CN112955184A - 可编程免疫细胞受体复合物系统 - Google Patents
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Abstract
一种由免疫细胞表达的可编程受体复合物，其中所述可编程受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包括FcγRI受体成分或生物素结合成分，并且其中所述FcγRI受体成分或生物素结合成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
Description
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发明背景
所描述的发明总体上涉及嵌合抗原免疫受体，更具体而言，涉及可编程免疫细胞受体复合物系统，其可与靶标检测分子一起使用，该靶标检测分子对诊断和治疗应用两者感兴趣的靶标具有特异性。
嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体、人工T细胞受体或CART)是赋予免疫效应细胞(即T细胞)任意特异性(例如单克隆抗体的)的工程化受体。这样的受体被称为“嵌合的”，因为这些受体包括衍生自不同来源的组分。CAR T细胞已成为癌症治疗中最重要的工具之一。在其基本形式中，CAR疗法使人类免疫细胞适应于识别并杀死体内的癌性细胞或携带危险病原体的细胞。这一过程是通过基因工程实现以在T淋巴细胞和其他免疫细胞的表面上产生重组受体，从而重定向其功能和特异性。
采用称为过继细胞转移的技术的CAR癌症疗法已被用于治疗急性淋巴细胞性白血病。这种疗法包括从患者移除T细胞并对这些细胞进行修饰，使得其表达对患者的癌症具有特异性的受体。将可以有效识别和杀死癌细胞的修饰T细胞重新引入患者中。表达嵌合抗原受体的T细胞的过继转移作为抗癌治疗是非常有希望的，因为CAR修饰的T细胞可以被工程化以靶向几乎任何肿瘤相关抗原。
对CAR T细胞进行工程化以用于癌症免疫治疗可包括使用病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒或转座子，其将转基因整合入宿主细胞基因组。然而，这种方法具有对T细胞的内源性基因表达产生负面影响的可能性，可能导致基因毒性，其中工程化细胞变成致瘤性的。替代方法利用非整合载体，如质粒或mRNA；然而，这些类型的附加体DNA/RNA通常在反复细胞分裂后丢失，并且工程化CAR T细胞可能在相对短的时间段后丢失其CAR表达。另一种方法涉及使用在T细胞中稳定维持的载体，而不整合到其基因组中。该方法能够实现长期转基因表达，而没有插入突变或遗传毒性的风险，从而为生产用于癌症免疫治疗的CAR T细胞提供了更安全的方法。
尽管使用了巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞，但CAR细胞的构建压倒性地依赖于T细胞。尽管也可以使用不同的蛋白质，但大多数CAR T细胞在表面上包含用于抗原识别的抗体单链可变片段(scFv)。在CAR T细胞内，这些抗原识别结构域与用于细胞内信号传导的CD3ζ链相连。CD3ζ链是来自内源性T细胞受体(TCR)的信号的主要传递者。在表面受体结合特定抗原后，信号传导结构域激活细胞因子释放、靶细胞裂解和T细胞增殖。不同的设计策略被用于提高CAR T细胞的安全性和抗肿瘤效果，从而产生了四代CAR设计。第一代CAR包含靶标检测结构域和一个信号传导结构域。第二代CAR包含靶标检测结构域、信号传导结构域和共刺激信号传导结构域(例如，CD28、41BB、ICOS)。临床前研究表明，第二代提高了T细胞的抗肿瘤活性。第三代CAR包含靶标检测结构域、信号传导结构域和两个共刺激信号传导结构域(例如，CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40)。图1显示了标准的第三代CAR，仅显示了6个ITAM和用于靶向的永久性的、共价连接的scFv。在这一技术的发展过程中，共受体CD28中发现了所使用的PI3K结合位点，而ITAM基序被确定为CD4-和CD8-p56lck复合物的靶标。第四代CARs因其细胞因子释放功能与前三代有很大不同。
免疫肿瘤学中的小分子药物缀合物(SMDC)平台涉及单一通用CAR T细胞的工程化，其以极高的亲和力与称为FITC分子的良性分子结合。然后当与双特异性SMDC衔接分子共同给药时，这些细胞被用于治疗各种类型的癌症。这些独特的双特异性衔接子由FITC分子和肿瘤归巢分子构建而成，以精确地将通用CAR T细胞导向癌细胞，其导致局部T细胞激活。只有当通用CAR T细胞和正确的抗原特异性衔接分子同时存在时，才诱导抗肿瘤活性。抗肿瘤活性和毒性可通过调整给药的衔接分子的剂量来控制。通过给予所需的抗原特异性衔接子的混合物，可以实现抗原异质性肿瘤的治疗。然而，与该治疗方法相关的限制和困难包括:(i)不能控制细胞因子释放和肿瘤溶解的速率；和(ii)不存在可在肿瘤消除完成后终止细胞毒性活性的“关闭开关”。
使用第二代和第三代CAR T时发生了不良事件。1名患者在环磷酰胺化学治疗，随后输注识别ERBB2(HER-2/neu)抗原的CAR T后第5天死亡。该毒性导致促炎细胞因子的临床显著释放、肺毒性、多器官衰竭和最终患者死亡。该“细胞因子风暴”(细胞因子释放综合征)被认为是由于CAR T细胞对已知表达低水平的ERBB2的正常肺上皮细胞的细胞毒性。这个和其他不良事件强调了在使用CAR T时需要谨慎，因为与针对肿瘤相关抗原的抗体不同，这些细胞并不从身体快速清除。长期暴露于CAR T对于良好临床结果是必要的，但由于不良效果而不可行。癌症免疫疗法的很大希望是清除肿瘤，而没有常规治疗的毒性。CAR T治疗癌症具有几个优点：抗原的HLA非依赖性识别、对许多患者的广泛适用性和快速递送。CAR T的成功应用将需要鉴定仅在肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原，从而最小化毒性风险。
尽管取得了巨大成功，但开发和改进CAR T细胞系统的努力仍受到多种挑战的阻碍：(i)该系统的功能性需要针对每种靶标抗原的单独细胞开发路径，因为其缺乏用于不同检测分子的快速适应性的平台；(ii)CAR T细胞系统的单一抗原特异性在肿瘤异质性的情况下以及当癌细胞停止表达CAR靶向标记物中的一些时可能成为问题，从而逃逸免疫应答；(iii)CAR活性的不受控制的持续性可能导致细胞因子释放综合征和其他毒性；(iv)目前的系统极度聚焦于使用T细胞，只有极小比例的领域试图使用其他细胞类型；(v)大多数CAR T细胞是开发用于癌症治疗，很少或根本不关注传染病的治疗；(vi)CAR T细胞有时可结合并反应于弱表达的脱肿瘤靶标(off-tumor target)，从而导致不期望的效果(“中靶、脱肿瘤(on-target off-tumor)”反应)；和(vii)工程化细胞可具有低信号传导能力、降低的细胞增殖和持久性。因此，持续需要另一代更加可预测、有效和可靠的CAR T细胞，或者克服上述缺陷的不同系统。
发明内容
下文提供了本发明的某些示例性实施方式的概要。本概要不是广泛的概述，也不旨在确定本发明的关键或决定性方面或要素，或描绘其范围。然而，应当理解，在用于描述和要求保护本发明的语言中使用不定冠词并非旨在以任何方式限制所描述的系统。而是“一个/一种(a/an)”的使用应被解释为指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”。
根据本发明的一个方面，提供了一种由免疫细胞表达的可编程免疫细胞受体复合物。该可编程免疫细胞受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包含生物素结合成分(或生物素类似物结合成分)，并且其中所述生物素结合成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
根据本发明的另一方面，提供了一种可编程免疫细胞受体复合物细胞系统。该可编程免疫细胞受体复合物细胞系统包括免疫细胞；和由所述免疫细胞表达的可编程受体复合物，其中所述可编程受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包含生物素结合成分(或生物素类似物结合成分)，和其中所述生物素结合成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
在本发明的又一方面，提供了一种可编程免疫细胞受体复合物细胞系统。该可编程免疫细胞受体复合物细胞系统包括免疫细胞；和由所述免疫细胞表达的可编程受体复合物，其中所述可编程受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包含FcγRI受体成分，和其中所述FcγRI受体成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
在阅读和理解以下示例性实施方式的详细描述后，本发明的另外特征和方面对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。如本领域技术人员将理解的，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的另外的实施方式是可能的。因此，附图和相关描述应被视为说明性的而非限制性的。
附图说明
包含在说明书中并构成说明书一部分的附图示意性说明了本发明的一个或多个示例性实施方式，并且与上文给出的一般描述和下文给出的详细描述一起用于解释本发明的原理，其中：
图1是标准第三代(现有技术)CAR的示意图，显示了六个ITAM和用于靶向的永久性的、共价连接的scFv；
图2是显示抗原结合区域的鼠IgG抗体的示意图；
图3是本发明的示例性靶标检测分子的示意图，显示了用于结合靶标表位的互补位、用于稳定性的整体核心结构、以及结合本发明的工程化受体的一部分的生物素；
图4是示例性天然或内源性表达的αβT细胞受体复合物的示意图；
图5是示例性天然或内源性表达的γδT细胞受体复合物的示意图；
图6-27是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的工程化受体的小鼠FcγRI变体的示例性实施方式的示意图；
图28-45是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的工程化受体的mSA2变体的示例性实施方式的示意图；
图46-57是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的工程化受体的eMA变体的示例性实施方式的示意图；
图58-69是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的FcγRI/mSA2组合变体的示例性实施方式的示意图；
图70-89是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的FcγRI/eMA组合变体的示例性实施方式的示意图；
图90A是根据本发明的示例性实施方式的发光报告酶水母素的基因构建体的示意图；
图90B是根据本发明的示例性实施方式的通用或可编程TCR复合物mFcγRI-CD3ζ的基因构建体的示意图；
图90C是根据本发明的另一示例性实施方式的通用或可编程TCR复合物mSA2-CD3ζ的基因构建体的示意图；
图90D是根据本发明的又一示例性实施方式的通用或可编程TCR复合物eMA-CD3ε的基因构建体的示意图；
图91是质粒pFSC005(pEF1-Aeq)的示意图；
图92是质粒pFSC048(pVitro-blasti-Aeq-FcγRI-CD3ζ)(FcγRI-CD3ζ)的示意图；
图93是质粒pFSC074b(pUC-Kan-mSA2-CD3ζ-2A-Blasti)(mSA2-CD3ζ)的示意图；
图94是质粒pFSC086(pUC-Kan-mSA2-CD3ζ-IRES-Blasti)的示意图；
图95是质粒pFSC100(pFSC095-eMA-LL-CD3e-IRES-Blast)(eMA-CD3ε)的示意图；
图96是质粒pFSC097(pFSC095-FcγRI-CD3ε-IRES-Blasti)的示意图；
图97是质粒pFSC098(pFSC095-FcγRI-TRAC-IRES-Blasti)的示意图；
图98是质粒pFSC094(pFSC048-FcγRI-TRBC1-IRES-Blasti)的示意图；
图99是质粒pFSC103(pFSC102-eMA-LL-TRBC1-IRES-Blasti)的示意图；
图100是质粒pFSC085(pFSC083a-eMA-LL-CD3ζ-IRES-Blasti)的示意图；
图101A-101C是比较eMA-CD3ε细胞的未染色、阴性和染色样品中eMA-CD3ε受体表达水平的流式细胞仪图；图101A为未染色样品；图101B为仅第二Ab；图101C是第一Ab加上第二Ab；
图102是显示使用大肠杆菌O111 LPS和针对大肠杆菌O111 LPS的生物素化小鼠mAb激活带电eMA-CD3ε细胞的图，其中阴性对照为大肠杆菌O157 LPS，其是非特异性抗原；
图103是显示使用生物素抑制eMA受体的图，其中生物素与受体结合并阻止生物素化抗体结合；
图104是显示生物素竞争测定的结果的图，其中eMA-CD3ε细胞在与针对大肠杆菌O111 LPS和大肠杆菌O111 LPS的生物素化小鼠mAb混合时被激活以发出光信号；
图105是显示生物素浓度对信号输出的影响的图，其中在细胞激活过程中，eMA-CD3ε细胞上的eMA受体被不同浓度的生物素抑制，其中使用与大肠杆菌O111 LPS混合的针对大肠杆菌O111 LPS的生物素化小鼠mAb激活细胞；
图106-107是针对大肠杆菌O111 LPS(1F11)IgG2a的纯化的、生物素化的小鼠mAb的SDS-PAGE凝胶和Western-blot分析的图像；其中图106是4-20％SDS-PAGE凝胶的照片，显示了泳道1中的蛋白质标准品、泳道2中的纯化的非生物素化的蛋白质和泳道3中的纯化的生物素化的蛋白质；并且其中图107是Western-blot分析的照片，显示了泳道1中的蛋白质标准品、泳道2中的纯化的非生物素化的蛋白质和泳道3中的纯化的生物素化的蛋白质；
图108是显示来自生物素化1F11(针对大肠杆菌O111 LPS的小鼠mAb)纯化的洗脱级分的ELISA分析的结果的柱状图，其中所述级分是针对HRP缀合的抗生物素IgG进行测试；
图109是显示在FreeStyle 293-F细胞上清液中1F11(针对大肠杆菌O111 LPS的小鼠mAb)IgG2a抗体表达的ELISA时间进程表征的柱状图；
图110是显示大肠杆菌O157特异性抗体(mAb FF754)与大肠杆菌O157和大肠杆菌O111的结合的Biacore分析的结果的图，其中该结果确认mAb FF754对大肠杆菌O157具有特异性；
图111是显示使用不同浓度的抗体在大肠杆菌O157特异性抗体和大肠杆菌O157之间的相互作用的动力学的Biacore Analysis的结果的图；
图112是显示细胞因子释放研究(激活eMA-CD3ε细胞以释放IL-2)的结果的图，其中将细胞与针对大肠杆菌O111 LPS和大肠杆菌O111 LPS的生物素化抗体一起培养导致细胞激活和IL-2释放；
图113是显示细胞因子释放研究(激活eMA-CD3ε细胞以释放IL-2)的结果的图，其中IL-2的释放被显示为是抗体浓度依赖性的；
图114-116是显示激活标记物表达测定的结果的图(在使用小鼠抗大肠杆菌O111LPS和大肠杆菌O111 LPS激活后eMA-CD3ε细胞上CD69的表达水平)，其中图114显示了仅与LPS一起培养的细胞的结果；图115显示了仅与抗体一起培养的细胞的结果；图116显示了与抗体和LPS一起培养的细胞的结果；
图117-119是显示激活标记物表达测定的结果的图(在使用小鼠抗大肠杆菌O111LPS和大肠杆菌O111 LPS激活后eMA-CD3ε细胞上CD62L的表达水平)，其中图117显示了仅与LPS一起培养的细胞的结果；图118显示了仅与抗体一起培养的细胞的结果；图119显示了与抗体和LPS一起培养的细胞的结果。
图120是显示在与XTT试剂一起培养2小时后不同样品在OD450处的平均吸光度读数的图：仅培养基；Raji+生物素化抗CD19+效应T细胞；Raji+生物素化抗EGFR+效应T细胞；Raji+抗CD19+效应T细胞；和K562+生物素化抗CD19+效应T细胞；和
图121是显示不同样品中靶细胞的计算活力％的图：Raji+生物素化抗CD19+效应T细胞；Raji+生物素化抗EGFR+效应T细胞；Raji+抗CD19+效应T细胞；和K562+生物素化抗CD19+效应T细胞。
具体实施方式
现在参考附图描述本发明的示例性实施方式。在整个详细描述中，参考数字用于指代各种要素和结构。尽管以下详细描述出于说明的目的包含许多细节，但本领域普通技术人员将理解，对以下细节的许多变化和变更均在本发明的范围内。因此，本发明的以下实施方式在不丧失对所要求保护的发明的一般性且不对其施加限制的情况下进行阐述。
如前所述，嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)在癌症治疗中非常重要。CAR疗法涉及使人类免疫细胞适应于识别和杀死体内的癌性细胞或携带危险病原体的细胞。这一过程通过基因工程完成，所述基因工程在T淋巴细胞和其他免疫细胞的表面上产生重组受体，从而改变其功能和特异性。在该修饰后，细胞被重新引入患者中以寻找某些已知的“固定靶标”。然后，这些细胞能够识别并杀死体内携带这些“固定靶标”的“坏”细胞。然而，目前的CAR T系统缺乏快速适应不同检测分子的平台，并且需要针对每个“固定靶标”的单独细胞开发路径。此外，一旦给药，CAR T细胞活性不可以被调节或关闭以停止不良反应，如上文讨论的那些。此外，T细胞的过度工程化和高度侵入性操纵降低了细胞信号传导能力、细胞增殖、存活和持久性。因此，本发明的可编程、通用、适应性强的TCR复合物设计成通过提供包括可编程免疫细胞受体复合物的新型细胞系统来克服现有CAR T系统的缺陷。
实施例I：mFcγRI-CD3ζ
本发明的第一示例性实施方式包括可编程的、通用的、适应性强的TCR复合物系统，该系统包括通过将小鼠FcγRI(mFcγRI)融合到人TCR复合物的CD3ζ以产生mFcγRI-CD3ζ来修饰TCR复合物。表达的通用受体(mFcγRI)可以以高亲和力结合某些小鼠免疫球蛋白的Fc区，并将衔接TCR复合细胞重新定向以靶向特定抗原。图2是显示抗原结合区域的mIgG抗体的示意图。通过电穿孔将FcγRI-CD3ζ基因导入CD4+T细胞，并作为随机插入物加入。图6-27是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的工程化受体的mFcγRI变体的示例性实施方式的示意图。美国专利9,752,199；9,850,546；9,850,547；和9,850,548进一步描述了该实施方式的变型，其全部内容出于所有目的通过引入并入本文。
实施例II：mSA2-CD3ζ
本发明的第二个示例性实施方式包括可编程的、通用的、适应性强的TCR复合物系统，该系统是通过融合单体链霉抗生物素蛋白2(mSA2)和人TCR复合物的内源性CD3ζ而对TCR复合物进行修饰而开发的。通过电穿孔用CRISPR/Cas9技术替代内源性CD3ζ，mSA2-CD3ζ基因作为杂合插入物被导入CD4+T细胞。在该设计中，表面表达的通用受体(mSA2)可结合任何生物素化的靶标检测分子(TDM)，并将衔接TCR复合物细胞重新定向以靶向特定抗原。图3是示例性靶标检测分子的示意图，显示了用于结合靶标表位的互补位(或其他配体)、用于稳定性的整体核心结构、和生物素，用于连接工程化受体的结合部位。该版本的衔接TCR复合物与标准CAR T细胞在以下方面有所不同：(I)mSA2受体是通用的(可与任何生物素化TDM结合)和(ii)mSA2受体以设计成出于最大信号传导能力而利用TCR复合物的方式通过CD3ζ直接连接到TCR复合物，因为工程细胞利用了复合物的所有10个ITAM。图28-45是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的工程化受体的mSA2-CD3ζ变体的示例性实施方式的示意图。美国专利9,752,199；9,850,546；9,850,547；和9,850,548进一步描述了该实施方式的变型，其全部内容出于所有目的通过引入并入本文。
实施例III：eMA-CD3ε
本发明的第三个示例性实施方式包括可编程的、通用的、适应性强的TCR复合物系统，该系统是通过将增强的单抗生物素蛋白(eMA)和人T细胞受体复合物的内源性CD3ε融合以形成eMA-CD3ε而对TCR复合物进行修饰而开发的(参见图46和48，其说明了eMA-CD3ε衔接TCR复合物表达构建体的设计，该构建体显示了所有10个保留的ITAMs)。通用受体eMA可以以非常高的亲和力结合任何生物素缀合的TDM，从而使修饰T细胞能够靶向任何负载有生物素化TDM的抗原。在该实施方式中，CD4+T细胞已经被基因工程化以在细胞表面上表达eMA-CD3ε。激活后，工程化CD4+T细胞募集其他免疫细胞以追踪不同的癌症靶标或病原体。eMA-CD3ε基因通过使用CRISPR/Cas9技术替换内源性CD3ε而作为纯合插入物引入T细胞，并且通过设计，T细胞受体复合物的两个CD3ε均被利用(参见图46和48)。基因构建体通过电穿孔递送。该工程化细胞在三个基本方面不同于标准CAR T细胞：(i)eMA受体是通用的(可与任何生物素化TDM结合)；(ii)eMA受体以设计成出于最大信号传导能力而利用TCR复合物的方式通过内源性CD3ε直接连接至TCR复合物，因为工程化细胞利用了该复合物的全部10个ITAM；和(iii)通过将eMA连接至TCR复合物的内源性CD3ε，为每个TCR复合物产生两个通用受体。图46-57是基于内源性αβT细胞受体复合物或内源性γδT细胞受体复合物的本发明的工程化受体的eMA-CD3ε变体的示例性实施方式的示意图。
eMA-CD3ε实施方式是非侵入性的，不干扰TCR复合物，并利用TCR复合物的所有10个ITAM，从而产生最大信号传导。在一组体外实验中，使用生物素化TDM和特定靶标激活衔接TCR复合物细胞(参见图102)。实验证明，所有三个示例性实施方式的激活均导致细胞因子的产生(参见图75-76)。此外，生物素竞争和抑制测定证明，根据本发明修饰的细胞的活性可以被调节(参见图66-68)。
就第三个实施方式而言，通用受体(eMA)可与任何生物素缀合的编程性TDM结合，从而使当特定/正确的生物素化TDM结合在细胞表面上时，修饰T细胞能够靶向任何抗原或癌细胞。图47显示了与靶标检测分子相互作用的满负荷eMA-CD3ε，其中每个TCR复合物有两个通用受体，并且TCR复合物的所有10个ITAM均被保留。作为一项安全措施，在体内给予这些工程化细胞后，生物素可用作抑制剂/竞争剂，以在不良反应的情况下调节细胞活性。与标准CAR T细胞相比，这种设计是非侵入性的，并使修饰T细胞能够在其最大信号传导能力下自然发挥作用，导致改善的细胞增殖、存活和持久性。在开发eMA-CD3ε实施方式时，使用针对大肠杆菌O111的生物素化mAb和作为靶标抗原的大肠杆菌O111细菌激活表达eMA-CD3ε的T细胞。此外，如下文所述，在竞争和抑制研究中使用生物素调节细胞激活。包含本发明的可编程免疫细胞受体复合物的T细胞可用于治疗，作为更安全和适应性更强的癌症治疗，以及作为诊断中的病原体检测器。对修饰T细胞进行的细胞激活和细胞因子释放测定(参见图65和75-76)成功证明了细胞的功能和性能。
本发明的可编程免疫细胞受体复合物有效地解决了影响当前CAR T细胞系统的许多挑战，并对现有系统和方法提供了重大改进。相对于现有CAR T细胞系统相比的优势和改进包括以下：(I)无需每个“固定靶标”的单独细胞开发路径；(ii)可以应用不同靶标的多重混合；(iii)通过使用对肿瘤抗原具有较高特异性的可编程免疫细胞受体复合物细胞和TDM，可以避免与现有CAR T细胞相关的“中靶、脱肿瘤”问题；(iv)所描述的可编程免疫细胞受体复合物细胞被设计用于伴随诊断，因为其可用于任何给定样品中的抗原检测，并同时作为治疗品给药，以靶向体内检测到的病原体/生物标志物；(v)所描述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统可用作通用/可编程配置，用于解决各种各样癌症、传染病(例如TB和HIV)和其他患者特定需求；(vi)本发明提供了更安全的部署，因为在给药后可以调节或关闭(使用生物素)系统活性，有停止不良反应的能力；(vii)作为额外的安全措施，所描述的系统的活性可在生物素化TDM的剂量依赖性给药中调节；(viii)所描述的系统的多功能性和改进的安全性允许更好的结果和更好的加速临床测试的前景，以及积极追求更广泛靶标的能力；(ix)由于设计中的安全特性，可以实现人体内的生物靶标的更快速验证，而无需经过冗长(且通常误导性)的动物研究；(x)所描述的系统的可重复使用的组分可以通过改变靶向抗体而使新的配置能够进入市场，同时保持基础通用技术；(xi)本发明的通用衔接受体系统易于适应不同的免疫细胞类型，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞；和(xii)所描述的系统在T细胞中基本上是“非侵入性的”(即，对T细胞的最小添加)。
可编程免疫细胞受体复合物的构建
Jurkat Clone E6-1细胞[Cat.ATCC TIB152]购自ATCC。从ThermoFisherScientific(Waltham，MA)订购以下细胞系和试剂：FreeStyleTM HEK 293-F细胞[Cat.R79007]；FreeStyleTM 293Expression Medium[Cat.12338001]；OptiPROTM SFM培养基[Cat.12309019]；FreeStyleTM MAX Reagent[Cat.16447750]；生物素化小鼠抗山羊抗体[Cat.31730]；PierceTM G蛋白加琼脂糖；高碘酸钠；酰肼-PEG4-生物素；BCA蛋白检测试剂盒；和Pierce生物素定量试剂盒。所有限制性酶均从New England Biolabs获得。山羊抗小鼠IgG AlexaFlour647[Cat.115-605-062]购自Jackson ImmunoResearch。Coelenterazine-h[Cat.S20011]和
SV Gel和PCR Clean-up Kit[Cat.A9281]从Promega订购。QiaFilter Plasmid Midi和Maxi Kit[Cat.12243]和
Blood&Tissue Kit[Cat#69504]均购自Qiagen。
Cell Line
Kit V[Cat#VCA-1003]来源于Lonza。Pluronic-F68[Cat#A1288]从Applichem获得，BirA-500试剂盒购自Avidity,Aurora,CO。生物素化1F11 scFv抗体通过来自MilliporeSigma,Burlington,MA的BugBuster Master Mix提取，并使用来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO的链霉抗生物素蛋白突变蛋白基质纯化。链霉抗生物素蛋白[Cat.85878]和大肠杆菌O111LPS[Cat：L3024-5MG]也来源于Sigma，而大肠杆菌O157 LPS购自List BiologicalLaboratories[Cat:206]。HRP缀合的抗生物素抗体购自Abcam(Cambridge，MA)。MERS-CoV突刺蛋白和SARS-CoV突刺蛋白购自Sino Biological(Beijing,China)，而RPMI 1640购自Gibco(Cat:A1049-01)。在一些实施方式中，可以使用鸡抗生物素蛋白。
基因被设计和构建成从T细胞产生通用衔接TCR复合物细胞。发光报告酶水母素和三种不同的通用(可编程)受体：小鼠FcγRI-CD3ζ；mSA2-CD3ζ；和eMA-CD3ε，使用如下所述的不同载体构建。该受体构建体用于Jurkat细胞的转染，导致受体表达。水母素基因构建体也被用于转染Jurkat细胞，作为检测细胞激活的报告基因。通过CRISPR/Cas9技术插入eMA-CD3ε和mSA2-CD3ζ两个构建体，通过随机插入引入mFcγRI-CD3ζ和水母素。所有构建体均通过电穿孔递送。
图90A是发光报告酶水母素的基因构建体的示意图；图90B是通用或可编程TCR复合物mFcγRI-CD3ζ的基因构建体的示意图；图90C是通用或可编程TCR复合物mSA2-CD3ζ的基因构建体的示意图；图90D是通用或可编程TCR复合物eMA-CD3ε的基因构建体的示意图。
图91显示了作为Aeq表达载体的质粒pFSC005(pEF1-Aeq)。从DNA2.0订购的AeqDNA序列被克隆到Invitrogen pEF1/myc-His B载体中。SEQ ID NO:1提供了AEQ的DNA序列，SEQ ID NO:2提供了AEQ的氨基酸序列。
质粒pFSC005包括以下组分。第一个组分是EF-1α启动子，其是人延伸因子1α-亚基(hEF-1α)启动子，用于在广泛的物种和细胞类型中的高水平表达。第二组分是AEQ，其是水母素基因。该水母素基因编码水母(Aequorea victoria，维多利亚多管水母)钙可激活的光蛋白，并由DNA2.0进行密码子优化和合成。活性水母素酶是由远水母素(apoaequorin，APO)、氧气和外部注入的腔肠素(coelenterazine)之间的复合物形成。当远水母素结合从内质网释放的细胞内钙时，该酶被激活，腔肠素被氧化，从而发射光并释放游离远水母素和腔肠素。
mFcγRI-CD3ζ的构建
图92显示了质粒pFSC048(pVitro-blasti-Aeq-FcγRI-CD3ζ)(mFcγRI-CD3ζ)，其为mFcγRI-CD3ζ融合蛋白表达载体。T细胞CD3ζ亚基经基因工程化后表达为融合蛋白，其中CD3ζ的细胞外结构域与小鼠FcγRI融合。表面表达的mFcγRI对结合小鼠IgG2a的Fc区具有特异性。短GS接头被基因地导入以将抗体结合结构域mFcγRI与信号转换蛋白元件CD3ζ分隔。CD3ζ信号肽序列用于mFcγRI-接头-CD3ζ融合蛋白T细胞表面表达。SEQ ID NO:3提供了CD3ζSS-FcγRI-CD3ζ的DNA序列，SEQ ID NO:4提供了CD3ζSS-FcγRI-CD3ζ的氨基酸序列。
质粒pFSC048包括以下组件。第一组件是CD3ζSP，其是CD3ζ信号肽序列。DNA序列由DNA2.0合成，CD3ζ信号肽用于eMA-接头-CD3ε融合蛋白T细胞表面表达。第二组件CD3ζ，其是T细胞CD3ζ亚基编码序列。CD3ζcDNA购自MyBioSource.com(CAT#:MBS1278153)。第三组件是mFcγRI(FcgammaRI)，其是小鼠T细胞表面FcγRI受体。DNA是从GeneCopoeia,Inc(CAT#:EX-Mm02462-M02)订购。第四组件是rEF1启动子，其来源于InvivoGen pVITRO1-blasti-mcs载体并具有大鼠来源。与其人类对应物类似，这种启动子表现出强大的活性，其产生类似的表达水平。EF-1α启动子在所有细胞周期均以高水平表达，在G0期期间以低水平表达。EF-1α启动子也是非组织特异性的，在所有细胞类型中均高度表达。第五组件是CMV增强子，其是人巨细胞病毒(HCMV)的主要即时早期增强子，其位于核苷酸-118和-524之间，由独特且重复的序列基序组成。HCMV增强子可以替代SV40的72bp重复序列，比SV40增强子活性高几倍。第六组件是FMDV·IRES，其是口蹄疫病毒的内部核蛋白体进入部位，使能够以高表达水平翻译来自一个mRNA的两个开放阅读框。第七组件是EM7，其是使能够在大肠杆菌中组成型表达抗生素抗性基因的细菌启动子。第八组件是Blasti，其中对杀稻瘟菌素S(BlasticidinS)的抗性是由蜡状芽孢杆菌的bsr基因赋予。在细菌中，bsr从组成型大肠杆菌EM7启动子表达。在哺乳动物细胞中，bsr从大鼠EF-1α启动子转录为多顺反子mRNA，并通过FMDV·IRES翻译。第九组件是EF1 pAn，其是强聚腺苷酸化信号。InvivoGen使用起始于EF1 cDNA的终止密码子之后，结束于富含GT的弯曲结构之后的序列。
mSA2-CD3ζ的构建
图93-94显示了质粒pFSC074b(pUC-Kan-mSA2-CD3ζ-2A-Blasti)(mSA2-CD3ζ)和pFSC086(pUC-Kan-mSA2-CD3ζ-IRES-Blasti)，其是供体质粒中的CD3ζ基因座敲除。这些质粒包含位于T细胞CD3ζ亚基基因侧翼的CD3ζ同源臂，其通过GS接头与CD3ζ的N端上的生物素结合蛋白mSA2(单体链霉抗生物素蛋白2)基因地融合。mSA2-接头-CD3ζ盒由pFSC074b中的人EF1α启动子驱动，并且在pFSC086中使用大鼠EF1α启动子驱动mSA2-接头-CD3ζ的转录。来自CD3ζ的信号肽被用于mSA2-接头-CD3ε融合蛋白T细胞表面表达，并且杀稻瘟菌素基因被用作选择标记物。在pFSC074b中使用furin-P2A肽序列以与mSA2-接头-CD3ζ共表达杀稻瘟菌素，而在pFSC086中使用IRES与mSA2-接头-CD3ζ一起共表达杀稻瘟菌素。SEQ.ID NO.5提供了CD3ζSS-mSA2-CD3ζ的DNA序列，而SEQ ID NO.6提供了CD3ζSS-mSA2-CD3ζ的氨基酸序列。
质粒pFSC074b和pFSC086包括以下组件。第一组件是CD3ζSP，其为CD3ζ信号肽序列。DNA序列由DNA2.0合成，CD3ζ信号肽用于mSA2-接头-CD3ε融合蛋白T细胞表面表达。第二组件是CD3ζ，其为CD3ζ编码序列。CD3ζcDNA购自MyBioSource.com(CAT#：MBS1278153)。第三组件是mSA2生物素结合蛋白mSA2(单体链霉抗生物素蛋白2)。mSA2的DNA序列由DNA 2.0合成。mSA2氨基酸序列从科学文献中获得(参见Lim等，Stable,high-affinity streptavidinmonomer for protein labeling and monovalent biotin detection,BiotechnolBioeng.(110):57-67(2013))。第四组件是CD3ζcrispr left HA和right HA，其中序列从NCBI获得(访问号：NG_007384.1)，DNA序列由DNA2.0合成。使用CRISPR-cas9基因编辑系统，CD3ζ同源臂用于修饰CD3ζ基因座。mSA2-接头-CD3ζ通过同源重组整合入CD3ζ基因座后，内源性CD3ζ亚基被破坏。在CD3ζcrispr同源臂的合成DNA序列中引入突变，以防止CRISPR/Cas9在引入所需编辑后重新修饰靶标序列。第四组件是EF-1α启动子，其是人延伸因子1α-亚基(hEF-1α)启动子，用于在广泛的物种和细胞类型中的高水平表达。第五组件是P2A，其是来源于猪肠病毒-1的2A肽。第六组件是Furin，其是furin切割位点。第七组件是rEF1启动子，其来源于InvivoGen pVITRO1-blasti-mcs载体并具有大鼠来源。与其人类对应物类似，其表现出强活性，其产生类似的表达水平。EF-1α启动子在所有细胞周期均以高水平表达，在G0期期间以低水平表达。EF-1α启动子也是非组织特异性的，在所有细胞类型中均高度表达。第八组件是CMV增强子，其是人巨细胞病毒(HCMV)的主要直接早期增强子，位于核苷酸-118和-524之间，由独特且重复的序列基序组成。HCMV增强子可以替代SV40的72bp重复序列，比SV40增强子活性高几倍。第九组件是FMDV·IRES，其是口蹄疫病毒的内部核蛋白体进入部位，使能够以高表达水平翻译来自一个mRNA的两个开放阅读框。第十组件是EM7，其是可以在大肠杆菌中组成型表达抗生素抗性基因的细菌启动子。第十一组件是Blasti，其中对杀稻瘟菌素S的抗性由蜡状芽孢杆菌的bsr基因赋予。在细菌中，bsr由组成型大肠杆菌EM7启动子表达。在哺乳动物细胞中，bsr从大鼠EF-1α启动子转录为多顺反子基因，并通过FMDV·IRES翻译。第十二组件是EF1 pAn，其是强聚腺苷酸化信号。InvivoGen使用起始于EF1 cDNA的终止密码子之后，结束于富含GT的弯曲结构之后的序列。
eMA-CD3ε的构建
图95显示了质粒pFSC100(pFSC095-eMA-LL-CD3e-IRES-Blast)(eMA-CD3ε)。该质粒是供体质粒中的CD3ε基因座敲除，该供体质粒包含位于T细胞CD3ε亚基编码序列侧翼的CD3ε同源臂，该编码序列通过GS接头与CD3ε的N端上的生物素结合蛋白eMA基因基因地融合。eMA-接头-CD3ε盒由大鼠EF1α启动子rEF1驱动；来自CD3ζ的信号肽用于eMA-接头-CD3ε融合蛋白T细胞表面表达；杀稻瘟菌素基因被用作选择标记物。SEQ ID NO.7提供了CD3ζSS-eMA-CD3ε的DNA序列，SEQ ID NO.8提供了CD3ζSS-eMA-CD3ε的氨基酸序列。
质粒pFSC100包括以下组件。第一组件是eMA，其是增强的单抗生物素蛋白(eMA)。该氨基酸序列来源于科学文献(参见Lee等，A Rhizavidin Monomer with NearlyMultimeric Avidin-Like Binding Stability Against Biotin Conjugates,Angew.Chem.Int.Ed.(55):3393–3397(2016))，DNA序列由DNA2.0进行密码子优化并合成。eMA对生物素具有很强的结合亲和力。第二组件是CD3ζSP，其是CD3ζ信号肽序列。DNA序列由DNA2.0合成，CD3ζ信号肽用于将eMA-CD3ε融合蛋白输出至T细胞表面。第三组件是CD3ε，其是CD3ε编码序列。CD3ε编码序列从NCBI获得(访问号：NM_000733.3)，DNA序列由IDT合成。CD3ε是T细胞受体复合物的一部分，用于信号转导。第四组件是CD3εcripr lef HA和rightHA，其是CD3ε同源臂。该序列从NCBI获得(访问号：NG_007383.1)，DNA序列由IDT合成。CD3ε同源臂用于通过CRISPR-cas9基因编辑系统修饰CD3ε基因座。eMA-接头-CD3ε通过同源重组整合到CD3ε基因座中后，内源性CD3ε亚基被破坏。在CD3εCRISPR同源臂的合成DNA序列中引入突变，以防止CRISPR/Cas9在引入所需编辑后重新修饰靶标序列。第五组件是rEF1启动子，其来自InvivoGen pVITRO1-blasti-mcs载体，并且其具有大鼠来源。与其人类对应物类似，这种启动子表现出强活性，其产生类似的表达水平。EF-1α启动子在所有细胞周期均以高水平表达，在G0期期间以低水平表达。EF-1α启动子也是非组织特异性的，在所有细胞类型中均高度表达。第六组件是CMV增强子，其是人巨细胞病毒(HCMV)的主要直接早期增强子，位于核苷酸-118和-524之间，由独特且重复的序列基序组成。HCMV增强子可以替代SV40的72bp重复序列，比SV40增强子活性高几倍。第七组件是FMDV·IRES，其是口蹄疫病毒的内部核蛋白体进入部位，使能够以高表达水平翻译来自一个mRNA的两个开放阅读框。第八组件是EM7，其是可以在大肠杆菌中组成型表达抗生素抗性基因的细菌启动子。第九种组件是Blasti，其中对杀稻瘟菌素S的抗性是由蜡状芽孢杆菌的bsr基因赋予。在细菌中，bsr由组成型大肠杆菌EM7启动子表达。在哺乳动物细胞中，bsr从大鼠EF-1α启动子转录为多顺反子基因，并通过FMDV·IRES翻译。第十组件是EF1 pAn，其是强聚腺苷酸化信号。InvivoGen使用起始于EF1 cDNA的终止密码子之后，结束于富含GT的弯曲结构之后的序列。
另外的质粒用于构建本发明的各种实施方式和变体。图96所示的质粒pFSC097(pFSC095-FcγRI-CD3ε-IRES-Blasti)用于构建如图6和图8所示的mFcγRI-CD3ε。SEQ IDNO.9提供了CD3ζSS-FcγRI-CD3ε的DNA序列，SEQ ID NO.10提供了CD3ζSS-FcγRI-CD3ε的氨基酸序列。图97所示的质粒pFSC098(pFSC095-FcγRI-TRAC-IRES-Blasti)用于构建图20所示的mFcγRI-TRAC。SEQ ID NO.11提供了CD3ζSS-FcγRI-TRAC的DNA序列，SEQ ID NO.12提供了CD3ζSS-FcγRI-TRAC的氨基酸序列。图98所示的质粒pFSC094(pFSC048-FcγRI-TRBC1-IRES-Blasti)用于构建图22所示的mFcγRI-TRBC1。SEQ ID NO.13提供了CD3ζSS-FcγRI-TRBC1的DNA序列，SEQ ID NO.14提供了CD3ζSS-FcγRI-TRBC1的氨基酸序列。图99所示的质粒pFSC103(pFSC102-eMA-LL-TRBC1-IRES-Blasti)用于构建图52所示的eMA-TRBC1。SEQ ID NO.15提供了CD3ζSS-eMA-TRBC1的DNA序列，SEQ ID NO.16提供了CD3ζSS-eMA-TRBC1的氨基酸序列。图100所示的质粒pFSC085(pFSC083a-eMA-LL-CD3ζ-IRES-Blasti)也用于构建本发明的某些实施方式和变体。SEQ ID NO.17提供了CD3ζSS-eMA-CD3ζ的DNA序列，SEQ ID NO.18提供了CD3ζSS-eMA-CD3ζ的氨基酸序列。
细胞和来源的选择
本发明的可编程免疫细胞受体复合物可用于治疗、治疗的预测试和诊断。受体复合物可在不同的人免疫细胞中进行基因工程化，包括但不限于：T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。这些细胞是原代细胞(用于治疗和诊断)或永生化细胞(用于诊断)。由于该系统是为诊断、治疗和伴随诊断而设计的，因此工程化细胞的功能和性能将针对TDM的混合物进行测试。在本发明的一个示例性实施方式中，Jurka T细胞(Clone E61，
TIB152TM)已被工程化以产生表达通用或可编程受体eMA-CD3ε的修饰TCR复合物。这些细胞已被用于证明靶标诱导的细胞激活、细胞因子释放和进行生物素抑制试验。本发明的另一个实施方式包括同时表达通用/可编程受体和水母素(来自水母(维多利亚多管水母)的钙可激活光蛋白)的工程化细胞。该实施方式尤其可用于诊断应用，其中工程化细胞用作病原体检测的生物传感器。两种原代T细胞(CD4+和CD8+)也已被工程化为表达通用/可编程受体eMA-CD3ε。所得适应性TCR复合物细胞可用于细胞激活研究、靶细胞裂解和激活标记物的表达。其他免疫细胞可被工程化以表达本发明的通用、适应性强的受体。免疫细胞也可以选自非人类动物。这一过程可通过改变细胞自身的受体来完成，但在某些情况下，这将涉及受体的移动性(受体组分从一个细胞转移到另一个细胞)。就治疗应用而言，将从个体收获自身的、同基因的或同种异基因的原代细胞，激活、分离和基因工程化以产生通用的/可编程的/适应性的受体表达细胞，然后输注到患者中。本发明还包括用于工程化细胞的安全和有效的冷冻方法，以允许治疗过程的灵活性。
基因递送和编辑
本发明使用瞬时和稳定的基因表达方法。基因构建体已根据所需的表达模式通过电穿孔线性或圆形质粒进行递送。其他基因构建体已通过使用慢病毒系统的转导进行递送。基因构建体也通过脂肪感染被递送到细胞中。基因的定点整合已通过CRISPR/Cas9技术完成，但也可使用其他核酸酶技术，如TALE核酸酶、锌指核酸酶和兆核酸酶。另外，也可以使用RNA递送方法。表达基因的细胞通过细胞分选(克隆系发育)和通过抗生素选择富集。然而，抗生素选择通常仅用于基于诊断的细胞，因为抗生素抗性基因对于治疗性细胞是不期望的。
转染
对于DNA线性化和纯化，使用Qiagen QiaFilter Plasmid Midi and Maxi Kit，制备包含rEF1-mSA2-CD3ζ-IRES-Blasti CRISPR构建体的质粒DNA pFSC086a；包含rEF1-eMA-LL-CD3ε-IRES-Blasti CRISPR构建体的pFSC100a和包含EF-1α-Aeq构建体用于水母素表达的pFSC005的maxi制备物。然后通过限制性酶切将质粒DNA线性化以提高染色体整合至Jurka T细胞中的效率。质粒pFSC086a和pFSC005通过SspI限制性酶切进行线性化，而质粒pFSC100a通过ApaLI限制性酶切进行线性化。使用Promega
SV Gel and PCRClean-up Kit纯化线性化质粒DNA，以准备转染到MF Jurkat/pEF1-Aeq细胞中。通过在0.8％的琼脂糖凝胶上运行每个线性化样品和非线性化对照样品，并通过凝胶电泳分析以确认每个质粒的正确DNA带大小，对线性的、纯化的构建体质粒进行质量控制检查。
为了产生表达水母素的平台细胞(MF Jurkat/pEF1-Aeq平台细胞)，从ATCC获得Jurkat细胞，并按照ATCC指南进行培养。按照用于Jurkat,Clone E6-1细胞的Lonza
Cell Line
Kit V优化转染方案，将纯化的线性pFSC005转染至JurkaT细胞中。用4μg线性化DNA进行转染，使用Lonza程序X-005获得最大转染效率。转染后，在加入培养基前，细胞在12孔板中于室温下培养20分钟。转染后第二天，将细胞在150RCF离心8分钟，去除上清液，将细胞沉淀重新悬浮于3mL RPMI 1640、10％FBS、1×Pen/Strep中，并转移至6孔板中开始培养。Jurkat/pEF1-Aeq细胞在RPMI 1640、10％FBS、1×Pen/Strep中培养并扩增1周至30mL，直至细胞活力超过90％。然后将G418添加至0.5mg/mL的浓度，以选择具有pEF1-Aeq基因构建体的染色体整合的细胞。Jurkat/pEF1-Aeq细胞在G418选择下培养2-3周，直至细胞活力恢复至至少90％。
为了产生表达eMA-CD3ε和mSA2-CD3ζ的细胞，每个线性化质粒DNA(pFSC100a和pFSC086a)和相应的CRISPR指导RNA质粒按照用于Jurkat,Clone E6-1细胞的Lonza
Cell Line
Kit V优化转染方案共转染入MF Jurkat/pEF1-Aeq细胞。使用Lonza程序X-005进行转染，每次转染加入2μg线性化构建体质粒和2μgCRISPR指导RNA质粒。将转染的细胞从透明小容器转移至12孔板，并在加入培养基前在室温下培养20分钟。转染后第二天，将细胞在150RCF离心8分钟，去除上清液，将细胞沉淀重新悬浮于3mL RPMI 1640、10％FBS、1×Pen/Strep中，并转移至6孔平板。然后在37℃下伴随5％或8％的CO2培养转染细胞。
转染细胞的选择、验证和保存
为了选择和富集转染的细胞，在转染后，培养MF Jurkat/pEF1-Aeq/rEF1-mSA2-CD3ζ-IRES-Blasti CRISPR细胞株(下称mSA2-CD3ζ)和MF Jurkat/pEF1-Aeq/rEF1-eMA-LL-CD3ε-IRES-Blasti CRISPR细胞株(下称eMA-CD3ε)，并逐渐扩增至30mL体积，在RPMI 1640、10％FBS、1×Pen/Strep中培养大约1周，直到细胞活力超过90％。然后将杀稻瘟菌素添加至最终浓度为3μg/mL，以选择具有rEF1-mSA2-CD3ζIRES-Blasti或rEF1-eMA-LL-CD3ε-IRES-Blasti CRISPR构建体的染色体整合的细胞。在进行验证试验前，将细胞在RPMI 10％FBS、1×Pen/Strep、3μg/mL杀稻瘟菌素中培养2-3周以允许发生选择，并使细胞活力恢复至至少90％。克隆系通过流式细胞仪上的单细胞分选产生。
转染细胞的验证
对于通过PCR进行验证，使用Qiagen
Blood&Tissue Kit从eMA-CD3ε和mSA2-CD3ζ细胞的混合群体中提取基因组DNA。使用针对每个构建体的插入连接的引物对提取的基因组DNA进行PCR，以确认正确的染色体整合到预定的基因组位置中。
对于通过流式细胞术进行验证，通过流式细胞术分析eMA-CD3ε细胞以评估受体表达水平。通过台盼蓝染色对细胞进行计数，并将其等分成2×106细胞的样品。将每个样品重新悬浮在不含生物素的DMEM中，并在室温下与最终浓度为5.2μg/mL的链霉抗生物素蛋白一起培养30分钟，以去除培养基中存在的或与eMA受体结合的任何过量的生物素。样品在重悬于100μL的DMEM 2％BSA之前，用DMEM洗涤以除去链霉抗生物素蛋白。将经染色的样品与1.5μg一抗、生物素化小鼠抗山羊IgG一起培养，然后允许与eMA受体结合30分钟。在与一抗一起培养后，将阴性和染色的样品用1.5μg二抗Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG染色，并允许与一抗结合。使用流式细胞术分析染色样品的受体表达，并与未染色和阴性对照样品进行比较。重复该实验以验证mSA2受体在mSA2-CD3ζ细胞中的表达。图100A-100C是比较eMA-CD3ε细胞的未染色、阴性和染色样品中eMA-CD3ε受体的表达水平的流式细胞仪图；图100A为未染色样品；图100B为仅第二Ab；图100C是第一Ab加上第二Ab。染色样品用生物素化小鼠抗山羊IgG+AlexaFlour 647山羊抗小鼠IgG进行染色。阴性样品仅用AlexaFluor647山羊抗小鼠IgG染色，以说明二抗的非特异性结合。
对于通过细胞激活测定进行验证，因为eMA-CD3ε和mSA2-CD3ζ两个细胞系也被工程化以表达水母素，所以它们与Coelenterazine-h一起培养24小时(充电)，然后测试以确定mSA2和eMA受体是否成功结合生物素化抗体。生物素化抗体和靶标抗原的加入导致激活信号转导途径的受体聚集，从而导致发光计检测到水母素光信号(参见图102)。
衔接TCR复合物细胞功能和性能的证明
eMA-CD3ε可编程免疫细胞受体复合物的功能和性能通过下述实验证实。
细胞激活测定：eMA-CD3ε细胞被基因工程化以表达水母素，其是来自水母(维多利亚多管水母)的钙可激活光蛋白。活性水母素酶由远水母素(APO)、氧气和外部注入的腔肠素之间的复合物在称为“充电”的过程中形成。为了激活“带电”细胞，添加了生物素化靶标检测分子以结合到eMA受体上。然后加入靶标抗原以与细胞表面上已结合的TDM结合，导致受体聚集。这触发了一系列细胞内信号，其导致钙从内质网释放到细胞溶质中。释放的钙激活发光酶水母素，其催化化学反应，从而产生被光度计检测到的光信号。在本实验中，将针对大肠杆菌O111 LPS的10μg/mL生物素化小鼠单克隆抗体与eMA-CD3ε效应细胞(800,000细胞/90μL RPMI)混合并允许结合30分钟。然后加入大肠杆菌O111 LPS(250μg/mL)以激活细胞。作为阴性对照，大肠杆菌O157 LPS用于类似的设置中。使用GloMax 20/20Luminometer(Promega)记录信号。图102是显示使用大肠杆菌O111LPS和针对大肠杆菌O111 LPS的生物素化小鼠mAb激活带电eMA-CD3ε细胞的图，其中阴性对照为大肠杆菌O157 LPS，其是不发光的非特异性抗原。
受体抑制测定：通过使用生物素封闭细胞表面上的eMA通用受体，对“带电”eMA-CD3ε细胞进行受体抑制测定。将13.3μg/mL生物素与eMA-CD3ε细胞(800,000细胞/90μLRPMI)混合并允许在室温下结合eMA受体30分钟。然后向混合物中加入类似浓度(13.3μg/mL)的针对大肠杆菌O111 LPS的生物素化小鼠单克隆抗体并允许培养30分钟。向混合物中加入大肠杆菌O111 LPS(250μg/mL)，并使用GLO max 20/20Luminometer(Promega)记录信号。图103是显示使用生物素抑制eMA受体的图，其中生物素与受体结合并防止生物素化抗体结合。当加入生物素化抗体和相应的靶标/病原体时，封闭的eMA-CD3ε细胞未被激活。然而，在阳性对照测定中，未被封闭的eMA-CD3ε细胞被激活。
生物素竞争测定：生物素和其他生物素缀合物可用于调节衔接TCR复合物细胞的激活。使用生物素作为“开/关”开关(“on/off”switch)以调节细胞激活而对eMA-CD3ε细胞进行竞争测定。eMA-CD3ε细胞与针对大肠杆菌O111 LPS的5μg/mL生物素化scFv一起培养30分钟以允许scFv结合。向混合物中加入生物素(13.3μg/mL)并在室温下培养30分钟，然后加入250μg/mL大肠杆菌O111LPS以激活细胞。在不添加生物素的情况下进行重复测定。还在不添加生物素的情况下进行了阴性对照测定，但使用了250μg/mL的大肠杆菌O157 LPS，其是非特异性靶标。所有测定一式三份进行，所有信号均记录在GLO max 20/20Luminometer(Promega)上。图102是显示生物素竞争测定的结果的图，其中eMA-CD3ε细胞在与针对大肠杆菌O111 LPS的生物素化scFv和大肠杆菌O111 LPS混合时被激活以发出光信号。然而，由于与eMA受体的竞争性结合，生物素的加入导致猝灭的信号。加入与非特定靶标(大肠杆菌O157 LPS)结合的生物素化scFv不激活细胞。
图105是说明eMA-CD3ε细胞上的通用受体在细胞激活期间被不同浓度的生物素抑制的图。在生物素浓度与激活信号之间存在相关性。由于与eMA受体的竞争性结合，生物素的加入导致猝灭的信号。在该生物素竞争测定中，生物素和其他生物素缀合物被用于调节可编程免疫细胞受体复合物细胞的激活。使用生物素化1F11-IgG2a(针对大肠杆菌O111LPS的mAb)和大肠杆菌O111 LPS对eMA-CD3ε细胞进行该分析。不同浓度的生物素用于调节细胞激活。本实验试图开发信号输出与生物素浓度之间的趋势。将160万个细胞/90μL的RPMI与不同浓度的生物素一起培养30分钟。加入10μg/mL生物素化1F11-IgG2a，再培养30分钟。培养后，将细胞/抗体/生物素混合物加入到250μg/mL的大肠杆菌O111 LPS中以触发细胞激活。培养基中存在的生物素的量从一开始就很高，因此加入的生物素的量是小的增量。结果证明在信号输出与生物素浓度之间存在相关性。生物素浓度越高，激活信号越低，因此在本发明中，生物素是信号激活的良好调节剂。
细胞因子释放研究：生物素化靶标检测分子可以识别eMA-CD3ε细胞表面上的eMA并与之结合。在引入其特定靶标后，细胞被激活，从而产生细胞因子。图112是显示细胞因子释放研究(激活eMA-CD3ε细胞以释放IL-2)的结果的图，其中将细胞与针对大肠杆菌O111LPS的生物素化抗体和大肠杆菌O111 LPS一起培养导致细胞激活和IL-2释放；图113显示了细胞因子释放研究(激活eMA-CD3ε细胞以释放IL-2)的结果，其中IL-2释放被显示为是抗体浓度依赖性的。对于这些实验，eMA-CD3ε细胞(1×106细胞/2mL RPMI)与针对大肠杆菌O111LPS的10μg/mL生物素化小鼠单克隆抗体(IgG2a)和150μg/mL大肠杆菌O111 LPS一起在室温下混合30分钟，每10分钟温和混合。然后将细胞转移至含5％CO2的37℃培养箱中18小时。收集上清液并通过ELISA分析IL-2的存在。测定是一式三份进行，平均IL-2生产与标准偏差一起作图。重复类似的实验，但使用不同浓度的生物素化抗体；2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL。图112中的结果显示，eMA-CD3ε细胞通过与结合靶标抗原LPS的抗体结合而被激活，从而导致IL-2释放。在图113中，结果显示IL-2释放是抗体浓度依赖性的，10μg/mL的抗体导致最多的释放。
激活标记物表达测定：当可编程免疫细胞受体细胞与生物素化靶标检测分子及其特定靶标一起培养时，细胞被激活。激活后，T细胞将以可预测的模式上调或下调多种多样的T细胞激活标记物。在本测定中，选择了两种T细胞激活标记物(CD69和CD62L)用于细胞激活后的分析。图77-79是显示激活标记物表达测定的结果的图(在使用生物素化小鼠抗大肠杆菌O111 LPS抗体和大肠杆菌O111 LPS激活后eMA-CD3细胞上CD69的表达水平)，其中图114显示了仅与LPS一起培养的细胞的结果；图115显示了仅与抗体一起培养的细胞的结果；图116显示了与抗体和LPS一起培养的细胞的结果；图80-82是显示激活标记物表达测定的结果的图(在使用生物素化小鼠抗大肠杆菌O111 LPS抗体和大肠杆菌O111 LPS激活后eMA-CD3细胞上CD62L的表达水平)，其中图117显示了仅与LPS一起培养的细胞的结果；图118显示了仅与抗体一起培养的细胞的结果；图119显示了与抗体和LPS一起培养的细胞的结果。为了确定CD69的表达水平，将细胞(1×106细胞/样品)接种在12孔板中，然后通过添加针对大肠杆菌O111 LPS的10μg/mL生物素化小鼠mAb和大肠杆菌O111 LPS进行激活。样品在37℃、5％CO2下培养24小时，以允许T细胞激活标记物的表达。以针对标记物的小鼠mAb作为一抗，以AlexaFluor647山羊抗小鼠IgG作为二抗，通过流式细胞术分析CD69和CD62L的表达水平。
靶细胞裂解测定。从ThermoFisher Scientific购买的XTT(3’-[1-[(苯氨基)-羰基]-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物)细胞活力测定法是基于通过主动呼吸活细胞减少XTT的比色测定法。在添加针对靶细胞表达的细胞表面标记物的生物素化抗体后，使用该XTT细胞活力测定法评估工程化Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)进行的靶细胞裂解。
测定设计：Raji细胞在表面上表达CD19(癌症标记物)，而K562细胞不表达该标记物。本实验的目的是确认在与生物素化抗CD19抗体和Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)一起培养时的Raji(CD19+)细胞裂解。设计了三个阴性对照条件，以评估Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)在与正确的生物素化抗体一起培养时针对Raji细胞的特定细胞毒性：(i)第一个阴性对照是与生物素化抗CD19抗体和Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)一起培养的K562(CD19-)细胞；(ii)第二个阴性对照是与Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)和针对在Raji细胞上不表达的标记物(EGFR)的生物素化抗体一起培养的Raji细胞；(iii)第三个阴性对照是与Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)和不与Jurkat eMA-CD3ε细胞(效应T细胞)的eMA-CD3ε受体结合的非生物素化抗CD19抗体一起培养的Raji细胞。抗CD19和抗EGFR重组单克隆小鼠IgG2a抗体两者均购自Absolute Antibody，并使用ThermoFisher Scientific的EZ-Link NHS-Biotin Kit进行生物素化。使用Pierce Biotin Quantitation Kit(ThermoFisher Scientific)确定每分子IgG中的生物蛋白数量为4-5。
程序：从ATCC获得Raji和K562细胞，并在RPMI 1640、10％FBS、1X Pen/Strep中按照ATCC规范培养，用作本实验的靶细胞。效应细胞和靶细胞以2:1的比率在96孔板中每孔总共100μL DMEM，10％FBS中铺板。向适当的样品中加入最终浓度为10μg/mL的特定抗体。增加仅含有DMEM，10％FBS的额外样品以说明背景吸收。增加仅包含以与实验样品中相同的数量铺板的靶细胞的样品，以说明靶细胞对XTT的最大减少。增加仅以与实验样品中相同的数量铺板的效应细胞的样品，以说明效应细胞导致的XTT减少。所有样品一式三份铺板，板在37℃、5％CO2下培养48小时。培养后，按照ThermoFisher Scientific提供的方案制备XTT溶液并加入样品中，并在37℃、5％CO2温度下培养2小时。通过在450nm的波长和650nm的参比波长下测量OD来评估细胞的活力。计算各样品类型的平均OD和标准偏差。活靶细胞的百分比计算如下：靶细胞的活力％＝((OD实验孔-仅OD仅效应孔)/(OD仅靶细胞孔-OD培养基))×100。
结果：图120是显示不同样品在与XTT试剂一起培养2小时后在OD450处的平均吸光度读数的图：仅培养基；Raji+生物素化抗CD19+效应T细胞；Raji+生物素化抗EGFR+效应T细胞；Raji+抗CD19+效应T细胞；和K562+生物素化抗CD19+效应T细胞。图121是显示不同样品中靶细胞的计算活力％的图：Raji+生物素化抗CD19+效应T细胞；Raji+生物素化抗EGFR+效应T细胞；Raji+抗CD19+效应T细胞；和K562+生物素化抗CD19+效应T细胞。图120中的结果显示，Raji+生物素化抗CD19+效应细胞样品在OD450处的吸光度读数(2.74)低于其他样品(3.25-3.36)，表明由于靶细胞裂解导致的细胞活力的下降。图121中的结果显示了标准化至100％后靶细胞的活力百分比的计算值。如图121所示，与具有69.2％至100％的靶细胞活力的对照样品相比，Raji+生物素化抗CD19+效应细胞样品具有显著更低的靶细胞活力百分比(18.6％)。这些结果表明JurkateMA-CD3ε细胞(效应T细胞)裂解了靶标Raji细胞，并且该裂解对具有选定标记物结合针对该标记物的相应生物素化抗体的添加的细胞具有特异性。
细胞保存
本发明还包括修饰/工程化TCR复合物细胞保存的方法，该方法允许工程化细胞在-80℃冷冻直至使用的时候。为了使用细胞，将细胞从冰箱中取出并在室温下解冻15分钟，然后用于激活。eMA-CD3ε细胞可在-80℃冷冻，在室温下解冻15分钟，并使用生物素化TDM和靶标抗原激活。
对于治疗，可以将工程化细胞解冻，然后针对生物素化TDM的混合物进行测试，直至找到有效的细胞，然后将细胞输注到患者中。这种安排为治疗过程提供了灵活性。一旦从个体收获细胞，它们被分离、激活和基因工程化以产生通用衔接子受体表达细胞，然后使用我们的发明进行扩增和冷冻。为了冷冻细胞，将扩增的细胞与浓度0.1％Pluronic F68和7％甘油以1.6×106个细胞/90μL RPMI混合并在-80℃冷冻。细胞将保持存活至少6个月或更长时间。
靶标检测分子(TDM)
本发明的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统能够结合任何生物素化靶标检测分子(TDM)，然后生物素化TDM藉此将工程化细胞导向特定的靶标，例如癌细胞。工程化细胞在与靶标结合后被激活。本发明用于诊断和治疗应用两者的功能涉及使用高质量、可操作的TDM。因此，本发明包括设计用于免疫细胞受体复合物细胞系统的不同TDM的生产方案。商业上可获得的TDM也与本发明兼容。TDM能够检测不同病原体，包括但不限于：细菌、病毒、真菌、原生动物、生物标记物、细胞受体、蛋白质、核酸、肽、代谢物或其他小分子。对于一个或多个靶标的不同表位，TDM可包含多个结合结构域。TDM可包括抗体，如IgG、Fab、F(ab’)2、scFv、双抗体、三抗体、scFv-Fc、纳米抗体、微型抗体、VHH、骆驼科重链IgG、V-NAR、鲨鱼IgNAR、IgM、IgA、IgE、IgD等；适体，例如寡核苷酸，例如DNA、RNA或XNA、肽等；碳水化合物；或其他合成分子。TDM可与作为效应子部分发挥作用以触发免疫应答的生物素或生物素衍生物(具有可调节的接头臂)缀合，从而提供Fc介导的效应功能的替代。这对于临床应用来说是实质性的优势，因为其消除了与具有Fc受体的细胞(例如，树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞)的、可造成有害健康影响的非特异性结合(参见Masuda等，Role of Fc Receptors as aTherapeutic Target,Inflamm Allergy Drug Targets.8(1):80–86(2009))。TDM可结合或以其他方式识别抗体、B细胞或T细胞识别的抗原决定簇或表位。这样的抗原决定簇包括线性表位和构象表位，以及在抗原提呈细胞上识别的表位，例如在MHC I类或MHC II类分子的情况下呈现的那些。
可以通过不同的技术产生TDM，包括免疫和血清收集、杂交瘤选择、单个B细胞分选、单个浆细胞分选、噬菌体展示、酵母展示、细菌展示、核蛋白体展示、mRNA展示、酵母双杂交系统和SELEX。当确定了TDM的序列时，其可以被基因修饰成不同的形式(例如scFv)。可从转化的细菌(例如，大肠杆菌)或转染的哺乳动物细胞(例如，HEK293)表达和纯化TDM用于进一步应用。取决于分子是否具有适当的糖基化或赖氨酸残基，以及其是否包含AviTagTM，TDM可以被化学或酶促生物素化(例如，参见美国专利5,932,433、5,874,239和5,723,584,其出于所有目的通过引入全文并入本文)。化学生物素化对于生物素化高度糖基化抗体是理想的，因为在TDM的Fc部分上的碳水化合物残基可被高碘酸钠氧化成醛类，然后与酰肼-PEG4-生物素缀合。或者，AviTagTM可基因融合至远离互补位的TDM的C端。未定向的、不受控制的生物素化可导致不期望的TDM，尤其是如果赖氨酸残基位于TDM的互补位区域中。可使用生物素连接酶(例如BirA-500试剂盒(Avidity)将带有AviTag的抗体进行生物素化，如下：简言之，将10mM ATP、10mM MgOAc、50μm D-生物素和生物素连接酶与抗体在0.05M Bicine缓冲液中于pH 8.3混合，并在30℃下培养1小时。本发明包括以下TDM。
针对大肠杆菌O111的mAb(IgG2c)(下称1F11)：该抗体通过杂交瘤系统产生，并与mFcγRI-CD3ζ细胞一起用于大肠杆菌O111检测和效应细胞激活。
AviTagged 1F11(IgG2a)：通过IF11从IgG2c到IgG2a的种类交换并在Fc区的C端添加AviTag，生成该TDM。其是1F11的改进版本，因为其以比IgG2c版本高得多的亲和力结合mFcγRI-CD3ζ。该抗体通过分泌到培养基中而在FreeStyleTM 293-F细胞中克隆和表达。蛋白G树脂(Thermo Scientific)用于从细胞上清液中纯化该抗体。
生物素化AviTagged 1F11(IgG2a)：这是AviTagged 1F11(IgG2a)的生物素化版本，其可与FcγRI-CD3ζ和eMA-CD3ε细胞两者一起使用。我们将这种TDM用于大肠杆菌O111检测和效应细胞激活。其是通过使用生物素连接酶对纯化的AviTagged 1F11进行生物素化而产生。
生物素化AviTagged 1F11 scFv：该TDM是从1F11 mAb的原始可变区序列设计和构建的。其构建为具有AviTag，并在大肠杆菌菌株中与生物素连接酶(BirA)共表达。这两个基因均为IPTG诱导型，因此在培养基中加入IPTG和生物素以诱导蛋白表达和生物素化。生物素化scFv通过BugBuster Master Mix(MilliporeSigma)提取，并通过链霉抗生物素蛋白突变蛋白基质(Sigma-Aldrich)纯化。
AviTagged 1F11 Fab：1F11的Fab版本被设计并构建为具有AviTag和信号传导序列以用于在FreeStyleTM 293-F细胞中表达的期间输出并分泌到培养基中。
针对PBP2A的V-NAR抗体：针对对MRSA有较高特异性的结合物筛选鲨鱼IgNAR抗体文库(Exommune,Gaithersburg,MD)(PBP2A)。产生了7个序列，并用于构建带有AviTag的TDM以在大肠杆菌菌株中表达和生物素化。在链霉抗生物素蛋白柱上纯化所得TDM并用于MRSA检测和效应细胞激活。
针对MERS-CoV突刺蛋白的IgNAR抗体：从Exommune(Gaithersburg,MD)获得7个序列，用于构建用于检测MERS-CoV病毒和效应细胞激活的TDM。在使用前，表达的TDM在链霉抗生物素蛋白柱上纯化。
针对PBP2A蛋白的人Fab：针对识别PBP2A(MRSA)蛋白的人Fab抗体，筛选HuCAL
噬菌体文库。来自高结合物的序列被用于构建和表达待在大肠杆菌细胞中表达的HisTagged、AviTagged Fab抗体。TDM在Nickel-NTA柱上提取和纯化。抗体使用生物素连接酶进行生物素化，并在链霉抗生物素蛋白柱上纯化，然后与eMA-CD3ε细胞一起用于靶标检测和效应细胞激活。
Pierce Biotin Quantitation Kit(Thermo Scientific)用于确定标记的TDM的生物素化水平。将HABA(2-(4-羟基偶氮苯)苯甲酸)/抗生物素蛋白复合物溶解在超纯水中。在500nm处测量溶液的吸光度。然后将生物素化抗体引入到HABA/抗生物素蛋白复合物中，导致500nm处的吸光度的变化。500nm处的吸光度的变化用于计算每摩尔蛋白质的生物素摩尔数。
在纯化和生物素化后，通过SDS-PAGE和Western-blot分析所有TDM的生物素化和纯度。为了检测小鼠抗体，在印迹过程中直接使用山羊抗小鼠IgG-HRP(Sigma目录号AP503P)。为了检测带有Avi-Tag的抗体，在Western-blot期间使用Biotin Ligase EpitopeTag Antibody(Rockland目录号100-401-B21)作为一抗，使用Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(Santa Cruz目录号SC-2922)作为二抗。为了检测生物素化抗体，在Western-blot期间直接使用Anti-Biotin HRP(Abcam目录号ab6651)。考马斯染色凝胶和相应的Western-blot的例子见图106和107。图106-107是纯化的、生物素化的1F11 IgG2a的SDS-PAGE和Western-blot分析的图像；其中图106是4-20％SDS-PAGE凝胶的照片，显示了泳道1中的蛋白质标准品、泳道2中的纯化的、非生物素化的蛋白质和泳道3中的纯化的、生物素化的蛋白质；并且其中图107是Western-blot分析的照片，显示了泳道1中的蛋白质标准品、泳道2中的纯化的、非生物素化的蛋白质和泳道3中的纯化的、生物素化的蛋白质。为确定提取和纯化后的抗体的浓度，使用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo目录号23227)。
通过ELISA分析抗体-抗原相互作用。将96孔微量滴定板在4℃下用抗原(大肠杆菌O111 LPS)涂布过夜。洗涤平板以去除未结合的抗原，然后在室温下用5％w/v牛血清(或脱脂奶粉)封闭1小时。样品的系列稀释(包括标准品、阳性和阴性对照品以及未知物)被添加到板上。培养1小时后，将板洗涤3次，加入HRP缀合的检测抗体并培养1小时。洗涤板，加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺基质溶液进行显色。用1M HCl停止反应，并立即在OD450处使用平板读数器读取板。图109是显示来自生物素化1F11 scFv纯化的洗脱级分的ELISA分析的结果的图，其中该等级分针对HRP缀合的抗生物素IgG进行测试。每个孔涂有500μg/mL的大肠杆菌O111 LPS，一式三份。测试了四个洗脱级分中1F11 scFv的存在。抗体储存缓冲液用作空白。图110是显示在FreeStyle 293-F细胞上清液中1F11 IgG2a抗体表达的ELISA时间进程表征的图。ELISA板涂有大肠杆菌O111 LPS。在7天时间段收集样品，并使用HRP缀合的山羊抗小鼠IgGγ链抗体分析1F11 IgG2a抗体的存在。新鲜细胞培养基作为空白。
Biacore SPR用于在使用前分析生成的TDM和其他商业抗体。该过程使能够对与可编程免疫细胞受体复合物细胞系统一起使用的最佳TDM进行排序和选择。对于每种抗体，测量了TDM-靶标相互作用、结合亲和力和动力学速率常数，从而允许确定每种TDM的动力学和平衡常数。图109是显示大肠杆菌O157特异性抗体(mAb FF754)与大肠杆菌O157和大肠杆菌O111的结合的Biacore分析的结果的图，其中该等结果确认mAb FF754对大肠杆菌O157具有特异性。图74是显示使用不同浓度的抗体，在大肠杆菌O157特异性抗体和大肠杆菌O157之间的相互作用的动力学的Biacore Analysis的结果的图。
本发明提供了一种通用的、适应性强的和/或可编程的免疫细胞受体复合物细胞系统，其可与任何生物素化靶标检测分子(TDM)一起使用。这些工程化细胞被适当的TDM和特定靶标激活，以诱导细胞因子释放。该等工程化细胞可以被冷冻，在室温下解冻15分钟，并立即用于激活分析。该系统与现有CAR T细胞系统相比提供许多优势。本发明不是创造人工受体，而是通过对复合物的简单修饰而利用天然T细胞受体复合物信号传导能力。与CART细胞相比，这允许工程化细胞尽可能接近正常的发挥功能，从而产生改善的信号传导、细胞增殖、扩增和持久性。通过使用eMA和mSA2作为通用受体，细胞激活可通过在必要时调整TDM剂量或使用生物素(或生物素类似物)作为“开/关”或信号“音量控制”开关来进行调节。此外，工程化细胞可用于快速筛查更理想的TDM并对它们进行配对，然后输注到患者中。可以使用已知的癌症标记物生成TDM文库，使得提取的、工程化的患者细胞可以针对TDM混合物进行快速测试，从而找到最有效的治疗。本发明还包括使用水母素作为一种工具，用于在将工程化细胞输注回到体内之前更好、更快和更安全地在体外测试工程化细胞。一小部分的提取的细胞可与水母素一起用作样本分析，以确定患者对TDM的应答。所公开的冷冻工程化细胞的方法赋予了使用工程化细胞的治疗方法的灵活性。这种新的衔接TCR复合物系统是稳健的，eMA和mSA2的任何潜在免疫原性均可通过对蛋白质的微小突变而容易地处理。本发明设想了一种系统，其中健康人提交其自身提取的细胞以进行工程化，以产生可编程免疫细胞受体复合物细胞，然后所述细胞将被测试并储存，用于未来当该人出现疾病时使用或用特定TDM编程。
在一些实施方式中，免疫细胞受体复合物将不表现出天然的、未修饰受体的结合特异性，例如，修饰T细胞受体将基本上仅表现出靶标检测分子提供的特异性。这可以通过取代形成受体的抗原结合部位的一个或多个亚基或通过修饰天然抗原结合部位必需的残基来实现。缺乏天然TCR功能的CAR T细胞将消除因原始T细胞株的特异性而产生的脱靶效应的可能性。此外，消除MHC I和MHC II表面蛋白会降低靶向进入的治疗性T细胞的宿主适应性免疫系统的能力，并随时间增强快速响应排斥。这也会降低身体排斥同种异基因T细胞作为非自身的能力。不含MHC的T细胞仍将经历部分固有免疫系统(例如NK细胞)的增强的靶向，但这些不会获得特异性靶向治疗性T细胞上的嵌合蛋白的能力。
BLASTP可用于使用相似性矩阵(如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80，其中BLOSUM45可用于密切相关的序列，BLOSUM62可用于中等范围序列，BLOSUM80可用于更远相关的序列)鉴定与参比氨基酸具有至少95％、97.5％、98％、99％序列同一性或相似性的氨基酸序列。除非另有规定，本文公开的序列的相似性分数将基于BLOSUM45的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比是基于BLASTP阳性分数，序列同一性百分比是基于BLASTP同一性分数。BLASTP“同一性”显示了高评分序列对中相同的总残基的数量和比例；BLASTP“阳性”显示比对分数具有正值且彼此相似的残基的数量和比例。具有这些同一性或相似性程度或与本文公开的氨基酸序列具有任何中间程度的同一性或相似性的氨基酸序列被本公开所考虑和包含。使用预期阈值10、字长3、BLOSUM 62作为矩阵、缺口罚分11(存在)和1(延伸)以及条件组成评分矩阵调整的代表性BLASTP设置。BLASTP的默认设置由https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TY PE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome描述并通过引用并入(2018年3月13日最近一次访问)。优选地，与本文公开的序列相似或具有至少95％同一性的序列将保留所公开序列的至少一种功能。
尽管本发明已经通过对其示例性实施方式的描述进行了说明，并且尽管已经对实施方式在某些细节进行描述，但并不意图将所附权利要求的范围限制或以任何方式限制于这样的细节。本领域技术人员将容易理解另外的优点和修改。因此，本发明在其更广泛的方面不限于所示和所述的任何具体细节、代表性设备和方法、和/或说明性实施例。因此，在不脱离总体发明概念的精神或范围的情况下，可以偏离这样的细节。
此外，本文中的章节标题提供为与37C.F.R.1.77下的建议保持一致，或以其他方式提供组织提示。这些标题不应限制或表征可以从本公开提出的任何权利要求中描述的发明。具体地，并且作为示例，“背景技术”中对技术的描述不应被解释为承认某些技术是本公开中任何实施方式的现有技术。“发明内容”也不应被视为对任何已提出的权利要求中陈述的实施方式的穷尽表征。此外，本公开中以单数形式提及“发明”不应被用于论证本公开中仅存在一个新颖之处。根据从本公开提出的多个权利要求的限制，可以阐述多个实施方式，并且这样的权利要求相应地定义了由此保护的实施方式及其等同方式。在所有情况下，这样的权利要求的范围应根据本公开的内容根据其自身的优点予以考虑，但不应受限于本文所述的标题。
Claims (29)
1.一种由免疫细胞表达的可编程受体复合物，其中所述可编程受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包含生物素结合成分，并且其中所述生物素结合成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
2.根据权利要求1所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位为T细胞受体亚单位。
3.根据权利要求2所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位包括至少一个CD3-δ、CD3-γ、TCRα、TCRβ、两个CD3-ζ和两个CD3-ε。
4.根据权利要求3所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中已被工程化或修饰以包含生物素结合成分的所述天然或内源性表达的受体亚单位为CD3-ε亚单位。
5.根据权利要求1所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中所述免疫细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞或同种异基因细胞。
6.根据权利要求1所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中所述生物素结合成分是单体链霉抗生物素蛋白2或增强的单抗生物素蛋白。
7.根据权利要求1所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中所述生物素结合成分是鸡抗生物素蛋白。
8.根据权利要求1所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述靶标检测分子包含生物素部分、稳定核心结构、和对所述预定靶标具有特异性的互补位或其他配体。
9.根据权利要求1所述的可编程免疫细胞受体复合物，其中所述预定靶标是已知类型的癌细胞或癌细胞决定簇，或已知类型的传染病病原体或传染病病原体决定簇。
10.一种可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其包括：
(a)免疫细胞；和
(b)由所述免疫细胞表达的可编程受体复合物，
(i)其中所述可编程受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，
(ii)其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包含生物素结合成分，和
(iii)其中所述生物素结合成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
11.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位为T细胞受体亚单位。
12.根据权利要求11所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位包括至少一个CD3-δ、CD3-γ、TCRα、TCRβ、两个CD3-ζ和两个CD3-ε。
13.根据权利要求12所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中已被工程化或修饰以包含生物素结合成分的所述天然或内源性表达的受体亚单位为CD3-ε亚单位。
14.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述免疫细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞或同种异基因细胞。
15.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述生物素结合成分为单体链霉抗生物素蛋白2或增强的单抗生物素蛋白。
16.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述生物素结合成分为鸡抗生物素蛋白。
17.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述靶标检测分子包含生物素部分、稳定核心结构、和对所述预定靶标具有特异性的互补位或其他配体。
18.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述预定靶标是已知类型的癌细胞或癌细胞决定簇，或已知类型的传染病病原体或传染病病原体决定簇。
19.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述系统适用于诊断用途。
20.根据权利要求10所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述系统适用于治疗用途。
21.一种可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其包括：
(a)免疫细胞；和
(b)由所述免疫细胞表达的可编程受体复合物，
(i)其中所述可编程受体复合物包含多个天然或内源性表达的受体亚单位，
(ii)其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位中的至少一个已被工程化或修饰以包含FcγRI受体成分，和
(iii)其中所述FcγRI受体成分可操作地结合至与预定靶标结合或以其他方式相互作用的靶标检测分子。
22.根据权利要求21所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位为T细胞受体亚单位。
23.根据权利要求22所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述多个天然或内源性表达的受体亚单位包括至少一个CD3-δ、CD3-γ、TCRα、TCRβ、两个CD3-ζ和两个CD3-ε。
24.根据权利要求23所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中已被工程化或修饰以包含生物素结合成分的所述内源性表达的受体亚单位为CD3-ε亚单位。
25.根据权利要求21所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述免疫细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞或同种异基因细胞。
26.根据权利要求21所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述靶标检测分子是IgG抗体。
27.根据权利要求21所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述预定靶标是已知类型的癌细胞或癌细胞决定簇，或已知类型的传染病病原体或传染病病原体决定簇。
28.根据权利要求21所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述系统适用于诊断用途。
29.根据权利要求21所述的可编程免疫细胞受体复合物细胞系统，其中所述系统适用于治疗用途。
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