JP2024071769A - ヒト細胞への遺伝物質の標的化導入のための指向性改変組換えウイルス粒子およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】様々な標的細胞に対する対象となる核酸の標的化導入に適応可能な状態を維持しながら、改変ウイルス構造の完全性を維持するウイルスベクターシステムを提供する。【解決手段】特異的結合対の第1のメンバーおよび第2の同族メンバーを利用することによって、以前の再標的化戦略に固有の問題を解決するウイルス再標的化戦略であって、第1のメンバーおよび第2の同族メンバーが、特異的に化学的結合、好ましくは共有結合を形成するよう相互作用する、ウイルス標的化戦略を本明細書に記載する。第1のメンバーは、キャプシドタンパク質上に提示されるとき、第2の同族メンバーに融合された任意の標的リガンドの足場として機能するが、第1のメンバーおよび第2の同族メンバーの結合時に、イソペプチド結合形態、および組換えウイルス粒子が、一成分標的化ベクターとして機能する。【選択図】なし
Description
配列表の参照
EFSウェブ経由でテキストファイルとして提出
ファイル10359WO01_ST25.txtに記述されている配列表は、183キロバイトであり、2018年6月27日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
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本明細書の開示は、概して、遺伝物質の細胞への標的化導入に有用な指向性改変組換えウイルス粒子およびそれらを含む組成物に関する。
特定の標的細胞への遺伝子の送達は、様々な慢性疾患および遺伝的疾患の潜在的治療のための現代医学における最も重要な技術のうちの1つとなっている。現在のところ、理想的な遺伝子送達媒体がないために、遺伝子療法の臨床適用における進歩が制限されている。治療的な成功を達成するために、遺伝子送達媒体は、非標的細胞の形質導入を回避しながら、標的細胞を形質導入することができる必要がある。具体的には、ウイルスの天然指向性が所望の治療標的組織または細胞タイプに合わない場合、天然指向性が削除または軽減され、所望の指向性が首尾よく操作されている組換えウイルス粒子に対する必要性がある。(Buchholzら)
近年では、ベクター開発の大部分の進展は、アデノ随伴ウイルス(AAV)およびアデノウイルス(Ad)などの非エンベロープウイルス(例えば、エンベロープ(例えば、脂質二重層)を有しないウイルスキャプシドタンパク質によって形成されるキャプシドを含むウイルス)、ならびにレトロウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルスなどのエンベロープウイルス(例えば、キャプシドが脂質二重層によって囲まれているウイルス)を使用して達成されている。AAVは、控えめな免疫原性のみであり、毒性の所見なしに広範囲の種および組織を生体内に形質導入することができるため、AAV系ベクターは多くの研究の焦点となっている。
AAVは、小さな非エンベロープ性の一本鎖DNAウイルスである。AAVゲノムは、4.7kbであり、それぞれ、2つの逆位末端配列(ITR)、およびRepタンパク質およびCapタンパク質をコードする2つのオープンリーディングフレームによって特徴付けられる。2つのITRは、AAV複製およびキャプシド形成に必要不可欠な唯一のシスエレメントである。Repリーディングフレームは、分子量78kD、68kD、52kD、および40kDの4つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、主に、AAVゲノムの転写および複製を調節する機能を果たす。Capリーディングフレームは、83~85kD(VP1)、72~73kD(VP2)、および61~62kD(VP3)の分子量を有する3つの構造(キャプシド)ウイルスタンパク質(VP)をコードする。AAVビリオンにおける総タンパク質のうちの80%以上は、VP3を含み、成熟ビリオンVP1、VP2、およびVP3において、およそ1:1:10の相対的存在量で見出されている。生体内で、3つのタンパク質は、ビリオン様構造、例えば、ウイルスのキャプシドへと自然発生的に集合する。したがって、感染細胞におけるウイルスキャプシド形成がウイルスDNA合成とは無関係に進行するように見える(Kotin et al.(1994)Hum.Gene Ther.5:793によって検証されている)。
すべての既知のAAVセロタイプの中でも特に、AAV2は、その感染クローンが最初に作製されたため、おそらく最も良好に特徴付けられたセロタイプである。(Samulski et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:2077-2081)。続いて、いくつかのAAVセロタイプの完全な配列も決定されている(例えば、Rutledge et al.(1998)J.Virol.,72:309-319;Gao et al.(2005)Curr.Gen.Ther.5(3)285-97;Chiorini et al.(1997)J.Virol.,71:6823-6833;S.Muramatsu et al.,(1996)Virol.,221:208-217を参照されたい)。一般に、すべてのAAVは、80%を超えるヌクレオチド配列の同一性を共有している。
AAVは、他のウイルスベクターとは異なり、AAVが任意の既知のヒト疾患と関連していることが示されておらず、一般に病原性とはみなされていないため、ヒト遺伝子療法のための有望なベクターである。(Muzyczka,et al.(1992)Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129)。さらに、AAVは、有糸分裂後の組織を比較的低い免疫原性で安全に形質導入するものであり、ウイルスは時として宿主染色体に統合される場合があるが、ヒト染色体19のセーフハーバー遺伝子座に、Repタンパク質がトランスに供給された場合にのみ、非常に頻繁に統合される。AAVゲノムは、感染細胞中で迅速に環状化および鎖状体化し、感染細胞内に安定したエピソーム状態で存在し、ペイロードの長期の安定した発現を提供する。
ウイルス/リガンド:細胞/受容体相互作用を介した感染細胞であるAAVを含むいくつかのウイルスは、最終的に、感染細胞によるウイルスのエンドサイトーシスをもたらす。このリガンド:受容体相互作用は、ウイルスベクターの研究の大部分の焦点となっており、例えば、標的細胞によって発現された受容体を介した、野生型ウイルスによる非天然型標的細胞への感染に対して天然に許容状態である細胞からのウイルスの天然指向性を再配向させるために操作することができる。
理論上、任意の細胞表面タンパク質またはマーカーに向かうベクターの再標的化は、大部分の細胞表面受容体が、恒常的である(例えば、再生使用のため)か、またはリガンドに誘導される(例えば、受容体に媒介される)かのいずれかでエンドサイトーシスの経路に関与するため、感染をもたらすはずである。これら受容体は、クラスリン被覆ピット中で塊状になり、クラスリン被覆小胞を介して細胞を進入し、受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、その後、細胞表面に再生使用して、細胞内で分類されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。このように、ウイルスベクターを再標的化するためのプラットフォームは、多くの場合、ウイルスベクターの天然指向性を削除し、標的細胞単独でまたは主に標的細胞によって発現される受容体またはマーカーにウイルスベクターを再配向することを目的としている。ウイルスベクターを使用した標的化遺伝子療法の進歩のうちの多くは、ウイルスベクターの非組換え(非遺伝子)または組換え(遺伝子)改変として要約することができ、これらの結果として、ウイルスベクターの天然指向性のシュードタイピング、拡張、および/または再標的化がもたらされる。(Reviewed in Nicklin and Baker(2002)Curr.Gene Ther.2:273-93;Verheiji and Rottier(2012)Advances Virol 2012:1-15)。
最も一般的な手法は、ウイルスキャプシドタンパク質の組換え遺伝子改変であり、そのため、ウイルスキャプシドの表面である。一方、間接的な組換え手法では、ウイルスキャプシドは、異種「足場」で改変され、その後、アダプターに連結される。アダプターは、足場および標的細胞の両方に結合する。直接的な組換え標的化手法において、標的化リガンドは、ウイルスキャプシドに直接挿入されるか、またはウイルスキャプシドに連結され、すなわち、タンパク質ウイルスキャプシドが改変されて異種リガンドを発現する。次に、リガンドは、標的細胞上で優先的にまたは標的細胞上でのみ発現される受容体またはマーカーを再配向、例えば結合する。
手法のそれぞれに、利点および欠点がある。ウイルスを遺伝子改変する能力は、キャプシドの構造を維持すること、および標的化リガンドまたは足場に耐用性があるかまたはこれを適切に提示するキャプシドタンパク質内の位置に標的化リガンドまたは足場を配置することを必要とする。例えば、ウイルスタンパク質に導入される標的化リガンドまたは足場は、改変されたキャプシドの構造を妨げることなく、直接リガンドまたは足場が標的リガンドまたは足場として使用可能な天然分子のスペクトルを正確に制限することができない可能性があるように、サイズ制限を満たす必要がある。さらに、ウイルスキャプシドに直接挿入される標的化リガンドの使用は、モジュール式でなく、すべての標的に対して再操作される必要がある。足場プラットフォームは、使用されるアダプターの柔軟性およびモジュール式の性質において有利であるが、ウイルス粒子およびアダプター上の足場は、イオン状に相互作用し、2つの別個の実体のままであり、それらの相互作用の固有の不安定性により、それらの実用性を生体内で制限し得る。こうした2つの構成要素システムでは、最適な形質導入効率が困難になる可能性がある。
明らかに、様々な標的細胞に対する対象となる核酸の標的化導入に適応可能な状態を維持しながら、改変ウイルス構造の完全性を維持するウイルスベクターシステムに対する必要性が依然としてある。
明らかに、様々な標的細胞に対する対象となる核酸の標的化導入に適応可能な状態を維持しながら、改変ウイルス構造の完全性を維持するウイルスベクターシステムに対する必要性が依然としてある。
Kotin et al.(1994)Hum.Gene Ther.5:793
Samulski et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:2077-2081
Rutledge et al.(1998)J.Virol.,72:309-319
Gao et al.(2005)Curr.Gen.Ther.5(3)285-97
Chiorini et al.(1997)J.Virol.,71:6823-6833
S.Muramatsu et al.,(1996)Virol.,221:208-217
Muzyczka,et al.(1992)Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129
Nicklin and Baker(2002)Curr.Gene Ther.2:273-93
Verheiji and Rottier(2012)Advances Virol 2012:1-15
特異的結合対の第1のメンバーおよび第2の同族メンバーを利用することによって、以前の再標的化戦略に固有の問題を解決するウイルス再標的化戦略であって、第1のメンバーおよび第2の同族メンバーが、特異的に化学的結合、好ましくは共有結合を形成するよう相互作用する、ウイルス標的化戦略を本明細書に記載する。第1のメンバーは、キャプシドタンパク質上に提示されるとき、第2の同族メンバーに融合された任意の標的リガンドの足場として機能するが、第1のメンバーおよび第2の同族メンバーの結合時に、イソペプチド結合形態、および組換えウイルス粒子が、一成分標的化ベクターとして機能する。
特異的結合対、例えば、ペプチドタグの第1のメンバーを含む異種アミノ酸配列を提示するように遺伝子改変された組換えウイルス粒子(例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質、組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシド、および/または対象ヌクレオチドを封入する組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクター)であって、アミノ酸配列が50未満のアミノ酸長であり、かつ組換えウイルスキャプシド/粒子タンパク質が天然指向性を減少させるか、または無効にする、組換えウイルス粒子を本明細書に提供する。組換えウイルスキャプシドタンパク質/キャプシド/ベクターの指向性は、特異的結合対の第2の同族メンバーとのイソペプチド結合の形成に際して復元および/または再配向され得、この第2のメンバーは、標的細胞に特異的に結合する標的化リガンドと融合される。このような結合により、標的化リガンドを提示する組換えウイルスキャプシドタンパク質/キャプシド/ベクターが生じる。標的化リガンドがリンカーを介して組換えウイルスキャプシド/ベクターによって、かつ/またはウイルスキャプシドの表面上に限定された量で提示されるとき、驚くべきことに、形質導入効率および特異性が増強される。こうしたウイルス粒子、これらを含む組成物、およびこれらを作製および使用する方法を本明細書に提供する。
したがって、キャプシドタンパク質に操作可能に連結(例えば、共有結合)されたペプチドタグを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、ウイルスキャプシドタンパク質が、真核細胞に感染するウイルスのキャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグが、特異的結合対の第2の同族メンバーとのイソペプチド結合を形成する特異的結合対の第1のメンバーである、組換えウイルスキャプシドタンパク質を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質(真核細胞に感染するウイルスのキャプシド遺伝子に由来し得る、例えば、真核細胞に感染するウイルスの遺伝子改変キャプシドタンパク質である)は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された特異的結合対(すなわち、ペプチドタグ)の第1のメンバーを含み、かつ特異的結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、特異的結合対の第1および第2のメンバーは、共有(イソペプチド)結合によって結合されており、例えば、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された第1のメンバーを含み、かつ第1のメンバーに共有結合された特異的結合対の第2の同族メンバーをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質(真核細胞に感染するウイルスのキャプシド遺伝子に由来し得る、例えば、真核細胞に感染するウイルスの遺伝子改変キャプシドタンパク質である)は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された特異的結合対(すなわち、ペプチドタグ)の第1のメンバーを含み、かつ標的化リガンドに融合された特異的結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、特異的結合対の第1および第2のメンバーは、共有(イソペプチド)結合によって結合されており、例えば、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に操作可能に連結された特異的結合対の第1のメンバーを含み、かつ第1のメンバーに共有結合された特異的結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、特異的結合対の第2の同族メンバーは、標的細胞上で細胞表面マーカー(例えば、細胞表面オリゴ糖、細胞表面受容体、および/または細胞表面マーカーなど)に特異的に結合する標的化リガンドに操作可能に連結される。また、組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシド、および本明細書に記載のウイルスキャプシドによって封入された対象ヌクレオチドを含むウイルスベクターを本明細書に記載する。また、本明細書に記載の組換えウイルス粒子(例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質、組換えウイルスキャプシド、および/または組換えウイルスベクター)を含む組成物、対象ヌクレオチドの標的化送達のためにそれらを使用する方法、およびそれらを作製する方法を記載する。
いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(特異的結合対の第1のメンバー)は、第1または第2のリンカー、例えば、少なくとも1アミノ酸長であるアミノ酸スペーサーを介して、キャプシドタンパク質に操作可能に連結される(フレームに翻訳される、化学的に付着される、かつ/またはこれによって提示される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、第1および/または第2のリンカー、例えば、第1および/または第2のアミノ酸スペーサーと隣接し、それらのスペーサーのそれぞれが、少なくとも1アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは同一でない。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長または2アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、または3アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、または4アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、または5アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、または5アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、または6アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、または7アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、または8アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、または9アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、または9アミノ酸長、または10アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、それぞれ独立して1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、または9アミノ酸長、または10アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、配列および/または長さが同一であり、それぞれ長さが1アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ1アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ2アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ3アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ4アミノ酸長であり、例えば、リンカーは、GLSG(配列番号40)である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ5アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ6アミノ酸長であり、例えば、第1および第2のリンカーは、それぞれGLSGSGの配列(配列番号41)を含む。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ7アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ8アミノ酸長であり、例えば、第1および第2のリンカーは、それぞれGLSGLSGSの配列(配列番号42)を含む。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ9アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ10アミノ酸長であり、例えば、第1および第2のリンカーはそれぞれ、GLSGLSGLSG(配列番号43)またはGLSGGSGLSG(配列番号44)の配列を含む。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、長さが同一であり、それぞれ10アミノ酸長よりも長い。
一般に、ペプチドタグおよび任意選択的に本明細書に記載の1つ以上のリンカー、例えば、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、約5アミノ酸長~約50アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、少なくとも5アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、6アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、7アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または1つ以上のリンカーとのペプチドタグは、8アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、9アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、10アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、11アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、12アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、13アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、14アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または1つ以上のリンカーとのペプチドタグは、15アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、16アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、17アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、18アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、19アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、20アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、21アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、22アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、23アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、24アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、25アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、26アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または1つ以上のリンカーとのペプチドタグは、27アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、28アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、29アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、30アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、31アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、32アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、33アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、34アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または1つ以上のリンカーとのペプチドタグは、35アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、36アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、37アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、それ自体または1つ以上のリンカーとのペプチドタグは、38アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、39アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、40アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、40アミノ酸長よりも長い。いくつかの実施形態では、単独でのまたは1つ以上のリンカーと組み合わせたペプチドタグは、50アミノ酸長以下である。
一般に、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、非エンベロープウイルスのキャプシド遺伝子に由来し得、例えば、非エンベロープウイルスの遺伝子改変キャプシドタンパク質を発現するように改変されたキャップ遺伝子であり、非エンベロープウイルスは、ヒト細胞、またはヒト細胞、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに一般に感染する非エンベロープウイルスのセロタイプに感染する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAVのVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質(またはVP1、VP2、および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の一部分)をコードするAAVキャプシド遺伝子に由来し、遺伝子改変アデノ随伴ウイルス(AAV)VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9からなる群から選択される、ヒトに感染するAAVセロタイプの遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするように改変されたキャップ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2 VP1、VP2、および/もしくはVP3キャプシドタンパク質、またはAAV9 VP1、VP2、および/もしくはVP3キャプシドタンパク質をそれぞれコードするAAV2もしくはAAV9キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV2 VP1、VP2、および/もしくはVP3キャプシドタンパク質、または遺伝子改変AAV9 VP1、VP2、および/もしくはVP3キャプシドタンパク質をそれぞれコードするように改変されたAAV2もしくはAAV9キャップ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV6キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV6 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質をコードするように改変されたAAV6キャップ遺伝子によってコードされ、このAAV6 VP1キャプシドタンパク質の野生型アミノ酸配列は、配列番号51としてそれぞれ表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質をコードするように改変されたAAV2キャップ遺伝子によってコードされ、このAAV2 VP1キャプシドタンパク質の野生型アミノ酸配列は、配列番号9としてそれぞれ表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV9キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV9 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質をコードするように改変されたAAV9キャップ遺伝子によってコードされ、このAAV9 VP1キャプシドタンパク質の野生型アミノ酸配列は、配列番号31としてそれぞれ表される。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラAAVキャプシド遺伝子に由来し(これによってコードされ)、キメラキャプシド遺伝子は、複数の核酸配列を含み、複数の核酸配列のそれぞれが、異なるAAVセロタイプのキャプシドタンパク質の部分をコードし、複数の核酸配列が一緒になって、キメラAAVキャプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラAAV2キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラAAV6キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、キメラAAV9キャプシド遺伝子に由来する。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、任意選択的にリンカーを介して、組換えキャプシドタンパク質に操作可能に連結された(例えば、これに挿入された、かつ/またはこれによって提示された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)を含むように改変され、そのため、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカー自体が、それぞれ、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを欠いている参照キャプシドタンパク質、または参照キャプシドキャプシドを含むキャプシドと比較して、組換えキャプシドタンパク質またはこれを含むキャプシドの天然指向性を減少させ、かつ/または無効にする。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、野生型参照キャプシドタンパク質の天然指向性に関与するキャプシドタンパク質の領域、例えば、細胞標的化に関与するキャプシドタンパク質の領域に操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、任意選択的にリンカーを介して、Ad繊維タンパク質のノブドメインに操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、Ad繊維タンパク質のHIループに操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、AAVキャプシドタンパク質中の露出された可変ループに操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、AAV2キャプシドタンパク質の露出された可変ループに操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、AAV9キャプシドタンパク質の露出された可変ループに操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。
いくつかの実施形態では、(i)ウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質をコードするAAV2キャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグは、任意選択的にリンカーを介して、AAV2 VP1キャプシドタンパク質の位置I453またはI587のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)に操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)か、(ii)ウイルスキャプシドタンパク質は、AAV6キャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、AAV6 VP1キャプシドタンパク質の位置I585のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)に操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)か、または(iii)ウイルスキャプシドタンパク質は、AAV9 VP1、VP2、および/もしくはVP3キャプシドタンパク質をコードするAAV9キャプシド遺伝子に由来し、ペプチドタグは、任意選択的にリンカーを介して、位置I453もしくはI589 AAV9 VP1キャプシドのアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)に操作可能に連結される(例えば、これに挿入され、かつ/またはこれによって提示される)。
いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)は、任意選択的にリンカーを介して、AAV2キャプシドタンパク質VP1の453、AAV2キャプシドタンパク質VP1の587、AAV6キャプシドタンパク質VP1の585、AAV9キャプシドタンパク質VP1の453、AAV9キャプシドタンパク質VP1の589からなる群から選択されるアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)に操作可能に連結され、例えば、AAV2キャプシドタンパク質VP1の453、AAV2キャプシドタンパク質VP1の587、AAV6キャプシドタンパク質VP1の585、AAV9キャプシドタンパク質VP1の453、およびAAV9キャプシドタンパク質VP1の589からなる群から選択されるアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)のC末端に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、AAV2キャプシドタンパク質VP1の位置453のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)の直後に挿入される(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、AAV2キャプシドタンパク質VP1の位置587のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)の直後に挿入される(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、AAV6キャプシドタンパク質VP1の位置585のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、およびAAV9のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)の直後に挿入される(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、AAV9キャプシドタンパク質VP1の位置453のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)の直後に挿入される(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、AAV9キャプシドタンパク質VP1の位置589のアミノ酸(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)の直後に挿入される(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合される)。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーは、AAV2 VP1キャプシドタンパク質の位置587と588との間(または同じキャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置、またはヒトに感染する異なるAAV、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8のVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応するアミノ酸)に挿入および/または提示される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質は、(第2の異なる)変異を含み、これは、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーに加えたものであり得る。いくつかの実施形態では、(第2の異なる変異)は、キャプシドタンパク質への異種ペプチドの挿入、1つ以上の異種アミノ酸とのキャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の置換、キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシド遺伝子に由来し(例えば、遺伝子改変AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質であり)、ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつ変異、例えば、AAV2 VP1キャプシドタンパク質中のR585Aおよび/またはR588A変異(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異)をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質であり、AAV2
VP1タンパク質の位置453のアミノ酸(またはAAV2キャプシド遺伝子によってコードされたAAV2 VP2および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸)の直後に挿入された(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつR585Aおよび/またはR588Aからなる群から選択される変異(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異)をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質であり、AAV2 VP1キャプシドタンパク質の位置587のアミノ酸(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたAAV2 VP2および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸)の直後に挿入された(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつR585A、R588Aからなる群から選択される変異、および/または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異をさらに含む。
VP1タンパク質の位置453のアミノ酸(またはAAV2キャプシド遺伝子によってコードされたAAV2 VP2および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸)の直後に挿入された(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつR585Aおよび/またはR588Aからなる群から選択される変異(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異)をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質であり、AAV2 VP1キャプシドタンパク質の位置587のアミノ酸(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたAAV2 VP2および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸)の直後に挿入された(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつR585A、R588Aからなる群から選択される変異、および/または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV9キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV9 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質であり、AAV9 VP1タンパク質の位置453のアミノ酸(またはAAV9キャプシド遺伝子からコードされたAAV9 VP2またはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸)の直後に挿入された(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつW503A変異(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異)をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV9キャプシド遺伝子に由来し、例えば、遺伝子改変AAV9 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質であり、AAV9 VP1タンパク質の位置589のアミノ酸(または同じAAV9キャプシド遺伝子からコードされたAAV9 VP2および/またはVP3キャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸)の直後に挿入された(例えば、当該アミノ酸のC末端に融合された)ペプチドタグ(タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバー)および任意選択的なリンカーを含み、かつW503A変異(または同じAAV2キャプシド遺伝子からコードされたVP2および/もしくはVP3キャプシドタンパク質中の対応する変異)をさらに含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質:タンパク質結合対は、SpyTag:SpyCatcher、SpyTag002:SpyCatcher002、SpyTag:KTag、イソペプタグ:ピリン-C、およびSnoopTag:SnoopCatcherからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、SpyTag(またはその生物学的活性部分)であり、タンパク質(第2の同族メンバー)は、SpyCatcher(またはその生物学的活性部分)である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、SpyTag(またはその生物学的活性部分)であり、タンパク質(第2の同族メンバー)は、KTag(またはその生物学的活性部分)である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、KTag(またはその生物学的活性部分)であり、タンパク質(第2の同族メンバー)は、SpyTag(またはその生物学的活性部分)である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、SnoopTag(またはその生物学的活性部分)であり、タンパク質(第2の同族メンバー)は、SnoopCatcher(またはその生物学的活性部分)である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、イソペプタグ(またはその生物学的活性部分)であり、タンパク質(第2の同族メンバー)は、ピリン-C(またはその生物学的活性部分)である。いくつかの実施形態では、ペプチドタグ(第1のメンバー)は、SpyTag002(またはその生物学的活性部分)であり、タンパク質(第2の同族メンバー)は、SpyCatcher002(またはその生物学的活性部分)である。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、SpyTagを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドまたはウイルスベクターを含む組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質のアミノ酸配列として表1に列挙された任意の配列番号として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号13として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号15として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号17として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号19として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号21として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号23として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシド、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物を含む組換えウイルスキャプシドであるウイルスベクターは、配列番号25として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号27として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号29として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号35として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号37として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシド、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物を含む組換えウイルスキャプシドであるウイルスベクターは、配列番号39として表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、特異的結合対の第2の同族タンパク質メンバーに共有結合された特異的結合対(例えば、ペプチドタグ)の第1のメンバーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、標的化リガンドに操作可能に連結された同族タンパク質(第2のメンバー)を含むアダプターポリペプチドに共有結合されたペプチドタグ(第1のメンバー)を含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、任意選択的にリンカーを介して、タンパク質(第2のメンバー)に操作可能に連結される、例えば、タンパク質に融合される。概して、標的化リガンドは、結合部分、例えば、天然リガンド、抗体、多特異性結合分子などであり得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、抗体またはその一部分である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質および重鎖定常ドメインに結合する可変ドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質およびIgG重鎖定常ドメインに結合する可変ドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質およびIgG重鎖定常ドメインに結合する可変ドメインを含む抗体であり、IgG重鎖定常ドメインは、例えば、リンカーを介して、ペプチドタグとのイソペプチド共有結合を形成するタンパク質(例えば、タンパク質:タンパク質結合対の第2のメンバー)に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えキャプシドタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質に操作可能に連結され、かつSpyTagに共有結合されたSpyTag、抗体可変ドメインを含む標的化リガンドに連結されたSpyCatcherを含むアダプターポリペプチド、ならびにIgG重鎖ドメインを含み、SpyCatcherおよびIgG重鎖ドメインは、アミノ酸リンカー、例えば、GSGESG(配列番号48)を介して連結される。いくつかの実施形態では、アダプターポリペプチドは、ヒトIgG4重鎖の一部分を含む配列番号46として表される配列を含み、当該IgG4部分は、リンカー(配列番号48)を介してSpyCatcher(配列番号3)に連結された配列番号49として表される配列を有する。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、標的化リガンドに融合されたSpyCatcherに共有結合されたSpyTagを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターコードする表1に列挙された任意の配列番号として表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号13として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号15として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号17として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号19として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスキャプシド、および/または組換えウイルスキャプシド形成物を含む組成物を含む組換えウイルスキャプシド、ウイルスベクターが、配列番号21として表されるアミノ酸配列と、配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号23として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号25として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号27として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号29として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号35として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドを含む組換えウイルスキャプシド、および/または組換えウイルスキャプシド形成物を含む組成物を含む組換えウイルスキャプシド、ウイルスベクターが、配列番号37として表されるアミノ酸配列と、配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号39として表されるアミノ酸配列、および配列番号46として表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドアダプターを含む。
一般に、標的化リガンドは、哺乳類(例えば、ヒト)真核細胞、例えば、標的細胞の表面上に発現される、細胞表面分子、例えば、オリゴ糖、受容体、細胞表面マーカーなどに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)肝細胞、(ヒト)脳細胞、(ヒト)T細胞、(ヒト)腎細胞、(ヒト)腸細胞、(ヒト)肺細胞、(ヒト)癌細胞、または異種病原体に感染した(ヒト)細胞に結合する。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)肝細胞、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、hASGR1によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)神経細胞、例えば、GABA、トランスフェリンなどによって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)T細胞、例えば、CD3、例えば、CD3εによって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、CD63に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)造血幹細胞、例えば、CD34によって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)腎細胞によって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)筋細胞、例えば、インテグリンによって発現される分子に結合する。いくつかの実施形態では、r標的化リガンドは、(ヒト)癌細胞によって発現される分子、例えば、腫瘍関連抗原、例えば、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1A1、アルファ-アクチニン-4、アルファ-胎児タンパク質(「AFP」)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合タンパク質b3a2、ベータ-カテニン、BING-4、CA-125、CALCA、癌胎児抗原(「CEA」)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、サイクリンD1、サイクリン-A1、dek-can融合タンパク質、DKK1、EFTUD2、伸長因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮性腫瘍抗原(「ETA」)、ETV6-AML1融合タンパク質、EZH2、E6、E7、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、グリピカン-3、GnTV、gp100/Pme117、GPNMB、HAUS3、へプシン、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rアルファ2、腸カルボキシエステラーゼ、K-ras、カリクレイン4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、CCDC110としても知られているKMHN1、LAGE-1、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、リンゴ酸酵素、マンマグロビン-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、ムチン、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン、ミオシンクラスI、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、Pポリペプチド、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARアルファ融合タンパク質、多形性上皮ムチン(「PEM」)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、セセルニン1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、サバイビン、SYT-SSX1または-SSX2融合タンパク質、TAG-1、TAG-2、テロメラーゼ、TGF-betaRII、TPBG、TRAG-3、トリオースリン酸イソメラーゼ、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、チロシナーゼ、チロシナーゼ(「TYR」)、VEGF、WT1、XAGE-lb/GAGED2a、Kras、NY-ESO1、MAGE-A3、HPV E2、HPV E6、HPV E7、WT-1抗原(リンパ腫および他の固形腫瘍中の)、ErbB受容体、Melan A[MART1]、gp 100、チロシナーゼ、TRP-1/gp 75、およびTRP-2(黒色腫中の)、MAGE-1およびMAGE-3(膀胱癌、頭頸部癌、および非小細胞癌中の)、HPV EGおよびE7タンパク質(子宮頸癌中の)、ムチン[MUC-1](乳癌、膵癌、結腸癌、および前立腺癌)、前立腺特異的抗原[PSA](前立腺癌中の)、癌胎児性抗原[CEA]結腸癌、乳癌、および胃腸癌中の)、ならびにMAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3 TO 7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、TRP2-INT2などの共通の腫瘍特異的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、E6および/またはE7に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、Her2に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、CD63に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体(hGCGR)に結合する。いくつかの実施形態では、再標的化リガンドは、ヒトエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ3(hENTPD3)に結合する。
一般に、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、標的化リガンド、例えば、標的リガンドに操作可能に連結された第2のメンバーの非存在下では標的細胞に感染することができない。概して、適切な標的化リガンドの非存在下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、天然指向性を減少させるか、または無効にし、例えば、参照ウイルスキャプシド、例えば、参照ウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシド、例えば、野生型対照ウイルスキャプシドタンパク質、または参照ウイルスキャプシドタンパク質と同一であるが、標的化リガンドならびに任意選択的にタンパク質:タンパク質結合対のいずれかもしくは両方を欠いているウイルスキャプシドタンパク質の形質導入と比較して、形質導入に対して天然に許容状態の参照細胞を標的化するか、これに結合する能力を減少させるか、または無効にする。いくつかの実施形態では、SpyTagを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質の形質導入効率は、対照の野生型ウイルスキャプシドタンパク質と比較して、減少されるか、または無効にされる。
いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、例えば、表1に列挙された本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも10%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも20%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも30%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも40%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも50%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも60%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも70%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも75%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも80%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも85%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも90%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも95%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された対照の野生型ウイルスキャプシドと比較して、少なくとも99%の形質導入効率の減少を示す。いくつかの実施形態では、適切な標的化リガンドが存在しない場合、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドによる制御細胞の形質導入は、例えば、対象ヌクレオチドの発現を測定する方法、例えば、レポーターアッセイなどを介して無効にされる、例えば、検出不能である。
逆に、適切なアダプターポリペプチドに共有結合されたペプチドタグを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシド、例えば、標的化リガンドに共有結合された同族タンパク質は、標的細胞に感染することができ、例えば、参照ウイルスキャプシド、例えば、参照ウイルスキャプシドタンパク質、例えば、野生型対照キャプシドタンパク質を含むキャプシドの形質導入と比較して、形質導入に対して天然に許容状態の参照細胞を標的化し、これに結合する部分的または完全に復元された能力を有する。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも10%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも20%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも30%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも40%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも50%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも60%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも70%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも75%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも80%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも85%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも90%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも95%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの少なくとも99%の形質導入効率である形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に共有結合された適切な対照の野生型ウイルスキャプシドの形質導入効率と同一の形質導入効率を表す。
同様に、適切なアダプターポリペプチドに共有結合されたペプチドタグを含む組換えウイルスキャプシドタンパク質、例えば、標的化リガンドに操作可能に連結された同族タンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、標的細胞に感染することができ、例えば、タンパク質:タンパク質結合対のいずれかまたは両方を欠いている、例えば、参照キャプシドタンパク質を含むことを除いて、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同一である参照ウイルスキャプシドの形質導入と比較して、形質導入に対して天然に許容状態の参照細胞を標的化し、これに結合する増強された能力を有する。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも10%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも20%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも30%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも40%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも50%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも60%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも70%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも75%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも80%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも85%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも90%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも95%大きい形質導入効率を示す。いくつかの実施形態では、適切なアダプターポリペプチドに共有結合された、本明細書に記載の、例えば、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、例えば、表1に列挙された適切な対照の参照ウイルスキャプシドの形質導入効率よりも99%大きい形質導入効率を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルス性キャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドは、モザイクキャプシドであり、例えば、少なくとも2セットのVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質を含み、それらの各セットは、異なるキャップ遺伝子によってコードされ、例えば、ペプチドタグ、および特定の比率でペプチドタグを含まない参照キャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、参照キャプシドタンパク質は、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同じセロタイプを有する野生型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含むという点で、野生型の参照キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、参照のキャプシドタンパク質は、対照の参照キャプシドタンパク質がペプチドタグを欠いていることを除いて、組換えウイルスキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を含むという点で、対照の参照キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、参照キャプシドタンパク質は、組換えウイルスキャプシドタンパク質と同じセロタイプを有するが、野生型キャプシドタンパク質の指向性を減少させる変異(例えば、アミノ酸配列の欠失、アミノ酸配列の挿入、キメラ化など)のための野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸は入れると実質的に同一のアミノ酸配列を含むという点で、変異型の野生型参照タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質を1:1~1:15の範囲の比率で含むか、本明細書に記載の方法は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質を1:1~1:15の範囲の比率で組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は1:2である。いくつかの実施形態では、比率は1:3である。いくつかの実施形態では、比率は1:4である。いくつかの実施形態では、比率は1:5である。いくつかの実施形態では、比率は1:6である。いくつかの実施形態では、比率は1:7である。いくつかの実施形態では、比率は1:8である。いくつかの実施形態では、比率は1:9である。いくつかの実施形態では、比率は1:10である。いくつかの実施形態では、比率は1:11である。いくつかの実施形態では、比率は1:12である。いくつかの実施形態では、比率は1:13である。いくつかの実施形態では、比率は1:14である。いくつかの実施形態では、比率は1:15である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質、およびこれも表1に列挙されたその適切な参照キャプシドタンパク質(またはその参照キャプシドタンパク質の組み合わせ)を1:1~1:15の範囲の比率(組換えキャプシドタンパク質:参照キャプシドタンパク質(複数可))で含むか、または本明細書に記載の方法は、表1に列挙された組換えウイルスキャプシドタンパク質、およびこれも表1に列挙されたその適切な参照キャプシドタンパク質(またはその参照キャプシドタンパク質の組み合わせ)を1:1~1:15の範囲の比率(組換えキャプシドタンパク質:参照キャプシドタンパク質(複数可))で組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は1:2である。いくつかの実施形態では、比率は1:3である。いくつかの実施形態では、比率は1:4である。いくつかの実施形態では、比率は1:5である。いくつかの実施形態では、比率は1:6である。いくつかの実施形態では、比率は1:7である。いくつかの実施形態では、比率は1:8である。いくつかの実施形態では、比率は1:9である。いくつかの実施形態では、比率は1:10である。いくつかの実施形態では、比率は1:11である。いくつかの実施形態では、比率は1:12である。いくつかの実施形態では、比率は1:13である。いくつかの実施形態では、比率は1:14である。いくつかの実施形態では、比率は1:15である。
表1は、(1)本明細書に記載のペプチドタグを含む例示的かつ非制限的な組換えウイルスキャプシドタンパク質、(2)標的化ベクターの非存在下で共有タンパク質タグを含む組換えキャプシドタンパク質の形質導入効率の減少または無効化を決定するために任意選択的に参照として使用され得る例示的かつ非制限的な例の対応する対照(C)の野生型ウイルスキャプシドタンパク質、および(3)モザイクキャプシドを生成するための対応する参照ウイルスキャプシドタンパク質の例示的かつ非制限的な例のアミノ酸配列として表される配列同定番号(配列番号)、ならびに/またはタンパク質:タンパク質結合類および標的化リガンドを含む組換えキャプシドタンパク質の形質導入効率の復元を決定するための参照としての使用を提供する。
概して、本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、モザイクウイルスキャプシドを含む、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドを含み、ウイルスキャプシドは、対象ヌクレオチドを封入する。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、非ヒトプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、EF1αプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターはCAGGプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ユビキチンC(UbC)プロモーターである。
概して、対象ヌクレオチドは、1つ以上の遺伝子であり得、これは、検出可能なマーカー、例えば、レポーター、または治療用ポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子である。いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなどからなる群から選択される検出可能なマーカーをコードするレポーター遺伝子である。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、緑色蛍光タンパク質である。他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、CRISPR/Casシステムまたはその一部分(複数可)をコードするヌクレオチド、アンチセンスRNAをコードするヌクレオチド、siRNAをコードするヌクレオチド、分泌酵素、治療用タンパク質をコードする遺伝子などからなる群選択される。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、例えば、2つの別個の機能を提供する少なくとも2つのドメインを含むタンパク質をコードする。
本明細書に記載の組成物は、概して、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターを含み、例えば、組換えウイルスキャプシドタンパク質(例えば、モザイクキャプシドを含む)キャプシドを含み、キャプシドは対象ヌクレオチドを封入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、(1)本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むキャプシドを有するウイルスベクター、および(2))薬学的に許容可能な担体を含む。
また、組換えウイルスキャプシドタンパク質、これを含むウイルスベクター、組成物などを作製および使用する方法も本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどを再配向すること、標的細胞への診断/治療用カーゴを送達することなどを含む方法は、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスベクターと標的細胞(生体外または生体内、例えば、ヒト中にあり得る)を接触させることを含み、ウイルスキャプシドまたはウイルスベクターは、標的細胞の表面上に発現されたタンパク質に特異的に結合する標的化リガンドを含む。このような方法は、組換えウイルスベクターを生成すること、例えば、ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞が、参照キャプシドタンパク質をコードするプラスミドの非存在または存在下でペプチドタグ(第1のメンバー)を含むキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含む、培養すること、標的化リガンドに操作可能に連結された第2の同族部材により組換えキャプシドタンパク質をインキュベートすることなどを第1の工程として含み得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)肝細胞であり、(モザイク)組換えウイルスベクターは、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、(h)ASGR1に特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)神経細胞であり、(モザイク)組換えウイルスベクターは、GABA、トランスフェリン受容体などに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)T細胞であり、(モザイク)組換えウイルスベクターは、CD3、例えばCD3εに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)造血幹細胞であり、(モザイク)組換えウイルスベクターは、CD34に特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)腎細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)筋細胞であり、(モザイク)組換えウイルスベクターは、インテグリンに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、(ヒト)癌細胞であり、(モザイク)組換えウイルスベクターは、腫瘍関連抗原、例えば、E6およびE7、Her2などに特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体(hGCGR)に結合する。
また、ウイルスキャプシドを不活性化し、かつ/またはウイルスベクターを生成する方法であって、概して、(a)異種タンパク質をコードする核酸を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、ペプチドタグを含む(参照キャプシドタンパク質をコードするプラスミドの非存在または存在下で)遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形成することと、および/または(b)ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞がヌクレオチド配列を含む、培養することと、を含む、方法を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび/または導入プラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを細胞溶解物から単離することと、をさらに含む。いくつかの実施形態ではさらに、本方法は、(a)細胞片を除去することと、(b)MgCl2の存在下で、ヌクレアーゼ、例えば、DNase Iを有するウイルスベクターを含有する上清を処理することと、(c)ウイルスベクターを濃縮することと、(d)ウイルスベクターを精製することと、(e)(a)~(d)の任意の組み合わせと、をさらに含む。また、本明細書に記載の方法に従って作製されたウイルスベクター、および本明細書に記載のウイルスベクターを生成するために有用なパッケージング細胞、例えば、組換えキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むパッケージング細胞を本明細書に提供する。
特許または出願書類は、色付きで作成された少なくとも1つの図面を含む。色付きの図面(複数可)を伴う本特許または特許出願公開の写しは、要求により、および必要な料金を支払うことにより、当局に提供されるであろう。
WO2016/11291は、ワクチン接種の目的で、免疫原性抗原をAP205キャプシド上に高密度で提示する、改変バクテリオファージAP205由来のウイルス様粒子(VLP)を生産するための特異的結合対(SpyCatcher:SpyTag)の利用を記載している。理論上、ウイルスベクターを再標的化する目的で、ウイルスベクターの天然指向性が実質的に減少されるか、または無効にされることを確実にするために、このようなウイルスキャプシドの高度な改変が望ましい場合がある。しかしながら、標的化リガンドをウイルス表面上にこのように高密度で提示することは、形質導入効率を妨げる可能性がある。実施例4および5を参照されたい。最適な形質導入効率を達成するためには、メンバーを用いたウイルス表面の改変の程度が減少されるときに最適な形質導入効率が生じることが発見された。このように、遺伝子改変ウイルス粒子、これらを含む組成物、およびこれらを作製および使用する方法を本明細書に提供する。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈により別段明確に指示されない限り、複数形の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、1つ以上の方法、および/または本明細書に記載の、かつ/もしくは当業者には本開示を読むと明らかになるタイプの工程を含む。
「抗体」という用語には、4つのポリペプチド鎖(ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖)を含む、免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変ドメイン(VH)および重鎖定常領域(CH)を含む。重鎖定常領域は、少なくとも3つのドメイン、CH1、CH2、CH3、および任意選択的にCH4を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン(CH)および軽鎖定常領域(CL)を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存的な領域が散在する。各重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、3つのCDRおよび4つのFRを含み、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される。FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鎖CDRは、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3として省略される場合があり、軽鎖CDRは、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3として省略され得る)。典型的な四量体抗体構造は、2つの同一の抗原結合ドメインを含み、それらのそれぞれがVHドメインおよびVLドメインの会合によって形成され、それらのそれぞれがそれぞれのCHおよびCLドメインと一緒に抗体Fv領域を形成する。単一ドメイン抗体は、単一抗原結合ドメイン、例えば、VHまたはVLを含む。抗原の抗原結合ドメイン、例えば、抗原の特異的結合対の第1のメンバーを認識し、これに結合する抗体の一部は、「パラトープ」とも呼ばれる。それは、抗体のFv領域の小さい領域(5~10個のアミノ酸の)であり、断片抗体結合(Fab領域)の一部であり、抗体の重鎖および/または軽鎖の部分を含有し得る。パラトープは、パラトープが特異的結合対の第1のメンバーに高親和性で結合する場合に、特異的結合対の第1のメンバーに特異的に結合する。「高親和性」抗体という用語は、約10-9M以下(例えば、約1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、または約1×10-12M)の特異的結合対のその標的となる第1のメンバーに対するKDを有する抗体を指す。一実施形態では、KDは、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)によって測定され、別の実施形態では、KDは、ELISAによって測定される。
「相補性決定領域」という語句または「CDR」という用語は、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、通常(すなわち、野生型動物では)、免疫グロブリン分子(例えば、抗体またはT細胞受容体)の軽鎖または重鎖の可変領域における2つのフレームワーク領域の間に見られる。CDRは、例えば、生殖細胞系配列、または再配列されたもしくは再配列されていない配列によって、例えば、ナイーヴ細胞もしくは成熟したB細胞またはT細胞によってコードされ得る。CDRは、体細胞変異されている(例えば、動物生殖細胞系でコードされた配列と異なり)、ヒト化されている、かつ/またはアミノ酸置換、付加、もしくは欠失で改変されている場合がある。いくつかの環境下(例えば、CDR3に関して)では、CDRは、2つ以上の配列(例えば、生殖細胞系配列)によってコードすることができ、当該2つ以上の配列は、例えば、(例えば、再配列されていない核酸配列においては)連続していないが、配列のスプライシングまたは接続(例えば、重鎖CDR3を形成するためのV-D-J再組み合わせ)の結果として、B細胞核酸配列においては連続している。
「逆位末端配列」または「ITR」という語句は、効率的な複製に必要なアデノ随伴ウイルスのゲノム中の対称核酸配列を含む。ITR配列は、AAV DNAゲノムの各末端に位置する。ITRは、ウイルスDNA合成のための複製の起源としての役割を果たし、AAVベクターを生成するための必須シス構成要素である。
「軽鎖」という語句は、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列を含み、別段の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトκ軽鎖およびヒトλ軽鎖ならびにVpreBを含む。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、3つの軽鎖CDRおよび4つのフレームワーク(FR)領域を含む。一般に、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、当該遺伝子配列は、一般に、生殖細胞系に存在するVセグメントおよびJセグメントのレパートリーに由来するVLセグメントおよびJLセグメントを含む。様々な生物体に対するV軽鎖セグメントおよびJ軽鎖セグメントの配列、位置、および命名は、IMGTデータベース、www.imgt.orgで見ることができる。軽鎖は、例えば、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第1のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の第1のメンバーまたは第2のメンバーのいずれも選択的に結合しない軽鎖を含む。軽鎖はまた、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第1のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の1つ以上の第1のメンバーの結合および認識により重鎖または別の軽鎖に結合し、これを認識するか、またはこれを補助する軽鎖を含む。一般的な軽鎖または汎用軽鎖には、ヒトVκ1~39Jκ遺伝子またはヒトVκ3~20Jκ遺伝子に由来する軽鎖を含み、それらの体細胞変異(例えば、親和性成熟)バージョンを含む。例示的なヒトVLセグメントは、ヒトVκ1~39遺伝子セグメント、ヒトVκ3~20遺伝子セグメント、ヒトVλ1~40遺伝子セグメント、ヒトVλ1~44遺伝子セグメント、ヒトVλ2~8遺伝子セグメント、ヒトVλ2~14遺伝子セグメント、およびヒトVλ3~21遺伝子セグメントを含み、それらの体細胞変異(例えば、親和性成熟)バージョンを含む。1つの生物体(例えば、ヒトもしくは齧歯類、例えば、ラットもしくはマウス、または鳥類、例えば、ニワトリ由来の可変ドメイン、および同じまたは異なる生物体(例えば、ヒトもしくは齧歯類、例えば、ラットもしくはマウス、または鳥類、例えば、ニワトリ)由来の定常領域を含む軽鎖を作製することができる。
「約」または「およそ」という用語は、ある値の統計的に有意義な範囲内にあることを含む。このような範囲は、所与の値または範囲の10倍以内、好ましくは50%以内、より好ましくは20%以内、さらにより好ましくは10%以内、よりいっそう好ましくは5%以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容可能な変動は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。
「キャプシドタンパク質」という用語は、ウイルスのキャプシドの一部であるタンパク質を含む。アデノ随伴ウイルスについては、キャプシドタンパク質は、一般に、VP1、VP2、および/またはVP3と呼ばれ、それらは単一のキャップ遺伝子によってコードされる。AAVについては、3つのAAVキャプシドタンパク質が、代替的なmRNAスプライシングおよび/または代替的な翻訳開始コドン使用を介したキャップオープンリーディングフレーム(ORF)から重複様式で生成されるが、3つのタンパク質すべてが共通の終止コドンを使用する。Warrington et al.(2004)J.Virol.78:6595(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。AAV2のVP1は、一般に、2.4kbのmRNA上のATG開始コドン(アミノ酸M1)から翻訳されるが、AAV2のVP2およびVP3は、VP2生成のためのより弱いACG開始コドン(アミノ酸T138)、および最も豊富なキャプシドメタンタンパク質であるVP3の生成のための次の利用可能なATGコドン(アミノ酸M203)に対するリードスルー翻訳を使用して、より小さい2.3kbのmRNAから生じる。Warrington,supra;Rutledge et al.(1998)J.Virol.72:309-19(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。アデノ随伴ウイルスのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られており、一般に保存されており、特にデペンドパルボウイルス(dependoparvovirus)内に保存されている。上記のRutledge et al.を参照されたい。例えば、上記のRutledge et al.(1998)は、図4Bに、AAV2、AAV3、AAV4、およびAAV6のVP1、VP2、およびVP3キャプシドタンパク質のためのアミノ酸配列アラインメントを提供し、VP1、VP2、およびVP3のそれぞれの開始部位は矢印で示され、可変ドメインはボックスで示されている。したがって、本明細書に提供されるアミノ酸位置は、AAVのVP1キャプシドタンパク質に関連して提供され得、さらに明記されない本明細書に提供されるアミノ酸位置は、配列番号1として表される主要なコードタンパク質VP1のAAV2配列を指すが、当業者であれば、AAVのVP2および/またはVP3キャプシドタンパク質内の同じアミノ酸の位置、および異なるセロタイプの中のアミノ酸の対応する位置をそれぞれ容易に決定することができるであろう。したがって、本明細書に提供されるアミノ酸位置は、AAVのVP1キャプシドタンパク質に関連して提供され得、さらに明記されない本明細書に提供されるアミノ酸位置は、配列番号9として表される主要なコードタンパク質VP1のAAV2配列を指すが、当業者であれば、AAVのVP2および/またはVP3キャプシドタンパク質内の同じアミノ酸の位置、および異なるAAVセロタイプの中の対応するアミノ酸および位置をそれぞれ容易に決定することができるであろう。さらに、当業者であれば、「キメラキャプシドタンパク質」の形成のために異なるAAVセロタイプのキャプシドタンパク質間のドメインを交換することができるであろう。
「キメラAAVキャプシドタンパク質」の生成のための2つのAAVキャプシドタンパク質構築物間のドメイン交換が記載されている。例えば、Shen et al.(2007)Mol.Therapy 15(11):1955-1962(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。「キメラAAVキャプシドタンパク質」には、アミノ酸配列、例えば、2つ以上の異なるAAVセロタイプ由来のドメインを含み、AAV様ウイルスキャプシド/ウイルス粒子を形成することができ、かつ/または形成する、AAVキャプシドタンパク質が含まれる。キメラAAVキャプシドタンパク質は、キメラAAVキャプシド遺伝子、例えば、複数の、例えば少なくとも2つのヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされ、その複数のそれぞれは、区別可能なAAVセロタイプのキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子の一部分と同一であり、その複数は共に、機能的キメラAAVキャプシドタンパク質をコードする。特定のAAVセロタイプに関連してキメラキャプシドタンパク質を参照することは、キャプシドタンパク質が、そのセロタイプのキャプシドタンパク質由来の1つ以上のドメイン、および異なるセロタイプのキャプシドタンパク質由来の1つ以上のドメインを含むことを示している。例えば、AAV2キメラキャプシドタンパク質は、AAV2 VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の1つ以上のドメイン、ならびに異なるAAVのVP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質の1つ以上のドメインを含む、キャプシドタンパク質を含む。
「モザイクキャプシド」は、少なくとも2セットのVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質を含み、それらの各セットは、異なるキャップ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のモザイクキャプシドは、異種エピトープをコードする核酸配列の挿入により遺伝子改変されたキャップ遺伝子によってコードされる組換えVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質を含み、参照キャップ遺伝子、例えば、組換えVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質と同じAAVセロタイプの野生型VP1、VP2、および/またはVP3タンパク質をコードする野生型参照キャップ遺伝子、組換えVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質と同一であるが、異種エピトープが非存在であるVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質をコードする対照参照キャップ遺伝子、組換えVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質と同じAAVセロタイプであるが、変異により野生型VP1、VP2、および/またはVP3タンパク質の指向性が好ましくは減少された変異(例えば、導入、置換、欠失)を有する実質的に野生型のVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質をコードする変異野生型参照キャップ遺伝子によってコードされるVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、参照キャップ遺伝子は、キメラVP1、VP2、および/またはVP3タンパク質をコードする。
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という語句には、任意の生物体由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列が含まれる。重鎖可変ドメインは、別段の規定がない限り、3つの軽鎖CDRおよび4つのFR領域を含む。重鎖の断片には、CDR、CDR、およびFR、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて(N末端からC末端方向に)、CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、特異的結合対の第1のメンバーを特異的に認識する(例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のKDにより特異的結合対の第1のメンバーを認識する)ことができ、細胞を発現し、細胞から分泌可能であり、かつ少なくとも1つのCDRを含む、断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、当該遺伝子配列は、一般に、生殖細胞系に存在するVHセグメント、DHセグメント、およびJHセグメントのレパートリー由来のVHセグメント、DHセグメント、およびJHセグメントを含む。様々な生物体についてのV重鎖セグメント、D重鎖セグメント、およびJ重鎖セグメントの配列、位置、および命名は、IMGTデータベースで見ることができ、これは、インターネット経由でURLが「imgt.org」の世界的なウェブ(www)でアクセス可能である。
「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」などの用語は、重鎖定常領域に動作可能に結び付けられた可変領域を含む免疫グロブリン様鎖を含む単量体またはホモ二量体の免疫グロブリン分子を指し、これは、重鎖定常領域が典型的には機能的CH1ドメインを欠いているため軽鎖と会合することができない。したがって、「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」などの用語は、(i)機能的CH1ドメインを欠いている重鎖定常領域に操作可能に連結された可変ドメインを含む免疫グロブリン様鎖の1つを含む単量体単一ドメイン抗原結合タンパク質、または(ii)2つの免疫グロブリン様鎖を含むホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質であって、そのそれぞれが、機能的CH1ドメインを欠いている重鎖定常領域に操作可能に連結された可変ドメインを含む、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質の両方を包含する。様々な態様では、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質は、2つの同一の免疫グロブリン様鎖を含み、それらのそれぞれが、機能的CH1ドメインを欠いている同一の重鎖定常領域に操作可能に連結された同一の可変ドメインを含む。さらに、単一ドメイン抗原結合タンパク質の各免疫グロブリン様鎖は、重鎖定常領域遺伝子(例えば、IgG、IgA、IgE、IgD、またはそれらの組み合わせ)の配列(および、任意選択的に、ヒンジ領域)をコードするCH1における欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域(CH)遺伝子配列に連結された、重鎖可変領域遺伝子セグメント(例えば、VH、DH、JH)、軽鎖遺伝子セグメント(例えば、VL、JL)、またはそれらの組み合わせに由来し得る可変ドメインを含む。重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「VH単一ドメイン抗体または「VH単一ドメイン抗体結合タンパク質」と呼ばれる場合があり、例えば、米国特許第8,754,287、米国特許公開第2014/0289876;号、同第2015/0197553号、同第2015/0197554号、同第2015/0197555号、同第2015/0196015号、同第2015/0197556号、同第2015/0197557号(それらのそれぞれは、それらの全体が参照により組み込まれる)を参照されたい。軽鎖遺伝子セグメント由来の可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「VL単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼ばれる場合があり、例えば、米国特許公開第2015/0289489号(その全体が参照により組み込まれる)を参照されたい。
「軽鎖」という語句には、任意の生物体由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、別段の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトカッパ(κ)軽鎖およびヒトラムダ(λ)軽鎖、ならびにVpreBが含まれる。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、3つの軽鎖CDRおよび4つのフレームワーク(FR)領域を含む。一般に、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、当該軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、一般に、生殖細胞系に存在する軽鎖V遺伝子セグメントおよび軽鎖J遺伝子セグメントのレパートリーに由来する軽鎖VL遺伝子セグメントおよび軽鎖JL遺伝子セグメントを含む。様々な生物体についての軽鎖V遺伝子セグメントおよび軽鎖J遺伝子セグメントの配列、位置、および命名は、IMGTデータベースで見ることができ、これは、インターネット経由でURLが「imgt.org」の世界的なウェブ(www)でアクセス可能である。軽鎖には、例えば、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第1のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の第1のメンバーまたは第2のメンバーのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。軽鎖にはまた、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第1のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の1つ以上の第1のメンバーに結合し、これを認識することにより重鎖に結合し、これを認識するか、または重鎖を補助する軽鎖が含まれる。軽鎖にはまた、当該軽鎖が現れる特異的結合対結合タンパク質の第1のメンバーによって選択的に結合される特異的結合対の1つ以上の第1のメンバーに結合し、これを認識することにより重鎖に結合し、これを認識するか、または重鎖を補助する軽鎖が含まれる。一般的な軽鎖または汎用軽鎖は、ヒトVκ1~39Jκ5遺伝子またはヒトVκ3~20Jκ1遺伝子由来の軽鎖を含み、それらの体細胞変異(例えば、親和性成熟)バージョンを含む。
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」という語句は、互いに直接的または間接的に相互作用するか、または別様に互いに協働して生態学的事象に加わる、構成要素または要素の物理的な並置(例えば、3次元空間での)を含み、当該並置は、こうした相互作用および/または協働を達成するかまたは可能にする。一例を挙げると、核酸中の制御配列(例えば、発現制御配列)は、その存在または非存在がコード配列の発現および/または活性に影響を与えるようにコード配列に対して位置する場合に、コード配列に対して「操作可能に連結されている」と言われる。多くの実施形態では、「操作可能な連結」は、互いに関連する構成要素または要素の共有結合を含む。当業者であれば、いくつかの実施形態では、共有結合は、効果的で操作可能な連結を達成する必要がないことを容易に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、核酸制御配列であって、それらが制御しているコード配列と操作可能に連結される核酸制御配列は、対象ヌクレオチドと連続している。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、1つ以上のこうした制御配列は、トランスまたは対象のコード配列を制御するための距離において作用する。いくつかの実施形態では、「発現制御配列」という用語は、本明細書で使用される場合、それらが連結されているコード配列の発現および処理に影響を与えるのに必要なおよび/または十分なポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNA処理シグナル、細胞質mRNAを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列(すなわち、コザック配列)、タンパク質安定性を強化する配列、および/またはいくつかの実施形態では、タンパク質分泌を強化する配列であり得る、またはこれらを含み得る。いくつかの実施形態では、1つ以上の制御配列は、特定の宿主細胞もしくは生物体、またはそれらのタイプで優先的にまたはそれらでのみ活性である。一例を挙げると、原核生物では、制御配列は、典型的には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物では、多くの実施形態では、制御配列は、典型的に、プロモーター、エンハンサー、および/または転写終結配列を含む。当業者であれば、多くの実施形態で、「制御配列」という用語は、発現および処理に不可欠な構成要素を指し、いくつかの実施形態で、その存在が発現に有利である構成要素(例えば、リーダー配列、標的化配列、および/または融合パートナー配列を含む)を含むことを理解するであろう。
「組換えキャプシドタンパク質」という用語には、野生型ウイルスの対応するキャプシドタンパク質と比較して、少なくとも1つの変異を有するキャプシドタンパク質が含まれ、当該野生型は、比較研究のための参照および/または対照ウイルスであり得る。組換えキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質に挿入され得、かつ/またはこれによって提示され得る異種アミノ酸配列を含む、キャプシドタンパク質を含む。この文脈における「異種」とは、ウイルスと比較して異種を意味し、これからキャプシドタンパク質が由来する。挿入されるアミノ酸は、キャプシドタンパク質の2つの所与のアミノ酸の間に単に挿入され得る。アミノ酸の挿入はまた、挿入部位におけるキャプシドタンパク質の所与のアミノ酸の欠失と共に行われる場合があり、例えば、1つ以上のキャプシドタンパク質アミノ酸は、5つ以上の異種アミノ酸によって置換される)。
「再標的化」または「再配向」とは、野生型ベクターが組織内のいくつかの細胞および/または生物体内のいくつかの器官内のいくつかの細胞を標的化し、組織または器官の一般的な標的化が、異種エピトープの挿入によって減少されるか、または無効にされ、生物体内の組織または特異的器官中のより特異的な細胞の再標的化が、特異的細胞によって発現されるマーカーに結合する標的化リガンドにより達成されるというシナリオを含み得る。こうした再標的化または再指向はまた、野生型ベクターが組織を標的化し、組織の標的化が、異種エピトープの挿入によって減少されるか、または無効にされ、完全に異なる組織への再標的化が標的化リガンドにより達成されるというシナリオを含み得る。
「特異的結合対」、「タンパク質:タンパク質結合対」などは、イソペプチド結合形成を可能にするか、または促進する条件下で結合される、共有イソペプチド結合を形成するように相互作用する、2つのタンパク質(例えば、第1のメンバー(例えば、第1のポリペプチド))および第2の同族メンバー(例えば、第2のポリペプチド)を含み、「同族」という用語は、イソペプチド結合を形成するように一緒に機能する、すなわち、一緒に反応する構成要素を指す。したがって、イソペプチド結合形成を可能にするか、または促進する条件下で、共有イソペプチド結合を形成するように一緒に効率的に反応する2つのタンパク質はまた、ペプチドリンカーの「相補的」対であるとも称され得る。共有イソペプチド結合を形成するように相互作用することができる特異的結合対は、Veggiani et al.(2014)Trends Biotechnol.32:506で再検討されており、これらは、SpyTag:SpyCatcher、SpyTag002:SpyCatcher002、SpyTag:KTag、イソペプタグ:ピリンC、SnoopTag:SnoopCatcherなどのペプチド:ペプチド結合対を含む。概して、ペプチドタグは、タンパク質:タンパク質結合対のメンバーを指し、これは、概して、30アミノ酸長よりも短く、第2の同族タンパク質と共有イソペプチド結合を形成するが、ここで、第2の同族タンパク質は、概して、より大きいが、これもSpyTag:KTagシステムなどの30アミノ酸長よりも短い場合がある。
「イソペプチド結合」という用語は、カルボキシル基またはカルボキサミド基とアミノ基との間のアミド結合を指し、ここで、アミノ基の少なくとも1つは、タンパク質主鎖に由来しないか、または代替的に、タンパク質骨格の一部でないものと見られる。イソペプチド結合は、単一のタンパク質内に形成され得るか、または2つのペプチド間もしくはペプチドとタンパク質との間で生じ得る。したがって、イソペプチド結合は、単一のタンパク質内の分子内に、または分子内に、すなわち、2つのペプチド/タンパク質分子間に、例えば、2つのペプチドリンカー間に、形成され得る。典型的には、イソペプチド結合は、リジン残基と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸残基、またはタンパク質もしくはペプチド鎖からなる末端カルボキシル基との間に生じ得るか、またはタンパク質もしくはペプチド鎖のアルファ-アミノ末端と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、もしくはグルタミン酸残基との間に生じ得る。イソペプチド結合に関与する対の各残基は、本明細書では反応性残基と呼ばれる。本発明の好ましい実施形態では、イソペプチド結合は、リジン残基とアスパラギン残基との間に、またはリジン残基とアスパラギン酸残基との間に形成され得る。特に、イソペプチド結合は、リジンの側鎖アミンと、アスパラギンのカルボキサミド基またはアスパラギン酸のカルボキシル基との間に生じ得る。
SpyTag:SpyCatcherシステムは、米国特許第9,547,003号およびZakeri et al.(2012)PNAS 109:E690-E697に記載されており(それらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)、これは、Streptococcus pyogenesフィブロネクチン結合タンパク質FbaBのCnaB2ドメインに由来している。ドメインを分割することによって、Zakeriらは、配列番号3で表されるアミノ酸配列を有する112アミノ酸ポリペプチドである、その同族タンパク質「SpyCatcher」に対するアミド結合を形成する、配列AHIVMVDAYKPTK(配列番号1)を有するペプチド「SpyTag」を得た。(Zakeri(2012),supra)。CnaB2ドメインに由来するさらなる特異的結合対は、SpyTag:KTagであり、これは、SpyLigaseの存在下でイソペプチド結合を形成する。(Fierer(2014)PNAS 111:E1176-1181)。SpyLigaseは、反応性リシンを含含有するSpyCatcherからのβ鎖を削除することによって操作され、その結果、アミノ酸配列ATHIKFSKRD(配列番号2)を有する10残基ペプチドタグである、KTagを得た。SpyTag002:SpyCatcher002システムは、Keeble et
al(2017)Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25に記載されている(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。SpyTag002は、配列番号54として表されるアミノ酸配列VPTIVMVDAYKRYKを有し、SpyCatcher002(配列番号55)に結合する。
al(2017)Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25に記載されている(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。SpyTag002は、配列番号54として表されるアミノ酸配列VPTIVMVDAYKRYKを有し、SpyCatcher002(配列番号55)に結合する。
SnoopTag:SnoopCatcherシステムは、Veggiani(2016)PNAS 113:1202-07に記載されている。Streptococcus
pneumoniae由来の接着剤であるRrgAのD4 Ig様ドメインを分割して、SnoopTag(残基734~745、配列番号5)およびSnoopCatcher(残基749~860)を形成した。SnoopTagおよびSnoopCatcherのインキュベーションにより、相補的タンパク質間に特異的な自然イソペプチド結合が生じる。上記のVeggiani(2016))を参照されたい。
pneumoniae由来の接着剤であるRrgAのD4 Ig様ドメインを分割して、SnoopTag(残基734~745、配列番号5)およびSnoopCatcher(残基749~860)を形成した。SnoopTagおよびSnoopCatcherのインキュベーションにより、相補的タンパク質間に特異的な自然イソペプチド結合が生じる。上記のVeggiani(2016))を参照されたい。
イソペプタグ:ピリン-C特異的結合対は、Streptococcus pyogenes由来の主なピリンタンパク質Spy0128に由来した。(Zakeir and
Howarth(2010)J.Am.Chem.Soc.132:4526-27)。イソぺプタグは、配列番号7として表されるアミノ酸配列TDKDMTITFTNKKDAEを有し、ピリン-C(Spy0128の残基18~299)に結合する。SnoopTagおよびSnoopCatcherのインキュベーションにより、相補的タンパク質間に特異的な自然イソペプチド結合が生じる。上記のZakeir and Howarth(2010)を参照されたい。
Howarth(2010)J.Am.Chem.Soc.132:4526-27)。イソぺプタグは、配列番号7として表されるアミノ酸配列TDKDMTITFTNKKDAEを有し、ピリン-C(Spy0128の残基18~299)に結合する。SnoopTagおよびSnoopCatcherのインキュベーションにより、相補的タンパク質間に特異的な自然イソペプチド結合が生じる。上記のZakeir and Howarth(2010)を参照されたい。
「ペプチドタグ」という用語は、(1)ペプチドタグでタグ付きのタンパク質に対して異種であり、(2)イソペプチド結合を形成することができる特異的タンパク質:タンパク質結合対のメンバー、および(3)50以下のアミノ酸長である、ポリペプチドを含む。
「標的細胞」という用語には、対象ヌクレオチドの発現が所望の任意の細胞が含まれる。好ましくは、標的細胞は、以下に記載のように、細胞を標的化リガンドにより標的化することを可能にする受容体をそれらの表面上に呈する。
「形質導入」または「感染」などの用語は、ウイルスベクターによる標的細胞核への核酸の導入を指す。形質導入などに関連する効率という用語、例えば、「形質導入効率」という用語は、例えば、対象ヌクレオチドを含むウイルスベクターのセット数とのインキュベーション後の対象ヌクレオチドを発現する細胞の画分(例えば、パーセンテージ)を指す。形質導入効率を決定するよく知られている方法には、蛍光レポーター遺伝子により形質導入された蛍光活性化細胞ソーティング、対象ヌクレオチドの発現のためのPCRなどが含まれる。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語には、「正常」(変異体、疾患の、変更されたなどとは対照的に)な状態または文脈で自然界に見られる構造および/または活性を有する実体を含む。当業者であれば、野生型ウイルスベクター、例えば、野生型キャプシドタンパク質が、比較研究における参照ウイルスベクターとして使用され得ることを理解するであろう。一般に、参照ウイルスキャプシドタンパク質/キャプシド/ベクターは、試験ウイルスキャプシドタンパク質/キャプシド/ベクターと同一であるが、効果が試験される変化に対して同一である。例えば、特異的結合対の第1のメンバーを試験ウイルスベクターに挿入する、例えば、形質導入効率に対する効果を決定するために、試験ウイルスベクターの形質導入効率(適切な標的化リガンドの存在または非存在下で)は、特異的結合対の第1のメンバーの存在を除いて、あらゆる例(例えば、さらなる変異、対象となるヌクレオチド、ウイルスベクターおよび標的細胞の数など)において試験ウイルスベクターと同一である参照ウイルスベクターの形質導入効率と比較され得る(必要に応じて、適切な標的化リガンドの非存在または存在下で)。
本明細書に記載の再標的化戦略は、上記に記載の足場および直接的な組換え手法の両方の利点を提供し、ならびに両方に固有の欠点のうちの多くを解決する。この戦略は、第1のメンバーおよび第2の同族メンバーが互いに特異的に結合し、結合すると、ウイルス粒子を同族メンバーに融合された任意の標的化リガンドに永久的に連結させる共有結合を形成する、特異的結合対を利用する。このような遺伝子改変ウイルス粒子を用いると、ウイルスキャプシドが損なわれない状態である限り、指向性が維持され、例えば、他の足場手法と比較した本明細書に提供されるシステムの1つの利点は、「アダプター」、例えば、標的化リガンドが直接的な組換え手法と類似した組換えウイルス粒子に結合される能力である。しかしながら、直接的な組換え手法とは対照的に、本明細書に記載のシステムは、組換えウイルス粒子がアダプターに見られる可変性を一定に維持することができる、例えば、同族メンバーが標的化リガンドを示差するように融合され、次に異なる融合タンパク質が標的細胞に従ってウイルス粒子に連結され得るという点で、足場アダプター手法の柔軟性を維持している。
組換えウイルスキャプシドタンパク質およびウイルスベクターおよび核酸
特異的結合対の第1のメンバーを含む異種アミノ酸配列を提示するように遺伝子改変された組換えウイルス粒子(例えば、ウイルスキャプシドタンパク質、ならびに組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドおよび/または組換えウイルスベクター)であって、アミノ酸配列が、50アミノ酸長よりも短く、組換えウイルスキャプシド/粒子タンパク質が、天然指向性を減少させるか、または無効にする、組換えウイルス粒子を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、特異的結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、第1および第2のメンバーは、共有結合され、第2のメンバーは、標的化リガンドに融合される。
特異的結合対の第1のメンバーを含む異種アミノ酸配列を提示するように遺伝子改変された組換えウイルス粒子(例えば、ウイルスキャプシドタンパク質、ならびに組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む組換えウイルスキャプシドおよび/または組換えウイルスベクター)であって、アミノ酸配列が、50アミノ酸長よりも短く、組換えウイルスキャプシド/粒子タンパク質が、天然指向性を減少させるか、または無効にする、組換えウイルス粒子を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、特異的結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、第1および第2のメンバーは、共有結合され、第2のメンバーは、標的化リガンドに融合される。
いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、特異的結合対の第1のメンバーおよび1つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、リンカーに隣接する特異的結合対の第1のメンバーを含み、例えば、異種アミノ酸配列は、第1のリンカーのN末端~C末端、特異的結合対の第1のリンカー、および第2のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第1および第2のリンカーは同一である。
一般に、本明細書に記載の異種アミノ酸配列は、例えば、自身による特異的結合対の第1のメンバーを含むか、または1つ以上のリンカーと組み合わせて、約5アミノ酸長~約50アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、少なくとも5アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、6アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、7アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、8アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、9アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、10アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、11アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、12アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、13アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、14アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、15アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、16アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、17アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、18アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、19アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、20アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、21アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、22アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、23アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、24アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、25アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、26アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、27アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、28アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、29アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、30アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、31アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、32アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、33アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、34アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、35アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、36アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、37アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、38アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、39アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、40アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、41アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、42アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、43アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、44アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、45アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、46アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、47アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、48アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、49アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列の長さは、50アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、特異的結合対は、SpyTag:SpyCatcher結合対であり、第1のメンバーは、SpyTagであり、第2の同族メンバーは、SpyCatcherである。いくつかの実施形態では、特異的結合対は、SpyTag:KTagであり、第1のメンバーは、SpyTagであり、第2の同族メンバーは、KTagである。いくつかの実施形態では、特異的結合対は、SpyTag:KTagであり、第1のメンバーは、KTagであり、第2の同族メンバーは、SpyTagである。いくつかの実施形態では、特異的結合対は、イソペプタグ:ピリン-Cであり、第1のメンバーは、イソペプタグであり、第2の同族メンバーは、ピリン-Cまたはその一部分である。いくつかの実施形態ではである。特異的結合対は、SnoopTag:SnoopCatcherであり、第1のメンバーは、SnoopTagであり、第2の同族メンバーは、SnoopCatcherである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Adキャプシドタンパク質、例えば、Ad1、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad6、およびAd7からなる群から選択されるAdセロタイプのキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ad2キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、Ad5キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えAdウイルスキャプシドタンパク質は、繊維タンパク質ドメイン中に、例えば、繊維タンパク質、繊維ノブ、および/または繊維ノブのHIループのカルボキシ末端に、特異的結合対の第1のメンバーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質遺伝子、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9からなる群から選択されるAAVセロタイプのキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシド遺伝子またはAAV9キャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変AAV2 VP1キャプシドタンパク質であり、その野生型アミノ酸配列は、配列番号9として表される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシドタンパク質は、遺伝子改変AAV9 VP1キャプシドタンパク質であり、その野生型アミノ酸配列は、配列番号31として表される。
一般に、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、特異的結合対の第1のメンバーが、キャプシドタンパク質またはそれを含むキャプシドの天然指向性を減少させ、かつ/または無効にするように、キャプシドタンパク質に挿入され、かつ/またはこれによって提示される特異的結合対の第1のメンバーを含む。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーは、野生型参照キャプシドタンパク質の天然指向性に関与するキャプシドタンパク質の領域、例えば、細胞受容体に関与するキャプシドタンパク質の領域に挿入される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーは、Ad繊維タンパク質のノブドメインに挿入され、かつ/またはこれによって提示される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーは、Ad繊維タンパク質のHIループに挿入され、かつ/またはこれによって提示される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーは、AAV2キャプシドタンパク質VP1のG453、AAV2キャプシドタンパク質VP1のN587、AAV9キャプシドタンパク質VP1のG453、およびAAV9キャプシドタンパク質VP1のA589からなる群から選択されるアミノ酸位置の後に挿入される。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーは、AAV2 VP1キャプシドのアミノ酸N587とR588との間に挿入および/または提示される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスキャプシド、組換えウイルスキャプシドを含むウイルスベクター、および/または組換えウイルスキャプシドを含む組成物は、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、35、37、または39として表されるアミノ酸配列を含む。AAV2を使用することによって同定されるさらなる好適な挿入部位は、当該技術分野でよく知られており(Wu et al.(2000)J.Virol.74:8635-8647)、I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、およびI-716を含む。本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、I-1、I-34、I-138、I-139、I-161、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-459、I-471、I-520、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、I-716、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に挿入される特異的結合対の第1のメンバーを含む、AAV2キャプシドタンパク質であり得る。さらなるAAVセロタイプを使用することによって同定されるさらなる好適な挿入部位は、よく知られており、I-587(AAV1)、I-589(AAV1)、I-585(AAV3)、I-585(AAV4)、およびI-585(AAV5)を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、I-587(AAV1)、I-589(AAV1)、I-585(AAV3)、I-585(AAV4)、I-585(AAV5)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に挿入される特異的結合対の第1のメンバーを含むAAV2キャプシドタンパク質であり得る。
本明細書で使用される命名I-###は、AAVキャプシドタンパク質のVP1タンパク質に関するアミノ酸数を###に命名する挿入部位を指すが、このような挿入は、直接N末端もしくはC末端に、好ましくは所与のアミノ酸の5つのアミノ酸のN末端またはC末端の配列における1つのアミノ酸のC末端に、所与のアミノ酸の好ましくは3つの、より好ましくは2つの、特に1つのアミノ酸(複数可)のN末端もしくはC末端に位置し得る。追加的に、本明細書で言及される位置は、AAVキャプシド遺伝子によってコードされるVP1タンパク質に関するものであり、対応する位置(およびその変異)は、参照AAVキャプシド遺伝子によってコードされるVP1、VP2、およびVP3タンパク質の配列アラインメントを実施することによって、キャプシド遺伝子によってコードされるVP2およびVP3キャプシドタンパク質について簡単に識別することができる。
したがって、キャップ遺伝子のこれらの部位のうちの1つのコード核酸の対応する位置への挿入は、キャプシドタンパク質がずらされた開始コドンと同じ遺伝子の重複したリーディングフレームによってコードされるので、VP1、VP2、および/またはVP3への挿入につながる。したがって、例えば、AAV2については、この命名によると、アミノ酸1~138の挿入のみがVP1に挿入され、138~203の挿入は、VP1およびVP2に挿入され、203~C末端の挿入は、VP1、VP2、およびVP3に挿入され、これは当然のことながら、挿入部位I-587についても当てはまる。したがって、本発明は、VP1、VP2、および/またはVP3タンパク質における対応する挿入を有するAAVの構造遺伝子を包含する。
追加的に、少なくとも大きな延伸の高度保存および密接に関連するファミリーメンバーの大きなメンバーにより、列挙されているAAV以外のAAVの対応する挿入部位は、アミノ酸アラインメントを実施することによって、またはキャプシド構造の比較によって同定することができる。例えば、Rutledge et al.(1998)J.Virol.72:309-19、および異なるAAVキャプシドタンパク質の例示的なアラインメントについての米国特許第9,624,274号(それらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を減少させるか、または無効にし、例えば、野生型参照ウイルスベクターおよび/または標的細胞による感染に対して天然に許容状態の細胞の形質導入は、適切な標的化リガンドに融合される結合対の第2の同族部材との共有結合の非存在下で検出不能である。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、例えば、野生型参照ウイルスベクターによる感染に対して天然に許容状態である細胞の形質導入と比較して、ウイルスベクターの天然指向性を減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも5%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも5%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも10%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも20%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも30%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも40%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも50%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも60%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも70%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも80%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも90%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも95%減少させる。いくつかの実施形態では、特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)は、ウイルスベクターの天然指向性を少なくとも90%減少させる。特異的結合対の第1のメンバーの挿入(提示)が組換えウイルスキャプシドの天然指向性を完全に無効にしない実施形態では、このような組換えウイルスキャプシドの天然指向性は、第2の異なる変異によってさらに減少され得る。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質は、AAV9セロタイプに由来し得、特異的結合対の第1のメンバーを含み得、変異、例えば、W503A変異をさらに含み得る。
このウイルスのその天然宿主からの脱離は、天然宿主細胞によるウイルスベクターの取り込みがウイルスベクターの有効量を制限するため、特に、ウイルスベクターの全身投与対局所的または局所領域的投与が意図されている場合に重要である。AAV2およびAAV6の場合、HSPGは、多数の細胞、特に肝細胞におけるウイルス取り込みのための主な受容体であると報告されている。AAV2については、HSPG結合活性は、5つの基本アミノ酸、R484、R487、R585、R588、およびK532(Kern et al.,(2003)J Virol.77(20):11072-81)の群に依存している。したがって、好ましい点変異は、標的細胞へのウイルスベクターの結合のための主な受容体としてのHSPGの場合、天然受容体によって媒介される所与の標的細胞に対するウイルスベクターの形質導入活性を、少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも95%減少させるものである。
結果として、HSPG結合ウイルスベクターに対して好ましいさらなる変異は、R、K、またはHなどの塩基性アミノ酸、好ましくはA、D、G、Q、S、およびTなどの非塩基性アミノ酸、好ましくはA、またはこの位置にそのようなアミノ酸を欠いている、異なるが高度に保存されたAAVセロタイプの対応する位置に存在するアミノ酸によって、それぞれのウイルスのHSPG結合に関与するRまたはKを除去または置換する変異である。結果として、好ましいアミノ酸置換は、R484A、R487A、R487G、K532A、K532D、R585A、R585S、R585Q、R585A、またはR588T、特にAAV2に対するR585Aおよび/またはR588A、ならびにAAV6に対するK531AまたはK531Eである。本発明の特に好ましい一実施形態では、これらの2つの点変異が大幅にHSPG結合活性をもたらすのに十分であるように、2つの点変異のR585AおよびR588Aを追加的に含有するAAV2のキャプシドタンパク質変異体である。これらの点変異は、HSPG発現細胞からの効率的な脱離を可能にし、標的化のために、その新しい標的細胞に対するそれぞれの変異体ウイルスの特異性を増加させる。
標的化リガンド
本明細書に記載のウイルス粒子は、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入され/これによって提示される特異的結合対の第1のメンバーとの共有結合を特異的に形成する特異的結合対の第2のメンバーをさらに含み、第2のメンバーは、標的化リガンドに融合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞、例えば、(ヒト)真核細胞(例えば、標的細胞)上の細胞表面タンパク質の表面上に発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腎細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)脳細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)リンパ球(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)T細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)B細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)樹状細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)マクロファージ(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)NK細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腎臓細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(例えば、ヒト)癌細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に異種病原体に感染された(ヒト)細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。
本明細書に記載のウイルス粒子は、組換えウイルスキャプシドタンパク質に挿入され/これによって提示される特異的結合対の第1のメンバーとの共有結合を特異的に形成する特異的結合対の第2のメンバーをさらに含み、第2のメンバーは、標的化リガンドに融合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞、例えば、(ヒト)真核細胞(例えば、標的細胞)上の細胞表面タンパク質の表面上に発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腎細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)脳細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)リンパ球(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)T細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)B細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)樹状細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)マクロファージ(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)NK細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腎臓細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(例えば、ヒト)癌細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に異種病原体に感染された(ヒト)細胞(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。
標的化リガンドによって標的化され得る好適であり、そのための標的化リガンド、例えば、抗体またはそれらの一部分が既に利用可能である、細胞表面タンパク質、例えば、細胞表面受容体は多数存在する。このような構造には、クラスIおよびクラスIIの主要組織適合性抗原、様々なサイトカインのための受容体(例えば、IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22、IL-25、IL-33などのための受容体)、細胞型特異的性病ホルモン、脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CTNF)、コロニー刺激成長因子、内皮成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経膠由来神経栄養因子、グリア細胞成長因子、gro-beta/mip 2、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、インターフェロン(α-IFN、β-IFN、γIFN、コンセンサスIFN)、インターロイキン(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14)、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、マクロファージ/単球走化性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化タンパク質2、血小板由来成長因子、幹細胞因子、形質転換成長因子、腫瘍壊死因子、血管内非成長因子、リポタンパク質(PRLRなどのさらなるまたは他のタイプ1膜貫通受容体、GCGRなどのG-タンパク質結合受容体、Nav1.7、ASIC1、またはASIC2などのイオンチャネルを含む)、細胞接着分子、アミノ酸などの代謝物質のための輸送分子、Bリンパ球またはTリンパ球の光源受容体(例えば、B細胞受容体および関連するタンパク質(例えば、CD19、CD20など)、ならびにT細胞受容体および関連するタンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8など)、テトラスパニンタンパク質(例えば、CD63)が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドは、ウイルスベクター複合体のための標的として分化細胞表面抗原に結合する標的化リガンドを用いることによって、細胞型の特異的感染を可能にする。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腎細胞、すなわち、肝臓特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)脳細胞、脳細胞特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)造血細胞、すなわち、造血細胞特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)T細胞、すなわち、T細胞特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)B細胞、すなわち、B細胞特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)樹状細胞、すなわち、樹状細胞特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)マクロファージ、すなわち、マクロファージ特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)NK細胞、すなわち、NK細胞特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腎細胞、すなわち、腎臓特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)膵臓細胞、すなわち、膵臓特異的マーカーによって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)腸細胞、すなわち、腸特異的マーカー(例えば、のみ)によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に(ヒト)癌細胞、すなわち、腫瘍関連抗原(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、主に異種病原体に感染された(ヒト)細胞(例えば、のみ)によって発現されるタンパク質に結合する。(1)細胞/組織/器官によって特異的に発現されるか、またはその発現が細胞/組織/器官中に濃縮され、(2)本明細書に記載の標的化リガンドとして有用な抗原結合タンパク質によって認識されるタンパク質は、よく知られており、www.proteinatlas.orgでも見ることができ、Uhlen et al.(2010)Nat.Biotech.28:1248-50(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい。以下の表2は、標的化リガンドとして有用であり得る抗原結合タンパク質が利用可能である例示的および非限定的な器官特異的マーカー、およびこのようなマーカーを発現する細胞/組織/器官を提供している。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)肝細胞、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体、例えば、hASGR1によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)脳細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)T細胞、例えば、CD3、例えば、CD3εによって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、例えば、(ヒト)腎細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、例えば、インテグリンなどの(ヒト)筋細胞によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、(ヒト)癌細胞、例えば、腫瘍関連抗原、例えば、E6およびE7によって発現される受容体に結合する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ヒトグルカゴン受容体(hGCGR)に結合する。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原に結合する。特定の腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、例えば、AFP、ALK、BAGEタンパク質、β-カテニン、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、炭酸脱水酵素IX、カスパーゼ-8、CCR5、CD19、CD20、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、サイクリン-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGEタンパク質(例えば、GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、グリピカン-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGEタンパク質(例えば、MAGE-1、-2、-3、-4、-6、および-12)、MART-1、メソセリン、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGEタンパク質、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、サバイビン、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ、およびウロプラキン-3が挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、免疫応答、例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20などに関連するCDマーカーに結合する。
本発明の一実施形態は、本発明の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造である。多量体構造は、本明細書に記載の特異的結合対の第1のメンバーを含む、少なくとも5つ、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも30個、最も好ましくは少なくとも60個の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む。これらは、定常ウイルスキャプシド(空のウイルス粒子)またはウイルスベクター(対象ヌクレオチドを封入するキャプシド)を形成することができる。ウイルス性ゲノムをパッケージングすることができるウイルスベクターの形成は、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドをウイルスベクターとして使用するための非常に好ましい特徴である。
本発明の一実施形態は、上記に記載のキャプシドタンパク質をコードする核酸である。核酸は、好ましくは、本特許請求の範囲の核酸を含むベクターである。核酸、特にベクターは、本発明のキャプシドタンパク質を組換え発現するために必要である。
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも1つの組換えウイルスキャプシドタンパク質および/またはこれらをコードする核酸、好ましくは、遺伝子導入ベクターの製造および遺伝子導入ベクターとしての使用のための少なくとも1つの多量体構造(例えば、ウイルスベクター)の使用である。
使用および作製方法
本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質のさらなる実施形態は、対象ヌクレオチド、例えば、レポーター遺伝子または治療遺伝子を標的細胞に送達するためのそれらの使用である。概して、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子(複数可)または治療遺伝子(複数可)と隣接する5’および3’逆位末端配列(ITR)配列を一般に含み得る導入プラスミドであり得る(これはAAVベクター内に包含される場合、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターの制御下であり得る)。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、5’~3’:5’ITR、プロモーター、遺伝子(例えば、レポーターおよび/または治療遺伝子)、および3’ITRを含む導入プラスミドである。
本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質のさらなる実施形態は、対象ヌクレオチド、例えば、レポーター遺伝子または治療遺伝子を標的細胞に送達するためのそれらの使用である。概して、対象ヌクレオチドは、レポーター遺伝子(複数可)または治療遺伝子(複数可)と隣接する5’および3’逆位末端配列(ITR)配列を一般に含み得る導入プラスミドであり得る(これはAAVベクター内に包含される場合、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターの制御下であり得る)。一実施形態では、対象ヌクレオチドは、5’~3’:5’ITR、プロモーター、遺伝子(例えば、レポーターおよび/または治療遺伝子)、および3’ITRを含む導入プラスミドである。
有用なプロモーターの非限定的な例としては、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、脾臓焦点形成ウイルス(SFFV)プロモーター、伸長因子1アルファ(EF1a)プロモーター(1.2kb EFlaプロモーター、または0.2kb EFlaプロモーター)、キメラEF 1a/IF4-プロモーター、およびホスホグリセロートキナーゼおよびホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターが挙げられる。内部エンハンサーはまた、対象となる遺伝子の発現を増加させるためにウイルス構築物中に存在し得る。例えば、CMVエンハンサー(Karasuyama et al.1989.J.Exp.Med.169:13(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を使用し得る。いくつかの実施形態では、CMVエンハンサーは、ニワトリβ-アクチンプロモーターと組み合わせて使用することができる。
様々なレポーター遺伝子(または検出可能部分)を、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造に封入することができる。例示的なレポーター遺伝子には、例えば、β-ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子がコード)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)、MmGFP、青色蛍光タンパク質(BFP)、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化型黄色蛍光タンパク質(eYFP)、Emerald、CyPet、シアン蛍光タンパク質(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の方法は、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子の使用を用いる標的化ベクターの構築を実証しているが、本開示を読んだ当業者であれば、本明細書に記載の非ヒト動物が、レポーター遺伝子の非存在下で、または当該技術分野で知られている任意のレポーター遺伝子を用いて生産され得ることを理解するであろう。
様々な治療遺伝子を、例えば、導入ベクターの一部として、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む多量体構造に封入することもできる。治療遺伝子の非限定的な例としては、毒素(例えば、自殺遺伝子)、治療抗体またはその断片、CRISPR/Casシステムまたはその一部分(複数可)、アンチセンスRNA、siRNA、shRNAなどをコードする治療遺伝子が挙げられる。
本発明のさらなる実施形態は、組換えキャプシドタンパク質の調製のためのプロセスであり、本方法は、
a)好適な条件下で組換えキャップシステムタンパク質をコードする核酸を発現する工程と、
b)工程a)の発現されたキャプシドタンパク質を単離する工程と、を含む。
a)好適な条件下で組換えキャップシステムタンパク質をコードする核酸を発現する工程と、
b)工程a)の発現されたキャプシドタンパク質を単離する工程と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルス粒子は、参照キャプシドタンパク質との特定の比率で、モザイクキャプシド、例えば、本明細書に記載の遺伝子改変されたキャプシドタンパク質を含む(例えば、標的化リガンドとの共有結合の存在または非存在下で)を含む。こうしたモザイクウイルス粒子を作製するための方法は、
a)好適な条件下で、組換えキャプシドタンパク質をコードする核酸および参照キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチドを1:1~10:1の比率(wt/wt)で発現することと、
b)工程a)の発現されたキャプシドタンパク質を単離することと、を含む。
a)好適な条件下で、組換えキャプシドタンパク質をコードする核酸および参照キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチドを1:1~10:1の比率(wt/wt)で発現することと、
b)工程a)の発現されたキャプシドタンパク質を単離することと、を含む。
一般に、本方法に従って形成されたモザイクキャプシドは、モザイクキャプシドを生成するのに使用されるモザイクキャプシドをコードする核酸の比率(wt:wt)と同様の改変キャプシドタンパク質:参照キャプシドタンパク質比を有すると考えられるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質(または参照キャプシドタンパク質の組み合わせ)を1:1~1:15の範囲の比率で含むか、または本明細書に記載の方法は、組換えウイルスキャプシドタンパク質および参照キャプシドタンパク質(または参照キャプシドタンパク質の組み合わせ)を1:1~1:15の範囲の比率で組み合わせる。いくつかの実施形態では、比率は1:2である。いくつかの実施形態では、比率は1:3である。いくつかの実施形態では、比率は1:4である。いくつかの実施形態では、比率は1:5である。いくつかの実施形態では、比率は1:6である。いくつかの実施形態では、比率は1:7である。いくつかの実施形態では、比率は1:8である。いくつかの実施形態では、比率は1:9である。いくつかの実施形態では、比率は1:10である。いくつかの実施形態では、比率は1:11である。いくつかの実施形態では、比率は1:12である。いくつかの実施形態では、比率は1:13である。いくつかの実施形態では、比率は1:14である。いくつかの実施形態では、比率は1:15である。
本発明のさらなる実施形態は、ウイルスの指向性を変更させるための方法であって、(a)異種アミノ酸配列をコードする核酸を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、異種アミノ酸配列を含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形成する工程と、および/または(b)ウイルスベクターの生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、パッケージング細胞が核酸を含む、培養する工程と、を含む、方法である。本発明のさらなる実施形態は、キャプシドタンパク質の表面上の標的化リガンドを提示するための方法であって、(a)核酸が特異的結合対の第1のメンバーを含むキャプシドタンパク質をコードする好適な条件下で、本明細書に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸(および任意選択的に、参照キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチドを含む)を発現する工程と、(b)工程(a)の特異的結合対の第1のメンバーを含む発現されたキャプシドタンパク質またはこれを含むキャプシドを単離する工程と、(c)第1のメンバーと第2のメンバーとの間のイソペプチド結合の形成を可能にするのに好適な条件下で、特異的結合対の第2の同族メンバーによりキャプシドタンパク質またはキャプシドをインキュベートする工程であって、特異的結合対の第2の同族メンバーが、標的化リガンドと融合される、工程と、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび/または導入プラスミドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、培養上清から自己相補的アデノ随伴ウイルスベクターを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、パッケージング細胞を溶解することと、一本鎖アデノ随伴ウイルスベクターを細胞溶解物から単離することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、(a)細胞片を除去することと、(b)ヌクレアーゼを有するウイルスベクター、例えば、DNase IおよびMgCl2を含有する上清を処理することと、(c)ウイルスベクターを濃縮することと、(d)ウイルスベクターを精製することと、(e)(a)~(d)の任意の組み合わせと、をさらに含む。
本明細書に記載のウイルスベクターの生成に有用なパッケージング細胞には、例えば、ウイルスに対して許容状態の動物細胞、もしくはウイルスに対して許容状態になるように改変された細胞、または例えば、リン酸カルシウムなどの形質転換剤の使用によるパッケージング細胞構築物が含まれる。本明細書に記載のウイルスベクターの生成に有用なパッケージング細胞株の非限定的な例としては、例えば、ヒト胚腎臓293(HEK-293)細胞(例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関[ATCC]番号CRL-1573)、SV40 Large T-抗原を含有するHEK-293細胞(HEK-293Tまたは293T)、HEK293T/17細胞、ヒト肉腫細胞株HT-1080(CCL-121)、リンパ芽球様細胞株ラージー(CCL-86)、上皮神経膠芽腫-星状細胞腫様細胞株U87-MG(HTB-14)、T-リンパ腫細胞株HuT78(TIB-161)、NIH/3T3細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)(例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096)、HeLa細胞(例えば、ATCC番号CCL-2)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例えば、ATCC番号CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC番号CCL10)、PC12細胞(ATCC番号CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC番号CRL1651)、RATI細胞、マウスL細胞(ATCC番号CCLI.3)、HLHepG2細胞、CAP細胞、CAP-T細胞などが挙げられる。
L929細胞、Cosset et al(1995)J Virol 69,7430-7436に概説されているFLYウイルスパッケージング細胞系、NS0(マウス骨髄腫)細胞、ヒト羊膜細胞(例えば、CAP、CAP-T)、酵母細胞(S.cerevisiae、Pichia pastorisを含むがこれらに限定されない)、植物細胞(タバコNTl、BY-2を含むがこれらに限定されない)、昆虫細胞(SF9、S2、SF21、Tni(例えば、High5)を含むがこれらに限定されない)、または細菌細胞(E.coliを含むがこれに限定されない)。
さらなるパッケージング細胞およびシステム、核酸ゲノムをシュードタイプ化ウイルスベクターにパッケージングするためのパッケージング技術およびベクターについては、例えば、Polo,et al,Proc Natl Acad Sci USA,(1999)96:4598-4603を参照されたい。パッケージングの方法には、ウイルス成分を永久的に発現するパッケージング細胞を使用すること、または細胞をプラスミドで過渡的にトランスフェクトすることが含まれる。
さらなる実施形態には、ウイルスを再配向する方法、および/またはレポーターもしくは治療遺伝子を標的細胞に送達する方法が含まれ、本方法は、細胞を生体外または生体内で形質導入するための方法を含み、本方法は、本明細書に記載のキャプシドを含むウイルスベクターと標的細胞を接触させる工程を含み、キャプシドは、標的細胞によって発現される受容体に特異的に結合する標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は生体外にある。他の実施形態では、標的細胞は、対象、例えばヒトの生体内にある。
標的細胞
本明細書に開示される組換えウイルスベクターを使用して、対象ヌクレオチドを送達するために、多種多様な細胞を標的化することができる。標的細胞は、一般に、対象ヌクレオチドおよび所望の効果に基づいて選択されるであろう。
本明細書に開示される組換えウイルスベクターを使用して、対象ヌクレオチドを送達するために、多種多様な細胞を標的化することができる。標的細胞は、一般に、対象ヌクレオチドおよび所望の効果に基づいて選択されるであろう。
いくつかの実施形態では、対象ヌクレオチドは、標的細胞を送達して、酵素欠損症、ならびにX連鎖重症複合免疫不全などの免疫力低下などの生物体の欠損を回復させるタンパク質を生成することができるようにし得る。したがって、いくつかの実施形態では、通常は、動物のタンパク質を生成する細胞が標的化される。他の実施形態では、タンパク質が最も有益である領域内の細胞が標的化される。
他の実施形態では、siRNAをコードする遺伝子などの対象ヌクレオチドは、標的細胞内の特定の遺伝子の発現を阻害し得る。対象ヌクレオチドは、例えば、病原体ライフサイクルに関与する遺伝子の発現を阻害し得る。したがって、病原体から感染しやすいか、または病原体により感染された細胞が標的化され得る。他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、標的細胞中の毒素の生成に関与する遺伝子の発現を阻害し得る。
他の実施形態では、対象ヌクレオチドは、それが発現される細胞を殺傷する毒性タンパク質をコードし得る。この場合、腫瘍細胞または他の不要な細胞が標的化され得る。
さらに他の実施形態では、治療用タンパク質をコードする対象ヌクレオチド。
対象ヌクレオチドの発現が所望される標的細胞の特定の集団が同定されると、標的細胞の集団上で特異的に発現される標的受容体が選択される。標的受容体は、細胞の集団に対してのみ発現され得るか、または他の細胞の集団に対するよりもこの細胞の集団に対してより大きい程度に発現され得る。発現が特異的になるにつれて、送達が標的細胞に対してより特異的に配向され得る。文脈に応じて、マーカーの(およびしたがって、遺伝子送達の)の特異性の所望の量は変化し得る。例えば、毒性遺伝子を導入するためには、非標的細胞を殺傷することを避けるために高い特異性が最も好ましい。収穫するためのタンパク質の発現、またはグローバルな影響が所望される分泌生成物の発現については、より少ないマーカー特異性が必要とされ得る。
上記に考察されるように、標的受容体は、標的化リガンドを同定または作成することができる任意の受容体であり得る。好ましくは、標的受容体は、受容体などのペプチドまたはポリペプチドである。しかしながら、他の実施形態では、標的受容体は、結合パートナーによって認識され得る炭水化物または他の分子であり得る。標的受容体のための結合パートナー(例えば、リガンド)が既に知られている場合、それは親和性分子として使用され得る。しかしながら、結合分子が不明である場合、標準的な手順を使用して標的受容体に対する抗体を生成することができる。次に、抗体を標的化リガンドとして使用することができる。
したがって、標的細胞は、例えば、(1)特定の用途(例えば、治療、回収されるタンパク質の発現、および疾患抵抗の付与)および(2)所望の量の特異性を有するマーカーの発現を含む、様々な因子に基づいて選択され得る。
標的細胞は、いかなる方法でも限定されず、生殖系列細胞および細胞株ならびに体細胞および細胞株の両方を含む。標的細胞は、いずれかの起源由来の幹細胞であり得る。標的細胞が生殖系列細胞である場合、標的細胞は、好ましくは、単細胞胚および胚幹細胞(ES)からなる群から選択される。
医薬組成物、剤形、および投与
さらなる実施形態は、少なくとも1つの組換えウイルスキャプシドタンパク質、および本発明による適切な標的化リガンド、ならびに/または本発明による核酸を含む、医薬品を提供する。好ましくは、こうした医薬品は、遺伝子導入粒子に有用である。
さらなる実施形態は、少なくとも1つの組換えウイルスキャプシドタンパク質、および本発明による適切な標的化リガンド、ならびに/または本発明による核酸を含む、医薬品を提供する。好ましくは、こうした医薬品は、遺伝子導入粒子に有用である。
本明細書に記載のウイルス粒子、および薬学的に許容可能な担体および/または賦形剤を含む医薬組成物も本明細書に開示する。追加的に、本明細書に記載のウイルス粒子を含む医薬剤形を本明細書に開示する。
本明細書で考察されるように、本明細書に記載のウイルス粒子は、様々な治療用途(生体内および生体外で)のために、また研究ツールとして使用することができる。
本明細書に開示されるウイルス粒子に基づく医薬組成物は、1つ以上の生理学的に許容可能な担体および/または賦形剤を使用して、任意の従来的な方法で製剤化され得る。ウイルス粒子は、投与するために、例えば、注射、吸入、もしくは単離によって(口もしくは鼻のいずれかを通して)、または経口、口腔内、非経口、もしくは直腸内投与によって、または腫瘍に直接投与することによって処方され得る。
医薬組成物は、全身投与、局所投与、または局在化投与を含む、様々な投与様式のために製剤化され得る。技術および製剤は、例えば、Remrnington’s Pharmaceutical Sciences,Meade Publishing Co.,Easton,Paに見られ得る。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む、注射が好ましい。注射のために、医薬組成物は、好ましくは、ハンク溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液で、液体溶液中に製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、固体形態で製剤化され得、使用直前に再溶解または懸濁され得る。医薬組成物の凍結乾燥形態も好適である。
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例えば、ラクトース、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ)、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に従来的な手段によって調製される、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤はまた、当該技術分野でよく知られている方法によって被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとり得るか、または使用前に水もしくは他の好適な媒体を含む構成のために乾燥生成物として提示され得る。このような液体調製物は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂)、乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)、非水性媒体(例えば、ationd油、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油)、および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)などの薬学的に許容可能な添加剤を用いた従来的な手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含むことができる。
医薬組成物は、注射によって、例えば、ボーラス注射または連続注入によって、非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、任意選択的に添加された防腐剤を用いて、例えば、アンプルまたは多用量容器内で単位剤形で提示することができる。医薬組成物は、油性媒体または水性媒体中に懸濁液、溶液、または乳濁液として製剤化することができ、また懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤を含む、他の薬剤を含有し得る。
追加的に、医薬組成物は、デポ調製として製剤化することもできる。これらの長時間作用する製剤は、移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、好適な高分子もしくは疎水性材料(例えば、許容可能な油中の乳濁液として)またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。他の好適な送達システムには、長期間にわたる薬物の局所的な非浸潤性送達の可能性を提供するマイクロスフェアが含まれる。この技術には、炎症または虚血を引き起こすことなく、冠動脈カテーテルを介して器官の任意の選択される部分に注射することができる前毛細血管サイズを有するマイクロスフェアが含まれ得る。投与された治療薬は、マイクロスフェアから徐々に放出され、選択される組織中に存在する周囲細胞によって吸収される。
全身投与は、経粘膜的手段または経皮的手段によっても可能である。経粘膜的投与または経皮的投与については、浸透するためのバリアに適切な浸透剤が製剤中に使用される。こうした浸透剤は、一般に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜的投与、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。加えて、洗剤を使用して浸透を促進し得る。経粘膜的投与は、鼻腔内噴霧または座薬を使用して生じ得る。局所投与のために、本明細書に記載のウイルス粒子は、当該技術分野で一般に知られている、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。治癒を加速させるために、洗浄溶液を局所的に使用して損傷または炎症を治療することもできる。
注射可能な使用に好適な医薬品形態には、滅菌水溶液または分散液、ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤、滅菌注射溶溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれ得る。すべての場合において、医薬品形態は、滅菌される必要があり、かつ流体である必要がある。また、製造条件および特定の保存パラメータ(例えば、冷却および凍結)の条件下で安定している必要があり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される必要がある。
本明細書に開示される製剤が対象における免疫応答を促進する治療剤として使用される場合、治療剤は、中性または塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基で形成される)であって、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸などで形成される、酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基などにも由来し得る。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆の使用によって、分散の場合は必要な粒子径の維持によって、かつ界面活性剤の使用の場合によって維持することができる。微生物の作用の防止は、当該技術分野で知られている様々な抗菌剤および抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤の組成物、例えば、アルミニウムモノステアリン酸およびゼラチン使用によってもたらされ得る。
滅菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙されている様々な他の成分を用いて、活性化合物または構築物を適切な溶媒中に必要な量で組み込むことによって調製することができ、その後に濾過滅菌を行う。
処方の際、溶液は、投与製剤と適合する方法で、かつ治療上有効な量で投与され得る。製剤は、上記に記載の注射可能な溶液のタイプなど、様々な剤形で容易に投与されるが、徐放性カプセルまたはマイクロ粒子およびマイクロスフェアなども用いることができる。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を好適に緩衝化し、最初に液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースと等張させるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に好適である。この文脈では、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には分かるであろう。例えば、1mlの等張性NaCl溶液中に1回分の用量を溶解し、1000mlの皮下注入流体に添加するか、または提案される注入部位に注射することができる。
投与に責任を有する人物は、いずれの場合でも、個々の対象に対する適切な用量を決定するであろう。例えば、対象は、病原性微生物に対する、または対象の条件(例えば、癌)に対する必要性もしくは曝露に応じて、ある期間の間毎日もしくは毎週、または月1回、年2回、もしくは年1回、本明細書に記載のウイルス粒子を投与され得る。
静脈内、腫瘍内、皮下、または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化される化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態には、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体、リポソーム製剤、徐放性カプセル、生分解性形態、および現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
また、鼻腔内もしくは吸入可能な溶液もしくは噴霧、エアロゾル、または吸入剤も使用し得る。鼻腔溶液は、ドロップまたは噴霧中の鼻腔通路に投与するように設計された水溶液であり得る。鼻腔溶液は、鼻の分泌に多くの点で類似しているように調製され得る。したがって、水性の鼻腔溶液は、通常、等張性であり、わずかに緩衝化されて、pH5.5~7.5を維持する。加えて、必要に応じて、眼科調製物および適切な薬物安定剤に使用されるものと類似した抗菌防腐剤を製剤に含めることができる。様々な市販の鼻腔調製物が知られており、例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤を含むことができ、喘息予防のために使用される。
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムとしての賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または粉末の形態をとる。特定の定義された実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体を含むか、または硬質もしくは軟質のシェルゼラチンカプセルで囲まれ得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または食事の食品により直接組み込まれ得る。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤により組み込まれ得、摂取性錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で使用され得る。
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下:トラガントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンとしての結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、およびスクロース、ラクトース、もしくはサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ油、イチャクソウの油、もしくはチェリー香味料などの香味剤を含有し得る。投薬単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体が含有され得る。様々な他の材料が被覆として、または別様に、投薬単位の物理的形態を変更するために存在し得る。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、シェラック、糖、またはそれらの両方で被覆され得る。エリキシル剤のシロップは、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、ならびにチェリーまたはオレンジ風味などの香味剤を含有し得る。
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、方法および組成物と併用するためのキットに関する場合がある。キットはまた、好適な容器、例えば、バイアル、チューブ、ミニチューブもしくはマイクロチューブ、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器も含み得る。さらなる構成要素または薬剤が提供される場合、キットは、この薬剤または構成要素が配置され得る1つ以上のさらなる容器を含み得る。本明細書のキットはまた、典型的には、ウイルス粒子および市販のための密封閉じ込めにおける任意の他の試薬容器を含む手段を含むであろう。こうした容器は、所望のバイアルが保持される注射またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。任意選択的に、記載されている組成物のためには、例えば、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗真菌もしくは抗菌剤、または抗腫瘍剤などの1つ以上のさらなる活性薬剤が必要とされ得る。
本明細書に開示されている組成物は、当該技術分野で知られている任意の手段によって投与することができる。例えば、組成物は、静脈内、腫瘍内、皮内、動脈内、腹腔内、傷害内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、腟内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、髄腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内に、経口で、局所的に、吸入、注射、注入、持続注入、局在化灌流での、カテーテル、洗浄を介した、クリーム、または脂質組成物中での、対象への投与を含み得る。
当業者に知られている任意の方法は、本明細書に記載のウイルス粒子、パッケージング細胞、および粒子構築物の大規模生成に使用され得る。例えば、マスターおよびワーキングシードストックは、適した主要CEFにおけるGMP条件下で、または他の方法によって調製され得る。パッケージング細胞は、大きな表面積のフラスコにプレーティングして、ほぼ合流点まで成長させ、ウイルス粒子を精製し得る。細胞を収穫し、単離および精製された培養培地中にウイルス粒子を放出し得るか、または機械的破損によって細胞内ウイルス粒子を放出することができる(細胞片は、大孔深度濾過およびエンドヌクレアーゼで消化された宿主細胞DNAによって除去することができる)。ウイルス粒子を、その後精製し、接線流濾過によって濃縮し、その後透析濾過し得る。得られた濃縮バルクを、安定化剤を含有する緩衝液で希釈することによって製剤化し、バイアルに充填し、凍結乾燥し得る。組成物および製剤は、後で使用するために保存され得る。使用のために、凍結乾燥ウイルス粒子を、希釈剤を添加することによって再構成することができる。
併用療法で使用される特定のさらなる薬剤を、当該技術分野で知られている任意の手段によって製剤化および投与することができる。
本明細書に開示されている組成物は、アルミニウム塩および他の鉱物アジュバント、テンソ活性剤、細菌誘導体、媒体、およびサイトカインなどのアジュバントも含み得る。アジュバントはまた、拮抗免疫調節特性を有し得る。例えば、アジュバントは、Th1免疫性またはTh2免疫性を刺激することができる。本明細書に開示されている組成物および方法はまた、アジュバント療法を含み得る。
これらの実施例は、例示のためだけに提供されており、本発明の範囲を制限することを意図していない。
材料および方法
細胞株および抗体
293個の細胞株すべてを、10%のFBS、1%のPen/Strep、および1%のL-グルタミンを補充したDMEM中に維持した。対応するcDNAを発現するベクターにより、親293細胞株をレンチウイルス形質導入することによって、293 hErbB2および293hASGR1/2細胞株を生成した。すべての細胞株を、Regeneron TCコア施設から得た。B1抗体は、AAV VP1、VP2、およびVP3によって共有される直鎖状エピトープを認識する。
細胞株および抗体
293個の細胞株すべてを、10%のFBS、1%のPen/Strep、および1%のL-グルタミンを補充したDMEM中に維持した。対応するcDNAを発現するベクターにより、親293細胞株をレンチウイルス形質導入することによって、293 hErbB2および293hASGR1/2細胞株を生成した。すべての細胞株を、Regeneron TCコア施設から得た。B1抗体は、AAV VP1、VP2、およびVP3によって共有される直鎖状エピトープを認識する。
AAVキャプシドタンパク質構築物
所望のSpyTag挿入、隣接するリンカーアミノ酸、およびさらなる変異をコードするGeneBlockを、IDTから購入し、製造業者のプロトコル(NEB)に従ってGibson Assemblyを使用して、BsiWIおよびXcmIで消化されたpAAV2-CAP wtまたはpAAV9-CAP wtにクローニングした。
所望のSpyTag挿入、隣接するリンカーアミノ酸、およびさらなる変異をコードするGeneBlockを、IDTから購入し、製造業者のプロトコル(NEB)に従ってGibson Assemblyを使用して、BsiWIおよびXcmIで消化されたpAAV2-CAP wtまたはpAAV9-CAP wtにクローニングした。
SpyCatcherへの抗体への融合
SpyCatcherをコードするGeneBlockをIDTから購入し、Gibson Assemblyを使用して、可撓性アミノ酸リンカーGSGESG(配列番号48)によって分離される各構築物のC末端におけるscFvまたは抗体重鎖の発現プラスミドへとコード配列をフレーム単位でクローニングした。
SpyCatcherをコードするGeneBlockをIDTから購入し、Gibson Assemblyを使用して、可撓性アミノ酸リンカーGSGESG(配列番号48)によって分離される各構築物のC末端におけるscFvまたは抗体重鎖の発現プラスミドへとコード配列をフレーム単位でクローニングした。
AAVウイルスベクターの調製
以下のプラスミド:pAdヘルパー、レポータータンパク質をコードするAAV2 ITR含有ゲノムプラスミド、およびAAV RepおよびCap遺伝子をコードするpAAV-CAPプラスミドであって、scFvまたは抗体の重鎖および軽鎖のいずれかをコードするさらなるプラスミドを有するか、または有しないプラスミドによりPEI Proを使用して293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってウイルスを生産した。scFvおよび抗体重鎖構築物は、すべて、上記に記載のC末端でSpyCatcherに融合されている。OptiMEMにおいてトランスフェクトを行い、8時間後に培地を、10%のFBS、1%のPen/Strep、および1%のL-Glutを補充したDMEMに変更した。
以下のプラスミド:pAdヘルパー、レポータータンパク質をコードするAAV2 ITR含有ゲノムプラスミド、およびAAV RepおよびCap遺伝子をコードするpAAV-CAPプラスミドであって、scFvまたは抗体の重鎖および軽鎖のいずれかをコードするさらなるプラスミドを有するか、または有しないプラスミドによりPEI Proを使用して293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってウイルスを生産した。scFvおよび抗体重鎖構築物は、すべて、上記に記載のC末端でSpyCatcherに融合されている。OptiMEMにおいてトランスフェクトを行い、8時間後に培地を、10%のFBS、1%のPen/Strep、および1%のL-Glutを補充したDMEMに変更した。
トランスフェクトされたパッケージング細胞を、37℃で3日間インキュベートし、次に、標準的凍結解凍プロトコルを使用して細胞溶解物からウイルスを回収した。簡潔に言うと、パッケージング細胞を、分解およびペレット化することによって持ち上げた。上清を除去し、50mMのTris-HCl、150mMのNaCl、および2mMのMgCl2[pH8.0]の溶液中に細胞を再懸濁した。ドライアイス/エタノール浴と37℃の水浴との間で激しく攪拌しながら細胞懸濁液をシャットリングすることからなる3つの連続する凍結解凍サイクルを介した細胞溶解によって、細胞内ウイルス粒子を放出させた。EMD Millipore Benzonase(50U/mlの細胞溶解物)により時々混合しながら37℃で60分間溶解物を処理することによって、粘土を減少させた。次に、細胞片を遠心単離によってペレット化し、得られた上清を、0.22μmのPVDF Millex-GVフィルターを通して、Ultracel-100膜(100KDaのMWCO)フィルターカートリッジを有するAmicon Ultra-15遠心フィルターユニットの上部チャンバー内に直接濾過した。フィルターユニットを、上部チャンバー内で所望の体積に達するまで5~10分間隔で遠心単離し、次に、濃縮粗ウイルスを低タンパク質結合管にピペッティングし、4Cで保存した。力価(ミリリットル当たりのウイルス性ゲノム vg/mL)を、既知の濃度のウイルスの標準曲線を使用してqPCRによって決定した。
細胞感染/形質導入およびフローサイトメトリー分析
細胞に感染させるために、培養中の細胞の培地にウイルス粒子を直接加え、混合物を37℃で一晩インキュベートした。各ウェル中の培地を24時間後に置換し、細胞を5日間インキュベートした。感染後5日目に、細胞をトリプシン処理し、2%のFBSによりPBS中に再懸濁し、GFP+細胞のパーセンテージをBD FACSCantoフローサイトメトリー上で回収し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
細胞に感染させるために、培養中の細胞の培地にウイルス粒子を直接加え、混合物を37℃で一晩インキュベートした。各ウェル中の培地を24時間後に置換し、細胞を5日間インキュベートした。感染後5日目に、細胞をトリプシン処理し、2%のFBSによりPBS中に再懸濁し、GFP+細胞のパーセンテージをBD FACSCantoフローサイトメトリー上で回収し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
ウエスタンブロット解析
SpyTag付きタンパク質VP1、VP2、およびVP3と、SpyCatcherタグ付き抗体またはscFvとの間の反応を、ウエスタンブロット分析によって観察した。還元剤を含むNovex(登録商標)トリス-グリシンSDS試料緩衝液を、等体積の粗ウイルス調製物に加え、試料を85℃まで5分間加熱し、次に、室温まで冷却し、プレキャスト4~12%のトリス-グリシンゲル(Invitrogen)に装填した。タンパク質を還元SDS-PAGEによって分離し、湿潤導入を介してPVDF上にブロットした。膜を、Li-Cor Odyssey TBSブロッキング緩衝液でブロッキングし、マウスモノクロ-ナルB1抗体(ARP American Research Products,Inc.)でプローブして、4℃で一晩、TBST中に1:100で希釈した。ブロットをTBSTで洗浄し、赤外線接合抗マウス二次抗体でプローブし、the Li-Cor Odyssey上で撮像した。
SpyTag付きタンパク質VP1、VP2、およびVP3と、SpyCatcherタグ付き抗体またはscFvとの間の反応を、ウエスタンブロット分析によって観察した。還元剤を含むNovex(登録商標)トリス-グリシンSDS試料緩衝液を、等体積の粗ウイルス調製物に加え、試料を85℃まで5分間加熱し、次に、室温まで冷却し、プレキャスト4~12%のトリス-グリシンゲル(Invitrogen)に装填した。タンパク質を還元SDS-PAGEによって分離し、湿潤導入を介してPVDF上にブロットした。膜を、Li-Cor Odyssey TBSブロッキング緩衝液でブロッキングし、マウスモノクロ-ナルB1抗体(ARP American Research Products,Inc.)でプローブして、4℃で一晩、TBST中に1:100で希釈した。ブロットをTBSTで洗浄し、赤外線接合抗マウス二次抗体でプローブし、the Li-Cor Odyssey上で撮像した。
実施例1 残基N587でAAV2キャプシドに挿入されたペプチドに対するscFvのコンジュゲートは、抗原特異的標的化を配向する
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
上記に記載のウイルス粒子でインキュベートされた細胞を、感染のためのフローサイトメトリー分析によって評価した。
ヘパリン結合変異(HBM)R585AおよびR588Aを保有するAAV2、ならびにキャプシド位置N587におけるSpyTagペプチドを、C6.5-SpyCatcher、HER2に結合するscFvの存在下または非存在下で生成し、そのC末端でSpyCatcherに融合させる。HER2的化scFvに接合されたAAV2は、HER2+細胞に特異的に感染し、HER2-細胞の背景感染は非常に少ない。図1
実施例2 残基N587においてAAV2キャプシドに挿入されたペプチドへの抗体の結合は、抗原特異的な標的化を配向する
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
HER2に結合する抗体である、SpyCatcher-Herceptinをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、野生型AAV2およびヘパリン結合変異(HBM)R585AおよびR588Aを保有するAAV2、ならびにキャプシド位置N587におけるSpyTagペプチドを生成し、重鎖のC末端でSpyCatcherに融合させる。上記に記載のウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を観察した。HER2標的化抗体に接合されたAAV2は、HER2+細胞に特異的に感染し、HER2-細胞の背景感染は非常に少ない。図2
実施例3 残基G453においてAAV2キャプシドに挿入されたペプチドへの抗体の接合は、抗原特異的標的化を配向する
残基N587およびG453は、それぞれ、ビリオン表面から離れて延在するタンパク質スパイクを形成するAAV2キャプシドの露出された領域上にある。残基は2つの異なるスパイク上にあるため、残基G453の後に挿入されたSpyTagが残基N587の後に挿入されたSpyTagと同じように機能するかどうかを調査した。以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
残基N587およびG453は、それぞれ、ビリオン表面から離れて延在するタンパク質スパイクを形成するAAV2キャプシドの露出された領域上にある。残基は2つの異なるスパイク上にあるため、残基G453の後に挿入されたSpyTagが残基N587の後に挿入されたSpyTagと同じように機能するかどうかを調査した。以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
HER2に結合する抗体である、SpyCatcher-Herceptinをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、野生型AAV2およびヘパリン結合変異(HBM)R585AおよびR588Aを保有するAAV2、ならびにキャプシド位置G453におけるSpyTagペプチドを生成し、重鎖のC末端でSpyCatcherに融合させる。SpyTag発現キャプシドをHBMキャプシドと混合することによって、ウイルスをモザイクとして生成した。上記に記載のウイルス粒子を感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を観察した。HER2標的化抗体に接合されたAAV2は、HER2+細胞に特異的に感染し、HER2-細胞の背景感染は非常に少ない。図3
実施例4 scFvによるAAVビリオンの改変を増加させると、それらの感染性が減少する
SpyTag-SpyCatcher反応の効率を最適化するための試みにおいて、ペプチドタグを各側上の可撓性リンカーアミノ酸に隣接させることによって、ウイルス表面上のSpyTagの送達性が改善された。リンカー長の増加に隣接するN587 SpyTag挿入変異体のパネルを生成し、HER2に結合するscFvである、C6.5-SpyCatcherの存在下または非存在下で、これらのAAV2 Rep-Cap構築物を使用してウイルスを調製し、そのC末端でSpyCatcherに融合させる。SpyTag付きAAV2タンパク質VP1、VP2、およびVP3とSpyCatcher-タグ付きC6.5との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、SpyCatcher-タグ付きscFvと反応したSpyTag付きキャプシドタンパク質は、SDS-PAGEによるサイズの増加を示す。上記に記載のウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を測定した。
SpyTag-SpyCatcher反応の効率を最適化するための試みにおいて、ペプチドタグを各側上の可撓性リンカーアミノ酸に隣接させることによって、ウイルス表面上のSpyTagの送達性が改善された。リンカー長の増加に隣接するN587 SpyTag挿入変異体のパネルを生成し、HER2に結合するscFvである、C6.5-SpyCatcherの存在下または非存在下で、これらのAAV2 Rep-Cap構築物を使用してウイルスを調製し、そのC末端でSpyCatcherに融合させる。SpyTag付きAAV2タンパク質VP1、VP2、およびVP3とSpyCatcher-タグ付きC6.5との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、SpyCatcher-タグ付きscFvと反応したSpyTag付きキャプシドタンパク質は、SDS-PAGEによるサイズの増加を示す。上記に記載のウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を測定した。
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
pAAV2-CAP N587 リンカー SpyTag構築物は、以下を含む。
pAAV2-CAP N587 リンカー1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー10 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー10 SpyTag HBM
SpyTagがリンカーアミノ酸に隣接していない場合、VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv複合体は、ウエスタンブロッティングによって検出不能であり、ウイルスは、HER2+細胞の低レベルの特異的形質導入を達成した。図4。リンカー長が増加する(1~6つのアミノ酸)につれて、VP-SpyTag-SpyCatcher-scFv複合体は、ウエスタンブロッティングを介して検出可能となり始め、ウイルスの形質導入効率が増加した。図4。しかしながら、SpyTagが2つの最も長いリンカー(8~10個のアミノ酸)に隣接したとき、ほぼすべてのVPタンパク質がウエスタンブロッティングによってSpyCatcher-Vhと反応したが、これらの完全に装飾されたウイルスは、もはや効率的に細胞を形質導入しなかった。図4。したがって、scFvによるAAV粒子の過剰な改変は、標的細胞を形質導入する能力にとって有害であり、かつウイルスを標的細胞に再標的化するためには、少数の接合scFvのみが必要であると分かった。
実施例5 抗体によるAAVビリオンの改変の増加は、その感染性を減少させる
リンカー長の増加に隣接するN587 SpyTag挿入変異のパネルを使用して、HER2に結合する抗体である、SpyCatcher-Herceptinをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、これらのAAV2 Rep-Cap構築物を使用してウイルスを調製し、重鎖のC末端でSpyCatcherに融合させる。SpyTag付きAAVタンパク質VP1、VP2、およびVP3とSpyCatcher-タグ付きHerceptin重鎖(Vh)との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、SpyCatcher-タグ付き抗体と反応したSpyTag付きキャプシドタンパク質は、SDS-PAGEによるサイズの移行を示すであろう。
リンカー長の増加に隣接するN587 SpyTag挿入変異のパネルを使用して、HER2に結合する抗体である、SpyCatcher-Herceptinをコードする抗体の重鎖および軽鎖の存在下または非存在下で、これらのAAV2 Rep-Cap構築物を使用してウイルスを調製し、重鎖のC末端でSpyCatcherに融合させる。SpyTag付きAAVタンパク質VP1、VP2、およびVP3とSpyCatcher-タグ付きHerceptin重鎖(Vh)との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、SpyCatcher-タグ付き抗体と反応したSpyTag付きキャプシドタンパク質は、SDS-PAGEによるサイズの移行を示すであろう。
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
pAAV2-CAP N587 リンカー SpyTag構築物は、以下を含む。
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー10 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー1 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー2 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー4 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー6 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー8 SpyTag HBM
pAAV2-CAP N587 リンカー10 SpyTag HBM
SpyTagがリンカーアミノ酸に隣接していないか、または非常に短いアミノ酸に隣接している場合、VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体は、ウエスタンブロッティングによって検出されなかったが、ウイルスは、野生型レベルに近い効率でHER2+細胞に特異的に感染した。図5。逆に、SpyTagがより長いリンカー(6つ以上のアミノ酸)に隣接する場合、ほぼすべてのVPタンパク質が、ウエスタンブロッティングによってSpyCatcher-Vhと反応したが、これらの完全に装飾されたウイルスは、もはや感染しなかった。図5。抗体によるAAV粒子の改変の増加は、標的細胞を形質導入する能力にとって有害であり、かつウイルスを標的細胞に再標的化するためには、少数の接合抗体のみが必要である。
実施例6 モザイク性は、ウイルス粒子の形質導入効率を調節する
長い可撓性リンカーは、SpyCatcher-融合scFvとのSpyTag付きAAVキャプシドの効率的な反応を可能にするが、scFvによるAAV粒子の過剰改変は、標的細胞を形質導入するそれらの能力にとって有害であるため、各ビリオン上のSpyTagの数が減少される一方で、すべてがR585A R588Aヘパリン結合変異(HBM)を保有する、非SpyTag付きキャプシド構築物との高度に反応性のSpyTag付き構築物の異なる比率の混合物であるモザイクAAV粒子を生産することによって、SpyTagの送達性および効率的な反応性が維持された。以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
長い可撓性リンカーは、SpyCatcher-融合scFvとのSpyTag付きAAVキャプシドの効率的な反応を可能にするが、scFvによるAAV粒子の過剰改変は、標的細胞を形質導入するそれらの能力にとって有害であるため、各ビリオン上のSpyTagの数が減少される一方で、すべてがR585A R588Aヘパリン結合変異(HBM)を保有する、非SpyTag付きキャプシド構築物との高度に反応性のSpyTag付き構築物の異なる比率の混合物であるモザイクAAV粒子を生産することによって、SpyTagの送達性および効率的な反応性が維持された。以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
pAAV2-CAP N587 リンカー10 SpyTag HBMとpAAV2-CAP R585A R588Aプラスミドとの間の比率は、トランスフェクション混合中、純粋なpAAV2-CAP N587 リンカー10 SpyTag HBMビリオンを表す1:0(4ug:0ug)、3:1(3ug:1ug)、1:1(2ug:2ug)、または1:3(1ug:3ug)のいずれかであった。pAAV2-CAP G453 リンカー10 SpyTag HBMと、pAAV2-CAP R585A R588Aプラスミドとの間の比率は、トランスフェクション混合中、純粋なpAAV2-CAP G453 リンカー10 SpyTag HBMビリオンを表す1:0(4ug:0ug)、1:3(1ug:3ug)、または1:7(0.5ug:3.5ug)のいずれかであった。SpyTag付きAAVタンパク質VP1、VP2、およびVP3とSpyCatcher-タグ付き抗HER scFvまたはSpyCatcher-tag付きHerceptin重鎖(Vh)との間の反応を、ウエスタンブロッティングによって観察し、SpyCatcher-タグ付きscFvまたは抗体と反応したSpyTag付きキャプシドタンパク質は、SDS-PAGEによるサイズの移行を示すであろう。SpyCathcer抗HER2 scFvとのN587 SpyTag リンカーパネルの反応を図6に示す。SpyCathcer抗HER2抗体とのN587 SpyTagリンカーパネルの反応を図7に示す。上記に記載のモザイクウイルス粒子に感染した細胞を、フローサイトメトリー分析によって評価し、形質導入を測定した図6~7。高度に反応性のあるリンカー10に隣接するSpyTagキャプシドの量が減少し、非SpyTag付きキャプシドの数が増加するにつれて、ウエスタンブロッティングによってVP-SpyTag-SpyCatcher-scFv複合体の量の減少が観察され、これはウイルスの形質導入効率の増加と結び付いた図6~7。ビリオンを装飾する抗体数と再標的化ウイルスによる形質導入効率との間に逆の関係が実証された。
SpyCatcher-抗HER2抗体とのG453 SpyTag HBMおよびG453 リンカー10 SpyTag HBMの反応を図8に示す。G453におけるSpyTag挿入の両方が、SpyTag単独またはリンカー10に隣接するSpyTagのいずれかにおいて、ウエスタンブロッティングによって測定されるようにSpyCatcher-tag付きHerceptinと非常に効率的に反応し、これは、G453挿入部位はリンカーアミノ酸に隣接しない限り容易に反応しない、N587よりも天然に送達性が高いことを示唆している。N587リンカーパネルで観察されたように、ウイルスがSpyCatcher-Herceptin抗体によって重度に改変されたとき、ウイルスはもはや感染しなかった。したがって、抗体によるAAV粒子の高レベルの改変は、標的細胞を形質導入する能力にとって有害であり、G453の後に挿入されたSpyTagは、N587に挿入されたSpyTagよりも天然に送達性が高いことが分かる。
実施例7 さらなる抗体標的対と共にSpyTag-SpyCatcherシステムを使用して、生体外で特異的標的化を達成することができる
AAVをHER2以外の標的に再標的化するSpyTag-SpyCatcher手法の能力を調査した。さらなる細胞表面タンパク質を標的化するSpyCatcherタグ付き抗体をクローニングし、SpyTag付きAAVをこれらの追加の標的を発現する細胞タイプに再標的化するこれらの抗体の能力を調査した。ASGR1およびCD63を標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
AAVをHER2以外の標的に再標的化するSpyTag-SpyCatcher手法の能力を調査した。さらなる細胞表面タンパク質を標的化するSpyCatcherタグ付き抗体をクローニングし、SpyTag付きAAVをこれらの追加の標的を発現する細胞タイプに再標的化するこれらの抗体の能力を調査した。ASGR1およびCD63を標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
PTPRNを標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
ENTPD3およびCD20を標的化する実験において、以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
ヒトタンパク質ASGR1、CD63、PTPRN、ENTPD3、およびCD20を認識する抗体重鎖および軽鎖をコードするSpyCatcher-VhおよびVkプラスミドを試験した。少数の露出したSpyTagを有するモザイクAAV粒子を生産するために、SpyTagおよび非SpyTag付きプラスミドは、抗体を使用してAAVを再標的化するためのSpyTagと非SpyTagキャプシドとの理想的な比率であることが以前に決定された、1:7の比率でトランスフェクション混合中に存在した。ASGR1、CD63、またはPTPRNを発現する細胞を、上記に記載のモザイクAAV2粒子に感染させ、フローサイトメトリーによって形質導入を測定した。ASGR1、CD63、およびPTPRN特異的抗体に接合したAAV2は、それぞれASGR1、CD63、およびPTPRNを発現する同族標的細胞に特異的に感染することができ、抗体の非存在下では非常に低い背景感染を提示した。ENTPD3またはCD20を発現する細胞を、上記に記載のAAV2粒子に感染させ、標準的なプロトコルを使用したルシフェラーゼアッセイによって形質導入を測定した。ENTPD3およびCD20特異的抗体に接合したAAV2は、それぞれENTPD3およびCD20を発現する同族標的細胞に特異的に感染することができ、抗体の非存在下では非常に低い背景感染を提示した。図9
実施例8 SpyTag-SpyCatcherシステムは、AAV9の再標的化のために適合され得る
他のAAVセロタイプに対するSpyTag-SpyCatcherシステムの適合性を試験した。AAV9は、高い力価ウイルスを生成する広く使用されているセロタイプであり、マウスの組織の形質導入に非常に効率的である。AAV2がヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、AAV9がガラクトースに結合するため、受容体結合に重要な残基は、AAV2とAAV9との間で異なる。受容体結合において重要であることが知られている残基は、利用可能な文献(Bell,C.L.,Gurda,B.L.,Van Vliet,K.,Agbandje-McKenna,M.,& Wilson,J.M.(2012).Identification of the galactose binding domain of the adeno-associated virus serotype 9 capsid.Journal of Virology,86(13),7326-7333.http://doi.org/10.1128/JVI.00448-12)から決定され、これには、N470、D271、N272、Y446、およびW503が含まれる。W503A変異は、この単一アミノ酸変異が受容体結合を大きく減少させたため、変異体構築物を生成する際に使用するための受容体結合変異として選択された。AAV2 N587およびG453が内部に存在する2つの突起部(可変ループ)に対してオルソロガスなAAV9キャプシドの領域も同定され、AAV9において対応する残基は、A589およびG453である。SpyTagを、隣接するリンカーアミノ酸を有し、かつ有しないAAV9内のこれらの2つの部位に、受容体結合変異W503Aと組み合わせて、挿入した。
他のAAVセロタイプに対するSpyTag-SpyCatcherシステムの適合性を試験した。AAV9は、高い力価ウイルスを生成する広く使用されているセロタイプであり、マウスの組織の形質導入に非常に効率的である。AAV2がヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、AAV9がガラクトースに結合するため、受容体結合に重要な残基は、AAV2とAAV9との間で異なる。受容体結合において重要であることが知られている残基は、利用可能な文献(Bell,C.L.,Gurda,B.L.,Van Vliet,K.,Agbandje-McKenna,M.,& Wilson,J.M.(2012).Identification of the galactose binding domain of the adeno-associated virus serotype 9 capsid.Journal of Virology,86(13),7326-7333.http://doi.org/10.1128/JVI.00448-12)から決定され、これには、N470、D271、N272、Y446、およびW503が含まれる。W503A変異は、この単一アミノ酸変異が受容体結合を大きく減少させたため、変異体構築物を生成する際に使用するための受容体結合変異として選択された。AAV2 N587およびG453が内部に存在する2つの突起部(可変ループ)に対してオルソロガスなAAV9キャプシドの領域も同定され、AAV9において対応する残基は、A589およびG453である。SpyTagを、隣接するリンカーアミノ酸を有し、かつ有しないAAV9内のこれらの2つの部位に、受容体結合変異W503Aと組み合わせて、挿入した。
以下のプラスミドおよび数量で、1つの15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
AAV9 wt、AAV9-CAP A589SpyT_W503A、AAV9-CAP A589 リンカー10SpyT_W503A、およびAAV9-CAP G453
リンカー10SpyT_W503Aについて、各プラスミドのうちの4μgを、各トランスフェクションのために使用した。
リンカー10SpyT_W503Aについて、各プラスミドのうちの4μgを、各トランスフェクションのために使用した。
モザイクウイルスについては、SpyTagと非SpyTag付きRep-Capプラスミドとの1:7の比率を達成するために、3.5ugのpAAV9-CAP W503Aおよび0.5ugのpAAV9-CAP A589リンカー10SpyT_W503AまたはpAAV9-CAP G453リンカー10SpyT_W503Aのいずれかを、各トランスフェクションのために使用した。
細胞形質導入、フローサイトメトリー分析、およびウエスタンブロット分析を、上記に記載のように実施した。
AAV9 RC A589およびG453 SpyTag挿入は、SpyCatcher-Herceptinとの反応を支援し、HER2+細胞の特異的形質導入を媒介した。図10。AAV2と同様に、隣接するリンカーを有しないAAV9 RC A589に挿入されたSpyTagは、送達性が非常に低く、SpyCatcherとの反応が不十分であった。図10。逆に、スパイタグのいずれかの側上にアミノ酸リンカーを加えることで、SpyCatcherに対してより堅牢な反応性が許容され、またいくつかの反応性の高いSpyTagを有するモザイク粒子は、標的細胞の形質導入において非常に効率的であった。図10。
実施例9 SpyTag付きAAV粒子-SpyCatcher-Vh複合体の生体内での再標的化
生体内でhASGR1を発現する肝細胞に対してVP-SpyTag-SpyCatcher-Vhを再標的化することができるかどうかを決定するために、それらの肝細胞がC57BL/6背景に対してhASGR1を発現するように遺伝子改変されたマウス、および対照の野生型マウスに、野生型AAV単独またはレポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質もしくはホタルルシフェラーゼを担持するVP-SpyTag-SpyCatcher-Vhウイルス粒子(純粋な粒子またはモザイク粒子として、かつアミノ酸リンカーを有するか、または有しない)を腹腔内注射した。対照としては、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注射したマウスが挙げられる。VP-SpyTag-SpyCatcher-Vhが肝臓から脱離され、他の器官に再標的化され得るかどうかを決定するために、レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質を担持する野生型AAVのみまたはVP-SpyTag-SpyCatcher-Vhウイルス粒子(モザイク粒子として)を血管内注射した。肝臓からの脱離および別の器官への再標的化を実証するために、肝臓で発現することが知られていないが、膵島細胞(Syed et al.2013,Am
J Physiol Endocrinol Metab 305:E1319-E1326,2013)および一般に入手可能なデータベースによる舌(GenePaint.org http://www.informatics.jax.org/assay/MGI:5423021 and Riken FANTOM5 project,adult mouse datasetから抽出されたデータ)などの他の器官中に発現されているため、タンパク質ENTPD3を選択した。
生体内でhASGR1を発現する肝細胞に対してVP-SpyTag-SpyCatcher-Vhを再標的化することができるかどうかを決定するために、それらの肝細胞がC57BL/6背景に対してhASGR1を発現するように遺伝子改変されたマウス、および対照の野生型マウスに、野生型AAV単独またはレポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質もしくはホタルルシフェラーゼを担持するVP-SpyTag-SpyCatcher-Vhウイルス粒子(純粋な粒子またはモザイク粒子として、かつアミノ酸リンカーを有するか、または有しない)を腹腔内注射した。対照としては、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注射したマウスが挙げられる。VP-SpyTag-SpyCatcher-Vhが肝臓から脱離され、他の器官に再標的化され得るかどうかを決定するために、レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質を担持する野生型AAVのみまたはVP-SpyTag-SpyCatcher-Vhウイルス粒子(モザイク粒子として)を血管内注射した。肝臓からの脱離および別の器官への再標的化を実証するために、肝臓で発現することが知られていないが、膵島細胞(Syed et al.2013,Am
J Physiol Endocrinol Metab 305:E1319-E1326,2013)および一般に入手可能なデータベースによる舌(GenePaint.org http://www.informatics.jax.org/assay/MGI:5423021 and Riken FANTOM5 project,adult mouse datasetから抽出されたデータ)などの他の器官中に発現されているため、タンパク質ENTPD3を選択した。
ヒトCD3、ヒトCD63、ヒトASGR1(どれも野生型マウス中には発現されない)またはヒトENTPD3(マウスタンパク質も認識する)を標的とするSpyCatcher-tag付き抗体が、クローニングされ、またこれらの抗体が、生体内にeGFPまたはホタルルシフェラーゼのいずれかを担持するSpyTag付きAAV2を再標的化するこれらの抗体の能力を試験した。以下のプラスミドおよび数量で、15cmのプレートの293Tパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、上記に記載のように各ウイルスを生産した。
ヒトタンパク質ASGR1、CD3、またはCD63を認識する抗体重鎖および軽鎖をコードするSpyCatcher-VhおよびVkプラスミドを、それらの肝臓細胞がC57BL/6背景上にhASGR1を発現するように遺伝子改変されたマウスにおいて試験した。ヒトタンパク質ASGR1(非標的化対照として)またはマウスおよびヒトタンパク質ENTPD3を認識する抗体をコードするSpyCatcher-VhおよびVkプラスミドを、野生型マウスにおいて試験した。感染の10日後、マウスを屠殺し、レポーター遺伝子の発現を試験し、肝臓、脾臓、および腎臓を固定し、ニワトリ抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)およびAlexa-488接合抗ニワトリ二次抗体(Jackson ImmunoResearch Labs、Inc.West Grove、PA)で染色した。動物の発光を試験するために、感染の14日後、生きた動物を イソフルランを使用して麻酔し、10分後にIVISスペクトル生体内生体内撮像システム(PerkinElmer)を使用して撮像した。図11および図12は、AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体による感染が、hASGR1再標的化AAVを注射したhASGR1発現マウスの肝臓でのみ検出され、hASGR1を発現しない野生型マウスの肝臓では検出されなかったことを示す。他の器官では陽性EGFは検出されなかった(データに示さず)。
図13は、hASGR1が野生型マウスで発現されないため、非標的化対照としてENTPD3またはhASGR1を標的化する抗体に接合されたAAVの注射後の野生型マウスの肝臓および膵臓におけるeGFP発現のための免疫組織化学染色を示す。感染の4週間後に、感染動物から器官を採取し、10%の好中球緩衝ホルマリン中に48時間固定し、次に、免疫組織化学を介してeGFPのために染色した。図13は、AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体が野生型マウスの肝臓から脱離されたことを示しており、ENTPD3およびhASGR1を標的化する抗体に接合されたAAVを注射したマウスすべてが肝臓におけるeGFP発現の類似の欠損を示した。ENTPD3を標的化する抗体に接合されたAAVを注射したマウスは、膵島においてeGFPを発現する細胞を有し、ここでENTPD3が発現されると考えられる。
図14は、hASGR1が野生型マウスで発現されないため、非標的化対照としてENTPD3またはhASGR1を標的化する抗体に接合されたAAVの注射後の野生型マウスの肝臓および舌におけるeGFP発現のための免疫組織化学染色を示す。感染の14日後に、感染動物から器官を採取し、10%の好中球緩衝ホルマリン中に48時間固定し、次に、免疫組織化学を介してeGFPのために染色した。図14は、AAV2-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体が野生型マウスの肝臓から脱離されたことを示しており、ENTPD3およびhASGR1を標的化する抗体に接合されたAAVを注射したマウスすべてが肝臓におけるeGFP発現の類似の欠損を示した。非標的化無関連抗体(抗ASGR1)に接合されたAAVを注射した3匹のマウスすべてが、舌における染色を示しておらず、抗ENTPD3に接合された3匹のマウスすべてが、舌におけるeGFP発現細胞を示しており、ここでENTPD3が発現されると考えられる。
実施例10 標的化リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子の送達
また、1つ以上の自殺遺伝子、生物学的治療(例えば、抗体)、CRISPR/Cas遺伝子編集システム、shRNAなどのセラピュティックカーゴを、標的化細胞タイプに特異的に送達するための、VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体の能力も記載する。
また、1つ以上の自殺遺伝子、生物学的治療(例えば、抗体)、CRISPR/Cas遺伝子編集システム、shRNAなどのセラピュティックカーゴを、標的化細胞タイプに特異的に送達するための、VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体の能力も記載する。
自殺遺伝子を特定の細胞に送達するためのVP-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体の能力を試験するために、Wang et al.((2010)Cancer Gene Therapy 17:559-570)によって記載されるHER2+乳癌の異種移植片ヌードマウスモデルを使用する。
自殺遺伝子(SG)を担持するVP-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体を、材料および方法に記載されるものと同様に生産する。
細胞株BT474乳癌、SK-BR-3乳癌、およびCalu-3肺癌の細胞株は、HER2陽性ヒト腫瘍細胞株である(Bunn P.A.et al.,(2001)Clin Cancer Res.7:3239-3250、Pegram M,et al.(1999)Oncogene 18:2241-2251、Spiridon CI,et al.,(2002)Clin Cancer Res.8:1720-1730)。A-673横紋筋肉腫およびHeLa子宮頸癌は、HER2陰性ヒト腫瘍細胞株であり、BEAS-2bは、不死化気管支上皮HER2陰性細胞株である(Jia LT et al.(2003)Cancer Res.63:3257-3262;Kern
JA,et al.,(1993)Am J Respir Cell Mol Biol 9:448-454;Martinez-Ramirez A,et al.,(2003)Cancer Genet Cytogenet.2003;141:138-142)。これらの細胞株のうちのすべてを、American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)から入手し、ATCCによって推奨される培地中に維持する。
JA,et al.,(1993)Am J Respir Cell Mol Biol 9:448-454;Martinez-Ramirez A,et al.,(2003)Cancer Genet Cytogenet.2003;141:138-142)。これらの細胞株のうちのすべてを、American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)から入手し、ATCCによって推奨される培地中に維持する。
マウス生後6~8週間の雌ヌードマウスを得て、特定の病原体のない条件下で収容する。0日目に、マウスに、(1)107 BT474、SK-BR-3、Calu-3、A-673、またはHeLaを右脇腹に皮下注射し、(2)レポーター(例えば、EGFP)または自殺遺伝子を担持する静脈内VP-SpyTag-SpyCatcher-Vh複合体を静脈内で処理した。未処理の動物(腫瘍細胞のみを注射した動物)、レポーターまたは自殺遺伝子を担持する野生型AAV粒子を注射した動物、SpyTagウイルス粒子のみを注射した動物が、対照として機能している。すべての動物を、注射および処理1日後に適切なプロドラッグにより処理する。各腫瘍のサイズを、キャリパーを使用して毎週2回測定し、腫瘍体積は、長さ×幅2×0.52として計算する。罹患状態、腫瘍潰瘍化、腫瘍直径15mm、または腫瘍体積1000mm3となったときに、マウスを屠殺し、屠殺日を死亡日として記録する。レポーター遺伝子を担持するウイルス粒子を注射した動物の肝臓、脾臓、腎臓、および腫瘍を固定し、レポーター遺伝子発現を可視化する。
自殺誘導遺伝子の標的化送達が記載されている(Zarogoulidis P.,et al.(2013)J.Genet.Syndr.Gene Ther.4:16849)が、本実施例は、本明細書に記載のウイルス粒子を使用して標的化HER2リガンドを発現する細胞への自殺遺伝子の送達を記載している。追加的な実験では、自殺遺伝子は、本明細書に記載のウイルス粒子を使用した1つ以上の他の標的リガンドを発現する別の細胞タイプに送達される。標的化に好適なレポーターの例示的かつ非制限的な例には、ウイルス粒子、例えば、カルシーニン胚性抗原(CEA)のエンドサイトーシスを媒介するレポーター(Qiu Y,et al.(2012)Cancer Lett.316:31-38)および血管内皮成長因子レポーター(VEGFR)(Leng A,et
al.(2013)Tumour Biol.32:1103-1111、Liu T,et al.(2011)Exp Mol Pathol.91:745-752)が含まれる。標的化され得るさらなる受容体には、上皮成長因子受容体(EGFR)(Heimberger AB,et al.(2009)Expert Opin Biol
Ther.9:1087-1098)、表面抗原分類44(CD44)(Heider
KH,et al.(2004)Cancer Immunol Immunother.53:567-579)、表面抗原分類133(CD133 aka AC133)(Zhang SS,et al.(2012)BMC Med.;10:85)、葉酸受容体(FR)(Duarte S,et al.,(2011)J Control Release 149(3):264-72)、トランスフェリン受容体(TfR)または表面抗原分類71(CD71)(Habashy HO,et al.,Breast Cancer Res Treat.119(2):283-93)、ムチン(Torres MP,et al.,(2012)Curr Pharm Des.2012;18(17):2472-81)、ステージ特異的胎児抗原4(SSEA-4)(Malecki M.,et al.,(2012)J Stem Cell Res Ther.2(5))、腫瘍耐性抗原1-60(TRA-1-60)(Malecki M.,et al.,(2013)J Stem Cell Res Ther.3:134)が含まれる。
al.(2013)Tumour Biol.32:1103-1111、Liu T,et al.(2011)Exp Mol Pathol.91:745-752)が含まれる。標的化され得るさらなる受容体には、上皮成長因子受容体(EGFR)(Heimberger AB,et al.(2009)Expert Opin Biol
Ther.9:1087-1098)、表面抗原分類44(CD44)(Heider
KH,et al.(2004)Cancer Immunol Immunother.53:567-579)、表面抗原分類133(CD133 aka AC133)(Zhang SS,et al.(2012)BMC Med.;10:85)、葉酸受容体(FR)(Duarte S,et al.,(2011)J Control Release 149(3):264-72)、トランスフェリン受容体(TfR)または表面抗原分類71(CD71)(Habashy HO,et al.,Breast Cancer Res Treat.119(2):283-93)、ムチン(Torres MP,et al.,(2012)Curr Pharm Des.2012;18(17):2472-81)、ステージ特異的胎児抗原4(SSEA-4)(Malecki M.,et al.,(2012)J Stem Cell Res Ther.2(5))、腫瘍耐性抗原1-60(TRA-1-60)(Malecki M.,et al.,(2013)J Stem Cell Res Ther.3:134)が含まれる。
本発明はいくつかの実施形態を参照して特に示され、記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示の様々な実施形態に対して形態および詳細の変更を行うことができ、また本明細書に開示の様々な実施形態は、特許請求の範囲の範囲に対する制限として機能することを意図していないことは、当業者であれば理解するであろう。
本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの好ましい方法および材料をこれより記載する。本明細書に引用されたすべての出版物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質に操作可能に連結されたタンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバーを含み、任意選択的に、前記第1のメンバーがペプチドタグであり、任意選択的に、前記第1のメンバーおよび/または変異が前記キャプシドタンパク質の天然指向性を減少させるかまたは無効にする、組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目2)
前記タンパク質:タンパク質結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、前記第1および第2のメンバーが共有結合によって結合されている、項目1に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目3)
前記共有結合がイソペプチド結合である、項目2に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目4)
前記第2のメンバーが標的化リガンドに操作可能に連結され、任意選択的に、前記標的化リガンドが結合部分である、項目2または3に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目5)
前記第1のメンバーは、前記第1のメンバーを前記キャプシドタンパク質に連結する第1および/または第2のリンカーと隣接し、前記第1および/または第2のリンカーが、それぞれ独立して少なくとも1アミノ酸長である、項目1~4のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目6)
前記第1および第2のリンカーが同一ではない、項目5に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目7)
前記第1および第2のリンカーが同一であり、10アミノ酸長である、項目5に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目8)
前記ウイルスキャプシドタンパク質のその天然受容体への結合に関与するアミノ酸位置に変異をさらに含み、前記変異が、異種ペプチドの前記キャプシドタンパク質への挿入、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の異種ペプチドとの置換、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む、項目1~7のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目9)
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質の形質導入効率が、
(i)10%減少されるか、
(ii)20%減少されるか、
(iii)30%減少されるか、
(iv)40%減少されるか、
(v)50%減少されるか、
(vi)60%減少されるか、
(vii)70%減少されるか、
(viii)80%減少されるか、
(ix)90%減少されるか、または
(x)無効にされる、項目1~8のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目10)
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス(AAV)のキャプシド遺伝子に由来し、前記キャプシド遺伝子が、AAV VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質をコードし、任意選択的に、前記キャプシドの結合に関与するアミノ酸位置に変異をさらに含む、項目1~9のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目11)
前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9からなる群から選択される、項目10に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目12)
前記アデノ随伴ウイルスがAAV2である、項目10に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目13)
前記アデノ随伴ウイルスがAAV9である、項目10に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目14)
前記タンパク質:タンパク質結合対が、
(i)SpyTag:SpyCatcher、
(ii)SpyTag:KTag、
(iii)イソペプタグ:ピリン-C、
(iv)SnoopTag:SnoopCatcher、または
(v)SpyTag002:SpyCatcher002である、項目1~13のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目15)
前記第1のメンバーおよび任意のリンカーが一緒になって約50以下のアミノ酸長である、項目1~14のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目16)
前記第1のメンバーがSpyTagである、項目1~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目17)
前記第2の同族メンバーがSpyCatcherである、項目2~16のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目18)
前記第2の同族メンバーがKTagである、項目2~16のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目19)
前記第1のメンバーがKTagであり、前記第2の同族メンバーがSpyTagである、項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目20)
前記第1のメンバーがSnoopTagであり、前記第2の同族メンバーがSnoopCatcherである、
項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目21)
前記第1のメンバーがイソペプタグであり、前記第2の同族メンバーがピリン-Cである、項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目22)
前記第1のメンバーがSpyTag002であり、前記第2の同族メンバーがSpyCatcher002である、項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目23)
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質または前記組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドが、適切な標的化リガンドを含む前記ウイルスキャプシドタンパク質またはキャプシドと比較して、前記適切な標的化リガンドの非存在下で標的細胞に感染することが減少されるかまたは無効にされている、項目1~22のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目24)
前記結合部分が、抗体またはその一部分である、項目4~23のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目25)
前記抗体またはその一部分がSpyCatcherに融合されている、項目24に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目26)
前記抗体またはその一部分が、C末端でリンカーに融合されており、前記リンカーが、前記リンカーのC末端でSpyCatcherに融合されている、項目25に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目27)
前記リンカーが、配列番号48(GSGESG)として表される配列を含む、項目26に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目28)
前記標的化リガンドが、配列番号46として表されるアミノ酸配列を含む、項目4~27のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目29)
前記標的化リガンドが、細胞表面分子に特異的に結合し、任意選択的に、細胞表面マーカーが、
(i)アシアロ糖タンパク質1(ASGR1)、
(ii)ENTPD3、
(iii)PTPRN、
(iv)CD20、
(v)CD63、または
(vi)Her2である、項目4~28のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目30)
前記細胞表面分子がアシアロ糖タンパク質1(ASGR1)である、項目29に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目31)
前記細胞表面分子がCD63である、項目29に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目32)
前記細胞表面分子がENTDP3である、項目29に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目33)
項目1~32のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む、組換えウイルスキャプシド。
(項目34)
前記特異的結合対の任意のメンバーを欠いている参照ウイルスキャプシドタンパク質をさらに含む、項目33に記載の組換えウイルスキャプシド。
(項目35)
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質および前記参照ウイルスキャプシドタンパク質が、それぞれ、前記ウイルス粒子のその天然リガンドとの結合に関与する少なくとも1つの残基の変異を含む、項目34に記載の組換えウイルスキャプシド。
(項目36)
1:1~1:15の比率で前記組換えウイルスキャプシドタンパク質および前記参照ウイルスキャプシドタンパク質を含む、項目34または35に記載の組換えウイルスキャプシド。
(項目37)
項目33~36のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドによって封入された対象ヌクレオチドを含む、組換えウイルスベクター。
(項目38)
前記対象ヌクレオチドが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、項目37に記載の組換えウイルス粒子。
(項目39)
前記対象ヌクレオチドが、ヒトプロモーターの制御下にある、項目37に記載の組換えウイルス粒子。
(項目40)
前記対象ヌクレオチドが、非ヒトプロモーターの制御下にある、項目37に記載の組換えウイルス粒子。
(項目41)
前記対象ヌクレオチドがレポーター遺伝子である、項目37~40のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
(項目42)
前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、項目41に記載の組換えウイルス粒子。
(項目43)
前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子がコード)、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)、MmGFP、青色蛍光タンパク質(BFP)、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化型黄色蛍光タンパク質(eYFP)、Emerald、CyPet、シアン蛍光タンパク質(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせをコードする、項目41に記載の組換えウイルス粒子。
(項目44)
前記対象ヌクレオチドが、治療用タンパク質、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、CRISPR/Casシステムまたはその一部分(複数可)をコードするヌクレオチド、アンチセンスRNAをコードするヌクレオチド、およびshRNAをコードするヌクレオチドからなる群から選択される、項目37~40のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
(項目45)
(a)項目33~36のいずれか一項に記載のウイルスキャプシド、または項目37~44のいずれか一項に記載のウイルスベクター、および(b)薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
(項目46)
対象ヌクレオチドを標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を、項目37~44のいずれか一項に記載のウイルス粒子または項目45に記載の組成物に接触させることを含み、前記ウイルスキャプシドが、前記標的細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する標的化リガンドを含む、方法。
(項目47)
前記標的細胞が、生体外にある、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記標的細胞が、対象の生体内にある、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記対象が、ヒトである、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記標的細胞が、ヒト標的細胞である、項目46~49のいずれか一項に記載の方法。(項目51)
前記標的細胞がヒト肝細胞であり、前記標的化リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体(ASGR1)に結合する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記標的細胞がヒト神経細胞であり、前記標的化リガンドがGABAに結合する、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記標的細胞がヒトT細胞であり、前記標的化リガンドが、CD3、任意選択的にCD3εに結合する、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記標的化リガンドがPTPRNに結合する、項目50に記載の方法。
(項目55)
前記標的細胞がヒト造血細胞であり、前記標的化リガンドがCD34に結合する、項目50に記載の方法。
(項目56)
前記標的細胞がヒト腎細胞である、項目50に記載の方法。
(項目57)
前記標的細胞がヒト癌細胞であり、前記標的化リガンドが腫瘍関連抗原に結合する、項目50に記載の方法。
(項目58)
前記腫瘍抗原がE6、E7、またはHer2である、項目57に記載の方法。
(項目59)
前記標的化リガンドがCD20に結合する、項目50に記載の方法。
(項目60)
前記標的化リガンドがヒトグルカゴン受容体に結合する、項目50に記載の方法。
(項目61)
前記標的化リガンドがCD63に特異的に結合する、項目46~50のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記標的化リガンドが、ヒト細胞外ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ3(hENTPD3)に特異的に結合する、項目46~50のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
足場および/またはアダプターを有するウイルスキャプシドタンパク質を提供する方法であって、
(a)特異的タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバーをコードする核酸、および任意選択的にリンカーを、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、前記特異的結合対の前記第1のメンバーを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意選択的に前記リンカーを形成する、挿入することと、
(b)ウイルス粒子の生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、前記パッケージング細胞が前記核酸を含む、培養することと、を含む、方法。
(項目64)
ウイルス粒子を生成する方法であって、前記ウイルス粒子の生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することを含み、前記パッケージング細胞が、特異的タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバーを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意選択的に前記第1のメンバーを前記キャプシドタンパク質に連結するアミノ酸リンカーを含む、方法。
(項目65)
前記パッケージング細胞が、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび/または導入プラスミドをさらに含む、項目63または項目64に記載の方法。
(項目66)
前記パッケージング細胞が、参照モザイクキャプシドをコードするプラスミドをさらに含む、項目63~65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
前記パッケージング細胞を溶解することと、アデノ随伴ウイルスベクターを細胞可溶化物から単離することと、をさらに含む、項目63~66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
a.細胞片を除去することと、
b.ウイルス粒子を含有する上清をヌクレアーゼで処理することと、
c.ウイルス粒子を濃縮することと、
d.前記ウイルス粒子を精製することと、
e.a~dの任意の組み合わせと、をさらに含む、項目63~67のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、前記キャプシドタンパク質の天然指向性に関与する位置にアミノ酸の変異をさらに含み、前記変異が、前記キャプシドタンパク質への異種ペプチドの挿入、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の異種ペプチドとの置換、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む、項目63~68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
項目63~69のいずれか一項に記載の方法に従って作製される、ウイルス粒子。
(項目71)
項目1~32のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞。
(項目72)
項目1~32のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする組換えベクター。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
組換えウイルスキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質に操作可能に連結されたタンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバーを含み、任意選択的に、前記第1のメンバーがペプチドタグであり、任意選択的に、前記第1のメンバーおよび/または変異が前記キャプシドタンパク質の天然指向性を減少させるかまたは無効にする、組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目2)
前記タンパク質:タンパク質結合対の第2の同族メンバーをさらに含み、前記第1および第2のメンバーが共有結合によって結合されている、項目1に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目3)
前記共有結合がイソペプチド結合である、項目2に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目4)
前記第2のメンバーが標的化リガンドに操作可能に連結され、任意選択的に、前記標的化リガンドが結合部分である、項目2または3に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目5)
前記第1のメンバーは、前記第1のメンバーを前記キャプシドタンパク質に連結する第1および/または第2のリンカーと隣接し、前記第1および/または第2のリンカーが、それぞれ独立して少なくとも1アミノ酸長である、項目1~4のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目6)
前記第1および第2のリンカーが同一ではない、項目5に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目7)
前記第1および第2のリンカーが同一であり、10アミノ酸長である、項目5に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目8)
前記ウイルスキャプシドタンパク質のその天然受容体への結合に関与するアミノ酸位置に変異をさらに含み、前記変異が、異種ペプチドの前記キャプシドタンパク質への挿入、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の異種ペプチドとの置換、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む、項目1~7のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目9)
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質の形質導入効率が、
(i)10%減少されるか、
(ii)20%減少されるか、
(iii)30%減少されるか、
(iv)40%減少されるか、
(v)50%減少されるか、
(vi)60%減少されるか、
(vii)70%減少されるか、
(viii)80%減少されるか、
(ix)90%減少されるか、または
(x)無効にされる、項目1~8のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目10)
前記ウイルスキャプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス(AAV)のキャプシド遺伝子に由来し、前記キャプシド遺伝子が、AAV VP1、VP2、および/またはVP3キャプシドタンパク質をコードし、任意選択的に、前記キャプシドの結合に関与するアミノ酸位置に変異をさらに含む、項目1~9のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目11)
前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9からなる群から選択される、項目10に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目12)
前記アデノ随伴ウイルスがAAV2である、項目10に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目13)
前記アデノ随伴ウイルスがAAV9である、項目10に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目14)
前記タンパク質:タンパク質結合対が、
(i)SpyTag:SpyCatcher、
(ii)SpyTag:KTag、
(iii)イソペプタグ:ピリン-C、
(iv)SnoopTag:SnoopCatcher、または
(v)SpyTag002:SpyCatcher002である、項目1~13のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目15)
前記第1のメンバーおよび任意のリンカーが一緒になって約50以下のアミノ酸長である、項目1~14のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目16)
前記第1のメンバーがSpyTagである、項目1~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目17)
前記第2の同族メンバーがSpyCatcherである、項目2~16のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目18)
前記第2の同族メンバーがKTagである、項目2~16のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目19)
前記第1のメンバーがKTagであり、前記第2の同族メンバーがSpyTagである、項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目20)
前記第1のメンバーがSnoopTagであり、前記第2の同族メンバーがSnoopCatcherである、
項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目21)
前記第1のメンバーがイソペプタグであり、前記第2の同族メンバーがピリン-Cである、項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目22)
前記第1のメンバーがSpyTag002であり、前記第2の同族メンバーがSpyCatcher002である、項目2~15のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目23)
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質または前記組換えウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルスキャプシドが、適切な標的化リガンドを含む前記ウイルスキャプシドタンパク質またはキャプシドと比較して、前記適切な標的化リガンドの非存在下で標的細胞に感染することが減少されるかまたは無効にされている、項目1~22のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目24)
前記結合部分が、抗体またはその一部分である、項目4~23のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目25)
前記抗体またはその一部分がSpyCatcherに融合されている、項目24に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目26)
前記抗体またはその一部分が、C末端でリンカーに融合されており、前記リンカーが、前記リンカーのC末端でSpyCatcherに融合されている、項目25に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目27)
前記リンカーが、配列番号48(GSGESG)として表される配列を含む、項目26に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目28)
前記標的化リガンドが、配列番号46として表されるアミノ酸配列を含む、項目4~27のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目29)
前記標的化リガンドが、細胞表面分子に特異的に結合し、任意選択的に、細胞表面マーカーが、
(i)アシアロ糖タンパク質1(ASGR1)、
(ii)ENTPD3、
(iii)PTPRN、
(iv)CD20、
(v)CD63、または
(vi)Her2である、項目4~28のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目30)
前記細胞表面分子がアシアロ糖タンパク質1(ASGR1)である、項目29に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目31)
前記細胞表面分子がCD63である、項目29に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目32)
前記細胞表面分子がENTDP3である、項目29に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質。
(項目33)
項目1~32のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質を含む、組換えウイルスキャプシド。
(項目34)
前記特異的結合対の任意のメンバーを欠いている参照ウイルスキャプシドタンパク質をさらに含む、項目33に記載の組換えウイルスキャプシド。
(項目35)
前記組換えウイルスキャプシドタンパク質および前記参照ウイルスキャプシドタンパク質が、それぞれ、前記ウイルス粒子のその天然リガンドとの結合に関与する少なくとも1つの残基の変異を含む、項目34に記載の組換えウイルスキャプシド。
(項目36)
1:1~1:15の比率で前記組換えウイルスキャプシドタンパク質および前記参照ウイルスキャプシドタンパク質を含む、項目34または35に記載の組換えウイルスキャプシド。
(項目37)
項目33~36のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドによって封入された対象ヌクレオチドを含む、組換えウイルスベクター。
(項目38)
前記対象ヌクレオチドが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳類プロモーター、鳥類プロモーター、魚プロモーター、昆虫プロモーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、項目37に記載の組換えウイルス粒子。
(項目39)
前記対象ヌクレオチドが、ヒトプロモーターの制御下にある、項目37に記載の組換えウイルス粒子。
(項目40)
前記対象ヌクレオチドが、非ヒトプロモーターの制御下にある、項目37に記載の組換えウイルス粒子。
(項目41)
前記対象ヌクレオチドがレポーター遺伝子である、項目37~40のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
(項目42)
前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、項目41に記載の組換えウイルス粒子。
(項目43)
前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ(lacZ遺伝子がコード)、強化型緑色蛍光タンパク質(eGFP)、MmGFP、青色蛍光タンパク質(BFP)、強化型青色蛍光タンパク質(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化型黄色蛍光タンパク質(eYFP)、Emerald、CyPet、シアン蛍光タンパク質(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせをコードする、項目41に記載の組換えウイルス粒子。
(項目44)
前記対象ヌクレオチドが、治療用タンパク質、自殺遺伝子、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、CRISPR/Casシステムまたはその一部分(複数可)をコードするヌクレオチド、アンチセンスRNAをコードするヌクレオチド、およびshRNAをコードするヌクレオチドからなる群から選択される、項目37~40のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
(項目45)
(a)項目33~36のいずれか一項に記載のウイルスキャプシド、または項目37~44のいずれか一項に記載のウイルスベクター、および(b)薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
(項目46)
対象ヌクレオチドを標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を、項目37~44のいずれか一項に記載のウイルス粒子または項目45に記載の組成物に接触させることを含み、前記ウイルスキャプシドが、前記標的細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する標的化リガンドを含む、方法。
(項目47)
前記標的細胞が、生体外にある、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記標的細胞が、対象の生体内にある、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記対象が、ヒトである、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記標的細胞が、ヒト標的細胞である、項目46~49のいずれか一項に記載の方法。(項目51)
前記標的細胞がヒト肝細胞であり、前記標的化リガンドが、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体(ASGR1)に結合する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記標的細胞がヒト神経細胞であり、前記標的化リガンドがGABAに結合する、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記標的細胞がヒトT細胞であり、前記標的化リガンドが、CD3、任意選択的にCD3εに結合する、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記標的化リガンドがPTPRNに結合する、項目50に記載の方法。
(項目55)
前記標的細胞がヒト造血細胞であり、前記標的化リガンドがCD34に結合する、項目50に記載の方法。
(項目56)
前記標的細胞がヒト腎細胞である、項目50に記載の方法。
(項目57)
前記標的細胞がヒト癌細胞であり、前記標的化リガンドが腫瘍関連抗原に結合する、項目50に記載の方法。
(項目58)
前記腫瘍抗原がE6、E7、またはHer2である、項目57に記載の方法。
(項目59)
前記標的化リガンドがCD20に結合する、項目50に記載の方法。
(項目60)
前記標的化リガンドがヒトグルカゴン受容体に結合する、項目50に記載の方法。
(項目61)
前記標的化リガンドがCD63に特異的に結合する、項目46~50のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記標的化リガンドが、ヒト細胞外ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ3(hENTPD3)に特異的に結合する、項目46~50のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
足場および/またはアダプターを有するウイルスキャプシドタンパク質を提供する方法であって、
(a)特異的タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバーをコードする核酸、および任意選択的にリンカーを、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列に挿入して、前記特異的結合対の前記第1のメンバーを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意選択的に前記リンカーを形成する、挿入することと、
(b)ウイルス粒子の生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することであって、前記パッケージング細胞が前記核酸を含む、培養することと、を含む、方法。
(項目64)
ウイルス粒子を生成する方法であって、前記ウイルス粒子の生成に十分な条件下でパッケージング細胞を培養することを含み、前記パッケージング細胞が、特異的タンパク質:タンパク質結合対の第1のメンバーを含む遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意選択的に前記第1のメンバーを前記キャプシドタンパク質に連結するアミノ酸リンカーを含む、方法。
(項目65)
前記パッケージング細胞が、対象ヌクレオチドを含むヘルパープラスミドおよび/または導入プラスミドをさらに含む、項目63または項目64に記載の方法。
(項目66)
前記パッケージング細胞が、参照モザイクキャプシドをコードするプラスミドをさらに含む、項目63~65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
前記パッケージング細胞を溶解することと、アデノ随伴ウイルスベクターを細胞可溶化物から単離することと、をさらに含む、項目63~66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
a.細胞片を除去することと、
b.ウイルス粒子を含有する上清をヌクレアーゼで処理することと、
c.ウイルス粒子を濃縮することと、
d.前記ウイルス粒子を精製することと、
e.a~dの任意の組み合わせと、をさらに含む、項目63~67のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記遺伝子改変キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、前記キャプシドタンパク質の天然指向性に関与する位置にアミノ酸の変異をさらに含み、前記変異が、前記キャプシドタンパク質への異種ペプチドの挿入、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の異種ペプチドとの置換、前記キャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを含む、項目63~68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
項目63~69のいずれか一項に記載の方法に従って作製される、ウイルス粒子。
(項目71)
項目1~32のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードするプラスミドを含むウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞。
(項目72)
項目1~32のいずれか一項に記載の組換えウイルスキャプシドタンパク質をコードする組換えベクター。
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