DE60317220T2 - Verbesserte mutanten von biotinbindendem protein - Google Patents

Verbesserte mutanten von biotinbindendem protein Download PDF

Info

Publication number
DE60317220T2
DE60317220T2 DE60317220T DE60317220T DE60317220T2 DE 60317220 T2 DE60317220 T2 DE 60317220T2 DE 60317220 T DE60317220 T DE 60317220T DE 60317220 T DE60317220 T DE 60317220T DE 60317220 T2 DE60317220 T2 DE 60317220T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
avidin
biotin
avr4
binding
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60317220T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60317220D1 (de
Inventor
Markku Sakari Kulomaa
Henri Rainer Nordlund
Olli-Heikki Laitinen
Vesa HYTÖNEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JYVAESKYLAEN YLIOPISTO
Jyvaskylan Yliopisto
Original Assignee
JYVAESKYLAEN YLIOPISTO
Jyvaskylan Yliopisto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JYVAESKYLAEN YLIOPISTO, Jyvaskylan Yliopisto filed Critical JYVAESKYLAEN YLIOPISTO
Application granted granted Critical
Publication of DE60317220D1 publication Critical patent/DE60317220D1/de
Publication of DE60317220T2 publication Critical patent/DE60317220T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Silicon Polymers (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Mutanten von Biotin bindenden Proteinen mit verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu Wildtyp-Proteinen. Proteine, die Biotin binden, beinhalten Hühneravidin und bakterielles Streptavidin, andere Geflügelavidine, wie Avidinproteine, die aus der Ente, Gans, dem Strauß und Truthahn isoliert werden, und Hühneravidinverwandte Proteine (AVRs).
  • Hintergrund der Erfindung
  • Hühneravidin und bakterielles Streptavidin sind in vielen biowissenschaftlichen Anwendungen, die von Reinigungstechniken zu moderner Diagnostik und zielgerichteter Medikamentenabgabe reichen, breit angewendete Proteine. Diese Methodik, bekannt als (Strept)avidin-Biotin-Technologie, verlässt sich auf die extrem enge und spezifische Affinität (Kd ~ 10–15 M) zwischen (Strept)avidin und Biotin.
  • Avidin und Streptavidin sind außergewöhnlich stabile Proteine, die aus homotetrameren up-and-down β-Tonnen bestehen, die bei Biotinbindung sogar noch stabiler werden. Die Übergangsmittelpunkte der Hitzedenaturierung-(Tm), analysiert durch Differenzial-Scanning-Kalorimetrie (DSC), haben gezeigt, dass Avidin sowohl in der Gegenwart wie auch der Abwesenheit von Biotin stabiler ist als Streptavidin (Gonzalez, M., Argarana, C. E., & Fidelio, G. D., Biomol. Eng. 16, 67–72 (1999). Ein möglicher Grund dafür kann die intramonomere Disulfidbrücke, die in jedem Avidinmonomer gefunden wird, sein. Wildtyp-(wt)-Avidin besitzt einen hohen isoelektrischen Punkt und es ist glycosyliert, wobei diese Eigenschaften unspezifische Bindungen bei einigen Anwendungen hervorrufen könnten. Streptavidin ist nicht glycosyliert und es fehlt ihm an Cysteinresten, die in der Lage sind, Disulfidbrücken zu bilden. Es wurde gezeigt, dass die unerwünschten Eigenschaften von Avidin ohne deutliche Beeinflussung der festen Biotin-Bindungsaffinität und der Stabilitätseigenschaften von Avidin beseitigt werden können (Marttila, A. T. et al., FEBS Lett 467 (2000), 31–6). Das Avidin und Streptavidintetramer ist tatsächlich ein Dimer von zwei Dimeren. Die Monomere, die das Tetramer bilden, treten miteinander auf eine symmetrische Weise in Wechselwirkung und bilden die drei Arten von Monomer-Monomer-Wechselwirkungen, die detailliert durch Livnah (Livnah, O., Bayer, E. A., Wilcheck, M., & Sussman, J. L., Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America 90 (1993), 5076–5080) beschrieben werden. Die Wechselwirkung zwischen den Monomeren 1-4 (und dem äquivalenten 2-3) ist die stärkste, während die Wechselwirkung zwischen den Monomeren 1-3 (und 2-4) die schwächste ist. Die Intensität der Wechselwirkung zwischen den Monomeren 1-2 (und 3-4) ist auch relativ schwach, aber wichtig, da Tryptophan 110 in Avidin (Trp120 in Streptavidin) von Untereinheit 1 an der Biotinbindung an der Bindungsstelle von Untereinheit 2 teilnimmt, wodurch die mit der Funktion im Zusammenhang stehende Monomer-Monomer-Grenzfläche gebildet wird.
  • Die 3-D-Strukturen von Avidin und Streptavidin wurden durch Röntgenkristallographie aufgedeckt und ihre tertiären und quaternären Strukturen zeigen eine erstaunliche Ähnlichkeit trotz der relativ geringen Aminosäuresequenzidentität (Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J. und Salemme, F. R. (1989) Science 243, 85–88; Livnah, O., Bayer, E. A., Wilcheck, M. und Sussman, J. L. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 5076–5080; Pugliese, L., Coda, A., Malcovati, M. und Bolognesi, M. (1993) J. Mol. Biol. 231, 698–710). Die meisten der essenziellen Biotin-bindenden Reste sind konserviert und die Affinität für Biotin ist sowohl in Avidin wie auch Streptavidin nahezu identisch. Zusätzlich zu der hohen Biotin-Bindungskapazität zeigen Avidin- und Streptavidintetramere eine erstaunliche Stabilität bei hohen Temperaturen wie auch unter stark denaturierenden Bedingungen. Die Stabilität steigt bei Biotinbindung sogar noch mehr (Green, M. (1990) Methods Enzymol. 184, 51–67; Gonzalez, M., Argarana, C. E. und Fidelio, G. D. (1999) Biomol. Eng. 16, 67–72).
  • Es wurde zuvor über eine Streptavidinmutante mit gesteigerten Stabilitätseigenschaften im Vergleich mit denjenigen des Wildtyp-Streptavidins berichtet (Reznik, G. O. et al., Nat Biotechnol 14 (1996), 1007–11). Die verbesserte Stabilität wurde durch Zugabe von zwei intermonomeren Disulfidbrücken zu dem Streptavidintetramer erreicht, eine zwischen den Monomeren 1-3 und die andere zwischen den Monomeren 2-4, durch Änderung des Histidinrestes 127 zu Cystein. In Avidin sind diese Grenzflächen ähnlich und der Histidinrest 127 von Streptavidin ist analog zu dem Isoleucinrest 117 von Avidin.
  • Das Avidingen (AVD) in Hühnern besitzt Homologe, genannt Avidin-verwandte Gene (AVRs) (Keinänen, R. A., Laukkanen, M. L. und Kulomaa, M. S. (1988) J. Steroid Biochem. 30, 17–21; Keinänen, R. A., Wallen, M. J., Kristo, P. A., Laukkanen, M. O., Toimela, T. A., Helenius, M. A. und Kulomaa, M. S. (1994) Eur. J. Biochem. 220, 615–21; Ahlroth, M. K., Kola, E. H., Ewald, D., Masabanda, J., Sazanov, A., Fries, R. und Kulomaa, M. S. (2000) Anim. Genet. 31, 367–75).
  • Sieben verschiedene Gene, AVR1–AVR7, wurden geklont und sequenziert. Zwei der Gene, AVR4 und AVR5, sind in ihrer Codierungssequenz 100% identisch, weisen in ihrer 5'-flankierenden Region nur eine einzige Nukleotiddifferenz auf, während die anderen 94 bis 99% identisch zueinander sind. Die Identität zwischen AVD und den verschiedenen AVRs reicht von 91 bis 95%. Es wurden Boten-RNAs für AVR1, AVR2 und AVR3 bei Hühnern unter entzündlichen Bedingungen festgestellt (Kunnas, T. A., Wallen, M. J. und Kulomaa, M. S. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1216, 441–5), aber es ist nicht bekannt, ob sie als Proteine exprimiert werden. Die mutmaßlichen Avidin-verwandten Proteine (AVRs), wie von ihren Nukleotidsequenzen abgeleitet werden, sind 74 bis 81% identisch zu Avidin und 85 bis 100% identisch zueinander.
  • Avidinproteine, die aus der Ente, der Gans, dem Strauß und dem Truthahn isoliert wurden, zeigten ähnliche tetramere Struktur, Glycosylierung und Stabilität sowohl gegen Temperatur wie auch proteolytische Aktivität von Proteinase K wie Hühneravidin. Die Biotin-bindenden Eigenschaften dieser Avidine, gemessen unter Verwendung von IAsys-optischem Biosensor, waren denjenigen ähnlich, die in Avidin vom Huhn gefunden wurden. Drei dieser Avidine zeigten jedoch verschiedene immunologische Kreuzreaktivität, wenn sie mit dem Hühneravidin verglichen wurden. Die Patientenserenreaktion auf Enten-, Gans- und Straußen-Avidin war auch niedriger als diejenige, die für Hühner- und Truthahnavidine beobachtet wurde. Diese Proteine könnten Vorteile gegenüber der Verwendung von Hühneravidin und bakteriellem Streptavidin bei Pretargeting-Anwendungen bieten (Hytönen et al., Biochem. J. (2003) 372; 219–225).
  • Wegen der Ähnlichkeit der Struktur der Biotin-bindenden Proteine, einschließlich Hühneravidin und bakteriellem Streptavidin, anderen Geflügelavidinen, wie Avidin-Proteinen, die aus der Ente, der Gans, dem Strauß und dem Truthahn isoliert werden, und Hühneravidin-verwandten Proteinen (AVRs), wird angenommen, dass neue Mutanten dieser Biotin-bindenden Proteine durch ortsgerichtete Mutagenese der Aminosäuren der Sequenzen geschaffen werden könnten und dass die resultierenden Mutanten ähnliche Eigenschaften aufweisen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Mutanten von Biotin-bindenden Proteinen mit verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu Wildtyp-Proteinen bereitzustellen. Der Begriff Biotin-bindende Proteine wird so verstanden, dass er Hühneravidin und bakterielles Streptavidin, andere Geflügelavidine, wie Avidinproteine, die aus der Ente, der Gans, dem Strauß und dem Truthahn isoliert werden, und Hühneravidin-verwandte Proteine (AVRs) mit einschließt.
  • Diese Erfindung stellt thermisch stabilisierte Biotin-bindenden Proteine unter Verwendung von ortsgerichteter Mutation bereit. Für Avidin und AVRs wurde dies durch Einführung von Disulfidbrücken zwischen ihren Untereinheiten erreicht. Diese kovalenten Bindungen besaßen keine größeren Effekte auf die Biotin-bindenden Eigenschaften der jeweiligen Mutanten. Darüber hinaus behielt eine der Mutanten ihre tetramere Integrität sogar unter denaturierenden Bedingungen. Diese neuen Avidinformen besitzen native → denaturierte Übergangsmittelpunkte (Tm) nahe 100°C in der Abwesenheit von Biotin; für AVR4/5 liegt Tm nahe 110°C. Überdies wird gezeigt, dass die intramonomeren Disulfidbrücken, die in Wildtyp-Avidin gefunden werden, Effekte auf seine Stabilität aufweisen. Eine Mutantenform, bei der diese Brücke entfernt wurde, wies in der Abwesenheit von Biotin einen niedrigeren Tm als Wildtyp-Avidin auf, aber zeigte eine vergleichbare Stabilität in der Gegenwart von Biotin.
  • Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Stabilität von Avidin durch die Zugabe von intermonomeren Disulfidbrücken durch Änderung des Isoleucinrestes 117 zu Cystein verbessert.
  • Zudem wurden zwei zusätzliche Mutanten hergestellt, bei denen noch mehr intermonomere Disulfidbrücken eingeführt wurden. Es wurde auch eine cysteinlose Avidinversion konstruiert, bei der die intramonomeren Disulfidbrücken des Wildtyp-Avidins entfernt wurden. Die Stabilitätseigenschaften dieser Mutanten wurden untersucht und mit denjenigen von Wildtyp-Avidin und Streptavidin verglichen.
  • Ortsgerichtete Mutagenese kann auch in andere Biotin-bindende Proteine, einschließlich bakteriellem Streptavidin, andere Geflügelavidine und Hühneravidin-verwandte Proteine (AVRs), eingeführt werden, um ihre Eigenschaften ähnlich dem Avidin zu verändern. Die ortsgerichtete Mutagenese kann auch eine Deletion einer Aminosäure sein.
  • Das einzige AVR, das Affinität zu Biotin und 2-Iminobiotin aufwies, die mit Avidin vergleichbar war, war AVR4/5. Nichtsdestotrotz zeigte AVR4/5 andere interessante Unterschiede, sprich ein "Extra"-Cysteinrest in jeder Untereinheit und ein unterschiedliches Glycosylierungsmuster, wenn es mit Avidin verglichen wurde.
  • Die ortsgerichtete Mutagenese von AVR4/5 cDNA wurde durch Mutation des Asparagin 43 von AVR4/5 zu Glutaminsäure (AVR4/5(N43E)) durchgeführt, um eine mögliche Glycosylierung an dieser Position zu vermeiden. Cystein 124 in AVR4/5 wurde zu Serin konvertiert, um die erwartete fremde Disulfidbrücke in AVR4/5 zu eliminieren. Das AVR4/5/(C124S) wurde weiter durch Änderung des Tyrosins 117 zu Cystein (AVR4/5(Y117C)) mutagenisiert. Das Cystein 124 in AVR4/5 könnte zu jeder Aminosäure konvertiert werden. (Die Nummerierung der Aminosäuren entspricht dem Avidin (siehe 4)).
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass AVR4/5 die dauerhaftesten Hitzestabilitätseigenschaften von allen Biotin-bindenden Proteinen, die bisher charakterisiert wurden, aufweist. AVR4/5 zeigte einen Tm, der nachweislich den Siedepunkt von Wasser sogar in der Abwesenheit von Ligand übertrifft. Aufgrund seiner hohen thermischen Stabilität kann sich AVR4/5 oder eines seiner Derivate als extrem nützlich bei Anwendungen, bei denen eine hohe Hitzebeständigkeit erforderlich ist, erweisen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A zeigt eine schematische Darstellung der Mutanten Avd-ci, Avd-cci und Avd-ccci, die intermonomere Disulfidbrücken aufweisen.
  • 1B zeigt eine nicht-reduzierende SDS-PAGE-Analyse von Avidin (Avd) und den Avidinmutanten Avd-ci, Avd-cci und Avd-ccci. Die Proben wurden für 15 Minuten in SDS-PAGE-Probenpuffer (ohne β-Mercaptoethanol) gekocht und das Gel wurde mit Coomassie-Brillantblau gefärbt. Wildtyp-Avidin (Avd) wird hauptsächlich als eine monomere Form gefunden. Die Mutanten, die intermonomere Disulfidbrücken zwischen zwei Untereinheitspaaren (Avd-ci, Avd-cci) aufweisen, und die Mutante, die ein kontinuierliches Makromolekül (Avd-ccci) bildet, bildeten dimere und tetramere Strukturen.
  • 2 zeigt die Bestimmung der Bindung von biotinylierter alkalischer Phosphatase durch Wildtyp-Avidin und die Mutanten Avd-ci und Avd-ccci nach Hitzebehandlung (99,9°C) für verschiedene Zeiträume durch Mikrotiterplattenassay.
  • 3 ist eine Darstellung der hitzeinduzierten Entfaltung von Avidin und den Mutanten ohne (A) und mit (B) Biotin in einer Basislinien-subtrahierten Form.
  • 4 ist die Sequenzanordnung von Avd und den AVRs (AVR1–AVR7). Die Punkte weisen auf identische Aminosäuren in AVRs im Vergleich mit Avidin hin und die zwei Aminosäuredeletionen in AVRs werden durch Striche angezeigt. Die horizontalen Pfeile bezeichnen die β-Faltblätter von Avidin und der vertikale Pfeil weist auf den Spaltungsort des Signalpeptids in Avidin hin. Die Biotin-bindenden Reste in der Avidinsequenz sind fettgedruckt und der N-Glycosylierungsort von Avidin wie auch die möglichen N-Glycosylierungsorte auf den AVRs werden mit Grau hervorgehoben. Die Cysteinreste sind eingerahmt.
  • 5 Re-Organisation der Untereinheitsgrenzfläche, wo Sequenzunterschiede an Position 96 lokalisiert sind (in Stereo), und der Effekt von Sequenzunterschieden an Position 111 auf die Orientierung der Seitenkette von Trp-110. Die Aminosäure an Position 96 wird als CPK-Modell gezeigt und die umgebenden Aminosäuren werden als Kugel-Stab-Darstellungen gezeigt. a) Met-96 (Avidin und AVR4/5), b) Lys-96 (AVR1–3,6,7), c) Lys-111 (Avidin, AVR1–3–7), d) Ile-111 (AVR2) als CPK-Modelle. Trp-110 wird als Stäbe zusammen mit der Lösungsmittel-zugänglichen (transparenten) Oberfläche gezeichnet; Kugel-Stab-Modelle stellen das Liganden-Biotin dar. Beachte in d) die starke Überlappung zwischen Ile-111 und Trp-110, die die Neuorientierung der Tryptophan-Seitenkette erzwingen würde, was zu schlechteren Wechselwirkungen mit Biotin und reduzierter Bindungsaffinität führen würde.
  • 6A Bindungskurven für Iminobiotinbindung durch AVR4/5 in verschiedenen Konzentrationen (in diesem Fall von 4 × 10–7 M bis 2,2 × 10–6 M). Die ersten 500 Sekunden wurden verwendet, um die Kass-Konstante zu kalkulieren. Der Gleichgewichtszustand wurde nach ungefähr 1 Stunde Messung, abhängig von der Konzentration, erhalten. Die maximale Bindung (Rmax) für die höchste Konzentration betrug ca. 1.000 Bogensekunden. B) Ein Beispiel eines IASyS-Umkehrbarkeitsexperiments. Man ließ das Protein an eine Biotin-Aminosilanküvette binden. Nach Erreichen des Gleichgewichts wurde die Küvette gewaschen und die Dissoziation gemessen. Es wurde dann ein Überschuss an freiem Biotin zugegeben und die Messung wurde fortgeführt, um ein Fließgleichgewicht zu erreichen. Die Küvette wurde dann wieder gewaschen. Die nach der Bindung und Dissoziation und nach der Biotinbehandlung und dem zweiten Waschschritt gemessenen Werte wurden verwendet, um die Umkehrbarkeit der Biotinbindung zu definieren. Bei diesem besonderen Experiment betrug die Umkehrbarkeit praktisch 0% für AVR6 und 100% für AVR2.
  • 7 Nicht-reduzierende SDS-PAGE von Avidin (AVD), AVR2 und AVR6 bei 90°C und 100°C Temperaturen. Die tetrameren, dimeren und monomeren Formen werden mit Balken auf der rechten Seite der Figur angezeigt.
  • 8 Glycosylierung von Avidin und AVRs in Bakulovirus-infizierten Insektenzellen. Die Proben wurden entweder mit Endo-Hf-Glycosidase, gefolgt von 15% SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Brilliantblau, behandelt oder nicht behandelt. Avidin wird durch A und die verschiedenen AVRs durch ihre korrespondierenden Zahlen bezeichnet. M weist auf die Biorad-niedrigen Molekulargewichtsmarker (31, 21,5 und 14,4 kDa) hin.
    u unbehandelt mit Enzym
    t behandelt mit Enzym.
  • 9 Sequenzanordnung von Hühneravidin und AVR4/5. Die sekundäre Struktur von Hühneravidin wird auch gezeigt (β-Stränge: Pfeile). Mutierte Aminosäurereste sind mit Schwarz schattiert. Aminosäurereste, die an den Monomer-Monomer-Grenzflächen lokalisiert sind, sind eingerahmt. Potenzielle Unterschiede, die die hohe thermische Stabilität von AVR4/5 im Vergleich mit Avidin erklären, sind grau schattiert.
  • 10 FPLC-Gelfiltrations-Chromatogramme. A) AVR4/5 B) AVR4/5(C124S) C) oxidiertes AVR4/5 D) AVR4/5, reduziert mit 2-Mercaptoethanol E) AVR4/5(Y117C, C124S). Die Elutionszeiten der Gelfiltrationssstandards betrugen: Thyreoglobulin (670 kDa) 18,8 min, IgG (158 kDa) 24,6 min, BSA (68 kDa) 27,1 min, Ovalbumin (44 kDa) 30,5 min, Myoglobin (17 kDa), 33,9 min. Die Standard-Proteinelutionszeiten werden mit Pfeilen in den Chromatogrammen angezeigt.
  • 11A Deglycosylierungsanalyse der Proteine. Denaturierte Proteine, behandelt mit Endoglycosidase Hf, analysiert mit 15% SDS-PAGE.
    4/5 = AVR4/5
    43 = AVR4/5(N43E)
    43+ = AVR4/5(N43E), behandelt mit Endoglycosidase Hf
    A = Avidin (Belovo)
    A+ = Avidin, behandelt mit Endoglycosidase Hf
    B) Nicht-reduzierende SDS-PAGE. Die Proben wurden zuerst in vitro acetyliert, für 20 Minuten gekocht und 15% SDS-PAGE unterworfen. Der Pfeil zeigt die Gegenwart der dimeren Form von AVR4/5 an. Die Werte links stellen die Banden für die Molekulargewichtsstandards (Bio-Rad) dar.
    A = Avidin
    4/5 = AVR4/5
    124 = AVR4/5(C124S)
    C) Nicht-reduzierende SDS-PAGE. Die Proben wurden zuerst in vitro acetyliert, für 20 Minuten gekocht und 15% SDS-PAGE unterworfen. Der Pfeil zeigt die Gegenwart der dimeren Form von AVR4/5(Y117C, C124S) an. Die Werte links stellen die Banden für die Molekulargewichtsstandards (Bio-Rad) dar.
  • 12 Microplatten-Assay. AVR4/5 zeigt eine überlegene Stabilität gegenüber Kochen im Vergleich zu Avidin wie auch zu Hochstabilitäts-AVD-ci (Durchschnitt, N = 4).
  • 13 Sequenzunterschiede zwischen Avidin und AVR4/5 an den Untereinheitsgrenzflächen. An der 1-4 (und 2-3) Grenzfläche: A) I56 in Avidin und B) R56 in AVR4/5. An der 1-3 (und 2-4) Grenzfläche (in Stereo): C) I117 in Avidin und D) Y117 in AVR4/5. Wechselwirkende Aminosäuren werden als Kugel-Stab-Darstellungen gezeigt. Untereinheitsoberflächen sind wie folgt gefärbt: 1 = blau, 2 = gelb, 3 = rot und 4 = grün. In A) werden Wassermoleküle nahe dem I117, die in der Kristallstruktur gesehen werden, als einzelne rote Kugeln gezeigt.
  • 14 Die Salzbrücke zwischen D39 und R112 in AVR4/5. Die potenzielle Salzbrücke beschränkt die Flexibilität und Größe der Öffnung des Liganden-bindenden Hohlraums im Vergleich mit Avidin, wo Alanin an Position 39 vorliegt. Die transparente Oberfläche wird für eine AVR4/5-Untereinheit, 1, gezeichnet, aber beinhaltet zwei wechselwirkende Aminosäuren von Untereinheit 2 des AVR4/5-Tetramers. Biotin wird als ein cpk-Modell, Schlüssel-Aminosäuren als Kugel-Stab-Figuren gezeigt und andere Aminosäuren werden durch Linien dargestellt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Avidin (SEQ ID NO 1) und Streptavidin (SEQ ID NO 2) sind wertvolle und breit angewendete Werkzeuge in den Biowissenschaften. Zusätzlich zu ihrer hohen Biotin-Bindungsaffinität vertraut die Robustheit und die Flexibilität des Systems auf ihre extreme Stabilität unter verschiedenen anspruchsvollen Bedingungen. Bei der vorliegenden Anmeldung ist eine Aufgabe, die Stabilität von Hühneravidin und anderen Biotin-bindenden Proteinen noch weiter zu steigern, ohne ihre starke Biotin-Bindungsfähigkeit zu verlieren. Um dieses Ziel zu erreichen, werden zwei, vier oder sechs intermonomere Disulfidbrücken in Avidin eingeführt. Das gleiche könnte auch mit Avidin-verwandten Proteinen gemacht werden. Zusätzlich wurde die Rolle der intramonomeren Disulfidbrücken bei der Stabilität des Avidintetramers durch Entfernung von ihnen unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese bestimmt.
  • Gemäß den DSC-Ergebnissen haben sowohl die intramonomeren wie auch die intermonomeren Disulfidbrücken Effekte auf die hitzeinduzierte Denaturierung von Avidin. Die Entfernung der intramonomeren Disulfidbrücken von Avidin (Avd-nc) rief eine Abnahme in seiner Tm in der Abwesenheit von Biotin hervor (ΔTm = –8,9°C), während in der Gegenwart von Biotin der Tm praktisch der gleiche war wie der von Wildtyp-Avidin. Dies unterstreicht die Wichtigkeit der Biotin-induzierten Steigerung in der Stabilität von Avidin. Interessanterweise besitzt die cysteinlose Mutante Avd-nc einen gering höheren Tm als denjenigen von Streptavidin als eine Apo-Form und einen signifikant höheren als ein Komplex mit Biotin. Außerdem besitzt Avidin einen natürlich höheren Tm als Streptavidin.
  • Das stabilste der mutierten Avidine ist Avd-ci, welches eine intermonomere Disulfidbrücke in den Monomergrenzflächen 1-3 und 2-4 besitzt. Im Gegensatz dazu verbessern die Disulfidbrücken, die an den Grenzflächen 1-4 und 2-3 geschaffen werden, nicht die thermische Stabilität von Avidin. Statt dessen rufen diese Mutationen eine Abnahme in dem Tm des Mutanten Avd-cci hervor, wenn sie mit dem Wildtyp-Avidin oder sogar mit der cysteinlosen Mutante Avd-nc verglichen werden. Dieser Effekt war in der Abwesenheit von Biotin auffallender. Die hohe thermische Stabilität der kombinierten Mutante Avd-ccci wies darauf hin, dass der stabilisierende Effekt der Disulfidbrücke an der Grenzfläche 1-3 (und 2-4) die Abnahme, die durch die Disulfidbrücken an der Grenzfläche 1-4 (und 2-3) hervorgerufen wird, übertraf.
  • In der Gegenwart von denaturierenden Wirkstoffen kann es vorzuziehen sein, die Mutanten Avd-ci, Avd-cci und Avd-ccci anstelle von Wildtyp-Avidin zu verwenden. Dies kann insbesondere für Avd-ccci der Fall sein, da alle seine Monomere kovalent aneinander gebunden sind (direkt oder indirekt). Die Mutante ist in der Lage, sogar nach der Entfaltung als ein Tetramer bestehen zu bleiben, wie in der SDS-PAGE-Analyse gesehen wird (1B). Daher könnte sie bei Anwendungen nützlich sein, wo ein Verlust von Untereinheiten von Matrix-gekoppelten Avidintetrameren die qualitative und quantitative Analyse von Molekülen behindern würde. Gemäß den DSC- und Mikrotiterplatten-Assays könnten die Avidinmutanten Avd-ci und Avd-ccci, die bemerkenswert hohe Tm-Werte sogar in der Abwesenheit von Biotin aufwiesen, in PCR-Protokollen verwendet werden, da sie den Temperaturen, die verwendet werden, um dsDNA zu denaturieren, widerstehen können. Zum Beispiel ist die Extraktion von 2-iminobiotinylierten oder biotinylierten ssDNA-Molekülen bei 95°C mit Avd-ci- und Avd-ccci-beschichteten Teilchen möglich.
  • Bei den meisten Anwendungen der Biotin-Bindungstechnologie ist eine Hochaffinitäts-Biotinbindung essenziell. Daraus folgt, dass alle Mutanten, die in dieser Anmeldung vorgestellt werden, vielversprechende Kandidaten für die Verwendung bei der Methodik sind, da sie alle irreversible Biotinbindung und hohe Affinität gegenüber 2-Iminobiotin zeigen. Keine der Mutationen involvierte Reste, die direkt für die Biotinbindung verantwortlich waren. Cystein 106, das Isoleucin 106 in den Mutanten Avd-cci und Avd-ccci substituierte, ist jedoch auf der gleichen Schleife (zwischen den β-Strängen 7 und 8) lokalisiert wie der wichtige Biotin-Bindungsrest Tryptophan 110. Die Disulfidbrücke, die zwischen Cys106 von Untereinheit 1 und Cys86 von Untereinheit 4 gebildet wird, kann direkt oder indirekt einen Einfluss auf Trp110 haben und dadurch auch die Biotin-Bindungsfähigkeit dieser Avidinmutanten beeinflussen.
  • Es wurde auch gefunden, dass das Streptavidin-Tetramer unter bestimmten Bedingungen ohne seinen gebundenen Liganden instabil ist. Dies könnte bei vielen Anwendungen aufgrund des Verlustes von Signal zusammen mit den analytischen Molekülen schädlich sein. Darüber hinaus würde es wahrscheinlich die Lebensspanne von Materialien verkürzen, wenn sie kovalent gebundene Streptavidinmoleküle enthielten. Chilkoti wie auch Reznik haben eine Streptavidinmutante beschrieben, His127Cys (Chilkoti, A., Schwartz, B. L., Smith, R. D., Long, C. J. und Stayton, P. S. (1995) Bio/Technology 13, 1198–1204; Reznik, G. O. et al., Nat Biotechnol 14 (1996), 1007–11). Diese Mutante besitzt eine intermonomere Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten 1 und 3 (2 und 4), die analog zu der Isoleucin-117-zu-Cystein-Substitution in unserer Avidinmutante Avd-ci ist. Sie berichteten, dass die resultierende Mutante stabiler war als Wildtyp-Streptavidin (Reznik, G. O. et al., Nat Biotechnol 14 (1996), 1007–11). Avidin ist jedoch stabiler als Streptavidin, wie durch DSC-Analyse beurteilt wird (Gonzalez, M. et al., Biomol Eng 16 (1999) 67–72). Daher würde die 1-3 (und 2-4) intermonomere Disulfidbrücken-tragende Mutante Avd-ci auch einen höheren Tm als die korrespondierende Streptavidinmutante aufweisen.
  • Die Produktion von Streptavidin (oder seinen Mutanten) wird normalerweise als Einschlusskörper in E. coli durchgeführt. Sein Downstream-Processing beinhaltet mühsame und zeitaufwendige Denaturierungs- und Renaturierungsverfahren, gefolgt von der künstlichen Bildung von Disulfidbrücken (in dem Fall der His127Cys-Mutante) und zusätzliche Reinigungsschritte. Im Gegensatz dazu ergab gemäß der vorliegenden Erfindung die Herstellung von Avidin und anderen Biotin-bindenden Mutanten, sogar von denjenigen mit intermonomeren Disulfidbrücken, lösliche Proteine in Insektenzellen, die einfach in einem einzelnen Schritt durch Affinitätschromatographie auf einer 2-Iminobiotinsäule gereinigt wurden.
  • Die Avidinmutanten und andere Avidin-verwandte Proteinmutanten beinhalten eine Signalsequenz und werden daher in eine eukaryote Insektenzelle auf einem speziellen Weg eingeführt, wo die Ausbildung der zahlreichen Disulfidbrücken als ein Teil des Vorganges möglich ist. Die Mutanten sind daher direkt nach diesem Vorgang löslich und funktional. Bei diesem speziellen Weg wird die Brückenbildung durch i. a. PDI(Protein-Disulfid-Isomerase)-Enzyme verstärkt. Im Gegensatz dazu werden die Streptavidinmutanten in einer inaktiven Form in prokaryoten Bakterien produziert ( US-Patent 6,022,951 ). Streptavidin wurde nicht erfolgreich auf einem speziellen Weg in einem Insektenzell/Bakulovirussystem hergestellt, welches System nun erfolgreich bei der Avidin und Avidinmutanten-Produktion verwendet wurde. Avidin besitzt auch eine beträchtlich höhere Löslichkeit als Streptavidin. Zuvor wurde gedacht, dass, da Avidin bereits eine natürliche intramonomere Disulfidbrücke besitzt, die Einführung von neuen intermonomeren Disulfidbrücken falsche Paarung hervorrufen würde, die zu niedriger Qualität oder inaktivem Protein in den Zellen führen würde. Streptavidin besitzt kein natürliches Cystein und daher würde dies kein Problem bei der Streptavidin-Produktion sein.
  • Avidin und Streptavidin sind total unterschiedliche Proteine, auch wenn sie eine ähnliche Struktur aufweisen. Die Mutante Avidin Avd-ccci unterscheidet sich von den bekannten Avidinen dadurch, dass alle Untereinheiten kovalent aneinander gebunden sind. Sie beinhaltet zusätzlich zu I117C auch Änderungen, wo intermonomere Brücken durch Aminosäuren an verschiedenen Positionen der Untereinheiten gebildet werden, sprich Cystein 86 paart sich mit Cystein 106 und anders herum (1-4-Monomere und 2-3-Monomere) und unterscheidet sich so von der I117C-Mutante (oder H127C-Streptavidinmutante), worin die gleiche Aminosäure in den Paarungsuntereinheiten bei der Disulfidbrückenbildung überbrückt wird. Es wurden verschiedene Disulfidbrücken nicht in ein Streptavidintetramer eingeführt als durch H127C erreicht werden konnte und eine solche Streptavidinmutante könnte nicht funktionell und vermutlich sehr heterogen sein. Wenn die Seitenketten von den Isoleucinen 117 in jeder Avidintetramer-Untereinheit mit Cysteinen substituiert werden, bilden sie die 1-3-(und 2-4-)Disulfidbrücken in den Mutanten Avd-ci und Avd-ccci. Jede Untereinheit besitzt Isoleucin 106 und Aspartat 86, bei den Mutanten Avd-cci und Avd-ccci sind diese mit Cysteinen substituiert, um die 1-4 (und 2-3) intermonomeren Disulfidbrücken zu bilden.
  • Das Gen, das Avidin (AVD) codiert, besitzt in Hühnern sieben Homologe, genannt Avidin-verwandte Gene (AVRs, AVR1–AVR7 (SEQ ID NO 3-9)). Da es nicht bekannt ist, ob die Avidin-verwandten oder AVR-Gene in Hühnern als Proteine exprimiert werden, wurden ihre cDNAs kürzlich geklont und sie wurden unter Verwendung eines Bakulovirus-Insektenzell-Expressionssystems hergestellt (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617). Zwei der Gene, AVR4 und AVR5, sind in ihrer Codierungssequenz 100% identisch, wobei sie nur eine einzelne Nukleotiddifferenz in ihrer 5'-flankierenden Region zeigen, während die anderen 94 bis 99% identisch zueinander sind. Die Identität zwischen AVD und den verschiedenen AVRs reicht von 91 bis 95% (Keinänen, R. A., Wallen, M. J., Kristo, P. A., Laukkanen, M. O., Toimela, T. A., Helenius, M. A. und Kulomaa, M. S. (1994) Eur. J. Biochem. 220, 615–21; Ahlroth, M. K., Kola, E. H., Ewald, D., Masabanda, J., Sazanov, A., Fries, R. und Kulomaa, M. S. (2000) Anim. Genet. 31, 367–75). Die mutmaßlichen Avidin-verwandten Proteine (AVRs), wie von ihren Nukleotidsequenzen abgeleitet, sind 74 bis 81%ig identisch zu Avidin und 85 bis 100% identisch zueinander.
  • Aminosäuresequenzanalyse und Molekülmodellierung werden verwendet, um die Eigenschaften der AVRs vorherzusagen und zu erklären. Es wurde gefunden, dass die AVR-Proteine sowohl strukturell wie auch funktionell dem Avidin sehr ähnlich sind. Trotz der zahlreichen Aminosäuresubstitutionen in den Untereinheitsgrenzflächenregionen, bilden die AVRs extrem stabile Tetramere, ähnlich dem Avidin.
  • In der gesamten vorliegenden Anmeldung werden die Sequenzen von Avidin und AVRs so angeordnet, dass die Aminosäuren 55 (Threonin) und 56 (Isoleucin) der Avidinsequenz, die in der Sequenz der AVRs nicht vorkommen, in der AVR-Sequenz gezählt werden (siehe 4). Daher korrespondieren z. B. die Asparagine 117 in den AVRs AVR1 und AVR2 zu dem Isoleucin 117 in Avidin, während die Zahl der Aminosäure 117 in den AVRs 115 sein würde, wenn die zwei Aminosäuren 55 und 56 in der Sequenz nicht gezählt würden.
  • Unterschiede werden in einigen physikochemischen Eigenschaften der AVRs im Vergleich mit Avidin gefunden, einschließlich erniedrigtem isoelektrischem Punkt, gesteigerter Glycosylierung und, am bemerkenswertesten, reversible Biotinbindung für zwei AVRs (AVR1 und AVR2). Die Molekülmodellierung zeigt, wie der Ersatz von Lys-111-Ile in AVR2 die Form der Biotin-bindenden Tasche ändert und so zu einer reversiblen Bindung führt. Biochemische Analysen zeigen, dass Disulfidbindungen Monomere in AVR5 bilden und verbinden können, eine Eigenschaft, die in Avidin nicht gefunden wird.
  • Trotz der relativ hohen primären Sequenzkonservierung (4) gibt es interessante Aminosäuresubstitutionen, die die physikochemischen Eigenschaften von AVRs gegenüber denjenigen von Avidin verändern. Zum Beispiel ist der isoelektrische Punkt von einigen AVRs neutral oder sogar azidisch, im Gegensatz zu basisch für Avidin, und ihre Glycosylierungsmuster unterscheiden sich auch. Darüber hinaus werden Unterschiede bei der Biotinbindung beobachtet, unabhängig von dem Fakt, dass fast alle der Aminosäurereste, die für die Biotinbindung in Avidin und Streptavidin wichtig sind, in den AVRs konserviert werden. In vorangehenden Studien wurden die AVR-Sequenzen als Modelle für die Senkung des pI von Avidin verwendet (Marttila, A. T., Airenne, K. J., Laitinen, O. H., Kulik, T., Bayer, E., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1998) FEBS Lett. 441, 313–317) und zur Herstellung von nicht-glycosyliertem Avidin (Marttila, A. T., Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Kulik, T., Bayer, E. A., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (2000) FEBS Lett. 467, 31–6).
  • Alle pI-Mutanten, wie auch die nicht-glycosylierten Avidine, binden Biotin mit hoher Affinität und bilden stabile Tetramere. Daher wird von Unterschieden im pI oder dem Mangel von Glycosylierung an Positionen, die zu Rest 17 in Avidin korrespondieren, nicht erwartet, dass sie die Biotinbindung und Tetramerbildung der AVRs beeinflussen. Daraus folgt, dass die beobachteten Unterschiede auf bisher unbekannten Eigenschaften basieren müssen, die während sie die Biotinbindung beeinflussen, der Tetramerstabilität nicht schaden.
  • Ein anderes strukturell interessantes Merkmal der AVRs (mit Ausnahme von AVR2) ist der dritte Cysteinrest. Zusätzlich zu AVR4/5 kann dies zumindest teilweise die Eigenschaften der AVRs 1, 3, 6 und 7 erklären. Ihre Unfähigkeit, 2-Iminobiotin in IASyS-Analysen zu binden, kann die Gegenwart von solchen strukturellen Unterschieden im Vergleich mit Avidin reflektieren.
  • Zum Abschluss sind die rekombinanten AVRs funktionell und zeigen interessante physikochemische Eigenschaften. Diese neuen Biotinbinder können Vorteile gegenüber Avidin und Streptavidin bei verschiedenen Anwendungen bereitstellen. Zum Beispiel könnte AVR2 bei Affinitätsreinigungsprotokollen, die milde Elutionsbedingungen erfordern, verwendet werden.
  • Weiter können, wegen der Ähnlichkeit der Sequenzen von Avidin und AVRs, die ortsgerichteten Mutationen, die an der Avidinsequenz durchgeführt werden, um die thermostabile Mutante Avidin zu schaffen, auf eine ähnliche Weise für die AVRs durchgeführt werden, wodurch intermonomere Disulfidbrücken in dem Tetramer geschaffen werden. Das Tetramer kann eine Disulfidbrücke zwischen den Monomeren 1-3 und eine Disulfidbrücke zwischen den Monomeren 2-4, wie in Avd-ci, zwei Disulfidbrücken zwischen den Monomeren 1-4 und zwei Disulfidbrücken zwischen den Monomeren 2-3, wie in Avd-cci, oder eine Disulfidbrücke zwischen den Monomeren 1-3 und eine Disulfidbrücke zwischen den Monomeren 2-4 und zwei Disulfidbrücken zwischen den Monomeren 1-4 und zwei Disulfidbrücken zwischen den Monomeren 2-3, wie in Avd-ccci, aufweisen.
  • Die AVRs AVR1 und AVR2 besitzen Asparagin 117 anstelle des Isoleucins 117 in Avidin, das in diesen Mutanten zu Cystein geändert wird, und in AVR3–7 ist der Aminosäurerest 117 Tyrosin, der zu Cystein geändert wird. Der Isoleucinrest 106 und der Aspartatrest 86 sind die gleichen in dem Avidin und den AVRs (siehe 4).
  • AVR4/5 ist der nächste Verwandte zu dem Avidingen in der Familie und seine chromosomale Lokalisierung liegt dem Avidingen am nächsten (Ahlroth, M. K., Grapputo, A., Laitinen, O. H. & Kulomaa, M. S. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 285, 734–741). Es ist das einzige AVR, das Affinität gegenüber Biotin und 2-Iminobiotin zeigte, die dem Avidin vergleichbar war. Die offensichtlichsten strukturellen Unterschiede würden aus den verschiedenen Mustern der Glycosylierung und dem fremden Cysteinrest, der in den meisten AVRs gefunden wird, der in Avidin nicht vorliegt, entstehen. Zusätzlich zeigten die Reste in Kontakt an den Untereinheitsgrenzflächen der Modellstruktur signifikante Unterschiede, wenn sie mit der Avidinstruktur verglichen wurden. Gemäß der Analyse der Stabilität durch SDS-PAGE (Bayer, E. A., Ehrlich-Rogozinski, S. & Wilchek, M. (1996) Electrophoresis 17, 1319–1324) reduzierten diese Unterschiede jedoch nicht die Stabilität der AVRs.
  • Bei der vorliegenden Studie haben wir eine ausführlichere Untersuchung der strukturellen und Stabilitätseigenschaften des AVR4/5-Proteins unter Verwendung von umfassenden biochemischen und Mutationsanalysen durchgeführt. Eine überraschende Beobachtung der vorliegenden Erfindung war die überlegene Hitzestabilität von AVR4/5 und seinen Mutanten, wenn sie mit Avidin oder Streptavidin (Gonzalez, M., Argarana, C. E. & Fidelio, G. D. (1999) Biomol. Eng. 16, 67–72) und auch den thermisch verbesserten Avidinformen (Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483) verglichen wurden. In dem letzteren Fall wurden die Verbesserungen bei der Stabilität durch Einführung von Disulfidbrücken zwischen Avidinuntereinheiten erreicht. Im Gegensatz dazu ist die Disulfidbrücke, aufgrund des fremden Cys-124 von AVR4/5 nicht verbunden, um die Stabilität zu verbessern, da beobachtet wurde, dass AVR4/5(C124S) noch stabiler als AVR4/5 ist. Gemäß ITC, DSC und optischen Biosensordaten ähneln die Biotin- und 2-Iminobiotin-Bindungseigenschaften von AVR4/5 denjenigen von Avidin. Die gemessene Affinität gegenüber Biotin (Kd ≈ 3,6 × 10–14 M) ist schwächer als diejenige für Avidin, aber diese Wechselwirkung ist dennoch eine der stärksten, die für Ligand-Protein-Wechselwirkungen gemessen wird. Tatsächlich ähnelt sie Werten, die zwischen Biotin und bakteriellem Streptavidin gemessen werden (Kd ≈ 4,0 × 10–14 M) (Green, N. M. (1990) Methods Enzymol. 184, 51–67). Die thermodynamische Erklärung für die schwächere Affinität von AVR4/5 gegenüber Biotin (im Vergleich mit Avidin) scheint in der Entropieänderung bei Bindung zu liegen. Aufgrund ihrer hohen thermischen Stabilität können sich AVR4/5 oder einige seiner Derivate als extrem nützlich bei Anwendungen, bei denen eine hohe Hitzebeständigkeit erforderlich ist, erweisen.
  • Die Modellierungsergebnisse legen nahe, dass mögliche Gründe für die verbesserte thermische Stabilität sowohl eine stabilere tertiäre Struktur der AVR4/5 β-Tonne wie auch günstigere Untereinheitswechselwirkungen des Tetramers beinhalten. Die Struktur des Avidins kann flexibler und in einer offeneren Konformation vorliegen, um den Biotineintritt in die Bindungstasche zu akzeptieren, als die potenziell starrere AVR4/5-Tonne. Dies könnte auch die höhere Affinität von Avidin gegenüber Biotin und 2-Iminobiotin erklären. Die potenzielle Salzbrücke zwischen Asp-39 und Arg-114 in AVR4/5 könnte zu der beobachteten langsameren Assoziationsgeschwindigkeit von AVR4/5 für 2-Iminobiotin beitragen und sie könnte auch die Monomerstruktur stabilisieren. Darüber hinaus könnte die Wechselwirkung von Asp-39 mit dem positiv geladenen Lys-111 von der benachbarten Untereinheit die Stabilität des Tetramers steigern. Ein anderer Beitrag zu der langsameren Assoziationsgeschwindigkeit könnte die Gegenwart des Pro-41-Gly-42-Dipeptids in AVR4/5 sein, das eine Konformation bilden könnte, die den Eintritt von Biotin in die Bindungstasche teilweise blockiert.
  • Ein wichtiger Faktor für die gesteigerte Stabilität ist vermutlich mit der Deletion von zwei Resten in Schleife 4 von AVR4/5, korrespondierend zu den Resten Thr-55 und Ile-56 in Avidin, verbunden. Diese Deletion könnte die ungünstige Wechselwirkung, die in Avidin gesehen wird, eliminieren. Im allgemeinen hat der Vergleich der Kristallstruktur von verwandten Proteinen gezeigt, dass kürzere Schleifen weniger mobil und vermutlich stabiler sind (Usher, K. C., de la Cruz, A. F., Dahlquist, F. W., Swanson, R. V., Simon, M. I. & Remington, S. J. (1998) Protein Sci. 7, 403–412; Davail, S., Feller, G., Narinx, E. & Gerday, C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 17448–17453; Thompson, M. J. & Eisenberg, D. (1999) J. Mol. Biol. 290, 595–604). Zusätzlich könnte die Ser-41-zu-Prolin-Konversion in Schleife 3 zu der sekundären und tertiären Struktur von AVR4/5 Festigkeit hinzufügen. Der Ersatz von Glycinresten in AVR4/5, die in Avidin vorliegen, könnte einen weiteren stabilisierenden Effekt aufweisen, da Glycin potenziell mobiler ist und mehr Freiheit besitzt, um Torsionswinkel anzunehmen, die anderen Aminosäuren nicht erlaubt sind (Liu, H. L., Doleyres, Y., Coutinho, P. M., Ford, C. & Reilly, P. J. (2000) Protein Eng. 13, 655–659; Shibuya, H., Kaneko, S. & Hayashi, K. (2000) Biochem. J. 349, 651–656).
  • Schließlich sollte der Ersatz von Ile-117 in Avidin durch Tyrosin in AVR4/5 die Stabilität der 1-3-(und 2-4-)Dimer-Grenzfläche im Vergleich mit Avidin steigern. Darüber hinaus könnte sich der stabilisierende Effekt auf die Untereinheiten 2 und 4 (1 und 3) erstrecken, die zu der 1-3-(2-4-)Dimer-Grenzfläche in großer Nähe liegen (13D). Es werden jedoch zusätzliche Mutations- und Strukturanalysen gebraucht, um die Genauigkeit dieser Vorschläge zu validieren.
  • Obwohl die vorhergesagten Disulfidbrücken keinen Effekt auf die thermische Stabilität von AVR4/5 zu haben schienen, besaßen sie einen klaren Einfluss auf die Gesamtstruktur des Proteins. Im Gegensatz zu den vorangehenden Hypothesen (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617) legten die FPLC-Daten nahe, dass diese Disulfidbrücken AVR4/5-Tetramere miteinander verbinden, so dass größere oligotetramere Strukturen anstelle der Verbindung der Monomere mit dem gleichen Tetramer gebildet werden (10). Multimerisation hat direkte Konsequenzen für die möglichen Anwendungen, bei denen AVR4/5 ausgenutzt werden könnte. In einigen Fällen, bei denen eine hohe thermische Stabilität in Verbindung mit einer klar definierten Molekülmasse gebraucht wird, könnten dann AVR4/5(C124S) oder seine Derivate die beste Option sein. Unter anderen Umständen, z. B. bei denen eine hohe Biotin-Bindungskapazität zusammen mit höherer Thermostabilität erforderlich ist (Välimaa, L., Pettersson, K., Vehniäinen, M., Karp, M. & Lövgren, T. (2003) Bioconjug. Chem. 14, 103–111), könnte natives AVR4/5 der am besten geeignete Kandidat sein.
  • Basierend auf der Sequenz enthält AVR4/5 drei potenzielle N-Glycolysierungsorte. In einer vorangehenden Studie schien es, dass AVR4/5 stark glycosyliert war, aber es war nicht möglich, zu beurteilen, ob alle möglichen Orte genutzt werden (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617). Mutationsanalyse zeigte, dass Glycosylierung mindestens an Asn-43 auftritt (11). Die Glycosylierung von Asn-43 besitzt jedoch keinen deutlichen Einfluss auf die Biotinbindung, thermische Stabilität oder strukturelle Merkmale von AVR4/5. Ein Teil des resultierenden Proteins AVR4/5(N43E) schien sogar noch stärker glycosyliert zu sein als Avidin, was nahelegt, dass die beiden verbleibenden Glycosylierungsorte (Asn-71 und Asn-119) zumindest in einigem Ausmaß genutzt werden könnten.
  • Durch Konstruktion und Analyse des AVR4/5(Y117C, C124S) wurde gezeigt, dass es möglich ist, die Mutation(en), die in (Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483) beschrieben wird/werden, auf AVR4/5 (C124S) anzuwenden. Das erhaltene Protein AVR4/5(Y117C, C124S) ist ein stabiles Tetramer einschließlich kovalenten Bindungen zwischen den Untereinheiten. Diese Art von Protein könnte sogar noch bessere Eigenschaften bei Anwendungen, bei denen eine hohe Resistenz gegen Umgebungsfaktoren benötigt wird, anbieten. Eine mögliche Verwendung könnte z. B. bei oberflächenbasierten Anwendungen sein, bei denen das Biotin-bindende Protein an eine Matrix angebracht wird und die Untereinheitsdissoziation ein schädliches Ereignis ist.
  • Das Verhalten von AVR4/5-Protein wurde signifikant aufgrund der Mutation von Cys124 → Ser verändert. AVR4/5 bildet Oligomere von Tetrameren über intertetramere Disulfidbindungen. AVR4/5(C124S) verhält sich wie ein natives Avidin mit der hohen Stabilität von AVR4/5. Für das erhaltene Protein AVR4/5(C124S) wurde gefunden, dass es sogar noch stabiler als das ursprüngliche (AVR4/5) war. Dieses Protein (AVR4/5(C124S)) könnte sich als nützlich für viele Anwendungen in der Avidin-Biotin-Technologie herausstellen.
  • Es wird in dieser Anmeldung gezeigt, dass die intramonomeren Disulfidbrücken von Wildtyp-Avidin ein wichtiger Faktor dabei zu sein scheinen, das Avidin so thermostabil zu machen. Auf der anderen Seite ist es möglich, die hohe Thermostabilität von Avidin und anderen Biotin-bindenden Proteinen weiter durch die Einführung von intermonomeren Disulfidbrücken zu steigern. Die thermostabilsten Avidinmutanten und andere Biotin-bindende Proteinmutanten, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, stellen stabilere Werkzeuge für die Biotin-Bindungstechnologie, auch geeignet für neue Arten von Anwendungen, bereit.
  • Die Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele weiter beschrieben.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Design der Avidinmutanten
  • Die Mutationen wurden unter Verwendung der Sequenz- und Strukturinformation entwickelt, die aus Analysen mit GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite), WHAT IF (Vriend, G., J. Mol. Graph. 8 (1990), 52–6, 29) und InsightII (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA) Programmen erhalten wurde. Die Gentechnik der Codierungssequenz von Avidin wurde durch Megaprimer- (Sarkar, G. & Sommer, S. S., Biotechniques 8 (1990), 404–407) und QuikChange (Stratagene)-Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die die erwünschten Mutationen enthielten, durchgeführt.
  • Die Avidinmutante Avd-nc (C4A, C83Y) wurde konstruiert, um Information über die Wichtigkeit der intrinsischen Disulfidbrücken für die Gesamtstabilität des Avidintetramers zu erhalten. Gemäß der Sequenzanordnung mit Streptavidin wurden die Cysteinreste mit den gleichen Resten, die Streptavidin an den analogen Positionen in seiner Primärstruktur trägt, substituiert (Tabelle 1). Die Avidinmutante Avd-cci (D86C, I106C) übernahm unter Verwendung des evolutionären Ansatzes auch die Cysteine (Laitinen, O. H. et al., FEBS Lett 461 (1999), 52–8). Die Sequenzinformation kam von der avidinähnlichen Domäne der Seeigel-Fibropelline (Hunt, L. T. & Barker, W. C., Faseb 3 (1989), 1760–1764; Delgadillo-Reynoso, M. G. et al., J Mol Evol 29 (1989), 314–27; Bisgrove, B. W. et al., Journal of Molecular Evolution 41 (1995), 34–45; Bisgrove, B. W. & Raff, R. A., Dev Biol 157 (1993), 526–38). In dem Fall von Avd-cci wurden zwei intermonomere Disulfidbrücken, entwickelt, um sich zwischen den Monomeren 1-4 und 2-3 zu bilden, eingeführt, wodurch eine Gesamtheit von vier neuen Disulfidbrücken per Tetramer gebildet wurde (1A). Bei Avd-cci wurde von Cystein 86 von Untereinheit 1 angenommen, dass es sich mit Cystein 106 von der benachbarten Untereinheit 4 paart und umgekehrt. Es wurde angenommen, dass identische Kontakte auch auf der Grenzfläche der Untereinheiten 2 und 3 vorliegen.
  • Tabelle 1
  • Beschreibung der Proteine. Die Zahl der intermonomeren Disulfidbrücken und die gemessene Affinität gegenüber 2-Iminobiotin werden angezeigt. Hochgestellte (*) weisen darauf hin, dass Avd-nc aufgrund der Entfernung der Wildtypintramonomeren Disulfidbrücke keine Cysteine besitzt.
    Probe Mutierte Reste Zahl der intermonomeren Disulfidbrücken 2-Iminobiotinaffinität Kd (M)
    wt Avidin keine 0 2,5 × 10–8
    Avd-nc C4A, C83Y 0* 1,9 × 10–7
    Avd-ci I117C 2 8,5 × 10–8
    Avd-cci D86C, I106C 4 9,4 × 10–8
    Avd-ccci D86C, I106C I117C 6 2,9 × 10–7
  • Avd-ci (I117C) besitzt einen extra Cysteinrest in jeder Untereinheit des Tetramers. Es wurde gemäß der Mutationsstrategie, die Chilkoti (Chilkoti, A. et al., Bio/Technology 13 (1995), 1198–1204) und Reznik (Reznik, G. O. et al., Nat Biotechnol 14 (1996), 1007–11) verwendeten, um das Streptavidintetramer zu stabilisieren, entwickelt. In Avd-ci steht Cystein 117 von Untereinheit 1, Cystein 117 von der benachbarten Untereinheit 3 gegenüber.
  • Identisch enthält die korrespondierende Untereinheitsgrenzfläche 2-4 des Wildtyp-Proteins zwei äquivalente Isoleucinreste, die durch Cysteine ersetzt wurden. Daher wurde von zwei intermonomeren Disulfidbrücken in dem Avidintetramer erwartet, dass sie sich zwischen den Untereinheiten 1-3 und 2-4 bilden, wodurch die feste Bindung zwischen den Dimeren 1-4 und 2-3 durch die Addition der zwei kovalenten Bindungen intensiviert wird. Schließlich wurde, um sechs intermonomere Disulfidbrücken in das Avidintetramer, Avd-ccci, einzuführen, eine Kombination der Mutanten Avd-ci und Avd-cci konstruiert.
  • Beispiel 2
  • Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von mutanten Avidinen
  • Alle Mutanten wurden durch ein Bakulovirus-Expressionssystem (Bac-To-Bac, Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) in den infizierten Insektenzellen hergestellt und durch Affinitätschromatographie auf 2-Iminobiotinagarose gereinigt, wie zuvor detailliert durch Airenne (Airenne, K. J. et al., Protein Expression and Purification 9 (1997), 100–108) und Laitinen (Laitinen, O. H. et al., Biochem J. 363 (2002), 609–17) beschrieben wurde.
  • Wildtyp-Avidin wurde aus Hühnereiweiß gereinigt. Unter Verwendung eines Vibra cellTM Ultraschallgerätes wurde das Eiweiß für 3 Minuten auf Eis bei einer Stärkeneinstellung von 8 und einem 50% Tastgrad mit einer einminütigen Pause zwischen den Bursts beschallt. Nach der Beschallung wurde die Probe mit zwei Volumen PBS verdünnt und zentrifugiert (20 Minuten, 20.000 g, 4°C). Die lösliche Fraktion wurde weiter durch Affinitätschromatographie auf 2-Iminobiotinagarose, wie zuvor berichtet (Laitinen, O. H. et al., J Biol Chem 276 (2001), 8219–24) gereinigt. Die Proteinproben wurden konzentriert und einer Änderung der Puffer mit Centricon YM-3-Filtern (Millipore, cat. no. 4202) unterworfen. Die SDS-PAGE-Analyse wurde mit einem Probenpuffer ohne β-Mercaptoethanol durchgeführt.
  • Alle Mutanten zeigten eine ausgezeichnete Reinigungseffizienz, was darauf hinweist, dass die Mutationen keine größeren Effekte auf die 2-Iminobiotin-bindenden Eigenschaften hatten. Darüber hinaus zeigten die Mutanten irreversible Biotin-bindende Eigenschaften, die von denen des Wildtyp-Avidins nicht zu unterscheiden waren, wie mit einem IAsys optischen Biosensor gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). Die Affinitäten gegenüber 2-Iminobiotin wurden für Wildtyp-Avidin und die vier Mutanten bestimmt (Tabelle 1). Die Resultate wiesen darauf hin, dass die Mutationen die 2-Iminobiotin-bindenden Eigenschaften der Mutanten nicht signifikant veränderten. Die Bildung der intermonomeren Disulfidbrücken wurde mit SDS-PAGE-Analyse untersucht (1B), die bestätigte, dass die Cysteine auf die erwartete Weise Paare bildeten. Die Biotin-bindende Aktivität nach Hitzebehandlung von Avd-ci und Avd-ccci wurde durch ein Mikrotiterplattenassay untersucht (2). Die Mutanten erwiesen sich als stabiler und länger aktiv, in dem Sinne der Biotinbindung, als das Wildtyp-Avidin.
  • Beispiel 3
  • Biotin-Bindungsassays für Avidin und die Mutanten
  • Die Umkehrbarkeit der Biotinbindung wurde für Avidin und die Mutanten mit einem IA-sys optischen Biosensor (Laitinen, O. H. et al., FEBS Lett 461 (1999), 52–8) gemessen. Man ließ Proteinproben an eine Biotin-Aminosilan-Küvette in PBS, das 1 M NaCl enthielt, binden. Nachdem das Gleichgewicht erreicht wurde, wurde Biotin enthaltender Puffer zugegeben und die Dissoziation der Proteine wurde beobachtet. Die Affinitäten der Proteine gegenüber 2-Iminobiotin wurden mit einem IAsys optischen Biosensor (Marttila, A. T. et al., FEBS Lett 441 (1998), 313–7) bestimmt. Die Biotin-Bindungsaktivität der Mutanten Avd-ci und Avd-ccci nach Hitzebehandlung wurde mit einem Mikrotiterplattenassay untersucht. Die Proteinproben, 5 μg/ml Konzentration in PBS, wurden für unterschiedliche Zeiträume bei 99,9°C erhitzt und dann auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden auf eine Nunc Maxisorp-Platte übertragen und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS-Tween (0,05% V/V) gewaschen. Danach wurden die Vertiefungen mit PBS, das 1% BSA enthielt, bei 37°C für 30 Minuten blockiert und wieder mit PBS-Tween gewaschen. Als nächstes wurde biotinylierte alkalische Phosphatase (Sigma) in PBS, 1% BSA zugegeben und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden noch einmal mit PBS-Tween gewaschen und das PNPP-Substrat in DEA-Puffer (1 mg/ml) wurde zu den Vertiefungen zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde nach der Inkubation für 45 Minuten gemessen.
  • Beispiel 4
  • Differential-Scanning-Kalorimetrie der Avidin-Mutanten
  • Um die thermische Stabilität der gereinigten Avidin-Mutanten zu untersuchen, wurden sie einer Analyse durch Differential-Scanning-Kalorimetrie unterworfen. Es wurde ein Nano II-Differential-Scanning-Kalorimeter (Calorimetric Science Corporation, Provo, Utah) verwendet. Die Proteinprobenkonzentrationen betrugen 0,032 mM (als die Monomerkonzentration angegeben) und die Biotin enthaltenden Proben besaßen ein molares Biotin:Avidin-Verhältnis von 3:1. Die Referenzzelle wurde mit dem gleichen Puffer gefüllt, in dem die Probenproteine aufgelöst wurden (100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4). Die Thermogramme wurden als eine Funktion der Temperatur, zwischen 25 und 130°C bei einer Temperatur-Scangeschwindigkeit von 55,6°C/Stunde aufgezeichnet. Die Basislinien wurden subtrahiert und die Übergangsmittelpunkte (Tm) der Proben wurden unter Verwendung von Markensoftware, die durch den Instrumentenhersteller bereitgestellt wurde, berechnet.
  • Die Ergebnisse werden in einer Basislinien-subtrahierten Form (3) und numerisch (Tabelle 2) gezeigt. Wie durch die Thermogramme gezeigt wird, war Avd-ci die stabilste Avidinmutante, da ihr Denaturations-Tm-Wert der höchste war, sowohl in der Abwesenheit wie auch der Gegenwart von Biotin. Avd-ccci war nur gering weniger stabil als Avd-ci. Die anderen Mutanten und wt Avidin waren gleich stabil, wenn sie an Biotin gebunden waren, während Avd-nc und Avd-cci die niedrigsten Tm-Werte in der Abwesenheit von Biotin zeigten. Die hitzeinduzierte Entfaltung der Avidine war ein irreversibler Prozess und die Entfaltung der Proteine wurde oft von einer mehr oder weniger steilen Abnahme in der Hitzekapazität gefolgt (aufgrund Aggregation, Daten nicht gezeigt).
  • Tabelle 2
  • Hitze-induzierte Entfaltung der Wildtyp- und Mutanten-Avidine mit oder ohne Biotin wurde unter Verwendung von DSC untersucht. Die Werte für Tm sind die Durchschnitte der Ergebnisse aus zwei verschiedenen Experimenten (± Standardfehler des Mittelwertes). Der Wert für ΔTm zeigt die Differenz bei der Tm im Vergleich mit derjenigen von wt Avidin oder wt Avidin + Biotin an.
    Probe Tm/(°C) ΔTm/(°C)
    wt Avidin + Biotin 85,5 ± 0,1 118,2 ± 0,1
    Avd-nc + Biotin 76,4 ± 0,4 118,5 ± 0,1 –9,1 0,3
    Avd-ci + Biotin 98,6 ± 0,1 124,7 ± 0,5 13,1 6,5
    Avd-cci + Biotin 74,4 ± 0,1 117,5 ± 0,1 –11,1 –0,7
    Avd-ccci + Biotin 94,7 ± 0,5 122,0 ± 0,1 9,2 3,8
  • Beispiel 5
  • Sequenzvergleich und Molekülmodellierung von AVR-Proteinen
  • Die EMBL-Datenbank-Zugangsnummern für die AVR-Gene, die verwendet werden, um die korrespondierenden Aminosäuresequenzen abzuleiten, sind wie folgt: AVR1, Z21611; AVR2, Z21554; AVR3, Z21612; AVR4, Z22883, AVR6, AJ237658; AVR7, AJ237659. AVR4 stellt auch das identische AVR5 dar und wir benutzen daher die Bezeichnung AVR4/5. Die AVR-cDNAs wurden mit dem GCG-Software-Package-Programm Map (Genetic Computer Group, Madison, WI, USA) translatiert. Der theoretische pI für die AVRs und Avidin wurde unter Verwendung des GCG-Package-Programms Peptidesort bestimmt. Der Vergleich der Sequenzen von Avidin und AVR1–AVR7 wurde unter Verwendung von Malign (Johnson, M. S. und Overington, J. P. (1993) J. Mol. Biol. 233, 716–38; Johnson, M. S., May, A. C., Rodionov, M. A. und Overington, J. P. (1996) Methods Enzymol. 266, 575–98) in dem BODIL Modelling Environment (Lehtonen, Rantanen, Still and Johnson, unveröffentlicht) durchgeführt. Modellstrukturen von AVR1–AVR7 wurden unter Verwendung des Schnell-Homologie-Modellierungsprogramms HOMODGE in BODIL auf der Basis der Röntgenstruktur von Hühneravidin in Komplex mit Biotin (PDB-Code: 1avd; (Pugliese, L., Coda, A., Malcovati, M. und Bolognesi, M. (1993) J. Mol. Biol. 231, 698–710) erstellt. HOMODGE zielt darauf ab, Fehler bei Modellen von nah verwandten Proteinen durch Verwendung von so vielen Atomkoordinaten von der bekannten Struktur wie möglich zu reduzieren, um die konservierten Hauptketten- und Seitenkettenstrukturen aufzubauen. Wo sich die Seitenketten unterscheiden, verwendet HOMODGE eine Rotamerbibliothek, um die Seitenkettenkonformation auszuwählen, um die Kontakte zu optimieren.
  • Die mutmaßlichen AVRs wurden mit Avidin verglichen, um Unterschiede zu identifizieren, die die Biotinbindung, strukturelle oder andere biochemische Merkmale beeinflussen könnten. Die Biotin-Bindungsreste sind gut in allen AVR-Proteinen konserviert, zeigen nur drei Aminosäureänderungen (aus 16 möglichen) (4). Drei sequenzielle Reste, die in die Biotinbindung involviert sind (38–40, Thr-Ala-Thr in Avidin) werden durch Ala-Asp-Asn in allen AVR-Proteinen substituiert. Mit der Ausnahme von AVR7 mangelt es den AVR-Proteinen an dem Glycosylierungsort (Asn-17), der in Avidin vorliegt. Statt dessen weisen sie alle andere Asn-Xaa-Ser/Thr-Sequenzen auf, welche während der Proteinreifung entlang des Sekretionsweges glycosyliert werden könnten. Es gibt einen gemeinsamen Asn-Xaa-Ser-Ort in der L5-Schleife von allen AVR-Proteinen. Zusätzliche Asn-Xaa-Ser/Thr-Sequenzen sind wie folgt verteilt: zwei in AVR1 (in Strang β3 und in L3), eine in AVR2 (L3), eine in AVR3 (β8), zwei in AVR4/5 (L3 und β8) und zwei in AVR6 und AVR7 (β3 und β8). Die potenziellen N-Glycosylierungsorte der AVRs sind auf der Oberfläche des Tetramers lokalisiert und man erwartet daher von ihnen, dass sie glycosyliert werden.
  • Die theoretischen pIs von AVR3 und AVR4/5 sind basisch, ähnlich dem pI von Avidin (Avidin 10,4, AVR3 10,2 und AVR4/5 10,0). Auf der anderen Seite sind AVR1, AVR6 und AVR7 neutral (pI 7,3) und für AVR2 wird berechnet, dass es mit einem pI von 4,7 sauer ist. Alle AVR-Proteine, mit Ausnahme von AVR2, besitzen drei Cysteinreste (4). Bei AVR1, AVR3, AVR6 und AVR7 ersetzt das dritte "extra" Cystein Thr-60 von Avidin, das an dem Beginn von β5 lokalisiert ist. Bei AVR4/5 befindet sich der "extra" Cysteinrest nahe dem C-Ende des Proteins, wo Arg-124 in Avidin gefunden wird. Dieses Extra-Cystein ruft Agglomeration der Tetramere hervor und so würde es vorzuziehen sein, es durch eine andere Aminosäure zu substituieren.
  • Die Grenzflächenregionen zwischen verschiedenen Untereinheiten zeigen eine variable Anzahl von Aminosäuresubstitutionen zwischen den AVR-Proteinen und Avidin. Die Grenzfläche zwischen den Untereinheiten 1 und 2 (wie auch zwischen 3 und 4) ist in allen AVRs perfekt konserviert. Im Gegensatz dazu zeigen zwei von drei Grenzflächenresten zwischen den Untereinheiten 1 und 3 (2 und 4) Änderungen in allen AVR-Proteinen, mit Ausnahme von AVR4/5, welche nur eine Substitution (Ile-117-Tyr) zeigt. Interessanterweise zeigt die eng miteinander in Wechselwirkung stehende 1-4-(2-3)-Untereinheitsgrenzfläche verschiedene Aminosäuresubstitutionen in allen AVRs. In Avidin verleiht eine Gesamtheit von 22 Resten Kontakte unter den Untereinheiten innerhalb dieser Grenzfläche. Die AVR-Proteine weisen neun Substitutionen in dieser Region auf, von denen sieben in allen AVRs und zwei in allen AVRs außer AVR4/5 gefunden werden (Tabelle 3).
  • Tabelle 3
  • Aminosäuresubstitutionen in den Grenzflächenregionen zwischen AVRs und Avidin
  • Aminosäuren, die in Avidin an Wechselwirkungen unter den Untereinheiten teilnehmen, aber in AVRs substituiert sind.
    • a Hauptkettenkontakt
    • b Sauerstoffatom der Hauptkette
    • c Seitenkettenkontakt
    • d Van der Waals-Kontakte
    • e Anzahl der Wasserstoffbindungen
  • Figure 00350001
  • Die meisten der Sequenzunterschiede in der Untereinheitsgrenzfläche von Avidin und AVR1 bis AVR7 würden nicht mit der Tetramerbildung interferieren. Die kritischste Sequenzdifferenz ist an der Position 96 lokalisiert, wo Methionin in Avidin und AVR4/5 durch Lysin in AVR1 bis AVR3 und AVR6 bis AVR7 ersetzt wird. In Avidin und AVR4/5 interagiert Met-96 mit Met-96 von einem zweiten Monomer des Tetramers (5a). Wenn Met-96 durch das positiv geladene Lysin ersetzt wird, wie es in AVR1 bis AVR3 und AVR6 bis AVR7 gesehen wird, würde es logisch sein, zu erwarten, dass die Ladungsabstoßung mit der Bildung des Tetramers interferiert. Dies scheint jedoch nicht aufzutreten, sondern statt dessen kann Lys-96 von Monomer 1 Wasserstoffbindungen mit der Seitenketten-OH-Gruppe von Thr-113 von Monomer 4 und mit dem Hauptketten-Sauerstoff von Val-115 von Monomer 3 bilden (5b).
  • Im Vergleich mit Avidin ist die Biotin-Bindungstasche in AVR1 bis AVR7 hoch konserviert, wobei nur geringe Änderungen in den Sequenzen und daher in der Form der Bindungstasche beobachtet werden. Diese Änderungen sind auf den Bereich, der den flexibelsten Teil des Biotinmoleküls umgibt, begrenzt und daher kann Biotin einfach diese Änderungen kompensieren. Die einzige Ausnahme tritt an Position 111 auf. In Avidin, AVR1 und AVR3 bis AVR7 wird Lysin an dieser Position gefunden, während in AVR2 Isoleucin vorliegt. In der Avidin-Kristallstruktur interagiert der hydrophobe Teil der Lysin-Seitenkette mit dem Indolring von Trp-110, wodurch seine Position fixiert wird (5c). Der Ersatz von Lys-111 durch die massige Isoleucin-Seitenkette würde die Seitenkette von Trp-110 dazu zwingen, sich entweder in Richtung der Bindungstasche (effektiv den Biotineintritt an dieser Stelle blockierend) oder weg von der Bindungstasche (den Eintritt und Austritt von Biotin in/von dieser Stelle erlaubend) zu beugen (5d). Trp-110 ist eine der kritischsten Aminosäuren in der Bindungstasche, da es genau der Form von Biotin entspricht, wo der Ligand am starrsten ist. Der N-gebundene Glycosylierungsort auf L5, obwohl nahe dem Biotin-Bindungsort, ist Lösungsmittelexponiert. Das Asparagin, das glycosyliert ist, liegt nicht in der Nähe des Liganden, während die Serinseitenkette an die Carboxylatgruppe von Biotin wasserstoffgebunden ist. Wenn Biotin fehlt (z. B. während posttranslationeller Glycosylierung), sollte die Serin-Seitenkette für das glycosylierende Enzym zugänglich sein.
  • Alle AVRs, mit der Ausnahme von AVR2, enthalten ein drittes einzelnes Cystein (zusätzlich zu den zwei, die in Avidin vorliegen), das auf der Oberfläche der Proteine lokalisiert ist. Da AVR2 kein Extra-Cystein aufweist, gibt es keinen Grund zu glauben, dass AVR2 Tetramere auf einem Weg, der zu Avidin unterschiedlich ist, bilden könnte. In AVR1, AVR3, AVR6 und AVR7 ist das Extra-Cystein jedoch in L4 an Position 60 (Avidin-Nummerierung) lokalisiert, wo es unmöglich ist, eine Extra-Disulfidbindung zwischen Untereinheiten zu bilden, ohne die Tetramerbildung stark zu stören.
  • Beispiel 6
  • Herstellung und Reinigung von rekombinanten AVR-Proteinen
  • Die AVR1–4/5-Gene (Keinanen, R. A., Laukkanen, M. L. und Kulomaa, M. S. (1988) J. Steroid Biochem. 30, 17–21; Keinanen, R. A., Wallen, M. J., Kristo, P. A., Laukkanen, M. O., Toimela, T. A., Helenius, M. A. und Kulomaa, M. S. (1994) Eur. J. Biochem. 220, 615–21) wurden in die EcoRI-HindIII-Orte von pGEM4 geklont und wurden in vitro transkribiert und unter Verwendung von Ribomax und RNA Splicing System Kits (Promega) gemäß den Anleitungen des Herstellers gespliced. Die cDNAs wurden dann durch RT-PCR hergestellt und weiter durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer: AK33 (5'-CTGCTAGATCTATGGTGCACGCAACCTCCCC-3') und AK44 (5'GTTGCAAGCTTTGCGGGGCCATCCT-3'), die BglII bzw. HindII Restriktionsorte enthielten, amplifiziert. Nach Schneiden mit BglII und HindIII wurden die AVR1–4/5-cDNAs in BamHI- und HindIII-Orte von pFASTBAC geklont. Für AVR6 und AVR7 wurden cDNAs durch Subklonierung der korrespondierenden Gene (Ahlroth, M. K., Kola, E. H., Ewald, D., Masabanda, J., Sazanov, A., Fries, R. und Kulomaa, M. S. (2000) Anim. Genet. 31, 367–75) in pDsRed1 (Clontech), wo die rot fluoreszierende Protein codierende Region entfernt worden war, und durch darauffolgende Transfektion der Konstrukte in NIH/3T3-Zellen hergestellt. Die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung des SV Total RNA Isolation System (Promega) extrahiert. Die AVR6- und AVR7-cDNAs wurden durch RT-PCR (RobusT RT-PCR Kit, Finnzymes, Espoo, Finnland) unter Verwendung der Oligonukleotidprimer AK33 und AK44 hergestellt, um BglII- und HindIII-Restriktionsorte an den 5'- bzw. 3'-Enden der cDNAs herzustellen. Die synthetisierten cDNAs wurden in BamHI/HindIII verdauten pFASTBAC1 kloniert, dem Klonierungsvektor für das Bac-To-Bac Bakulovirus-Expressionsystem (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Die Nukleotidsequenzen der cDNAs wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die Virusvektoren für die Herstellung der AVR-Proteine wurden gemäß den Bac-To-Bac-Systemanleitungen konstruiert und amplifiziert. Rekombinante AVR-Proteine wurden in Sf9-Instektenzellen hergestellt, wie zuvor berichtet (Airenne, K. J., Oker-Blom, C., Marjomäki, V. S., Bayer, E. A., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1997) Protein Expr. Purif. 9, 100–10822). Die Proteine wurden aus den Zellen unter Verwendung von Affinitätschromatographie auf einer 2-Iminobiotin-(AVR1, AVR3, AVR4/5–7) und/oder Biotinagarosesäule (AVR1 und AVR2) gereinigt, wie zuvor beschrieben (Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Marttila, A. T., Kulik, T., Porkka, E., Bayer, E. A., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1999) FEBS Lett. 461, 52–8). AVR2 wurde aus Biotinagarose mit 1 M Essigsäure eluiert und die Elutionsfraktionen wurden sofort mit NaOH neutralisiert. Die Flution von AVR1 wurde unter Verwendung von 1 M HCl, gefolgt von Neutralisation mit Tris (1 g/ml) erreicht.
  • Alle AVRs zeigten verschiedene Muster in der SDS-PAGE im Vergleich mit Avidin (8). Ein-Schritt-2-Iminobiotin(AVR1, AVRs 3–7) und/oder Biotin-(AVRs 1 und 2) Agarose-Affinitätschromatographie ergab hoch homogene Proteine, die keine Kontaminanten zeigten, wie durch SDS-PAGE-Analyse beurteilt wurde.
  • Beispiel 7
  • Biotin-Bindungsanalysen von AVRs
  • Die Biotin-Bindungseigenschaften der AVR-Proteine wurden, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung des IASyS optischen Biosensors untersucht (Marttila, A. T., Airenne, K. J., Laitinen, O. H., Kulik, T., Bayer, E. A., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1998) FEBS Lett. 441, 313–317; Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Marttila, A. T., Kulik, T., Porkka, E., Bayer, E. A., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1999) FEBS Lett. 461, 52–8). Die Affinitäten wurden für 2-Iminobiotin oder Biotin bei 20°C unter Verwendung einer Rührstärke von 100 gemessen. Kurz gefasst, ließ man das untersuchte Protein in Biotin-freiem Puffer an die Biotin-beschichtete Oberfläche der IASyS-Küvette binden. Als eine negative Kontrolle wurde das untersuchte Protein mit einem Überschuss an Biotin vor (und wurde auch unter einem Biotin-Überschuss erhalten bei) der Zugabe zu der Küvette getränkt. Unter diesen Bedingungen konnte eine restliche Bindung an die Biotinoberfläche der Küvette als unspezifisch betrachtet werden und wurde als ein Maß der Basislinienvariation verwendet. Ein Bindungsgleichgewicht in der experimentellen Küvette wurde als erreicht angenommen, nachdem keine Bindung im Vergleich zu der negativen Kontrolle nachgewiesen wurde.
  • Die Umkehrbarkeit der Biotinbindung wurde wie folgt untersucht: man ließ Avidin und die AVRs an eine Biotin-beschichtete Küvette binden. Nach Messung der anfänglichen Bindung (A), wie oben beschrieben, wurde Biotin-gesättigter (0,17 mg/ml) Puffer in die Küvette injiziert und die Menge an Proteinen, die gebunden blieb, wurde gemessen, bis keine Dissoziation gesehen wurde, wiederum im Vergleich mit der negativen Kontrollküvette (B). Die Messzeit betrug mindestens 20 Minuten. Das Prozent Umkehrbarkeit wurde wie folgt berechnet: Umkehrbarkeit (%) = 100 × (A – B)/A. A – B ist die Menge befreiter Proteine nach Biotinzugabe.
  • In dem Umkehrbarkeitsassay zeigten AVRs 3–7 total irreversible Biotinbindung, ähnlich wie Avidin. Im Gegensatz dazu zeigte AVR1 18%ige und AVR2 93%ige Umkehrbarkeit nach der Zugabe von freiem Biotin (Tabelle 4). Die tatsächlichen Dissoziationskonstanten (Kd) wurden für die AVRs gemäß den kass- und kdiss-Geschwindigkeiten, gemessen in einem getrennten Assay, in verschiedenen Proteinkonzentrationen (variierend zwischen 10 μM und 100 pM) berechnet (Tabelle 4 und 6). Die Bindung schien einer Kinetik zweiter Ordnung oder einer noch komplexeren zu folgen. Die ersten 1.000 Sekunden der Bindung passten jedoch sehr gut zu der biphasischen Kurve. Alle gemessenen Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten (kdiss) folgten der Kinetik erster Ordnung. Wegen der extrem hohen Bindung konnten die Affinitäten der AVRs für Biotin, mit Ausnahme für AVR1, AVR2 und AVR7, nicht bestimmt werden. Die Bindung an 2-Iminobiotin wurde nur für AVR4/5 bestimmt und sie war ähnlich derjenigen von Avidin. Der Mangel an Bindung für die anderen AVRs war überraschend, da die meisten von ihnen unter Verwendung von 2-Iminobiotinagarose gereinigt worden waren. Dies kann durch den relativ kurzen Linker zwischen 2-Iminobiotin und der aktivierten Gruppe der IASyS-Küvette bedingt sein, der nicht erlaubte, dass 2-Iminobiotin tief genug in die Biotin-Bindungstasche der anderen AVRs eindrang.
  • Tabelle 4
  • Optische Biosensordaten für Biotin und 2-Iminobiotin-Bindungen für Avidin und AVRs
  • Biotin-bindende Eigenschaften von AVRs im Vergleich zu Avidin (AVD), bestimmt unter Verwendung des IASyS-Biosensors. Die Werte für Avidin stammen von Laitinen et al. (Laitinen, O. H. et al., Biochem. J 363, 609–17 (2002)) und Marttila et al. (Marttila, A. T. et al., FEBS Lett 467, 31–6 (2000)). Die Umkehrbarkeit der Bindung wurde unter Verwendung einer Biotinküvette bestimmt.
    • a Gemessen in einer 2-Iminobiotinküvette.
    • b Gemessen in einer Biotinküvette.
    • c Die Dissoziationskonstanten wurde aus den Gleichgewichtsantwortdaten berechnet.
    • d Die Dissoziationskonstanten wurden direkt aus den Bindungskurven berechnet.
    • ND Nicht bestimmt.
    AVD AVR1 AVR2 AVR3 AVR4/5 AVR6 AVR7
    Kd(M)c (1,7 ± 1,3) × 10–8a (1,0 ± 0,8) × 10–7b (1,7 ± 1,5) × 10–6b << 10–8b (5,7 ± 2,5) × 10–7a << 10–8b (4,5 ± 6,2) 10–9b
    Kd(M)d (2 ± 0,9) × 10–8a (4,4 ± 1,9) × 10–8b (5,2 ± 1,7) × 10–8b ND (9,1 ± 3,6) × 10–8a ND ND
    kass (M–1 s–1) (1,6 ± 0,7) × 104 (5,5 ± 1,5) × 104 (1,8 ± 0,1) × 104 ND (1,8 ± 0,2) × 105 ND (1,8 ± 0,2) × 105
    kdiss (s–1) (3,1 ± 1,4) ± 10–4 (2,4 ± 0,8) × 10–3 (4,6 ± 1,1) × 10–3 ND (1,7 ± 0,7) × 10–3 ND ND
    Umkehrbarkeit (%) 1 ± 1 18 ± 10 94 ± 3 3 ± 2 2 ± 2 5 ± 3 3 ± 3
  • Beispiel 8
  • Strukturanalysen der AVRs
  • Die Hitzestabilität der AVRs wurde unter Verwendung eines auf SDS-PAGE basierenden Verfahrens untersucht (Bayer, E. A., Ehrlich-Rogozinski, S. und Wilchek, M. (1996) Electrophoresis 17, 1319–1324). Bei diesem Verfahren wurde jede Proteinprobe in zwei Fraktionen unterteilt, von denen eine biotinfrei gehalten wurde und die andere mit einem Überschuss an Biotin versorgt wurde. Die Proben wurden dann mit denaturierendem SDS-PAGE-Probenpuffer (enthaltend β-Mercaptoethanol) gemischt und bei einer gegebenen Temperatur für 20 Minuten inkubiert. Nach der Hitzebehandlung wurden die Proben SDS-PAGE unterworfen und durch Färbung mit Coomassie-Brilliantblau sichtbar gemacht. Es wurden die relativen Anteile von tetrameren und monomeren Formen der AVR-Proteine (mit Avidin als der Kontrolle) nachgewiesen. Ein ähnlicher Assay, bei dem β-Mercaptoethanol in dem Probenpuffer ausgelassen wurde, wurde durchgeführt, um die Gegenwart von Disulfidbrücken zwischen den Untereinheiten zu untersuchen. Die Sensibilität gegenüber Proteinase K wurde sowohl in der Abwesenheit wie auch der Anwesenheit von Biotin, wie beschrieben, untersucht (Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Marttila, A. T., Kulik, T., Porkka, E., Bayer, E. A., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1999) FEBS Lett. 461, 52–8). Der isoelektrische Punkt von jedem AVR wurde durch isoelektrische Fokussierung, wie zuvor berichtet, bestimmt (Marttila, A. T., Airenne, K. J., Laitinen, O. H., Kulik, T., Bayer, E., Wilchek, M. und Kulomaa, M. S. (1998) FEBS Lett. 441, 313–317). Die Glycosylierungsmuster der AVR-Proteine wurden durch Behandlung der Proteine mit Endo Hf und PNGase F-Glycosidase gemäß den Anleitungen des Herstellers (New England Biolabs, MA, USA) untersucht.
  • Alle AVRs zeigten in einem reduzierenden SDS-PAGE-Assay mit Avidin vergleichbare Hitzestabilität (nicht gezeigt). In der Abwesenheit von Biotin begannen AVR-Tetramere in Monomere bei ungefähr 60°C zu dissoziieren. In der Gegenwart von Biotin blieb ein Teil der AVRs sogar bei Kochen tetramer. Nicht-reduzierende SDS-PAGE zeigte, dass AVR1 und AVRs 3–7 eine Tendenz aufweisen, Dimere zu bilden. Unter reduzierenden Bedingungen konnten nur Tetramere und Monomere erkannt werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Dimere über Disulfidbrücken (stabil genug, um die Dimere unter nichtreduzierenden Bedingungen zusammenzuhalten) quervernetzt sind und durch Hitze langsam zu Monomeren abgebaut werden (7 und Tabelle 5). Die Verschiebung von einem vollständig tetrameren Zustand zu einem dimeren und monomeren Zustand wurde bei der allmählichen Anhebung der Temperatur nachgewiesen. AVR2 ist eine Ausnahme, da es direkt in Monomere zerfiel, ähnlich nativem Avidin.
  • Die AVRs zeigten auch eine bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse. In der Gegenwart von Biotin blieben alle AVRs nach 16 Stunden Proteinase K-Behandlung intakt. Proteolyse trat, wenn auch langsam, in der Abwesenheit von Biotin auf. Zusammengenommen zeigten die AVRs eine Stabilität, die ähnlich oder sogar größer war als diejenige von Avidin (nicht gezeigt).
  • Über die multiplen Banden, die für die AVRs in SDS-PAGE beobachtet wurden, wurde herausgefunden, dass sie verschieden glycosylierte Formen waren. Die Behandlung mit Endo Hf-Glycosidase und PNGase F eliminierte die Banden mit höherem Molekulargewicht. Die Anzahl mutmaßlicher Glycosylierungsorte scheint gut mit den beobachteten Glycosylierungsmustern zu korrelieren. Vorläufige Deglycosylierungsergebnisse, die nicht-denaturierende Bedingungen verwenden, legen nahe, dass N-Glycan an dem Glycosylierungsort in L5 in AVRs 1,2,4/5 anbegracht wird. Die isoelektrische Fokussierung zeigte, dass die pIs der AVRs annähernd die gleichen waren, wie aus theoretischen Berechnungen erwartet; ca. 7 für AVRs 1, 6 und 7; ungefähr 5 für AVR2 und ungefähr 10 für AVRs 3 und 4/5.
  • Tabelle 5
  • Relative Thermostabilität von Avidin und AVRs unter nichtreduzierenden Bedingungen
  • Die relativen Anteile (als Prozentsatz) von verschiedenen oligomeren Formen von AVRs und Avidin (AVD) in SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen, gekocht 20 Minuten vor der Ladung auf das Gel. Beachte die Gegenwart von dimeren Formen in dem Fall der AVRs 1, 3–7.
    Protein AVD AVR1 AVR2 AVR3 AVR4/5 AVR6 AVR7
    Tetramer - 20 - - - - -
    Dimer - 40 - 50 50 50 20
    Monomer 100 40 100 50 50 50 80
  • Beispiel 9
  • Mutagenese von AVR4/5 und die Reinigung von exprimierten rekombinanten Proteinen
  • Es wurde ortsgerichtete Mutagenese von cDNA, die AVR4/5-Protein codiert, (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617) unter Verwendung von Quik-Change-(Stratagene, La Jolla, CA, USA)Mutageneseverfahren durchgeführt.
  • Basierend auf der Sequenzanordnung von AVR4/5 und Avidin (4), wurde Asp-43 von AVR4/5 zu Glutamat mutiert, um eine mögliche Glycosylierung an dieser Position zu vermeiden. Cys-124 in AVR4/5 wurde zu Serin konvertiert, um die Bildung von fremden Disulfidbrücken in AVR4/5 zu eliminieren. Serin wurde aufgrund der Sequenzunterschiede, die AVR4/5 und Avidin an ihren C-Enden zeigen, ausgewählt. Serin ist ein polarer Rest mit einer ähnlichen Größe wie Cystein. Die resultierenden Mutanten wurden als AVR4/5(N43E) und AVR4/5(C124S) bezeichnet und sie wurden hergestellt, wie in (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617) beschrieben. Tyr-117 in AVR4/5(C124S) wurde zu Cys konvertiert, um eine Doppelmutante AVR4/5(Y117C, C124S) zu züchten und die Bildung von Disulfidbrücken zwischen Untereinheiten in demselben Tetramer zu ermöglichen (Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483).
  • Es wurden rekombinante Bakuloviren, die AVR4/5 und seine mutierten Formen herstellten, gemäß den Instruktionen des Bac-To-BacTM-Systems (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) erzeugt. Es wurden Wildtyp- und Mutanten-AVR4/5-Proteine in mit Bakulovirus infizierten Sf9-Insektenzellen in biotinfreiem Medium hergestellt, wie zuvor berichtet (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617). Die hergestellten Proteine wurden mit Affinitätschromatographie unter Verwendung von 2-Iminobiotinagarose gereinigt, wie zuvor beschrieben (Laitinen, O. H., Marttila, A. T., Airenne, K. J., Kulik, T., Livnah, Ο., Bayer, E. A., Wilchek, M. & Kulomaa, M. S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 8219–8224).
  • Kurz gefasst, wurden die Insektenzellinfektionen mit Zellen durchgeführt, die auf ein biotinfreies Medium transferiert wurden. Man ließ die Infektion 72 Stunden fortschreiten und danach wurden die Zellen durch Zentrifugation (1.500 g, 5 min) gesammelt. Die Zellpellets wurden in einem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, pH 8) erneut suspendiert und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Danach wurde der Zellextrakt beschallt und zentrifugiert (15.000 g 20 min) und der pH des Überstandes wurde mit 5 M NaOH auf 11 eingestellt und NaCl wurde zu einer endgültigen Konzentration von 1 M zugegeben. Dann wurde der Zellextrakt auf eine 2-Iminobiotinagarosesäule, die zuvor mit Bindungspuffer (50 mM Natriumcarbonat, 1 M NaCl) gewaschen worden war, aufgebracht. Die gebundenen Proteine wurden von der Säule mit 50 mM Na-Acetat, pH 4, eluiert.
  • Die Konzentrationen der Avidinlösungen wurden aus der Absorption bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 24.280 M-1 cm-1 für Avidin, 26.960 M-1 cm-1 für AVR4/5 und AVR4/5(N43E), 26.840 M-1 cm-1 für AVR4(C124S) und 25.680 M-1 cm-1 für AVR4/5(Y117C, C124S) (Green, N. M. (1975) Adv. Protein Chem. 29, 85–133) berechnet.
  • Beispiel 10
  • Glycosylierungsanalyse von AVR 4/5 und seinen Mutanten
  • Die Glycosylierungsmuster der Proteine wurden durch Behandlung der Proteine mit Endo Hf-Glycosidase gemäß den Anleitungen des Herstellers (New England Biolabs, MA, USA) untersucht, wie in (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617) beschrieben wird. Die Proben wurden dann mit 15% SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-Brillantblau gefärbt. Nicht-behandelte Proteinproben wurden als eine Kontrolle verwendet.
  • Die Behandlung mit Endo Hf-Glycosidase rief das Verschwinden von Banden mit höherem Molekulargewicht in den Proteinproben hervor (11A). In dem Fall von AVR4/5(N43E) gab es keine Bande, die zu der Form mit den höchsten Molekulargewichten, die bei den unbehandelten Proben von AVR4/5 vorlag, korrespondierte.
  • Beispiel 11
  • Gelfiltrationsanalyse von AVR4/5 und seinen Mutanten
  • Der oligomere Zustand des AVR4/5 und seinen Mutantformen wurde mit FPLC-Gelfiltration unter Verwendung von Shimadzu HPLC-Flüssigchromatographie, ausgerüstet mit einer Superdex 200 HR 10/30-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und einem Fluoreszenzdetektor (Anregung 280 nm, Nachweis 350 nm) untersucht. Die Säule wurde unter Verwendung der Gelfiltrationsmischung (Thyreoglobulin, IgG, Ovalvumin, Myoglobin, Vitamin B-12; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) und Rinderserumalbumin (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) als Molekulargewichtsstandards kalibriert. Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,2) oder Natriumcarbonatpuffer (50 mM, pH 11) mit 650 mM NaCl wurden als die Flüssigphase verwendet. Proteinproben, die zwischen 5 und 25 μg in einem Volumen von 20 μl variierten, wurden bei der Analyse verwendet. Die Reduktion der intertetrameren Disulfidbrücken wurde durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol zu einer endgültigen Konzentration von 10% (V/V), wonach die Proteinprobe 1 Stunde bei 37°C inkubiert wurde, durchgeführt.
  • AVR4/5 und seine mutierte Form N43E schienen bei der Gelfiltration heterogen zu sein, da Formen mit höherem Molekulargewicht gesehen wurden (10A, Tabelle 6). Die Oxidierung von AVR4/5 rief eine ausgedehnte Oligomerisation des Proteins hervor (10C). Wenn die Probe von AVR4/5 mit 2-Mercaptoethanol behandelt wurde, verschwanden die Formen mit hohem Molekulargewicht und das Protein lag hauptsächlich in der tetrameren Form vor (10D). AVR4/5(C124S) erschien als ein Tetramer (10B), identisch mit Avidin. AVR4/5(Y117C, C124S) erschien als ein Tetramer, was auf die Abwesenheit von intertetrameren Disulfidbrücken (die in nativem AVR4/5 vorliegen) hinweist (10E).
  • Tabelle 6
  • Strukturmerkmale von Avidinen
  • FPLC-Gelfiltrationselutionszeiten und berechnete Molekulargewichte der Proteine. Hitzeinduzierte Entfaltung von Proteinen, bestimmt durch DSC (Durchschnitt ± S.A). Ein Überblick über die zuvor veröffentlichten Ergebnisse ist auch mit eingeschlossen.
    Figure 00480001
    • a ΔTm ist die Änderung in Tm bei Zugabe eines dreifachen molaren Überschusses von Biotin.
    • b ΔH Wert, der aus der Probe ohne Biotin erhalten wird. Der Wert konnte aus Proben, die mit Biotin gesättigt waren, nicht genau bestimmt werden, da die Tm-Werte zu nah an der Temperaturgrenze der DSC-Ausrüstung lagen.
    • c Drei Proteinformen mit den niedrigsten Molekulargewichten werden angegeben.
    • d Nicht gemessen.
    • e Nicht bestimmt, aufgrund niedrigen Signals.
    • f Unveröffentlichte Ergebnisse (V. P. Hytönen 2003)
    • g Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483.
    • h Gonzalez, M., Argarana, C. E. & Fidelio, G. D. (1999) Biomol. Eng. 16, 67–72.
  • Beispiel 12
  • Nicht-reduzierende SDS-PAGE-Analyse von AVR 4/5 und seinen Mutanten
  • Proteinproben wurden in der Abwesenheit oder Gegenwart von Biotin (0,02 mg/ml) auf eine endgültige Konzentration von ungefähr 0,2 mg/ml in 50 mM Na-Carbonatpuffer, pH 8,7 verdünnt und die Proteine wurden durch Zugabe von NHS-Essigsäurekonjugat auf eine endgültige Konzentration von 0,2 μg/ml acetyliert. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur (23°C) für 10 Minuten inkubiert. Es wurde eine gleiche Menge an SDS-PAGE-Probenpuffer ohne 2-Mercaptoethanol zu der Probe zugegeben und sie wurde für 20 Minuten gekocht. Nach der Analyse durch 15% SDS-PAGE wurde das Gel mit Coomassie-Brillantblau gefärbt.
  • In der SDS-PAGE-Analyse erschien AVR4/5(Y117C, C124S) (11C) sowohl in dimerer wie auch monomerer Form in der nichtreduzierenden Umgebung (dimere Form weist auf die Bildung von Disulfidbrücken zwischen Untereinheiten hin). (Die Gegenwart von monomeren Formen könnte auf eine gewisse Ineffizienz bei der Disulfidbrückenbildung hinweisen).
  • Beispiel 13
  • Optische Biosensorstudien von AVR 4/5 und seinen Mutanten
  • Die Biotin-bindenden Eigenschaften der verschiedenen Avidine wurde unter Verwendung eines IAsys optischen Biosensors bei 20°C untersucht. Die Umkehrbarkeit der Bindung und die Bindungsaffinitäten an die 2-Iminobiotinoberfläche in 50 mM Boratpuffer (pH 9,5, 1 M NaCl) wurden gemessen, wie zuvor berichtet (Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M. S., Airenne, K. J. & Kulomaa, M. S. (2002) Biochem. J. 363, 609–617).
  • Kurz gefaßt, wurde der 2-Iminobiotinligand auf der Carboxymethyldextranoberfläche einer Küvette unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimidaktivierung immobilisiert. Die Bindung von verschiedenen Konzentrationen von Avidin oder Avidinmutanten auf die 2-iminobiotinylierte Oberfläche wurden in einem 50 mM Boratpuffer (pH 9,5), der 1 M NaCl enthielt, bei 20°C gemessen. Die Iminobiotinküvetten wurden mit 20 mM HCl regeneriert. Die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziation (kass) und Dissoziation (kdiss) wurden unter Verwendung des Fast Fit programm package (Affinity Sensors) berechnet. Die erhaltenen Geschwindigkeitskonstanten wurden verwendet, um Kd (rel) gemäß Kd = kdiss/kass zu berechnen. Die Gleichgewichtsdaten, die aus Messungen mit verschiedenen Proteinkonzentrationen erhalten wurden, wurden verwendet, um die Dissoziationskonstante Kd(eq) zu berechnen.
  • Alle Proteine zeigten in der IAsys-Wechselwirkungsanalyse eine starke Bindung an die Biotinoberfläche, ähnlich derjenigen von Hühneravidin (Tabelle 7). Alle AVR4/5-Varianten zeigten ähnliche Affinitäten gegenüber der 2-Iminobiotinoberfläche (Tabelle 7). Diese Affinitäten waren jedoch eine Größenordnung niedriger als diejenigen, die von Avidin für 2-Iminobiotin gezeigt wird. In allen Fällen wurde eine langsamere Assoziationsgeschwindigkeit als die Ursache für die erniedrigten 2-Iminobiotinaffinitäten beobachtet.
  • Tabelle 7
  • Biotin-bindende Eigenschaften von Broteinen, bestimmt durch optischen Biosensor.
  • Gemessene Affinitäten zu der 2-Iminobiotinoberfläche für Avidin und verschiedene AVR4/5. Die Umkehrbarkeit der Bindung an Biotin wurde unter Verwendung einer Biotin-Küvette bestimmt.
    Figure 00520001
    Avd-ncd Avd-cid Avd-ccid Avd-cccid
    Kd(M)a 2,5 × 10–8 1,9 × 10–7 9,4 × 10–8 2,9 × 10–7
    • d Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483.
  • Beispiel 14
  • Differential-Scanning-Kalorimetrie
  • Die Thermodynamik der hitzeinduzierten Entfaltung der Proteine wurde unter Verwendung von DSC untersucht. Der Übergangsmittelpunkt der hitzeinduzierten Denaturierung (Tm) des Avidins und verschiedener AVR4/5-Formen wurde unter Verwendung eines Nano II-Differenzial-Scanning-Kalorimeters (Calorimetric Sciences Corporation, Provo, UT, USA) untersucht. Die Referenzzelle wurde mit Puffer gefüllt, während die Probenzelle mit Proteinen gefüllt wurde, die in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 100 mM NaCl enthielt, aufgelöst wurden. Avidin und AVR4/5(C124S) wurden auch in 50 mM Na-Acetat, pH 4,0, enthaltend 100 mM NaCl, analysiert. Darüber hinaus wurde AVR4/5 in der Gegenwart von 2-Mercaptoethanol (0,4% V/V) analysiert. Die Proben (1,6 bis 9,6 μM) wurden sowohl in der Abwesenheit wie auch der Gegenwart eines dreifachen molaren Überschusses an Biotin pro Untereinheit analysiert. Alle Proben wurden vor der Ladung auf die DSC entgast. Die Thermogramme wurden als eine Funktion der Temperatur aufgezeichnet; zwischen 25 und 130°C bei einer Geschwindigkeit von 55,6°C/Stunde (Gonzalez, M., Argarana, C. E. & Fidelio, G. D. (1999) Biomol. Eng. 16, 67–72; Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483). Die Daten wurden unter Verwendung von Microcal Origin 6.0 und Cpcalc 2.1 (Applied Thermodynamics, Hunt Valley, Maryland) analysiert. Es wurde die Änderung in der Hitzekapazität bei der Entfaltung (ΔCp) für Avidin und AVR4/5(C124S) unter Verwendung von DSC-Daten aus Messungen bei pH 4,0 und 7,0 gemessen. ΔCp wurde dann aus der Steigung von ΔH gegen Tm erhalten (Liu, Y. & Sturtevant, J. M. (1996) Biochemistry 35, 3059–3062).
  • Biotin wurde von Sigma Chemicals erworben und wie geliefert verwendet. In dem Messpuffer wurde eine 0,395 mM Lösung von Biotin hergestellt. Die Konzentration von Biotin wurde gravimetrisch mit einer Mikrowaage bestimmt.
  • Im Vergleich mit Wildtyp-Avidin entfalteten sich alle AVR4/5-Proteine bei einer deutlich höheren Temperatur (Tabelle 6). Die Enthalphieänderung ΔH bei der Entfaltung war für AVR4/5 und AVR4/5(C124S) im Vergleich mit Avidin größer. Aufgrund der Zugabe von Biotin wurde der Tm für alle Proteine zu einer höheren Temperatur verschoben. Keine der AVR4/5-Formen waren jedoch in dem gleichen Grade stabilisiert wie Wildtyp-Avidin (ΔTm, Tabelle 6). Die Behandlung mit 2-Mercaptoethanol rief keine signifikante Abnahme in dem Tm von AVR4/5 hervor.
  • Die Tm-Werte von Avidin und AVR4/5(C124S) bei pH 4 betrugen 76,6 ± 0,2°C bzw. 103,2 ± 0,5°C. Die Änderung in der Hitzekapazität bei der Entfaltung (ΔCp) war für AVR4/5(C124S) und Avidin eher ähnlich (Tabelle 6). Die ΔCp für Avidin war dem Wert ähnlich, der von Donovan und Ross (Donovan, J. W. & Ross, K. D. (1973) Biochemistry 12, 512–517) berichtet wird.
  • Beispiel 15
  • Isothermale Titrationskalorimetrie
  • Die Bindungsenthalpien (ΔH) wurden mit einem isothermalen Titrationskalorimeter (ITC-4200, Calorimetric Sciences Corporation, Provo, UT, USA) gemessen. Das ITC wurde chemisch durch Titration von Aliquots von 1,00 mM HCl in 265 mM Tris, aufgelöst in Wasser, kalibriert. Die Messungen wurden bei 25 und 37°C mit 1,0 ml Proteinlösung (20 bis 25 μM), die unter konstantem Rühren erhalten wurde, durchgeführt. Biotin (0,395 mM) wurde in die Probenzelle in 10 μl Aliquots titriert. Für die Hitze der Dilution, die im Vergleich zu der Hitze der Bindungsreaktion klein war, wurde in der Analyse der Ergebnisse korrigiert. Die Analyse der Daten wurde unter Verwendung von Titration Bindworks 3.0.69 (Applied Thermodynamics, Hunt Valley, MD, USA) durchgeführt. ΔCpL wurde aus der Steigung von ΔH gegen Temperatur (T) berechnet.
  • Die Wechselwirkung zwischen AVR4/5(C124S) und Biotin wurde mit der zwischen Avidin und Biotin unter Verwendung von ITC verglichen. Da für AVR4/5(C124S) herausgefunden wurde, dass es Biotin wie AVR4/5 bindet und wie Avidin oligomerisiert, wurde es für ITC-Messungen ausgewählt. Da diese Proteine eine sehr hohe Affinität zu Biotin besitzen, konnte keine Bindungskonstante aus den ITC-Experimenten allein berechnet werden. Da der gesamte Ligand jedoch bei der Titration gebunden wird, konnte die Bindungsenthalpie aus der Hitze berechnet werden, die bei der Injektion von Biotin freigesetzt wird. Die ITC-Experimente, durchgeführt bei 25 und 37°C, zeigten, dass sowohl die ΔH wie auch die ΔCp für die Biotinbindung an AVR4/5(C124S) und Avidin ähnlich waren (Tabelle 6). Die Bindungsenthalpie für Biotin, das an Avidin bindet, war einem zuvor berichteten Wert ähnlich und die ΔCpL lag dem berichteten Wert auch nahe (Swamy, M. J. (1995) Biochem. Mol. Biol. Int. 36, 219–225).
  • Die geschätzte Bindungskonstante Kb, berechnet aus einer Kombination von ITC- und DSC-Daten, zeigte, dass die Bindung von Biotin an AVR4/5(C124S) (Kb ≈ 2,8 × 1.013 M-1) fast zwei Größenordnungen kleiner war als für Avidin (Kb ≈ 9,3 × 1.015 M-1). Der Unterschied, wie Biotin an AVR4/5(C124S) und Avidin bindet, kann aus den thermodynamischen Daten in Tabelle 6 interpretiert werden. Da ΔH für die Biotinbindung sowohl an AVR4/5(C124S) und Avidin ähnlich ist, wird von der Differenz in ΔG erwartet, dass sie hauptsächlich entropiebedingt hervorgerufen wird.
  • Beispiel 16
  • Mikroplattenassay
  • Die Biotin-bindende Aktivität der Proteine nach Hitzebehandlung wurde mit einem Mikrotiterplattenassay untersucht (Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483). Proteinproben, 5 μg/ml in PBS (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,2) wurden für verschiedene Zeiträume bei 99,9°C erhitzt (T3-Thermocycler, Whatman Biometra, Göttingen, Deutschland; Deckeltemperatur 102°C, Anstieg 0,2°C/sek) und dann auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden auf eine Maxisorp-Platte mit 96 Vertiefungen (Nalge Nunc International) transferiert und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS-Tween (0,05% Tween-20 V/V) gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit PBS-BSA (1% Gew./Vol.) bei 37°C für 30 Minuten blockiert und wieder mit PBS-Tween gewaschen. Es wurde biotinylierte alkalische Phosphatase (Sigma) in PBS-BSA zugegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden noch einmal mit PBS-Tween gewaschen und das para-Nitrophenylphosphat in DEA-Puffer (Sigma, 1 mg/ml) wurde auf die Vertiefungen aufgebracht. Die Absorptionen bei 405 nm wurden nach Inkubation für 45 Minuten gemessen.
  • Der Mikroplattenassay zeigte, dass AVR4/5 und seine Mutanten Kochen widerstehen und in einer aktiven Form signifikant länger verbleiben als Hühneravidin oder sogar ein stabilisiertes Avidin AVD-ci mit zusätzlichen intermonomeren Disulfidbindungen (Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483). Von den untersuchten Proteinen zeigte AVR4/5(C124S) die größte Stabilität, da ungefähr 30% der anfänglichen Bindungsaktivität nach Kochen für 32 Minuten vorlag (12).
  • Beispiel 17
  • Strukturmodellierung und Sequenzanalyse von AVR4/5
  • Die dreidimensionale Struktur von Avidin im Komplex mit Biotin (PDB-Zugangscode: 1avd;) (Pugliese, L., Coda, A., Malcovati, M. & Bolognesi, M. (1993) J. Mol. Biol. 231, 698–710) wurde von der Protein Data Bank (PDB) erhalten. Die Sequenzanordnung von Avidin und AVR4/5 wurde unter Verwendung von MALIGN (Johnson, M. S., Overington, J. P. & Blundell, T. L. (1993) J. Mol. Biol. 231, 735–752) in dem BODIL Modeling Environment1 unter Verwendung einer strukturbasierten Sequenzvergleichsmatrix (Johnson, M. S., May, A. C., Rodionov, M. A. & Overington, J. P. (1996) Methods Enzymol. 266, 575–598) mit einer gap penalty 40 durchgeführt.
  • Das Programm HOMODGE in BODIL wurde verwendet, um 3D-Modellstrukturen durch Erhaltung der Fixierung der Seitenkettenkonformationen von allen identischen Resten und durch Erhalt der korrespondierenden Torsionswinkel von ähnlichen Resten in der Anordnung zu konstruieren. Die intramolekularen Wechselwirkungen der Aminosäuren an Sequenzpositionen, die sich von denjenigen in der Matrizenstruktur unterscheiden, wurden unter Verwendung der Aminosäurenseitenketten-Rotamer-Bibliothek (Lovell, S. C., Word, J. M., Richardson, J. S. & Richardson, D. C. (2000) Proteine 40, 389–408), eingeschlossen innerhalb BODIL, analysiert.
  • Die Molekularmodellierung und Sequenzanalyse identifizierte Aminosäuresubstitutionen zwischen Avidin und AVR4/5, die die beobachteten Unterschiede in der Stabilität und den funktionellen Eigenschaften von AVR4/5 erklären könnten. Zum Beispiel werden Gly-21 und Gly-107 in den Schleifen 2 und 7 in Avidin gefunden, aber sie liegen nicht in AVR4/5 vor. Auf der anderen Seite enthält Schleife 3 von AVR4/5 die Pro-41-Gly-42-Sequenz, die nicht in Avidin vorliegt (4).
  • In 13 werden Sequenzunterschiede zwischen Avidin und AVR4/5 für Reste, bei denen die Seitenketten in Wechselwirkungen an den Untereinheitsgrenzflächen involviert sind, hervorgehoben. Die größte Grenzfläche tritt zwischen den Untereinheiten 1 und 4 (2 und 3) auf, wobei 31 Aminosäure-Seitenketten von beiden Untereinheiten involviert sind. Diese Grenzfläche zeigt nur vier Sequenzunterschiede. Tyr-55 und Ile-56 in Avidin korrespondieren zu einer Deletion in AVR4/5 an einer Schleife, die zwischen den β-Strängen 4 und 5 lokalisiert ist. In Avidin wird die hydrophobe Seitenkette von Ile-56 von Untereinheit 1 von den polaren Hauptketten-Sauerstoffatomen von Trp-70, Lys-71 und Ser-73 von Untereinheit 4 umgeben (13A). In AVR4/5 ist es wahrscheinlich, dass die Deletion vorteilhafte Wechselwirkungen zwischen der positiv geladenen Seitenkette von Arg-56 und den polaren Hauptketten-Sauerstoffatomen von Trp-68, Asn-69 und Ser-71 erlaubt (13B). In der Avidinstruktur wird eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen Ile-117 von Untereinheit 1 und Ile-117 von Untereinheit 3 (oder Untereinheiten 2 und 4) gebildet. In Avidin wird Ile-117 von verschiedenen Wassermolekülen umgeben, was die benachbarte polare Umgebung reflektiert (13C). In AVR4/5 (13D) kann Tyr-117 eine zusätzliche vorteilhafte Wechselwirkung mit Tyr-117 von der anderen Untereinheit bilden. Tyr-117 in AVR4/5 würde sehr wahrscheinlich zwei Wassermoleküle ersetzen und mit den verbleibenden Wassermolekülen und umgebenden Aminosäureresten in Wechselwirkung treten.
  • Asp-39 in AVR4/5 korrespondiert zu Alanin in Avidin, wobei es an der Grenzfläche zwischen Untereinheiten 1 und 2 lokalisiert ist. Die Seitenkette von Alanin in der Avidinstruktur ist nicht in der Lage, irgendwelche intramolekularen Wechselwirkungen zu bilden, sondern säumt nur die Ligand-bindende Tasche (14A). Im Gegensatz dazu bildet Asp-39 in AVR4/5 sehr wahrscheinlich eine Salzbrücke mit Arg-112 von der gleichen Untereinheit, was die Größe des Einganges zu der Ligand-bindenden Höhlung begrenzen könnte (14B). Zusätzlich kann dieses Aspartat mit dem positiv geladenen Ende der Lys-109-Seitenkette von einem benachbarten Monomer in Wechselwirkung treten.
  • Beispiel 18
  • Mikropartikelanalyse von AVR4/5
  • Vor der Analyse wurden 3,22 μm Mikropartikel mit COOH-Gruppe/0,852 nm2 (Gangs laboratories, Fishers, IN, USA) kovalent mit Biotin-bindenden Proteinen beschichtet. Mikropartikel (1·108 Stück) wurden zweimal mit H20 durch sequenzielle Zentrifugation (5.000 g; 3 Minuten) und Aspiration gewaschen und in 200 μl PB-Puffer (50 mM NaH2PO4-HCl, pH 3,0) erneut suspendiert. Es wurde eine Lösung aus Biotin-bindendem Protein (50 μl, 1 mg/ml oder 3 mg/ml, 50 mM Na-Acetat, pH 4,0) während Verwirbelung zugegeben. Die Suspension wurde für 1 Stunde inkubiert (500 U/min; 23°C). Die Partikel wurden mit PB und mit MES-Puffer (50 mM, pH 5,5) gewaschen und in MES-Puffer (200 μl) suspendiert. Es wurde eine Lösung aus 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (Pierce, Rockford, IL, USA) in MES-Puffer (200 μl, 1 mg/ml) während Verwirbelung zugegeben und die Suspension wurde für eine Stunde inkubiert (500 U/min; 23°C). Die Partikel wurden dann einmal mit MES-Puffer und viermal mit Assay-Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM NaN3, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20, pH 8,0) gewaschen. Nach der letzten Waschung wurden die Partikel in 100 μl Volumen suspendiert und die Konzentration der Partikel mit Multisizer 3 Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) bestimmt. Streptavidin-beschichtete Mikrosphären (3,12 μm Durchmesser) wurden von Gangs Laboratories erworben.
  • Die Mikropartikel (5·106 Stück) wurden in 900 μl Assay-Puffer suspendiert und in vier PCR-Röhren (i–iv; 180 μl/Aliquot) aliquotiert. Eine Lösung aus BF523-Biotin (ArcDia Ltd., Turku, Finnland) in N,N-Dimethylformamid (Riedel-De-Haen, Seelze, Deutschland) wurde mit Assay-Puffer auf eine Konzentration von 200 nM verdünnt und 20 μl dieser Lösung wurde in die Aliquots (i) und (ii) gegeben, die dann für 1 Stunde unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert wurden (22°C, 1.100 U/min Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Deutschland). Die Aliquots (ii) und (iv) wurden dann für 30 Minuten bei 95°C inkubiert (PTC-100, ausgerüstet mit Hot bonnetTM beheizbarem Deckel; M & J Research; Waltham, MA, USA), während die Aliquots (i) und (iii) diese Zeit bei Raumtemperatur erhalten wurden. Die BF523-Biotinlösung (20 μl, 200 nM) wurde zu den Aliquots (iii) und (iv) nach thermischer Behandlung zugegeben. Alle Aliquots wurden für 2 Stunden (22°C, 1.100 U/min) inkubiert und in 3 Wiederholungsversuchen (15 μl) zu den Vertiefungen einer 384-Platte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) transferiert und die Platte wurde mit klebendem PCR-Film (Abgene, Surrey, UK) versiegelt. Die Proben wurden mit ArcDia TPX PlateReader (ArcDia Ltd.) gemessen (Soini, E., Meltola, N. J., Soini, A. E., Soukka, J., Soini, J. T. & Hanninen, P. E. (2000) Biochem. Soc. Trans. 28, 70–74). Um die Präzision und Genauigkeit der Resultate zu verbessern, wurden die individuellen Datenpunkte (Mikropartikel), die durch eine fokale Zeitdauer von weniger als 5 ms charakterisiert wurden, ausgelassen.
  • Die negative Kontrolle für den Assay wurde durch Sättigung der beschichteten Partikel mit unmarkiertem Biotin (100 pmol/1·106 Partikel) vor der Inkubation mit BF523-Biotin hergestellt.
  • Die Fluoreszenz-Emissionseffizienz des BF523-Biotin-Konjugats (200 nM) wurde vor und nach der Inkubation (30 min) bei 95°C bestimmt. Die Messungen wurden mit dem ArcDia TPX PlateReader unter Verwendung von sechs Proben-Wiederholungsversuchen (15 μl) durchgeführt. Die erhaltene 14,1%ige Abnahme bei der Sondenfluoreszenz wurde durch die gesamten Analysen hindurch verwendet, um die Resultate zu korrigieren.
  • Die Eigenschaften von AVR4/5 und AVR4/5(C124S) wurden durch Beschichtung von Kunststoffmikropartikeln mit Proteinen untersucht. Die Kapazität von AVR4/5-beschichteten Partikeln war deutlich höher im Vergleich zu kommerziellen Streptavidinpartikeln und Partikeln, die mit Wildtyp-Avidin beschichtet waren, und Hochstabilitäts (Tm = 98,6°C)-AVD-ci mit zwei Disulfidbindungen zwischen den Untereinheiten (Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., Slotte, J. P. & Kulomaa, M. S. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2479–2483) (Tabelle 4, i, iii). Die Spezifität von BF523-Biotinbindung an Protein-beschichtete Partikel wurde durch Sättigung der Partikel mit unmarkiertem Biotin vor der Analyse bestätigt.
  • Wenn Partikel, die mit Biotin-bindenden Proteinen beschichtet waren, hitzebehandelt wurden, zeigten AVR4/5-Formen eine ausgezeichnete Hitzeresistenz im Vergleich zu anderen Proteinen (Tabelle 4, iv). AVR4/5 und AVR4/5(C124S) zeigten 93% bzw. 75% des ursprünglichen Signals nach Behandlung. Die Streptavidinpartikel zeigten 21% des ursprünglichen Signals nach Erhitzung. AVD-ci zeigte im Vergleich mit Wildtyp-Avidin (9%) eine höhere Beständigkeit (35%). Wenn das Biotinkonjugat vor der Hitzebehandlung zugegeben wurde (ii), zeigten alle Partikel eine bessere Beständigkeit, als wenn sie allein behandelt wurden. Sequenzprotokoll
    Figure 00620001
    Figure 00630001
    Figure 00640001
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    Figure 00670001
    Figure 00680001
    Figure 00690001

Claims (2)

  1. Thermostabile Avidinmutante mit einer Aminosäuresequenz von vier Monomeren, die ein Tetramer bilden, dadurch gekennzeichnet, dass das Avidin ein Avidin-verwandtes Protein AVR4/5 gemäß 4 ist, wobei der Aminosäurerest Tyrosin 117 in Cystein geändert wurde und wobei Cystein 124 in Serin geändert wurde.
  2. Isolierte Polynukleotidsequenz, kodierend die Mutante gemäß Anspruch 1.
DE60317220T 2002-08-23 2003-08-22 Verbesserte mutanten von biotinbindendem protein Expired - Lifetime DE60317220T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20021518 2002-08-23
FI20021518A FI20021518A0 (fi) 2002-08-23 2002-08-23 Avidiinin lämpökestävyyden lisääminen
PCT/FI2003/000619 WO2004018509A1 (en) 2002-08-23 2003-08-22 Improved mutants of biotin binding protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60317220D1 DE60317220D1 (de) 2007-12-13
DE60317220T2 true DE60317220T2 (de) 2008-08-14

Family

ID=8564470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60317220T Expired - Lifetime DE60317220T2 (de) 2002-08-23 2003-08-22 Verbesserte mutanten von biotinbindendem protein

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20060281899A1 (de)
EP (1) EP1546195B1 (de)
AT (1) ATE377024T1 (de)
AU (1) AU2003262585A1 (de)
DE (1) DE60317220T2 (de)
FI (1) FI20021518A0 (de)
WO (1) WO2004018509A1 (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI20041396A0 (fi) * 2004-10-29 2004-10-29 Vesa Pekka Hytoenen Uudet mikrobiavidiinit
FI119024B (fi) 2004-12-31 2008-06-30 Licentia Oy Kimeeriset avidiinimutantit
DE102008053892A1 (de) 2008-10-30 2010-05-06 Fachhochschule Gelsenkirchen Medizinisches Implantat mit biofunktionalisierter Oberfläche
GB0906643D0 (en) 2009-04-17 2009-06-03 Wilson Stuart M Detection of bacteria and fungi
US9018360B2 (en) 2009-06-24 2015-04-28 Japan Tobacco Inc. Modified biotin-binding protein
EP2400304A1 (de) 2010-06-22 2011-12-28 Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) Verfahren zur Charakterisierung intermolekularer Interaktionen
WO2012123269A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Immunogenic compositions and methods for their use
EP2505640A1 (de) 2011-03-29 2012-10-03 Neo Virnatech, S.L. Impfstoffzusammensetzungen für vom Birnavirus übertragenen Krankheiten
EP2743695A1 (de) 2012-12-12 2014-06-18 Nanogap Sub NM Powder, S.A. Verfahren und Reagenzien zur Detektion von Biomolekülen mittels Lumineszenz
WO2015101666A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 Fundación Biofísica Bizkaia VLPs, METHODS FOR THEIR OBTENTION AND APPLICATIONS THEREOF
GB201616051D0 (en) * 2016-09-21 2016-11-02 Univ Oxford Innovation Ltd Mutant streptavidian with improved fluorescent brightness and uses thereof
WO2018162450A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells
CN112955184A (zh) * 2018-03-15 2021-06-11 基本解决方案公司 可编程免疫细胞受体复合物系统
EP4371569A1 (de) 2022-11-16 2024-05-22 Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea Vlps gegen akute myeloische leukämie

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997011183A1 (en) * 1995-04-11 1997-03-27 Trustees Of Boston University Streptavidin mutants
AU6344100A (en) * 1999-07-15 2001-02-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Generation of stable dimers with reversible biotin-binding activity

Also Published As

Publication number Publication date
ATE377024T1 (de) 2007-11-15
AU2003262585A1 (en) 2004-03-11
EP1546195B1 (de) 2007-10-31
FI20021518A0 (fi) 2002-08-23
WO2004018509A1 (en) 2004-03-04
EP1546195A1 (de) 2005-06-29
DE60317220D1 (de) 2007-12-13
US20060281899A1 (en) 2006-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60317220T2 (de) Verbesserte mutanten von biotinbindendem protein
Shoemaker et al. Use of DNA sequence and mutant analyses and antisense oligodeoxynucleotides to examine the molecular basis of nonmuscle myosin light chain kinase autoinhibition, calmodulin recognition, and activity.
Bennett et al. The spectrin skeleton: from red cells to brain.
Suckow et al. Genetic studies of the lac repressor XV: 4000 single amino acid substitutions and analysis of the resulting phenotypes on the basis of the protein structure
Lohse et al. Arrestin interactions with G protein-coupled receptors
Miller et al. Sequence of the Octopus dofleini hemocyanin subunit: structural and evolutionary implications
Palczewski et al. Role of the carboxyl-terminal region of arrestin in binding to phosphorylated rhodopsin
Baxevanis et al. The HMG-1 box protein family: classification and functional relationships
Gertler et al. Mena, a relative of VASP and Drosophila Enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics
Klco et al. C5a Receptor Oligomerization: I. disulfide trapping reveals oligomers and potential contact surfaces in ag protein-coupled receptor
KR100602857B1 (ko) 감각 정보 전달과 관련된 ｇ-단백질 커플링된 수용체를암호화하는 핵산
DE60027295T2 (de) Sphingosinekinase
Rees et al. Three-dimensional structures of neurotoxins and cardiotoxins
DE60305634T2 (de) Anaplastisches Lymphoma Kinase Testverfahren, Reagenzien und Kompositionen davon
Quesenberry et al. Role of conserved and nonconserved residues in the Ca (2+)-dependent carbohydrate-recognition domain of a rat mannose-binding protein. Analysis by random cassette mutagenesis.
Cestele et al. Scorpion α‐like toxins, toxic to both mammals and insects, differentially interact with receptor site 3 on voltage‐gated sodium channels in mammals and insects
Sugita et al. NECABs: a family of neuronal Ca2+-binding proteins with an unusual domain structure and a restricted expression pattern
Joglekar et al. The SNARE motif contributes to rbet1 intracellular targeting and dynamics independently of SNARE interactions
Herrmann et al. The effects of hydrophilic to hydrophobic surface mutations on the denatured state of iso-1-cytochrome c: investigation of aliphatic residues
DE602004011686T2 (de) Avidinmutanten
Fukada et al. Phosphorylation of iodopsin, chicken red-sensitive cone visual pigment
Xiao et al. Dimerization interface of osteoprotegerin revealed by hydrogen–deuterium exchange mass spectrometry
Vishnivetskiy et al. Molecular defects of the disease-causing human arrestin-1 C147F mutant
Van Houten Chemosensory transduction in Paramecium
Kerwin et al. Assembly of avian skeletal muscle myosins: evidence that homodimers of the heavy chain subunit are the thermodynamically stable form.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition