JPH11513246A

JPH11513246A - 融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ

Info

Publication number: JPH11513246A
Application number: JP9512071A
Authority: JP
Inventors: マーシイ，アリス; サロウ，スコツト・ピー; ウイスニユウスキイ，ダグラス
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 1999-11-16
Also published as: WO1997010253A1; CA2231330A1; EP0871648A1

Abstract

(57)【要約】本明細書は、標的タンパク質とＦＫ５０６結合タンパク質からなる融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニングのためのハイスループットアッセイを記載する。融合タンパク質をコードするＤＮＡの製造方法及び該ＤＮＡの発現方法も本明細書に記載する。本発明は、幾つかの融合タンパク質のための組換えＤＮＡ配列及びタンパク質配列も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ発明の背景Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインは、特定のペプチドコンテキストの中でリン酸化チロシン残基の認識という共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーである。該ドメインは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質としてE.coli で定型的に発現された。通常、このために、高レベルの発現とグルタチオン−セファロースでの簡単なアフィニティー精製が可能となる。続いてリガンド結合は、ＧＳＴ／ＳＨ２を放射性標識ホスホペプチドとインキュベートし、グルタチオン−セファロースとの複合体を沈殿させ、ビーズを洗浄し、次にビーズをカウントして結合放射活性を測定することによりアッセイする[Isakovら、J.Exp.Med.,181,375-380(1995)；Piccion eら、Biochemistry,32,3197-3202(1993)；Huyerら、Biochemistry,34,1040-1049 (1995)]。この方法には幾つかの欠点がある。特に、薬剤開発のための新規リード化合物としてアゴニスト、アンタゴニスト、又は阻害剤のハイスループットスクリーニングに適用する場合に当てはまる。第１に、ペプチドの放射性標識を、キナーゼと[³²Ｐ]ＡＴＰを用いて酵素的に、又は[¹²⁵Ｉ]Bolton-Hunter試薬を用いて化学的に行う。両方の場合に、アイソトープは短寿命であり、そのため材料を頻度高く調製する必要がある。酵素的リン酸化の場合には、適当なキナーゼも、スクリーニング目的のために十分な材料を生じさせるために十分な量利用できなけらばならない。第２に、プロトコルにおいて、グルタチオン−セファロースビーズを洗浄して、遊離ホスホペプチドから結合複合体を分離する必要がある。これは、結合リガンドの解離の危険のある非平衡方法である。特に解離速度が速い場合に当てはまる。このため、結果を誤らせる可能性がある。最後に、含まれる操作と遠心分離の数のために、プロトコルは手動で行うためには非常に面倒で、スループットを増加させるためのロボット自動化には容易には適合させられない。ＳＨ２ドメインに適用された、タンパク質とリガンドの相互作用の別の２種の測定方法は、表面プラスモン共鳴と等温滴定熱量測定を用いる生物特異的相互作用分析である（Felderら、Mol.Cell.Biol.，13,1449-1455(1993);Panayotouら、 Mol．Cell.Biol.，13,3567-3576(1993)：Payneら、Proc.Natl．Acad．Sci. U.S.A.，90,4902-4906(1993)；Morelockら、J.Med.Chem.，38,1309-18(1995)；L adburyら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,92,3199-3203(1995)；Lemmonら、Bi ochemistry，33,5070-5076(1994)）。これらの技術はＳＨ２ドメインの特別の融合パートナーを必要としないが、ハイスループットスクリーニングに適さない複雑な装置が必要である。発明の概要本発明は、融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって、被覆されたミクロシンチレーションプレートに、試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質（標的タンパク質、ペプチドリンカー及びＦＫ５０６−結合タンパク質）、及び放射標識リガンドを結合させ、試験化合物の非存在下の対照アッセイに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合のせいであるシンチレーションカウントを測定し、試験化合物がタッグ付けリガンドの結合に及ぼす効果を測定することを特徴とする該方法を包含する。融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの調製及び発現の方法も本発明の範囲内である。更に、本発明は、融合タンパク質を発現できる組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。更に、本発明は、組換え融合タンパク質の精製方法に関する。本発明は、単一又は多数のシグナル伝達ドメインへのリガンド結合、例えば、ＳＨ２ドメインへのホスホペプチド結合の機能性アッセイのためにミクロシンチレーションプレート技術を使用する即時性方法を提供する。本発明は、特別の放射化学合成を必要とせず、アゴニスト、アンタゴニスト、及び／又は阻害剤の高能力スクリーニングのためのロボット自動化に容易に適合できる。図面の簡単な説明図１．Ａ）ストレプトアビジンミクロシンチレーションプレート、ビオチニル化リガンド及び融合タンパク質（ＳＨ−２：ＦＫＢＰ）の結合。その結合は検出可能なシグナルを発する。Ｂ）試験化合物と融合タンパク質（ＳＨ−２：ＦＫＢＰ）の結合。その結合ではシグナル検出ができない。発明の詳細な説明本発明は、標的タンパク質に優先的に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明の一実施態様は、融合タンパク質に結合できる化合物のシクリーニング方法であって、ａ）試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質、及び放射性標識リガンドを混合すること；ｂ）被覆されたミクロシンチレーションプレートに混合液を添加すること；ｃ）混合液を約１〜約２４時間インキュベートすること；ｄ）シンチレーション計測を用い、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合のためであるプレート結合カウントを測定すること；及びｅ）試験化合物の非存在下での対照アッセイランに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合を決定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第２の実施態様は、融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法であって、ａ）ＦＫ−５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡの終止コドンを除去すること；ｂ）ＦＫ５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡ上に、ペプチドリンカーをコードする修飾ＤＮＡフラグメントを合成すること；ｃ）クローニング部位で発現ベクターを消化すること；ｄ）ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする修飾ＤＮＡフラグメントを消化された発現ベクターにクローニングし、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターを産生させること；及びｅ）標的タンパク質をコードするＤＮＡを、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターにクローニングすること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第３の実施態様は、発現ベクター中の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法であって、ａ）宿主細胞を融合タンパク質発現ベクターで形質転換すること；ｂ）宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導すること；ｃ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること；及びｄ）融合タンパク質を精製すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第４の実施態様は、単離されるＦＫＢＰ−ＳＨ２融合タンパク質の精製方法であって、ａ）固体支持体に固定化したアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造すること；ｂ）融合タンパク質を発現する細胞から凍結／融解抽出液を製造すること；及びｃ）アフィニティーマトリックスに抽出液を負荷し、非結合タンパク質を洗い流すこと；及びｄ）所望の融合タンパク質をフェニルホスフェートで溶出すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。 “融合タンパク質”という用語は、２個のタンパク質が“ペプチドリンカー” で分離されていることを特徴とする、“ＦＫ５０６結合タンパク質”（ＦＫＢＰ）に融合した“標的タンパク質”を指す。 “ペプチドリンカー”は、約１〜約２０個のアミノ酸を含む配列からなりうるが、プロテアーゼ切断部位のための配列を含んでも含まなくともよい。プロテアーゼ切断部位であるペプチドリンカーの例は、アミノ酸配列ＧＬＰＲＧＳによって表される。 “標的タンパク質”という用語は、規定されたリガンドを有するタンパク質を指す。標的タンパク質のこの定義内に、単一及び複数のシグナル伝達ドメイン、例えばＳｒｃホモロジー１（ＳＨ１）ドメイン、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン、Ｓｒｃホモロジー３ドメイン（ＳＨ３）、及びプレクストリンホモロジー（ＰＨ）ドメイン[Hanks & Hunter，FASEBJ.,9,576-596(1995)；Bolen，Cur r.Opin.Immunol.，7,306-311(1995)；Kuriyan & Cowburn，Curr.Opin.Struct.Bi ol.，3,828-837(1993)；Cohenら、Cell，80,237-248(1995)]など（これらに限定されない）が含まれる。“ＳＨ１ドメイン”という用語は、ＡＴＰを結合し、ペプチド基質とタンパク質基質のチロシンリン酸化を触媒する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“ＳＨ２ドメイン”という用語は、特定のペプチドコンテキスト中のリン酸化チロシン残基を認識するという共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“ＳＨ３ドメイン”という用語は、ポリプロリンII型ヘリックスを認識するという共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“ＰＨドメイン”という用語は、タンパク質−タンパク質相互作用とタンパク質−脂質相互作用の両方を媒介する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。本発明の方法で使用できるＳＨ２ドメインの例は、チロシンキナーゼであるＺＡＰ、ＳＹＫ及びＬＣＫ中に存在する単一及びタンデムＳＨ２ドメインなどがある(これらに限定されない)。ＤＮＡ配列は、GenBank，National Center for Biotechnology Information，Nati onal Library of Medicine，8600 Rockville Pike，Bethesda，MD20894から得た。配列の受託番号は、ヒトＺＡＰ（Ｌ０５１４８）、ヒトＳＹＫ（Ｌ２８８２４）及びヒトＬＣＫ（Ｘ１３５２９）である。 “タッグ付きリガンド”という用語は、標的タンパク質のためのビオチニル化又はエピトープをタッグとしたリガンドを指す。 “放射性標識リガンド”という用語は、ＦＫＢＰに結合する［³Ｈ］−、［¹²⁵Ｉ］−、［¹⁴Ｃ］−、［³⁵Ｓ］−、［³²Ｐ］−、又は［³³Ｐ］ −標識リガンドを指す。本発明において有用な放射性標識リガンドの例は［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６である。 “被覆されたミクロシンチレーションプレート”という用語は、タッグ付きリガンドがビオチニル化されている場合にはストレプトアビジンで被覆されたミクロシンチレーションプレート、及びタッグ付きリガンドがエピトープタッグ付きである場合には抗−抗体被覆もしくはプロテインＡ被覆ミクロシンチレーションプレートに結合した抗エピトープ抗体を指す。本発明において有用な被覆されたミクロシンチレーションプレートの例は、ストレプトアビジン被覆、ヒツジ抗ウサギ被覆、及びヤギ抗マウス被覆 FlashPlate Plus（DuPont-NEN）である。プロテインＡ（これに限定されない）などの別の被覆を、当業者公知の方法で、非被覆FlashPlateに適用できる。 “対照アッセイ”という用語は、タッグ付きリガンド、融合タンパク質、放射性標識リガンド、及び被覆されたミクロシンチレーションプレートの存在下、但し試験化合物の非存在下で行うアッセイを指す。 “ＦＫ５０６結合タンパク質”という用語は、下記のＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ相同体を含みうる（それらに限定されない）[それらを開示する参考文献を引用する]。このリストで本発明の範囲を限定するものではない。哺乳動物細菌菌類種々の宿主細胞が本発明で使用できるが、それらには細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞がある（これらに限定されない）。発現ベクターとは、本明細書で、適当な宿主中で、遺伝子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。このようなベクターを用い、細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの種々の宿主細胞で遺伝子を発現できる。特別に設計したベクターでは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞などの宿主間のＤＮＡシャトルが可能となる。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞での自律的複製の複製起点；選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数能、及び活性プロモーターを含みうる。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベクターとは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスでありうる（これらに限定されない）。ＦＫＢＰ融合タンパク質発現に適した市販のベクターには、ｐＢＲ３２２（Promega）、ｐＧＥＸ（Amersham）、ｐＴ７（U SB）、ｐＥＴ（Novagen）、ｐＩＢＩ（IBI）、ｐＰｒｏＥＸ−１（Gibco/BRL）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Stratagene）、ｐＴＺ１８ＲとｐＴＺ１９Ｒ（US B）、ｐＳＥ４２０（Invitrogen）、ｐＶＬ１３９２（Invitrogen）、ｐＢｌｕｅＢａｃ（Invitrogen）、ｐＢＡｃＰＡＫ（Clontech）、ｐＨＩＬ（Invitrogen ）、ｐＹＥＳ（Invitrogen）、ｐＣＤＮＡ（Invitrogen）、ｐＲＥＰ（Invitrog en）などがある（これらには限定されない）。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合、及びエレクトロポレーションなど（これらに限定されない）の幾つかの技術のいずれかにより、宿主細胞に導入できる。ＦＫＢＰに融合した標的遺伝子を有する発現プラスミドを含有するE.coliを増殖させ、適切に誘導する。次に細胞をペレットにし、適切な緩衝液に再懸濁させる。ＦＫＢＰ−１２はそれを特別にペリプラズムに向かわせる配列を欠くけれども、ＦＫＢＰは主にそこに局在し、細胞ペレットの標準的な凍結／融解処理によって放出されうる。遠心分離後、得られた上清は８０％超の純度のＦＫＢＰ融合タンパク質を含み、所望ならば更に通常の方法で精製できる。あるいは、アッセイは純粋なタンパク質に依存せず、最初のペリプラズム調製物を直接使用できる。ＦＫＢＰと標的タンパク質間に位置するトロンビン部位を、融合タンパク質からＦＫＢＰを切断する手段として使用できる。このような切断された物質は次のアッセイでの適切な陰性対照でありうる。単一又は複数のＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質は、固体支持体上に固定化されたアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造することによって精製できる。凍結／融解抽出液を、融合タンパク質を発現する細胞から調製し、アフィニティーマトリックスに負荷する。次に、所望の融合タンパク質をフェニルホスフェートで特異的に溶出する。標的タンパク質とそのリガンド間の複合体の形成をアッセイするために、適切な緩衝液中、放射性標識リガンドの存在下、タッグ付きリガンドをＦＫＢＰ融合タンパク質と混合する。複合体形成が起る適切なインキュベーション時間後、混合液を被覆されたミクロシンチレーションプレートに移し、タッグ付きリガンドと結合融合タンパク質を捕捉させる。プレートを密封し、捕捉が完全に行われるのに十分な時間インキュベートし、次にマルチウエルシンチレーションカウンターで計測する。最初のインキュベーションを行い、次いで単一又は複数の試験化合物の存在下、ミクロシンチレーションプレートでの捕捉工程を行い、試験化合物が融合タンパク質へのタッグ付きリガンドの結合に効果を有するかどうかを測定することによって、アゴニスト／アンタゴニスト／阻害剤のスクリーニングを行う。この原理を図１に示す。以下の実施例によって更に本発明を理解することができるが、実施例は本発明を限定するものではない。実施例１ＦＫＢＰ融合体クローニングベクター製造方法種々の宿主細胞での遺伝子の修飾と発現の一般的技術は、Ausubel,F.M.，Bren t,R.，Kingston,R.E.，Moore,D.D.，Seidman,J.G.，Smith,J.A．及びStruhl,K． Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，New York，New York，1989)に記載されている。終止コドン（ＴＧＡ）の変りにグリシンコドン（ＧＧＴ）、続いてトロンビン部位（Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）とＢａｍＨＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）をコードする配列を含む３′−改変ＦＫＢＰフラグメントの配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。ＰＣＲ反応液は、以下のプライマー、即ち５′−ＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ−３′と５′−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧ−３′及び鋳型としてヒトＦＫＢＰ−１２を含むプラスミドを含んでいた。得られた３６７塩基対増幅産物をベクターｐＣＲII(Invitrogen)に連結し、連結混合物でコンピテントEscherichia coli 細胞を形質転換した。挿入物を含むクローンを隣接ベクタープライマーを用いるＰＣＲで同定した。ジデオキシＤＮＡ配列決定により、一つのポジティブ単鎖のヌクレオチドを確認した。改変した３３８塩基対のＦＫＢＰフラグメントを、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩを用いｐＣＲIIプラスミドから切出し、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ消化ｐＥＴ９ｄ(Novagen)プラスミドに連結した。コンピテントE.coliを連結混合物で形質転換し、挿入体を含むコロニーを、隣接ベクター配列をコードするプライマーを用いるＰＣＲで同定した。ＦＫＢＰ融合クローニングベクターをｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔと命名する。実施例２ＦＫ−ＺＡＰ融合発現ベクターの製造方法読取り枠が融合ベクター中のＦＫＢＰの読取り枠で保存されるように、５′− 末端のＢａｍＨＩ部位を含ませるように、ＺＡＰ−７０のタンデムＳＨ２ドメインをコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより製造した。３′−末端で、フラグメントはまた、終止コドン、続いてＢａｍＨＩ部位を含んでいた。ＰＣＲ反応液はＭｏｌｔ−４ｃＤＮＡ(Clontech)と以下のプライマー、即ち５′−ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴ −３′と５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＴＧＣＴ−３ ′を含んでいた。フラグメントを、適切なベクターにクローンし、配列決定し、ＢａｍＨＩで消化し、ＳＨ２ドメインを含む挿入体を、ＢａｍＨＩ処理ｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔに連結し、E.coliを形質転換した。正しい方向で挿入体を含むクローンをＰＣＲ又は制限酵素分析で同定した。プラスミドＤＮＡを調製し、それを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。実施例３ＦＫ−ＳＹＫ融合発現ベクターの製造方法ＦＫＢＰに融合したＳＹＫのタンデムＳＨ２ドメイン用発現ベクターを、実施例２のように、但しＰＣＲ反応液はＲａｊｉ細胞ｃＤＮＡ(Clontech)と以下のプライマー、即ち５′−ＣＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＡ−３′と５′−ＧＡＣＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴ−３′を含んでいたことを除いて製造した。実施例４ＦＫ−ＬＣＫ融合発現ベクターの製造方法ＦＫＢＰに融合したＬＣＫのＳＨ２ドメイン用発現ベクターを、実施例２のように、但し、ＰＣＲ反応液はＭｏｌｔ−４ｃＤＮＡ(Clontech)と以下のプライマー、即ち５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＣＴ−３′と５′−ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＧＴＧＣＡ− ３′を含んでいたことを除いて製造した。実施例５ＦＫ−ＺＡＰ工程Ａ：ＦＫ−ＺＡＰの発現方法ｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔ／ＺＡＰＳＨ２プラスミドを含むE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を、６００ｎｍで測定した光学密度が約０．５〜１．０になるまで、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むLuria-Bertani（ＬＢ）培地で、約３７℃で増殖させた。ＦＫ−ＺＡＰ融合タンパク質の発現を、０．１ｍＭイソプロピルベータ− チオガラクトピラノシドで誘導し、更に３〜５時間、約３０℃で細胞を増殖させた。４４００×ｇで約１０分、約４℃で細胞をペレットにし、細胞を、各１μｇ／ｍＬのアプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチン及びベスタチンを含む１００ｍＭトリスｐＨ８．０を用いて最初の培養液容量の２％に再懸濁した。再懸濁したペレットを、更なる精製まで、約−２０℃で凍結した。工程Ｂ：ＦＫ−ＺＡＰの精製方法アガロースに固定化したアビジンを、ヒトＴ細胞レセプターのζ１ＩＴＡＭ配列由来の過剰のビオチニル化ホスホペプチド、即ちビオチニル−ＧＳＮＱＬｐＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥｐＹＤＶＬＤＫと混合し、非結合ペプチドを洗い流すことによって、ＦＫ−ＺＡＰの精製用アフィニティーマトリックスを製造した。ＦＫ−ＺＡＰを含む凍結細胞を温水で融解させ、ドライアイス上で約２５分間再凍結させ、次に再度融解させた。０．１％オクチルグリコシド、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び５００ｍＭＮａＣｌの添加後、抽出液を３５，０００×ｇで約３０分間遠心分離した。上清を約４ ℃でホスホペプチドアフィニティーカラムにかけ、１ｍＭＤＴＴと０．１％オクチルグリコシドを含むリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。ＦＫ−ＺＡＰを約３７℃で同緩衝液中の２００ｍＭフェニルホスフェートで溶出した。タンパク質プールを濃縮し、フェニルホスフェートを脱塩カラムで除去した。精製ＦＫ−ＺＡＰを、１０ｍＭＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＤＴＴ／０．１ｍＭＥＤＴＡ／１０％グリセロール中、約−３０℃で保存した。実施例６ＦＫ−ＳＹＫｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔ／ＳｙｋＳＨ２プラスミドを含む E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例５に記載のように、増殖、誘導、回収した。ＦＫ−ＳＹＫを、実施例５に記載の同一のアフィニティーマトリックスと方法を用いて精製した。実施例７ＦＫ−ＬＣＫｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔ／ＬｃｋＳＨ２プラスミドを含むE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例５に記載のように、増殖、誘導、回収した。ＦＫ−ＬＣＫの精製用アフィニティーマトリックスは、アガロースに固定化したアビジンを過剰のビオチニル−ＥＰＱｐＹＥＥＩＰＩＹＬと混合し、非結合ペプチドを洗い流して製造した。精製の残りの方法は実施例５と同じであった。実施例８ＦＫ−ＺＡＰへのホスホペプチド結合のアッセイ２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＤＴＴ、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０、ｐＨ７．０からなる緩衝液中、外界温度でアッセイを行った。緩衝液と種々の量のビオチニル−ホスホペプチドの混合液３００μＬを、ＦＫ−ＺＡＰタンパク質２５μＬと［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６(DuPont NEN)５０μＬと、微量遠心チューブ中で混合した。次に、ストレプトアビジンで被覆されたFlashPlate Plus(Du Pont-NEN)のウエルに各アッセイの１５０μＬ部分を移し、緩衝液を更に５０μ Ｌ加えた。アッセイ成分の最終濃度は、０〜５０ｎＭビオチニル−ＧＳＮＱＬｐＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥｐＹＤＶＬＤＫ、１００ｎＭＦＫ−ＺＡＰ融合タンパク質、２５ｎＭ［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６であった。プレートを密封し、２０時間インキュベートした。プレート結合放射活性を、パッカードトップカウントミクロプレートシンチレーション計測器で、種々の時点で計測した。実施例９ＦＫ−ＺＡＰのアンタゴニストのスクリーニング方法２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＤＴＴ、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０、ｐＨ７．０からなる緩衝液中、外界温度でアッセイを行う。試験化合物のＤＭＳＯ溶液１０μＬとビオチニル−ホスホペプチド保存溶液１２０μＬを標準的９６ウエルプレートのウエルに分配する。次に、ＦＫ−ＺＡＰタンパク質と［³Ｈ］− ジヒドロＦＫ５０６(DuPont NEN)の混合液２０μＬを各試験ウエルに加える。次に、アッセイ溶液を、ストレプトアビジン−被覆 FlashPlate(DuPont NEN)のウエルに移す。アッセイ成分の最終濃度は、２５ｎＭビオチニル−ＧＳＮＱＬｐＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥｐＹＤＶＬＤＫ、２５ｎＭＦＫ−ＺＡＰ融合タンパク質、１０ｎＭ［³Ｈ］− ジヒドロＦＫ５０６、５％ＤＭＳＯである。プレートを密封し、１〜８時間インキュベートする。次に、ビーズ結合放射活性をパッカードトップカウントミクロプレートシンチレーション計測器で測定する。実施例１０ＦＫ−ＳＹＫのアンタゴニストのスクリーニング方法アッセイを、ＦＫ−ＺＡＰの変りにＦＫ−ＳＹＫを用いることを除いて実施例９に記載のように行う。実施例１１ＦＫ−ＬＣＫのアンタゴニストのスクリーニング方法アッセイを、ＦＫ−ＺＡＰの変りにＦＫ−ＬＣＫを用い、タッグ付きリガンドが２５ｎＭビオチニル−ＥＰＱｐＹＥＥＩＰＩＹＬであることを除いて実施例９に記載のように行う。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年９月１９日【補正内容】融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ発明の背景Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインは、特定のペプチドコンテキストの中でリン酸化チロシン残基の認識という共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーである。該ドメインは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質としてE.coliで定型的に発現された。通常、このために、高レベルの発現とグルタチオン−セファロースでの簡単なアフィニティー精製が可能となる。続いてリガンド結合は、ＧＳＴ／ＳＨ２を放射性標識ホスホペプチドとインキュベートし、グルタチオン−セファロースとの複合体を沈殿させ、ビーズを洗浄し、次にビーズをカウントして結合放射活性を測定することによりアッセイする[Isakovら、J.Exp.Med.,181,375-380(1995)；Piccione ら、Biochemistry,32,3197-3202(1993)；Huyerら、Biochemistry,34,1040-1049( 1995)]。この方法には幾つかの欠点がある。特に、薬剤開発のための新規リード化合物としてアゴニスト、アンタゴニスト、又は阻害剤のハイスループットスクリーニングに適用する場合に当てはまる。第１に、ペプチドの放射性標識を、キナーゼと［³²Ｐ］ＡＴＰを用いて酵素的に、又は[¹²⁵Ｉ]Bolton-Hunter試薬を用いて化学的に行う。両方の場合に、アイソトープは短寿命であり、そのため材料を頻度高く調製する必要がある。酵素的リン酸化の場合には、適当なキナーゼも、スクリーニング目的のために十分な材料を生じさせるために十分な量利用できなけらばならない。第２に、プロトコルにおいて、グルタチオン−セファロースビーズを洗浄して、遊離ホスホペプチドから結合複合体を分離する必要がある。これは、結合リガンドの解離の危険のある非平衡方法である。特に解離速度が速い場合に当てはまる。このため、結果を誤らせる可能性がある。最後に、含まれる操作と遠心分離の数のために、プロトコルは手動で行うためには非常に面倒で、スループットを増加させるためのロボット自動化には容易には適合させられない。ＳＨ２ドメインに適用された、タンパク質とリガンドの相互作用の別の２種の測定方法は、表面プラスモン共鳴と等温滴定熱量測定を用いる生物特異的相互作用分析である（Felderら、Mol.Cell.Biol.，13,1449-1455(1993);Panayotouら、 Mol.Cell.Biol.，13,3567-3576(1993)；Payneら、Proc.Natl．Acad．Sci. U.S.A.，90,4902-4906(1993)；Morelockら、J.Med.Chem.，38,1309-18(1995)；L adburyら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,92,3199-3203(1995)；Lemmonら、Bi ochemistry，33,5070-5076(1994)）。これらの技術はＳＨ２ドメインの特別の融合パートナーを必要としないが、ハイスループットスクリーニングに適さない複雑な装置が必要である。発明の概要本発明は、融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって、被覆されたミクロシンチレーションプレートに、試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質（標的タンパク質、ペプチドリンカー及びＦＫ５０６−結合タンパク質）、及び放射標識リガンドを結合させ、試験化合物の非存在下の対照アッセイに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合のせいであるシンチレーションカウントを測定し、試験化合物がタッグ付けリガンドの結合に及ぼす効果を測定することを特徴とする該方法を包含する。融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの調製及び発現の方法も本発明の範囲内である。更に、本発明は、融合タンパク質を発現できる組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。更に、本発明は、組換え融合タンパク質の精製方法に関する。本発明は、単一又は多数のシグナル伝達ドメインへのリガンド結合、例えば、ＳＨ２ドメインへのホスホペプチド結合の機能性アッセイのためにミクロシンチレーションプレート技術を使用する即時性方法を提供する。本発明は、特別の放射化学合成を必要とせず、アゴニスト、アンタゴニスト、及び／又は阻害剤の高能力スクリーニングのためのロボット自動化に容易に適合できる。図面の簡単な説明図１．Ａ）ストレプトアビジンミクロシンチレーションプレート、ビオチニル化リガンド及び融合タンパク質（ＳＨ−２：ＦＫＢＰ）の結合。その結合は検出可能なシグナルを発する。Ｂ）試験化合物と融合タンパク質（ＳＨ−２：ＦＫＢＰ）の結合。その結合ではシグナル検出ができない。発明の詳細な説明本発明は、標的タンパク質に優先的に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明の一実施態様は、融合タンパク質に結合できる化合物のシクリーニング方法であって、ａ）試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質、及び放射性標識リガンドを混合すること；ｂ）被覆されたミクロシンチレーションプレートに混合液を添加すること；ｃ）混合液を約１〜約２４時間インキュベートすること；ｄ）シンチレーション計測を用い、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合のためであるプレート結合カウントを測定すること；及びｅ）試験化合物の非存在下での対照アッセイランに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合を決定すること：の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第２の実施態様は、融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法であって、ａ）ＦＫ−５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡの終止コドンを除去すること；ｂ）ＦＫ５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡ上に、ペプチドリンカーをコードする修飾ＤＮＡフラグメントを合成すること；ｃ）クローニング部位で発現ベクターを消化すること；ｄ）ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする修飾ＤＮＡフラグメントを消化された発現ベクターにクローニングし、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターを産生させること；及びｅ）標的タンパク質をコードするＤＮＡを、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターにクローニングすること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第３の実施態様は、発現ベクター中の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法であって、ａ）宿主細胞を融合タンパク質発現ベクターで形質転換すること；ｂ）宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導すること；ｃ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること；及びｄ）融合タンパク質を精製すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第４の実施態様は、単離されるＦＫＢＰ−ＳＨ２融合タンパク質の精製方法であって、ａ）固体支持体に固定化したアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造すること；ｂ）融合タンパク質を発現する細胞から凍結／融解抽出液を製造すること；及びｃ）アフィニティーマトリックスに抽出液を負荷し、非結合タンパク質を洗い流すこと；及びｄ）所望の融合タンパク質をフェニルホスフェートで溶出すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。 “融合タンパク質”という用語は、２個のタンパク質が“ペプチドリンカー” で分離されていることを特徴とする、“ＦＫ５０６結合タンパク質”（ＦＫＢＰ）に融合した“標的タンパク質”を指す。 “ペプチドリンカー”は、約１〜約２０個のアミノ酸を含む配列からなりうるが、プロテアーゼ切断部位のための配列を含んでも含まなくともよい。プロテアーゼ切断部位であるペプチドリンカーの例は、アミノ酸配列ＧＬＰＲＧＳ（配列番号７）によって表される。 “標的タンパク質”という用語は、規定されたリガンドを有するタンパク質を指す。標的タンパク質のこの定義内に、単一及び複数のシグナル伝達ドメイン、例えばＳｒｃホモロジー１（ＳＨ１）ドメイン、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン、Ｓｒｃホモロジー３ドメイン（ＳＨ３）、及びプレクストリンホモロジー（ＰＨ）ドメイン[Hanks & Hunter，FASEBJ.,9,576-596(1995)；Bolen，Cur r.Opin.Immunol.，7,306-311(1995)；Kuriyan & Cowburn，Curr.Opin.Struct.Bi ol.，3,828-837(1993)；Cohenら、Cell，80,237-248(1995)]など（これらに限定されない）が含まれる。“ＳＨ１ドメイン”という用語は、ＡＴＰを結合し、ペプチド基質とタンパク質基質のチロシンリン酸化を触媒する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“ＳＨ２ドメイン”という用語は、特定のペプチドコンテキスト中のリン酸化チロシン残基を認識するという共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“ＳＨ３ドメイン”という用語は、ポリプロリンII型ヘリックスを認識するという共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“ＰＨドメイン”という用語は、タンパク質−タンパク質相互作用とタンパク質−脂質相互作用の両方を媒介する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。本発明の方法で使用できるＳＨ２ドメインの例は、チロシンキナーゼであるＺＡＰ、ＳＹＫ及びＬＣＫ中に存在する単一及びタンデムＳＨ２ドメインなどがある(これらに限定されない)。ＤＮＡ配列は、GenBank，National Center for Biotechnology Information，Nati onal Library of Medicine,8600 Rockville Pike，Bethesda，MD20894から得た。配列の受託番号は、ヒトＺＡＰ（Ｌ０５１４８）、ヒトＳＹＫ（Ｌ２８８２４）及びヒトＬＣＫ（Ｘ１３５２９）である。ＺＡＰ、ＳＹＫ及びＬＣＫは以下に記載の配列で開示されている：ＺＡＰを含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡは配列番号１である；ＳＹＫを含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡは配列番号２である；ＬＣＫを含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡは配列番号３である；ＦＫＢＰ−ＺＡＰ：ＳＨ２融合タンパク質の配列は配列番号４である；ＦＫＢＰ−ＳＹＫ：ＳＨ２融合タンパク質の配列は配列番号５である；及び、ＦＫＢＰ−ＬＣＫ：ＳＨ２融合タンパク質の配列は配列番号６である。 “タッグ付きリガンド”という用語は、標的タンパク質のためのビオチニル化又はエピトープをタッグとしたリガンドを指す。 “放射性標識リガンド”という用語は、ＦＫＢＰに結合する［³Ｈ］−、［¹²⁵ Ｉ］−、［¹⁴Ｃ］−、［³⁵Ｓ］−、［³²Ｐ］−、又は［³³Ｐ］−標識リガンドを指す。本発明において有用な放射性標識リガンドの例は［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６である。 “被覆されたミクロシンチレーションプレート”という用語は、タッグ付きリガンドがビオチニル化されている場合にはストレプトアビジンで被覆されたミクロシンチレーションプレート、及びタッグ付きリガンドがエピトープタッグ付きである場合には抗−抗体被覆もしくはプロテインＡ被覆ミクロシンチレーションプレートに結合した抗エピトープ抗体を指す。本発明において有用な被覆されたミクロシンチレーションプレートの例は、ストレプトアビジン被覆、ヒツジ抗ウサギ被覆、及びヤギ抗マウス被覆Fl ashPlate Plus（DuPont-NEN）である。プロテインＡ（これに限定されない）などの別の被覆を、当業者公知の方法で、非被覆FlashPlateに適用できる。 “対照アッセイ”という用語は、タッグ付きリガンド、融合タンパク質、放射性標識リガンド、及び被覆されたミクロシンチレーションプレートの存在下、但し試験化合物の非存在下で行うアッセイを指す。 “ＦＫ５０６結合タンパク質”という用語は、下記のＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ相同体を含みうる（それらに限定されない）[それらを開示する参考文献を引用する]。このリストで本発明の範囲を限定するものではない。哺乳動物細菌菌類種々の宿主細胞が本発明で使用できるが、それらには細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞がある（これらに限定されない）。発現ベクターとは、本明細書で、適当な宿主中で、遺伝子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。このようなベクターを用い、細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの種々の宿主細胞で遺伝子を発現できる。特別に設計したベクターでは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞などの宿主間のＤＮＡシャトルが可能となる。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞での自律的複製の複製起点；選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数能、及び活性プロモーターを含みうる。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベクターとは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスでありうる（これらに限定されない）。ＦＫＢＰ融合タンパク質発現に適した市販のベクターには、ｐＢＲ３２２（Promega）、ｐＧＥＸ（Amersham）、ｐＴ７（USB）、ｐＥＴ（Novagen）、ｐＩＢＩ（IBI）、ｐＰｒｏＥＸ−１（Gibco/BRL）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Stratagene）、ｐＴＺ１８ＲとｐＴＺ１９Ｒ（USB）、ｐＳＥ４２０（Invitrogen）、ｐＶＬ１３９２（Invitrogen）、ｐＢｌｕｅＢａｃ（Invitrogen）、ｐＢＡｃＰＡＫ（ Clontech）、ｐＨＩＬ（Invitrogen）、ｐＹＥＳ（Invitrogen）、ｐＣＤＮＡ（ Invitrogen）、ｐＲＥＰ（Invitrogen）などがある（これらには限定されない）。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合、及びエレクトロポレーションなど（これらに限定されない）の幾つかの技術のいずれかにより、宿主細胞に導入できる。ＦＫＢＰに融合した標的遺伝子を有する発現プラスミドを含有するE.coliを増殖させ、適切に誘導する。次に細胞をペレットにし、適切な緩衝液に再懸濁させる。ＦＫＢＰ−１２はそれを特別にペリプラズムに向かわせる配列を欠くけれども、ＦＫＢＰは主にそこに局在し、細胞ペレットの標準的な凍結／融解処理によって放出されうる。遠心分離後、得られた上清は８０％超の純度のＦＫＢＰ融合タンパク質を含み、所望ならば更に通常の方法で精製できる。あるいは、アッセイは純粋なタンパク質に依存せず、最初のペリプラズム調製物を直接使用できる。ＦＫＢＰと標的タンパク質間に位置するトロンビン部位を、融合タンパク質からＦＫＢＰを切断する手段として使用できる。このような切断された物質は次のアッセイでの適切な陰性対照でありうる。単一又は複数のＳＨ２ドメインを含む融合タンパク質は、固体支持体上に固定化されたアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造することによって精製できる。凍結／融解抽出液を、融合タンパク質を発現する細胞から調製し、アフィニティーマトリックスに負荷する。次に、所望の融合タンパク質をフェニルホスフェートで特異的に溶出する。標的タンパク質とそのリガンド間の複合体の形成をアッセイするために、適切な緩衝液中、放射性標識リガンドの存在下、タッグ付きリガンドをＦＫＢＰ融合タンパク質と混合する。複合体形成が起る適切なインキュベーション時間後、混合液を被覆されたミクロシンチレーションプレートに移し、タッグ付きリガンドと結合融合タンパク質を捕捉させる。プレートを密封し、捕捉が完全に行われるのに十分な時間インキュベートし、次にマルチウエルシンチレーションカウンターで計測する。最初のインキュベーションを行い、次いで単一又は複数の試験化合物の存在下、ミクロシンチレーションプレートでの捕捉工程を行い、試験化合物が融合タンパク質へのタッグ付きリガンドの結合に効果を有するかどうかを測定することによって、アゴニスト／アンタゴニスト／阻害剤のスクリーニングを行う。この原理を図１に示す。以下の実施例によって更に本発明を理解することができるが、実施例は本発明を限定するものではない。実施例１ＦＫＢＰ融合体クローニングベクター製造方法種々の宿主細胞での遺伝子の修飾と発現の一般的技術は、Ausubel,F.M.，Bren t,R.，Kingston,R.E.，Moore,D.D.，Seidman,J.G.，Smith,J.A．及びStruhl,K． Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，New York，New York，1989)に記載されている。終止コドン（ＴＧＡ）の変りにグリシンコドン（ＧＧＴ）、続いてトロンビン部位（Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）とＢａｍＨＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）をコードする配列を含む３′−改変ＦＫＢＰフラグメントの配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。ＰＣＲ反応液は、以下のプライマー、即ち５′−ＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ−３′（配列番号８）と５′−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＧ−３′（配列番号９）及び鋳型としてヒトＦＫＢＰ−１２を含むプラスミドを含んでいた。得られた３６７塩基対増幅産物をベクターｐＣＲII(Invitrogen)に連結し、連結混合物でコンピテント Escherichia coli細胞を形質転換した。挿入物を含むクローンを隣接ベクタープライマーを用いるＰＣＲで同定した。ジデオキシＤＮＡ配列決定により、一つのポジティブ単鎖のヌクレオチドを確認した。改変した３３８塩基対のＦＫＢＰフラグメントを、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩを用いｐＣＲIIプラスミドから切出し、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ消化ｐＥＴ９ｄ(Novagen)プラスミドに連結した。コンピテントE.coliを連結混合物で形質転換し、挿入体を含むコロニーを、隣接ベクター配列をコードするプライマーを用いるＰＣＲで同定した。ＦＫＢＰ融合クローニングベクターをｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔと命名する。実施例２ＦＫ−ＺＡＰ融合発現ベクターの製造方法読取り枠が融合ベクター中のＦＫＢＰの読取り枠で保存されるよう、に、５′ −末端のＢａｍＨＩ部位を含ませるように、ＺＡＰ−７０のタンデムＳＨ２ドメインをコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより製造した。３′−末端で、フラグメントはまた、終止コドン、続いてＢａｍＨＩ部位を含んでいた。ＰＣＲ反応液はＭｏｌｔ−４ｃＤＮＡ(Clontech)と以下のプライマー、即ち５ ′−ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴ−３′（配列番号１０）と５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＴＧＣＴ−３′（配列番号１１）を含んでいた。フラグメントを、適切なベクターにクローンし、配列決定し、ＢａｍＨＩで消化し、ＳＨ２ドメインを含む挿入体を、ＢａｍＨＩ処理ｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔに連結し、E.coliを形質転換した。正しい方向で挿入体を含むクローンをＰＣＲ又は制限酵素分析で同定した。プラスミドＤＮＡを調製し、それを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。実施例３ＦＫ−ＳＹＫ融合発現ベクターの製造方法ＦＫＢＰに融合したＳＹＫのタンデムＳＨ２ドメイン用発現ベクターを、実施例２のように、但しＰＣＲ反応液はＲａｊｉ細胞ｃＤＮＡ(Clontech)と以下のプライマー、即ち５′−ＣＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＡ−３′（配列番号１２）と５′−ＧＡＣＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴ−３′（配列番号１３）を含んでいたことを除いて製造した。実施例４ＦＫ−ＬＣＫ融合発現ベクターの製造方法ＦＫＢＰに融合したＬＣＫのＳＨ２ドメイン用発現ベクターを、実施例２のように、但し、ＰＣＲ反応液はＭｏｌｔ−４ｃＤＮＡ(Clontech)と以下のプライマー、即ち５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＣＴ−３′（配列番号１４）と５′−ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＧＴＧＣＡ−３′（配列番号１５）を含んでいたことを除いて製造した。実施例５ＦＫ−ＺＡＰ工程Ａ：ＦＫ−ＺＡＰの発現方法ｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔ／ＺＡＰＳＨ２プラスミドを含むE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を、６００ｎｍで測定した光学密度が約０．５〜１．０になるまで、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むLuria-Bertani（ＬＢ）培地で、約３７℃で増殖させた。ＦＫ−ＺＡＰ融合タンパク質の発現を、０．１ｍＭイソプロピルベータ−チオガラクトピラノシドで誘導し、更に３〜５時間、約３０℃で細胞を増殖させた。４４００×ｇで約１０分、約４℃で細胞をペレットにし、細胞を、各１μｇ／ｍＬのアプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチン及びべスタチンを含む１００ｍＭトリスｐＨ８．０を用いて最初の培養液容量の２％に再懸濁した。再懸濁したペレットを、更なる精製まで、約−２０℃で凍結した。工程Ｂ：ＦＫ−ＺＡＰの精製方法アガロースに固定化したアビジンを、ヒトＴ細胞レセプターのζ１ＩＴＡＭ配列由来の過剰のビオチニル化ホスホペプチド、即ちビオチニル−ＧＳＮＱＬｐＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥｐＹＤＶＬＤＫ（配列番号１６）と混合し、非結合ペプチドを洗い流すことによって、ＦＫ−ＺＡＰの精製用アフィニティーマトリックスを製造した。ＦＫ−ＺＡＰを含む凍結細胞を温水で融解させ、ドライアイス上で約２５分間再凍結させ、次に再度融解させた。０．１％オクチルグリコシド、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び５００ｍＭＮａＣｌの添加後、抽出液を３５，０００×ｇで約３０分間遠心分離した。上清を約４℃ でホスホペプチドアフィニティーカラムにかけ、１ｍＭＤＴＴと０．１％オクチルグリコシドを含むリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。ＦＫ−ＺＡＰを約３７℃で同緩衝液中の２００ｍＭフェニルホスフェートで溶出した。タンパク質プールを濃縮し、フェニルホスフェートを脱塩カラムで除去した。精製ＦＫ−ＺＡＰを、１０ｍＭＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌ／１ｍＭＤＴＴ／０．１ｍＭＥＤＴＡ／１０％グリセロール中、約−３０℃で保存した。実施例６ＦＫ−ＳＹＫｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔ／ＳＹＫＳＨ２プラスミドを含むE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例５に記載のように、増殖、誘導、回収した。ＦＫ−ＳＹＫを、実施例５に記載の同一のアフィニティーマトリックスと方法を用いて精製した。実施例７ＦＫ−ＬＣＫｐＥＴ９ｄＦＫＢＰｔ／ＬＣＫＳＨ２プラスミドを含むE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例５に記載のように、増殖、誘導、回収した。ＦＫ−ＬＣＫの精製用アフィニティーマトリックスは、アガロースに固定化したアビジンを過剰のビオチニル−ＥＰＱｐＹＥＥＩＰＩＹＬ（配列番号１７）と混合し、非結合ペプチドを洗い流して製造した。精製の残りの方法は実施例５と同じであった。実施例８ＦＫ−ＺＡＰへのホスホペプチド結合のアッセイ２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＤＴＴ、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０、ｐＨ７．０からなる緩衝液中、外界温度でアッセイを行った。緩衝液と種々の量のビオチニル−ホスホペプチドの混合液３００μＬを、ＦＫ−ＺＡＰタンパク質２５μＬと［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６(DuPont NEN)５０μＬと、微量遠心チューブ中で混合した。次に、ストレプトアビジンで被覆されたFlashPlate Plus(Du Pont-NEN)のウエルに各アッセイの１５０μＬ部分を移し、緩衝液を更に５０μ Ｌ加えた。アッセイ成分の最終濃度は、０〜５０ｎＭビオチニル−ＧＳＮＱＬｐＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥｐＹＤＶＬＤＫ（配列番号１６）、１００ｎＭＦＫ −ＺＡＰ融合タンパク質、２５ｎＭ［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６であった。プレートを密封し、２０時間インキュベートした。プレート結合放射活性を、パッカードトップカウントミクロプレートシンチレーション計測器で、種々の時点で計測した。実施例９ＦＫ−ＺＡＰのアンタゴニストのスクリーニング方法２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＤＴＴ、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０、ｐＨ７．０からなる緩衝液中、外界温度でアッセイを行う。試験化合物のＤＭＳＯ溶液１０μＬとビオチニル−ホスホペプチド保存溶液１２０μＬを標準的９６ウエルプレートのウエルに分配する。次に、ＦＫ−ＺＡＰタンパク質と［³Ｈ］− ジヒドロＦＫ５０６(DuPont NEN)の混合液２０μＬを各試験ウエルに加える。次に、アッセイ溶液を、ストレプトアビジン−被覆FlashPlate(DuPont NEN)のウエルに移す。アッセイ成分の最終濃度は、２５ｎＭビオチニル−ＧＳＮＱＬｐＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥｐＹＤＶＬＤＫ（配列番号１６）、２５ｎＭＦＫ−ＺＡＰ融合タンパク質、１０ｎＭ［³Ｈ］−ジヒドロＦＫ５０６、５％ＤＭＳＯである。プレートを密封し、１〜８時間インキュベートする。次に、ビーズ結合放射活性をパッカードトップカウントミクロプレートシンチレーション計測器で測定する。実施例１０ＦＫ−ＳＹＫのアンタゴニストのスクリーニング方法アッセイを、ＦＫ−ＺＡＰの変りにＦＫ−ＳＹＫを用いることを除いて実施例９に記載のように行う。実施例１１ＦＫ−ＬＣＫのアンタゴニストのスクリーニング方法アッセイを、ＦＫ−ＺＡＰの変りにＦＫ−ＬＣＫを用い、タッグ付きリガンドが２５ｎＭビオチニル−ＥＰＱｐＹＥＥＩＰＩＹＬ（配列番号１７）であることを除いて実施例９に記載のように行う。請求の範囲１．融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって、ａ）試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質、及び放射性標識リガンドを混合すること；ｂ）被覆されたミクロシンチレーションプレートに混合液を添加すること；ｃ）混合液を約１〜約２４時間インキュベートすること；ｄ）シンチレーション計測を用い、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合のためであるプレート結合カウントを測定すること；及びｅ）試験化合物の非存在下での対照アッセイランに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合を決定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。２．タッグ付けリガンドがビオチニル化リガンド又はエピトープ付けリガンドであることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。３．被覆されたミクロシンチレーションプレートが、ストレプトアビジン被覆又は抗−抗体もしくはプロテインＡ被覆であることを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。４．放射性標識リガンドが、［³Ｈ］−、[¹²⁵Ｉ]−、[¹⁴Ｃ]−、[³⁵Ｓ]−、[³ ² Ｐ]−、又は[³³Ｐ]−標識ＦＫ５０６アナログからなることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。５．融合タンパク質が、標的タンパク質にペプチドリンカーを介し結合したＦＫ５０６結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。６．標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。７．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＳＨ１、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＰＨドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。８．標的タンパク質が単一又は複数のＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。９．放射性標識リガンドが[³Ｈ]−ジヒドロＦＫ５０６であることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１０．ＦＫ５０６結合タンパク質が１２ｋＤａのヒトＦＫ５０６結合タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１１．標的タンパク質が、ＺＡＰ：ＳＨ２、ＳＹＫ：ＳＨ２及びＬＣＫ：ＳＨ２からなる群から選択される単一又は複数のＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項１０に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１２．標的タンパク質がＳＨ２ドメインであるＺＡＰ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１３．標的タンパク質がＳＨ２ドメインであるＳＹＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１４．標的タンパク質がＳＨ２ドメインであるＬＣＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１５．融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法であって、ａ）ＦＫ５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡの終止コドンを除去すること；ｂ）ＦＫ５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡ上に、ペプチドリンカーをコードする修飾ＤＮＡフラグメントを合成すること；ｃ）クローニング部位で発現ベクターを消化すること；ｄ）ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする修飾ＤＮＡフラグメントを消化された発現ベクターにクローニングし、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターを産生させること；及びｅ）標的タンパク質をコードするＤＮＡを、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターにクローニングすること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。１６．標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインであることを特徴とする、請求項１５に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。１７．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＳＨ１、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＰＨドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。１８．単一又は複数のシグナル伝達ドメインがＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項１７に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。１９．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＺＡＰ：ＳＨ２、ＳＹＫ：ＳＨ２及びＬＣＫ：ＳＨ２からなる群から選択されるＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項１８に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２０．ＦＫ５０６結合タンパク質が１２ｋＤａのＦＫ５０６結合タンパク質であることを特徴とする、請求項１９に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２１．ペプチドリンカーがアミノ酸配列ＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号７）を有することを特徴とする、請求項２０に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２２．標的タンパク質がＺＡＰ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項２１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２３．標的タンパク質がＳＹＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項２１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２４．標的タンパク質がＬＣＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項２１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２５．配列番号１である配列を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ。２６．配列番号２である配列を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ。２７．配列番号３である配列を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ。２８．配列番号４である配列を含むＦＫＢＰ−ＺＡＰ：ＳＨ２融合タンパク質。２９．配列番号５である配列を含むＦＫＢＰ−ＳＹＫ：ＳＨ２融合タンパク質。３０．配列番号６である配列を含むＦＫＢＰ−ＬＣＫ：ＳＨ２融合タンパク質。３１．発現ベクター中の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法であって、ａ）宿主細胞を融合タンパク質発現ベクターで形質転換すること；ｂ）宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導すること；ｃ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること；及びｄ）融合タンパク質を精製すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。３２．標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインであることを特徴とする、請求項３１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３３．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＳＨ１、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＰＨドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３２に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３４．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが単一又は複数のＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項３３に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３５．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＺＡＰ：ＳＨ２、ＳＹＫ：ＳＨ２及びＬＣＫ：ＳＨ２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３４に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３６．ＦＫ５０６結合タンパク質がヒト１２ｋＤａのＦＫ５０６結合タンパク質であることを特徴とする、請求項３５に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３７．宿主細胞が細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、又は動物細胞山来であることを特徴とする、請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３８．宿主細胞が、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、及びＪＭ１０９（ＤＥ３）からなる群から選択されるE.coli株であることを特徴とする、請求項３７に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３９．単一又は複数のＳＨ２ドメインがＺＡＰ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項３８に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４０．単一又は複数のＳＨ２ドメインがＳＹＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項３８に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４１．単一又は複数のＳＨ２ドメインがＬＣＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項３８に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４２．単離されるＦＫＢＰ−ＳＨ２融合タンパク質の精製方法であって、ａ）固体支持体に固定化したアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造すること；ｂ）融合タンパク質を発現する細胞から凍結／融解抽出液を製造すること；及びｃ）アフィニティーマトリックスに抽出液を負荷し、非結合タンパク質を洗い流すこと；及びｄ）所望の融合タンパク質をフェニルホスフェートで溶出すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。４３．ＤＮＡが、ＦＫＢＰ−ＺＡＰ：ＳＨ２融合タンパク質をコードし、配列番号１であるＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクター。４４．ＤＮＡが、ＦＫＢＰ−ＳＹＫ：ＳＨ２融合タンパク質をコードし、配列番号２であるＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクター。４５．ＤＮＡが、ＦＫＢＰ−ＬＣＫ：ＳＨ２融合タンパク質をコードし、配列番号３であるＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクター。４６．組換え宿主細胞が、E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）、E.coliＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、及びE.coli ＪＭ１０９（ＤＥ３）からなる群から選択されることを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクターを含む組換え宿主細胞。４７．組換え宿主細胞が、E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項４６に記載の、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクターを含む組換え宿主細胞。【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者サロウ，スコツト・ピーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ウイスニユウスキイ，ダグラスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって、ａ）試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質、及び放射性標識リガンドを混合すること；ｂ）被覆されたミクロシンチレーションプレートに混合液を添加すること；ｃ）混合液を約１〜約２４時間インキュベートすること；ｄ）シンチレーション計測を用い、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合のためであるプレート結合カウントを測定すること；及びｅ）試験化合物の非存在下での対照アッセイランに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合を決定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。２．タッグ付けリガンドがビオチニル化リガンド又はエピトープ付けリガンドであることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。３．被覆されたミクロシンチレーションプレートが、ストレプトアビジン被覆又は抗−抗体もしくはプロテインＡ被覆であることを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。４．放射性標識リガンドが、［³Ｈ］−、[¹²⁵Ｉ]−、[¹⁴Ｃ]−、[³⁵Ｓ]−、[³ ² Ｐ]−、又は[³³Ｐ]−標識ＦＫ５０６アナログからなることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。５．融合タンパク質が、標的タンパク質にペプチドリンカーを介し結合したＦＫ５０６結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。６．標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。７．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＳＨ１、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＰＨドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。８．標的タンパク質が単一又は複数のＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。９．放射性標識リガンドが[³Ｈ]−ジヒドロＦＫ５０６であることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１０．ＦＫ５０６結合タンパク質が１２ｋＤａのヒトＦＫ５０６結合タンパク質であることを特徴とする、請求項９に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１１．標的タンパク質が、ＺＡＰ：ＳＨ２、ＳＹＫ：ＳＨ２及びＬＣＫ：ＳＨ２からなる群から選択される単一又は複数のＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項１０に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１２．標的タンパク質がＳＨ２ドメインであるＺＡＰ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１３．標的タンパク質がＳＨ２ドメインであるＳＹＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１４．標的タンパク質がＳＨ２ドメインであるＬＣＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。１５．融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法であって、ａ）ＦＫ５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡの終止コドンを除去すること；ｂ）ＦＫ５０６結合タンパク質をコードするＤＮＡ上に、ペプチドリンカーをコードする修飾ＤＮＡフラグメントを合成すること：ｃ）クローニング部位で発現ベクターを消化すること；ｄ）ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする修飾ＤＮＡフラグメントを消化された発現ベクターにクローニングし、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターを産生させること；及びｅ）標的タンパク質をコードするＤＮＡを、ペプチドリンカーを有するＦＫ５０６結合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターにクローニングすること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。１６．標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインであることを特徴とする、請求項１５に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。１７．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＳＨ１、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＰＨドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。１８．単一又は複数のシグナル伝達ドメインがＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項１７に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。１９．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＺＡＰ：ＳＨ２、ＳＹＫ：ＳＨ２及びＬＣＫ：ＳＨ２からなる群から選択されるＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項１８に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２０．ＦＫ５０６結合タンパク質が１２ｋＤａのＦＫ５０６結合タンパク質であることを特徴とする、請求項１９に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２１．ペプチドリンカーがアミノ酸配列ＧＬＶＰＲＧＳを有することを特徴とする、請求項２０に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２２．発現ベクターが、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＸ、ｐＴ７、ｐＥＴ、ｐＩＢＩ、ｐＰｒｏＥＸ−１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII、ｐＴＺ１８ＲとｐＴＺ１９Ｒ、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ、ｐＢＡｃＰＡＫ、ｐＨＩＬ、ｐＹＥＳ２、ｐＣＤＮＡ、及びｐＲＥＰからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２３．発現ベクターがＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとしたｐＥＴ発現ベクターであることを特徴とする、請求項２２に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２４．標的タンパク質がＺＡＰ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項２３に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２５．標的タンパク質がＳＹＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項２３に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２６．標的タンパク質がＬＣＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項２３に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターの製造方法。２７．配列番号１である配列を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ。２８．配列番号２である配列を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ。２９．配列番号３である配列を含む融合タンパク質をコードする単離ＤＮＡ。３０．配列番号４である配列を含むＦＫＢＰ−ＺＡＰ：ＳＨ２融合タンパク質。３１．配列番号５である配列を含むＦＫＢＰ−ＳＹＫ：ＳＨ２融合タンパク質。３２．配列番号６である配列を含むＦＫＢＰ−ＬＣＫ：ＳＨ２融合タンパク質。３３．発現ベクター中の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法であって、ａ）宿主細胞を融合タンパク質発現ベクターで形質転換すること；ｂ）宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導すること；ｃ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること；及びｄ）融合タンパク質を精製すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。３４．標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインであることを特徴とする、請求項３３に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３５．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＳＨ１、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＰＨドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３４に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３６．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが単一又は複数のＳＨ２ドメインであることを特徴とする、請求項３５に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３７．単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、ＺＡＰ：ＳＨ２、ＳＹＫ：ＳＨ２及びＬＣＫ：ＳＨ２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３８．ＦＫ５０６結合タンパク質がヒト１２ｋＤａのＦＫ５０６結合タンパク質であることを特徴とする、請求項３７に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。３９．宿主細胞が細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、又は動物細胞由来であることを特徴とする、請求項３８に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４０．発現ベクターがＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクターであることを特徴とする、請求項３９に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４１．宿主細胞が、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、及びＪＭ１０９（ＤＥ３）からなる群から選択される E.coli 株であることを特徴とする、請求項４０に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４２．単一又は複数のＳＨ２ドメインがＺＡＰ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項４１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４３．単一又は複数のＳＨ２ドメインがＳＹＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項４１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４４．単一又は複数のＳＨ２ドメインがＬＣＫ：ＳＨ２であることを特徴とする、請求項４１に記載の融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡの発現方法。４５．単離されるＦＫＢＰ−ＳＨ２融合タンパク質の精製方法であって、ａ）固体支持体に固定化したアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造すること：ｂ）融合タンパク質を発現する細胞から凍結／融解抽出液を製造すること；及びｃ）アフィニティーマトリックスに抽出液を負荷し、非結合タンパク質を洗い流すこと；及びｄ）所望の融合タンパク質をフェニルホスフェートで溶出すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。４６．ＤＮＡが、ＦＫＢＰ−ＺＡＰ：ＳＨ２融合タンパク質をコードし、配列番号１であるＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクター。４７．ＤＮＡが、ＦＫＢＰ−ＳＹＫ：ＳＨ２融合タンパク質をコードし、配列番号２であるＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクター。４８．ＤＮＡが、ＦＫＢＰ−ＬＣＫ：ＳＨ２融合タンパク質をコードし、配列番号３であるＤＮＡ配列を有することを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクター。４９．組換え宿主細胞が、E.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）、E.coli ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、及びE.coli ＪＭ１０９（ＤＥ３）からなる群から選択されることを特徴とする、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクターを含む組換え宿主細胞。５０．組換え宿主細胞が、E.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする、請求項４９に記載の、組換えＦＫＢＰ−ＳＨ２ドメインＴ７ＲＮＡポリメラーゼをベースとした発現ベクターを含む組換え宿主細胞。