CN109706120A

CN109706120A - 一种双靶点特异性t淋巴细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109706120A
Application number: CN201711015103.5A
Authority: CN
Inventors: 张宏玲
Original assignee: Shenzhen Bindebio Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Bindebio Technology Co ltd
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞，包括Mesothelin抗原受体和NY‑ESO‑1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述NY‑ESO‑1抗原受体为基因修饰抗原受体，其中Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，NY‑ESO‑1抗原受体的编码基因序列为SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法和应用。本发明提供的双靶点特异性T淋巴细胞可以适用于两个肿瘤靶点，增强了对癌细胞的识别，避免癌细胞出现靶点逃逸，扩大了免疫细胞的杀伤谱。

Description

一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用。

背景技术

免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，并在白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤中取得了卓越的临床疗效，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。

嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)以及基因修饰的T细胞受体技术(TC R)作为当前过继性细胞回输治疗技术两大最新的免疫细胞技术，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶性肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。CAR-T和TCR-T原理相似，其中，C AR-T的肿瘤识别蛋白为人工设计，因此可以不依赖于主要组织相容性复合体等人体正常免疫识别体系，但是无法识别表达在肿瘤内部的靶点，在实体瘤方面的疗效还十分有限；而TCR-T的肿瘤识别模式是通过改造T细胞本身的T细胞受体，增强其对肿瘤的亲和力，比CAR-T更加“天然，”但其单独使用，在肿瘤杀伤能力方面也很有限，特别是对于多种肿瘤抗原同时出现的情况，在复杂的肿瘤微环境中，其杀伤肿瘤细胞的能力被大大降低，限制了其临床应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用。本发明提供的双靶点特异性T淋巴细胞可以适用于两个肿瘤靶点，增强了对癌细胞的识别，避免癌细胞出现靶点逃逸，扩大了免疫细胞的杀伤谱。

第一方面，本发明提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞，包括Mesothelin抗原受体和NY-ESO-1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述N Y-ESO-1抗原受体为基因修饰抗原受体，所述Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因序列为SEQ ID NO：2所示。

其中所述Mesothelin抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

其中所述NY-ESO-1抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。

具体地，所述Mesothelin抗原受体的编码基因包括Mesothelin单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。

具体地，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因包括NY-ESO-1单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。

第二方面，本发明提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

可选地，所述重组慢病毒载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ I D NO：2所示的DNA分子。采用重组慢病毒载体感染T淋巴细胞，可得到如本发明第一方面所述的双靶点特异性T淋巴细胞。

可选地，重组慢病毒载体分别包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的D NA分子、如SEQ ID NO：2所示的DNA分子，采用这两种重组慢病毒载体共同感染T淋巴细胞，也可得到如本发明第一方面所述的双靶点特异性T淋巴细胞。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的重组慢病毒载体。

第四方面，本发明提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法，包括：

(1)构建pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒，通过氨基端到羧基端顺次拼接人信号肽、靶向Mesothelin单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区、CD3ζ胞内信号区构成CAR-Mesothelin序列，所述CAR-Mesothelin序列如SEQ ID NO:1所示，并连接pWPXLD载体；

(2)构建pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒，通过氨基端到羧基端顺次拼接人信号肽、靶向NY-ESO-1单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区、CD3ζ胞内信号区构成TCR-NY-ESO-1序列，所述TCR-NY-ESO-1序列如SEQ ID NO:2所示，并连接pWPXLD载体；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；

(5)分离并获取所述双靶点特异性T淋巴细胞。

具体地，所述包装所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXL D-TCR-NY-ESO-1重组质粒，得到重组慢病毒，包括如下步骤：

将所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒分别与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，完成所述重组慢病毒的构建。

可选地，所述包膜质粒为pMD2.G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为293T细胞。

可选地，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。

可选地，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。

优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

具体地，在步骤(4)之前先将外周血单个核细胞按一定比例加入CD3磁珠，并孵育一段时间后，放入磁铁进行分离得到CD3阳性T淋巴细胞。

第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的细胞、如第二方面所述的重组慢病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞、如第四方面所述的制备方法制备方法制得的双靶点特异性T淋巴细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。尤其在胰腺癌中的应用。

本发明的效益：

(1)同时靶向两个肿瘤靶点(Mesothelin以及NY-ESO-1)，增强了对癌细胞的识别，避免癌细胞出现靶点逃逸，扩大了免疫细胞的杀伤谱；

(2)免疫细胞同时具备嵌合抗原受体以及T细胞受体两种识别模式，提升了肿瘤杀伤能力，高效多样化的识别癌症细胞，对于复杂的肿瘤微环境有着更强的肿瘤杀伤能力；

(3)节约免疫细胞治疗成本，降低所需的CAR-T细胞总数，极大节省其中的人力、物力和财力，减少患者治疗疗程，减轻患者治疗费用负担。

附图说明

图1为本发明实施提供的pWPXLd-CAR-Mesothelin重组载体的质粒图谱。

图2为本发明实施提供的pWPXLd-TCR-NY-ESO-1重组载体的质粒图谱。

图3为本发明实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞的阳性率；图3(A)为阴性对照组，图3(B)为本发明实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞的阳性组。

图4为本发明实施例提供的CD3+/CD8+阳性细胞情况；图4(A)为阴性对照组，图4(B)为采用本发明所述方法后CD3+/CD8+阳性细胞情况。

图5为本发明实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞体外肿瘤杀伤效果。

图6为本发明实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞治疗肿瘤小鼠的效果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，

实施例一、一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备Mesothelin抗原受体基因和NY-ESO-1抗原受体基因

a)提供上游引物和下游引物，其中，Mesothelin抗原受体基因上游引物碱基序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物碱基序列如SEQ ID NO:6所示；NY-ESO-1抗原受体基因上游引物碱基序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物碱基序列如SEQ ID NO:8所示；

b)通过PCR的方法分别获得Mesothelin抗原受体基因和NY-ESO-1抗原受体基因。Mesothelin抗原受体基因的基因序列如SEQ ID NO：1所示和NY-ES O-1抗原受体基因如SEQID NO：2所示。

(2)构建pWPXLd-CAR-Mesothelin重组质粒和pWPXLd-TCR-NY-ESO-1重组质粒

将Mesothelin抗原受体基因和NY-ESO-1抗原受体基因分别与pWPXLD载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜之后进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存，pWPXLd-CAR-Mesothelin重组质粒(图1)和重组质粒pWPXLd-TCR-NY-ESO-1(图2)构建成功。

(3)重组慢病毒构建

将pWPXLd-CAR-Mesothelin、psPAX2、pMD2.G三者共转染入培养好的293T细胞以及将pWPXLd-TCR-NY-ESO-1、psPAX2、pMD2.G三者共转染入培养好的293T细胞中。第48h收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×10⁸个/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱。

(4)双靶点特异性T淋巴细胞的制备

a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离

PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；PBS洗涤，得到PBMC。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞

取PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3磁珠，室温孵1-2h；将孵育好磁珠的细胞，放入磁铁进行分离；PBS洗涤，得到CD3阳性T淋巴细胞。

(c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞

取经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的pWPXLd-CAR-Mesothelin重组慢病毒和pWPXLD-TCR-N Y-ESO-1重组慢病毒。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/ml，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到双靶点特异性T淋巴细胞。

效果实施例

为了评估本发明所描述的上述方法制备的双靶点特异性T淋巴细胞的阳性率，使用流式细胞仪检测Mesothelin、NY-ESO-1的阳性率(PE荧光标记的鼠抗人Mesothelin抗体，Biolegend公司，货号：560179；FITC荧光标记的鼠抗人Vβ8抗体，BD公司，货号：555606)，并比较本发明培养获得的CD3+/CD8+T淋巴阳性细胞群情况(APC荧光标记鼠抗人CD3抗体，Biolegend公司，货号：300312；APC-H7荧光标记鼠抗人CD8抗体，BD公司，货号：300406)。

效果实施例一，评估本发明所制备的双靶点特异性T淋巴细胞的阳性率

将经过本发明方法制备双靶点特异性T淋巴细胞与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照)，使用流式细胞仪检测Mesothelin、NY-ESO-1的阳性率，结果如图3所示，其中图3中(A)为阴性对照组，图3中(B)为使用本发明方法的阳性组。在图3(B)中Mesothelin阳性率为8.4％，NY-ESO-1阳性率为3.17％，Mesothelin+NY-ESO-1+双阳性率为6.35％，而图3(B)中对应的阴性对照组均为0％。这表明本方法制备的双靶点特异性T淋巴细胞可以靶向Mesothelin和NY-ESO-1两个肿瘤靶点。

效果实施例二，评估采用本发明所述方法后，CD3+/CD8+阳性细胞情况

将经过本发明方法制备双靶点特异性T淋巴细胞与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照)，在37℃，5％CO2下培养2天后，用流式细胞仪检测法，来检测CD3+CD8+阳性细胞在细胞总数中占比的情况，结果如图4所示，其中图4中(A)为阴性对照组，图4中(B)为采用本发明所述方法后CD3+/CD8+阳性细胞情况。

从图4中可以看出，采用本发明所述的方法后CD3+阳性率高达89％以上，CD3+/CD8+双阳性率高达49％以上，显著高于一般方法培养人外周血所获得的T淋巴CD3+阳性率约12％，和CD3+/CD8+双阳性比例约7.7％。这说明本发明提供的双靶点特异性T淋巴细胞体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。

效果实施例三，评估双靶点特异性T淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明方法制备双靶点特异性T淋巴细胞(CAR/TCR-T)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR–T效果的细胞(CAR-T单独组)以及具有单独的TCR-T效果的细胞(TCR-T单独组)进行比较，在体外使用效应细胞与靶细胞(相关肿瘤细胞：如Nalm-6、PANC-1细胞等)数量比为10:1、3:1、1:1、1:3和1:10比例，在37℃，5％CO₂下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果如图5所示。从图5中可看出，经过本发明所述的方法制备的双特异性T淋巴细胞肿瘤杀伤力在60％以上，远远高于其他组，因此经本发明方法制备的双靶点特异性T淋巴细胞具有十分强的肿瘤杀伤能力。

效果实施例四，评估双靶点CAR/TCR-T免疫细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明方法制备的双靶点特异性T淋巴细胞(CAR/TCR-T组)与未经制备的T淋巴细胞(未制备组)，在小鼠肿瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果如图6所示。从图6可以看出经过本方法制备的CAR/TCR-T淋巴细胞使得小鼠在培养60天时存活率还高于50％，远远超过未经制备的T淋巴细胞组，表明经过本方法制备的CAR/TCR-T淋巴细胞更能保护小鼠免于因肿瘤而导致的死亡。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120

atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180

atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240

tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300

tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360

ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420

ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc ggcggaggtg ggtccgacgt cgtgatgacc 480

cagagccctg acagcctggc agtgagcctg ggcgaaagag ctaccattaa ctgcaaatcg 540

tcgcagagcc tgctggactc ggacggaaaa acgtacctca attggctgca gcaaaagcct 600

ggccagccac cgaagcgcct tatctcactg gtgtcgaagc tggattcggg agtgcccgat 660

cgcttctccg gctcgggatc gggtactgac ttcaccctca ctatctcctc gcttcaagca 720

gaggacgtgg ccgtctacta ctgctggcag ggaacccact ttccgggaac cttcggcgga 780

gggacgaaag tggagatcaa gaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct 840

accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg 900

gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct 960

ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 1020

aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080

gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140

aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200

gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260

ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320

caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380

ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440

gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg taa 1521

<210> 2

<211> 2028

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatccatgc tgctgctggt gaccagcctg ctgctgtgtg agctgcccca ccccgccttt 60

ctgctgatcc ccgacatcca gatgacccag agccccagca gcgtgagcgc cagcgtgggc 120

gaccgggtga ccatcacctg ccgggccagc cagggcatca acacctggct ggcctggtat 180

cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcag cctgaagagc 240

ggcgtgccca gccggtttag cggctctggc tctggcgccg acttcaccct gaccatcagc 300

agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc aggccaacag cttccccctg 360

acctttggcg gcggaacaaa ggtggagatc aagggcagca cctccggcag cggcaagcct 420

ggcagcggcg agggcagcac caagggccag gtgcagctgg tgcagagcgg agccgaggtg 480

aagaagcctg gcgcctccgt caaggtgtcc tgcgaggcca gcggctacac cttcaccagc 540

tacggcttca gctgggtgcg gcaggcacca ggccagggcc tcgagtggat gggctggatc 600

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gccgtgtact actgcgccag ggtgtacgcc gactacgccg attactgggg ccagggcacc 780

ctggtgaccg tgagcagcga gagcaagtac ggccctccct gccccccttg ccctgccccc 840

gagttcctgg gcggacccag cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg 900

atcagccgga cccccgaggt gacctgtgtg gtggtggacg tgtcccagga ggaccccgag 960

gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcaca acgccaagac caagccccgg 1020

gaggagcagt tcaatagcac ctaccgggtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac 1080

tggctgaacg gcaaggaata caagtgtaag gtgtccaaca agggcctgcc cagcagcatc 1140

gagaaaacca tcagcaaggc caagggccag cctcgggagc cccaggtgta caccctgccc 1200

cctagccaag aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc 1260

taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaacggcc agcccgagaa caactacaag 1320

accacccccc ctgtgctgga cagcgacggc agcttcttcc tgtacagccg gctgaccgtg 1380

gacaagagcc ggtggcagga gggcaacgtc tttagctgct ccgtgatgca cgaggccctg 1440

cacaaccact acacccagaa gagcctgagc ctgtccctgg gcaaggatat catctacatc 1500

tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctgt ccctggtcat caccctgtac 1560

tgcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcctgtg 1620

cagaccacac aggaagagga cggctgtagc tgtagattcc ccgaggaaga ggaaggcggc 1680

tgcgagctga gagtgaagtt cagcagaagc gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag 1740

aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggagg aatacgacgt gctggacaag 1800

agaagaggcc gggaccctga gatgggcggc aagcccagac ggaagaaccc ccaggaaggc 1860

ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1920

ggcgagcgga gaagaggcaa gggccatgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1980

aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcctc caagatga 2094

<210> 3

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile

165 170 175

Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

180 185 190

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile

195 200 205

Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

225 230 235 240

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly

245 250 255

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 4

<211> 675

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Ser Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro

1 5 10 15

His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

35 40 45

Ala Ser Gln Gly Ile Asn Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

130 135 140

Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

145 150 155 160

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr

165 170 175

Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

195 200 205

Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser

210 215 220

Thr Ser Ser Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Ala Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

260 265 270

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

275 280 285

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

305 310 315 320

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

340 345 350

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

355 360 365

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

385 390 395 400

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

405 410 415

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

420 425 430

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

435 440 445

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

450 455 460

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

465 470 475 480

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Asp

485 490 495

Ile Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

500 505 510

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

515 520 525

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

530 535 540

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

545 550 555 560

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

565 570 575

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

580 585 590

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

595 600 605

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

610 615 620

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

625 630 635 640

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

645 650 655

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

660 665 670

Pro Pro Arg

675

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccctcc ctgtcaccgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattcttacc gaggcggcag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatccatgc tgctgctggt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattctcatc ttggaggcag 20

Claims

1.一种双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，包括Mesothelin抗原受体和NY-ESO-1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述NY-ESO-1抗原受体为基因修饰抗原受体，所述Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因序列为SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述Mesot helin抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述NY-ES O-1抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。

4.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述Mesot helin抗原受体的编码基因包括Mesothelin单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。

5.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述NY-ES O-1抗原受体的编码基因包括NY-ESO-1单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。

6.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包括核苷酸序列如SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的重组慢病毒载体。

8.一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；

(5)分离并获取所述双靶点特异性T淋巴细胞。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述包装所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒，得到重组慢病毒，包括如下步骤：

将所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒分别与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞进行所述重组慢病毒的构建。

10.一种如权利要求1-5任一项所述的或如权利要求8-9任一项所述的制备方法制得的双靶点特异性T淋巴细胞、如权利要求6所述的重组慢病毒载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。