JP2006519800A - 未分化リンパ腫キナーゼアッセイ、試薬及びその組成物 - Google Patents
未分化リンパ腫キナーゼアッセイ、試薬及びその組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006519800A JP2006519800A JP2006504533A JP2006504533A JP2006519800A JP 2006519800 A JP2006519800 A JP 2006519800A JP 2006504533 A JP2006504533 A JP 2006504533A JP 2006504533 A JP2006504533 A JP 2006504533A JP 2006519800 A JP2006519800 A JP 2006519800A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- alk
- peptide
- seq
- antibody
- solid phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 7
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 title description 73
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 title description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 43
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 claims description 10
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 208000032004 Large-Cell Anaplastic Lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 3
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 206010073478 Anaplastic large-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 claims 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- -1 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Chemical class 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 4
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N fluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)CF QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122531 Anaplastic lymphoma kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 1
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
- A61K31/5395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines having two or more nitrogen atoms in the same ring, e.g. oxadiazines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
ALKチロシンキナーゼ活性を検出する方法であって、i)ALKタンパク質又はそれらの機能性誘導体を配列番号1又は2から選択されるペプチド基質とともに、該ペプチドのリン酸化反応に適した条件下でインキュベートし、ii)リン酸化されたペプチドを検出する工程を含む方法。
Description
本発明は、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)のキナーゼ活性を測定するためのアッセイを提供する。より詳細には、本発明は、ALKのチロシン−リン酸化活性を検出するための方法、試薬及び組成物に指向する。アッセイは、特に、潜在的ALK阻害剤のインビトロでのスクリーニング及び同定に有用である。
未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)は、受容体チロシンキナーゼであり、神経系の発達及び機能における重要な役割を果たすと考えられている。ALKは、通常、新生児期でピークの発現を伴って、中枢神経系で発現される。しかし、染色体転座によって、ALKは、異常に発現され、腫瘍融合タンパクの形態でいずれかの癌を活性化する。ALK融合タンパクは、全非ホジキンリンパ腫の約5〜10%に関与する。ALK陽性リンパ腫の1年の発生率は、EU国で発生する2000から3000の新たな症例を含んで、全世界で約100000である。ALKは、発癌において必須の役割を果たし、その正常な発現は、ほとんど中枢神経系に限定されているため、治療行為に対する良好な候補である。よって、特定のALK阻害剤は、臨床的な副作用をほとんど伴わないALK陽性リンパ腫の有効な治療薬となり得る。潜在的なALK阻害剤の同定のために、酵素活性に対して直接、阻害作用を示す化合物を評価するのに適するアッセイを開発することが強く望まれている。
本発明によれば、ALKに特異で、かつALK活性を調節する化合物のスクリーニングに有用なインビトロでのキナーゼアッセイが提供される。
このアッセイは、ALKによって容易にリン酸化されるペプチド基質の使用及びそのようにして得られたリン酸化生成物のその後の検出を基にしている。本発明の好ましい実施形態では、アッセイは、リン酸化された生成物が免疫学的反応によって検出されるELISA法である。
このアッセイは、ALKによって容易にリン酸化されるペプチド基質の使用及びそのようにして得られたリン酸化生成物のその後の検出を基にしている。本発明の好ましい実施形態では、アッセイは、リン酸化された生成物が免疫学的反応によって検出されるELISA法である。
選択的なALK基質を生成するために、ALK活性化ループの配列を複製するペプチド(aa 1274-1294:ALK HUMAN、Q9UM73、swiss-PROT))を合成し、試験した。そのペプチド ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK(配番号1)及びARDIYRASYYRKGGCAMLPVK(配列番号2)は、ほとんどのチロシンキナーゼに対して良好な基質となることが知られているランダムポリマーであるポリGlu/Tyrよりも高いリン酸化の程度を示すALK基質として、特に有効であった。従って、本発明の第1の目的は、配列番号1及び配列番号2から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである。
本発明のさらなる目的は、ALKチロシンキナーゼ活性を検出する方法であり、それは、本質的に、
i) AKLタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号1及び2から選択されたペプチドとともに、そのペプチドのリン酸化反応に適する条件下でインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを検出する工程を含む。
i) AKLタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号1及び2から選択されたペプチドとともに、そのペプチドのリン酸化反応に適する条件下でインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを検出する工程を含む。
ここで用いられる「ALK機能的誘導体」は、ALKタンパクのいずれかの修飾型、例えば、未修飾ALKの触媒活性を維持している、欠失又は複合型あるいはそれらのフラグメントを意味する。機能的誘導体は、ALK配列の1116から1392のALK全長(spanning)残基の全触媒ドメイン(Q9UM73)を含むことが好ましい。残基Leu1073からAla1459に伸長したALKタンパクの一部が好ましく使用される。
バキュロウイルス型発現システムを用いた組換え遺伝子技術によって生成された場合、このALKフラグメントは、正しいホールディング(CDスペクトルによって確認)及び有効な触媒活性を示す。
さらに、ALKの構成的に活性な形態を含む製剤を、精製たんぱく質又はその機能的誘導体のかわりに用いてもよい。そのような製剤は、細胞溶解物であることが好ましく、それは、ALK発現細胞を異なる化合物で処理し、次いで、ALKキナーゼ活性に対する細胞溶解物をアッセイすることによって、a)AKL又はALK融合プロテインを発現する全細胞において、ALK活性を確かめ、及びb)細胞中でALKに対する潜在的な阻害剤の効果を確かめるために使用することができる。
工程ii)においてリン酸化ペプチドを検出するために、工程i)のリン酸化反応を、[γ32P]ATP又は[γ33P]ATPのような放射性試薬の存在下で行うことができ、それにより、放射技術によって容易に検出される放射性生成物を形成することができる。あるいは、免疫反応を行うことができ、それは、リン酸化ペプチドと抗リン酸化チロシン抗体との免疫複合体の形成を含む。この抗リン酸化チロシン抗体は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスホターゼ又はグルコースオキシダーゼのような、受容体酵素に放射性標識又は結合することができ、よって、特定の放射活性又は酵素活性を測定することによって、抗体及びリン酸化ペプチドの直接的な検出を可能にする。さらなる代替として、抗リン酸化チロシン抗体は、抗リン酸化チロシン抗体を認識し、かつ放射性標識又は受容体酵素を有する第2の抗体によって、あるいは、抗リン酸化チロシン抗体におけるビオチン標識を認識するストレプロアビジンに結合した酵素によって、間接的に検出することができる。
好ましい実施形態では、本発明は、ALKチロシンキナーゼ活性を検出する方法を提供し、それは、
a)配列番号1又は2のペプチドを固相に接着させ、
b)Leu1073からAla1459に伸張するALKフラグメントとともに固相を、チロシンリン酸化反応に適する条件下でインキュベートし、
c)固相を洗浄し、
d)抗リン酸化チロシン抗体(第1抗体)とともに固相を、抗原−抗体結合に適する条件下でインキュベートし、
e)固相を洗浄し、
f)抗リン酸化チロシン第1抗体を認識する酵素結合抗体(第2の抗体)とともに固相を、第1抗体の第2抗体への結合に適する条件下でインキュベートし、それによって三成分免疫複合体を形成し、
g)固相を洗浄し、
h)免疫複合体の酵素活性を測定する(測定された活性は、チロシン−リン酸化の量に比例する)工程を含む。
a)配列番号1又は2のペプチドを固相に接着させ、
b)Leu1073からAla1459に伸張するALKフラグメントとともに固相を、チロシンリン酸化反応に適する条件下でインキュベートし、
c)固相を洗浄し、
d)抗リン酸化チロシン抗体(第1抗体)とともに固相を、抗原−抗体結合に適する条件下でインキュベートし、
e)固相を洗浄し、
f)抗リン酸化チロシン第1抗体を認識する酵素結合抗体(第2の抗体)とともに固相を、第1抗体の第2抗体への結合に適する条件下でインキュベートし、それによって三成分免疫複合体を形成し、
g)固相を洗浄し、
h)免疫複合体の酵素活性を測定する(測定された活性は、チロシン−リン酸化の量に比例する)工程を含む。
このアッセイ、正確にはELISAベースのキナーゼアッセイは、酵素−抗体結合体に利用される。結合酵素は、基質を開裂し、着色した溶液(それは、リン酸化チロシンの量に比例する)の吸収を測定することによって、分光光度的に検出することができる着色反応生成物を生じさせる。
本発明で使用することができる固相又は支持体は、プラスチック材料(反応プレート、ウェル、バイアル)、ポリスチレン、ラテックス及び磁性物質ビーズ、コロイダル金属粒子、ガラス及び/又はシリカ表面ならびにその他を含む。
ELISAベースのALKアッセイは、ALKのチロシン−リン酸化活性を調節する化合物のスクリーニング、特に、ALK阻害剤のスクリーニングに好ましく使用される。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ALKのチロシン−キナーゼ活性を調節する化合物の同定方法に指向し、上述したALKアッセイは、候補化合物あるいはALKチロシンキナーゼ活性を刺激又は阻害するとして知られた化合物(対照)の存在下に行われる。特に、ALKチロシンキナーゼ活性を調節する化合物を同定する方法は、
i)ALKタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号1又は2から選択される(好ましくは配列番号1)ペプチドとともに、そのペプチドのリン酸化に適した条件下で、候補化合物の存在のもとにインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを定量する工程を含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ALKのチロシン−キナーゼ活性を調節する化合物の同定方法に指向し、上述したALKアッセイは、候補化合物あるいはALKチロシンキナーゼ活性を刺激又は阻害するとして知られた化合物(対照)の存在下に行われる。特に、ALKチロシンキナーゼ活性を調節する化合物を同定する方法は、
i)ALKタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号1又は2から選択される(好ましくは配列番号1)ペプチドとともに、そのペプチドのリン酸化に適した条件下で、候補化合物の存在のもとにインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを定量する工程を含む。
ALK活性を阻害する化合物は、未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫のようなALK関連腫瘍の治療用の潜在的な治療剤として選択される。候補化合物のALK調節活性は、候補化合物と同じ条件下でアッセイされた参照化合物(対照)のそれと比較することができる。スタウロスポリン(Staurosporine)(Meggio F.ら、Eyr. J. Biochem. (1995) 234、317-322)は、0.2から0.3μM濃度でALK阻害剤として有効であることが証明されており、ALK阻害活性の他の化合物をスクリーニングする場合、陽性の対照として用いることができる。
分子モデルの研究は、スタウロスポリン親和性及びALKタンパクに対する特異性を改善することが要求されている置換基のパターンに関して、重要な指標を与えた。最も有効な構造は、以下の一般式(I)で示される。
(式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、ハロゲン(好ましくは塩素)、フェニル又は任意に1以上のハロゲンで置換されていてもよいC1からC3アルキルから選択され、R3はヒドロキシ、R4はヒドロキシ又はヒドロキシメチル、R5は、任意にハロ置換されていてもよいC1からC3アルキル又はベンジルである。)
式(I)の化合物は、NPM−ALK、ATIC−ALK、CTLC−ALK、TFG−ALK又はその他のトロポミオシンとの散発性融合のような発癌性の融合タンパク内で、ATPのALKのチロシンキナーゼドメインへの結合を拮抗する。したがって、それらはALK関連腫瘍、特に、未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の治療用医薬製剤に用いることができる。
式(I)の化合物は、NPM−ALK、ATIC−ALK、CTLC−ALK、TFG−ALK又はその他のトロポミオシンとの散発性融合のような発癌性の融合タンパク内で、ATPのALKのチロシンキナーゼドメインへの結合を拮抗する。したがって、それらはALK関連腫瘍、特に、未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の治療用医薬製剤に用いることができる。
本発明の異なる実施形態では、化合物(I)を、ここで開示されたように、ALK阻害剤のスクリーニング用ALKアッセイに用いる。ハイスループットのスクリーニングもまた、本発明のALKアッセイを用いて実行することができる。
さらなる観点によれば、本発明は、上述したALKアッセイを行うためのキットに指向する。そのキットは、所定の割合で試薬を組み合わせて包装したものからなる。通常、キットは、配列番号1又は2のペプチド(任意に固相に固定されていてもよい)、抗リン酸化チロシン抗体及び、必要に応じて、酵素的又は放射性標識された標識抗体を含むであろう。さらに、キットは、比色又は放射性反応のための試薬、バッファ、スタウロスポリン又はその誘導体のような対照、希釈剤、洗浄剤、安定剤及びアッセイを組み立てるか、アッセイを行うために有用ないずれかの他の成分を含んでいてもよい。種々の試薬の相対的な量は、アッセイの感度を最適化するために変化させることができる。特に、試薬は、溶液、懸濁剤、分散剤、乾燥粉末、凍結乾燥製剤のような固体又は液体製剤で提供してもよい。キット成分は、1つの又は別個の容器で供給される。またそのキットは、アッセイを行うための指示書を含んでいてもよい。
実験結果
ペプチド合成
アプライド・バイオシステム・モデル431A・シンセサイザー(4−ヒドロキシメチル−コポリスチレン−1%ジビニルベンゼン樹脂(0.95mmol/g、0.05mmol))で、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を利用する自動固相合成法によって、ペプチドを合成した。
ペプチド合成
アプライド・バイオシステム・モデル431A・シンセサイザー(4−ヒドロキシメチル−コポリスチレン−1%ジビニルベンゼン樹脂(0.95mmol/g、0.05mmol))で、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を利用する自動固相合成法によって、ペプチドを合成した。
Fmocアミノ酸(0.5mmol)を、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1−1,1,3,3−トリメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート(HBTU)(1当量)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1当量)を、DIPEA(2当量)の存在下で、活性化した。
ペプチジル樹脂(100mg)を開裂させ、5mlのトリフルオロ酢酸、0.375gのフェノール、0.125μlの1,2−エタンエジチオール、0.250μlのチオアニソール及び0.25μlの水中で、2時間、脱保護した。その反応混合物を、0℃に冷却したエチルエーテルを含む試験管にろ過した。析出したペプチドを遠心により分離し、新鮮なエーテルで洗浄した。
粗ペプチド(10mlの水中、50から100mg)を分離用RP−カラム(prepNova-Pak HR C18、6μm、25×10mm、Waters)にポンピングし、12ml/分で、10%から45%アセトニトリルの線形勾配で溶出した。
ペプチドの純度は、1ml/分で、0.1%フルオロ酢酸中のアセトニトリルの線形勾配を用いた分析RP−HPLC(5μm、C18Symmetry300カラム、4.6×250mm (Waters))による判定で>90%であった。ペプチドの分子量は、マトリクス−援助レーザー吸収イオン化飛行時間型(MALDI−Tof)質量分析計(Maldi-1;Kratos-Schimadzu、Mancester、UK)を用いた質量分析法によって確認した。
組換えALKの生成及び精製
AKLの一部(Leu1073からAla1459から伸張)をバキュロウイルス転移ベクター(pBlueBacHis2C (インビトロゲン))にクローン化した。
このベクターとMaxBac(登録商標)2.0バキュロウイルス発現システム(インビトロゲン)を用いて、我々は、Sf9(Spodoptera ftugiperda)昆虫細胞内で、組換えバキュロウイルス及び発現組換えALK(rALK)プロテインを生成した。このタンパクは、理論分子量が49kDaであり、6−ヒスチジン標識(His−tag)に融合したALK(Ile1116からVal1392)の予測触媒ドメインを含む。His標識rALKの自動リン酸化活性は、正しいホールディングを表示し、全細胞溶解物の抗リン酸化チロシン免疫ブロット及びインビトロの放射性キナーゼアッセイによって検証された。
AKLの一部(Leu1073からAla1459から伸張)をバキュロウイルス転移ベクター(pBlueBacHis2C (インビトロゲン))にクローン化した。
このベクターとMaxBac(登録商標)2.0バキュロウイルス発現システム(インビトロゲン)を用いて、我々は、Sf9(Spodoptera ftugiperda)昆虫細胞内で、組換えバキュロウイルス及び発現組換えALK(rALK)プロテインを生成した。このタンパクは、理論分子量が49kDaであり、6−ヒスチジン標識(His−tag)に融合したALK(Ile1116からVal1392)の予測触媒ドメインを含む。His標識rALKの自動リン酸化活性は、正しいホールディングを表示し、全細胞溶解物の抗リン酸化チロシン免疫ブロット及びインビトロの放射性キナーゼアッセイによって検証された。
精製のためのタンパクを生成するために、感染多重度(MOI)5で、Sf9細胞を組み換えウイルスに感染させた。 27℃にて3日間、インキュベートすることにより培養し、次いで、4℃にて10分間400gで遠心することにより回収した。細胞ペレットを使用まで−80℃で保存した。細胞を溶解するために、50mMのTris−HCl(pH8)、20mMのNaCl及びプロテアーゼ阻害剤(ペプスタチン、ベンズアミジン、ロイペプチン及びアプロチニン)を含む低張のバッファ(バッファA)中で、細胞ペレットを再懸濁した。氷上でのインキュベーションの30分後、細胞再懸濁液を1500gで15分間、4℃にて遠心し、上清を0.45μmフィルターによってろ過した。次いで、ろ液を、バッファAの存在下、80mlアニオン交換高速DEAEセファロース(シグマ)カラムに、1.5ml/分の流量で、AKTAFPLCシステム(アマーシャム−ファルマシアバイオテック)を用いてロードした。結合したタンパクを、20から200mMの範囲のNaClの勾配中で溶出した。フラクションを、免疫ブロットによって、ALKタンパクが存在するかどうか分析した。陽性フラクションをプールし、1リットルの陰性結合バッファ(20mMのリン酸ナトリウム(pH7.8)、500mMのNaCl及びPI)中で、毎時間バッファを交換しながら、4℃にて3時間透析した。次いで、透析フラクションを、50mMイミダゾール及び20mMβメルカプトエタノールを添加した陰性結合バッファで予め平衡させて、HiTrap(商標)−ニッケル親和性クロマトクラフィーカラム(アマーシャム−ファルマシアバイオテック)にロードした。0.5から1ml/分の流量をカラムに適用した。カラムを陰性結合バッファで洗浄した後、結合タンパクを、50から200mMの範囲のイミダゾールの線形勾配を用いて溶出した。次いで、フラクションを、SDS−PAGE及び銀染色によって、rALKの存在及び純度について分析した。図1AはrALKの精製の実施例を示す。
最後に、陽性フラクションを、50mMのトリス(pH7.4)、100mMのNaCl、10%グリセロール、20mMのβ−メルカプロエタノール及びプロテアーゼ阻害剤中で透析し、使用まで−80℃で保存した。精製rALKが活性であることを検証するために、我々は、放射性自動リン酸化アッセイを行った。25μlのrALK陽性フラクション、6μMの冷ATP、1.2mMのDTT、10μCi[γ−32P]ATP、25mMのヘペス(pH7.5)、10mMのMgCl2及び10mMのMnCl2を含む反応混合物を30℃にて30分間インキュベートした。反応を、Laemmliバッファを加えることによって中止させ、95℃にて5分間加熱した。サンプルを10%SDS−PAGEゲルに解像し、Immobilon(商標)−Pメンブレンに転写した。放射性標識タンパクを図1Bに示したように、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
ペプチドリン酸化反応(放射性アッセイ)
ペプチド及びランダムポリマーポリGlu/Tyr(1:4)を、50mMのTris/HCl(pH 7.5)、5mMのMnCl2、10μMのNa−バンデート、30μM[γ32P]ATP又は[γ33P]ATP (特異活性1000cpm/pmol)及び10単位のrALK [1ユニットは、ポリGluTyr (0.1 mg/ml)に対して、1分当り1pmolのリン酸を転移する酵素の量として定義されている]を含む媒体の30μl中でリン酸化した。その反応を、30℃で10分間のインキュベーションの後、25μlの混合物をP81ホスホセルロース紙にスポットすること(それは、他の箇所(1)で説明されたように進めた)により終了させた。非線形回帰を用いたミハエリス‐メンテンの式に直接データを代入するGraphPad Prism softwareによって、反応速度定数を測定した。
ペプチド及びランダムポリマーポリGlu/Tyr(1:4)を、50mMのTris/HCl(pH 7.5)、5mMのMnCl2、10μMのNa−バンデート、30μM[γ32P]ATP又は[γ33P]ATP (特異活性1000cpm/pmol)及び10単位のrALK [1ユニットは、ポリGluTyr (0.1 mg/ml)に対して、1分当り1pmolのリン酸を転移する酵素の量として定義されている]を含む媒体の30μl中でリン酸化した。その反応を、30℃で10分間のインキュベーションの後、25μlの混合物をP81ホスホセルロース紙にスポットすること(それは、他の箇所(1)で説明されたように進めた)により終了させた。非線形回帰を用いたミハエリス‐メンテンの式に直接データを代入するGraphPad Prism softwareによって、反応速度定数を測定した。
結果
Tyr−1278を含む、ALK参照配列から誘導されたペプチドは、rALKの良好な基質となったが、Tyr−1282又はTyr−1283のいずれかを含むペプチドは、酵素によってわずかに影響された(図2参照)。Tyr−1278誘導体は3つのTyr残基を有するペプチドによって表されたものよりももっと高い効率でリン酸化された(表I)。Tyr−1278誘導体がALK触媒ドメインに最適なペプチド基質であることを確認するために、我々は、ポリGlu/Tyr(1:4)、つまり、ほとんどのチロシンキナーゼに非常に良好な基質であるランダムポリマーによって表されたものとそのリン酸化の程度を比較した。
表IIは、Tyr−1278誘導体がポリGlu/Tyrよりも良好なALK基質となることを示す。
Tyr−1278を含む、ALK参照配列から誘導されたペプチドは、rALKの良好な基質となったが、Tyr−1282又はTyr−1283のいずれかを含むペプチドは、酵素によってわずかに影響された(図2参照)。Tyr−1278誘導体は3つのTyr残基を有するペプチドによって表されたものよりももっと高い効率でリン酸化された(表I)。Tyr−1278誘導体がALK触媒ドメインに最適なペプチド基質であることを確認するために、我々は、ポリGlu/Tyr(1:4)、つまり、ほとんどのチロシンキナーゼに非常に良好な基質であるランダムポリマーによって表されたものとそのリン酸化の程度を比較した。
表IIは、Tyr−1278誘導体がポリGlu/Tyrよりも良好なALK基質となることを示す。
表I
rALKと合成ペプチドとの反応速度定数
ペプチド:Vmax(pmol/分):Km(μM):効率(Vmax/Km)
ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK:99.5:90.5:1.1
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK:186.3:109.4:1.7
rALKと合成ペプチドとの反応速度定数
ペプチド:Vmax(pmol/分):Km(μM):効率(Vmax/Km)
ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK:99.5:90.5:1.1
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK:186.3:109.4:1.7
表II
ALK触媒ドメインによるモデル基質のリン酸化速度
ポリ(Glu/Tyr)及びペプチド濃度を、それぞれ0.1mg/ml及び400μMとした。酵素濃度は10単位であった。報告された値は、3回の別個の実験の平均を示す。S. E. M.値は常に14%未満であった。
基質:リン酸化の程度(pmol/分)
ポリ(Glu/Tyr):10.0
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK:30.3
ALK触媒ドメインによるモデル基質のリン酸化速度
ポリ(Glu/Tyr)及びペプチド濃度を、それぞれ0.1mg/ml及び400μMとした。酵素濃度は10単位であった。報告された値は、3回の別個の実験の平均を示す。S. E. M.値は常に14%未満であった。
基質:リン酸化の程度(pmol/分)
ポリ(Glu/Tyr):10.0
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK:30.3
ELISAベースのインビトロでのキナーゼアッセイ
ナンクイムノ96ウェルプレートを、PBS中の種々の濃度でALKペプチド基質(配列番号1又は2)を含む被覆溶液(125μ1/ウェル)とともに、37℃にて一晩インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液(PBS−トウーン0.05%)の200μ1で洗浄し、37℃にて2時間放置して乾燥した。キナーゼ反応をキナーゼバッファ(25 mMHepes(pH 7.5)、5mMのMnCl2、5mMのMgCl2)、0.3mMのATP及び精製rALKを30℃にて15分間、100μl/ウェルの総容量中、種々の濃度でインキュベートすることによって行った。次いで、反応混合物を取り出し、ウェルを洗浄バッファ200μlで5回洗浄した。リン酸化ペプチドをPBS+4%BSA中で1:500に希釈されたマウスモノクローナル抗リン酸化チロシン抗体(クローン4G10 UpstateBiotech Ltd)100μl/ウェルを用いて検出した。室温でのインキュベートの30分後、抗体を取り出し、上述したようにウェルを洗浄した。PBS+4%BSA中で1:500に希釈された第2抗体(抗マウスIgG、ホースラディッシュパーオキシターゼ結合全抗体、羊から、Amersham Pharmacia Biotech)の100μlを各ウェルに加え、上述したような洗浄の前に、プレートを再度室温にて30分間インキュベートした。プレートを100μl/ウェルのTMB基質溶液(エンドゲン)を用いて製造し、反応を0. 18 Mの硫酸の同量を添加することによって中止させた。最後に、Ultrospec(登録商標)300スペクトロメータ(Amersham- Pharmacia Biotech)を用いて、450又は490nmで吸収を読み取った。
ナンクイムノ96ウェルプレートを、PBS中の種々の濃度でALKペプチド基質(配列番号1又は2)を含む被覆溶液(125μ1/ウェル)とともに、37℃にて一晩インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液(PBS−トウーン0.05%)の200μ1で洗浄し、37℃にて2時間放置して乾燥した。キナーゼ反応をキナーゼバッファ(25 mMHepes(pH 7.5)、5mMのMnCl2、5mMのMgCl2)、0.3mMのATP及び精製rALKを30℃にて15分間、100μl/ウェルの総容量中、種々の濃度でインキュベートすることによって行った。次いで、反応混合物を取り出し、ウェルを洗浄バッファ200μlで5回洗浄した。リン酸化ペプチドをPBS+4%BSA中で1:500に希釈されたマウスモノクローナル抗リン酸化チロシン抗体(クローン4G10 UpstateBiotech Ltd)100μl/ウェルを用いて検出した。室温でのインキュベートの30分後、抗体を取り出し、上述したようにウェルを洗浄した。PBS+4%BSA中で1:500に希釈された第2抗体(抗マウスIgG、ホースラディッシュパーオキシターゼ結合全抗体、羊から、Amersham Pharmacia Biotech)の100μlを各ウェルに加え、上述したような洗浄の前に、プレートを再度室温にて30分間インキュベートした。プレートを100μl/ウェルのTMB基質溶液(エンドゲン)を用いて製造し、反応を0. 18 Mの硫酸の同量を添加することによって中止させた。最後に、Ultrospec(登録商標)300スペクトロメータ(Amersham- Pharmacia Biotech)を用いて、450又は490nmで吸収を読み取った。
結果
我々は、ELISAベースキナーゼアッセイがリン酸化ALKペプチド基質(配列番号1及び2)を、よって精製rALK活性を検出するために使用することができることを示した。最初の実験で、我々は、450nm(A450)での吸収における特別な増加が観察できるかどうかを測定するために、精製rALK及び配列番号2のペプチド基質の双方の存在、非存在下でアッセイを行った(図3A)。当然、精製rALK及び基質の双方の存在下で、A450nmにおける劇的な増加が観察された。それに対して、ペプチド又はrALKのいずれか及び双方の非存在下では、A450nmは低く、つまりバックグラウンド吸収の低いレベルを示した。基質リン酸化の反応速度を測定するために、我々は、種々のインキュベーション時間後のA450を測定した(図3B)。双方のペプチドについて、反応速度は、10分後に最大リン酸化に達したというように、同様であった。
我々は、ELISAベースキナーゼアッセイがリン酸化ALKペプチド基質(配列番号1及び2)を、よって精製rALK活性を検出するために使用することができることを示した。最初の実験で、我々は、450nm(A450)での吸収における特別な増加が観察できるかどうかを測定するために、精製rALK及び配列番号2のペプチド基質の双方の存在、非存在下でアッセイを行った(図3A)。当然、精製rALK及び基質の双方の存在下で、A450nmにおける劇的な増加が観察された。それに対して、ペプチド又はrALKのいずれか及び双方の非存在下では、A450nmは低く、つまりバックグラウンド吸収の低いレベルを示した。基質リン酸化の反応速度を測定するために、我々は、種々のインキュベーション時間後のA450を測定した(図3B)。双方のペプチドについて、反応速度は、10分後に最大リン酸化に達したというように、同様であった。
ELISAキナーゼアッセイにおける2種のペプチドの効率を比較し、使用のためのペプチドの最適濃度を測定するために、我々は、双方のペプチドについて検量線測定を行った。結果は、ペプチド基質の量の増加がA450を、よってrALKキナーゼ活性を増加させることを示す。配列番号2のペプチド基質について、最大A450及びリン酸化反応は、約200μMで観察され、それに対して、配列番号1のペプチド基質はわずか25μMであった(図4A及びB)。これは、配列番号1のペプチド基質がrALK用の基質としてより有効であることを示す。
キナーゼ活性の阻害を観察するために、酵素の適当な濃度、つまり、検量線の線形範囲を用いることが必須である。ELISAを、206μMの配列番号2又は42μMの配列番号1及びrALKの0〜220ngの範囲を用いて行った。双方の基質の曲線の線形範囲は、rALKの約0〜15ngの間であり、その後、曲線はプラトーに達した(図5)。
rALK活性に対する阻害剤スタウロスポリンの効果を42μMの配列番号2のペプチド基質を用いて評価した。また、対応濃度でDMSOを含有する溶媒対照を行った。スタウロスポリンは、1μMで、見積もりIC50=300nMの最大阻害に達し、著しくrALK活性を阻害した(図6)。溶媒(DMSO)単独ではrALK活性に実質的な効果はなかった。
参照
[1] Glass, D.B.、Masaracchia, R.A.、Feramisco, J.R.及びKemp, D.E.、(1978) Anal. Biochem. 87、566-575。
[2] Till, J. H.、Ablooglu, A. J.、Frankel, M.、Bishop, S. M.、Kohanski, R. A.及びHubbard S. R.、(2001) J. Biol. Chem. 276、10049-10055。
[1] Glass, D.B.、Masaracchia, R.A.、Feramisco, J.R.及びKemp, D.E.、(1978) Anal. Biochem. 87、566-575。
[2] Till, J. H.、Ablooglu, A. J.、Frankel, M.、Bishop, S. M.、Kohanski, R. A.及びHubbard S. R.、(2001) J. Biol. Chem. 276、10049-10055。
Claims (20)
- ALKチロシンキナーゼ活性を検出する方法であって、以下の工程、
i)ALKタンパク又はそれらの機能性誘導体を配列番号1又は2から選択されるペプチド基質とともに、該ペプチドのリン酸化反応に適した条件下でインキュベートし、
ii)リン酸化されたペプチドを検出する工程を含む方法。 - ペプチドが配列番号1の配列を有する請求項1の方法。
- 精製ALKタンパク又はALK含有製剤を用いる請求項1の方法。
- 製剤が細胞溶解物である請求項3の方法。
- 機能性誘導体が、ALK配列のALK全長残基1116−1392の全触媒ドメインを含む請求項1の方法。
- 機能性誘導体が、残基Leu1073からAla1459に伸張したALKプロテインのフラグメントである請求項5の方法。
- a)配列番号1又は2のペプチドを固相に接着させ、
b)ALKフラグメントとともに固相を、チロシンリン酸化に適当な条件下でインキュベートし、
c)固相を洗浄し、
d)抗リン酸化チロシン抗体(第1抗体)とともに固相を、抗原−抗体結合に適当な条件下でインキュベートし、
e)固相を洗浄し、
f)第1抗体を認識する酵素結合抗体(第2抗体)とともに固相を、第1抗体及び第2抗体の結合に適当な条件下でインキュベートし、それによって三成分免疫複合体を形成し、
g)固相を洗浄し、
h)免疫複合体の酵素活性を測定し、測定された活性は、チロシン−リン酸化の量に比例する工程を含む請求項6の方法。 - 抗体に結合した酵素が、ホースラディッシュパーオキシターゼである請求項7の方法。
- 酵素活性を比色分析反応によって検出する請求項7の方法。
- ALKチロシンキナーゼ活性を調節する化合物を同定する請求項1から9のいずれかの方法。
- i)ALKタンパク又はそれらの機能的誘導体を、配列番号1又は2から選択されるペプチドと、ペプチドのリン酸化に適した条件下で、候補化合物の存在のもとにインキュベートし、
ii)このようにして形成されたリン酸化ペプチドを検出する工程を含む請求項10の方法。 - 候補化合物のALK調節活性を、候補化合物と同じ条件下でアッセイされた参照化合物のそれと比較する請求項10又は11の方法。
- 参照化合物はスタウロスポリンである請求項12の方法。
- 配列番号1又は2から選択されるALK基質として有用なペプチド。
- 配列番号1である請求項15のペプチド。
- ALKチロシンキナーゼ活性の測定のための請求項15又は16のペプチドの使用。
- ALK関連腫瘍、特に未分化大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の治療用医薬の製造のための請求項14の式(I)の化合物の使用。
- 配列番号1又は2のペプチド及び抗リン酸化チロシン抗体を含む請求項1から14のALKチロシンキナーゼ活性を検出するためのキット。
- 比色分析反応用試薬、バッファ、希釈剤、洗浄剤、安定剤、請求項14のスタウロスポリン又はそれらの誘導体から選択されるさらなる成分を含む請求項19のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP03005186A EP1454992B1 (en) | 2003-03-07 | 2003-03-07 | Anaplastic lymphoma kinase assay, reagents and compositions thereof |
PCT/EP2004/002185 WO2004079326A2 (en) | 2003-03-07 | 2004-03-04 | Anaplastic lymphoma kinase assay, reagents and compositions thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006519800A true JP2006519800A (ja) | 2006-08-31 |
Family
ID=32798804
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006504533A Pending JP2006519800A (ja) | 2003-03-07 | 2004-03-04 | 未分化リンパ腫キナーゼアッセイ、試薬及びその組成物 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070031907A1 (ja) |
EP (1) | EP1454992B1 (ja) |
JP (1) | JP2006519800A (ja) |
CN (1) | CN100345978C (ja) |
AT (1) | ATE328112T1 (ja) |
CA (1) | CA2518094A1 (ja) |
CY (1) | CY1106115T1 (ja) |
DE (1) | DE60305634T2 (ja) |
DK (1) | DK1454992T3 (ja) |
ES (1) | ES2263862T3 (ja) |
HK (1) | HK1068154A1 (ja) |
IL (1) | IL170669A0 (ja) |
PT (1) | PT1454992E (ja) |
SI (1) | SI1454992T1 (ja) |
WO (1) | WO2004079326A2 (ja) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2561406T3 (es) | 2006-04-14 | 2016-02-26 | Cell Signaling Technology, Inc. | Defectos de genes y quinasa ALK mutante en tumores sólidos humanos |
US8168383B2 (en) | 2006-04-14 | 2012-05-01 | Cell Signaling Technology, Inc. | Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors |
EP2107054A1 (en) | 2008-04-01 | 2009-10-07 | Università Degli Studi Di Milano - Bicocca | Antiproliferative compounds and therapeutic uses thereof |
EP2274288A2 (en) | 2008-04-24 | 2011-01-19 | Incyte Corporation | Macrocyclic compounds and their use as kinase inhibitors |
EP2161271A1 (en) | 2008-09-08 | 2010-03-10 | Università Degli Studi Di Milano - Bicocca | Alpha-carboline inhibitors of NMP-ALK, RET, and Bcr-Abl |
WO2010085597A1 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Incyte Corporation | Macrocyclic compounds and their use as kinase inhibitors |
US9126931B2 (en) * | 2009-06-10 | 2015-09-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Tetracyclic compound |
CN101955995B (zh) * | 2010-06-17 | 2013-06-26 | 江苏迈迪基因生物科技有限公司 | 淋巴瘤相关的融合基因的诊断试剂盒 |
US20120101108A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-04-26 | Cell Signaling Technology, Inc. | Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer |
WO2012023597A1 (ja) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | 中外製薬株式会社 | 4環性化合物を含む組成物 |
EP2847353B1 (en) | 2012-05-10 | 2022-01-19 | The General Hospital Corporation | Methods for determining a nucleotide sequence |
TR201815994T4 (tr) | 2012-09-25 | 2018-11-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Ret inhibitörü. |
WO2014128235A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods of treating cancer and preventing drug resistance |
US10450597B2 (en) | 2014-01-27 | 2019-10-22 | The General Hospital Corporation | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
CA2946268A1 (en) | 2014-04-25 | 2015-10-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Crystal of tetracyclic compound |
KR102412321B1 (ko) | 2014-04-25 | 2022-06-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 4환성 화합물을 고용량 함유하는 제제 |
TWI718102B (zh) | 2014-08-08 | 2021-02-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 4環性化合物的非晶質體 |
RU2740261C2 (ru) | 2015-01-16 | 2021-01-12 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Комбинированное лекарственное средство |
CN109937254B (zh) | 2016-09-15 | 2023-05-30 | 阿谢尔德克斯有限责任公司 | 核酸样品制备方法 |
CA3037190A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free dna |
EP4198140A1 (en) | 2016-11-02 | 2023-06-21 | ArcherDX, LLC | Methods of nucleic acid sample preparation for immune repertoire sequencing |
WO2020050241A1 (ja) | 2018-09-04 | 2020-03-12 | 中外製薬株式会社 | 4環性化合物の製造方法 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05126833A (ja) * | 1991-10-31 | 1993-05-21 | Tosoh Corp | チロシンキナ−ゼ活性の免疫化学的測定法及びそのキツト |
AU4281393A (en) * | 1992-04-10 | 1993-11-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Activation-state-specific phosphoprotein immunodetection |
ES2136103T3 (es) * | 1992-06-22 | 1999-11-16 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Procedimiento para la preparacion de derivados de estaurosporina. |
GB9314271D0 (en) * | 1993-07-09 | 1993-08-18 | Inst Of Cancer The Research | Cell growth factor receptors |
US6001621A (en) * | 1993-11-23 | 1999-12-14 | Genetech, Inc. | Protein tyrosine kinases |
CA2175892C (en) * | 1993-11-23 | 2000-03-07 | Paul J. Godowski | Kinase receptor activation assay |
US5529925A (en) * | 1993-12-03 | 1996-06-25 | St. Jude Children's Research Hospital | Nucleic acid sequences and fusion proteins present in human t(2;5) lymphoma |
US5763198A (en) * | 1994-07-22 | 1998-06-09 | Sugen, Inc. | Screening assays for compounds |
US5759787A (en) * | 1996-08-26 | 1998-06-02 | Tularik Inc. | Kinase assay |
CA2288221A1 (en) * | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Sugen, Inc. | Diagnosis and treatment of phosphatase 0r kinase-related disorders |
US6806266B1 (en) * | 1999-07-13 | 2004-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Staurosporin derivatives |
-
2003
- 2003-03-07 DE DE60305634T patent/DE60305634T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-03-07 PT PT03005186T patent/PT1454992E/pt unknown
- 2003-03-07 ES ES03005186T patent/ES2263862T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-07 AT AT03005186T patent/ATE328112T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-03-07 DK DK03005186T patent/DK1454992T3/da active
- 2003-03-07 SI SI200330308T patent/SI1454992T1/sl unknown
- 2003-03-07 EP EP03005186A patent/EP1454992B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-04 WO PCT/EP2004/002185 patent/WO2004079326A2/en active Application Filing
- 2004-03-04 CN CNB2004800060187A patent/CN100345978C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-04 CA CA002518094A patent/CA2518094A1/en not_active Abandoned
- 2004-03-04 JP JP2006504533A patent/JP2006519800A/ja active Pending
- 2004-03-04 US US10/547,842 patent/US20070031907A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-02-17 HK HK05101314A patent/HK1068154A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2005-09-05 IL IL170669A patent/IL170669A0/en unknown
-
2006
- 2006-07-04 CY CY20061100923T patent/CY1106115T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1756850A (zh) | 2006-04-05 |
CY1106115T1 (el) | 2011-06-08 |
ATE328112T1 (de) | 2006-06-15 |
WO2004079326A2 (en) | 2004-09-16 |
US20070031907A1 (en) | 2007-02-08 |
DE60305634T2 (de) | 2006-09-21 |
HK1068154A1 (en) | 2005-04-22 |
WO2004079326A3 (en) | 2004-12-09 |
EP1454992B1 (en) | 2006-05-31 |
IL170669A0 (en) | 2011-08-01 |
SI1454992T1 (sl) | 2006-10-31 |
EP1454992A1 (en) | 2004-09-08 |
DK1454992T3 (da) | 2006-10-02 |
ES2263862T3 (es) | 2006-12-16 |
CN100345978C (zh) | 2007-10-31 |
PT1454992E (pt) | 2006-09-29 |
DE60305634D1 (de) | 2006-07-06 |
CA2518094A1 (en) | 2004-09-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006519800A (ja) | 未分化リンパ腫キナーゼアッセイ、試薬及びその組成物 | |
Herget et al. | The myristoylated alanine‐rich C‐kinase substrate (MARCKS) is sequentially phosphorylated by conventional, novel and atypical isotypes of protein kinase C | |
Gardiner et al. | Identification and characterization of FUS/TLS as a new target of ATM | |
Turk et al. | Selective inhibition of amino-terminal methionine processing by TNP-470 and ovalicin in endothelial cells | |
Scott et al. | Reversible phosphorylation at the C-terminal regulatory domain of p21Waf1/Cip1 modulates proliferating cell nuclear antigen binding | |
Jones et al. | Phosphatidylinositol 3–kinase is required for the formation of constitutive transport vesicles from the TGN | |
Takizawa et al. | Phosphorylation of CPI17 and myosin binding subunit of type 1 protein phosphatase by p21-activated kinase | |
JP3991327B2 (ja) | 甲状腺組織試料中の甲状腺癌細胞を検出する方法及び甲状腺癌の組織診断用組成物 | |
US7763418B2 (en) | Detection of Rho proteins | |
US20080020462A1 (en) | Atm kinase compositions and methods | |
McNEILL et al. | A novel UBA and UBX domain protein that binds polyubiquitin and VCP and is a substrate for SAPKs | |
Gjonaj et al. | Development of a DUB-selective fluorogenic substrate | |
US6228989B1 (en) | Peptide substrates phosphorylated by P21-activated protein kinase | |
OEHRLEIN et al. | Phosphorylation of GAP-43 (growth-associated protein of 43 kDa) by conventional, novel and atypical isotypes of the protein kinase C gene family: differences between oligopeptide and polypeptide phosphorylation | |
Merrick et al. | Site-specific phosphorylation of human p53 protein determined by mass spectrometry | |
Colbran et al. | Analysis of specific interactions of native protein phosphatase 1 isoforms with targeting subunits | |
US7108992B2 (en) | ATM kinase compositions and methods | |
AU2003257962A1 (en) | Mk2 interacting proteins | |
Scholten et al. | The hinge region operates as a stability switch in cGMP‐dependent protein kinase Iα | |
Fährmann et al. | Binding of CaMKII to the giant muscle protein projectin: stimulation of CaMKII activity by projectin | |
CA1339109C (en) | Alpha-n-acetylgalactosaminyltransferase and method of detecting tumor cells using same | |
Praseeda et al. | Influence of a mutation in the ATP-binding region of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II on its interaction with peptide substrates | |
US10842793B2 (en) | Inhibitors of the unconventional secretion of fibroblast growth factor 2 (FGF2) by tumor cells and uses thereof | |
Alligood et al. | Monoclonal antibodies generated against recombinant ATM support kinase activity | |
DAVID‐PFEUTY et al. | Serine/threonine‐specific protein kinase activity associated with viral pp60src protein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100209 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100810 |