FI119024B - Kimeeriset avidiinimutantit - Google Patents
Kimeeriset avidiinimutantit Download PDFInfo
- Publication number
- FI119024B FI119024B FI20041705A FI20041705A FI119024B FI 119024 B FI119024 B FI 119024B FI 20041705 A FI20041705 A FI 20041705A FI 20041705 A FI20041705 A FI 20041705A FI 119024 B FI119024 B FI 119024B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- avidin
- avr4
- protein
- proteins
- biotin
- Prior art date
Links
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 101150072119 Avr4 gene Proteins 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 abstract description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 86
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 42
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 42
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 42
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 26
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 23
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 23
- 102220623518 Immunoglobulin heavy variable 4-61_I117Y_mutation Human genes 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- WWVANQJRLPIHNS-BKPPORCPSA-N 2-iminobiotin Chemical compound N1C(=N)N[C@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@H]21 WWVANQJRLPIHNS-BKPPORCPSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 3
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 3
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-2-iminopentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCC(=N)C(=O)O)SC[C@@H]21 DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010056594 Avian Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100437155 Gallus gallus AVR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437158 Gallus gallus AVR5 gene Proteins 0.000 description 1
- HLRLXVPRJJITSK-IFFSRLJSSA-N Gln-Thr-Val Chemical group [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HLRLXVPRJJITSK-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102220491927 Golgin subfamily A member 6-like protein 2_N54H_mutation Human genes 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102220465574 Putative uncharacterized protein OBSCN-AS1_A39D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 description 1
- 238000013321 baculovirus-insect cell expression system Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940068840 d-biotin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 201000008659 immature cataract Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200129657 rs35278779 Human genes 0.000 description 1
- 102220114585 rs886039132 Human genes 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006918 subunit interaction Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012982 x-ray structure analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
119024
KIMEERISET AVIDIINIMUTANTIT - KIMERISKA AVIDINMUTANTER KEKSINNÖN ALA
Esillä oleva keksintö koskee kanan avidiiniproteiinin uusia kimeerisiä mutantteja, 5 joilla on parannettuja ominaisuuksia, esim. lämmönkestävyys, parempi proteolyy-sinkestävyys, paremmat varausominaisuudet (esimerkiksi pienempi pl) natiiviin avidiiniin ja avidiinin kaltaisiin proteiineihin, AVR:iin, verrattuna. Kimeerisiä avidiini-mutantteja ovat mutantit, joissa vähintään yksi avidiinin alue on substituoitu vähintään yhdellä vastaavalla AVR-proteiinista peräisin olevalla alueella.
10 KEKSINNÖN TAUSTA
Avidiini on homotetrameerinen glykoproteiini, joka on eristetty kananmunanvalku-aisesta. Jokainen avidiinin kahdeksanjuosteinen beetasylinterialayksikkö koostuu 128 aminohaposta ja sisältää yhden ligandin sitoutumiskohdan. Avidiini, kuten myös sen bakteerianalogi, Streptomyces avidiniista peräisin oleva sirepfavidiini, 15 pystyy muodostamaan lujan ja spesifisen kompleksin vesiliukoisen vitamiinin, d-biotiinin (dissosiaatiovakio Kd s 10"15 M) kanssa (1, 2). Tämä avidiinin erityisominaisuus sekä sen tetrameerinen luonne ja hyvä pysyvyys ovat tehneet siitä erään laajimmin hyväksikäytetyistä proteiinityökaluista biotieteiden useissa biokemiani- • · · ·*·· * sissa, farmaseuttisissa ja biofysikaalisissa sovelluksissa (3, 4).
• · • · • · · ·*·" 20 Avidiinin geeniperheeseen kuuluvat avidiini ja seitsemän avidiinin kaltaista geeniä (AVR:ää) (5). Vaikka avidiiniproteiini ilmentyy erilaisissa kudoksissa (6), geeniper- heen muita jäseniä ei ole tähän mennessä havaittu kanassa proteiinimuodossa.
AVR-proteiinien toiminnallisten ja rakenteellisten ominaisuuksien tutkimiseksi niitä **·* tuotettiin äskettäin bakuloviruksen hyönteissoluilmentämisjärjestelmän avulla (7).
25 Sekä AVR4- että AVR5-geeni koodaavat identtistä proteiinia, jota kutsutaan nimel- *·:.* lä AVR4/5. Avidiini ja AVR4/5 ovat noin 80-prosenttisesti identtisiä aminohappose- • · · kvenssinsä suhteen, ja lähes kaikki avidiinissa biotiinin sitoutumiseen osallistuvat tähteet ovat konservoituneina AVR4/5:ssä. Havaittiin, että rekombinanttinen .···. AVR4/5 sitoi biotiinia melkein yhtä lujasti kuin avidiini. Kiinnostavinta oli se, että [" 30 sen havaittiin olevan merkittävästi lämmönkestävämpi, sen lämpödenaturaation v.: siirtymän puoliväli Tm oli 106,4 °C avidiinin vastaavaan arvoon Tm = 83,5 °C verrat- tuna (8).
2 119024
On ehdotettu, että proteiinin oligomerisoituminen luonnossa saa aikaan pysyvämpiä rakenteita (9, 10). Tämän lisäksi pysyvillä proteiineilla on rakenteissaan luontaisesti yleensä vain joitakin vesirakenteita (water clefts) (11, 12). Sitä paitsi Szilägyi and Zävodszky (13) ovat tutkineet ionisidosten osuutta proteiinien hyvän 5 lämmönkestävyyden aikaansaamisessa, he suorittivat mesofiilisistä ja termofiilisis-tä organismeista saaduille korkealaatuisille proteiinirakenteille tilastollisen analyysin. He havaitsivat korrelaation ioniparien lukumäärän ja organismin kasvulämpöti-lan välillä ja laativat hypoteesin, jonka mukaisesti ionipareilla on merkitystä rakenteelle erityisesti korkeissa lämpötiloissa. Lämmönkestävistä proteiineista löydettyjä 10 ionisidoksia on siirretty onnistuneesti niiden mesofiilisistä organismeista peräisin oleviin analogeihin niiden stabiloimiseksi (14). Aromaattisten parien tärkeys läm-mönkestävissä proteiineissa on myös havaittu (15), ja näitä pareja on siirretty onnistuneesti proteiinien välillä niiden lämmönkestävyyden parantamiseksi (16).
KEKSINNÖN LYHYT KUVAUS
15 Kanan avidiinin geeniperheeseen kuuluvat avidiini ja seitsemän erillistä avidiinin kaltaista geeniä (AVR:ää) 1-7 (SEQ ID No:t 2-8). Avidiiniproteiinia käytetään laajalti biokemiallisena työkaluna, kun taas muita perheenjäseniä on vasta äskettäin tuotettu ja karakterisoitu rekombinanttiproteiineina. Aikaisemmin AVR4/5:n on havaittu olevan tähän mennessä karakterisoiduista biotiinia sitovista proteiineista 20 kaikkein pysyvin (Tm = 106,4 °C). AVR4/5:n tarkka rakenne helpotti avidiinin ja ··· : AVR4/5:n rakenteellisten yksityiskohtien vertailua. Esillä olevassa keksinnössä • · · näistä vertailututkimuksista saatuja tietoja käytetään AVR4/5:n pysyvyys- ja funk- • *·· tionaalisten ominaisuuksien siirtämiseen avidiiniin. Esillä olevassa keksinnössä *:·*: saatiin aikaan parempi lämmönkestävyys sekä myös parempi kestävyys proteo- ··· 25 lyyttistä hajoamista vastaan. AVR-proteiineilla on joitakin mielenkiintoisia ominai- :***. suuksia, ja saattaa olla mahdollista siirtää niitä avidiiniin analogisen menettelyn avulla.
Kimeerisen avidiiniproteiinin, ChiAVD:n, joka sisälsi AVR4/5:n 21 :n aminohapon • · · segmentin, havaittiin olevan merkittävästi pysyvämpi (Tm = 96,5 °C) kuin natiivin : V. 30 avidiinin (Tm = 83,5 °C), ja sen biotiinia sitovat ominaisuudet muistuttivat AVR4/5:n ,···. vastaavia ominaisuuksia. Avidiinin tärkeän alayksikön rajapinnan optimointi • · y AVR4/5:n sekvenssin mukaisella isoleusiini 117:n pistemutaatiolla tyrosiiniksi v.: (I117Y) paransi merkittävästi avidiinimutantin lämmönkestävyyttä (Tm = 97,5 °C) ·«« heikentämättä sen voimakasta biotiiniin sitoutumista. Nämä kaksi modifikaatiota 35 yhdistämällä rakennettiin hyperlämmönkestävä ChiAVD(l117Y) (Tm = 111,1 °C). Tutkimme myös edelleen AVR4/5:n biotiininsitomisominaisuuksia. AVR4/5:n bio- 3 119024 tiinisitoutuneen ja ei-sitoutuneen tilan välillä havaittiin energiakynnyksen kasvu avidiinin vastaavaan ominaisuuteen verrattuna. Näin saaduille kimeereille saattaa löytyä käyttöä ääriolosuhteita hyödyntävissä sovelluksissa, kuten PCR:ssä.
PIIRUSTUSTEN KUVAUS
5 Kuvio 1 A) Kanan avidiinin ja AVR4/5:n Needleman-Wunsch-rinnastus. Proteiinien identtisyys on 77,8 %. Alue, joka sisältää beetalaskoksen 4 ja osan sen ympärillä olevista silmukoista, sekä mutatoitu aminohappotähde 1117 on raamitettu. Rinnastus tehtiin käyttämällä MALIGN-ohjelmaa (36). B) Kimeerisen proteiinin topologiakaavio. Avidiinista 10 otetut segmentit on esitetty mustalla ja AVR4/5:stä lisätty osa on esi tetty harmaalla. Näiden segmenttien välisiä rajoja on korostettu valkoisilla nuolilla.
Kuvio 2 Puhdistettujen proteiinien SDS-PAGE-analyysi. A = avidiini, Y = 15 AVD(I117Y), C = ChiAVD, CY = ChiAVD(l117Y), 4 = AVR4/5(C122S), 4b = AVR4/5(C122S)-b, tuotettu bakteereissa. Kuviossa on esitetty merkkiaineproteiinit, joiden moolimassat ovat 14,4, 21,5 ja 31 kDa.
20 Kuvio 3 Proteinaasi K:n kanssa inkuboitujen proteiininäytteiden SDS-PAGE-: analyysi. Nuoli osoittaa pilkottujen proteiinimuotojen sijainnin. Kirjai- mella “c” merkityt näytteet ovat vertailunäytteitä, joille ei ole suoritettu proteaasikäsittelyä. A = avidiini + ProtK, Y = AVD(I117Y), 4 = ·:··: AVR4/5(C122S), C = ChiAVD, CY = ChiAVD(l117Y), 4b = 25 AVR4/5(C122S)-b. Kuviossa on esitetty merkkiaineproteiinit, joiden ···· .···. moolimassat ovat 14,4 ja 21,5 kDa.
• t * ·«·
Kuvio 4 Proteiineille mitatut radiobiotiinin dissosiaationopeusvakiot lämpötilan *:f funktiona. Globaalisovituksen avulla määritetyt dissosiaationopeus- • « 30 vakiot on yhdistetty viivoin.
• · · • · · • · •
Kuvio 5 Yhdistettyjen avidiinin (magenta) ja AVR4/5:n (syaani) putkirakenne- ··· .\ esitys L3,4-silmukan alueesta, jossa biotiinimolekyylit ovat sitoutu- ‘l.l miskohdassa, viitteeksi. AVR4/5:n tähteiden 39-42 sivuketjut on esi- • ψ *···* 35 tetty ja ne osoittavat Pro-Gly-tandemin aiheuttaman taitteen silmu kassa. Vaikka kummankin proteiinin L3,4-silmukat ovat samankokoi- 4 119024 siä, niillä on täysin erilainen konformaatio. L3,4:n suljettu konformaa-tio AVR4/5:ssa ilmenee sekä apo- että biotiinikompleksimuodoissa. Kuvio on tehty käyttämällä MIDAS-ohjelmaa (37).
5 Kuvio 6 Reaktion termodynaamiset koordinaatit biotiinin sitoutumiselle avidii-niin ja AVR4/5(C122S):ään. Eyringin yhtälöstä saatua dissosiaation aktivoitumisenergiaa dissosiaatiotuloksiin sovitettuna käytettiin reaktion siirtymätilan energian (AG*) laskemiseen käyttämällä sitoutumiselle aikaisemmin määritettyjä kokonaissitoutumisenergian arvoja 10 (AG) (8).
KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN SELITYS
Kanan avidiinin geeniperheeseen kuuluvat avidiini ja seitsemän erillistä avidiinin kaltaista geeniä (AVR:ää) 1-7. AVR4/5:n on havaittu olevan tähän mennessä karakterisoiduista biotiinia sitovista proteiineista kaikkein pysyvin (Tm = 106,4 °C). 15 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena oli tunnistaa ne ominaispiirteet, jotka tekevät AVR4/5:stä niin paljon pysyvämmän proteiinin kuin kanan avidiini (8) sekä siirtää tämä parempi pysyvyys avidiiniin. Keksinnön toisena tarkoituksena oli tutkia ja vertailla avidiinin, AVR4/5:n ja tässä keksinnössä tuotettujen kimeeristen proteiinien biotiinia sitovia ominaisuuksia. Lisäksi tarkoituksena oli määrittää näiden proteiini- : 20 en primaarisen ja kolmiulotteisen rakenteen (Eisenberg-Domovich et ai.) välisten • · · erojen merkitys niiden biotiinia sitoville ja pysyvyysominaisuuksille (8). Näiden tar- • · koitusten saavuttamiseksi käytettiin molekyylimallinnusta ja määritettyjä kolmiulot- • * : “ teisia rakenteita, ja tuloksia käytettiin pysyvyyttä edistävien tekijöiden siirtämiseksi *:**: AVR4/5:stä avidiiniin. Avidiinin ja AVR4/5:n välisen sekvenssivertailun perusteella 25 näiden kahden proteiinin välinen erittäin variaabeli segmentti sijaitsee L3,4:n ja j L4,5:n välissä (kuvio 1). Aluksi rakennettiin kimeerinen avidiini, jossa β4 ja sen vie reiset silmukat korvattiin vastaavalla AVR4/5:stä peräisin olevalla alueella. Saadun kimeerin lämmönkestävyys oli selvästi parempi (Tm = 96,5 °C) kuin avidiinilla (Tm = .*··. 83,5 °C), mutta heikompi kuin AVR4/5:llä (Tm = 106,4 °C).
·«· :\j 30 Toisessa mutantissa avidiiniin tehtiin pistemutaatio (I117Y) AVR4/5-sekvenssistä ·:♦·: mallinnuksen (8) ja 3-D-röntgenrakenneanalyysin perusteella (Eisenberg-Domo- vich et ai.), jolla mutaatiolla ajateltiin olevan merkittävä osuus alayksiköiden väli- ” sissä vuorovaikutuksissa ja sen vuoksi parantavan AVR4/5:n lämmönkestävyyttä.
· · *·Tämä substituutio paransi näin saadun mutantin lämmönkestävyyden tasolle (Tm = 35 97,5 °C), joka on verrattavissa edellä kuvattujen kimeerien lämmönkestävyyteen.
5 119024
Lisäksi kun nämä kaksi modifikaatiota yhdistettiin, saatiin aikaan hyperlämmön-kestävä avidiini, jonka lämmönkestävyys oli vielä parempi (Tm = 111,1 °C) kuin AVR4/5:llä.
Odotusten mukaisesti saatiin aikaan merkittävästi pysyvämpi proteiini, kun 5 AVR4/5:stä otettu 21 aminohapon pituinen segmentti (tähteet 38-58) siirrettiin avi-diiniin substituoimalla avidiinimolekyylin tähteet 38-60. Kimeerisen avidiinin (ChiAVD:n) L4,5-silmukan lyheneminen kahdella tähteellä saattaa selittää osittain paremman pysyvyyden. Vertaamalla mesofiilien, termofiilien ja ekstremofiilien ge-nomeja Thompson ja Eisenberg havaitsivat lämmönkestävistä proteiineista lyhy-10 empiä ulkonevia silmukoita kuin niiden mesofiilisistä analogeista (25). L3,4-sil-mukka on kuitenkin samanpituinen avidiinissa ja AVR4/5:ssä, vaikka sen aminohappokoostumus on täysin erilainen (kuvio 1). L3,4:n kolmiulotteinen rakenne osoittaa selvästi, että sen konformaatio on erilainen AVR4/5:ssä ja avidiinissa (kuvio 5) (Eisenberg-Domovich et ai.). ChiAVD:lla ja AVR4/5:llä oletetaan olevan sa-15 manlainen L3,4-silmukan konformaatio. Pro41-Gly42-venymä ja Asp39:n ja Arg112:n välinen suolasilta parantavat sekä apo- että biotiinikompleksimuotojen L3,4-silmukan pysyvyyttä (Eisenberg-Domovich et ai.).
Proteiinien rajapinnoilla on havaittu tiettyjen pysyvyyttä edistävien “hot-spot”-täh- teiden merkittävyys (26-28). Aromaattisten parien tiedetään muodostavan stabi- , . 20 loivia pareja proteiinirakenteissa, mitä on tutkittu myös kokeellisesti (16). Esillä « · · ··· · olevassa keksinnössä avidiinin alayksikön rajapinta optimoitiin korvaamalla Ile117- tähde tyrosiinilla AVR4/5-sekvenssin mukaisesti. Aikaisempi mallinnusanalyysi (8) ·· : *·· oletti, että tässä kohdassa oleva tyrosiini pystyy parantamaan AVR4/5-tetrameerin *:*·: pysyvyyttä avidiinin pysyvyyteen verrattuna. AVR4/5:n kolmiulotteinen rakenne ·:· 25 osoittaa vierekkäin olevien monomeerien kahden tyrosiinitähteen välisen π-π (pii- ···♦ pii) -pinoutumisen (Eisenberg-Domovich et ai.), ja koetulokset (AVD(I117Y), Tm = • * · 97,5 °C; avidiini, Tm = 83,5 °C) tukevat sitä, että rakenne on parantunut tässä koh- :·. dassa. Kannan ja Vishveshwara vertailivat termofiilisistä ja mesofiilisistä organis- • ♦ ♦ meistä peräisin olevien proteiinien aromaattisia klustereita (15). He havaitsivat, et- T* 30 tä tähteet, jotka sisälsivät termofiilisistä proteiineista peräisin olevia aromaattisia • ♦ :.*·· klustereita, on edullisesti korvattu mesofiilisistä organismeista peräisin olevissa *:**: proteiineissa Leu:lla tai lle:ila.
• · : *** Tulisi huomata, että proteiiniin voitaisiin tehdä useita pistemutaatioita. Aikaisem- • · :.‘*i massa hakemuksessa Fl 20031663, joka liitetään tähän viitteeksi, rakennettiin uu- 35 siä lämmönkestäviä biotiinia sitovia proteiineja kohdennetun mutaation avulla. Avi- 6 119024 diinin ja AVR:ien osalta tämä saatiin aikaan lisäämällä disulfidisiltoja sen alayksiköiden väliin.
Pysyvyyden osalta kaikkein mielenkiintoisin tulos oli se, että kimeerimenettelyn ja M17Y-pistemutaation yhdistelmän avulla saatiin tuotettua proteiinia, joka oli jopa 5 lämmönkestävämpää kuin AVR4/5. Tämä osoittaa sen, että avidiinin ja AVR4/5:n väliseen pysyvyyseroon vaikuttavat rakenteelliset tekijät on onnistuttu tunnistamaan ja siirtämään. Aikaisemmin on esitetty, että avidiinigeeniperheen sisällä re-kombinaatiota tapahtuu yleisesti (29). Esillä olevan hakemuksen tulokset osoittavat, että rekombinaatio saattaa tuottaa funktionaalisia kimeerisiä proteiineja geeni-10 perheen sisällä, koska AVR4/5:stä siirretyt rakenneosat näyttävät toimivan avidiinin rakenteen osana ilman haitallisia vaikutuksia.
ChiAVD:n pysyvyyden paraneminen johtuu AVR4/5:stä peräisin olevien beetajuos-teiden 3 ja 5 välisen alueen substituutiosta. Muilla AVR:illä on AVR4/5:n kanssa melko samanlainen sekvenssi tällä alueella, ja minkä tahansa näistä alueista siir-15 täminen avidiiniin saattaa tehdä lopputuotteen pysyvämmäksi vastaavalla tavalla kuin ChiAVD:n tapauksessa.
Esimerkiksi avidiinin isoelektrinen piste on korkean pH:n alueella, ts. se on emäksinen proteiini. Sen sijaan AVR2 on hapan proteiini, jonka pl on lähellä pH-arvoa 5. Sen vuoksi avidiinin pl-arvoa voidaan muuttaa siirtämällä avidiiniin avidiinin kal- • 20 täisten proteiinien osia. Samanaikaisesti voitaisiin saada parempi lopputuotteen M* · .**. pysyvyys villityypin avidiiniin verrattuna.
*·· • · ·' " Marttila et ai. (38) ja Nardone et ai. (39) ovat aikaisemmin alentaneet avidiinin isoelektristä pistettä geneettisten menetelmien avulla, mutta näissä tutkimuksissa korvattiin vain yksittäisiä aminohappoja.
• · * • · • ·
25 Keksintöä kuvataan lisää seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla. ESIMERKIT
··· • * * a *·* Esimerkki 1.
i« · * * · * · • » :***: Kimeerisen avidiinimutantin rakentaminen, puhdistaminen ja sekvenssi- ·** Λ analyysi a a * • a 30 β3:η ja β5:η välisen, erilaisen segmentin merkitsevyyden tutkimiseksi rakennettiin ChiAVD (SEQ ID NO.15), jolloin tämä segmentti siirrettiin AVR4/5:stä (SEQ ID N0.5/SEQ ID NO.6) avidiiniin (SEQ ID NO.1). Avidiinin aminohappotähteet 38-60 7 119024 substituoitiin AVR4/5:n aminohappotähteillä 38-58 (kuvio 1). Lisäksi avidiinin iso-leusiini 117 mutatoitiin tyrosiiniksi AVR4/5:n mukaisesti (kuvio 1).
Kimeerinen ChiAVD-proteiini tuotettiin kolmen peräkkäisen PCR-reaktion avulla, joista lopputuote saatiin osittain päällekkäisistä mega-aluke-tuotteista (17). En-5 simmäisessä PCR:ssä oligonukleotideja Kimera.1 ja Kimera.2 käytettiin AVR4:n cDNA:n (7) (SEQ ID NO.5) kanssa templaattina. Tuote eristettiin agaroosigeeli-elektroforeesin avulla ja sitä käytettiin mega-alukkeena seuraavassa PCR:ssä oli-gonukleotidin AK33 kanssa. Toisessa PCR:ssä templaattina käytettiin avidiinin cDNA:ta. Jälleen tuote eristettiin elektroforeesin avulla ja sitä käytettiin jälleen me-10 ga-alukkeena kolmannessa PCR:ssä oligonukleotidin AK44 kanssa. Kolmannessa PCR:ssä templaattina käytettiin avidiinin cDNA:ta. Tuote eristettiin elektroforeesin avulla.
Saatu DNA pilkottiin Bgllhlla ja HindllLIIa ja ligoitiin BamHI/Hindlll-pilkottuun pFASTBACI-plasmidiin. Lopputuote varmistettiin DNA-sekvensoinnin avulla.
15 Mutaatio I117Y tehtiin pFASTBACI-plasmidiin, joka koodaa avidiinia tai ChiAVD:tä, QuickChange-menetelmällä (Stratagene, La Jolla, CA, USA) käyttämällä oligonukleotideja I117Y.1 ja I117Y.2. Lopputuotteen varmistettiin DNA-sekvensoinnin avulla olevan ChiAVD(M 17Y) (SEQ ID NO.16).
Lopputuote kloonattiin pFASTBACI-vektoriin. Rekombinanttisia bakuloviruksia, 20 jotka koodasivat ChiAVD-muotoja AVR4/5(C122S) ja AVD(I117Y), muodostettiin • · );··* Bac-To-Bac™ -järjestelmän valmistajan (Invitrogen) ohjeiden mukaisesti. Proteiinit • ·* " tuotettiin bakulovirusinfektoiduissa Sf9-hyönteissoluissa elatusaineessa, joka ei si- *!*‘: sältänyt biotiinia, aikaisemmin raportoidulla tavalla (7). Ei-glykosyloitunut ...T AVR4/5(C122S)-b tuotettiin käyttämällä E. colin ilmentämisjärjestelmää (18) (Laiti- 25 nen et ai., julkaisematon) sen tutkimiseksi, miten hiilihydraattiketjut vaikuttavat proteiinin ominaisuuksiin (taulukko I). Sen jälkeen proteiinit puhdistettiin affiniteetti-: kromatografian avulla käyttämällä 2-iminobiotiiniagaroosia aikaisemmin kuvatulla .***. tavalla (19). Proteiinimuodot on koottu taulukkoon I.
• · · :***: Oligonukleotidien sekvenssit: ··· • ·
'*:** 30 Kimera.1 GCACCTACATCACAGCCGTAGCGGATAATCCAGGAAA (SEQ ID
:!0 NO.9) «··
Kimera.2 GAAGCCAAAGGTGGGCTGGCTGGCTCTTTTGTGTTGG (SEQ ID NO. 10) 8 119024 AK33 CT GCT aga tct ATG GTG CAC GCA ACC TCC CC (SEQ ID N0.11) AK44 GTTGCAAGCTTTGCGGGGCCATCC (SEQ ID N0.12) 1117Y. 1 CAGGGTCGGCTACAACATCTTC (SEQ ID NO. 13) 1117Y.2 GAAGATGTTGTAGCCGACCCTG (SEQ ID NO. 14) 5
Taulukko I. Analysoitujen proteiinien kuvaus.
Proteiini_Modifikaatiot_Lähde AVD - Kana3 AVD(I117Y) Mutaatio 1117Y 1-3 alayksikön rajapinnalla. BEVSb
ChiAVD Tähteet 38-58 siirrettiin AVR4/5:stä avidiiniin. BEVSb
ChiAVD(I117Y) Tähteet 38-58 siirrettiin AVR4/5:stä avidiiniin ja BEVSb mutaatio I117Y 1-3 alayksikön rajapinnalla.
AVR4/5(C122S) Kysteiinitähde, joka muodostaa monomeerien välisiä BEVSb disulfidisiltoja AVR4/5:ssä, mutatoitiin seriiniksi.
AVR4/5(C122S)-b Kuten edellä, mutta ei-glykosyloitu. E. colF
aKanan avidiini saatiin yritykseltä Belovo S. A. (Bastogne, Belgia). bRekombinanttiproteiini tuotettiin bakuloviruksen ilmentämisvektorijärjestelmän avulla : .*. hyönteissoluissa.
,···. 10 cRekombinanttiproteiini tuotettiin bakteerin ilmentämisjärjestelmän avulla. Tämä muoto si- • · sältää kolme lisätähdettä (Gln-Thr-Val) bakteerin signaalipeptidin N-päätteessä (18).
• · ·
Eristetyt proteiinit olivat erittäin puhtaita SDS-PAGE-analyysin mukaan (kuvio 2).
• · ·*·· Puhdistettujen proteiinien glykosylaatiorakenteet olivat erilaisia, koska 15 AVR4/5(C122S):ssä on kolme mahdollista glykosylaatiokohtaa, kun taas avidiinis- sa on vain yksi (1, 7). Yksi näistä AVR4/5:n kohdista (Asn43) siirrettiin kimeeriseen proteiiniin, mikä sai aikaan kimeerin laajemman glykosyloitumisen natiiviin avidii-niin verrattuna. Bakteerin avulla tuotettu AVR4/5(C122S) oli odotusten mukaisesti ei-glykosyloitunut (kuvio 2).
• · * * 20 Avidiinin ja AVR4/5:n sekvenssien identtisyys on 77,8 %. Yli puolet (15/28 mutaa- .v. tiosta) näiden kahden proteiinin välisistä eroista esiintyy suhteellisen lyhyessä • · · 23/21 (avidiini/AVR4/5) aminohapon segmentissä β3:η lopun ja β5:η alun välissä **** (kuvio 1). Kaikki tähteet, jotka ovat kosketuksissa biotiinin (24) kanssa, ovat kon- servoituneita, lukuun ottamatta Thr38-Ala39-Thr40-sekvenssiä, joka sijaitsee L3,4- 9 119024 silmukassa (joka yhdistää β3- ja |34-juosteet) ja joka on korvattu Ala38-Asp39-Asn40:llä AVR4/5:ssä. Alayksikön rajapinnan tähteet (41 tähdettä) (8) ovat myös hyvin konservoituneita, ainoat aminohappoerot ovat Thr38Ala, Ala39Asp, His50Leu, Thr52lle, Asn54His ja lle117Tyr (numerointi avidiinin sekvenssin mu-5 kaisesti).
Esimerkki 2.
Proteinaasi K -määritys
Proteiinien proteolyysinkestävyyttä tutkittiin suorittamalla proteolyysi Proteinaasi K:n avulla aikaisemmin kuvatulla tavalla (7). Proteiininäytettä (4 pg) inkuboitiin 10 Proteinaasi K:n (1/25 paino/paino) kanssa 37 °C:ssa ennalta määrätyn ajanjakson ajan, se denaturoitiin keittämällä näytepuskurissa (SDS, 2-merkaptoetanoli) ja sille suoritettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Coomassie-värjäys.
Avidiinin ja avidiinimutantin AVD(I117Y) havaittiin olevan 50-prosenttisesti pilkkoutuneita sen jälkeen kun niitä oli käsitelty 16 tuntia Proteinaasi K:n kanssa (kuvio 3). 15 Kun nämä proteiinit kyllästettiin biotiinilla ennen käsittelyä, pilkkoutumista ei havaittu. AVR4/5(C122S) kesti kuitenkin täydellisesti Proteinaasi K:n proteolyyttisen aktiivisuuden, jopa ilman biotiinia. ChiAVD:n, ChiAVD(l117Y):n ja AVR4/5(C122S)-b:n, jotka oli tuotettu E. colissa, havaittiin myös käyttäytyvän AVR4/5(C122S):n ta- : .·. voin tässä tutkimuksessa, ts. pysyvän ehjänä 16 tuntia proteaasin kanssa sekä • · · 20 biotlinin kanssa tai sitä ilman. Tämä osoittaa sen, että AVR4/5-apoproteiinin L3,4:n ..***’ konformaatio (Eisenberg-Domovich et ai.) suojaa sitä pilkkoutumiselta. Lisäksi täh- • · : " teen Asn43 (8) glykosylaatiolla ei vaikuttanut olevan osuutta proteaa- * *: sinkestävyyteen.
• · * • · · ·
Proteinaasi K pilkkoo avidiinia vain yhdeltä alueelta, silmukasta β-juosteiden 3 ja 4 φ · · 25 välistä (33). Havaittiin myös, että biotiini estää tehokkaasti pilkkoutumisen. Toi- ··. saalta AVR4/5 ja streptavidiini eivät pilkkoudu Proteinaasi K:n vaikutuksesta, vaik- • · · ka ne eivät sisältäisi sitoutunutta biotiinia (8, 32). Koska Proteinaasi K pilkkoo usei-**:·* ta sekvenssejä, selitys sille, miksi ne eivät pilkkoudu, saattaa löytyä AVR4/5:n !.’·· L3,4-silmukan konformaatiosta. ChiAVD:n Proteinaasi K -resistenssi tukee näitä *:*·: 30 tuloksia (kuvio 3). AVR4/5:n rakenteessa voidaan havaita silmukan erilainen ra- kenne (kuvio 5) (Eisenberg-Domovich et ai.). Tässä silmukassa proliini vaikuttaisi \ . aiheuttavan taipumisen silmukan keskellä. Siten vastaava streptavidiinin silmukka on kolme tähdettä lyhyempi (34), eikä proteaasi sen vuoksi ehkä pääse siihen käsiksi. Tässä analyysissä ei havaittu mitään eroa AVR4/5(C122S):n glykosyloitu- 10 119024 neen ja glykosyloitumattoman muodon välillä; siten AVR4/5:n tämän silmukan so-keriosa ei pysty selittämään resistenssiä proteaasille. Tämä pätee myös avidiiniin, jonka pysyvyys oli samanlaista sekä entsymaattisesti deglykosyloiduissa että tavallisissa hiilihydraattia sisältävissä muodoissa (35).
5 Esimerkki 3.
Geelisuodatusanalyysi
Proteiinien oligomeerinen tila määritettiin FPLC-geelisuodatuksella aikaisemmin kuvatulla tavalla (8). Nestefaasina käytettiin natriumkarbonaattipuskuria (50 mM, pH 11), jossa oli 150 mM NaCI:a. Analyysissä käytettiin 5-10 pg:n proteiininäyttei-10 tä.
Kaikki muokatut proteiinit olivat tetrameerisiä, kun niille suoritettiin geelisuodatusanalyysi. Bakteerin avulla tuotetulla AVR4/5(C122S):llä oli odotetun mukaisesti hieman pienempi näennäinen moolimassa muihin proteiineihin verrattuna, mikä johtui hiiIihydraattiosan puuttumisesta (taulukko II).
15 Esimerkki 4.
M i krolevymääritys . t.m Proteiinien inaktivoituminen lämpökäsittelyn aikana analysoitiin käyttämällä mikro- levymääritystä (23). Proteiinit kuumennettiin 99,9 °C:isiksi 50 mM fosfaattipusku- • t );··* rissa, joka sisälsi 100 mM NaCI:a (pH 7,0), 32 minuutiksi. Jäljellä oleva aktiivisuus • · ** 20 tutkittiin määrittämällä proteiinien kyky sitoa biotinyloitua emäksistä fosfataasia päällystämällä mikrolevykuopat kuumennetuilla proteiininäytteillä.
• · · .···. Jäljellä oleva aktiivisuus 32 minuutin käsittelyn jälkeen on esitetty taulukossa II.
Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia DSC-analyysien kanssa osoittaen, että ChiAVD(l117Y) on karakterisoiduista proteiineista kaikkein lämmönkestävin.
• ·» •V \* 25 Esimerkki 5.
!<· « • ·
Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria (DSC) • ·
Avidiiniproteiinien lämpödenaturoitumisen siirtymän puoliväli (Tm) määritettiin käyt-" tämällä yrityksen Calorimetry Sciences Corporation (CSC) differentiaalista pyyh- *· " käisykalorimetria Nano II aikaisemmin kuvattujen raporttien mukaisesti (22, 23).
11 119024
Proteiinit (—0,5 mg/ml) analysoitiin sekä ilman biotiinia että sen kanssa (moolisuh-de3:1; biotiini:avidiini-monomeeri).
DSC-kokeissa ChiAVD-proteiinilla ja AVD(l117Y):llä oli merkittävästi parempi läm-mönkestävyys kuin avidiinilla sekä apomuotoina että holomuotoina (taulukko II).
5 Kun nämä modifikaatiot yhdistettiin, saadun ChiAVD(l117Y):n havaittiin olevan jopa pysyvämpi kuin AVR4/5(C122S). Kaikissa tapauksissa holomuodot olivat selvästi pysyvämpiä kuin apomuodot. Havaitsimme avautumisentalpian huomattavan kasvamisen sekä kasvaneen sulamislämpötilan. AVR4/5(C122S)-b käyttäytyi DSC-analyysissä samalla tavoin kuin hyönteissoluissa tuotettu proteiini.
10 Taulukko II. Avidiinien rakenneominaisuudet. FPLC-geelisuodatuksen eluutioajat ja proteiinien lasketut moolimassat. DSC:n avulla määritetty proteiinien lämpöin-dusoitu avautuminen (keskiarvo ± SD).
Geelisuodatus DSC0 Mikro- levy- __määritys
Proteiini Eluutio- Mooli- Tm(+bio- ATma ΔΗ5 Aktii- aika massa biotiini) tiini) (°C) (°C) (kJ/mol) visuus6 (min) (kDa) (°C)___(%) AVD 29,3 53,1 83,5 + 0,1 117,0 ±0,7 33,5 329 + 5 4 AVD(I117Y) 29,6 49,5 97,5 + 0,4 123,7 + 0,1 26,2 536 ±6 47
ChiAVD 29,0 56,9 96,5 ± 0,2 124,4 + 0,2 27,9 527 ±10 47 • ... ChiAVD(l117Y) 29,0 56,9 111,1 ±0,2 ~130d ~19 659 ±38 98 .*·: : AVR4/5(C122S) 29,5 50,6 106,4 ± 0,8 125,4 + 0,8 19,5 575 ±33 72 :“*! AVR4/5(C122S)-b 30,3 42.1 109,9 127,1 17,2 460 56 e • e • ·· 15 aATm on Tm:n muutos sen jälkeen kun oli lisätty kolminkertainen mooliylimäärä bio-.;. tiinia.
bAH näytteelle, joka ei sisältänyt biotiinia, saatu arvo. Arvoa ei pystytty määrittä-mään tarkasti näytteistä, jotka oli kyllästetty biotiinilla, koska Tm-arvot olivat liian lähellä DSC-laitteen lämpötilarajaa.
20 cAVD:n ja AVR4/5(C122S):n tulokset ovat peräisin viitteestä (8).
dEi pystytty määrittämään tarkasti DSC-laitteen ylemmän lämpötilarajan vuoksi. ®Biotiinia sitova aktiivisuus 32 min käsittelyn jälkeen 99,9 °C:ssa • · *·· 4 · • · ·♦· ♦ · « * < • · · • · ··· : : *··
Esimerkki 6.
12 119024
Optiset biosensoritutkimukset
Erilaisten avidiinien biotiinia sitovia ominaisuuksia tutkittiin pintaplasmoniresonans-sin (SPR:n) optisen biosensorin (lAsys) avulla. Sitoutumisaffiniteetit 2-iminobio-5 tiinin pintaan 50 mM boraattipuskurissa (pH 9,5, 1 M NaCI) määritettiin aikaisemmin raportoidulla tavalla (7). Tulokset on esitetty taulukossa III.
Taulukko lii. Proteiinien 2-iminobiotiinia sitovat ominaisuudet määritettyinä optisella biosensorilla lAsys. Proteiinien iminobiotiinia sitovat ominaisuudet optisella biosensorilla lAsys analysoituina 20 °C:ssa. Affiniteetit 2-iminobiotiinin pintaan on 10 määritetty tasapainovastetuloksista. kags on assosiaationopeusvakio.
_Kd (M)a_kass (M~V) AVD (2,1 ± 0,6) x 10“8 (2,6 ± 0,2) x 104 AVD(I117Y) (6,3 * 1,2) x 10-8 (2,3 ± 0,3) x 104
ChiAVD (1,1 ±0,4) x10”7 (1,7 ± 0,1) x 104
ChiAVD(l117Y) (6,7 ± 1,2) x 10*8 (1,6 ±0,2) x 104 AVR4/5(C122S) (1,4 ± 0,4) x 10~7 (9,3 ± 0,4) x 103 aTasapainoarvoista laskettu näennäinen dissosiaatiovakio • · φφφ • · « • φ · ·
Esimerkki 7.
·· • φ • φφ • . 20 Radiobiotiinin dissosiaatiomääritys φ φ ,.*·* Avidiinista, AVR4/5:stä ja avidiinimutanteista peräisin olevan [3H]biotiinin dissosi- j*": aationopeus määritettiin viitteessä (20) kuvatulla tavalla eri lämpötiloissa.
AVR4/5(C122S):n ja avidiinin termodynaamiset aktivoitumisparametrit määritettiin : analysoimalla dissosiaationopeuden riippuvuus lämpötilasta käyttämällä kaikkien .···. 25 tulosten globaalisovitusta viitteessä (21) kuvatulla tavalla.
φφφ* φ :*·*: Havaittiin, että AVR4/5 sitoo biotiinia melkein yhtä lujasti kuin avidiini. Eri lämpöti- :***. loissa mitattujen [3H]biotiinin dissosiaatiotulosten analyysin mukaan sitoutumat- φφφ .*. tornien ja sitoutuneiden tilojen välinen energiakynnys on AVR4:ssä jonkin verran φ φ φ 'lii suurempi kuin avidiinissa (kuvio 6). Siirtymätilan suurempi vapaa energia saattaa 30 myös selittää AVR4:n hitaamman assosiaationopeuden 2-iminobiotiinin pinnalle avidiiniin verrattuna (kuvio 6, taulukko III). Koska sitoutumisen vapaa energia on 13 119024 pienempi AVR4:n tapauksessa (8), biotiinin dissosiaatiokynnys on vielä pienempi AVR4:llä, vaikka siirtymätilan vapaa energia onkin suurempi.
Mahdollisen selityksen AVR4/5:n ja avidiinin biotiininsidontaominaisuuksien välisille eroille tarjoavat L3,4-silmukan eroavaisuudet. Tämän alueen on havaittu olevan 5 tärkeä tekijä biotiinin sitoutumisessa streptavidiiniin (30). Molempien ChiAVD-muotojen biotiininsidontaominaisuudet olivat samanlaisia kuin AVR4/5:llä erilaisilla menetelmillä mitattuina, mikä siten tukee tätä oletusta. Havaitsimme, että glyko-sylaatiolla saattaa olla pieni osuus biotiinin sidonnassa, koska bakteereissa tuotetulla AVR4/5(C122S)-b:llä oli hieman lujemmat sidontaominaisuudet sekä radio-10 biotiinin että fluoresoivan biotiinin dissosiaatioanalyysissä (kuvio 4, taulukko IV)
Esimerkki 8.
Fluoresoivan biotiinin dissosiaatiomääritys
Leimatun biotiinin sitoutumista avidiineihin analysoitiin menetelmällä, joka perustui biotiiniin kytketyn fluoresoivan koettimen ArcDia BF560 (ArcDia Ltd., Turku, Suo-15 mi) sammumiseen avidiiniin sitoutumisesta johtuen aikaisemmin kuvatun mukaisesti (18). Määritykset suoritettiin käyttämällä PerkinElmer LS55 -luminometriä, jossa oli termostaattinen kyvetti (25 tai 50 °C). Signaalia, joka mitattiin 3600 s (25 °C) tai 2400 s (50 °C) kuluttua, käytettiin dissosiaationopeusvakion määrittä- . . miseen.
• * · • φ · · · 20 Fluoresoivan biotiinikonjugaatin sitoutumiskinetiikkaa erilaisiin avidiineihin verrat-tiin määrittämällä dissosiaationopeusvakiot 25 °C:ssa ja 50 °C:ssa (taulukko IV). ·:··· Avidiinin dissosiaationopeus oli pienempi kuin AVR4/5(C122S):n. ChiAVD:llä oli tässä tutkimuksessa samankaltaisia ominaisuuksia kuin AVR4/5(C122S):llä. Mie-.··*, lenkiintoista oli se, että mutaatio lle117Tyr vaikutti lujentavan biotiini-konjugaatin 25 sitoutumista proteiineihin.
• :.:.i Ligandinsidonta-analyysit, jotka suoritettiin optisen bioanturin lAsys kanssa, osoitit*: tivat ChiAVD:n ollessa kyseessä hieman heikompaa affiniteettia 2-iminobiotiini- :v. pintaan avidiiniin verrattuna (taulukko III). Affiniteetti oli kuitenkin kaikesta huoli- \/,m matta suuri muistuttaen AVR4/5(C122S):lle havaittuja arvoja (8). Havaitsimme *”* 30 myös molempien ChiAVD-muotojen assosiaationopeusvakioiden vähäisen piene- v.: nemisen avidiiniin ja AVD(I117Y):hyn verrattuna.
··· • · • · AVR4/5(C122S) sitoutui biotiiniin lujasti radiobiotiinin dissosiaatiomäärityksessä (kuvio 4). Määritetyt dissosiaationopeusvakiot olivat kuitenkin merkittävästi suu- 14 119024 rempia kuin aviidiinilla. ChiAVD ja ChiAVD(M17Y) muistuttivat tässä tutkimuksessa ÄVR4/5(C122S):ää. Mielenkiintoista oli se, että bakteeriperäisen AVR4/5(C122S)-b:n dissosiaationopeus oli tässä tutkimuksessa hieman pienempi kuin hyönteissoluissa tuotetun AVR4/5(C122S):n. Avidiinimutantti AVD(I117Y) si-5 toutui biotiiniin erittäin lujasti, avidiinin kaltaisesti. Termodynaamiset aktivoitumis-parametrit laskettiin tuloksista toisaalla esitetyn mukaisesti (21) ja yhdistettiin AVR4/5(C122S):lle ja avidiinille aikaisemmassa tutkimuksessa saatujen termodynaamisten parametrien kanssa (8). Saadut arvot on esitetty kuviossa 6.
Fluoresoivassa biotiinimäärityksessä havaitut dissosiaationopeudet olivat merkit-10 tävästi suurempia kuin radiobiotiinianalyysissä saadut, mutta proteiinien vastaavat ominaisuudet olivat kuitenkin samankaltaiset (taulukko IV).
Taulukko IV. Biotiinikonjugaatin dissosiaatiokinetiikka. Biotiini-BF560-konjugaatille 25 °C:ssa ja 50 °C:ssa luminometrillä määritetyt dissosiaationopeusvakiot. Koettimen vapautumisen kokonaismäärät tunnin mittauksen jälkeen on myös esitetty. 15 kdiss on dissosiaationopeusvakio.
kdiss (10”5s“1) Vapautuminen kn,-. (10~* s~1) Vapautuminen
_25 °C 1 h (%) 25 °C_50 °C_1 h (%) 50 °C
AVD 2,04 10,7 2,74 71,5 ; AVD(I117Y) 0,81 3,0 1,61 56,5 cmavd i ,76 13,1 8,00 93,9 e · »7 ChlAVD(l117Y) 1,94 9,5 7,33 94,8 e ee AVR4/5(C122S) 2,77 12,5 7,88 93,7 AVR4/5(C122S)-b 2,31 10,9 6,20 88,3 ···· ................................................. ........ — • ee • e e · • · e
Esimerkki 9.
*· : ** 3-D-rakenneanalyysi * · • · • · · / . 20 Avidiinin (24) ja AVR4/5(C122S):n (Eisenberg-Domovich et ai.) röntgenrakenteista ** " saadut tiedot viittasivat siihen, että β4:η ja sen viereisten L3,4- ja L4,5-silmukoiden lisääminen AVR4/5:stä avidiiniin ei muuta saadun proteiinin muotoa ratkaisevasti. [*·.. AVR4/5:n L3,4-silmukan erilaisen konformaation (kuvio 5) avidiiniin verrattuna tuli- ·*·.· si analogisesti heijastua ChiAVD:n ominaisuuksiin, nimittäin pienempänä määränä e e 25 vetysidoksia sitoutuneeseen ligandiin (Eisenberg-Domovich et ai.). Lisäksi keskeltä muuttunut sekvenssi sisältää L4,5-silmukassa kahden tähteen deleetion, jonka 15 119024 ei ole havaittu muuttavan silmukkaa ympäröivän alueen rakenneominaisuuksia AVR4/5:ssä (Eisenberg-Domovich et ai.).
Keksintöä on havainnollistettu esimerkein ja suoritusmuodoin, mutta sitä voidaan muunnella monin tavoin. Tällaisten muutosten ei katsota poikkeavan keksinnön 5 hengestä tai suojapiiristä, ja kaikkien tällaisten modifikaatioiden on tarkoitus sisältyä oheisten patenttivaatimusten suojapiiriin.
• • · • · · ·«· ♦ ··· • • · ·«1 ·· • · • · · · * · · «··· III • · • ♦ * · · • · * · • · ··· • · t · • 1 1 • · • I I Φ · · ♦ · • ·· • · • Il • · ·
• M
« · 16 119024
VIITEJULKAISUT
1. Green, N. M. (1975) Adv Prot Chem 29, 85-133 2. Green, N. M. (1990) Methods Enzymol 184, 51-67.
3. Wilchek, M. ja Bayer, E. A. (1999) Biomol Eng 16,1-4.
5 4. Wilchek, M. ja Bayer, E. (1990) Meth Enzymol 184, 5-13 5. Ahlroth, M. K., Kola, E. H., Ewald, D., Masabanda, J., Sazanov, A., Fries, R. ja Kulomaa, M. S. (2000) Anim Genet 31,367-375.
6. Tuohimaa, P., Joensuu, T., Isola, J., Keinänen, R., Kunnas, T., Niemelä, A., Pekki, A., Wallen, M., Ylikomi, T. ja Kulomaa, M. (1989) Int J Dev Biol 33, 125- 10 134.
7. Laitinen, O. H., Hytönen, V. P., Ahlroth, M. K., Pentikäinen, O. T., Gallagher, C., Nordlund, H. R., Ovod, V., Marttila, A. T., Porkka, E., Heino, S., Johnson, M.
S., Airenne, K. J. ja Kulomaa, M. S. (2002) Biochem J 363, 609-617 8. Hytönen, V. P., Nyholm, T. K., Pentikäinen, O. T., Vaarno, J., Porkka, E. J., 15 Nordlund, H. R., Johnson, M. S., Slotte, J. P., Laitinen, O. H. ja Kulomaa, M. S.
(2004) J Biol Chem 279, 9337-9343 • · • » · • · · .***. 9. Backmann, J., Schafer, G., Wyns, L. ja Bonisch, H. (1998) J Mol Biol 284, 817-833 • · · *"** 10. Villeret, V., Clantin, B., Tricot, C., Legrain, C., Roovers, M., Stalon, V., ..*·* 20 Glansdorff, N. ja Van Beeumen, J. (1998) Proc Natl Acad Sei U S A 95, 2801-2806 • · · • ♦ 11. Knapp, S., de Vos, W. M., Rice, D. ja Ladenstein, R. (1997) J Mol Biol 267, 916-932 « · » • ♦ · ··♦ 12. Britton, K. L., Yip, K. S., Sedelnikova, S. E., Stillman, T. J., Adams, M. W., :v. Ma, K., Maeder, D. L, Robb, F. T., Tolliday, N., Vetriani, C., Rice, D. W. ja Baker, 25 P.J. (1999) J Mol Biol 293, 1121-1132 • * • · · 13. Szilagyi, A. ja Zavodszky, P. (2000) Structure Fold Des 8, 493-504.
• ♦ ··♦ • · • * • * ♦ 17 119024 14. Vetriani, C., Maeder, D. L, Tolliday, N., Yip, K. S.-P., Stillman, T. J., Britton, K. L, Rice, D. W., Klump, H. H., Robb, F. T. (1998) Prot. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12300-12305 15. Kannan, N. ja Vishveshwara, S. (2000) Protein Eng 13, 753-761 5 16. Serrano, L, Bycroft, M. ja Fersht, A. R. (1991) J Mol Biol 218, 465-475 17. Sarkar, G. ja Sommer, S. S. (1990) Biotechniques 8, 404-407.
18. Hytönen, V. P., Laitinen, O. H., Airenne, T. T., Kidron, H., Meltola, N. J., Porkka, E., Hörhä, J., Paldanius, T., Määttä, J. A., Nordlund, H. R., Johnson, M.
S., Salminen, T. A., Airenne, K. J., Ylä-Herttuala, S. ja Kulomaa, M. S. (2004) 10 Biochem J 384, 385-390 19. Laitinen, O. H., Marttila, A. T., Airenne, K. J., Kulik, T., Livnah, 0., Bayer, E. A., Wilchek, M. ja Kulomaa, M. S. (2001) J Biol Chem 276, 8219-8224.
20. Klumb, L. A., Chu, V. ja Stayton, P. S. (1998) Biochemistry 37, 7657-7663 21. Hyre, D. E., Le Trong, I., Freitag, S., Stenkamp, R. E. ja Stayton, P. S. (2000) 15 Protein Sci 9, 878-885.
22. Gonzalez, M., Argarana, C. E. ja Fidelio, G. D. (1999) Biomol Eng 16, 67-72.
• · • · ♦ • · · 23. Nordlund, H. R., Laitinen, O. H., Uotila, S. T., Nyholm, T., Hytönen, V. P., :·!’ Slotte, J. P. ja Kulomaa, M. S. (2003) J Biol Chem 278, 2479-2483.
• ** 24. Livnah, 0., Bayer, E. A., Wilchek, M. ja Sussman, J. L (1993) Proc Natl Acad 20 Sci U S A 90, 5076-5080 • · • · 25. Thompson, M. J. ja Eisenberg, D. (1999) J Mol Biol 290, 595-604.
26. Clackson, T. ja Wells, J. A. (1995) Science 267, 383-386.
··· • · • · ..** 27. DeLano, W. L. (2002) Curr Opin Struct Biol 12,14-20.
• · · • · • * :***: 28. Hu, Z., Ma, B., Wolfson, H. ja Nussinov, R. (2000) Proteins 39, 331-342 ««· v.: 25 29. Ahlroth, M. K., Ahlroth, P. ja Kulomaa, M. S. (2001) Biochem Biophys Res :...: Commun 288, 400-406.
18 119024 30. Chu, V., Freitag, S., Le Trong, I., Stenkamp, R. E. ja Stayton, P. S. (1998) Protein Sci 7, 848-859.
31. Chilkoti, A., Tan, P. H. ja Stayton, P. S. (1995) Proc Natl Acad Sei U S A 92, 1754-1758.
5 32. Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Marttila, A. T., Kulik, T., Porkka, E., Bayer, E.
A., Wilchek, M. ja Kulomaa, M. S. (1999) FEBS Lett 461,52-58 33. Ellison, D., Hinton, J., Hubbard, S. J. ja Beynon, R. J. (1995) Protein Sci 4, 1337-1345.
34. Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J. ja Salemme, F. R. (1989) 10 Science 243, 85-88 35. Wang, C., Eufemi, M., Turano, C. ja Giartosio, A. (1996) Biochemistry 35, 7299-7307.
36. Johnson, M. S., Overington, J. P. ja Blundell, T. L. (1993) J Mol Biol 231, 735-752.
15 37. Ferrin, T. E., Huang, C. C., Jarvis, L. E. ja Langridge, R. (1988) J. Mol.
Graphics 6, 36-37 • t :.: : 38. Marttila, A., Airenne, K., Laitinen, 0., Kulik, T., Bayer, E., Wilchek, M. ja Ku- C.: lomaa, M. (1998) FEBS Lett 441,313-317 ·· * · • · · 39. Nardone, E., Rosano, C., Santambrogio, P., Curnis, F., Corti, A., Magni, F., t,m 20 Siccardi, A. G., Paganelli, G., Losso, R., Apreda, B., Bolognesi, M., Sidoli, A. ja *::: Arosio, P. (1998) Eur J Biochem 256, 453-460.
• 1 * · ··· 40. Yael Eisenberg-Domovich, Vesa P. Hytönen, Markku S. Kulomaa, Meir Wil-chek, Edward A. Bayer, Oded Livnah (2005) Crystal structure of an avidin-related .·2. protein 4: Insight into high-affinity biotin binding and protein stability. Acta Crystal- /1. 25 logr. D. 61,528-538.
• · · • ·· • · · ·· • · * ·· · • 1 · • 1· 2 • ·
Claims (7)
1. Kimeerinen avidiinimutantti, tunnettu siitä, että villityypin avidiinin aminohappotähteet 38-60 on korvattu aminohappotähteillä 38-58 AVR4/5:stä, ja että sen aminohapposekvenssiä koodaa DNA-sekvenssi SEQ ID NO: 15.
2. Kimeerinen avidiinimutantti, jolla on aminohapposekvenssi SEQ ID NO: 16.
3. Eristetty polynukleotidi, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista kimeeristä avidiinimutanttia.
4. Rekombinanttivektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen polynuk-leotidin.
5. Rekombinanttinen isäntäsolu, joka sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen polynukleotidin tai patenttivaatimuksen 4 mukaisen rekombinanttivektorin.
6. Menetelmä kimeerisen avidiinimutantin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 5 mukaista rekombinanttista isäntäsolua viljelyväliai-neessa, ja otetaan talteen kimeerinen avidiinimutantti viljelyväliaineesta.
7. Menetelmä parantuneen stabiilisuuden kimeerisen avidiinimutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että villityypin avidiinin (SEQ ID NO: 1) . . aminohappotähteet 38-60 korvataan AVR4/5-proteiinin (SEQ ID NO: 5 ja SEQ ID ·:·: t NO: 6) tähteillä 38-58. ··· ' • · • ♦ #·· ·· • · • ·· ♦ • · ··· ···· ··· • · • · ··· ·· • 1 • ♦· ··♦ • ♦ • · ·♦· ♦ · • · · • ♦ ♦ ··· · ··· ♦ · • · ··· • i · 119024
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20041705A FI119024B (fi) | 2004-12-31 | 2004-12-31 | Kimeeriset avidiinimutantit |
| AT05112190T ATE481418T1 (de) | 2004-12-31 | 2005-12-15 | Chimäre avidinmutanten |
| DE602005023576T DE602005023576D1 (de) | 2004-12-31 | 2005-12-15 | Chimäre Avidinmutanten |
| EP05112190A EP1676858B1 (en) | 2004-12-31 | 2005-12-15 | Chimeric avidin mutants |
| US11/321,685 US7268216B2 (en) | 2004-12-31 | 2005-12-29 | Chimeric avidin mutants |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20041705 | 2004-12-31 | ||
| FI20041705A FI119024B (fi) | 2004-12-31 | 2004-12-31 | Kimeeriset avidiinimutantit |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20041705A0 FI20041705A0 (fi) | 2004-12-31 |
| FI20041705A FI20041705A (fi) | 2006-07-01 |
| FI119024B true FI119024B (fi) | 2008-06-30 |
Family
ID=33548062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20041705A FI119024B (fi) | 2004-12-31 | 2004-12-31 | Kimeeriset avidiinimutantit |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7268216B2 (fi) |
| EP (1) | EP1676858B1 (fi) |
| AT (1) | ATE481418T1 (fi) |
| DE (1) | DE602005023576D1 (fi) |
| FI (1) | FI119024B (fi) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI20021518A0 (fi) | 2002-08-23 | 2002-08-23 | Jyvaeskylaen Yliopisto | Avidiinin lämpökestävyyden lisääminen |
-
2004
- 2004-12-31 FI FI20041705A patent/FI119024B/fi active IP Right Grant
-
2005
- 2005-12-15 EP EP05112190A patent/EP1676858B1/en active Active
- 2005-12-15 AT AT05112190T patent/ATE481418T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-12-15 DE DE602005023576T patent/DE602005023576D1/de active Active
- 2005-12-29 US US11/321,685 patent/US7268216B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI20041705A0 (fi) | 2004-12-31 |
| US7268216B2 (en) | 2007-09-11 |
| EP1676858A3 (en) | 2008-02-13 |
| FI20041705A (fi) | 2006-07-01 |
| US20060172387A1 (en) | 2006-08-03 |
| DE602005023576D1 (de) | 2010-10-28 |
| ATE481418T1 (de) | 2010-10-15 |
| EP1676858A2 (en) | 2006-07-05 |
| EP1676858B1 (en) | 2010-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10247727B2 (en) | Peptide tag system that spontaneously form an irreversible link to protein partners via isopeptide bonds | |
| Hytönen et al. | Efficient production of active chicken avidin using a bacterial signal peptide in Escherichia coli | |
| AU2007256780B2 (en) | Protein surface remodeling | |
| Laitinen et al. | Chicken avidin-related proteins show altered biotin-binding and physico-chemical properties as compared with avidin | |
| Hytönen et al. | Design and construction of highly stable, protease-resistant chimeric avidins | |
| US7666591B2 (en) | Single stranded DNA binding proteins from Archaea and uses therefor | |
| JP5278940B2 (ja) | 安定な抗体結合性タンパク質 | |
| JP6141205B2 (ja) | 窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）親和性ペプチド、及びその利用 | |
| US7960140B2 (en) | Avidin mutants | |
| EP1546195A1 (en) | Improved mutants of biotin binding protein | |
| Snow et al. | Molecular cloning of regulators of G-protein signaling family members and characterization of binding specificity of RGS 12 PDZ domain | |
| FI119024B (fi) | Kimeeriset avidiinimutantit | |
| Merrick et al. | The Escherichia coli AmtB protein as a model system for understanding ammonium transport by Amt and Rh proteins | |
| US20090215120A1 (en) | The Use of Protein S Fusion for Protein Solubilization | |
| Mayr et al. | Phosphorylation of p97 (VCP) and p47 in vitro by p34cdc2 kinase | |
| US7037699B2 (en) | Human extracellular signal regulated kinases | |
| US7183397B2 (en) | NK-2 homeobox transcription factor | |
| US7034125B2 (en) | Identification of new human gaba transporter | |
| CA2404496A1 (en) | Calcium binding regulatory subunit | |
| US20030108932A1 (en) | Ras guanine-nucleotide-exchange factor 1 (nrg1) | |
| CA2412665A1 (en) | Scramblase 2 | |
| De Falco et al. | Human DNA replication factors: new interactions and functional significance | |
| CA2425723A1 (en) | Neuromedin u delta | |
| AU2013263759A1 (en) | Protein surface remodeling | |
| EP1268771A1 (en) | Human gata-5 transcription factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 119024 Country of ref document: FI |
|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: ORION DIAGNOSTICA OY Free format text: ORION DIAGNOSTICA OY |