CN118613499A - 对b细胞受体特异的嵌合抗原受体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用抗BCR CAR治疗或预防哺乳动物的血液学癌症或自身免疫性疾病的组合物和方法。一个方面包括修饰T细胞和包括所述修饰细胞的药物组合物，其用于过继细胞疗法和治疗与包括富集的定型BCR的B细胞相关的癌症或自身免疫性疾病。

Description

对B细胞受体特异的嵌合抗原受体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月18日提交的美国临时申请号63/234,514的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
电子序列表引用
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背景技术
淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或其它血液学癌症中的恶性或致病性B细胞克隆可通过特异的、复发的或富集的定型(stereotyped)B细胞受体(BCR)的表达来鉴定，这些受体可参与B细胞恶性肿瘤的发病机制。此外，数种自身免疫性障碍的特征在于特异性B细胞受体富集，这些受体被认为与自身免疫性疾病的发病机制有关。靶向与癌症或自身免疫性疾病相关的B细胞的现有疗法存在缺陷，因为它们不能特异性靶向致病克隆，而会耗竭整个B细胞隔室。例如，CD19定向的嵌合抗原受体(CAR)靶向所有患者B细胞，并且常常会导致B细胞发育不全(B-cell aplasia)，患者需要长期输注IgG以防止感染复发。此外，没有B细胞的话，患者对疫苗的反应很差。
对于靶向与血液学癌症或自身免疫性疾病相关的致病性B细胞克隆并留存(不伤害，spare)正常B细胞或浆细胞的有效疗法，仍有未满足的需求。
附图说明
当结合附图阅读时，将会更好地理解本发明优选实施方式的下列详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了当前优选的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。
通过下面结合附图对说明性实施方式的详细描述，将会更全面地理解本发明的前述和其它特征和优点。
图1示出携带含免疫球蛋白重链区(IGHV)4-34的B细胞受体的各种血液学恶性肿瘤患者的百分比。在原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(PVRL)患者当中，这些患者中超过60％携带此特异性BCR，而在原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)、活化B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)和毛细胞白血病-变体(HCLv)中，大约30-40％的患者其恶性肿瘤细胞中携带此特异性BCR。相比之下，在少数正常健康的B细胞(<5％)中发现含IGHV4-34的BCR(Belhouaci et al,Blood Advances,2020)。PVRL：原发性玻璃体视网膜淋巴瘤；PCNSL：原发性中枢神经系统淋巴瘤：DLBCL-ABC：弥漫性大B细胞淋巴瘤-活化B细胞样；DLBCL-GCB：弥漫性大B细胞淋巴瘤-生发中心样；BL：伯基特淋巴瘤；CLL：慢性淋巴细胞白血病；MCL：套细胞淋巴瘤；SMZL：脾边缘区淋巴瘤；OAMZL：眼附属器边缘区淋巴瘤；CBL-MZ：边缘区特性克隆性B细胞淋巴细胞增多症(clonal B cell lymphocytosis of marginal zone origin)；HCLc：毛细胞白血病-经典型；HCLv：毛细胞白血病-变体。
图2A示出慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者大队列中特异性IGHV的富集。红色条表示下列IGHV区域在5-12％的CLL患者中各有富集：IGHV1-69、IGHV3-23、IGHV4-34。
图2B示出来自不同CLL队列的大约17-18％的患者携带在R110位点含有突变的IGLV3-21 BCR(Maity et al,PNAS2020；Muggen et al,Immunity&Ageing 2019)。
图3是示出靶向富集的定型BCR的CAR的开发的示意图。抗富集的定型BCR的嵌合抗原受体T细胞将特异性杀伤肿瘤克隆，同时留存正常B细胞；因此，不会出现B细胞发育不全，无需终生静脉内注射(IV)免疫球蛋白，以及机会性感染减少。此外，已知BCR下游的信号传导驱动肿瘤细胞存活和增殖。因此，与靶向并非肿瘤B细胞存活和增殖所需的CD19不同，靶向富集的定型BCR还意味着靶向白血病/淋巴瘤细胞(L/L)的“阿喀琉斯之踵”，即其存活所需的BCR。因此，此策略能够潜在地减少抗原阴性逃逸(antigen-negative escape)(例如CD19-neg复发)。IV：静脉内注射；L/L：白血病/淋巴瘤细胞；StBCR：定型/富集BCR。
图4是示出特异性靶向肿瘤B细胞克隆的CAR T细胞的开发的示意图。与CD19定向的CAR T细胞疗法相比，本文公开的此策略具有数个优点，包括下列：(i)CD19定向的CAR T细胞疗法将导致所有成熟B细胞的杀伤(B细胞发育不全)；而仅靶向携带疾病特异性的“定型”或“富集”BCR的B细胞将导致消除肿瘤B细胞克隆，同时留存携带各种BCR的所有其它多克隆B细胞。在输注抗BCR CAR T细胞后这些多克隆B细胞可在患者体内茁壮成长，保护患者免受危及生命的机会性感染；和(ii)CD19定向的CAR T细胞疗法最初将杀伤携带CD19的肿瘤B细胞，而常见的是CD19阴性肿瘤细胞甚至在CD19定向的CAR T细胞的存在下也会发育，因为CD19不是肿瘤B细胞存活或增殖所需的分子。相比之下，鉴于BCR在促进B细胞信号传导、存活和增殖方面的关键作用，将不会太常见BCR阴性肿瘤B细胞。BCR：B细胞受体。
图5是显示CAR构建体的示例性实施方式的示意图。本文公开的CAR包含源自识别特异性免疫球蛋白重链区(IGHV)的抗体的单链可变片段(scFv)。CAR的这一部分用于将CART细胞定向至表达特异性BCR的致病B细胞。每个构建体都克隆有轻至重(Light-to-Heavy,L2H)和重至轻(Heavy-to-Light,H2L)取向的抗原结合结构域(scFv)。识别特异性BCR的各种scFv与以前用于抗CD19 CAR的41BB-CD3z胞内信号传导结构域配对。scFv：单链可变片段。41BB：41BB的胞内结构域。
图6是显示本文公开的开发表达定型BCR的肿瘤B细胞系的方法的示意图。作为第一步，使用CRISPR/Cas9敲除内源性免疫球蛋白重链(IGH)和轻链(IGL)，之后用编码免疫球蛋白重链和轻链的定型或富集BCR进行慢病毒转导(IGLV3-21 R110；IGHV1-69；IGHV4-34；IGHV3-23)。这些BCR编码的序列源自血液学恶性肿瘤患者。CRISPR：成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。LV：慢病毒；IgM C：IgM恒定区；IgG1 C：IgG1恒定区。
图7A-7B涉及携带可识别定型或富集BCR的多种CAR的CAR T细胞的抗BCR CART制造。图7A显示(i)用CD3/CD28包被的磁珠刺激后的总T细胞数；刺激后T细胞的细胞体积，显示细胞大小先是扩大，之后是静息期(rest-down period)；和刺激后T细胞的群体倍增。图7B显示刺激后8天抗BCR CAR的成功表达。AVA＝抗3-21IGLV；hG6.3＝抗1-69IGHV；9G4＝抗IGHV4-34；3C9＝抗3-23IGLV。
图8A-8B显示抗BCR CAR T细胞功效的体外测定。图8A显示使携带WT BCR、定型BCR或具有CD19耗竭的肿瘤B细胞与对CD19、VL3-21-R110、VH1-69或VH4-34特异的CAR T细胞一起培养，导致预期条件下活肿瘤细胞数量的特异性减少：CART19 T细胞导致除CD19-KO以外的所有肿瘤B细胞耗竭；CART3-21导致Jeko1 VL3-21*耗竭，但不导致其它肿瘤B细胞耗竭；CART1-69导致Jeko1 VH1-69耗竭，但不导致其它肿瘤B细胞耗竭；以及CART4-34导致Jeko1VH4-34耗竭，但不导致其它肿瘤B细胞耗竭。这些数据明确证明本发明的抗BCR CAR T细胞的特异性。图8B显示在与各种肿瘤B细胞一起培养6天后各种CAR T细胞的增殖情况。这些结果表明，当CAR T细胞遇到其可通过其表达的CAR识别的抗原(CD19或定型/富集BCR)时，其发生特异性反应并增殖。
图9显示本发明的CAR T细胞对患者来源肿瘤细胞的特异性抗肿瘤作用。在本实验中，将来自健康患者的B细胞，或来自表达IGHV1-69+BCR的CLL患者的肿瘤B细胞，或来自表达IGHV4-34+BCR的CLL患者的肿瘤B细胞与CART19或CART1-69或CART4-34共培养。数据显示，如所预期的，CART19对所有类型的B细胞，包括来自健康患者与肿瘤患者的健康B细胞与肿瘤B细胞均表现出强细胞毒性。相比之下，CART1-69对IGHV1-69+CLL肿瘤B细胞表现出特异性细胞毒性，同时留存正常健康B细胞。类似地，CART4-34对IGHV4-34+CLL肿瘤B细胞表现出特异性细胞毒性，同时留存健康B细胞。ND580 B细胞：正常/健康供体B细胞。
图10显示CART3-23 CAR T细胞对表达IGHV3-23+BCR(OCI-Ly18)的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系的体外细胞毒性，但未显示对表达IGHV4-34+BCR的另一DLBCL细胞系HBL1可观的细胞毒性。这些结果显示CART3-23特异性靶向携带IGHV3-23+BCR的B细胞的特异性。
图11显示CART4-34在体内控制肿瘤的能力。对细胞系(Mec1，CLL)进行工程改造，使其内源性免疫球蛋白重链和轻链缺失，之后使含有IGHV4-34区域的BCR过表达。在第0天将此IGHV4-34+细胞系静脉内注射小鼠体内，之后在实验的第13天静脉内注射CART19或CART4-34 T细胞(未转导(UTD)T细胞充当阴性对照)。此图显示CART19和CART4-34均可将肿瘤生长缩减到相近水平。
图12显示自身免疫性疾病中IGHV基因频率和BCR亚型的热图。系统性红斑狼疮富含IGHV4-34 BCR；白塞病却富含IGHV 1-69；血栓性血小板减少性紫癜富含IGHV 1-69。TTP：血栓性血小板减少性紫癜；SLE：系统性红斑狼疮；CD：克罗恩病；BD：白塞病；EGPA：嗜酸性肉芽肿性多血管炎(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis)；TTP：血栓性血小板减少性紫癜；AAV：ANCA相关性血管炎；IgAV：IgA血管炎；IgAV：IgA血管炎。图改编自Bashford-Rogers,R.J.M.et al.,Nature,574(7776):122-1261-29(2019)。
图13是显示基于来自血栓性血小板减少性紫癜患者(TTP)的信息的抗ADAMTS13scFv的表位特异性的图。图摘自Ostertag,E.M.et al.,Transfusion 56,1763-1774(2016)。
图14示出慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中定型BCR的其中某些特征：慢性淋巴细胞白血病患者当中共享的B细胞受体序列；41％的CLL患者具有含定型BCR的恶性B细胞；以及具有定型BCR的CLL患者的某亚组显示预后不良。CLL亚组2：IGHV3-21和IGHV3-21；独特的HCDR3序列；含IGLV3-21的BCR预后不良。摘自Maity,P.C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,117:4320-4327(2020),Stamatopoulos,B.et al.,ClinCancer Res,24:5048-5057(2018)和Agathangelidis,A.et al.Blood 119,4467-4475(2012)。
图15显示分别对应于VL 3-21、VH 4-34和VH 1-69的亚组2、4和6中定型BCR的序列标识在慢性淋巴细胞白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)中富集。摘自Agathangelidis,A.et al.Blood 119,4467-4475(2012)。
图16是示出靶向定型BCR的CAR的开发的示意图。抗定型BCR的嵌合抗原受体T细胞特异性杀伤肿瘤克隆，同时留存正常B细胞；因此，不会出现B细胞发育不全，无需终生IV免疫球蛋白，以及机会性感染减少。此外，靶向定型BCR还将意味着靶向CLL细胞的“阿喀琉斯之踵”，即其存活所需的BCR(不同于CD19)；因此，本文考虑到此策略将减少抗原阴性逃逸(例如CD19-neg复发)。“R110 BCR”是含R110突变的IGLV3-21。
图17是根据CAR的一个实施方式的pTRPE AVA L2H CAR的载体图和CAR的对应序列(SEQ ID NO:47)的示意性表示(实例)。
图18是显示体外杀伤实验的图：对VL 3-21的特异性杀伤。图例：UTD-未转导T细胞；CART19-抗CD19 CAR T细胞；3.21*CAR-抗IGLV3-21 R110 BCR CAR T细胞；和1.69CAR-抗IGHV1-69 BCR CAR T细胞。
具体实施方式
本发明涉及细胞(例如，免疫细胞如，例如T细胞)的过继细胞转移策略，细胞经转导以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将基于抗原结合结构域的针对靶抗原的特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合生成表现出特异性抗靶标细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。在一些方面中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被遗传修饰以表达CAR抵抗定型B细胞受体(例如，抗VH4-34、VL3-21、VH3-23或VH1-69 BCR的CAR)，并且CAR T细胞可输注给有需要的受体。输注的细胞能够靶向受体中的富集/定型B细胞，从而靶向例如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、其它血液学恶性肿瘤或自身免疫性疾病中的例如恶性或致病性B细胞克隆，同时保留受体的正常B细胞。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管在测试本发明的实践中可使用与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但本文对优选的材料和方法进行了描述。在描述和主张本发明的过程中，将使用以下术语。
还应理解，本文采用的术语学仅出于描述具体实施方式的目的，而不意图是限制性的。
此外，除非另有指示，否则本文描述的实验使用本领域技术范围内的常规的分子和细胞生物学和免疫学技术。这样的技术对于熟练的技术人员来说是公知的，并且在文献中充分地说明。参见，例如，Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)(包括所有增刊)、MR Green和J.Sambrook的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)以及Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor(2013,第2版)。
使用具有嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的方法和技术描述于例如Ruella,M.et al.,Dual CD19 and CD123 targeting prevents antigen-loss relapses afterCD19-directed immunotherapies.J.Clin.Invest.,126(10):3814-3826(2016)和Kalos,M.et al.,T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent AntitumorEffects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia,ScienceTranslational Medicine,3(95),95ra73:1-11(2011)，其内容特此通过引用以其整体并入。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员的通常理解相同的含义。在有任何潜在模棱两可的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外在的定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用意为“和/或”。术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括(included)”之类的其它形式的使用不是限制性的。
总体上，关于本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交所使用的命名法在本领域中是公知且常用的。除非另有指示，否则本文提供的方法和技术总体上是根据本领域公知并且如本说明书通篇中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述的常规方法进行的。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书进行的，如本领域通常完成的或如本文所述的那样。关于本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学所使用的命名法，以及本文描述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学的实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
为了更容易理解本公开，选择的术语定义如下。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代一个或多于一个(即，指代至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意为一个元素或多于一个元素。
当涉及诸如量、持续时间等的可测量值时，如本文所用的“约”意为包括指定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1，还更优选±0.1％的变动，因为这样的变动适于执行所公开的方法。
如本文所用，“活化”是指已被充分地刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关联。术语“活化的T细胞”指的是正经历细胞分裂的T细胞等。
如本文所用，术语“衔接分子”是指具有允许与两个或更多个分子相互作用的序列的多肽，并且在某些实施方式中，促进细胞毒性细胞的活化或失活。
如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab')2以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlowet al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science242:423-426)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且指代完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“抗体重链”是指所有抗体分子其天然存在构象中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链”是指所有抗体分子其天然存在构象中存在的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两个主要抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“合成抗体”是指利用重组DNA技术生成的抗体，如，例如，本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释意为通过合成编码抗体的DNA分子(并且该DNA分子表达抗体蛋白)或限定抗体的氨基酸序列而生成的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已利用本领域可获得和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用的术语“抗癌作用”是指可通过肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加和/或与癌性状况(例如，血液学癌症)相关的各种生理症状改善而展现的生物学作用。“抗癌作用”还可通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和/或CAR预防癌症最初发生的能力而展现。
如本文所用的术语“自身免疫性疾病”被定义为由自身免疫应答引起的障碍。自身免疫性疾病是对自身抗原反应不当或过度的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病(CD)、白塞病(BD)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、ANCA相关性血管炎(AAV)、IgA血管炎(IgAV)、IgA血管炎(IgAV)、阿狄森病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、糖尿病(I型)、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本病、溶血性贫血、多发性硬化、重症肌无力、寻常天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
如本文所用，术语“自体的”意指源自同一个体的任何物质，其随后被再引入该个体中。
“同种异体的”指的是源自同一物种的不同生物体的移植物。
“异种的”是指源自不同物种的生物体的移植物。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经工程改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工T细胞受体。CAR可用作采用过继细胞转移的疗法。将T细胞从患者取出并修饰使得其表达对具体形式的抗原特异的受体。CAR还可包含胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区域的胞外结构域。在一些方面中，CAR包含与跨膜和胞内结构域融合的、源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体。
术语“嵌合胞内信号传导分子”是指包含一种或多种共刺激分子的一个或多个胞内结构域的重组受体。嵌合胞内信号传导分子基本上缺少胞外结构域。在一些实施方式中，嵌合胞内信号传导分子包含另外的结构域，如跨膜结构域、可检测标签和间隔区结构域。
如本文所用，术语“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，被引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，例如，抗体或其抗原结合片段的互补决定区(CDR)内的一个或多个氨基酸残基可被来自同一侧链家族的其它氨基酸残基置换，并且可利用本文描述的功能测定来测试改变后的抗体结合抗原的能力。
术语“细胞毒性的”或“细胞毒性”是指杀伤性或破坏性细胞。在一个实施方式中，修饰细胞的细胞毒性被提高，例如，增大T细胞的细胞溶解活性。
“疾病”是动物的如下健康状态：其中动物不能维持稳态，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康持续恶化。相比之下，动物的“障碍”是动物的如下健康状态：其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态没有障碍不存在时那么有利。如不加以治疗，障碍不一定会导致动物健康状态进一步下降。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述有效实现具体生物学结果或提供治疗或预防益处的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的效果可包括但不限于通过本领域适合的任意方法确定的抗癌活性。
“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列充当用于合成生物过程中具有限定的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)序列或限定的氨基酸序列的其它聚合物和大分子的模板的固有性质以及由此产生的生物学性质。因此，基因编码蛋白质——如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生该蛋白质。用作基因或cDNA的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常被提供在序列表中)和非编码链都可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外引入或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何材料。
如本文所用，术语“扩大”是指数量增加，如T细胞数量增加。在一个实施方式中，离体扩大的T细胞的数量相对于最初存在于培养物中的数量增加。在另一实施方式中，离体扩大的T细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。如本文所用，术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)移出并在生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文所用，术语“表达”被定义为具体核苷酸序列受其启动子驱动的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含充足的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，如并入该重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，“同源”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间——如两个DNA分子或两个RNA分子之间——或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置均被相同的单体亚单位占据时；例如，如果两个DNA分子中每一个中的一个位置均被腺嘌呤占据，则其在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个亚单位长度的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或同源，则这两个序列是90％同源的。应用于核酸或蛋白质时，如本文使用的“同源”是指具有约50％序列同一性的序列。更优选地，同源序列具有约75％的序列同一性，甚至更优选具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)(例如，互补决定区1(CDR1)和/或互补决定区2(CDR2)和/或互补决定区3(CDR3))的残基被来自具有期望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体还可包含在受体抗体和引入的CDR或框架序列中均找不到的残基。这些修饰被进行以进一步改进和优化抗体性能。总体上，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个可变结构域，一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的。更多细节参见Jones etal.,Nature,321:522-525,1986；Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“全人”是指免疫球蛋白，如抗体或其抗原结合片段，其中整个分子是人来源的或由与人形式的该抗体或其抗原结合片段相同的氨基酸序列组成。
如本文所用，“同一性”是指两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每一个中的一个位置被精氨酸占据，则其在该位置处具有同一性。同一性或在比对时两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半位置(例如，10个氨基酸长度的聚合物中的5个位置)相同，则两个序列具有50％同一性；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或相同，则两个氨基酸序列具有90％同一性。
“基本上同一”意为多肽或核酸分子表现出与参考氨基酸序列(例如，本文所述的氨基酸序列中的任一个)或核酸序列(例如，本文所述的核酸序列中的任一个)至少50％的同一性。优选地，这样的序列在氨基酸或核酸水平上具有与用于比较的序列至少60％，更优选80％或85％，以及更优选90％、95％或甚至99％的同一性。
序列同一性一般用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这样的软件通过分配与各种取代、缺失和/或其它修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守取代一般包括以下分组中的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率评分指示密切相关的序列。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为充当抗体的一类蛋白质。B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。这类蛋白质包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物如唾液、眼泪、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和生殖泌尿道粘液分泌物中的一级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数对象的初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。其是凝集、补体固定和其它抗体响应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可充当抗原受体。IgE是通过在暴露于过敏原后引起介体从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放而介导瞬时超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所用，术语“免疫应答(响应，response)”被定义为在淋巴细胞将抗原分子识别为外源并引起抗体形成和/或激活淋巴细胞以去除该抗原时发生的对抗原的细胞响应。
如本文所用，“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的有用性的出版物、记录、图或任意其它表达介质。例如，本发明的试剂盒的说明材料可例如被附于容纳本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与容纳核酸、肽和/或组合物的容器一起装运。可选地，说明材料可与容器分开装运，目的是说明材料和化合物被接受者配合地使用。
“分离的”意为自天然状态改变或移出的。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，也可存在于非天然环境如例如宿主细胞中。
如本文所用，“慢病毒”是指反转录病毒科的一个属。慢病毒在反转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；其可将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此其是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供实现体内显著水平基因转移的手段。
如本文所用，术语“修饰”意为本发明的分子或细胞的状态或结构改变。分子可以以多种方式被修饰，包括化学、结构和功能修饰。细胞可通过核酸的引入而被修饰。
如本文所用，术语“调节”意为与不存在治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与其它方面相同但未经治疗的对象的应答水平相比，介导对象中的应答水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖干扰和/或影响天然信号或应答，由此介导对象(优选人)的有益治疗响应。
在本发明的环境中，对于常出现的核酸碱基使用以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶(胞苷，cytosine)，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，以及“U”是指尿苷。
除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，使得编码该蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可含有内含子(一个或多个)。
术语“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当使第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列被可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。总体上，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在连接两个蛋白编码区需要时处于相同的阅读框中。
组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、胸骨内注射或输注技术。
“单链抗体”是指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段经由氨基酸改造段(an engineered span of amino acids)连接至Fv区域。生成单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward et al.(1989)Nature 334:54454；Skerra et al.(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。
如本文关于抗体或其抗原结合片段所使用的术语“特异性结合”意为识别特定抗原但不实质上识别或结合样品中的其它分子的抗体或其抗原结合片段。例如，特异性结合来自一个物种的一种抗原的抗体或其抗原结合片段也可结合来自一个或多个物种的该种抗原。但是，这种交叉物种反应性本身并不使抗体或其抗原结合片段为特异性的归类发生改变。在另一个实例中，特异性结合一种抗原的抗体或其抗原结合片段也可结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不使抗体或其抗原结合片段为特异性的归类发生改变。在一些情况下，术语“特异性的结合”或“特异性结合”可在涉及抗体或其抗原结合片段、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用时使用，意为该相互作用取决于化学物种上具体结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体或其抗原结合片段识别和结合特定的蛋白质结构而非总体上识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则包含表位A(或游离的无标记A)的分子的存在在包含带标记“A”和该抗体或其抗原结合片段的反应中将使与抗体或其抗原结合片段结合的带标记A的量减少。
术语“对象”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，如羊科、牛科、猪科、犬科、猫科和鼠科哺乳动物。优选地，对象是人。
如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指代已与在其天然存在状态下其通常相关的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指代均质的细胞群。在其它情况下，此术语仅指已与在其天然状态下其天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，细胞被体外培养。在其它实施方式中，细胞不被体外培养。
如本文所用，术语“治疗性”意为治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的抑制、缓解或根除而获得。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括初代对象细胞及其后代。
如本文所用的“治疗”疾病意为降低对象所经历的疾病或障碍(例如，癌症；自身免疫性疾病)的至少一种征兆或症状的频率或严重程度。
“载体”是包含分离的核酸并且可被用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体在本领域已知，包括但不限于线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸到细胞中转移的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体和类似物。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式展示。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明的范围的刻板限制。因此，范围的描述应该被认为是已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及个体数值。例如，诸如1至6的范围描述应被认为已具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围宽度如何，这都适用。
描述
本发明包括用于治疗或预防B细胞癌症(包括但不限于淋巴瘤、骨髓瘤、白血病)和/或B细胞介导的自身免疫性疾病的组合物和方法。根据本发明，免疫细胞——包括但不限于T细胞(包括但不限于自然杀伤T(NKT)细胞和γ-δT细胞)、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞——通过表达包含特异性识别和结合由细胞(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的癌性B细胞)表达的疾病特异性或定型B细胞受体的抗原结合结构域的CAR而被修饰，用于过继细胞(例如，T细胞)疗法。本发明的修饰细胞(例如，修饰T细胞)对疾病相关或定型B细胞受体具有特异性，并且对具有定型B细胞受体的B细胞具有提高的细胞毒性和功效。
例如，很多B细胞非霍奇金淋巴瘤在其B细胞受体(BCR)内表达受限或“定型”的免疫球蛋白可变重链和轻链基因。三分之一的CLL患者表达定型受体，以及在其它B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中的很大一部分中发现定型受体，包括33.9％的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者、46.3％的套细胞淋巴瘤(MCL)患者和45.8％的脾边缘区淋巴瘤(SMZL)患者。虽然不希望受理论的束缚，但这些发现表明抗原(一种或多种)可能在瘤性克隆的选择和扩大中起作用。例如，VL 3.21(包括含R110突变的VL 3.21)、VH 1.69、VH 4.34、VH3.23等在这些疾病中高度富集。这些保守抗原为CAR疗法提供新型且肿瘤选择性抗原。靶向此类抗原的本发明CAR代表相比例如CD19定向的CAR更具肿瘤选择性的细胞疗法，CD19定向的CAR靶向所有成熟的B-细胞并导致患者需要终生输注IgG防止感染。在一些实施方式中，本发明的这些BCR同种型CAR将靶向一部分B细胞群，因此具有降低的瘤外毒性。
在其它实施方式中，本发明的CAR T细胞也可用于特异性清除自身免疫性B细胞克隆。虽然不希望受理论的束缚，但数种自身免疫性疾病的特征在于被认为与疾病发病机制相关的特异性BCR的富集。具体地，VH 1.69抗体在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和白塞病(Bechet Disease)中富集，VH 4.34抗体在系统性红斑狼疮(SLE)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)和克罗恩病(CD)中富集。因此，在一些实施方式中，本发明的CAR T细胞可特异性地耗竭表达和产生促成此类自身免疫性疾病发病机制的抗体的B细胞和浆细胞。
B细胞恶性肿瘤CD19、CD20和CD22 CAR T细胞疗法中的各疗法的报告数据表明，对此类治疗剂(therapeutics)的耐药性可能由于抗原逃逸，即出现靶抗原丢失或下调的肿瘤。
因此，在再进一步的实施方式中，本发明的CAR细胞(例如，CAR T细胞)可单独使用或与其它治疗组合使用，以通过靶向B细胞白血病和淋巴瘤存活所必需的蛋白(即BCR)来减少或消除B细胞癌症(例如，CLL患者的癌性B细胞)的抗原逃逸。
嵌合抗原受体(CAR)
一方面，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中抗原结合结构域特异性结合富集的定型B细胞受体(BCR)。
抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域是CAR的胞外区域，用于结合特定的靶抗原，包括蛋白质、碳水化合物和糖脂。抗原结合结构域可包括与抗原结合的任意结构域，并且可包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体及其任意片段。
在一些实施方式中，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的经共价连接形成VH::VL异二聚体的重链(VH)可变区与轻链(VL)可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过将VH的N-末端与VL的C-末端，或将VH的C-末端与VL的N-末端连接的编码肽的连接体连接。在一些实施方式中，抗原结合结构域包括具有从N-末端到C-末端的构型——VH-连接体-VL的scFv。在一些实施方式中，抗原结合结构域包括具有从N-末端到C-末端的构型——VL-连接体-VH的scFv。本领域技术人员将能够选择适当的构型用于本发明。
在一些实施方式中，连接体为了柔韧性(flexibility)而富含甘氨酸，以及为了溶解性而富含丝氨酸或苏氨酸。连接体可连接胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。连接体的非限制性实例公开于Shen et al.,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO2014/087010中，其内容特此通过引用以其整体并入。本领域已知各种连接体序列，非限制地包括甘氨酸丝氨酸(GS)连接体如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:1)、(GGGS)n(SEQ ID NO:2)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:3)，其中n代表至少为1的整数。示例性连接体序列可包括氨基酸序列，其非限制地包括GGSG(SEQ ID NO:4)、GGSGG(SEQ ID NO:5)、GSGSG(SEQ ID NO:6)、GSGGG(SEQ ID NO:7)、GGGSG(SEQ ID NO:8)、GSSSG(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:10)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:11)等。本领域技术人员将能够选择合适的连接体序列用于本发明。在一个实施方式中，本发明的抗原结合结构域包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL由具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的连接体序列分隔，该连接体序列可由核酸序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT(SEQ ID NO:12)编码。
单链Fv多肽抗体可由包含VH-和VL-编码序列的核酸表达，如Huston,et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)描述的那样。另见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；和美国专利公开号20050196754与20050196754。已描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，例如，Zhao et al.,Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter et al.,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012年8月12日；Shieh et al.,J Imunol2009 183(4):2277-85；Giomarelli et al.,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fifeeta.,J Clin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks et al.,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer et al.,Ther Immunol 1995 2(10:31-40)。已描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如，Peter et al.,J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7；Xieet al.,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol 199717(5-6):427-55；Ho et al.,BioChim Biophys Acta 20031638(3):257-66)。
如本文所用，“Fab”是指与抗原结合但为单价且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，被木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不结合抗原的Fc区)。
如本文所用，“F(ab′)2”是指通过胃蛋白酶消化完整IgG抗体产生的抗体片段，其中此片段具有两个抗原结合(ab′)(二价)区，其中每个(ab′)区包含两条单独的氨基酸链，一部分H链通过S—S键与轻(L)链连接以用于结合抗原，而其中剩余的H链部分连接在一起。“F(ab′)2”片段可分成两个独立的Fab′片段。
在其它实施方式中，抗原结合结构域包括抗体模拟蛋白，如，例如经设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、亲和体(affibody)、adnectin或抗运载蛋白(anticalin)。可利用DARPin文库生成具有特异性结合亲和力的构建体，例如，如Seeger,M.A.et al.,Design,construction,and characterization of a second generation DARPin library withreduced hydrophobicity,Protein Sci.,22:1239-1257(2013)描述的那样。
在一些实施方式中，抗原结合结构域可源自最终将使用CAR的同一物种。例如，对于在人类中的使用，CAR的抗原结合结构域可包括本文别处描述的人抗体或其片段。
“富集的定型”BCR，或与BCR相关的“富集的定型”，是指这样的BCR：具有由H和L链中高度相似的Ig V区定义的相似的一级结构，如，例如长度、氨基酸组成和重组连接处的独特氨基酸残基，并且在一些实施方式中共享不同的H和L CDR3构型。这些富集的定型BCR——其可被分到富集的定型BCR的不同亚组中，每个亚组常规上按序列号命名(例如，亚组2、4或6)——包括本发明CAR的抗原结合结构域所针对的抗原靶标。由于这些富集的定型BCR具有内在的信号传导和活化B细胞的能力，因此直接参与疾病发病机制。例如，Stamatopoulos,B.et al.,Clin.Cancer Res.,24:5048-5057(2018),Rovida et al.,Clin.Cancer Res.,27(3):729-739(2021),Hacken,E.T.et al.,Leukemia,33(2):287-298(2019),Messmer,B.T.et al.,J.Exp.Med.,200(4):519-525(2004)和Rossi,D.&Gaidano,G.,Haematologica,95(12):1992-1995(2010)，其每一篇通过引用以其整体并入本文，描述了多组不同的富集的定型受体。
在一个实施方式中，可通过使用IGHV1-5-7、IGHD6-19、IGHJ4和/或IGKV1-39来表征亚组1BCR；可通过使用IGHV3-21、IGHJ6和/或IGLV3-21来表征亚组2BCR；可通过使用IGHV4-34、IGHD5-5或D4-17、IGHJ6和/或IGKV3-30来表征亚组4BCR；可通过使用IGHV1-69、IGHD3-10、IGHJ6和/或IGKV1-33或IGLV3-21来表征亚组5BCR；可通过使用IGHV1-69、IGHD3-16、IGHJ3和/或IGKV3-20来表征亚组6BCR；以及可通过使用IGHV4-39、IGHD6-13、IGHJ5和/或IGKV1-39来表征亚组8BCR。
在一些实施方式中，富集的定型BCR是亚组1、2、4、5、6或8富集的定型BCR。在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域特异性结合亚组1、2、4、5、6或8富集的定型BCR。
在其它实施方式中，富集的定型BCR是亚组2、4或6富集的定型BCR。在另一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域特异性结合亚组2、4或6富集的定型BCR。
在一些实施方式中，富集的定型BCR被表征为自主活性(autonomously active)BCR。
在一个实施方式中，自主活性BCR可由自主BCR信号传导驱动，例如通过HCDR3介导的对另一种BCR的内部表位的结合，从而实现BCR-BCR结合、聚集和/或活化(参见，例如，Dühren-von Minden,M.et al.,Nature,489(7415):309-12(2012)；也参见例如美国专利公开号2020/0199225，其通过引用以其整体并入本文)。
例如，美国专利公开号2020/0199225描述了CLL B细胞受体亚组2变体的与该受体自主活性功能性相关的区域的特征在于轻链的氨基酸序列KLTVLRQPKA(SEQ ID NO:13)和VAPGKTAR(SEQ ID NO:14)，而亚组4的与该受体自主活性功能性相关的区域由重链的可变部分的氨基酸序列PTIRRYYYYG(SEQ ID NO:15)、NHKPSNTKV(SEQ ID NO:16)和VSSASTKG(SEQ ID NO:17)定义。
在其它实施方式中，富集的定型BCR包含KLTVLRQPKA(SEQ ID NO:13)、VAPGKTAR(SEQ ID NO:14)、PTIRRYYYYG(SEQ ID NO:15)、NHKPSNTKV(SEQ ID NO:16)或VSSASTKG(SEQID NO:17)的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域特异性结合富集的定型BCR，富集的定型BCR包含轻链可变区(VL)，轻链可变区包含KLTVLRQPKA(SEQ ID NO:13)和/或VAPGKTAR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，CAR的抗原结合结构域特异性结合富集的定型BCR，富集的定型BCR包含重链可变区(VH)，重链可变区(VH)包含PTIRRYYYYG(SEQ ID NO:18)和/或NHKPSNTKV(SEQ ID NO:19)和/或VSSASTKG(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，抗原结合结构域特异性结合富集的定型BCR，富集的定型BCR包含下列序列：
EVQLVESGGGGGLGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIISSSSYIYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDQNAMDVWGGTTVTVTVSS(SEQ ID NO:21)；和/或
SYELTQPPSVSVSVSVAPGKTARITCAGNNIGSKSVHWYQQQQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHPWWVFGGGTKLTVLRQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:22)。
在另一个实施方式中，抗原结合结构域特异性结合富集的定型BCR，富集的定型BCR包含下列序列：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWTWIRQSPGKGLEWIGEINHSGSTTYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGYGDTPTIRRYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPACLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKC(SEQ ID NO:23)；和/或
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSDRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQGTHWPPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:24)。
在一些实施方式中，本发明的CAR的抗原结合结构域是包含VH和VL的富集的定型BCR特异性结合结构域。
在一个实施方式中，抗原结合结构域包含VH，VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含GFSLTSYG(SEQ ID NO:25)的序列，CDR2包含IWRGGGT(SEQ ID NO:26)的序列；并且CDR3包含ARSRYDEEESMNY(SEQ ID NO:27)的序列。
在一个实施方式中，抗原结合结构域包含VL，VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含GNIHSY(SEQ ID NO:28)的序列，CDR2包含NAKT(SEQ ID NO:29)的序列；并且CDR3序列包含QHFWNTPPT(SEQ ID NO:30)的序列。
在一个实施方式中，抗原结合结构域包含VH，VH包含下列序列：
QVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGGTDSNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSRYDEEESMNYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:31)；
QLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNEKFKGKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)；
QVHLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTFYNVHWVRQPTGKGLEWMAIIWNGGKTDYNSGLKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQSEDTAAYYCVREVGGRFDYWGQGVLVTVSS(SEQ ID NO:64)；或
EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTAYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYHGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDYAVYYCARGGGDWSWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:76)。
在一个实施方式中，抗原结合结构域包含VH，VH由包含下列的序列编码：
CAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGCCCTGGTCTGGTCCAACCTAGTCAATCTTTGTCCATTACCTGCACTGTGTCTGGTTTTTCTCTCACGTCTTATGGAATTCATTGGGTTAGACAAAGCCCTGGGAAAGGGTTGGAGTGGTTGGGTGTGATCTGGCGCGGAGGTGGTACTGACAGCAACGCAGCGTTTATGTCTCGGCTTTCCATAACCAAAGACAACAGCAAGTCTCAGGTGTTCTTCAAGATGAATTCCCTCCAGGCCGACGATACGGCGATCTATTATTGTGCTCGCTCCAGATACGACGAGGAAGAAAGCATGAACTATTGGGGACAGGGGACCTCAGTAACAGTGTCAAGC(SEQ ID NO:33)；
CAACTGGTTCAGTCAGGTGCTGAAGTTGTAAAACCAGGCGCTTCTGTTAAAGTATCCTGTAAAGCTAGCGGATATACATTTACCAGTTACTGGATGCACTGGGTAAAGCAGGCTCCAGGACAAGGACTGGAGTGGATCGGGGCTGTTAGCCCAGGAAACTCAGATACAAGCTACAACGAGAAGTTCAAAGGGAAGGCAACTCTGACTGTCGATAAGAGCGCGAGTACAGCTTATATGGAACTTTCCTCACTTCGGAGCGAAGACACAGCTGTATATTATTGTACCAGGTCTCGCTACGGTAATAATGCACTGGATTACTGGGGACAAGGAACCCTCGTTACGGTCAGTTCT(SEQ ID NO:34)；或
CAAGTGCACCTCAAAGAATCCGGGCCCGGGCTCGTACAACCGTCCCAAACACTCAGCCTGACATGTACAGTGTCAGGATTTTCCCTCACGTTTTATAACGTCCATTGGGTGCGCCAACCAACTGGCAAGGGCCTTGAATGGATGGCCATCATCTGGAACGGTGGCAAAACGGACTATAACAGCGGCCTTAAGAGCAGACTCTCCATATCCCGAGATACTAGCAAATCACAGGTGTTTCTCAAGATGAATTCTCTCCAGAGCGAGGATACTGCTGCCTATTATTGCGTGCGCGAAGTCGGCGGTCGGTTTGACTATTGGGGACAGGGCGTTCTCGTGACTGTGAGCAGT(SEQ ID NO:65)；或
GAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGAACTGGAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTACCGCGTATAACATGAACTGGGTGAAACAGAACAACGGCAAAAGCCTGGAATGGATTGGCAACATTGATCCGTATCATGGCGGCACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAAAAGCCTGACCAGCGAAGATTATGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCGGCGGCGATTGGAGCTGGTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCG(SEQ ID NO:77)。
在一个实施方式中，抗原结合结构域包含VL，VL包含下列序列：
QIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWNTPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:35)；
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:36)；
DFQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYDILAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLHTGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQPEDFASYYCQSGLSAPWTFGGGTKLEL(SEQ ID NO:66)；或
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQAEDLALYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIER(SEQ ID NO:78)。
在一个实施方式中，抗原结合结构域包含VL，VL由包含下列的序列编码：
CAGATCGTTCTTACGCAGAGTCCTGCTTCCCTTTCCGCTTCTGTGGGCGAAACAGTTACCATTACATGCCGCGCAAGCGGGAATATTCACTCTTACCTGGCGTGGTATCAACAAAAGCAAGGTAAATCCCCACAACTTCTGGTTTACAACGCCAAAACTCTGGCTGATGGTGTACCTTCACGCTTCAGCGGCAGTGGGAGCGGGACTCAGTACTCTCTGAAAATCAATAGCCTTCAACCAGAAGATTTTGGCTCCTATTATTGCCAACACTTTTGGAATACTCCTCCGACTTTCGGGGCTGGGACTAAGCTTGAATTGAAA(SEQ ID NO:37)；
GATATACAGTTGACGCAGAGTCCATCTTCTCTCAGTGCTAGCGTTGGAGACCGGGTGACGATTACGTGTAGGGCGAGCCAGGGGATTAGTTCCAATATCGTGTGGCTCCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGGGCCTTATTTACCACGGGACTAATCTGGAATCAGGTGTACCAAGTCGATTCTCCGGGTCCGGTTCAGGCACAGACTATACCCTCACGATAAGTTCATTGGAGCCGGAGGATTTTGCCACATATTATTGCGTCCAGTATTCACAGTTCCCTCCGACATTTGGTCAGGGGACTAAGCTTGAAATTAAG(SEQ ID NO:38)；
GATTTTCAAATGACGCAAAGTCCTGCCAGCTTGTCCGCCTCATTGGGCGAGACAGTTACAATAGAGTGTCTCGCCAGTGAAGATATATATGACATCCTGGCCTGGTACCAGCAAAAGCCTGGAAAGTCACCCCAACTGCTTATTTACGACGCTTCCTCACTGCACACCGGTGTGCCCTCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCTCAGGTGCCCAATACAGTCTGAAAATTAACTCACTCCAACCAGAGGACTTCGCATCCTACTATTGCCAGAGCGGACTCAGCGCTCCATGGACCTTTGGCGGCGGGACGAAATTGGAGCTG(SEQ ID NO:67)；或
GATATTGTGATGACCCAGAGCCATAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGCGATCGCGTGAGCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAAGTGCTGATTTATTGGGCGAGCAACCGCCATACCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCATGCAGGCGGAAGATCTGGCGCTGTATTATTGCCATCAGCATTATAGCACCCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTGAACGC(SEQ ID NO:79)。
在一些实施方式中，抗原结合结构域包含具有从N-末端到C-末端的构型即VH-连接体-VL或VL-连接体-VH的scFv，其中连接体包含SEQ ID NO:11的序列。
在再其它实施方式中，scFv包含下列氨基酸序列：
QVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGGTDSNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSRYDEEESMNYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWNTPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:39)；
QIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWNTPPTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGGTDSNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSRYDEEESMNYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:40)；
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNEKFKGKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:41)；
QLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNEKFKGKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:42)；
QVHLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTFYNVHWVRQPTGKGLEWMAIIWNGGKTDYNSGLKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQSEDTAAYYCVREVGGRFDYWGQGVLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDFQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYDILAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLHTGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQPEDFASYYCQSGLSAPWTFGGGTKLEL(SEQ ID NO:68)；
DFQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYDILAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLHTGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQPEDFASYYCQSGLSAPWTFGGGTKLELGGGGSGGGGSGGGGSQVHLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTFYNVHWVRQPTGKGLEWMAIIWNGGKTDYNSGLKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQSEDTAAYYCVREVGGRFDYWGQGVLVTVSS(SEQ ID NO:69)；
EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTAYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYHGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDYAVYYCARGGGDWSWFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQAEDLALYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIER(SEQ ID NO:80)；或
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQAEDLALYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIERGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTAYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYHGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDYAVYYCARGGGDWSWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:81)。
在进一步的实施方式中，scFv由核酸序列编码，核酸序列包含：
CAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGCCCTGGTCTGGTCCAACCTAGTCAATCTTTGTCCATTACCTGCACTGTGTCTGGTTTTTCTCTCACGTCTTATGGAATTCATTGGGTTAGACAAAGCCCTGGGAAAGGGTTGGAGTGGTTGGGTGTGATCTGGCGCGGAGGTGGTACTGACAGCAACGCAGCGTTTATGTCTCGGCTTTCCATAACCAAAGACAACAGCAAGTCTCAGGTGTTCTTCAAGATGAATTCCCTCCAGGCCGACGATACGGCGATCTATTATTGTGCTCGCTCCAGATACGACGAGGAAGAAAGCATGAACTATTGGGGACAGGGGACCTCAGTAACAGTGTCAAGCGGTGGTGGAGGGAGTGGAGGGGGTGGGTCTGGTGGTGGTGGTAGCCAGATCGTTCTTACGCAGAGTCCTGCTTCCCTTTCCGCTTCTGTGGGCGAAACAGTTACCATTACATGCCGCGCAAGCGGGAATATTCACTCTTACCTGGCGTGGTATCAACAAAAGCAAGGTAAATCCCCACAACTTCTGGTTTACAACGCCAAAACTCTGGCTGATGGTGTACCTTCACGCTTCAGCGGCAGTGGGAGCGGGACTCAGTACTCTCTGAAAATCAATAGCCTTCAACCAGAAGATTTTGGCTCCTATTATTGCCAACACTTTTGGAATACTCCTCCGACTTTCGGGGCTGGGACTAAGCTTGAATTGAAA(SEQ ID NO:43)；
CAAATCGTGCTCACTCAGAGCCCAGCCTCTTTGTCCGCTTCCGTGGGCGAAACTGTCACCATAACCTGCCGCGCCAGTGGTAATATACACAGCTACCTGGCATGGTATCAACAAAAGCAAGGTAAATCTCCACAACTTCTTGTATACAACGCCAAAACACTGGCCGATGGAGTTCCCTCTCGTTTCAGCGGCAGCGGAAGTGGGACTCAGTACTCCCTGAAAATCAATTCCTTGCAACCTGAAGATTTTGGTTCCTATTATTGCCAACACTTTTGGAATACCCCGCCAACATTCGGAGCTGGCACTAAGTTGGAGCTGAAAGGAGGAGGCGGATCAGGCGGGGGGGGTTCCGGTGGTGGTGGCTCTCAGGTCCAACTGCAGCAGTCCGGCCCTGGTCTGGTCCAACCTTCCCAAAGTCTGTCCATAACATGCACAGTGTCAGGGTTTTCATTGACGTCTTATGGAATACATTGGGTTAGGCAAAGTCCTGGAAAAGGCCTCGAATGGCTTGGGGTGATCTGGCGCGGAGGAGGCACAGACAGCAACGCGGCTTTTATGAGTCGTCTCTCAATTACTAAAGACAACTCTAAGTCACAGGTGTTCTTCAAGATGAATAGTCTCCAGGCGGACGATACAGCTATCTATTATTGTGCTCGCTCTCGCTACGACGAGGAAGAAAGCATGAACTATTGGGGACAGGGCACCTCTGTAACAGTGTCAAGC(SEQ ID NO:44)；
GATATACAGTTGACGCAGAGTCCATCTTCTCTCAGTGCTAGCGTTGGAGACCGGGTGACGATTACGTGTAGGGCGAGCCAGGGGATTAGTTCCAATATCGTGTGGCTCCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGGGCCTTATTTACCACGGGACTAATCTGGAATCAGGTGTACCAAGTCGATTCTCCGGGTCCGGTTCAGGCACAGACTATACCCTCACGATAAGTTCATTGGAGCCGGAGGATTTTGCCACATATTATTGCGTCCAGTATTCACAGTTCCCTCCGACATTTGGTCAGGGGACTAAGCTTGAAATTAAGGGCGGAGGTGGCTCCGGTGGTGGGGGCTCAGGCGGCGGGGGCTCTCAACTGGTTCAGTCAGGTGCTGAAGTTGTAAAACCAGGCGCTTCTGTTAAAGTATCCTGTAAAGCTAGCGGATATACATTTACCAGTTACTGGATGCACTGGGTAAAGCAGGCTCCAGGACAAGGACTGGAGTGGATCGGGGCTGTTAGCCCAGGAAACTCAGATACAAGCTACAACGAGAAGTTCAAAGGGAAGGCAACTCTGACTGTCGATAAGAGCGCGAGTACAGCTTATATGGAACTTTCCTCACTTCGGAGCGAAGACACAGCTGTATATTATTGTACCAGGTCTCGCTACGGTAATAATGCACTGGATTACTGGGGACAAGGAACCCTCGTTACGGTCAGTTCT(SEQ ID NO:45)；
CAACTGGTTCAGTCAGGTGCTGAAGTTGTAAAACCAGGCGCTTCTGTTAAAGTATCCTGTAAAGCTAGCGGATATACATTTACCAGTTACTGGATGCACTGGGTAAAGCAGGCTCCAGGACAAGGACTGGAGTGGATCGGGGCTGTTAGCCCAGGAAACTCAGATACAAGCTACAACGAGAAGTTCAAAGGGAAGGCAACTCTGACTGTCGATAAGAGCGCGAGTACAGCTTATATGGAACTTTCCTCACTTCGGAGCGAAGACACAGCTGTATATTATTGTACCAGGTCTCGCTACGGTAATAATGCACTGGATTACTGGGGACAAGGAACCCTCGTTACGGTCAGTTCTGGCGGAGGTGGCTCCGGTGGTGGGGGCTCAGGCGGCGGGGGCTCTGATATACAGTTGACGCAGAGTCCATCTTCTCTCAGTGCTAGCGTTGGAGACCGGGTGACGATTACGTGTAGGGCGAGCCAGGGGATTAGTTCCAATATCGTGTGGCTCCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGGGCCTTATTTACCACGGGACTAATCTGGAATCAGGTGTACCAAGTCGATTCTCCGGGTCCGGTTCAGGCACAGACTATACCCTCACGATAAGTTCATTGGAGCCGGAGGATTTTGCCACATATTATTGCGTCCAGTATTCACAGTTCCCTCCGACATTTGGTCAGGGGACTAAGCTTGAAATTAAG(SEQ ID NO:46)；
CAAGTGCACCTCAAAGAATCCGGGCCCGGGCTCGTACAACCGTCCCAAACACTCAGCCTGACATGTACAGTGTCAGGATTTTCCCTCACGTTTTATAACGTCCATTGGGTGCGCCAACCAACTGGCAAGGGCCTTGAATGGATGGCCATCATCTGGAACGGTGGCAAAACGGACTATAACAGCGGCCTTAAGAGCAGACTCTCCATATCCCGAGATACTAGCAAATCACAGGTGTTTCTCAAGATGAATTCTCTCCAGAGCGAGGATACTGCTGCCTATTATTGCGTGCGCGAAGTCGGCGGTCGGTTTGACTATTGGGGACAGGGCGTTCTCGTGACTGTGAGCAGTGGCGGGGGGGGCTCAGGAGGAGGTGGCTCTGGCGGGGGGGGGTCTGATTTTCAAATGACGCAAAGTCCTGCCAGCTTGTCCGCCTCATTGGGCGAGACAGTTACAATAGAGTGTCTCGCCAGTGAAGATATATATGACATCCTGGCCTGGTACCAGCAAAAGCCTGGAAAGTCACCCCAACTGCTTATTTACGACGCTTCCTCACTGCACACCGGTGTGCCCTCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCTCAGGTGCCCAATACAGTCTGAAAATTAACTCACTCCAACCAGAGGACTTCGCATCCTACTATTGCCAGAGCGGACTCAGCGCTCCATGGACCTTTGGCGGCGGGACGAAATTGGAGCTG(SEQ ID NO:70)；
GATTTTCAAATGACCCAAAGCCCTGCATCACTTAGCGCCAGTCTCGGCGAGACCGTGACTATAGAGTGTCTGGCCTCAGAAGATATCTATGACATCCTTGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGAGCCCCCAACTGCTCATATACGACGCATCCTCTCTGCACACGGGCGTTCCTTCCCGCTTTAGCGGGTCTGGTAGCGGGGCGCAATACTCCCTGAAAATTAACAGTCTTCAACCCGAGGACTTCGCGTCCTACTATTGCCAGAGCGGTCTTAGCGCTCCATGGACATTTGGTGGCGGAACGAAACTTGAGCTGGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGTGGTGGTTCAGGCGGCGGCGGGTCACAAGTTCACCTCAAAGAAAGTGGCCCAGGCCTCGTCCAACCAAGCCAAACACTCTCACTGACATGTACGGTGAGCGGATTTTCACTCACATTTTATAACGTTCATTGGGTGCGCCAACCCACGGGGAAGGGACTTGAATGGATGGCTATTATTTGGAACGGTGGTAAAACTGACTATAACAGTGGACTTAAGAGTAGGCTCAGTATTTCACGCGATACAAGTAAATCTCAGGTGTTTCTTAAGATGAATTCCTTGCAGTCCGAGGATACCGCTGCCTATTATTGCGTGCGAGAGGTCGGTGGCCGCTTCGACTATTGGGGTCAGGGAGTGCTCGTAACGGTGAGCAGC(SEQ ID NO:71)；
GAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGAACTGGAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTACCGCGTATAACATGAACTGGGTGAAACAGAACAACGGCAAAAGCCTGGAATGGATTGGCAACATTGATCCGTATCATGGCGGCACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAAAAGCCTGACCAGCGAAGATTATGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCGGCGGCGATTGGAGCTGGTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATGACCCAGAGCCATAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGCGATCGCGTGAGCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAAGTGCTGATTTATTGGGCGAGCAACCGCCATACCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCATGCAGGCGGAAGATCTGGCGCTGTATTATTGCCATCAGCATTATAGCACCCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTGAACGC(SEQ ID NO:82)；或
GATATTGTGATGACCCAGAGCCATAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGCGATCGCGTGAGCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAAGTGCTGATTTATTGGGCGAGCAACCGCCATACCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCATGCAGGCGGAAGATCTGGCGCTGTATTATTGCCATCAGCATTATAGCACCCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTGAACGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGAACTGGAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTACCGCGTATAACATGAACTGGGTGAAACAGAACAACGGCAAAAGCCTGGAATGGATTGGCAACATTGATCCGTATCATGGCGGCACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAAAAGCCTGACCAGCGAAGATTATGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCGGCGGCGATTGGAGCTGGTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCG(SEQ ID NO:83)。
抗原结合结构域的可容许变异对本领域技术人员来说将是已知的，同时维持与富集的定型BCR的特异性结合。例如，在一些实施方式中，抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:25-30、31-32、35-36、39-42、64、66、68、69、80和81中列出的任一个氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方式中，抗原结合结构域由与SEQ ID NO:33-34、37-38、43-46、65、67、70、71、82和83中列出的任一个核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列编码。
抗原结合结构域可以可操作地连接到CAR的另一个结构域，如跨膜结构域或胞内结构域，两者在本文别处都有描述。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的核酸与编码跨膜结构域的核酸和编码胞内结构域的核酸可操作地连接。
本文所述的抗原结合结构域，如特异性结合富集的定型BCR的抗体或其片段，可与本文所述的任何跨膜结构域、本文所述的任何胞内结构域或胞质结构域，或本文所述的可被包含在CAR中的任何其它结构域组合。
例如，在一些实施方式中，CAR包含下列序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWNTPPTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGGTDSNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSRYDEEESMNYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:47)；
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGGTDSNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSRYDEEESMNYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWNTPPTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:48)；
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNEKFKGKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:49)；
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGAVSPGNSDTSYNEKFKGKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSRYGNNALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSNIVWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFATYYCVQYSQFPPTFGQGTKLEIKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:50)；
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVHLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTFYNVHWVRQPTGKGLEWMAIIWNGGKTDYNSGLKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQSEDTAAYYCVREVGGRFDYWGQGVLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDFQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYDILAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLHTGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQPEDFASYYCQSGLSAPWTFGGGTKLELSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:72)；
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDFQMTQSPASLSASLGETVTIECLASEDIYDILAWYQQKPGKSPQLLIYDASSLHTGVPSRFSGSGSGAQYSLKINSLQPEDFASYYCQSGLSAPWTFGGGTKLELGGGGSGGGGSGGGGSQVHLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTFYNVHWVRQPTGKGLEWMAIIWNGGKTDYNSGLKSRLSISRDTSKSQVFLKMNSLQSEDTAAYYCVREVGGRFDYWGQGVLVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:73)；
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTAYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYHGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDYAVYYCARGGGDWSWFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQAEDLALYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIERSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:74)；或
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSMQAEDLALYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIERGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTAYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYHGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDYAVYYCARGGGDWSWFAYWGQGTLVTVSASGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:75)。
在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO:47-50和72-75中列出的任一个氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方式中，CAR由核酸序列编码，核酸序列包含：
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGAACTGGAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTACCGCGTATAACATGAACTGGGTGAAACAGAACAACGGCAAAAGCCTGGAATGGATTGGCAACATTGATCCGTATCATGGCGGCACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAAAAGCCTGACCAGCGAAGATTATGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCGGCGGCGATTGGAGCTGGTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATGACCCAGAGCCATAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGCGATCGCGTGAGCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAAGTGCTGATTTATTGGGCGAGCAACCGCCATACCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCATGCAGGCGGAAGATCTGGCGCTGTATTATTGCCATCAGCATTATAGCACCCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTGAACGCAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:84)；
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAGCTATGGCATTCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGCGCGGCGGCGGCACCGATAGCAACGCGGCGTTTATGAGCCGCCTGAGCATTACCAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAGGCGGATGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCAGCCGCTATGATGAAGAAGAAAGCATGAACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGAAACCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGGCAACATTCATAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACAGGGCAAAAGCCCGCAGCTGCTGGTGTATAACGCGAAAACCCTGGCGGATGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCCAGTATAGCCTGAAAATTAACAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGGCAGCTATTATTGCCAGCATTTTTGGAACACCCCGCCGACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAAAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:85)；
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGGGCATTAGCAGCAACATTGTGTGGCTGCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAAGGCCTGATTTATCATGGCACCAACCTGGAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCGTGCAGTATAGCCAGTTTCCGCCGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCAGCTATTGGATGCATTGGGTGAAACAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCGCGGTGAGCCCGGGCAACAGCGATACCAGCTATAACGAAAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCGCGAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCACCCGCAGCCGCTATGGCAACAACGCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:86)；
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCAGCTATTGGATGCATTGGGTGAAACAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCGCGGTGAGCCCGGGCAACAGCGATACCAGCTATAACGAAAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCGCGAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCACCCGCAGCCGCTATGGCAACAACGCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGGGCATTAGCAGCAACATTGTGTGGCTGCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAAGGCCTGATTTATCATGGCACCAACCTGGAAAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCGTGCAGTATAGCCAGTTTCCGCCGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:87)；
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCCAGGTGCATCTGAAAGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCTTTTATAACGTGCATTGGGTGCGCCAGCCGACCGGCAAAGGCCTGGAATGGATGGCGATTATTTGGAACGGCGGCAAAACCGATTATAACAGCGGCCTGAAAAGCCGCCTGAGCATTAGCCGCGATACCAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGAAGATACCGCGGCGTATTATTGCGTGCGCGAAGTGGGCGGCCGCTTTGATTATTGGGGCCAGGGCGTGCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATTTTCAGATGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGAGCGCGAGCCTGGGCGAAACCGTGACCATTGAATGCCTGGCGAGCGAAGATATTTATGATATTCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAAGCCCGCAGCTGCTGATTTATGATGCGAGCAGCCTGCATACCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGCAGTATAGCCTGAAAATTAACAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGAGCTATTATTGCCAGAGCGGCCTGAGCGCGCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAACTGAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:88)；
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCGATTTTCAGATGACCCAGAGCCCGGCGAGCCTGAGCGCGAGCCTGGGCGAAACCGTGACCATTGAATGCCTGGCGAGCGAAGATATTTATGATATTCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAAGCCCGCAGCTGCTGATTTATGATGCGAGCAGCCTGCATACCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGCAGTATAGCCTGAAAATTAACAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGAGCTATTATTGCCAGAGCGGCCTGAGCGCGCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAACTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCATCTGAAAGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCTTTTATAACGTGCATTGGGTGCGCCAGCCGACCGGCAAAGGCCTGGAATGGATGGCGATTATTTGGAACGGCGGCAAAACCGATTATAACAGCGGCCTGAAAAGCCGCCTGAGCATTAGCCGCGATACCAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGAAGATACCGCGGCGTATTATTGCGTGCGCGAAGTGGGCGGCCGCTTTGATTATTGGGGCCAGGGCGTGCTGGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGA
GCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGC
CTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGC
TGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTA
TATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTG
CAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTA
GCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAAC
TGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATC
CGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAA
CTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACG
CCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:89)；
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGAACTGGAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTACCGCGTATAACATGAACTGGGTGAAACAGAACAACGGCAAAAGCCTGGAATGGATTGGCAACATTGATCCGTATCATGGCGGCACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAAAAGCCTGACCAGCGAAGATTATGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCGGCGGCGATTGGAGCTGGTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATGACCCAGAGCCATAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGCGATCGCGTGAGCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAAGTGCTGATTTATTGGGCGAGCAACCGCCATACCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCATGCAGGCGGAAGATCTGGCGCTGTATTATTGCCATCAGCATTATAGCACCCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTGAACGCAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:90)；或
ATGGCGCTGCCGGTGACCGCGCTGCTGCTGCCGCTGGCGCTGCTGCTGCATGCGGCGCGCCCGGGCAGCGATATTGTGATGACCCAGAGCCATAAATTTATGAGCACCAGCGTGGGCGATCGCGTGAGCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGT GGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGAAAGTGCTGATTTATTGGGCGAGCAACCGCCATACCGGCGTGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATACCCTGACCATTAGCAGCATGCAGGCGGAAGATCTGGCGCTGTATTATTGCCATCAGCATTATAGCACCCCGTGGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTGAACGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGAACTGGAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAATTAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTACCGCGTATAACATGAACTGGGTGAAACAGAACAACGGCAAAAGCCTGGAATGGATTGGCAACATTGATCCGTATCATGGCGGCACCAACTATAACCAGAAATTTAAAGGCAAAGCGACCCTGACCGTGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAGCTGAAAAGCCTGACCAGCGAAGATTATGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGCGGCGGCGATTGGAGCTGGTTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGAGCGGCACCACCACCCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGCGTGCGATATTTATATTTGGGCGCCGCTGGCGGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATTACCCTGTATTGCAAACGCGGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATAAACAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC(SEQ ID NO:91)。
在一些实施方式中，CAR由包含与SEQ ID NO:84-91中列出的任一个序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸的核酸序列编码。
跨膜结构域
在一些实施方式中，CAR包含与胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，CAR包含天然地与CAR的其中一个结构域缔合(associated)的跨膜结构域。在一些实施方式中，选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域以避免与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可源自天然来源或合成来源。当来源为天然时，结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。一方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽连接体可形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸(GS)双联体提供特别合适的连接体。
在其它实施方式中，在CAR的胞外结构域与跨膜结构域之间，或在CAR的胞质结构域与跨膜结构域之间可并入间隔区结构域。如本文所用，术语“间隔区结构域”通常是指功能是将跨膜结构域连接到多肽链中的胞外结构域或胞质结构域的任意寡肽或多肽。间隔区结构域可包含上至300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。
在一些实施方式中，在跨膜结构域之前可使用间隔区结构域，其包括CD8或人Ig(免疫球蛋白)铰链，或甘氨酸-丝氨酸连接体。在一个实施方式中，在跨膜结构域N-末端的铰链(例如，CD8α铰链)被包含在CAR中位于CAR的胞外结构域与跨膜结构域之间，例如位于CAR的抗原结合结构域与跨膜结构域之间。
铰链和/或跨膜结构域的实例包括但不限于下列的铰链和/或跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIR、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。
在一个实施方式中，CAR包含跨膜结构域，诸如但不限于包含下列序列的CD8α跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:51)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD8跨膜结构域由包含下列的序列编码：
ATCTACATCTGGGCACCCTTGGCTGGAACATGCGGGGTCCTGCTGCTGAGCTTGGTGATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:52)，
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:53)，或与SEQ ID NO:60或61具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，CAR包含CD8α铰链，CD8α铰链包含下列序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:54)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD8α铰链区由包含下列的序列编码：
ACCACGACGCCAGCACCGCGACCACCAACACCTGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCAGACCAGCAGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(SEQ IDNO:55)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。
胞质结构域
本发明CAR的胞质结构域或者就是胞内信号传导结构域负责活化CAR已被置于其中的免疫细胞的其中至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能的部分。虽然通常可使用整个胞内信号传导结构域，但在很多情况下不需要使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于替代完整链，只要其转导效应物功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意为包含胞内信号传导结构域的足以转导效应物功能信号的任何截短部分。
用于本发明CAR的胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列，其协同起作用以在抗原受体结合后启动信号转导，以及这些序列的任意衍生物或变体和具有相同功能能力的任意合成序列。
已知仅通过TCR生成的信号不足以完全活化T细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为是由两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的胞质信号传导序列(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用来提供次级或共刺激信号的胞质信号传导序列(次级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可包含信号传导基序，被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。
在本发明中特别有用的包含初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括源自下列的ITAM：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施方式中，本发明CAR中的胞质信号传导分子包括源自CD3ζ(CD3 zeta)的胞质信号传导序列。
在一个实施方式中，源自CD3ζ的胞质信号传导序列包括下列氨基酸序列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:56)，或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，编码CD3ζ信号传导结构域的核酸序列包括下列序列：
AGAGTAAAGTTCAGTAGGTCCGCCGATGCCCCAGCCTATCAACAGGGGCAAAATCAACTCTACAACGAACTTAATCTGGGACGCCGAGAGGAGTACGATGTCTTGGATAAGAGACGCGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGAAAGCCAAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGTCTGTACAATGAACTTCAGAAAGATAAGATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAAGGAGAGAGGCGCCGCGGCAAAGGGCATGATGGACTGTATCAGGGTCTCAGTACTGCTACTAAGGACACATATGATGCCCTCCACATGCAGGCCCTGCCACCAAGGTGA(SEQ ID NO:57)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列；或
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:58)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。
在另一个实施方式中，CAR的胞质结构域包括CD3ζ信号传导结构域本身或与任意其它可用于本发明CAR环境的所需胞质结构域(一个或多个)组合。例如，CAR的胞质结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号区是指CAR的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所需要的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件来示例，但其它共刺激元件也在本发明的范围内。
在一个实施方式中，4-1BB的胞内信号传导结构域包含下列氨基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:59)，或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，编码4-1BB的胞内信号传导结构域的核酸序列包括下列序列：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:60)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。
本发明CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的连接体。
在一个实施方式中，胞质结构域包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的胞内信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞质结构域包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。
在一个实施方式中，CD28的信号传导结构域包含下列氨基酸序列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:61)，或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，编码CD28信号传导结构域的核酸序列包括下列序列：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:62)或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。
在又一个实施方式中，胞质结构域包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB和CD28的胞内信号传导结构域。
在一个实施方式中，本发明CAR中的胞质结构域包括4-1BB的胞内信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列，并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列。
其它结构域
在一些实施方式中，CAR包含信号肽(例如，CD8信号肽)。在一些实施方式中，信号肽负责受体向T细胞表面的易位。
在一些实施方式中，信号肽是CD8信号肽，CD8信号肽包含MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列或与其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
核酸/载体
在其它方面中，本发明提供重组核酸分子，其包含编码本发明CAR的序列，本发明CAR具有特异性结合富集的定型BCR的抗原结合结构域。
可使用本领域已知的重组方法获得编码所需分子的核酸序列，诸如使用标准技术，通过筛选表达该基因的细胞的文库、通过从已知包含该基因的载体中衍生基因、通过对照致病靶标(例如，ADAMTS13)进行筛选或通过从含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可合成产生，而不是克隆得到。
本发明在一些实施方式中还提供其中插入本发明的DNA的载体。源自反转录病毒如慢病毒的载体是适于实现长期基因转移的工具，因为其允许转基因的长期、稳定整合和在子细胞中的传播。慢病毒载体相对于源自致癌反转录病毒(onco-retroviruse)的载体如鼠白血病病毒具有附加优点，因为其可转导非增殖性细胞，如肝细胞。其还具有低免疫原性的附加优点。在其它实施方式中，使用例如转座子系统(例如，PiggyBacTM)、脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒或mRNA将CAR引入细胞(例如，T细胞)中。在其它实施方式中，本发明的CAR在体内引入细胞(例如，T细胞)中。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽的核酸或其部分可操作地连接至启动子，以及将该构建体并入表达载体。载体能够适于在真核细胞中复制和整合。一般的载体含有用于调控所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可使用标准的基因递送方案用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其通过引用以其整体并入本文。在另一个实施方式中，本发明提供基因疗法载体。
核酸可被克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可被克隆到下列载体中：包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体还可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且被描述于例如Sambrook et al.,(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。总体上，合适的载体含有在至少一种生物体中有作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了多种用于将基因转移到哺乳动物细胞中的基于病毒的系统。例如，反转录病毒为基因传递系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将所选基因插入载体中并包装在反转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并在体内或离体递送至对象的细胞。本领域已知多种反转录病毒系统。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。本领域已知多种腺病毒载体。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如增强子，调控转录启动的频率。一般地，这些位于起始位点上游30-110bp区域，尽管近期已经显示多种启动子在起始位点下游也包含功能性元件。启动子元件之间的间距常常是灵活的，使得在元件颠倒或相对于彼此移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距可在活性开始下降前增加到50bp。取决于启动子，看似个体元件能够协同地或独立地发挥作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即时早期细胞巨化病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸因子-1α(EF-1α)然而，也可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子——诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明还不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供能够打开其所可操作地连接的多核苷酸序列的表达(在期望这样的表达时)或者关闭该表达(在不期望表达时)的分子开关。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫因启动子、糖皮质素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进表达细胞从拟通过病毒载体转染或感染的细胞群的鉴定和选择。在其它方面中，选择标记可被携载在DNA的单独一段上并用于共转染程序中。选择标记和报告基因均可侧接适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能性。总体上，报告基因是这样的基因：不存在于受体生物体或组织中或不被受体生物体或组织表达，并且编码多肽，该多肽的表达通过一定的可容易检测的性质(例如，酶活性)表现。报告基因的表达在DNA已被引入受体细胞后一段适当的时间被评估。适合的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei et al.,2000FEBS Letters 479:79-82)。适合的表达系统是公知的，并且可利用已知技术制备或商业获得。总体上，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被确定为启动子。这样的启动子区域可与报告基因连接并用于评价用剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入和表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达载体的环境下，载体可以很容易地通过本领域的任意方法引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。用于将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体，特别是反转录病毒载体，已经成为用于将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、I型单纯疱疹病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。在其它实施方式中，使用例如转座子系统(例如，PiggyBacTM)、脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒或mRNA将CAR引入细胞(例如，T细胞)中。在又其它实施方式中，本发明的CAR在体内被引入细胞(例如，T细胞)中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和脂质基系统——包括水包油乳液、微团(micelle)、混合微团和脂质体。用作体外和体内递送媒介的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介是脂质体。脂质制剂的使用被考虑用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，可将核酸与脂质关联。与脂质关联的核酸可被包封在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸均关联的连接分子附接至脂质体，截留在脂质体中，与脂质体复合，分散在含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含或复合于微团，或以其它方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，其可以双层结构存在，如微团般，或具有“塌陷”结构。其也可简单地被散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可天然存在的脂肪物质或是合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及包含长链脂族烃和其衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可被储存在约-20℃下。氯仿被用作唯一的溶剂是因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是上位概念，其涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层次的和多层次的脂质媒介。脂质体可表征为具有囊泡结构——具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层次脂质体具有被水性介质分隔的多个脂质层。其在磷脂悬浮在过量水溶液中时自发地形成。脂质组分在封闭结构形成前经历自我重排并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，具有不同于普通囊泡结构的溶液结构的组合物也涵盖在内。例如，脂质可呈现微团结构或仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑脂转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
无论什么方法用于将外源核酸引入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可进行多种测定。这种测定包括，例如，本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测具体肽存在或不存在——例如，通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文描述的用于鉴定落入本发明范围的用剂的测定。
T细胞来源
在扩大和遗传修饰本发明的T细胞之前，从对象获得T细胞来源。T细胞可获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、胎盘组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤和通过从诱导多能干细胞(iPSC)或其它干细胞来源分化T细胞。在本发明的某些实施方式中，可使用本领域可获得的任意数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，T细胞可利用技术人员已知的任意数量的技术(如FicollTM分离)从采自对象的血液单位获得。在一个优选实施方式中，来自个体循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，通过单采血液成分术采集的细胞可被洗涤以去除血浆部分和使细胞处于适当的缓冲剂或介质中以用于后续处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可选实施方式中，洗涤溶液缺少钙以及可缺少镁或者可缺少多种(即便不是全部)二价阳离子。同样，令人惊讶的是，在没有钙的情况下，初始活化步骤会导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法来实现，诸如根据制造商的说明书，通过使用半自动“无逆流(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤后，细胞可被重悬于多种生物相容性缓冲剂如，例如，无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含缓冲剂或不含缓冲剂的盐水溶液中。可选地，可去除单采血液成分术样品的不期望组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一个实施方式中，通过裂解红细胞和耗竭单核细胞——例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗(counterflow centrifugal elutriation)——从外周血淋巴细胞分离T细胞。可通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞的亚群。例如，在一个实施方式中，通过与抗CD3/抗CD28(即3x28)缀合珠粒如M-450CD3/CD28 T温育足以阳性选择所需T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施方式中，时间段是约30分钟。在进一步的实施方式中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长，以及其间所有的整数值。在进一步的实施方式中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个优选实施方式中，时间段是10至24小时，并且可进行上至14天。在一个优选实施方式中，温育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的温育时间(如24小时)可提高细胞产率。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任意情况下，如从肿瘤组织或免疫缺陷个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)时，可使用更长的温育时间来分离T细胞。此外，使用更长的温育时间可提高CD8+T细胞的捕获效率。因此，仅通过缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或降低珠粒与T细胞的比例(如本文进一步描述的)，便可在培养开始时或在该过程中的其它时间点优先选择T细胞亚群或针对T细胞亚群进行选择。此外，通过增加或降低珠粒或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可在培养开始时或在其它期望的时间点优先选择T细胞亚群或针对T细胞亚群进行选择。本领域技术人员将认识到，在本发明环境下还可采用多轮选择。在某些实施方式中，在活化和扩大过程中可能需要执行选择程序和利用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经历进一轮选择。
通过阴性选择富集T细胞群，可利用针对阴性选择细胞所特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术——其利用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物——进行的细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物一般包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可能需要富集或阳性选择一般表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。可选地，在某些实施方式中，通过抗CD25缀合珠粒或其它类似的选择方法耗竭T调节细胞。
为了通过阳性或阴性选择来分离所需的细胞群，细胞和表面(例如，颗粒，如珠粒)的浓度可变。在某些实施方式中，可能期望显著减少珠粒和细胞混合在一起所处的体积(即增加细胞浓度)以确保细胞和珠粒最大限度接触。例如，在一个实施方式中，采用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，采用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，采用大于1亿个细胞/ml。在进一步实施方式中，采用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方式中，采用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可采用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。采用高浓度的细胞可导致提高的细胞产率、细胞活化和细胞扩大。此外，使用高细胞浓度还允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)或来自存在多个肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这种细胞群可具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关实施方式中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过大幅稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠粒)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被降至最少。这就选择出待与颗粒结合的表达大量所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个实施方式中，所用细胞浓度是5X 106/ml。在其它实施方式中，所用浓度可以是约1X 105/ml至1X 106/ml，以及其间的任意整数值。
在其它实施方式中，细胞可在2-10℃或室温下于旋转器上以不同的速度温育不同的时间长度。
也可在洗涤步骤后冷冻供刺激的T细胞。不希望被理论所束缚，冷冻和后续解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞以及在一定程度上的单核细胞，提供更为均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，可将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管多种冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在此环境下将是有用的，但是一种方法涉及使用含20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或者含10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO，或31.25％ Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或者其它含例如Hespan和PlasmaLyte A的合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1摄氏度的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可使用其它控制冷冻的方法，以及在-20℃或液氮中立即进行非受控冷冻。
在某些实施方式中，冷冻保存的细胞如本文所述进行解冻和洗涤，并在使用本发明的方法活化之前在室温下静置1小时。
在本发明环境中还考虑了，在可能需要如本文所述的经扩大细胞时之前的时间段从对象采集血液样品或单采血液成分术产品。这样，待扩大的细胞来源可在任意必要的时间点采集，并且分离和冷冻所需的细胞(如T细胞)以供后期在T细胞疗法中针对将受益于T细胞疗法的任意数量的疾病或状况(如本文所述的疾病或状况)使用。在一个实施方式中，血液样品或单采血液成分术取自总体上健康的对象。在某些实施方式中，血液样品或单采血液成分术取自处于发展疾病风险但尚未发展疾病的总体上健康的对象，并将感兴趣的细胞分离和冷冻以供后期使用。在某些实施方式中，T细胞可被扩大、冷冻并在后期使用。在某些实施方式中，在如本文所述的特定疾病诊断后不久但在任何治疗之前，从患者采集样品。在进一步的实施方式中，在任意数量的相关治疗模式之前，从对象的血液样品或单采血液成分术中分离细胞，相关治疗模式包括但不限于采用下列用剂的治疗：如那他珠单抗(natalizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablative agents)如抗CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉宾(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶即钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，针对患者所分离并经冷冻以供后期结合(例如，在前、同时或在后)骨髓或干细胞移植、T细胞清除疗法——利用化学治疗剂如氟达拉滨、外照射放射治疗(external-beam radiation therapy,XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH——使用。在另一个实施方式中，细胞在B细胞清除疗法(如与CD20反应的用剂，例如，利妥昔单抗(Rituxan))之前被分离以及可被冷冻以供后期在B细胞清除疗法之后治疗使用。
在本发明进一步的实施方式中，紧接疗治后，便从患者获得T细胞。在这方面，观察到在某些癌症治疗之后，具体是用损伤免疫系统的药物治疗之后，在患者将正常地从治疗中恢复期间的治疗之后不久，所获得的T细胞的质量对于其离体扩大的能力可以是最佳的或提高的。同样，使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可处于移植和体内扩大得到增强的优选状态。因此，在本发明的环境下考虑到，在此恢复期过程中采集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在某些实施方式中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调节方案可用于在对象中创建这样的条件：其中，特别是在疗法之后的限定的时间窗口期间有利于特定细胞类型的群体恢复(repopulation)、再循环、再生和/或扩大。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩大
不管是在对T细胞进行遗传修饰以表达所需CAR之前还是之后，都可总体上使用例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法使T细胞活化并扩大。
总体上，本发明的T细胞可通过接触附着了刺激CD3/TCR复合物相关信号的用剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面来扩大。具体地，T细胞群可通过接触抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体，或者通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑制素)接触来刺激。为了对T细胞表面上的辅助分子进行共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适合刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,法国)，其可如本领域常见的其它方法使用(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland et al.,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施方式中，对T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供各信号的用剂可在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，用剂可与同一表面偶联(即呈“顺式”形式)或与单独的表面偶联(即呈“反式”形式)。可选地，一种用剂可与表面偶联，而另一种用剂在溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的用剂与细胞表面结合，而提供初级活化信号的用剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施方式中，两种用剂都可在溶液中。在另一个实施方式中，用剂可以是可溶形式，然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或抗体或将与用剂结合的其它结合用剂。在这点上，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810中考虑到用于活化和扩大本发明中的T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
在一个实施方式中，将两种用剂固定在珠粒上，固定在相同的珠粒上，即“顺式”，或固定至单独的珠粒，即“反式”。举例而言，提供初级活化信号的用剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的用剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种用剂均以当量分子量共同固定至相同的珠粒。在一个实施方式中，使用与珠粒结合用于CD4+T细胞扩大和T细胞生长的各抗体的1:1比例。在本发明的某些方面中，使用与珠粒结合的抗CD3:CD28抗体的比例使得与使用1:1的比例观察到的扩大相比，观察到T细胞扩大有所增加。在一个具体的实施方式中，与使用1:1的比例观察到的扩大相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方式中，与珠粒结合的CD3:CD28抗体的比例范围为100:1至1:100，以及其间的所有值。在本发明的一个方面中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方式中，与珠粒结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用与珠粒结合的1:100CD3:CD28的抗体比例。在另一个实施方式中，使用与珠粒结合的1:75CD3:CD28的抗体比例。在进一步的实施方式中，使用与珠粒结合的1:50CD3:CD28的抗体比例。在另一个实施方式中，使用与珠粒结合的1:30CD3:CD28的抗体比例。在一个优选的实施方式中，使用与珠粒结合的1:10CD3:CD28的抗体比例。在另一个实施方式中，使用与珠粒结合的1:3CD3:CD28的抗体比例。在又一个实施方式中，使用与珠粒结合的3:1CD3:CD28的抗体比例。
颗粒与细胞比为1:500至500:1以及其间的任意值均可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员容易理解的，颗粒与细胞比可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠粒只能结合少数细胞，而较大的珠粒可结合多个细胞。在某些实施方式中，细胞与颗粒比范围为1:100至100:1以及其间的任意整数值，而在进一步的实施方式中，该比例包括1:9至9:1以及其间的任意整数值，也可用于刺激T细胞。如上所述，引起T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比例可以变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选比例为至少1:1颗粒/T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞比。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞比可根据刺激日来变化。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞比在第一天为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中添加另外的颗粒达上至10天，最终比为1:1至1:10(基于添加当日的细胞计数)。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞比在刺激的第一天为1:1，并在刺激的第三天和第五天调整至1:5。在另一个实施方式中，在每日或每隔一天的基础上添加颗粒，达到刺激的第一天为1:1，刺激的第三天和第五天1:5的最终比例。在另一个实施方式中，颗粒与细胞比在刺激的第一天为2:1，并在刺激的第三天和第五天调节至1:10。在另一个实施方式中，在每日或每隔一天的基础上添加颗粒，达到刺激的第一天为1:1，刺激的第三天和第五天1:10的最终比例。本领域技术人员将理解，多种其它比例也适用于本发明。具体地，比例将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。
在本发明进一步的实施方式中，将细胞(如T细胞)与用剂包被的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在可选实施方式中，在培养之前，不分离用剂包被的珠粒和细胞，而是一起培养。在进一步的实施方式中，先通过施加力(如磁力)浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例而言，可通过使附着抗CD3和抗CD28的顺磁(paramagnetic)珠粒(3x28个珠粒)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠粒(例如，比例为1:1的M-450CD3/CD28 T顺磁珠粒)组合于缓冲液，优选PBS(不含二价阳离子如钙和镁)中。同样，本领域普通技术人员可很容易地理解可使用任意细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少，且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可能包含感兴趣的靶细胞。因此，任意细胞数量都在本发明的环境内。在某些实施方式中，可能期望显著减少颗粒和细胞混合在一起所处的体积(即增加细胞浓度)以确保细胞和珠粒最大限度接触。例如，在一个实施方式中，采用20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，采用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方式中，采用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方式中，采用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可采用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。采用高浓度的细胞可导致提高的细胞产率、细胞活化和细胞扩大。此外，使用高细胞浓度还允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。这种细胞群在某些实施方式中可具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方式中，混合物可培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任意小时整数值。在另一个实施方式中，混合物可培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠粒和T细胞一起培养约8天。在另一个实施方式中，珠粒和T细胞一起培养2-3天。也可能需要数个周期的刺激使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合T细胞培养的条件包括适合的培养基(例如，极限必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α，或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任意其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制剂(plasmanate)和还原剂如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，同时添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩大的量的细胞因子(一种或多种)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)只包含在实验培养物中，而不包含在待输注到对象体内的细胞培养物中。靶细胞供养在支持生长所需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％ CO2)。
非活化T细胞或暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术外周血单核细胞产物的辅助T细胞群(TH，CD4+)大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体进行的T细胞体外扩大产生T细胞群——在约8-9天之前，其主要由TH细胞构成，而在约8-9天之后，该T细胞群包含渐增更多的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向对象输注以TH细胞为主的T细胞群可以是有利的。类似地，如果分离出了TC细胞的抗原特异性亚组，则将此亚组扩大至更大程度可以是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记外，其它表型标记在细胞扩大过程中也会显著地改变，但很大程度上，可再现地改变。因此，这种可再现性实现了为特定目的定制活化的T细胞产品的能力。
治疗应用
在其它方面中，本发明包括用慢病毒载体(LV)或其它合适的载体转导的细胞(例如，T细胞)。例如，一些实施方式，LV编码本发明的CAR，本发明的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中抗原结合结构域特异性结合富集的定型BCR。因此，在其它实施方式中，转导的T细胞可引发针对例如淋巴瘤、白血病或自身免疫性疾病中具体的恶性和/或致病性B细胞克隆的CAR介导的T细胞应答。
本发明提供CAR将免疫细胞(例如，原代T细胞)的特异性重新定向于富集的定型BCR上存在的抗原的用途。因此，本发明还提供在哺乳动物中刺激对靶B细胞群的T细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物施用表达本发明CAR的T细胞的步骤。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中免疫细胞(例如，T细胞)经遗传修饰以表达CAR(例如，抗VL3-21、VH3-23和VH1-69 VH4-34的CAR)，并且CAR免疫细胞(例如，CAR T细胞)被输注给有需要的受体。输注的细胞能够靶向受体中富集的定型B细胞，例如从而靶向例如淋巴瘤、白血病或自身免疫性疾病中的恶性或致病性B细胞克隆，同时保留正常的B细胞。在一些实施方式中，与抗体疗法不同，CAR免疫细胞(例如，CAR T细胞)能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可导致持续的肿瘤控制。
在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳健的体内T细胞扩大，并且可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞进化为特异性记忆T细胞，其可被再活化以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。不希望受任意特定理论的束缚，CAR T细胞可在体内遇到表达替代(surrogate)抗原的靶细胞并随后将其消除后分化进入中枢记忆样状态。
可治疗或预防的癌症包括血液学癌症如血液或骨髓癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，其包括但不限于急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级(indolent and high grade)形式)、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。在一些实施方式中，癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或脾边缘区淋巴瘤(SMZL)。
在其它实施方式中，本发明的CAR细胞(例如，CAR T细胞)单独使用或与其它治疗组合使用，以减少或消除致病性B细胞(例如，CLL患者的癌性B细胞)的抗原逃逸。因此，在一个实施方式中，本发明提供用于减少或消除有需要的对象中B细胞癌症的抗原逃逸的方法，该方法包括向对象施用有效量的本文公开的遗传修饰细胞。在一些实施方式中，B细胞癌症是CD19阴性癌症。在其它实施方式中，B细胞癌症是CD19阴性癌症。
几种具体的BCR(例如，VH 4-34、1-69等)也富集于自身免疫性疾病中：例如，系统性红斑狼疮、克罗恩病、白塞病、嗜酸性肉芽肿性多血管炎和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。参见，例如，Bashford-Rogers,R.J.M.et al.,Nature,574(7776):122-126129(2019)和Ostertag,E.M.et al.,Transfusion 56:1763-1774(2016)，其每一篇均通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，可针对患有B细胞介导的自身免疫性疾病的患者开发CAR T细胞。在其它实施方式中，此方法与自身免疫性疾病(例如，CAART)的其它方法相比，优势在于本方法使用包含抗原结合结构域(例如，scFv)的CAR，而非Ab靶蛋白。
在一些实施方式中，可治疗或预防的自身免疫性疾病包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病(CD)、白塞病(BD)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、ANCA相关性血管炎(AAV)、IgA血管炎(IgAV)和IgA血管炎(IgAV)。
本发明的CAR修饰T细胞可单独施用，也可与稀释剂和/或其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合作为药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可包含如本文所述的靶细胞群组合一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可包含：缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素决定，但适当的剂量可通过临床试验确定。
当指示“抗癌有效量”、“癌症抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师在考虑患者(对象)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异的情况下确定。总体上认为，包含本文所述T细胞的药物组合物可以104至109个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用这些细胞(参见，例如，Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。医学领域技术人员通过监测特定患者的疾病体征并相应地调整治疗能够容易地确定该患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些实施方式中，可期望将活化的T细胞施用于对象，随后再次抽血(或执行单采血液成分术)，根据本发明从其中活化T细胞，并用这些活化和扩大的T细胞对患者再次输注。此过程可每隔几周进行多次。在某些实施方式中，可从10cc至400cc的抽血中活化T细胞。在某些实施方式中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液样品中活化T细胞。不受理论约束，使用此多次抽血/多次再次输注方案可用于筛选出某些T细胞群。
本主题组合物的施用可以任意便利的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。本文所述的组合物可通过皮下、皮内、瘤内、节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。
在本发明的某些实施方式中，将使用本文所述的方法或本领域已知的其它方法活化和扩大的细胞——其中T细胞被扩大至治疗水平——与任意数量的相关治疗模式(例如，在前、同时或在后)组合施用于患者。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与血浆置换、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂如抗CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素(cytoxin)、氟达拉宾、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶即钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物组合(例如，在前、同时或在后)下列施用于患者：骨髓移植、T细胞清除疗法——利用化学治疗剂如氟达拉滨、外照射放射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B细胞清除疗法如与CD20反应的用剂(例如，利妥昔单抗)后施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历用高剂量化学疗法，之后外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方式中，在移植之后，对象接受本发明经扩大免疫细胞的输注。在另外的实施方式中，经扩大细胞可在手术之前或之后施用。
待施用于患者的上述治疗的剂量将随所治疗状况和治疗受体的确切属性而相异。对人施用剂量的缩放比例(scaling)可根据本领域接受的实践进行。
本文提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和电子可用信息的内容特此通过引用以其整体并入，其程度与各单独出版物具体和单独指示通过引入并入的程度相同。申请人保留将任意此类文章、专利、专利申请或其它实体和电子文件的任意和所有材料及信息实体并入本申请的权利。
尽管已经参照其具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变和等同物替换。对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本文所公开的实施方式的范围的情况下，可使用合适的等同物对本文描述的方法进行其它合适的修改和改编。另外，可以做出多种修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实例将会对其更清楚地了解，这些实例仅出于说明的目的被包括在内而不旨在限制。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是出于说明的目的，而不意图进行限制，除非另有说明。因此，本发明绝不应被解释为受限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而显而易见的任何和所有变型。
无进一步描述时，认为本领域普通技术人员能够利用前文描述和下文示例性实施例来制备和应用本发明的化合物以及实践所要求保护的方法。因此，下文工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，而不被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1
抗IGLV3-21 R110、抗IGHV1-69和抗IGHV4-34 BCR CAR T细胞分别特异性杀伤表达VL3-21 R110、VH1-69和VH4-34 BCR的淋巴瘤细胞
生成其内源性BCR耗竭的Jeko1细胞，并用合适的载体转导这些细胞以表达单独的富集的定型BCR：VL3-21 R110 BCR(“Jeko1 VL3-21*”)、VH1-69(“Jeko1 VH1-69”)或VH4-34(“Jeko1 VH4-34”)。含其内源性BCR的Jeko1细胞(“Jeko1 WT BCR”)和CD19敲除细胞(“Jeko1 CD19KO”)充当对照。
抗IGLV3-21 R110 BCR CAR T细胞(“CART3-21*”)是通过下列制备的：用图5中描绘的pTRPE AVAL2H CAR载体转导T细胞以表达包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CAR抗IGLV3-21 R110 BCR CAR-T细胞)，其包含特异性结合VL3-21 R110的scFv(SEQ ID NO:35)、CD8α铰链(SEQ ID NO:54)、CD8跨膜结构域(SEQ ID NO:51)、共刺激分子4-1BB的胞内结构域(SEQ ID NO:59)和CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO:56)。
为了制备抗IGHV1-69 BCR CAR T细胞(“CART1-69”)，将载体pTRPE AVAL2H CAR的CAR编码序列替换为SEQ ID NO:50的CAR编码序列，并转导至T细胞中以获得抗IGHV1-69BCR CAR-T细胞(“CART1-69”)。
为了制备抗IGHV4-34 BCR CAR T细胞(“CART4-34”)，将载体pTRPE AVA L2H CAR的CAR编码序列替换为SEQ ID NO:X的CAR编码序列，并转导至T细胞中以获得抗IGHV4-34BCR CAR-T细胞(“CART4-34”)。
为了制备抗IGHV3-23 BCR CAR T细胞(“CART3-23”)，将载体pTRPE AVA L2H CAR的CAR编码序列替换为SEQ ID NO:X的CAR编码序列，并转导至T细胞中以获得抗IGHV3-23BCR CAR-T细胞(“CART3-23”)。抗CD19 CAR T细胞(“CART19”)和未转导T细胞(“UTD”)分别充当阳性和阴性对照。
在将细胞与转导或未转导T细胞共培养后测定各个Jeko1细胞(Jeko1 WT BCR、Jeko1VL3-21*、Jeko1 VH1-69、Jeko1 VH4-34、Jeko1 CD19KO)的细胞毒性，且示于图6中。用抗IGLV3-21 R110 BCR CAR-T细胞(“CART3-21*”)转导的T细胞特异性杀伤表达VL3-21R110 BCR的Jeko1 VL3-21*细胞，同时留存其它细胞(图6，上图)，并且CART3-21*T细胞随时间推移，特异性地响应于Jeko1 VL3-21细胞而增殖(图6，下图)。用抗IGHV1-69BCR CAR T细胞(CART1-69)转导的T细胞特异性杀伤表达VH1-69 BCR的Jeko1 VH1-69细胞，同时留存其它细胞，并且CART1-69 T细胞随时间推移，特异性地响应于Jeko1VH1-69细胞而增殖；以及用抗IGHV4-34 BCR CAR T细胞转导的T细胞特异性杀伤表达VH4-34 BCR的Jeko1 VH4-34细胞，同时留存其它细胞，并且CART4-34 T细胞随时间推移，特异性地响应于Jeko1 VH4-34细胞而增殖。
列举的实施方式
提供下面列举的实施方式，其编号不应被解释为表示重要性级别。
实施方式1提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中抗原结合结构域特异性结合B细胞受体(BCR)。
实施方式2提供实施方式1的CAR，其中抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
实施方式3提供实施方式1或2的CAR，其中抗原结合片段是单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)或单结构域抗体。
实施方式4提供实施方式1-3中任一项的CAR，其中抗原结合片段是scFv。
实施方式5提供实施方式1-4中任一项的CAR，其中富集的定型BCR是B细胞或浆细胞上的膜结合蛋白。
实施方式6提供实施方式1-5中任一项的CAR，其中富集的定型BCR包含SEQ ID NO:13-17、18-20和21-24中任一个列出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:13-17、18-20和21-24中任一个列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式7提供实施方式1-6中任一项的CAR，其中抗原结合结构域包含SEQ IDNO:25-30、31-33、37-39和43-48中任一个列出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:25-30、31-32、35-36、39-42、64、66、68、69、76、78、80和81中任一个列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式8提供实施方式1-7中任一项的CAR，其中跨膜结构域包括CD8跨膜结构域。
实施方式9提供实施方式1-8中任一项的CAR，其中跨膜结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:51中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式10提供实施方式1-9中任一项的CAR，其中胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。
实施方式11提供实施方式1-10中任一项的CAR，其中胞内信号传导结构域包含SEQID NO:56的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:56中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式12提供实施方式1-11中任一项的CAR，其中CAR还包括共刺激分子的胞内结构域。
实施方式13提供实施方式12的CAR，其中共刺激分子是4-1BB。
实施方式14提供实施方式12或13的CAR，其中胞内结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:59中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式15提供实施方式1-14中任一项的CAR，其中CAR还包含CD8α铰链。
实施方式16提供实施方式15的CAR，其中CD8α铰链包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:54中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式17提供实施方式1-16中任一项的CAR，其中CAR还包含CD8信号肽。
实施方式18提供实施方式17的CAR，其中CD8信号肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:63中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式19提供实施方式1-14中任一项的CAR，其中CAR包含SEQ ID NO:47-50中任一个列出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:47-50和72-75中任一个列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方式20提供核酸分子，其包括编码实施方式1-19中任一项的CAR的核酸序列。
实施方式21提供载体，其包含实施方式20的核酸。
实施方式22提供遗传修饰细胞，其包含实施方式1-21中任一项的CAR。
实施方式23提供实施方式22的遗传修饰细胞，其中细胞是人T细胞。
实施方式24提供药物组合物，其包含实施方式1-19中任一项的CAR、实施方式20的核酸分子、实施方式21的载体或实施方式22或23的遗传修饰细胞；和药学上可接受的赋形剂。
实施方式25提供用于特异性消除有需要的对象中富集的定型B细胞的方法，方法包括向对象施用有效量的实施方式23或23的遗传修饰细胞。
实施方式26提供用于治疗或预防有需要的对象中血液学癌症的方法，方法包括向对象施用有效量的实施方式22或23的遗传修饰细胞。
实施方式27提供实施方式26的方法，其中血液学癌症是白血病。
实施方式28提供实施方式26或27的方法，其中血液学癌症是慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病。
实施方式29提供用于治疗或预防有需要的对象中自身免疫性疾病的方法，方法包括向对象施用有效量的实施方式22或23的遗传修饰细胞。
实施方式30提供实施方式29的方法，其中自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病(CD)、白塞病(BD)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、ANCA相关性血管炎(AAV)、IgA血管炎(IgAV)或IgA血管炎(IgAV)。
实施方式31提供实施方式25-30中任一项的方法，其中对象是人。
实施方式32提供根据实施方式22或23的遗传修饰细胞在制备用于治疗或预防有需要的对象中血液学癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途。
本文提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和电子可用信息的内容特此通过引用以其整体并入，其程度与各单独出版物具体和单独指示通过引入并入的程度相同。申请人保留将任意此类文章、专利、专利申请或其它实体和电子文件的任意和所有材料及信息实体并入本申请的权利。
尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但是很明显，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域其它技术人员可设计出本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有此类实施方式和等同变型。

Claims (32)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合疾病特异性或富集的定型B细胞受体(BCR)。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)或单结构域抗体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合片段是scFv。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CAR，其中所述富集的定型BCR是B细胞或浆细胞上的膜结合蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述富集的定型BCR包含SEQ ID NO:13-17、18-20和21-24中任一个列出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:13-17、18-20和21-24中任一个列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:25-30、31-32、35-36、39-42、64、66、68和69中任一个列出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:25-30、31-32、35-36、39-42、64、66、68、69、76、78、80和81中任一个列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包括CD8跨膜结构域。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:51中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的CAR，其中所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的CAR，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQIDNO:56的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:56中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含共刺激分子的胞内结构域。
13.根据权利要求12所述的CAR，其中所述共刺激分子是4-1BB。
14.根据权利要求12或13所述的CAR，其中所述胞内结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:59中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含CD8α铰链。
16.根据权利要求15所述的CAR，其中所述CD8α铰链包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:54中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含CD8信号肽。
18.根据权利要求17所述的CAR，其中所述CD8信号肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:63中列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-14中任一项所述的CAR，其中CAR包含SEQ ID NO:47-50中任一个列出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:47-50和72-75中任一个列出的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
20.核酸分子，其包括编码权利要求1-19中任一项所述的CAR的核酸序列。
21.载体，其包括权利要求20所述的核酸。
22.遗传修饰细胞，其包含权利要求1-21中任一项所述的CAR。
23.根据权利要求22所述的遗传修饰细胞，其中所述细胞是人T细胞。
24.药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的CAR、权利要求20所述的核酸分子、权利要求21所述的载体或权利要求22或23所述的遗传修饰细胞；和药学上可接受的赋形剂。
25.用于特异性消除有需要的对象中富集的定型B细胞的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求23或23所述的遗传修饰细胞。
26.用于治疗或预防有需要的对象中血液学癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求22或23所述的遗传修饰细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述血液学癌症是白血病。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述血液学癌症是慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病。
29.用于治疗或预防有需要的对象中自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求22或23所述的遗传修饰细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病(CD)、白塞病(BD)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、ANCA相关性血管炎(AAV)、IgA血管炎(IgAV)或IgA血管炎(IgAV)。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
32.根据权利要求22或23所述的遗传修饰细胞在制备用于治疗或预防有需要的对象中血液学癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途。
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