JP5578464B2 - 微小管伸長抑制剤をスクリーニングする方法および微小管伸長抑制剤 - Google Patents
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Description
1.CLIP-170のアミノ酸配列において、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸が変異している変異型CLIP-170のポリペプチドであって、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド。
2.以下の1)〜3)から選択される、前項1に記載のポリペプチド:
1)CLIP-170のアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列であり、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンであるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
2)CLIP-170のアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列から選択される部分アミノ酸配列であり、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンであるアミノ酸配列からなり、かつ、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド;
3)上記1)または2)に示すポリペプチドをコードするアミノ酸配列において、311番目以外の位置に1〜5個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド。
3.前記セリンがアラニンに置換している、前項1または2に記載のポリペプチド。
4.AMPKによるCLIP-170のリン酸化を指標とする、AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質のスクリーニング方法。
5.AMPKによるCLIP-170のリン酸化が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンのリン酸化である、前項4に記載のスクリーニング方法。
6.以下の工程を含む前項4または5に記載のスクリーニング方法:
(a)AMPKとCLIP-170とを被検物質の存在下で接触させて、AMPKによるCLIP-170のリン酸化活性を検出する工程;
(b)被検物質の非存在下と比べて、AMPKによるCLIP-170のリン酸化活性を低減させうる物質を選択する工程。
7.AMPKによるCLIP-170のリン酸化活性の検出が、AMPKによりリン酸化されたCLIP-170を特異的に認識する抗体を用いて行われる、前項4〜6のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
8.AMPKによるCLIP-170のリン酸化を指標とする、微小管伸長抑制剤のスクリーニング方法。
9.前項4〜7のいずれか1に記載の方法を用いる、微小管伸長抑制剤のスクリーニング方法。
10.AMPKによりリン酸化されたCLIP-170を特異的に認識する抗体。
11.前項9に記載の抗体を少なくとも含む、AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
12.AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質を有効成分として含む、微小管伸長抑制剤。
13.AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンのリン酸化を阻害する物質である、前項12に記載の微小管伸長抑制剤。
14.AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質が、6-[4-(2-ピペリジン-1-イル-エトキシ)-フェニル)]-3-ピリジン-4-イル-ピラゾロ[1,5-a]-ピリミジンである、前項12または13に記載の微小管伸長抑制剤。
リン酸化CLIP-170を特異的に認識する抗体を用いる手段では、細胞を溶解してウエスタンブロッティングを行う、または、細胞を溶解せず、蛍光標識された抗体などを用いて、in vivo蛍光イメージング装置などにより検出を行うことができる。
1)CLIP-170のアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列であり、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンであるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
2)CLIP-170のアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列から選択される部分アミノ酸配列であり、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンであるアミノ酸配列からなり、かつ、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド;
3)上記1)または2)に示すアミノ酸配列において、311番目以外の位置に1〜5個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド。
(1)実施例にて用いるタンパク質もしくはポリペプチドを作製するためのプラスミド:
以下の各タンパク質もしくはポリペプチドをコードするcDNA断片を、ラットまたはマウス心臓のcDNAライブラリからPCR法を用いて増幅した。
・ラットAMPKα1 (GenBank Accession No. NM_019142)
・マウスCLIP-170 (GenBank Accession No. BC007191)の全長タンパク質
・マウスCLIP-170 (GenBank Accession No. BC007191)の1〜311番目のアミノ酸配列を有する部分ポリペプチド
・マウスCLIP-115 (GenBank Accession No. NM_009990)の全長タンパク質
・マウスCLIP-115 (GenBank Accession No. NM_009990)の1〜399番目のアミノ酸配列を有する部分ポリペプチド
・マウスCLIP-115 (GenBank Accession No. NM_009990)の340〜1012番目のアミノ酸配列を有する部分ポリペプチド
その後、各増幅断片を、pENTR/D-TOPOベクターにGateway Technology(Invitrogen)を用いて挿入した。それぞれベクターをpENTR-WT AMPKα1, pENTR-WT CLIP-170, pENTR-WT CLIP-170 1-331, pENTR-WT CLIP-115, pENTR-WT CLIP-115 1-339, and pENTR-WT CLIP-115 340-1012と称する。
5'-TTTTTAAGAGCTAGCTGTGGCTCGCC-3'(配列番号4)
5'-GCCACAGCTAGCTCTTAAAAATTCAC-3'(配列番号5)
5'-CGAAGCCCTGCTGCCTCCTCCCTCAGCTCCATGAGC-3'(配列番号6)
5'-GGAGGAGGCAGCAGGGCTTCGCTTCAGGCTGGCGGGCG-3'(配列番号7)
5'-AAAGCCAATGCCGAAGGTAAACTGGAGCTCGAGACACTTA-3'(配列番号8)
5'-TTTACCTTCGGCATTGGCTTTCCGAAGCGCATCAAGATCC-3'(配列番号9)
Ser311がAla(アラニン)またはAsp(アスパラギン酸)により置換されたCLIP-170の突然変異体は、鋳型としてCLIP-170-pEGFPと以下のプライマーを使用して、PCR法により作製した(Ala:配列番号10および11、Asp:配列番号12および13)。
5'-CGCAGCCCTGCTGCCTCTTCCCTCAGCTCCATGAGC-3'(配列番号10)
5'-GGAAGAGGCAGCAGGGCTGCGCTTCAGGCTGGCGGACG-3'(配列番号11)
5'-CGCAGCCCTGATGCCTCTTCCCTCAGCTCCATGAGC-3'(配列番号12)
5'-GGAAGAGGCATCAGGGCTGCGCTTCAGGCTGGCGGACG-3'(配列番号13)
Flag融合タンパク質の精製:上記プラスミドでトランスフェクトした293T細胞を、溶解バッファーA(20 mM MOPS、10%グリセロール、0.15 M NaCl、1% CHAPS、1 mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Nacalai Tesque)、50 mMβ-グリセロ燐酸塩、25 mM NaFおよび1 mM Na3VO4、pH 7.4)中で溶解し、4℃で1時間、抗Flag M2アガロース(シグマ)により免疫沈降を行った。ビーズを溶解バッファーAで3回洗浄し、4℃にて1時間、溶出バッファー(20 mMトリス-HCl pH 7.4、10%グリセロール、0.3 mM NaCl、0.1% CHAPS、0.5mg/ml Flagペプチド(シグマ)および1 mM DTT)で溶出した。遠心分離後、上清を組み換えFlag融合タンパク質として使用した。
GST融合タンパク質の精製:上記プラスミドでトランスフェクトしたBL21-AI chemically competent E. coli(Invitrogen)を、20℃で12時間、0.02% L-アラビノースを用いて誘導した。遠心分離して細胞を集め、5mM EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むリン酸塩緩衝食塩水(PBS)にて超音波処理により溶解した。1% トリトンX-100を添加した後、細胞溶解物を4℃で30分間攪拌し、4℃で1.5時間、グルタチオン・セファロース 4 Fast Flow(GE Healthcare UK Ltd., Littele Chalfont, Buckighamshire, England)により吸着させた。3回洗浄後、タンパク質を10 mM 還元グルタチオンで溶出し、Nanosep 10K Device(Pall Life Science, Ann Arbor, MI)を使用して、溶離バッファー中で限外濾過を行った。
(1)組織からのタンパク質粗精製
C57BL/6Jマウス(雌)の心臓を、Polytronホモジナイザー(Kinematica, Bohemia, NY)を使用して、溶解バッファーB(20 mM MOPS pH 7.4、10%グリセロール、0.1% CHAPS、2 mM EDTA、1 mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル)中で磨砕した。磨砕後、終濃度1%になるようCHAPSを加えた。また、ホモジネートは15分間攪拌しながら4℃でインキュベートし、その後10,000×gで30分間、遠心分離を行った。上清をろ過し、カラムバッファーAにより予め平衡に保たれたTSK-GEL SuperQ5PW(7.5×75 mm、TOSOH)陰イオン交換カラム上に負荷した。なおカラムバッファーAは、20 mM MOPS(pH 7.4)、10%グリセロールおよび2 mM EDTAからなる。カラムバッファーAで洗浄した後、タンパク質を0.5 ml/minの流量でNaCl 0〜1 M/60 minの直線濃度勾配(図1a参照)により溶出した。各0.5mlで画分を回収した。各画分の一部50μlをin vtro AMPK活性のアッセイに用いた。
AMPK活性のアッセイのためのタンパク質試料を65℃で20分間予め熱し、0.2 mM AMP、0.8 mM MgCl2、10 mCi/ml [γ-32P]ATP(GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ)の存在下で、30℃で60分間、kinase-dead型(KD)もしくは野生型(WT)のAMPK-cFlagタンパク質とともにインキュベートし、Nanosep 10K Device(Pall Life Science)を使用して、0.1% SDSを含むPBSで限外ろ過を行った。各画分の試料についてSDS-PAGEを行いオートラジオグラフィー(AR)によって視覚化した。
(1)スケールアップして、[γ-32P]ATPの代わりに放射性同位体標識のないATPを使用して、実施例1および2と同様の手順を行った。放射性同位体標識バンドと一致するバンドをゲルから切出し、MALDI-Qq-TOF MS/MSを使用して分析を行った。
(1)リン酸化アミノ酸の分析
CLIP-170-cFlagを[γ-32P]ATPの存在下でAMPK-cFlagとともにインキュベートした。反応物をSDS-PAGEによって分離し、クマシーブリリアントブルー(CBB)により染色し、ARにより視覚化した。放射性同位体により標識されたバンドをゲルから切り出し、トリプシンにより消化した。その後試料を完全に乾燥させ、リン酸化アミノ酸標準を含む5% TFAおよび50% アセトニトリルの中に再懸濁し、薄層セルロースプレート上にスポットした。電気泳動では、pH 1.9のバッファー(0.22%ギ酸および7.8%酢酸)を1次元目に使用し、pH 3.5 バッファー(5%酢酸、0.5%ピリジンおよび0.5mM EDTA)を2次元目に使用した。その後、リン酸化アミノ酸標準をニンヒドリンで染色した。またプレートをARによって分析した。
WT-CLIP-170、S311A CLIP-170、S737A CLIP-170、またはWT CLIP-115と、kinase-dead型(KD)または野生型(WT)のAMPKを用いて、実施例2(2)と同様にしてAMPK活性についてアッセイを行った。各反応後の試料について、SDS-PAGEを行いオートラジオグラフィー(AR)によって視覚化した。
抗原としてCLIP-170の部分ポリペプチド: SLKRSPSASSLS(下線のセリンがリン酸化されている)を使用して常法に従い、リン酸化CLIP-170を認識する抗体(抗p-CLIP-170抗体)のポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体の特異性、感度を確認するために、以下の実験を行った。
実施例4(2)にて使用した試料を用いて、取得した抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。また、Vero細胞を溶解バッファーC(50 mMトリス-HCl pH 7.5、0.01% Brij 35、0.1M NaCl、0.1 mM EGTA、2 mM DTT、2 mM MnCl2、プロテアーゼ阻害剤カクテル、50 mMβ-グリセロリン酸塩、25 mM NaFおよび1 mM Na3VO4)を用いて溶解し、4℃で15分間攪拌して遠心分離をした上清についても、取得した抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。遠心分離後、上清に、20unit/μl λプロテインホスファターゼ(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)あるいは0.5のmM EDTAを添加して、30分間30℃で培養することにより、ホスファターゼ処理を行い、ホスファターゼ処理後の試料についても、取得した抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
(1)Fukataら(Cell 109, 873-885 (2002))の記載に従って、安定してCLIP-170-EGFPを発現するVero細胞を作製した。Vero細胞を、一定の湿度、5% CO2雰囲気下、37℃で、10%ウシ胎仔血清(Equitech-Bio, Kerrville, TX)補充Dulbecco's modified Eagle培地(Sigma-Aldrich)で維持した。目的のVero細胞を1.5 mg/ml Geneticin存在下で選択した。得られた組み換えVero細胞を15時間血清飢餓状態とし、10分間、20μM Compound C(AMPK阻害剤:Calbiochem, San Diego, CA)または、30分間、1 mM AICAR(AMPK促進剤:5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleosid; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)と共にインキュベートした。その後、溶解バッファーAで溶解し、15分間、4℃で攪拌した。遠心分離後、上清についてSDS-PAGEを行い、CLIP-170、ACC、AMPKのリン酸化について、ウエスタンブロッティングを行った。
Vero細胞を15時間、血清飢餓状態とし、10分間、20μM Compound C(AMPK阻害剤)またはコントロールの0.2% DMSOと共にインキュベートした。これらのVero細胞を、コラーゲンコートした35 mmガラスディッシュ上に播種し、温PBSにより一旦洗浄し、-20℃で10分間、100%メタノールで固定し、その後室温(RT)で、5分間、1%パラホルムアルデヒドにより固定した。次に細胞を室温、5分間、0.01%トリトンX-100を含むPBSにより透過性にし、抗CLIP-170C抗体または抗p-CLIP-170抗体、抗αチューブリン抗体で1時間、免疫染色を行った。二次反応については、アレクサ488または568で標識した2次抗体を使用した。EGFP、アレクサ488、アレクサ568の蛍光画像を、PLAPO 100X油浸対物レンズ(オリンパス株式会社)を使用して、冷却CCD CoolSNAP-HQカメラ(Roper Scientific, Tucson, AZ)を備えたOlympus IX-81倒立型蛍光顕微鏡で記録した。
実施例6(2)と同様にして、AMPK siRNAs 50 nmol/lまたはCLIP-170-S311Aのプラスミドでトランスフェクトした。その後、実施例6と同様の方法で、蛍光画像を得た。
Vero細胞を、スクラッチの12時間前に、コラーゲンコートした35mmガラスディッシュ上に密度3×104/cm2で播種した。スクラッチ線をピペットの先端で作り、新鮮な培地で一旦洗浄した。スクラッチ部位の観察と、0.2%コントロールDMSOまたは20μM Compound Cの添加を、2時間ごとに行い、培地を4時間ごとに交換した。実施例6と同様の方法で、12時間後に細胞を固定して、抗γチューブリン抗体で免疫染色した。細胞極性分析のため、スクラッチ線近くの100細胞について、細胞核の中心を支点として、細胞核の中心とスクラッチ線を結ぶ線と、細胞核の中心とγチューブリンとを結ぶ線とのなす角度(θ)を測定した。
Vero細胞を5×104/cm2の密度で、コラーゲンコートした35mmガラスディッシュ上に播種し、Lipofectamine 2000を使用して、WTかS311A CLIP-170-EGFPをトランスフェクトした。24時間後、DICイメージを、ステージ・トップインキュベータシステムONICS、温度・CO2制御ユニットINUG2(東海ヒット社)を備えた、オリンパスIX-81倒立型蛍光顕微鏡で、10分ごとに12時間記録した。細胞軌道の決定は、Time-lapsイメージングにより、MetaMorph 7.1.3.0ソフトウェアを使用して細胞核の中心小体を追跡することにより行った。
Vero細胞を5×103/cm2の密度でコラーゲンコートした35mmガラスディッシュ上に播種し、Lipofectamine 2000を使用してWTかS311A CLIP-170-EGFPをトランスフェクトした。翌日にアクチン、パキシリン抗体にて免疫染色した。また、同様に播種したVero細胞に、5μMのPacritaxelまたは10μMのNocodazoleを添加し、1時間後に同様の抗体にて免疫染色した。
Claims (10)
- CLIP-170のアミノ酸配列において、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸である配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目に相当するセリンがアラニンに変異している変異型CLIP-170のポリペプチドであって、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド。
- 以下の1)〜3)から選択される、請求項1に記載のポリペプチド:
1)配列番号1に示すアミノ酸配列において、AMPKによりリン酸化されるアミノ酸配列の311番目のセリンがアラニンに置換しているアミノ酸配列からなるポリペプチド;
2)配列番号1に示すアミノ酸配列から選択される1〜311番目のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列であり、311番目のセリンがアラニンに置換しているアミノ酸配列からなり、かつ、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド;
3)上記1)または2)に示すポリペプチドのアミノ酸配列において、311番目以外の位置に1〜5個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、微小管伸長を抑制する機能を有するポリペプチド。 - AMPKによるCLIP-170のリン酸化を指標とする、AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質のスクリーニング方法。
- AMPKによるCLIP-170のリン酸化が、配列番号1に示すアミノ酸配列の311番目のセリンのリン酸化である、請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む請求項3または4に記載のスクリーニング方法:
(a)AMPKとCLIP-170とを被検物質の存在下で接触させて、AMPKによるCLIP-170のリン酸化活性を検出する工程;
(b)被検物質の非存在下と比べて、AMPKによるCLIP-170のリン酸化活性を低減させうる物質を選択する工程。 - AMPKによるCLIP-170のリン酸化活性の検出が、AMPKによりリン酸化されたCLIP-170を特異的に認識する抗体を用いて行われる、請求項3〜5のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
- AMPKによるCLIP-170のリン酸化を指標とする、微小管伸長抑制剤のスクリーニング方法。
- 請求項3〜6のいずれか1に記載の方法を用いる、微小管伸長抑制剤のスクリーニング方法。
- AMPKによりリン酸化されたCLIP-170を特異的に認識する抗体。
- 請求項9に記載の抗体を少なくとも含む、AMPKによるCLIP-170のリン酸化を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
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