencia) en una relación que varía de 1:1 a 1:15. En algunas realizaciones, la relación es 1:2. En algunas realizaciones, la relación es 1:3. En algunas realizaciones, la relación es 1:4. En algunas realizaciones, la relación es 1:5. En algunas realizaciones, la relación es 1:6. En algunas realizaciones, la relación es 1:7. En algunas realizaciones, la relación es 1:8. En algunas realizaciones, la relación es 1:9. En algunas realizaciones, la relación es 1:10. En algunas realizaciones, la relación es 1:11. En algunas realizaciones, la relación es 1:12. En algunas realizaciones, la relación es 1:13. En algunas realizaciones, la relación es 1:14. En algunas realizaciones, la relación es 1:15.
Otras realizaciones de la presente invención son un método para alterar el tropismo de un virus, comprendiendo el método las etapas de: (a) insertar un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga que es un primer miembro de un par de unión proteína:proteína como se describe en el presente documento en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside viral como se describe en el presente documento para formar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención y/o (b) cultivar una célula de empaquetamiento en condiciones suficientes para la producción de vectores virales, en donde la célula de empaquetamiento comprende el ácido nucleico. Una realización adicional de la presente invención es un método para presentar un ligando de direccionamiento en la superficie de una proteína de la cápside, comprendiendo el método las etapas de: (a) expresar un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside viral recombinante de la presente invención (y opcionalmente con un nucleótido que codifica una proteína de la cápside de referencia) en condiciones adecuadas, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de la cápside de la presente invención que comprende un primer miembro de un par de unión específica, (b) aislar la proteína de la cápside expresada de la presente invención que comprende un primer miembro de un par de unión específica de la etapa (a) o la cápside que comprende la misma, y (c) incubar la proteína de la cápside o la cápside de la presente invención con un segundo miembro afín del par de unión específica en condiciones adecuadas para permitir la formación de un enlace isopeptídico entre el primer y el segundo miembro, en donde el segundo miembro afín del par de unión específica se fusiona con un ligando de direccionamiento.
En algunas realizaciones, la célula de empaquetamiento comprende además un plásmido auxiliar y/o un plásmido de transferencia que comprende un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además aislar vectores virales adenoasociados autocomplementarios del sobrenadante del cultivo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además lisar la célula de empaquetamiento y aislar vectores virales adenoasociados monocatenarios del lisado celular. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además (a) eliminar los restos celulares, (b) tratar el sobrenadante que contiene vectores virales con nucleasas, p. ej., ADNasa I y MgCb, (c) concentrar vectores virales, (d) purificar los vectores virales, y (e) cualquier combinación de (a)-(d).
Las células de empaquetamiento útiles para la producción de los vectores virales descritos en el presente documento incluyen, p. ej., células animales permisivas para el virus, o células modificadas para ser permisivas para el virus; o la construcción de la célula de empaquetamiento, por ejemplo, con el uso de un agente de transformación tal como el fosfato de calcio. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares de empaquetamiento útiles para producir vectores virales descritos en el presente documento incluyen, p. ej., células de riñón embrionario humano 293 (HEK-293) (p. ej., American Type Culture Collection [ATCC] N.° CRL-1573), Células HEK-293 que contienen el antígeno T grande de SV40 (HEK-293T o 293T), células HEK293T/17, línea celular de sarcoma humano HT-1080 (CCL-121), línea celular tipo linfoblasto Raji (CCL-86), línea celular epiteloide de glioblastoma-astrocitoma U87-MG (HTB-14), Línea celular de linfoma T HuT78 (TlB-161), células NIH/3T3, Células de ovario de hámster chino (Ch O) (p. ej., ATCC números CRL9618, CCL61, CRL9096), células HeLa (p. ej., ATCC N.° CCL-2), células Vero, células NIH 3T3 (p. ej., ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (p. ej., ATCC N.° CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RATI, células L de ratón (ATCC N.° CCLI.3), células HLHepG2, células CAP, células CAP-T y similares.
células L929, el sistema celular de empaquetamiento viral FLY descrito en Cosset et al (1995) J Virol 69,7430-7436, células NS0 (mieloma murino), células amnióticas humanas (p. ej., CAP, CAP-T), células de levadura (incluyendo, pero sin limitación, S. cerevisiae, Pichia pastoris), células vegetales (incluyendo, pero sin limitación, Tabaco NTl, BY-2), células de insectos (incluidos, pero sin limitación, SF9, S2, SF21, Tni (por ejemplo, High 5)) o células bacterianas (incluyendo, pero sin limitación, E. coli).
Para células y sistemas de empaquetamiento adicionales, técnicas de empaquetamiento y vectores para empaquetar el genoma del ácido nucleico en el vector viral pseudotipado véase, por ejemplo, Polo, et al, Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603. Los métodos de empaquetamiento incluyen el uso de células de empaquetamiento que expresan de forma permanente los componentes virales, o mediante la transfección transitoria de células con plásmidos.
Otras realizaciones incluyen métodos para redirigir un virus y/o administrar un gen indicador o terapéutico a una célula diana, comprendiendo el método un método para transducir células in vitro, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto la célula diana con un vector viral que comprende una cápside descrita en el presente documento, en donde la cápside comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a un receptor expresado en la célula diana. Otras realizaciones también incluyen las partículas de virus y las composiciones de la presente invención para su uso en métodos para redirigir un virus y/o administrar un gen indicador o terapéutico a una célula diana, comprendiendo el método un método para transducir células in vivo, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto la célula diana con un vector viral que comprende una cápside descrita en el presente documento, en donde la cápside comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a un receptor expresado en la célula diana. En otras realizaciones, la célula diana es in vivo en un sujeto humano.
Células diana
Para administrar un nucleótido de interés usando un vector viral recombinante como se ha divulgado en el presente documento existe una gran variedad de células diana. Las células diana generalmente se elegirán basándose en el nucleótido de interés y el efecto deseado.
En algunas realizaciones, se puede administrar un nucleótido de interés para permitir que una célula diana produzca una proteína que compense una deficiencia en un organismo, tal como una deficiencia enzimática, o inmunodeficiencia, tal como la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X. Así, en algunas realizaciones, son diana las células que normalmente producirían la proteína en el animal. En otras realizaciones, son diana las células en el área en la que una proteína sería más beneficiosa.
En otras realizaciones, un nucleótido de interés, tal como un gen que codifica un ARNip, puede inhibir la expresión de un gen particular en una célula diana. El nucleótido de interés puede, por ejemplo, inhibir la expresión de un gen implicado en el ciclo de vida de un patógeno. Por lo tanto, las células susceptibles a la infección por el patógeno o infectadas con el patógeno pueden ser la diana. En otras realizaciones, un nucleótido de interés puede inhibir la expresión de un gen responsable de la producción de una toxina en una célula diana.
En otras realizaciones, un nucleótido de interés puede codificar una proteína tóxica que destruye las células en las que se expresa. En este caso, las células tumorales u otras células no deseadas pueden ser la diana.
Incluso en otras realizaciones, un nucleótido de interés que codifica una proteína terapéutica.
Una vez que se identifica una población particular de células diana en la que se desea la expresión de un nucleótido de interés, se selecciona un receptor diana que se expresa específicamente en esa población de células diana. El receptor diana puede expresarse exclusivamente en esa población de células o en mayor medida en esa población de células que en otras poblaciones de células. Cuanto más específica sea la expresión, más específicamente se puede dirigir la administración a las células diana. Dependiendo del contexto, la cantidad deseada de especificidad del marcador (y por lo tanto de la administración del gen) puede variar. Por ejemplo, para la introducción de un gen tóxico, lo más preferido es una alta especificidad para evitar destruir células no diana. Para la expresión de una proteína para su recogida, o la expresión de un producto secretado donde se desea un impacto global, es posible que se necesite menos especificidad de marcador.
Como se ha analizado anteriormente, el receptor diana puede ser cualquier receptor para el que se pueda identificar o crear un ligando de direccionamiento. Preferentemente, el receptor diana es un péptido o polipéptido, tal como un receptor. Sin embargo, en otras realizaciones, el receptor diana puede ser un hidrato de carbono u otra molécula que pueda ser reconocida por un compañero de unión. Si ya se conoce un compañero de unión, p. ej., ligando, para el receptor diana, este puede usarse como la molécula de afinidad. Sin embargo, si no se conoce una molécula de unión, se pueden generar anticuerpos contra el receptor diana usando procedimientos estándar. A continuación, los anticuerpos se pueden utilizar como ligando de direccionamiento.
Así, las células diana se pueden elegir en función de una variedad de factores, incluidos, por ejemplo, (1) la aplicación particular (p. ej., terapia, expresión de una proteína a recoger y que confiere resistencia a la enfermedad) y (2) expresión de un marcador con la cantidad deseada de especificidad.
Composiciones farmacéuticas, formas farmacéuticas y administración
Una realización adicional proporciona un medicamento que comprende al menos una proteína de la cápside viral recombinante y un ligando de direccionamiento apropiado de acuerdo con esta invención y/o un ácido nucleico de acuerdo con esta invención. Preferentemente dicho medicamento es útil como partícula de transferencia de genes.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las partículas virales de la presente invención y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, en el presente documento se proporcionan formas farmacéuticas que comprenden la partícula viral descrita en el presente documento.
Como se analiza en el presente documento, las partículas virales descritas en el presente documento se pueden utilizar para diversas aplicaciones terapéuticas (in vivo y ex-vivo) y como herramientas de investigación.
Las composiciones farmacéuticas basadas en las partículas virales de la presente invención se pueden formular de cualquier manera convencional utilizando uno o más vehículos y/o excipientes fisiológicamente aceptables. Las partículas virales pueden formularse para su administración mediante, por ejemplo, inyección, inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) o por vía oral, bucal, administración parenteral o rectal, o por administración directamente a un tumor.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para una variedad de modos de administración, incluyendo la administración sistémica, tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. A los efectos de la inyección, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en soluciones líquidas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como la solución de Hank o la solución de Ringer. Además, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma sólida y volver a disolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. También son adecuadas las formas liofilizadas de la composición farmacéutica.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (p. ej., almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (p. ej., lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (p. ej., aceite, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p. ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponantes, aromatizantes, colorantes y agentes edulcorantes, según corresponda.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, p. ej., mediante inyección de bolo o perfusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, p. ej., en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido opcionalmente. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular además como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos y pueden contener otros agentes que incluyen agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Asimismo, las composiciones farmacéuticas también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implante (p. ej., subcutáneo o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (p. ej., como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, una sal moderadamente soluble. Otros sistemas de administración adecuados incluyen microesferas, que ofrecen la posibilidad de administración local no invasiva de fármacos durante un período prolongado de tiempo. Esta tecnología puede incluir microesferas que tienen un tamaño precapilar, que se pueden inyectar a través de un catéter coronario en cualquier parte seleccionada de un órgano sin causar inflamación o isquemia. A continuación, el agente terapéutico administrado se libera lentamente de las microesferas y es absorbido por las células circundantes presentes en el tejido seleccionado.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la materia, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la penetración. La administración transmucosa puede ocurrir usando aerosoles nasales o supositorios. Para la administración tópica, las partículas virales descritas en el presente documento se pueden formular en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la materia. Se puede usar también una solución de lavado localmente para tratar una lesión o inflamación para acelerar la cicatrización.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y ciertos parámetros de almacenamiento (p. ej., refrigeración y congelación) y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Si las formulaciones divulgadas en el presente documento se utilizan como terapia para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, un agente terapéutico puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Un vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos conocidos en la técnica. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los compuestos o construcciones activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración.
T ras la formulación, las soluciones se pueden administrar de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación lenta o micropartículas y microesferas y similares.
Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intratumoral, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este contexto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión.
La persona responsable de la administración, en todo caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar partículas virales descritas en el presente documento diariamente o semanalmente durante un período de tiempo o mensualmente, cada dos años o cada año dependiendo de la necesidad o la exposición a un organismo patógeno o a una afección en el sujeto (por ejemplo, cáncer).
Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa, intratumoral, intradérmica o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposomales; cápsulas de liberación controlada; biodegradables y cualquier otra forma usada en la actualidad.
También se pueden usar soluciones o aerosoles intranasales o inhalables, aerosoles o inhalantes. Las soluciones nasales pueden ser soluciones acuosas diseñadas para administrarse a los pasos nasales en gotas o pulverizaciones. Las soluciones nasales se pueden preparar de forma que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales. Así, las soluciones acuosas nasales suelen ser isotónicas y levemente tamponadas para mantener un pH de 5,5 a 7,5. Además, conservantes antimicrobianos, análogos a los usados en preparaciones oftálmicas y los estabilizadores de fármaco adecuados, si fuese necesario, se pueden incluir en la formulación. Se conocen diversas preparaciones nasales comerciales, y pueden incluir, por ejemplo, antibióticos y antihistamínicos y se utilizan para la profilaxis del asma.
Las formulaciones orales pueden incluir excipientes tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. En ciertas realizaciones definidas, las composiciones farmacéuticas orales incluirán un diluyente inerte o vehículo comestible asimilable, o se pueden encerrar en un cápsula de gelatina dura o blanda, o pueden comprimirse para formar comprimidos, o bien se pueden incorporar directamente a la comida de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los principios activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.
Los comprimidos, trociscos, pastillas, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante, tales como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tales como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, se puede añadir lactosa o sacarina o un agente aromatizante, tal como la menta, aceite de gaulteria, o sabor a cereza. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes otros materiales diversos en forma de recubrimientos o de otra manera para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden estar revestidos con gelatina, con azúcar o con ambos. Un jarabe de elixir puede contener los compuestos activos sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y un saborizante, como sabor a cereza o naranja.
Las realizaciones adicionales divulgadas en el presente documento pueden referirse a kits para usar con métodos y composiciones. Los kits también pueden incluir un recipiente adecuado, por ejemplo, viales, tubos, minitubos o microcentrífugas, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa u otro recipiente. Cuando se proporcione un componente o agente adicional, el kit puede contener uno o más recipientes adicionales en los que se puede colocar este agente o componente. Los kits del presente documento también incluirán normalmente un medio para contener las partículas virales y cualquier otro recipiente de reactivo en un espacio cerrado para la venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico inyectados o moldeados por soplado en los que se conserven los viales deseados. Opcionalmente, uno o más agentes activos adicionales tales como, p. ej., agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes antifúngicos o antibacterianos o agentes antitumorales pueden ser necesarios para las composiciones descritas.
Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden administrarse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir la administración a un sujeto por vía intravenosa, intratumoral, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intratecal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, local, mediante inhalación, mediante inyección, mediante infusión, mediante infusión continua, mediante perfusión localizada, mediante un catéter, mediante un lavado, en una crema, o en una composición lipídica.
Cualquier método conocido por un experto en la materia se puede utilizar para la producción a gran escala de partículas virales, células de empaquetamiento y construcciones de partículas descritas en el presente documento. Por ejemplo, las existencias de semillas maestras y de trabajo se pueden preparar en condiciones de BPF en CEF primarios calificados o por otros métodos. Las células de empaquetamiento se pueden sembrar en matraces de gran superficie, cultivar hasta casi la confluencia y purificar las partículas virales. Las células se pueden recoger y las partículas virales se pueden liberar en los medios de cultivo aislados y purificados, o las partículas virales intracelulares se pueden liberar mediante disrupción mecánica (los desechos celulares se pueden eliminar mediante filtración profunda de poro grande y el ADN de la célula hospedadora se puede digerir con endonucleasa). Las partículas de virus pueden purificarse y concentrarse posteriormente mediante filtración de flujo tangencial, seguido de diafiltración. El granel concentrado resultante puede formularse por dilución con un tampón que contenga estabilizadores, llenado en viales y liofilizado. Las composiciones y formulaciones se pueden almacenar para su uso posterior. Para su uso, las partículas virales liofilizadas pueden reconstituirse mediante la adición de diluyente.
Ciertos agentes adicionales utilizados en las terapias de combinación pueden formularse y administrarse por cualquier medio conocido en la técnica.
Las composiciones como se ha divulgado en el presente documento también pueden incluir adyuvantes tales como sales de aluminio y otros adyuvantes minerales, agentes tensioactivos, derivados bacterianos, vehículos y citocinas. Los adyuvantes también pueden tener propiedades inmunomoduladoras antagonistas. Por ejemplo, los adyuvantes pueden estimular la inmunidad Th1 o Th2. Las composiciones y los métodos como se ha divulgado en el presente documento también pueden incluir terapia adyuvante.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente y no están destinados a limitar el alcance de la invención.
Materiales y métodos
Líneas celulares y anticuerpos
Todas las líneas celulares 293 se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 10 %, Pen/Strep al 1 % y L-glutamina al 1 %. Las líneas celulares 293 hErbB2 y 293hASGR1/2 se generaron mediante transducción lentiviral de la línea celular 293 parental con un vector que expresa el ADNc correspondiente. Todas las líneas celulares se obtuvieron de las instalaciones centrales de Regeneron TC. El anticuerpo B1 reconoce un epítopo lineal compartido por AAV VP1, VP2 y VP3.
Construcciones de proteínas de la cápside de AAV
GeneBlocks que codifican las inserciones de SpyTag deseadas, los aminoácidos del enlazador flanqueante y las mutaciones adicionales se adquirieron en IDT y se clonaron en pAAV2-CAP wt o pAAV9-CAP wt digeridos con BsiWI y XcmI usando Gibson Assembly de acuerdo con el protocolo del fabricante (NEB).
Fusión de SpyCatcher a anticuerpos
GeneBlocks que codifican SpyCatcher se adquirieron en IDT, y se usó Gibson Assembly para clonar la secuencia de codificación en marco en plásmidos de expresión para scFv o cadenas pesadas de anticuerpos en el extremo C terminal de cada construcción, separados por un enlazador de aminoácidos flexible GSGESG (SEQ ID NO:48).
Preparación de vectores virales de AAV
El virus se generó mediante la transfección de células de empaquetamiento 293T utilizando PEI Pro con los siguientes plásmidos: pAd Helper, un plásmido genómico que contiene ITR de AAV2 que codifica una proteína indicadora, y un plásmido pAAV-CAP que codifica los genes Rep y Cap de AAV, con o sin plásmidos adicionales que codifican un scFv o las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo. El scFV y las construcciones de cadena pesada de anticuerpo se fusionan con SpyCatcher en su extremo C-terminal como se ha descrito anteriormente. La transfección se realizó en OptiMEM y el medio se cambió a DMEM complementado con FBS al 10 %, Pen/Strep al 1 % y L-Glut al 1 % después de 8 horas.
Las células de empaquetamiento transfectadas se incubaron durante 3 días a 37 °C, a continuación se recogió el virus de los lisados celulares utilizando un protocolo estándar de congelación-descongelación. En resumen, las células de empaquetamiento se levantaron raspando y sedimentando. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en una solución de Tris-HCl 50 mM; NaCl 150 mM; y MgCb 2 mM [pH 8,0]. Las partículas intracelulares de virus se liberaron induciendo la lisis celular a través de tres ciclos consecutivos de congelación y descongelación, que consiste en una suspensión de células de intercambio entre un baño de hielo seco/etanol y un baño de agua a 37 °C con agitación vigorosa. La viscosidad se redujo tratando el lisado con EMD Millipore Benzonase (50 U/ml de lisado celular) durante 60 min a 37 °C, mezclando ocasionalmente. A continuación, los residuos se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro Millex-GV de PVDF de 0,22 pm, directamente en la cámara superior de una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con cartucho de filtro de membrana Ultracel-100 (100 KDa MWCO). La unidad de filtro se centrifugó a intervalos de 5 a 10 minutos hasta alcanzar el volumen deseado en la cámara superior, a continuación, el virus crudo concentrado se pipeteó en un tubo de baja unión a proteínas y se almacenó a 4 °C. El título (genomas virales por mililitro vg/ml) se determinó mediante qPCR usando una curva patrón de un virus de concentración conocida.
Infección celular/Análisis de transducción y citometría de flujo
Para infectar células, las partículas virales se agregaron directamente al medio de las células en cultivo y la mezcla se incubó durante la noche a 37 °C. El medio de cada pocillo se reemplazó 24 horas más tarde y las células se incubaron durante 5 días. En el día 5 posterior a la infección, las células se tripsinizaron, se resuspendieron en PBS con FBS al 2 % y el porcentaje de células GFP+ se recogió en un citómetro de flujo BD FACSCanto y se analizó con el software FlowJo.
Análisis por transferencia Western
La reacción entre las proteínas VP1, VP2 y VP3 de AAV marcadas con SpyTag y los anticuerpos marcados con SpyCatcher o scFvs se controlaron mediante análisis de transferencia Western. Se añadió Novex® Tampón de muestra de Tris-Glicina SDS con agente reductor a volúmenes iguales de preparaciones de virus sin procesar y las muestras se calentaron a 85 °C durante 5 minutos, a continuación se enfrió a temperatura ambiente y se cargó en un gel Tris-Glicina al 4-12 % prefundidos (Invitrogen). Las proteínas se separaron reduciendo SDS-PAGE y se transfirieron a PVDF mediante una transferencia húmeda. Las membranas se bloquearon con Li-Cor Odyssey TBS Blocking Buffer y se probaron con el anticuerpo monoclonal de ratón B1 (ARP American Research Products, Inc.) diluido 1:100 en TBST durante la noche a 4 °C. Las transferencias se lavaron en TBST, se probaron con un anticuerpo secundario anti­ ratón conjugado con luz infrarroja, y fotografiado en el Li-Cor Odyssey.
Ejemplos
Ejemplo 1 La conjugación de un scFv con un péptido insertado en la cápside de AAV2 en el residuo N587 dirige el direccionamiento específico del antígeno
Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
CON O SIN
pCMV-C6.5-SpyCatcher 4ug
Las células incubadas con partículas virales como se ha descrito anteriormente se evaluaron en cuanto a la presencia de infección mediante análisis de citometría de flujo.
El AAV2 que lleva las mutaciones de unión a heparina (HBM) R585A y R588A, así como el péptido SpyTag en la posición de la cápside N587, fue producido en presencia o ausencia de C6.5-SpyCatcher, un scFv que se une a HER2 y se fusiona con SpyCatcher en su extremo C-terminal. El AAV2 conjugado con el scFv dirigido a HER2 infecta específicamente las células HER2+ y presenta muy poca infección de fondo de las células HER2-. Figura 1.
Ejemplo 2 La conjugación de un anticuerpo con un péptido insertado en la cápside de AAV2 en el residuo N587 dirige el direccionamiento específico del antígeno
Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP wt 4ug
O
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
CON O SIN
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
AAV2 de tipo silvestre y AAV2 portador de las mutaciones de unión a heparina (HBM) R585A y R588A, así como el péptido SpyTag en la posición de la cápside N587, se produjo en presencia o ausencia de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo que codifican SpyCatcher-Herceptin, un anticuerpo que se une a HER2 y se fusiona con SpyCatcher en el extremo C-terminal de la cadena pesada. Las células infectadas con partículas virales como se ha descrito anteriormente se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo para controlar la transducción. AAV2 conjugado con el anticuerpo dirigido a HER2 infecta específicamente las células HER2+ y muestra muy poca infección de fondo de las células HER2-. Figura 2.
Ejemplo 3 La conjugación de un anticuerpo con un péptido insertado en la cápside de AAV2 en el residuo G453 dirige el direccionamiento específico del antígeno
Los residuos N587 y G453 se encuentran en regiones expuestas de la cápside de AAV2 que forman picos de proteínas que se extienden fuera de la superficie del virión. Los residuos se encuentran en dos picos diferentes, por lo que se investigó si una SpyTag insertada después del residuo G453 funcionaría de la misma manera que la SpyTag insertada después del residuo N587. Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP G453 SpyTag HBM 0,5ug
pAAV2-CAP R585A R588A HBM 3,5ug
O
pAAV2-CAP wt 4ug
CON O SIN
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
AAV2 de tipo silvestre y AAV2 portador de las mutaciones de unión a heparina (HBM) R585A y R588A, así como el péptido SpyTag en la posición de la cápside G453, se produjo en presencia o ausencia de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo que codifican SpyCatcher-Herceptin, un anticuerpo que se une a HER2 y se fusiona con SpyCatcher en el extremo C-terminal de la cadena pesada. El virus se produjo como un mosaico mezclando cápsides que expresan SpyTag con cápsides HBM. Las células infectadas con partículas virales como se ha descrito anteriormente se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo para controlar la transducción. AAV2 conjugado con el anticuerpo dirigido a HER2 infecta específicamente las células HER2+ y muestra muy poca infección de fondo de las células HER2-. Figura 3
Ejemplo 4 El aumento de la modificación de viriones AAV por scFvs disminuye su infectividad
En un esfuerzo por optimizar la eficiencia de la reacción de SpyTag-SpyCatcher, se mejoró la accesibilidad de SpyTag en la superficie del virus al flanquear la etiqueta peptídica con aminoácidos enlazadores flexibles en cada lado. Se generó un panel de mutantes de inserción N587 SpyTag flanqueados por longitudes de enlazador crecientes y se preparó el virus usando estas construcciones Rep-Cap de AAV2 en presencia o ausencia de C6.5-SpyCatcher, el scFv que se une a HER2 y se fusiona con SpyCatcher en su extremo C-terminal. La reacción entre las proteínas VP1, VP2 y VP3 de AAV2 etiquetadas con SpyTag y C6.5 etiquetada con SpyCatcher se controló mediante transferencia Western; Las proteínas de la cápside marcadas con SpyTag que han reaccionado con el scFv etiquetado con SpyCatcher muestran un aumento de tamaño por SDS-PAGe . Las células infectadas con partículas virales como se ha descrito anteriormente se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo para medir la transducción.
Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
pAAV2-CAP N587 EnlazadorX SpyTag 4ug
Las construcciones pAAV2-CAP N587 Enlazador SpyTag incluyen:
pAAV2-CAP N587 Enlazador1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBM
Cuando SpyTag no estaba flanqueada por aminoácidos enlazadores, los complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv fueron indetectables mediante transferencia Western y los virus lograron niveles bajos de transducción específica de células HER2. Figura 4. A medida que aumentaba la longitud del enlazador (1-6 aminoácidos), Los complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv comenzaron a ser detectables mediante transferencia Western y la eficiencia de transducción de los virus aumentó. Figura 4. Sin embargo, cuando SpyTag estaba flanqueada por los dos enlazadores más largos (8-10 aminoácidos), casi todas las proteínas VP habían reaccionado con SpyCatcher-Vh por transferencia Western, pero estos virus completamente decorados ya no transducían células de manera eficiente. Figura 4. Por lo tanto, parecía que la modificación excesiva de las partículas de AAV por scFvs es perjudicial para su capacidad de transducir células diana, y solo se requiere una pequeña cantidad de scFvs conjugados para redirigir el virus a las células diana.
Ejemplo 5 La modificación creciente de viriones AAV por anticuerpos disminuye su infectividad
Usando el panel de mutantes de inserción de SpyTag N587 flanqueados por longitudes de enlace crecientes, el virus se preparó utilizando estas construcciones AAV2 Rep-Cap en presencia o ausencia de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo que codifican SpyCatcher-Herceptin, un anticuerpo que se une a HER2 y se fusiona con SpyCatcher en el extremo C-terminal de la cadena pesada. La reacción entre las proteínas VP1, VP2 y VP3 de AAV etiquetadas con SpyTag y la cadena pesada (Vh) de Herceptin (Vh) etiquetada con SpyCatcher se controlaron mediante transferencia Western; Las proteínas de la cápside etiquetadas con SpyTag que han reaccionado con los anticuerpos etiquetados con SpyCatcher presentarán un cambio de tamaño por SDS-PAGe .
Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
pAAV2-CAP N587 EnlazadorX SpyTag 4ug
Las construcciones pAAV2-CAP N587 Enlazador SpyTag incluyen:
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBM
Cuando SpyTag no estaba flanqueada por aminoácidos enlazadores o estaba flanqueada por aminoácidos muy cortos, los complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh no fueron detectados por transferencia Western, pero los virus infectaron específicamente las células HER2+ con una eficiencia cercana a los niveles de tipo silvestre. Figura 5. Por el contrario, cuando SpyTag estaba flanqueada por enlazadores más largos (6 aminoácidos o más), casi todas las proteínas VP habían reaccionado con SpyCatcher-Vh por transferencia Western, pero estos virus totalmente flanqueados ya no eran infecciosos. Figura 5. El aumento de la modificación de las partículas de AAV por parte de los anticuerpos es perjudicial para su capacidad de transducir las células diana, y solo se requiere una pequeña cantidad de anticuerpos conjugados para redireccionar el virus a las células diana.
Ejemplo 6 El mosaicismo modula la eficiencia de transducción de partículas virales
Desde hace mucho, los enlazadores flexibles permiten una reacción eficiente de las cápsides de AAV etiquetadas con SpyTag con scFv fusionados con SpyCatcher, pero la modificación excesiva de las partículas de AAV por scFvs es perjudicial para su capacidad para transducir células diana, el número de SpyTag en cada virión se redujo, mientras que la accesibilidad y la reactividad eficiente de SpyTag se mantuvieron mediante la generación de partículas de AAV en mosaico que son una mezcla de diferentes proporciones de construcciones etiquetadas con SpyTag altamente reactivas con construcciones de cápside no etiquetadas con SpyTag, todas con la mutación de unión a heparina (HBM) R585A R588A. Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pCMV-C6.5-SpyCatcher 4ug
CON VARIAS PROPORCIONES DE:
pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBM Xug
pAAV2-CAP R585A R588A Xug
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
CON VARIAS PROPORCIONES DE:
pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBM Xug
pAAV2-CAP R585A R588A Xug
o
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
CON VARIAS PROPORCIONES DE:
pAAV2-CAP G453 EnlazadorX SpyTag HBM Xug
pAAV2-CAP R585A R588A Xug
La relación entre los plásmidos pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBM y pAAV2-CAP R585A R588A fue de 1:0 (4ug:0ug), lo que representa viriones pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBm puros, 3:1 (3ug:1ug), 1:1 (2ug:2ug) o 1:3 (1ug:3ug) en la mezcla de transfección. La relación entre los plásmidos pAAV2-CAP G453 Enlazador10 SpyTag HBM y pAAV2-CAP R585A R588A fue de 1:0 (4ug:0ug), lo que representa viriones pAAV2-CAP G453 Enlazador10 SpyTag HBM puros, 1:3 (1ug:3ug) o 1:7 (0,5ug:3,5ug) en la mezcla de transfección. La reacción entre las proteínas VP1, VP2 y VP3 de AAV etiquetadas con SpyTag y el scFv anti-HER etiquetado con SpyCatcher o la cadena pesada (Vh) de Herceptin (Vh) etiquetada con SpyCatcher se controlaron mediante transferencia Western; las proteínas de la cápside etiquetadas con SpyTag que han reaccionado con scFv o anticuerpos etiquetados con SpyCatcher presentarán un cambio de tamaño por SDS-PAGE. La reacción del panel del enlazador de N587 SpyTag con SpyCatcher-scFv anti-HER2 se muestra en la Figura 6. La reacción del panel del enlazador N587 SpyTag con SpyCatcher-anticuerpo anti-HER2 se muestra en la Figura 7. Las células infectadas con las partículas virales en mosaico descritas anteriormente se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo para medir la transducción Figura 6-7. A medida que se reducía la cantidad de cápsides SpyTag flanqueadas por Enlazador10 altamente reactivas y aumentaba la cantidad de cápsides no etiquetadas con SpyTag, se observaba una disminución en la cantidad de complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv mediante transferencia Western, junto con un aumento en la eficiencia de la transducción del virus Figuras 6-7. Se demostró una relación inversa entre el número de anticuerpos que complementan el virión y la eficacia de la transducción con el virus redireccionado.
La reacción de G453 SpyTag HBM y G453 Enlazador10 SpyTag HBM con SpyCatcher-anticuerpo anti-HER2 se muestra en la Figura 8. Ambas inserciones de SpyTag en G453, ya sea SpyTag sola o SpyTag flanqueada por Enlazador10, reaccionaron de manera muy eficiente con Herceptin etiquetado con SpyCatcher según se determinó mediante transferencia Western, lo que sugiere que el sitio de inserción G453 es naturalmente más accesible que N587, que no reacciona fácilmente a menos que esté flanqueado por aminoácidos enlazadores. Como se observó con el panel del enlazador N587, cuando los virus estaban fuertemente modificados por SpyCatcher-anticuerpo Herceptin, los virus ya no eran infecciosos. Por lo tanto, parece que los altos niveles de modificación de las partículas de AAV por parte de los anticuerpos son perjudiciales para su capacidad de transducir las células diana y concluyen que una SpyTag insertada después de G453 es naturalmente más accesible que una SpyTag insertada en N587.
Ejemplo 7 El sistema SpyTag-SpyCatcher se puede utilizar con pares de anticuerpo-diana adicionales para lograr un redireccionamiento específico in vitro
Se examinó la capacidad del enfoque SpyTag-SpyCatcher para redireccionar AAV a dianas distintas de HER2. Se clonaron anticuerpos etiquetados con SpyCatcher dirigidos a proteínas adicionales de la superficie celular, y se examinó la capacidad de estos anticuerpos para redireccionar AAV etiquetados con SpyTag a tipos de células que expresan estas dianas adicionales. Para experimentos de direccionamiento a ASGR1 y CD63, cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-hrGFP 4ug
pAAV2-CAP N587 Enlazador10 SpyTag HBM 0,5ug
pAAV2-CAP R585A R588A 3,5ug
CON O SIN
Plásmido de cadena pesada Vh fusionada con SpyCatcher 1,5ug Plásmido de cadena ligera Vk 3ug
Para experimentos de direccionamiento a PTPRN, cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-eGFP 4ug
pAAV2-CAP G453 Enlazador 10 SpyTag HBMx5 0,5ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3,5ug
CON O SIN
Plásmido de cadena pesada Vh fusionada con SpyCatcher 1,5ug Plásmido de cadena ligera Vk 3ug
Para experimentos de direccionamiento a ENTPD3 y CD20, cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-Luciferasa de luciérnaga 4ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
CON O SIN
Plásmido de cadena pesada Vh fusionada con SpyCatcher 1,5ug Plásmido de cadena ligera Vk 3ug
Se probaron plásmidos SpyCatcher-Vh y Vk que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que reconocen las proteínas humanas a SGr 1, CD63, PTPr N, ENTPD3 y CD20. Para generar partículas de AAV en mosaico con un bajo número de SpyTag expuestas, los plásmidos con SpyTag y no etiquetados con SpyTag estaban presentes en una relación de 1:7 en la mezcla de transfección, que previamente se determinó que era la relación ideal de cápsides SpyTag y sin SpyTag para redireccionar AAV usando anticuerpos. Células que expresan ASGR1, CD63 o PTPRN se infectaron con las partículas de AAV2 en mosaico descritas anteriormente y se midió la transducción mediante citometría de flujo. AAV2 conjugado con los anticuerpos específicos de ASGR1, CD63 y PTPRN, fue capaz de infectar específicamente las células diana afines que expresan ASGR1, CD63 y PTPRN, respectivamente, y presentaron una infección de fondo muy baja en ausencia del anticuerpo. Se infectaron células que expresaban ENTPD3 o CD20 con las partículas AAV2 descritas anteriormente y se midió la transducción mediante un ensayo de luciferasa utilizando protocolos estándar. AAV2 conjugado con los anticuerpos específicos de ENTPD3 y CD20, fue capaz de infectar específicamente las células diana afines que expresan ENTPD3 y CD20, respectivamente, y presentaron una infección de fondo muy baja en ausencia del anticuerpo. Figura 9
Ejemplo 8 El sistema SpyTag-SpyCatcher se puede adaptar para redireccionar AAV9
Se examinó la adaptabilidad del sistema SpyTag-SpyCatcher a otros serotipos de AAV. AAV9 es un serotipo ampliamente utilizado que genera virus de alto título y es muy eficiente en la transducción de tejidos de ratón. Los residuos importantes para la unión del receptor difieren entre AAV2 y AAV9, ya que AAV2 se une a proteoglicanos de sulfato de heparina y AAV9 se une a galactosa. Los residuos que se sabe que son importantes en la unión del receptor se determinaron a partir de la bibliografía disponible (Bell, C. L., Gurda, B. L., Van Vliet, K., Agbandje-McKenna, M., & Wilson, J. M. (2012). Identification of the galactose binding domain of the adeno-associated virus serotype 9 capsid. Journal of Virology, 86(13), 7326-7333. http://doi.org/10.1128/JVI.00448-12), e incluye N470, D271, N272, Y446 y W503. La mutación W503A se seleccionó como la mutación de unión al receptor para usar en la generación de construcciones mutantes, ya que esta mutación de un solo aminoácido redujo fuertemente la unión al receptor. También se identificaron regiones de la cápside de AAV9 que son ortólogas a las dos proyecciones (bucles variables) dentro de las cuales se encuentran N587 y G453 de AAV2; los residuos correspondientes en AAV9 son A589 y G453. SpyTag se insertó en estos dos sitios dentro de la cápside de AAV9, con y sin aminoácidos enlazadores flanqueantes, y en combinación con la mutación de unión al receptor W503A.
Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de una placa de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades:
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-eGFP 4ug
pAnti-HER2 hIgG4 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-HER2 Vk 3ug
plásmido pAAV9 RC 4ug de ADN total
Para AAV9 wt, AAV9-CAP, A589SpyT_W503A, AAV9-CAP A589Enlazador10SpyT_W503A, y AAV9-CAP G453Enlazador10SpyT_W503A, Se utilizaron 4 ug de cada plásmido para cada transfección.
Para los virus en mosaico, se usaron 3,5 ug de pAAV9-CAP W503A y 0,5 ug de pAAV9-CAP A589Enlazador10SpyT_W503A o pAAV9-CAP G453Enlazador10SpyT_W503A para cada transfección para lograr una relación de 1:7 entre plásmidos Rep-Cap SpyTag y no etiquetados con SpyTag.
La transducción celular, el análisis de citometría de flujo y el análisis de transferencia Western se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Las inserciones de SpyTag en AAV9 RC A589 y G453 respaldaron una reacción con SpyCatcher-Herceptin y mediaron la transducción específica de células HER2+. Figura 10. Similar a AAV2, una SpyTag insertada en Aa v 9 RC A589 sin enlazadores flanqueantes no era muy accesible y reaccionaba mal con SpyCatcher. Figura 10. Por el contrario, la adición de enlazadores de aminoácidos a ambos lados de SpyTag permitió una reactividad más fuerte con SpyCatcher, y las partículas en mosaico con algunas SpyTag altamente reactivas fueron muy eficientes en la transducción de células diana. Figura 10.
Ejemplo 9: Redireccionamiento de complejos de partícula de AAV etiquetada con SpyTag-SpyCatcher-Vh in vivo
Para determinar si el VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh podría redireccionarse a las células hepáticas que expresan hASGR1 in vivo, se inyectó a ratones modificados genéticamente de modo que sus células hepáticas expresen hASGR1 con la constitución C57BL/6v y los ratones de tipo silvestre de control se inyectaron por vía intravascular con AAV de tipo silvestre solo o partículas virales VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh (como partículas puras o en mosaico, y con o sin un enlazador de aminoácidos) que lleva un gen indicador, p. ej., proteína fluorescente verde o luciferasa de luciérnaga. Los controles incluyen ratones a los que se les inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para determinar si VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh podría variar el direccionamiento al hígado y ser redireccionado a otros órganos, ratones de tipo silvestre fueron inyectados intravascularmente con AAV de tipo silvestre solo o partículas virales VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh (como partículas en mosaico) que llevan un gen indicador, p. ej., proteína fluorescente verde. Para variar el direccionamiento al hígado y ser redireccionado a otros órganos, se eligió la proteína ENTPD3, ya que no se sabe que se exprese en el hígado pero sí en otros órganos, tal como las células de los islotes pancreáticos (Syed et al. 2013, Am J Physiol Endocrinol Metab 305: E1319-E1326, 2013) y lengua, de acuerdo con las bases de datos disponibles públicamente (datos extraídos de GenePaint.org http://www.informat¡cs.iax.org/assav/MGI:5423021 y el proyecto Riken FANTOM5, conjunto de datos de ratones adultos).
Los anticuerpos etiquetados con SpyCatcher dirigidos a CD3 humano, CD63 humano, ASGR1 humano (ninguno de los cuales se expresa en ratones de tipo silvestre) o ENTPD3 humano (que también reconoce la proteína de ratón) fueron clonados y se examinó la capacidad de estos anticuerpos para redireccionar AAV2 etiquetado con SpyTag que lleva eGFP o luciferasa de luciérnaga in vivo. Cada virus se generó como se ha descrito anteriormente mediante la transfección de placas de 15 cm de células de empaquetamiento 293T con los siguientes plásmidos y cantidades: Anti-CD3 humano/anti-ASGR1 humano GFP
pAd Helper 8ug
pAAV-CAGG-eGFP 4ug
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM 4ug
CON O SIN
pAnti-CD3 o Anti-ASGR1 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-CD3 o Anti-ASGR1 Vk 3ug
Anti-CD63 humano/anti-ASGR1 humano Luciferasa
pAd Helper 8ug
pAAV-UbC- Luciferasa de luciérnaga 4ug
pAAV2-CAP G453 Enlazador 10 SpyTag HBMx5 0,5ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3,5ug
CON O SIN
pAnti-CD63 o Anti-ASGR1 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-CD63 o Anti-ASGR1 Vk 3ug
Anti-ENTPD3 humano/anti-ASGR1 humano GFP
pAd Helper 8ug
pAAV-CMV-eGFP 4ug
pAAV2-CAP G453 Enlazador 10 SpyTag HBMx5 0,5ug
pAAV2-CAP N587 Myc 3,5ug
CON O SIN
pAnti-ENTPD3 o Anti-ASGR1 SpyCatcher Vh 1,5ug
pAnti-ENTPD3 o Anti-ASGR1 Vk 3ug
Se probaron plásmidos SpyCatcher-Vh y Vk que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que reconocen las proteínas humanas ASGR1, CD3 o CD63, en ratones modificados genéticamente de manera que sus células hepáticas expresen hASGR1 con la constitución C57BL/6. Se probaron los plásmidos SpyCatcher-Vh y Vk que codifican anticuerpos que reconocen la proteína humana ASGR1 (como un control no dirigido) o la proteína humana y de ratón ENTPD3 en ratones de tipo silvestre. Diez días después de la infección, se sacrificaron los ratones y se examinó la expresión del gen indicador; los hígados, bazos y riñones fueron fijados y teñidos con anticuerpo anti-EGFP de pollo (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) y anticuerpo secundario anti-pollo conjugado con Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). Para probar la luminiscencia de los animales, 14 días después de la infección, los animales vivos fueron anestesiados con isoflurano, inyectados con un sustrato de luciferina y fotografiados 10 minutos más tarde usando el IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer). Las Figuras 11 y 12 muestran que la infección con los complejos AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh se detectó solo en el hígado de ratones que expresan hASGR1 a los que se les inyectó AAV redireccionado a hASGR1 y no se detectó en el hígado de ratones de tipo silvestre, que no expresan hASGR1. No se detectó EGF positivo en otros órganos (datos no mostrados).
La Figura 13 muestra la tinción inmunohistoquímica para la expresión de eGFP en el hígado y el páncreas de ratones de tipo silvestre después de la inyección de AAV conjugados con anticuerpos dirigidos a e Nt p D3 o hASGR1 como control no dirigido, ya que hASGR1 no se expresa en ratones de tipo silvestre. Cuatro semanas después de la infección, los órganos se extrajeron de los animales infectados y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante 48 horas, a continuación se tiñó para eGFP mediante inmunohistoquímica. La Figura 13 muestra que en los complejos AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh se eliminó el direccionamiento al hígado de ratón de tipo silvestre; todos los ratones inyectados con AAV conjugados con anticuerpos dirigidos a ENTPD3 y hASGR1 mostraron una falta similar de expresión de eGFP en el hígado. Un ratón inyectado con AAV conjugados con anticuerpos dirigidos a ENTPD3 tenía células que expresaban eGFP en islotes pancreáticos, donde se cree que se expresa ENTPD3.
La Figura 14 muestra la tinción inmunohistoquímica para la expresión de eGFP en el hígado y la lengua de ratones de tipo silvestre después de la inyección de AAV conjugados con anticuerpos dirigidos a ENTPD3 o hASGR1 como control no dirigido, ya que hASGR1 no se expresa en ratones de tipo silvestre. 14 días después de la infección, los órganos se extrajeron de los animales infectados y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante 48 horas, a continuación se tiñó para eGFP mediante inmunohistoquímica. La Figura 14 muestra que en los complejos AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh se eliminó el direccionamiento al hígado de ratón de tipo silvestre; todos los ratones inyectados con AAV conjugados con anticuerpos dirigidos a ENTPD3 y hASGR1 mostraron una falta similar de expresión de eGFP en el hígado. Los tres ratones inyectados con AAV conjugados con un anticuerpo irrelevante no dirigido (anti-ASGR1) no mostraron tinción en la lengua, mientras que los tres ratones inyectados con AAV conjugados con anti-ENTPD3 mostraron células que expresan eGFP en la lengua, donde se cree que se expresa ENTPD3.
Ejemplo 10: Administración de un gen suicida a células que expresan un ligando específico
También se describe la capacidad de los complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh para administrar específicamente carga terapéutica, tal como uno o más genes suicidas, un agente terapéutico biológico (p. ej., un anticuerpo), un sistema de edición de genes CRISPR/Cas, ARNhc, etc., a un tipo de célula diana.
Para probar la capacidad de los complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh para administrar un gen suicida a una célula específica, se usó un modelo de ratón desnudo de xenoinjerto de cáncer de mama HER2+ descrito por Wang et al. ((2010) Cancer Gene Therapy 17:559-570).
Los complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh que llevan un gen suicida (SG) se generan de manera similar a los descritos en Materiales y Métodos.
Líneas celulares: BT474 cáncer de mama, Las líneas celulares de cáncer de mama SK-BR-3 y de cáncer de pulmón Calu-3 son líneas celulares tumorales humanas HER2 positivas (Bunn P.A. et al., (2001) Clin Cancer Res. 7:3239-3250; Pegram M, et al. (1999) Oncogene 18:2241-2251; Spiridon CI, et al., (2002) Clin Cancer Res. 8:1720-1730). El rabdomiosarcoma A-673 y el cáncer de cuello uterino HeLa son líneas celulares tumorales humanas HER2 negativas y BEAS-2b es una línea celular epitelial bronquial HER2 negativa inmortalizada (Jia LT et al. (2003) Cancer Res.
63:3257-3262; Kern JA, et al., (1993) Am J Respir Cell Mol Biol 9:448-454; Martinez-Ramirez A, et al., (2003) Cancer Genet Cytogenet. 2003;141:138-142). Todas estas líneas celulares se obtienen de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y son mantenidas en el medio recomendado por la ATCC.
Ratones: Se obtienen ratones desnudos femeninos, de 6 a 8 semanas de edad y se alojan en condiciones específicas libres de patógenos. El día 0, los ratones se inyectan simultáneamente (1) por vía subcutánea en el flanco derecho con 107 células tumorales BT474, SK-BR-3, Calu-3, A-673 o HeLa y (2) complejos VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh tratados por vía intravenosa que llevan un gen indicador (p. ej., EGFP) o suicida. Como controles sirvieron los animales no tratados (animales inyectados con células tumorales solamente), animales inyectados con partículas de AAV de tipo silvestre que llevan un gen indicador o suicida, animales inyectados solo con partículas de virus SpyTag, etc. Todos los animales se tratan con un profármaco apropiado 1 día después de la inyección y el tratamiento. El tamaño de cada tumor se mide con calibradores 2 veces por semana y el volumen del tumor se calcula como largo x ancho2 x 0,52. En caso de morbilidad, ulceración tumoral, un diámetro del tumor de 15 mm, o volumen del tumor de 1000 mm3, los ratones se sacrifican y la fecha del sacrificio se registra como la fecha de la muerte. Los hígados, bazos, riñones y tumores de animales inyectados con partículas de virus que llevan un gen indicador se fijan y se visualiza la expresión del gen indicador.
Aunque se ha descrito la administración dirigida de genes que inducen al suicidio (Zarogoulidis P., et al. (2013) J. Genet. Sindr. Gene Ther. 4:16849), este ejemplo describe la administración de un gen suicida a una célula que expresa el ligando de HER2 diana usando las partículas virales descritas en el presente documento. En experimentos adicionales, un gen suicida se administra a otro tipo de célula que expresa uno o más de otros ligandos diana utilizando una partícula viral descrita en el presente documento Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de receptores adecuados para el direccionamiento incluyen aquellos receptores que median la endocitosis de la partícula viral, p. ej., el antígeno carcinoembrionario (CEA) (Qiu Y, et al. (2012) Cancer Lett. 316:31-38) y el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) (Leng A, et al. (2013) Tumor Biol. 32:1103-1111; Liu T, et al. (2011) ExpMolPathol. 91:745-752). Los receptores adicionales diana incluyen: receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Heimberger AB, et al. (2009) Expert Opin Biol Ther. 9:1087-1098), grupo de diferenciación 44s (CD44s) (Heider KH, et al. (2004) Cancer Immunol Immunother. 53:567-579), grupo de diferenciación 133 (CD133 también conocido como AC133) (Zhang SS, et al. (2012) BMC Med.;10:85), receptor de folato (FR) (Duarte S, et al., (2011) J Control Release 149(3):264-72), receptor de transferrina (TfR) o grupo de diferenciación 71 (CD71) (Habashy HO, et al., Breast Cancer Res Treat.
119(2):283-93), mucinas (Torres MP, et al., (2012) Curr Pharm Des. 2012; 18(17):2472-81), antígeno embrionario específico de estadio 4 (Ss EA-4) (Malecki M., et al., (2012) J Stem Cell Res Ther. 2(5)), antígeno de resistencia tumoral 1-60 (TRA-1-60) (Malecki M., et al., (2013) J Stem Cell Res Ther. 3:134).
Los ejemplos anteriores ilustran aspectos de la invención pero no limitan su alcance, que se define por las reivindicaciones.
Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales preferidos. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de la cápside viral recombinante que se modifica genéticamente para presentar una secuencia de aminoácidos heteróloga que comprende un primer miembro de un par de unión proteína:proteína insertado en la proteína de la cápside viral,
en donde la proteína de la cápside viral se deriva de un gen cap de un virus adenoasociado (AAV) que codifica una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV;
en donde:
(a) el primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y es capaz de formar un enlace isopeptídico con un segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína; o
(b) el primer miembro del par de unión proteína:proteína es una etiqueta peptídica y la proteína de la cápside viral comprende además el segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína, en donde el primer miembro y el segundo miembro afín están unidos por un enlace isopeptídico.
2. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 1, en donde la proteína de la cápside viral comprende además el segundo miembro afín del par de unión proteína:proteína, en donde el primer miembro y el segundo miembro afín están unidos por un enlace isopeptídico.
3. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína de la cápside viral se deriva de un gen cap de AAV quimérico.
4. La proteína de la cápside viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de la cápside viral comprende además una mutación además del primer miembro del par de unión proteína:proteína.
5. La proteína de la cápside viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) el primer miembro reduce o anula el tropismo natural de la proteína de la cápside; y/o
(b) la proteína de la cápside viral comprende además una mutación además del primer miembro del par de unión proteína:proteína, que reduce o anula el tropismo natural de la proteína de la cápside.
6. La proteína de la cápside viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) el primer miembro está flanqueado por un primer y/o segundo enlazador que une(n) el primer miembro a la proteína de la cápside viral, y en donde el primer y/o segundo enlazador tiene cada uno independientemente al menos un aminoácido de longitud;
(b) la proteína de la cápside viral comprende además una mutación en una posición de aminoácido involucrada con la unión de la proteína de la cápside viral a su receptor natural, en donde la mutación comprende una inserción de un péptido heterólogo en la proteína de la cápside, sustitución de uno o más aminoácidos de la proteína de la cápside con un péptido heterólogo, deleción de uno o más aminoácidos de la proteína de la cápside, o una combinación de los mismos;
(c) el AAV se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9; (d) el par de unión proteína:proteína es:
(i) SpyTag: SpyCatcher,
(ii) SpyTag:KTag,
(iii) Isopeptag:pilina-C,
(iv) SnoopTag: SnoopCatcher,
(v) SpyTag002:SpyCatcher002; o
(e) cualquier combinación de (a)-(d).
7. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 5 o 6, en donde el tropismo de la proteína de la cápside viral es:
(a) restaurado;
(b) redireccionado; o
(c) restaurado y redireccionado,
tras la formación del enlace isopeptídico con el segundo miembro afín, cuyo segundo miembro afín se fusiona con un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una célula diana.
8. La proteína de la cápside viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde:
(a) el primer miembro es SpyTag y el segundo miembro afín es SpyCatcher o KTag;
(b) el primer miembro es KTag y el segundo miembro afín es SpyTag;
(c) el primer miembro es SnoopTag y el segundo miembro afín es SnoopCatcher;
(d) el primer miembro es isopeptag y el segundo miembro afín es Pilina-C; o
(e) el primer miembro es SpyTag002 y el segundo miembro afín es SpyCatcher002.
9. La proteína de la cápside viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde el segundo miembro afín está unido a un ligando de direccionamiento.
10. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 9, en donde:
(a) el ligando de direccionamiento es un resto de unión;
(b) el ligando de direccionamiento es un anticuerpo, o una parte del mismo;
(c) el ligando de direccionamiento comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:46; (d) el ligando de direccionamiento se une específicamente a una molécula de la superficie celular; o
(e) cualquier combinación de (a)-(d).
11. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 10, en donde el resto de unión es un anticuerpo, o una parte del mismo, en donde:
(a) el anticuerpo, o parte del mismo, está fusionado con SpyCatcher;
(b) el anticuerpo, o parte del mismo, está fusionado con SpyCatcher, en donde el anticuerpo, o parte del mismo, está fusionado con un enlazador en el extremo C-terminal y el enlazador está fusionado con SpyCatcher en el extremo C-terminal del enlazador; o
(c) el anticuerpo, o parte del mismo, está fusionado con SpyCatcher, en donde el anticuerpo, o parte del mismo, está fusionado con un enlazador en el extremo C-terminal, y el enlazador está fusionado con SpyCatcher en el extremo C-terminal del enlazador, en donde el enlazador comprende una secuencia establecida como SEQ ID NO:48 (GSGESG).
12. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 10, en donde el ligando de direccionamiento se une específicamente a una molécula de la superficie celular que es:
(i) asialoglicoproteína 1 (ASGR1),
(ii) ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 3 humana (ENTPD3),
(iii) PTPRN,
(iv) CD20,
(v) CD63,
(vi) Her2; o
(vii) receptor de transferrina 2.
13. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 10, en donde:
(a) el ligando de direccionamiento se une específicamente a una molécula expresada en una célula neuronal; o (b) el ligando de direccionamiento se une específicamente al receptor de transferrina expresado en una célula neuronal.
14. La proteína de la cápside viral recombinante de la reivindicación 10, en donde el ligando de direccionamiento se une específicamente a una molécula expresada en una célula muscular.
15. Una cápside viral recombinante que comprende la proteína de la cápside viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
16. La cápside viral recombinante de la reivindicación 15, en donde la proteína de la cápside viral comprende además una proteína de la cápside viral de referencia que carece de cualquier miembro del par de unión específica.
17. La cápside viral recombinante de la reivindicación 16, que comprende la proteína de la cápside viral y la proteína de la cápside viral de referencia en una relación entre 1:1 y 1:15.
18. Una partícula viral recombinante que comprende un nucleótido de interés encapsulado por la proteína de la cápside viral de una cualquiera de las reivindicaciones 15-17.
19. Una composición que comprende: (a) la proteína de la cápside viral de una cualquiera de las reivindicaciones 15­ 17 o la partícula viral de la reivindicación 18; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20. La partícula viral de la reivindicación 18 o la composición de la reivindicación 19 para su uso en un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana que comprende poner en contacto la célula diana con dicha partícula viral o dicha composición, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana.
21. La partícula viral o composición para su uso en el método de la reivindicación 20, en donde:
(a) la célula diana es in vivo en un sujeto;
(b) la célula diana es in vivo en un sujeto humano; y/o
(c) la célula diana es una célula diana humana.
22. La partícula viral o composición para su uso en el método de la reivindicación 21, en donde:
(i) la célula diana es una célula hepática humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une al receptor de asialoglicoproteína humana (ASGR1);
(ii) la célula diana es una célula neuronal humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a GABA; (iii) la célula diana es un linfocito T humano, y en donde el ligando de direccionamiento se une a CD3;
(iv) la célula diana es un linfocito T humano, y en donde el ligando de direccionamiento se une a CD3e;
(v) la célula diana es una célula hematopoyética humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a CD34;
(vi) la célula diana es una célula renal humana;
(vii) la célula diana es una célula cancerosa humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor; o
(viii) la célula diana es una célula cancerosa humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor, en donde el antígeno tumoral es E6, E7 o Her2.
23. La partícula viral o composición para su uso en el método de la reivindicación 21, en donde:
(i) el ligando de direccionamiento se une a PTPRN (proteína tirosina fosfatasa de tipo receptor N);
(ii) el ligando de direccionamiento se une a CD20;
(iii) el ligando de direccionamiento se une al receptor de glucagón humano; o
(iv) el ligando de direccionamiento se une específicamente a CD63 o ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 3 humana (hENTPD3).
24. Un método para administrar un nucleótido de interés a una célula diana in vitro que comprende poner en contacto la célula diana con la partícula viral de la reivindicación 18 o la composición de la reivindicación 19, en donde la proteína de la cápside viral comprende un ligando de direccionamiento que se une específicamente a una proteína expresada en la superficie de la célula diana.
25. El método de la reivindicación 24, en donde:
(i) la célula diana es una célula hepática humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une al receptor de asialoglicoproteína humana (ASGR1);
(ii) la célula diana es una célula neuronal humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a GABA; (iii) la célula diana es un linfocito T humano, y en donde el ligando de direccionamiento se une a CD3;
(iv) la célula diana es un linfocito T humano, y en donde el ligando de direccionamiento se une a CD3e;
(v) la célula diana es una célula hematopoyética humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a CD34;
(vi) la célula diana es una célula renal humana;
(vii) la célula diana es una célula cancerosa humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor; o
(viii) la célula diana es una célula cancerosa humana, y en donde el ligando de direccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor, en donde el antígeno tumoral es E6, E7 o Her2.
26. El método de la reivindicación 24, en donde:
(i) el ligando de direccionamiento se une a PTPRN;
(ii) el ligando de direccionamiento se une a CD20;
(iii) el ligando de direccionamiento se une al receptor de glucagón humano; o
(iv) el ligando de direccionamiento se une específicamente a CD63hENTPD3; o
(v) el ligando de direccionamiento se une específicamente al receptor de transferrina 2.
27. Un vector recombinante que codifica la proteína de la cápside viral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
28. Un gen cap de AAV que codifica la proteína de la cápside viral recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
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