JP4168028B2 - 発現ベクター、宿主、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、組み換えタンパク質が封入体等の異常型として発現することを防ぎ、天然型として可溶画分に生産することができる、発現ベクター、宿主、融合タンパク質、タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法に関する。

近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後は遺伝子の発現産物であるタンパク質の網羅的な機能解析へと進むと考えられている。個々のタンパク質の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、生命現象解明の一助としようとする研究が急速に増えつつある。一方、各種の生理活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質も、その受容体タンパク質と結合する活性物質が、新規医薬品の候補物質となり得ることから、その３次元構造決定に重大な関心が持たれ、新規医薬品のスクリーニングにおいて注目されている。このようなタンパク質の性質を決定しようとする場合、該当する遺伝子をベクター遺伝子上に組み込み、バクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主にトランスフォーメーションし、発現させて得られる組み換えタンパク質の性質を調べる方法が一般的である。
タンパク質の正しい性質を評価する際、そのタンパク質が、正しい立体構造に折り畳まれているか否かが非常に重要となる。しかしながら、異種生物由来のタンパク質を、上述の宿主発現系を用いたタンパク質発現法で作成しようとする場合、しばしばタンパク質のフォールディング異常により、立体構造の異なった異常型タンパク質しか得られないケースに遭遇する。このようなタンパク質は宿主内で封入体と呼ばれる凝集体として発現したり、宿主細胞のプロテアーゼにより、分解されたりすることが知られている。これらを解決するためには、目的タンパク質の宿主細胞内での折り畳み反応が正確に行われるよう制御することが極めて重要であると考えられる。
目的タンパク質が異常型タンパク質である封入体として発現した場合、その正常型を得る手段としては、従来それをインビトロで正常型に変換する方法が一般的であった。即ち、宿主から封入体を回収し、高濃度の塩酸グアニジンや尿素等で可溶化後、適当な緩衝液等で３０〜１００倍程度に希釈することで、可溶化した目的タンパク質をリフォールディングさせる方法である。一例を挙げると、抗体は、医療分野等での利用が期待されているが、その組み換え体を大腸菌を宿主としてその細胞質内に発現しようとすると、ほとんどが不溶性の封入体として発現されることが知られている（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、５４５−、１９９１年）。封入体として得られた抗体を、効率よくインビトロでリフォールディングする方法として、希釈緩衝液中にタンパク質の折り畳みを促進するシャペロニンを含有させることで、その収量を増大させる方法が提案されている（特開平９−２２００９２号）。抗体以外にも、封入体タンパク質として発現するＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリータンパク質のリフォールディング方法（特開平６−３２７４８９号、特開平６−３１９５４９号）や、ニューロトロフィン−３のリフォールディング方法（特開平９−２６２０９３号）等、希釈液中に還元剤、有機酸等を加えることで、目的タンパク質の収量を増大させる、さまざまな工夫が提案されてきた。しかしながら、封入体として得られたタンパク質をインビトロでリフォールディングさせるこれらの方法は、非常に手間がかかる割には、得られる収量は低い。
抗体の場合、そのＮ末端にシグナル配列を付与してペリプラズム領域に発現させれば、大腸菌を宿主として用いても可溶画分に発現できることが報告されている（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１、１２７９−、１９９２年）。しかしながら、ペリプラズム領域は細胞質領域と比較して、非常に狭い領域であるため、タンパク質が発現される量も非常に少なく、たとえ、発現量が増やせたとしても、封入体となってしまう。細胞質内に抗体を可溶体として発現させようとする試みもいくつか報告されている。タンパク質のフォールディングに関与する分子シャペロンと抗体遺伝子を細胞質内で共発現させることで、組み換え抗体の封入体形成を防ぎ、可溶型の収量を増大させる工夫や、宿主大腸菌としてチオレドキシン還元酵素欠損株を用いる方法等が提案されている（特開平９−２２００９２号；Ｐｌｏｂａ、Ｇｅｎｅ １５９、２０３−、１９９５年）。しかしながら、これらの方法は、可溶型の抗体を得ることができるとはいえ、その収量は１ｍｇ／培地１Ｌ程度と低く（Ｌｅｖｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３、３３８−、２００１年）、更に生産効率の良い方法が必要とされている。
一方、膜タンパク質も生体膜の表面上又は内部に埋もれて存在する性質上、疎水性アミノ酸の含有率が高く、膜の非存在化で組み換えタンパク質として発現させた場合にはしばしば封入体として発現することが知られる。細胞に対する毒性を示す場合には発現にすら至らない場合が多い。膜タンパク質の組み換え型を取得する場合、酵母や動物細胞等の真核細胞を用い、その膜画分に発現させることが常套手段であるが、一方で発現量は少なく、また、培養発現する際にはコストと手間がかかるため、より簡便な発現方法が望まれている。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、組み換えタンパク質生産時の不活性な異常型タンパク質の形成を防ぎ、目的タンパク質を天然型、即ち、可溶型として大量且つ効率的に生産させることを可能とする、発現ベクター、宿主、融合タンパク質、タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
即ち、本発明は、（ａ）分子シャペロン活性を有するポリペプチドをコードする第１コード領域、及び、（ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有する発現ベクターである。
本発明の発現ベクターにおいては、上記第１コード領域は、プロモーターに有効に連結しており、かつ、上記制限酵素サイトは、第１コード領域と同じ解読枠内であって、上記第１コード領域の下流にあるか、又は、上記制限酵素サイトは、挿入された上記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、かつ、上記第１コード領域は、上記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、上記第２コード領域の下流にある。
本発明の発現ベクターは、第１コード領域と、第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化サイトとなる領域を有することが好ましい。
本発明の発現ベクターは、タンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることが好ましい。
本発明の発現ベクターにおいて、分子シャペロン活性を有するポリペプチドは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであることが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅ、又は、パーブリン型ＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ、又は、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅとしては、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記パーブリン型ＰＰＩａｓｅとしては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、また、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、又は、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅが挙げられる。
本発明の発現ベクターにおいて、上記第２コード領域は、モノクローナル抗体をコードする塩基配列を有するか、又は、膜タンパク質をコードする塩基配列を有することが好ましい。
本発明の発現ベクターを内包している宿主もまた、本発明の１つである。
本発明の宿主は、大腸菌であることが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質もまた、本発明の１つである。
本発明の融合タンパク質は、プロテアーゼ消化サイトを含有することが好ましい。
本発明の融合タンパク質を製造する方法もまた、本発明の１つである。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質を細胞質に発現させるか、本発明の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けて、得られた発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に発現させるか、又は、本発明の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、上記融合タンパク質を発現させることが好ましい。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、ＰＰＩａｓｅ活性を阻害するマクロライド、シクロスポリン、ジュグロン、又は、これらの類縁化合物を担持した担体に、融合タンパク質を吸着させた後、上記担体を回収することが好ましい。
上記第２コード領域がコードするタンパク質を製造する方法であって、本発明の融合タンパク質の製造方法で得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化サイトを消化するプロテアーゼで消化するタンパク質の製造方法もまた、本発明の１つである。
発明の詳細な説明
以下に本発明を詳述する。
なお、本発明において、「プロモーターに有効に連結する」とは、分子シャペロン活性を有するポリペプチドが正常に転写されるように第１コード領域がプロモーターに連結していること、又は、目的タンパク質が正常に転写されるように第２コード領域がプロモーターに連結していることを意味する。
また、本発明において、「分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ」には、実質的に同等の機能を有しているものも含まれる。即ち、実質的に同等のポリペプチド、少なくともこれらの一部分を含むポリペプチド、及び、一部のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したもの等も含まれる。
更に、本発明において、「ドメイン」には、実質的に同等の機能を有するドメインも含まれる。
本発明の発現ベクターは、（ａ）分子シャペロン活性を有するポリペプチドをコードする第１コード領域を含有するものである。
上記分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性を意味する。例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田、バイオサイエンスとインダストリー ５６，５９３−、１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理した後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率でその検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０、３６１−、１９９５年）等が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、８５２９−、１９９４年）等が挙げられる。
上記分子シャペロン活性を有するポリペプチドとしては特に限定されず、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ等の分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ；スモールヒートショックプロテイン、シャペロニン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＨＳＰ９０等が挙げられる。
上記スモールヒートショックプロテインは、１５〜３０ｋＤａ程度のサブユニットが、２４〜３２個程度集まって巨大な分子構造をとり、シャペロン活性を有することが報告されている（Ｊａｋｏｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８，１５１７−、１９９３年）。これと相同性の高い領域をそのＣ末端領域に有するクリスタリンもまた、スモールヒートショックタンパク質と同様の性質を有しており、いずれも本発明の発現ベクターに適用可能である。
上記シャペロニンは７〜９個のサブユニットが環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なった、合計１４〜１８個のサブユニットからなる特徴的な構造を有している。上記シャペロニンは、ドーナツ構造の凹部に変性タンパク質を捕捉し、ＡＴＰ等のヌクレオチドの消費をともなってタンパク質のリフォールディングを促進する。真正細菌由来のグループ１型シャペロニンの場合は、更に補助因子としてＧｒｏＥＳ（ヒートショックプロテイン１０）の結合を伴って、タンパク質の折り畳み反応を促進する。真核生物又は古細菌由来のグループ２型に属するシャペロニンの場合は、ＧｒｏＥＳのような補助因子は必要とせず、効率的に正しい立体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている（Ｇｕｐｔａ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５、１−、１９９５年）。
上記プレフォルディンは真核生物のチューブリンのタンパク質折り畳みに関与する因子として見いだされた分子シャペロンであり（Ｌｏｐｅｚ、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３５，２１９−、２００１年）、６量体を形成し、インビトロでは、変性したタンパク質と相互作用するシャペロン活性を有することが知られている（Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｃｅｌｌ １０３，６２１−、２０００年）。
上記ＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥのホモログは生物種を問わず幅広く存在し、タンパク質のフォールディングに関与していると考えられている分子シャペロンである。これらのうち、特に大腸菌のＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質フォールディングシステムはよく研究されている。これらの提案されている反応メカニズムとしては、リボゾームで生合成された新生ポリペプチドがＤｎａＫと結合し、ＡＴＰ存在下で更にＤｎａＪが結合することで、不可逆的な凝集形成が抑制される。更にＧｒｐＥに依存したヌクレオチドの解離に伴い、新生ポリペプチドも解離され、シャペロニンのフォールディングシステムに受け渡されるというものである（Ｆｉｎｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＭＡＲＣＥＬ ＤＥＫＫＥＲ，ＩＮＣ、１９９８）。本発明の発現ベクターにおいては、これら大腸菌由来のＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥと同じ働するホモログを用いることができる。
上記ＨＳＰ９０（ヒートショックプロテイン９０）にも、シャペロン様活性を有するものがあり（Ｒａｍｓｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１７８５７−、２０００年）、本発明の発現ベクターにおいては、そのホモログ、その一部又はそれらを含むポリペプチドを用いることができる。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）は、タンパク質のフォールディングに関与するタンパク質折り畳み因子の１つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲットタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有するものである。
上記分子シャペロン活性を有するポリペプチドとしては、なかでも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、上記の３種類のＰＰＩａｓｅのうち、いずれのタイプのＰＰＩａｓｅであってもよい。
上記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９、１２５４−、２０００年）、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９、１９９−、２００１年）、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、１７１５−、１９９６年）等が挙げられる。
上記シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、例えば、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Ｐｉｒｋｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８、７９５−、２００１年）等が挙げられる。
上記パーブリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、例えば、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．２０、２８５−、２００１年）等が挙げられる。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能については、興味深いことに、ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、タンパク質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性タンパク質のリフォールディングを促進させる分子シャペロン活性を有することが見出されている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９、４５３−、２０００年；Ｉｄｅｎｏ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年；Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７、４６５−、２００１年；Ｉｄｅｎｏ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８、４６４−、２００２）。分子シャペロン活性は、本来、分子シャペロンの１つとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で生合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰ等の高エネルギー物質の加水分解を必要とする。上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子シャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点で優れている。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより、２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明で用いられる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであってもよい。しかしながら、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、本発明ではショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの方が好ましい。なお、上記した分子量の幅はこれまで見いだされているＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明における古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するものであればいずれであってもよい。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、いずれの古細菌由来のものであってもよく、例えば、これまで見いだされている古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのうち、ショートタイプとしては、好熱性及び超好熱性菌由来古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のもの、常温性古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ由来のもの等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ ５、８２１−、２０００）。一方、ロングタイプは、ゲノム解析やその他の解析の結果、ほとんどの古細菌のゲノム上で見いだされており、例えば、好熱性及び超好熱性古細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ由来、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由来のもの、常温性好塩菌であるＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ由来のもの等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ ５、８２１−、２０００年）。なかでも、常温性の古細菌由来のものが好ましい。上記ロングタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの１例として、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のもののアミノ酸配列を配列番号１に、上記ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの１例として、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のもののアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。
上記古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性とＦＫ５０６との結合に関与するＦＫＢＰドメイン、及び、ＩＦドメインを有しており、ロングタイプの古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの場合、更にＣ末端ドメインを有している（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１、Ｄ８２１−、２０００年）。上記ＩＦドメイン（Ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｐ；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８，１１４９−、２００３年）は、アミノ酸一次配列上、ＦＫＢＰドメインを構成するアミノ酸配列中に挿入された約１００アミノ酸からなり、ドメイン構造を形成する特徴的な高次構造を形成している（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１、Ｄ８２１−、２０００年；Ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｐ；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８，１１４９−、２００３年）。上記ショートタイプの古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性には、ＦＫＢＰドメインのＦＫ５０６結合領域とＩＦドメインとが関与することがわかっている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，２８２２−，２０００年； Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５７、４６５−、２００１年）。また、上記ロングタイプの古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅについては上記２つのドメインと共にＣ末端ドメインがその分子シャペロン活性に関与していることがわかっている（ＩＤＥＮＯ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年）。本発明においては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。例えば、本来分子シャペロン活性を持たないＰＰＩａｓｅであるヒトＦＫＢＰ１２にタンパク質工学的にＩＦドメインやＣ末端ドメインを導入したキメラＰＰＩａｓｅ等は上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメインとしては、配列番号１では、７８番プロリンから１４６チロシンまでの領域が、また、配列番号２では、７８番プロリンから１４１番グルタミン酸までの領域がそれぞれＩＦドメインに相当する（ＩＤＥＮＯ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年）。一方、上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインとしては、配列番号１では、１５７番イソロイシンからＣ末端までの領域がＣ末端ドメインに相当する（ＩＤＥＮＯ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年）。各ドメインの相同性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅはほとんどすべてのバクテリアのゲノム上で見つかっているＰＰＩａｓｅである。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ由来、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ由来、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｕｍ由来、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来のもの等が挙げられる。また、本発明で用いられるトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅは、アミノ酸配列においてバクテリア由来トリガーファクターと実質的に同じと認められるグループに属するものであれば、いずれのトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅであってもよい。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの一例として大腸菌由来のトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列を配列番号３に示し、塩基配列を配列番号４に示す。
上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性とＦＫ５０６との結合に関与するＦＫＢＰドメインを中間ドメインとし、そのＮ末端側及びＣ末端側にそれぞれ２つのドメインを有している（Ｚａｒｎｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１，８２７−，１９９７年）。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性は、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様にＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性であることが知られ、そのＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインのいずれか一方、又は、両者の作用であることが示唆されている。本発明においては、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインとしては、配列番号３では、１番メチオニンから１４５番アルギニン付近の領域がＮ末端ドメインに相当し、２５２番フェニルアラニン付近からＣ末端までの領域がＣ末端ドメインに相当する（Ｚａｒｎｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１，８２７−，１９９７年）。各ドメインの相同性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、いずれも大腸菌をはじめとするグラム陰性バクテリアのペリプラズム領域に発現するＰＰＩａｓｅである。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅはＦＫ５０６により活性が阻害されるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであるのに対し、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、ＦＫ５０６及び他の免疫抑制剤であるシクロスポリンのいずれの免疫抑制剤に対して感受性を示さない、パーブリン型ＰＰＩａｓｅホモログの１つである。これら２つのＰＰＩａｓｅもまた、分子シャペロン活性を示すタンパク質として知られている（Ｒａｍｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５、１７１０６−、２０００年；Ｂｅｈｒｅｎｓ、ＥＭＢＯ．Ｊ． ２０、２８５−、２００１年）。
上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、グラム陰性バクテリアのゲノムに見られるだけでなく、酵母等の真核生物のゲノムでもそのホモログが見つかってきている。
本発明で用いられるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｉｕｍ由来、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ由来、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ由来、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のもの等が挙げられる。また、バクテリア由来のものだけでなく、それらと同じグループに属し、実質的に同等の機能を有するものであれば、いずれの生物由来のＰＰＩａｓｅであってもよい。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの一例として、大腸菌由来のもののアミノ酸配列を配列番号５に示し、塩基配列を配列番号６に示す。また、上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの一例とし、大腸菌由来のもののアミノ酸配列を配列番号７に示し、塩基配列を配列番号８に示す。
上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅは、そのＣ末端側のＦＫＢＰドメインとそれ以外のＮ末端ドメインとを有している（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１９９−，２００１年）。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性もまたＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性であることが知られ、そのＮ末端ドメインの関与が示唆されている。本発明においては、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインとしては、配列番号５では、Ｎ末端から１２０番アスパラギン酸付近の領域がＮ末端ドメインに相当する（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１９９−，２００１年）。
一方、上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅもそのＣ末端側にパーブリン型ＰＰＩａｓｅ間で相同性の高いドメインと、それ以外のＮ末端ドメインとを有している。
上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性にも、パーブリン型ＰＰＩａｓｅ間で相同性の高いドメインとは別にＮ末端ドメインの関与が示唆されている（Ｂｅｈｒｅｎｎｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．２０，２８５−、２００１年）。本発明においては、上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインとしては、配列番号７では、Ｎ末端から１７５番アスパラギン付近の領域がＮ末端ドメインに相当する。上記Ｎ末端ドメインの相同性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、いずれも真核生物中に見いだされるＰＰＩａｓｅである。上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅは、約５２ｋＤａ程度のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅで、ｐ５９又はＨＳＰ５６等とも呼ばれる。そのアミノ酸配列は、ヒト由来１２ｋＤａ ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと相同性の高い領域２つがタンデムに連なり、更にそのＣ末端側にカルモジュリン結合部位を含む領域が連なった構成を有する（Ｒａｔａｊｃｚａｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８、１３１８７−、１９９３）。上記ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは４０ｋＤａ程度の分子量を持ち、免疫抑制剤であるシクロスポリン感受性であるシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅの１つである。いずれも、そのＮ末端にＰＰＩａｓｅ活性を担うドメインを、そのＣ末端にヒートショックタンパク質の１つであるＨＳＰ９０と結合するテトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）を含むドメインを有することを特徴とし、真核生物においてステロイドホルモンレセプター形成に関与するＰＰＩａｓｅである（Ｇａｌａｔ、Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−Ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８年）。上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、ラット等の真核生物由来のものが挙げられる。また、本発明で用いられるＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、真核生物由来のものだけでなく、実質的に同等の機能を有するＰＰＩａｓｅと認められるグループに属するものであれば、いずれの生物由来のＰＰＩａｓｅであってもよい。
上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のもののアミノ酸配列を配列番号９に示し、塩基配列を配列番号１０に示す。また、上記ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のもののアミノ酸配列を配列番号１１に示し、塩基配列を配列番号１２に示す。
上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性には、ＴＰＲを含むそれぞれのＣ末端ドメインが関与していることが示唆されている。本発明においては、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記Ｃ末端ドメインは、ヒトＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅでは、配列番号９における２６４番グルタミン酸付近からＣ末端までの領域であるが、このうち２６４番グルタミン酸から４００番イソロイシン付近の領域が特に重要である。また、ヒトＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅでは、１８４番ロイシン付近からＣ末端までの領域がＣ末端ドメインに相当する。
本発明で用いられる分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、上記例示のもの以外であっても、同等の分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであれば、好適に用いることができ、そのようなものとしては、例えば、最近その分子シャペロン活性が再評価されたブタ由来１８ｋＤａシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅ（Ｏｕ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１０、２３４６−、２００１年）等が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、（ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有するものである。
上記第２コード領域は、本発明の発現ベクターを用いて発現しようとする目的タンパク質をコードする塩基配列を有する領域である。
本発明で用いられる第２コード領域としては特に限定されないが、例えば、モノクローナル抗体等の抗体をコードする塩基配列や、膜タンパク質をコードする塩基配列を有するもの等が挙げられる。
上記抗体は、いずれの動物種由来の抗体であってもよく、抗体全長、その断片、Ｆａｂ、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等のその２個以上の断片がリンカーペプチドで連結したポリペプチド等も上記抗体に含まれる。また、上記抗体は、いずれのサブクラスであってもよい。
抗体は分子量が１０万を越える巨大分子であり、特定の抗原物質に特異的に結合する機能を利用して、分析用試薬、生体外診断薬等として幅広く使用されており、産業的な利用価値が高い。抗体分子と抗原物質との結合に寄与している部分はＶ領域（可変領域）と呼ばれ、重鎖のＶ領域と軽鎖のＶ領域とから構成されている。特定抗原に対する抗体を取得する方法としては、ラットやウサギ等の実験動物に抗原物質を免疫感作させ、その血清に含まれる抗体（ポリクローナル抗体）を得る方法と、次に述べるモノクローナル抗体を得る方法とが一般的である。
モノクローナル抗体は、単一クローンの抗体産生細胞が産生する抗体であり、その特徴は一次構造が均一なことである。モノクローナル抗体はケーラーとミルシュタインによるハイブリドーマ技術の確立によって、容易に製造できるようになった。この方法では、まず、所定の抗原物質をマウス等の実験動物に投与し免疫感作を行う。次に、免疫感作された動物の脾臓から、上記抗原物質に対する抗体産生能を獲得した脾臓細胞を取り出し、これをミエローマのような適切な腫瘍細胞と融合させてハイブリドーマを作成する。ついでＥＬＩＳＡの様な適当な免疫分析法を用いたスクリーニングにより、目的の抗体を産生しているハイブリドーマを選択する。その後、限界希釈法等を用いてクローニングすることにより、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立する。こうして樹立されたハイブリドーマを適当な培地中で培養した後、その代謝産物を含む培地をクロマトグラフ等を用いて分離することにより、目的のモノクローナル抗体が得られる。しかしながら、これらの方法は、動物に対する免疫感作というインビボでの生体反応を利用しているため、必然的に実験動物の介在を必要とする。従って、実験動物を飼育維持しなければならず、煩雑な労力を必要とすると同時に、多大なコストが必要となる。また、この方法では必ずしも全ての抗原物質に対するモノクローナル抗体が製造できるとは限らず、試行錯誤的な要素が含まれる。近年、大腸菌の表層に、抗体の重鎖及び軽鎖のＶ領域のみを適当なリンカーを介して連結させたｓｃＦｖ又は抗体のＦａｂ部分が発現できるようになってきた。これら抗体遺伝子をＰＣＲでランダムに増幅することで抗体遺伝子のライブラリーを作成し、細胞外に提示させ、これらのライブラリーから特定抗原に親和性を有するものをスクリーニングする方法が開発されつつある（熊谷ら，タンパク質・核酸・酵素 ４３、１５９−、１９９８年）。スクリーニングによって得られた抗体遺伝子を大腸菌等を用いて発現すれば、目的の抗原に対する抗体を、実験動物を用いることなく作成することが可能である。しかしながら、例えば抗体遺伝子を大腸菌内で大量発現させる場合、前述の通り、ほとんどが不溶性の封入体として発現され、活性型を得ることはできなかった。
これに対して、本発明の発現ベクターに第２コード領域としてモノクローナル抗体をコードする塩基配列を有するものを組み込めば、スクリーニングで得られた抗体の活性型（可溶型）産物を簡単に取得することが可能となる。
上記膜タンパク質としては特に限定されず、例えば、生理活性物質の受容体等が挙げられる。上記生理活性物質の受容体は、細胞外のさまざまな物質に選択的に応答し、細胞内に多彩なシグナルを伝達することから、その機能を解明することが創薬に直接繋がるとして非常に注目されている。これらの膜受容体タンパク質は構造的によく保存されたファミリーを形成しており、大きく分けて、イオンチャネル内在型、チロシンカイネース型、及び、Ｇタンパク質共役型等の３つに分類される。上記イオンチャネル内在型は、リガンドが受容体に結合すると、受容体そのものに存在するイオンチャネルが開き、Ｎａ^＋やＣａ^２＋等を細胞内外のイオン勾配を利用して細胞内に移動させるタイプである。上記チロシンカイネース型は、リガンドの結合をリン酸化活性の上昇に転換させ、一連のカスケードを引き起こすことによりシグナルを増幅する。上記Ｇタンパク質共役型は、受容体自身はイオンチャネルや酵素活性をもたず、リガンドの結合による情報をＧタンパク質を介して細胞内に伝達する。膜受容体タンパク質を標的とした医薬品は数多く開発されているが、その多くがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をターゲットとしている。したがって、ＧＰＣＲの内因性リガンドを特定し、更にその機能及び構造を明らかにすることによって、迅速な医薬品開発が可能になることが期待できる。これらのリガンドスクリーニングや構造解析のための結晶化や重水素化のためにはＧＰＣＲの大量発現技術の開発が不可欠であるが、これまでＧＰＣＲの発現は大腸菌や酵母では不可能であるとされてきており、主にＣＨＯやＣＯＳ−７、ＨＥＫのような動物培養細胞で発現した微量なサンプルを用いて様々な分析を行っているのが現状であった。
これに対して、本発明の発現ベクターに第２コード領域として膜タンパク質をコードする塩基配列を有するものを組み込めば、組み換え型タンパク質を安価に大量調整することができる。
上記制限酵素サイトはマルチクローニングサイトとも呼ばれる。上記制限酵素サイトを有する領域は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を第２コード領域として挿入する領域である。
本発明の発現ベクターにおいては、（１）上記第１コード領域がプロモーターに有効に連結しており、かつ、上記制限酵素サイトが第１コード領域と同じ解読枠内であって、上記第１コード領域の下流にあるか、又は、（２）上記制限酵素サイトが挿入された上記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、かつ、上記第１コード領域が上記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、上記第２コード領域の下流にある。
上記プロモーターとしては特に限定されず、例えば、Ｐｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇａｌ１／ｇａｌ１０プロモーター、ｎｍｔ１プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、マウスメタロチオネインプロモーター等が挙げられる。
本発明の発現ベクターでは、上記制限酵素サイトに目的とするタンパク質をコードする第２コード領域を挿入して、第２コード領域が組み込まれている発現ベクターを得、この発現ベクターを発現させることにより、（１）上記第１コード領域がプロモーターに有効に連結しており、かつ、上記制限酵素サイトが第１コード領域と同じ解読枠内であって、上記第１コード領域の下流にある場合は、第１コード領域とそれに続く第２コード領域が上記プロモーターにより翻訳され、一方、（２）上記制限酵素サイトが挿入された上記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、かつ、上記第１コード領域が上記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、上記第２コード領域の下流にある場合は、第２コード領域とそれに続く第１コード領域が上記プロモーターにより翻訳され、いずれの場合も、第２コード領域にコードされている目的タンパク質は分子シャペロン活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。
本発明の発現ベクターは、上記第１コード領域と上記第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化サイトとなる領域を有してもよい。
上記プロテアーゼ消化サイトは、本発明の発現ベクターに第２コード領域が組み込まれた発現ベクターの発現により得られる、第１コード領域にコードされる分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされるタンパク質とが結合した融合タンパク質において、上記ポリペプチドと上記タンパク質とをつなぐペプチドリンカーとなるものである。得られた融合タンパク質がプロテアーゼ消化サイトを有することにより、プロテアーゼを作用させることによって容易に融合タンパク質を消化して、第１コード領域にコードされる分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされるタンパク質とを切り離して、目的とする第２コード領域にコードされるタンパク質を得ることができる。
上記プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。これらのプロテアーゼはファルマシアバイオテク社等から市販されている。また、インテインの自己タンパク質スプライシング機能を利用して目的タンパク質を切り離すことも可能である。
上記プロテアーゼ消化サイトをコードする塩基配列の長さは特に限定されないが、１５〜９０塩基程度であることが好ましく、翻訳されてグリシンやセリン等の中性アミノ酸となる塩基配列を多く含むことが好ましい。
本発明の発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。上記他の公知の塩基配列としては特に限定されず、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、得られる融合タンパク質が適当なリガンドを介して固定化担体に結合する形態に設計されていてもよい。これにより発現後、その精製を簡略化することができる。例えば、分子シャペロン活性を有するポリペプチドとしてＰＰＩａｓｅを用いる場合、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであればＦＫ５０６やラパマイシン、その類縁化合物を担持させた担体を、シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅであればシクロスポリン又はその類縁化合物を担持させた担体を、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅであればＪｕｇｌｏｎｅ又はその類縁化合物を担持させた担体をそれぞれ用いることにより融合タンパク質の精製を簡略化することができる。
また、上記分子シャペロン活性を有するポリペプチドのＮ末端側に、ヒスチジン６残基程度のタグを有するよう本発明の発現ベクターを設計すると、得られた融合タンパク質は、ニッケル等の金属をキレートした担体に、ヒスチジン残基を介して結合するので、当該担体を用いれば、宿主由来のタンパク質と融合タンパク質とを簡単に分離することができる。更に、上記担体に結合した融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることにより、上記プロテアーゼ消化サイトが消化され、目的タンパク質のみを簡単に担体から遊離させることができる。
なお、イミダゾールで溶出すれば、プロテアーゼを作用させることなく、融合タンパク質のまま担体から遊離させることもできる。上記のヒスチジンタグ以外にも、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタチオン樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又はその一部をタグとし、マルトース樹脂により精製する方法等を用いることもできる。その他、抗体との親和性を用いることもできる。上記の各種タグは、融合タンパク質のＮ端側及びＣ末端側のいずれに設計してもよく、双方に設計してもよい。これらの遺伝子操作方法や、アフィニティー精製方法としては、当業者に公知の方法を用いることができる。
本発明の発現ベクターに目的とするタンパク質をコードする遺伝子を第２コード領域として組み込んで発現させることにより、第１コード領域にコードされる分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされるタンパク質との融合タンパク質が得られる。このような上記分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質もまた、本発明の１つである。更に、両者の間にプロテアーゼ消化サイトを含むリンカーペプチドが組み込まれている場合は、得られた融合タンパク質をプロテアーゼで消化すれば、目的タンパク質を容易に融合タンパク質から切り出すことができる。このため、本発明の融合タンパク質は、プロテアーゼ消化サイトを含有することが好ましい。
本発明の発現ベクターは宿主に導入されて目的タンパク質の発現に供される。このような本発明の発現ベクターを内包している宿主もまた、本発明の１つである。
上記宿主としては特に限定されず、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられる。しかしながら、使用される宿主と発現ベクターとの特性は適合しなければならない。例えば、ほ乳類細胞系において融合タンパク質を発現する場合、発現ベクターは、マウスメタロチオネインプロモーター等のほ乳類細胞のゲノムから単離されたプロモーターや、バキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のほ乳類細胞で成長するウイルスから単離されたプロモーターを用いることが好ましい。
上記宿主としては、なかでも、大腸菌等の原核生物が好ましい。
本発明の発現ベクターを宿主に導入する方法としては特に限定されず、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、トランスフェクションとしてリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。
本発明の発現ベクターを適切な宿主に導入し、宿主を適切な条件下で培養し、発現させることにより大量の融合タンパク質を得ることができる。このような、本発明の融合タンパク質を製造する方法もまた、本発明の１つである。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質を細胞質に発現させるか、本発明の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けて、得られた発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に発現させるか、又は、本発明の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、上記融合タンパク質を発現させることが好ましい。
グラム陰性細菌を宿主として用いる場合、融合タンパク質の発現は、細胞質であっても、ペリプラズム又は培地への発現であっても良い。本発明の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に、転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けることにより、上記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に分泌発現することができる。上記融合タンパク質をペリプラズムに発現させる場合、第１コード領域にコードされるポリペプチドとしては、本来細胞内では膜に存在するポリペプチドを用いると発現性を向上させることができる。上記本来細胞内では膜に存在するポリペプチドとしては、例えば、ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅであるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅや、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅであるＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ等が挙げられる。これらのＰＰＩａｓｅは本来グラム陰性菌のペリプラズムに存在し、タンパク質の折り畳みに関与するタンパク質である。
上記第２コード領域にコードされるタンパク質が膜タンパク質や抗体等である場合、本来これらのタンパク質は細胞質外に発現しているタンパク質であるため、上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅやＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ等と融合して発現させれば発現性が向上する。
本発明の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、上記融合タンパク質を発現させる場合は、宿主細胞を用いることなく、バクテリア又は真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ １１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）にて、本発明の融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させる。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、ＰＰＩａｓｅ活性を阻害するマクロライド、シクロスポリン、ジュグロン、又は、これらの類縁化合物を担持した担体に、融合タンパク質を吸着させた後、担体を回収することが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅと上記の阻害剤との結合性は強く、この親和力を利用して発現した融合タンパク質を精製することができる。例えば、アガロースゲル担体上にＦＫ５０６等のマクロライドを担持させたビーズを用いれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質を特異的に結合させることができる。同様に、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質の場合はシクロスポリンを担持させた担体を、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質の場合はジュグロン（Ｊｕｇｌｏｎｅ）を担持させた担体を用いれば精製を簡略化することができる。
本発明の融合タンパク質の製造方法で得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化サイトを消化するプロテアーゼで消化することにより目的タンパク質を得ることができる。このような、上記第２コード領域がコードするタンパク質を製造する方法もまた、本発明の１つである。
本発明によれば、目的のタンパク質を分子シャペロン活性を有するポリペプチドとともにペプチドリンカーで連結して、融合タンパク質として発現させることで、本来、異常型として発現される難発現性タンパク質を天然型の可溶体として大量に発現でき、その生産性を大幅に飛躍させることができる。また、目的タンパク質が抗体である場合、本発明によれば、実験動物を用いることなく簡便に機能を有した組み換え型抗体を調製することが可能となるので、他のタンパク質やペプチド等と融合させることで、高機能な抗体を大量調製することが可能となる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＴｃＦＫＢＰ１８（Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７、４６５−、２００１年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ ２２２、２４９−、１９９８）を鋳型とし、そのＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴｃＦｕ−Ｆ１及びＴｃＦｕ−Ｒ２を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質をプロテアーゼによりＴｃＦＫＢＰ１８と目的タンパク質とに切断するためのリンカーをコードする塩基配列として、Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖を設計した。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、その５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ有している（図１）。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、トロンビン切断部分のＤＮＡ配列の下流には、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイトを有しているため、目的タンパク質の遺伝子断片をこれらの制限酵素サイトを利用して導入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を得ることができる（図１）。
上記ＴｃＦＫＢＰ１８の遺伝子断片と、トロンビン切断部分をコードするＤＮＡ断片とを、各々の制限酵素で処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆ２の順でライゲーションした。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２とした。

（実施例２）大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴＦ−Ｆ１及びＴＦ−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＴＦ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＴＦ遺伝子を回収した。得られたＴＦ遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ＴＦ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった、ＴＦ融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドをＴＦｆ２とした。
（実施例３）ヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
ヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（ｈＦＫＢＰ５２）と融合するための発現ベクターを構築するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、終止コドンを除いたＦＫＢＰ５２遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＦＫ５２−Ｆ１及びＦＫ５２−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ｈＦＫＢＰ５２遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたｈＦＫＢＰ５２遺伝子の断片を回収した。得られたｈＦＫＢＰ５２遺伝子断片と上記ベクターとをライゲーションし、ｈＦＫＢＰ５２遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がｈＦＫＢＰ５２遺伝子に置き換わったｈＦＫＢＰ５２との融合タンパク質発現系が構築できた。得られたｈＦＫＢＰ５２融合タンパク質発現用プラスミドをＦＫ５２ｆ２とした。
（実施例４）ヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
ヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（ＣｙＰ４０）と融合するための発現ベクターを構築するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、終止コドンを除いたｈＣｙＰ４０遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＣＰ４０−Ｆ１及びＣＰ４０−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ｈＣｙＰ４０遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたｈＣｙＰ４０遺伝子を回収した。得られたｈＣｙＰ４０遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ｈＣｙＰ４０遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がｈＣｙＰ４０遺伝子に置き換わったｈＣｙＰ４０との融合タンパク質発現系が構築できた。得られたｈＣｙＰ４０融合タンパク質発現用プラスミドをＣＰ４０ｆ２とした。
（実施例５）大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（ＦｋｐＡ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌ＣＴＦ０７３株から、終止コドンを除いたＦｋｐＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＦＫＰＡ−Ｆ１及びＦＫＰＡ−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＦｋｐＡ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＦｋｐＡ遺伝子を回収した。得られたＦｋｐＡ遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ＦｋｐＡ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＦｋｐＡ遺伝子に置き換わったＦｋｐＡとの融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＦｋｐＡ融合タンパク質発現用プラスミドをＦｋｐＡｆ２とした。
（実施例６）大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（ＳｕｒＡ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＳｕｒＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＳＵＲ−Ｆ１及びＳＵＲ−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＳｕｒＡ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＳｕｒＡ遺伝子を回収した。得られたＳｕｒＡ遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ＳｕｒＡ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＳｕｒＡ遺伝子に置き換わったＳｕｒＡとの融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＳｕｒＡ融合タンパク質発現用プラスミドをＳｕｒＡｆ２とした。
（実施例７）ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いたＴｃＦＫＢＰ１８の発現
実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２によりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株をトランスフォーメーションした。２Ｌの三角フラスコに２×ＹＴ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒｕｃｔ １６ｇ／Ｌ、ＢＡＣＴＯ ＴＲＹＰＴＯＮ ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを入れ、組み換え大腸菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。沈殿画分は、更に封入体画分に精製するため、４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁後、３０分間反応させることで膜成分を可溶化し、遠心分離にて沈殿する封入体成分を回収した。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿部を封入体画分とした。可溶性画分１０μｇと、それに相当する封入体画分の容量をそれぞれ１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ＴｃＦＫＢＰ１８に相当するバンドは、可溶性画分のみに見られた。本来ＴｃＦＫＢＰ１８が検出させる位置よりも見かけ上高分子量の位置に検出されたが（図２）、これは、ＴｃＦＫＢＰ１８の構造遺伝子の３’末端に終止コドンが存在せず、マルチクローニングサイトが存在するため、その翻訳産物がＴｃＦＫＢＰ１８のＣ末端に連なっているためであると考えられる。
（実施例８）ＴｃＦＫＢＰ１８とマウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）Ｆａｂ抗体フラグメント（Ｄ１．３）からなる融合タンパク質の発現
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメントの発現プラスミド ｐＥＨＥＬＦａｂ−１（Ｉｄｅｎｏ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８、４６４−、２００２）をＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉにより処理し、アガローズゲルを用いた電気泳動法により、ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメント遺伝子断片を精製した。あらかじめＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ処理しておいたＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２に、このＤＮＡ断片をライゲーションした。この結果得られたプラスミドを発現すると、上記Ｆａｂの重鎖部分はＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現され、軽鎖部分は融合タンパク質になることなく、単独で発現することとなる。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離し、実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、ウサギ由来抗Ｄ１．３抗体を１次抗体として用いたウエスタンブロッティング法により、発現したＦａｂを特異的に検出した。
宿主菌である大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分には、ＣＢＢ染色、ウエスタンブロッティングによる検出のいずれにおいても、ＦａｂとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質に相当するバンドは見られなかった（図３）。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現させた場合、ＣＢＢ染色において、Ｆａｂの重鎖部分はＴｃＦＫＢＰ１８と融合した形態で可溶画分にメジャーバンドとして発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かにＦａｂが大量に発現していることが明らかとなった（図４）。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１０％であった。それに対し、Ｆａｂの軽鎖部分に相当するバンドは見られなかった。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｆａｂの軽鎖は宿主由来のプロテアーゼで分解していると考えられた（図４）。
（比較例１）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメントの単体での発現
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメントの発現プラスミド ｐＥＨＥＬＦａｂ−１を実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色及びウエスタンブロッティングの結果、Ｆａｂ遺伝子は、単独では可溶画分への発現は見られず、すべて沈殿画分に発現することが確認された（図５）。
（実施例９）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の発現
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントの発現プラスミドｐＡＡＬＳＣ（伊庭ら １９９７、Ｇｅｎｅ １９４、３５−）を鋳型とし、表１に示したＳＣＦ−Ｆ３及びＳＣＦ−Ｒ３をプライマーして用いるＰＣＲにより、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントの遺伝子を増幅した。この遺伝子をＴＡクローニングにより、ｐＴ７ブルーベクターにライゲーションし、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめ同制限酵素により処理しておいたＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２に再度ライゲーションすることで、ＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖとの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。
宿主菌である大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分には、ＣＢＢ染色においてマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質に相当するバンドは見られなかった（図６Ａ）。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現させた場合、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖはＴｃＦＫＢＰ１８と融合した形態で可溶画分にメジャーバンドとして大量に発現されることが示された（図６Ｂ）。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１４％であった。
（比較例２）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの単体での発現
実施例９で得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖ遺伝子を含むｐＴ７ブルーベクターをＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめ同制限酵素により処理しておいたｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）に再度ライゲーションすることで、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの発現系を構築した。得られた発現プラスミドを実施例９と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７に示した方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。その結果、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖは可溶画分にはほとんど発現せず、ほとんどが不溶性画分に発現することが確認された（図６Ｃ）。
（実施例１０）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴＦとの融合タンパク質の発現
実施例９で調製したマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントを含むｐＴ７ブルーベクターのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を、あらかじめ同制限酵素により処理しておいた実施例２のＴＦｆ２にライゲーションすることにより、ＴＦとｓｃＦｖとの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。比較例２で示したように、ｓｃＦｖ単独で発現させた場合にはｓｃＦｖは不溶性画分に発現したのに対し、ＴＦと融合発現させた場合、可溶性画分に大量に発現されることがわかった。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約７％であった。
（実施例１１）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとｈＦＫＢＰ５２との融合タンパク質の発現
実施例９で調製したＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖとの融合タンパク質発現ベクターをＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ処理し、ｓｃＦｖフラグメントを含むＤＮＡ断片を調製した。あらかじめ同制限酵素により処理しておいた実施例３のＦＫ５２ｆ２に上記ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、ｈＦＫＢＰ５２とｓｃＦｖとの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。ｈＦＫＢＰ５２と融合発現させた場合、可溶性画分に大量に発現されることがわかった。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約９％であった。
（実施例１２）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとｈＣｙＰ４０との融合タンパク質の発現
実施例１１のＦＫ５２ｆ２の代わりに、実施例４で調製したＣＰ４０ｆ２を用いたこと以外は実施例１１と同様の方法でｈＣｙＰ４０とｓｃＦｖとの融合タンパク質を発現させた。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１１％であった。
（実施例１３） ヒト由来セロトニンレセプターとＦｋｐＡとの融合タンパク質の発現
７回膜貫通型膜タンパク質の一つであるヒト由来セロトニンレセプター（ＨＴ１ａレセプター）と大腸菌由来ＦｋｐＡとの融合タンパク質発現系を構築するためにヒトｃＤＮＡライブラリーからＨＴ１ａレセプター遺伝子のクローニングを行った。すなわち、ＮＣＢＩコード：ＨＳＳＥＲＲ５１として登録されている塩基配列情報を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を増幅した。
ＨＴ１ａのアミノ酸配列を配列番号１３に示し、塩基配列を配列番号１４に示した。プライマーには５‘側にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３’側にＮｏｔＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理により、ＨＴ１ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片を切断・精製後、あらかじめＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理しておいた実施例５のＦｋｐＡｆ２にライゲーションし、ＨＴ１ａ遺伝子を含むベクターを回収した。得られたＦｋｐＡとＨＴ１ａとの融合タンパク質発現ベクターを実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を超音波破砕後、３０００ｒｐｍにて遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分画した。実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、発現したＨＴ１ａを特異的に検出した。その結果、ＣＢＢ染色において、ＨＴ１ａはＦｋｐＡと融合した形態で可溶画分に発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かに発現していることが確認された。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％であった。
（実施例１４） ヒト由来セロトニンレセプターとＳｕｒＡとの融合タンパク質の発現
実施例１３のＦｋｐＡｆ２の代わりに、実施例６で調製したＳｕｒＡｆ２を用いたこと以外は実施例１３と同様の方法でＳｕｒＡとＨＴ１ａとの融合タンパク質を発現させた。
実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウエスタンブロッティング法により発現したＨＴ１ａを特異的に検出したところ、ＣＢＢ染色において、ＨＴ１ａはＳｕｒＡと融合した形態で可溶画分に発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かに発現していることが確認された。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％であった。
（実施例１５）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の精製
実施例９で得られた可溶性画分を下記の（ａ）及び（ｂ）の陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過の順でカラム精製を繰り返すことにより、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質をほぼ単一にまで精製した。精製の結果得られた融合タンパク質の量は、培地１Ｌあたり約５０ｍｇであった。
（ａ）ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｃｏｌｕｍｎ（１６ｍｍ×６０ｃｍ；東ソー社製）
Ａ液：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ 緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
（０−３００分：Ｂ液０−１００％の直線グラジエント、３００−４２０分：Ｂ液１００％）
流速：１ｍＬ／分
（ｂ）ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ｃｏｌｕｍｎ（２６ｍｍ×６０ｃｍ；アマシャムファルマシア社製）
溶離液：１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０；０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有）
流速：３ｍＬ／分
（実施例１６） 融合タンパク質のトロンビンによる切断
実施例１５で精製した融合タンパク質１ｍｇ当たりに、１０Ｕのトロンビンを加え、２２℃にて１６時間処理することにより、融合タンパク質のトロンビンサイトを切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、融合タンパク質は確かにマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８とに切断されたことが確認された（図７）。
（実施例１７）ＥＬＩＳＡによるマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの機能確認
発現で得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの機能は、ニワトリリゾチームを抗原とするＥＬＩＳＡ法において、１次抗体として機能するか否かで評価した。即ち、９６穴プレートに５０μｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）溶液１００μＬを添加し、３０℃にて３時間インキュベーションすることにより、ＨＥＬをプレート上に固定化した。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にてプレートを洗浄後、ブロックエース（大日本製薬社製）を含むＴＢＳ緩衝液でブロッキングした（４℃、オーバーナイト）。ＴＢＳにて洗浄後、実施例１６で得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖ ２４μｇを含むＴＢＳ（１０％ブロックエース含有）を用い、室温にて３時間インキュベートした。ＴＢＳにて洗浄後、２次抗体としてＡｎｔｉ−マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（フナコシ社製）を含むＴＢＳ緩衝液でインキュベート（２時間、３０℃）した。ＴＢＳにて洗浄後、ＨＲＰの基質としてＡＢＴＳ液（フナコシ社製）１００μＬを加え、３０分間インキュベートし、ＯＤ４０５を測定した。得られた結果を図８に示した。プレートに固定したＨＥＬ濃度に応じて、吸光度が増大することから（▲）、得られたｓｃＦｖが抗原と結合していることが確認された。一方、ＨＥＬの代わりに同濃度のキモトリプシンインヒビター（□）を用いた場合、吸光度の上昇は見られなかった。このことは発現して得られた抗体が特異的に抗原に結合することを示していると思われる。

本発明は、上述の構成よりなるので、これまでバクテリアや酵母、昆虫細胞等を用いたタンパク質発現系において問題となっていた封入体の形成を防ぎ、正常型タンパク質を可溶性画分に大量に発現させることを可能とする。これにより、従来のようにインビトロで封入体を正常型タンパク質にリフォールディングするといった手間が不要となる。

図１は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質を作成するためのベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２の遺伝子配置を示す図である。
図２は、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いた場合のＴｃＦＫＢＰ１８の発現を示す図である。
図３は、宿主由来のタンパク質の電気泳動パターンを示す図である。
図４は、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）Ｆａｂ抗体フラグメントとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の発現を示す図である。
図５は、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）Ｆａｂ抗体フラグメントの単体での発現を示す図である。
図６は、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）ｓｃＦｖフラグメント及びそのＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の発現を示す図である。
図７は、精製したマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質と、それをトロンビン処理した結果を示す図である。
図８は、発現の結果得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの活性をＥＬＩＳＡ法により示した図である。

Claims (29)

1. 組み換えタンパク質生産時の不活性な異常型タンパク質の形成を防ぎ、目的タンパク質を可溶型として大量且つ効率的に生産させるための発現ベクターであって、
   （ａ）分子シャペロン活性（変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性）を有するＰＰＩａｓｅであるポリペプチド（ただしＳＬＹＤタンパク質を除く）をコードする第１コード領域、及び、
   （ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有し、
   前記第１コード領域は、プロモーターに有効に連結しており、
   前記制限酵素サイトは、第１コード領域と同じ解読枠内であって、前記第１コード領域の下流にある
   ことを特徴とする発現ベクター。
2. 組み換えタンパク質生産時の不活性な異常型タンパク質の形成を防ぎ、目的タンパク質を可溶型として大量且つ効率的に生産させるための発現ベクターであって、
   （ａ）分子シャペロン活性（変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性）を有するＰＰＩａｓｅであるポリペプチド（ただしＳＬＹＤタンパク質を除く）をコードする第１コード領域、及び、
   （ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有し、
   前記制限酵素サイトは、挿入された前記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、
   前記第１コード領域は、前記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、前記第２コード領域の下流にある
   ことを特徴とする発現ベクター。
3. 第１コード領域と、第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化サイトとなる領域を有することを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
4. 請求の範囲第１、２又は３項記載の発現ベクターにタンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることを特徴とする発現ベクター。
5. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
6. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
7. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、パーブリン型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
8. ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第５項記載の発現ベクター。
9. 古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第８項記載の発現ベクター。
10. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有していることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
11. ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第５項記載の発現ベクター。
12. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有していることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
13. ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第５項記載の発現ベクター。
14. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有していることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
15. ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第５項記載の発現ベクター。
16. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有していることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
17. シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第６項記載の発現ベクター。
18. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有していることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
19. パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の発現ベクター。
20. 分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有していることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の発現ベクター。
21. 第２コード領域は、モノクローナル抗体をコードする塩基配列を有することを特徴とする請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０項記載の発現ベクター。
22. 第２コード領域は、膜タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０項記載の発現ベクター。
23. 請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターを内包していることを特徴とする宿主。
24. 大腸菌であることを特徴とする請求の範囲第２３項記載の宿主。
25. 分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質を製造する方法であって、
    請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養し、前記融合タンパク質を細胞質に発現させることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
26. 分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質を製造する方法であって、
    請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けて、前記発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養し、前記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に発現させることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
27. 分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質を製造する方法であって、
    請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、前記融合タンパク質を発現させることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
28. ＰＰＩａｓｅ活性を阻害するマクロライド、シクロスポリン、ジュグロン、又は、これらの類縁化合物を担持した担体に、融合タンパク質を吸着させた後、前記担体を回収することを特徴とする請求の範囲第２５、２６又は２７項記載の融合タンパク質の製造方法。
29. 第２コード領域がコードするタンパク質を製造する方法であって、請求の範囲第２５、２６、２７又は２８項記載の方法で得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化サイトを消化するプロテアーゼで消化することを特徴とするタンパク質の製造方法。

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