CN111484562A - 一种靶向cd22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物 - Google Patents

一种靶向cd22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种靶向CD22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物，涉及细胞免疫治疗技术领域，该嵌合抗原受体具有针对肿瘤表面抗原CD22的抗原结合结构域，抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。该嵌合抗原受体可靶向CD22蛋白，用该嵌合抗原受体制备的T细胞可特异性的作用于CD22呈阳性的靶细胞，具有很好的特异性和持续性，杀伤能力大，对于健康组织的副作用小，可用于制备治疗或预防CD22呈阳性的肿瘤的药物。

Description

一种靶向CD22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，具体而言，涉及一种靶向CD22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是恶性浆细胞病中最常见的一种类型，恶性程度很高，以克隆性浆细胞大量增生为特征。目前临床治疗MM可诱导缓解，但几乎所有患者最终仍会复发甚至死亡。尽管一些单克隆抗体已经在临床前研究和早期临床试验中显示出治疗MM的希望，但由于效果及安全性尚有不足，并没有得到一致性认可。显然，非常需要探寻MM的新的免疫疗法，并且为治疗该疾病开发有效的抗原特异性过继性T细胞疗法将是重中之重。T细胞可以被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，该受体包括抗原识别部分和T细胞活化结构域的融合蛋白。对于B系恶性肿瘤，最常用的是抗CD19-CAR的过继性T细胞方法。抗CD19-CAR转导的T细胞在小鼠中治愈了白血病和淋巴瘤，一些患者也在过继输注的抗CD19-CAR转导的T细胞的早期临床试验中获得缓解，但同时，用抗CD19-CAR转导的T细胞也会清除掉正常的B细胞，并且不幸的是，CD19很少在MM的恶性浆细胞中表达，因此用CAR表达的T细胞治疗MM将需要寻找其它更好的靶标。
CD22是一种主要在B细胞上表达的I型特异性跨膜唾液酸化糖蛋白，为亲和素，在B细胞信号传导中起重要作用。CD22 RNA在MM细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面可检测到CD22蛋白，其分子量135kD，主要表达于成熟B细胞，可作为共受体调节物，调节B细胞受体功能，能介导细胞黏附、存活。CD22缺乏的小鼠看上去一切正常，似乎很健康，但成熟B细胞确数量减少。因此，CD22将是用于治疗具有CAR表达T细胞的MM的合适的靶抗原。
然而，目前针对CD22的抗体类别较少，且现有的针对CD22的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的特异结合力和杀伤力均不够理想。因此，制备一种性能优良的针对CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体，其可靶向CD22蛋白，表达该嵌合抗原受体的T细胞可特异性杀伤CD22呈阳性的靶细胞，其杀伤能力大，特异性强，对于健康组织的副作用小。
本发明的另一目的在于提供靶向CD22蛋白的抗体，该抗体可特异性结合CD22蛋白，用于制备靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞。
本发明的另一目的在于提供一种靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞，该T细胞可特异性地杀伤CD22阳性的靶细胞，可用于治疗CD22阳性的肿瘤。
本发明的另一目的在于提供一种核酸分子。
本发明的另一目的在于提供一种治疗肿瘤的药物，该药物可用于治疗或预防CD22呈阳性的肿瘤，例如多发性骨髓瘤。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明以人CD22(hCD22)蛋白作为抗原，结合噬菌体库展示技术，淘选得到1个现有技术未曾报道的scFV抗体。并经实验验证该scFV抗体具有结合CD22蛋白的能力，采用该scFV抗体制备的嵌合抗原受体T细胞对CD22蛋白呈阳性的靶细胞具有特异性的杀伤效果。因此，该scFV抗体可用于制备靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞以及用于制备CD22呈阳性的肿瘤。
基于此，一方面，本发明提供了一种靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体(CAR-CD22)，所述嵌合抗原受体具有针对肿瘤表面抗原CD22的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
该嵌合抗原受体可靶向CD22蛋白，可用于制备靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体的T细胞(CAR-CD22T)，通过抗CD22嵌合抗原受体的过继性T细胞方法，可特异性的作用于CD22呈阳性的靶细胞。该嵌合抗原受体T细胞与靶细胞上的CD22蛋白直接结合后便会通过信号传导结构域刺激T细胞增殖，同时激活T细胞的细胞毒作用并促进细胞因子分泌，最终消除带有CD22蛋白的肿瘤细胞。并且，相比于目前FDA批准上市的CD22-Car(CELLECTIS-WO2018178378(A1)-CD22)，本发明提供该CAR-CD22T具有对肿瘤细胞的更好的结合力和杀伤力。这主要是源于本发明的这种嵌合抗原受体的互补性决定区(complementaritydetermining region，CDR)能够在空间结构上与肿瘤抗原CD22形成更为精密的互补，由此能够得到更为理想的结合能力，同时也使得诱导释放TNFa等细胞因子的能力更强。
进一步地，所述抗原结合结构域选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv中的任意一种。
对于本领域技术人员而言，在本发明提供了可特异性结合CD22蛋白的抗体的重链可变区和轻链可变区的基础上，容易构建得到可结合CD22蛋白的全长抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任一种抗体类型；无论何种类型的抗体，只要含有上述的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列，均属于本发明的保护范围。
进一步地，所述抗原结合结构域为scFv，所述抗原结合结构域的重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域，所述共刺激信号传导区包括4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域依次串联组成；
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述4-1BB共刺激信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
另一方面，本发明提供一种靶向CD22蛋白的抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
具有上述序列的抗体可特异性结合CD22蛋白，其用于制备靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞。此外，将本发明提供的抗体用于制备检测CD22蛋白的检测试剂，或者在本发明提供的抗体上添加标记用于检测CD22蛋白，属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗体为scFv，所述抗体中重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码如上述嵌合抗原受体。
另一方面，本发明提供一种靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞，其表达如上述嵌合抗原受体。
该T细胞可特异性地杀伤CD22呈阳性的靶细胞，可用于治疗CD22阳性的肿瘤。
另一方面，本发明提供一种治疗肿瘤的药物，其含有上述嵌合抗原受体T细胞。该药物可用于治疗或预防CD22呈阳性的肿瘤例如：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为CD22抗体与人的CD22蛋白的结合力检测结果示意图；
图2为CAR-CD22结构示意图；
图3为流式细胞仪显示CD4+CD8+T细胞感染72Hrs后CAR-CD22阳性率；以及
图4为效靶比为7/1时，表达CAR-CD22T的T细胞与靶细胞K562-CD22细胞共培养，靶细胞比例随时间变化的流式图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1.噬菌体库淘选
使用生物素化的hCD22蛋白作为全人源抗体库的淘选抗原。首先用封闭液(PBST/5％脱脂奶粉)室温封闭噬菌体抗体2h，噬菌体的投入量为1012pfu，然后加入10ìg抗原，室温孵育1h，孵育后加入50ìl预封闭的
Figure BDA0002466615760000061
M-280Streptavidin磁珠，室温孵育30min。
先用PBST洗去未结合的噬菌体，再用0.1M的HCl-Glycine洗脱结合在磁珠上的噬菌体，之后用Tris-HCl中和洗脱液，取部分噬菌体侵染对数生长期的大肠杆菌TG1，收集的噬菌体用于下一轮淘选。
逐渐增加每轮的筛选强度，富集度达到100倍以上时，终止淘选。
2.采用phage Elisa筛选抗CD22的单链抗体阳性克隆
(1)挑选四轮淘选后的噬菌体侵染的TGl单克隆，接种于96孔板中，培养基为2YT(含2％glucose、100ìg/ml Ampicilline)。
(2)37℃、250rpm过夜培养后转接至新的培养基中，培养至对数生长期后加入M13K07辅助噬菌体，37℃静止侵染1h。
(3)4000rpm离心15min，使用2YT(含100ìg/ml Ampicilline、70ìg/ml Kanamycin)培养基30℃过夜培养，离心取噬菌体上清，进行ELISA鉴定克隆。
(4)用0.5ìg/ml的hCD22抗原包被Costar-9018酶标板，3％BSA 4℃封闭过夜，加入收集的噬菌体上清，4℃孵育2h。
(5)洗去未结合的噬菌体后加入Ml3 Bacteriophage抗体(HRP)，4℃孵育1h。洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应。
(6)用酶标仪于450nm读数，选择OD450>1.5克隆进行测序，对序列进行Germline分析和PTMs位点分析，排除有潜在开发风险的分子后共得到1个具有结合hCD22蛋白特性的scFv单链抗体(后文也可称为CD22抗体)。
该CD22抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，具体如下：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINNYLNWYQQKPGKAPKLLISAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPLTFGGGTKVEIR。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.4，具体如下：
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTAATCTCTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGAGTTACACTACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAGA。
该CD22抗体的重链可变区的氨基酸序列为：SEQ ID NO.7，具体如下：
QVQLQQSGPGLVESSQILSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRLSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYPASVKGRIIIDPDTSKNQFSLLLSSVTPEDTAVYYCARELVPRGATIGFDYWGQGTLVTVSS。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.8，具体如下：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGGAGTCCTCGCAGATCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCAACTTGGAACTGGATCAGGCTGTCCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTATAGGTCCACCTGGTATAATGATTATCCAGCATCTGTGAAAGGTCGAATCATCATCGACCCCGACACATCCAAGAACCAGTTCTCTCTGCTATTGAGCTCTGTGACTCCCGAAGACACGGCTGTCTATTATTGTGCAAGAGAGTTGGTCCCTCGGGGGGCGACAATTGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGT。
实施例2
检测实施例1得到的CD22抗体与hCD22蛋白的结合力
检测方法：
(1)hCD22蛋白包被，自1ìg/ml开始稀释，3倍梯度稀释，共7个梯度，分别用100ìlhCD22蛋白稀释液包被Costar-9018酶标板，4℃过夜。
(2)用3％BSA室温封闭2h后加入CD22抗体对应噬菌体上清(1010pfu)，室温孵育2h。
(3)洗去未结合的噬菌体后加入Ml3 Bacteriophage抗体(HRP)，4℃孵育1h。洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应。
(4)用酶标仪于450nm读数，结果见图1。
从图1中结果可以看出，表达有CD22抗体的噬菌体与hCD22蛋白的结合能力良好，表现出S曲线，呈现出剂量效应关系，说明实施例1得到的CD22抗体具有与hCD22蛋白的结合能力。
实施例3
构建嵌合抗原受体表达载体
构建方法：
(1)全基因合成：信号肽、CD22抗体轻链可变区、linker、CD22抗体重链可变区、铰链区(hinge)、CD8α跨膜结构域(TM)、4-1BB共刺激信号传导区以及CD3ζ信号传导结构域。将上述序列依次连接得到CD22嵌合抗原受体表达盒，命名为：CD22嵌合抗原受体表达盒，并在表达盒最前端引入Kozac序列，表达盒结构如图2所示。
该CD22嵌合抗原受体表达盒的各元件序列如下：
信号肽(Leader)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。
其对应的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA。
CD22抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其对应的碱基序列如SEQID NO.4所示。
该CD22抗体的重链可变区与轻链可变区之间的linker的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，具体如下：
GSTSGSGKPGSGEGSTKG。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.6，具体如下：
GGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGC。
CD22抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；其对应的碱基序列如SEQID NO.8所示。
铰链区(hinge)的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体如下：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.10，具体如下：
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT。
CD8α跨膜结构域(TM)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体如下：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.12，具体如下：
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC。
4-1BB共刺激信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体如下：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.14，具体如下：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG。
CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体如下：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
其对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.16，具体如下：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC。
(2)全基因合成嵌合抗原受体表达盒的序列后，通过XbaI/SalI酶切位点连入空载体pCDH-EF1-MSC-T2A-copGFP上，得到嵌合抗原受体表达载体；得到嵌合抗原受体表达载体，经测序验证正确后，命名为pCDH-EF1-CAR-CD22-2073-NO-copGFP，含抗体CD22的轻链可变区和重链可变区。
实施例4
制备含嵌合抗原受体表达载体的菌种
方法：
(1)在-80℃冰箱取出DH5α感受态，冰上解冻。
(2)在感受态中加5ng质粒，轻轻混匀，冰上5分钟。
质粒是：
pCDH-EF1-CAR-CD22-NO-copGFP
(3)42℃热击90秒，冰上30分钟。
(4)加0.5ml无抗性的LB，37℃，180rpm培养30分钟。
(5)涂到氨苄抗性的平板上。
(6)37℃倒置过夜培养。
(7)挑单克隆，在氨苄抗性的LB中37℃，200rpm培养9-12小时。
(8)菌液中加甘油，甘油终浓度为10％，-80℃冰箱保存菌种，备用，可用于后续大量提取质粒。
(9)将上述菌种在LB中大量培养后，使用质粒抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司无内毒素质粒抽提试剂盒)抽提质粒，以备感染使用。质粒抽提方法按说明书进行即可。
实施例5
病毒包装
PEI法转染细胞。转染前24小时胰酶消化293T细胞，4*106的293T细胞铺在一个10cm细胞培养皿中，细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中，37℃5％CO2培养箱中培养，不超过24小时，当细胞达到60-80％密度时可转染。
具体步骤如下：
(1)将质粒，PEI，DMEM培养基置于室温5min；
(2)取DMEM 450ìl于1.5mlEP管中，再加入50ìl PEI(1ìg/ìl)混匀，室温静置5min；
(3)取10ìg质粒(pCDH-EF1-CAR-CD22-NO-copGFP或是pCDH-EF1-MSC-T2A-copGFP)，10ìg psPA18039243X2，5ìg pMD2.G，加入DMEM至500ìl，混匀，室温静置5min；
(4)将配好的步骤(2)的PEI-DMEM溶液加入到步骤(3)得到的含质粒的DMEM中，混匀，室温静置20min；得到DNA/PEI混合物；
(5)将1ml DNA/PEI混合物慢慢滴入293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育6-8h小时；
(6)弃去原有培养基，更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育；
(7)更换培养基48小时后，收集培养基，之后每皿各添加10ml新鲜培养基继续培养，24h后再次收集上清，与48小时收集的上清混合；
(8)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
(9)以0.45ìm滤器过滤得到的上清；
(10)将过滤后的上清进行切向流过滤；
(11)将切向流过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000rpm离心2h，用无血清培养基对超离后得到的病毒沉淀进行重悬，轻轻吹打直至完全溶解，得到病毒液，采用不同载体得到的病毒液分别命名为：
TCD22病毒液(含CD22嵌合抗原受体表达盒)、空载体病毒液；
(12)将各病毒液分装，置于-80℃冰箱保存，并预留5-10ìl病毒浓缩液进行滴度测定。
实施例6
病毒滴度测定
方法：
消化并计数293T细胞，用含10％FBS的DMEM培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4*105/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液。细胞贴壁培养8小时后，感染稀释100倍的病毒液1ìl、10ìl、20ìl、30ìl、50ìl，24小时后换液，48小时后流式检测293T细胞阳性率。
离心、重悬并调节细胞密度为1*106/ml，50ìl中加biotin-CD22抗原，终浓度为1ug/ml，孵育30min后，DPBS清洗一次，重悬，染二抗APC-Streptavidin(购自BD)30min，清洗一次后DPBS重悬，流式检测。
检测结果显示，病毒滴度为2.0×108IU/mL，病毒滴度理想。
实施例7
制备靶向人CD22抗原的嵌合抗原受体的T细胞
1.人外周血单核细胞PBMC的分离
使用抗凝管(购自BD)采集外周血约25ml，按照1：1的体积比加入到淋巴细胞分离液中，梯度离心25min，离心后取白膜层细胞，用DPBS洗两遍，得到人外周血单核细胞PBMC。
2.CD4+CD8+T细胞富集及活化
重悬PBMC，调整密度为1*105/ìl，按照50ìl细胞悬液中加入CD4/CD8磁珠各10ìl，通过磁极分离得到CD4+CD8+T细胞。
得到的CD4+CD8+T细胞，加入含有10％FBS的AIM-V完全培养基培养，用抗人CD3/CD28抗体(购自美天旎，10ìl/ml)活化T细胞，IL-2浓度为200IU/ml。活化24小时后，换液，使用含有IL-2 200IU/ml的完全培养基继续培养。
3.慢病毒感染
调节T细胞细胞密度为1*106/ml，按MOI＝10，用实施例6中得到的病毒液(2073病毒液、2077病毒液、2079病毒液或2082病毒液)感染活化48小时后的T细胞，24小时后换液，持续添加IL-2 200IU/ml，采用病毒液，得到的可表达靶向人CD22抗原的嵌合抗原受体的T细胞；命名为T-CD22。
4.检测靶向人CD22抗原的嵌合抗原受体(CAR-CD22)表达情况
在培养过程中，取病毒感染后72小时的T细胞(T-CD22)，离心、重悬并调节细胞密度为1*106/ml，50ìl中加biotin-CD22抗原，终浓度为0.2ug/ml，孵育30min后，DPBS清洗一次，重悬，染二抗APC-Streptavidin(购自BD)30min，清洗一次后DPBS重悬，流式检测CAR-CD22的阳性率。
结果见图3，结果显示T-CD22有表达靶向CD22的嵌合抗原受体，结合力为52.81％，较CELLECTIS-WO2018178378(A1)-CD22的结合力(43.28％)强。
实验例1
体外共培养检测CAR-CD22T的肿瘤杀伤效果，靶细胞为K562-CD22。
取感染后72小时的T细胞(T-CD22)及过表达CD22的细胞K562-CD22，计数，调节细胞密度为1*106/ml，按照效靶比7:1共培养，即：T细胞1*106，K562-CD22 1.5*105，对照细胞为未经病毒液处理的CD4+CD8+T细胞，记为Ctrl-T细胞。分别在0H，24H，48H，96H检测K562-CD22细胞在总细胞中的比例，使用抗体APC-conjugated Human CD22/TNFRSF17 Antibody标记靶细胞，结果见图4。
结果显示，在T-CD22存在的情况下，随着时间的增加，靶细胞K562-CD22的比例明显减少，在0-96h的时间段内，靶细胞K562-CD22的比例分别是：27.46％、14.45％、12.33％、3.22％；由此说明，该T-CD22能很好的杀伤CD22T呈阳性的靶细胞K562-CD22。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 一种靶向CD22蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
<130> F2023625
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg
100 105
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattaac aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct aatctctgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag agttacacta ctccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcag a 321
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54
<210> 7
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Glu Ser Ser Gln
1 5 10 15
Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Leu Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Pro
50 55 60
Ala Ser Val Lys Gly Arg Ile Ile Ile Asp Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Leu Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Val Pro Arg Gly Ala Thr Ile Gly Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtggagt cctcgcagat cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg caacttggaa ctggatcagg 120
ctgtcccctt cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat attataggtc cacctggtat 180
aatgattatc cagcatctgt gaaaggtcga atcatcatcg accccgacac atccaagaac 240
cagttctctc tgctattgag ctctgtgact cccgaagaca cggctgtcta ttattgtgca 300
agagagttgg tccctcgggg ggcgacaatt gggtttgact actggggcca ggggaccctg 360
gtcaccgtct cgagt 375
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc acagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 11
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 12
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc acagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (10)

1.一种靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有针对肿瘤表面抗原CD22的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；所述抗原结合结构域的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域选自Fab、Fab’、F(ab’)2和scFv中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域为scFv，所述抗原结合结构域的重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域，所述共刺激信号传导区包括4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
5.根据权利要求4所述的靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域依次串联组成；
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述4-1BB共刺激信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
6.一种靶向CD22蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求6所述的靶向CD22蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体为scFv，所述抗体中重链可变区与轻链可变区之间的铰接区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.一种核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体。
9.一种靶向CD22蛋白的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表达如权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体。
10.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，其含有权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞，所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤。
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