JP2022525775A - ＳｐｙＴａｇ含有ペリプラズム融合タンパク質のプロテアーゼＴＳＰ及びＯＭＰＴ分解からの保護 - Google Patents
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Abstract
第１のタンパク質に付加、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸構築物、核酸構築物を含むベクター、及びペリプラズム融合タンパク質を製造する方法が提供される。また、ペリプラズム融合タンパク質を製造するためのプロテアーゼ欠損宿主細胞も提供される。
Description
関連出願を相互参照
本出願は、２０１９年３月１８日出願の米国仮出願第６２／８１９，７５８号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１８日出願の米国仮出願第６２／８１９，７５８号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
いくつかの技術によって、特定の所定の部位でのポリペプチドの共有結合又はライゲーションが可能になっている。一例を挙げると、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（非特許文献２２）システムであり、天然に存在するタンパク質における自然発生のイソペプチド結合形成の概念を用いて、１つのポリペプチドを別のポリペプチドに共有結合させている。このようなイソペプチド結合を含むStreptococcus pyogenesタンパク質ＦｂａＢ由来のドメインは２つの部分に分かれる。１つの部分、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１）は、自己触媒中心の一部（例えば、アスパラギン酸残基）を含む１３アミノ酸ペプチドである。他の部分、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、中心の他の部分（例えば、リジン）及び近接する触媒グルタミン酸塩又はアスパラギン酸残基を含む１１６アミノ酸タンパク質ドメインである。これらの２つのポリペプチドを混合することによって、自己触媒中心を回復し、イソペプチド結合の形成を導き、それによってＳｐｙＴａｇをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに共有結合的に連結する（非特許文献３２）。さらなるエンジニアリングによって、わずか８４のアミノ酸を有する短いＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、最適化されたＳｐｙＴａｇ００２（配列番号２）及び反応の早いＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２がもたらされた（全体が援用される非特許文献１７及び非特許文献１２）。さらなるエンジニアリングによって、拡散限界に近い反応による、別の最適化されたＳｐｙＴａｇ００３（配列番号３６）及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３がもたらされた（全体が援用される非特許文献１３）。
互いにライゲーションされる２つのポリペプチドは、典型的には、ポリペプチドが混合されると、イソペプチド結合が形成されるような、ＦｂａＢからの自己触媒中心の一部を有する各ポリペプチドとの融合タンパク質として製造される。例えば、ＳｐｙＴａｇに連結された第１のポリペプチド及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結された第２のポリペプチドは融合タンパク質として別々に製造され、そして第１及び第２のポリペプチドが一緒に混合されると、イソペプチド結合がＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの間で形成される。このタイプの融合タンパク質は、細菌中で製造される。多くの融合タンパク質は、細菌の細胞質において製造されるが、還元条件のために、ジスルフィド架橋タンパク質は、ジスルフィド結合を形成しないため、細胞質の還元環境において発現されるとき、適切に折り畳まれない。しかしながら、多くの重要なタンパク質の部類は、ジスルフィド結合を含んでいる。一例を挙げると、抗体フラグメントである。抗体Ｆｖ及びＦａｂフラグメントの機能発現が、酸化条件を有し、ジスルフィド結合の形成を可能にする、大腸菌などのグラム陰性細菌のペリプラズムへの発現タンパク質鎖の輸送を指示することによって行われ（Plueckthum A、1990、Antibodies from Escherichia coli、Nature 347、497-498）、これが、抗体エンジニアリング分野への道を開いた。多くのＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の細菌組換え発現が、文献に記載されているが、それらはほとんどもっぱら細菌細胞質において発現していた（非特許文献１３）。ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム細菌発現については、わずかな例しか存在せず（非特許文献４、非特許文献３）、収率は低いか、又は不明であった。非特許文献１３、非特許文献４、及び非特許文献３は、その全体が援用される。
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第１のタンパク質（例えば、抗原結合フラグメント）に付加され、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフ（例えば、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３）を含むペリプラズム融合タンパク質、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸構築物、核酸構築物を含むベクター、及びこのようなペリプラズム融合タンパク質を製造する方法が提供される。また、ペリプラズム融合タンパク質を製造するための突然変異プロテアーゼ欠損大腸菌細胞も提供される。
一実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、結合モチーフは、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、第１のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質は、タンパク質構造ドメインである。特定の実施形態において、リンカー配列は、精製タグを含む。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、第１のタンパク質のＣ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、タンパク質分解感受性がある。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、タンパク質分解耐性がある。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質は、抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質は、抗原結合フラグメントであり、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂである。いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂである。特定の実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、結合モチーフのＮ末端又はＣ末端に付加した精製タグをさらに含む。特定の実施形態において、結合モチーフは、第１のタンパク質のＣ末端を第２のタンパク質のＮ末端に、又は第１のタンパク質のＮ末端を第２のタンパク質のＣ末端に連結するリンカー配列である。
ペリプラズム融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物も提供される。核酸構築物を含むベクターも提供される。
第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質を製造する方法も提供され、結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み、又は結合モチーフは、配列番号３６又は配列番号３６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、大腸菌宿主細胞からペリプラズム融合タンパク質を回収することを含む。いくつかの実施形態において、大腸菌宿主細胞において発現される融合タンパク質の結合モチーフは、タンパク質分解耐性がある。特定の実施形態において、大腸菌宿主細胞において発現される融合タンパク質の結合モチーフは、タンパク質分解感受性がある。このような実施形態において、大腸菌宿主細胞は、１つ以上のペリプラズムプロテアーゼを欠損する変異細胞である。いくつかの実施形態において、本方法で使用される変異体大腸菌細胞は、プロテアーゼＴｓｐ（尾部特異的プロテアーゼ）をコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐを欠損している。いくつかの実施形態において、方法で使用される突然変異体大腸菌細胞は、それぞれプロテアーゼＴｓｐ及びＯｍｐＴ（外膜タンパク質Ｔ）をコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐ及びｏｍｐＴを欠損している。
また、プロテアーゼＴｓｐをコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐを欠損する大腸菌ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１ブルー、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株が提供される。いくつかの実施形態において、このような変異体大腸菌株は、結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含み、結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。また、プロテアーゼＴｓｐ及びｏｍｐＴをコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐ及びｏｍｐＴをそれぞれ欠損する大腸ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１ブルー、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株も提供される。いくつかの実施形態において、このような変異体大腸菌株は、結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含み、結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、このような変異体大腸菌株は、結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含み、結合モチーフは、配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
第１のタンパク質（例えば、抗原結合フラグメント又はタンパク質構造ドメイン）に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフ（すなわち、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３）を含むペリプラズム融合タンパク質、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸構築物、核酸構築物を含むベクター、及びペリプラズム融合タンパク質を製造する方法が提供される。また、ペリプラズム融合タンパク質を製造するためのプロテアーゼ欠損宿主細胞も提供される。
ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３結合モチーフを含む融合タンパク質は、大腸菌でペリプラズム発現させるとペリプラズムプロテアーゼによって消化されることが知見された。ＳｐｙＴａｇをリンカー配列なしでタンパク質のＣ末端又はＮ末端、タンパク質構造ドメイン、又はタンパク質構造ドメインフラグメントに直接結合させると、大腸菌で製造されている間にＳｐｙＴａｇがペリプラズムプロテアーゼに対して実質的に耐性がある融合タンパク質が得られる。ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３がタンパク質のＮ末端又はＣ末端又はタンパク質ドメインへリンカー配列により連結されると、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３は、細菌における融合タンパク質の発現の間、ペリプラズムプロテアーゼに対して感受性があることもまた知見された。このようなプロテアーゼ感受性融合タンパク質について、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３開裂を担うペリプラズムプロテアーゼを欠損する大腸菌宿主細胞が作製されている。
定義
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含む、本出願において使用される以下の用語は、以下に与えられる定義を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「一つの」、及び「その」は、内容が別段の明確な指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
特に断りのない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含む、本出願において使用される以下の用語は、以下に与えられる定義を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「一つの」、及び「その」は、内容が別段の明確な指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
「抗体」は、免疫グロブリン、複合体（例えば、融合）、又はそのフラグメント形成を指す。この用語には、抗体製造細胞株由来の、又はヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、移植、及びその他in vitro製造抗体などの天然な又は遺伝的に修飾された又は合成の形態を含む、in vitro抗体ライブラリー由来の、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの部類のポリクローナル又はモノクローナル抗体を含まれるが、これらに限定されない。「抗体」は、免疫グロブリン部分を有する融合タンパク質を含む複合形態も含むが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される「抗原結合フラグメント」という語句は、Ｆａｂなどの抗体の抗原結合部分を含むタンパク質を指す。他の抗原結合フラグメントには、可変フラグメント（Ｆｖ）、二硫化安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又は単鎖Ｆａｂフラグメント（ｓｃＦａｂ）が含まれる。抗原結合フラグメントのさらなる例には、重鎖抗体（ＶＨＨ）の可変ドメイン、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、又はシャーク可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）を含む抗原結合部位を含む抗原結合フラグメントの一価形態が含まれる。さらに、可変リンパ球受容体（ＶＬＲ）、アフィマー、アフィボディ、ダルピン、アンチカリン、モノボディ、又は抗原結合ペプチドなどの非抗体足場も、「抗原結合フラグメント」と考えることができる。
「結合モチーフ」という用語は、ポリペプチドに付加し、別のポリペプチドへの共有結合の形成を可能にするタンパク質配列を指す。結合モチーフの非限定的な例として、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、及びＳｐｙＴａｇ００３配列が挙げられる。ＳｐｙＴａｇ配列は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列と共有結合を形成する。結合モチーフは、Ｎ末端、Ｃ末端に融合されるか、又はポリペプチドのアミノ酸配列内に埋め込まれる。１つ以上のリンカー配列（例えば、グリシン／セリンリッチリンカー）又は１つ以上のタンパク質タグは、結合モチーフに隣接して、反応のための接近性を増強し、融合ポリペプチドの柔軟性を増強し、又はポリペプチドの精製及び／又は検出する。結合モチーフが２つ以上のタンパク質を連結する場合、結合モチーフのＮ末端及びＣ末端は、１つ以上のリンカー配列によって隣接されて、反応のための接近性を増強し、融合ポリペプチドの柔軟性を増強し、そしてポリペプチドの精製及び／又は検出をする。
「原核生物系」という用語は、細菌細胞（例えば、Escherichia又はSalmonellaを有する細菌細胞）又は原核生物ファージ又は細菌芽胞などの原核生物細胞を指す。「真核生物系」という用語は、動物、植物、真菌及び原生生物の細胞、ならびにレトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなどの真核生物ウイルスを含む真核生物細胞を指す。原核生物及び真核生物系はまとめて「発現系」と呼んでもよい。
「発現カセット」という用語は、ここではペリプラズム中で組換えポリペプチドを発現させる目的でベクター中に構築された機能ユニットを指すために用いられる。発現カセットは、プロモーター、転写ターミネーター配列、リボソーム結合部位、及び融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。発現系（例えば、真核生物発現系のエンハンサー及びポリアデニル化シグナル）に応じて、他の遺伝子成分を発現カセットに添加することができる。
本明細書中で使用される「ベクター」という用語は、好ましくは、細胞内で自己複製する核酸分子をいい、これは、挿入された核酸分子を、宿主細胞中及び／又は宿主細胞間で転移する。典型的には、ベクターは、複製起点、選択マーカー、及び／又はウイルスパッケージ信号、ならびに他の調節エレメントを含む環状ＤＮＡである。ベクター、ベクターＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージミドＤＮＡは、本発明の説明において区別なく用いられる。この用語には、主として細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために機能するベクター、主としてＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために機能する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。また、上記の機能の２つ以上を提供するベクターも含まれる。
本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語は、適切な宿主細胞に導入されると、適切な条件下で１つ以上のポリペプチドの転写及び翻訳を導くポリヌクレオチドである。「発現ベクター」という用語は、結合モチーフとインフレームで融合された当該のポリペプチドの発現を指向するベクターを指す。
本明細書中で使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかで任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。以下に、ポリヌクレオチドの非限定的な例を挙げると、遺伝子又は遺伝子フラグメントのコード領域又は非コード領域、連鎖分析から規定される遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーがある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ヌクレオチドポリマーの組立の前又は後に行われる。
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸、Ｄ又はＬの両光学異性体、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を指す。
本明細書中で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書中で区別なく用いられる。
本明細書中で使用される「タンパク質構造ドメイン」又は「ドメイン」という用語は、別個の疎水性コアを有する半自律的でコンパクトな折り畳み単位を指す（非特許文献９）。ドメインは、タンパク質鎖の他の部分からは独立して進化し、機能し、存在する所与のタンパク質配列及び構造の保存された部分である。各ドメインは、独立して安定かつ折り畳まれるコンパクトな三次元構造を形成する。タンパク質構造ドメインの例としては、ヒトＩｇＧ１及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の定常ドメイン（例えば、ヒンジ領域の最初の２つのアミノ酸を含むＣＨ１）が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質構造ドメインの「Ｃ末端」は、タンパク質データバンク（非特許文献５）において、同一又は密接に関連するタンパク質構造ドメイン（すなわち、少なくとも７０％の配列同一性を有する）の結晶構造において構造化されている（すなわち、結晶構造において可視である）と注釈される最後のアミノ酸をいう。タンパク質構造ドメインは、折り畳み能力、すなわち、構造ドメインを残す能力を失うことなく、Ｎ又はＣ末端上で最大１０個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）に短縮される。
本明細書中で使用される「宿主細胞」という用語は、開示される発現構築物のレシピエントであり得るか、又はレシピエントであった個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれる。子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異、意図的突然変異のために、必ずしも元の親細胞と完全に同一ではないことがある。
２つの核酸配列又はポリペプチドは、それぞれ、２つの配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が、以下に記載されるように、最大一致させるために整列されたときに同じである場合、「同一」と言われる。「同一」又はパーセント「同一」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列について、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は手動整列及び目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウにわたって最大一致させるために比較及び整列されたときに、同じであるか、又は同じアミノ酸残基又はヌクレオチドの指定されたパーセンテージを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列同一性のパーセンテージを、タンパク質又はペプチドに関して使用するとき、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、ここで、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、従って、分子の機能的特性を変化させないものとが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を補正するために上方に調節される。この調整を行うための手段は、当業者に周知されている。典型的には、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとして保存的置換をスコアリングし、それによって配列同一性のパーセンテージを増加させるものである。従って、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０と１との間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実行される例えば、Ｍｅｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１－１７（１９８８）のアルゴリズムに従って計算される。
比較ウィンドウにわたって最大一致させるために比較及び整列されたときに、同じである特定の割合のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する場合（例えば、特定の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する場合、又は領域が特定されていない場合は、指定された配列全体にわたって）、配列は、互いに「実質的に同一」である。
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として作用し、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用したり、代替パラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
本明細書中で使用される「比較ウィンドウ」は、１０～６００、約１０～約３００、約１０～約１５０からなる群から選択される数の連続する位置のいずれか１つのセグメントに対する参照であり、配列は２つの配列が最適に整列された後に、同じ数の連続する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウはまた、参照又は試験配列のいずれかの全長である。
配列同一性パーセント及び配列類似性は、Altschulら（J. Mol. Biol. 215:403-10、１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴ２．０分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（Worldwide Website: ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを識別することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を識別するものであり、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと並べたときに、いくつかの正の値の閾値スコアＴに一致するか、又はそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（前述のAltschulら）。この最初の近傍ワードヒットは、そらを含む長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットを、その累積アラインメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に延ばしていく。各方向におけるワードヒットの伸長は、蓄積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか、蓄積スコアが１つ以上の負スコアリング残基アラインメントの蓄積のためにゼロ以下になるか、又はいずれかの配列の末端に到達すると停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff、ProcNatlAcadSciUSA 89:10915（１９８９）を参照のこと）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両ストランド鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析も行う（例えば、Karlin & Altschul、ProcNat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチングが偶然に生じる確率の指示を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると考えられる。
ペリプラズム融合タンパク質
一実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質（図１Ａ～１Ｎ）に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列（例えば、図１Ｐ）内に埋め込まれた結合モチーフ（例えば、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３）を含む。本明細書中で使用される場合、「ペリプラズム融合タンパク質」は、適切な細菌宿主細胞のペリプラズムにおいて製造されるタンパク質を指し、２つのポリペプチドを含み、第１のものは任意のタンパク質であり、そして第２のものはＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３結合モチーフである。結合モチーフは、第１のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に、直接（図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｋ、１Ｎ）又はリンカー配列（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｌ、１Ｍ）を介して、付加させることができる。特定の実施形態において、第１のタンパク質がタンパク質構造ドメインである。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質は、抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂ）である。本明細書中で使用される場合、「結合モチーフ」は、ペリプラズムにおいて発現されるタンパク質に付加し、２つの結合モチーフが互いに接触したときに、別のポリペプチドに付加した別の結合モチーフ（例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２、又はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３）へのタンパク質ライゲーションを介する共有結合の形成を容易にするペプチド配列を指す。２つの結合モチーフ間の共有結合は自発的に、又は酵素の助けを借りて形成される。例えば、結合モチーフは、ＦｃフラグメントのＮ末端上の別の結合モチーフと、又は多量体化結合モチーフと共有結合を形成することができる。別の結合モチーフを有するＦｃフラグメントの例は、同時係属中の米国特許出願第６２／８１９，７４８号（複数のＦｃイソタイプに結合した抗原結合フラグメント及びサブクラス、２０１９年３月１８日出願、ＢＲＬ．１２３Ｐ）に記載されており、多量体化結合モチーフの例は、同時係属中の米国特許出願第６２／８１９，７５３号（抗原結合タンパク質、２０１９年３月１８日出願、ＢＲＬ．１２９Ｐ）に記載されており、それぞれ、その全体が援用される。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、配列番号１（すなわち、ＳｐｙＴａｇ）又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、配列番号２（すなわち、ＳｐｙＴａｇ００２）又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、結合モチーフは、配列番号３６（すなわち、ＳｐｙＴａｇ００３）又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質（図１Ａ～１Ｎ）に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列（例えば、図１Ｐ）内に埋め込まれた結合モチーフ（例えば、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３）を含む。本明細書中で使用される場合、「ペリプラズム融合タンパク質」は、適切な細菌宿主細胞のペリプラズムにおいて製造されるタンパク質を指し、２つのポリペプチドを含み、第１のものは任意のタンパク質であり、そして第２のものはＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３結合モチーフである。結合モチーフは、第１のタンパク質のＮ末端又はＣ末端に、直接（図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｋ、１Ｎ）又はリンカー配列（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｌ、１Ｍ）を介して、付加させることができる。特定の実施形態において、第１のタンパク質がタンパク質構造ドメインである。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質は、抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂ）である。本明細書中で使用される場合、「結合モチーフ」は、ペリプラズムにおいて発現されるタンパク質に付加し、２つの結合モチーフが互いに接触したときに、別のポリペプチドに付加した別の結合モチーフ（例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２、又はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３）へのタンパク質ライゲーションを介する共有結合の形成を容易にするペプチド配列を指す。２つの結合モチーフ間の共有結合は自発的に、又は酵素の助けを借りて形成される。例えば、結合モチーフは、ＦｃフラグメントのＮ末端上の別の結合モチーフと、又は多量体化結合モチーフと共有結合を形成することができる。別の結合モチーフを有するＦｃフラグメントの例は、同時係属中の米国特許出願第６２／８１９，７４８号（複数のＦｃイソタイプに結合した抗原結合フラグメント及びサブクラス、２０１９年３月１８日出願、ＢＲＬ．１２３Ｐ）に記載されており、多量体化結合モチーフの例は、同時係属中の米国特許出願第６２／８１９，７５３号（抗原結合タンパク質、２０１９年３月１８日出願、ＢＲＬ．１２９Ｐ）に記載されており、それぞれ、その全体が援用される。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、配列番号１（すなわち、ＳｐｙＴａｇ）又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、結合モチーフは、配列番号２（すなわち、ＳｐｙＴａｇ００２）又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、結合モチーフは、配列番号３６（すなわち、ＳｐｙＴａｇ００３）又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの例において、結合モチーフ（例えば、ＳｐｙＴａｇ）を第１のタンパク質に直接付加させる（すなわち、リンカー配列なし、図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｋ、１Ｎ）と、実質的にタンパク質分解非感受性である、すなわち、発現の間のペリプラズムプロテアーゼによる切断に対して抵抗性のあるペリプラズム融合タンパク質が生じる。
いくつかの実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質が第１のタンパク質と結合モチーフとの間に少なくとも１つのリンカー配列を含む。本明細書中で使用される「リンカー配列」又は「リンカー」は、ペプチド結合によって連結された１つ以上のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、１０又はそれ以上のアミノ酸残基）を含むペプチド又はポリペプチドを指す。このようなリンカーは、融合タンパク質の各成分が妨害されることなく、その意図される対象と相互作用することを可能にする回転自由度を提供する。これらのリンカーは、－（ＧＧＧＳ）n－（式中、ｎは１、２、３、４、又は５である）のようなグリシンとセリンの混合物である。他の適切なペプチド／ポリペプチドリンカー配列は、天然に存在する又は天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを任意で含む。任意で、ペプチド又はポリペプチドリンカー配列は、柔軟なペプチド又はポリペプチドである（図１Ｂ、１Ｅ、１Ｉ、１Ｌ）。柔軟なペプチド／ポリペプチドとしては、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ａｌａ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）2、（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）3、（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）4、（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）Ｇｌｙ4、2－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＳｅｒＧｌｙ4－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）2、Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ3、Ｇｌｙ－ＳｅｒＧｌｙ4－Ｓｅｒが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なペプチドリンカー配列は、タバコエッチウイルスプロテアーゼによって認識される線状エピトープであるＴＥＶリンカーＥＮＬＹＦＱＧを任意で含む。ペプチド／ポリペプチドとしては、ＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＧが挙げられるが、これに限定されない。他の適切なペプチドリンカー配列は、Ａｌａ－（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ）n－Ａｌａ（ｎ=１－５）のようなヘリックス形成リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＧＡＰ（Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ）配列である。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、精製タグを含む（図１Ｃ、１Ｆ、１Ｊ、１Ｍ）。精製タグとしては、ポリヒスチジン又はＨｉｓ－ｔａｇ及びＦＬＡＧ（登録商標）ｔａｇ（すなわち、アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ 式中、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｙはチロシンであり、そしてＫはリシンである）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、リンカー配列は、結合モチーフ（図Ｇ及びＮ）を含み、任意で、結合モチーフのＣ末端及びＮ末端のいずれか又は両方に付加した精製タグ及び／又は柔軟なリンカー配列を含む。いくつかの実施形態において、１～５０のアミノ酸残基の配列をリンカーとして使用することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、プロテアーゼ耐性である（すなわち、宿主細胞においてリンカーを有するポリペプチドのペリプラズム発現は、プロテアーゼによるリンカーの開裂なしに生じる）。２つ以上のリンカー配列がタンパク質と結合モチーフとの間で使用される場合、２つ以上のリンカー配列は同じであっても異なっていてもよい。
ペリプラズム融合タンパク質が第１のタンパク質と結合モチーフとの間にリンカー配列を含むいくつかの実施形態において、結合モチーフ（すなわち、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、及びＳｐｙＴａｇ００３）は、タンパク質分解感受性がある、すなわち、結合モチーフは、ペリプラズム発現の間に１つ以上の大腸菌プロテアーゼによって切断される。特定の実施形態において、ペリプラズムプロテアーゼによる結合モチーフの開裂は、リンカー長（すなわち、アミノ酸の数）に依存するが、リンカーアミノ酸組成には依存しない。
いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３結合モチーフを含む。この実施形態において、結合モチーフは、第１のタンパク質のＮ末端を第２のタンパク質のＣ末端に連結し（図１Ｇ）、又は第１のタンパク質のＣ末端を第２のタンパク質のＮ末端に連結する（図１Ｎ）。第２のタンパク質としては、抗原結合フラグメント、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他のペルオキシダーゼなどの酵素、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、分割蛍光タンパク質、及びＭＢＰが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ００２、又はＳｐｙＴａｇ００３を含むリンカー配列は、結合モチーフと、第１及び第２のタンパク質のいずれか又は両方との間に、精製タグ又は柔軟なリンカー配列をさらに含む。
特定の実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、結合モチーフのＮ末端（図１Ｄ、１Ｅ）、結合モチーフのＣ末端（図１Ｋ、１Ｌ）、又は結合モチーフのＮ末端及びＣ末端の両方（図１Ｆ及び１Ｍ）に付加した精製タグを有する。
核酸構築物
また、第１のタンパク質と結合モチーフとの間、及び／又は結合モチーフとペリプラズム融合タンパク質の第２のタンパク質との間にリンカーなしで、又は有りで、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸構築物も提供される。このような核酸は、適宜、原核生物宿主細胞中の発現ベクター中に存在する。
また、第１のタンパク質と結合モチーフとの間、及び／又は結合モチーフとペリプラズム融合タンパク質の第２のタンパク質との間にリンカーなしで、又は有りで、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸構築物も提供される。このような核酸は、適宜、原核生物宿主細胞中の発現ベクター中に存在する。
典型的には、Ｃ末端で結合モチーフに融合したＦａｂをコードするポリヌクレオチド配列が２つのペプチド、すなわちＦａｂのＬ鎖及びＨ鎖をコードする。ＳｐｙＴａｇのような結合モチーフは、Ｌ鎖又はＨ鎖のいずれかに、直接的に、又は１つ以上のリンカーを介して融合される。Ｆａｂ発現カセットは、Ｌ鎖とＨ鎖の両方をコードする１つのｍＲＮＡを製造するバイシストロン性ベクターを含み、そのうちの少なくとも１つは結合モチーフに融合される。また、Ｈ鎖とＬ鎖の両方は、それらのペリプラズムへの輸送を指示するためのシグナルペプチドを有する。
核酸構築物は、典型的に、種々のベクターに導入される。本明細書中に記載されるベクターは、一般に、融合タンパク質を発現するために必要とされる転写又は翻訳制御配列を含む。適切な転写又は翻訳制御配列は、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、及び転写及び翻訳のための終結部位を含むが、これらに限定されない。
複製起点（一般にｏｒｉ配列と呼ばれる）は、適当な宿主細胞内でベクターの複製を可能にする。ｏｒｉの選択は、使用される宿主細胞の型及び／又は遺伝子パッケージに依存する。宿主細胞が原核生物である場合、発現ベクターは、典型的には原核細胞内でのベクターの自律複製を指示するｏｒｉ配列を含む。好ましい原核生物ｏｒｉは、細菌細胞におけるベクター複製を指示することができる。この部類のｏｒｉの非限定的な例としては、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、その他の大腸菌起点が挙げられる。
本明細書中で使用される「プロモーター」は、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、プロモーターの下流（３´方向）に位置するコード領域の転写を開始することのできるＤＮＡ領域である。それは構成的であっても誘導的であってもよい。一般に、プロモーター配列は、その３´末端において転写開始部位によって結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基又はエレメントを含むように上流（５´方向）に伸長する。プロモーター配列内には、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインと同様に、転写開始部位がある。
プロモーターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞に大きく依存する。原核細胞については、種々の強いプロモーターが当該分野で公知である。好ましいプロモーターは、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター及びｐＢＡＤプロモーターである。
対象ベクターの構築において、タンパク質コード配列に関連する終結配列はまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び／又は転写終結信号を提供するために、転写されることが所望される配列の３´末端に挿入することもできる。ターミネーター配列は、好ましくは１つ以上の転写終結配列（例えば、ポリアデニル化配列）を含み、また、転写リードスルーをさらに破壊するために、さらなるＤＮＡ配列を含めることによって長くすることもできる。本発明の好ましいターミネーター配列（又は終結部位）は、それ自体の終結配列又は異種終結配列のいずれかの転写終結配列が続く遺伝子を有する。このような終結配列の例には、当技術分野で公知で、広く利用可能な種々の酵母転写終結配列又は哺乳動物ポリアデニル化配列に結合した終結コドンが含まれる。ターミネーターが遺伝子を含む場合、検出可能又は選択可能なマーカーをコードする遺伝子を使用することが有利であり、それによって、ターミネーター配列の存在及び／又は非存在（従って、転写単位の対応する不活性化及び／又は活性化）が検出及び／又は選択される手段を提供する。
上記のエレメントに加えて、ベクターは、選択可能マーカー（例えば、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含み、このようなマーカー遺伝子は、宿主細胞に同時導入された別のポリヌクレオチド配列上に保持される。選択可能な遺伝子が導入された宿主細胞のみが、選択的条件下で生存及び／又は増殖することとなる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、Ｇ４１８、メトトレキサートなどに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完するタンパク質、又は（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切なマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存し、異なる宿主についての適切な遺伝子は、当該分野で公知である。
一実施形態において、発現ベクターは、少なくとも２つの無関係な宿主系において複製することができるシャトルベクターである。このような複製を容易にするために、ベクターは、一般に、少なくとも２つの複製起点を含み、各宿主系において１つが有効である。典型的には、シャトルベクターは、真核宿主系及び原核宿主系において複製可能である。これにより、真核生物宿主（発現細胞型）におけるタンパク質発現の検出や、原核生物宿主（増幅細胞型）におけるベクターの増幅が可能となる。好ましくは、１つの複製起点はＳＶ４０又は２ｕに由来し、１つはｐＵＣに由来するが、ベクターの複製を指示する当技術分野で公知の任意の適切な起点を使用することができる。ベクターがシャトルベクターである場合、ベクターは、好ましくは、少なくとも２つの選択可能マーカーを含み、１つは発現細胞型について、１つは増幅細胞型についてである。当該分野で公知の、又は本明細書中に記載された任意の選択可能マーカーは、利用される発現系において機能するように使用される。
本発明に包含されるベクターは、組換えクローニング法を用いて、及び／又は化学合成によって得ることができる。ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化及びライゲーションなどの膨大な数の組換えクローニング技術が当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。当業者はまた、本明細書中に提供される配列データ、又は公的もしくは独占的データベース中の配列データを使用して、当該分野で利用可能な任意の合成手段によって所望のベクターを得ることができる。さらに、周知の制限及びライゲーション技術を使用して、本明細書中に記載された実施形態に従って、適切な配列を、種々のＤＮＡ供給源から切り出し、発現されるべき外因性配列と作動可能な関係で組み込むことができる。
融合タンパク質の製造方法
また、任意で、第１のタンパク質又は第１及び第２のタンパク質に、１つ以上のリンカーを介して、付加した結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質を製造する方法が提供される。一実施形態において、本方法は、宿主細胞においてペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養する工程を含む。大腸菌の任意の好適な株を用いて、ペリプラズム融合タンパク質を製造することができる。タンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、又はＭＢＰ）発現のために使用される抗体フラグメント大腸菌の１つのこのような菌株は、ＴＧ１菌株である。ＴＧ１菌株は、大腸菌Ｋ－１２（遺伝子型ｇｌｎ４４Ｖｔｈｉ－１Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＢ－ｈｓｄＳＭ）５（ｒK－ｍＫ－）Ｆ´［ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑ ＺｌａｃΔＭ１５］）に基づいており、これはペリプラズムにおける抗体及び抗体フラグメントの発現のために一般的に使用される（例えば、ペリプラズム発現を示す実験については非特許文献１６を参照のこと）。いくつかの実施形態において、大腸菌宿主細胞株は、Ｆ線毛消失型であるＴＧ１Ｆ－（遺伝子型ｇｌｎＶ４４ｔｈｉ－１Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ） Δ（ｍｃｒＢ－ｈｓｄＳＭ）５（ｒK－ｍK－））である。特定の実施形態において、大腸菌宿主細胞株としては、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、Ｃｍａｘ５アルファ、及び大腸菌における抗体フラグメントの機能的発現に好適な任意の大腸菌株が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、大腸菌宿主細胞は、１つ以上のペリプラズムプロテアーゼを欠損した突然変異細胞である。いくつかの実施形態において、突然変異体大腸菌細胞は、プロテアーゼＴｓｐ（尾部特異的プロテアーゼ）をコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐを欠損している。いくつかの実施形態において、突然変異体大腸菌細胞は、それぞれプロテアーゼＴｓｐ及びＯｍｐＴ（外膜タンパク質Ｔ）をコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐ及びｏｍｐＴを欠損している。プロテアーゼについての遺伝子は、例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子のような外来ＤＮＡ配列で遺伝子を欠失又は置換することによって「ノックアウト」される。プロテアーゼ遺伝子をノックアウトする１つのこのようなプロセスは、非特許文献８に記載されている。いくつかの実施形態において、プロテアーゼの遺伝子は、タンパク質分解活性が消失している、又は低下した変異プロテアーゼを製造するように修飾される（非特許文献１５）。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ又はｏｍｐＴプロテアーゼの発現が、アンチセンスモルホリノ、アンチセンスペプチド核酸、又は他のアンチセンスヌクレオチドオリゴマーによって阻害され（非特許文献１１）、それぞれ、大腸菌内のｔｓｐ又はｏｍｐＴプロテアーゼ活性の減少又は排除をもたらす。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼの両方が、アンチセンスモルホリノ、アンチセンスペプチド核酸、又はｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼ活性の低下又は排除をもたらす他のアンチセンスヌクレオチドオリゴマーによって阻害される。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ又はｏｍｐＴプロテアーゼ活性は、フェニルメタンスルホニルフルオリド又はｐ－トルエンスルホニルフルオリド（非特許文献２０）を含むがこれらに限定されない化学的プロテアーゼ阻害剤によって、アプロチニン（非特許文献６）又は金属カチオン（非特許文献２５）のようなペプチド又は小タンパク質によって減少又は排除される。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼ活性の両方が、上記した化学的阻害剤によって減少又は排除される。
また、任意で、第１のタンパク質又は第１及び第２のタンパク質に、１つ以上のリンカーを介して、付加した結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質を製造する方法が提供される。一実施形態において、本方法は、宿主細胞においてペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で、ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養する工程を含む。大腸菌の任意の好適な株を用いて、ペリプラズム融合タンパク質を製造することができる。タンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、又はＭＢＰ）発現のために使用される抗体フラグメント大腸菌の１つのこのような菌株は、ＴＧ１菌株である。ＴＧ１菌株は、大腸菌Ｋ－１２（遺伝子型ｇｌｎ４４Ｖｔｈｉ－１Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＢ－ｈｓｄＳＭ）５（ｒK－ｍＫ－）Ｆ´［ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑ ＺｌａｃΔＭ１５］）に基づいており、これはペリプラズムにおける抗体及び抗体フラグメントの発現のために一般的に使用される（例えば、ペリプラズム発現を示す実験については非特許文献１６を参照のこと）。いくつかの実施形態において、大腸菌宿主細胞株は、Ｆ線毛消失型であるＴＧ１Ｆ－（遺伝子型ｇｌｎＶ４４ｔｈｉ－１Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ） Δ（ｍｃｒＢ－ｈｓｄＳＭ）５（ｒK－ｍK－））である。特定の実施形態において、大腸菌宿主細胞株としては、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、Ｃｍａｘ５アルファ、及び大腸菌における抗体フラグメントの機能的発現に好適な任意の大腸菌株が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、大腸菌宿主細胞は、１つ以上のペリプラズムプロテアーゼを欠損した突然変異細胞である。いくつかの実施形態において、突然変異体大腸菌細胞は、プロテアーゼＴｓｐ（尾部特異的プロテアーゼ）をコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐを欠損している。いくつかの実施形態において、突然変異体大腸菌細胞は、それぞれプロテアーゼＴｓｐ及びＯｍｐＴ（外膜タンパク質Ｔ）をコードする機能的染色体遺伝子ｔｓｐ及びｏｍｐＴを欠損している。プロテアーゼについての遺伝子は、例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子のような外来ＤＮＡ配列で遺伝子を欠失又は置換することによって「ノックアウト」される。プロテアーゼ遺伝子をノックアウトする１つのこのようなプロセスは、非特許文献８に記載されている。いくつかの実施形態において、プロテアーゼの遺伝子は、タンパク質分解活性が消失している、又は低下した変異プロテアーゼを製造するように修飾される（非特許文献１５）。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ又はｏｍｐＴプロテアーゼの発現が、アンチセンスモルホリノ、アンチセンスペプチド核酸、又は他のアンチセンスヌクレオチドオリゴマーによって阻害され（非特許文献１１）、それぞれ、大腸菌内のｔｓｐ又はｏｍｐＴプロテアーゼ活性の減少又は排除をもたらす。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼの両方が、アンチセンスモルホリノ、アンチセンスペプチド核酸、又はｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼ活性の低下又は排除をもたらす他のアンチセンスヌクレオチドオリゴマーによって阻害される。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ又はｏｍｐＴプロテアーゼ活性は、フェニルメタンスルホニルフルオリド又はｐ－トルエンスルホニルフルオリド（非特許文献２０）を含むがこれらに限定されない化学的プロテアーゼ阻害剤によって、アプロチニン（非特許文献６）又は金属カチオン（非特許文献２５）のようなペプチド又は小タンパク質によって減少又は排除される。いくつかの実施形態において、ｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼ活性の両方が、上記した化学的阻害剤によって減少又は排除される。
変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株ＳＫ４（ＤＳＭ３３００４）及びＳＫ１３（ＤＳＭ３３００５）を、Leibniz Institute DSMZ－German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraβe 7B,38124 Braunschweig、Germanyに２０１９年１月８日に寄託した。ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ３３００４を有する変異体大腸菌ＴＧ１株ＳＫ４はｔｓｐが欠損しており、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ３３００５を有する変異体大腸菌ＴＧ１株ＳＫ１３は、ｔｓｐ及びｏｍｐＴの両方が欠損している。
ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターは、標準的な技術を使用して、例えば、化学的方法（Green R、Rogers EJ. Transformation of chemically competent E.coli. Methods Enzymol 2013; 529:329－36）を使用することによって、又はエレクトロポレーションによって、細胞を形質転換させる。結合モチーフが、配列番号１（ＳｐｙＴａｇ）であるいくつかの実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、ｔｓｐが欠損しているＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ３３００４を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株に形質転換させる。結合モチーフが配列番号２（ＳｐｙＴａｇ００２）又は配列番号３６（ＳｐｙＴａｇ００３）であるいくつかの実施形態において、ペリプラズム融合タンパク質は、ｔｓｐ及びｏｍｐＴが欠損しているＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ３３００５を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株に形質転換させる。
１つ以上のマーカーを発現し得る細胞は、その中に組み込まれる選択システムのポリペプチド／遺伝子又はポリペプチド成分によって与えられる特性（例えば、抗生物質耐性）のために、特定の人工的に課される状態、例えば、培養培地への毒素又は抗生物質の添加で、生存／成長／増殖することができる。１つ以上のマーカーを発現することができない細胞は、人工的に課された条件において生存／成長／増殖することができない。
本明細書に記載の方法において、任意の適切な選択システムを使用することができる。典型的には、選択システムは、既知の抗生物質、例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子に対する耐性を提供する１つ以上の遺伝子をベクターに含めることに基づく。関連する抗生物質の存在下で増殖する細胞は、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子と所望のタンパク質の両方を発現するので、選択することができる。
一実施形態において、本方法は、形質転換細胞を培地中で培養し、それによってペリプラズム融合タンパク質を発現させる工程をさらに含む。
本方法はまた、ペリプラズム融合タンパク質を発現するために、誘導性発現系又は構成的プロモーターを使用することができる。
任意の好適な培地を使用して、形質転換細胞を培養することができる。培地は特定の選択システムに適合させることができ、例えば、培地は、形質転換に成功した細胞のみが培地中で増殖することを可能にするために、抗生物質を含むことができる。
次いで、発現された融合タンパク質は、まず、全細胞溶解又はペリプラズム溶解のいずれかによって細菌を溶解することによって、宿主細胞のペリプラズムから回収される。本方法は、ペリプラズム融合タンパク質を抽出及び精製するための１つ以上の工程をさらに含むことができる。ペリプラズム融合タンパク質は、これらに限定されるものではないが、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、チオフィル、混合モード樹脂、Ｈｉｓ－ｔａｇのためのニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）樹脂、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）のためのＳｔｒｅｐｏｒ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）又はＳｔｒｅｐｏｒ ＸＴ樹脂、ＦＬＡＧ（登録商標）－ｔａｇ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法、硫酸アンモニウム、エタノール又はＰＥＧ分画／沈殿、イオン交換膜、膨張床吸着クロマトグラフィー、又は模擬移動床クロマトグラフィーを含む、好適な精製手順によって、細胞抽出物から分離することができる。
いくつかの実施形態において、本方法は、精製後のペリプラズム融合タンパク質の発現量を測定する工程をさらに含む。
追加の開示及び請求可能な主題事項
項目１ 第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質であって、前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、ペリプラズム融合タンパク質。
項目１ 第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質であって、前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、ペリプラズム融合タンパク質。
項目２ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のＮ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している、項目１に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目３ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のＣ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している、項目１に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目４ 前記リンカー配列は、精製タグを含む、項目－２又は３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目５ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のタンパク質構造ドメインのＣ末端に直接付加し、前記結合モチーフは、タンパク質分解耐性がある、項目３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目６ 前記タンパク質構造ドメインは、ＦＲ４領域内でＣ末端が短縮されたヒトｓｃＦｖ単鎖抗体フラグメントである、項目５に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目７ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質中の前記タンパク質構造ドメインのＣ末端に、第１又は第２のアミノ酸リンカーを介して、付加している、項目３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目８ 前記結合モチーフは、ヒト重鎖ＣＨ１抗体ドメインのＩＭＧＴ位置１２１でＣ末端に、２、３、又は４アミノ酸リンカーを介して、付加している、項目３のいずれか一項に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目９ 前記結合モチーフは、ヒト定常軽鎖抗体ドメインのＩＭＧＴ位置１２１のＣ末端に、２、３、又は４アミノ酸リンカーを介して、付加している、項目３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目１０ 前記結合モチーフのＮ末端又はＣ末端に付加した精製タグをさらに含む、項目１～９のいずれか一項に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目１１ 前記結合モチーフは、第１のタンパク質のＣ末端を第２のタンパク質のＮ末端又は第１のタンパク質のＮ末端と第２のタンパク質のＣ末端とを連結している、項目１～１０のいずれか一項に記載のペリプラズム融合タンパク質。
項目１２ 項目１～１１のいずれか一項に記載の前記ペリプラズム融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
項目１３ 項目１２に記載の核酸構築物を含むベクター。
項目１４ ペリプラズム融合タンパク質を製造する方法であって、
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、
ｂ）前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は
ｃ）前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失；又は
ｄ）前記Ｔｓｐプロテアーゼ活性を減少又は消失させる阻害剤又は不活性化剤、又はＴｓｐプロテアーゼ発現の阻害剤
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失している、方法。
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、
ｂ）前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は
ｃ）前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失；又は
ｄ）前記Ｔｓｐプロテアーゼ活性を減少又は消失させる阻害剤又は不活性化剤、又はＴｓｐプロテアーゼ発現の阻害剤
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失している、方法。
項目１５ ペリプラズム融合タンパク質を製造する方法であって、
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｂ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、方法。
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｂ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、方法。
項目１６ ペリプラズム融合タンパク質を製造する方法であって、
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）Ｔｓｐプロテアーゼの阻害剤又は不活性化剤、又はＴｓｐ発現の阻害剤、及び
ｂ）ｏｍｐＴプロテアーゼの阻害剤又は不活性化剤、又はｏｍｐＴ発現の阻害剤
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、方法。
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）Ｔｓｐプロテアーゼの阻害剤又は不活性化剤、又はＴｓｐ発現の阻害剤、及び
ｂ）ｏｍｐＴプロテアーゼの阻害剤又は不活性化剤、又はｏｍｐＴ発現の阻害剤
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、方法。
項目１７ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のＮ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
項目１８ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のＣ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
項目１９ 前記第１のタンパク質は、タンパク質構造ドメインである、項目１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
項目２０ 前記リンカー配列は、精製タグを含む、項目１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
項目２１ 前記結合モチーフは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、前記第１のタンパク質のＣ末端に直接付加している、項目１８に記載の方法。
項目２２ 前記結合モチーフは、タンパク質分解感受性がある、項目１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
項目２３ 前記結合モチーフは、タンパク質分解耐性がある、項目１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
項目２４ 前記第１のタンパク質は、抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂを含む、項目１４～２３のいずれか一項に記載の方法。
項目２５ 前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂである、項目２４に記載の方法。
項目２６ 前記ペリプラズム融合タンパク質は、前記結合モチーフのＮ末端又はＣ末端に付加した精製タグをさらに含む、項目１４～２５のいずれか一項に記載の方法。
項目２７ 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のＣ末端を、第２のタンパク質のＮ末端に、又は前記第１のタンパク質のＮ末端を、第２のタンパク質のＣ末端に連結する、項目１４～２５のいずれか一項に記載の方法。
項目２８ 前記大腸菌宿主細胞は、２０１９年１月８日に寄託されたＤＳＭ受託番号３３００４を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株である、項目１４に記載の方法。
項目２９ 前記大腸菌宿主細胞は、２０１９年１月８日に寄託されたＤＳＭ受託番号３３００５を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株である、項目１５又は１６に記載の方法。
項目３０ 突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失した、大腸菌ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株。
項目３１ 結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含み、前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、項目３０に記載の大腸菌株。
項目３２ ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｂ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失した、大腸菌ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株。
ｂ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失した、大腸菌ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株。
項目３３
配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸、又は
配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸
を含む、項目３２に記載の大腸菌株。
配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸、又は
配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸
を含む、項目３２に記載の大腸菌株。
項目３４ 前記結合モチーフは、タンパク質分解感受性がある、項目３０～３３のいずれか一項に記載の大腸菌株。
項目３５ 前記結合モチーフは、タンパク質分解耐性がある、項目３０～３３のいずれか一項に記載の大腸菌株。
項目３６
ａ）配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフであって、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質の発現について、
突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失し、
ｂ）配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列をそれぞれ含む結合モチーフであって、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質の発現について、
ｉ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｉｉ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失した、突然変異大腸菌株。
ａ）配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフであって、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質の発現について、
突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失し、
ｂ）配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列をそれぞれ含む結合モチーフであって、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質の発現について、
ｉ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｉｉ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失した、突然変異大腸菌株。
項目３７ 共に２０１９年１月８日に寄託された、ＤＳＭ受託番号３３００４又は３３００５を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株。
実施例
以下の実施例は、例示のためのみであり、限定するものではない。当業者であれば、本質的に同じ又は類似の結果をもたらすように変更又は修正することができる様々な重要でないパラメータについては、容易に認識される。
以下の実施例は、例示のためのみであり、限定するものではない。当業者であれば、本質的に同じ又は類似の結果をもたらすように変更又は修正することができる様々な重要でないパラメータについては、容易に認識される。
実施例１－ＸがリンカーであるＦａｂ－Ｘ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現
短縮重鎖のＣ末端にＳｐｙＴａｇを有するＦａｂフォーマットのヒト抗体フラグメントをコードする遺伝子（すなわち、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ構築物）を、ＦａｂのＨ鎖及びＬ鎖にシグナル配列を有する発現ベクターにクローニングした。これは、細菌輸送によって新生鎖をペリプラズムに導く。この実施例で使用したＦａｂ遺伝子は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びヒンジ領域の最初の４つのアミノ酸（第１ヒンジシステインまでで、それは含まれない）を有する短縮重鎖を有する軽鎖（Ｃ末端システインなし）の非共有ヘテロダイマーをコードした。次いで、大腸菌ＴＧ１Ｆ（Ｆ－エピソームなし、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）をかかるベクターで形質転換した。５つの異なる抗体に由来するＦａｂ構築物を試験した。構築物の部分配列を図２に示す。形質転換体を、０．１％グルコース及びクロラムフェニコールと共に２５０ｍＬの２ｘＹＴブロス中で培養した。３７℃で１時間増殖させた後、０．８ｍＭ ＩＰＴＧで培養を誘導した。発現を３０℃で約１６時間進行させた。培養物を遠心分離し、細胞を－８０℃で凍結した。細胞を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）で溶解した。次いで、融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって（例えば、ヘキサヒスチジンタグを有する融合タンパク質についてはＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって、又、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）を有する融合タンパク質についてはＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）クロマトグラフィーによって）精製し、３×ＰＢＳに緩衝液交換した。融合タンパク質の純度は、非還元条件下、４～２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ）及びＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定した。さらに、全ての精製Ｆａｂフラグメントを、Ｆａｂ抗原（４℃で一晩、マイクロタイタープレートウェルの表面上にコーティングされたＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）を使用して、ＥＬＩＳＡ（２μｇ／ｍｌで）によって官能基について試験した。Ｆａｂフラグメントのその抗原への結合を、ＨＲＰ標識抗Ｆａｂ（ＳＴＡＲ１２６Ｐ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）又は抗ヒスチジンタグ（ＭＣＡ１３９６Ｐ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）二次抗体及びＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて検出した。
短縮重鎖のＣ末端にＳｐｙＴａｇを有するＦａｂフォーマットのヒト抗体フラグメントをコードする遺伝子（すなわち、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ構築物）を、ＦａｂのＨ鎖及びＬ鎖にシグナル配列を有する発現ベクターにクローニングした。これは、細菌輸送によって新生鎖をペリプラズムに導く。この実施例で使用したＦａｂ遺伝子は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びヒンジ領域の最初の４つのアミノ酸（第１ヒンジシステインまでで、それは含まれない）を有する短縮重鎖を有する軽鎖（Ｃ末端システインなし）の非共有ヘテロダイマーをコードした。次いで、大腸菌ＴＧ１Ｆ（Ｆ－エピソームなし、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）をかかるベクターで形質転換した。５つの異なる抗体に由来するＦａｂ構築物を試験した。構築物の部分配列を図２に示す。形質転換体を、０．１％グルコース及びクロラムフェニコールと共に２５０ｍＬの２ｘＹＴブロス中で培養した。３７℃で１時間増殖させた後、０．８ｍＭ ＩＰＴＧで培養を誘導した。発現を３０℃で約１６時間進行させた。培養物を遠心分離し、細胞を－８０℃で凍結した。細胞を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）で溶解した。次いで、融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって（例えば、ヘキサヒスチジンタグを有する融合タンパク質についてはＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって、又、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）を有する融合タンパク質についてはＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）クロマトグラフィーによって）精製し、３×ＰＢＳに緩衝液交換した。融合タンパク質の純度は、非還元条件下、４～２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ）及びＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定した。さらに、全ての精製Ｆａｂフラグメントを、Ｆａｂ抗原（４℃で一晩、マイクロタイタープレートウェルの表面上にコーティングされたＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）を使用して、ＥＬＩＳＡ（２μｇ／ｍｌで）によって官能基について試験した。Ｆａｂフラグメントのその抗原への結合を、ＨＲＰ標識抗Ｆａｂ（ＳＴＡＲ１２６Ｐ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）又は抗ヒスチジンタグ（ＭＣＡ１３９６Ｐ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）二次抗体及びＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて検出した。
Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質を精製する最初の試みは成功しなかった。Ｆａｂ重鎖（配列番号４）のＣ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓペプチド配列を含む構築物は精製できなかったが、これはＳｐｙＴａｇ（配列番号３－５及び８－１０）のＣ末端に精製タグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ又はＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標））を有する他の全ての構築物と同様であった。一方、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にＨｉｓ－ＳｐｙＴａｇ又はＨｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－ＦＬＡＧペプチド配列を含む構築物（それぞれ配列番号６及び７）を精製することができたが、これらの構築物は、その後のＳｐｙＴａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質ライゲーション反応において反応性ではない。融合タンパク質のＳｐｙＴａｇ部分のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとのタンパク質ライゲーションを試験するために、各融合タンパク質（最終濃度１５μＭ）を、１ｘＰＢＳ緩衝液中のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ(最終濃度２０μＭ）と混合し、室温で２時間カップリングさせた。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、細菌細胞質発現によって製造され、非特許文献３２に記載されているように、Ｎｉ ＮＴＡを介して精製された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、ＳｐｙＴａｇ融合－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒカップリング生成物に対応するゲル上の新しいバンドの出現について試験した。正しいサイズの新たなＳｐｙＴａｇ融合タンパク質－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒバンドは、融合タンパク質のいずれについても観察されなかったことから、融合タンパク質のいずれもＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに結合せず、融合タンパク質のＳｐｙＴａｇ部分が無傷でも完全に機能的でもなかったことが示唆された。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、ＳｐｙＴａｇが１つ以上のペリプラズムプロテアーゼによる切断に感受性があると仮定した。
融合タンパク質のどこで開裂が起こったかを決定するために、Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号４）及びＦａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－ＦＬＡＧ（配列番号７）融合タンパク質の発現生成物を、ウェスタンブロット分析（還元サンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＡｎｙＫＤ ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたＳＤＳ ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）への転移）によって分析した。融合タンパク質の発現生成物を、ＨＲＰ標識抗－ＦＬＡＧ（登録商標）抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ８５９２）又はＨＲＰ標識抗ヒスチジンタグ抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＭＣＡ１３９６Ｐ）を用いたウエスタンブロット分析によって分析した。ウエスタンブロットの結果を図３に示す。
結果：図３のウェスタンブロットに示されるように、Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ融合タンパク質の発現生成物は、標識抗－ＦＬＡＧ（登録商標）抗体によって認識されたが、抗ヒスチジンタグ抗体によっては認識されなかったことから、ヒスチジンタグ含有部分が融合タンパク質のＣ末端から切断された、すなわち、切断がＦＬＡＧ配列の後に生じたことが示唆された。Ｆａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－フラグ融合タンパク質の発現生成物は、標識抗ヒスチジンタグ抗体によって認識されたが、標識抗フラグ抗体によっては認識されなかったことから、融合タンパク質のフラグ含有部分が、融合タンパク質のＣ末端から切断されたこと、すなわちヒスチジンタグの後に切断が起こったことが示唆された。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－質量分析（４８００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を用いて、Ｎｉ－ＮＴＡにより精製されたＦａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ（配列番号６）の発現生成物の軽鎖及び重鎖ペプチドの質量を決定した。サンプルを脱塩し（ＺｉｐＴｉｐＣ４、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、シナピン酸と共結晶化させた。質量は、５０００～５００００ｍ／ｚの線形モードで決定した。１つのスペクトルに対して４０００回のレーザショットを加えた。タンパク質標準Ｉ（Ｂｒｕｋｅｒ）を質量較正に使用した。質量分析法の結果を以下に示す。
軽鎖：
計算質量（全長） ２２６９１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２２６９１Ｄａ
重鎖：
計算質量（全長） ２６４３７Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２５４１６Ｄａ
計算質量（－９ａａ） ２５４０３Ｄａ
計算質量（全長） ２２６９１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２２６９１Ｄａ
重鎖：
計算質量（全長） ２６４３７Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２５４１６Ｄａ
計算質量（－９ａａ） ２５４０３Ｄａ
質量分析結果は、９つのアミノ酸が、Ｆａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のＣ末端から切断されたことを示した。従って、ＳｐｙＴａｇのＣ末端からの９つのアミノ酸残基（これは、長さが１３個のアミノ酸：AHIVMVDAYKPTK、配列番号１）を、大腸菌ペリプラズム中のプロテアーゼによって、アミノ酸位置４のバリンの後に切断した。理論に束縛されることを望むものではないが、出願人は、ＳｐｙＴａｇがすべての構築物において切断されたので、ＳｐｙＴａｇの切断は、ＳｐｙＴａｇの前後のアミノ酸配列とは無関係であると考える。
実施例２－種々のマルトース結合タンパク質－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現
ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ ｔａｇ（配列番号１１）又はＨｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－ＦＬＡＧ ｔａｇ（配列番号１２）のいずれかをＣ末端に有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－に形質転換した。この実施例で使用したＭＢＰは、Ｃ末端から４つのアミノ酸が除去されていた。ＭＢＰ含有構築物の部分配列を図４に示す。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載のように行った。
ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ ｔａｇ（配列番号１１）又はＨｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－ＦＬＡＧ ｔａｇ（配列番号１２）のいずれかをＣ末端に有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－に形質転換した。この実施例で使用したＭＢＰは、Ｃ末端から４つのアミノ酸が除去されていた。ＭＢＰ含有構築物の部分配列を図４に示す。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載のように行った。
ペリプラズム発現ＭＢＰ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質を精製する最初の試みは成功しなかった。実施例１のＦａｂフラグメントと同様に、ＭＢＰのＣ末端に、ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓペプチド配列を含むペリプラズム構築物は精製できなかった。ＭＢＰのＣ末端に、Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－ＦＬＡＧペプチド配列を含む構築物を精製することができたが、その後のＳｐｙＴａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質ライゲーション反応において反応性ではなかった。実施例１に記載したように、精製前の発現生成物のウェスタンブロット分析で、各構築物の最初のタグは検出されたが、最後のタグは検出されなかったという点で同様の結果となった。
ＭＢＰΔ４ａａ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－ＦＬＡＧ構築物（配列番号１２）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を、実施例１に記載のように行った。質量分析法の結果を以下に示す。
全長タンパク質：
計算質量（全長） ４４２４１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ４４２７３Ｄａ（全長）
検出質量（ｍ／ｚ） ４２０３２Ｄａ（主生成物）
計算質量（１－３８２ａａ） ４２０１１Ｄａ
計算質量（全長） ４４２４１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ４４２７３Ｄａ（全長）
検出質量（ｍ／ｚ） ４２０３２Ｄａ（主生成物）
計算質量（１－３８２ａａ） ４２０１１Ｄａ
質量分析法の結果により、少量の全長タンパク質が示された。しかしながら、主生成物は、アミノ酸１～３８２個からなり、開裂がＳｐｙＴａｇのアミノ酸位置４のバリンの後に起こったことが示された。これは、実施例１のＦａｂフラグメントについて開裂が起こったのと同じ位置である。理論に束縛されることを望むものではないが、本出願人らは、構造的に完全に独立したタンパク質（すなわち、ＭＢＰ）でも開裂が起こるので、ＳｐｙＴａｇの開裂は、Ｆａｂアミノ酸配列又は構造に依存しないと考える。質量分析法によってまた、ペリプラズムへの輸送のためのｏｍｐＴシグナルペプチドが開裂されたことが示され、これは、タンパク質のペリプラズムへの転移後に生じる。細胞質における全長ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現は、非特許文献１３に記載されているので、出願人らは、実施例１及び２に記載のＳｐｙＴａｇ開裂がペリプラズムにおいて起こったと仮定した。
この仮説を検証するために、Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ及びＨｉｓ－ｔａｇを有するＭＢＰをｏｍｐＴシグナルペプチドなしで細胞質発現用の発現ベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換した。発現及び精製は、実施例１に記載したように行った。構築物の細胞質発現は、高収率（約１１ｍｇ／Ｌ）の全長生成物となった。
Ｆａｂ及びＭＢＰ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現は、切断されたＳｐｙＴａｇを有する短縮タンパク質をもたらし、同一のアミノ酸配列（シグナルペプチドなし）を有するＭＢＰの細胞質発現は、全長生成物をもたらした。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、ＳｐｙＴａｇの開裂が１つ以上のペリプラズムプロテアーゼによって引き起こされたと仮定した。
実施例３－ｓｃＦｖ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号３４、図９）を有するｓｃＦｖをコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－に形質転換した。ｓｃＦｖ構築物の部分配列を図９に示す。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載のように行った。
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号３４、図９）を有するｓｃＦｖをコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－に形質転換した。ｓｃＦｖ構築物の部分配列を図９に示す。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載のように行った。
ペリプラズムで発現されたｓｃＦｖ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質を精製する最初の試みは成功しなかった。実施例１のＦａｂフラグメント及び実施例２のＭＢＰ構築物と同様に、ｓｃＦｖのＣ末端に、ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓペプチド配列を含むペリプラズムｓｃＦｖ構築物は、Ｈｉｓ－ｔａｇを介して精製することができなかった。
実施例４－種々の細菌株におけるＸがリンカーであるＦａｂＸ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現
Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号３）及びＦａｂ-ＦＬＡＧ-Ｓｐｙ-Ｈｉｓ（配列番号４）構築物をそれぞれ、ペリプラズム発現のために以下の大腸菌株に形質転換して、どのペリプラズムプロテアーゼがＳｐｙＴａｇを切断したかを決定した。
Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号３）及びＦａｂ-ＦＬＡＧ-Ｓｐｙ-Ｈｉｓ（配列番号４）構築物をそれぞれ、ペリプラズム発現のために以下の大腸菌株に形質転換して、どのペリプラズムプロテアーゼがＳｐｙＴａｇを切断したかを決定した。
１．ＴＧ１Ｆ（Ｆ－エピソームなし、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）
２．Ｊｗ０１５７：ｄｅｇＰ－（Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）
３．ＫＳ４７６：ｄｅｇＰ－（Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）
４．ＫＳ１０００：ｐｒｃ－（又はｔｓｐ－）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
５．ＪＷ３２０３：ｄｅｇＱ－（Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）
６．２７Ｃ２：ｄｅｇＰ－、ｐｔｒ３－、ｏｍｐＴ（ＡＴＣＣ）
７．ＨＭ１３０：ｄｅｇＰ－、ｐｔｒ－、ｏｍｐＴ－、ｔｓｐ－、ｅｄａ（米国、テキサス州、オースチン）
２．Ｊｗ０１５７：ｄｅｇＰ－（Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）
３．ＫＳ４７６：ｄｅｇＰ－（Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）
４．ＫＳ１０００：ｐｒｃ－（又はｔｓｐ－）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
５．ＪＷ３２０３：ｄｅｇＱ－（Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）
６．２７Ｃ２：ｄｅｇＰ－、ｐｔｒ３－、ｏｍｐＴ（ＡＴＣＣ）
７．ＨＭ１３０：ｄｅｇＰ－、ｐｔｒ－、ｏｍｐＴ－、ｔｓｐ－、ｅｄａ（米国、テキサス州、オースチン）
形質転換体を実施例１に記載のように培養し、発現させ、精製した。各大腸菌株との精製融合タンパク質の濃度を決定し、各融合の発現生成物を、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。全長Ｆａｂ（タグを含む）の発現は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で重鎖及び軽鎖として可視であったが、ＳｐｙＴａｇ開裂は、精製タグなしのＦａｂをもたらし、精製されなかった。両タイプの融合タンパク質は、ＫＳ１０００（ｔｓｐ－）菌株とＨＭ１３０（ｄｅｇＰ－、ｐｔｒ－、ｏｍｐＴ－、ｔｓｐ－、ｅｄａ）菌株のみで全長タンパク質として発現し、これは、ｔｓｐプロテアーゼがＳｐｙＴａｇの切断に関与することを示した。
実施例５－Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ構築物のためにＴＧ１Ｆ株を用いたノックアウト細胞株の生成
ＴＧ１Ｆを除いて実施例４で使用した全の発現株は、十分に増殖せず、適切に折り畳まれた可溶性Ｆａｂで高収率とはならなかったため、ＴＧ１Ｆプロテアーゼノックアウト株を構築して、ＳｐｙＴａｇに融合したＦａｂの収率を増加させた。
ＴＧ１Ｆを除いて実施例４で使用した全の発現株は、十分に増殖せず、適切に折り畳まれた可溶性Ｆａｂで高収率とはならなかったため、ＴＧ１Ｆプロテアーゼノックアウト株を構築して、ＳｐｙＴａｇに融合したＦａｂの収率を増加させた。
非特許文献８に記載されているように、ｔｓｐ遺伝子、ｄｅｇＰ遺伝子又はｔｓｐ遺伝子とｄｅｐＰ遺伝子の両方をノックアウトした変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ細胞株を作製した。簡単に述べると、ＦＲＴ部位と抗生物質耐性遺伝子を含む相同フランキング領域をもつＰＣＲ生成物を、λリコンビナーゼを含むプラスミドと共に形質転換することによって、遺伝子をノックアウトした。遺伝子を再結合によりＰＣＲ生成物と置き換えた抗生物質耐性によってクローンが選択された。次の段階では、これらのクローンにＦｌｐリコンビナーゼをトランスフェクトし、耐性遺伝子の切り出しを導いた。
Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ及びＦａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ構築物（すなわち、実施例４と同じ構築物）を、上記で構築した菌株、すなわち、ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐ（ＳＫ４、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ３３００４）、ＴＧ１Ｆ－ΔｄｅｇＰ、及びＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇＰ二重ノックアウトに形質転換した。発現した融合タンパク質を精製し、実施例１に記載したようにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
結果：ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐ菌株（ＳＫ４）とＴＧ１ΔｄｅｇＰダブルノックアウト菌株では、両タイプの融合タンパク質が全長タンパク質として発現したが、ＴＧ１Ｆ－ΔｄｅｇＰ菌株では発現しなかったことから、ｄｅｇＰはＳｐｙＴａｇ開裂に関与しないことが示された。さらに、ＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐとＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇＰの発現は同等の収率を与え、ｔｓｐのみがＳｐｙＴａｇを開裂すると結論した。
次に、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ及びＦａｂ－ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ構築物を、タンパク質ライゲーションによってＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと共有結合を形成する能力について試験した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、細菌細胞質発現によって製造され、非特許文献３２に記載されるように、Ｎｉ ＮＴＡを介して精製された。融合タンパク質を発現させ、上記のようにＳＫ４菌株を用いて精製した。各融合タンパク質（最終濃度１５μＭ）を、１×ＰＢＳ緩衝液中のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（最終濃度２０μＭ）と混合し、１５分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、及び室温で一晩カップリングさせた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、ＳｐｙＴａｇ融合－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合生成物に対応するゲル上の新しいバンドの出現について試験した（図５を参照のこと）。正しいサイズの新たなＳｐｙＴａｇ融合－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒバンドが両方の融合タンパク質について観察され、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈ及びＦａｂ－ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈが両方ともＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに結合していること、及び融合タンパク質のＳｐｙＴａｇ部分が無傷であり、完全に機能的であることが示された。
実施例６－プロテアーゼノックアウト菌株におけるＭＢＰ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号１１、図４）を有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子をペリプラズム発現用の発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＳＫ４菌株に形質転換した。タンパク質結晶化研究のための融合タンパク質においてよくあるＭＢＰ配列は、Ｃ末端において４つのアミノ酸で短縮される（非特許文献２９）。この配列をこれらの実験に使用した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載したように行った。ｔｓｐプロテアーゼノックアウト株を使用することにより、高収率（約１０ｍｇ／Ｌ）の全長タンパク質を製造した。
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号１１、図４）を有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子をペリプラズム発現用の発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＳＫ４菌株に形質転換した。タンパク質結晶化研究のための融合タンパク質においてよくあるＭＢＰ配列は、Ｃ末端において４つのアミノ酸で短縮される（非特許文献２９）。この配列をこれらの実験に使用した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載したように行った。ｔｓｐプロテアーゼノックアウト株を使用することにより、高収率（約１０ｍｇ／Ｌ）の全長タンパク質を製造した。
実施例７－プロテアーゼ欠損細菌株におけるｓｃＦｖ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号３４；図９）を有するｓｃＦｖをコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐノックアウト株に形質転換した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載したように行った。ｔｓｐプロテアーゼノックアウト株を用いて、高収率（約７ｍｇ／Ｌ）の全長タンパク質を製造した。
Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ（配列番号３４；図９）を有するｓｃＦｖをコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐノックアウト株に形質転換した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載したように行った。ｔｓｐプロテアーゼノックアウト株を用いて、高収率（約７ｍｇ／Ｌ）の全長タンパク質を製造した。
実施例８－Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２構築物のためのＴＧ１Ｆ株を用いたノックアウト細胞株の生成
短縮重鎖のＣ末端にＳｐｙＴａｇ００２を有するＦａｂフォーマットのヒト抗体フラグメントをコードする遺伝子（すなわち、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２構築物、図６）を、ＦａｂのＨ鎖及びＬ鎖にシグナル配列を有する発現ベクターにクローニングし、細菌輸送によって新生鎖をペリプラズムに導いた。次いで、大腸菌ＴＧ１Ｆ（Ｆ－エピソームなし、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）をこのようなベクターで形質転換した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載したように行った。Ｃ末端末Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号１３及び１４）を有するＦａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２融合タンパク質を精製する試みは全て成功しなかった。ＦａｂとＳｐｙＴａｇ（配列番号１５）との間にＨｉｓ－ｔａｇを有する構築物を精製することができたが、機能的ＳｐｙＴａｇ００２は保有していなかった。
短縮重鎖のＣ末端にＳｐｙＴａｇ００２を有するＦａｂフォーマットのヒト抗体フラグメントをコードする遺伝子（すなわち、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２構築物、図６）を、ＦａｂのＨ鎖及びＬ鎖にシグナル配列を有する発現ベクターにクローニングし、細菌輸送によって新生鎖をペリプラズムに導いた。次いで、大腸菌ＴＧ１Ｆ（Ｆ－エピソームなし、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）をこのようなベクターで形質転換した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載したように行った。Ｃ末端末Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号１３及び１４）を有するＦａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２融合タンパク質を精製する試みは全て成功しなかった。ＦａｂとＳｐｙＴａｇ（配列番号１５）との間にＨｉｓ－ｔａｇを有する構築物を精製することができたが、機能的ＳｐｙＴａｇ００２は保有していなかった。
Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２－Ｈｉｓ（図６に示される配列番号１３）構築物（種々の抗体に由来するＦａｂを有する）の発現を、ＳｐｙＴａｇ００２の代わりにＳｐｙＴａｇを有する構築物で発現が成功した細胞の以下のノックアウト株において試験した。
１．ＫＳ１０００(Δｔｓｐ)
２．ＳＫ４(ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐ)
３．ＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇ
４．ＰＨＭ１３０菌株（Δｔｓｐ、ΔｄｅｇＰ、ΔｏｍｐＴ、Δｐｔｒ）
２．ＳＫ４(ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐ)
３．ＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇ
４．ＰＨＭ１３０菌株（Δｔｓｐ、ΔｄｅｇＰ、ΔｏｍｐＴ、Δｐｔｒ）
Ｈｉｓ－ｔａｇによる精製後、生成物を実施例４のようにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。全長融合タンパク質の発現は、ＫＳ１０００（Δｔｓｐ）、ＳＫ４（ＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐ）、及びＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇＰでは失敗し、ＨＭ１３０菌株（Δｔｓｐ、ΔｄｅｇＰ、ΔｏｍｐＴ、Δｐｔｒ）では成功し、精製抗体の収率は、許容可能又は「高」（すなわち、約１０ｍｇ／Ｌ）であった。
次に、上述したように、非プロテアーゼ欠損ＴＧ１Ｆ－菌株（すなわち、菌株はｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼの両方を有する）、及びＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇＰ菌株（すなわち、菌株はｏｍｐＴプロテアーゼを有する）で発現及び精製されたＦａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ００２（配列番号１５、図６）を、実施例１に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって分析し、融合タンパク質が切断された場所を決定した。質量分析結果を以下に示す。
Ｆａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ００２のＴＧ１Ｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：
軽鎖
計算質量（全長） ２２６９１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２２６８２Ｄａ
重鎖
計算質量（全長） ２６６４３Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２５４７８Ｄａ
計算質量（－９ａａ） ２５４８８Ｄａ
軽鎖
計算質量（全長） ２２６９１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２２６８２Ｄａ
重鎖
計算質量（全長） ２６６４３Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２５４７８Ｄａ
計算質量（－９ａａ） ２５４８８Ｄａ
Ｆａｂ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ００２のＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｄｅｇＰ発現
軽鎖
計算質量（全長） ２２６９１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２２６８０Ｄａ
重鎖
計算質量（全長） ２６６４３Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２６６２６Ｄａ（全長）
検出質量（ｍ／ｚ） ２６１８２Ｄａ（－３ａａ）
計算質量（－３ａａ） ２６１９５Ｄａ
軽鎖
計算質量（全長） ２２６９１Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２２６８０Ｄａ
重鎖
計算質量（全長） ２６６４３Ｄａ
検出質量（ｍ／ｚ） ２６６２６Ｄａ（全長）
検出質量（ｍ／ｚ） ２６１８２Ｄａ（－３ａａ）
計算質量（－３ａａ） ２６１９５Ｄａ
結果：非プロテアーゼ欠損細菌株による質量分析結果に基づいて、９アミノ酸部分が融合タンパク質のＣ末端から切断された。これは、ｔｓｐプロテアーゼによって切断されることが示されたＳｐｙＴａｇについて観察されたのと同じ開裂部位であった。ｔｓｐ及びｄｅｇＰプロテアーゼが欠損した（及びｏｍｐＴプロテアーゼを有する）細菌株による質量分析結果に基づいて、３アミノ酸部分がＣ末端から切断される。全ての質量分析結果に基づいて、ＳｐｙＴａｇ００２（長さが１４アミノ酸、VPTIVMVDAYKRYK、配列番号２）を、アミノ酸位置５のバリン後のｔｓｐプロテアーゼによって、及びアミノ酸位置１１のリジン後の第２のプロテアーゼによって切断された。このように、ＳｐｙＴａｇ００２の開裂には２つの異なるプロテアーゼが関与しており、そのうちの１つはｔｓｐであり、２つ目のプロテアーゼは、４つの菌株における発現結果に基づくと、ｏｍｐＴ又はｐｔｒと仮定することができる。
ＴＧ１Ｆ－ノックアウト株であるＴＧ１Ｆ－ΔｏｍｐＴ株及びＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｏｍｐＴ株（ＳＫ１３、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ３３００５）を、実施例４に記載されたのと同じ方法によって作製した。次いで、Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００２－Ｈｉｓ構築物（図６、配列番号１３）及びＦａｂ－ＦＬＡＧ－ＳｐｙＴａｇ００２－Ｈｉｓ構築物（図６、配列番号１４）の発現を、上述した通り、ＴＧ１Ｆ－ΔｏｍｐＴ菌株及びＴＧ１Ｆ－Δｔｓｐ｀ｏｍｐＴ菌株において試験した。ＴＧ１Ｆ－ΔｏｍｐＴ菌株における発現は、ＳｐｙＴａｇからのｔｓｐ開裂部位がＳｐｙＴａｇ００２に依然として存在するため、相当量の全長タンパク質をもたらさなかった。ＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｏｍｐＴ菌株（ＳＫ１３）における構築物の発現は成功し、精製後に高タンパク質収率（すなわち、約１０ｍｇ／Ｌ）を有する全長タンパク質をもたらした。従って、ｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼの両方がＳｐｙＴａｇ００２の切断に関与する。
実施例９－非プロテアーゼ欠損細菌株におけるＦａｂ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現中にＳｐｙＴａｇを保護するための種々のストラテジーの試験
非プロテアーゼ欠損大腸菌ＴＧ１Ｆ－細胞株におけるＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現中にＳｐｙＴａｇを開裂から保護できるかどうかを調べるために実験を行った。
非プロテアーゼ欠損大腸菌ＴＧ１Ｆ－細胞株におけるＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現中にＳｐｙＴａｇを開裂から保護できるかどうかを調べるために実験を行った。
以下のストラテジーを、ＳｐｙＴａｇ開裂を防止するために試験した。
１．ＳＴ２－２つのシステイン残基を有するリンカー（ＣＸＣ）を、ＦＬＡＧ（登録商標）－ｔａｇとＳｐｙＴａｇとの間に導入して、ジスルフィド架橋ループを生成した（非特許文献３０）。理論に束縛されるものではないが、出願人らはこのような非線形リンカーがプロテアーゼの結合が防止されると理論付けた：Ｆａｂ重鎖－Ｆｌａｇ－ＣＸＣ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ６。
２．ＳＴ３－ポリ－プロリンリンカーを融合タンパク質に導入した。ポリ－プロリンリンカーは、ポリ－プロリン螺旋を形成する（非特許文献２１）。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、ポリプロリン螺旋がプロテアーゼの結合を防止すると理論づけた。ポリ－プロリンリンカーを有する融合タンパク質の２つのバージョンを作製した。
ａ．強：ＰＰＰＰＰＴ
ｂ．弱：ＰＬＰＰＰＦ
３．ＳＴ４－２つのアミノ酸が、Ｆａｂ重鎖の球状折り畳みドメインから突出している（ＰＤＢ構造アクセッション番号２ＪＢ５）。これらの２つのアミノ酸を除去し、ＳｐｙＴａｇを、折り畳まれていないリンカー配列なしで、短縮Ｆａｂ重鎖（保存されたバリン（ＩＭＧＴ位置番号１２１）及び２つのヒンジアミノ酸、グルタミン酸及びプロリンで終わる）に付加させた（以下の「ｂ」を参照のこと）。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、ＳｐｙＴａｇを折り畳まれたドメインに近づけると、プロテアーゼの結合が防止されると理論付けた。
ａ．Ｆａｂ重鎖：...ＶＥＰＫＳ－ＣＯＯＨ
ｂ．ＳＴ４:...ＶＥＰ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ
４．ＳＴ５－このストラテジーはＳＴ２に類似しているが、ジスルフィド架橋ループにＦＬＡＧ及びＳｐｙＴａｇ：Ｆａｂ重鎖－Ｃ－Ｆｌａｇ－Ｓｐｙ－Ｃ－Ｈｉｓ６を含む。
１．ＳＴ２－２つのシステイン残基を有するリンカー（ＣＸＣ）を、ＦＬＡＧ（登録商標）－ｔａｇとＳｐｙＴａｇとの間に導入して、ジスルフィド架橋ループを生成した（非特許文献３０）。理論に束縛されるものではないが、出願人らはこのような非線形リンカーがプロテアーゼの結合が防止されると理論付けた：Ｆａｂ重鎖－Ｆｌａｇ－ＣＸＣ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ６。
２．ＳＴ３－ポリ－プロリンリンカーを融合タンパク質に導入した。ポリ－プロリンリンカーは、ポリ－プロリン螺旋を形成する（非特許文献２１）。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、ポリプロリン螺旋がプロテアーゼの結合を防止すると理論づけた。ポリ－プロリンリンカーを有する融合タンパク質の２つのバージョンを作製した。
ａ．強：ＰＰＰＰＰＴ
ｂ．弱：ＰＬＰＰＰＦ
３．ＳＴ４－２つのアミノ酸が、Ｆａｂ重鎖の球状折り畳みドメインから突出している（ＰＤＢ構造アクセッション番号２ＪＢ５）。これらの２つのアミノ酸を除去し、ＳｐｙＴａｇを、折り畳まれていないリンカー配列なしで、短縮Ｆａｂ重鎖（保存されたバリン（ＩＭＧＴ位置番号１２１）及び２つのヒンジアミノ酸、グルタミン酸及びプロリンで終わる）に付加させた（以下の「ｂ」を参照のこと）。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、ＳｐｙＴａｇを折り畳まれたドメインに近づけると、プロテアーゼの結合が防止されると理論付けた。
ａ．Ｆａｂ重鎖：...ＶＥＰＫＳ－ＣＯＯＨ
ｂ．ＳＴ４:...ＶＥＰ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ
４．ＳＴ５－このストラテジーはＳＴ２に類似しているが、ジスルフィド架橋ループにＦＬＡＧ及びＳｐｙＴａｇ：Ｆａｂ重鎖－Ｃ－Ｆｌａｇ－Ｓｐｙ－Ｃ－Ｈｉｓ６を含む。
上記構築物を、非プロテアーゼ欠損大腸菌ＴＧ１Ｆ－細胞菌株において発現させ、Ｈｉｓ－ｔａｇを介して精製し、前述した通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＳＴ４（配列番号１６、図７）のみが、ＳｐｙＴａｇ開裂なしで発現された。ＳＴ４のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへの連結を、実施例５に記載したようにして試験した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によれば、約２時間以内にＳｐｙＴａｇ融合－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合生成物について新しいバンドが示されなかった。従って、Ｆａｂの重鎖から２つのアミノ酸が除去された融合タンパク質はＳｐｙＴａｇ切断なしで発現されたが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒには連結しなかった。理論に束縛されることを望むものではないが、出願人は、ＳｐｙＴａｇが折り畳まれた抗体構造に近接していることにより、プロテアーゼがＳｐｙＴａｇに結合し、開裂することが妨げられたが、ＳｐｙＴａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ反応に必要とされる、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒがＳｐｙＴａｇに結合することも立体的に妨げられたと考える。
図７（配列番号１７～３２）にまとめたＳＴ４設計に基づく構築物をさらに作製し、ＳｐｙＴａｇが開裂されたかどうかを決定するために、前述した通りに試験した。実施例５に記載したように、ＳｐｙＴａｇがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結する能力についても構築物を試験した。全てのＳＴ４構築物の全長発現収率及びライゲーション結果を表１にまとめてある。「高い」は融合タンパク質発現収率が約５～１０ｍｇ／Ｌの間であったことを示し、「低い」は発現収率が約２～４ｍｇ／Ｌであったことを示し、「非常に低い」は、発現収率が約２ｍｇ／Ｌ未満であったことを示す。
表１の結果は、融合タンパク質が高収率の全長タンパク質（すなわち、約５～１０ｍｇ／Ｌ）を示し、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒにライゲーションされたという点で、Ｆａｂ重鎖（又はＳＴ４＋２）のＣ末端に直接付加したＳｐｙＴａｇが最良の全体的な性能を与えたことを示す。Ｆａｂ重鎖のＣ末端とＳｐｙＴａｇ（すなわち、ＳＴ４＋３及びＳＴ４＋４／５）との間に１、２、又は３個のアミノ酸リンカーを有する融合タンパク質は、プロテアーゼによって大きく開裂され、全長タンパク質の低い収率又は非常に低い収率をもたらした。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、折り畳まれたＦａｂ球状ドメインのＣ末端とＳｐｙＴａｇとの間のリンカーが長いほど、ＳｐｙＴａｇが開裂及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへのライゲーションがしやすくなると考えている。出願人らはまた、Ｆａｂ重鎖のＣ末端に直接付加したＳｐｙＴａｇを有する融合タンパク質が、ペリプラズムプロテアーゼ開裂を回避するためにＦａｂの折り畳まれたドメインに近接してＳｐｙＴａｇを付加させることと、ＳｐｙＴａｇのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへのライゲーションを立体的に可能にするのに十分な空間を可能にすることとの間の最適な妥協であると考える。
実施例１０－非プロテアーゼ欠損細菌株におけるマルトース結合タンパク質－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現中にＳｐｙＴａｇを保護するためのストラテジーの試験
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）において、ＳｐｙＴａｇを折り畳みドメイン近くに動かすと、ＳｐｙＴａｇがペリプラズムプロテアーゼ消化から保護されるという仮説を検証するために実験を行った。ＭＢＰは、それがＦａｂとは異なる部類のタンパク質であるので選択された。結晶化研究に最もよく使用されるＭＢＰ配列は、Ｃ末端において４つのアミノ酸が短縮されたものである（非特許文献２９）。結晶化実験及び構造決定には、タンパク質（すなわち、柔軟なリンカーを有さない折り畳まれたドメイン）の剛性の増加が役立ち、同じことが、プロテアーゼ開裂からのＳｐｙＴａｇの安定化について予想されるので、同配列を、この実施例において使用した。Ｃ末端に直接融合したＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号３３、図８）を有するＭＢＰをコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－株に形質転換した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載した通りに行った。高収率（約７ｍｇ／Ｌ）の全長タンパク質が、非プロテアーゼ欠損ＴＧ１Ｆ株において製造された。この構築物を、ＳｐｙＴａｇがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒにライゲーションする能力について、実施例５に記載した通りに試験し、この事実が確認された。
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）において、ＳｐｙＴａｇを折り畳みドメイン近くに動かすと、ＳｐｙＴａｇがペリプラズムプロテアーゼ消化から保護されるという仮説を検証するために実験を行った。ＭＢＰは、それがＦａｂとは異なる部類のタンパク質であるので選択された。結晶化研究に最もよく使用されるＭＢＰ配列は、Ｃ末端において４つのアミノ酸が短縮されたものである（非特許文献２９）。結晶化実験及び構造決定には、タンパク質（すなわち、柔軟なリンカーを有さない折り畳まれたドメイン）の剛性の増加が役立ち、同じことが、プロテアーゼ開裂からのＳｐｙＴａｇの安定化について予想されるので、同配列を、この実施例において使用した。Ｃ末端に直接融合したＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ－ｔａｇ（配列番号３３、図８）を有するＭＢＰをコードする遺伝子を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－株に形質転換した。構築物の発現及び精製を、実施例１に記載した通りに行った。高収率（約７ｍｇ／Ｌ）の全長タンパク質が、非プロテアーゼ欠損ＴＧ１Ｆ株において製造された。この構築物を、ＳｐｙＴａｇがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒにライゲーションする能力について、実施例５に記載した通りに試験し、この事実が確認された。
ＳｐｙＴａｇをＭＢＰの折り畳まれたドメインに直接付加させると、ＳｐｙＴａｇがペリプラズムプロテアーゼ開裂から保護され、ＳｐｙＴａｇが依然として機能的であり、ＳｐｙＴａｇが重鎖に直接付加された実施例９のＦａｂ融合タンパク質と同様である融合タンパク質もたらされた。対照的に、実施例２におけるＭＢＰ－Ｆｌａｇ－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ及びＭＢＰ－Ｈｉｓ－ＳｐｙＴａｇ－Ｆｌａｇ融合タンパク質は、ＳｐｙＴａｇをプロテアーゼ開裂に対して脆弱にする、それぞれ１３及び１２アミノ酸を有するリンカーとして作用するタグを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、出願人は、これらの結果が、リンカーなしでＦａｂのＣ末端に融合されたＳｐｙＴａｇ（すなわち、実施例９で試験されたＦａｂ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質）の開裂は、構造的にＦａｂと無関係である、ＳｐｙＴａｇがリンカーを介してＭＢＰのＣ末端に融合された場合にも開裂が起こったので、Ｆａｂ構造に依存しなかったことを示すと考える。
実施例１１－非プロテアーゼ欠損細菌株におけるｓｃＦｖ－ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質のペリプラズム発現中にＳｐｙＴａｇを保護するためのストラテジーの試験
ｓｃＦｖにおいて、ＳｐｙＴａｇを折り畳まれたドメインに近づけると、ＳｐｙＴａｇをペリプラズムプロテアーゼ消化から保護するという仮説を試験するために実験を行った。ＳｃＦｖは、Ｆａｂ又はＭＢＰとは異なるタンパク質であり、異なる構造を有するので、選択した。この実施例で使用したｓｃＦｖは、Ｃ末端から６つのアミノ酸が除去され、その軽鎖ＦＲ４領域（Ｊ遺伝子によってコードされる）内で短縮されたｓｃＦｖをもたらした。ＳｐｙＴａｇ－ＨｉｓがＣ末端短縮ｓｃＦｖのＣ末端に直接的に（すなわち、リンカー配列なしに）融合されたｓｃＦｖ（Δ６ａａ）－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ融合構築物（配列番号３５、図９）を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－に形質転換した。融合タンパク質の発現及び精製を、実施例１に記載した通りに行った。全長タンパク質が高収率（約８ｍｇ／Ｌ）で製造され、ＳｐｙＴａｇをｓｃＦｖに直接付加させることが、ＳｐｙＴａｇをペリプラズム開裂から保護することを示した。
ｓｃＦｖにおいて、ＳｐｙＴａｇを折り畳まれたドメインに近づけると、ＳｐｙＴａｇをペリプラズムプロテアーゼ消化から保護するという仮説を試験するために実験を行った。ＳｃＦｖは、Ｆａｂ又はＭＢＰとは異なるタンパク質であり、異なる構造を有するので、選択した。この実施例で使用したｓｃＦｖは、Ｃ末端から６つのアミノ酸が除去され、その軽鎖ＦＲ４領域（Ｊ遺伝子によってコードされる）内で短縮されたｓｃＦｖをもたらした。ＳｐｙＴａｇ－ＨｉｓがＣ末端短縮ｓｃＦｖのＣ末端に直接的に（すなわち、リンカー配列なしに）融合されたｓｃＦｖ（Δ６ａａ）－ＳｐｙＴａｇ－Ｈｉｓ融合構築物（配列番号３５、図９）を、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＴＧ１Ｆ－に形質転換した。融合タンパク質の発現及び精製を、実施例１に記載した通りに行った。全長タンパク質が高収率（約８ｍｇ／Ｌ）で製造され、ＳｐｙＴａｇをｓｃＦｖに直接付加させることが、ＳｐｙＴａｇをペリプラズム開裂から保護することを示した。
実施例１２－プロテアーゼ欠損細菌株におけるＦａｂ－ＳｐｙＴａｇ００３融合タンパク質のペリプラズム発現
短縮重鎖のＣ末端にＳｐｙＴａｇ００３を有するＦａｂフォーマットのヒト抗体フラグメント、すなわちＳｐｙＴａｇ００３（配列番号３６）で置換されたＳｐｙＴａｇ００２を有する配列番号３及び４の構築物をコードする遺伝子を、実施例１に記載した通りにして、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングした。プラスミドの大腸菌ＴＧ１Ｆ－又はＳＫ４株への形質転換及び構築物の発現及び精製を、実施例１に記載した通りにして、行った。Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００３融合タンパク質を精製するための試みは全て成功しなかった。
短縮重鎖のＣ末端にＳｐｙＴａｇ００３を有するＦａｂフォーマットのヒト抗体フラグメント、すなわちＳｐｙＴａｇ００３（配列番号３６）で置換されたＳｐｙＴａｇ００２を有する配列番号３及び４の構築物をコードする遺伝子を、実施例１に記載した通りにして、ペリプラズム発現のために発現ベクターにクローニングした。プラスミドの大腸菌ＴＧ１Ｆ－又はＳＫ４株への形質転換及び構築物の発現及び精製を、実施例１に記載した通りにして、行った。Ｆａｂ－ＳｐｙＴａｇ００３融合タンパク質を精製するための試みは全て成功しなかった。
実施例１に記載した通りにして、プラスミドがＳＫ１３菌株を形質転換し、発現させ、精製した。ＴＧ１Ｆ－ΔｔｓｐΔｏｍｐＴ菌株（ＳＫ１３）における構築物の発現は成功し、精製後に良好なタンパク質収率（すなわち、約６ｍｇ／Ｌ）を有する全長タンパク質をもたらした。従って、ｔｓｐ及びｏｍｐＴプロテアーゼの両方がＳｐｙＴａｇ００３の切断に関与する。
ＤＳＭ受託番号３３００４
ＤＳＭ受託番号３３００５
ＤＳＭ受託番号３３００５
本明細書で引用された特許、特許出願及びその他公開された参考材料は全て、全体が援用される。
配列番号１（ＳｐｙＴａｇ）
AHIVMVDAYK PTK
配列番号２（ＳｐｙＴａｇ００２）
VPTIVMVDAY KRYK
配列番号３（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号４（Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧＩヒンジドメインの４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ定義位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列
ヒトCH1-EPKSEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号５（Ｆａｂ－Ｘ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGGGSGGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号６（Ｆａｂ－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFHHHHHHGAPGAHIVMVDAYKPTK
配列番号７（Ｆａｂ－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ－ＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFHHHHHHGAPGAHIVMVDAYKPTKGGSDYKDDDDK
配列番号８（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｓｘ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGAHIVMVDAYKPTKGAPSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号９（Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｓｘ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号１０（Ｆａｂ－Ｘ－Ｓｐｙ－Ｓｘ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGGGSGGGSAHIVMVDAYKPTKGAPSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号１１（ＭＢＰ（Δ４ａａ）－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ）
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１２（ＭＢＰ（Δ４ａａ）－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ－ＦＬＡＧ）
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTEFHHHHHHGAPGAHIVMVDAYKPTKGGSDYKDDDDK
配列番号１３（Ｆａｂ－Ｓｐｙ２－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGVPTIVMVDAYKRYKGAPHHHHHH
配列番号１４（Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ２－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFDYKDDDDKGGSVPTIVMVDAYKRYKGAPHHHHHH
配列番号１５（Ｆａｂ－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFHHHHHHGAPGVPTIVMVDAYKRYK
配列番号１６（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４（ＨＣΔ２ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）ヒトCH1-EPAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１７（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）
ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１８（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、第３のアミノ酸残基は「Ｅ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPEAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１９（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、第３のアミノ酸残基は「Ｇ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２０（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、第３のアミノ酸残基は「Ｒ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPRAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２１（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２２（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、第４のアミノ酸残基は「Ｅ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKEAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２３（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、第４のアミノ酸残基は「Ｋ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２４（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、第４のアミノ酸残基は「Ｓ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２５（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）ヒトCH1-EPKSDAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２６（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２７（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSPAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２８（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２９（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋４（ＨＣ＋２）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSGGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３０（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋４（ＨＣ＋２）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSGFAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３１（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋５（ＨＣ＋３、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEGGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３２（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋５（ＨＣ＋３）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３３（ＭＢＰ（Δ４ａａ）－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４）：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３４（ｓｃＦｖ－Ｆ－Ｓｐｙ－Ｈ）：
QVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVLGQEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３５（ｓｃＦｖ（Δ６ａａ）－Ｓｐｙ－Ｈ）：
QVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３６（ＳｐｙＴａｇ００３）
RGVPHIVMVDAYKRYK
配列番号１（ＳｐｙＴａｇ）
AHIVMVDAYK PTK
配列番号２（ＳｐｙＴａｇ００２）
VPTIVMVDAY KRYK
配列番号３（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号４（Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧＩヒンジドメインの４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ定義位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列
ヒトCH1-EPKSEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号５（Ｆａｂ－Ｘ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGGGSGGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号６（Ｆａｂ－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFHHHHHHGAPGAHIVMVDAYKPTK
配列番号７（Ｆａｂ－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ－ＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFHHHHHHGAPGAHIVMVDAYKPTKGGSDYKDDDDK
配列番号８（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｓｘ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGAHIVMVDAYKPTKGAPSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号９（Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｓｘ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号１０（Ｆａｂ－Ｘ－Ｓｐｙ－Ｓｘ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGGGSGGGSAHIVMVDAYKPTKGAPSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
配列番号１１（ＭＢＰ（Δ４ａａ）－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ）
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１２（ＭＢＰ（Δ４ａａ）－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ－ＦＬＡＧ）
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTEFHHHHHHGAPGAHIVMVDAYKPTKGGSDYKDDDDK
配列番号１３（Ｆａｂ－Ｓｐｙ２－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFGVPTIVMVDAYKRYKGAPHHHHHH
配列番号１４（Ｆａｂ－ＦＬＡＧ－Ｓｐｙ２－Ｈｉｓ、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFDYKDDDDKGGSVPTIVMVDAYKRYKGAPHHHHHH
配列番号１５（Ｆａｂ－Ｈｉｓ－Ｓｐｙ２、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEFHHHHHHGAPGVPTIVMVDAYKRYK
配列番号１６（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４（ＨＣΔ２ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）ヒトCH1-EPAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１７（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）
ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１８（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、第３のアミノ酸残基は「Ｅ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPEAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号１９（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、第３のアミノ酸残基は「Ｇ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２０（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋１（ＨＣΔ１ａａ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の２つのアミノ酸残基で始まり、第３のアミノ酸残基は「Ｒ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPRAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２１（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２２（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、第４のアミノ酸残基は「Ｅ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKEAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２３（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、第４のアミノ酸残基は「Ｋ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２４（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋２（ＨＣ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の３つのアミノ酸残基で始まり、第４のアミノ酸残基は「Ｓ」で置換され、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２５（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）ヒトCH1-EPKSDAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２６（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２７（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSPAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２８（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋３（ＨＣ＋１）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号２９（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋４（ＨＣ＋２）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSGGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３０（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋４（ＨＣ＋２）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSGFAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３１（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋５（ＨＣ＋３、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSEGGAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３２（Ｆａｂ－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４＋５（ＨＣ＋３）、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの最初の４つのアミノ酸残基で始まり、ＩＭＧＴ定義によるヒトＩｇ ＣＨ１、ＩＭＧＴ位置番号１２１で保存されたバリンで終わる部分アミノ酸配列）
ヒトCH1-EPKSGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３３（ＭＢＰ（Δ４ａａ）－Ｓｐｙ－Ｈｉｓ＿ＳＴ４）：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３４（ｓｃＦｖ－Ｆ－Ｓｐｙ－Ｈ）：
QVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVLGQEFDYKDDDDKGGSAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３５（ｓｃＦｖ（Δ６ａａ）－Ｓｐｙ－Ｈ）：
QVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKAHIVMVDAYKPTKGAPHHHHHH
配列番号３６（ＳｐｙＴａｇ００３）
RGVPHIVMVDAYKRYK
Claims (20)
- ペリプラズム融合タンパク質を製造する方法であって、
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、
ｂ）前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は
ｃ）前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失；又は
ｄ）前記Ｔｓｐプロテアーゼ活性を減少又は消失させる阻害剤又は不活性化剤、又はＴｓｐプロテアーゼ発現の阻害剤
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失している、方法。 - ペリプラズム融合タンパク質を製造する方法であって、
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｂ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、方法。 - ペリプラズム融合タンパク質を製造する方法であって、
前記ペリプラズム融合タンパク質を発現するのに有効な条件下で、培養培地中で前記ペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を培養し、
前記大腸菌宿主細胞から前記ペリプラズム融合タンパク質を回収することを含み、
前記ペリプラズム融合タンパク質は、第１のタンパク質に付加した、又は前記第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含み、
前記結合モチーフは、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含み、
前記大腸菌宿主細胞は、
ａ）Ｔｓｐプロテアーゼの阻害剤又は不活性化剤、又はＴｓｐ発現の阻害剤、及び
ｂ）ｏｍｐＴプロテアーゼの阻害剤又は不活性化剤、又はｏｍｐＴ発現の阻害剤
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、方法。 - 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質のＣ末端に、直接又はリンカー配列を介して、付加している、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のタンパク質は、抗原結合フラグメントであり、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｓｃＦａｂを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂである、請求項５に記載の方法。
- 前記大腸菌宿主細胞は、２０１９年１月８日に寄託されたＤＳＭ受託番号３３００４を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株である、請求項１に記載の方法。
- 前記大腸菌宿主細胞は、２０１９年１月８日に寄託されたＤＳＭ受託番号３３００５を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株である、請求項２又は３に記載の方法。
- 配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸を含む、大腸菌ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株であって、
前記大腸菌株は、突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失している、大腸菌。 - ａ）配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸、又は
ａ）配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質をコードする核酸
を含む大腸菌ＴＧ１、ＴＧ１Ｆ－、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０、ＢＬ２１、ＪＭ８３、ＪＭ１０９、ＨＢ２１５１、Ｗ３１１０、又はＣｍａｘ５アルファ株であって、
前記大腸菌株は、
ａ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｂ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失している、大腸菌。 - ａ）配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む結合モチーフであって、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質の発現について、
突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性が低下又は消失し、
ｂ）配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３６又は配列番号３６と少なくとも７８％の配列同一性を有する配列をそれぞれ含む結合モチーフであって、第１のタンパク質に付加した、又は第１のタンパク質のアミノ酸配列内に埋め込まれた結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質の発現について、
ｉ）突然変異Ｔｓｐタンパク質をコードするＴｓｐ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記Ｔｓｐタンパク質の発現を低下又は消失させる前記Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記Ｔｓｐタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失、
ｉｉ）突然変異ｏｍｐＴタンパク質をコードするｏｍｐＴ遺伝子の突然変異であって、プロテアーゼ活性を低下又は消失させる突然変異、又は、前記ｏｍｐＴタンパク質の発現を低下又は消失させる前記ｏｍｐＴ遺伝子又はｏｍｐＴ遺伝子の調節配列の突然変異、又は前記ｏｍｐＴタンパク質活性を低下又は消失させる細菌染色体の領域の１つ以上の欠失
により生じる野生型細胞と比較して、Ｔｓｐタンパク質活性及びｏｍｐＴタンパク質活性が低下又は消失した、突然変異大腸菌株。 - 共に２０１９年１月８日に寄託された、ＤＳＭ受託番号３３００４又は３３００５を有する変異体大腸菌ＴＧ１Ｆ株。
- 第１のタンパク質中のタンパク質構造ドメインのＣ末端に、直接又はリンカーを介して、付加した結合モチーフを含むペリプラズム融合タンパク質であって、前記結合モチーフは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、ペリプラズム融合タンパク質。
- 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質中のタンパク質構造ドメインのＣ末端に直接付加し、前記結合モチーフは、タンパク質分解抵抗性がある、請求項１３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
- 前記タンパク質構造ドメインは、ＦＲ４領域内でＣ末端が短縮されたヒトｓｃＦｖ単鎖抗体フラグメントである、請求項１４に記載のペリプラズム融合タンパク質。
- 前記結合モチーフは、前記第１のタンパク質中の前記タンパク質構造ドメインのＣ末端に、第１又は第２のアミノ酸リンカーを介して、付加している、請求項１３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
- 結合モチーフは、ヒト重鎖ＣＨ１抗体ドメインのＩＭＧＴ位置１２１のＣ末端に、２、３、又は４アミノ酸リンカーを介して付加している、請求項１３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
- 前記結合モチーフは、ヒト定常軽鎖抗体ドメインのＩＭＧＴ位置１２１のＣ末端に、２、３、又は４アミノ酸リンカーを介して結合している、請求項１３に記載のペリプラズム融合タンパク質。
- 請求項１３～１８のいずれか一項に記載の前記ペリプラズム融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
- 請求項１９に記載の前記核酸構築物を含むベクター。
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