CN1756850A - 间变性淋巴瘤激酶测定法、试剂和它们的组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于检测ALK酪氨酸激酶活性并且用于鉴定调节ALK活性的化合物的方法、肽底物、试剂和它们的组合物。

Description

间变性淋巴瘤激酶测定法、试剂和它们的组合物
本发明提供了测定间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)(ALK)的激酶活性的测定法。更具体地，本发明针对用于检测ALK酪氨酸磷酸化活性的方法、试剂和组合物。该测定法对于体外筛选和鉴定潜在的ALK抑制剂特别有用。
发明背景
间变性淋巴瘤激酶(ALK)是一种受体酪氨酸激酶，被认为在神经系统的发育和功能方面起着重要的作用。ALK通常表达于中枢神经系统，而在新生儿期有较弱的表达。然而由于染色体易位，在一些癌症中ALK也可以以致癌性融合蛋白的形式异常表达或激活。在所有的非何杰金(Hodgkin)淋巴瘤中，大约5-10％是由于ALK融合蛋白引起的。ALK阳性的淋巴瘤的年发病率在全世界为大约100 000，在欧盟(EU)国家每年的新发病例为2000-3000。因为ALK在致癌性中起着根本的作用并且正常的表达基本上局限在中枢神经系统，它成为用于治疗介入的极好的候选。因此，特异的ALK抑制剂会有效的治疗ALK阳性淋巴瘤，且几乎不带有临床副作用。对于鉴定潜在的ALK抑制剂，极其需要研发出直接评估化合物对酶活性抑制效果的适宜测定法。
发明内容
根据发明，提供了对ALK特异的并且用于筛选调节ALK活性的化合物的体外激酶测定法。本测定法基于使用容易被ALK磷酸化的肽底物和随后的对所得到的磷酸化产物的检测。在本发明的一个优选实施方案中，测定法是ELISA，其中通过免疫化学反应检测磷酸化产物。
为了产生选择性的ALK底物，合成并测试了再现ALK激活环(氨基酸1274-1294：ALK_HUMAN，Q9UM73，swiss-PROT)的序列的肽。肽ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK(SEQ ID N.1)和ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK(SEQ ID N.2)作为ALK底物特别有效，表现出高于多聚Glu/Tyr的磷酸化程度，多聚Glu/Tyr是一种随机多聚物，已知它对于多数酪氨酸激酶是优良的底物。因此本发明的第一个目标是具有选自SEQ ID N.1和SEQ ID N.2的氨基酸序列的肽。
本发明还有的的目标是检测ALK酪氨酸激酶活性的方法，其大致包括步骤：
i)将ALK蛋白质或其功能衍生物与选自SEQ ID N.1及2的肽在适于肽磷酸化的条件下孵育；
ii)检测所形成的磷酸化的肽。
如此处所使用“ALK功能衍生物”指ALK蛋白质的任何修饰形式，例如其保持着未修饰ALK的催化活性的截短或缀合的形式或其片段。功能衍生物应优选含有跨越ALK序列(Q9UM73)中1116-1392残基的ALK完整的催化结构域。优选使用从残基Leu1073延伸到Ala1459的ALK蛋白质的部分。当通过重组基因技术使用基于杆状病毒的表达系统产生时，ALK片段表现出正确的折叠(通过圆二色性谱证实)和有效的催化活性。
此外，可以使用含有ALK组成性活性形式的制品代替纯化的蛋白质或其功能性衍生物。此种制品优选地是细胞裂解液，通过用不同的化合物处理表达ALK的细胞进而评估细胞胞裂解液中ALK激酶的活性，细胞裂解液可用于a)评估表达ALK或者ALK融合蛋白的全细胞中的ALK活性和b)评估潜在抑制剂对细胞内ALK的效果。
为了检测步骤ii)中的磷酸化的肽，步骤i)中的磷酸化反应可以在放射性试剂(例如[γ32P]ATP或者[γ33P]ATP)存在的情况下进行，从而形成了通过放射分析技术容易检测的放射性产物。另外，可以实施免疫反应，该反应括形成磷酸化肽和抗磷酸化酪氨酸抗体之间的免疫复合物。该抗磷酸化酪氨酸的抗体可以是放射性标记的或者与诸如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或者葡萄糖氧化酶之类的报告酶缀合，因此能够通过测定特异的放射性或者酶活性直接检测抗体并由此检测磷酸化肽。还可另选的是，通过识别抗磷酸化酪氨酸抗体并且带有放射性标记或者报告酶的次级抗体，或者通过识别生物素标记的抗磷酸化酪氨酸抗体的链霉亲和素缀合酶，间接检测抗磷酸化酪氨酸的抗体。
在本发明一个优选的实施方案中，提供了检测ALK酪氨酸激酶活性的方法，其包含步骤：
a)使SEQ ID N.1或者2中的肽附着于固相上；
b)将固相和从Leu1073至Ala1459的ALK片段在适宜酪氨酸磷酸化的条件下孵育；
c)洗涤固相；
d)将固相和抗磷酸化酪氨酸的抗体(初级抗体)在适宜抗原-抗体结合的条件下孵育；
e)洗涤固相；
f)将固相与能够识别抗磷酸化酪氨酸初级抗体的酶缀合抗体(次级抗体)在适于初级抗体与次级抗体结合的条件下孵育，以致形成三元免疫复合物；
g)洗涤固相；
h)测定免疫复合物的酶活性，其中测定的活性与酪氨酸磷酸化的数量成比例。
该测定法是完全基于ELISA的激酶测定法，它利用了酶-抗体缀合物。缀合的酶裂解底物以产生有色反应产物，该产物可通过测定有色溶液的吸收来进行分光光度法检测，其与磷酸化酪氨酸的数量成比例。
根据本发明，能够使用的固相或支持物包括塑料材料(反应板、孔、瓶)、聚苯乙烯、橡胶和磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅表面等。
基于ELISA的ALK测定法优选用于筛选能够调节ALK酪氨酸磷酸化活性的化合物，特别是用于筛选ALK抑制剂。
因此本发明的一个优选实施方案涉及用于鉴定能够调节ALK酪氨酸激酶活性的化合物的方法，其中在存在候选化合物或者已知刺激或者抑制ALK酪氨酸激酶活性的化合物(对照)的条件下进行上述的ALK测定法。具体而言，用于鉴定能够调节ALK酪氨酸激酶活性的化合物的方法包含步骤
i)将ALK蛋白质或者它们的功能衍生物与选自SEQ ID N.1或者2，(优选SEQ ID N.1)、的肽在候选化合物存在并在适于肽磷酸化的条件下孵育；
ii)定量所形成的磷酸化的肽。
抑制ALK活性的化合物选作潜在的治疗剂，用于治疗ALK相关肿瘤，例如间变性大细胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤。可比较候选化合物和同候选化合物相同的条件下进行测定的参考化合物(对照)的ALK调节活性。
当筛选其它化合物的ALK抑制活性时，证明在0.2-0.3μM浓度下是有效的ALK抑制剂的星形孢菌素(Meggio F.等，Eyr.J.Biochem.(1995)234，317-322)，可用作阳性对照。
分子建模研究就改进星形孢菌素对ALK蛋白质的亲和性和特异性所需的取代模式提供了重要的指示。最有效的结构表示为下面的通式(I)：
其中R1和R2相互独立地选择于卤素(优选为氯)、苯基或者C1-C3烷基(任选被一个或多个卤素取代)；R3为羟基；R4为羟基或者羟甲基；R5为C1-C3烷基(任选地卤代)或者苯甲基。
式(I)中的化合物能够拮抗ATP与致癌融合蛋白的ALK酪氨酸激酶结构域的结合，致癌融合蛋白例如有NPM-ALK、ATIC-ALK、CTLC-ALK、TFG-ALK或者其它个别的与原肌球蛋白融合的蛋白。因此，它们可以用于制备治疗ALK相关肿瘤(特别是间变性大细胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤)的药物。
如此处所公开的，在本发明的另一实施方案中，化合物(I)用于筛选ALK抑制剂的ALK测定法中。使用本发明的ALK测定法还可以进行高通量筛选。
根据另一方面，本发明涉及用于进行上述ALK测定的试剂盒。试剂盒由预定比例的试剂组合包装而成。通常，试剂盒含有SEQ ID N：1或2的肽(任选固定于固相)，抗磷酸化酪氨酸的抗体和用酶或者放射性标记的抗体(如果需要的话)。此外，试剂盒可以含有用于显色或放射性反应的试剂、缓冲液、诸如星形孢菌素或其衍生物之类的对照、稀释剂、去污剂、稳定剂和任何对于建立和开展测定法有用的其它组分。为了最优化测定的灵敏度，可以改变各种试剂的相对量。具体而言，可以以固体或者液体制品提供试剂，例如溶液、悬浮液、分散液、干粉、冻干制品。试剂盒组分以单个或分开的容器提供。试剂盒还可以包含开展测定的说明书。
附图说明
图1：带有His标签的重组ALK的纯化和活性
A)10％SDS-PAGE凝胶的银染色显示标准(M)、欲上样到HiTrap柱的已透析并合并的DEAE柱级分(上样)、HiTrap柱级分(数字表示级分编号)。B)纯化的ALK的放射性自磷酸化分析。泳道1：32P标记的rALK的放射自显影。泳道2：与泳道1同一样品的银染色。
图2：ALK激酶对肽的动力学
图3：使用基于ELISA的激酶测定法检测rALK活性
A)肽SEQ ID N.2被纯化的rALK的磷酸化。在含有或不含有0.5μg纯化rALK，含有或不含有15μg SEQ.ID N.2肽，30℃反应30分钟的条件下进行ELISA激酶反应。图显示450nm的吸光度。B)ALK肽底物磷酸化的动力学。使用206μM肽SEQ.ID N.2或者42μM肽SEQ.ID N.1与0.1μg纯化rALK进行ELISA激酶反应。在0、0.5、2、5、10和15分钟后加入EDTA终止反应。
图4：肽底物浓度对磷酸化水平的影响
在0.2μg纯化rALK和0-105μM肽SEQ ID N.1(A)或者0-315μM肽SEQ ID N.2(B)存在的条件下进行ELISA测定，反应在30℃持续15分钟。
图5：rALK浓度对底物磷酸化的影响
使用206μM肽SEQ ID N.2或者42μM肽SEQ ID N.1和0-225ng范围内的rALK进行ELISA测定，反应在30℃持续15分钟。
图6：星形孢菌素对rALK活性的抑制
在0-5μM星形孢菌素或者相等体积的溶剂(DMSO)存在的条件下，使用42μM肽SEQ ID N.1、20ng rALK，在30℃反应15分钟进行ELISA测定。图示按未处理对照标准化的A450。
实验结果
肽的合成
使用Applied Biosystems Model 431A合成仪，通过利用9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学的自动固相合成，在4-羟甲基-共聚苯乙烯(copolystirene)-1％二乙烯基苯树脂(0.95mmol/g，0.05mmol)上合成肽。
Fmoc氨基酸(0.5mmol)被2-(1H-苯并三唑-1-yl)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)(1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(1当量)在DIPEA(2当量)存在的条件下激活。
在含有5ml三氟乙酸、0.375克苯酚、0.125μl 1，2-二巯基乙烷、0.250μl苯甲硫醚和0.25μl水的混合物中裂解和脱保护肽酰树脂(100mg)，反应进行2小时。将反应混合物过滤到含有预冷至0℃的乙醚的管中。离心分离沉淀的肽并用新鲜乙醚洗涤。
将粗制的肽(50-100mg于10ml水中)泵入制备型RP-柱上(prepNova-Pak HR C18，6μm，25×10mm，Waters)并用10％-45％线性梯度的乙腈以12ml/分钟的流速进行洗脱。
通过在5μm，C18Symmetry 300柱，4.6×250mm(Waters)，使用在0.1％三氟乙酸中的线性梯度的乙腈以1ml/分钟的流速进行分析型RP-HPLC，判定肽的纯度为＞90％。通过使用基质辅助的激光解吸离子化飞行时间(matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-flight)质谱仪(MALDI-Tof)(Maldi-1；Kratos-Schimadzu，Mancester，UK)的质谱证实肽的分子量。
重组ALK的产生和纯化
将从氨基酸Leu1073到Ala1459的ALK的一部分克隆到杆状病毒转移载体、pBlueBacHis2C(Invitrogen)中。使用该载体和MaxBac2.0杆状病毒表达系统(Invitrogen)，产生了重组杆状病毒并且在Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))昆虫细胞中表达了重组ALK(rALK)蛋白质。该蛋白质具有一个49kDa的理论分子量并且含有融合6个组氨酸-标签(His标签)的预测的ALK(Ile1116-Val1392)催化结构域。通过对全细胞裂解液进行抗磷酸化酪氨酸的免疫印迹和体外放射性激酶分析证实了带有His标签的rALK的自磷酸化活性，该活性是正确折叠的指示。
为了产生用于纯化的蛋白质，用重组的病毒以5的感染复数(MOI)感染Sf9细胞。将培养物在27℃下培养3天然后通过在4℃下400g离心10分钟进行收获。将细胞沉淀贮存于-80℃备用。为了裂解细胞，将细胞沉淀重新悬浮于含有50mM Tris-HCl pH 8、20mM NaCl和蛋白酶抑制剂(抑胃酶肽、苯甲脒、亮抑酶肽和抑酶肽)的低渗缓冲液(缓冲液A)中。在冰上孵育30分钟后，将细胞悬浮液在4℃下1500g离心15分钟并且将上清液用0.45μm的滤器过滤。然后使用AKTK FPLC系统(Amersham-Pharmacia Biotech)在缓冲液A存在的条件下，以1.5ml/分钟的流速将滤液上样到80ml阴离子交换Fast Flow DEAE-sephorose(Sigma)柱上。用从20-200mM的NaCl梯度将结合的蛋白质洗脱下来。通过免疫印迹分析级分中是否存在ALK蛋白质。合并阳性级分并在1升天然结合缓冲液(20mM磷酸钠pH7.8、500mM NaCl和PI)中于4℃下透析3小时，每小时换一次缓冲液。然后将透析后的级分上样到HiTrapTM镍亲和层析柱(Amersham-Pharmacia Biotech)上，该柱预先用添加50mM咪唑和20mM β-巯基乙醇的天然结合缓冲液平衡。对于柱子使用0.5-1ml/分钟的流速。当用天然结合缓冲液洗涤柱子后，用50-200mM的线性梯度的咪唑将结合蛋白质洗脱下来。然后通过SDS-PAGE和银染色分析级分中是否存在rALK及其纯度。图1A显示的是rALK纯化的实例。
最后，将阳性级分用50mM Tris pH 7.4、100mM NaCl、10％甘油、20mM β-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂透析并贮存于-80℃备用。为了证实纯化的rALK是有活性的，我们进行了放射性自磷酸化分析。含有20μl rALK阳性级分、6μM冷的ATP、1.2mM DTT、10μCi[γ-32P]ATP、25mM HepespH 7.5、10mM MgCl2和10mM MnCl2的反应混合物在30℃孵育30分钟。通过加入Laemmli缓冲液并在95℃加热5分钟终止反应。样品在10％SDS-PAGE凝胶中进行分离并将其转移到ImmobilonTM-P膜上。如图1B所示，通过放射自显影显示出放射性标记的蛋白质。
肽磷酸化(放射性分析)
在30μl含有50mM Tris/HCl pH 7.5、5mM MnCl2、10μμM钒酸钠，30μM[γ32P]ATP或者[γ33P]ATP(比活性1000cpm/pmol)和10单位rALK[定义每分钟转移1pmol磷酸至多聚GluTyr(0.1mg/ml)的酶量为1个单位]的介质中磷酸化肽和随机多聚体多聚Glu/Tyr(1∶4)。在30℃孵育10分钟后将25μl混合物点到P81磷酸纤维素纸上以终止反应，其操作如别处所述(1)。通过GraphPad Prism软件使用非线性回归将数据直接拟合米曼(Michaelis-Menten)方程来决定动力学常数。
结果
来源于ALK参考序列的、含有Tyr-1278的肽是rALK的优选底物，而含有Tyr-1282或者Tyr-1283的肽受酶的影响较弱(见图2)。Tyr-1278衍生物的磷酸化效率甚至比具有三个Tyr残基的肽表现的更高(表I)。为了证实Tyr-1278衍生物是ALK催化结构域最佳的肽底物，我们比较了它与多聚Glu/Tyr(1∶4)的磷酸化程度，多聚Glu/Tyr(1∶4)是一种随机多聚体并且对于大多数酪氨酸激酶而言为非常好的底物。表II显示Tyr-1278衍生物是一个比多聚Glu/Tyr更好的ALK底物。
表I
  rALK对于合成肽的动力学常数肽ARDIYRASYYRKGGCAMLPVKARDIVRASFFRKGGCAMLPVK Vmax(pmol/分钟)99.5186.3 Km(μM)90.5109.4 效率(Vmax/Km)1.11.7
表II
模型底物被ALK催化结构域磷酸化的速率
多聚(Glu/Tyr)和肽的浓度分别为0.1mg/ml和400μM。酶浓度为10单位。报导的数值为3次独立实验的平均值。S.E.M.数值始终小于14％。
 底物多聚(Glu/Tyr)ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK基于ELISA的体外激酶测定法  磷酸化程度(pmol/分钟)10.030.3
用含有以不同浓度存在于PBS中的ALK肽底物(SEQ ID N.1或者SEQ ID N.2)的包被溶液于37℃过液孵育Nunc Immuno 96孔板(125μl/孔)。然后用200μl洗涤缓冲液(PBS-Tween 0.05％)进行洗涤并且在37℃放置至少2小时使其干燥。通过将激酶缓冲液(25mM Hepes pH 7.5、5mM MnCl2、5mM MgCl2)，0.3mM ATP和不同浓度的纯化的rALK以100μl/孔的总体积在30℃下孵育15分钟来进行激酶反应。然后将反应混合物去除并用200μl洗涤缓冲液将孔洗涤5次。使用100μl/孔的用PBS+4％BSA进行1∶500稀释的鼠单克隆抗磷酸化酪氨酸的抗体(克隆4G10UpstateBiotech Ltd)来检测磷酸化的肽。当在室温孵育30分钟后将抗体去除并且如上所述将孔进行洗涤。每孔加入100μl用PBS+4％BSA 1∶1000稀释的次级抗体(抗鼠IgG，辣根过氧化物酶耦联的完整抗体，来源于绵羊，Amersham Pharmacia Biotech)，并且将板在室温下再次孵育30分钟，然后如上进行洗涤。将板子用100μl/孔的TMB底物溶液(Endogen)进行显色并且通过加入等体积的0.18M H2SO4终止反应。最后，使用Ultrospec300分光光度计(Amersham-Pharmacia Biotech)读取450或者490nm下的吸光度。
结果
我们已经证明基于ELISA的激酶测定法能够用来检测磷酸化的ALK肽底物(SEQ ID N.1和N.2)并且因此能够检测纯化的rALK的活性。在起始的实验中，我们在纯化的rALK和底物SEQ ID N.2都存在或都缺乏的条件下进行测定以便决定是否能观察到450nm吸光度(A450)特异的增加(图3A)。在rALK和底物都存在时确实观察到A450急剧增加。相反，缺乏肽或者rALK或者两者时，A450是低的，表明有低水平的背景吸光度。为了确定底物磷酸化的动力学，我们在各种不同的孵育时间之后测定了A450值(图3B)。两个肽的反应动力学相似，都在10分钟后达到最大的磷酸化。
为了比较在ELISA激酶测定中两个肽的效率和确定所使用肽的最佳浓度，我们制作了两个肽的标准曲线。结果表明随着肽底物量的增加A450增加了并且因此rALK激酶活性增加了。对于肽底物SEQ ID N.2，A450最大值因而也是磷酸化的最大值出现在大约200μM处，与此相比较对于肽底物SEQ ID N.1只在25μM时就达到最大值(图4A和B)。这表明肽底物SEQ ID N.1是一个更有效的rALK底物。
为了观察激酶活性的抑制，有必要使用恰当浓度的酶，即标准曲线的线性范围内的浓度。使用206μM SEQ ID N.2或者42μM SEQ ID N.1和0-220ng范围内的rALK进行ELISA反应。对于两个底物的线性范围大约介于0-15ng之间的rALK，在这之后曲线达到了平台(图5)。
使用42μM肽底物SEQ ID N.2评估了抑制剂星形孢菌素对rALK活性的影响。同时进行了含有相应浓度的DMSO的溶剂对照实验。星形孢菌素显著抑制rALK活性，在1μM时达到了最大抑制，并且估计的IC50为300nM(图6)。单独的溶剂(DMSO)对rALK活性没有显著的影响。
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<160>2
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>合成肽
<400>1
Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Phe Phe Arg Lys Gly Gly Cys Ala
1                5              10                      15
Met Leu Pro Val Lys
            20
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>合成肽
<400>2
Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Cys Ala
1                5                   10                  15
Met Leu Pro Val Lys
             20

Claims (20)

1.检测ALK酪氨酸激酶活性的方法，其包含以下步骤：
i)将ALK蛋白质或者它们的功能衍生物与选自SEQ ID N.1或者2的肽底物在适于肽磷酸化的条件下孵育；
ii)检测磷酸化的肽。
2.根据权利要求1的方法，其中肽具有SEQ ID N.1的序列。
3.根据权利要求1的方法，其中使用纯化的ALK蛋白质或者含有ALK的制品。
4.根据权利要求3的方法，其中所述制品是细胞裂解液。
5.根据权利要求1的方法，其中所述功能衍生物含有跨越ALK序列1116-1392残基的完整ALK催化结构域。
6.根据权利要求5的方法，其中所述功能衍生物是从残基Leu1073到Ala1459的ALK蛋白质片段。
7.根据权利要求6的方法，其包含步骤：
a)将SEQ ID N.1或者2的肽附着于固相；
b)将固相与所述ALK片段在适宜酪氨酸磷酸化的条件下孵育；
c)洗涤固相；
d)将固相与抗磷酸化酪氨酸的抗体(初级抗体)在适宜抗原-抗体结合的条件下孵育；
e)洗涤固相；
f)将固相与能够识别初级抗体的酶缀合抗体(次级抗体)在适于初级抗体与次级抗体结合的条件下孵育，以致形成三元免疫复合物；
g)洗涤固相；
h)测定免疫复合物的酶活性，其中测定的活性与酪氨酸磷酸化的数量成比例。
8.根据权利要求7的方法，其中与抗体缀合的酶是辣根过氧化物酶。
9.根据权利要求7的方法，其中酶活性是通过比色反应检测的。
10.根据先前任一项的权利要求的方法，用于鉴定调节ALK酪氨酸激酶活性的化合物。
11.根据权利要求10的方法，其包含步骤：
i)在存在候选化合物(a)时，将ALK蛋白质或其功能衍生物与选自SEQ ID N.1或者2的肽在适于肽磷酸化的条件下孵育；
ii)检测因此而形成的磷酸化的肽。
12.根据权利要求10或11的方法，其中比较候选化合物的ALK调节活性与同候选化合物相同的条件下进行测定的参考化合物的ALK调节活性。
13.根据权利要求12的方法，其中参考化合物是星形孢菌素。
14.根据权利要求12的方法，其中参考化合物是具有通式(I)的星形孢菌素衍生物：
Figure A2004800060180003C1
其中R1和R2相互独立地选自优选为氯的卤素、苯基或者任选被一个或多个卤素取代的C1-C3烷基；R3为羟基；R4为羟基或者羟甲基；R5为任选被卤素取代的C1-C3烷基或者苯甲基。
15.选自SEQ ID N.1或2的用作ALK底物的肽。
16.根据权利要求15的肽，它是SEQ ID N.1。
17.根据权利要求15或者16的肽用于测定ALK酪氨酸激酶活性的用途。
18.根据权利要求14式(I)的化合物的用途，用于制备治疗ALK相关肿瘤，特别是间变性大细胞淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤的药物。
19.用于检测根据权利要求1-14的ALK酪氨酸激酶活性的试剂盒，其中含有SEQ ID N：1或者2的肽和抗磷酸化酪氨酸的抗体。
20.根据权利要求19的试剂盒，其含有选自比色反应试剂、缓冲液、稀释剂、去污剂、稳定剂、根据权利要求14的星形孢菌素或其衍生物的额外组分。
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