CN112342228B

CN112342228B - 表达抗vegf融合蛋白的aav病毒载体及其应用

Info

Publication number: CN112342228B
Application number: CN201910736573.3A
Authority: CN
Inventors: 罗学廷; 孙晓东
Original assignee: Shanghai Langsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Langsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2039-08-09
Also published as: CN112342228A

Abstract

本发明人涉及一种表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体及其应用。具体地，本发明了涉及一种包含编码抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列的重组AAV病毒载体及其应用。本发明的重组AAV病毒在小鼠细胞内的感染效果优异，且在细胞核内稳定表达，能有效抑制眼内VEGF表达,减轻激光损伤导致的渗漏和血管新生，因此可用于制备治疗VEGF相关疾病的药物，具有广泛的市场前景。

Description

表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体及其应用。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种导致老年人严重视力减退甚至失明的眼病。AMD分为干性和湿性，分别以地图样萎缩(geographicatrophy,GA)和脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)为特征。

由于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是CNV生成的关键介质，阻断或中和VEGF表达的药物制剂，如贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普及康柏西普等在近十年的临床治疗中成为主要选择。目前，抗VEGF治疗采用玻璃体腔内注射，存在并发眼内炎、葡萄膜炎、医源性玻璃体出血及视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)撕裂等风险。由于抗VEGF药物半衰期短，为了维持功效，需要每4-8周进行重复的眼内注射。频繁注射带来的不便及高昂的价格使患者的依从性逐渐降低。由于VEGF不仅是内皮细胞特异性的，其在视网膜细胞中也广泛表达，对维持视网膜的结构和功能具有重要作用。长期的抗VEGF治疗可能会增加RPE萎缩、脉络膜萎缩及地图样萎缩(geographic atrophy，GA)的发生率。多中心临床研究发现：部分患者在抗VEGF治疗七年后，其视力降至基线甚至基线水平以下，甚至伴随着黄斑萎缩和纤维化的发生。因此在使用抗VEGF药物靶向抑制CNV的同时，需要注重保护光感受器和RPE功能。为了改善湿性AMD患者的治疗效果，必须开发出替代或补充治疗来降低视网膜的毒性反应。

因此，本领域迫切需要开发有效治疗黄斑变性等VEGF相关眼部疾病的方法和治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4(I)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为启动子；

Z2为内含子；

Z3为编码抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列；和

Z4为任选的hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)序列。

其中，所述的抗VEGF融合蛋白包括VEGFR1的胞外第二结构域、VEGFR2的胞外第三结构域。

在另一优选例中，所述的抗VEGF融合蛋白还包括Fc片段，较佳地为人IgG1的Fc片段。

在另一优选例中，所述的抗VEGF融合蛋白还包括分泌信号肽，较佳地，所述的分泌信号肽来源于VEGFR1。

在另一优选例中，所述的抗VEGF融合蛋白还包括HA标记。

在另一优选例中，所述的启动子包括组织特异性启动子。

在另一优选例中，所述启动子为ubiquitin启动子。

在另一优选例中，所述内含子为uBc内含子。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为0-30nt，较佳地1-15nt。

在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有权利要求1所述的核苷酸序列的AAV载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达抗VEGF融合蛋白。

在本发明的第三方面，提供了一种腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体含有如在本发明的第一方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述腺相关病毒的血清型选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV2-AAV3、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAVHSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV clone32/83、AAVShH10、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、AAVr3.45、AAV2或AAV5、或其组合。

在另一优选例中，所述腺相关病毒为AAV2，较佳地，所述腺相关病毒为单链AAV2。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体具有式II结构：

A1-Z1-Z2-Z3-Z4-A2-A3(I)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

A1为L-ITR序列；

Z1为ubiquitin启动子；

Z2为内含子；

Z3为权利要求1所述的核苷酸序列；

Z4为hGHpA序列；

A2为R-ITR序列；

A3为任选的标签序列；和

A4为任选的f1 ori序列。

在另一优选例中，所述的标签包括抗性标记和荧光素标记，较佳地，所述的标签序列为Ampicillin序列。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:2所示。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体，或其染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK细胞、感光细胞(包括视锥细胞和/或视杆细胞)、其他视觉细胞(如双极细胞、水平细胞)、神经节细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗VEGF相关眼部疾病，较佳地，用于治疗黄斑变性和/或糖尿病视网膜病变，更佳地，用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于抑制眼内VEGF表达。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于减轻激光损伤导致的渗漏和/或抑制血管新生。

在另一优选例中，所述VEGF相关眼部疾病选自下组：黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗VEGF相关眼部疾病。

在本发明的第七方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，将所述腺相关病毒载体注射到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述的注射包括视网膜下腔注射、玻璃体腔注射。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗VEGF相关眼部疾病的方法。

在本发明的第八方面，提供了一种抗VEGF融合蛋白的制备方法，包括培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到抗VEGF融合蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了病毒载体rAAV/ubC.anti-VEGF的特征图谱。

图2显示了转染HEK-293细胞48小时后通过Westernblot检测蛋白表达的结果。

图3显示了小鼠注射rAAV/ubC.anti-VEGF后的各项实验结果。

图3A显示了小鼠注射rAAV/ubC.anti-VEGF两周后进行视网膜免疫荧光染色的结果。

图3B显示了westernblot检测视网膜融合蛋白表达的结果。

图3C显示注射rAAV/ubC.anti-VEGF的小鼠激光斑渗漏明显减轻，CNV面积减小。

图3D显示rAAV/ubC.anti-VEGF减少了激光损伤后脉络膜新生血管的生成。

图4显示了抗VEGF融合蛋白的序列和结构。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，获得了一种表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体及其应用。具体地，本发明构建了一种包含编码抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列的重组AAV病毒载体。实验结果表明，本发明的重组AAV病毒在小鼠细胞内的感染效果优异，且在细胞核内稳定表达，能有效抑制眼内VEGF表达,减轻激光损伤导致的渗漏和血管新生，因此可用于制备治疗VEGF相关疾病的药物，具有广泛的市场前景

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

VEGF

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种具有促进血管生成作用的重要生长因子，同时可发挥促进内皮细胞有丝分裂、抗凋亡、增加血管通透性、促进细胞迁移等作用。因此，VEGF在调控正常和病理性血管生成的过程中发挥着重要的作用。人类VEGF家族主要由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及血小板生成因子(placenta growth factor,PIGF)组成。VEGF与酪氨酸激酶受体VEGFR1，VEGFR2及VEGFR3结合，前两者主要表达在血管内皮细胞。其中VEGFR2较VEGFR1具有更强的促血管生成活性和酪氨酸激酶活性。VEGFR3仅表达在淋巴内皮细胞。

VEGF在胚胎发育过程中的血管形成及出生后的血管损伤修复中起到重要作用，但在病理条件下，VEGF水平的升高诱导的新生血管生成有可能导致湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等的发生，进一步加重视网膜缺氧，影响视觉功能。目前抗VEGF治疗已成为VEGF相关新生血管性眼病的一线治疗方法。但长期的抗VEGF治疗可能增加RPE萎缩、脉络膜萎缩及地图样萎缩(geographic atrophy，GA)的发生率。多中心临床研究发现：部分患者在抗VEGF治疗七年后，其视力降至基线甚至基线水平以下，甚至伴随着黄斑萎缩和纤维化的发生。因此在使用抗VEGF药物靶向抑制CNV的同时，需要注重保护光感受器和RPE功能。为了改善湿性AMD患者的治疗效果，必须开发出替代或补充治疗来降低视网膜的毒性反应。

核酸编码序列

本发明提供了表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。在另一优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的AAV病毒载体表达抗VEGF融合蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO.:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示，结构如图4所示。

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的抗VEGF融合蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达抗VEGF融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明抗VEGF融合蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

腺相关病毒

因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种表达抗VEGF融合蛋白的表达载体，它含有本发明的抗VEGF融合蛋白编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

在另一优选例中，本发明所用的腺相关病毒为AAV2，较佳地，所述腺相关病毒为单链AAV2。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、内含子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动子是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为人ubiquitin C启动子。该启动子来源于人泛素蛋白C基因(GENE ID：7316)的上游表达调控序列(-1225-6)。

许多表达载体可应用抗VEGF融合蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。

本发明还提供一种包含抗VEGF融合蛋白编码序列的重组腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带抗VEGF融合蛋白编码序列的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。

在另一优选例中，本发明所述的携带抗VEGF融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:2所示。其中，所述表达抗VEGF融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

基因治疗载体

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体，根据本发明，病毒表达载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45，AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV 2载体。

本发明的AAV载体为单链AAV，可根据标准技术生产重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷～10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰-1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体可以是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达抗VEGF融合蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高抗VEGF融合蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病，较佳地，所述药物制剂用于治疗用于治疗VEGF相关眼部疾病，较佳地，用于治疗黄斑变性和/或糖尿病视网膜病变，更佳地，用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码抗VEGF融合蛋白的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产抗VEGF融合蛋白，含所述抗VEGF融合蛋白的制剂可应用于制备治疗眼部疾病的药物。

治疗方法

本发明提供了治疗VEGF介导的新生血管性眼病的方法，所述方法包括将包含编码抗VEGF融合蛋白核酸序列的载体引入到眼睛内。所述方法可包括向视网膜下或玻璃体内施用核酸载体,所述核酸载体靶向RPE细胞。

本发明提供了用于通过向细胞提供感光细胞功能在治疗新生血管性眼病的方法中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列。本发明组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

如本文所用，治疗疾病意指施用如本文描述的核酸或载体以改善或减轻疾病的一种或多种症状，包括减少血管渗漏、减少新生血管生成等。

本发明的方法包括将编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地，方法包括使细胞与包含编码抗VEGF融合蛋白的核酸序列的载体(较佳地为病毒，更佳地为腺相关病毒)接触。优选地，细胞是视网膜细胞，优选地视锥细胞、视杆细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

当核酸序列和一种或多种酶以多个(两个或多个)剂量被提供时，这些剂量可分隔合适的时间间隔，例如30秒到若干小时或1天或多天。

每个剂量可包含有效量的核酸序列或病毒载体。核酸序列或病毒载体的有效剂量可以在每治疗方案1×10⁹-1×10¹⁶病毒的范围。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明选择了合适的载体和相关元件，构建了重组腺相关病毒载体rAAV/ubC.anti-VEGF，感染效果优异，且在细胞核内稳定表达，是一种稳定的重组腺相关病毒载体。

(b)本发明的重组腺相关病毒载体可以有效抑制眼内VEGF表达,减轻激光损伤导致的渗漏和血管新生，因此可用于制备治疗VEGF相关疾病的药物，具有广泛的市场前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料和方法

(I)激光诱导眼底损伤模型的构建方法如下：

1.麻醉：采用每20g小鼠0.1ml的10％水合氯醛腹腔注射深度麻醉小鼠。2.双眼滴用复方托吡卡胺滴眼液充分散大瞳孔，随后用倍诺喜滴眼液点滴双眼进行角膜表面麻醉。

3.眼前放置-53.00D角膜接触镜，便于观察激光照射时视网膜的情况。

4.将半导体倍频激光经裂隙灯显微镜和角膜接触镜导入眼内。每眼距离视盘2-3PD、围绕视盘在视网膜血管之间行激光光凝共4个点。

5.激光参数：功率150mW，光凝斑直径0.05mm，光凝时间100ms。

6.光凝后光凝斑中央立刻有气泡形成为准，是Bruch膜破裂的标志。

7.光凝后光凝斑部位视网膜急性水肿，呈白色，同时没有发生视网膜下出血。

8.在小鼠麻醉彻底苏醒后，将其送回饲养箱。

(II)眼底血管渗漏成像方法如下：

使用海德堡荧光血管造影仪对小鼠进行FFA检查，以评估CNV损伤的程度。

1.在激光损伤后第7天对小鼠进行荧光素钠尾静脉注射。

2.在尾静脉注射后立即开始计时。在注射后的第45秒、2分钟和7分钟时分别获取造影早期、中期和后期阶段的荧光造影图片。

3.FFA下可见在光凝斑CNV阳性部位，早期即可出现范围局限的强荧光，在造影后期荧光持续增强。

4.每个CNV损伤的荧光素渗漏范围根据Marneros方法进行评估：1)0级损伤为没有显示强荧光；2)1级损伤为显示了强荧光但是没有发现明显的渗漏；3)2级损伤为在造影早期和中期显示了强荧光，晚期渗漏小于1/4视盘面积。4)3级损伤为在造影早期和中期显示了强荧光，晚期渗漏大而明显。

(III)玻璃体腔注射

使用玻璃制毛细针，于视网膜边缘、角膜巩膜交界靠后处进针，使用微量注射器注射，注射时需注意进针角度和深度，注意避免损伤晶体或其他眼内组织。

(IV)组织处理

动物先经由PBS进行全身灌注，后继续用4％多聚甲醛(PFA)灌注，灌注速度为5mL/分钟。眼球及视神经取出后在4％PFA溶液中浸泡约2小时。组织染色铺片前需在0.1M PBS中4℃储存。

实施例1重组腺相关病毒载体的构建和分离纯化

质粒rAAV/ubC.anti-VEGF的构建如图1所示，主要元件包括人源ubiquitin启动子及anti-VEGF融合蛋白序列。人源ubiquitin启动子可以调控转入基因在视网膜组织高表达。目的基因之后紧接着是hGHpA(SEQ ID NO:7)，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)，即病毒载体包括L-ITR(SEQ ID NO:3)，R-ITR(SEQ ID NO:8)。L-ITR与目的基因之间包含uniquitin C启动子(SEQ ID NO.:4)和内含子(SEQ ID NO.:5)。此外，病毒载体还包括Ampicillin和f1 ori。

病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV/ubC.anti-VEGF质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体。经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化，使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组病毒载体进行收集。收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组病毒载体进行浓缩。再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度。最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80度储存。

实施例2：腺病毒感染检测

将实施例1构建的病毒载体转染HEK-293细胞48小时后，收集细胞和培养液样本通过Westernblot检测蛋白表达(抗体：anti-human IgG(识别Fc片段))

结果如图2所示，病毒载体rAA/ubC.anti-VEGF转染HEK-293细胞及细胞培养液中均检测到融合蛋白表达。显示病毒感染效果优异(图2)。

动物模型检测：小鼠玻璃体腔注射HA标记的rAAV/ubC.anti-VEGF两周后，据前述组织处理方法进行眼球的前处理，后使用显微镊夹住眼球底部向上提起，用剪刀剪断眼球周围的结膜和肌肉组织，保持眼球组织完整，剪去角膜、虹膜和晶状体做成眼杯，并分离视网膜和RPE-脉络膜-巩膜复合体。

免疫荧光染色：选取视网膜，在20％山羊血清溶液中封闭1h，后一抗孵育过夜，抗体分别为HA；PBS清洗三次、每次10min，后二抗孵育1h；PBS清洗三次、每次十分钟后封片。使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照。

结果如图3所示，小鼠注射rAAV/ubC.anti-VEGF两周后，进行视网膜免疫荧光染色铺片，可见眼底存在大量HA标记的rAAV/ubC.anti-VEGF(图3A)，westernblot检测视网膜融合蛋白表达增加(图3B)，显示重组病毒感染效果优异。

实施例3重组腺相关病毒载体对新生血管模型小鼠的治疗

6周龄小鼠通过玻璃体腔注射rAAV/ubC.anti-VEGF病毒(对照病毒：AAV-mCherry)，在第8周通过激光光凝诱导眼底RPE-脉络膜损伤，在第9周进行FFA检查及免疫荧光染色，观察光凝斑部位CNV形态及面积。

结果如图3C-D所示，注射rAAV/ubC.anti-VEGF的小鼠激光斑渗漏明显减轻，CNV面积减小，显示rAAV/ubC.anti-VEGF减少了激光损伤后脉络膜新生血管的生成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 表达抗VEGF融合蛋白的AAV病毒载体及其应用

<130> P2018-2113

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val

115 120 125

Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val

130 135 140

Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg

165 170 175

Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr

180 185 190

Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys

195 200 205

Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg

210 215 220

Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

260 265 270

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

275 280 285

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

290 295 300

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

305 310 315 320

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

325 330 335

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

340 345 350

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

355 360 365

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

370 375 380

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

385 390 395 400

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

405 410 415

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

420 425 430

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

435 440 445

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro

450 455 460

Asp Tyr Ala

465

<210> 2

<211> 6554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgcg gcctccgcgc cgggttttgg cgcctcccgc 180

gggcgccccc ctcctcacgg cgagcgctgc cacgtcagac gaagggcgca gcgagcgtcc 240

tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc ggcccgctgc tcataagact cggccttaga 300

accccagtat cagcagaagg acattttagg acgggacttg ggtgactcta gggcactggt 360

tttctttcca gagagcggaa caggcgagga aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga 420

gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca 480

gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg 540

tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc 600

ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg 660

ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc agcaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga 720

atagaacctt cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc 780

tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg 840

gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc 900

tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc 960

ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc 1020

tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt 1080

tctttggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat 1140

gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc 1200

atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc 1260

gtttttggct tttttgttag acgaagctaa ggcgcgcctg agaacttcag ggtgagtttg 1320

gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat tcatgttata tggagggggc 1380

aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct tgtatcacca tgcatggacc 1440

ctcatgataa ttttgtttct ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat 1500

tttcttttca ttttctgtaa ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatcta 1560

gacaatcagg gtatattata ttgtacttca gcacagtttt agagaacaat tgttataatt 1620

aaatgataag gtagaatatt tctgcatata aattctggct ggcgtggaaa tattcttatt 1680

ggtagaaaca actacatcct ggtcatcatc ctgcctttct ctttatggtt acaatgatat 1740

acactgtttg agatgaggat aaaatactct gagtccaaac cgggcccctc tgctaaccat 1800

gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 1860

catcaagctt aagaattcca ccatggtgag ctactgggac accggggtgc tgctgtgcgc 1920

cctgctgagc tgcctgctgc tgaccggctc ctcctccggc ggaagaccct tcgtggagat 1980

gtacagcgag atccccgaga tcattcacat gaccgaaggc agagagctgg tgatcccctg 2040

cagagtgacc agccccaaca tcaccgtgac cctgaaaaag ttccccctcg acacactgat 2100

ccccgacggc aaaagaatca tctgggacag cagaaagggc tttatcatta gcaacgccac 2160

ctacaaggaa atcggcctcc tgacctgcga agccaccgtg aacggccacc tgtacaagac 2220

caactacctg acacaccggc agaccaacac catcatcgac gtggtgctgt ccccctccca 2280

cggcatcgag ctgtccgttg gcgagaaact ggtgctgaac tgcaccgccc gcaccgaact 2340

gaacgtgggc atcgacttca actgggagta ccccagcagc aagcaccaac acaagaagct 2400

ggtgaaccgg gacctgaaga cccaatccgg ctccgaaatg aagaaattcc tgagcactct 2460

gaccatcgac ggcgtgacca gaagcgacca gggactgtac acctgcgccg catcctccgg 2520

gctgatgacc aaaaagaaca gcactttcgt cagagtgcac gagaagggcc ccggagacaa 2580

gacccacaca tgccccccct gccccgcccc tgaatttctg ggcggcccct ccgtgttcct 2640

gttcccccct aagcctaaag acactctgat gatcagcaga acccccgaag tgacctgcgt 2700

ggtcgtggac gtctcccagg aagatcccga ggtgcaattc aactggtacg tggacggcgt 2760

cgaagtccac aacgccaaaa ccaaaccccg cgaagaacag ttcaacagca catacagagt 2820

ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctcaac ggcaaggagt acaagtgcaa 2880

ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat agaaaaaacc atcagcaagg ccaagggcca 2940

gcccagagag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag gaggagatga ccaagaacca 3000

ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 3060

gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg acagcgacgg 3120

cagcttcttc ctgtacagca gactgaccgt ggacaagagc agatggcagg agggcaacgt 3180

gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag 3240

cctgagcctg ggcaagtatc cttacgacgt gcctgactac gcctgactcg agagatctac 3300

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 3360

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 3420

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 3480

acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 3540

ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 3600

ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 3660

ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 3720

tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg 3780

attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg 3840

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 3900

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc 3960

gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa 4020

gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 4080

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 4140

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 4200

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc 4260

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 4320

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc 4380

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 4440

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct 4500

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 4560

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 4620

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 4680

gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 4740

gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 4800

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 4860

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 4920

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 4980

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 5040

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 5100

cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 5160

tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 5220

agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 5280

tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 5340

tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 5400

tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 5460

acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 5520

accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 5580

tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 5640

cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 5700

tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 5760

actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 5820

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 5880

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 5940

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 6000

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 6060

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 6120

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 6180

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 6240

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 6300

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 6360

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 6420

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 6480

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 6540

ttttgctcac atgt 6554

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

<210> 4

<211> 1096

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccgcggcct ccgcgccggg ttttggcgcc tcccgcgggc gcccccctcc tcacggcgag 60

cgctgccacg tcagacgaag ggcgcagcga gcgtcctgat ccttccgccc ggacgctcag 120

gacagcggcc cgctgctcat aagactcggc cttagaaccc cagtatcagc agaaggacat 180

tttaggacgg gacttgggtg actctagggc actggttttc tttccagaga gcggaacagg 240

cgaggaaaag tagtcccttc tcggcgattc tgcggaggga tctccgtggg gcggtgaacg 300

ccgatgatta tataaggacg cgccgggtgt ggcacagcta gttccgtcgc agccgggatt 360

tgggtcgcgg ttcttgtttg tggatcgctg tgatcgtcac ttggtgagta gcgggctgct 420

gggctggccg gggctttcgt ggccgccggg ccgctcggtg ggacggaagc gtgtggagag 480

accgccaagg gctgtagtct gggtccgcga gcaaggttgc cctgaactgg gggttggggg 540

gagcgcagca aaatggcggc tgttcccgag tcttgaatag aaccttcgct aatgcgggaa 600

agctcttatt cgggtgagat gggctggggc accatctggg gaccctgacg tgaagtttgt 660

cactgactgg agaactcggt ttgtcgtctg ttgcgggggc ggcagttatg gcggtgccgt 720

tgggcagtgc acccgtacct ttgggagcgc gcgccctcgt cgtgtcgtga cgtcacccgt 780

tctgttggct tataatgcag ggtggggcca cctgccggta ggtgtgcggt aggcttttct 840

ccgtcgcagg acgcagggtt cgggcctagg gtaggctctc ctgaatcgac aggcgccgga 900

cctctggtga ggggagggat aagtgaggcg tcagtttctt tggtcggttt tatgtaccta 960

tcttcttaag tagctgaagc tccggttttg aactatgcgc tcggggttgg cgagtgtgtt 1020

ttgtgaagtt ttttaggcac cttttgaaat gtaatcattt gggtcaatat gtaattttca 1080

gtgttagact agtaaa 1096

<210> 5

<211> 632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag acgaagctaa ggcgcgcctg 60

agaacttcag ggtgagtttg gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat 120

tcatgttata tggagggggc aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct 180

tgtatcacca tgcatggacc ctcatgataa ttttgtttct ttcactttct actctgttga 240

caaccattgt ctcctcttat tttcttttca ttttctgtaa ctttttcgtt aaactttagc 300

ttgcatttgt aacgaatcta gacaatcagg gtatattata ttgtacttca gcacagtttt 360

agagaacaat tgttataatt aaatgataag gtagaatatt tctgcatata aattctggct 420

ggcgtggaaa tattcttatt ggtagaaaca actacatcct ggtcatcatc ctgcctttct 480

ctttatggtt acaatgatat acactgtttg agatgaggat aaaatactct gagtccaaac 540

cgggcccctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg 600

tgctggttat tgtgctgtct catcaagctt aa 632

<210> 6

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggtgagct actgggacac cggggtgctg ctgtgcgccc tgctgagctg cctgctgctg 60

accggctcct cctccggcgg aagacccttc gtggagatgt acagcgagat ccccgagatc 120

attcacatga ccgaaggcag agagctggtg atcccctgca gagtgaccag ccccaacatc 180

accgtgaccc tgaaaaagtt ccccctcgac acactgatcc ccgacggcaa aagaatcatc 240

tgggacagca gaaagggctt tatcattagc aacgccacct acaaggaaat cggcctcctg 300

acctgcgaag ccaccgtgaa cggccacctg tacaagacca actacctgac acaccggcag 360

accaacacca tcatcgacgt ggtgctgtcc ccctcccacg gcatcgagct gtccgttggc 420

gagaaactgg tgctgaactg caccgcccgc accgaactga acgtgggcat cgacttcaac 480

tgggagtacc ccagcagcaa gcaccaacac aagaagctgg tgaaccggga cctgaagacc 540

caatccggct ccgaaatgaa gaaattcctg agcactctga ccatcgacgg cgtgaccaga 600

agcgaccagg gactgtacac ctgcgccgca tcctccgggc tgatgaccaa aaagaacagc 660

actttcgtca gagtgcacga gaag 684

<210> 7

<211> 524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agatctacgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg 60

ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact 120

aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg 180

ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc aagctggagt gcagtggcac 240

aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc 300

ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt 360

agagacgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct 420

acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg 480

tccttctgat tttgtaggta accacgtgcg gaccgagcgg ccgc 524

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

Claims

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4(I)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示；

Z2核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示，并且Z1和Z2通过键连接；

Z3为编码抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列；和

Z4为任选的hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)序列，

2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.:6所示。

3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述抗VEGF融合蛋白的序列如SEQ IDNO.:1所示。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的表达盒。

5.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体含有如权利要求1所述的表达盒。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述腺相关病毒为AAV2。

7.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体具有式II结构：

A1-Z1-Z2-Z3-Z4-A2-A3(II)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

A1为L-ITR序列；

Z1核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示；

Z2核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示，并且Z1和Z2通过键连接；

Z3为编码抗VEGF融合蛋白的核苷酸序列，所述抗VEGF融合蛋白的序列如SEQ ID NO.:1所示；

Z4为hGHpA序列；

A2为R-ITR序列；

A3为任选的标签序列。

8.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:2所示。

9.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体或权利要求5所述的腺相关病毒载体，或其染色体中整合有外源的权利要求1所述的表达盒。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下组：HEK细胞、感光细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞、或其组合。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述的感光细胞包括视锥细胞和/或视杆细胞。

12.一种如权利要求4所述的载体或权利要求5所述的腺相关病毒载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗VEGF相关眼部疾病，其中所述VEGF相关眼部疾病为黄斑变性和/或糖尿病视网膜病变。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述VEGF相关眼部疾病为湿性年龄相关性黄斑变性。

14.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求4所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

15.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求5所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。