JP2000501171A - 融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ - Google Patents
融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイInfo
- Publication number
- JP2000501171A JP2000501171A JP9512067A JP51206797A JP2000501171A JP 2000501171 A JP2000501171 A JP 2000501171A JP 9512067 A JP9512067 A JP 9512067A JP 51206797 A JP51206797 A JP 51206797A JP 2000501171 A JP2000501171 A JP 2000501171A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- binding
- fusion protein
- screening
- ligand
- compound capable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9493—Immunosupressants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Abstract
(57)【要約】
本明細書は、標的タンパク質とFK506結合タンパク質からなる融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニングのためのハイスループットアッセイを記載する。
Description
【発明の詳細な説明】
融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ 発明の背景
Srcホモロジー2(SH2)ドメインは、特定のペプチドコンテキストの中
でリン酸化チロシン残基の認識という共通の性質を有する相同性タンパク質ドメ
インの一ファミリーである。該ドメインは、グルタチオン−S−トランスフェラ
ーゼ(GST)との融合タンパク質として E.coli で定型的に発現された。通常
、このために、高レベルの発現とグルタチオン−セファロースでの簡単なアフィ
ニティー精製が可能となる。続いてリガンド結合は、GST/SH2を放射性標
識ホスホペプチドとインキュベートし、グルタチオン−セファロースとの複合体
を沈殿させ、ビーズを洗浄し、次にビーズをカウントして結合放射活性を測定す
ることによりアッセイする[Isakovら、J.Exp.Med.,181,375-380(1995);Piccio
ne ら、 Biochemistry,32,3197-3202(1993);Huyer ら、 Biochemistry,34,10
40-1049(1995)]。
この方法には幾つかの欠点がある。特に、薬剤開発のための新規リード化合物と
してアゴニスト、アンタゴニスト、又は阻害剤のハイスループットスクリーニン
グに適用する場合に当ては
まる。第1に、ぺプチドの放射性標識を、キナーゼと[32P]ATPを用いて酵
素的に、又は[125I]Bolton-Hunter試薬を用いて化学的に行う。両方の場合に
、アイソトープは短寿命であり、そのため材料を頻度高く調製する必要がある。
酵素的リン酸化の場合には、適当なキナーゼも、スクリーニング目的のために十
分な材料を生じさせるために十分な量利用できなけらばならない。第2に、プロ
トコルにおいて、グルタチオンーセファロースビーズを洗浄して、遊離ホスホペ
プチドから結合複合体を分離する必要がある。これは、結合リガンドの解離の危
険のある非平衡方法である。特に解離速度が速い場合に当てはまる。このため、
結果を誤らせる可能性がある。最後に、含まれる操作と遠心分離の数のために、
プロトコルは手動で行うためには非常に面倒で、スループットを増加させるため
のロボット自動化には容易には適合させられない。
SH2ドメインに適用された、タンパク質とリガンドの相互作用の別の2種の
測定方法は、表面プラスモン共鳴と等温滴定熱量測定を用いる生物特異的相互作
用分析である(Fe1derら、Mol.Cell.Biol., 13,1449-1455(1993);Panayotouら、
Mol.Cel1.Biol.,13,3567-3576(1993);Payne ら、Proc.Natl.Acad. Sci.
U.S.A.,90,4902-4906(1993);Morelock ら、J.Med.Chem.,38,1309-18 (1995)
;Ladbury ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,92,3199-3203(1995);Lemmon
ら、Biochemistry,33,5070-5076(1994))。これらの技術はSH2ドメインの特
別の融合パートナーを必要としないが、ハイスループットスクリ-ニングに適さ
ない複雑な装置が必要である。発明の概要
本発明は、融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって
、試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質(標的タンパク質、ぺプチ
ドリンカー及びFK506−結合タンパク質)、放射標識リガンド、及び被覆さ
れたシンチレーション近接アッセイ(SPA)ビーズを結合させ、試験化合物の
非存在下の対照アッセイに比較して、試験化合物の存在下、融合タンパク質への
タッグ付けリガンドの結合のせいであるシンチレーションカウントを測定し、試
験化合物がタッグ付けリガンドの結合に及ぼす効果を測定することを特徴とする
該方法を包含する。本発明は、単一又は複数のシグナル伝達ドメインへのリガン
ド結合、例えば、SH2ドメインへのホスホペプチド結合の機能性アッセイのた
めのSPA技術を使用する
即時性方法を提供する。本発明は、特別の放射化学合成を必要とせず、アゴニス
ト、アンタゴニスト、及び/又は阻害剤の高能力スクリーニングのためのロボッ
ト自動化に容易に適合できる。図面の簡単な説明
図1.
A)ストレプトアビジンSPAビーズ、ビオチニル化リガンド及び融合タンパク
質(SH−2:FKBP)の結合。その結合は検出可能なシグナルを発する。
B)試験化合物と融合タンパク質(SH−2:FKBP)の結合。その結合では
シグナル検出ができない。発明の詳細な説明
本発明は、標的タンパク質に優先的に結合する化合物のスクリーニング方法に
関する。
本発明の一実施態様は、
融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって、
a)試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質、放射性標識リガンド、
及び被覆されたシンチレーション近接アッセ
イ(SPA)ビーズを混合すること;
b)混合液を約1〜約24時間インキュベートすること;
c)シンチレーション計測を用い、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタ
ッグ付けリガンドの結合のためであるSPAビーズ結合カウントを測定すること
;及び
d)試験化合物の非存在下での対照アッセイランに比較して、試験化合物の存在
下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合を決定すること;
の各工程を含むことを特徴とする該方法である。
“融合タンパク質”という用語は、2個のタンパク質が“ペプチドリンカー”
で分離されていることを特徴とする、“FK506結合タンパク質”(FKBP
)に融合した“標的タンパク質”を指す。
“ペプチドリンカー”は、約1〜約20個のアミノ酸を含む配列からなりうる
が、プロテアーゼ切断部位のための配列を含んでも含まなくともよい。プロテア
ーゼ切断部位であるペプチドリンカーの例は、アミノ酸配列GLPRGSによっ
て表される。
“標的タンパク質”という用語は、規定されたリガンドを有
するタンパク質を指す。標的タンパク質のこの定義内に、単一及び複数のシグナ
ル伝達ドメイン、例えばSrcホモロジー1(SH1)ドメイン、Srcホモロ
ジー2(SH2)ドメイン、Srcホモロジー3ドメイン(SH3)、及びプレ
クストリンホモロジー(PH)ドメイン[Hanks & Hunter,FASEBJ.,9,576-596(
1995) ; Bolen,Curr.Opin.Immunol.,7,306-311(1995);Kuriyan & Cowburn,
Curr.Opin.Struct.Biol.,3,828-837 (1993);Cohenら、Cell,80,237-248(1995
)]など(これらに限定されない)が含まれる。“SH1ドメイン”という用語
は、ATPを結合し、ペプチド基質とタンパク質基質のチロシンリン酸化を触媒
する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“SH2ドメイン”とい
う用語は、特定のペプチドコンテキスト中のリン酸化チロシン残基を認識すると
いう共通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“S
H3ドメイン”という用語は、ポリプロリンII型ヘリックスを認識するという共
通の性質を有する相同性タンパク質ドメインの一ファミリーを指す。“PHドメ
イン”という用語は、タンパク質−タンパク質相互作用とタンパク質−脂質相互
作用の両方を媒介する相同性タンパク質ドメインの一フ
ァミリーを指す。本発明の方法で使用できるSH2ドメインの例は、チロシンキ
ナーゼであるZAP、SYK及びLCK中に存在する単一及びタンデムSH2ド
メインなどがある(これらに限定されない)。DNA配列は、GenBank, Nationa
l Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine,860
0 Rockville Pike,Bethesda,MD20894 から得た。配列の受託番号は、ヒトZA
P(L05148)、ヒトSYK(L28824)及びヒトLCK(X1352
9)である。
“タッグ付きリガンド”という用語は、標的タンパク質のためのビオチニル化
又はエピトープをタッグとしたリガンドを指す。
“放射性標識リガンド”という用語は、FKBPに結合する[3H]一又は[1 25
I]−標識リガンドを指す。本発明において有用な放射性標識リガンドの例は
[3H]−ジヒドロFK506である。
“被覆されたシンチレーション近接アッセイビーズ”(SPAビーズ)という
用語は、タッグ付きリガンドがビオチニル化されている場合にはストレプトアビ
ジンで被覆されたシンチレーション近接アッセイビーズ、及びタッグ付きリガン
ドがエピト
ープタッグ付きである場合には抗−抗体被覆もしくはプロテインA被覆シンチレ
ーション近接アッセイビーズに結合した抗エピトープ抗体を指す。
“対照アッセイ”という用語は、タッグ付きリガンド、融合タンパク質、放射
性標識リガンド、及び被覆されたミクロシンチレーションプレートの存在下、但
し試験化合物の非存在下で行うアッセイを指す。
“FK506結合タンパク質”という用語は、下記のFKBP及びFKBP相
同体を含みうる(それらに限定されない)[それらを開示する参考文献を引用す
る]。このリストで本発明の範囲を限定するものではない。哺乳動物 細菌 菌類 種々の宿主細胞が本発明で使用できるが、それらには細菌、酵母、藍藻、植物
細胞、昆虫細胞及び動物細胞がある(これらに限定されない)。
発現ベクターとは、本明細書で、適当な宿主中で、遺伝子のクローン化コピー
の転写及びそれらのmRNAの翻訳に必要なDNA配列と定義される。このよう
なベクターを用い、細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの
種々の宿
主細胞で遺伝子を発現できる。
特別に設計したベクターでは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞などの宿主間の
DNAシャトルが可能となる。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞での自
律的複製の複製起点;選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピ
ー数能、及び活性プロモーターを含みうる。プロモーターとは、RNAポリメラ
ーゼをDNAに結合させ、RNA合成を開始させるDNA配列と定義される。強
力なプロモーターとは、mRNAを高頻度で開始させるプロモーターである。発
現ベクターとは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設
計したプラスミド又はウイルスでありうる(これらに限定されない)。FKBP
融合タンパク質発現に適した市販のベクターには、pBR322(Promega)、
pGEX(Amersham)、pT7(USB)、pET(Novagen)、pIBI(IBI)
、pProEX−1(Gibco/BRL)、pBluescriptII(Stratagene)
、pTZ18RとpTZ19R(USB)、pSE420(Invitrogen)、pVL1
392(Invitrogen)、pBlueBac(Invitrogen)、pBAcPAK(Cl
ontech)、pHIL(Invitrogen)、pYES(Invitrogen)、pCDNA(In
vitrogen)、pREP(Invitrogen)
などがある(これらには限定されない)。
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融
合、及びエレクトロポレーションなど(これらに限定されない)の幾つかの技術
のいずれかにより、宿主細胞に導入できる。
FKBPに融合した標的遺伝子を有する発現プラスミドを含有するE.coliを増
殖させ、適切に誘導する。次に細胞をペレットにし、適切な緩衝液に再懸濁させ
る。FKBP−12はそれを特別にペリプラズムに向かわせる配列を欠くけれど
も、FKBPは主にそこに局在し、細胞ペレットの標準的な凍結/融解処理によ
って放出されうる。遠心分離後、得られた上清は80%超の純度のFKBP融合
タンパク質を含み、所望ならば更に通常の方法で精製できる。あるいは、アッセ
イは純粋なタンパク質に依存せず、最初のペリプラズム調製物を直接使用できる
。FKBPと標的タンパク質間に位置するトロンビン部位にを、融合タンパク質
からFKBPを切断する手段として使用できる。このような切断された物質は次
のアッセイでの適切な陰性対照でありうる。
単一又は複数のSH2ドメインを含む融合タンパク質は、固
体支持体上に固定化されたアビジン又はストレプトアビジンに結合したビオチニ
ル化ホスホペプチドからなるアフィニティーマトリックスを製造することによっ
て精製できる。凍結/融解抽出液を、融合タンパク質を発現する細胞から調製し
、アフィニティーマトリックスに負荷する。次に、所望の融合タンパク質をフェ
ニルホスフェートで特異的に溶出する。
標的タンパク質とそのリガンド間の複合体の形成をアッセイするために、適切
な緩衝液中、放射性標識リガンドの存在下、白色ミクロプレートのウエル中で、
タッグ付きリガンドをFKBP融合タンパク質と混合する。複合体形成が起る適
切なインキュベーション時間後、被覆されたシンチレーションSPAビーズを加
え、タッグ付きリガンドと結合融合タンパク質を捕捉させる。プレートを密封し
、捕捉が完全に行われるのに十分な時間インキュベートし、次にマルチウエルシ
ンチレーションカウンターで計測する。最初のインキュベーションを行い、次い
で単一又は複数の試験化合物の存在下、SPAビーズでの捕捉工程を行い、試験
化合物が融合タンパク質へのタッグ付きリガンドの結合に効果を有するかどうか
を測定することによって、アゴニスト/アンタゴニスト/阻害剤のスクリーニン
グを行う。
この原理を図1に示す。
以下の実施例によって更に本発明を理解することができるが、実施例は本発明
を限定するものではない。
実施例1 FKBP融合体クローニングベクター製造方法
種々の宿主細胞での遺伝子の修飾と発現の一般的技術は、Ausubel,F.M., Bre
nt,R., Kingston,R.E., Moore,D.D., Seidman,J.G.,Smith,J.A. 及び Struh
l,K. Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley & Sons,New York
,New York,1989)に記載されている。終止コドン(TGA)の変りにグリシン
コドン(GGT)、続いてトロンビン部位(Leu−Val−Pro−Arg)
とBamHI制限部位(GAATTC)をコードする配列を含む3′−改変FK
BPフラグメントの配列を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させた。P
CR反応液は、以下のプライマー、即ち5′−GATCGCCATGGGAGT
GCAGGTGGAAACCATCTCCCCA−3′と5′−TACGAAT
TCTGGCGTGGATCCACGCGGAACCAGACCTTCCAGT
TTTAG−3′及び鋳型としてヒトFKBP−12を含むプラスミドを含んで
いた。
得られた367塩基対増幅産物をベクターpCRII(Invitrogen)に連結し、連
結混合物でコンピテントEscherichia coli細胞を形質転換した。挿入物を含むク
ローンを隣接ベクタープライマーを用いるPCRで同定した。ジデオキシDNA
配列決定により、一つのポジティブ単鎖のヌクレオチドを確認した。改変した3
38塩基対のFKBPフラグメントを、NcoIとBamHIを用いpCRII
プラスミドから切出し、NcoIとBamHI消化pET9d(Novagen)プラ
スミドに連結した。コンピテント E.coli を連結混合物で形質転換し、挿入体を
含むコロニーを、隣接べクター配列をコードするプライマーを用いるPCRで同
定した。FKBP融合クローニングベクターをpET9dFKBPtと命名する
。
実施例2 FK−ZAP融合発現ベクターの製造方法
読取り枠が融合ベクター中のFKBPの読取り枠で保存されるように、5′−
末端のBamHI部位を含ませるように、ZAP−70のタンデムSH2ドメイ
ンをコードするDNAフラグメントをPCRにより製造した。3′−末端で、フ
ラグメントはまた、終止コドン、続いてBamHI部位を含んでいた。
PCR反応液はMolt−4 cDNA(Clontech)と以下のプライマー、即ち
5′−ATTAGGATCCATGCCAGATCCTGCAGCTCACCT
GCCCT−3′と5′−ATATGGATCCTTACCAGAGGCGTT
GCT−3′を含んでいた。フラグメントを、適切なベクターにクローンし、配
列決定し、BamHIで消化し、SH2ドメインを含む挿入体を、BamHI処
理pET9dFKBPtに連結し、E.coli を形質転換した。正しい方向で挿入
体を含むクローンをPCR又は制限酵素分析で同定した。プラスミドDNAを調
製し、それを用いてBL21(DE3)細胞を形質転換した。
実施例3 FK−SYK融合発現べクターの製造方法
FKBPに融合したSykのタンデムSH2ドメイン用発現ベクターを、実施
例2のように、但しPCR反応液はRaji細胞cDNA(Clontech)と以下の
プライマー、即ち5′−CAATAGGATCCATGGCCAGCAGCGG
CATGGCTGA−3′と5′−GACCTAGGATCCCTAATTAA
CATTTCCCTGTGTGCCGAT−3′を含んでいたことを除いて製造
した。実施例4 FK−LCK融合発現ベクターの製造方法
FKBPに融合したLckのSH2ドメイン用発現ベクターを、実施例2のよ
うに、但し、PCR反応液はMolt−4cDNA(Clontech)と以下のプライ
マー、即ち5′−ATATGGATCCATGGCGAACAGCCTGGAG
CCCGAACCCT−3′と5′−ATTAGGATCCTTAGGTCTG
GCAGGGGCGGCTCAACCGTGTGCA−3′を含んでいたことを
除いて製造した。
実施例5 FK−ZAP 工程A:FK−ZAPの発現方法
pET9dFKBPt/ZapSH2プラスミドを含むE.coliBL21(DE3
)を、600nmで測定した光学密度が約0.5〜1.0になるまで、50μg
/mL カナマイシンを含むLuria-Bertani(LB)培地で、約37℃で増殖さ
せた。FK−ZAP融合タンパク質の発現を、0.1mMイソプロピルベータ−
チオガラクトピラノシドで誘導し、更に3〜5時間、約30℃で細胞を増殖させ
た。4400×gで約10分、約4℃
で細胞をペレットにし、細胞を、各1μg/mLのアプロチニン、ペプスタチン
、ロイペプチン及びベスタチンを含む100mMトリスpH8.0を用いて最初
の培養液容量の2%に再懸濁した。再懸濁したペレットを、更なる精製まで、約
−20℃で凍結した。工程B:FK−ZAPの精製方法
アガロースに固定化したアビジンを、ヒトT細胞レセプターのζ1 ITAM
配列由来の過剰のビオチニル化ホスホペプチド、即ちビオチニル−GSNQLp
YNELNLGRREEpYDVLDKと混合し、非結合ペプチドを洗い流すこ
とによって、FK−ZAPの精製用アフィニティーマトリックスを製造した。F
K−ZAPを含む凍結細胞を温水で融解させ、ドライアイス上で約25分間再凍
結させ、次に再度融解させた。0.1%オクチルグリコシド、1mMジチオトレ
イトール(DTT)及び500mM NaClの添加後、抽出液を35,000
Xgで約30分間遠心分離した。上清を約4℃でホスホペプチドアフィニティー
カラムにかけ、1mM DTTと0.1%オクチルグリコシドを含むリン酸緩衝
化生理食塩水で洗浄した。FK−ZAPを約37℃で同緩衝液中の200mMフ
ェニルホスフ
ェートで溶出した。タンパク質プールを濃縮し、フェニルホスフェートを脱塩カ
ラムで除去した。精製FK−ZAPを、10mM HEPES/150mM N
aCl/1mM DTT/0.1mM EDTA/10%グリセロール中、約−
30℃で保存した。
実施例6 FK−SYK
pET9dFKBPt/SykSH2プラスミドを含むE.coliBL21(DE
3)を実施例5に記載のように、増殖、誘導、回収した。FK−SYKを、実施
例5に記載の同一のアフィニティーマトリックスと方法を用いて精製した。
実施例7 FK−LCK
pET9dFKBPt/LckSH2プラスミドを含む E.coliBL21(D
E3)を実施例5に記載のように、増殖、誘導、回収した。FK−LCKの精製
用アフィニティーマトリックスは、アガロースに固定化したアビジンを過剰のビ
オチニル−EPQpYEEIPIYLと混合し、非結合ペプチドを洗い流して製
造した。精製の残りの方法は実施例5と同じであった。実施例8 FK−ZAPのアンタゴニストのスクリーニング方法
25mM HEPES、10mM DTT、0.01%TWEEN−20、p
H7.0からなる緩衝液中、外界温度でアッセイを行った。試験化合物のDMS
O溶液10μLとビオチニル−ホスホペプチド保存溶液120μLを96ウエル
のPackard Optiplateのウエルに分配した。次に、FK−ZAP融合タンパク質
と3H−ジヒドロFK506の混合液20μLを各試験ウエルに加えた。最後に
、SPAビーズ4mg/mL懸濁液50μLを各ウエルに分配した。アッセイ成
分の最終濃度は、25nM ビオチニル−GSNQLpYNELNLGRREE
pYDVLDK、25nM FK−ZAP融合タンパク質、10nM[3H]−
ジヒドロFK506(DuPont NEN)、1.0mg/mLストレプトアビジン−S
PAビーズ(Amersham)、5%DMSOであった。プレートを密封し、1〜8時
間インキュベートした。次に、ビーズ結合放射活性をパッカードトップカウント
ミクロプレートシンチレーション計測器で測定した。実施例9 FK−SYKのアンタゴニストのスクリーニング方法
アッセイを、FK−ZAPの変りにFK−SYKを用いることを除いて実施例
8に記載のように行った。
実施例10 FK−LCKのアンタゴニストのスクリーニング方法
アッセイを、FK−ZAPの変りにFK−LCKを用い、タッグ付きリガンド
が25nMビオチニル−EPQpYEEIPIYLであることを除いて実施例8
に記載のように行った。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 33/566 G01N 33/566
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),CA,JP,US
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 融合タンパク質に結合できる化合物のスクリーニング方法であって、 a)試験化合物、タッグ付けリガンド、融合タンパク質、放射性標識リガンド、 及び被覆されたシンチレーション近接アッセイ(SPA)ビーズを混合すること ; b)混合液を約1〜約24時間インキュベートすること; c)シンチレーション計測を用い、試験化合物の存在下、融合タンパク質へのタ ッグ付けリガンドの結合のためであるSPAビーズ結合カウントを測定すること ;及び d)試験化合物の非存在下での対照アッセイランに比較して、試験化合物の存在 下、融合タンパク質へのタッグ付けリガンドの結合を決定すること; の各工程を含むことを特徴とする該方法。 2. タッグ付けリガンドがビオチニル化リガンド又はエピトープ付けリガンド であることを特徴とする、請求項1に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物 のスクリーニング方法。 3. 被覆されたミクロシンチレーションプレートが、ストレ プトアビジン被覆又は抗−抗体もしくはプロテインA被覆であることを特徴とす る、請求項2に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法 。 4. 放射性標識リガンドが、[3H]−又は[125I]−標識FK506アナロ グからなることを特徴とする、請求項3に記載の融合タンパク質へ結合できる化 合物のスクリーニング方法。 5. 融合タンパク質が、標的タンパク質にペプチドリンカーを介し結合したF K506結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項4に記載の融合タンパ ク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。 6. 標的タンパク質が単一又は複数のシグナル伝達ドメインを含むことを特徴 とする、請求項5に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング 方法。 7. 単一又は複数のシグナル伝達ドメインが、SH1、SH2、SH3、及び PHドメインからなる群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の融 合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方法。 8. 標的タンパク質が単一又は複数のSH2ドメインである ことを特徴とする、請求項7に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスク リーニング方法。 9. 放射性標識リガンドが[3H]−ジヒドロFK506であることを特徴と する、請求項8に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング方 法。 10. FK506結合タンパク質が12kDaのヒトFK506結合タンパク 質であることを特徴とする、請求項9に記載の融合タンパク質へ結合できる化合 物のスクリーニング方法。 11. 標的タンパク質が、ZAP:SH2、SYK:SH2及びLCK:SH 2からなる群から選択される単一又は複数のSH2ドメインであることを特徴と する、請求項10に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニング 方法。 12. 標的タンパク質がSH2ドメインであるZAP:SH2であることを特 徴とする、請求項11に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニ ング方法。 13. 標的タンパク質がSH2ドメインであるSYK:SH2であることを特 徴とする、請求項11に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニ ング方法。 14. 標的タンパク質がSH2ドメインであるLCK:SH2であることを特 徴とする、請求項11に記載の融合タンパク質へ結合できる化合物のスクリーニ ング方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US382495P | 1995-09-15 | 1995-09-15 | |
GBGB9603486.3A GB9603486D0 (en) | 1996-02-20 | 1996-02-20 | A high throughputassay using fusion proteins |
GB9603486.3 | 1996-02-20 | ||
GB60/003,824 | 1996-02-20 | ||
PCT/US1996/014563 WO1997010502A1 (en) | 1995-09-15 | 1996-09-11 | A high throughput assay using fusion proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000501171A true JP2000501171A (ja) | 2000-02-02 |
Family
ID=26308762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9512067A Pending JP2000501171A (ja) | 1995-09-15 | 1996-09-11 | 融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0855029A4 (ja) |
JP (1) | JP2000501171A (ja) |
CA (1) | CA2231385A1 (ja) |
WO (1) | WO1997010502A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010501837A (ja) * | 2006-08-25 | 2010-01-21 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 輸送タンパク質の輸送活性を決定するための方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6187757B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-02-13 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Regulation of biological events using novel compounds |
WO1998041866A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-24 | Merck & Co., Inc. | A high throughput assay using fusion proteins |
AU1121000A (en) * | 1998-10-19 | 2000-05-08 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Materials and methods involving conditional retention domains |
US7067526B1 (en) | 1999-08-24 | 2006-06-27 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | 28-epirapalogs |
ATE522603T1 (de) | 2001-06-22 | 2011-09-15 | Hoffmann La Roche | Löslicher komplex, der retrovirale oberflächen- glykoproteine und fkpa oder slyd enthält |
DE60331367D1 (de) | 2002-12-30 | 2010-04-01 | Angiotech Int Ag | Wirkstofffreisetzung von schnell gelierender polymerzusammensetzung |
CA2711765A1 (en) | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Conditional-stop dimerizable caspase transgenic animals |
EP3008192B1 (en) | 2013-06-11 | 2019-07-17 | Takara Bio USA, Inc. | Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE56096T1 (de) * | 1984-03-15 | 1990-09-15 | Immunex Corp | Test zur sofortigen feststellung von liganden, testsatz und seine herstellung. |
-
1996
- 1996-09-11 WO PCT/US1996/014563 patent/WO1997010502A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-09-11 CA CA002231385A patent/CA2231385A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-11 JP JP9512067A patent/JP2000501171A/ja active Pending
- 1996-09-11 EP EP96931529A patent/EP0855029A4/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010501837A (ja) * | 2006-08-25 | 2010-01-21 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 輸送タンパク質の輸送活性を決定するための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2231385A1 (en) | 1997-03-20 |
EP0855029A4 (en) | 2000-03-08 |
EP0855029A1 (en) | 1998-07-29 |
WO1997010502A1 (en) | 1997-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Phizicky et al. | Protein-protein interactions: methods for detection and analysis | |
Lamphere et al. | Interaction between Cdc37 and Cdk4 in human cells | |
JP3472584B2 (ja) | IKK−βタンパク質、核酸及び方法 | |
Gagné et al. | A proteomic approach to the identification of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins as a new family of poly (ADP-ribose)-binding proteins | |
US5783398A (en) | High throughput assay using fusion proteins | |
US20060019365A1 (en) | IKK-alpha proteins, nucleic acids and methods | |
US5776696A (en) | High throughput assay using fusion proteins | |
US5837514A (en) | IκB kinases | |
JP2006519800A (ja) | 未分化リンパ腫キナーゼアッセイ、試薬及びその組成物 | |
US8058241B2 (en) | Signal transduction protein TAB2 | |
JP2000501171A (ja) | 融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ | |
US5874230A (en) | Assays using TRAF2-associated protein kinase polypeptides | |
JPH11513246A (ja) | 融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ | |
US20030073097A1 (en) | TRAF6-regulated IKK activators (TRIKA1 and TRIKA2) and their use as anti-inflammatory targets | |
Sonatore et al. | The utility of FK506-binding protein as a fusion partner in scintillation proximity assays: application to SH2 domains | |
US5710025A (en) | Cell-type specific transcription factor | |
US8008452B2 (en) | Phosphorylated Ndr kinase | |
US6300473B1 (en) | SLM-1: a novel Sam68-like mammalian protein | |
JP4458847B2 (ja) | インタクトな細胞において受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充を観察するための方法およびキット | |
Wang et al. | Analysing protein–protein interactions using a GST-fusion protein to pull down the interacting target from the cell lysate | |
US20020164650A1 (en) | Methods of assessing wolframin protein activity | |
US20070224199A1 (en) | Targeting of MKRN1 for Identifying Cancer Treatment Agents | |
JP2006512048A (ja) | 有糸分裂の阻害剤の同定 | |
Kilian | Identification of novel interaction partners for the leukocyte adhesion molecule L-selectin | |
SHIROGANE | By JIANPING JIN, XIAOLU L. ANG, TAKAHIRO SHIROGANE, and J. WADE HARPER |