DE60305634T2

DE60305634T2 - Anaplastisches Lymphoma Kinase Testverfahren, Reagenzien und Kompositionen davon

Info

Publication number: DE60305634T2
Application number: DE60305634T
Authority: DE
Inventors: Lorenzo A. Pinna; Arianna Donella-Deana; Oriano Marin; Luca Mologni; Rosalind Gunby; Carlo Gambacorti Passerini; Leonardo Scapozza
Original assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Current assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2023-03-08
Also published as: JP2006519800A; CN1756850A; CY1106115T1; ATE328112T1; WO2004079326A2; US20070031907A1; HK1068154A1; WO2004079326A3; EP1454992B1; IL170669A0; SI1454992T1; EP1454992A1; DK1454992T3; ES2263862T3; CN100345978C; PT1454992E; DE60305634D1; CA2518094A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Testverfahren zur Messung der Kinaseaktivität der anaplastischen Lymphomkinase (ALK). Die Erfindung bezieht sich speziell auf Verfahren, Reagenzien und Zusammensetzungen zum Nachweis der Tyrosin phosphorydierenden Aktivität der ALK. Das Testverfahren ist insbesondere nützlich für ein invitro Screening und die Identifizierung von möglichen ALK-Inhibitoren.
Die anaplastische Lymphomkinase (ALK) ist eine Rezeptortyrosinkinase, von der angenommen wird, dass sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und der Funktion des Nervensystems spielt. ALK wird normalerweise in dem zentralen Nervensystem mit einer Peak-Expression während der neonatalen Phase exprimiert. Aufgrund von chromosomalen Translokationen wird ALK jedoch auch abweichend davon exprimiert und wird bei einigen Krebsarten in Form von onkogenen Fusionsproteinen aktiviert. Die ALK-Fusionsproteine sind verantwortlich für zirka 5–10 % aller Non-Hodgkin's Lymphoma. Das jährliche Auftreten von ALK positiven Lymphoma beträgt etwa 100.000 weltweit, wobei 2.000–3.000 neue Fälle in den EU-Ländern auftreten. ALK ist ein exzellenter Kandidat für ein therapeutisches Eingreifen, da sie eine wichtige Rolle bei der Onkogenese spielt und ihre normale Expression zum größten Teil auf das zentrale Nervensystem beschränkt ist. Somit könnte ein spezifischer ALK-Inhibitor eine wirksame Behandlung für ALK positive Lymphoma mit wenigen assoziierten klinischen Nebenwirkungen darstellen. Für die Identifizierung von potentiellen ALK-Inhibitoren ist es sehr wünschenswert, ein geeignetes Testverfahren für die direkte Bestimmung des hemmenden Effektes von Verbindungen auf die Enzymaktivität zu entwickeln.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro Kinasetestverfahren, das spezifisch für ALK und nützlich für das Screening von Verbindungen ist, welche die ALK-Aktivitiät modulieren, bereitgestellt. Dieses Testverfahren basiert auf der Verwendung eines Peptidsubstrates, welches vollständig von ALK phosphoryliert wird, und auf dem nachfolgenden Nachweis des so erzielten, phosphorylierten Produktes. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Testverfahren ein ELISA, wobei das phosphorylierte Produkt durch immunochemische Reaktionen nachgewiesen wird.
Um ein selektives ALK-Substrat zu erzeugen, wurden Peptide, welche die Sequenz des ALK-Aktivierungsloops (aa 1274–1294: ALK_HUMAN, Q9UM73, swiss-PROT) reproduzieren, synthetisiert und getestet. Die Peptide ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK (SEQ ID Nr. 1) und ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK (SEQ ID Nr. 2) waren besonders effektiv als ALK-Substrate und zeigten einen Phosphorylierungsgrad, der höher ist als der von polyGlu/Tyr, einem zufälligen Polymer, von dem bekannt ist, dass es ein gutes Substrat für die meisten Tyrosinkinasen darstellt. Der erste Gegenstand gemäß der vorliegenden Erfindung ist somit ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 ausgewählt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis der ALK-Tyrosinkinaseaktivität, welches die folgenden Schritte umfasst:

i) Inkubation des ALK-Proteins oder eines funktionellen Derivates davon mit einem Peptid, das aus SEQ ID Nr. 1 oder 2 ausgewählt ist, unter Bedingungen, die für die Phosphorylierung des Peptides geeignet sind;
ii) Nachweis des so gebildeten, phosphorylierten Peptides.

Wie hier verwendet, bedeutet „funktionelles ALK-Derivat" jede modifizierte Form des ALK-Proteins, zum Beispiel eine abgestumpfte oder konjugierte Form oder ein Fragment davon, welche die katalytische Aktivität der nicht-modifizierten ALK aufrecht erhält. Das funktionelle Derivat sollte vorzugsweise die gesamte katalytische Domäne von ALK enthalten, die sich von den Resten 1116–1392 der ALK-Sequenz erstreckt (Q9UM73). Der Teil des ALK-Proteins, der sich vom Rest Leu¹⁰⁷³ bis Ala¹⁴⁵⁹ erstreckt, wird bevorzugt verwendet. Dieses ALK-Fragment zeigt eine korrekte Faltung (bestätigt durch CD-Spektren) und eine wirksame katalytische Aktivität, wenn es durch rekombinante Gentechnologie unter Verwendung des Expressionssystems auf Basis des Bakulovirus hergestellt wird.
Ferner kann eine Zubereitung, die eine konstitutiv aktive Form von ALK enthält, anstelle des gereinigten Proteins oder seines funktionellen Derivates verwendet werden. Solch eine Zubereitung ist vorzugsweise ein Zelllysat, welches verwendet werden kann, um a) die ALK-Aktivität in ganzen Zellen, welche ALK oder ALK-Fusionsproteine exprimieren, zu bestimmen, und b) den Effekt von potentiellen Inhibitoren auf ALK innerhalb einer Zelle zu bestimmen, indem die ALK exprimierenden Zellen mit unterschiedlichen Verbindungen behandelt werden, und anschließende Testung des Zelllysates auf ALK-Kinaseaktivität.
Um das phosphorylierte Peptid im Schritt ii) zu bestimmen, kann die Phosphorylierungsreaktion des Schrittes i) in Gegenwart eines radioaktiven Reagenzes durchgeführt werden, wie [γ³²P]ATP oder [γ³³P]ATP, wodurch ein radioaktives Produkt gebildet wird, welches einfach durch radiometrische Techniken bestimmt werden kann. Alternativ kann eine Immunreaktion durchgeführt werden, welche die Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem phosphorylierten Peptid und einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper umfasst. Dieser Anti-Phosphotyrosin-Antikörper kann radioaktiv markiert oder mit einem Reporterenzym konjugiert werden, wie Meerrettichperoxidase, Beta-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Glucoseoxidase, was den direkten Nachweis des Antikörpers ermöglicht und so des phosphorylierten Peptides durch Messung der spezifischen Radioaktivität oder der enzymatischen Aktivität. Als weitere Alternative kann der Anti-Phosphotyrosin-Antikörper indirekt durch einen zweiten Antikörper, der den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper erkennt und eine radioaktive Markierung oder ein Reporterenzym trägt, oder durch ein enzymkonjugiertes Streptavidin nachgewiesen werden, welches eine Biotinmarkierung auf dem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper erkennt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für den Nachweis der ALK-Tyrosinkinaseaktivität bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Binden eines Peptides mit der SEQ ID Nr. 1 oder 2 an eine feste Phase;
b) Inkubation der festen Phase mit dem ALK-Fragment, das sich von Leu¹⁰⁷³ bis Ala¹⁴⁵⁹ erstreckt, unter geeigneten Bedingungen für die Tyrosinphosphorylierung;
c) Waschen der festen Phase;
d) Inkubation der festen Phase mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (primärer Antikörper) unter Bedingungen, die für eine Antigen-Antikörper-Bindung geeignet sind;
e) Waschen der festen Phase;
f) Inkubation der festen Phase mit einem enzymkonjugierten Antikörper (sekundärer Antikörper) der den primären Anti-Phosphotyrosin-Antikörper erkennt, unter Bedingungen, die für die Bindung des primären Antikörpers an den sekundären Antikörper geeignet sind, so dass ein dreifacher Immunkomplex gebildet wird;
g) Waschen der festen Phase;
h) Messen der enzymatischen Aktivität des Immunkomplexes, wobei die gemessene Aktivität proportional zu dem Betrag der Tyrosinphosphorylierung ist.

Dieses Testverfahren, welches eigentlich ein Kinasetestverfahren auf ELISA-Basis ist, verwendet Enzym-Antikörper-Konjugate. Das konjugierte Enzym spaltet ein Substrat, um ein gefärbtes Reaktionsprodukt zu erzeugen, das dann spektrophotometrisch durch Messung der Extinktion der gefärbten Lösung nachgewiesen wird, die proportional zu der Menge der Phosphotyrosine ist.
Feste Phasen oder Träger, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen Kunststoffmaterial (Reaktionsplatten, Vertiefungen, Glasflächen), Polystyrol und magnetische Kügelchen, kolloidale Metallpartikel, Glas- und/oder Quarzoberflächen und andere.
Das ALK-Testverfahren auf ELISA-Basis wird vorzugsweise verwendet für das Screening von Verbindungen, welche die Tyrosin phosphorylierende Aktivität von ALK modulieren, insbesondere für das Screening von ALK-Inhibitoren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist somit gerichtet auf ein Verfahren für die Identifizierung von Verbindungen, welche die ALK-Tyrosinkinaseaktivität modulieren, wobei das oben beschriebene ALK-Testverfahren in Gegenwart einer Kandidatenverbindung oder einer Verbindung durchgeführt wird, von der bekannt ist, dass sie die ALK- Tyrosinkinaseaktivität (Kontrolle) stimuliert oder hemmt. Das Verfahren für die Identifizierung von Verbindungen, welche die ALK-Tyrosinkinaseaktivität modulieren, umfasst spezifisch die folgenden Schritte:

i) Inkubation des ALK-Proteins oder eines funktionellen Derivates davon mit einem Peptid, das aus SEQ ID Nr. 1 oder 2 ausgewählt ist, vorzugsweise SEQ ID Nr. 1, in Gegenwart einer Kandidatenverbindung unter Bedingungen, die für die Phosphorylierung des Peptids geeignet sind;
ii) Quantifizierung des so gebildeten, phosphorylierten Peptids.

Verbindungen, welche die ALK-Aktivität hemmen, werden als potentielle therapeutische Mittel zur Verwendung bei der Behandlung von mit ALK verbundenen Tumoren ausgewählt, wie die anaplastischen großen Zelllymphoma und die Non-Hodgkin-Lymphoma. Die ALK-modulierende Aktivität einer Kandidatenverbindung kann mit der einer Referenzverbindung (Kontrolle) verglichen werden, welche unter den gleichen Bedingungen wie die Kandidatenverbindung getestet wird. Staurosporin (Meggio F. et al, Eyr. J. Biochem. (1995) 234, 317–322), das ein wirksamer ALK-Inhibitor bei einer Konzentration von 0,2–0,3 μM darstellt, kann als positive Kontrolle verwendet werden, wenn andere Verbindungen auf ALK-Hemmaktivität getestet werden.
Studien zum molekularen Design gaben wichtige Anhaltspunkte hinsichtlich des Musters an Substitutionen, die erforderlich sind, um die Staurosporinaffinität und Spezifität zu dem ALK-Protein zu verbessern. Die effektivsten Strukturen sind in der folgenden allgemeinen Formel (I) dargestellt:
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander aus Halogen, vorzugsweise Chlor, Phenyl oder C1-C3 Alkyl, das optional mit einem oder mehreren Halogenen substituiert ist, ausgewählt werden; R3 Hydroxyl ist; R4 Hydroxyl oder Hydroxymethyl ist; R5 C1-C3 Alkyl, das optional mit Halogen substituiert ist, oder Benzyl ist.
Die Verbindungen der Formel (I) wirken der Bindung von ATP an die Tyrosinkinasedomäne von ALK innerhalb von onkogenen Fusionsproteinen, wie NPM-ALK, ATIC-ALK, CTLC-ALK, TFG-ALK, oder anderen sporadischen Fusionen mit Tropomyosinen entgegen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Verbindungen (I) in einem ALK-Testverfahren für das Screening von ALK-Inhibitoren verwendet, wie hier offenbart. High-Throughput Screening kann auch unter Verwendung des ALK-Testverfahrens nach der Erfindung implementiert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf einen Kit zur Durchführung des oben beschriebenen ALK-Testverfahrens gerichtet. Der Kit besteht aus einer verpackten Kombination von Reagenzien in vorbestimmten Anteilen. Typischerweise wird der Kit ein Peptid der SEQ ID Nr. 1 oder 2, optional immobilisiert auf einer festen Phase, den Anti-Phosphotyrosin-Antikörper und, falls notwendig, einen Antikörper, der mit einer enzymatischen oder radioaktiven Markierung gekennzeichnet ist, enthalten. Zusätzlich kann der Kit Reagenzien für die kolorimetrischen oder radiometrischen Reaktionen, Puffer, Kontrollen, wie Stauroporin oder ein Derivat davon, Verdünnungsmittel, Detergenzien, Stabilisatoren und andere Komponenten, die für die Einrichtung und die Durchführung des Testverfahrens nützlich sind, enthalten. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können variiert werden, um die Empfindlichkeit des Testverfahrens zu optimieren. Insbesondere können die Reagenzien in festen oder flüssigen Zubereitungen bereitgestellt werden, wie eine Lösung, Suspension, Dispersion, trockenen Pulvern, lyophylisierten Zubereitungen. Die Kit-Zusammensetzungen werden in einem einzelnen oder getrennten Behältern geliefert. Das Kit kann auch Anweisungen zur Durchführung des Testverfahrens enthalten.
1: Reinigung und Aktivität von rekombinanter His-markierter ALK
A) Silbergefärbtes 10 % SDS-PAGE Gel mit Marker (M), dialysierte und gepoolte DEAE Säulenfraktionen, die auf eine HiTrap-Säule (Ladung) geladen wurden, HiTrap-Säulenfraktionen (Zahlen zeigen die Fraktionsnummer). B) Radioaktives Autophosphorylierungstestverfahren von gereinigter rALK. Spur 1: Autoradiogramm von 32P-markierter rALK. Spur 2: Silberanfärbung der gleichen Probe wie in Spur 1.
2: Kinetiken der ALK-Kinase mit Peptiden
3: Nachweis der rALK-Aktivität unter Verwendung des Kinasetestverfahrens auf Basis ELISA
A) Phosphorylierung des Peptides SEQ ID Nr. 2 durch gereinigte rALK. Eine ELISA-Kinasereaktion wurde durchgeführt mit oder ohne 0,5 μg gereinigter rALK, 15 μg Peptid SEQ ID Nr. 2 oder kein Peptid, bei 30° C für 30 Minuten. Das Diagramm zeigt die Extinktion bei 450 nm. B) Kinetik der ALK-Peptidsubstratphosphorylierung. Eine ELISA-Kinasereaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 206 μM Peptid SEQ ID Nr. 2 oder 42 μM Peptid SEQ ID Nr. 1 mit 0,1 μg von gereinigter rALK. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von EDTA nach 0, 0,5, 2, 5, 10 und 15 Minuten.
4: Wirkung der Peptidsubstratkonzentration auf den Grad der Phosphorylierung
Das ELISA-Testverfahren wurde in Gegenwart von 0,2 μg gereinigter rALK und 0–105 μM Peptid SEQ ID Nr. 1 (A) oder 0–315 μM Peptid SEQ ID Nr. 2 (B) bei 30° C für 15 Minuten durchgeführt.
5: Wirkung der rALK-Konzentration auf die Substratphosphorylierung
Ein ELISA-Testverfahren wurde durchgeführt unter Verwendung von 206 μM Peptid SEQ ID Nr. 2 oder 42 μM Peptid SEQ ID Nr. 1 und rALK von 0 bis 225 ng, bei 30° C für 15 Minuten.
6: Hemmung der rALK-Aktivität durch Staurosporin
Ein ELISA-Testverfahren wurde durchgeführt unter Verwendung von 42 μM SEQ ID Nr. 1 und 20 ng rALK bei 30° C für 15 Minuten in Gegenwart von 0–5 μM Staurosporin oder einem equivalenten Volumen des Lösungsmittes, DMSO. Das Diagramm zeigt A450 normalisiert zu der nicht behandelten Kontrolle.
Experimentelle Ergebnisse
Peptidsynthese
Die Peptide wurden synthetisiert durch automatische Festphasensynthese unter Verwendung der 9-Fluornilmethoxycarbonyl (Fmoc) Chemie mit einem „Applied Biosystems Modell 431 A Synthetisierer" auf 4-Hydroxymethyl-Copolystirol-1 % Divinylbenzol-Harz (0,95 mMol/g; 0,05 mMol).
Fmoc Aminosäuren (0,5 mMol) wurden aktiviert durch 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) (1 eq) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (1 eq) in Gegenwart von DIPEA (2 eq).
Peptidyl-Harze (100 mg) wurden gespalten und entschützt für 2 Stunden in einer Mischung, die 5 ml Trifluoressigsäure, 0,375 g Phenol, 0,1 25 μl 1,2-Ethandithiol, 0,250 μl Thioanisol und 0,25 μl Wasser enthielt. Die Reaktionsmischung wurde auf ein Röhrchen filtriert, das Ethylether, abgekühlt auf 0° C, enthielt. Präzipitierte Peptide wurden mittels Zentrifugation getrennt und mit frischem Ether gewaschen.
Rohe Peptide (50–100 mg in 10 ml Wasser) wurden auf eine präparative RP-Säule (prepaNova HR C18,6 μm, 25 × 10 mm, Waters) gepumpt und mit einem linearen Gradienten von 10 % bis 45 % Acetonitril bei 12 ml/Min. eluiert.
Die Reinheit der Peptide war >90 % gemäß Bestimmung durch die analytische RP-HPLC auf einer 5 μm, C18 Symmetry300 Säule, 4,6 × 250 mm (Waters) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure bei 1 ml/Min. Die Molekulargewichte der Peptide wurden bestätigt durch Massenspektroskopie unter Verwendung eines matrixunterstützten Laser-Deoprtions/Ionisations-Flugzeit (MALDI-Tof)-Spektrometers (Maldi-1; Kratos-Schimadzu, Mancester, UK).
Herstellung und Reinigung von rekombinanter ALK
Ein Teil von ALK, der sich von den Aminosäuren Leu¹⁰⁷³ bis Ala¹⁴⁵⁹ erstreckt, wurde in den Bakulovirus-Transfervektor, pBlueBacHis2C (Invitrogen), kloniert. Unter Verwendung dieses Vektors und des MaxBac^® 2.0 Bakulovirus-Expessionssystems (Invitrogen) haben wir rekombinantes Bakulovirus hergestellt und exprimiertes, rekombinantes ALK (rALK) Protein in Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen. Dieses Protein hat ein theoretisches Molekulargewicht von 49 kDa und enthält die vorhergesagte katalytische Domäne von ALK (Ile¹¹¹⁶ bis Val¹³⁹²), die mit einer 6-Histidin-Marke (His-tag) fusioniert ist. Die Autophosphorylierungsaktivität der His-markierten rALK, was eine korrekte Faltung anzeigt, wurde überprüft durch Anti-Phosphotyrosin-Immunoblotting von ganzen Zelllysaten und einem in vitro radioaktiven Kinasetestverfahren.
Um Protein für die Reinigung herzustellen, wurden die Sf9 Zellen mit rekombinantem Virus mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 infiziert. Die Kulturen wurden für 3 Tage bei 27° C inkubiert und dann durch Zentrifugation bei 400 g für 10 Minuten bei 4° C geerntet. Die Zellpellets wurden bis zur Verwendung bei –80° C gelagert. Um die Zellen zu lysieren, wurden die Zellpellets in hypotonischem Puffer (Puffer A) resuspendiert, der 50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl und Proteaseinhibitoren (Pepstatin, Benzamidin, Leupeptin und Aprotinin) enthielt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten auf Eis wurde die Zellsuspension bei 1.500 g für 15 Minuten bei 4° C zentrifugiert und der Überstand wurde durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Das Filtrat wurde dann auf eine 80 ml Anionenaustauscher Fast Flow DEAE-Sepharose (Sigma) Säule geladen in Gegenwart des Puffers A mit einer Fließrate von 1,5 ml/Min. und unter Verwendung des AKTA FPLC Systems (Amersham-Pharmacia Biotech). Gebundene Proteine wurden in einem NaCl-Gradienten von 20 bis 200 mM eluiert. Die Fraktionen wurden auf Gegenwart des ALK-Proteins durch Immunblotting analysiert. Positive Fraktionen wurden zusammengefasst und für 3 Stunden bei 4° C in 1 Liter von nativem Bindungspuffer dialysiert (20 mM Natriumphosphat pH 7,8; 500 mM NaCl und PI), wobei der Puffer jede Stunde gewechselt wurde. Dialysierte Fraktionen wurden dann auf eine HiTrap^TM-Nickelaffinitäts-Chromatographiesäule (Amersham-Pharmacia Biotech) geladen, die zuvor mit nativem Bindungspuffer äquilibriert wurde, der mit 50 mM Imidazol und 20 mM β-Mercaptoethanol ergänzt war. Ein Fluss von 0,5–1 ml/Min. wurde an die Säule angelegt. Nach Waschen der Säule mit nativem Bindungspuffer wurden die gebundenen Proteine unter Verwendung eines linearen Gradienten von Imidazol im Bereich von 50 bis 200 mM eluiert. Die Fraktionen wurden dann auf Anwesenheit und Reinheit von rALK durch SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert. Die 1A zeigt eine Beispielsreinigung von rALK.
Die positiven Fraktionen wurden dann dialysiert in 50 mM Tris pH 7,4; 100 mM NaCl, 10 % Glycerin, 20 mM β-Mercaptoethanol und Proteaseinhibitoren und bei –80° C bis zur Verwendung gelagert. Um zu prüfen, ob die gereinigte rALK aktiv war, haben wir einen radioaktiven Autophosphorylierungstest durchgeführt. Eine Reaktionsmischung, die 25 μl einer rALK positiven Fraktion; 6 μM kaltes ATP; 1,2 mM DTT, 10 μCi [γ³²P]ATP, 25 mM Hepes pH 7,5; 10 mM MgCl₂ und 10 mM MnCl₂ enthielt, wurde bei 30° C für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmli-Puffer und Erhitzen bei 95° C für 5 Minuten gestoppt. Die Proben wurden aufgelöst auf einem 10 % SDS-PAGE Gel und auf eine Immobilon^TM-P Membran transferiert. Radioaktiv markierte Proteine wurden durch Autoradiographie dargestellt, wie in der 1B dargestellt.
Peptidphosphorylierung (radioaktives Testverfahren)
Die Peptide und das zufällige Polymer polyGlu/Tyr (1 : 4) wurden phosphoriliert in 30 μl eines Mediums, das 50 mM Tris/HCl, pH 7,5; 5 mM MnCl₂, 10 μM Na-Vanadat, 30 μM [γ³²P]ATP oder [γ³³P]ATP (spezifische Aktivität 1.000 cpm/pMol) und 10 Einheiten von rALK [eine Einheit wurde definiert als die Menge an Enzym, welche 1 pMol Phosphat pro Minute zu polyGluTyr (0,1 mg/ml) transferiert] enthielt. Die Reaktionen wurden beendet nach einer 10-minütigen Inkubation bei 30° C durch Aufbringen von 25 μl der Mischung auf P81 Phosphorcellulosepapiere, die dann verarbeitet wurden, wie beschrieben an anderer Stelle (1). Die kinetischen Konstanten wurden bestimmt mit der GraphPad Prism-Software, welche die Daten direkt auf die Michaelis-Menten-Gleichung unter Verwendung der nicht linearen Regression anpasst.
Ergebnisse
Das Peptid, das von der ALK-Referenzsequenz abstammte und Tyr-1278 enthielt, war ein gutes Substrat der rALK, während die Peptide, die entweder Tyr-1282 oder Tyr-1283 enthielten, nur schwach durch das Enzym beeinflusst wurden (siehe 2). Das Tyr-1278-Derivat wurde phosphoryliert mit einer Effizienz, die sogar höher war als die, welche durch das Peptid, das drei Tyr-Reste trug, angezeigt wurde (Tabelle 1). Um zu bestätigen, dass das Tyr-1278-Derivat ein optimales Peptidsubstrat für die ALK katalytische Domäne ist, haben wir seinen Phosphorylierungsgrad mit dem von polyGlu/Tyr (1 : 4) verglichen, was ein zufälliges Polymer ist und ein sehr gutes Substrat für die meisten Tyrosinkinasen darstellt. Die Tabelle II zeigt, dass das Tyr-1278-Derivat ein besseres ALK-Substrat als polyGlu/Tyr ist.
Tabelle I : Kinetische Konstanten für rALK mit synthetischen Peptiden.
Tabelle II: Phosphorylierungsraten der Modellsubstrate durch die ALK katalytische Domäne.
Die Poly(Glu/Tyr) und die Peptidkonzentrationen waren 0,1 mg/ml beziehungsweise 400 μM. Die Enzymkonzentration betrug 10 Einheiten. Die berichteten Werte entsprechen den Durchschnittswerten von drei getrennten Experimenten. S.E.M. Werte waren immer niedriger als 10 %.

Substrat Phosphorylierungsgrad (pMol/Min.)

Poly(Glu/Tyr) 10,0

ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK 30,3
In vitro Kinasetestverfahren auf ELISA-Basis
Eine Nunc Immuno 96-Vertiefungsplatte wurde über Nacht bei 37° C mit einer Beschichtungslösung (125 μl/Vertiefung), die das ALK Peptidsubstrat (SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2) bei verschiedenen Konzentrationen in PBS enthielt, inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann mit 200 μl Waschpuffer (PBS-Tween 0,05 %) gewaschen und für wenigstens 2 Stunden bei 37° C zur Trocknung stehen gelassen. Die Kinasereaktion wurde durchgeführt durch Inkubation von Kinasepuffer (25 mM Hepes pH 7,5; 5 mM MnCl₂; 5 mM MgCl₂), 0,3 mM ATP und gereinigter rALK mit verschiedenen Konzentrationen in einem Gesamtvolumen von 100 μl/Vertiefung bei 30° C für 15 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde dann entfernt und die Vertiefungen wurden fünfmal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen. Phosphoryliertes Peptid wurde nachgewiesen unter Verwendung von 100 μl/Vertiefung eines monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Mausantikörpers (Klon 4G10, UpstateBiotech Ltd.), verdünnt 1 : 500 in PBS + 4 % BSA. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Antikörper entfernt und die Vertiefungen wurden wie oben beschrieben gewaschen. 100 μl eines sekundären Antikörpers (Anti-Maus IgG, Meerrettichperoxidase, verbunden mit dem ganzen Antikörper, vom Schaf, Amersham Pharmacia Biotech), verdünnt 1 1.000 in PBS + 4 % BSA, wurde zu jeder Vertiefung zugesetzt und die Platte wurde wieder für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie gewaschen wurde, wie oben beschrieben. Die Platte wurde unter Verwendung von 100 μl/Vertiefung TMB Substratlösung (Endogen) entwickelt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe eines gleichen Volumens von H₂SO₄ 0,18 M. Abschließend wurde die Extinktion bei 450 oder 490 nm unter Verwendung eines Ultrospec^® 300 Spectrophotometers (Amersham-Pharmacia Biotech) abgelesen.
Ergebnisse
Wir haben gezeigt, dass das Kinasetestverfahren auf ELISA-Basis benutzt werden kann, um phosphorylierte ALK Peptidsubstrate (SEQ ID Nr. 1 und Nr. 2) nachzuweisen und so auch die Aktivität der gereinigten rALK. Bei den anfänglichen Experimenten wurde das Testverfahren in Gegenwart und Abwesenheit von sowohl gereinigter rALK und dem Peptidsubstrat SEQ ID Nr. 2 durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein spezifischer Anstieg in der Extinktion bei 450 nm (A450) beobachtet werden konnte (3A). Tatsächlich wurde in Gegenwart von rALK und dem Substrat ein dramatischer Anstieg bei A450 beobachtet. Dagegen war A450 niedrig bei Abwesenheit von dem Peptid oder von rALK oder von beiden, was ein niedriges Niveau der Hintergrundextinktion anzeigt. Um die Kinetik der Substratphosphorylierung zu bestimmen, haben wir A450 nach verschiedenen Inkubationszeiten gemessen (3B). Für beide Peptide war die Kinetik der Reaktion ähnlich, wobei die maximale Phosphorylierung nach 10 Minuten erreicht wurde.
Um die Wirksamkeit der beiden Peptide in dem ELISA-Kinasetestverfahren zu vergleichen und um die optimale Konzentration des zu verwendenden Peptides zu bestimmen, haben wir Standardkurven für beide Peptide erstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass der Anstieg der Menge des Peptidsubstrates A450 anstiegen ließ und somit die rALK-Kinaseaktivität. Für das Peptidsubstrat SEQ ID Nr. 2 wurde ein maximales A450 und damit eine maximale Phosphorylierung bei etwa 200 μM beobachtet im Vergleich mit nur 25 μM für das Peptidsubstrat SEQ ID Nr. 1 (4A und B). Dies zeigt, dass das Peptidsubstrat SEQ ID Nr. 1 effizienter ist als ein Substrat für rALK.
Um die Hemmung der Kinaseaktivität zu beobachten, ist es wichtig, dass eine geeignete Konzentration an Enzym verwendet wird, das heißt, in dem linearen Bereich einer Standardkurve. Ein ELISA wurde durchgeführt unter Verwendung von 206 μM SEQ ID Nr. 1 oder 42 μM SEQ ID Nr. 1 und rALK im Bereich von 0–220 ng. Der lineare Bereich der Kurve für beide Substrate lag etwa zwischen 0–15 ng rALK und anschließend erreichten die Kurven das Plateau (5).
Der Effekt des Inhibitors Staurosporin auf die rALK-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung von 42 μM des Peptidsubstrates SEQ ID Nr. 2. Eine Lösungsmittelkontrolle, die DMSO bei entsprechenden Konzentrationen enthielt, wurde auch durchgeführt. Staurosporin hemmte deutlich die rALK-Aktivität, wobei eine maximale Hemmung bei 1 μM erreicht wurde, mit einem geschätzten IC₅₀ = 300 nM (6). Das Lösungsmittel (DMSO) alleine hatte keine substantielle Wirkung auf die rALK-Aktivität.
Referenzen

[1] Glass, D.B., Masaracchia, R.A., Feramisco, J.R. und Kemp, D.E. (1978) Anal. Biochem. 87, 566–575
[2] Till, J.H., Ablooglu, A.J., Frankel, M., Bishop, S.M., Kohanski, R.A. und Hubbard S.R. (2001) J. Biol. Chem. 276, 10049–10055.

Sequenzliste

Claims

Verfahren zum Nachweis einer ALK-Tyrosinkinaseaktivität, welches die folgenden Schritte umfasst; i) Inkubation des ALK-Proteins oder eines funktionellen Derivats davon mit einem Peptidsubstrat, das aus SEQ ID Nr. 1 oder 2 ausgewählt ist, unter Bedingungen, die für die Phosphorylierung des Peptids geeignet sind; ii) Nachweis des phosphorylierten Peptids.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid die Sequenz SEQ ID Nr. 1 hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein gereinigtes ALK-Protein oder eine ALK-enthaltende Zubereitung verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zubereitung ein Zelllysat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionelle Derivat die gesamte katalytische Domäne von ALK enthält, die sich von den Resten 1116 bis 1392 der ALK-Sequenz erstreckt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das funktionelle Derivat ein Fragment des ALK-Proteins ist, das sich vom Rest Leu¹⁰⁷³ bis Ala¹⁴⁵⁹ erstreckt.
Verfahren nach Anspruch 6, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Binden des Peptids mit SEQ ID Nr. 1 oder 2 an eine feste Phase; b) Inkubation der festen Phase mit dem ALK-Fragment unter Bedingungen, die für die Tyrosinphosphorylierung geeignet sind; c) Waschen der festen Phase; d) Inkubation der festen Phase mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (primärer Antikörper) unter Bedingungen, die für eine Antigen-Antikörper-Bindung geeignet sind; e) Waschen der festen Phase; f) Inkubation der festen Phase mit einem enzymkonjugierten Antikörper (sekundärer Antikörper), der den primären Antikörper erkennt, unter Bedingungen, die für die Bindung des primären und des sekundären Antikörpers geeignet sind, so dass ein dreifacher Immunkomplex gebildet wird; g) Waschen der festen Phase; h) Messen der enzymatischen Aktivität des Immunkomplexes, wobei die gemessene Aktivität proportional zu dem Betrag der Tyrosinphosphorylierung ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym, das mit dem Antikörper konjugiert ist, eine Meerrettichperoxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die enzymatische Aktivität durch eine kolorimetrische Reaktion nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Identifikation von Verbindungen, welche die ALK-Tyrosinkinaseaktivität modulieren.
Verfahren nach Anspruch 10, das die folgenden Schritte umfasst: i) Inkubation des ALK-Proteins oder eines funktionellen Derivats davon mit einem Peptid, das aus SEQ ID Nr. 1 oder 2 ausgewählt ist, in Gegenwart einer Kandidatenverbindung (a) unter Bedingungen, die für die Peptidphosphorylierung geeignet sind; iii) Nachweis des so gebildeten, phosphorylierten Peptids.
Verfahren nach den Ansprüchen 10–11, wobei die ALK-modulierende Aktivität der Kandidatenverbindung mit der einer Referenzverbindung verglichen wird, die unter den gleichen Bedingungen wie die Kandidatenverbindung getestet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Referenzverbindung Staurosporin ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Referenzverbindung ein Staurosporin-Derviat der allgemeinen Formel (I) ist:
wobei R1 und R2 unabhängig voneinander aus Halogen, vorzugsweise Chlor, Phenyl oder C1-C3 Alkyl, das optinal mit einem oder mehreren Halogenen substituiert ist, ausgewählt werden; R3 Hydroxyl ist; R4 Hydroxyl oder Hydroxymethyl ist; R5 C1-C3 Alkyl, optional halogensubstituiert ist, oder Benzyl ist.
Peptid, das als ALK-Substrat nützlich ist und aus SEQ ID Nr. 1 oder 2 ausgewählt ist.
Peptid nach Anspruch 15, welches SEQ ID Nr. 1 ist.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 15 oder 16 für die Bestimmung der ALK-Tyrosinkinaseaktivität.
Kit zum Nachweis der ALK-Tyrosinkinaseaktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 14, das ein Peptid mit SEQ ID Nr. 1 oder 2 und einen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper umfasst.
Kit nach Anspruch 18, der eine zusätzliche Komponente enthält, die ausgewählt ist aus Reagenzien für kolorimetrische Reaktionen, Puffer, Verdünnungsmittel, Reinigungsmittel, Stabilisatoren, Staurosporin oder einem Derivat davon gemäß Anspruch 14.