JP2001505063A

JP2001505063A - ＩκＢキナーゼ類

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Publication number: JP2001505063A
Application number: JP53888698A
Authority: JP
Inventors: カオ，ジョーダン
Original assignee: トゥラリックインコーポレイテッド
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2001-04-17
Anticipated expiration: 2018-03-06
Also published as: WO1998039410A1; CA2281895A1; AU719774B2; US5776717A; AU6691398A; JP3500156B2; CA2281895C; EP1017786A4; EP1017786A1; US5837514A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｔ２Ｋタンパク質として知られるＩκＢ調節タンパク質、及び関連した核酸に関する方法と組成物を提供する。本タンパク質は開示されたＴ２Ｋコード核酸からの形質転換宿主細胞から組換え的に産生されてもヒト細胞から精製してもよい。本発明は開示されたＴ２Ｋ遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な特異的ハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、特異的抗体のようなＴ２Ｋ特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造し、診断法、治療法及び生物製剤工業において使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＩκＢキナーゼ類緒言発明の分野この発明の分野はシグナル伝達を調節するキナーゼ類のファミリーである。背景炎症性サイトカイン類ＩＬ−１及びＴＮＦは、大抵は転写因子ＮＦ−κＢにより媒介される機能である、細胞における遺伝子発現の変更により、多様な生物学的活動を行う。刺激されていない細胞において、ＮＦ−κＢタンパク質は、阻害性分子との複合体であるＩκＢタンパク質を形成し、細胞質において不活性にされる。サイトカイン類と他の刺激に反応して、ＩκＢタンパク質は特定のセリン残基でリン酸化される。特に、コンセンサス配列ＤＳＧＬ／ＩＸＳＭ／Ｌの一部としての２つのセリン残基（例えばＩκＢαのセリン３２と３６、ＩκＢβのセリン１９と２３、及びメチオニンの使用に依存してＩκＢεのセリン１５７と１６１、あるいは１８と２２のそれぞれ）のリン酸化は、ユビキチン化とプロテオソーム媒介分解のタンパク質をマークし、ＮＦ−κＢを放出しこれが核に入って、炎症性及び免疫応答に関与するタンパク質をコード化する遺伝子を活性化する。以下において、ＩκＢセリン３６という用語は前記のコンセンサス配列の第２のセリン残基、例えばＩκＢαのセリン３６、ＩκＢβのセリン２３、及びＩκ Ｂεのセリン１６１又は２２を上位概念的に指すために使用する。ＮＦ−κＢ活性化に対するＴＮＦ及びＩＬ−１シグナル伝達経路を描写することにより、ＴＲＡＦ分子が異なったサイトカインに対する収束点であり、ＴＲＡＦ２がＴＮＦ−の、ＴＲＡＦ６がＩＬ−１−誘導ＮＦ−κＢ活性化に関与していることが分かった。我々はＴＲＡＦ２随伴キナーゼ活性を含むＩκＢキナーゼのファミリー（Ｔ２Ｋと命名する）と、特定の調節残基上でＩκＢをリン酸化するＫＩＡＡ０１５１遺伝子産物の翻訳物をここに開示する。我々は、そのようなキナーゼ活性をもたらす天然のタンパク質の精製、誘導されたＴ２Ｋペプチドの配列決定、及び天然のＴ２ＫｃＤＮＡのクローニングをまた開示する。関連文献 Nagaseら(1995)DNA Res.2(4),167-174はＫＩＡＡ０１５１を含む多くの未同定のヒト遺伝子由来の概念的コード配列を報告している。Songらの米国特許出願第０８／６７７８６２号はＴＲＡＦ２関連キナーゼを開示している。発明の概要本発明は、Ｔ２Ｋタンパク質と呼ばれる天然の単離された調節タンパク質、関連する核酸、及びＴ２Ｋ特異的活性を有するそのタンパク質ドメインに関する方法及び組成物を提供する。該タンパク質は主題のＴ２Ｋコード核酸由来の形質転換宿主細胞から組換え的に産生されても哺乳動物細胞から精製されてもよい。本発明は、開示されたＴ２Ｋ遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離Ｔ２Ｋハイブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗体のようなＴ２Ｋ特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造し、診断法（例えば、Ｔ２Ｋ転写物に対する遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーン）、治療法（例えばＴ２Ｋ遺伝子発現を変調する遺伝子療法）及び生物薬剤工業（例えば免疫原、他の転写調節因子を単離するための試薬、薬理学的リード薬剤のために化学ライブラリをスクリーニングするための試薬等々）に使用する方法を提供する。発明の詳細な説明ヒトＴ２Ｋタンパク質をコードしている天然ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１として示され；概念的全長翻訳物は配列番号２として示される。本発明のＴ２Ｋタンパク質は配列番号１の不完全翻訳物と配列番号２の欠失変異体を含み、この翻訳物と欠失変異体はＴ２Ｋ特異的アミノ酸配列とアッセイにより識別可能なＴ２Ｋ特異的結合特異性又は機能を有する。このような活性なＴ２Ｋ欠失変異体、Ｔ２Ｋペプチド又はタンパク質ドメインは、配列番号２の少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０の連続残基の配列を含んでなり、該配列が配列番号１の塩基１７５６−２０９５の翻訳物とＫＩＡＡ０１５１遺伝子産物の双方を区別する。例えば、以下に同定されるＴ２Ｋタンパク質ドメインは、以下に記載されているように、とりわけ固相結合及びキナーゼアッセイにおいて同定され使用されるタンパク質結合ドメインを提供することが示される。Ｔ２Ｋ特異的活性又は機能は、簡便なインビトロ、細胞ベース、又はインビボアッセイ：例えば動物でのインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ（例えば遺伝子療法、遺伝子組換え動物等々）等々により決定することができる。結合アッセイは、結合標的とのＴ２Ｋタンパク質の分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを包含する。結合標的は、ＩκＢ又はＴＲＡＦ２のような天然の細胞内結合標的（基質、アゴニスト及びアンタゴニストを含む）であったり、Ｔ２Ｋ活性又はその局在化を直接変調するその他の制御因子；あるいは抗体のような特異的免疫タンパク質、又は以下に記載するようなスクリーニングアッセイにおいて同定されるもののようなＴ２Ｋ特異的薬剤のような非天然結合標的でもよい。Ｔ２Ｋ結合特異性は、結合平衡定数（通常少なくとも約１０⁷Ｍ^-1、好ましくは少なくとも約１０⁸Ｍ^-1、より好ましくは少なくとも約１０⁹Ｍ^-1）により、Ｔ２Ｋ発現細胞における負の変異体として機能し、異種性宿主（例えばげっ歯類又はウサギ）においてＴ２Ｋ特異的抗体を誘発する等々の主題タンパク質の能力；あるいは好適な実施態様ではキナーゼ活性により、検定することができる。本発明に係るＴ２Ｋタンパク質は単離されるか純粋である：「単離」タンパク質は、天然の状態では付随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、与えられた試料中の全タンパク質の好ましくは少なくとも約０．５％，より好ましくは少なくとも約５％を構成し、純粋なタンパク質が与えられた試料中の全タンパク質の少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９９％を構成する。Ｔ２Ｋタンパク質とタンパク質ドメインは合成されても、組換え技術により産生されても、あるいは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞から精製されてもよい。非常に広範な分子及び生化学的方法が主題組成物の生化学合成、分子発現及び精製に利用できる。例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子クローニング、実験室マニュアル)（Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学における現在のプロトコール)（Ausubelら編、Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience, NY）あるいは当該分野でその他知られているものを参照されたい。本発明は、天然及び非天然Ｔ２Ｋ特異的結合薬剤、かかる薬剤を同定し調製する方法、及び診断法、治療法及び製薬開発におけるその用途を提供する。例えば、Ｔ２Ｋ特異的薬剤は様々な診断及び治療用途に有用である。新規なＴ２Ｋ特異的結合薬剤には、Ｔ２Ｋ特異的レセプター、例えば特異的抗体のような体細胞性組換えタンパクレセプター又はＴ細胞抗原レセプター（例えばHarlowとLane（１９８８）Antibodies，A Laboratory Manual(抗体、実験室マニュアル)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）及び例えば一重、二重及び二重ハイブリッドスクリーンのようなアッセイで同定されるその他の天然の結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリのスクリーンで同定される非天然細胞内結合薬剤等々が包含される。診断用途では、結合薬剤は、結合薬剤に直接抱合され、又は結合薬剤に特異的なプローブに抱合される、例えば蛍光、放射能、化学発光、あるいは他の容易に検出可能な分子でしばしば標識される。特に興味深い薬剤はＴ２Ｋ機能、例えばＴ２Ｋキナーゼ活性を変調する；例えば単離細胞、全組織、あるいは個体をＴ２Ｋ結合薬剤で処理してＮｆκＢ活性化のようなＴ２Ｋキナーゼ依存性プロセスを活性化、阻害、又は変更するようにしてもよい。開示したＴ２Ｋタンパク質のアミノ酸配列は、選択された発現系に対して最適化されたＴ２Ｋタンパク質コード核酸を逆翻訳するために使用されるか（Holler ら(1993)Gene 136,323-328;Martinら(1995)Gene 154,150-166）、天然のＴ２Ｋコード核酸配列の単離に使用される変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを産生するために使用される（「ＧＣＧ」ソフトウェア、ジェネティクス・コンピュータ・グループ・インク、マディソンＷＩ）。Ｔ２Ｋコード核酸配列は、Ｔ２Ｋ発現ベクターに使用され、例えば発現及びスクリーニングのために組換え宿主細胞に、例えばＴ２Ｋ変調細胞機能に関与する疾患に対する候補薬の効能等の機能性研究等々のための遺伝子組換え動物に導入される。本発明はまた、配列番号１に含まれるこれまでに新規なＴ２ＫｃＤＮＡ特異的配列を有し（その補体及び類似体及び例えばＲＮＡにおける対応配列を有するその補体を含む）、それに対して特異的ハイブリダイゼーションを行う（すなわち、ＫＩＡＡ０１５１遺伝子の存在下で配列番号１及び配列番号１の塩基１７５６− ２０９５からなる核酸に特異的にハイブリダイズする）のに充分な核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。かかるプライマーもしくはプローブは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、最も好ましくは少なくとも９６の塩基長である。特異的ハイブリダイゼーションを実証するには一般に厳密な条件、例えば４２℃の温度で５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ７．７、０．００１ＭのＥＤＴＡ）中に３０％のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし４２℃において０．２ｘＳＳＰＥで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件、好ましくは例えば４２℃の温度で５ｘＳＳＰＥ中に５０％のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし４２℃において０．２ｘＳＳＰＥバッファーで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件を必要とする。Ｔ２ＫｃＤＮＡ相同体はまた例えばＢＬＡＳＴＸ（Altschulら(1990)Basic Local Alignmen t Search Tool，J Mol Biol 215，403-410）のような整合化アルゴリズムを使用して他のタンパク質から区別することもできる。主題の核酸は、合成／非天然配列のものであり、及び／又は単離される、すなわちその天然の状態で付随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、好ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少なくとも約０．５％，より好ましくは少なくとも約５％を構成し、通常は、天然染色体上に結合しているもの以外のヌクレオチド（群）に結合した天然配列又は非天然配列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含んでなる核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置している末端か、天然染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある１０ｋｂ、好ましくは２ｋｂよりも小さい負のフランキング領域が隣に位置している末端に含んでいる。核酸は通常はＲＮＡもしくはＤＮＡであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を含んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしばしば好適である。主題の核酸には、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等々としての使用；Ｔ２Ｋ遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検出し、更なるＴ２Ｋ相同体及び構造類似体をコードする核酸を検出又は増幅するための使用を含む広範な応用範囲が見出される。診断法では、Ｔ２Ｋハイブリダイゼーションプローブが、臨床及び実験室試料中の野生型及び変異体Ｔ２Ｋ対立遺伝子を同定する際に使用される。変異体対立遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを産生するために使用される。治療法では、治療用Ｔ２Ｋ核酸が活性なＴ２Ｋの細胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために使用される。例えば、Ｔ２Ｋ核酸は活性なＴ２Ｋタンパク質の細胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために使用される。Ｔ２Ｋ阻害核酸は典型的には開示された天然Ｔ２Ｋコード配列の補体を含んでなるアンチセンス、一本鎖配列である。与えられたＴ２Ｋタンパク質の発現のアンチセンス変調には遺伝子調節配列に作用可能に連結したアンチセンス核酸を使用してもよい。遺伝子の転写が内因性Ｔ２ＫコードｍＲＮＡに結合可能なアンチセンス転写物を生じるように配向されたプロモータ配列を持つＴ２Ｋ配列を含んでなるベクターを細胞に形質移入する。アンチセンス核酸の転写は構成的又は誘発性であり、ベクターは安定した染色体外イメンテナンス又は組込みをもたらし得る。別法としては、与えられたＴ２Ｋタンパク質をコードするゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡに結合する一本鎖アンチセンス核酸を、標的タンパク質の発現が大幅に減少する濃度で、宿主中の又は宿主から一時的に単離された標的細胞に投与してもよい。Ｔ２Ｋ発現の増強は、対応する遺伝子産物の機能性発現を増大させるＴ２Ｋ核酸を標的細胞型中に導入することにより行われる。このような核酸はＴ２Ｋ発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能性発現を上方制御するベクター、又は変異体対立遺伝子の標的修正のための置換ベクターであってもよい。生きた細胞中に核酸を導入する技術は当該分野において知られており、レトロウィルスベースの形質移入、ウィルスコートタンパク質−リポソーム性形質移入等々が含まれる。本発明はＩκＢセリン３６特異的キナーゼタンパク質変調性細胞機能のレベルで活性な薬剤、化合物又は薬剤用のリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング法は天然のＩκＢセリン３６特異的キナーゼタンパク質結合標的とのＩκＢセリン３６特異的キナーゼタンパク質の相互作用を変調する化合物に対するアッセイを含む。標識インビトロタンパク−タンパク結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ等々を含む結合薬剤に対する広範なアッセイが提供される。該方法は、リード化合物に対しての化学ライブラリの自動でコスト性能の良い高処理スクリーニングに受け入れられる。このようなライブラリは数多くの化学クラスの候補薬剤を包含するが、典型的には有機化合物；好ましくは小さい有機化合物であり、合成もしくは天然化合物のライブラリを含む広範なソースから得られる。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業で使用される；例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のための活性を最適化し毒性を最小化することができる。インビトロ結合アッセイでは、他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ等との融合産物の一部であってもよいＴ２Ｋタンパク質のようなＩκＢセリン３６特異的キナーゼタンパク質を含む成分の混合物を使用する。アッセイ混合物は、キナーゼタンパク質の天然の細胞内結合標的を含む。天然の結合標的を使用してもよいが、その部分がアッセイにおいて簡便に測定可能な主題キナーゼタンパク質に対する結合親和性及び結合活性をもたらす限り、その部分（例えばペプチド）を使用することがしばしば好ましい。特定の実施態様では、結合標的はＩκＢセリン３６を含んでなる基質である。このような基質は、セリン３６残基と、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の天然に生じる直ぐ隣りに位置する残基（すなわち、ＩκＢα、 βもしくはε由来基質に対してそれぞれ残基２６−４６、２２−４２、又は１２ −３２もしくは１５１−１７１の残基）を各側に含むＩκＢα、βもしくはεペプチドを含んでなる。アッセイ混合物はまた候補薬理剤及び典型的には塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等々のような様々なその他の試薬を含有する。混合物成分は、要求された結合をもたらす任意の順序で添加することができ、最適な結合を容易にする任意の温度でインキュベーションを実施することができる。ついで、混合物は、候補の薬理剤が存在しなかったらキナーゼタンパク質が細胞結合標的、部分又は類似体に基準結合親和性をもって特異的に結合するような条件下でインキュベートされる。インキュベート期間は同様に最適結合となるように選択されるが、迅速な高処理スクリーニングを容易にするように最小化される。インキュベート後、キナーゼタンパク質と一又は複数の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便な方法で検出される。分離工程が未結合成分から結合成分を分離するために最初に使用される。分離は、沈降（例えばＴＣＡ沈降、免疫沈降等々）、固定化（例えば固体基質上）等々により実施してもよく、続いて、例えば膜ろ過、ゲルクロマトグラフィー（例えばゲルろ過、アフィニティー等々）による洗浄が続く。成分の一つは通常標識を含むか標識に結合される。標識は、放射能、発光、光学もしくは電子密度等々のような直接的検出をもたらすものでも、あるいはエピトープタグ、酵素等々のような間接的検出をもたらすものでもよい。標識と他のアッセイ成分、例えば光学又は電子密度、放射線、非放射性エネルギー移動等々の性質に応じて、様々な方法を使用して標識を検出することができ、あるいは抗体抱合体等々で間接的に検出される。薬剤の存在下での結合アフィニティーと比較して薬剤の非存在下における標的に対するキナーゼタンパク質の結合アフィニティーの差は、薬剤が結合標的に対するキナーゼタンパク質の結合を変調することを示している。同様に、以下に記載される細胞ベース転写アッセイにおいても、薬剤の存在及び不存在下におけるキナーゼタンパク質転写誘導の差は、薬剤がキナーゼ変調転写を変調することを示している。本明細書において使用される差は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の差を表す。次の実験部分と実施例は例証のために提供するもので限定をなすものではない。実験Ｔ２Ｋの同定：Ｎ末端フラッグ−エピトープタグを持つヒトＴＲＡＦ２タンパク質の発現を指示するＤＮＡプラスミドを２９３細胞に安定に形質移入した。懸濁培養液中で成長させた細胞を、２０００ＲＰＭで５分間回転させるソーバル(Sorvall)GS−３ロータにより５００ｍｌボトル中でペレット化し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２５ＯｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのβグリセロリン酸、５ｍＭのリン酸ｐ−ニトロフェニル、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのベンズアミジン、０．４ｍＭのフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのメタ亜硫酸水素ナトリウム、０．１％のＮＰ−４０及び１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む５ペレット化細胞容量の「溶解バッファー」に溶解した。時折揺らして３０分間氷上でインキュベーションした後、細胞溶解物を４０００ＲＰＭで１０分間ソーバルＨ６０００Ａロータにより５０ｍｌのコニカルチューブ中で遠心分離した。上清を収集し、ベックマン４５ＴＩロータにおいて４００００ＲＰＭで２時間遠心分離した。ＴＲＡＦ複合体をセファロースに架橋した抗フラッグモノクローナル抗体（ＶＷＲ）（２００ｍｌの抽出物に対して１．５ｍｌのセファロースビーズ）を使用して免疫沈降させた。免疫沈降物を、細胞溶解バッファーで４回、１モルのＮａＣｌを含む溶解バッファーで２回、そして溶解バッファーで２回洗浄した。この段階で、免疫複合体が野生型ＩκＢα及びβを効果的にリン酸化し得るが、アラニンで置換した２つのセリンを持つ変異体はリン酸化しない。ついで、ＴＲＡＦ２複合体を含むセファロースビーズを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０ｍＭのβグリセロリン酸、２０ｍＭのリン酸ｐ−ニトロフェニル、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのベンズアミジン、０．４ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのメタ亜硫酸水素ナトリウム、１ｍＭのＡＴＰ、及び２０ｍＭのクレアチンリン酸を含む４．５ｍｌｓのキナーゼバッファー中において３０℃で１時間インキュベーションした。インビトロキナーゼ反応後に、有意な量のＩκＢキナーゼ活性が、１ｍｌのヘパリンアガロースカラムに負荷されＮａＣｌ勾配で溶出された可溶性画分中に見出された。ＩκＢキナーゼ活性は、セントリコン（Amicon）で５０ｕｌまで濃縮した画分フロー中に回収された。スマート（Smart）システム（ファーマシア）により駆動されるスーパーデックス（superdex）２００ゲルろ過カラム上で材料を分画して溶出液を５０ｕｌ画分に収集した。キナーゼ活性は６７０ｋＤの分子サイズマーカーと相関付けされた画分中に回収された。これらの画分をプールし、ＮａＣｌ線形勾配でモノＱカラムで更に分離した。キナーゼ活性は０．３から０．４ＭのＮａＣｌ溶出液中に見出された。ＳＤＳゲルで分離したカラム画分の銀染色により、スーパーデックス２００とモノＱ分画の双方においてキナーゼ活性に相関付けされた８５から９０ｋＤのポリペプチドが明らかになった。ＳＤＳゲルろ過後、このポリペプチドをマイクロペプチド配列決定にかけた。得られた一つのペプチド配列がメルク−ワシントン大学のＥＳＴデータベースの部分的ｃＤＮＡ配列に一致した。７２９アミノ酸に対するオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡクローンをＨｅＬａ細胞から産生したラムダファージｃＤＮＡライブラリから単離した。配列解析により、予想されたタンパク質（Ｔ２Ｋ）のＮ末端部分にプロテインキナーゼドメインが明らかになった。Ｔ２Ｋのキナーゼドメインでタンパク質配列データベースをサーチして、Ｔ２Ｋ、特にプロテインキナーゼドメインに高度に相同な（７５％同一性）タンパク質（ＫＩＡＡ０１５１）が同定された。ＫＩＡＡ０１５１は未知の機能を持つキナーゼであり、Nagase T らによりヒトＫＧ−１細胞から単離された新規なｃＤＮＡ配列として報告されている(DNA Res.2(4),167-174(1995))。基質特異性の分析により、Ｔ２ＫとＫＩＡＡ０１５１の双方がＩκＢセリン３６を特異的にリン酸化しＴＲＡＦ２と結合することが明らかになった。更に、欠失変異体分析により、１０−２５０残基がキナーゼドメインを定め、Ｔ２ＫとＫＩＡＡ０１５１に対して、残基２５１−７２９と２５１−７１６がそれぞれＩκ Ｂキナーゼ活性に対する負の変異体として活性な調節ドメインを定めることが明らかになった。組換えＴ２Ｋキナーゼは大腸菌及びバキュロウィルス発現系においてＧＳＴ融合タンパク質を過剰発現させることにより調製される。実施例１．Ｔ２Ｋ−ＩκＢαリン酸化アッセイに対するプロトコールＡ．試薬： −ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍｌ。 −キナーゼ：ＰＢＳに２０μｇ／ｍｌで入れた１０−⁸−１０^-5Ｍのキナーゼ（配列番号２）。 −基質：ＰＢＳに４０μｇ／ｍｌで入れた１０^-7−１０^-4Ｍのビオチン化基質（ヒトＩκＢαの２６−４６残基からなる２１残基ペプチド）。 −阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％のＢＳＡ、０．５％のトウィーン２０；室温で１時間。 −アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＭｎＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのＢＭＥ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。 −[³²Ｐ]γ−ＡＴＰの１０ｘ保存液：１００μＣｉ[³²Ｐ]γ−ＡＴＰを伴う２ｘ１０^-5Ｍの非放射性ＡＴＰ。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。 −プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−６５０６）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ₃（シグマ＃Ｓ−６５０８）。Ｂ．アッセイプレートの調製： −４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎ−アビジンでコーティング。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。 −１５０μｌの阻害バッファーで阻害。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。Ｃ．アッセイ： −４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。 −４０μｌのビオチン化基質（アッセイバッファー中に２−２００ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −４０μｌのキナーゼ（アッセイバッファー中に０．１−１０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −１０μｌの化合物又は抽出物を添加。 −１０μｌの[³²Ｐ]γ−ＡＴＰの１０ｘ保存液を添加。 −２５℃で１５分間振とう。 −２５℃で更に４５分間インキュベ−ト。 −２００μｌのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を停止。 −１５０μｌのシンチレ−ションカクテルを添加。 −トップカウントをカウント。Ｄ．（各プレート上にある）全アッセイ用の対照：ａ．非特異的結合ｂ．８０％阻害の非放射性ＡＴＰ。２．ＫＩＡＡ０１５１−ＩκＢβリン酸化アッセイに対するプロトコールＡ．試薬： −ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍｌ。 −キナーゼ：ＰＢＳに２０μｇ／ｍｌで入れた１０^-8−１０^-5Ｍの切断ＫＩＡＡ０１５１キナーゼ（４−７１４残基）。 −基質：ＰＢＳに４０μｇ／ｍｌで入れた１０^-7−１０^-4Ｍのビオチン化基質（ヒトＩκＢβの２２−４２残基からなる２１残基ペプチド）。 −阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％のＢＳＡ、０．５％のトウィーン２０；室温で１時間。 −アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＭｎＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのＢＭＥ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。 −[ ³² Ｐ]γ−ＡＴＰの１０ｘ保存液：１００μＣｉ[³²Ｐ]γ−ＡＴＰを伴う２ｘ１０^-5Ｍの非放射性ＡＴＰ。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。 −プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−６５０６）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ₃（シグマ＃Ｓ−６５０８）。Ｂ．アッセイプレートの調製： −４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎ−アビジンでコーティング。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。 −１５０μｌの阻害バッファーで阻害。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。Ｃ．アッセイ： −４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。 −４０μｌのビオチン化基質（アッセイバッファー中に２−２００ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −４０μｌのキナーゼ（アッセイバッファー中に０．１−１０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −１０μｌの化合物又は抽出物を添加。 −１０μｌの[³²Ｐ]γ−ＡＴＰの１０ｘ保存液を添加。 −２５℃で１５分間振とう。 −２５℃で更に４５分間インキュベート。 −２００μｌのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を停止。 −１５０μｌのシンチレーションカクテルを添加。 −トップカウントをカウント。Ｄ．（各プレート上にある）全アッセイ用の対照：ａ．非特異的結合ｂ．８０％阻害の非放射性ＡＴＰ。３．高収量Ｔ２Ｋ−ＴＲＡＦ２ヘテロ二量体生成アッセイに対するプロトコールＡ．試薬： −ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍｌ。 −阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％のＢＳＡ、０．５％のトウィーン２０；室温で１時間。 −アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。 − ³³ ＰＴ２Ｋタンパク質の１０ｘストック：２００，０００−２５０，０００ｃｐｍの標識Ｔ２Ｋ（ベックマンカウンター）が補填された１０^-8−１０^-6 Ｍの「非放射性」Ｔ２Ｋ。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。 −プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−６５０６）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ₃（シグマ＃Ｓ−６５０８）。 −ＴＲＡＦ２：ＰＢＳ中の１０^-7−１０^-5Ｍのビオチン化ＴＲＡＦ２Ｂ．アッセイプレートの調製： −４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎ−アビジンでコーティング。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。 −１５０μｌの阻害バッファーで阻害。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。Ｃ．アッセイ： −４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。 −１０μｌの化合物又は抽出物を添加。 −１０μｌの³³Ｐ−Ｔ２Ｋ（２０−２５，０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌ／ウェル＝１０^-9−１０^-7Ｍ最終濃度）を添加。 −２５℃で１５分間振とう。 −２５℃で更に４５分間インキュベート。 −４０μｌのビオチン化ＴＲＡＦ２（アッセイバッファー中に０．１−１０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −室温で１時間インキュベート −２００μＭのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を停止。 −１５０μＭのシンチレーションカクテルを添加。 −トップカウントをカウント。Ｄ．（各プレート上にある）全アッセイ用の対照：ａ．非特異的結合ｂ．８０％阻害の可溶性（非ビオチン化ＴＲＡＦ２）。本明細書において引用した刊行物と特許出願の全てを、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典明示により特に個々に取り込まれることが示されているように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣ１２Ｑ 1/48 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号２、あるいはＴ２Ｋ特異的活性を有するそのフラグメントを含んでなる単離Ｔ２Ｋタンパク質。２．上記タンパク質がＩκＢをセリン３６で特異的にリン酸化する請求項１に記載の単離タンパク質。３．上記タンパク質が配列番号２の欠失変異体を含んでなり、該欠失変異体が配列番号２の残基１−２５０又は２５１−７２９を含んでなる請求項１に記載の単離タンパク質。４．請求項１に記載のタンパク質をコードしている組換え核酸。５．請求項４に記載の核酸を含んでなる細胞。６．単離Ｔ２Ｋタンパク質の調製方法において、請求項４に記載の核酸を宿主細胞又は細胞抽出物中に導入し、上記核酸が転写物として発現し、該転写物が上記タンパク質を含んでなる翻訳産物として発現される条件下で上記宿主細胞又は抽出物をインキュベートし、上記翻訳産物を単離する工程を含んでなる方法。７．請求項６に記載の方法により調製された単離Ｔ２Ｋタンパク質。８．配列番号１、あるいは配列番号１の少なくとも２４の連続塩基を有し、配列番号１の配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分なそのフラグメントを含んでなる単離Ｔ２Ｋ核酸。９．Ｔ２Ｋタンパク質の結合標的への結合を変調する薬剤のスクリーニング方法において、請求項１に記載の単離タンパク質、上記タンパク質の結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤が存在しなかったら上記タンパク質が基準親和性をもって上記結合標的に特異的に結合する条件下で、インキュベートし、上記結合標的に対する上記タンパク質の結合親和性を検出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、薬剤偏向親和性と基準親和性の間の差が、上記結合標的に対する上記タンパク質の結合を上記薬剤が変調することを示す方法。１０．上記結合標的がＩκＢセリン３６を含む基質であり、上記結合親和性が上記ＩκＢセリン３６のリン酸化として検出される請求項９に記載の方法。１１．ＩκＢセリン３６に対して特異的なＩκＢキナーゼによりＩκＢリン酸化を変調する薬剤をスクリーニングする方法において、単離ＩκＢセリン３６特異的キナーゼ、ＩκＢセリン３６を含んでなる基質、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤が存在しなかったら該キナーゼが基準親和性をもって上記基質をＩκＢセリン３６で特異的にリン酸化する条件下で、インキュベートし、上記キナーゼによる上記基質のリン酸化を検出して薬剤偏向活性を決定する工程を含んでなり、薬剤偏向活性と基準活性の間の差が、ＩκＢセリン３６リン酸化を上記薬剤が変調することを示す方法。１２．上記キナーゼがＫＩＡＡ０１５１又は配列番号２、あるいはＩκＢをセリン３６で特異的にリン酸化する何れかのフラグメントを含んでなる請求項１１に記載の方法。