CN101955995A - 淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒,通过对淋巴瘤相关的融合基因API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK设计引物和探针,将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物,与逆转录PCR扩增产物杂交,加入链霉亲和素藻红蛋白后,可检测出不同微球的荧光信号,从而确定待检测样品中是否含有淋巴瘤相关的融合基因及融合基因的表达状况。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点,能够对多种淋巴瘤融合基因同时进行定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断检测技术领域,具体涉及多种淋巴瘤相关的融合基因的液相芯片联合检测方法及其诊断试剂盒。
背景技术
淋巴瘤是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤,可分为霍奇金病(HD)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)两大类,目前已成为最常见的十大恶性肿瘤之一。组织学可见淋巴细胞和(或)组织细胞的肿瘤性增生,临床以无痛性、进行性淋巴结肿大为主要表现。
黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤是一种原发于淋巴结外的恶性淋巴瘤,其发生率约占整个淋巴瘤的40%,其中以胃肠道MALT淋巴瘤最常见。API2-MALT1是MALT淋巴瘤染色体易位产生的融合基因,在约50%的MALT淋巴瘤中可被发现,目前被看作MALT淋巴瘤特征性的遗传学改变。目前发现API2-MALT1融合基因形成的变异体主要有API2-MALT1(A1446-M541)、API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150);其中API2-MALT1(A1446-M541)相对较少,只占9%左右。
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是非霍奇金淋巴瘤的一种独立类型,常呈间变性特征,是一种高度恶性淋巴瘤,5年生存率为52%。约60%-85%左右间变性大细胞淋巴瘤病例表达间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合蛋白,这是由于2号染色体上的ALK基因位点的畸变所致。NPM-ALK是间变性大细胞淋巴瘤中染色体易位而形成的最常见的融合基因,由位于5号染色体上的核仁磷酸蛋白(NPM)基因与位于2号染色体的ALK基因相融合形成。
当前国内外广泛使用的分子生物学检测淋巴瘤融合基因的方法中,荧光原位杂交技术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂;荧光定量PCR存在着检测通量的局限性,所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种检测方法,能够迅速、稳定、准确地对白血病的多种融合基因进行联合并行检测,液相芯片(xMAP)技术正是这样一种新型检测技术。
液相芯片能够对少量样本进行定性、定量检测,具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的,在微球的制造过程当中,掺入了两种不同的红色分类荧光,根据这两种荧光的比例不同,把球形基质分为100种,可以标记上100种不同的探针分子,能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。根据检测物的不同,微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针,在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球,这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后,通过微流体技术将微球排成单列快速流经液相芯片检测仪,每个微球可同时被两束激光检测到,红色激光激发微球上的红色分类荧光,将各个不同的反应区分开来而定性;绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时,两束激光所激发的光均可被检测到。最后,通过计算机的高速数字信号处理器,可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度,从而确定检测物的种类和数量。
本发明基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点,对淋巴瘤相关的多种融合基因进行联合检测,能够在临床检测上得到更好的应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒。该方法及试剂盒包含对API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK多种融合基因联合检测,可以对淋巴瘤进行临床分型,同时对患者进行疗效观察、预后及微小残留疾病进行动态监测。本检测方法及诊断试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。
为解决上述技术问题,在本发明的一方面,提供一种淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法,包括以下步骤:
(1)包含多种不同荧光编码的羧基微球beads;每种微球上分别共价结合针对淋巴瘤中染色体易位形成的多种融合基因的mRNA所设计的特异性核酸探针;所述的淋巴瘤中染色体易位形成的多种融合基因包含以下任意一种基因或任意组合的多种基因:API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK;即所述的多种融合基因可以是API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK中的任意一种或加上其它基因,也可以是API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK中的任意两种基因组合或加上其它基因,也可以是API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK中的任意三种基因组合或加上其它基因,也可以是API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK四种基因组合或加上其它基因;
(2)针对不同淋巴瘤类型中染色体易位所形成的多种融合基因的mRNA,分别设计上下游引物,对不同的融合基因mRNA,通过逆转录PCR扩增出相应的产物;
(3)含有特异性核酸探针的微球与融合基因mRNA的逆转录扩增产物杂交后,加入链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE),通过液相芯片法xMAP检测荧光信号;
(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较,从而确定检测样品中是否含有淋巴瘤相关的融合基因,和/或样品中融合基因的表达状况。
以上检测方法的步骤(1)中所述的微球是平均直径为5.6μm,结合了不同荧光染料的聚苯烯微球,即色彩编码微球(color-coded beads);
步骤(1)中,所述的共价结合于微球上的针对淋巴瘤中染色体易位形成的多种融合基因的mRNA所设计的特异性核酸探针,包括如下序列(其中5’端含氨基修饰):
API2-MALT1(A1446-M814):5’-AminolinkerC12 GCTTTGATTCTTTTTCCTCAG-3’,如SEQ ID NO.1所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):5’-AminolinkerC12 CCAAGATTATTTAATTCATTTG-3’,如SEQ ID NO.2所示;
API2-MALT1(A1446-M1150):5’-AminolinkerC12 TGCTCTTTATTATTTGATTCTT-3’,如SEQ ID NO.3所示;
NPM-ALK:5’-AminolinkerC12 CCTATAGTTGTTTTAAATGC-3’,如SEQ ID NO.4所示;
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列;
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85%的序列;
或者与上述序列的碱基互补序列;
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
步骤(2)中,所述的针对不同融合基因的mRNA所设计的上下游引物,包括如下序列(其中上游引物5’端含生物素标签):
API2-MALT1(A1446-M814):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.5所示;下游引物5’-TTGGGAAGTTGGTTCAACACAG-3’,如SEQ IDNO.6所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG3’,如SEQ ID NO.7所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
API2-MALT1(A1446-M1150):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.9所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.10所示;
NPM-ALK:上游引物5’-biotin TGTTGCCCAGATTGGACTCTT-3’,如SEQ ID NO.11所示;下游引物5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACAG-3’,如SEQ ID NO.12所示;
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列;
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85%的序列;
或者与上述序列的碱基互补序列;
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
步骤(4)中,所述的内参基因β-actin基因的引物和探针序列如下:
上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’,如SEQ ID NO.13所示;
下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’,如SEQ ID NO.14所示;
探针5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’,如SEQ ID NO.15所示;
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列;
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85%的序列;
或者与上述序列的碱基互补序列;
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
在本发明另一方面,提供一种检测淋巴瘤相关的多种融合基因的诊断试剂盒,包含共价结合了淋巴瘤融合基因mRNA特异性探针的微球混合物、结合了β-actin基因探针的微球、淋巴瘤融合基因mRNA的上下游引物、β-actin基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白Streptavidin-PE、质控品(阴性对照和阳性对照)。
以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照,其中阳性对照为含有各种淋巴瘤相关的融合基因质粒的混合液(包括含β-actin基因的质粒),阴性对照品为不含有淋巴瘤相关的融合基因及β-actin基因的质粒;所述的微球混合物,根据不同检测样品的需要自由组合。
本发明的另一方面,提供一种检测淋巴瘤相关的多种融合基因的诊断试剂盒在检测体外样品,对淋巴瘤进行分型,早期诊断,疗效观察,预后与微小残留疾病的动态监测中的应用。
由于本发明利用了液相芯片技术,使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点,能够对淋巴瘤相关的融合基因进行定性和定量检测,能在临床检测上得到更好的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明,但并不能理解为对本发明的限制。所述的实施例只提供阐明核酸探针、试剂盒及其制作和应用方法而不为其所限制。期间各种变化形式在本发明和所述的权项的范围内是可预期的。
实验材料:
引物和探针均由invitrogen公司合成;Trizol购自invitrogen公司;逆转录cDNA合成试剂盒购置于Fermentas公司;多重PCR试剂盒、不同编号的微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于QIAGEN公司;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购置于Pierce公司;2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂酰基氨酸钠(Sarkosyl)、四甲基氯化铵(TMAC)均购置于sigma公司。
缓冲液和杂交液的配制:
偶联缓冲液,pH4.5 250ml
MES 4.88g;
1.5×TMAC杂交溶液 250ml
5M TMAC 225ml
20%Sarkosyl 1.88ml
1M Tris-HCl,pH8.0 18.75ml
0.5M EDTA,pH8.0 3.0ml
H2O 1.37ml;
1.5×TMAC杂交溶液 250ml
5M TMAC 150ml
20%Sarkosyl 1.25ml
1M Tris-HCl,pH8.0 12.5ml
0.5M EDTA,pH8.0 2.0ml
H2O 84.25ml;
TE缓冲液,pH8.0 500ml
1M Tris-HCl,pH8.0 5ml
0.5M EDTA,pH8.0 1ml
H2O 444ml
实施例1:1种淋巴瘤相关的融合基因的液相芯片检测方法
具体的检测方法包括如下步骤:
一.检测API2-MALT1(A1446-M1123)融合基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针:
API2-MALT1(A1446-M1123):5’-AminolinkerC12 CCAAGATTATTTAATTCATTTG-3’,如SEQ ID NO.2所示;
β-actin基因:5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’,如SEQ IDNO.15所示;
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为25、64号的2种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温;
2.2用dH2O分别溶解API2-MALT1(A1446-M1123)、β-actin的寡核苷酸探针,浓度为1mM(1nmol/μl);
2.3分别全速涡旋编号为25、64号的2种羧基微球储存悬液至少3min,产生均一的微球悬液;
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到两个离心管中;
2.5 10,000g,离心,1-2min;
2.6移除上清液,用50μl 0.1M MES,pH4.5的偶联缓冲液,重悬微球,涡旋震荡20秒;
2.7将两种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释,使其浓度为0.1nmol/μl;
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里,涡旋混合;
2.9用dH2O配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意:保持EDC粉末干燥,便于下一步EDC的使用);
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到两种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀;
2.11室温避光孵育30min;
2.12用dH2O配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意:EDC粉末如果潮解,则应丢弃,建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末);
2.13两种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液,涡旋混匀;
2.14室温避光孵育30min;
2.15两种偶联微球中各加入1ml 0.02%Tween-20;
2.16 10,000g,离心,1-2min;
2.17移除上清,分别用1ml 0.1%SDS重悬两种偶联微球,振荡混匀;
2.18 10,000g,离心,1-2min;
2.19移除上清,分别加入100μl TE,pH8.0,涡旋混合20s,重悬微球;
2.20用细胞计数器计数两种偶联了寡核苷酸探针的微球;
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释;
b.涡旋震荡充分混匀;
c.取10μl到细胞计数器上;
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量;
e.微球/μl=(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球,如下列:分别为API2-MALT1(A1446-M1123)探针微球25、β-actin探针微球64,等比例混合,各种微球的终浓度为1500个/μl,2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-5号患者的临床样本为非霍奇金淋巴瘤(NHL)的冰冻组织块,其中包括黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)患者的临床样本。1-5号淋巴瘤患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA:
1.将冷冻的组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2.研磨液室温放置5分钟,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3.取上层水相于一新的离心管,按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4.弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下8,000g离心5分钟。
5.小心弃去上清液,然后室温晾干或真空干燥5-10min。
6.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品,55-60℃,5-10min;
7.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-5号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增:
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管,置于冰上,建立下列反应体系;
Total RNA 5~10μg/3μl
Oligo(dT)18 Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
②离心管于70℃温育5分钟,之后迅速取出置于冰中冷却,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
③将离心管放置于冰上,按顺序加入以下反应液;
5×reaction buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
④离心管于37℃温育5分钟;
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl),终体积为20μl;
⑥离心管于42℃反应60分钟;
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应,之后迅速取出置于冰中冷却;
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物:
AAPI2-MALT1(A1446-M1123):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG3’,如SEQ ID NO.7所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
β-actin基因:上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’,如SEQ IDNO.13所示;下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’,如SEQ ID NO.14所示;
2.2多重PCR反应:
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒,体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序:95℃15min;94℃30s,55℃90s,72℃90s,35个循环;72℃10min;4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物;
2.涡旋震荡20s,混匀微球;
3.制备微球工作液,用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。
(注:每个反应需要33μl的微球工作液);
4.涡旋震荡20s,混匀微球工作液;
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液;
6.向每个样品孔内分别加入1-5号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(pH为8.0),总体积为17μl;
7.用排枪上下吸打,温柔混匀反应液;
8.盖上反应盖避免蒸发,在95-100℃下孵育1-3min,使样品中的寡核苷酸去掉二级结构;
9.在杂交温度下孵育反应板15min;
10.制备新鲜的检测混合液,用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液);
11.向每孔加入25μl的检测混合液,用排枪上下吸打,温柔混匀;
12.在杂交温度下孵育5min;
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并:
95℃,1-3min;
杂交温度,forever;
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200,QIAGEN和Luminex公司)上,保持杂交温度,对各反应孔进行检测分析,测定荧光MFI值(平均荧光强度)。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表1所示:
表1
阳性对照 | 3953 | 3076 |
阴性对照 | 85 | 72 |
结果分析如表2所示:
表2
1-5号患者类型均为融合基因API2-MALT1(A1446-M1123)阳性
同时,将患者呈现阳性的融合基因的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比,可得出融合基因的表达状况。
实施例2:2种淋巴瘤相关的融合基因的液相芯片联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤:
一.检测API2-MALT1(A1446-M1123)、NPM-ALK融合基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针:
API2-MALT1(A1446-M1123):5’-AminolinkerC12 CCAAGATTATTTAATTCATTTG-3’,如SEQ ID NO.2所示;
NPM-ALK:5’-AminolinkerC12 CCTATAGTTGTTTTAAATGC-3’,如SEQ ID NO.4所示;
β-actin基因:5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’,如SEQ IDNO.15所示;
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为25、50、64号的3种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温;
2.2用dH2O分别溶解API2-MALT1(A1446-M1123)、NPM-ALK、β-actin的寡核苷酸探针,浓度为1mM(1nmol/μl);
2.3分别全速涡旋编号为25、50、64号的3种羧基微球储存悬液至少3min,产生均一的微球悬液;
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到三个离心管中;
2.5 10,000g,离心,1-2min;
2.6移除上清液,用50μl 0.1M MES,pH4.5的偶联缓冲液,重悬微球,涡旋震荡20秒;
2.7将三种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释,使其浓度为0.1nmol/μl;
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里,涡旋混合;
2.9用dH2O配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意:保持EDC粉末干燥,便于下一步EDC的使用);
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到三种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀;
2.11室温避光孵育30min;
2.12用dH2O配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意:EDC粉末如果潮解,则应丢弃,建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末);
2.13三种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液,涡旋混匀;
2.14室温避光孵育30min;
2.15三种偶联微球中各加入1ml 0.02%Tween-20;
2.16 10,000g,离心,1-2min;
2.17移除上清,分别用1ml 0.1%SDS重悬三种偶联微球,振荡混匀;
2.18 10,000g,离心,1-2min;
2.19移除上清,分别加入100μl TE,pH8.0,涡旋混合20s,重悬微球;
2.20用细胞计数器计数三种偶联了寡核苷酸探针的微球;
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释;
b.涡旋震荡充分混匀;
c.取10μl到细胞计数器上;
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量;
e.微球/μl=(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球,如下列:分别为API2-MALT1(A1446-M1123)探针微球25、NPM-ALK探针微球50、β-actin探针微球64,等比例混合,各种微球的终浓度为1500个/μl,2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-5号患者的临床样本为非霍奇金淋巴瘤(NHL)的冰冻组织块,其中包括黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)患者的临床样本。1-5号淋巴瘤患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA:
1.将冷冻的组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2.研磨液室温放置5分钟,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3.取上层水相于一新的离心管,按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4.弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下8,000g离心5分钟。
5.小心弃去上清液,然后室温晾干或真空干燥5-10min。
6.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品,55-60℃,5-10min;
7.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-5号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增:
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管,置于冰上,建立下列反应体系;
Total RNA 5~10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
②离心管于70℃温育5分钟,之后迅速取出置于冰中冷却,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
③将离心管放置于冰上,按顺序加入以下反应液;
5×reaction buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
④离心管于37℃温育5分钟;
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl),终体积为20μl;
⑥离心管于42℃反应60分钟;
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应,之后迅速取出置于冰中冷却;
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物:
AAPI2-MALT1(A1446-M1123):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG3’,如SEQ ID NO.7所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
NPM-ALK:上游引物5’-biotin TGTTGCCCAGATTGGACTCTT-3’,如SEQ ID NO.11所示;下游引物5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACAG-3’,如SEQ ID NO.12所示;
β-actin基因:上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’,如SEQ IDNO.13所示;下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’,如SEQ ID NO.14所示;
2.2多重PCR反应:
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒,体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序:95℃15min;94℃30s,55℃90s,72℃90s,35个循环;72℃10min;4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物;
2.涡旋震荡20s,混匀微球;
3.制备微球工作液,用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。(注:每个反应需要33μl的微球工作液);
4.涡旋震荡20s,混匀微球工作液;
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液;
6.向每个样品孔内分别加入1-5号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(pH为8.0),总体积为17μl;
7.用排枪上下吸打,温柔混匀反应液;
8.盖上反应盖避免蒸发,在95-100℃下孵育1-3min,使样品中的寡核苷酸去掉二级结构;
9.在杂交温度下孵育反应板15min;
10.制备新鲜的检测混合液,用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液);
11.向每孔加入25μl的检测混合液,用排枪上下吸打,温柔混匀;
12.在杂交温度下孵育5min;
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并:
95℃,1-3min;
杂交温度,forever;
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200,QIAGEN和Luminex公司)上,保持杂交温度,对各反应孔进行检测分析,测定荧光MFI值(平均荧光强度)。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表3所示:
表3
阳性对照 | 3158 | 2917 | 3369 |
阴性对照 | 94 | 101 | 86 |
结果分析如表4所示:
表4
1、3、4号患者类型为融合基因API2-MALT1(A1446-M1123)阳性
2、5号患者类型为融合基因NPM-ALK阳性
同时,将患者呈现阳性的融合基因的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比,可得出融合基因的表达状况。
实施例3:3种淋巴瘤相关的融合基因的液相芯片联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤:
一.检测API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、NPM-ALK融合基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针:
API2-MALT1(A1446-M814):5’-AminolinkerC12 GCTTTGATTCTTTTTCCTCAG-3’,如SEQ ID NO.1所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):5’-AminolinkerC12 CCAAGATTATTTAATTCATTTG-3’,如SEQ ID NO.2所示;
NPM-ALK:5’-AminolinkerC12 CCTATAGTTGTTTTAAATGC-3’,如SEQ ID NO.4所示;
β-actin基因:5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’,如SEQ IDNO.15所示;
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、25、50、64号的4种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温;
2.2用dH2O分别溶解API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、NPM-ALK、β-actin的寡核苷酸探针,浓度为1mM(1nmol/μl);
2.3分别全速涡旋编号为11、25、50、64号的4种羧基微球储存悬液至少3min,产生均一的微球悬液;
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到四个离心管中;
2.5 10,000g,离心,1-2min;
2.6移除上清液,用50μl 0.1M MES,pH4.5的偶联缓冲液,重悬微球,涡旋震荡20秒;
2.7将四种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释,使其浓度为0.1nmol/μl;
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里,涡旋混合;
2.9用dH2O配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意:保持EDC粉末干燥,便于下一步EDC的使用);
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到四种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀;
2.11室温避光孵育30min;
2.12用dH2O配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意:EDC粉末如果潮解,则应丢弃,建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末);
2.13四种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液,涡旋混匀;
2.14室温避光孵育30min;
2.15四种偶联微球中各加入1ml 0.02%Tween-20;
2.16 10,000g,离心,1-2min;
2.17移除上清,分别用1ml 0.1%SDS重悬四种偶联微球,振荡混匀;
2.18 10,000g,离心,1-2min;
2.19移除上清,分别加入100μl TE,pH8.0,涡旋混合20s,重悬微球;
2.20用细胞计数器计数四种偶联了寡核苷酸探针的微球;
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释;
b.涡旋震荡充分混匀;
c.取10μl到细胞计数器上;
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量;
e.微球/μl=(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球,如下列:分别为API2-MALT1(A1446-M814)探针微球11、API2-MALT1(A1446-M1123)探针微球25、NPM-ALK探针微球50、β-actin探针微球64,等比例混合,各种微球的终浓度为1500个/μl,2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-6号患者的临床样本为非霍奇金淋巴瘤(NHL)的冰冻组织块,其中包括黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)患者的临床样本。1-6号淋巴瘤患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA:
1.将冷冻的组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2.研磨液室温放置5分钟,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3.取上层水相于一新的离心管,按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4.弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下8,000g离心5分钟。
5.小心弃去上清液,然后室温晾干或真空干燥5-10min。
6.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品,55-60℃,5-10min;
7.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-6号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增:
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管,置于冰上,建立下列反应体系;
Total RNA 5~10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
②离心管于70C温育5分钟,之后迅速取出置于冰中冷却,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
③将离心管放置于冰上,按顺序加入以下反应液;
5×reaction buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
④离心管于37℃温育5分钟;
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl),终体积为20μl;
⑥离心管于42℃反应60分钟;
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应,之后迅速取出置于冰中冷却;
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物:
API2-MALT1(A1446-M814):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.5所示;下游引物5’-TTGGGAAGTTGGTTCAACACAG-3’,如SEQ IDNO.6所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG3’,如SEQ ID NO.7所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
NPM-ALK:上游引物5’-biotin TGTTGCCCAGATTGGACTCTT-3’,如SEQ ID NO.11所示;下游引物5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACAG-3’,如SEQ ID NO.12所示;
β-actin基因:上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’,如SEQ IDNO.13所示;下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’,如SEQ ID NO.14所示;
2.2多重PCR反应:
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒,体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序:95℃15min;94℃30s,55℃90s,72℃90s,35个循环;72℃10min;4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物;
2.涡旋震荡20s,混匀微球;
3.制备微球工作液,用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。
(注:每个反应需要33μl的微球工作液);
4.涡旋震荡20s,混匀微球工作液;
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液;
6.向每个样品孔内分别加入1-6号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(pH为8.0),总体积为17μl;
7.用排枪上下吸打,温柔混匀反应液;
8.盖上反应盖避免蒸发,在95-100℃下孵育1-3min,使样品中的寡核苷酸去掉二级结构;
9.在杂交温度下孵育反应板15min;
10.制备新鲜的检测混合液,用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液);
11.向每孔加入25μl的检测混合液,用排枪上下吸打,温柔混匀;
12.在杂交温度下孵育5min;
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并:
95℃,1-3min;
杂交温度,forever;
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200,QIAGEN和Luminex公司)上,保持杂交温度,对各反应孔进行检测分析,测定荧光MFI值(平均荧光强度)。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表5所示:
表5
API2-MALT(A1446-M814) | API2-MALT(A1446-M1123) | NPM-ALK | β-actin内参基因 | |
1 | 79 | 92 | 2751 | 3564 |
2 | 105 | 3493 | 98 | 4082 |
3 | 3826 | 84 | 102 | 3659 |
4 | 91 | 108 | 4327 | 3946 |
5 | 2905 | 76 | 85 | 2813 |
6 | 94 | 3618 | 110 | 3257 |
阳性对照 | 2974 | 3152 | 4460 | 3591 |
阴性对照 | 87 | 96 | 113 | 81 |
结果分析如表6所示:
表6
3、5号患者类型为融合基因API2-MALT1(A1446-M814)阳性
2、6号患者类型为融合基因API2-MALT1(A1446-M1123)阳性
1、4号患者类型为融合基因NPM-ALK阳性
同时,将患者呈现阳性的融合基因的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比,可得出融合基因的表达状况。
实施例4:4种淋巴瘤相关的融合基因的液相芯片联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤:
一.检测API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK融合基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针:
API2-MALT1(A1446-M814):5’-AminolinkerC12 GCTTTGATTCTTTTTCCTCAG-3’,如SEQ ID NO.1所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):5’-AminolinkerC12 CCAAGATTATTTAATTCATTTG-3’,如SEQ ID NO.2所示;
API2-MALT1(A1446-M1150):5’-AminolinkerC12 TGCTCTTTATTATTTGATTCTT-3’,如SEQ ID NO.3所示;
NPM-ALK:5’-AminolinkerC12 CCTATAGTTGTTTTAAATGC-3’,如SEQ ID NO.4所示;
β-actin基因:5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’,如SEQ IDNO.15所示;
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、25、37、50、64号的5种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温;
2.2用dH2O分别溶解API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK、β-actin的寡核苷酸探针,浓度为1mM(1nmol/μl);
2.3分别全速涡旋编号为11、25、37、50、64号的5种羧基微球储存悬液至少3min,产生均一的微球悬液;
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到五个离心管中;
2.5 10,000g,离心,1-2min;
2.6移除上清液,用50μl 0.1M MES,pH4.5的偶联缓冲液,重悬微球,涡旋震荡20秒;
2.7将五种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释,使其浓度为0.1nmol/μl;
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里,涡旋混合;
2.9用dH2O配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意:保持EDC粉末干燥,便于下一步EDC的使用);
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到五种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀;
2.11室温避光孵育30min;
2.12用dH2O配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意:EDC粉末如果潮解,则应丢弃,建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末);
2.13五种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液,涡旋混匀;
2.14室温避光孵育30min;
2.15五种偶联微球中各加入1ml 0.02%Tween-20;
2.16 10,000g,离心,1-2min;
2.17移除上清,分别用1ml 0.1%SDS重悬五种偶联微球,振荡混匀;
2.18 10,000g,离心,1-2min;
2.19移除上清,分别加入100μl TE,pH8.0,涡旋混合20s,重悬微球;
2.20用细胞计数器计数五种偶联了寡核苷酸探针的微球;
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释;
b.涡旋震荡充分混匀;
c.取10μl到细胞计数器上;
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量;
e.微球/μl=(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球,如下列:分别为API2-MALT1(A1446-M814)探针微球11、API2-MALT1(A1446-M1123)探针微球25、API2-MALT1(A1446-M1150)探针微球37、NPM-ALK探针微球50、β-actin探针微球64,等比例混合,各种微球的终浓度为1500个/μl,2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-20号患者的临床样本为非霍奇金淋巴瘤(NHL)的冰冻组织块,其中包括黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)患者的临床样本。1-20号淋巴瘤患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA:
1.将冷冻的组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2.研磨液室温放置5分钟,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3.取上层水相于一新的离心管,按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4.弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下8,000g离心5分钟。
5.小心弃去上清液,然后室温晾干或真空干燥5-10min。
6.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品,55-60℃,5-10min;
7.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-20号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增:
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管,置于冰上,建立下列反应体系;
Total RNA 5~10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
②离心管于70℃温育5分钟,之后迅速取出置于冰中冷却,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
③将离心管放置于冰上,按顺序加入以下反应液;
5×reaction buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液,用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底;
④离心管于37℃温育5分钟;
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl),终体积为20μl;
⑥离心管于42℃反应60分钟;
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应,之后迅速取出置于冰中冷却;
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物:
API2-MALT1(A1446-M814):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.5所示;下游引物5’-TTGGGAAGTTGGTTCAACACAG-3’,如SEQ IDNO.6所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG3’,如SEQ ID NO.7所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
API2-MALT1(A1446-M1150):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.9所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.10所示;
NPM-ALK:上游引物5’-biotin TGTTGCCCAGATTGGACTCTT-3’,如SEQ ID NO.11所示;下游引物5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACAG-3’,如SEQ ID NO.12所示;
β-actin基因:上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’,如SEQ IDNO.13所示;下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’,如SEQ ID NO.14所示;
2.2多重PCR反应:
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒,体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序:95℃15min;94℃30s,55℃90s,72℃90s,35个循环;72℃10min;4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物;
2.涡旋震荡20s,混匀微球;
3.制备微球工作液,用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。
(注:每个反应需要33μl的微球工作液);
4.涡旋震荡20s,混匀微球工作液;
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液;
6.向每个样品孔内分别加入1-20号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(pH为8.0),总体积为17μl;
7.用排枪上下吸打,温柔混匀反应液;
8.盖上反应盖避免蒸发,在95-100℃下孵育1-3min,使样品中的寡核苷酸去掉二级结构;
9.在杂交温度下孵育反应板15min;
10.制备新鲜的检测混合液,用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液);
11.向每孔加入25μl的检测混合液,用排枪上下吸打,温柔混匀;
12.在杂交温度下孵育5min;
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并:
95℃,1-3min;
杂交温度,forever;
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200,QIAGEN和Luminex公司)上,保持杂交温度,对各反应孔进行检测分析,测定荧光MFI值(平均荧光强度)。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表7所示:
表7
8 | 87 | 111 | 104 | 3603 | 3347 |
9 | 75 | 3376 | 96 | 88 | 2859 |
10 | 109 | 97 | 115 | 4318 | 3526 |
11 | 3450 | 84 | 99 | 113 | 3078 |
12 | 116 | 4289 | 123 | 94 | 4295 |
13 | 82 | 108 | 91 | 3940 | 3716 |
14 | 95 | 114 | 100 | 3157 | 3481 |
15 | 2724 | 80 | 73 | 89 | 2932 |
16 | 102 | 98 | 3291 | 107 | 3654 |
17 | 79 | 72 | 90 | 2869 | 3278 |
18 | 3956 | 103 | 117 | 109 | 4169 |
19 | 105 | 78 | 85 | 3542 | 3013 |
20 | 88 | 3605 | 81 | 76 | 3982 |
阳性对照 | 3713 | 2849 | 4152 | 3276 | 3547 |
阴性对照 | 95 | 83 | 106 | 91 | 78 |
结果分析如表8所示:
表8
16 | 阴性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 |
17 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 |
18 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
19 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 |
20 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 |
2、5、11、15、18号患者类型为融合基因API2-MALT1(A1446-M814)阳性
1、4、6、9、12、20号患者类型为融合基因API2-MALT1(A1446-M1123)阳性
7、16号患者类型为融合基因API2-MALT1(A1446-M1150)阳性
3、8、10、13、14、17、19号患者类型为融合基因NPM-ALK阳性
同时,将患者呈现阳性的融合基因的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比,可得出融合基因的表达状况。
在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后,本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化,这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。
序列表
<110>江苏迈迪基因生物科技有限公司
<120>淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒
<130>NP-10-14287
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(21)
<400>1
gctttgattc tttttcctca g 21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(22)
<400>2
ccaagattat ttaattcatt tg 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(22)
<400>3
tgctctttat tatttgattc tt 22
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
<400>4
cctatagttg ttttaaatgc 20
<210>5
<211>24
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<400>15
tcattgtaga aggtgtggtg 20
Claims (9)
1.一种淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)包含多种不同荧光编码的羧基微球Beads,每种微球上分别共价结合针对淋巴瘤中染色体易位形成的多种融合基因的mRNA所设计的特异性核酸探针;所述的淋巴瘤中染色体易位形成的多种融合基因包含以下任意一种基因或任意组合的多种基因:API2-MALT1(A1446-M814)、API2-MALT1(A1446-M1123)、API2-MALT1(A1446-M1150)、NPM-ALK;
(2)针对不同淋巴瘤类型中染色体易位所形成的多种融合基因的mRNA,分别设计上下游引物,对不同的融合基因mRNA,通过逆转录PCR扩增出相应的产物;
(3)含有特异性核酸探针的微球与融合基因mRNA的逆转录扩增产物混合杂交,加入链霉亲和素-藻红蛋白Streptavidin-PE后,通过液相芯片xMAP方法检测荧光信号;
(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较,从而确定检测样品中是否存在淋巴瘤相关的融合基因,和/或样品中融合基因的表达状况。
2.如权利要求1所述的淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的微球是平均直径为5.6μm,结合了不同荧光染料的聚苯烯微球,即色彩编码微球Color-coded beads。
3.如权利要求1所述的淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的共价结合于微球上的针对淋巴瘤中染色体易位形成的多种融合基因的mRNA所设计的特异性核酸探针,包括如下序列,其中5’端含氨基修饰:
API2-MALT1(A1446-M814):5’-AminolinkerC12 GCTTTGATTCTTTTTCCTCAG-3’,如SEQ ID NO.1所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):5’-AminolinkerC12 CCAAGATTATTTAATTCATTTG-3’,如SEQ ID NO.2所示;
API2-MALT1(A1446-M1150):5’-AminolinkerC12 TGCTCTTTATTATTTGATTCTT-3’,如SEQ ID NO.3所示;
NPM-ALK:5’-AminolinkerC12 CCTATAGTTGTTTTAAATGC-3’,如SEQ ID NO.4所示;
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列;
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列;
或者与上述序列的碱基互补序列;
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
4.如权利要求1所述的淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的针对不同融合基因的mRNA所设计的上下游引物,包括如下序列,其中上游引物5’端含生物素标签:
API2-MALT1(A1446-M814):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.5所示;下游引物5’-TTGGGAAGTTGGTTCAACACAG-3’,如SEQ IDNO.6所示;
API2-MALT1(A1446-M1123):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG3’,如SEQ ID NO.7所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.8所示;
API2-MALT1(A1446-M1150):上游引物5’-biotin CGTGGAAATGGGCTTTAGTAGAAG-3’,如SEQ ID NO.9所示;下游引物5’-CGCCAAAGGCTGGTCAGTT-3’,如SEQ ID NO.10所示;
NPM-ALK:上游引物5’-biotin TGTTGCCCAGATTGGACTCTT-3’,如SEQ ID NO.11所示;下游引物5’-GCAGCTTCAGTGCAATCACAG-3’,如SEQ ID NO.12所示;
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列;
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列;
或者与上述序列的碱基互补序列;
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
5.如权利要求1所述的淋巴瘤相关的融合基因的联合检测方法,其特征在于,步骤(4)中,所述的内参基因为β-actin基因,其引物和探针序列如下:
上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’,如SEQ ID NO.13所示;
下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’,如SEQ ID NO.14所示;
探针5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’,如SEQ ID NO.15所示;
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列;
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列;
或者与上述序列的碱基互补序列;
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
6.一种检测淋巴瘤相关的融合基因的诊断试剂盒,其特征在于,包含了权利要求1中所述的共价结合了淋巴瘤融合基因特异性探针的微球混合物及结合了β-actin基因探针的微球、权利要求1中所述的淋巴瘤融合基因mRNA的上下游引物及β-actin基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白和质控品。
7.如权利要求6所述的检测淋巴瘤相关的融合基因的诊断试剂盒,其特征在于,所述的微球混合物,根据不同检测样品的需要自由组合。
8.如权利要求6所述的检测淋巴瘤相关的融合基因的诊断试剂盒,其特征在于,所述的质控品包含阳性对照和阴性对照,其中阳性对照为含有各种淋巴瘤相关的融合基因质粒的混合液,包括含β-actin基因的质粒;阴性对照品为不含有淋巴瘤相关的融合基因及β-actin基因的质粒溶液。
9.一种如权利要求6所述的检测淋巴瘤相关的融合基因的诊断试剂盒在检测体外样品,对淋巴瘤进行分型、早期诊断、疗效观察、预后与微小残留疾病的动态监测中的应用。
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CN102888452A (zh) * | 2012-05-18 | 2013-01-23 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种筛查alk融合基因的方法 |
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CN104357558A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-18 | 邵棠 | 焦磷酸测序法同时检测api2-malt1和npm-alk融合基因的引物对及试剂盒 |
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1756850A (zh) * | 2003-03-07 | 2006-04-05 | 国家肿瘤治疗研究中心 | 间变性淋巴瘤激酶测定法、试剂和它们的组合物 |
CN1995386A (zh) * | 2006-08-22 | 2007-07-11 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | Bcr-abl基因荧光定量rt-pcr引物和探针及试剂盒 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN1995386A (zh) * | 2006-08-22 | 2007-07-11 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | Bcr-abl基因荧光定量rt-pcr引物和探针及试剂盒 |
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Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
《中华病理学杂志》 20010228 张铀等 原位杂交对胃粘膜相关组织淋巴瘤的免疫球蛋白轻链的检测 第30卷, 第01期 * |
《中国实验血液学杂志》 20080615 季天海等 ALCL染色体移位的间变性淋巴瘤激酶的表达及其与预后的关系 第16卷, 第03期 * |
《南方医科大学学报》 20080420 李慧灵等 细胞核阵列荧光原位杂交技术检测石蜡包埋间变性大细胞淋巴瘤组织的ALK基因转位及其意义 第28卷, 第04期 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011157222A1 (zh) * | 2010-06-17 | 2011-12-22 | 江苏迈迪基因生物科技有限公司 | 淋巴瘤融合基因的联合检测方法及其诊断试剂盒 |
CN102888452A (zh) * | 2012-05-18 | 2013-01-23 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种筛查alk融合基因的方法 |
CN102888452B (zh) * | 2012-05-18 | 2014-08-27 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种筛查alk融合基因的方法 |
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CN103805686B (zh) * | 2012-11-09 | 2016-05-18 | 益善生物技术股份有限公司 | Ros1融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片 |
CN104357558A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-18 | 邵棠 | 焦磷酸测序法同时检测api2-malt1和npm-alk融合基因的引物对及试剂盒 |
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