CN104583230A - 通过共同引入双特异性抗体增强car t细胞的活性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供治疗人癌症的组合物和方法。本发明包括给对象施用基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)、双特异性抗体或其组合的T细胞。本发明的CAR和双特异性抗体可包括人抗体、人源化抗体或其抗原结合片段。

Description

通过共同引入双特异性抗体增强CAR T细胞的活性
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月13日提交的美国临时申请号61/671,535的优先权，通过引用以其全文并入本文。
背景技术
对T细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的进展，已经为许多癌症和其他紊乱的新的潜在疗法打开了大门。通常地，CAR包括胞外抗原识别结构域和细胞内结构域。
一些CAR使用非人类胞外抗原识别结构域，其可能引入可危及CAR介导的肿瘤识别和肿瘤溶解的治疗成果的有害免疫应答。例如，患者可能对小鼠源的抗体应答并产生对外来小鼠源抗体特异性的抗体。这种应答称为人抗小鼠抗体(HAMA)应答，其可产生类似过敏反应的症状，其范围从轻度皮疹到危及生命的并发症。因此，含有源自人的抗原识别结构域或人源化抗体的CAR可能是有益的，因为它们不会激发这种危险的免疫应答。
双特异性T细胞衔接器(BiTE)是结合T细胞抗原(如CD3)和肿瘤抗原的双特异性抗体。BiTE已经显示出诱导靶肿瘤细胞定向溶解的功能，从而也为癌症和其他紊乱提供了潜力巨大的疗法。然而，BiTE的全身递送可导致毒性，因而可能需要BiTE对特定肿瘤环境的更加定向的递送。
因此，在该领域中，急需使用人或人源化的CAR治疗癌症的组合物和方法以及治疗性双特异性抗体的定向递送。本发明满足了该未满足的需求。
发明内容
本发明提供了分离的核酸序列，该序列包括编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，其中该CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合。
在一个实施方式中，编码CAR的分离的核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个实施方式中，该抗原结合片段是Fab或scFv。
在一个实施方式中，该抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
在一个实施方式中，该肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关联。
在一个实施方式中，该肿瘤抗原与实体瘤相关联。
在一个实施方式中，该肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR和其任意组合。
在一个实施方式中，该CAR进一步包括共刺激信号传导区，其包括选自下列的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任意组合。
在一个实施方式中，编码CAR的分离的核酸序列包括编码双特异性抗体的序列。
在一个实施方式中，编码该双特异性抗体的核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和其任意组合。
在一个实施方式中，该双特异性抗体包括人抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，该双特异性抗体包括人源化抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了包括核酸序列的细胞，该核酸序列包括编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，其中该CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合。
在一个实施方式中，该细胞是T细胞。
在一个实施方式中，当抗原结合结构域结合至其相应的抗原时，该细胞表现抗肿瘤免疫性。
本发明提供了用于刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中该CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答。
本发明提供了用于刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中该CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答。
本发明提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，该方法包括给该哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中该CAR包 括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而在该哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。
本发明提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中该CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而在该哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。
本发明提供了治疗具有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中该CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而治疗该哺乳动物。
本发明提供了治疗具有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中该CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而治疗该哺乳动物。
本发明提供了治疗具有癌症的人的方法，该方法包括给人施用基因工程化以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中该CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，其中该细胞为T细胞。
本发明提供了治疗具有癌症的人的方法，该方法包括给人施用基因工程化以表达CAR的细胞，其中该CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中该抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，其中该细胞为T细胞。
本发明提供了编码双特异性抗体的分离的核酸序列，其中该核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
本发明提供了包括编码双特异性抗体的核酸序列的细胞，其中该核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
本发明提供了用于刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达双特异性抗体的细胞。
本发明提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达双特异性抗体的细胞。
本发明提供了治疗具有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达双特异性抗体的细胞。
本发明提供了治疗具有癌症的人的方法，该方法包括给人施用基因工程化以表达双特异性抗体的细胞。
在一个实施方式中，该基因工程化的细胞是自体T细胞。
在一个实施方式中，该细胞分泌双特异性抗体。
附图简述
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明以下的优选实施方式的详细描述。为了说明本发明的目的，以附图示出目前优选的实施方式。然而，应该理解本发明并不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
图1描绘了RNA构建体的矢量图。Blinatumomab(pGEM-Blina.64A)、具有4-1BB-ζ信号传导结构域针对人CD19完全人Ab 21D4(pGEM.D4(CD19).BBZ.64A)、人源化的HB12B(pGEM.12B(CD19).BBZ.64A)和源自Blinatumomab的小鼠源CD19scFv(pGEM.Blina.19BBZ.64A)的CAR的体外转录(IVT)矢量图。
图2是描绘用于测试Blina RNA电穿孔的CD19CAR T细胞的实验设计的图表。在第10天，受激的T细胞(来自ND200)按照指示进行电穿孔。EP#1使用10μg FCM63CD19BBZ RNA，EP#2使用5μg FCM63CD19BBZ RNA，EP#3使用5μg FCM63CD19BBZ加10μg Blina RNA，EP#4使用10μg Blina RNA和EP#5使用5μg GFP RNA。#12是不进行电穿孔的T细胞。电穿孔后，立即按照指示将相等体积(1ml)的电穿孔T细胞的等分试样合并为#6至#8。电穿孔后十五小时，按照指示将电穿孔细胞的另一等分试样(1ml)合并为#9到#11，随后该细胞进行FACS染色以进行CAR检测、CD107a测定和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定。
图3是一系列图表，其描绘CD19CAR、Blina RNA电穿孔的T细胞和与Blina RNA电穿孔的T细胞一起温育的GFP RNA电穿孔的T细胞的CAR染色。电穿孔后15小时，所有如图2所示处理的T细胞用山羊抗小鼠Fab染色。每个标绘上方所示数字是图2中所列出的条件。结果显示不仅CD19CAR RNA电穿孔的T细胞可以进行CAR表达的染色，而且Blina bis-RNA单独电穿孔的T细胞(#4)和与已经用Blina bis-RNA(#7、#8、#10、#11)电穿孔的T细胞共同温育的GFP RNA 电穿孔的T细胞也可以被染色。这表明由Blina电穿孔的T细胞所分泌的CD19-CD3双特异性抗体可以结合GFP电穿孔的T细胞的CD3。
图4是一系列图表，其描绘说明用Blina bis-RNA“BITE”电穿孔的T细胞可特异性识别肿瘤的实验结果。电穿孔后15小时，T细胞进行CD107a脱粒测定。电穿孔后15小时，如图2所示的所有条件下的T细胞与表达CD19的不同类型细胞(Nalm6、K562-CD19和Raji)或CD19阴性肿瘤K562进行共培养。每个标绘上方所示数字是在图2中所列出的条件。结果证明用Blina bis-RNA电穿孔的T细胞特异性地识别CD19阳性肿瘤。
图5是一系列图表，其描绘证明用Blina“BITE”双特异性抗CD19/CD3RNA电穿孔的T细胞可以使非肿瘤反应性的GFP RNA电穿孔的T细胞实现特异性地识别肿瘤的实验结果。电穿孔后15小时，如图2所示的所有条件下的T细胞与表达CD19的不同细胞(Nalm6、K562-CD19和Raji)或CD19阴性肿瘤K562进行共培养用于CD107a脱粒测定。每个标绘上方所示数字是图2中所列出的条件。结果显示用Blina bis-RNA电穿孔的T细胞特异性地识别肿瘤。结果显示用Blina bis-RNA电穿孔的T细胞可以使非肿瘤反应性的GFP RNA电穿孔的“旁观”T细胞实现特异性识别肿瘤(#7、#8、#10、#11)。CD8+T细胞被设门(gate)。
图6是图表，其描绘说明用Blina bis-RNA电穿孔的T细胞特异性地杀死CD19抗原表达细胞的实验结果。电穿孔后15小时，在基于流式CTL测定中，使用K562-CD19-CFSE/K562-meso-CMRA作为靶细胞，测试图2所示所有条件下的T细胞的溶解活性。示出的用于电穿孔T细胞的每个条件的数字是图2中所列出的数字。结果显示Blina双特异性抗CD19/抗CD3RNA和CD19CAR RNA的共电穿孔可以进一步增强T细胞的杀伤活性(#3对#2)。向CD19CAR RNA电穿孔的T细胞加入等量非肿瘤反应性的GFP电穿孔的T细胞通过减少E:T比降低了CD19CAR表达T细胞的杀伤能力，而向Blina bis-RNA电穿孔的T细胞(#7、#8、#10、#11)加入等量非肿瘤反应性的GFP电穿孔的T细胞可以保持其与未稀释组(#3和#4)相等的T细胞杀伤活性，这表明Blina bis-RNA电穿孔的T细胞分泌的抗CD19/抗CD3双特异性抗体可与GFP RNA电穿孔的T细胞结合，并有效地杀死靶细胞，从而有效地保持E:T比。
图7是一系列图表，其描绘对新CD19CAR RNA电穿孔RNA的CAR表达的染色。按照指示，T细胞电穿孔后15小时，显现出新构建的CD19CAR的表达。使用两种不同的抗IgG Fab：使用抗mIgG Fab对小鼠源CAR进行染色，使用抗hIgG Fab对人源CAR进行染色。
图8是一系列图表，其描绘说明来自完全人抗体12D4的CD19CAR和人源化HB12B都特异性识别CD19阳性肿瘤的实验结果。电穿孔后15小时，按照指示将电穿孔的T细胞与两个CD19阳性肿瘤系(K562-CD19或Raji)以及一个CD19阴性系U266B1进行共培养用于CD107a脱粒测定。与目前使用的FMC63CD19 CAR(10OF)相比，来自完全人抗体12D4的CD19CAR和人源化HB12B都特异性地识别CD19阳性肿瘤。
图9包括图9A和图9B，是一系列图表，其描绘说明与用CD19CAR RNA电穿孔的T细胞相比，单独使用Blina Bis-RNA电穿孔的T细胞更加敏感并且显示了更持久的抗肿瘤活性的实验结果。用1μg、5μg或10μg的Blina bis-RNA电穿孔的T细胞与用10μg的CD19BBZ(19OF)RNA电穿孔的T细胞进行比较。在电穿孔后数日，在用CD19+细胞系(Naln6、K562-CD19或Raji细胞)或用CD19阴性细胞系K562作为对照刺激那些T细胞后，进行CD107a测定。图9A分别显示了在第3天、第8天和第12天的CD107a表达。图9B显示电穿孔后不同天数下CD107a的平均荧光强度(MFI)和表达百分比。图9B表明与CAR RNA T细胞相比，CD19-CD3(Blina)RNA电穿孔的T细胞的灵敏度更高和在体外功能持久性方面更持久。
图10是一系列图表，其描绘说明用含有人CD19scFv(Blina-D4)的bis-RNA电穿孔的T细胞与用Blina bis-RNA的T细胞功能相同的实验结果。T细胞使用10μg或20μg的Blina-D4Bis-RNA，或使用10μg的Blina Bis-RNA电穿孔并进行CAR染色(抗-小鼠IgG Fab)，上图(电穿孔后1天)和Cd107a染色(下图)。
图11包括图11A和图11B，是一系列图表，其描绘说明用对间皮素、cMet或PSCA的Bis-RNA电穿孔的T细胞与用CAR RNA电穿孔的T细胞功能相同的实验结果。使用10μg的ss1HL-Blina、或ss1LH-Blina、或cMet-Blina、或PSCA-Blina或GD2-Blina的Bis-RNA电穿孔的T细胞，与使用10μg的ss1BBZ(ss1.OF)、或cMetBBZ、或PSCA.BBZ或GD2.BBZ CAR RNA电穿孔的T细胞进行比较。图11A描绘了电穿孔后1天的细胞的CAR染色(抗-小鼠IgG Fab)的结果(注意，cMet CAR是人源scFv)。图11B描绘Cd107a染色的结果(CD8+设门)。
具体实施方式
本发明涉及治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于血液恶性肿瘤和实体瘤。本发明涉及被修饰以表达双特异性抗体的T细胞的过继细胞转移的策略。在另一个实施方式中，本发明涉及被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继细胞转移。
在一个实施方式中，该T细胞被修饰以表达双特异性抗体。双特异性抗体包括两种不同的结合特异性，因此与两种不同的抗原结合。在一个实施方式中，该双特异性抗体包括与第一抗原结合的第一抗原识别结构域和与第二抗原结合的第二抗原识别结构域。在一个实施方式中，该第一抗原识别结构域与肿瘤相关抗原结合。在一个实施方式中，第二抗原识别区与T细胞上的抗原结合。在具体实施方式中，该第二抗原识别区与T细胞上的CD3结合。在一个实施方式中，本发明涉及被修饰以表达人或人源化双特异性抗体的T细胞的过继细胞转移。
在一个实施方式中，该T细胞被修饰以表达CAR。CAR是结合了基于抗体对期 望抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性以及T细胞受体活化的细胞内结构域，以产生表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。在一个实施方式中，本发明涉及被修饰以表达人或人源化CAR的T细胞的过继细胞转移。
在另一个实施方式中，本发明涉及被修饰以表达双特异性抗体和嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继细胞转移。
本发明通常涉及被基因修饰以表达期望CAR的T细胞的应用，以及被基因修饰以表达期望CAR连同期望双特异性抗体的T细胞的应用。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。优选地，该细胞可以被基因修饰以在其表面上表达抗体结合结构域，赋予新的MHC独立的抗原特异性。在一些实例中，该T细胞被基因修饰以表达CAR，该CAR结合特异性抗体的抗原识别结构域和CD3-ζ链或FcγRI蛋白的胞内结构域成为单个嵌合蛋白。在一些实例中，该CAR T细胞被基因修饰以表达CAR以及双特异性抗体，该CAR结合特异性抗体的抗原识别结构域和该CD3-ζ链或FcγRI蛋白的细胞内结构域成为单个嵌合蛋白。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。在一个实施方式中，该CAR可包括人源化抗体或其片段。在一个实施方式中，该CAR可包括人抗体或其片段。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一个实施方式中，可选择跨膜结构域，或可由氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合体的其他成员的相互作用。在一些实施方式中，该胞外结构域还包括铰链结构域。优选地，铰链结构域包括CD8α铰链结构域。
对于胞浆结构域，本发明的CAR可被设计以包括在本发明的CAR的内容中有用的任何期望的胞浆结构域(一个或多个)。在一个实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以进一步包括CD3-ζ、4-1BB和/或CD28的信号传导结构域。例如，CAR的胞浆结构域可包括但不限于CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导模块和其组合。因此，本发明提供了CAR T细胞和它们用于过继治疗的方法。
在一个实施方式中，T细胞被修饰以表达双特异性抗体连同CAR。在一个实施方式中，双特异性抗体和CAR的共同表达改善了肿瘤识别和肿瘤溶解。
在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中引入包括期望双特异性抗体的慢病毒载体来生成。在一个实施方式中，本发明的修饰T的细胞可以通过向T细胞中引入包括期望CAR——例如包括抗CD19、CD8α铰链和CD3ζ信号传导结构域的CAR——的慢病毒载体来生成。在一个实施方式中，本发明的修饰T的细胞可以通过向T细胞中引入包括期望双特异性抗体的慢病毒载体连同包括期望CAR的慢病毒载体来生成。在另一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中引入包括期望CAR——例如包括抗CD19、CD8α铰链和CD3ζ信号传导结构域的CAR——和期望双特异性抗体的慢病毒载体来生成。 在一个实施方式中，本发明的修饰T细胞能够在体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中转染编码期望双特异性抗体的RNA来生成。在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中转染编码期望CAR——例如包括抗CD19、CD8α铰链和CD3ζ信号传导结构域的CAR——的RNA来生成。在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中转染编码期望双特异性抗体的RNA连同编码期望CAR的RNA来生成。在另一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中转染编码期望CAR——例如包括抗CD19、CD8α铰链和CD3ζ信号传导结构域的CAR——并进一步编码期望双特异性抗体的RNA来生成。在一个实施方式中，CAR和双特异性抗体二者都在基因修饰的T细胞中瞬时表达。
在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中转染编码期望CAR——例如包括抗CD19、CD8α铰链和CD3ζ信号传导结构域的CAR——的RNA，并且引入包括期望双特异性抗体的慢病毒载体来生成。在另一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞可以通过向T细胞中引入包括期望CAR——例如包括抗CD19、CD8α铰链和CD3ζ信号传导结构域的CAR——的慢病毒载体，并且向该细胞中转染编码期望双特异性抗体的RNA来生成。
在一个实施方式中，本发明涉及利用淋巴细胞注入施用表达人源化双特异性抗体、人源化CAR、或其组合的基因修饰的T细胞，用于治疗具有癌症或处于具有癌症风险下的患者。在另一个实施方式中，本发明涉及利用淋巴细胞注入施用表达双特异性抗体、CAR、或其组合的基因修饰的T细胞，用于治疗具有癌症或处于具有癌症风险下的患者。优选地，自体淋巴细胞注入用于治疗。自体PBMC从需要治疗的患者收集，和T细胞利用本文描述和本领域已知的方法进行活化和增殖，并且随后注入返回患者。
在一个实施方式中，本发明涉及包括人或人源化抗体、或其片段的CAR。在一个实施方式中，本发明涉及包括人或人源化抗体、或其片段的双特异性抗体。本发明基于以下发现：源自人或人源化抗体的构建体特异性识别肿瘤抗原。因此，这样的人或人源化构建体可以用于治疗癌症和其他紊乱，并且避免诱发免疫应答的风险。
在一个实施方式中，本发明涉及表达CAR和双特异性抗体的基因修饰的T细胞。本发明基于以下发现：CAR和双特异性抗体的共表达显著提高肿瘤反应性和肿瘤溶解。进一步，诱导T细胞产生CAR和双特异性抗体募集非反应性的T细胞成为肿瘤反应性的。这允许利用T细胞局部化抗肿瘤药剂递送至特定肿瘤微环境的方法。在一个实施方式中，CAR T细胞将双特异性抗体运输到肿瘤部位，从而降低了与双特异性抗体全身递送相关的毒性。
在一个实施方式中，本发明涉及表达双特异性抗体的基因修饰的T细胞。本 发明部分地基于以下发现：被修饰以表达双特异性抗体的T细胞与被修饰以表达CAR的T细胞性能相同。
在又另一个实施方案中，本发明通常涉及处于发展癌症风险下的患者的治疗。本发明也包括治疗恶性肿瘤或自身免疫疾病，其中患者的化疗和/或免疫疗法产生患者的显著免疫抑制，由此增加患者发展癌症的风险。
本发明包括使用表达抗CD19CAR和双特异性抗体的T细胞。在一个实施方式中，与仅表达抗CD19CAR的T细胞相比，本发明的表达抗CD19CAR和双特异性抗体的T细胞显示了提高的肿瘤识别和肿瘤溶解活性。在一些实例中，本发明的注入患者的修饰的T细胞可消除具有癌症患者体内的癌细胞。但是，本发明不限于表达CAR的T细胞。相反地，本发明包括与选自下列的一种或多种细胞内结构域融合的任何抗原结合结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和其任意组合。
定义
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本文使用冠词“一个(a)”和“一个(an)”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，和还要更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫应答部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
“双特异性抗体”，如本文所用的，指的是对至少两种不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方式中，表位来自相同的抗原。在另一个实施方式中，表位来自两种不同的抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，可以利用共表达两个免疫球蛋白重链/轻链对来重组地产生双特异性抗体。参见，例如，Milstein等(1983)Nature 305:537-39。可选地，双特异性抗体可使用化学键合来制备。参见，例如，Brennan等(1985)，Science 229:81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如，Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48，Gruber等(1994)J.Immunol.152:5368。
如本文所用的术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如，例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和广泛公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子，该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是，本发明包括但不限于多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是，抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
如本文所用的术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。
根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统识别为外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
“同种异基因的(allogeneic)”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的(xenogeneic)”指的是源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合体与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病(disease)”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“紊乱(disorder)”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不必定引起动物健康状态的进一步降低。
如本文所用的“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。
“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常在序列表中提供的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用的“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用的，术语“外源的”指的是从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
如本文所用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初 级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
如本文所用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加至包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。
在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某一版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用的“慢病毒”指的是反转录病毒科的属。在反转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是所有慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。
如本文所用的术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象——优选人——的有益的治疗性应答。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA 序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定来确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCR等等克隆核酸序列，和通过合成手段。
如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可包括蛋白质或肽的序列的最大数目的氨基酸没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别，或引导合成机器的DNA序列。
如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。例如，启动子/调节序列可为以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子为核苷酸序列，当其与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子为核苷酸序列，当其与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，当其与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。
术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合体的信号转导——诱导的初级应答。刺激可介导一些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文所用的“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子。
术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可交换使用，并意欲包括在其内可引起免疫应答的活有机体(例如，哺乳动物)。对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
如本文所用的“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然发生状态中与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与在其天然状态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。
如本文所用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾病状 态的抑制、缓和或根除获得。
术语“治疗上有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗上有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗上有效量将根据化合物、疾病和其严重性以及待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。
如本文所用的短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
“载体”为物质的组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体等等。
范围：在该公开中，本发明的多个方面可以以范围形式示出。应当理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从1至6的描述应被考虑为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
说明
本发明提供了治疗癌症以及其他疾病的组合物和方法。该癌症可为血液恶性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。利用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。
在一个实施方式中，本发明提供了工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞显示抗肿瘤性质。在优选的实施方式中，CAR是人源化CAR。 本发明的CAR可被工程化以包括胞外结构域，所述胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合体ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性重定向(redirect)抗原识别。示例性抗原为CD19，因为该抗原在B细胞淋巴瘤上表达。然而，本发明不限于靶向CD19。相反地，本发明包括任何抗原结合结构域，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷(tumor burden)缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合的一个或多个细胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明提供被工程化以表达双特异性抗体的T细胞。在一个实施方式中，双特异性抗体包括人抗体或其片段。在一个实施方式中，双特异性抗体包括人源化抗体或其片段。双特异性抗体包括两种不同的结合特异性。在一个实施方式中，双特异性抗体包括与肿瘤抗原结合的区域。在一个实施方式中，双特异性抗体包括与T细胞抗原结合的区域。例如，在一个实施方式中，双特异性抗体与CD3结合。
在一个实施方式中，本发明提供被工程化以表达CAR和双特异性抗体的T细胞。在一些实施方式中，CAR是人源化CAR。在一些实施方式中，双特异性抗体识别与CAR所识别的相同抗原。在其他实施方式中，双特异性抗体识别不同的抗原。本发明基于以下发现：被修饰以表达CAR和双特异性抗体二者的T细胞显示提高的肿瘤识别和肿瘤溶解活性。而且，CAR和双特异性抗体的共表达或共引入使非反应性T细胞成为肿瘤反应性的。因此，本发明提供了双特异性抗体至肿瘤微环境的特异性递送，从而减轻与双特异性抗体的全身递送相关的毒性。
在一些实施方式中，本发明涉及被稳定地整合到T细胞并在其中稳定地表达的编码CAR和/或双特异性抗体的反转录病毒或慢病毒载体。在其他实施方式中，本发明涉及被转染到T细胞中并在其中瞬间表达的编码CAR和/或双特异性抗体的RNA。CAR和双特异性抗体在细胞中短暂的、非整合性的表达减轻与在细胞中的永久性和整合性表达相关的担忧。
在一些实施方式中，本发明包括引入双特异性抗体连同CD19CAR，以便提高CAR工程化的T细胞的抗肿瘤活性。在一个实施方式中，双特异性抗体是RNA形式的。在另一个实施方式中，CD19CAR是RNA形式的。在另外一个实施方式中，双特异性抗体和CD19CAR是RNA形式的。
在一个实施方式中，连同CD19CAR引入双特异性抗体RNA增强了CAR工程化的T细胞的抗肿瘤活性。进一步，向T细胞中引入双特异性抗体RNA募集非肿瘤反应性T细胞成为肿瘤反应性的，这提供了通过使用T细胞向癌症患者中递送和运输抗肿瘤药物的新方式。通过借助携带货物(BiTE)至肿瘤部位的CAR T 细胞集中将双特异性抗体递送至肿瘤微环境，这减少了全身BiTE的毒性。
组合物
本发明提供了包括胞外结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，本发明的CAR是人源化的。胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合结构域。在一些实施方式中，胞外结构域还包括铰链结构域。细胞内结构域或另外的胞浆结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
本发明包括可被直接转导至细胞中的表达CAR的反转录病毒和慢病毒载体构建体。本发明还包括可被直接转染至细胞中的RNA构建体。生成用于转染的mRNA的方法涉及用具体设计的引物体外转录(IVT)模板，随后是聚腺苷酸添加，以产生构建体，其包含3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达基因和聚腺苷酸尾部，典型地50-2000碱基长度。如此产生的RNA可有效转染不同类型的细胞。在一个实施方式中，该模板包括用于CAR的序列。
优选地，CAR包括胞外结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。胞外结构域和跨膜结构域可以从这类结构域的任何期望来源获得。在一些实例中，本发明的CAR的铰链结构域包括CD8α铰链结构域。在一个实施方式中，CAR包括SEQ ID NO:20-23的任何一个的核酸序列。在一个实施方式中，CAR包括由SEQ ID NO:20-23的任何一个的核酸序列编码的氨基酸序列。
抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的CAR包括另外被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
在一个实施方式中，本发明的CAR可经由工程化特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合结构域而被工程化，以便靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性紊乱(hyperporoliferative disorder)抗原”或“与过度增生性紊乱相关的抗原”指的是对于特定过度增生性紊乱诸如癌症共同的抗 原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且进一步的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。
肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合结构域的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP 100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的靶标。
本发明中提及的该类型的肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以更高的水平进行表达。
TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、 nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在优选的实施方式中，CAR的抗原结合结构域部分靶向如此抗原，所述抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等等。
取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程化以包括对期望抗原靶标特异性的适当的抗原结合部分。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则CD19的抗体可用作抗原结合部分，并入本发明的CAR。在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域部分靶向CD19。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体和其片段。在一些实例中，对于抗原结合结构域，源自CAR最终将使用的同一物种是有益的。例如，对于在人类中的使用，对于CAR的抗原结合结构域，包括人抗体或其片段可以是有益的。因此，在一个实施方式中，抗原结合结构域部分包括人抗体或其片段。例如，SEQ ID NO:20的抗原结合结构域在来源方面是完全来自人的。
对于在人体内使用抗体，可优选使用人抗体。完全地人抗体对于人类对象的治疗处理是特别期望的。人抗体可通过多种本领域已知的方法制备，所述方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741；以上每一篇都以其全文通过引用并入本文。人抗体还可以是其中重链和轻链都由源自一个或多个人DNA来源的核苷酸序列编码的抗体。
人抗体还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可以被随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区和多变区也可被引入小鼠胚胎干细胞。通过同源重组，可单独地或与引入人免疫球蛋白基因座同时，使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能性。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致内源抗体产生的完全抑制。修饰的胚胎干细胞被增殖并微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常的方式利用选择的抗原——例如本发明多肽的所有或部分——进行免疫。针对人CD19抗原的抗CD19抗体可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转 基因小鼠获得。转基因小鼠聚藏(harbor)的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体，包括但不限于IgG1(γ-1)和IgG3。对于该技术用于产生人抗体的概述，参见Lonberg和Huszar(Int.Rev.Immunol.，13:65-93(1995))。对于该技术用于产生人抗体和人单克隆抗体及用于生产此类抗体的方案的详细讨论，参见，例如，PCT公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其中的每一篇都通过引用以其全文并入本文。另外，可以与企业诸如Abgenix公司(弗里蒙特，加州)(Freemont,Calif.)和Genpharm(圣何塞，加利福尼亚州)(San Jose,Calif.)签订合同使用与上述类似的技术提供针对所选抗原的人抗体。对于在种系突变小鼠体内转移人类种系免疫球蛋白基因阵列在抗原攻击后导致产生人抗体的具体讨论见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362:255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.，7:33(1993)；和Duchosal等，Nature，355:258(1992)。
人抗体也可以源自噬菌体展示库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech.，14:309(1996))。噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature，348:552-553(1990))可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全集体外生产人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因框内克隆进入丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要的外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码显示那些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模仿了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行；对于其综述，参见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology3:564-571(1993)。数种来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature，352:624-628(1991)从源自未免疫小鼠脾脏的V基因的小型随机组合库中分离出的抗唑酮抗体的多样化阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因全集，并且多样化抗原阵列(包括自身抗原)的抗体可以基本上遵循下列描述的技术进行分离：Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.，12:725-734(1993)。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905，其中的每一篇都通过引用以其全文并入本文。
人抗体也可以通过体外活化的B细胞生成(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275，其中每一篇都以其全文通过引用并入本文)。人抗体也可以使用杂交瘤技术体外生成，诸如，但不限于，如Roder等(Methods Enzymol.，121:140-167(1986))所描述。
可选地，在一些实施方式中，非人抗体是人源化的，其中抗体的特异性序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体的相似性。在一个实施方式中，抗原结合结构域部分是人源化的。例如，SEQ ID NO:21的抗原结合结构域是人源化的。
人源化抗体可使用多种本领域已知的技术产生，包括但不限于，CDR移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其中每一篇都以其全文通过引用并入本文)、贴面(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号EP 592106和EP 519596；Padlan，1991，Molecular Immunology，28(4/5):489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering，7(6):805-814；和Roguska等，1994，PNAS，91:969-973，其中每一篇都以其全文通过引用并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利号5,565,332，其以其全文通过引用并入本文)和在下述中公开的技术：例如，美国专利申请公开号US 2005/0042664，美国专利申请公开号US 2005/0048617，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan等，J.Immunol.，169:1119-25(2002)，Caldas等，Protein Eng.，13(5):353-60(2000)，Morea等，Methods，20(3):267-79(2000)，Baca等，J.Biol.Chem.，272(16):10678-84(1997)，Roguska等，Protein Eng.，9(10):895-904(1996)，Couto等，Cancer Res.，55(23副刊)：5973s-5977s(1995)，Couto等，Cancer Res.，55(8):1717-22(1995)，Sandhu J S，Gene，150(2):409-10(1994)和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235(3):959-73(1994)，其中每一篇都以其全文通过引用并入本文。通常，在构架区中的构架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选地改进抗原结合。这些构架取代通过本领域公知的方法进行确定，例如，通过对CDR和构架残基的相互作用建模，以确定对抗原结合重要的构架残基，和通过序列比较以确定在特定位置处的异常(unusual)构架残基。(参见，例如，Queen等，美国专利号5,585,089；和Riechmann等，1988，Nature，332:323，其都以其全文通过引用并入本文。)
人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。因此，人源化抗体包括一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR和来自人类的构架区。抗体的人源化是本领域公知的并且可基本上遵循Winter和合作者的方法进行(Jones等，Nature，321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536(1988))，这通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代相应的人抗体序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容都以其全文通过引用并入本文)。在这样的人源化嵌合抗体中，充分少于完整人的可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人抗体。抗体的人源化也可以通过贴面或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology，28(4/5):489-498；Studnicka等，Protein Engineering，7(6):805-814(1994)；和Roguska等，PNAS，91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，其内容都以其全文通过引用并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域——轻链和重链二者——的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”法，啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知人可变结构域序列的整个库进行筛选。最接近于啮齿动物的人序列接受作为用于人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，J.Immunol.，151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196:901(1987)，其内容都以其全文通过引用并入本文)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151:2623(1993)，其内容都以其全文通过引用并入本文)。
抗体可被人源化，其中保留对靶抗原的高亲和力以及其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的并且为本领域的技术人员所熟悉。可用图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些显示允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用的分析，即对影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基的分析。以这种方式，FR残基可以从受体和输入序列中被选择并组合，从而实现期望的抗体特征，例如对靶抗原增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性，即，在本发明中，结合人CD19抗原的能力。然而，使用人源化的某些方法时，使用“定向进化”的方法可增加抗体对人CD19抗原的结合亲和力和/或特异性，如Wu等，J.Mol.Biol.，294:151(1999)所描述的，其内容以其全文通过引用并入本文。
跨膜结构域
对于跨膜结构域，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合体的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS(即至少包括上述中的跨膜 区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和胞浆信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
胞浆结构域
本发明的CAR的胞浆结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
已知通过TCR单独生成的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可据说由两个不同类的胞浆信号传导序列介导：通过TCR(初级胞浆信号传导序列)开始抗原-依赖性初级活化的那些和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级胞浆信号传导序列)的那些。
初级胞浆信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合体的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
包含在本发明中具有具体用途的初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的胞浆信号传导分子包括源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3-ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、 CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件示例，但其他共刺激元件也位于本发明的范围内。
本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
双特异性抗体
本发明还提供了双特异性抗体。双特异性抗体包括两种不同的结合特异性，并且因此与两种不同的抗原结合。在一个实施方式中，双特异性抗体包括结合第一抗原的第一抗原识别结构域和结合第二抗原的第二抗原识别结构域。在一个实施方式中，第一抗原识别结构域与肿瘤相关抗原结合。如本文其他地方所描述的，双特异性抗体可以识别通过本发明的CAR识别的相同或不同的肿瘤抗原。在一个实施方式中，第二抗原识别区与T细胞抗原结合。例如，双特异性抗体可以识别CD3。在一些实例中，识别T细胞抗原的双特异性抗体被称为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。示例性的BiTE是Blinatumomab(从Amgen可获得)，其包括抗CD19结构域和抗CD3结构域。Blinatumomab(Blina)由SEQ ID NO:1的核酸序列编码。然而，本发明不被使用任何特定的双特异性抗体所限制。相反地，可以使用任何双特异性抗体或BiTE。肿瘤相关抗原的实例在本文中其他地方描述，其所有都可以被本发明的双特异性抗体靶向。在一个实施方式中，双特异性抗体包括人抗体、人源化抗体或其片段。制备人和人源化抗体的技术在本文其他地方描述。
用于制备双特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J 10:3655(1991))和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下制备：工程化用于制备Fc-异二聚体分子抗体的静电转向效应(electrostatic steering effect)(WO 2009/089004 A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等，Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如，Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994))；及制备三特异性抗体，例如在Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)中描述的。具有三个或更多个功能性抗原结合 位点的工程化的抗体——包括“章鱼抗体”——也包括在本文中(见，例如US2006/0025576A1)。双特异性抗体可通过连接两个不同的抗体或其部分构建。例如，双特异性抗体可包括来自两个不同抗体的Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和sdAb。
载体
本发明包括包含CAR序列的核酸构建体，其中该序列包括可操作地连接至细胞内结构域的核酸序列的抗原结合结构域的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的细胞内结构域。在一些例子中，CAR可包括CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的任何组合。本发明还包括包含双特异性抗体序列的核酸构建体。本发明进一步包括包含CAR序列的核酸构建体，其中该序列包括可操作地连接至细胞内结构域的核酸序列的抗原结合结构域的核酸序列，并且其中核酸构建体也包括双特异性抗体的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括抗CD19抗原结合结构域、人CD8铰链和CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:20-23之一中列出的核酸序列。
在一个实施方式中，抗体的双特异性抗体包括SEQ ID NO:1-19之一中列出的核酸序列。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如，例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而不被克隆。
本发明也提供了其中插入本发明的核酸的载体。源于反转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖(propagation)。慢病毒载体具有超过源自致癌反转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。参见，例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用以其全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载 体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，反转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入反转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管近来已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加以隔开50bp，活性才开始下降。这取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单 独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在核酸已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5′侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见，例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是反转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液 中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以以具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构为特征。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等，1991Glycobiology 5：505-10)。然而，也包括与正常的囊泡结构相比具有溶液中的不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合体。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞的方法，或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，以便证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
RNA转染
在一个实施方式中，本发明的基因修饰的T细胞通过引入RNA进行修饰。在一个实施方式中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染形式引入细胞。在另一个实施方式中，RNA CAR连同编码双特异性抗体的体外转录的RNA被引入。使用聚合酶链式反应(PCR)-生成的模板通过体外转录产生RNA。来自任何来源的感兴趣的DNA可通过PCR直接转化成使用适当的引物和RNA聚合酶的体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他适当的DNA来源。体外转录的期望模板是本发明的CAR和/或双特异性抗体。以举例的方式，模板包括包含抗肿瘤抗体的单链可变结构域的胞外结构域；包括CD8a的铰链和跨膜结构域的跨膜结构域；和包括CD3-ζ信号传导结构域的胞浆结构域。通过另一个举例的方式，模板包括双特 异性抗体。通过另一个举例的方式，模板包括包含抗肿瘤抗体的单链可变结构域的胞外结构域；包括CD8a的铰链和跨膜结构域的跨膜结构域；和包括CD3-ζ信号传导结构域的胞浆结构域，和双特异性抗体。在一个实施方式中，用于RNA-CAR的模板是SEQ ID NO:20-23之一。在一个实施方式中，用于编码双特异性抗体的RNA的模板是SEQ ID NO:1-19之一。
在一个实施方式中，待用于PCR的DNA包含开放阅读框。DNA可来自天然发生的来自生物体基因组的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是感兴趣的基因部分的全长基因。基因可包括一些或所有的5'和/或3'非翻译区域(UTR)。基因可包括外显子和内含子。在一个实施方式中，待用于PCR的DNA是人基因。在另一实施方式中，待用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。DNA可以可选地是在天然发生的生物体中不通常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是包含连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可来自单个生物体或来自多于一个生物体。
可用作用于PCR的DNA来源的基因包括编码为生物体提供治疗性或预防性作用或可用于诊断生物体中疾病或紊乱的多肽的基因。优选的基因是用于短期治疗或其中有关于剂量或表达基因的安全性担忧的基因。例如，对于癌症、自身免疫紊乱、寄生、病毒、细菌、真菌或其他感染的治疗，待表达的转基因(一个或多个)可编码作为免疫系统的细胞的配体或受体起作用，或对刺激或抑制生物体的免疫系统起作用的多肽。在一些实施方式中，不期望具有免疫系统的延长的继续刺激，也不必产生成功治疗之后持续的改变，因为这可然后引起新的问题。对于自身免疫紊乱的治疗，可期望在疾病突发(flare-up)期间抑制或压制免疫系统，但不是长期地，否则可使得患者对感染变得过度敏感。
PCR用于生成体外转录用于转染的mRNA的模板。本领域熟知实施PCR的方法。用于PCR的引物设计为具有与待用作PCR的模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所使用的“基本上互补”指引物序列中大部分或所有的碱基是互补的，或一个或更多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补序列能够与期望DNA靶在用于PCR的退火条件下退火或杂交。引物可设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可设计为扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。引物也可设计为扩增编码感兴趣的具体结构域的基因部分。在一个实施方式中，引物设计为扩增包括所有或部分5'和3'UTR的人cDNA的编码区域。通过本领域熟知的合成方法生成用于PCR的引物。“正向引物”是包含与待扩增DNA序列上游的DNA模板上核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“上游”指相对于编码链待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是包含与在待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指相对于编码链待扩增的DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶是商 业上从许多来源可获得的。
也可使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在零和3000个核苷酸之间。待添加至编码区域的5'和3'UTR序列的长度可通过不同方法改变，包括但不限于设计用于PCR的引物，其与UTR的不同区域退火。使用该方法，本领域技术人员可修改实现转染转录RNA后最佳翻译效率需要的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是感兴趣基因的天然发生的内源性5'和3'UTR。可选地，可通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰添加对感兴趣基因非内源性的UTR序列。使用对感兴趣基因非内源性的UTR序列可用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富AU元件可使mRNA的稳定性下降。所以，3'UTR可被选择或设计为基于本领域熟知的UTR的性质增加转录RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可包含内源基因的Kozak序列。可选地，当通过如上述的PCR添加对感兴趣基因非内源性的5'UTR时，可通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA转录体的翻译效率，但是好像不是实现所有RNA有效翻译必须的。对于许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施方式中，5'UTR可源自RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物可用于3'或5'UTR，以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，转录的启动子应在待转录序列上游附连至DNA模板。当作为RNA聚合酶的启动子起作用的序列添加至正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子在待转录的开放阅读框上游并入PCR产物。在一个优选的实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方描述的。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选的实施方式中，mRNA具有5'端的帽和3'聚腺苷酸尾部，其在细胞中确定核糖体结合、翻译的起始和mRNA的稳定性。在圆形DNA模板，例如，质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的不适于在真核细胞中表达的多联体(concatameric)产物。在3'UTR端处线性化的质粒DNA的转录产生正常尺寸的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录之后多腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可使转录体的3'端延伸超过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.，270:1485-65(2003)。
将聚A/T一段序列(stretch)整合至DNA模板的常规方法是分子克隆。但是，整合至质粒DNA的聚A/T序列可造成质粒不稳定，这是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板通常被缺失和其他畸变高度污染。这使得克隆程序不仅费力并且耗 时，而且通常不可靠。这是为什么使得构造具有聚A/T 3'一段序列的DNA模板而没有克隆的方法是高度期望的。
转录DNA模板的聚A/T区段可在PCR期间通过使用包含聚胸苷尾部(polyTtail)的反向引物产生，比如100个T尾部(尺寸可为50-5000T)，或在PCR之后通过任何其他方法，包括但不限于DNA连接或体外重组产生。聚腺苷酸尾部也为RNA提供稳定性并且减少它们的降解。通常，聚腺苷酸尾部的长度与转录RNA的稳定性正相关。在一个实施方式中，聚腺苷酸尾部在100和5000个腺苷之间。
RNA的聚腺苷酸尾部可进一步在体外转录之后使用聚腺苷酸聚合酶，比如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP)延伸。在一种实施方式中，使聚腺苷酸尾部的长度从100个核苷酸增加至300和400个核苷酸之间导致RNA的翻译效率增加大约两倍。另外地，不同的化学基团附连至3'端可增加mRNA稳定性。这种附连可包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，ATP类似物可使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾部。ATP类似物可进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot，等，Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski，等，RNA，7:1468-95(2001)；Elango，等，Biochim.Biophys.Res.Commun.，330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA也可包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是启动帽-独立性核糖体结合mRNA并且有助于翻译起始的任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列。可包括适于细胞电穿孔的任何溶质，其可包含有助于细胞通透性和活力的因子，比如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
RNA可使用任何许多不同的方法引入靶细胞，例如，商业上可获得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystem，Cologne，Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)，Multiporator(Eppendort，Hamburg Germany)、使用脂质转染法的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包裹、肽介导的转染或生物弹击(biolistic)颗粒递送系统比如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa，等，Hum Gene Ther.，12(8):861-70(2001))。
基因修饰的T细胞
在一些实施方式中，使用反转录病毒或慢病毒载体将CAR序列和/或双特异性抗体序列递送到细胞中。表达CAR和/或表达双特异性抗体的反转录病毒和慢病毒载体可递送至不同类型的真核细胞中以及使用转染的细胞作为载体或无细胞局部或全身递送封装的、结合的或裸露的载体递送至组织和整个生物体中。使用的方法可用于其中需要稳定表达或稳定表达是足够的任何目的。
在其他实施方式中，使用体外转录的mRNA将CAR序列和/或双特异性抗体序列递送到细胞中。体外转录的mRNA CAR可递送至不同类型的真核细胞中以及使用转染的细胞作为载体或无细胞局部或全身递送封装的、结合的或裸露的mRNA递送至组织和整个生物体中。使用的方法可用于其中需要瞬时表达或瞬时表达是足够的任何目的。
公开的方法可在癌症、干细胞、急性和慢性感染和自身免疫疾病领域的基础研究和疗法中用于调节T细胞活性，包括评估基因修饰的T细胞杀死靶癌细胞的能力。
方法也提供通过改变例如启动子或输入RNA的量在宽范围内控制表达水平的能力，使得可能单独调节表达水平。此外，mRNA生产的基于PCR的技术大大有助于具有不同结构和它们结构域组合的嵌合受体mRNA的设计。例如，改变相同的细胞中多个嵌合受体上不同细胞内效应子/共刺激物结构域允许测定受体组合的结构，其评估抗多抗原靶的最高水平的细胞毒性，和同时对正常细胞的最低细胞毒性。
本发明的RNA转染方法的一个优势是RNA转染基本上是瞬时和无载体的：RNA转基因可在简单的体外细胞活化之后递送至淋巴细胞并且在其中表达，作为最小表达盒而不需要任何另外的病毒序列。在这些条件下，转基因整合至宿主细胞基因组是不可能的。细胞的克隆不是必须的，因为RNA的转染效率和其均匀修饰整个淋巴细胞群的能力。
利用体外-转录的RNA(IVT-RNA)的T细胞的基因修饰利用都已经成功在各种动物模型中测试的两种不同策略。通过脂质转染法或电穿孔，用体外-转录的RNA转染细胞。优选地，期望使用各种修饰稳定IVT-RNA，以便实现转移的IVT-RNA的延长表达。
在文献中已知一些IVT载体，其以标准的方式用作体外转录的模板并且其已经基因修饰为使得产生稳定的RNA转录体。用于本领域的目前方案基于具有下列结构的质粒载体：5'RNA聚合酶启动子，其使得能够RNA转录，其后是在3'和/或5'非翻译区域(UTR)侧翼的感兴趣的基因，和包含50-70A核苷酸的3'聚腺苷酸基盒。体外转录之前，圆形质粒在聚腺苷酸基盒的下游通过II型限制酶(识别对应切割位点的序列)被线性化。聚腺苷酸基盒因此对应转录体中后面的聚腺苷酸序列。作为该程序的结果，在线性化之后一些核苷酸仍为部分酶切割位点并且延伸或掩盖3'端处的聚腺苷酸序列。尚不清楚该非生理悬突是否影响从这类构建体细胞内产生的蛋白质的量。
RNA具有优于更多传统质粒或病毒方法的许多优势。来自RNA源的基因表达不需要转录并且在转染之后快速产生蛋白产物。进一步，因为RNA必须仅仅接近细胞质而不是细胞核，并且所以典型的转染方法产生非常高的转染率。另外地，基于质粒的方法需要驱动表达感兴趣基因的启动子在研究的细胞中是活性的。
在另一方面中，RNA构建体可通过电穿孔递送入细胞。参见，例如，US2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的将核酸构建体电穿孔进入哺乳动物细胞的制剂和方法。包括任何已知细胞类型的电穿孔需要的电场强度的各种参数在相关研究文献以及本领域的许多专利和申请中一般是已知的。参见例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。电穿孔的治疗性应用的装置是商业上可获得的，例如，MedPulserTMDNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics，San Diego，Calif.)，并且描述在专利比如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223，美国专利号5,993,434，美国专利号6,181,964，美国专利号6,241,701，和美国专利号6,233,482中；电穿孔也可用于细胞体外的转染，如例如，在US20070128708A1中描述的。电穿孔也可用于体外将核酸递送入细胞。所以，使用本领域技术人员已知的任何许多可用的设备和电穿孔系统，将包括表达构建体的核酸电穿孔-介导的施用至细胞提供了令人激动的递送感兴趣RNA至靶细胞的新手段。
T细胞的来源
在增殖和基因修饰本发明的T细胞之前，从对象获得T细胞的来源。T细胞可从许多来源中获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用在本领域中可用的许多T细胞系。在本发明的某些实施方式中，T细胞可利用技术人员已知的许多技术诸如FicollTM分离法从对象中收集的单位血液中获得。在一个优选实施方式中，来自个体循环血液中的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可冲洗由单采血液成分术收集的细胞，以移除血浆部分并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。在可选实施方式中，冲洗液缺少钙并可缺少镁，或可缺少很多——如果不是全部的话——的二价阳离子。此外，令人惊讶地，在缺少钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。如本领域技术人员将容易理解的，冲洗步骤可通过本领域中技术人员已知的方法完成，诸如根据制造商的使用说明通过使用半自动“直流(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞回收器5)。在冲洗后，细胞可重悬浮在多种生物相容的缓冲液中，诸如，例如，无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyte A或含有或不含有缓冲液的其他盐溶液。可选地，可移除单采血液成分术样本的不期望组分，并且将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方式中，T细胞通过溶胞红细胞和耗尽单核细胞从外周血淋巴细胞中分离出来，例如，通过经过PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘洗 (counterflow centrifugal elutriation)。T细胞的特定亚群，诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞，可进一步通过阳性或阴性选择技术进行分离。例如，在一个实施方式中，T细胞通过与抗-CD3/抗-CD28(即，3×28)-缀合珠诸如 M-450CD3/CD28T一起温育持续足以阳性选择期望T细胞的时间段，进行分离。在一个实施方式中，时间段为大约30分钟。在进一步的实施方式中，时间段范围为30分钟至36小时或更长，和其间的所有的整数值。在进一步的实施方式中，时间段为至少1、2、3、4、5或6个小时。还在另一个优选的实施方式中，时间段为10至24个小时。在一个优选实施方式中，温育时间段为24个小时。对于分离来自具有白血病的患者的T细胞，使用更长的温育时间诸如24个小时，可增加细胞产量。更长的温育时间可用于在与其他细胞类型相比具有更少T细胞的任何情况中分离T细胞，例如，在分离来自肿瘤组织或来自无免疫应答(immune-compromised)个体的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中。进一步地，使用更长的温育时间可增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许T细胞结合CD3/CD28珠，和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文中进一步描述的)，在培养初始或在该过程的其他时间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。另外地，通过增加或减少珠或其他表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比率，在培养初始或在其他期望的时间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。技术人员将理解多轮选择也可用于本发明的内容中。在某些实施方式中，可期望实施选择程序并在活化和增殖过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经历更多轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可利用针对对阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合完成。一种方法为细胞分选和/或选择，其经阴性磁性免疫粘附或使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的流式细胞术进行。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可期望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。可选地，在某些实施方式中，T调节细胞通过抗-C25缀合珠或其他类似的选择方法耗尽。
对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度。在某些实施方式中，可期望显著减少珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150×106细胞/ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞 活化和细胞增殖。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞，或捕获来自有很多肿瘤细胞存在的样本(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将期望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达高数量的结合待至颗粒的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度，CD4+T细胞比CD8+T细胞表达更高水平的CD28并更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其他实施方式中，使用的浓度可从大约1×105/ml至1×106/ml，和之间的任何整数值。
在其他实施方式中，细胞可在旋转器上以不同的速度，在2-10℃或室温的任一个温度下温育不同的时间长度。
在冲洗步骤后，用于刺激的T细胞也可被冷冻。不希望被理论所束缚，通过去除细胞群中的粒细胞和以一定程度去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的冲洗步骤后，细胞可被悬浮在冷冻液中。尽管很多冷冻液和参数在本领域中是已知的，并在该内容中将是有用的，但一个方法包括使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或包含10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或包含例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，细胞随后被以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并保存在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在-20℃下或液氮中不受控的即刻冷冻。
在某些实施方式中，冷藏的细胞如本文所述的解冻和冲洗，并允许在使用本发明的方法活化前在室温下静止1个小时。
在本发明的内容中也考虑到的是在当可能需要如本文所述的增殖细胞前的时间段上，从对象收集血液样本或单采血液成分术产物。如此，待增殖的细胞的来源可在必要的任何时间点收集，并且期望的细胞，诸如T细胞，被分离和冷冻，以便以后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的许多疾病或病症，诸如本文所述的那些。在一个实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自大体健康的对象。在某些实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自处于患病风险下但还没有患病的大体健康的对象，和感兴趣的细胞被分离和冷冻以便以后使用。在某些实施方式中，T细胞可在以后的时间被增殖、冷冻和使用。在某些实施方式中，如本文所述的具体疾病的诊断后但在任何治疗前，立刻从患者收集样本。在进一步的实施方式中，在许多有关治疗形式前，从来自对象的血液样本或单采血液成分术样本分离细胞，所述治疗形式包括但不限于用以下治疗：试剂，诸如那 他珠单抗、厄法珠单抗、抗病毒剂、化疗、辐射(radiation)、免疫抑制剂，诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAMPATH、抗-CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228和照射(irradiation)。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70S6激酶(Liu等，Cell 66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bterer等，Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，对患者分离细胞并冷冻以便以后与骨髓或干细胞移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)使用。在另一个实施方式中，细胞可在治疗之前被分离，并可被冷冻以便以后在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan之后的治疗使用。
在本发明的进一步实施方式中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损坏免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久当患者将正常地从治疗中恢复期间，获得的T细胞的质量对于它们的离体增殖能力可为最佳或改善的。同样，在利用本文描述的方法离体操纵后，这些细胞可处于提高的移植物移入和体内增殖的优选状态。因此，在本发明的内容内考虑在该恢复期期间收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血系的其他细胞。进一步地，在某些实施方式中，转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案可用于在对象中产生病症，其中具体细胞类型的再群体化(repopulation)、再循环、再生和/或增殖是有利的，特别是在疗法后限定的时间窗期间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
T细胞的活化和增殖
不论在T细胞基因修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和增殖：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005。
通常地，本发明的T细胞通过与表面接触进行增殖，所述表面具有附着于其的刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段或抗-CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增 殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域中公知的其他方法一样，可使用包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diacione，Besancon，France)的抗-CD28抗体的例子(Berg等，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等，J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“顺式”形式)或分开的表面(即，以“反式”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在某些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其他结合剂。在这点上，参见例如，用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和增殖本发明的T细胞。
在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠上即“顺式”或分开的珠上即“反式”。通过例子，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于CD4+T细胞增殖和T细胞生长的珠的1:1比率的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的增殖相比，观察到T细胞增殖的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1:1比率观察到的增殖相比，观察到从大约1至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的CD3:CD28抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的抗-CD28抗体被结合至颗粒，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的CD3:CD28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的CD3:CD28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的CD3:CD28比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的CD3:CD28比率。
从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域技术人员可容易地领会的，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内和其 间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗-CD3-和抗-CD28-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而，某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1的颗粒/T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒：细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒此后每天或每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠组合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
通过例子，可通过允许附接抗-CD3和抗-CD28的顺磁珠(3×28珠)接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，以1:1比率的M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液优选PBS(没有二价阳离子诸如，钙和镁)中进行组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占样本的0.01％，或整个样本(即，100％)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在某些实施方式中，可期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150×106细胞/ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞增殖。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这 样的细胞群可具有治疗价值并将在某些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时(大约3个小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPM1培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和存活必须的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、优选子(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞的生长和增殖量的细胞因子(一个或多个)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于变化的刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(TC，CD8+)更多的辅助T细胞群(TH，CD4+)。T细胞通过刺激CD3和CD28受体的离体增殖在大约8-9天前产生主要由TH细胞组成的T细胞群，而在大约8-9天后，T细胞群包括渐增的更大的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，用主要包括TH细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度增殖该亚型。
进一步地，除了CD4和CD8标记以外，其他表型标记在细胞增殖过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。
治疗性应用
本发明包括被修饰以表达双特异性抗体、CAR或其组合的细胞(例如，T细胞)，其中CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或其任何组合的细胞内结构域组合。因此，在一些例子中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
在一个实施方式中，本发明提供了CAR重定向(redirect)初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激哺乳动物的靶细胞群或组织的T 细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定靶标相互作用的结合部分，包括例如人CD3-ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达双特异性抗体、CAR或其组合，并且T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，在一些实施方式中，修饰的T细胞可以在体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的T细胞可经历稳固的体内T细胞增殖并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。
不希望被任何具体的理论所束缚，由修饰的T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中修饰的T细胞诱导对CAR和/或双特异性抗体识别的靶向抗原特异性的免疫应答。
在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞分泌双特异性抗体进入肿瘤微环境的胞外空间中。这种有效的递送方法减少了与双特异性抗体全身递送相关的毒性。
在一个实施方式中，本发明提供了修饰的T细胞有效地递送双特异性抗体到特定区域(即肿瘤微环境)的用途。在一个实施方式中，被修饰以表达CAR和双特异性抗体的T细胞通过在CAR表面上表达的CAR的抗原结合结构域靶向特定的肿瘤微环境。进一步，在一个实施方式中，双特异性抗体的CAR介导的递送利用治疗性双特异性抗体武装(arm)肿瘤微环境中的未修饰T细胞。在一个实施方式中，双特异性抗体结合到T细胞和肿瘤抗原。这种形式的双特异性抗体——称为BiTE，与CAR一起作用以特异性地识别并杀死肿瘤。在一个实施方式中，与仅用CAR修饰的T细胞的递送相比，本发明的方法包括施用被修饰以同时向对象表达CAR和双特异性抗体二者的细胞，以增强肿瘤识别、免疫应答和肿瘤溶解。
尽管本文公开的数据具体描述了包括抗-CD19区、人CD8α铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的IVT RNA CAR，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。即，本发明包括CAR中任何抗原结合结构域生成对抗原结合结构域特异性的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明的CAR中的抗原结合结构域可出于治疗癌症的目的靶向肿瘤抗原。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素 瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，其包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一个实施方式中，本发明的CAR和双特异性抗体被设计以治疗具体的癌症。例如，被设计以靶向CD19的CAR和双特异性抗体可用于治疗癌症和紊乱，包括但不限于前-B ALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种异基因骨髓移植后的补救等等。
在另一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向CD22，以便治疗扩散大B-细胞淋巴瘤。 
在一个实施方式中，癌症和紊乱包括但不限于前-B ALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种异基因骨髓移植后的补救等等，其可利用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合进行治疗。
在一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向间皮素，来治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。在另一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向CD33/IL3Ra，来治疗急性骨髓性白血病等等。在进一步的实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向c-Met，来治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等等。
在一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向PSMA，来治疗前列腺癌等等。在另一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向糖脂F77，来治疗前列腺癌等等。在进一步的实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向EGFRvIII，来治疗成胶质细胞瘤等等。
在一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向GD-2，来治疗神经细胞瘤、黑素瘤等等。在另一个实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向NY-ESO-1TCR，来治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。在进一步的实施方式中，CAR和双特异性抗体可被设计以靶向MAGE A3TCR，来治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原靶标和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与疾病相关的抗原靶标，其中可使用CAR和/或双特异性抗体治疗该疾病。
本发明的修饰的T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)细胞的增殖，ii)将编码CAR和/或双特异性抗体的核酸引入细胞，和/或iii)细胞的低温保存。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的组合物的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗性益处。哺乳动物接受者可为人，和修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
通过引用并入本文的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体增殖程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体增殖的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和增殖包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体增殖这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其他因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体，也可用于细胞的培养和增殖。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常地，如本文所述活化和增殖的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的修饰的T细胞用于治疗癌症。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成癌症风险下的患者。因此，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗上有效量的本发明的修饰的T细胞。
本发明的修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(参见，例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
在某些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取(redraw)血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和增殖的T细胞再注入该患者。该过程可每几周进行多次。在一些实施方式中，T细胞可从10cc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽取/多个再输注方案可用于选出一些T细胞群。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞增殖至治疗性水平的方法活化和增殖的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用试剂进行以下治疗：诸如抗病毒治疗、对MS患者的西多福韦和白细胞介素-2治疗、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对 PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70S6激酶(Liu等，Cell 66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin,Tmmun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的增殖的免疫细胞的注入。在额外的实施方式中，增殖的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在1至大约100mg的范围中，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6,120,766中描述)，但优选的日剂量为1至10mg每天。
实验实施例 
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。
实施例1：通过共同引入双特异性抗体RNA(Bis-RNA)增强RNA CAR T细胞的抗肿瘤活性
使用CAR重定向的T细胞的过继转移治疗癌症患者已经呈现出有希望的成果。编码CAR的RNA电穿孔入T细胞提供了比当前常用的基于慢病毒或反转录病毒基因的基于递送的疗法更安全、更简单且可能更有效的替代方式。从最近的 临床试验的发现表明源自小鼠抗体的CAR显示出人抗小鼠抗体(HAMA)应答的证据，这潜在地危及该疗法。因此，源自人或人源化抗体的CAR提供小鼠源序列的理想替代，尤其是当需要通过使用RNA电穿孔的T细胞重复注入来治疗癌症患者的时候。
本文所公开的研究描述：1)生成源自人类源的抗人CD19CAR，其消除当通过慢病毒转导或RNA电穿孔使用CAR时潜在的HAMA；2)共同引用编码源自人(或人源化的)抗体的双特异性抗体的基因(或mRNA)。此处示例性CAR针对来自抗CD19抗体的人CD19被构建(图1)有4-1BB-ζ信号传导结构域，其是完全人源的(克隆21D4；美国专利申请号2010/0104509A1，或人源化的(克隆HB12B；美国专利申请号US 2008/0138336A1)或来自Blinatumomab(抗-CD19/抗-CD3双特异性抗体)；美国专利号：US 7,575,923B2)的小鼠源的(CD19scFv)。除了测试CD19-CD3双特异性抗体RNA(Bis-RNA)外，间皮素(ss1)-CD 3(ss1HL-Blina和ss1-BlinaLH)、cMet-CD3(cMet-Blina)、PSCA-CD3(PSCA-Blina)和GD2-CD3(GD2-Blina)Bis-RNAs也被构建。为了人源化Blina Bis-RNA，制备构建体并且将小鼠CD19和CD3scFv都分别通过针对CD19(21D4)和CD3(27H5VL1、27H5VL2、28F11、DIVHv5、DIVHv6和DIVHv7)的人或人源化的scFv代替，其导致13个构建体：D4-Blina、D4-VL1、D4-VL2、D4-F11、D4-Hv5、D4-Hv6、D4-Hv7、Blina-VL1、Blina-VL2、Blina-F11、Blina-Hv5、Blina-Hv6和Blina-Hv7。
从编码这些CD19CAR的构建体生成的IVT RNA电穿孔进入T细胞。CAR表达和抗肿瘤活性与源自FMC63的CD19CAR(目前用于CART19试验)进行比较。本文所呈现结果的实验设计结果展示在图2中。结果显示所有的新CD19CAR都可以被有效地表达。尽管与FMC63CAR相比表达略有减少，但通过CD107a检测测定的其抗肿瘤活性与对照的FMC63CAR相当。
为了检查共同导入编码抗CD19/抗CD3双特异性抗体的基因(或mRNA)是否进一步加强CAR过程化T细胞的抗肿瘤活性，通过PCR合成编码Blinatumomab(Blina)的基因，然后其被构建入IVT载体pGEM.64A以生成pGEM-Blina.64A。T细胞被编码Blinatumomab(Blina)的RNA和CD19CAR RNA(FCM63CAR)共电穿孔，或可选地被Blina RNA单独电穿孔，并且与FCM63CD19CAR RNA单独电穿孔的T细胞进行比较。细胞染色显示小鼠IgG的存在性，其示出不仅CD19CAR RNA电穿孔的细胞对CAR表达染色阳性，而且Blina Bis-RNA电穿孔的细胞和GFP-RNA电穿孔的细胞的共温育在大多数的细胞中产生了阳性染色(图3)。此数据与下述解释一致：由Blina电穿孔的T细胞所分泌的CD19-CD3双特异性抗体可以结合GFP电穿孔T细胞的CD3。
电穿孔的细胞与CD19表达细胞(Nalm6、K562-CD19、和Raji)或与CD19阴性细胞(K562)共培养。进行CD107a脱粒测定，其显示Blina Bis-RNA单独可以使得电穿孔T细胞能够特异性地检测肿瘤，这与FMC63CD19RNA电穿孔的T 细胞同样有效(图4)。Blina RNA与CD19CAR RNA的共电穿孔可以进一步增强肿瘤反应性，如通过CD107a测定证明的(图4)。
此外，当混合用CD19CAR RNA和Blina RNA二者或Blina RNA单独共同电穿孔的T细胞与仅用GFP电穿孔的T细胞时，发现由Blina RNA电穿孔的T细胞分泌的双特异性抗体可武装(arm)非肿瘤识别GFP+T细胞以有效地识别CD19+肿瘤(图5)。
在基于流式CTL测定中，使用K562-CD19-CFSE/K562-meso-CMRA作为靶细胞来检测电穿孔细胞的溶解活性。Blina RNA与CD19CAR RNA的共电穿孔可以进一步增强T细胞的杀伤活性(图6)。进一步，Blina RNA电穿孔的细胞与非肿瘤识别GFP+细胞的共温育相比于未稀释的相对物保持杀伤活性，这表明分泌的bis-RNA可以结合到GFP-RNA电穿孔的T细胞，从而以抗原特异性的方式有效地杀死CD19+肿瘤(图6)。
通过对小鼠IgG或人IgG染色，在电穿孔后15小时通过检查新CD19CARRNA构建体的表达，对其进行评估，其显示所有的构建体诱导CAR表达(图7)。当与CD19+肿瘤细胞系(K562-CD19或Raji)或与CD阴性系(U266B1)共培养时，用新构建体电穿孔的T细胞展示特异性识别CD19阳性肿瘤的能力，如通过CD107a测定证明的(图8)。
用1μg、5μg或10μg的Blina bis-RNA电穿孔T细胞，并将其与用10μg的FCM63CD19CAR RNA电穿孔的T细胞进行比较。在电穿孔的细胞用CD19+细胞(Naln6、K562-CD19或Raji细胞)或用CD19-细胞系(K562)刺激之后，进行CD107a测定。发现使用1μg Blina Bis-RNA的T细胞功能几乎与使用10μg的CD19CAR RNA的T细胞一样好。使用10μg的CD19CAR RNA的T细胞在电穿孔后8-10天失去其功能，这与使用1μg Blina Bis-RNA的T细胞相类似，而使用5μg或10μg Blina Bis-RNA的T细胞继续发挥功能上至电穿孔后14天(图9B)。
为了评估人和人源化形式的Bis-RNA的功能性，使用Blina-D4Bis-RNA电穿孔T细胞，其中来自Blina的CD19scFv用21D4scFv替换。细胞进行CAR染色和CD107a染色，其表明使用Blina-D4电穿孔的细胞功能与用Blina Bis-RNA的T细胞一样好(图10)。
设计和构建对其他抗原标记物特异性的Bis-RNA构建体。比较表达用于间皮素(ss1)、cMet或PSCA的CAR RNA的T细胞，发现表达ss1-Blina、cMet-Blina或PSCA-Blina的T细胞单独的功能可与用CAR RNA的T细胞一样好。而且，用ss1-Blina Bis-RNA的T细胞表现出比用ss1CAR RNA的T细胞更多的抗原特异性的T细胞活性(图11)。
本文的结果表明伴连同CD19CAR引入双特异性抗体RNA增强了CAR过程化的T细胞的抗肿瘤活性。进一步，将双特异性抗体RNA引入T细胞募集非肿瘤反应性T细胞成为肿瘤反应性的，这提供了通过使用T细胞向癌症患者递送和运 输抗肿瘤药物的新方式。通过借助携带货物(BiTE)至肿瘤部位的CAR T细胞集中双特异性抗体递送至肿瘤微环境，这可减少全身BiTE的毒性。
Blinatumomab ORF(SEQ ID NO:1)
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Blina-D4(SEQ ID NO:2)
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Ss1.HL.CD3(SEQ ID NO:3)
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Ss1.LH.CD3(SEQ ID NO:4)
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cMet.CD3(SEQ ID NO:5)
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PSCA.CD3(SEQ ID NO:6)
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GD2-CD3(SEQ ID NO:7)
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D4-27H5 VL1 (D4-VL1)(SEQ ID NO:8)
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D4-27H5 VL2 (D4-VL2)(SEQ ID NO:9)
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D4-28F11 (D4-F11)(SEQ ID NO:10)
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D4-DIVHv5 (D4-Hv5)(SEQ ID NO:11)
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D4-DIVHv6 (D4-Hv6)(SEQ ID NO:12)
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D4-DIVHv7 (D4-Hv7)(SEQ ID NO:13)
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Blina-27H VL1 (Blina-VL1)(SEQ ID NO:14)
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Blina-27H VL2 (Blina-VL2)(SEQ ID NO:15)
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Blina-28F11 (Blina-F11)(SEQ ID NO:16)
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Blina-DIVHv5 (Blina-Hv5)(SEQ ID NO:17)
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Blina-DIVHv6 (Blina-Hv6)(SEQ ID NO:18)
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Blina-DIVHv7 (Blina-Hv7)(SEQ ID NO:19)：
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D4(19)-BBz ORF(SEQ ID NO:20)：
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12B(19)-BBZ ORF(SEQ ID NO:21)：
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Blina.19BBZ ORF(SEQ ID NO:22)：
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本文引用的每一和每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此都通过引用 以其全文并入。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但显而易见的是可由本领域技术人员设计本发明的其他实施方式和变形，而不脱离本发明的真实精神和范围。权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。

Claims (47)

1.一种分离的核酸序列，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，其中所述CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸序列，其包括选自下列的核酸序列：SEQID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
4.根据权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
5.根据权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关联。
6.根据权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关联。
7.根据权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗体选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和其任意组合。
8.根据权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述CAR进一步包括共刺激信号传导区，其包括选自下列的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任意组合。
9.根据权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述源自双特异性抗体的抗原结合结构域的核酸序列编码双特异性抗体。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸序列，其中编码所述双特异性抗体的所述核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和其任意组合。
11.一种包括核酸序列的细胞，所述核酸序列包括编码嵌合抗原受体(CAR)的序列，其中所述CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
13.根据权利要求11所述的细胞，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
14.根据权利要求11所述的细胞，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关联。
16.根据权利要求14所述的细胞，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关联。
17.根据权利要求14所述的细胞，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和其任意组合。
18.根据权利要求11所述的细胞，其中所述CAR进一步包括共刺激信号传导区，其包括选自下列的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任意组合。
19.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
20.根据权利要求11所述的细胞，其中当所述抗原结合结构域结合至其相应的抗原时，所述细胞表现抗肿瘤免疫性。
21.根据权利要求11所述的细胞，其中所述源自双特异性抗体的抗原结合结构域的核酸序列编码双特异性抗体。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中编码所述双特异性抗体的所述核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和其任意组合。
23.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞进一步包括编码双特异性抗体的核酸。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中编码所述双特异性抗体的所述核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和其任意组合。
25.根据权利要求23所述的细胞，其中所述双特异性抗体包括人抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求23所述的细胞，其中所述双特异性抗体包括人源化抗体或其抗原结合片段。
27.用于刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而刺激T细胞介导的所述哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答。
28.用于刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而刺激T细胞介导的所述哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答。
29.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而在该所述哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。
30.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而在所述哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。
31.治疗具有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而治疗所述哺乳动物。
32.治疗具有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，从而治疗所述哺乳动物。
33.治疗具有癌症的人的方法，所述方法包括给所述人施用基因工程化以表达CAR和双特异性抗体的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，其中所述细胞为T细胞。
34.治疗具有癌症的人的方法，所述方法包括给所述人施用基因工程化以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域，进一步其中所述抗原结合结构域选自人抗体、人源化抗体、其抗原结合片段和其任意组合，其中所述细胞为T细胞。
35.编码双特异性抗体的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
36.包括编码双特异性抗体的核酸序列的细胞，其中所述核酸序列包括选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
37.用于刺激T细胞介导的哺乳动物靶细胞群或组织的免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达双特异性抗体的细胞。
38.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达双特异性抗体的细胞。
39.治疗具有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达双特异性抗体的细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
41.根据权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR和其任意组合。
42.治疗具有癌症的人的方法，所述方法包括给所述人施用基因工程化以表达双特异性抗体的细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因工程化的细胞是自体T细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞分泌所述双特异性抗体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述双特异性抗体由包括选自下列的核酸序列的核酸序列编码：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述双特异性抗体包括人抗体或其抗原结合片段。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述双特异性抗体包括人源化抗体或其抗原结合片段。
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