JP3500156B2 - ＩκＢキナーゼ類 - Google Patents
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明の分野はシグナル伝達を調節するキナーゼ類
のファミリーである。
のファミリーである。
背景
炎症性サイトカイン類IL−１及びTNFは、大抵は転写
因子NF−κＢにより媒介される機能である、細胞におけ
る遺伝子発現の変更により、多様な生物学的活動を行
う。刺激されていない細胞において、NF−κＢタンパク
質は、阻害性分子との複合体であるＩκＢタンパク質を
形成し、細胞質において不活性にされる。サイトカイン
類と他の刺激に反応して、ＩκＢタンパク質は特定のセ
リン残基でリン酸化される。特に、コンセンサス配列DS
GL/IXSM/Lの一部として２つのセリン残基（例えばＩκ
Ｂαのセリン32と36、ＩκＢβのセリン19と23、及びメ
チオニンの使用に依存してＩκＢεのセリン157と161、
あるいは18と22のそれぞれ）のリン酸化は、ユビキチン
化とプロテオソーム媒介分解のタンパク質をマークし、
NF−κＢを放出しこれが核に入って、炎症性及び免疫応
答に関与するタンパク質をコード化する遺伝子を活性化
する。以下において、ＩκＢセリン36という用語は前記
のコンセンサス配列の第２のセリン残基、例えばＩκＢ
αのセリン36、ＩκＢβのセリン23、及びＩκＢεのセ
リン161又22を上位概念的に指すために使用する。
因子NF−κＢにより媒介される機能である、細胞におけ
る遺伝子発現の変更により、多様な生物学的活動を行
う。刺激されていない細胞において、NF−κＢタンパク
質は、阻害性分子との複合体であるＩκＢタンパク質を
形成し、細胞質において不活性にされる。サイトカイン
類と他の刺激に反応して、ＩκＢタンパク質は特定のセ
リン残基でリン酸化される。特に、コンセンサス配列DS
GL/IXSM/Lの一部として２つのセリン残基（例えばＩκ
Ｂαのセリン32と36、ＩκＢβのセリン19と23、及びメ
チオニンの使用に依存してＩκＢεのセリン157と161、
あるいは18と22のそれぞれ）のリン酸化は、ユビキチン
化とプロテオソーム媒介分解のタンパク質をマークし、
NF−κＢを放出しこれが核に入って、炎症性及び免疫応
答に関与するタンパク質をコード化する遺伝子を活性化
する。以下において、ＩκＢセリン36という用語は前記
のコンセンサス配列の第２のセリン残基、例えばＩκＢ
αのセリン36、ＩκＢβのセリン23、及びＩκＢεのセ
リン161又22を上位概念的に指すために使用する。
NF−κＢ活性化に対するTNF及びIL−１シグナル伝達
経路を描写することにより、TRAF分子が異なったサイト
カインに対する収束点であり、TRAF2がTNF−の、TRAF6
がIL−１−誘導NF−κＢ活性化に関与していることが分
かった。我々はTRAF2結合性キナーゼ活性を含むＩκＢ
キナーゼのファミリー（T2Kと命名する）と、特定の調
節残基上でＩκＢをリン酸化するKIAA0151遺伝子産物の
翻訳物をここに開示する。我々は、そのようなキナーゼ
活性をもたらす天然のタンパク質の精製、誘導されたT2
Kペプチドの配列決定、及び天然のT2KcDNAのクローニン
グをまた開示する。
経路を描写することにより、TRAF分子が異なったサイト
カインに対する収束点であり、TRAF2がTNF−の、TRAF6
がIL−１−誘導NF−κＢ活性化に関与していることが分
かった。我々はTRAF2結合性キナーゼ活性を含むＩκＢ
キナーゼのファミリー（T2Kと命名する）と、特定の調
節残基上でＩκＢをリン酸化するKIAA0151遺伝子産物の
翻訳物をここに開示する。我々は、そのようなキナーゼ
活性をもたらす天然のタンパク質の精製、誘導されたT2
Kペプチドの配列決定、及び天然のT2KcDNAのクローニン
グをまた開示する。
関連文献
Nagaseら（1995）DNA Res.2（４）,167−174はKIAA01
51を含む多くの未同定のヒト遺伝子由来の概念的コード
配列を報告している。Songらの米国特許出願第08/67786
2号はTRAF2結合性キナーゼを開示している。
51を含む多くの未同定のヒト遺伝子由来の概念的コード
配列を報告している。Songらの米国特許出願第08/67786
2号はTRAF2結合性キナーゼを開示している。
発明の概要
本発明は、T2Kタンパク質と呼ばれる天然の単離され
た調節タンパク質、関連する核酸、及びT2K特異的活性
を有するそのタンパク質ドメインに関する方法及び組成
物を提供する。該タンパク質は主題のT2Kコード核酸由
来の形質転換宿主細胞から組換え的に産生されても哺乳
動物細胞から精製されてもよい。本発明は、開示された
T2K遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離T2Kハイ
ブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗体
のようなT2K特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造
し、診断法（例えば、T2K転写物に対する遺伝子ハイブ
リダイゼーションスクリーン）、治療法（例えばT2K遺
伝子発現を変調する遺伝子療法）及び生物薬剤工業（例
えば免疫原、他の転写調節因子を単離するための試薬、
薬理学的リード薬剤のために化学ライブラリをスクリー
ニングするための試薬等々）に使用する方法を提供す
る。
た調節タンパク質、関連する核酸、及びT2K特異的活性
を有するそのタンパク質ドメインに関する方法及び組成
物を提供する。該タンパク質は主題のT2Kコード核酸由
来の形質転換宿主細胞から組換え的に産生されても哺乳
動物細胞から精製されてもよい。本発明は、開示された
T2K遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離T2Kハイ
ブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗体
のようなT2K特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造
し、診断法（例えば、T2K転写物に対する遺伝子ハイブ
リダイゼーションスクリーン）、治療法（例えばT2K遺
伝子発現を変調する遺伝子療法）及び生物薬剤工業（例
えば免疫原、他の転写調節因子を単離するための試薬、
薬理学的リード薬剤のために化学ライブラリをスクリー
ニングするための試薬等々）に使用する方法を提供す
る。
発明の詳細な説明
ヒトT2Kタンパク質をコードしている天然cDNAのヌク
レオチド配列は配列番号１として示され；概念的全長翻
訳物は配列番号２として示される。本発明のT2Kタンパ
ク質は配列番号１の不完全翻訳物と配列番号２の欠失変
異体を含み、この翻訳物と欠失変異体はT2K特異的アミ
ノ酸配列とアッセイにより識別可能なT2K特異的結合特
異性又は機能を有する。このような活性なT2K欠失変異
体、T2Kペプチド又はタンパク質ドメインは、配列番号
２の少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、より
好ましくは少なくとも約10の連続残基の配列を含んでな
り、該配列が配列番号１の塩基1756−2095の翻訳物とKI
AA0151遺伝子産物の双方を区別する。例えば、以下に同
定されるT2Kタンパク質ドメインは、以下に記載されて
いるように、とりわけ固相結合及びキナーゼアッセイに
おいて同定される使用されるタンパク質結合ドメインを
提供することが示される。
レオチド配列は配列番号１として示され；概念的全長翻
訳物は配列番号２として示される。本発明のT2Kタンパ
ク質は配列番号１の不完全翻訳物と配列番号２の欠失変
異体を含み、この翻訳物と欠失変異体はT2K特異的アミ
ノ酸配列とアッセイにより識別可能なT2K特異的結合特
異性又は機能を有する。このような活性なT2K欠失変異
体、T2Kペプチド又はタンパク質ドメインは、配列番号
２の少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、より
好ましくは少なくとも約10の連続残基の配列を含んでな
り、該配列が配列番号１の塩基1756−2095の翻訳物とKI
AA0151遺伝子産物の双方を区別する。例えば、以下に同
定されるT2Kタンパク質ドメインは、以下に記載されて
いるように、とりわけ固相結合及びキナーゼアッセイに
おいて同定される使用されるタンパク質結合ドメインを
提供することが示される。
T2K特異的活性又は機能は、簡便なインビトロ、細胞
ベース、又はインビボアッセイ：例えば動物でのインビ
トロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ（例えば遺伝子療
法、遺伝子組換え動物等々）等々により決定することが
できる。結合アッセイは、結合標的とのT2Kタンパク質
の分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを包含す
る。結合標的は、ＩκＢ又はTRAF2のような天然の細胞
内結合標的（基質、アゴニスト及びアンタゴニストを含
む）であったり、T2K活性又はその局在化を直接変調す
るその他の制御因子；あるいは抗体のような特異的免疫
タンパク質、又は以下に記載するようなスクリーニング
アッセイにおいて同定されるもののようなT2K特異的薬
剤のような非天然結合標的でもよい。T2K結合特異性
は、結合平衡定数（通常少なくとも約107M-1、好ましく
は少なくとも約108M-1、より好ましくは少なくとも約10
9M-1）により、T2K発現細胞における負の変異体として
機能し、異種性宿主（例えばげっ歯類又はウサギ）にお
いてT2K特異的抗体を誘発する等々の主題タンパク質の
能力；あるいは好適な実施態様ではキナーゼ活性によ
り、検定することができる。
ベース、又はインビボアッセイ：例えば動物でのインビ
トロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ（例えば遺伝子療
法、遺伝子組換え動物等々）等々により決定することが
できる。結合アッセイは、結合標的とのT2Kタンパク質
の分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを包含す
る。結合標的は、ＩκＢ又はTRAF2のような天然の細胞
内結合標的（基質、アゴニスト及びアンタゴニストを含
む）であったり、T2K活性又はその局在化を直接変調す
るその他の制御因子；あるいは抗体のような特異的免疫
タンパク質、又は以下に記載するようなスクリーニング
アッセイにおいて同定されるもののようなT2K特異的薬
剤のような非天然結合標的でもよい。T2K結合特異性
は、結合平衡定数（通常少なくとも約107M-1、好ましく
は少なくとも約108M-1、より好ましくは少なくとも約10
9M-1）により、T2K発現細胞における負の変異体として
機能し、異種性宿主（例えばげっ歯類又はウサギ）にお
いてT2K特異的抗体を誘発する等々の主題タンパク質の
能力；あるいは好適な実施態様ではキナーゼ活性によ
り、検定することができる。
本発明に係るT2Kタンパク質は単離されるか純粋であ
る：「単離」タンパク質は、天然の状態では付随してい
る物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、
与えられた試料中の全タンパク質の好ましくは少なくと
も約0.5％，より好ましくは少なくとも約５％を構成
し、純粋なタンパク質が与えられた試料中の全タンパク
質の少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約99％を
構成する。T2Kタンパク質とタンパク質ドメインは合成
されても、組換え技術により産生されても、あるいは哺
乳動物細胞、好ましくはヒト細胞から精製されてもよ
い。非常に広範な分子及び生化学的方法が主題組成物の
生化学合成、分子発現及び精製に利用できる。例えば、
Molecular Cloning,A Laboratory Manual（分子クロー
ニング、実験室マニュアル）（Sambrookら、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、Current Prot
ocols in Molecular Biology（分子生物学における現在
のプロトコール）（Ausubelら編、Greene Pulb.Assoc.,
Wiley−Interscience,NY）あるいは当該分野でその他知
られているものを参照されたい。
る：「単離」タンパク質は、天然の状態では付随してい
る物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、
与えられた試料中の全タンパク質の好ましくは少なくと
も約0.5％，より好ましくは少なくとも約５％を構成
し、純粋なタンパク質が与えられた試料中の全タンパク
質の少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約99％を
構成する。T2Kタンパク質とタンパク質ドメインは合成
されても、組換え技術により産生されても、あるいは哺
乳動物細胞、好ましくはヒト細胞から精製されてもよ
い。非常に広範な分子及び生化学的方法が主題組成物の
生化学合成、分子発現及び精製に利用できる。例えば、
Molecular Cloning,A Laboratory Manual（分子クロー
ニング、実験室マニュアル）（Sambrookら、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、Current Prot
ocols in Molecular Biology（分子生物学における現在
のプロトコール）（Ausubelら編、Greene Pulb.Assoc.,
Wiley−Interscience,NY）あるいは当該分野でその他知
られているものを参照されたい。
本発明は、天然及び非天然T2K特異的結合薬剤、かか
る薬剤を同定し調製する方法、及び診断法、治療法及び
製薬開発におけるその用途を提供する。例えば、T2K特
異的薬剤は様々な診断及び治療用途に有用である。新規
なT2K特異的結合薬剤には、T2K特異的レセプター、例え
ば特異的抗体のような体細胞性組換えタンパクレセプタ
ー又はＴ細胞抗原レセプター（例えばHarlowとLane（19
88）Antibodies,A Laboratory Manual（抗体、実験室マ
ニュアル）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー）及び例えば一重、二重及び三重ハイブリッドス
クリーンのようなアッセイで同定されるその他の天然の
結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリのスク
リーンで同定される非天然細胞内結合薬剤等々が包含さ
れる。診断用途では、結合薬剤は、結合薬剤に直接抱合
され、又は結合薬剤に特異的なプローブに抱合される、
例えば蛍光、放射能、化学発光、あるいは他の容易に検
出可能な分子でしばしば標識される。特に興味深い薬剤
はT2K機能、例えばT2Kキナーゼ活性を変調する；例えば
単離細胞、全組織、あるいは個体をT2K結合薬剤で処理
してNfκＢ活性化のようなT2Kキナーゼ依存性プロセス
を活性化、阻害、又は変更するようにしてもよい。
る薬剤を同定し調製する方法、及び診断法、治療法及び
製薬開発におけるその用途を提供する。例えば、T2K特
異的薬剤は様々な診断及び治療用途に有用である。新規
なT2K特異的結合薬剤には、T2K特異的レセプター、例え
ば特異的抗体のような体細胞性組換えタンパクレセプタ
ー又はＴ細胞抗原レセプター（例えばHarlowとLane（19
88）Antibodies,A Laboratory Manual（抗体、実験室マ
ニュアル）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー）及び例えば一重、二重及び三重ハイブリッドス
クリーンのようなアッセイで同定されるその他の天然の
結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリのスク
リーンで同定される非天然細胞内結合薬剤等々が包含さ
れる。診断用途では、結合薬剤は、結合薬剤に直接抱合
され、又は結合薬剤に特異的なプローブに抱合される、
例えば蛍光、放射能、化学発光、あるいは他の容易に検
出可能な分子でしばしば標識される。特に興味深い薬剤
はT2K機能、例えばT2Kキナーゼ活性を変調する；例えば
単離細胞、全組織、あるいは個体をT2K結合薬剤で処理
してNfκＢ活性化のようなT2Kキナーゼ依存性プロセス
を活性化、阻害、又は変更するようにしてもよい。
開示したT2Kタンパク質のアミノ酸配列は、選択され
た発現系に対して最適化されたT2Kタンパク質コード核
酸を逆翻訳するために使用されるか（Hollerら（1993）
Gene 136,323−328;Martinら（1995）Gene 154,150−16
6）、天然のT2Kコード核酸配列の単離に使用される変性
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを産生する
ために使用される（「GCG」ソフトウェア、ジェネティ
クス・コンピュータ・グループ・インク、マディソンW
1）。T2Kコード核酸配列は、T2K発現ベクターに使用さ
れ、例えば発現及びスクリーニングのために組換え宿主
細胞に、例えばT2K変調細胞機能に関与する疾患に対す
る候補薬の効能等の機能性研究等々のための遺伝子組換
え動物に導入される。
た発現系に対して最適化されたT2Kタンパク質コード核
酸を逆翻訳するために使用されるか（Hollerら（1993）
Gene 136,323−328;Martinら（1995）Gene 154,150−16
6）、天然のT2Kコード核酸配列の単離に使用される変性
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを産生する
ために使用される（「GCG」ソフトウェア、ジェネティ
クス・コンピュータ・グループ・インク、マディソンW
1）。T2Kコード核酸配列は、T2K発現ベクターに使用さ
れ、例えば発現及びスクリーニングのために組換え宿主
細胞に、例えばT2K変調細胞機能に関与する疾患に対す
る候補薬の効能等の機能性研究等々のための遺伝子組換
え動物に導入される。
本発明はまた、配列番号１に含まれるこれまでに新規
なT2KcDNA特異的配列を有し（その相補配列及び類似体
及びRNAにおける対応配列を有するその相補配列を含
む）、それに対して特異的ハイブリダイゼーションを行
う（すなわち、KIAA0151遺伝子の存在下で配列番号１及
び配列番号１の塩基1756−2095からなる核酸に特異的に
ハイブリダイズする）のに充分な核酸ハイブリダイゼー
ションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。
かかるプライマーもしくはプローブは、少なくとも12、
好ましくは少なくとも24、より好ましくは少なくとも3
6、最も好ましくは少なくとも96の塩基長である。特異
的ハイブリダイゼーションを実証するには一般に厳密な
条件、例えば42℃の温度で5xSSPE（0.18MのNaCl、0.01M
のNaPO4、pH7.7、0.001MのEDTA）中に30％のホルムアミ
ドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃において
0.2xSSPEで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件、好
ましくは例えば42℃の温度で5xSSPE中に50％のホルムア
ミドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃におい
て0.2xSSPEバッファーで洗浄を行ったとき結合したまま
残る条件を必要とする。T2KcDNA相同体はまた例えばBLA
STX（Altschulら（1990）Basic Local Alignment Searc
h Tool,J Mol Biol 215,403−410）のような整合化アル
ゴリズムを使用して他のタンパク質から区別することも
できる。
なT2KcDNA特異的配列を有し（その相補配列及び類似体
及びRNAにおける対応配列を有するその相補配列を含
む）、それに対して特異的ハイブリダイゼーションを行
う（すなわち、KIAA0151遺伝子の存在下で配列番号１及
び配列番号１の塩基1756−2095からなる核酸に特異的に
ハイブリダイズする）のに充分な核酸ハイブリダイゼー
ションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。
かかるプライマーもしくはプローブは、少なくとも12、
好ましくは少なくとも24、より好ましくは少なくとも3
6、最も好ましくは少なくとも96の塩基長である。特異
的ハイブリダイゼーションを実証するには一般に厳密な
条件、例えば42℃の温度で5xSSPE（0.18MのNaCl、0.01M
のNaPO4、pH7.7、0.001MのEDTA）中に30％のホルムアミ
ドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃において
0.2xSSPEで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件、好
ましくは例えば42℃の温度で5xSSPE中に50％のホルムア
ミドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃におい
て0.2xSSPEバッファーで洗浄を行ったとき結合したまま
残る条件を必要とする。T2KcDNA相同体はまた例えばBLA
STX（Altschulら（1990）Basic Local Alignment Searc
h Tool,J Mol Biol 215,403−410）のような整合化アル
ゴリズムを使用して他のタンパク質から区別することも
できる。
主題の核酸は、合成／非天然配列のものであり、及び
／又は単離される、すなわちその天然の状態で付随して
いる物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量
は、好ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少
なくとも約0.5％，より好ましくは少なくとも約５％を
構成し、通常は、天然染色体上に結合しているもの以外
のヌクレオチド（群）に結合した天然配列又は非天然配
列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番
号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含んで
なる核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然
染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置
している末端か、天然染色体上に結合しているもの以外
の配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある10kb、好
ましくは2kbよりも小さい負のフランキング領域が隣に
位置している末端に含んでいる。核酸は通常はRNAもし
くはDNAであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を
含んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしば
しば好適である。
／又は単離される、すなわちその天然の状態で付随して
いる物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量
は、好ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少
なくとも約0.5％，より好ましくは少なくとも約５％を
構成し、通常は、天然染色体上に結合しているもの以外
のヌクレオチド（群）に結合した天然配列又は非天然配
列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番
号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含んで
なる核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然
染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置
している末端か、天然染色体上に結合しているもの以外
の配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある10kb、好
ましくは2kbよりも小さい負のフランキング領域が隣に
位置している末端に含んでいる。核酸は通常はRNAもし
くはDNAであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を
含んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしば
しば好適である。
主題の核酸には、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼ
ーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸等々と
しての使用;T2K遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検出
し、更なるT2K相同体及び構造類似体をコードする核酸
を検出又は増幅するための使用を含む広範な応用範囲が
見出される。診断法では、T2Kハイブリダイゼーション
プローブが、臨床及び実験室試料中の野生型及び変異体
T2K対立遺伝子を同定する際に使用される。変異体対立
遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立遺伝子特異的オ
リゴヌクレオチド（ASO）プローブを産生するために使
用される。治療法では、治療用T2K核酸が活性なT2Kの細
胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために
使用される。例えば、T2K核酸は活性なT2Kタンパク質の
細胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するため
に使用される。T2K阻害核酸は典型的には開示された天
然T2Kコード配列の補体を含んでなるアンチセンス、一
本鎖配列である。与えられたT2Kタンパク質の発現のア
ンチセンス変調には遺伝子調節配列に作用可能に連結し
たアンチセンス核酸を使用してもよい。遺伝子の転写が
内因性T2KコードmRNAに結合可能なアンチセンス転写物
を生じるように配向されたプロモータ配列を持つT2K配
列を含んでなるベクターを細胞に形質移入する。アンチ
センス核酸の転写は構成的又は誘発性であり、ベクター
は安定した染色体外イメンテナンス又は組込みをもたら
し得る。別法としては、与えられたT2Kタンパク質をコ
ードするゲノムDNAもしくはmRNAに結合する一本鎖アン
チセンス核酸を、標的タンパク質の発現が大幅に減少す
る濃度で、宿主中の又は宿主から一時的に単離された標
的細胞に投与してもよい。T2K発現の増強は、対応する
遺伝子産物の機能性発現を増大させるT2K核酸を標的細
胞型中に導入することにより行われる。このような核酸
はT2K発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能性発現を
上方制御するベクター、又は変異体対立遺伝子の標的修
正のための置換ベクターであってもよい。生きた細胞中
に核酸を導入する技術は当該分野において知られてお
り、レトロウィルスベースの形質移入、ウィルスコート
タンパク質−リポソーム性形質移入等々が含まれる。
ーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸等々と
しての使用;T2K遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検出
し、更なるT2K相同体及び構造類似体をコードする核酸
を検出又は増幅するための使用を含む広範な応用範囲が
見出される。診断法では、T2Kハイブリダイゼーション
プローブが、臨床及び実験室試料中の野生型及び変異体
T2K対立遺伝子を同定する際に使用される。変異体対立
遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立遺伝子特異的オ
リゴヌクレオチド（ASO）プローブを産生するために使
用される。治療法では、治療用T2K核酸が活性なT2Kの細
胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために
使用される。例えば、T2K核酸は活性なT2Kタンパク質の
細胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するため
に使用される。T2K阻害核酸は典型的には開示された天
然T2Kコード配列の補体を含んでなるアンチセンス、一
本鎖配列である。与えられたT2Kタンパク質の発現のア
ンチセンス変調には遺伝子調節配列に作用可能に連結し
たアンチセンス核酸を使用してもよい。遺伝子の転写が
内因性T2KコードmRNAに結合可能なアンチセンス転写物
を生じるように配向されたプロモータ配列を持つT2K配
列を含んでなるベクターを細胞に形質移入する。アンチ
センス核酸の転写は構成的又は誘発性であり、ベクター
は安定した染色体外イメンテナンス又は組込みをもたら
し得る。別法としては、与えられたT2Kタンパク質をコ
ードするゲノムDNAもしくはmRNAに結合する一本鎖アン
チセンス核酸を、標的タンパク質の発現が大幅に減少す
る濃度で、宿主中の又は宿主から一時的に単離された標
的細胞に投与してもよい。T2K発現の増強は、対応する
遺伝子産物の機能性発現を増大させるT2K核酸を標的細
胞型中に導入することにより行われる。このような核酸
はT2K発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能性発現を
上方制御するベクター、又は変異体対立遺伝子の標的修
正のための置換ベクターであってもよい。生きた細胞中
に核酸を導入する技術は当該分野において知られてお
り、レトロウィルスベースの形質移入、ウィルスコート
タンパク質−リポソーム性形質移入等々が含まれる。
本発明はＩκＢセリン36特異的キナーゼタンパク質変
調性細胞機能のレベルで活性な薬剤、化合物又は薬剤用
のリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一
般に、これらのスクリーニング法は天然のＩκＢセリン
36特異的キナーゼタンパク質結合標的とのＩκＢセリン
36特異的キナーゼタンパク質の相互作用を変調する化合
物に対するアッセイを含む。標識インビトロタンパク−
タンパク結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースア
ッセイ等々を含む結合薬剤に対する広範なアッセイが提
供される。該方法は、リード化合物に対しての化学ライ
ブラリの自動でコスト性能の良い高処理スクリーニング
に受け入れられる。このようなライブラリは数多くの化
学クラスの候補薬剤を包含するが、典型的には有機化合
物；好ましくは小さい有機化合物であり、合成もしくは
天然化合物のライブラリを含む広範なソースから得られ
る。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業で
使用される；例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及び
インビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のた
めの活性を最適化し毒性を最小化することができる。
調性細胞機能のレベルで活性な薬剤、化合物又は薬剤用
のリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一
般に、これらのスクリーニング法は天然のＩκＢセリン
36特異的キナーゼタンパク質結合標的とのＩκＢセリン
36特異的キナーゼタンパク質の相互作用を変調する化合
物に対するアッセイを含む。標識インビトロタンパク−
タンパク結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースア
ッセイ等々を含む結合薬剤に対する広範なアッセイが提
供される。該方法は、リード化合物に対しての化学ライ
ブラリの自動でコスト性能の良い高処理スクリーニング
に受け入れられる。このようなライブラリは数多くの化
学クラスの候補薬剤を包含するが、典型的には有機化合
物；好ましくは小さい有機化合物であり、合成もしくは
天然化合物のライブラリを含む広範なソースから得られ
る。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業で
使用される；例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及び
インビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のた
めの活性を最適化し毒性を最小化することができる。
インビトロ結合アッセイでは、他のペプチド又はポリ
ペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ等との融合
産物の一部であってもよいT2Kタンパク質のようなＩκ
Ｂセリン36特異的キナーゼタンパク質を含む成分の混合
物を使用する。アッセイ混合物は、キナーゼタンパク質
の天然の細胞内結合標的を含む。天然の結合標的を使用
してもよいが、その部分がアッセイにおいて簡便に測定
可能な主題キナーゼタンパク質に対する結合親和性及び
結合活性をもたらす限り、その部分（例えばペプチド）
を使用することがしばしば好ましい。特定の実施態様で
は、結合標的はＩκＢセリン36を含んでなる基質であ
る。このような基質は、セリン36残基と、少なくとも
５、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくと
も20の天然に生じる直ぐ隣りに位置する残基（すなわ
ち、ＩκＢα、βもしくはε由来基質に対してそれぞれ
残基26−46、22−42、又は12−32もしくは151−171の残
基）を各側に含むＩκＢα、βもしくはεペプチドを含
んでなる。
ペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ等との融合
産物の一部であってもよいT2Kタンパク質のようなＩκ
Ｂセリン36特異的キナーゼタンパク質を含む成分の混合
物を使用する。アッセイ混合物は、キナーゼタンパク質
の天然の細胞内結合標的を含む。天然の結合標的を使用
してもよいが、その部分がアッセイにおいて簡便に測定
可能な主題キナーゼタンパク質に対する結合親和性及び
結合活性をもたらす限り、その部分（例えばペプチド）
を使用することがしばしば好ましい。特定の実施態様で
は、結合標的はＩκＢセリン36を含んでなる基質であ
る。このような基質は、セリン36残基と、少なくとも
５、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくと
も20の天然に生じる直ぐ隣りに位置する残基（すなわ
ち、ＩκＢα、βもしくはε由来基質に対してそれぞれ
残基26−46、22−42、又は12−32もしくは151−171の残
基）を各側に含むＩκＢα、βもしくはεペプチドを含
んでなる。
アッセイ混合物はまた候補薬理剤及び典型的には塩、
バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄
剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤
等々のような様々なその他の試薬を含有する。混合物成
分は、要求された結合をもたらす任意の順序で添加する
ことができ、最適な結合を容易にする注意の温度でイン
キュベーションを実施することができる。ついで、混合
物は、候補の薬理剤が存在しなかったらキナーゼタンパ
ク質が細胞結合標的、部分又は類似体に基準結合親和性
をもって特異的に結合するような条件下でインキュベー
トされる。インキュベート期間は同様に最適結合となる
ように選択されるが、迅速な高処理スクリーニングを容
易にするように最小化される。
バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄
剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤
等々のような様々なその他の試薬を含有する。混合物成
分は、要求された結合をもたらす任意の順序で添加する
ことができ、最適な結合を容易にする注意の温度でイン
キュベーションを実施することができる。ついで、混合
物は、候補の薬理剤が存在しなかったらキナーゼタンパ
ク質が細胞結合標的、部分又は類似体に基準結合親和性
をもって特異的に結合するような条件下でインキュベー
トされる。インキュベート期間は同様に最適結合となる
ように選択されるが、迅速な高処理スクリーニングを容
易にするように最小化される。
インキュベート後、キナーゼタンパク質と一又は複数
の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便な方法で検
出される。分離工程が未結合成分から結合成分を分離す
るために最初に使用される。分離は、沈降（例えばTCA
沈降、免疫沈降等々）、固定化（例えば固体基質上）等
々により実施してもよく、続いて、例えば膜ろ過、ゲル
クロマトグラフィー（例えばゲルろ過、アフィニティー
等々）による洗浄が続く。成分の一つは通常標識を含む
か標識に結合される。標識は、放射能、発光、光学もし
くは電子密度等々のような直接的検出をもたらすもので
も、あるいはエピトープタグ、酵素等々のような間接的
検出をもたらすものでもよい。標識と他のアッセイ成
分、例えば光学又は電子密度、放射線、非放射性エネル
ギー移動等々の性質に応じて、様々な方法を使用して標
識を検出することができ、あるいは抗体抱合体等々で間
接的に検出される。薬剤の存在下での結合アフィニティ
ーと比較して薬剤の非存在下における標的に対するキナ
ーゼタンパク質の結合アフィニティーの差は、薬剤が結
合標的に対するキナーゼタンパク質の結合を変調するこ
とを示している。同様に、以下に記載される細胞ベース
転写アッセイにおいても、薬剤の存在及び不存在下にお
けるキナーゼタンパク質転写誘導の差は、薬剤がキナー
ゼ変調転写を変調することを示している。本明細書にお
いて使用される差は、統計的に有意であり、好ましくは
少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％の差を
表す。
の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便な方法で検
出される。分離工程が未結合成分から結合成分を分離す
るために最初に使用される。分離は、沈降（例えばTCA
沈降、免疫沈降等々）、固定化（例えば固体基質上）等
々により実施してもよく、続いて、例えば膜ろ過、ゲル
クロマトグラフィー（例えばゲルろ過、アフィニティー
等々）による洗浄が続く。成分の一つは通常標識を含む
か標識に結合される。標識は、放射能、発光、光学もし
くは電子密度等々のような直接的検出をもたらすもので
も、あるいはエピトープタグ、酵素等々のような間接的
検出をもたらすものでもよい。標識と他のアッセイ成
分、例えば光学又は電子密度、放射線、非放射性エネル
ギー移動等々の性質に応じて、様々な方法を使用して標
識を検出することができ、あるいは抗体抱合体等々で間
接的に検出される。薬剤の存在下での結合アフィニティ
ーと比較して薬剤の非存在下における標的に対するキナ
ーゼタンパク質の結合アフィニティーの差は、薬剤が結
合標的に対するキナーゼタンパク質の結合を変調するこ
とを示している。同様に、以下に記載される細胞ベース
転写アッセイにおいても、薬剤の存在及び不存在下にお
けるキナーゼタンパク質転写誘導の差は、薬剤がキナー
ゼ変調転写を変調することを示している。本明細書にお
いて使用される差は、統計的に有意であり、好ましくは
少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％の差を
表す。
次の実験部分と実施例は例証のために提供するもので
限定をなすものではない。
限定をなすものではない。
実験
T2Kの同定：
Ｎ末端フラッグ−エピトープタグを持つヒトTRAF2タ
ンパク質の発現を指示するDNAプラスミドを293細胞に安
定に形質移入した。懸濁培養液中で成長させた細胞を、
2000RPMで５分間回転させるソーバル（Sorvall）GS−３
ロータにより500mlボトル中でペレット化し、50mMのHEP
ES、pH7.9、250mMのNaCl、5mMのジチオスレイトール（D
TT）、1mMのEDTA、20mMのβグリセロリン酸、5mMのリン
酸ｐ−ニトロフェニル、1mMのオルトバナジン酸ナトリ
ウム、1mMのベンズアミジン、0.4mMのフェニルメチルス
ルホニルフロリド（PMSF）、1mMのメタ亜硫酸水素ナト
リウム、0.1％のNP−40及び10％（v/v）のグリセロール
を含む５ペレット化細胞容量の「溶解バッファー」に溶
解した。時折揺らして30分間氷上でインキュベーション
した後、細胞溶解物を4000RPMで10分間ソーバルH6000A
ロータにより50mlのコニカルチューブ中で遠心分離し
た。上清を収集し、ベックマン45TIロータにおいて4000
0RPMで２時間遠心分離した。TRAF複合体をセファロース
に架橋した抗フラッグモノクローナル抗体（VWR）（200
mlの抽出物に対して1.5mlのセファロースビーズ）を使
用して免疫沈降させた。免疫沈降物を、細胞溶解バッフ
ァーで４回、１モルのNaClを含む溶解バッファーで２
回、そして溶解バッファーで２回洗浄した。この段階
で、免疫複合体が野生型ＩκＢα及びβを効果的にリン
酸化し得るが、アラニンで置換した２つのセリンを持つ
変異体はリン酸化しない。ついで、TRAF2複合体を含む
セファロースビーズを、20mMのトリス−HCl、pH7.6、20
mMのMgCl2、20mMのβグリセロリン酸、20mMのリン酸ｐ
−ニトロフェニル、1mMのEDTA、1mMのオルトバナジン酸
ナトリウム、1mMのベンズアミジン、0.4mMのPMSF、1mM
のメタ亜硫酸水素ナトリウム、1mMのATP、及び20mMのク
レアチンリン酸を含む4.5mlsのキナーゼバッファー中に
おいて30℃で１時間インキュベーションした。インビト
ロキナーゼ反応後に、有意な量のＩκＢキナーゼ活性
が、1mlのヘパリンアガロースカラムに負荷されNaCl勾
配で溶出された可溶性画分中に見出された。ＩκＢキナ
ーゼ活性は、セントリコン（Amicon）で50ulまで濃縮し
た画分フロー中に回収された。スマート（Smart）シス
テム（ファーマシア）により駆動されるスーパーデック
ス（superdex）200ゲルろ過カラム上で材料を分画して
溶出液を50ul画分に収集した。キナーゼ活性は670kDの
分子サイズマーカーと相関付けされた画分中に回収され
た。これらの画分をプールし、NaCl線形勾配でモノＱカ
ラムで更に分離した。キナーゼ活性は0.3から0.4MのNaC
l溶出液中に見出された。SDSゲルで分離したカラム画分
の銀染色により、スーパーデックス200とモノＱ分画の
双方においてキナーゼ活性に相関付けされた85から90kD
のポリペプチドが明らかになった。SDSゲルろ過後、こ
のポリペプチドをマイクロペプチド配列決定にかけた。
得られた一つのペプチド配列がメルク−ワシントン大学
のESTデータベースの部分的cDNA配列に一致した。729ア
ミノ酸に対するオープンリーディングフレームを含むcD
NAクローンをHeLa細胞から産生したラムダファージcDNA
ライブラリから単離した。配列解析により、予想された
タンパク質（T2K）のＮ末端部分にプロテインキナーゼ
ドメインが明らかになった。T2Kのキナーゼドメインで
タンパク質配列データベースをサーチして、T2K、特に
プロテインキナーゼドメインに高度に相同な（75％同一
性）タンパク質（KIAA0151）が同定された。KIAA0151は
未知の機能を持つキナーゼであり、Nagase Tらによりヒ
トKG−１細胞から単離された新規なcDNA配列として報告
されている（DNA Res.2（４）,167−174（1995））。
ンパク質の発現を指示するDNAプラスミドを293細胞に安
定に形質移入した。懸濁培養液中で成長させた細胞を、
2000RPMで５分間回転させるソーバル（Sorvall）GS−３
ロータにより500mlボトル中でペレット化し、50mMのHEP
ES、pH7.9、250mMのNaCl、5mMのジチオスレイトール（D
TT）、1mMのEDTA、20mMのβグリセロリン酸、5mMのリン
酸ｐ−ニトロフェニル、1mMのオルトバナジン酸ナトリ
ウム、1mMのベンズアミジン、0.4mMのフェニルメチルス
ルホニルフロリド（PMSF）、1mMのメタ亜硫酸水素ナト
リウム、0.1％のNP−40及び10％（v/v）のグリセロール
を含む５ペレット化細胞容量の「溶解バッファー」に溶
解した。時折揺らして30分間氷上でインキュベーション
した後、細胞溶解物を4000RPMで10分間ソーバルH6000A
ロータにより50mlのコニカルチューブ中で遠心分離し
た。上清を収集し、ベックマン45TIロータにおいて4000
0RPMで２時間遠心分離した。TRAF複合体をセファロース
に架橋した抗フラッグモノクローナル抗体（VWR）（200
mlの抽出物に対して1.5mlのセファロースビーズ）を使
用して免疫沈降させた。免疫沈降物を、細胞溶解バッフ
ァーで４回、１モルのNaClを含む溶解バッファーで２
回、そして溶解バッファーで２回洗浄した。この段階
で、免疫複合体が野生型ＩκＢα及びβを効果的にリン
酸化し得るが、アラニンで置換した２つのセリンを持つ
変異体はリン酸化しない。ついで、TRAF2複合体を含む
セファロースビーズを、20mMのトリス−HCl、pH7.6、20
mMのMgCl2、20mMのβグリセロリン酸、20mMのリン酸ｐ
−ニトロフェニル、1mMのEDTA、1mMのオルトバナジン酸
ナトリウム、1mMのベンズアミジン、0.4mMのPMSF、1mM
のメタ亜硫酸水素ナトリウム、1mMのATP、及び20mMのク
レアチンリン酸を含む4.5mlsのキナーゼバッファー中に
おいて30℃で１時間インキュベーションした。インビト
ロキナーゼ反応後に、有意な量のＩκＢキナーゼ活性
が、1mlのヘパリンアガロースカラムに負荷されNaCl勾
配で溶出された可溶性画分中に見出された。ＩκＢキナ
ーゼ活性は、セントリコン（Amicon）で50ulまで濃縮し
た画分フロー中に回収された。スマート（Smart）シス
テム（ファーマシア）により駆動されるスーパーデック
ス（superdex）200ゲルろ過カラム上で材料を分画して
溶出液を50ul画分に収集した。キナーゼ活性は670kDの
分子サイズマーカーと相関付けされた画分中に回収され
た。これらの画分をプールし、NaCl線形勾配でモノＱカ
ラムで更に分離した。キナーゼ活性は0.3から0.4MのNaC
l溶出液中に見出された。SDSゲルで分離したカラム画分
の銀染色により、スーパーデックス200とモノＱ分画の
双方においてキナーゼ活性に相関付けされた85から90kD
のポリペプチドが明らかになった。SDSゲルろ過後、こ
のポリペプチドをマイクロペプチド配列決定にかけた。
得られた一つのペプチド配列がメルク−ワシントン大学
のESTデータベースの部分的cDNA配列に一致した。729ア
ミノ酸に対するオープンリーディングフレームを含むcD
NAクローンをHeLa細胞から産生したラムダファージcDNA
ライブラリから単離した。配列解析により、予想された
タンパク質（T2K）のＮ末端部分にプロテインキナーゼ
ドメインが明らかになった。T2Kのキナーゼドメインで
タンパク質配列データベースをサーチして、T2K、特に
プロテインキナーゼドメインに高度に相同な（75％同一
性）タンパク質（KIAA0151）が同定された。KIAA0151は
未知の機能を持つキナーゼであり、Nagase Tらによりヒ
トKG−１細胞から単離された新規なcDNA配列として報告
されている（DNA Res.2（４）,167−174（1995））。
基質特異性の分析により、T2KとKIAA0151の双方がＩ
κＢセリン36を特異的にリン酸化しTRAF2と結合するこ
とが明らかになった。更に、欠失変異体分析により、10
−250残基がキナーゼドメインを定め、T2KとKIAA0151に
対して、残基251−729と251−716がそれぞれＩκＢキナ
ーゼ活性に対する負の変異体として活性な調節ドメイン
を定めることが明らかになった。組換えT2Kキナーゼは
大腸菌及びバキュロウイルス発現系においてGST融合タ
ンパク質を過剰発現させることにより調製される。
κＢセリン36を特異的にリン酸化しTRAF2と結合するこ
とが明らかになった。更に、欠失変異体分析により、10
−250残基がキナーゼドメインを定め、T2KとKIAA0151に
対して、残基251−729と251−716がそれぞれＩκＢキナ
ーゼ活性に対する負の変異体として活性な調節ドメイン
を定めることが明らかになった。組換えT2Kキナーゼは
大腸菌及びバキュロウイルス発現系においてGST融合タ
ンパク質を過剰発現させることにより調製される。
実施例
1. T2K−ＩκＢαリン酸化アッセイに対するプロトコ
ール A.試薬： −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
ール A.試薬： −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−キナーゼ:PBSに20μg/mlで入れた10-8−10-5Mのキナ
ーゼ（配列番号２）。
ーゼ（配列番号２）。
−基質:PBSに40μg/mlで入れた10-7−10-4Mのビオチン
化基質（ヒトＩκＢαの26−46残基からなる21残基ペプ
チド）。
化基質（ヒトＩκＢαの26−46残基からなる21残基ペプ
チド）。
−阻害バッファー:PBS中に５％のBSA、0.5％のトウィー
ン20;室温で１時間。
ン20;室温で１時間。
−アッセイバッファー:100mMのKCl、10mMのMgCl2、1mM
のMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、１％の
グリセロール、0.5％のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBS
A、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。
のMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、１％の
グリセロール、0.5％のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBS
A、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。
−［32P］γ−ATPの10x保存液:100μCi［32P］γ−ATP
を伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、４
℃のマイクロ冷蔵庫の配置。
を伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、４
℃のマイクロ冷蔵庫の配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル（1000X）:10mlのPBS中
に10mgのトリプシン阻害剤（MBM＃109894）、10mgのア
プロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン
（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃101
7128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3
（シグマ＃Ｓ−6508）。
に10mgのトリプシン阻害剤（MBM＃109894）、10mgのア
プロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン
（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃101
7128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3
（シグマ＃Ｓ−6508）。
B.アッセイプレートの調製：
−４℃で一晩かけてウェル当り120μｌの保存Ｎ−アビ
ジンでコーティング。
ジンでコーティング。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
−150μｌの阻害バッファーで阻害。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
C.アッセイ：
−40μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。
−40μｌのビオチン化基質（アッセイバッファー中に２
−200pmol/40ul）を添加。
−200pmol/40ul）を添加。
−40μｌのキナーゼ（アッセイバッファー中に0.1−10p
mol/40ul）を添加。
mol/40ul）を添加。
−10μｌの化合物又は抽出物を添加。
−10μｌの［32P］γ−ATPの10x保存液を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−200μｌのPBSで４回洗浄することにより反応を停止。
−150μｌのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D.（各プレート上にある）全アッセイ用の対照：
a.非特異的結合
b.80％阻害の非放射性ATP。
2. KIAA0151−ＩκＢβリン酸化アッセイに対するプロ
トコール A.試薬： −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
トコール A.試薬： −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−キナーゼ:PBSに20μg/mlで入れた10-8−10-5Mの切断K
IAA0151キナーゼ（４−714残基）。
IAA0151キナーゼ（４−714残基）。
−基質:PBSに40μg/mlで入れた10-7−10-4Mのビオチン
化基質（ヒトＩκＢβの22−42残基からなる21残基ペプ
チド）。
化基質（ヒトＩκＢβの22−42残基からなる21残基ペプ
チド）。
−阻害バッファー:PBS中に５％のBSA、0.5％のトウィー
ン20;室温で１時間。
ン20;室温で１時間。
−アッセイバッファー:100mMのKCl、10mMのMgCl2、1mM
のMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、１％の
グリセロール、0.5％のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBS
A、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。
のMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、１％の
グリセロール、0.5％のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBS
A、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。
−［32P］γ−ATPの10x保存液:100μCi［32P］γ−ATP
を伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、４
℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
を伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、４
℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル（1000X）:10mlのPBS中
に10mgのトリプシン阻害剤（BMB＃109894）、10mgのア
プロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン
（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃101
7128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3
（シグマ＃Ｓ−6508）。
に10mgのトリプシン阻害剤（BMB＃109894）、10mgのア
プロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン
（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃101
7128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3
（シグマ＃Ｓ−6508）。
B.アッセイプレートの調製：
−４℃で一晩かけてウェル当り120μｌの保存Ｎ−アビ
ジンでコーティング。
ジンでコーティング。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
−150μｌの阻害バッファーで阻害。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
C.アッセイ：
−40μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。
−40μｌのビオチン化基質（アッセイバッファー中に２
−200pmol/40ul）を添加。
−200pmol/40ul）を添加。
−40μｌのキナーゼ（アッセイバッファー中に0.1−10p
mol/40ul）を添加。
mol/40ul）を添加。
−10μｌの化合物又は抽出物を添加。
−10μｌの［32P］γ−ATPの10x保存液を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−200μｌのPBSで４回洗浄することにより反応を停止。
−150μｌのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D.（各プレート上にある）全アッセイ用の対照：
a.非特異的結合
b.80％阻害の非放射性ATP。
3.高収量T2K−TRAF2ヘテロ二量体生成アッセイに対する
プロトコール A.試薬： −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
プロトコール A.試薬： −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−阻害バッファー:PBS中に５％のBSA、0.5％のトウィー
ン20;室温で１時間。
ン20;室温で１時間。
−アッセイバッファー:100mMのKCl、20mMのHEPES、pH7.
6、1mMのMgCl2、１％のグリセロール、0.5％のNP−40、
50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロ
テアーゼ阻害剤のカクテル。
6、1mMのMgCl2、１％のグリセロール、0.5％のNP−40、
50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロ
テアーゼ阻害剤のカクテル。
−33P T2Kタンパク質の10xストック:200,000−250,000
cpmの標識T2K（ベックマンカウンター）が補填された10
-8−10-6Mの「非放射性」T2K。スクリーニングの間、４
℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
cpmの標識T2K（ベックマンカウンター）が補填された10
-8−10-6Mの「非放射性」T2K。スクリーニングの間、４
℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル（1000X）:10mlのPBS中
に10mgのトリプシン阻害剤（BMB＃109894）、10mgのア
プロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン
（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃101
7128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3
（シグマ＃Ｓ−6508）。
に10mgのトリプシン阻害剤（BMB＃109894）、10mgのア
プロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン
（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃101
7128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3
（シグマ＃Ｓ−6508）。
−TRAF2:PBS中の10-7−10-5Mのビオチン化TRAF2
B.アッセイプレートの調製：
−４℃で一晩かけてウェル当り120μｌの保存Ｎ−アビ
ジンでコーティング。
ジンでコーティング。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
−150μｌの阻害バッファーで阻害。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
C.アッセイ：
−40μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。
−10μｌの化合物又は抽出物を添加。
−10μｌの33P−T2K（20−25,000cpm/0.1−10pmol/ウェ
ル＝10-9−10-7M最終濃度）を添加。
ル＝10-9−10-7M最終濃度）を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−40μｌのビオチン化TRAF2（アッセイバッファー中に
0.1−10pmol/40ul）を添加。
0.1−10pmol/40ul）を添加。
−室温で１時間インキュベート
−200μＭのPBSで４回洗浄することにより反応を停止。
−150μＭのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D.（各プレート上にある）全アッセイ用の対照：
a.非特異的結合
b.80％阻害の可溶性（非ビオチン化TRAF2）。
本明細書において引用した刊行物と特許出願の全て
を、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典
明示により特に個々に取り込まれることが示されている
ように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を
理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳
細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請
求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と
修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かる
であろう。
を、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典
明示により特に個々に取り込まれることが示されている
ように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を
理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳
細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請
求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と
修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かる
であろう。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人:Cao,Zhaodan
（ii）発明の名称:TRAF2結合性キナーゼ
（iii）配列の数:2
（iv）通信宛先：
（Ａ）宛先:SCIENCE ＆ TECHNOLOGY LAW GROUP
（Ｂ）通り:268 BUSH STREET,SUITE 3200
（Ｃ）都市:SAN FRANCISCO
（Ｄ）州:CALIFORNIA
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）ジップ:94104
（ｖ）コンピューター読取可能形態：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル
（Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0,Versi
on＃1.30 （vi）本出願のデータ： （Ａ）出願番号:US （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）代理人情報 （Ａ）氏名:OSMAN,RICHARD A （Ｂ）登録番号:36,627 （Ｃ）参照／書類番号:T97−002 （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話：（415）343−4341 （Ｂ）テレファックス：（415）343−4342 （２）配列番号:1 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:2994塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型:cDNA （ix）特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:73..2259 （xi）配列： （２）配列番号:2 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:729アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （xi）配列：
on＃1.30 （vi）本出願のデータ： （Ａ）出願番号:US （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）代理人情報 （Ａ）氏名:OSMAN,RICHARD A （Ｂ）登録番号:36,627 （Ｃ）参照／書類番号:T97−002 （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話：（415）343−4341 （Ｂ）テレファックス：（415）343−4342 （２）配列番号:1 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:2994塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型:cDNA （ix）特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:73..2259 （xi）配列： （２）配列番号:2 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:729アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子型：タンパク質 （xi）配列：
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/48 5/00 Ａ
(56)参考文献 ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，1995，Ｖ
ｏｌ．２，ｐｐ．167−174
Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ,
1995，Ｖｏｌ．14，Ｎｏ．12，ｐｐ.
2876−2883
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1996，Ｖ
ｏｌ．16，Ｎｏ．４，ｐｐ．1295−1304
Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂ．1997，Ｖｏ
ｌ．385，ｐｐ．540−544
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/12
C12N 15/54
C12N 9/12
C12Q 1/48
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (10)
- 【請求項１】配列番号２を含んでなるTRAF2結合性キナ
ーゼ活性を有する単離タンパク質。 - 【請求項２】上記タンパク質が、ＩκＢ基質をＩκＢα
のセリン36、ＩκＢβのセリン23又はＩκＢεのセリン
161又は22で特異的にリン酸化する請求項１に記載の単
離タンパク質。 - 【請求項３】上記タンパク質が配列番号:2を含む請求項
１に記載の単離タンパク質。 - 【請求項４】請求項１から３のいずれか一項に記載のタ
ンパク質をコードする組換え核酸。 - 【請求項５】請求項４に記載の核酸を含んでなる細胞。
- 【請求項６】請求項４に記載の核酸を宿主細胞又は細胞
抽出物中に導入し、上記核酸が転写物として発現し、該
転写物が上記タンパク質を含んでなる翻訳産物として発
現される条件下で上記宿主細胞又は抽出物をインキュベ
ートし、上記翻訳産物を単離する工程を含んでなる請求
項１から３のいずれか一項に記載の単離タンパク質の調
製方法。 - 【請求項７】請求項６に記載の方法により調製された単
離タンパク質。 - 【請求項８】配列番号１、あるいは配列番号１の少なく
とも24の連続塩基を有し、配列番号１の配列を有する核
酸と特異的にハイブリダイズするのに充分なそのフラグ
メントを含んでなる単離核酸。 - 【請求項９】TRAF2結合性キナーゼ活性を有するタンパ
ク質の結合標的への結合を変調する薬剤のスクリーニン
グ方法において、 請求項２又は３に記載の単離タンパク質、上記タンパク
質の結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤が
存在しなかったら上記タンパク質が基準親和性をもって
上記結合標的に特異的に結合する条件下で、インキュベ
ートし、 上記結合標的に対する上記タンパク質の結合親和性を検
出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、 薬剤偏向親和性と基準親和性の間の差が、上記結合標的
に対する上記タンパク質の結合を上記薬剤が変調するこ
とを示す方法。 - 【請求項１０】TRAF2結合性キナーゼ活性を有するタン
パク質によりリン酸化を変調する薬剤をスクリーニング
する方法において、 請求項２又は３に記載の単離タンパク質、ＩκＢαのセ
リン36、ＩκＢβのセリン23又はＩκＢεのセリン161
又は22を含むＩκＢ基質、及び候補薬剤を含む混合物
を、該薬剤が存在しなかったら上記タンパク質が基準親
和性をもって上記基質をセリン残基で特異的にリン酸化
する条件下で、インキュベートし、 上記タンパク質による上記基質のリン酸化を検出して薬
剤偏向活性を決定する工程を含んでなり、 薬剤偏向活性と基準活性の間の差が、ＩκＢ基質のリン
酸化を上記薬剤が変調することを示す方法。
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| US08/812,533 | 1997-03-07 | ||
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| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．４，ｐｐ．１２９５−１３０４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂ．１９９７，Ｖｏｌ．３８５，ｐｐ．５４０−５４４ |
| Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９５，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１２，ｐｐ．２８７６−２８８３ |
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