JP2015524255A - 二重特異性抗体を共導入することによってｃａｒｔ細胞の活性を強化する方法 - Google Patents

二重特異性抗体を共導入することによってｃａｒｔ細胞の活性を強化する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトにおける癌を治療するための組成物および方法を提供する。本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝子改変されたT細胞、二重特異性抗体、またはそれらの組み合わせを対象に投与する段階を含む。本発明のCARおよび二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含みうる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年7月13日に提出された米国仮出願第61/671,535号の優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝子改変されたT細胞の開発により、癌および他の障害に対する多くの新たな有望な治療法への道が開かれた。一般に、CARは、細胞外抗原認識ドメインおよび細胞内ドメインを含む。
ある種のCARは非ヒト性の細胞外抗原認識ドメインを利用しており、そのことにより、CARによって媒介される腫瘍認識および腫瘍溶解という治療上の利益を危うくする恐れのある、望まれない免疫応答が持ち込まれる恐れがある。例えば、患者がマウス由来抗体に反応して、外来性のマウス由来抗体に対して特異的な抗体を作り出す可能性がある。ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答と名付けられているこの応答は、軽度の皮疹から命にかかわる合併症までの範囲にわたる、アレルギー反応に類似した症状を生じさせる。このため、ヒトまたはヒト化抗体に由来する抗原認識ドメインを含むCARは、それらがそのような有害な免疫応答を誘発しないことから、有益な可能性がある。
二重特異性T細胞エンゲージャー（engager）（BiTE）は、T細胞抗原（例えば、CD3）および腫瘍抗原と結合する二重特異性抗体である。BiTEは、標的腫瘍細胞の指向性溶解（directed lysis）を誘導することが示されており、それ故に、癌および他の障害に対する非常に有望な治療法となる可能性もある。しかし、BiTEの全身性送達は毒性をもたらす恐れがあり、そのため、特定の腫瘍環境に対するBiTEのより指向的な送達が望ましいと考えられる。
したがって、当技術分野においては、ヒトCARまたはヒト化CARを用いる癌の治療のための組成物および方法、ならびに治療用二重特異性抗体の指向的な送達に対して差し迫った需要がある。本発明は、かなえられていないこの需要に応える。
本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする配列を含む単離された核酸配列であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、核酸配列を提供する。
1つの態様において、CARをコードする単離された核酸配列は、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、およびSEQ ID NO：22からなる群より選択される核酸配列を含む。
1つの態様において、抗原結合フラグメントはFabまたはscFvである。
1つの態様において、抗原結合ドメインは腫瘍抗原と結合する。
1つの態様において、腫瘍抗原は血液悪性腫瘍と関連する。
1つの態様において、腫瘍抗原は固形腫瘍と関連する。
1つの態様において、腫瘍抗原は、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33／IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
1つの態様において、CARは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。
1つの態様において、CARをコードする単離された核酸配列は、二重特異性抗体をコードする配列を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体をコードする核酸配列は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体はヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
1つの態様において、二重特異性抗体はヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする配列を含む核酸配列を含む細胞であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、細胞を提供する。
1つの態様において、細胞はT細胞である。
1つの態様において、細胞は、抗原結合ドメインがその対応する抗原と結合した場合に抗腫瘍免疫を呈する。
本発明は、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、それにより、該哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激する段階を含む、方法を提供する。
本発明は、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激する段階を含む、方法を提供する。
本発明は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える段階を含む、方法を提供する。
本発明は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える段階を含む、方法を提供する。
本発明は、腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物を治療する段階を含む、方法を提供する。
本発明は、腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物を治療する段階を含む、方法を提供する。
本発明は、癌を有するヒトを治療する方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子操作された細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、該細胞がT細胞である、方法を提供する。
本発明は、癌を有するヒトを治療する方法であって、CARを発現するように遺伝子操作された細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、該細胞がT細胞である、方法を提供する。
本発明は、二重特異性抗体をコードする単離された核酸配列であって、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：19からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸配列を提供する。
本発明は、二重特異性抗体をコードする核酸配列を含む細胞であって、該核酸配列が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：19からなる群より選択される核酸配列を含む、細胞を提供する。
本発明は、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。
本発明は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。
本発明は、腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。
本発明は、癌を有するヒトを治療する方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子操作された細胞を該ヒトに投与する段階を含む方法を提供する。
1つの態様において、遺伝子操作された細胞は自己T細胞である。
1つの態様において、細胞は二重特異性抗体を分泌する。
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、さらによく理解されるであろう。本発明を例示するために、本明細書において好ましい態様を図面中に示している。しかし、本発明は、図面中に示された態様の厳密な配置および手段には限定されないことが理解されるべきである。
RNA構築物のベクターマップを描写している。ブリナツモマブ（pGEM-Blina.64A）、ヒトCD19完全ヒトAb 21D4（pGEM.D4(CD19).BBZ.64A）、ヒト化HB12B（pGEM.12B(CD19).BBZ.64A）およびブリナツモマブ由来のマウス起源CD19 scFvに対する4-1BB-ζシグナル伝達ドメインを有するCAR（pGEM.Blina.19BBZ.64A）に関するインビトロ転写（IVT）ベクターマップ。 Blina RNAのエレクトロポレーションを行ったCD19 CAR T細胞を試験するための実験デザインを描写しているチャートである。第10日の刺激T細胞（ND200から）に対して、表記の通りにエレクトロポレーションを行った。EP#1には10μgのFCM63 CD19 BBZ RNA、EP#2には5μgのFCM63 CD19 BBZ RNA、EP#3には5μgのFCM63 CD19 BBZ＋10μgのBlina RNA、EP#4には10μgのBlina RNA、EP#5には5μgのGFP RNAを用いた。#12は、エレクトロポレーションを行わないT細胞とした。#6〜#8については、表記の通りに、エレクトロポレーションの直後に、エレクトロポレーションを行ったT細胞の等容積（1ml）のアリコートをプールした。#9〜#11については、表記の通りに、エレクトロポレーションから15時間後に、エレクトロポレーションを行った細胞の別のアリコート（1ml）をプールし、その後に細胞を、CAR検出のためのFACS染色、CD107aアッセイおよび細胞傷害性Tリンパ球（CTL）アッセイに供した。 CD19 CAR、Blina RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞、およびBlina RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞とともにインキュベートした、GFP RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞のCAR染色を描写している一連のグラフである。エレクトロポレーションから15時間後に、図2に示すようなすべての処理に関するT細胞を、ヤギ抗マウスFabで染色した。各プロットの上に示した数字は、図2に列記した条件のことを指す。これらの結果は、CD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞がCAR発現に関して染色されただけでなく、Blina bis-RNAのみ（#4）のエレクトロポレーションを行ったT細胞、およびBlina bis-RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞と共インキュベートした、GFP RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞（#7、#8、#10、#11）も染色されたことを示している。このことは、Blinaのエレクトロポレーションを行ったT細胞によって分泌されたCD19-CD3二重特異性Abが、GFPのエレクトロポレーションを行ったT細胞のCD3と結合することができたことを実証している。 Blina bis-RNA「BITE」によるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、腫瘍を特異的に認識することができたことを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。エレクトロポレーションから15時間後に、T細胞をCD107a脱顆粒アッセイに供した。エレクトロポレーションから15時間後に、図2に示したすべての条件に関するT細胞を、CD19を発現するさまざまな種類の細胞（Nalm6、K562-CD19およびRaji）またはCD19陰性腫瘍K562と共培養した。各プロットの上に示した数字は、図2に列記した条件である。これらの結果は、Blina bis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、CD19陽性腫瘍を特異的に認識したことを実証している。 Blina「BITE」二重特異性抗CD19／CD3 RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、GFP RNAのエレクトロポレーションを行った非腫瘍反応性T細胞に腫瘍を特異的に認識させることが可能であったことを実証している一連のグラフである。エレクトロポレーションから15時間後に、図2に示したすべての条件に関するT細胞を、CD107a脱顆粒アッセイのために、CD19を発現する異なる細胞（Nalm6、K562-CD19およびRaji）またはCD19陰性腫瘍K562と共培養した。各プロットの上に示した数字は、図2に列記した条件である。これらの結果は、Blina bis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が腫瘍を特異的に認識したことを示している。これらの結果は、Blina bis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、GFP RNAのエレクトロポレーションを行った非腫瘍反応性「バイスタンダー」T細胞に、腫瘍を特異的に認識させることが可能であったことを示している（#7、#8、#10、#11）。CD8+ T細胞のゲーティングを行った。 Blina bis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、CD19抗原発現細胞を特異的に死滅させることを例証している実験の結果を描写しているグラフである。エレクトロポレーションから15時間後に、図2に示したすべての条件に関するT細胞を、K562-CD19-CFSE／K562-meso-CMRAを標的細胞として用いるフローベースのCTLアッセイにおいて、それらの溶解活性に関して試験した。エレクトロポレーションを行ったT細胞の各条件に関して示した数字は、図2に列記した数字である。これらの結果は、Blina二重特異性抗CD19／抗CD3 RNAとCD19 CAR RNAとの共エレクトロポレーションにより、T細胞の死滅活性をさらに強化することができたことを示している（#3と#2の対比）。GFPのエレクトロポレーションを行った同数の非腫瘍反応性T細胞を、CD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞に加えたところ、CD19 CAR発現T細胞の死滅能力はE：T比が低下することによって低下し、一方、GFPのエレクトロポレーションを行った同数の非腫瘍反応性T細胞を、Blina bis-RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞（#7、#8、#10、#11）に加えたところ、それらの非希釈群（#3および#4）と同等なT細胞死滅活性を維持することができ、このことは、Blina bis-RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞によって分泌された抗CD19／抗CD3二重特異性Abが、GFP RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞と結合して標的細胞を効率的に死滅させ、その結果、E：T比が有効に維持されたことを指し示している。 新たなCD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを行ったRNAのCAR発現の染色を描写している一連のグラフである。表記の通りのT細胞のエレクトロポレーションから15時間後の、新たに構築したCD19 CARの発現を示している。2種類の抗IgG Fabを用いた：マウス由来CARの染色には抗mIgG Fabを用い、ヒト由来CARの染色には抗hIgG Fabを用いた。 完全ヒトAb 12D4由来のCD19 CARおよびヒト化HB12B由来のCD19 CARがいずれもCD19陽性腫瘍を特異的に認識することを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。エレクトロポレーションから15時間後に、表記の通りのエレクトロポレーションを行ったT細胞を、CD107a脱顆粒アッセイのために、2つのCD19陽性腫瘍株（K562-CD19またはRaji）および1つのCD19陰性株U266B1と共培養した。現在用いられているFMC63 CD19 CAR（10OF）と比較して、完全ヒトAb 12D4由来のCD19 CARおよびヒト化HB12B由来のCD19 CARはいずれもCD19陽性腫瘍を特異的に認識した。 Blina Bis-RNAのみによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、CD19 CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞よりも感度が高く、抗腫瘍活性の長い存続性を示したことを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。1μg、5μgまたは10μgのBlina Bis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞を、10μgのCD19BBZ（19OF）RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と比較した。エレクトロポレーションから複数日後に、T細胞をCD19+細胞株（Naln6、K562-CD19またはRaji）または対照としてのCD19陰性細胞株K562によって刺激した後に、CD107aアッセイを実施した。それぞれ第3日、8日および12日の時点でのCD107a発現を示している。 Blina Bis-RNAのみによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、CD19 CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞よりも感度が高く、抗腫瘍活性の長い存続性を示したことを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。1μg、5μgまたは10μgのBlina Bis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞を、10μgのCD19BBZ（19OF）RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と比較した。エレクトロポレーションから複数日後に、T細胞をCD19+細胞株（Naln6、K562-CD19またはRaji）または対照としてのCD19陰性細胞株K562によって刺激した後に、CD107aアッセイを実施した。エレクトロポレーション後のさまざまな日数の時点での、CD107aの平均蛍光強度（MFI）および発現パーセンテージの両方を示している。CAR RNA T細胞と比較して、CD19-CD3（Blina）RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞の方が感度が高く、インビトロでの機能的存続性が長いことを実証している。 Bis-RNAを含有するヒトCD19 scFv（Blina-D4）によるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、Blina Bis-RNAによるT細胞と同等に機能したことを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。10μgもしくは20μgのBlina-D4 Bis-RNA、または10μgのBlina Bis-RNAによるエレクトロポレーションを行った上で、CAR染色（抗マウスIgG Fab）に供したT細胞、上のパネル（エレクトロポレーションから1日後）、およびCd107a染色に供したT細胞（下のパネル）。 メソテリン、cMetまたはPSCAに対するBis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と同等に機能したことを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。ss1HL-Blina、またはss1LH-Blina、またはcMet-Blina、またはPSCA-BlinaまたはGD2-Blinaの10μgのBis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞を、10μgのss1BBZ（ss1.OF）、またはcMetBBZ、またはPSCA.BBZまたはGD2.BBZ CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と比較した。エレクトロポレーションから1日後の細胞のCAR染色（抗マウスIgG Fab）の結果を描写している（cMet CARがヒト起源scFvであることに留意されたい）。 メソテリン、cMetまたはPSCAに対するBis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞が、CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と同等に機能したことを例証している実験の結果を描写している一連のグラフである。ss1HL-Blina、またはss1LH-Blina、またはcMet-Blina、またはPSCA-BlinaまたはGD2-Blinaの10μgのBis-RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞を、10μgのss1BBZ（ss1.OF）、またはcMetBBZ、またはPSCA.BBZまたはGD2.BBZ CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と比較した。Cd107a染色の結果を描写している（CD8+ゲーティングを行った）。
詳細な説明
本発明は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を非限定的に含む癌を治療するための組成物および方法に関する。本発明は、二重特異性抗体を発現するように改変されたT細胞の養子細胞移入の戦略に関する。もう1つの態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように改変されたT細胞の養子細胞移入に関する。
1つの態様において、T細胞は、二重特異性抗体を発現するように改変される。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有し、それ故に2種類の異なる抗原と結合する。1つの態様において、二重特異性抗体は、第1の抗原と結合する第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原と結合する第2の抗原認識ドメインを含む。1つの態様において、第1の抗原認識ドメインは腫瘍関連抗原と結合する。1つの態様において、第2の抗原認識領域はT細胞上の抗原と結合する。1つの特定の態様において、第2の抗原認識領域はT細胞上のCD3と結合する。1つの態様において、本発明は、ヒト二重特異性抗体またはヒト化二重特異性抗体を発現するように改変されたT細胞の養子細胞移入に関する。
1つの態様において、T細胞は、CARを発現するように改変される。CARとは、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を作製するために、抗体に基づく所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する特異性と、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインとを組み合わせた分子のことである。1つの態様において、本発明は、ヒトCARまたはヒト化CARを発現するように改変されたT細胞の養子細胞移入に関する。
もう1つの態様において、本発明は、二重特異性抗体とキメラ抗原受容体（CAR）とを発現するように改変されたT細胞の養子細胞移入に関する。
本発明は、全体として、所望のCARを発現するように遺伝子改変されたT細胞の使用、ならびに所望のCARを所望の二重特異性抗体と組み合わせて発現するように遺伝子改変されたT細胞の使用に関する。CARを発現するT細胞を、本明細書ではCAR T細胞またはCAR改変T細胞と称する。好ましくは、細胞を、抗体結合ドメインをその表面に発現するように遺伝子改変することができ、これにより、MHCに依存しない新規な抗原特異性を付与する。場合によっては、T細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメインとCD3-ζ鎖またはFcγRIタンパク質の細胞内ドメインとを組み合わせて単一のキメラタンパク質としたCARを発現するように遺伝子改変される。場合によっては、CAR T細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメインとCD3-ζ鎖またはFcγRIタンパク質の細胞内ドメインとを組み合わせて単一のキメラタンパク質としたCARのほかに、二重特異性抗体をも発現するように遺伝子改変される。
1つの態様において、本発明のCARは、抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する細胞外ドメインを含む。1つの態様において、CARはヒト化抗体、またはそのフラグメントを含みうる。1つの態様において、CARはヒト抗体、またはそのフラグメントを含みうる。1つの態様においては、CARの中の1つに天然に付随する膜貫通ドメインを用いる。もう1つの態様において、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けるように選択すること、またはそのためのアミノ酸置換によって選択もしくは改変することもできる。いくつかの態様において、細胞外ドメインはヒンジドメインも含む。好ましくは、ヒンジドメインはCD8αヒンジドメインを含む。
細胞質ドメインに関して、本発明のCARは、本発明のCARに関連して有用な任意の所望の細胞質ドメインを含むように設計することができる。1つの態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζ、4-1BBおよび／またはCD28のシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計することができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζ、4-1BBおよびCD28シグナル伝達モジュール、ならびにそれらの組み合わせを非限定的に含みうる。したがって、本発明は、CAR T細胞、および養子療法のためのそれらの使用の方法に関する。
1つの態様において、T細胞は、二重特異性抗体をCARと組み合わせて発現するように改変される。1つの態様において、二重特異性抗体とCARとの共発現は、腫瘍認識および腫瘍溶解を向上させる。
1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望の二重特異性抗体を含むレンチウイルスベクターをT細胞に導入することによって作製することができる。1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19ドメイン、CD8αヒンジドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARをコードするレンチウイルスベクターをT細胞に導入することによって作製することができる。1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望の二重特異性抗体を含むレンチウイルスベクターを、所望のCARを含むレンチウイルスベクターと組み合わせてT細胞に導入することによって作製することができる。もう1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19ドメイン、CD8αヒンジドメインおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCAR、ならびに所望の二重特異性抗体を含むレンチウイルスベクターをT細胞に導入することによって作製することができる。1つの態様において、本発明の改変T細胞はインビボで複製することができ、そのことは持続的な腫瘍制御につながりうる長期存続性をもたらす。
1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望の二重特異性抗体をコードするRNAをT細胞にトランスフェクトすることによって作製することができる。1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19ドメイン、CD8αヒンジドメインおよびCD3ζシグナル伝達ドメインをコードするCARをコードするRNAをT細胞にトランスフェクトすることによって作製することができる。1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望の二重特異性抗体をコードするRNAを、所望のCARをコードするRNAと組み合わせてT細胞にトランスフェクトすることによって作製することができる。もう1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19ドメイン、CD8αヒンジドメインおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARをコードし、かつ所望の二重特異性抗体をさらにコードするRNAを細胞にトランスフェクトすることによって作製することができる。1つの態様においては、CARと二重特異性抗体の両方を、遺伝子改変されたT細胞において一過性に発現させる。
1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19ドメイン、CD8αヒンジドメインおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARをコードするRNAをT細胞にトランスフェクトすること、ならびに所望の二重特異性抗体を含むレンチウイルスベクターを導入することによって作製することができる。もう1つの態様において、本発明の改変T細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19ドメイン、CD8αヒンジドメインおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARを含むレンチウイルスベクターをT細胞に導入すること、ならびに所望の二重特異性抗体をコードするRNAを細胞にトランスフェクトすることによって作製することができる。
1つの態様において、本発明は、ヒト化二重特異性抗体、ヒト化CAR、またはそれらの組み合わせを発現する遺伝子改変されたT細胞を、癌を有するかまたは癌を有するリスクのある患者の治療のために、リンパ球輸注を用いて投与することに関する。もう1つの態様において、本発明は、二重特異性抗体、CAR、またはそれらの組み合わせを発現する遺伝子改変されたT細胞を、癌を有するかまたは癌を有するリスクのある患者の治療のために、リンパ球輸注を用いて投与することに関する。自己リンパ球輸注を治療に用いることが好ましい。治療を必要とする患者から自己PBMCを収集し、T細胞を活性化した上で、本明細書に記載された当技術分野において公知の方法を用いて増大させ、続いて患者に輸注して戻す。
1つの態様において、本発明は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはそれらのフラグメントを含むCARに関する。1つの態様において、本発明は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはそれらのフラグメントを含む二重特異性抗体に関する。本発明は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体に由来する構築物が腫瘍抗原を特異的に認識するという発見に基づく。したがって、そのようなヒト構築物またはヒト化構築物を用いて、癌および他の障害を治療すること、ならびに免疫応答を誘導するリスクを避けることができる。
1つの態様において、本発明は、CARと二重特異性抗体とを発現する遺伝子改変されたT細胞に関する。本発明は、CARと二重特異性抗体との共発現により、腫瘍反応性および腫瘍溶解が有意に強化されたという知見に基づく。さらに、CARおよび二重特異性抗体を産生するようにT細胞を誘導することにより、非反応性T細胞が腫瘍反応性になるように補強される。このことにより、抗腫瘍薬の送達を、T細胞を用いて特定の腫瘍微小環境に局在化させるための方法が可能になる。1つの態様において、CAR T細胞は二重特異性抗体を腫瘍の部位に輸送し、それにより、二重特異性抗体の全身性送達に付随する毒性を軽減する。
1つの態様において、本発明は、二重特異性抗体を発現する遺伝子改変されたT細胞に関する。本発明は一部には、二重特異性抗体を発現するように改変されたT細胞が、CARを発現するように改変されたT細胞と同等の働きをするという知見に基づく。
さらにもう1つの態様において、本発明は、一般に、癌を発症するリスクのある患者の治療に関する。本発明はまた、患者における化学療法および／または免疫療法がその患者における著しい免疫抑制をもたらし、それにより、患者が癌を発症するリスクが高まるような悪性腫瘍または自己免疫疾患を治療することも含む。
本発明は、抗CD19 CARと二重特異性抗体とを発現するT細胞を用いることを含む。1つの態様において、本発明の抗CD19 CARおよび二重特異性抗体を発現するT細胞は、抗CD19 CARのみを発現するT細胞と比較して、強化された腫瘍認識および腫瘍溶解活性を示す。場合によっては、患者に輸注された本発明の改変T細胞は、癌の患者においてインビボで癌性細胞を排除することができる。しかし、本発明はCARを発現するT細胞には限定されない。より正確には、本発明は、CD137（4-1BB）シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメイン、およびそれらの任意の組み合わせから選択される1つまたは複数の細胞内ドメインと融合した、あらゆる抗原結合ドメインを含む。
定義
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等な任意の方法および材料を本発明の試験のために実地に用いることができるが、本明細書では好ましい材料および方法について説明する。本発明の説明および特許請求を行う上では、以下の専門用語を用いる。
また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定的であることは意図しないことも理解される必要がある。
「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）を指して用いられる。一例として、「1つの要素」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
量、時間的長さなどの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いる「約」は、特定された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、いっそうより好ましくは±0.1％のばらつきを範囲に含むものとするが、これはそのようなばらつきが、開示された方法を実施する上で妥当なためである。
「活性化」とは、本明細書で用いる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態のことを指す。また、活性化が、サイトカイン産生の誘導および検出可能なエフェクター機能を伴うこともある。「活性化されたT細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を行っているT細胞のことを指す。
「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子のことを指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫応答部分であってもよい。抗体は典型的には、免疫グロブリン分子のテトラマーである。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在しうる（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。
「抗体フラグメント」という用語は、無傷の抗体の一部分のことを指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域のことも指す。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント、直鎖状抗体、scFv抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が非限定的に含まれる。
「抗体重鎖」とは、本明細書で用いる場合、天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、大きい方のことを指す。
「抗体軽鎖」とは、本明細書で用いる場合、天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方のことを指す。κ軽鎖およびλ軽鎖とは、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプのことを指す。
「二重特異性抗体」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも2種類の異なる抗原エピトープに対する結合特異性を有する抗体のことを指す。1つの態様において、エピトープは同じ抗原に由来する。もう1つの態様において、エピトープは2つの異なる抗原に由来する。二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野において公知である。例えば、二重特異性抗体を、2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現を用いる組換え法によって作製することができる。例えば、Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39を参照。または、二重特異性抗体を化学結合を用いて調製することもできる。例えば、Brennan et al. (1985) Science 229:81を参照。二重特異性抗体には、二重特異性抗体フラグメントが含まれる。例えば、Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368。
本明細書で用いる「合成抗体」とは、組換えDNA技術を用いて作製される抗体、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現させた抗体のことを意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって作製される抗体であって、そのDNA分子が抗体タンパク質またはその抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、利用可能であって当技術分野において周知であるDNA配列またはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られたような抗体も意味するとみなされるべきである。
本明細書で用いる「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役を果たしうることを理解するであろう。その上、抗原が組換えDNAまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それ故に、本明細書中でその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。その上、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を非限定的に含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するさまざまな組み合わせで並べられていることは直ちに明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原を合成して作製することもでき、または生物試料から得ることもできることは直ちに明らかである。そのような生物試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液が非限定的に含まれうる。
本明細書で用いる「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、期待余命の延長、または癌性病状に付随するさまざまな生理的症状の改善によって明らかになる生物学的効果のことを指す。「抗腫瘍効果」はまた、腫瘍のそもそもの発生を予防する、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかになる。
「自己抗原」という用語は、本発明によれば、免疫系によって外来性であると認識されるあらゆる自己抗原のことを意味する。自己抗原には、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が非限定的に含まれる。
本明細書で用いる「自己免疫疾患」は、自己免疫反応に起因する障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例には、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症（alopecia greata）、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（1型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー（Guillain-Barr）症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、尋常性白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が非限定的に含まれる。
本明細書で用いる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。
「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片のことを指す。
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。
本明細書で用いる「癌」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。さまざまな癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが非限定的に含まれる。
「共刺激リガンド」には、この用語が本明細書で用いられる場合、T細胞上のコグネイト共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子のTCR／CD3複合体への結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを非限定的に含むT細胞応答を媒介するシグナルも与えることのできる、抗原提示細胞（例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）上の分子が含まれる。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞内接着分子（ICAM）、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3／TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが非限定的に含まれる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3などの、ただしこれらに限定されない、T細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、およびCD83に特異的に結合するリガンドも包含する。
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、増殖などの、ただしこれに限定されない、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーのことを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が非限定的に含まれる。
「共刺激シグナル」とは、本明細書で用いる場合、TCR／CD3連結などの一次シグナルとの組み合わせで、T細胞の増殖、および／または鍵となる分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導く分子のことを指す。
「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善しなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことを指す。対照的に、動物における「障害」とは、その動物が恒常性を維持することはできるが、その動物の健康状態が、障害の非存在下にあるよりもより不都合である健康状態のことである。治療されないままであっても、障害は必ずしもその動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
本明細書で用いる「有効量」とは、治療的または予防処置的な有益性をもたらす量のことを意味する。
「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物過程において他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性のことを指す。すなわち、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、そのタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であって通常は配列表として提示されるヌクレオチド配列を有するコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称することができる。
本明細書で用いる場合、「内因性」とは、生物体、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の材料のことを指す。
本明細書で用いる場合、「外因性」という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系に導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の材料のことを指す。
本明細書で用いる「発現」という用語は、そのプロモーターによって作動する特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）といった、当技術分野において公知であるすべてのものが含まれる。
「相同な」とは、2つのポリペプチドの間または2つの核酸分子の間の配列類似性または配列同一性のことを指す。比較する2つの配列の両方において、ある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおいて、ある位置がアデニンによって占められている場合には、それらの分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同度（percent of homology）は、2つの配列が共通して持つ一致する位置または相同な位置の数を、比較する位置の数によって除算した上で100を掛けた関数である。例えば、2つの配列中の10個の位置のうち6個が一致するかまたは相同であるならば、2つの配列は60％相同である。一例として、DNA配列ATTGCCおよびTATGGCは50％の相同性を有する。一般に、比較は、最大の相同性が得られるように2つの配列のアラインメントを行った上で行われる。
「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、本明細書で用いる場合、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現させた抗体は、BCR（B細胞受容体）または抗原受容体と称されることも時にある。このタンパク質のクラスに含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な流血中抗体である。IgMは、ほとんどの哺乳動物で一次免疫応答において産生される主な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時にマスト細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
本明細書で用いる場合、「説明材料（instructional material」には、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いうる、刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含む容器に添付してもよく、または核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷してもよい。または、説明材料および化合物がレシピエントによって一体として用いられることを意図して、説明材料を容器と別に出荷してもよい。
「単離された」とは、天然の状態から変更されるかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもでき、または例えば宿主細胞などの非ネイティブ性環境で存在することもできる。
本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略語を用いる。「A」はアデノシンのことを指し、「C」はシトシンのことを指し、「G」はグアノシンのことを指し、「T」はチミジンのことを指し、「U」はウリジンのことを指す。
別に指定する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロンを含みうる限り、イントロンも含まれうる。
本明細書で用いる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科（Retroviridae）ファミリーの属のことを指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させうるという点で、レトロウイルスの中でも独特である；それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボでかなり高いレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。
「モジュレートする」という用語は、本明細書で用いる場合、治療もしくは化合物の非存在下でのその対象における反応のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における反応のレベルと比較して、対象における反応のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、ネイティブ性のシグナルまたは反応を擾乱させるか、および／またはそれに影響を及ぼして、それにより、有益な治療反応を媒介することを包含する。
別に指定する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であって、かつ同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列が、イントロンを含んでもよい。
「機能的に連結した」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす機能的連結のことを指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。一般に、機能的に連結したDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルに比して異常なレベルであることを指し示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において公知の標準的なアッセイによって判定することができる。
免疫原性組成物の「非経口的」投与には、例えば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）または胸骨内の注射法または輸注法が含まれる。
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書に記載の方法を適用しうる、インビトロまたはインサイチューの別を問わない、任意の動物またはその細胞のことを指す。ある非限定的な態様において、患者、対象または個体はヒトである。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの連鎖と定義される。その上、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらはモノマー性「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。モノマー性ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書で用いるポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCRなどを用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすること、および合成手段を非限定的に含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる、すべての核酸配列が非限定的に含まれる。
本明細書で用いる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般にタンパク質と称される長鎖の両方のことを指し、それらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、いくつか例を挙げると、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で用いる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
本明細書で用いる場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列と機能的に連結した遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の制御エレメントをも含んでもよい。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。
「構成性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的にはそのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的には細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
「特異的に結合する」という用語は、抗体に関して本明細書で用いる場合、試料中の特異的な抗原を認識するが、他の分子は実質的に認識もせず、それらと結合もしない抗体のことを意味する。例えば、1つの種由来の抗原と特異的に結合する抗体が、1つまたは複数の種由来のその抗原と結合してもよい。しかし、そのような種間反応性はそれ自体では、抗体の分類を特異的として変更させることはない。もう1つの例において、抗原と特異的に結合する抗体が、その抗原の異なるアレル形態と結合してもよい。しかし、そのような交差反応性はそれ自体では、抗体の分類を特異的として変更させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質またはペプチドの第2の化学種との相互作用に言及して、その相互作用が、化学種での特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味して用いることができる；例えば、ある抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識してそれと結合する。抗体がエピトープ「A」に対して特異的であるならば、エピトープAを含有する分子（または遊離した非標識A）の存在は、標識「A」およびその抗体を含む反応において、その抗体と結合した標識Aの量を減少させると考えられる。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、TCR／CD3複合体）がそのコグネイトリガンドと結合して、それにより、TCR／CD3複合体を介するシグナル伝達などの、ただしこれには限定されないシグナル伝達イベントを媒介することによって誘導される、一次応答のことを意味する。刺激は、TGF-βのダウンレギュレーション、および／または細胞骨格構造の再構築などのような、ある種の分子の発現の改変を媒介してもよい。
「刺激分子」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドに特異的に結合する、T細胞上の分子のことを意味する。
「刺激リガンド」とは、本明細書で用いる場合、抗原提示細胞（例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）上に存在する場合に、T細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称する）と特異的に結合して、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖などを非限定的に含む、T細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドのことを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
「対象」、「患者」、および「個体」という用語は本明細書において互換的に用いられ、免疫応答を惹起させることができる、生きている生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。
本明細書で用いる場合、「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞のことである。また、実質的に精製された細胞とは、その天然の状態に本来付随する他の細胞型から分離された細胞のことも指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団のことを指す。また別の場合には、この用語は、単に、天然の状態において本来付随する細胞から分離された細胞のことを指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。
本明細書で用いる「治療的」という用語は、治療および／または予防処置のことを意味する。治療効果は、疾病状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床専門家が詳しく調べようとしている、組織、系または対象の生物学的または医学的な反応を誘発すると考えられる対象化合物の量のことを指す。「治療的有効量」という用語には、投与された場合に、治療される障害または疾患の徴候または症状のうち1つもしくは複数の発生を予防するか、またはそれをある程度改善するのに十分な、化合物の量が含まれる。治療的有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに応じて異なると考えられる。
ある疾患を「治療する」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。
本明細書で用いる「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程のことを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外因性核酸をトランスフェクトされた、外因性核酸によって形質転換された、または外因性核酸を形質導入された細胞である。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
本明細書で用いる「転写制御下」または「機能的に連結した」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために正しい位置および向きにあることを意味する。
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いうる組成物のことである。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを非限定的に含む数多くのベクターが、当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが非限定的に含まれる。
範囲：本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解される必要がある。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分的範囲とともに、個々の数値も具体的に開示されていると考慮されるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分的範囲とともに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6も、具体的に開示されていると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。
説明
本発明は、癌および他の疾患を治療するための組成物および方法を提供する。癌は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発性または転移性の腫瘍であってよい。本発明の組成物および方法を用いて治療しうる他の疾患には、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、ならびに自己免疫疾患が含まれる。
1つの態様において、本発明は、CARを発現するように操作された細胞（例えば、T細胞）であって、抗腫瘍性を呈するCAR T細胞を提供する。好ましい態様において、CARはヒト化CARである。本発明のCARは、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖（例えば、CD3ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインと融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作することができる。本発明のCARは、T細胞によって発現させた場合に、抗原結合特異性に基づく抗原認識を再誘導することができる。例示的な抗原はCD19であるが、これはこの抗原がB細胞リンパ腫上で発現するためである。しかし、本発明は、CD19のターゲティングには限定されない。より正確には、本発明は、そのコグネイト抗原と結合した場合に腫瘍細胞に影響を及ぼし、その結果、腫瘍細胞が成長できなくなるか、死滅するように促されるか、または患者における腫瘍総量（tumor burden）が漸減するかもしくは消失する他の様式で影響を受けるような、あらゆる抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、共刺激分子およびζ鎖のうち1つまたは複数からの細胞内ドメインと融合していることが好ましい。抗原結合ドメインは、CD137（4-1BB）シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメイン、およびこれらの任意の組み合わせの群から選択される1つまたは複数の細胞内ドメインと融合していることが好ましい。
1つの態様において、本発明は、二重特異性抗体を発現するように操作されたT細胞を提供する。1つの態様において、二重特異性抗体はヒト抗体、またはそのフラグメントを含む。1つの態様において、二重特異性抗体はヒト化抗体、またはそのフラグメントを含む。二重特異性抗体は2つの異なる結合特異性を含む。1つの態様において、二重特異性抗体は腫瘍抗原と結合する領域を含む。1つの態様において、二重特異性抗体はT細胞抗原と結合する領域を含む。例えば、1つの態様において、二重特異性抗体はCD3と結合する。
1つの態様において、本発明は、CARと二重特異性抗体とを発現するように操作されたT細胞を提供する。いくつかの態様において、CARはヒト化CARである。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、CARによって認識されるのと同じ抗原を認識する。他の態様において、二重特異性抗体は異なる抗原を認識する。本発明は、CARと二重特異性抗体の両方を発現するように改変されたT細胞が、強化された腫瘍認識および腫瘍溶解活性を示すという発見に基づく。さらに、CARと二重特異性抗体との共発現または共導入により、非反応性T細胞が腫瘍反応性になることが可能になる。したがって、本発明は、腫瘍微小環境への二重特異性抗体の特異的送達を提供し、それにより、二重特異性抗体の全身性送達に付随する毒性を緩和する。
いくつかの態様において、本発明は、T細胞に安定的に組み込まれ、かつその中で安定的に発現される、CARおよび／または二重特異性抗体をコードするレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを対象とする。他の態様において、本発明は、T細胞内にトランスフェクトされ、かつその中で一過性に発現される、CARおよび／または二重特異性抗体をコードするRNAを対象とする。細胞におけるCARおよび二重特異性抗体の一過性の非組み込み型発現により、細胞における永続的かつ組み込み型の発現に付随する懸念は軽減される。
いくつかの態様において、本発明は、CAR操作T細胞（CAR engineered T cell）の抗腫瘍活性を強化する目的で、二重特異性抗体をCD19 CARとともに導入することを含む。1つの態様において、二重特異性抗体はRNAの形態にある。もう1つの態様において、CD19 CARはRNAの形態にある。さらにもう1つの態様において、二重特異性抗体およびCD19 CARはRNAの形態にある。
1つの態様においては、二重特異性抗体RNAをCD19 CARとともに導入することにより、CAR操作T細胞の抗腫瘍活性が強化される。さらに、T細胞への二重特異性抗体RNAの導入により、非腫瘍反応性T細胞が腫瘍反応性にされ、このことは、T細胞を用いることによって抗腫瘍薬を癌患者の体内に送達および輸送する新規な手段を提供する。これは、積み荷（BiTE）を腫瘍部位へと運ぶCAR T細胞のおかげで二重特異性抗体の送達を腫瘍微小環境に集中させることによって、全身性BiTEの毒性を軽減する。
組成物
本発明は、細胞外および細胞内のドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を含む。いくつかの態様において、本発明のCARはヒト化されている。細胞外ドメインは、別の言い方では抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合エレメントを含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインはヒンジドメインも含む。細胞内ドメイン、または別の言い方では細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な反応のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。
CARの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはCARの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを組み入れてもよい。本明細書で用いる場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般に、ポリペプチド鎖中の膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結させる働きをするオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。スペーサードメインは、最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸で構成されうる。
本発明は、細胞内に直接的に形質導入しうる、CARを発現するレトロウイルスベクター構築物およびレンチウイルスベクター構築物を含む。本発明はまた、細胞内に直接的にトランスフェクトすることができるRNA構築物も含む。トランスフェクションに用いるためのmRNAを作製するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いるテンプレートのインビトロ転写（IVT）、およびその後のポリA付加によって、3'および5'非翻訳配列（「UTR」）、5'キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位（IRES）、発現させようとする遺伝子、ならびに典型的には長さが50〜2000塩基であるポリA尾部を含有する構築物を生成させることを伴う。そのようにして生成されたRNAを、さまざまな種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。1つの態様において、テンプレートはCAR用の配列を含む。
好ましくは、CARは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、そのようなドメインの任意の所望の供給源から導き出すことができる。場合によっては、本発明のCARのヒンジドメインは、CD8αヒンジドメインを含む。1つの態様において、CARは、SEQ ID NO：20〜23のいずれか1つの核酸配列を含む。1つの態様において、CARは、SEQ ID NO：20〜23のいずれか1つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
抗原結合ドメイン
1つの態様において、本発明のCARは、別の言い方では抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合エレメントを含む。モイエティーの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数によって決まる。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾病状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。このように、本発明のCARにおける抗原モイエティードメインとして作用しうる細胞表面マーカーの例には、ウイルス感染、細菌感染症および寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびに癌細胞と関連するものが含まれる。
1つの態様において、本発明のCARは、腫瘍細胞上の抗原と特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを作製することによって、関心対象の腫瘍抗原を標的とするように操作することができる。本発明に関連して、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性（hyperporoliferative）障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」とは、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原のことを指す。本明細書で考察する抗原は、単に一例として含めているに過ぎない。リストは排他的であることを意図してはおらず、そのほかの例も当業者には容易に明らかとなるであろう。
腫瘍抗原とは、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質のことである。本発明の抗原結合ドメインの選択は、治療される癌の具体的な種類に依存すると考えられる。腫瘍抗原は当技術分野において周知であり、これには例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（CEA）、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、Her2／neu、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体ならびにメソテリンが含まれる。
1つの態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する1つまたは複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原としての役を果たしうる数多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるMART-1、チロシナーゼおよびGP 100、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）および前立腺特異的抗原（PSA）などの組織特異的抗原が非限定的に含まれる。他の標的分子には、腫瘍遺伝子HER-2／Neu／ErbB-2などの形質転換関連分子の群に属するものがある。標的抗原のさらにもう1つの群には、腫瘍胎児性抗原などの癌胎児性抗原（CEA）がある。B細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有である、真に腫瘍特異的である免疫グロブリン抗原で構成される。CD19、CD20およびCD37などのB細胞分化抗原は、B細胞リンパ腫における標的抗原の別の候補である。これらの抗原のいくつか（CEA、HER-2、CD19、CD20、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として用いられ、ある程度の成果を上げている。
本発明において言及される腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異的抗原（TSA）または腫瘍関連抗原（TAA）であってもよい。TSAは腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上には存在しない。TAA関連抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で、正常細胞上でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こりうる。TAAは、免疫系が未熟であって応答することができない胎児発生中に正常細胞上で発現する抗原であってよく、またはそれらは、正常細胞上に極めて低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現する抗原であってもよい。
TSA抗原またはTAA抗原の非限定的な例には、以下のものが含まれる：MART-1／MelanA（MART-I）、gp100（Pmel 17）、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2などの分化抗原、およびMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15などの腫瘍特異的多系列抗原；過剰発現する胎児抗原、例えばCEAなど；過剰発現する腫瘍遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、Ras、HER-2／neuなど；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原；BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RARなど；ならびに、ウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原EBVAならびにヒトパピローマウイルス（HPV）抗原E6およびE7など。その他の大型のタンパク質ベースの抗原には、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68＼P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733＼EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB／70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90＼Mac-2結合タンパク質＼シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、およびTPSが含まれる。
1つの好ましい態様において、CARの抗原結合ドメイン部分は、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCRなどを非限定的に含む抗原を標的とする。
標的にすることが望まれる抗原に応じて、本発明のCARを、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合モイエティーを含むように操作することができる。例えば、標的にすることが望まれる抗原がCD19であるならば、CD19に対する抗体を、本発明のCARに組み入れるための抗原結合モイエティーとして用いることができる。1つの態様において、本発明のCARの抗原結合ドメイン部分は、CD19を標的とする。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらのフラグメントを非限定的に含む、抗原と結合する任意のドメインでありうる。場合によっては、抗原結合ドメインは、CARが最終的に用いられることになるものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトで用いる目的には、CARの抗原結合ドメインがヒト抗体またはそのフラグメントを含むことが有益であると考えられる。したがって、1つの態様において、抗原結合（biding）ドメイン部分はヒト抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、SEQ ID NO：20の抗原結合ドメインは完全ヒト起源である。
ヒトにおける抗体のインビボ使用のためには、ヒト抗体を用いることが好ましいと考えられる。ヒト対象の治療的処置のためには、完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を、これらの手法の改良法と併せて含む、当技術分野において公知の種々の方法によって作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにPCT公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735およびWO 91/10741も参照されたい；これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、ヒト抗体が、重鎖および軽鎖がヒトDNAの1つまたは複数の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされている抗体であってもよい。
また、ヒト抗体を、機能的内因性免疫グロブリンを発現する能力はないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することはできるトランスジェニックマウスを用いて産生させることもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞に導入することができる。または、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することもできる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々または同時に、非機能性にすることができる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列突然変異型マウスにおける抗体重鎖連結領域（JH）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。この改変された胚性幹細胞を増やし、胚盤胞に微量注入してキメラマウスを生じさせる。続いて、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスに対して、通常の様式で、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部分による免疫処置を行う。免疫処置を行ったトランスジェニックマウスから、ヒトCD19抗原を対象とする抗CD19抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて入手することができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞分化の際に再編成され、その後にクラススイッチおよび体細胞突然変異を起こす。したがって、そのような手法を用いて、IgG1（γ1）およびIgG3を非限定的に含む、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生させることが可能である。ヒト抗体を産生させるためのこの技術の概略については、Lonberg and Huszar（Int. Rev. Immunol, 13:65-93 (1995)）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのこの技術の詳細な考察、ならびにそのような抗体を産生させるためのプロトコールについては、例えば、PCT公開WO 98/24893、WO 96/34096およびWO 96/33735；ならびに米国特許第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；および第5,939,598号も参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、Abgenix, Inc.（Freemont, Calif.）およびGenpharm（San Jose, Calif.）などの会社と、選択した抗原を対象とするヒト抗体を、上記のものに類似した技術を用いて得るための契約を結ぶこともできる。抗原負荷刺激によってヒト抗体の産生がもたらされると考えられる、生殖系列突然変異型マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入に関する具体的な考察については、例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993)；およびDuchosal et al., Nature, 355:258 (1992)を参照されたい。
また、ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリーから導き出すこともできる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)；Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)）。ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)）は、免疫処置を受けていないドナーの免疫グロブリン可変（V）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生させるために用いることができる。この手法によれば、抗体Vドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばM13またはfdの主要コートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子中にインフレームでクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。このため、ファージはB細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは種々のフォーマットで行うことができる；それらの概説については、Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫処置を受けたマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。免疫処置を受けていないヒトドナーからV遺伝子のレパートリーを構築して、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、本質的にはMarks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993)に記載された手法に従って単離することができる。米国特許第5,565,332号および第5,573,905号も参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
また、ヒト抗体をインビトロ活性化B細胞によって作製することもできる（米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。また、ヒト抗体を、限定はされないが、Roder et al.（Methods Enzymol, 121:140-167 (1986)）によって記載されたものなどのハイブリドーマ手法を用いてインビトロで作製することもできる。
または、いくつかの態様においては、非ヒト抗体をヒト化し、この場合には、抗体の特定の配列または領域を、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を高めるために改変する。1つの態様において、抗原結合ドメイン部分はヒト化される。例えば、SEQ ID NO：21の抗原結合ドメインはヒト化される。
ヒト化抗体は、以下のものを非限定的に含む、当技術分野において公知の種々の手法を用いて生成させることができる：CDRグラフティング（例えば、欧州特許EP 239,400；国際公開WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（例えば、欧州特許EP 592,106およびEP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814；およびRoguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、チェーンシャッフリング（chain shuffling）（例えば、米国特許第5,565,332号を参照。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ならびに例えば、米国特許出願公開US2005/0042664、米国特許出願公開US2005/0048617、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開WO 9317105、Tan et al., J. Immunol, 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10(1994)、およびPedersen et al., J. Mol. Biol, 235(3):959-73 (1994)に開示された手法、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。多くの場合、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変更するため、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体由来の対応する残基によって置換されると考えられる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、例えば抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためにCDRとフレームワーク残基との相互作用をモデリングすることによって、および特定の位置にある異常なフレームワーク残基を同定するために配列比較によって同定される（例えば、Queen et al., 米国特許第5,585,089号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から該抗体中に導入された、1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから採られる。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の1つまたは複数のCDR、およびヒト由来のフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当技術分野において周知であり、本質的にはWinterらの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従って、ヒト抗体の対応する配列を齧歯動物のCDRまたはCDR配列へと置換すること、すなわち、CDRグラフティング（EP 239,400；PCT公開WO 91/09967；および米国特許第4,816,567号；第6,331,415号；第5,225,539号；第5,530,101号；第5,585,089号；第6,548,640号。これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）によって行うことができる。そのようなヒト化キメラ抗体では、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際上は、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基およびおそらくはいくつかのFR残基が、齧歯動物抗体における類似部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。また、抗体のヒト化を、ベニヤリングもしくはリサーフェイシング（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)）またはチェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）によって達成することもでき、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ヒト化抗体を作製する上で用いられる、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させることを目的とする。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。続いて、齧歯動物のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（FR）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。もう1つの方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
抗体は、標的抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保ったままでヒト化することができる。本発明の1つの局面によれば、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列およびさまざまな概念上のヒト化産物の分析の過程によって、ヒト化抗体が調製される。免疫グロブリンの三次元モデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列に関して可能性のある三次元立体構造を図示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大といった所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関与している。
「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性、すなわち、本発明においては、ヒトCD19抗原と結合する能力を保っている。しかし、特定のヒト化方法を用いると、ヒトCD19抗原に対する抗体の結合の親和性および／または特異性を、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wu et al., J. Mol. Biol, 294:151 (1999)によって記載されたような「定方向進化」の方法を用いて高めることができる。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、CARは、CARの細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含むように設計することができる。1つの態様においては、CARの中のドメインの1つに天然に付随する膜貫通ドメインを用いる。場合によっては、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けるように選択すること、またはそのためのアミノ酸置換によって選択もしくは改変することもできる。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合には、ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本発明において特に有用性のある膜貫通領域は、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOSに由来しうる（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。または、膜貫通ドメインが合成性であってもよく、この場合には、それは主として、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと考えられる。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に認められるであろう。任意で、好ましくは長さが2〜10アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連鎖を形成してもよい。グリシン-セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。
細胞質ドメイン
本発明のCARの細胞質ドメイン、または別の言い方では細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが入れられた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも1つの活性化の原因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化した機能のことを指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であろう。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達して、細胞が特化した機能を遂行するように導く、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用しうるが、多くの場合には、その鎖全体を用いることは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分（truncated portion）が用いられる範囲内において、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、それ故に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むものとする。
本発明のCARに用いるための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原と受容体との係合後にシグナル伝達を惹起するように協調的に作用するT細胞受容体（TCR）および補助受容体の細胞質配列、ならびに、同じ機能的能力を有する、これらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列が含まれる。
TCRのみを通じて生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化のためには不十分であること、および二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされることが公知である。このため、T細胞活性化は、2つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができる：TCRを通じての抗原依存的な一次活性化を惹起するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および、抗原非依存的な様式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的な方式または阻害的な方式で、TCR複合体の一次活性化を調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）すなわちITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有しうる。
本発明において特に有用性のある、ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例には、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれる。本発明のCARにおける細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
1つの好ましい態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζシグナル伝達ドメインを、それ自体で、または本発明のCARの文脈において有用な他の任意の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように、設計することができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な反応のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。そのような分子の例には、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。したがって、本発明は、主として4-1BBを共刺激シグナル伝達エレメントとして用いて例示されるものの、他の共刺激エレメントも本発明の範囲内にある。
本発明のCARの細胞質シグナル伝達部分の内部の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結させることができる。任意で、好ましくは長さが2〜10アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが連鎖を形成してもよい。グリシン-セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。
1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。もう1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
二重特異性抗体
本発明はまた、二重特異性抗体も提供する。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有し、それ故に2種類の異なる抗原と結合する。1つの態様において、二重特異性抗体は、第1の抗原と結合する第1の抗原認識ドメインおよび第2の抗原と結合する第2の抗原認識ドメインを含む。1つの態様において、第1の抗原認識ドメインは腫瘍関連抗原と結合する。本明細書中の他所で記載したように、二重特異性抗体は、本発明のCARによって認識される同じまたは異なる腫瘍抗原を認識することができる。1つの態様において、第2の抗原認識領域はT細胞抗原と結合する。例えば、二重特異性抗体はCD3を認識することができる。場合によっては、T細胞抗原を認識する二重特異性抗体は、二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）と称される。例示的なBiTEはブリナツモマブ（Amgenから入手可能）であり、これは抗CD19ドメインおよび抗CD3ドメインを含む。ブリナツモマブ（Blina）はSEQ ID NO：1の核酸配列によってコードされる。しかし、本発明は、いかなる特定の二重特異性抗体の使用にも限定されない。そうではなくて、あらゆる二重特異性抗体またはBiTEを用いることができる。腫瘍関連抗原の例は本明細書中の他所に記載されており、本発明の二重特異性抗体はそれらのすべてを標的とすることができる。1つの態様において、二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはそれらのフラグメントを含む。ヒト抗体およびヒト化抗体を作製するための手法は、本明細書中の他所に記載されている。
二重特異性抗体を作製するための手法には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）、および「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」操作（例えば、米国特許第5,731,168号を参照）が非限定的に含まれる。また、抗体Fc-ヘテロダイマー分子を作製するために静電ステアリング効果を操作すること（WO 2009/089004A1）；2つまたはそれを上回る抗体またはフラグメントを架橋させること（例えば、米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照）；二重特異性抗体を生成させるためにロイシンジッパーを用いること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を用いること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；および単鎖Fv（scFv）ダイマーを用いること（例えば、Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)を参照）；および、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)に記載されたように三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。「オクトパス（Octopus）抗体」を含む、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含められる（例えば、US 2006/0025576A1を参照）。二重特異性抗体を、2種類の抗体またはそれらの部分を連結することによって構築することもできる。例えば、二重特異性抗体は、2種類の抗体由来のFab、F(ab')2、Fab'、scFv、およびsdAbを含みうる。
ベクター
本発明は、CARの配列を含む核酸構築物を範囲に含み、ここでその配列は、細胞内ドメインの核酸配列と機能的に連結された抗原結合モイエティーの核酸配列を含む。本発明のCARにおいて用いうる例示的な細胞内ドメインには、CD3-ζ、CD28、4-1BBなどの細胞内ドメインが非限定的に含まれる。場合によっては、CARは、CD3-ζ、CD28、4-1BBなどの任意の組み合わせを含みうる。本発明はまた、二重特異性抗体の配列を含む核酸構築物も範囲に含む。本発明はさらに、CARの配列を含む核酸構築物も範囲に含み、ここでその配列は、細胞内ドメインの核酸配列と機能的に連結された抗原結合ドメインの核酸配列を含み、核酸構築物は二重特異性抗体の核酸配列も含む。
1つの態様において、本発明のCARは、抗CD19 抗原結合ドメイン、ヒトCD8のヒンジ、およびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO：20〜23のうちの1つに示された核酸配列を含む。
1つの態様において、抗体の二重特異性抗体は、SEQ ID NO：1〜19のうちの1つに示された核酸配列を含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野において公知の組換え方法、例えば、標準的な手法を用いて、その遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが公知であるベクターから遺伝子を導き出すことによって、またはそれを含有する細胞および組織から直接的に単離することなどによって、入手することができる。または、関心対象の遺伝子を、クローニングするのではなくて、合成によって作製することもできる。
本発明はまた、本発明の核酸が挿入されたベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、長期的遺伝子移入を達成するための適したツールであるが、これはそれらが、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み、および娘細胞におけるその伝播を可能にするためである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターを上回る利点を有するが、これはそれらが、肝細胞などの非増殖性細胞の形質導入も行うことができるためである。また、それらには免疫原性が低いという利点も加わっている。
概要を述べると、CARをコードする天然性または合成性の核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチドまたはその部分をコードする核酸をプロモーターと機能的に連結させて、その構築物を発現ベクター中に組み入れることによって達成される。ベクターは、真核生物における複製および組み込みのために適している。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節のために有用なプロモーターを含有する。
また、本発明の発現構築物を、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いる核酸免疫処置および遺伝子治療のために用いることもできる。遺伝子送達のための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。もう1つの態様において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
核酸は、さまざまな種類のベクター中にクローニングすることができる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを非限定的に含むベクター中にクローニングすることができる。特に関心が持たれるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターが含まれる。
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に与えることもできる。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）、ならびにウイルス学および分子生物学の他のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが非限定的に含まれる。一般に、適したベクターは、少なくとも1つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する（例えば、WO 01/96584；WO 01/29058；および米国特許第6,326,193号を参照）。
数多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームとなる。当技術分野において公知の手法を用いて、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子の中にパッケージングすることができる。続いて、組換えウイルスを単離して、対象の細胞にインビボまたはエクスビボで送達することができる。数多くのレトロウイルス系が当技術分野において公知である。いくつかの態様においては、アデノウイルスベクターを用いる。数多くのアデノウイルスベクターが当技術分野において公知である。1つの態様においては、レンチウイルスベクターを用いる。
そのほかのプロモーターエレメント、例えばエンハンサーなどは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、数多くのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが最近示されている。多くの場合、プロモーターエレメント間の間隔には柔軟性があり、そのため、エレメントが互いに対して逆位になったり移動したりしてもプロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ（tk）プロモーターでは、反応性の低下を起こすことなく、プロモーターエレメント間の間隔を50bpまで隔てることができる。プロモーターによっては、個々のエレメントが協調的に、または独立して、転写を活性化しうるように思われる。
適したプロモーターの一例は、サイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと機能的に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を作動させることのできる、強力な構成性プロモーター配列である。適したプロモーターのもう1つの例は、伸長成長因子-1α（Elongation Growth Factor-1α）（EF-1α）である。しかし、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）長末端反復配列（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなどの、ただしこれらには限定されないヒト遺伝子プロモーターを非限定的に含む、他の構成性プロモーター配列を用いることもできる。さらに、本発明は、構成性プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として想定している。誘導性プロモーターの使用により、それと機能的に連結しているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が所望である場合には有効にし、発現が所望でない場合には発現を無効にすることができる、分子スイッチがもたらされる。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネイン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが非限定的に含まれる。
CARポリペプチドまたはその部分の発現を評価する目的で、ウイルスベクターをトランスフェクトまたは感染させようとする細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、細胞に導入される発現ベクターに、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方を含有させることもできる。他の局面において、選択マーカーを別個のDNA小片上に保有させて、同時トランスフェクション手順に用いることもできる。宿主細胞における発現を可能にするために、選択マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子をいずれも、適切な調節配列に隣接させることができる。有用な選択マーカーには、例えば、neoなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために用いられる。一般に、レポーター遺伝子とは、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれらによって発現せず、かつ、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって顕在化するポリペプチドをコードする、遺伝子のことである。レポーター遺伝子の発現は、核酸がレシピエント細胞に導入された後の適した時点でアッセイされる。適したレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌性アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光性タンパク質の遺伝子が含まれうる（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479:79-82）。適した発現系は周知であり、公知の手法を用いて調製すること、または販売されているものを入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最も高レベルでの発現を示す最小限の5'フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子と連結させて、プロモーターにより作動する転写を作用物質がモジュレートする能力を評価するために用いることができる。
細胞に遺伝子を導入して発現させる方法は、当技術分野において公知である。発現ベクターに関連して、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞に、当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、当該技術分野のいずれの方法によっても、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞にベクターを容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrookら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）を参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のために好ましい方法の1つは、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなど、ならびに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達媒体として用いるための例示的なコロイド系の1つは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス性送達系を利用する場合には、例示的な送達媒体の1つはリポソームである。脂質製剤の使用を、宿主細胞への核酸の導入のために想定している（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）。もう1つの局面において、核酸を脂質と付随させてもよい。脂質と付随した核酸をリポソームの水性内部の中に封入し、リポソームの脂質二重層の内部に配置させ、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と付随する連結分子を介してリポソームと連結させ、リポソーム内に封じ込め、リポソームと複合体化させ、脂質を含有する溶液中に分散させ、脂質と混合し、脂質と配合し、脂質中に懸濁物として含有させ、ミセル中に含有させるかもしくは複合体化させ、または他の様式で脂質と付随させることができる。脂質、脂質／DNAまたは脂質／発現ベクターが付随する組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二重層構造の中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造として存在しうる。それらはまた、溶液中に単に点在していて、大きさも形状も均一でない凝集物を形成する可能性があってもよい。脂質とは、天然脂質または合成脂質であってよい脂肪性物質のことである。例えば、脂質には、細胞質中に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物のクラス、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどが含まれる。
使用に適した脂質は、販売元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はSigma, St. Louis, MOから入手することができ；ジアセチルホスファート（「DCP」）はK & K Laboratories（Plainview, NY）から入手することができ；コレステロール（「Choi」）はCalbiochem-Behringから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.（Birmingham, AL）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中にある脂質の貯蔵溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、それを唯一の溶媒として用いることが好ましい。「リポソーム」とは、閉じた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される、種々の単層および多重層の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜による小胞構造および内部の水性媒質を有するものとして特徴づけることができる。多重層リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水性溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こし、その後に閉鎖構造の形成が起こり、水および溶解溶質を脂質二重層の間に封じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5:505-10）。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も想定している。例えば、脂質がミセル構造をとってもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集物として存在してもよい。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定している。
宿主細胞における組換えDNA配列の存在を確かめる目的で、宿主細胞に外因性核酸を導入するため、または他の様式で細胞を本発明の阻害因子に曝露させるために用いられる方法にかかわらず、種々のアッセイを用いることができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RT-PCRおよびPCRなど；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ELlSAおよびウエスタンブロット）または本発明の範囲内にある作用物質を同定するための本明細書に記載のアッセイにによって、特定のペプチドの有無を検出すること、などが含まれる。
RNAトランスフェクション
1つの態様において、本発明の遺伝子改変されたT細胞は、RNAの導入を通じて改変される。1つの態様においては、インビトロで転写されたRNA CARを、一過性トランスフェクションの形態で細胞に導入することができる。もう1つの態様において、RNA CARは、二重特異性抗体をコードするインビトロ転写されたRNAとともに導入される。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生じたテンプレートを用いるインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの関心対象のDNAを、PCRによって、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いるインビトロmRNA合成のためのテンプレートに直接変換することができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、またはDNAの他の任意の適切な供給源でありうる。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、本発明のCARおよび／または二重特異性抗体である。一例を挙げると、テンプレートは、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン；CD8aのヒンジおよび膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン；ならびにCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。もう1つの例を挙げると、テンプレートは二重特異性抗体を含む。もう1つの例を挙げると、テンプレートは、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン；CD8aのヒンジおよび膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン；ならびにCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメイン、ならびに二重特異性抗体を含む。1つの態様において、RNA-CARのためのテンプレートは、SEQ ID NO：20〜23の1つである。1つの態様において、二重特異性抗体をコードするRNAのためのテンプレートは、SEQ ID NO：1〜19の1つである。
1つの態様において、PCRのために用いられるDNAは、オープンリーディングフレームを含む。DNAは、生物のゲノム由来の天然のDNA配列に由来しうる。1つの態様において、DNAは、遺伝子の一部分の関心対象の完全長遺伝子である。遺伝子は、5'および／または3'非翻訳領域（UTR）の一部または全体を含みうる。遺伝子は、エクソンおよびイントロンを含みうる。1つの態様において、PCRのために用いられるDNAはヒト遺伝子である。もう1つの態様において、PCRのために用いられるDNAは、5'および3' UTRを含むヒト遺伝子である。あるいはDNAは、天然の生物において通常は発現されない人工DNA配列であってもよい。例示的な人工DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように一緒に連結される、複数の遺伝子の部分を含むものである。一緒に連結されるDNAの複数の部分は、単一の生物に由来しても、または複数の生物に由来してもよい。
PCRのためのDNAの供給源として用いうる遺伝子には、生物に治療的もしくは予防処置的な効果をもたらすまたは生物における疾患もしくは障害を診断するために用いうるポリペプチドを、コードする遺伝子が含まれる。好ましい遺伝子は、短期治療のために、または、投与量もしくは発現される遺伝子に関して安全性の懸念がある場合に、有用な遺伝子である。例えば、癌、自己免疫障害、寄生虫感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または他の感染症の治療の場合、発現させようとする導入遺伝子は、免疫系の細胞にとってリガンドもしくは受容体として機能するか、または生物の免疫系を刺激もしくは阻害するように機能しうるポリペプチドをコードしてよい。いくつかの態様において、免疫系の長期間にわたる継続的な刺激があることは望ましくなく、また治療成功後にも持続する変化をもたらすことも必要でなく、これは、このことが続いて新たな問題を誘発する恐れがあるためである。自己免疫障害の治療の場合、再燃時には免疫系を阻害または抑制することが望ましいと考えられるが、長期的には、患者が感染に過度にかかりやすくなる恐れがあるため、そうではない。
PCRは、トランスフェクションに用いられるmRNAのインビトロ転写のためのテンプレートを作製するために用いられる。PCRを行うための方法は、当技術分野において周知である。PCRに用いるためのプライマーは、PCRのためのテンプレートとして用いられるDNAの領域に対して実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的な」とは、本明細書で用いる場合、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または1つもしくは複数の塩基が非相補的もしくはミスマッチ性である、ヌクレオチドの配列のことを指す。実質的に相補的な配列は、PCRのために用いられるアニーリング条件下で、意図したDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNAテンプレートの任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、5'および3' UTRを含めて、細胞において通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。また、プライマーを、関心対象の特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計することもできる。1つの態様において、プライマーは、5'および3'UTRの全体または部分を含めて、ヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計される。PCRのために有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成法によって作製される。「順方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の上流にある、DNAテンプレート上のヌクレオチドに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「上流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の5の位置（location 5）を指して用いられる。「逆方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の下流にある、二本鎖DNAテンプレートに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「下流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の3'の位置のことを指す。
PCRのために有用な任意のDNAポリメラーゼを、本明細書に開示された方法に用いることができる。試薬およびポリメラーゼは、いくつかの供給元から販売されている。
安定性および／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造を用いることもできる。RNAは5'および3' UTRを有することが好ましい。1つの態様において、5' UTRは長さが0〜3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5'および3' UTR配列の長さは、UTRの異なる領域とアニールするPCR用のプライマーを設計することを非限定的に含む、異なる方法によって変化させることができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5'および3' UTRの長さを改変することができる。
5'および3' UTRは、関心対象の遺伝子の天然の内因性5'および3' UTRであってよい。または、UTR配列を順方向および逆方向プライマーに組み入れることによって、またはテンプレートの他の任意の改変によって、関心対象の遺伝子にとって内因性でないUTR配列を付加することもできる。関心対象の遺伝子にとって内因性でないUTR配列の使用は、RNAの安定性および／または翻訳効率を改変するために有用な可能性がある。例えば、3' UTR配列中のAUリッチエレメントはmRNAの安定性を低下させうることが知られている。このため、当技術分野において周知であるUTRの特性に基づき、転写されたRNAの安定性が高まるように3' UTRを選択または設計することができる。
1つの態様において、5' UTRは内因性遺伝子のKozak配列を含みうる。または、関心対象の遺伝子にとって内因性でない5' UTRを上記のようにPCRによって付加する場合には、5' UTR配列を付加することによってコンセンサスKozak配列を設計し直すこともできる。Kozak配列はある種のRNA転写物の翻訳の効率を高めることができるが、すべてのRNAで効率的な翻訳を可能にするために必須というわけではないように思われる。多くのmRNAに対するKozak配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の態様においては、5' UTRを、細胞内で安定しているRNAゲノムを有するRNAウイルスから、導くことができる。他の態様においては、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、さまざまなヌクレオチド類似体を3'または5' UTRに用いることができる。
遺伝子クローニングを必要とせずにDNAテンプレートからのRNAの合成を可能にするためには、転写のプロモーターを、転写させようとする配列の上流でDNAテンプレートと結びつける必要がある。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの5'末端に付加すると、RNAポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でPCR産物に組み入れられるようになる。1つの好ましい態様において、本明細書の他所に記載したように、プロモーターはT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3 RNAポリメラーゼプロモーターおよびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが非限定的に含まれる。T7プロモーター、T3プロモーターおよびSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。
1つの好ましい態様において、mRNAは5'末端のキャップおよび3'ポリ（A）尾部の両方を有し、それらがリボソーム結合、翻訳の開始および細胞におけるmRNA安定性を決定づける。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNA上では、RNAポリメラーゼは真核細胞における発現には適さない長いコンカテマー産物を生成させる。3' UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写では、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物トランスフェクションには有効でない、正常サイズのmRNAがもたらされる。
線状DNAテンプレート上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、テンプレートの最終塩基を越えて転写物の3'末端を伸長させることができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
DNAテンプレートへのポリA／T連鎖の従来の組み込み方法は分子クローニングである。しかし、プラスミドDNAに組み込まれたポリA／T配列はプラスミド不安定性を引き起こす恐れがあり、このことは、細菌細胞から得られたプラスミドDNAテンプレートに欠失および他の異常が非常に混入することが多い理由となっている。このためにクローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、往々にして信頼性も損なわれる。これが、クローニングを伴わずにポリA／T 3'連鎖を有するDNAテンプレートの構築を可能にする方法が非常に望まれる理由である。
転写DNAテンプレートのポリA／Tセグメントは、ポリT尾部、例えば100T尾部など（サイズは50〜5000 Tでありうる）を含む逆方向プライマーを用いることによってPCR中に、またはDNA連結もしくはインビトロ組換えを非限定的に含む他の任意の方法によってPCRの後に、生成させることができる。ポリ（A）尾部はまた、RNAに安定性を与え、それらの分解も低下させる。一般に、ポリ（A）尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関関係にある。1つの態様において、ポリ（A）尾部は100〜5000個のアデノシンである。
RNAのポリ（A）尾部は、インビトロ転写後に、ポリ（A）ポリメラーゼ、例えば大腸菌ポリAポリメラーゼ（E-PAP）などを用いることによって、さらに伸長させることができる。1つの態様においては、ポリ（A）尾部の長さを100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増やすことにより、RNAの翻訳効率が約2倍に高くなる。さらに、異なる化学基を3'末端に結びつけることもmRNA安定性を高める可能性がある。そのような付属物（attachment）は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含みうる。例えば、ポリ（A）ポリメラーゼを用いて、ATP類似体をポリ（A）尾部に組み入れることができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに高めることができる。
5'キャップもまた、RNA分子に安定性を与える。1つの好ましい態様において、本明細書に開示された方法によって生成されたRNAは5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において公知であって本明細書に記載された手法を用いて付与される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
本明細書で開示された方法によって生成されたRNAはまた、配列内リボソーム進入部位（IRES）配列も含みうる。IRES配列は、mRNAに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて翻訳開始を助長する、任意のウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってよい。細胞の透過性および生存能力を高める因子、例えば糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化物質および界面活性剤などを含みうる、細胞エレクトロポレーションのために適した任意の溶質を含めることができる。
RNAは、いくつかのさまざまな方法の任意のもの、例えば、エレクトロポレーション（Amaxa Nucleofector-II（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany））、（ECM 830（BTX）（Harvard Instruments, Boston, Mass.）またはGene Pulser II（BioRad, Denver, Colo.）、Multiporator（Eppendort, Hamburg Germany）、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック（biolistic）粒子送達システムを非限定的に含む市販の方法（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）を用いて、標的細胞に導入することができる。
遺伝子改変されたT細胞
いくつかの態様において、CAR配列および／または二重特異性抗体配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いて細胞内に送達される。CARを発現しかつ／または二重特異性抗体を発現するレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、形質導入された細胞を担体として用いるか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のベクターの無細胞性の局所的もしくは全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらにさまざまな種類の真核細胞、さらには組織および生物全体の中に送達することができる。用いられる方法は、安定的な発現が必要または十分とされる任意の目的に対するものでありうる。
他の態様において、CAR配列および／または二重特異性抗体配列は、インビトロで転写されたmRNAを用いて細胞内に送達される。インビトロで転写されたmRNA CARは、トランスフェクトされた細胞を担体として用いるか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のベクターの無細胞性の局所的または全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらには組織および生物全体の中に送達することができる。用いられる方法は、一過性発現が必要または十分とされる任意の目的に対するものでありうる。
開示された方法は、遺伝子改変されたT細胞が標的癌細胞を死滅させる能力の評価を含め、基礎研究および治療法において、癌、幹細胞、急性および慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野において、T細胞活性のモジュレーションのために適用しうる。
本方法はまた、例えばプロモーターまたは投入RNAの量を変化させることによって、発現のレベルを広範囲にわたって制御する能力も提供し、そのため発現レベルを個別に調節することが可能になる。その上、PCRに基づくmRNA生成の手法は、種々の構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するキメラ受容体mRNAの設計を非常に容易にする。例えば、同じ細胞における複数のキメラ受容体上の種々の細胞内エフェクター／共刺激ドメインを変えることにより、多抗原標的に対する細胞傷害性の最高レベル、およびそれと同時に正常細胞に対する最も低い細胞傷害性を評価する、受容体の組み合わせの構造の判定が可能になる。
本発明のRNAトランスフェクション法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターを用いないことである：RNA導入遺伝子をリンパ球に送達し、短時間のインビトロ細胞活性化の後に、その中で、いかなる別のウイルス配列も必要としない最小発現カセットとして発現させることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組み込みが起こる可能性は低い。RNAのトランスフェクションの効率の高さ、およびそれがリンパ球集団全体を均質に改変させる能力があることから、細胞のクローニングは必要でない。
インビトロで転写されたRNA（IVT-RNA）を用いるT細胞の遺伝子改変では、両者ともにさまざまな動物モデルで継続的に検討されてきた2種類の戦略を利用する。これらは細胞に対して、インビトロで転写されたRNAを、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。好ましくは、移入されたIVT-RNAの長期間にわたる発現を達成するために、さまざまな改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。
インビトロ転写のためのテンプレートとして標準化された様式で利用され、安定化されたRNA転写物が産生されるように遺伝子改変されている、いくつかのIVTベクターが文献で公知である。現在、当技術分野で用いられるプロトコールは、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づく：RNA転写を可能にする5' RNAポリメラーゼプロモーターと、それに続いて、3'および／または5'側に非翻訳領域（UTR）が隣接している関心対象の遺伝子、ならびに50〜70ヌクレオチドを含む3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドはII型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で線状化される。したがって、ポリアデニルカセットは転写物における後のポリ（A）配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドは、線状化の後に酵素切断部位の一部として残存し、伸長するか、または3'末端でポリ（A）配列を覆い隠す。この非生理的な突出部が、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすか否かは不明である。
RNAには、より従来的なプラスミドまたはウイルスによるアプローチを上回るいくつかの利点がある。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、トランスフェクション後にタンパク質産物が迅速に産生される。さらに、RNAは核ではなく細胞質に到達しさえすればよく、そのため、典型的なトランスフェクション法によって、極めて高率でのトランスフェクションがもたらされる。加えて、プラスミドに基づくアプローチは、関心対象の遺伝子の発現を作動させるプロモーターが、試験中の細胞において活性があることを必要とする。
もう1つの局面において、RNA構築物はエレクトロポレーションによって細胞内に送達することができる。例えば、US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1に教示されているような、哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの処方物および方法を参照されたい。任意の既知の細胞型のエレクトロポレーションのために必要な電場強度を含むさまざまなパラメーターは、関連研究文献ならびに当技術分野における数多くの特許および出願において一般に公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療適用のための装置は市販されており、これには例えば、MedPulser（商標）DNA Electroporation Therapy System（Inovio／Genetronics, San Diego, Calif）があり、米国特許第6,567,694号；米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号および米国特許第6,233,482号などの特許に記載されている；また、エレクトロポレーションを、例えばUS20070128708A1に記載されたように、インビトロでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできる。また、エレクトロポレーションを、インビトロで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。このように、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介性投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。
T細胞の供給源
本発明のT細胞の増大および遺伝子改変の前に、T細胞の供給源を対象から入手する。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、数多くの供給源から入手することができる。本発明のある態様において、当技術分野において入手可能な任意のさまざまなT細胞株を用いることができる。本発明のある態様において、T細胞は、フィコール（商標）分離などの、当業者に公知の任意のさまざまな手法を用いて対象から収集された血液ユニットから得られる。1つの好ましい態様において、個体の流血由来の細胞はアフェレーシスによって入手される。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。1つの態様においては、アフェレーシスによって収集された細胞を、血漿画分を除去するために洗浄した上で、その後の処理段階のために細胞を適切な緩衝液または培地中に配置することができる。本発明の1つの態様においては、これらの細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。1つの代替的な態様において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、かつ、マグネシウムを含まないか、またはすべてではないものの多くの二価カチオンを含まない。この場合にも、驚くべきことに、カルシウム非存在下での最初の活性化段階により、活性化の増強がもたらされる。当業者は容易に理解するであろうが、洗浄段階は、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサー、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5など）を製造元の指示に従って用いることなどによって、当技術分野において公知の方法によって実現することができる。洗浄の後に、細胞を、例えば、Ca2+非含有、Mg2+非含有PBS、PlasmaLyte A、または緩衝剤を含むかもしくは含まない他の食塩液といった、種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁させることができる。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去して、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
もう1つの態様においては、赤血球を溶解させた上で、例えばPERCOLL（商標）勾配での遠心分離によるか、または向流遠心分離溶出法によって単球を枯渇させることによって、T細胞を末梢血リンパ球から単離する。CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、およびCD45RO+T細胞といったT細胞の特定の部分集団を、陽性選択法または陰性選択法によってさらに単離することができる。例えば、1つの好ましい態様において、T細胞は、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3／CD28 Tなどの抗CD3／抗CD28（すなわち、3x28）結合ビーズとの、所望のT細胞の陽性選択に十分な期間にわたるインキュベーションによって単離される。1つの態様において、この期間は約30分間である。1つのさらなる態様において、この期間は、30分間〜36時間またはそれ以上、およびそれらの間の全ての整数値の範囲にわたる。1つのさらなる態様において、この期間は、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間である。さらにもう1つの好ましい態様において、この期間は10〜24時間である。1つの好ましい態様において、インキュベーション期間は24時間である。白血病の患者からのT細胞の単離のためには、24時間といった比較的長いインキュベーション時間を用いることにより、細胞収量を増やすことができる。腫瘍組織または免疫機能低下個体から腫瘍内浸潤リンパ球（TIL）を単離する際のように、他の細胞型と比較してT細胞がわずかしか存在しないあらゆる状況で、T細胞を単離するために比較的長いインキュベーション時間を用いることができる。さらに、比較的長いインキュベーション時間の使用により、CD8+ T細胞の捕捉効率を高めることもできる。したがって、単にこの時間を短縮または延長することによって、T細胞はCD3／CD28ビーズへの結合が可能になるか、および／またはビーズのT細胞に対する比を増加もしくは減少することにより（本明細書でさらに説明するように）、T細胞の部分集団は、培養開始時もしくはこの過程の他の時点で、これについてもしくはこれに対して優先的に選択されうる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗CD3および／または抗CD28抗体の比を増加または減少することにより、T細胞部分集団は、培養開始時もしくは他の望ましい時点で、これについてまたはこれに対して優先的に選択される。当業者は、本発明の状況において複数回の選択を使用することができることを認めると思われる。ある態様においては、この選択手順を実行し、活性化および増大の過程において「選択されない」細胞を使用することが望ましいことがある。「選択されない」細胞に、さらに選択を施すこともできる。
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞への独自の表面マーカーに対する抗体の組合せにより実行することができる。1つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体カクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によってCD4+細胞を濃縮するためのモノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。ある態様において、典型的にはCD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、およびFoxP3+を発現する調節性T細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましいことがある。または、ある態様においては、抗C25結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって、調節性T細胞を枯渇させる。
陽性または陰性選択によって望ましい細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある態様においては、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容積の著しい減少（すなわち、細胞の濃度の増加）が望ましいことがある。例えば、1つの態様においては、細胞20億個／mlの濃度を用いる。1つの態様において、細胞10億個／mlの濃度を用いる。さらなる態様においては、細胞1億個／mlよりも高いものを用いる。さらなる態様においては、1000万個／ml、1500万個／ml、2000万個／ml、2500万個／ml、3000万個／ml、3500万個／ml、4000万個／ml、4500万個／mlまたは5000万個／mlの細胞濃度を用いる。さらにもう1つの態様においては、7500万個／ml、8000万個／ml、8500万個／ml、9000万個／ml、9500万個／ml、または1億個／mlからの細胞濃度を用いる。さらなる態様においては、1億2500万個／mlまたは1億5000万個／mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることにより、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞増大を生じることができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞のような、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血、腫瘍組織など）からの、関心のある標的抗原を弱く発現する細胞の捕捉効率を高めることができる。そのような細胞集団は、治療的価値があり、かつ得ることが望ましい。例えば、高い濃度の細胞の使用は、通常弱くCD28を発現するCD8+ T細胞をより効率的に選択することを可能にする。
1つの関連した態様においては、より低い濃度の細胞を用いることが望ましいことがある。T細胞および表面（例えばビーズなどの粒子）の混合物の高度の希釈により、粒子と細胞間の相互作用は最小化される。これにより、これらの粒子と結合する所望の抗原を大量発現する細胞が選択される。例えば、CD4+ T細胞は、より高いレベルのCD28を発現し、希釈した濃度でCD8+ T細胞よりもより効率的に捕捉される。1つの態様において、用いられる細胞濃度は、5×106個／mlである。もう1つの態様において、用いられる濃度は、約1×105個／ml〜1×106個／ml、およびその間の任意の整数であることができる。
他の態様において、細胞を、回転器にて、さまざまな時間にわたって、さまざまな速度で、2〜10℃または室温のいずれかで、インキュベートすることもできる。
また、刺激のためのT細胞を、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論に拘束されることは望まないが、凍結段階およびそれに続く解凍段階は、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な製品を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後に、これらの細胞を凍結液中に懸濁させてもよい。多くの凍結液およびパラメーターが当技術分野において公知であり、かつこの状況において有用であるが、1つの方法は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または、10％デキストラン40および5％デキストロース、20％ヒト血清アルブミンおよび7.5％ DMSO、または31.25％ Plasmalyte-A、31.25％デキストロース5％、0.45％ NaCl、10％デキストラン40および5％デキストロース、20％ヒト血清アルブミンおよび7.5％ DMSO、または例えばHespanおよびPlasmaLyte Aを含有する他の適した細胞凍結培地の使用を伴い、続いてこれらの細胞は、1分間に1℃の速度で-80℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンク内で気相中に貯蔵される。その他の制御された凍結法に加え、即時-20℃または液体窒素中の制御されない凍結を使用してもよい。
ある態様においては、凍結保存細胞を本明細書に記載の通りに解凍および洗浄して、室温で1時間静置した後に、本発明の方法を用いる活性化を行う。
また、本発明に関連して、本明細書に記載されたような増大された細胞が必要となる前の期間での、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集も想定している。そのために、増大させようとする細胞の供給源を、必要な任意の時点で収集し、T細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載された説明されたもののような、T細胞療法による恩恵を受けると考えられる任意のさまざまな疾患または病状に対するT細胞療法に後に用いるために単離して凍結することができる。1つの態様においては、血液試料またはアフェレーシス物を、全般的に健常な対象から採取する。ある態様においては、血液試料またはアフェレーシス物を、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない全般的に健常な対象から採取し、関心対象の細胞を、後に用いるために単離して凍結する。ある態様においては、T細胞を増大させ、凍結して、後の時点で用いる。ある態様においては、本明細書に記載されたような特定の疾患の診断後間もなく、しかしいかなる治療も行わないうちに、患者から試料を収集する。1つのさらなる態様においては、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線療法、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506などの免疫抑制剤、抗体、または他の免疫除去薬、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および照射などの作用因子による治療を非限定的に含む、任意のさまざまな妥当な治療様式の前の対象由来の血液試料またはアフェレーシス物から単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子で誘導されるシグナル伝達にとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell, 66:807-815,1991；Henderson et al., Immun., 73:316-321,1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun., 5:763-773,1993）。1つのさらなる態様においては、細胞を患者のために単離して、骨髄移植もしくは幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射療法（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法とともに（例えば、その前、同時またはその後に）、後に用いるために凍結する。もう1つの態様においては、細胞を事前に単離した上で、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどによるB細胞除去療法後の治療のために後で用いるために凍結する。
本発明の1つのさらなる態様においては、T細胞を、治療後に患者から直接入手する。これに関して、ある種の癌治療、特に免疫系を障害を及ぼす薬物による治療の後には、患者が通常であれば治療から回復中であると考えられる治療後間もない時点で、得られるT細胞の品質が、それらがエクスビボで増大する能力の点で最適であるか改善されていることが観察されている。同様に、本明細書に記載された方法を用いるエクスビボ操作の後にも、これらの細胞は生着およびインビボ増大の増強のために好ましい状態にある可能性がある。したがって、本発明に関連して、この回復相の間に、T細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することを想定している。さらに、ある態様においては、動員（例えば、GM-CSFによる動員）レジメンおよび条件付けレジメンを用いて、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増大にとって有利に働く状態を、特に治療法の後のある規定された時間枠の間に、対象において作り出すことができる。例示的な細胞型には、T細胞、B細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞が含まれる。
T細胞の活性化および増大
所望のCARを発現させるためのT細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかにおいて、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681 号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；ならびに米国特許出願公開第20060121005号に記載された方法を用いて、T細胞を活性化して増大させることができる。
一般に、本発明のT細胞は、CD3／TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質、およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結びつけられた表面との接触によって増大させられる。特に、T細胞集団は、本明細書に記載されたように、例えば、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うプロテインキナーゼCアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触などによって、刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の同時刺激のためには、アクセサリー分子と結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体および抗CD28抗体。抗CD28抗体の例には、9.3、B-T3、XR-CD28（Diaclone, Besancon, France）が含まれ、当技術分野において一般に公知である他の方法と同様に用いることができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。
ある態様において、T細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、さまざまなプロトコールによって与えることができる。例えば、各シグナルを与える作用物質は、溶液中にあってもよく、または表面と結びつけてもよい。表面と結びつける場合、これらの作用物質を同じ表面に結びつけてもよく（すなわち、「シス」フォーメーション）、または別々の表面に結びつけてもよい（すなわち、「トランス」フォーメーション）。または、一方の作用物質を溶液中の表面に結びつけ、もう一方の作用物質が溶液中にあってもよい。1つの態様においては、共刺激シグナルを与える作用物質を細胞表面と結合させ、一次活性化シグナルを与える作用物質は溶液中にあるか、または表面と結びつける。ある態様においては、両方の作用物質が溶液中にあってもよい。もう1つの態様において、これらの物質は可溶形態にあり、続いて、Fc受容体を発現する細胞または抗体またはこれらの物質と結合する他の結合物質などの表面と架橋結合することができる。これに関しては、例えば、本発明においてT細胞を活性化および増大させるために用いることを想定している人工抗原提示細胞（aAPC）についての、米国特許出願公開第20040101519号および第20060034810号を参照されたい。
1つの態様においては、2種の作用物質を、同じビーズ上に、すなわち「シス」か、または別々のビーズ上に、すなわち「トランス」かのいずれかとして、ビーズ上に固定化する。一例として、一次活性化シグナルを与える作用物質は抗CD3抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを与える作用物質は抗CD28抗体またはその抗原結合フラグメントである；そして、両方の作用物質を等モル量で同じビーズに同時固定化する。1つの態様においては、CD4+ T細胞の増大およびT細胞増殖のためにビーズと結合させる各抗体を1：1の比で用いる。本発明のある局面においては、ビーズと結合させる抗CD3：CD28抗体の比として、1：1の比を用いて観察される増大と比較してT細胞増大の増加が観察されるようなものを用いる。1つの特定の態様においては、1：1の比を用いて観察される増大と比較して約1〜約3倍の増加が観察される。1つの態様においては、ビーズと結合させるCD3：CD28抗体の比は、100：1〜1：100、およびそれらの間のすべての整数の範囲にある。本発明の1つの局面においては、抗CD3抗体よりも多くの抗CD28抗体が粒子と結合され、すなわちCD3：CD28の比は1未満である。本発明のある態様において、ビーズと結合させる抗CD28抗体と抗CD3抗体との比は、2：1よりも大きい。1つの特定の態様においては、ビーズと結合させる抗体に1：100のCD3：CD28比を用いる。もう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に1：75のCD3：CD28比を用いる。さらなる態様においては、ビーズと結合させる抗体に1：50のCD3：CD28比を用いる。もう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に1：30のCD3：CD28比を用いる。1つの好ましい態様においては、ビーズと結合させる抗体に1：10のCD3：CD28比を用いる。もう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に1：3のCD3：CD28比を用いる。さらにもう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に3：1のCD3：CD28比を用いる。
T細胞または他の細胞標的を刺激するには、粒子と細胞との比として1：500〜500：1およびその間の任意の整数値を用いることができる。当業者が容易に理解するように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存しうる。例えば、小さいサイズのビーズは2、3個の細胞と結合しうるに過ぎないが、一方、より大きいビーズは多くと結合しうると考えられる。ある態様において、細胞と粒子との比は1：100〜100：1およびその間の任意の整数値の範囲にあり、さらなる態様において、この比は1：9〜9：1およびその間の任意の整数値を含み、これを同じくT細胞を刺激するために用いることができる。T細胞の刺激をもたらす、抗CD3および抗CD28が結びついた粒子とT細胞との比は、上述したようにさまざまでありうるが、いくつかの好ましい値には、1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1および15：1が含まれ、1つの好ましい比は、T細胞1個につき粒子が少なくとも1：1である。1つの態様においては、1：1またはそれ未満である粒子と細胞との比を用いる。1つの特定の態様において、好ましい粒子：細胞比は1：5である。さらなる態様において、粒子と細胞との比は、刺激の日に応じて変化しうる。例えば、1つの態様において、粒子と細胞との比は第1日に1：1〜10：1であり、その後最長10日間にわたって毎日または1日おきに追加の粒子を細胞に添加して、最終的な比が1：1〜1：10となる（添加の日の細胞数に基づく）。1つの特定の態様において、粒子と細胞との比は刺激の1日目に1：1であり、刺激の3日目および5日目に1：5に調節される。もう1つの態様において、粒子は毎日または1日おきに添加され、最終的な比は1日目に1：1であり、刺激の3日目および5日目には1：5である。もう1つの態様において、粒子と細胞との比は刺激の1日目に2：1であり、刺激の3日目および5日目に1：10に調節される。もう1つの態様において、粒子は毎日または1日おきに添加され、最終的な比は1日目に1：1であり、刺激の3日目および5日目には1：10である。当業者は、さまざまな他の比が、本発明における使用に適することを理解するであろう。特に、比は粒子サイズならびに細胞のサイズおよび型に応じて多様であると考えられる。
本発明のさらなる態様においては、T細胞などの細胞を、作用物質でコーティングされたビーズと一緒にし、その後にビーズと細胞を分離した上で、続いて細胞を培養する。1つの代替的な態様においては、培養の前に、作用物質でコーティングされたビーズと細胞を分離せずに、一緒に培養する。1つのさらなる態様においては、ビーズおよび細胞を磁力などの力の印加によってまず濃縮して、細胞表面マーカーの連結を増加させて、それにより、細胞刺激を誘導する。
例として、抗CD3および抗CD28が結びつけられた常磁性ビーズ（3x28ビーズ）をT細胞と接触させることによって、細胞表面タンパク質を連結させることができる。1つの態様においては、細胞（例えば、104〜109個のT細胞）およびビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ、1：1の比）を、緩衝液中、好ましくはPBS（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で一緒にする。この場合も、当業者は、あらゆる細胞濃度を用いうることを容易に理解するであろう。例えば、標的細胞が試料中に非常に稀であって、試料のわずかに0.01％を構成してもよく、または試料の全体（すなわち、100％）が関心対象の標的細胞で構成されてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況に包含される。ある態様においては、粒子と細胞を一緒にして混合する容積を著しく減らして（すなわち、細胞の濃度を高めて）、細胞と粒子の最大の接触を確実にすることが望ましいと考えられる。例えば、1つの態様においては、細胞約20億個／mlの濃度を用いる。もう1つの態様においては、細胞1億個／ml超を用いる。1つのさらなる態様においては、1000万個、1500万個、2000万個、2500万個、3000万個、3500万個、4000万個、4500万個、または5000万個／mlの細胞濃度を用いる。さらにもう1つの態様においては、7500万個、8000万個、8500万個、9000万個、9500万個または1億個／mlの細胞濃度を用いる。さらなる態様において、細胞1億2500万または1億5000万個／mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることにより、細胞収量、細胞活性化、および細胞増大の増加がもたらされうる。さらに、高い細胞濃度を用いることにより、CD28陰性T細胞のように関心対象の標的抗原を弱く発現する細胞のより効率的な捕捉が可能になる。ある態様においては、そのような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、入手することが望ましいと考えられる。例えば、高濃度の細胞を用いることにより、通常は比較的弱いCD28発現を有するCD8+ T細胞のより効率的な選択が可能にある。
本発明の1つの態様においては、混合物を、数時間（約3時間）〜約14日間、またはその間の任意の整数値単位の時間にわたって培養しうる。もう1つの態様において、混合物を21日間培養しうる。本発明の1つの態様においては、ビーズとT細胞を約8日間一緒に培養する。もう1つの態様においては、ビーズとT細胞は2〜3日間一緒に培養する。数回の刺激サイクルも望ましく、その結果、T細胞の培養時間は60日間またはそれより長くなる。T細胞の培養に適した条件には、血清（例えばウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβおよびTNF-α、または当業者に公知である細胞増殖のための他の添加物を含む、増殖および生存のために必要な因子を含みうる適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI Medium 1640または、X-vivo 15（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどが非限定的に含まれる。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加された、血清非含有であるか、またはT細胞の増殖および増大のために十分な、適量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンのセットおよび／もしくは一定量のサイトカインが加えられた、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20が含まれうる。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は実験培養物のみに含められ、対象に輸注される細胞の培養物には含められない。標的細胞は、増殖を支えるために必要な条件下、例えば適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％ CO2）の下で維持される。
多様な刺激時間にわたって曝露されたT細胞は、異なる特性を示しうる。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを受けた末梢血単核細胞産物は、ヘルパーT細胞集団（TH、CD4+）を、細胞傷害性またはサプレッサーT細胞集団（TC、CD8+）よりも多く有する。CD3受容体およびCD28受容体を刺激することによるT細胞のエクスビボ増大では、約8〜9日目より前には主としてTH細胞からなるT細胞集団が生じるが、約8〜9日目以後、T細胞の集団はTC細胞の集団を次第に多く含むようになる。したがって、治療の目的によっては、主としてTH細胞で構成されるT細胞集団を対象に輸注することが有利な場合がある。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合には、このサブセットをより高度に増大させることが有益な場合がある。
さらに、CD4およびCD8マーカーのほかに、他の表現型マーカーも、細胞増大の過程で顕著に、しかし大部分は再現性を伴って変動する。このため、そのような再現性により、活性化T細胞製品を特定の目的に合わせて作ることが可能になる。
治療適用
本発明は、二重特異性抗体、CAR、またはそれらの組み合わせを発現するように改変された細胞（例えば、T細胞）を包含し、ここで該CARは、特異的抗体の抗原認識ドメインを、CD3-ζ、CD28、4-1BBの細胞内ドメインまたはこれらの任意の組み合わせと組み合わせたものである。このため、場合によっては、形質導入されたT細胞は、CARにより媒介されるT細胞応答を誘発することができる。
1つの態様において、本発明は、一次T細胞の特異性を腫瘍抗原に向けて再誘導するためのCARの使用を提供する。したがって、本発明はまた、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するT細胞を哺乳動物に投与する段階を含み、該CARが、所定の標的と特異的に相互作用する結合モイエティー、例えばヒトCD3ζの細胞内ドメインを含むζ鎖部分、および共刺激シグナル伝達領域を含む、方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、二重特異性抗体、CAR、またはそれらの組み合わせを発現するようにT細胞を遺伝子改変し、そのT細胞をそれを必要とするレシピエントに輸注する、一種の細胞療法を含む。輸注された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、いくつかの態様において、改変T細胞はインビボで複製して、持続的腫瘍制御につながりうる長期存続性をもたらすことができる。
1つの態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増大を起こすことができ、より延長した時間にわたって存続することができる。もう1つの態様において、本発明のT細胞は、あらゆる追加的な腫瘍形成または増殖を阻害するように再活性化されうる、特異的なメモリーT細胞になることができる。
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、改変T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的な免疫応答でも受動的な免疫応答でもありうる。加えて、媒介される免疫応答は、改変T細胞がCARおよび/または二重特異性抗体により認識される標的抗原に対して特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部となりうる。
1つの態様において、本発明の改変T細胞は、二重特異性抗体を腫瘍微小環境の細胞外空間に分泌する。この有効な送達方法は、二重特異性抗体の全身性送達に付随する毒性を軽減する。
1つの態様において、本発明は、二重特異性抗体を特定の領域（すなわち、腫瘍微小環境）に有効に送達するための改変T細胞の使用を提供する。1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を発現するように改変されたT細胞は、CARの表面上に発現されるCARの抗原結合ドメインを通じて、特異的な腫瘍微小環境を標的とする。さらに、1つの態様において、二重特異性抗体のCAR媒介性送達は、腫瘍微小環境の非改変T細胞に治療用二重特異性抗体を装備させる。1つの態様において、二重特異性抗体はT細胞および腫瘍抗原と結合する。BiTEとして知られるこの型の二重特異性抗体は、CARと一緒に働いて、腫瘍を特異的に認識して死滅させる。1つの態様において、本発明の方法は、CARのみによって改変されたT細胞の送達と比較して、腫瘍認識、免疫応答および腫瘍溶解が強化するように、CARと二重特異性抗体との両方を発現するように改変されたT細胞を対象に投与する段階を含む。
本明細書に開示されたデータは、抗CD19領域、ヒトCD8αのヒンジおよび膜貫通領域、ならびに4-1BBおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含むIVT RNA CARを具体的に記載しているが、本発明は、本明細書中の別所に記載されたような構築物の構成要素のそれぞれに関してあらゆるさまざまな変形物を含むとみなされるべきである。すなわち、本発明は、抗原結合ドメインに対して特異的な、CARにより媒介されるT細胞応答を生じさせるための、CARにおける任意の抗原結合ドメインの使用を含む。例えば、本発明のCARにおける抗原結合ドメインは、癌の治療を目的として腫瘍抗原を標的とすることができる。
治療しうる可能性のある癌には、血管が発達していないか、またはまだ実質的に血管が発達していない腫瘍、ならびに血管が発達した腫瘍が含まれる。癌は非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫）を含んでもよく、または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のCARを用いて治療される癌の種類には、癌腫、芽細胞腫および肉腫、ある種の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫および黒色腫が非限定的に含まれる。成人腫瘍／癌および小児腫瘍／癌も含められる。
血液悪性腫瘍は、血液または骨髄の癌である。血液（または造血器）悪性腫瘍の例には、白血病、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄急性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性の白血病および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無症候型およびハイグレード型）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病および骨髄異形成が含まれる。
固形腫瘍とは、通常は嚢胞も液体領域も含まない組織の異常腫瘤のことである。固形腫瘍は良性のことも悪性のこともある。さまざまな種類の固形腫瘍が、それを形成する細胞の種類によって名付けられている（肉腫、癌腫およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞種 皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、ならびにCNS腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽細胞腫（多形性神経膠芽細胞腫としても知られる）、星状細胞腫、CNSリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移など）が含まれる。
1つの態様において、本発明のCARおよび二重特異性抗体は、特定の癌を治療するように設計される。例えば、CD19を標的とするように設計されたCARおよび二重特異性抗体を、プレB ALL（小児適応）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、同種骨髄移植後サルベージなどを非限定的に含む癌および障害を治療するために用いることができる。
もう1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を治療するために、CD22を標的とするように設計することができる。
1つの態様において、CD19、CD20、CD22およびROR1を標的とするCARの組み合わせを用いて治療しうる癌および障害には、プレB ALL（小児適応）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、同種骨髄移植後サルベージなどが非限定的に含まれる。
1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、中皮腫、膵癌、卵巣癌などを治療するために、メソテリンを標的とするように設計することができる。もう1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、急性骨髄性白血病などを治療するために、標的CD33/IL3Raを標的とするように設計することができる。さらなる態様において、CARおよび二重特異性抗体を、トリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌などを治療するために、c-Metを標的とするように設計することができる。
1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、前立腺癌などを治療するために、PSMAを標的とするように設計することができる。もう1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、前立腺癌などを治療するために、糖脂質F77を標的とするように設計することができる。さらなる態様において、CARおよび二重特異性抗体を、神経膠芽細胞腫（gliobastoma）などを治療するために、EGFRvIIIを標的とするように設計することができる。
1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、神経芽細胞腫、黒色腫などを治療するために、GD-2を標的とするように設計することができる。もう1つの態様において、CARおよび二重特異性抗体を、骨髄腫、肉腫、黒色腫などを治療するために、NY-ESO-1 TCRを標的とするように設計することができる。さらなる態様において、CARおよび二重特異性抗体を、骨髄腫、肉腫、黒色腫などを治療するために、MAGE A3 TCRを標的とするように設計することができる。
しかし、本発明は、本明細書に開示された抗原標的および疾患のみに限定されるとみなされるべきではない。より正確には、本発明は、疾患を治療するためにCARおよび/または二重特異性抗体を用いうる疾患と関連するあらゆる抗原標的を含むとみなされるべきである。
本発明の改変T細胞はまた、哺乳動物におけるエクスビボ免疫処置および／またはインビボ治療法のためのワクチンの一種としても役立つことができる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
エクスビボ免疫処置に関しては、細胞を哺乳動物に投与する前に、以下の少なくとも1つをインビトロで行う：i）細胞の増大、ii）CARおよび/もしくは二重特異性抗体をコードする核酸を細胞に導入すること、ならびに／またはiii）細胞の凍結保存。
エクスビボ手順は当技術分野において周知であり、以下でより詳細に考察する。手短に述べると、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離した上で、本明細書で開示された組成物を発現するベクターによって遺伝子改変する（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトを行う）。改変細胞を哺乳動物レシピエントに投与することにより、治療的利益を得ることができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、改変細胞はレシピエントに対して自己であることができる。または、細胞がレシピエントに対して同種、同系または異種であることもできる。
造血幹細胞および始原細胞のエクスビボ増大のための手順は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,199,942号に記載されており、これを本発明の細胞に適用することができる。他の適した方法は当技術分野において公知であり、このため、本発明は、エクスビボ細胞の増大のいかなる特定の方法にも限定されない。手短に述べると、T細胞のエクスビボ培養および増大は以下を含む：（1）CD34+造血幹細胞および始原細胞を哺乳動物から、末梢血採取物または骨髄エクスプラントから収集すること；ならびに（2）そのような細胞をエクスビボを増大させること。米国特許第5,199,942号に記載された細胞増殖因子のほかに、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および増大のために用いることができる。
エクスビボ免疫処置に関して細胞ベースのワクチンを用いることに加えて、本発明はまた、患者における抗原に向けての免疫応答を誘発するためのインビボ免疫処置のための組成物および方法も提供する。
一般に、本明細書に記載の通りに活性化および増大された細胞は、免疫機能が低下した個体において生じる疾患の治療および予防に利用することができる。特に、本発明の改変T細胞は、癌の治療に用いられる。ある態様において、本発明の細胞は、癌を発症するリスクのある患者の治療に用いられる。したがって、本発明は、癌の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に対して、本発明の改変T細胞の治療的有効量を投与する段階を含む方法を提供する。
本発明の改変T細胞は、単独で、または希釈剤および／またはIL-2もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた薬学的組成物として投与することができる。手短に述べると、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、1つまたは複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または添加剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；ブドウ糖、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；並びに保存剤を含有してもよい。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤されることが好ましい。
本発明の薬学的組成物は、治療（または予防）される疾患に適した方法で投与することができる。投与量および投与回数は、患者の状態、並びに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適量は臨床試験により決定され得る。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍的有効量」、「腫瘍阻害的有効量」または「治療量」が指示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、および患者（対象）の状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。一般に、本明細書に記載のT細胞を含む薬学的組成物は、細胞104〜109個／kg体重、好ましくは細胞105〜106個／kg体重であって、これらの範囲内のすべての整数値を含む投与量で投与することができる。また、T細胞組成物をこれらの用量で多回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知である輸注手法を用いることによって投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照）。特定の患者に関する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニタリングして、それに応じて治療を調節することによって、医療の当業者によって容易に決定されうる。
ある態様においては、活性化されたT細胞を対象に投与し、続いてその後に血液を再び採取して（またはアフェレーシスを行って）、それ由来のT細胞を本発明に従って活性化した上で、これらの活性化および増大されたT細胞を患者に再び輸注することが望まれると考えられる。この過程を2、3週毎に複数回行うことができる。ある態様において、T細胞は10cc〜400ccの採取血から活性化させることができる。ある態様において、T細胞は20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90ccまたは100ccの採取血から再活性化される。理論に拘束されるわけではないが、この複数回の採血／複数回の再輸注プロトコールを用いることは、T細胞のある特定の集団を選別するために役立つ可能性がある。
本組成物の投与は、エアゾール吸引、注射、経口摂取、輸液、植え付けまたは移植を含む、任意の好都合な様式で実施することができる。本明細書に記載された組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（i.v.）注射により、または腹腔内に投与することができる。1つの態様において、本発明のT細胞組成物は、患者に対して、皮内注射または皮下注射によって投与される。もう1つの態様において、本発明のT細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。T細胞の組成物を腫瘍内、リンパ節内または感染部位に直接注射してもよい。
本発明のある態様においては、本明細書に記載の方法、またはT細胞を治療的レベルまで増大させることが当技術分野において公知である他の方法を用いて活性化および増大された細胞を、MS患者に対する抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン-2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）もしくはナタリズマブ治療、乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはPML患者に対する他の治療などの薬剤による治療を非限定的に含む、任意のさまざまな妥当な治療様式とともに（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与する。さらなる態様において、本発明のT細胞を、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506など、抗体、またはCAMPATHなどの他の免疫除去薬、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射と組み合わせて用いてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存型ホスファターゼのカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子が誘導したシグナル伝達に重要であるp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）かのいずれかである（Liu et al., Cell, 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun., 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。1つのさらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法と組み合わせて（例えば、その前、同時またはその後に）、患者に投与される。もう1つの態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどによるB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量の化学療法薬に続いて末梢血幹細胞移植を行う標準治療を受けることができる。ある態様においては、移植後に、対象は本発明の増大された免疫細胞の輸注を受ける。1つの追加的な態様において、増大された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される病状および治療のレシピエントの正確な性質に応じて異なると考えられる。ヒトへの投与に関する投与量の増減は、当技術分野において許容される実践に従って行うことができる。例えば、CAMPATHの用量は、一般に成人患者について1〜約100mgの範囲であり、通常は1〜30日の期間にわたって毎日投与される。好ましい一日量は1〜10mg/日であるが、場合によっては、最大40mg／日までのより多くの用量を用いることもできる（米国特許第6,120,766号に記載）。
実験例
ここで本発明を、以下の実験例を参照しながら説明する。これらの例は例示のみを目的として提供されるものであり、本発明はこれらの例に限定されるとは全くみなされるべきではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意かつすべての変更も包含するとみなされるべきである。
それ以上の説明がなくても、当業者は、前記の説明および以下の例示的な例を用いて、本発明の化合物を作成して利用し、請求される方法を実施することができる。以下の実施例は、このため、本発明の好ましい態様を具体的に指摘しており、本開示の残りを限定するものとは全くみなされるべきでない。
実施例1：二重特異性抗体RNA（Bis-RNA）を共導入することによって、RNA CAR T細胞の抗腫瘍活性を強化すること
CAR再方向づけ（re-directed）T細胞の養子移入による癌患者の治療により、有望な結果が示されている。CARをコードするRNAのT細胞へのエレクトロポレーションは、現在一般的に用いられているレンチウイルスまたはレトロウイルスを利用する遺伝子送達に基づく治療法よりも、安全で、容易で、しかもおそらく効率的な代替的手段を提供する。最近の臨床試験からの知見により、マウスAbに由来するCARは、治療を危険にさらす恐れのあるヒト抗マウス抗体（HAMA）応答の所見を示すことが実証された。このため、ヒトAbまたはヒト化Abに由来するCARは、マウス由来配列の望ましい代替的選択肢になると考えられ、癌患者を治療するために、RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞の反復輸注が必要な場合には特にそうである。
本明細書に開示する研究では、以下のことを述べる：1）レンチウイルス形質導入またはRNAエレクトロポレーションのいずれによってCARを用いた場合にもHAMAの恐れがない、ヒト起源由来の抗ヒトCD19 CARの作製；2）ヒト（またはヒト化）Abに由来する二重特異性Abをコードする遺伝子（またはmRNA）の共導入。ここでは、完全ヒト起源（クローン21D4；米国特許出願2010/0104509 A1）であるかもしくはヒト化された（クローンHB12B；米国特許出願US2008/0138336 A1）、またはブリナツモマブ（抗CD19／抗CD3二重特異性Ab）；米国特許US 7,575,923 B2）由来のマウス起源（CD19 scFv）である、抗CD19 Ab由来のヒトCD19に対する4-1BB-ζシグナル伝達ドメインを用いて例示的なCARを構築した（図1）。CD19-CD3二重特異性Ab RNA（Bis-RNA）を試験することに加えて、メソテリン（ss 1）-CD3（ss1HL-Blinaおよびss1-BlinaLH）、cMet-CD3（cMet-Blina）、PSCA-CD3（PSCA-Blina）およびGD2-CD3（Gd2-Blina）Bis-RNAも構築した。Blina Bis-RNAのヒト化のためには、構築物を作製した上で、マウスCD19およびCD3 scFvの両方を、それぞれCD19（21D4）およびCD3（27H5 VL1、27H5 VL2、28F11、DIVHv5、DIVHv6およびDIVHv7）に対するヒトまたはヒト化scFvによって置き換え、その結果、13種の構築物を得た：D4-Blina、D4-VL1、D4-VL2、D4-F11、D4-Hv5、D4-Hv6、D4-Hv7、Blina-VL1、Blina-VL2、Blina-F11、Blina-Hv5、Blina-Hv6およびBlina-Hv7。
これらのCD19 CARをコードする構築物から作製されたIVT RNAのT細胞へのエレクトロポレーションを行った。CAR発現および抗腫瘍活性を、FMC63（CART 19の治験に現在用いられている）に由来するCD19 CARと比較した。本明細書に提示する結果に関する実験デザインを図2に示す。その結果により、新たなCD19 CARのすべてが効率的に発現可能であったことが示された。FMC63 CARと比較すると発現は幾分軽度であったにもかかわらず、CD107a検出によってアッセイしたそれらの抗腫瘍活性は対照FMC63 CARと同等であった。
抗CD19／抗CD3二重特異性Abをコードする遺伝子（またはmRNA）の共導入によってCAR操作T細胞の抗腫瘍活性がさらに強化されたか否かを検討するために、ブリナツモマブ（Blina）をコードする遺伝子をPCRによって合成し、続いてそれをIVTベクターpGEM.64Aに組み入れて、pGEM-Blina.64Aを作製した。T細胞に対して、ブリナツモマブ（Blina）をコードするRNAおよびCD19 CAR RNA（FCM63 CAR）による共エレクトロポレーションを行うか、または代替的にBlina RNAのみによるエレクトロポレーションを行い、FCM63 CD19 CAR RNAのみによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と比較した。細胞をマウスIgGの存在に関して染色したところ、CD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを行った細胞がCAR発現に関して陽性染色されただけでなく、Blina Bis-RNAのエレクトロポレーションを行った細胞とGFP-RNAのエレクトロポレーションを行った細胞との共インキュベーションによっても、大半の細胞で陽性染色が生じたことが示された（図3）。このデータは、Blinaのエレクトロポレーションを行ったT細胞によって分泌されたCD19-CD3二重特異性Abが、GFPのエレクトロポレーションを行ったT細胞のCD3と結合することができたという説明に一致する。
エレクトロポレーションを行った細胞を、CD19発現細胞（Nalm6、K562-CD19およびRaji）またはCD19陰性細胞（K562）と共培養した。CD107a脱顆粒アッセイを行ったところ、Blina Bis-RNAのみでも、エレクトロポレーションを行ったT細胞が、FMC63 CD19 RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞と同程度に効率的に腫瘍を特異的に検出しうるようになることが示された（図4）。CD107aアッセイによって明白に示されているように、Blina RNAとCD19 CAR RNAとの共エレクトロポレーションにより、腫瘍反応性をさらに強化することができた（図4）。
その上、CD19 CAR RNAとBlina RNAとの両方による共エレクトロポレーションを行うかまたはBlina RNAのみによるエレクトロポレーションを行ったT細胞を、GFPのみによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と混合した場合には、Blina RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞によって分泌された二重特異性Abが、非腫瘍認識性GFP+ T細胞がCD19+腫瘍を効率的に認識するように装備させることができることが見いだされた（図5）。
エレクトロポレーションを行った細胞を、K562-CD19-CFSE／K562-meso-CMRAを標的細胞として用いるフローベースのCTLアッセイにおいて、それらの溶解活性に関して検討した。Blina RNAとCD19 CAR RNAとの共エレクトロポレーションにより、T細胞の死滅活性をさらに強化することができた（図6）。さらに、Blina RNAのエレクトロポレーションを行った細胞と非腫瘍反応性GFP+細胞との共インキュベーションでは、希釈していない対応物と比較して死滅活性が維持され、このことは、分泌されたbis-RNAが、GFP-RNAのエレクトロポレーションを行ったT細胞と結合して、CD19+腫瘍を抗原特異的な様式で効率的に死滅させることができたことを実証している（図6）。
これらの新たなCD19 CAR RNA構築物を、エレクトロポレーションから15時間後に、マウスIgGまたはヒトIgGのいずれかに関する染色によってそれらの発現に関して検討することによって評価したところ、すべての構築物がCAR発現を誘導したことが示された（図7）。CD19+ 腫瘍株（K562-CD19またはRaji）またはCD陰性株（U266B1）と共培養した場合には、CD107aアッセイによって明白に示されているように、新たな構築物によるエレクトロポレーションを行ったT細胞は、CD19陽性腫瘍を特異的に認識する能力を示した（図8）。
T細胞に対して1μg、5μgまたは10μgのBlina Bis-RNAによるエレクトロポレーションを行い、10μgのFCM63 CD19 CAR RNAによるエレクトロポレーションを行ったT細胞と比較した。エレクトロポレーションを行った細胞をCD19+細胞（Naln6、K562-CD19またはRaji）またはCD19-細胞株（K562）によって刺激した後に、CD107aアッセイを行った。1μgのBlina Bis-RNAによるT細胞は、10μgのCD19 CAR RNAによるT細胞とほぼ同じように機能したことが見いだされた。10μg CD19 CAR RNAによるT細胞は、エレクトロポレーション後の第8〜10日の時点でそれらの機能を失ったが、これは1μg Blina Bis-RNAによるT細胞と同様であり、一方、5μgまたは10μgのBlina Bis-RNAによるT細胞は、エレクトロポレーション後の第14日まで機能し続けた（図9B）。
ヒト型およびヒト化型のBis-RNAの機能性を評価するために、T細胞に対して、Blina由来のCD19 scFvを21D4 scFvに置き換えたBlina-D4 Bis-RNAによるエレクトロポレーションを行った。細胞をCAR染色およびCD107a染色に供したところ、Blina-D4によるエレクトロポレーションを行った細胞が、Blina Bis-RNAによるT細胞と同等に良好に機能したことが実証された（図10）。
他の抗原マーカーに対して特異的なBis-RNA構築物を設計して構築した。メソテリン（ss1）、cMetまたはPSCAに対するCAR RNAを発現するT細胞と比較して、ss1-Blina、cMet-Blina、またはPSCA-Blina Bis-RNAのみを発現するT細胞は、CAR RNAによるT細胞と同等に機能することができたことが見いだされた。さらに、ss1-Blina Bis-RNAによるT細胞は、ss1 CAR RNAによるT細胞よりも抗原特異的なT細胞活性化を示した（図11）。
本明細書に提示された結果は、二重特異性抗体RNAをCD19 CARとともに導入することにより、CAR操作T細胞の抗腫瘍活性が強化されることを実証している。さらに、二重特異性抗体RNAのT細胞への導入により、非腫瘍反応性T細胞が腫瘍反応性になるように補強されたが、これは、T細胞を用いることによって抗腫瘍薬を患者の体内に送達および輸送する新規な手段を提供する。これは、積み荷（BiTE）を腫瘍部位へと運ぶCAR T細胞の能力によって二重特異性抗体の送達を腫瘍微小環境に集中させることによって、全身性BiTEの毒性を軽減する。
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本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物のそれぞれおよびすべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物も当業者によって考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および等価な変形物を含むことを意図している。

Claims (47)

  1. キメラ抗原受容体（CAR）をコードする配列を含む単離された核酸配列であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、単離された核酸配列。
  2. SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、およびSEQ ID NO：22からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  3. 前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項1記載の単離された核酸配列。
  4. 前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項1記載の単離された核酸配列。
  5. 前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項4記載の単離された核酸配列。
  6. 前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項4記載の単離された核酸配列。
  7. 前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33／IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項4記載の単離された核酸配列。
  8. 前記CARが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  9. 前記二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメインの核酸配列が二重特異性抗体をコードする、請求項1記載の単離された核酸配列。
  10. 前記二重特異性抗体をコードする前記核酸配列が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、請求項9記載の単離された核酸。
  11. キメラ抗原受容体（CAR）をコードする配列を含む核酸配列を含む細胞であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、細胞。
  12. 前記核酸配列が、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、およびSEQ ID NO：22からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項11記載の細胞。
  13. 前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項11記載の細胞。
  14. 前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項11記載の細胞。
  15. 前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項14記載の細胞。
  16. 前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項14記載の細胞。
  17. 前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33／IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項14記載の細胞。
  18. 前記CARが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項11記載の細胞。
  19. T細胞である、請求項11記載の細胞。
  20. 前記抗原結合ドメインがその対応する抗原と結合した場合に抗腫瘍免疫を呈する、請求項11記載の細胞。
  21. 前記二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメインの核酸配列が二重特異性抗体をコードする、請求項11記載の細胞。
  22. 前記二重特異性抗体をコードする前記核酸配列が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、請求項21記載の細胞。
  23. 二重特異性抗体をコードする核酸をさらに含む、請求項11記載の細胞。
  24. 前記二重特異性抗体をコードする前記核酸配列が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、請求項23記載の細胞。
  25. 前記二重特異性抗体がヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項23記載の細胞。
  26. 前記二重特異性抗体がヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項23記載の細胞。
  27. 哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、それにより、該哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激する段階を含む、方法。
  28. 哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激する段階を含む、方法。
  29. 哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える段階を含む、方法。
  30. 哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える段階を含む、方法。
  31. 腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物を治療する段階を含む、方法。
  32. 腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階であって、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、それにより、該哺乳動物を治療する段階を含む、方法。
  33. 癌を有するヒトを治療する方法であって、CARおよび二重特異性抗体を発現するように遺伝子操作された細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、該細胞がT細胞である、方法。
  34. 癌を有するヒトを治療する方法であって、CARを発現するように遺伝子操作された細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、さらに該抗原結合ドメインが、ヒト抗体、ヒト化抗体、それらの抗原結合フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせから選択され、該細胞がT細胞である、方法。
  35. 二重特異性抗体をコードする単離された核酸配列であって、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：19からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸配列。
  36. 二重特異性抗体をコードする核酸配列を含む細胞であって、該核酸配列が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：19からなる群より選択される核酸配列を含む、細胞。
  37. 哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含む方法。
  38. 哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含む方法。
  39. 腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含む方法。
  40. 前記細胞がT細胞である、請求項39記載の方法。
  41. 腫瘍抗原がCD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33／IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項43記載の方法。
  42. 癌を有するヒトを治療する方法であって、二重特異性抗体を発現するように遺伝子操作された細胞を該ヒトに投与する段階を含む方法。
  43. 前記遺伝子操作された細胞が自己T細胞である、請求項42記載の方法。
  44. 前記細胞が前記二重特異性抗体を分泌する、請求項43記載の方法。
  45. 前記二重特異性抗体が、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：19からなる群より選択される核酸配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項44記載の方法。
  46. 前記二重特異性抗体がヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項44記載の方法。
  47. 前記二重特異性抗体がヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項44記載の方法。
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SG (1) SG11201408787PA (ja)
WO (1) WO2014011988A2 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016514462A (ja) * 2013-03-16 2016-05-23 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ｃｄ１９キメラ抗原受容体を使用するがんの処置
JP2016514956A (ja) * 2013-03-05 2016-05-26 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫療法のためのエンゲージャー細胞
JP2019500881A (ja) * 2016-01-08 2019-01-17 プロスペクト チャーターケア アールダブリュエムシー，エルエルシー ディ／ビー／エイ ロジャー ウィリアムズ メディカル センターＰｒｏｓｐｅｃｔ Ｃｈａｒｔｅｒｃａｒｅ Ｒｗｍｃ，Ｌｌｃ Ｄ／Ｂ／Ａ Ｒｏｇｅｒ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 老年ｃａｒ−ｔ細胞およびその使用
JP2019506394A (ja) * 2016-01-21 2019-03-07 ファイザー・インク 上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉを標的とするキメラ抗原受容体
JP2019512215A (ja) * 2016-02-19 2019-05-16 ノヴォスコープ アイピー リミテッド 改変細胞及び方法
JP2021524731A (ja) * 2018-03-16 2021-09-16 サイトイミューン セラピューティクス， インコーポレイテッドＣｙｔｏＩｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 二重特異性抗体ｃａｒ細胞免疫療法
US11279764B2 (en) 2016-01-21 2022-03-22 Pfizer Inc. Antibodies specific for epidermal growth factor receptor variant III and their uses

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2708032C2 (ru) 2013-02-20 2019-12-03 Новартис Аг ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII
EP2958942B1 (en) 2013-02-20 2020-06-03 Novartis AG Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
EP3004337B1 (en) 2013-05-29 2017-08-02 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
CN116478927A (zh) 2013-12-19 2023-07-25 诺华股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
US11028143B2 (en) * 2014-01-21 2021-06-08 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of RNA CAR T cells by co-introduction of costimulatory molecules
WO2015120187A1 (en) * 2014-02-05 2015-08-13 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-spevific tn glycopeptide variants
BR112016018100A2 (pt) * 2014-02-07 2018-02-20 Univ Mcmaster acoplador antigênico de células t trifuncional, métodos e usos do mesmo
JP6673838B2 (ja) 2014-02-14 2020-04-01 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 免疫細胞と病的細胞の両方に存在する抗原を標的とするように操作された、免疫療法のための細胞
SG10202109752XA (en) 2014-04-07 2021-10-28 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
KR20170032406A (ko) 2014-07-15 2017-03-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016014576A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
BR112017000939A2 (pt) 2014-07-21 2017-11-14 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor antigênico quimérico de cll-1
RU2724999C2 (ru) 2014-08-19 2020-06-29 Новартис Аг Химерный антигенный рецептор (car) против cd123 для использования в лечении злокачественных опухолей
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016054520A2 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 The California Institute For Biomedical Research Engineered cell surface proteins and uses thereof
WO2016057705A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
CA3203273A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
US20170258835A1 (en) * 2014-10-31 2017-09-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for modified t cells
MX2017005698A (es) * 2014-10-31 2017-06-29 Univ Pennsylvania Alteracion de la expresion genetica en celulas t modificadas con el receptor de antigeno quimerico (cart) y usos de las mismas.
EP3227323B1 (en) 2014-12-03 2020-08-05 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for adoptive cell therapy
WO2016100232A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
JP2018504894A (ja) * 2014-12-19 2018-02-22 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド キメラ抗原受容体およびその使用方法
BR112017013690A2 (pt) 2014-12-24 2018-03-06 Ucl Business Plc célula
IL253149B2 (en) 2014-12-29 2023-11-01 Novartis Ag Methods for preparing cells expressing a chimeric receptor antigen
US11382963B2 (en) 2015-01-12 2022-07-12 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Engineered T cells and uses therefor
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
CA2973642A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Rinat Neuroscience Corporation Mab-driven chimeric antigen receptor systems for sorting/depleting engineered immune cells
JP7170394B2 (ja) * 2015-01-31 2022-11-14 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 治療用分子のｔ細胞送達のための組成物および方法
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
DK3280729T3 (da) * 2015-04-08 2022-07-25 Novartis Ag Cd20-behandlinger, cd22-behandlinger og kombinationsbehandlinger med en cd19-kimær antigenreceptor (car)-udtrykkende celle
AU2016249005B2 (en) 2015-04-17 2022-06-16 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
CN105158466B (zh) * 2015-05-05 2017-12-22 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种检测抗cd19的嵌合抗原受体t细胞对白血病细胞抑制作用的方法
CA2986254A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EP3307282A4 (en) * 2015-06-12 2019-05-01 Immunomedics, Inc. TREATMENT OF DISEASES WITH CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) AND T-CELL (T-CAR) OR NK (CAR-NK) CELL EXPRESSION CONSTRUCTIONS CAR CONSTRUCTIONS
MA42902A (fr) * 2015-07-08 2018-05-16 Univ Johns Hopkins Lymphocytes infiltrant la moelle (mil) en tant que source de lymphocytes t pour une thérapie par des récepteurs chimériques d'un antigène (car)
US10758612B2 (en) 2015-07-15 2020-09-01 Washington University Antibodies to tumor associated complex N-glycans with terminal GlcNAcβ residues and methods of use thereof
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
CN109476722A (zh) * 2015-07-21 2019-03-15 诺华股份有限公司 用于改善免疫细胞的功效和扩张的方法
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CA2994746A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting cd38 antigen and for cd38 gene inactivation
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017040324A1 (en) * 2015-08-28 2017-03-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for cells expressing a chimeric intracellular signaling molecule
EP3340998B1 (en) * 2015-08-28 2023-01-11 The Trustees of the University of Pennsylvania Methods and compositions for cells expressing a chimeric intracellular signaling molecule
US11747346B2 (en) 2015-09-03 2023-09-05 Novartis Ag Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
CN107531793B (zh) 2015-10-13 2022-01-11 优瑞科生物技术公司 对人类cd19具有专一性的抗体药剂和其用途
IL314725A (en) 2015-10-23 2024-10-01 Eureka Therapeutics Inc ׂ A Delaware Corp Antibody/T-cell receptor chimeric structures and their uses
JP6976960B2 (ja) * 2015-11-27 2021-12-08 カーサリクス プロプライエタリー リミテッド 遺伝子改変された細胞およびその使用
MA43380A (fr) * 2015-12-03 2018-10-10 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques modifiés et compositions et procédés associés
SG10202109655VA (en) 2015-12-04 2021-10-28 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
MA44140A (fr) 2015-12-22 2021-05-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Récepteur d'antigène chimérique (car) contre la mésothéline et anticorps contre l'inhibiteur de pd-l1 pour une utilisation combinée dans une thérapie anticancéreuse
AU2016380262B2 (en) * 2015-12-28 2023-02-09 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells
EP3432924A1 (en) * 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017177217A2 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Unum Therapeutics Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
WO2018026953A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
TW202340473A (zh) 2016-10-07 2023-10-16 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
KR20190058509A (ko) 2016-10-07 2019-05-29 티씨알2 테라퓨틱스 인크. 융합 단백질을 이용하는 t-세포 수용체 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US11578115B2 (en) 2017-01-10 2023-02-14 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors based on alternative signal 1 domains
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
EP3579870A4 (en) 2017-02-07 2020-12-30 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) PHOSPHOLIPID ETHER (PLE) T CAR-LYMPHOCYTE TUMOR (CTCT) TARGETING AGENTS
JP7178355B2 (ja) 2017-02-28 2022-11-25 エンドサイト・インコーポレイテッド Ｃａｒ ｔ細胞療法のための組成物および方法
WO2018170458A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting cd37
MX2019011272A (es) 2017-03-22 2019-10-24 Novartis Ag Composiciones y metodos para inmunooncologia.
CN108727497A (zh) * 2017-04-17 2018-11-02 沈阳美达博生物科技有限公司 一种cd19抗体及其应用
WO2018199593A1 (ko) * 2017-04-24 2018-11-01 재단법인 목암생명과학연구소 Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
SG10201913656TA (en) 2017-04-26 2020-03-30 Eureka Therapeutics Inc Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof
CN107267555B (zh) * 2017-05-27 2020-03-20 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的恶性胶质瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN110831970A (zh) * 2017-06-02 2020-02-21 辉瑞公司 靶向flt3的嵌合抗原受体
CA3067914A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Cellectis Cellular immunotherapy for repetitive administration
US20200255505A1 (en) * 2017-08-09 2020-08-13 Eureka Therapeutics, Inc. Cells Expressing Cell Surface Receptors and Antibodies
CN109422815A (zh) * 2017-08-28 2019-03-05 复旦大学 双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-1 scFv-CAR-T及其构建方法和应用
US20200230221A1 (en) 2017-09-19 2020-07-23 Massachusetts Institute Of Technology Compositions for chimeric antigen receptor t cell therapy and uses thereof
CN111479925B (zh) 2017-10-12 2024-03-08 麦克马斯特大学 具有y182t突变的t细胞-抗原偶联物及其方法和用途
TW202428622A (zh) 2017-10-18 2024-07-16 瑞士商諾華公司 用於選擇性蛋白質降解的組合物及方法
CN109706120A (zh) * 2017-10-26 2019-05-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种双靶点特异性t淋巴细胞及其制备方法和应用
JP7080514B2 (ja) * 2017-12-22 2022-06-06 アブクロン・インコーポレイテッド 悪性ｂ細胞を特異的に認知する抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体及びその用途
CN109971717B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
WO2019129850A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Cellectis Off-the-shelf engineered cells for therapy
CN109988242A (zh) * 2018-01-02 2019-07-09 武汉波睿达生物科技有限公司 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞
CN108285486A (zh) * 2018-01-15 2018-07-17 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd20为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
US11311576B2 (en) 2018-01-22 2022-04-26 Seattle Children's Hospital Methods of use for CAR T cells
WO2019178342A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 Fundamental Solutions Corporation Programmable immunocyte receptor complex system
US10869888B2 (en) * 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
CN109161532A (zh) * 2018-05-31 2019-01-08 华东师范大学 同时靶向psma和pd-l1的工程化免疫细胞
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
CA3099928A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting cd37 and cd19
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
KR20210021593A (ko) * 2018-07-17 2021-02-26 트리움비라 이뮤놀로직스 유에스에이, 인크. 다양한 구조 최적화를 갖는 t 세포-항원 커플러
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
CN112739340A (zh) 2018-07-23 2021-04-30 美真达治疗公司 抗cd5抗体药物缀合物(adc)在同种异体细胞疗法中的用途
CN110872356B (zh) * 2018-09-03 2023-06-13 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
JP2022501067A (ja) * 2018-09-26 2022-01-06 上海恒潤達生生物科技有限公司Hrain Biotechnology Co., Ltd. Ｂｃｍａ及びｃｄ１９を標的とするキメラ抗原受容体、並びにその使用
CN112771071A (zh) 2018-09-28 2021-05-07 麻省理工学院 胶原蛋白定位的免疫调节分子及其方法
WO2020092057A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Yale University Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells
CN109575143B (zh) * 2018-12-29 2022-06-17 博生吉医药科技(苏州)有限公司 双特异性cd20-cd19-car及其应用
WO2020180882A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Nkarta, Inc. Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
JP2022538974A (ja) 2019-06-26 2022-09-07 マサチューセッツ インスチテュート オブ テクノロジー 免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体およびその方法
CN114729059A (zh) * 2019-09-11 2022-07-08 宾夕法尼亚大学董事会 包含前列腺干细胞抗原(psca)嵌合抗原受体(cars)的组合物和方法
WO2021061648A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for stimulation of endogenous t cell responses
BR112022009679A2 (pt) 2019-11-26 2022-08-09 Novartis Ag Receptores de antígeno quimérico cd19 e cd22 e usos dos mesmos
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
IL296242A (en) 2020-03-10 2022-11-01 Massachusetts Inst Technology Methods for producing engineered memory-like nk cells and preparations containing them
CN115485295A (zh) 2020-03-10 2022-12-16 麻省理工学院 NPM1c阳性癌症的免疫疗法的组合物和方法
CN111484562B (zh) * 2020-04-25 2021-08-20 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种靶向cd22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
US20210338833A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
US20210340524A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
US20230235052A1 (en) * 2020-05-06 2023-07-27 Gracell Biotechnologies (Shanghai) Co., Ltd. Humanized cd19 antibody and use thereof
US12043654B2 (en) 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
US20230257475A1 (en) * 2020-07-16 2023-08-17 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric antigen receptors and uses thereof
EP4196579A1 (en) 2020-08-13 2023-06-21 Yale University Compositions and methods for engineering and selection of car t cells with desired phenotypes
EP4247850A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Simcere Innovation, Inc. Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy
WO2022111562A1 (zh) * 2020-11-26 2022-06-02 上海医药集团生物治疗技术有限公司 一种经修饰的免疫细胞及其应用
US12016923B2 (en) 2021-06-01 2024-06-25 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 T cell-antigen couplers and uses thereof
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
CN118613499A (zh) * 2021-08-18 2024-09-06 宾夕法尼亚大学董事会 对b细胞受体特异的嵌合抗原受体的组合物和方法
AU2022366987A1 (en) 2021-10-14 2024-05-16 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
WO2023081715A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
CN114133457B (zh) * 2021-12-08 2022-08-19 郑州源创吉因实业有限公司 一种靶向ror1和cd33的双特异性嵌合抗原受体(car)及其应用
WO2023173137A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Yale University Compositions and methods for efficient and stable genetic modification of eukaryotic cells

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5504692A (en) 1992-06-15 1996-04-02 E. I. Du Pont De Nemours Co., Inc. System and method for improved flow data reconciliation
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5993434A (en) 1993-04-01 1999-11-30 Genetronics, Inc. Method of treatment using electroporation mediated delivery of drugs and genes
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
DK0871495T3 (da) * 1995-02-24 2005-10-17 Gen Hospital Corp Omdirigering af cellulær immunitet med receptorkimærer
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
WO1998046645A2 (en) 1997-04-14 1998-10-22 Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh Method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6241701B1 (en) 1997-08-01 2001-06-05 Genetronics, Inc. Apparatus for electroporation mediated delivery of drugs and genes
US6055453A (en) 1997-08-01 2000-04-25 Genetronics, Inc. Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy
NZ507381A (en) 1998-04-21 2003-12-19 Micromet Ag CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
US6678556B1 (en) 1998-07-13 2004-01-13 Genetronics, Inc. Electrical field therapy with reduced histopathological change in muscle
US7171264B1 (en) 1999-05-10 2007-01-30 Genetronics, Inc. Intradermal delivery of active agents by needle-free injection and electroporation
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
IL151287A0 (en) 2000-02-24 2003-04-10 Xcyte Therapies Inc A method for stimulation and concentrating cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
JP4987205B2 (ja) 2000-03-03 2012-07-25 ジェネトロニクス， インコーポレイテッド 遺伝子送達用核酸製剤および使用方法
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
CN1195779C (zh) * 2001-05-24 2005-04-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 抗人卵巢癌抗人cd3双特异性抗体
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
US20040014645A1 (en) 2002-05-28 2004-01-22 Advisys, Inc. Increased delivery of a nucleic acid construct in vivo by the poly-L-glutamate ("PLG") system
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
US20050070841A1 (en) 2002-07-04 2005-03-31 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
AU2004242846A1 (en) * 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-CD3, anti-CD19 antibody constructs for the treatment of B-cell related disorders
WO2005042743A2 (en) 2003-08-18 2005-05-12 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
US20070014720A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-18 Gadi Gazit-Bornstein Antibodies directed to CD20 and uses thereof
JP2009518044A (ja) 2005-12-07 2009-05-07 ジェネトロニクス，インコーポレイティド 可変容積エレクトロポレーションチャンバー及びその使用方法
EP2066349B1 (en) 2006-09-08 2012-03-28 MedImmune, LLC Humanized anti-cd19 antibodies and their use in treatment of tumors, transplantation and autoimmune diseases
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
US8999398B2 (en) 2009-11-06 2015-04-07 Transtarget Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
JP6029581B2 (ja) * 2010-06-19 2016-11-24 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター 抗ｇｄ２抗体
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
SG190997A1 (en) 2010-12-09 2013-07-31 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
JP6850528B2 (ja) * 2012-02-13 2021-03-31 シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート 二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016514956A (ja) * 2013-03-05 2016-05-26 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫療法のためのエンゲージャー細胞
JP2019024499A (ja) * 2013-03-05 2019-02-21 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫療法のためのエンゲージャー細胞
JP2016514462A (ja) * 2013-03-16 2016-05-23 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ｃｄ１９キメラ抗原受容体を使用するがんの処置
JP2019500881A (ja) * 2016-01-08 2019-01-17 プロスペクト チャーターケア アールダブリュエムシー，エルエルシー ディ／ビー／エイ ロジャー ウィリアムズ メディカル センターＰｒｏｓｐｅｃｔ Ｃｈａｒｔｅｒｃａｒｅ Ｒｗｍｃ，Ｌｌｃ Ｄ／Ｂ／Ａ Ｒｏｇｅｒ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 老年ｃａｒ−ｔ細胞およびその使用
JP2019506394A (ja) * 2016-01-21 2019-03-07 ファイザー・インク 上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉを標的とするキメラ抗原受容体
JP2021036873A (ja) * 2016-01-21 2021-03-11 ファイザー・インク 上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉを標的とするキメラ抗原受容体
US11267892B2 (en) 2016-01-21 2022-03-08 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor variant III
US11279764B2 (en) 2016-01-21 2022-03-22 Pfizer Inc. Antibodies specific for epidermal growth factor receptor variant III and their uses
JP7198797B2 (ja) 2016-01-21 2023-01-04 ファイザー・インク 上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉを標的とするキメラ抗原受容体
JP2019512215A (ja) * 2016-02-19 2019-05-16 ノヴォスコープ アイピー リミテッド 改変細胞及び方法
JP2021524731A (ja) * 2018-03-16 2021-09-16 サイトイミューン セラピューティクス， インコーポレイテッドＣｙｔｏＩｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 二重特異性抗体ｃａｒ細胞免疫療法
JP7202689B2 (ja) 2018-03-16 2023-01-12 サイトイミューン セラピューティクス， インコーポレイテッド 二重特異性抗体ｃａｒ細胞免疫療法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2872526B1 (en) 2020-04-01
US20210040234A1 (en) 2021-02-11
US20240018271A1 (en) 2024-01-18
EA201590208A1 (ru) 2015-11-30
KR20150029714A (ko) 2015-03-18
US10696749B2 (en) 2020-06-30
US20150322169A1 (en) 2015-11-12
CN104583230A (zh) 2015-04-29
BR112015000638A2 (pt) 2017-08-08
MX2015000426A (es) 2015-07-14
WO2014011988A3 (en) 2014-03-13
EP2872526A4 (en) 2016-03-23
EP2872526A2 (en) 2015-05-20
SG11201408787PA (en) 2015-01-29
AU2013289971A1 (en) 2015-01-22
US11795240B2 (en) 2023-10-24
US9765156B2 (en) 2017-09-19
EP3730512A1 (en) 2020-10-28
WO2014011988A2 (en) 2014-01-16
IL236337A0 (en) 2015-02-26
HK1207090A1 (en) 2016-01-22
ES2786263T3 (es) 2020-10-09
CA2876730A1 (en) 2014-01-16
US20180057609A1 (en) 2018-03-01

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