JP2023538303A - 所望の表現型を有するｃａｒ ｔ細胞の操作および選択のための組成物および方法 - Google Patents

所望の表現型を有するｃａｒ ｔ細胞の操作および選択のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

ＣＡＲの単純かつ効率的な標的化ノックインおよび個々の遺伝子の同時ノックアウトを可能にする細胞ゲノム操作のための組成物および方法が、記載される。組成物および方法は、所望の表現型を示すＣＡＲ Ｔ細胞バリアントの大規模並行操作、選択および同定に特に応用できる。ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットとそれらの標的ゲノム組込みのための相同アームとを含有するＡＡＶベクターが、提供される。複数のＡＡＶベクターを含有するライブラリー、および望ましいＣＡＲ Ｔ細胞バリアントを同定するためのスクリーニングにおけるそれらの使用方法も、提供される。１つまたは複数の表現型の改善を示すＣＡＲ Ｔ細胞バリアントを使用する処置方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年８月１３日に出願した米国仮特許出願第６３／０６５，１９４号の利益および優先権を主張するものであり、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたＣＡ２３８２９５、ＣＡ２３１１１２およびＣＡ２２５４９８のもとで政府支援を受けて行ったものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表への言及
ファイル名「ＹＵ＿７９２７＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５」である、２０２１年８月１２に作成した２，５５７，４１７バイトのサイズを有するテキストファイルとして提出した配列表は、アメリカ合衆国特許規則連邦規則法典第３７巻第１．５２条（ｅ）項（５）に準じて、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、一般に、遺伝子編集技術および免疫療法の分野に、より詳細には、改善されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を操作する方法に関する。
発明の背景
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）などの細胞療法は、強力ながん治療法であることが証明されている。ＣＡＲ－Ｔ細胞養子移入療法は、血液がんの、特にＢ細胞白血病およびリンパ腫における処置において卓越した有効性を実証し（Neelapu SS., et al., N Engl J Med., 377(26):2531-2544 (2017)；Porter DL., et al., N Engl J Med., 365:725-733 (2011)）、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている。ＣＡＲ－Ｔおよび他の形態の養子Ｔ細胞療法は、既に急増し始めている。１，０００件を超える活発な臨床試験、および前臨床段階の非常に多くの研究がある（Tang J., et al., Nat Rev Drug Discov., 17(11):783-784 (2018)）。これらは、いくつかの異なるがん抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔ、例えば、Ｂ細胞悪性病変のためのＣＤ１９およびＣＤ２２標的化ＣＡＲ（Fry TJ., et al., Nat Med., 24(1):20-28 (2018); Porter et al., 2011）、多発性骨髄腫のためのＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）標的化ＣＡＲ、ならびにメソテリン、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲｖＩＩＩなどのいくつかの固形腫瘍標的のための他のＣＡＲ（Ahmed N., et al., JAMA Oncology 3:1094-1101 (2017)；Raje N., et al., N Engl J Med., 380:1726-1737 (2019)）を含む。新しいＣＡＲ－Ｔ形態が、最近、様々な標的、例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＵＣ１、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、クローディンなどに対して出てきているが、これらのＣＡＲ－Ｔは、開発の初期段階にある（Brudno, JN. and Kochenderfer JN., Nature reviews Clinical oncology 15, 31(2018)；Reinhard K., et al, Science 367, 446-453 (2020)）。これらの研究は、広範な腫瘍学適応症にわたってＣＡＲ－Ｔに基づく免疫療法の広大な景観を明らかにした（June CH., et al., Science 359, 1361-1365 (2018)）。
現在の成功にもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ療法には依然として大きな課題がある。今までのところ、ＦＤＡにより認可された固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ療法はない。液性がんでさえ、高い奏効率にもかかわらず、患者の大部分は、不良なＣＡＲ－Ｔ細胞拡大、持続性、または特異的抗原の欠損のせいで、再発する（Porter DL., et al., Sci Transl Med. 7(303):303ra139 (2015)；Gardner R., et al., Blood, 27(20):2406-10 (2016)）。抗原欠損、腫瘍微小環境での代謝抑制、がん部位への不十分なＴ細胞輸送、有効ながん細胞死滅の欠如、重度の毒性、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、最適に満たないＴ細胞増殖レベル、および診療所でよく見られるような、ＣＡＲ－Ｔ持続性の欠如を含む、複数の障害が、ＣＡＲ－Ｔ療法には存在する（June et al., 2018）。
これらの特徴を改善するために、およびＣＡＲ－Ｔ機能を増強するために、多くの努力が注がれてきた。例としては、数ある中でも、シグナル伝達ドメインの再構成（Sadelain M., et al., Nature 545, 423-431 (2017)）、様々なＣＡＲ－Ｔ構成成分、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または膜貫通領域の操作（Sadelain et al., 2017）、ブースト因子の過剰発現（Lynn RC., et al., Nature 576, 293-300 (2019)）、および免疫調節因子またはウイルスベクターの同時投与（Ma L., et al., Science 365, 162-168 (2019)）が挙げられる。いくつかの研究は、共刺激ドメインを変えることまたはＣＡＲ結合親和性を低下させることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞機能および持続性の改善を試験した（Ghorashian S., et al., Nature Medicine 25, 1408-1414 (2019)；Savoldo B., et al., The Journal of Clinical Investigation 121, 1822-1826 (2011)）。それにもかかわらず、持続性は、依然としてＣＡＲ－Ｔ細胞の大きな課題である。
それ故、免疫拒絶反応リスクの低下、疲弊の軽減ならびに持続性およびエフェクター機能の増強を示すＣＡＲ Ｔ療法を可能にする、改善されたＣＡＲ－Ｔを操作するための手法が、緊急に必要とされている。
したがって、本発明の目的は、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞を操作するための組成物および方法を提供することである。
本発明の別の目的は、より安定したＣＡＲ発現を示す、ＣＡＲ Ｔ細胞を提供することである。
本発明の別の目的は、培養下およびｉｎ ｖｉｖｏで、より持続性が高いＣＡＲ Ｔ細胞を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞傷害活性の増大および疲弊の軽減を示す、ＣＡＲ Ｔ細胞を提供することである。
本発明のさらなる目的は、所望の表現型を有するＣＡＲ Ｔバリアントの生成および選択のための効率的なハイスループットＣＡＲ－Ｔ操作のための方法を提供することである。
Neelapu SS., et al., N Engl J Med., 377(26):2531-2544 (2017) Porter DL., et al., N Engl J Med., 365:725-733 (2011) Tang J., et al., Nat Rev Drug Discov., 17(11):783-784 (2018) Fry TJ., et al., Nat Med., 24(1):20-28 (2018) Ahmed N., et al., JAMA Oncology 3:1094-1101 (2017) Raje N., et al., N Engl J Med., 380:1726-1737 (2019) Brudno, JN. and Kochenderfer JN., Nature reviews Clinical oncology 15, 31(2018) Reinhard K., et al, Science 367, 446-453 (2020) June CH., et al., Science 359, 1361-1365 (2018) Porter DL., et al., Sci Transl Med. 7(303):303ra139 (2015) Gardner R., et al., Blood, 27(20):2406-10 (2016) Sadelain M., et al., Nature 545, 423-431 (2017) Lynn RC., et al., Nature 576, 293-300 (2019) Ma L., et al., Science 365, 162-168 (2019) Ghorashian S., et al., Nature Medicine 25, 1408-1414 (2019) Savoldo B., et al., The Journal of Clinical Investigation 121, 1822-1826 (2011)
発明の概要
ＣＡＲの単純かつ効率的な標的化ノックインおよび個々の遺伝子の同時ノックアウトを可能にする細胞ゲノム操作（例えば、Ｔ細胞操作）のための組成物および方法が提供される。組成物および方法は、所望の表現型（例えば、改善された持続性）を示すＣＡＲ Ｔ細胞バリアントの大規模並行操作、選択および同定、ならびにＣＡＲ－Ｔ療法におけるそれらのその後の使用に、特に応用できる。
１つまたは複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、５’相同アーム、ｃｒＲＮＡ発現カセット、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセット、および３’相同アームを含む、ＡＡＶベクターが提供される。概して、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする配列に作動するように連結されたプロモーター（例えば、Ｕ６）を含む。ＣＡＲ発現カセットは、ＣＡＲをコードする配列に作動するように連結された、プロモーター（例えば、ＥＦＳプロモーター）および／またはポリアデニル化シグナル配列を含み得る。好ましくは、ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットは、５’相同アームと３’相同アームの間に位置する。一部の実施形態では、相同アームは、ＴＲＡＣ遺伝子座内の部位と相同である。
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡである、２つのガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子座内の部位を標的とし、その一方で第２のガイドＲＮＡは、ゲノム内の任意の部位を標的とする。例えば、第２のガイドＲＮＡは、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞共刺激、メモリーＴ細胞分化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、エピジェネティック調節、適応免疫応答、腫瘍細胞に対する免疫応答、他の免疫機能、またはこれらの組合せに関与する遺伝子を標的とし得る。
ＣＡＲを、任意の所望の抗原またはリガンドを標的とする（例えば、それを認識するまたはそれに結合する）ように設計することができる。好ましくは、ＣＡＲは、１つまたは複数のがん特異的またはがん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたは抗ＣＤ２２ ＣＡＲである。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号１または配列番号２に対して７５％またはそれより高い配列同一性を有する配列を含む。組成物および方法において使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶの天然に存在する血清型、または人工バリアントであり得る。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９である。
ＡＡＶベクターのライブラリーも記載される。ライブラリーは、複数のＡＡＶベクターを含有し得る。一部の実施形態では、ライブラリー内の各ベクターは、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードするｃｒＲＮＡ発現カセットを独立して含有する。好ましい実施形態では、ライブラリー内の全てのベクターは、同一の第１のガイドＲＮＡ（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ）を有する。一部の実施形態では、ライブラリー内の各ベクターは、複数のＡＡＶベクターにわたって特有のものである第２のガイドＲＮＡを含有する。ライブラリーは、約１００～約３００，０００、約１，０００～約５，０００、または約５０００～約１０，０００の別個のガイドＲＮＡを全体として含有する。
ベクターおよびそれらのライブラリーを含有する細胞も提供される。例えば、細胞の集団は、上述のベクターのいずれかを含有し得る。ライブラリーを全体として含有する、細胞の集団も提供される。一部の実施形態では、集団内の各細胞は、ライブラリーに含まれる多くて１つまたは２つのＡＡＶベクターを含有する。
ベクターおよびそれらのライブラリーを使用する方法も記載される。例えば、ベクターおよびライブラリーを使用して、ハイスループットスクリーニングを行うことができる。例示的な方法は、ＣＡＲを含有する細胞の所望の表現型を増強する１つまたは複数の遺伝子を同定するステップを含む。概して、方法は、（ａ）ベクターのライブラリーを全体として含有する細胞の集団を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットのゲノム組込みならびにその中にコードされているガイドＲＮＡおよびＣＡＲの発現に好適な条件下で接触させるステップ；ならびに（ｂ）所望の表現型を示す細胞を選択するステップを含む。好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットは、ＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれる。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするウイルスベクターによって、またはエンドヌクレアーゼタンパク質もしくはエンドヌクレアーゼタンパク質－ＲＮＡ複合体の直接電気穿孔によって、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを細胞に導入することができる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとして、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを提供することもできる。ｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１ψ）、および５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）；５’キャップ；ポリ（Ａ）テール；１つもしくは複数の核局在化シグナル；またはこれらの組合せなどの、改変を含有し得る。ｍＲＮＡは、真核細胞における発現のために最適化されたコドンであり得、例えば、電気穿孔、トランスフェクション、および／またはナノ粒子媒介送達によって細胞に導入することができる。好ましいＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、またはそのバリアント、誘導体もしくは断片、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２に由来するＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１、改善されたバリアント、例えばｅｎＡｓＣｐｆ１を含む）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆｌ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆｌ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１）、またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ（ＰｄＣｐｆ１）などである。
方法は、任意の望ましい特徴または表現型を示す細胞の同定に好適である。スクリーニングまたは選択され得る例示的な表現型としては、腫瘍／腫瘍微小環境浸潤の増加、標的細胞親和性の増加または最適化、標的細胞への細胞傷害性の増大、持続性の増大、拡大／増殖の増加、疲弊の軽減、抗がん代謝機能の向上、免疫回避を防止する能力の増大、非特異的サイトカイン産生の低減、オフターゲット毒性の低下、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の軽減（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで導入されたとき）、およびこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、所望の表現型を有する細胞は、細胞の集団を、標的細胞と、十分な選択に好適な任意の期間、共培養することにより選択される。これは、規定された期間、例えば、約１～約６０日であり得る。細胞は、この期間の間、繰り返し共培養され得る（例えば、標的細胞の新しいバッチが共培養物に定期的に添加され得る）。概して、標的細胞は、ＣＡＲにより認識される１つまたは複数の抗原を発現する。一部の実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、所望の表現型を有する細胞は、フローサイトメトリーに基づくもしくは親和性に基づく選別、免疫マーカーに基づく選択、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍浸潤（例えば、細胞の集団を、対象内の標的細胞、例えば腫瘍細胞に、十分な選択を可能にする期間、曝露すること）、ＣＡＲ－抗原相互作用、指向性進化、またはこれらの組合せにより、選択される。
方法は、選択された細胞に存在するｃｒＲＮＡ発現カセットを同定するステップをさらに含み得る。そのような同定は、選択された細胞のゲノムＤＮＡ（例えば、ゲノム組込み領域におけるまたはその付近における）をシークエンシングすることにより達成することができる。選択された細胞に存在するｃｒＲＮＡ発現カセットが分かったら、所望の表現型を増強する遺伝子を、ｃｒＲＮＡ発現カセットによりコードされるガイドＲＮＡの標的とされる遺伝子として同定することができる。
組成物および方法において使用される細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、およびエフェクターメモリーＴ細胞；ＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｆｈ細胞、およびＴｒｅｇ細胞；またはガンマ－デルタＴ細胞／ｇｄＴ細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、または他の免疫細胞であり得る。
例えば、上述の方法に従って改変され得る、単離された細胞が、記載される。例えば、ＣＡＲを発現し、上記のスクリーニング方法により同定される１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異も有する単離されたＣＡＲ Ｔ細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞を、スクリーニング方法により選択し、単離することができるか、または細胞を、目的のＣＡＲを発現するようにおよびスクリーニングにより同定された１つもしくは複数の遺伝子の１つもしくは複数の突然変異を含有するように細胞を改変することにより、独立して生成することができる。突然変異は、遺伝子またはその遺伝子産物の部分的または完全な機能喪失を引き起こし得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、表２または表３から選択される１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異を含有する。好ましい実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ、ＰＥＬＩ１、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２、ＬＡＩＲ１、ＵＳＢ１およびこれらの組合せから選択される遺伝子の１つまたは複数の突然変異を含有する。一部の実施形態では、単離されたＣＡＲ Ｔ細胞は、１つまたは複数の望ましい表現型（例えば、提供される方法で選択またはスクリーニングされる表現型）を示す。例えば、細胞は、１つまたは複数の遺伝子の突然変異を含まないＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、メモリーの増加、細胞増殖の増加、持続性の増大、標的細胞（例えば、がん細胞）に対する細胞傷害性の増大、Ｔ細胞最終分化の減少、および／またはＴ細胞疲弊の軽減を示し得る。細胞の集団は、単離された細胞を拡大することにより得ることができる。細胞の集団を、薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する医薬組成物も提供される。
処置の方法も提供される。例示的な方法は、疾患、障害または状態を有する対象を、上述の医薬組成物の有効量を対象に投与することにより処置することを含む。一部の実施形態では、疾患、障害または状態は、抗原の高度発現または特異的発現に関連している。概して、組成物中の細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、抗原を特異的に標的とするＣＡＲを発現する。組成物および方法に従って使用するために細胞を、任意の適切な供給源から得ることができる。例えば、一部の実施形態では、細胞を健康なドナーから得ることができる。一部の実施形態では、細胞を、疾患、障害または状態を有する対象から得ることができる。好ましくは、細胞は、ＣＡＲを発現させ、かつ１つまたは複数の遺伝子の所望の突然変異を含有するように遺伝子改変を受ける前に、ドナーまたは対象から得られる。
一部の実施形態では、疾患、障害または状態は、がん、炎症性疾患、ニューロン障害、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、感染性疾患、または自己免疫疾患である。
例示的ながんとしては、白血病またはリンパ腫、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、上述の処置方法のいずれかに従って処置されることになる対象は、ヒトであり得る。
図１は、ヒト初代Ｔ細胞における大量（mass）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作のためのＣＬＡＳＨ系の確立および特徴付けを示す。図１は、ＣＬＡＳＨのためのＡＡＶ構築物設計の略図である。ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットを、ＡＡＶ骨格における左および右ＴＲＡＣ相同アームの間に挿入した。図１は、ヒト初代ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＬＡＳＨ媒介性同時ＣＡＲ－ＴおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーノックインの略図も示す。ヒト初代ＣＤ８ Ｔ細胞に、４時間にわたるＣａｓ１２ａ ｍＲＮＡによる電気穿孔後に、ＡＡＶ－ＣＬＡＳＨ Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＡＡＶ６を形質導入した。ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ導入遺伝子は、ＡＡＶ媒介性ＨＤＲによるＴＲＡＣ遺伝子座への並列組込みを示す。 図２Ａは、ＲｅｎｅおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー設計を示す概略図である。免疫遺伝子カテゴリーサークルの図は、正確な比率で描かれてはいない。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーは、Ｒｅｎｅライブラリー全体ならびに追加の免疫遺伝子セットおよび追加の非標的化対照（ＮＴＣ）ｃｒＲＮＡを含有する。図２Ｂは、ＮＡＬＭ６細胞との継続的共培養によるＣＡＲ－Ｔ細胞持続性スクリーニングの略図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、電気穿孔後に８ラウンドにわたりＥ：Ｔ比＝０．２：１でＮＡＬＭ６と共培養した。刺激時点が時系列で指し示されている。図２Ｃ～図２Ｈは、ＮＡＬＭ６との反復した共培養後の、ベクターおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるメモリー、細胞傷害性および疲弊マーカー発現の定量化を示す棒グラフである。ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋（図２Ｃ）、ＩＦＮγ＋（図２Ｄ）、ＴＮＦα＋（図２Ｅ）、ＰＤ－１＋（図２Ｆ）、ＬＡＧ３＋（図２Ｇ）およびＴＩＧＩＴ＋（図２Ｈ）細胞のパーセンテージの定量化を各群において示す（感染複製、ｎ＝３）。独立両側性ｔ検定を使用して、有意性を評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。 同上。 図３Ａ～図３Ｂは、対数正規化されたｃｒＲＮＡ存在量の差を使用した、０日目試料に対する３２日目（図３Ａ）または５４日目（図３Ｂ）試料由来のスクリーニング解析を示すグラフである。図３Ｃ～図３Ｋは、候補遺伝子毎にベクター対照と比較した、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋（図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ）、ＩＦＮγ＋（図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ）およびＴＮＦα＋（図３Ｉ、図３Ｊ、図３Ｋ）ＣＡＲ－Ｔ細胞パーセンテージの定量化を示すグラフである。５日間にわたる電気穿孔の後に、マーカー発現レベルを測定した。ダネット多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的有意性を評価した。図３Ｌは、１４日目のＣＡＲ－Ｔ細胞対がん細胞比の定量化を示すグラフである（プールされた脾臓および骨髄試料；ｎ＝６匹のマウス、１２種の試料）。マン・ホイットニー検定を使用して、有意性を評価した。図３Ｍは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（３２日目および５４日目）およびｉｎ ｖｉｖｏ（７日目、１１日目および１４日目）ＣＬＡＳＨ－Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ実験の間の重複する上位ｃｒＲＮＡのベン図である。ＦＤＲ＝５％ ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ Ｐ＞０．０５。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。 同上。 同上。 図４Ａ～図４Ｔは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ Ｔ細胞の特徴付けを示す。図４Ａは、ＰＲＤＭ１タンパク質一次構造の略図であり、２個の異なるＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡの切断部位が、それぞれＰＲドメインおよびジンクフィンガードメインに指し示されている。予測されるＰＲＤＭ１－ｃｒ１およびＰＲＤＭ１－ｃｒ２切断部位は、赤色の矢印によって指し示される。３種のｑＰＣＲプローブ標的部位は、青色の矢印によって指し示される。図４Ｂは、異なる健康なドナーおよびＣＡＲ－Ｔ形態においてＰＲＤＭ１－ｃｒ１／ｃｒ２によって標的化されるゲノム遺伝子座における総インデルパーセンテージの定量化を示すグラフである。５日間にわたりベクターまたはＰＲＤＭ１－ｃｒ１／ｃｒ２ ＡＡＶ６によって処置されたＣＡＲ－Ｔ細胞からゲノムＤＮＡを単離した（技術的複製、ｎ＝３）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図４Ｃ～図４Ｄは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１－ｃｒ１（図４Ｃ）およびＰＲＤＭ１－ｃｒ２（図４Ｄ）によって標的化されるゲノム領域において観察される特有のバリアントを示す、Ｎｅｘｔｅｒａ－ＮＧＳシークエンシング結果を示す。各遺伝子型に対応する総リードのパーセンテージが、右の青色のボックスに指し示されている。赤色の矢じりは、予測される切断部位を指し示す。３回の感染複製から代表的な試料のデータの１つを示した。図４Ｅ～図４Ｍは、ベクターまたはＰＲＤＭ１－ｃｒ１／ｃｒ２突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ＋（図４Ｅ）、ＣＣＲ７＋（図４Ｆ）、ＣＤ２８＋（図４Ｇ）、ＩＬ７ＲＡ＋（図４Ｈ）、ＴＮＦα＋（図４Ｉ）、ＩＦＮγ＋（図４Ｊ）、グランザイムＢ＋（図４Ｋ）、ＬＡＧ３＋（図４Ｌ）およびＴＩＭ３＋（図４Ｍ）細胞のパーセンテージの定量化を示すグラフである（感染複製、ｎ＝３）。チューキー多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡによって全実験を解析して、有意性を評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ ＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ ｐ＞０．０５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図４Ｎ～図４Ｏは、５日間にわたるベクターまたはＰＲＤＭ１－ｃｒ１ ＡＡＶ６による形質導入後の、異なる健康なドナー（ｎ＝５）におけるＣＣＲ７＋（図４Ｎ）およびＣＤ６２Ｌ＋（図４Ｏ）の頻度の定量化を示すグラフである。対応のあるＴ検定を使用して、有意性を評価した。＊＊Ｐ＜０．０１。図４Ｐ～図４Ｑは、ドナー２（図４Ｐ）およびドナー０２８６（図４Ｑ）における、５日間にわたる電気穿孔の後のマイトマイシン－Ｃ前処置ＮＡＬＭ６細胞による刺激に応答した、ＣＬＡＳＨ生成ＰＲＤＭ１および対照ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、別々にベクターまたはＰＲＤＭ１－ｃｒ１ ＡＡＶ６で形質導入した（細胞培養複製、ｎ＝３）。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、有意性を評価した、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図４Ｒは、各ラウンドにおけるＮＡＬＭ６細胞刺激に応答したベクターおよびＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＦＮγタンパク質発現の時間経過解析を示すグラフである。チューキー多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、有意性を評価した。各時点でのベクターおよびＰＲＤＭ１群の間の比較も行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図４Ｓ～図４Ｔは、ＮＡＬＭ６とドナー２（図４Ｓ）およびドナー０２８６（図４Ｔ）による７ラウンドの共培養後の死滅アッセイによる、ベクターおよびＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を示すグラフである。ＧＦＰおよびルシフェラーゼ遺伝子で安定に形質導入されたＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞を標的細胞として使用した、異なるＥ／Ｔ比でのバイオルミネセンスアッセイによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を測定した。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、有意性を評価した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 図５Ａ～図５Ｌは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔが、ｉｎ ｖｉｖｏで増強された治療有効性を有することを示す。図５Ａは、実験設計の略図である。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍能力を評価するために、マウスに、０日目に５×１０５個のＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞を注射した。ベクターもしくはＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞、または非形質導入ＣＤ８ Ｔ細胞を３日目に注入した。３～４日毎にマウスを撮像した。終結後に、脾臓、血液および骨髄をフローサイトメトリーによって解析した。図５Ｂは、正常ＣＤ８ Ｔ細胞、ベクターおよびＰＲＤＭ１ ＣＡＲ２２細胞を比較した、経時的な全身バイオルミネセンスシグナルの定量化を示すグラフである。図５Ｃは、正常Ｔ細胞、ベクターおよびＰＲＤＭ１－ＣＡＲ１９細胞を比較した、経時的な全身バイオルミネセンスシグナルの定量化を示すグラフである。図５Ａおよび図５Ｂにおいて、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、有意性を評価した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図５Ｄ～図５Ｆは、血液（図５Ｄ）、骨髄（図５Ｅ）および脾臓（図５Ｆ）におけるＣＡＲ－Ｔ細胞対がん細胞比の定量化を示すグラフである。マン・ホイットニー検定を使用して、有意性を評価した。図５Ｇ～図５Ｉは、血液（図５Ｇ）、骨髄（図５Ｈ）および脾臓（図５Ｉ）におけるメモリー様ＣＡＲ－Ｔ（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）パーセンテージの定量化を示すグラフである。図５Ｄ～図５Ｉ：ベクターＣＡＲ１９（ｎ＝８）およびＰＲＤＭ１ ＣＡＲ１９（ｎ＝８）。マン・ホイットニー検定を使用して、有意性を評価した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ Ｐ＞０．０５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図５Ｊ～図５Ｌは、腫瘍誘導後３日目にベクターまたはＰＤＲＭ１突然変異体ＣＤ２２ ＣＡＲ Ｔ細胞（図５Ｊ）、腫瘍誘導後８日目にベクターまたはＰＤＲＭ１突然変異体ＣＤ２２ ＣＡＲ Ｔ細胞（図５Ｋ）、および腫瘍誘導後３日目にベクターまたはＰＤＲＭ１突然変異体ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（図５Ｌ）のいずれかで処置された、白血病を有する動物の生存を示す生存曲線である。ｐＸＤ６０＝ベクター対照抗ＣＤ２２ ＴＲＡＣノックインＣＡＲ－Ｔ；ｐＸＤ６０－ＰＲＤＭ１＝ｃｒ－ＰＲＤＭ１ ＣＬＡＳＨ抗ＣＤ２２ ＴＲＡＣノックインＣＡＲ－Ｔ；ｐＸＤ７１＝ベクター対照抗ＣＤ１９ ＴＲＡＣノックインＣＡＲ－Ｔ；ｐＸＤ７１－ＰＲＤＭ１＝ｃｒ－ＰＲＤＭ１ ＣＬＡＳＨ抗ＣＤ１９ ＴＲＡＣノックインＣＡＲ－Ｔ。図５Ｊ～図５Ｌにおいて、ログランク（log-rank）検定を使用して、有意性を評価した、ｐ＜０．０００１。 同上。 同上。 同上。 図６Ａは、３３日目のＰＲＤＭ１突然変異体ｖｓ対照ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞に関する差次的に発現される遺伝子のボルケーノプロット（volcano plot）である。図６Ｂ～図６Ｃは、３３日目にｑ値閾値＜１ｅ－３でＰＲＤＭ１欠損ｖｓ対照ＣＡＲ－Ｔに関する差次的に上方調節された遺伝子（図６Ｂ）および差次的に下方調節された遺伝子（図６Ｃ）におけるＤＡＶＩＤ解析によって見出される、富化されたジーンオントロジー経路を示す富化プロットである。 同上。 図７Ａ～図７Ｂは、ＮＡＬＭ６細胞との共培養の第１、第３および第５ラウンドでのＣＬＡＳＨ生成ベクターおよびＰＲＤＭ１突然変異体ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ２８（図７Ａ）およびＩＬ７ＲＡ（図７Ｂ）陽性細胞のパーセンテージの定量化を示すグラフである（感染複製、ｎ＝３）。図７Ｃ～図７Ｊは、ＮＡＬＭ６細胞との共培養の第１、第３および第５ラウンドでのベクターおよびＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＫＬＦ２（図７Ｃ）、Ｓ１ＰＲ１（図７Ｄ）、ＴＢＸ２１（図７Ｅ）、ＦＯＸＯ１（図７Ｆ）、ＮＦＫＢ１（図７Ｇ）、ＳＴＡＴ１（図７Ｈ）、ＳＴＡＴ６（図７Ｉ）、ＣＤＣＡ７（図７Ｊ）およびＢＡＴＦ（図７Ｋ）に関するＲＴ－ＰＣＲ解析によるｍＲＮＡ発現の定量化を示すグラフである（感染複製、ｎ＝３）。図７Ｌ～図７Ｏは、ＮＡＬＭ６細胞との共培養の第１、第３および第５ラウンドでのベクターおよびＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＩＭ３／ＨＡＶＣＲ２（図７Ｌ）、ＬＡＧ３（図７Ｍ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４（図７Ｎ）およびＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１（図７Ｏ）陽性細胞のパーセンテージの定量化を示すグラフである（感染複製、ｎ＝３）。表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって評定した。全実験データをシダックの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡによって解析して、有意性を評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎ．ｓ Ｐ＞０．０５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示す。図７Ｐは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞における免疫学的表現型および関連遺伝子を示す概略図である。 同上。 同上。 同上。 同上。
発明の詳細な説明
「生きた薬」として、遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、診療所において強力かつ特異的な抗腫瘍活性が期待されている（Porter, DL., et al.,. N. Engl. J. Med., 365(8): 725-733 (2011)）。形質導入効率、導入遺伝子発現レベル、およびＣＡＲ安定性または保持は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の重要な態様である。しかし、旧来のレンチウイルス形質導入では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、それらの導入遺伝子を喪失する傾向があり、したがって、がん細胞を認識し、破壊する能力を喪失する傾向がある（Ellis, J., Human Gene Therapy., 16:1241-1246 (2005)）。それ故、ＣＡＲ－Ｔ持続性を操作することは、ＣＡＲ－Ｔにそれらの十分な力を持たせ、それによってｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を持たせるための、最も重要な仕事の１つになってきている。
実施例で示されるように、ハイスループット手法が、ＣＡＲ－Ｔ細胞における操作時にそれらの持続性および／または他の望ましい特徴を増強することができる因子を試験するために、開発された。この手法は、（１）どのようにして大規模並行様式でＣＡＲ－Ｔノックインを増加させるか；（２）どのようにして、バリアント全てにわたって、安定している標準化されたコアＣＡＲ構成成分を有するＣＡＲ－Ｔの異なるバリアント同士を正確に比較するか；（３）どのようにして同じ設定で高分解能での異なるＣＡＲバリアント間の定量的評価を確実にするか；（４）どのようにして検証ならびに下流の研究および開発のための最も有望な候補を考案または選択する機会を最大にする確率が高いＣＡＲ－Ｔ候補セットを目標とするかを含む、ＣＡＲ Ｔ操作におけるいくつかの技術的な障害に対処する。
これらの課題は、高効率大規模並行ＣＡＲ－Ｔ操作のプラットフォームの開発により克服される。このプラットフォーム、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１に基づく大規模ＡＡＶ－同時ＨＤＲノックインでの撹乱（Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１－ｂａｓｅｄ Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ＡＡＶ－ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ＨＤＲ－ｋｎｏｃｋｉｎ）（ＣＬＡＳＨ）は、多機能のプールされたＡＡＶ形質導入によるＣｐｆ１ ｍＲＮＡ電気穿孔による簡単な手順で顧客所望規模のＣＡＲ－Ｔバリアントの迅速な生成を可能にする。実施例は、ＣＬＡＳＨ法によって、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１系により撹乱された１つの追加の候補免疫調節因子を用いてゲノム内の所望の遺伝子座に各々がノックインされたライブラリー規模のＣＡＲ－Ｔが生成されたことを実証する。ＣＡＲ－Ｔバリアントのライブラリーを、ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗原特異的がん細胞の長期共培養系を使用することにより体系的にアッセイし、それによって、長期持続性を有する候補ＣＡＲ－Ｔバリアントを同定した。これらのトップバリアントの再操作および検証によって、それらが、メモリー様表面マーカーおよび／または細胞傷害性サイトカイン放出を増加させることによりＣＡＲ－Ｔ細胞持続性を増強することが、個々に示された。これらの中で、ＰＲＤＭ１－突然変異型ＣＡＲ－Ｔは、白血病のマウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでメモリー細胞の潜在能力、寿命、増殖、および持続性を増大させ、これは治療有効性を意味した。以上のことから、ＣＬＡＳＨは、他の所望の特徴への応用のための多用途性を維持しながら、持続性の合理的最適化のためのＣＡＲ－Ｔの迅速で効率的で高度にスケーラブルな操作を実証する。
Ｉ．定義
ゲノム改変の文脈での「導入する」は、接触させることを指す。例えば、遺伝子編集組成物（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＡＡＶベクターを含有する）を細胞に導入することは、細胞と組成物との接触をもたらすことである。用語は、任意の好適な手段による、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、ナノ粒子送達などによる、細胞の内部への接触組成物の透過を包含する。
「相同（の）」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占有されているとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンにより占有されている場合には、それらの分子は、その位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、比較される位置の数で割った２つ配列により共有されるマッチするまたは相同の位置の数×１００である関数である。例えば、２つの配列中の位置の１０カ所のうちの６カ所がマッチしているまたは相同である場合には、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％相同性を共有する。一般に、比較は、最大の相同性が得られるように２つの配列がアラインメントされたときに行われる。
用語「作動可能に連結された」または「作動するように連結された」は、調節配列と異種核酸配列との、それらがそれらの意図された様式で機能することを可能にする（例えば、後者の発現を生じさせる結果となる）、機能的連結を指す。用語は、調節領域と核酸内に転写されることになる配列とを、そのような配列の転写および翻訳に影響を与えるような位置に置くことを包含する。例えば、コード配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、概して、プロモーターの下流側１～約５０ヌクレオチドの間に位置する。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドほども上流側に、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチドほども上流側に、位置することもある。プロモーターは、概して、コア（基本）プロモーターを少なくとも含む。
「内因性の」は、生物、細胞、組織もしくは系の内部からの、またはその内部で産生される、任意の材料を指す。「外因性の」は、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入される、またはその外部で産生される、任意の材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を包含する。「発現ベクター」または「発現カセット」は、発現されることになるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を有する組換えポリヌクレオチドを含有するベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含有し、発現のための他のエレメントは、宿主細胞により、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系内に、供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドに組み込まれる、当技術分野において公知の全てのもの、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含有されている）、ファージミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するベクター）を含む。
用語「相同組換え修復」またはＨＤＲは、ＤＮＡ鎖の切断されたまたはニッキングされた末端が相同鋳型核酸からの重合により修復される細胞プロセスを指す。したがって、元の配列は、鋳型の配列と置き換えられる。相同鋳型核酸は、ゲノム内のどこか（姉妹染色分体、相同染色体、または同じもしくは異なる染色体上の反復領域）の相同配列により提供され得る。あるいは、外因性鋳型核酸を導入して、配列の標的部位でのＨＤＲにより誘導される特異的変化を達成することができる。このようにして、特異的突然変異を切断部位に導入することができる。
「突然変異」は、所与の参照配列からの変更に至る、ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）配列の変化を指す。突然変異は、少なくとも１つのデオキシリボ核酸塩基、例えば、プリン（アデニンおよび／またはグアニン）および／またはピリミジン（チミン、ウラシルおよび／またはシトシン）の、欠失、挿入、重複および／または置換であり得る。突然変異は、対象の観測可能な特質（表現型）の識別可能な変化を生じさせることも、生じさせないこともある。
用語「抗原」は、抗体またはＴ細胞受容体（例えば、ＣＡＲ）が結合することができる分子を指す。一部の実施形態では、抗原は、免疫応答を誘発することができる。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫適格細胞の活性化のどちらか、または両方を引き起こし得る。タンパク質またはペプチドを含む、いずれの高分子も、抗原としての機能を果たし得ることは、当業者には理解されるであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。したがって、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むいずれのＤＮＡも、「抗原」をコードすることは、当業者には理解されるであろう。さらに、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによりコードされる必要がないことは、当業者には理解されるであろう。さらに、抗原が「遺伝子」によりコードされる必要が全くないことは、当業者には理解されるであろう。抗原を合成することができるか、または生体試料から得ることができる。そのような生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液を挙げることができるが、これらに限定されない。がんの文脈で、「抗原」は、腫瘍細胞において産生される、それ故、宿主において免疫応答を誘発し得る、抗原性物質を指す。これらのがん抗原は、処置または治療中に潜在的候補／標的になる可能性がある腫瘍細胞を同定するためのマーカーとして有用であり得る。いくつかのタイプのがんまたは腫瘍抗原がある。腫瘍細胞上にのみ存在し健康な細胞上には存在しない、がん／腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、ならびに腫瘍細胞内に存在し一部の正常細胞上にも存在する、がん／腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）がある。一部の実施形態では、ＴＡＡは、非がん性細胞におけるよりもがん細胞において豊富に発現される。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、腫瘍特異的抗原に対して特異的である。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、腫瘍関連抗原に対して特異的である。
「二重特異性キメラ抗原受容体」は、２つの抗原結合ドメインを含むＣＡＲであって、第１のドメインが第１のリガンド／抗原／標的に対して特異的であり、第２のドメインが第２のリガンド／抗原／標的に対して特異的である、ＣＡＲを指す。一部の実施形態では、リガンド／抗原／標的は、Ｂ細胞特異的タンパク質、腫瘍特異的リガンド、腫瘍関連リガンド、またはこれらの組合せである。二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的である。多重特異性または多価ＣＡＲは、１つより多くの異なる抗原、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多く、に特異的である。一部の実施形態では、多重特異性または多価ＣＡＲは、３つもしくはそれより多くの異なる抗原を標的とする、および／またはそれらを結合する。
「コードすること」または「コードする」は、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ中の、ヌクレオチドの特異的配列の固有の特性であって、生物学的プロセスにおいてヌクレオチドの規定された配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の規定された配列のどちらかを有する他のポリマーおよび高分子の合成の鋳型としての役割を果たす特性およびそれらの結果として生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により細胞または他の生物システムにおいてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写に鋳型として使用される、そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。
用語「標的核酸」、「標的配列」、および「標的部位」は、ｇＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズするように設計される、核酸配列を指す。標的核酸は、標的に方向付けられた対応するオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的である配列を有する。標的核酸または標的部位は、オリゴヌクレオチドが方向付けられる、より大きい核酸の特異的配列を、または配列全体（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）を指し得る。使い方の違いは、文脈から明らかであろう。
用語「遺伝子座」は、染色体上のＤＮＡ配列の（例えば、遺伝子の）特異的な物理的位置である。用語「遺伝子座」は、染色体上のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ標的配列の特異的な物理的位置を指し得る。そのような遺伝子座は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにより認識および／または切断される標的配列を含み得る。目的の遺伝子座が、細胞の遺伝子材料の本体に（例えば、染色体に）、およびまた遺伝子材料の前記本体に対して独立して存在し得る遺伝子材料の一部分に、例えば、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、または非限定的な例としてミトコンドリアなどの細胞小器官に、存在する核酸配列を含み得ることは、理解される。
「単離された」は、天然の状態から変更または除去されたという意味である。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離された」ものではないが、その天然の状態の共存材料から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれと隣接している配列から分離された核酸セグメントまたは断片、例えば、それが天然に存在するゲノム内でその断片に通常は隣接している配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。用語は、核酸に天然に付随する他の構成成分（例えば、細胞内で天然にそれに付随する、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、用語は、例えば、ベクターに、自立複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている、あるいは他の配列から独立して別々の分子として（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化により産生される、ｃＤＮＡ、またはゲノムもしくはｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡを含む。
細胞の文脈で、用語「単離された」は、その天然の状態から変更または除去された細胞を指す。したがって、単離された細胞は、細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にあり、例えば、その天然の環境から、例えばそれが自然界では見られない濃度に濃縮することにより、分離されている。「単離された細胞」は、目的の細胞が実質的に富化された、および／または目的の細胞が部分的にもしくは実質的に精製されている試料中にある細胞を含むように意図されている。
用語「形質転換された」、「形質導入された」、および「トランスフェクトされた」は、当技術分野において公知のいくつかの技法のうちの１つによる細胞への核酸または他の材料の導入を包含する。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物（composition of matter）である。ベクターの例としては、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合しているポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自立複製プラスミドまたはウイルスを含む。用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への移入を助長する非プラスミドおよび非ウイルス性化合物を含むように解釈される。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じて、配列をアラインメントし、ギャップを導入した後、参照核酸配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを言い表す。配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターは、公知の方法により決定することができる。
所与の核酸もしくはアミノ酸配列Ｄに対する、Ｄとの、またはＤに対しての、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｃの配列同一性％（これは、その代わりに、所与の配列Ｄに対する、Ｄとの、またはＤに対しての、ある特定の配列同一性％を有するまたは含む所与の配列Ｃと、表現されることもある）は、以下のように算出される：
１００掛ける分数Ｗ／Ｚ
（ここで、Ｗは、配列アラインメントプログラムによってそのプログラムのＣとＤのアラインメントで同一マッチとしてスコアリングされるヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である）。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤに対する配列同一性％がＤのＣに対する配列同一性％と等しくならないことは、理解されるであろう。
用語「対象」は、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫および任意の他の生物もしくは実体を含むが、これらに限定されない。対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、雌ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯動物）、魚、鳥、爬虫類、または両生類であり得る。用語は、特定の年齢も性別も示さない。したがって、成体および新生児対象はもちろん胎児も、雄または雌を問わず、網羅されるように意図されている。患者は、疾患または障害に罹患している対象を指す。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
用語「阻害／抑止する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「低減／低下／軽減する（ｒｅｄｕｃｅ）」およびこれらの語の他の形、例えば、「阻害／抑止すること」または「低減／低下／軽減すること」は、特定の特質、例えば、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを、減少させること、妨げること、または抑えることを意味する。これは、概して、一部の標準値または期待値に対してのものであるが、必ずしも標準値または相対値を言及する必要はないことは、理解される。「阻害／抑止する」または「低減／低下／軽減する」はまた、標準または対照と比べてタンパク質の合成、発現または機能を妨げるまたは抑えることを意味し得る。阻害／抑止（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）／低減／低下／軽減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、活性、応答、状態または疾患の完全な除去を含み得るが、これらに限定されない。例えば、用語は、天然または対照レベルと比較して活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの１０％低下を包含する。一部の実施形態では、低下は、天然または対照レベルと比較して、約１～１００％もしくはその中の整数、または間の任意の量の低下であり得る。
「処置」または「処置すること」は、望まない状態（例えば、がん）を有する対象または系に組成物を投与することを意味する。状態は、疾患、病的状態、または障害の１つまたは複数の症状を含み得る。処置は、疾患、病的状態、または障害を治癒、軽快、安定化または予防する目的での対象の医学的管理を含む。これは、積極的処置、すなわち、特に疾患、病的状態、または障害の改善に向けて行われる処置を含み、原因処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の原因の除去に向けて行われる処置も含む。加えて、この用語は、緩和的処置、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりむしろ症状の緩和のために計画された処置；予防的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の発症を最小限に抑えること、または部分的にもしくは完全に抑止することを対象にする処置；および支持的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の改善に向けて行われる別の特定の治療を補うために用いられる処置を含む。処置は、疾患、病的状態、または障害を治癒、軽快、安定化または予防することを意図しているが、実際に治癒、軽快、安定化または予防をもたらす必要がないことは、理解される。処置の効果を、当技術分野において含まれる疾患、病的状態または障害に好適であると記載されるようにおよび公知であるように、測定または評定することができる。そのような測定および評定は、定性的および／または定量的観点から行うことができる。したがって、例えば、疾患、病的状態、もしくは障害の特質もしくは特徴、および／または疾患、病的状態、もしくは障害の症状を、任意の効果に軽減または任意の量に低減することができる。
「予防」または「予防すること」は、望まない状態（例えば、がん）のリスクがある対象または系に組成物を投与することを意味する。状態は、疾患、病的状態、または障害の１つまたは複数の症状を含み得る。状態はまた、疾患、病的状態、または障害に対する素因であり得る。対象への組成物の投与の効果は、状態の特定の症状の停止、状態の症状の軽減もしくは予防、状態の重症度の低下、状態の完全な除去、特定の事象もしくは特質の発生もしくは進行の安定化もしくは遅延、または特定の事象もしくは特質が生じる機会の低減であり得る。
用語「有効量」または「治療有効量」は、処置される障害、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状を和らげるもしくは軽快させるのに、または所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を別様に提供するのに十分な量を意味する。そのような軽快は、軽減または変更のみを必要とし、必ずしも消失を必要としない。正確な量は、様々な要因、例えば、対象に依存する可変要素（例えば、年齢、免疫系の健康、体重など）、処置される疾患または障害はもちろん、投与経路、ならびに投与される薬剤の薬物動態および薬力学によっても変わることになる。
「薬学的に許容される」は、生物学的にまたは別様に望ましくないものではない材料を意味する。例えば、材料を、いずれの望ましくない生物学的効果を生じさせることも、医薬組成物に含有されている医薬組成物の他の構成成分のいずれかと有害に相互作用することもなく、選択された化合物と共に対象に投与することができる。
値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各別々の値に個々に言及する省略表現方法として役立つことを意図したものに過ぎず、各別々の値は、それが本明細書において個々に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。
用語「約」の使用は、述べられる値の上下どちらかのおおよそ＋／－１０％の範囲の値を記述することを意図したものであり、他の実施形態では、値には、述べられる値の上下どちらかのおおよそ＋／－５％の範囲の値の幅があり得る。
ＩＩ．組成物
方法における使用のための組成物が提供される。例えば、細胞のゲノムを改変する方法における使用のための遺伝子編集組成物が提供される。例示的な組成物としては、核酸ベクター、そのライブラリー、ならびにベクターおよびそのライブラリーを含有する細胞が挙げられる。改変された細胞を含有する医薬組成物も提供される。
Ａ．遺伝子編集組成物
細胞のゲノムを改変するための例示的な遺伝子編集組成物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む。ベクターは、エンドヌクレアーゼを１つもしくは複数の標的遺伝子に方向付ける１つもしくは複数のｃｒＲＮＡをコードする配列（例えば、ｃｒＲＮＡ発現カセット）、１つもしくは複数のキメラ抗原受容体をコードする配列（例えば、ＣＡＲ発現カセット）、および／または１つもしくは複数の標的部位と相同の１つもしくは複数の配列（例えば、ＴＲＡＣ）を含有し得る。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびベクターは、同じまたは異なる組成物中にあり得、細胞に一緒にまたは別々に導入され得る。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびベクターは、細胞に一緒にまたは別々の導入される、異なる組成物で提供され得る。一部の実施形態では、遺伝子編集組成物が、単離された核酸として投与される、または発現ベクター内に含有される場合、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）は、ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットと同じ核酸またはベクターによりコードされ得る。あるいは、または加えて、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットをコードするベクターとは物理的に別々の核酸またはベクター内にコードされ得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの導入後、ＡＡＶベクターは、直ちに、またはある特定の期間、例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、もしくは約９６時間後に、細胞に導入され得る。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、１つもしくは複数の標的遺伝子またはその遺伝子産物を変更する（例えば、その発現を増加もしくは低減する、および／またはその活性を増大もしくは低下させる）ことができる。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の標的遺伝子の破壊を引き起こすことができる。この破壊は、標的遺伝子または遺伝子産物の、発現の低減もしくは消滅、および／または活性の低下もしくは消滅につながり得る、ゲノムの変更（例えば、これらに限定されるものではないが、挿入、欠失、重複、転座、ＤＮＡまたはヒストンメチル化、アセチル化、およびこれらの組合せ）を含むが、これらに限定されない。遺伝子産物の発現および／または活性を決定する方法は、当技術分野において公知である。これらは、ＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット、ウエスタンブロット、ヌクレアーゼサーベイヤーアッセイ、シークエンシング、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ｍＲＮＡシークエンシング、シングルセルＲＮＡシークエンシング、ならびに他の分子生物学、化学的、生化学的、細胞生物学および免疫学アッセイを含むが、それらに限定されない。当業者には、当技術分野において公知の方法、および記載される教示に基づいて、どのようにして標的遺伝子の変更を決定および／または確認するかが理解されるであろう。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを、ウイルスおよび非ウイルス手法を含む様々な技法によって細胞に導入することができる。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））によって導入することができる。物理的および／または化学的方法などの非ウイルス手法も使用することができ、非ウイルス手法には、カチオン性リポソームおよびポリマー、ＤＮＡナノクルー（ＤＮＡ ｎａｎｏｃｌｅｗ）、遺伝子銃、マイクロインジェクション、トランスフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、パーティクルボンバードメント、超音波利用、マグネトフェクション、細胞透過性ペプチドとのコンジュゲーション、および／またはナノ粒子媒介送達が含まれるが、これらに限定されない。そのような方法は、例えば、Nayerossadat N., et al., Adv. Biomed. Res., 1:27 (2012)およびLino CA, et al., Drug Deliv., 25(1):1234-1257 (2018)に記載されている。各方法のそれぞれの長所および短所を考慮して、当業者は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの導入に最適な方法を決定することができるであろう。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、電気穿孔によって細胞に導入される。電気穿孔は、細胞膜への一対の電極の挿入による細胞膜の一時的な不安定化であり、その結果、不安定化された膜の周囲の培地中の核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、細胞の細胞質および核質内に透過することができることになる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼタンパク質またはエンドヌクレアーゼタンパク質－ＲＮＡ複合体（例えば、ｃｒＲＮＡと複合体化したエンドヌクレアーゼタンパク質）の直接電気穿孔によって導入することもできる。
好ましい実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの形態で細胞に提供することができる。ｍＲＮＡを改変しても、改変しなくてもよい。ｍＲＮＡを、例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの免疫原性を低下させるように、翻訳を最適化するように、ならびに／または安定性の増大および／もしくは発現の増加をもたらすように、改変することができる。改変されたｍＲＮＡは、核酸塩基、リボース糖、および／またはホスホジエステル連結への変化を含む、いくつかの化学的変化を、ヌクレオチドに組み込むことができる。これらの改変されたｍＲＮＡは、未改変ｍＲＮＡと比べて、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの効率を向上させ、オフターゲット効果を低下させ、毒性を低下させ、エンドヌクレアーゼタンパク質レベルを上昇させ、エンドヌクレアーゼ活性を増大させ、および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させることができる。Li, B., et al., Nat. Biomed. Eng., 1(5): pii: 0066 (2017)およびＷＯ２０１７／１８１１０７には、組成物および方法に従って使用され得るｍＲＮＡを改変する組成物および方法が開示されている。
例示的なｍＲＮＡ改変は、限定せずに、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１ψ）、および５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５’キャップ、ポリ（Ａ）テール、１つもしくは複数の核局在化シグナル、またはこれらの組合せを含む。
ｍＲＮＡを、真核細胞（例えば、植物、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト哺乳動物もしくは霊長類に由来する細胞）における発現のためにコドン最適化することができる。コドン最適化は、タンパク質産生を増加させることを目的として、目的の細胞型においてより高頻度に使用される同義コドンへのレアコドンの変化を使用する、遺伝子操作手法を表す。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞における発現の増強のために、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、もしくは約１つより多くの、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれより多くのコドン）を、天然アミノ酸配列を維持しながらその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることにより、核酸配列を改変することを含む。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについての特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の相違）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、そしてまたその翻訳効率は、数ある中でも、翻訳されるコドンの特性、および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されたｔＲＮＡが細胞において優勢であることは、一般に、ペプチド合成で最も高頻度に使用されたコドンの現れである。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表をいくつかの仕方に適応させることができる。Nakamura, Y., et al., Nucl. Acids Res., 28:292 (2000)を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）も利用可能である。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする配列における１つまたは複数のコドンは、特定のアミノ酸に対して最も高頻度に使用されるコドンに相当する。
遺伝子編集組成物は、ライブラリー、例えば、ＡＡＶベクターのライブラリーも含む。ライブラリーは、同じでも、異なってもよい、複数のベクターの収集物であり得る。好ましい実施形態では、ライブラリーは、複数の異なるＡＡＶベクターを含有する。例えば、一部の実施形態では、ライブラリー中の全てのベクターは、同一の第１のガイドＲＮＡ（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ）を有し、さらに、ライブラリー中の各ベクターは、複数のＡＡＶベクターにわたって特有のものである第２のガイドＲＮＡも含有する。特有のガイドＲＮＡは、ベクター中またはベクターのライブラリー中のその種類の唯一のＲＮＡである（例えば、ガイドＲＮＡは、特定のヌクレオチド配列を有する唯一のものであり得る）。全体として、ライブラリーは、任意の数のガイドＲＮＡを含有し得る。例えば、ライブラリーは、ゲノム中のタンパク質コード遺伝子の全セットを全体として標的とするガイドＲＮＡを含有し得る（例えば、ヒトゲノムワイドライブラリー）。あるいは、ライブラリーは、遺伝子または部位の選択されたサブセットを標的とするガイドＲＮＡを含有し得る。一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号３～１２，１３４から選択される核酸配列によりコードされる複数のガイドＲＮＡを全体として含有する。好ましい実施形態では、ライブラリーは、配列番号３～４，０８７（Ｒｅｎｅライブラリー）または配列番号４，０８８～１２，１３４（Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー）の核酸配列によりコードされるガイドＲＮＡを全体として含有する。
ライブラリーは、同じ遺伝子を標的とする複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの）特有のガイドＲＮＡを含有し得る。好ましい実施形態では、ライブラリーは、代表的な数（例えば、１０００）の非標的化対照ガイドＲＮＡも含有する。好ましくは、ライブラリーは、標的とされることになる目的の遺伝子または部位全てを代表する総数のガイドＲＮＡを含有する。例えば、ガイドＲＮＡの数の上限は、現在プールされているオリゴヌクレオチド合成および／またはクローニング限界（例えば、約３００，０００の別個のガイドＲＮＡ配列）を反映し得る。一部の実施形態では、ライブラリーは、約１００またはそれより多くの別個のガイドＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ライブラリーは、約１０００、５０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５００００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３００００００、またはそれより多くの別個のガイドＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ライブラリーは、約１００～約３０００００の別個のガイドＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ライブラリーは、ライブラリーのベクターを全体として含有する、プラスミドの収集物またはウイルスの収集物の形態であり得る。
１．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」は、そのエンドヌクレアーゼ活性および特異性がＲＮＡ分子とのその関連性に依存する、ポリペプチドである。このＲＮＡ分子の全配列、またはより一般的には、このＲＮＡ分子の断片は、ゲノム中の標的配列を指定する能力を有する。一般に、このＲＮＡ分子は、標的配列をハイブリダイズするおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性を媒介する能力を有する。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても公知）、Ｃｐｆ１、これらのホモログ、またはこれらの改変バージョンが挙げられる。好ましいＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分であるＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）である。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）は、塩基配列の複数の、短い、直接の繰り返しを含有するＤＮＡ遺伝子座についての頭文字である。原核生物ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、原核生物における使用のための遺伝子編集（特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変化）のような使用に適応されている（例えば、Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013)およびJinek, et al., Science, 337(6096):816-21 (2012)を参照されたい）。ｃａｓ遺伝子と特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲとを含む必要エレメントを細胞に提供することにより、ゲノムを任意の所望の位置で切断および改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するゲノム編集における使用のための組成物を調製する方法は、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１４／０１８４２３において詳細に説明されており、これらは、それら全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
用語「Ｃａｓ」（ＣＲＩＳＰＲ関連）は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または複合体のエフェクタータンパク質を指す。用語「Ｃａｓ」は、そうでないことが明らかでない限り、用語「ＣＲＩＳＰＲ」タンパク質、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素」などと同義で使用され得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエフェクター、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓ酵素であり得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与する、またはその活性を方向付ける、転写物または他のエレメントであって、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ならびに当てはまる場合、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、「ダイレクトリピート」、およびｔｒａｃｒＲＮＡがプロセシングされた部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「スペーサー」とも呼ばれる）、またはその用語が使用される場合の「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などの、Ｃａｓを誘導するためのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および／またはトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を含む、転写物または他のエレメントを全体として指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。例えば、Shmakov et al. (2015) "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems," Molecular Cell, DOI: dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008を参照されたい。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、限定せずに、ＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質から選択される、Ｃａｓエフェクタータンパク質であり得る。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のエレメントが標的細胞に導入され、その結果、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現によって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が１つまたは複数の標的部位に方向付けられる。具体的な内容は、操作される異なるＣＲＩＳＰＲ系により様々であり得るが、全体的な方法論は類似している。ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してＤＮＡ配列を標的とすることに関心がある実行者は、標的配列を含有する短いＤＮＡ断片をガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入することができる。ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（約２０ヌクレオチド）、必要に応じてｔｒａｃｒＲＮＡ配列（足場）の形態、ならびに真核細胞における適切なプロセシングに好適なプロモーターおよび必要なエレメントを含有する。そのようなベクターは、市販されている（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅを参照されたい）。系の多くは、アニールされて二本鎖ＤＮＡを形成し、次いでｓｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングされる特別注文の相補的オリゴマーに依拠している。細胞におけるｓｇＲＮＡと適切なＣａｓ酵素の共発現は、所望の標的部位において一本鎖または二本鎖切断（Ｃａｓ酵素の活性に依存して）を生じさせる結果となる。
Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）
好ましい実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１を含有することが公知の任意の細菌種に由来する、Ｃｐｆ１オルソログ、バリアント、または操作された誘導体であり得る。例えば、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含めた属からの生物に由来し得る。より詳細には、一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、次の生物のうちの１つからのＣｐｆ１である：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ。
一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓおよびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅから選択される細菌種に由来するか、またはそれから単離される。好ましいＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆｌ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆｌ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ（ＢｐＣｐｆ１）、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ（ＬｉＣｐｆ１）、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ（ＰｃＣｐｆ１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ（ＰｍＣｐｆ１）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ（ＣＭｔＣｐｆ１）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ（ＥｅＣｐｆ１）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１）、またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ（ＰｄＣｐｆ１）に由来するＣｐｆ１、またはそのバリアント、誘導体もしくは断片である。好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１は、ＬｂＣｐｆ１、またはそのバリアント、誘導体もしくは断片である。
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、改変された、例えば、操作されたまたは天然に存在しないＣｐｆ１であり得る。改変体は、エフェクタータンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基の突然変異を含有し得る。突然変異は、エフェクタータンパク質の１つまたは複数の触媒活性ドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン、またはＲｕｖＣドメインと相同である触媒活性ドメイン）においてであり得る。エフェクタータンパク質は、１つまたは複数の突然変異を欠いているエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性の低下または消滅を有し得る。一部の実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の切断を目的の標的遺伝子座に方向付けない。
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変または突然変異アミノ酸残基は、ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸位置番号付けに準拠してＤ９１７Ａ、Ｅ１００６ＡまたはＤ１２５５Ａである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異アミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１におけるアミノ酸位置に準拠してＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３Ａであるか、またはＬｂＣｐｆ１におけるアミノ酸位置に準拠してＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０Ａである。
隣接残基において、例えば、ヌクレアーゼ活性に関与する上に示されたものの付近のアミノ酸において、突然変異を生じさせることもできる。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインのみが不活性化され、他の実施形態では、別の推定的ヌクレアーゼドメインが不活性化される。一部の実施形態では、２つのＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１バリアント（各々、異なるニッカーゼ）が、特異性を増大させるために使用される。例えば、２つのニッカーゼバリアントを使用して、ＤＮＡを標的において切断することができる（この場合、両方のニッカーゼがＤＮＡ鎖を切断するが、１本のＤＮＡ鎖のみが切断され、そしてその後修復される、オフターゲット改変を最小限に抑えるかまたは消失させる）。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、２つのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを含むホモ二量体として、目的の標的遺伝子座に付随するまたはそこにある配列を切断する。一部の実施形態では、ホモ二量体は、それらのそれぞれのＲｕｖＣドメインに異なる突然変異を有する、２つのＣｐｆ１エフェクタータンパク質を含有し得る。
一部の実施形態では、Ｃｐｆ１は、野生型タンパク質、ヒト化Ｃｐｆ１、バリアント、誘導体、断片、ドメインがシャフリングされたバージョン、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、第１のＣｐｆ１エフェクタータンパク質オルソログからの第１の断片と、第２のＣｐｆ１エフェクタータンパク質オルソログからの第２の断片とを有する、キメラＣｐｆ１エフェクタータンパク質であって、第１および第２のエフェクタータンパク質オルソログが異なる（例えば、異なる生物に由来する）、キメラＣｐｆ１エフェクタータンパク質であり得る。
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、１つまたは複数の異種機能的ドメイン、例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを有し得る。ＮＬＳドメインは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質の末端に、その付近に、またはそれに近接して位置し得る。異種機能的ドメインは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ６５、ＨＳＦ１、Ａｃｔｉｖ）、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ；ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、およびＤＮＭＴ３Ｌを含むＤＮＭＴファミリーメンバーのメチルトランスフェラーゼドメイン；またはＳＩＤドメイン（例えば、ＳＩＤ４Ｘ））、およびヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｆｏｋ１）も含む。異種機能的ドメインは、次の活性のうちの１つまたは複数を有し得る：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン改変活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、および核酸結合活性。異種機能的ドメインを、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、融合、連結、繋留または別様に会合させることができる。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、目的の標的遺伝子座にＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体の結合を方向付ける。一部の実施形態では、ＰＡＭは、ＮがＡ／Ｃ／ＧまたはＴであり、エフェクタータンパク質がＦｎＣｐｆ１ｐである、５’ＴＴＮであり；ＰＡＭは、ＶがＡ／ＣまたはＧであり、エフェクタータンパク質がＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１またはＰａＣｐｆ１ｐである、５’ＴＴＴＶである。一部の実施形態では、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’末端の上流側に位置する。Ｃｐｆ１ファミリーのＴリッチＰＡＭは、ＡＴリッチゲノムの標的化および編集を可能にする。
Ｃａｓ１２ａエフェクタータンパク質は、アデノシンまたはシチジンデアミナーゼに融合したｄＣｐｆ１、例えば、米国特許仮出願第６２／５０８，２９３号、同第６２／５６１，６６３号、および同第６２／５６８，１３３号、同第６２／６０９，９４９号、および同第６２／６１０，０６５号に記載されているものを、さらに含み得る。使用され得るさらなるＣａｓ１２ａエフェクタータンパク質は、国際特許出願番号ＷＯ２０１６／２０５７１１、ＷＯ２０１７／１０６６５７、およびＷＯ２０１７／１７２６８２において論じられている。
細胞内での様々なＲＮＡとの可能性のある非特異的相互作用またはオフサイト標的化に起因する、細胞内のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの潜在的な毒性を考慮して、いくつかの手法を採用して、Ｃｐｆ１などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、一時的に（例えば、ｍＲＮＡ電気穿孔）、理想的には、ガイドＲＮＡの寿命の間、細胞内へ誘導することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）を、細胞により産生される酵素による活性化によってまたは細胞内のそのポリペプチド構造の不安定化によって活性にされる安定化または不活性形態下で、発現させることができる。条件付きタンパク質安定を、例えば、非限定的な例として、タンパク質の立体構造変化が小分子により誘導されるＦＫＢＰ／ラパマイシン系に基づく、安定化／不安定化タンパク質へのエンドヌクレアーゼの融合により、得ることができる。エンドヌクレアーゼタンパク質に融合したタンパク質パートナーの化学的または光誘導二量体化を使用して、エンドヌクレアーゼをロックまたはアンロックすることもできる。
２．ベクター
遺伝子編集組成物に含めることまたは遺伝子編集組成物のエレメントを提供することに好適なベクターとしては、限定せずに、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）またはＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）に由来し得る。非常に多くのベクターおよび発現系が、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む商業的供給業者から市販されている。
好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは、１つまたは複数の細胞のゲノムを改変するための遺伝子編集組成物の構成成分として提供される。ＡＡＶベクターは、遺伝子編集組成物の１つまたは複数のエレメント（例えば、ｃｒＲＮＡ発現カセット、ＣＡＲ発現カセット、相同アーム）を提供することができる。
ＡＡＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系とｉｎ ｖｉｖｏ系の両方で治療用遺伝子を送達するために何年にもわたって活発に用いられている、非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスである（Choi, et al., Curr. Gene Ther., 5:299-310, (2005)）。ＡＡＶは、パルボウイルスファミリーに属し、他のウイルス、主としてアデノウイルス、との同時感染に依存して複製する。最初に血清学的に区別された、ＡＡＶ遺伝子の分子クローニングは、非常に多くの種において何百もの特有のＡＡＶ株を同定してきた。一本鎖ＤＮＡゲノムの各末端は、ゲノム複製およびパッケージングに必要とされる唯一のシス作用エレメントである逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有する。一本鎖ＡＡＶゲノムは、Ｒｅｐ（複製）、Ｃａｐ（カプシド）およびａａｐ（アセンブリー）という３つの遺伝子を含有する。これら３つの遺伝子は、３つのプロモーター、選択的翻訳開始部位、および差次的スプライシングの使用によって、少なくとも９つの遺伝子産物を生じさせる。これらのコード配列には、ＩＴＲが隣接している。Ｒｅｐ遺伝子は、４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードし、その一方で、Ｃａｐ発現は、ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ；ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３）を生じさせ、これは、ウイルスゲノムを保護するカプシド外殻を形成することはもちろん、細胞結合および内在化に積極的に関与する。ウイルス外皮は、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）のモル比でカプシドタンパク質を有する二十面体構造に配置された６０のタンパク質を含有すると推定される。
ウイルスＤＮＡを欠いている組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、本質的には、細胞膜を横断するように操作されたタンパク質に基づくナノ粒子であって、最終的に、そのＤＮＡカーゴを輸送し、細胞の核に送達することができる。Ｒｅｐタンパク質の非存在下で、ｒＡＡＶ内にコードされたＩＴＲ隣接導入遺伝子は、形質導入細胞の核内にエピソームとして存続する環状コンカテマーを形成し得る。組換えエピソームＤＮＡは、宿主ゲノムに組み込まれないため、ゆくゆくは、細胞が反復される複製ラウンドを経るにつれて経時的に希釈されることになる。これは、結局のところ導入遺伝子および導入遺伝子発現の喪失につながり、導入遺伝子喪失率は、形質導入細胞の代謝回転率に依存する。これらの特質が、ｒＡＡＶを、ある特定の遺伝子治療応用に理想的なものにする。
ＡＡＶは、低い毒性（例えば、これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る）、およびＡＡＶが宿主ゲノム（主として、残りのエピソームゲノム）に組み込まれないため挿入突然変異を引き起こす低い確率に起因して、他のウイルスベクターより有利であり得る。
ＩＴＲ間に置かれる配列は、概して、哺乳動物プロモーター、目的の遺伝子、およびターミネーターを含むことになる。多くの場合、強力で構成的に活性なプロモーターが、目的の遺伝子の高レベル発現のために望まれる。このタイプの一般的に使用されるプロモーターとしては、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター／エンハンサー、伸長因子１αショート（ＥＦＳ）、ＳＶ４０（サルウイルス４０）、ニワトリβ－アクチンおよびＣＡＧ（ＣＭＶ、ニワトリβ－アクチン、ウサギβ－グロビン）が挙げられる。これらのプロモーターの全てが、ほとんどの細胞型において構成的に活性な高レベル遺伝子発現をもたらす。これらのプロモーターの一部は、ある特定の細胞型ではサイレンシングに供され、それ故、この考慮事項を各応用について評価すべきである。
一部の場合、導入遺伝子（例えば、組込みの標的となる）を内因性プロモーター（例えば、組込み部位におけるまたはその付近におけるプロモーター）の制御下に置くことが有利であり得る。例えば、ＡＡＶベクターにより提供されるＣＡＲ発現カセットは、スプライスアクセプター／ドナー、２Ａペプチド、ならびに／または組込み部位における遺伝子とインフレームでのおよび／もしくは組込み部位におけるプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現を可能にするために導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）に作動するように連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得る。他の場合、導入遺伝子は、外因性プロモーター、例えば構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、の制御下にあることが、有利であり得る。そのよう場合、ＡＡＶベクターにより提供されるＣＡＲ発現カセットは、導入遺伝子（例えば、レポーター遺伝子、ＣＡＲ）に作動するように連結されたプロモーター（例えば、ＥＦＳまたはテトラサイクリン誘導性プロモーター）を含有し得る。
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットは、１つの核酸分子、例えば、１つのＡＡＶベクター上に存在する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、第１の核酸分子、例えば、第１のＡＡＶベクター上に存在し、ＣＡＲ発現カセットは、第２の核酸分子、例えば、第２のＡＡＶベクター上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９であり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットは、１つの核酸分子、例えば、ＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ６またはＡＡＶ９上に存在する。
使用されることになるベクターのパッケージング限界によって、前記ベクターにより提供され得る遺伝子編集エレメント（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ発現カセット、ＣＡＲ発現カセット、またはこれらの組合せ）の数および組合せが決定する。例えば、ＡＡＶは、おおよそ４．５～４．８Ｋｂのパッケージング限界を有する。しかるが故に、より大きい構築物をパッケージングする試みは、ウイルス産生の大幅な低減につながり得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよび／またはＣＡＲ発現カセットをコードするベクターから異なる手段により細胞に導入される。遺伝子編集組成物（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、およびｃｒＲＮＡ発現カセット、ＣＡＲ発現カセットを含有するＡＡＶベクター）の細胞への導入を、ｅｘ ｖｉｖｏで、同時にまたは異なるときに行うことができる。
好ましい実施形態では、ベクターは、（ｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えば、配列番号３～１２，１３４から選択される）をコードするｃｒＲＮＡ発現カセット；（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセット；ならびに（ｉｉｉ）標的ゲノム組込みのための５’および３’相同組換え修復（ＨＤＲ）アームを含む、ＡＡＶベクターである。好ましくは、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、２つのガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、構成的に存在する（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ）。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、第１のガイドＲＮＡの下流側に、目的の任意の配列（例えば、第２のガイドＲＮＡをコードする配列）の挿入を可能にする１つまたは複数の制限部位（例えば、ＢｂｓＩ）を含有する。挿入されることになる配列は、可変的であり得、例えば、配列は、標的とされることになる遺伝子または遺伝子座によって様々であり得る。１つまたは複数の制限部位（例えば、ＢｂｓＩ）の存在によって、ベクターの線形化、続いて、ガイドＲＮＡをコードする配列のライゲーションが可能になる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットは、両方のカセットが特定の標的部位でゲノム組込みを受けるように５’ＨＤＲアームと３’ＨＤＲアームの間に位置する。
抗ＣＤ２２ ＣＡＲを含有する好適なＡＡＶベクターの例示的な配列が下に提供される：
Figure 2023538303000001
Figure 2023538303000002
Figure 2023538303000003
Figure 2023538303000004
Figure 2023538303000005
Figure 2023538303000006
 （配列番号１；ＴＲＡＣ－ＬＨＡ－ｐＡＡＶ－Ｕ６ＬｂｃｒＴＲＡＣ－ＤＲ－ＢｂｓＩ－ＥＦＳ－ＣＤ２２ＢＢｚ－ＴＲＡＣ－ＲＨＡ、またはｐＸＤ０６０）。配列番号１において、ヌクレオチド１～１４１は、ＩＴＲに対応し、ヌクレオチド１５６～８００は、ＴＲＡＣ左相同アームに対応し、ヌクレオチド８１６～１０６５は、ヒトＵ６プロモーターに対応し、ヌクレオチド１０６７～１０８７は、ダイレクトリピートに対応し、ヌクレオチド１０８８～１１０７は、ＴＲＡＣ標的化ｃｒＲＮＡに対応し、ヌクレオチド１１０８～１１２８は、ダイレクトリピートに対応し、ヌクレオチド１１２９～１１４４は、二重ＢｂｓＩ部位に対応し、ヌクレオチド１１９８～１４５３は、ＥＦＳ－ＮＳプロモーターに対応し、ヌクレオチド１４７８～２９３８は、ＣＤ２２ＢＢｚ ＣＡＲに対応し、ヌクレオチド２９４５～２９９２は、ポリＡシグナルに対応し、ヌクレオチド２９９９～３６５７は、ＴＲＡＣ右相同アームに対応し、ヌクレオチド３７５１～３８９１は、ＩＴＲに対応する。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含有する好適なＡＡＶベクターの例示的な配列が下に提供される：
Figure 2023538303000007
Figure 2023538303000008
Figure 2023538303000009
Figure 2023538303000010
 （配列番号２；ＴＲＡＣ－ＬＨＡ－ｐＡＡＶ－Ｕ６ＬｂｃｒＴＲＡＣ－ＤＲ－ＢｂｓＩ－ＥＦＳ－ＣＤ１９ＢＢｚ－ＴＲＡＣ－ＲＨＡまたはｐＸＤ０７１）。配列番号２のベクター配列は、一般に、配列番号１のヌクレオチド１４７８～２９３８のＣＤ２２ＢＢｚドメインがＣＤ１９ＢＢｚドメインで置換されている、配列番号１の配列に匹敵する。最も特に、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインをコードする配列番号１のヌクレオチド１，４７８～２，２５５は、配列番号２では抗ＣＤ１９抗原結合ドメインで置換されている。
配列番号１および配列番号２は、それぞれ、ＣＤ２２ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲの配列を含有するが、目的の任意のＣＡＲを、例えば、上で配列番号１および２で説明されたように、その代わりに含めることができることは理解される。加えて、これらのベクターを、目的の任意のガイドＲＮＡを含有するように改変することができる。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座（ｃｒＴＲＡＣ）を標的とするガイドＲＮＡを置換することができ、配列番号３～１２，１３４のうちのいずれか１つなどの、追加のガイドＲＮＡをコードする配列をベクターに（例えば、ＢｂｓＩ部位に）、またはこれらの組合せに含めることができる。したがって、ＴＲＡＣ標的化ｃｒＲＮＡをコードする配列を伴うもしくは伴わない、ＢｂｓＩクローニング部位に必要に応じて挿入された１つもしくは複数の追加のｃｒＲＮＡコード配列、および／または既存のＣＡＲコード配列もしくはその代わりに用いられる別のＣＡＲコード配列を伴うもしくは伴わない、配列番号１または配列番号２が、明確に開示される。一部の実施形態では、好適なベクターは、配列番号１もしくは配列番号２、またはその上述のバリエーションのいずれかに対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するバリアントを含む。
組成物および方法において使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶの天然に存在する血清型；人工バリアント、例えば、ＡＡＶ．ｒｈｌＯ、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒｌ、ｒＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ；またはＡＡＶの他の天然もしくは操作されたバージョンであり得る。好ましい実施形態では、組成物および方法において使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９である。
ＡＡＶの１２の天然血清型が、これまでに同定されており、ＡＡＶ２が、最もよく特徴付けられており、最も一般的に使用されている。これらの血清型は、それらの指向性、またはそれらが感染する細胞の種類が異なることにより、ＡＡＶは、特定の細胞型を優先的に形質導入するために非常に有用な系となる。例えば、ＡＡＶ血清型１、２、５、もしくはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはこれらの任意の組合せを、脳または神経細胞を標的とするために使用することができ、ＡＡＶ４を、心臓細胞を標的とするために選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓細胞への送達に有用である。研究者は、シュードタイプ化によって、または異なるウイルス血清型からのカプシドおよびゲノムを混合することによって、ＡＡＶの指向性をさらに洗練してきた。これらの血清型は、スラッシュを使用して示され、したがって、ＡＡＶ２／５は、血清型５からのカプシドにパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。これらのシュードタイプ化ウイルスの使用は、形質導入効率を向上させることに加えて、指向性を変更することもできる。例えば、ＡＡＶ２／５は、ＡＡＶ２／２により効率的に形質導入されないニューロンを標的とし、脳内により広く分配され、これは、形質導入効率の向上を示す。
他の操作されたＡＡＶも開発されており、これらを、導入遺伝子を導入する目的で、ならびに組成物および方法において、使用することができる。これらは、当技術分野において周知であり、当業者は、それぞれの応用に使用されることになる最適なＡＡＶ血清型を決定することができるであろう。
ｃｒＲＮＡ／ガイドＲＮＡ
遺伝子編集組成物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを１つまたは複数の標的遺伝子／部位に方向付ける、１つまたは複数のｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）を含む。好ましくは、ｃｒＲＮＡは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９ベクター）で提供される。ｃｒＲＮＡを、ｃｒＲＮＡ発現カセットの形態で個々にまたは一緒に提供することができる。ガイドＲＮＡ配列を、単一の配列として、または１つもしくは複数の異なる配列の組合せ、例えば、多重立体配置（アレイと呼ばれる）として、構成することができる。例えば、ウイルスベクターに関連して、複数のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡは、タンデムに配置され、必要に応じて、ｃｒＲＮＡ発現カセットの形態でダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列により隔てられていることがある。ｃｒＲＮＡ発現カセットは、ｃｒＲＮＡをコードする配列に作動するように連結された１つまたは複数の調節配列（例えば、Ｕ６プロモーター）を含有する。例えば、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、複数のｇＲＮＡ配列を同時に発現させることができるようにアレイ形式で設計された単一のプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）の制御下にある複数のｇＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、各個々のｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡガイド配列は、異なる標的を標的とし得る。ｃｒＲＮＡ発現カセットは、エンドヌクレアーゼを異なる標的遺伝子または標的部位（例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの）に方向付ける、２つまたはそれより多くの（例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの）ｃｒＲＮＡをコードし得る。好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットは、２つのガイドＲＮＡをコードする。
ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡは、各々個々に組成物に含有され、個々にまたは全体として細胞に導入され得る。あるいは、これらの構成成分は、細胞への導入用の単一の組成物で提供され得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと同様に、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、任意の好適な手段により、例えば、ウイルスまたは非ウイルス技法によって、細胞に導入され得る。例えば、ｃｒＲＮＡは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）で、または例えば、トランスフェクション、電気穿孔もしくはヌクレオフェクションにより、提供され得る。
Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡ非依存性であり、おおよそ４２ヌクレオチドの長いｃｒＲＮＡのみを必要とし、このｃｒＲＮＡは、その３’末端に、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに相補的な２０～２３ヌクレオチドを有する。Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされ、Ｃｐｆ１と複合体化された場合、Ｃｐｆ１ｐ－ｃｒＲＮＡ複合体は、単独で標的ＤＮＡを効率的に切断するのに十分なものである。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列（またはガイド配列）およびダイレクトリピート配列を含む。シード配列は、スペーサー配列の５’末端の、大体、最初の５ヌクレオチド以内にあり、シード配列内の突然変異は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の切断活性に悪影響を与える。
用語「ガイドＲＮＡ」は、推定的または同定されたｃｒＲＮＡ配列またはガイド配列を含有する、ポリヌクレオチド配列を指す。ガイドＲＮＡは、標的核酸配列との、標的核酸配列とハイブリダイズするのにおよびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの配列特異的結合を標的核酸配列に方向付けるのに十分な相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列であり得る。一部の実施形態では、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされた場合、ガイド配列とその対応する標的配列との相補性度は、約５０％もしくは約５０％より高い、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれより高い。最適なアラインメントを、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、アルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
組成物および方法における使用のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列は、センスまたはアンチセンス配列であり得る。ｇＲＮＡの特定の配列は、異なり得るが、配列に関係なく、有用なガイドＲＮＡ配列は、オフターゲット効果を最小限に抑え、標的となる遺伝子または標的部位の高効率変更を達成するものとなる。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約１０～約６０またはそれを超えるヌクレオチドまで変動し、例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０またはそれを超えるヌクレオチドであり得る。核酸標的化複合体の配列特異的結合を標的配列に方向付けるガイド配列の能力を任意の好適なアッセイにより評定することができる。
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、１つまたは複数のステムループまたはヘアピンを有し、３０もしくはそれを超えるヌクレオチド長、４０もしくはそれを超えるヌクレオチド長、または５０もしくはそれを超えるヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、４２～４４ヌクレオチド長の間である。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、約１９ヌクレオチドのダイレクトリピート、および２３～２５ヌクレオチドの間のスペーサー配列を含有する。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈で、「標的配列」は、ガイド配列が、標的とする、例えば相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列に対する相補性が切断活性にとって重要であるガイド配列の区画は、シード配列と呼ばれる。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含むことができ、目的の標的遺伝子座内に含まれる。
標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と会合していなければならないと考えられている。ＰＡＭについての正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、概して、プロトスペーサー（標的配列とも呼ばれる）に隣接した２～５塩基対配列である。当業者は、所与のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと共に使用するためのさらなるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。さらに、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの操作は、ＰＡＭ特異性を、標的部位認識忠実度を向上させ、Ｃａｓ、例えばＣｐｆ１、ゲノム操作プラットフォームの多用途性を増加させるようにプログラムすることを可能にし得る。Ｃａｓタンパク質を、例えば、Kleinstiver, BP., et al., Nature., 523(7561):481-5 (2015)に記載されているように、それらのＰＡＭ特異性を変更するように操作することができる。
所望のＤＮＡ標的配列または標的遺伝子が同定されると、実行者が好適な標的部位を決定するのに役立つ利用可能な多くの資料がある。例えば、ヒトエクソンの４０％より多くを標的とする約１９０，０００の可能性のあるガイドＲＮＡのバイオインフォマティクスにより生成されたリストを含む非常に多くの公開資料が、実行者が標的部位を選択し、その部位におけるニックまたは二本鎖切断に影響を及ぼすように関連ガイドＲＮＡを設計するのを補助するために、利用可能である。科学者が広範な種におけるＣＲＩＳＰＲ標的化部位を見つけ、適切なｃｒＲＮＡ配列を生成するのに役立つように設計されたツールである、crispr.u-psud.fr/も参照されたい。
ガイドＲＮＡは、コードまたは非コード配列（例えば、標的配列、標的部位、または標的遺伝子）に相補的な配列であり得る。ｇＲＮＡ配列は、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のどちらかに相補的であり得る。それらは、追加の５’および／または３’配列を含むことができ、これらの配列は、標的配列に相補的であっても相補的でなくてもよい。それらは、標的配列に対して１００％未満の相補性、例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相補性を有し得る。
ｃｒＲＮＡとのリボ核タンパク質複合体が形成されると、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、配列（例えば、標的配列、標的部位、または標的遺伝子）に局在化し、標的遺伝子の破壊を引き起こし、および／または１つもしくは複数の相同アームが、標的部位におけるＨＤＲによる導入遺伝子の標的組込みを媒介し得る。標的部位は、破壊される遺伝子の遺伝子座内にあっても、破壊される遺伝子とは異なる遺伝子座にあってもよい。例えば、標的部位は、遺伝子の一部分、例えば、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エクソン、または非翻訳領域（ＵＴＲ）とオーバーラップしていることがある。
例示的な標的遺伝子／標的部位
遺伝子編集組成物は、一般に、非コードおよびコード領域を含むゲノム内の目的の任意の配列の標的化および／または変更（例えば、破壊）に適用可能である。標的となる配列が、ゲノム改変が行われることになる応用に依存し、それに基づいて、適切なｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡが設計されることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞に関連して、同種異系治療用細胞がそれを必要とする対象に投与される標準化された治療を作り出すことが望ましい。同種異系とは、患者を処置するために使用される細胞が、前記患者ではなく同じ種に属するドナーに由来し、しかるが故に遺伝的に異なることを意味する。しかし、宿主対移植片拒絶反応（ＨｖＧ）および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）によって、それらの使用は著しく制限される。これらのこととの関連で、ＨｖＧおよびＧｖＨＤに関与するタンパク質が破壊されたＣＡＲ Ｔ細胞を生じさせることが望ましい。したがって、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、１つもしくは複数のＨＬＡ遺伝子、１つもしくは複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子、またはこれらの組合せが、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡの標的とされ得る。
免疫チェックポイントタンパク質は、免疫応答をダウンモジュレートまたは阻害するための「ブレーキ」として有効に働くＴ細胞により発現される分子群である。免疫チェックポイント分子としては、プログラム死１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても公知、受託番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても公知、受託番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知、受託番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＩＶＳＴＭ３としても公知、受託番号：ＮＭ＿１７３７９９）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４２０５１．１、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても公知、受託番号：ＮＭ＿００１ １６６６６４．１）、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、Ｍ ＯＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭ０Ｘ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、Ｆ０ＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１ Ｂ２、ＧＵＣＹ１ Ｂ３が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、免疫細胞を直接阻害する。例えば、ＣＴＬＡ－４は、ある特定のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上に発現される細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上のそのリガンド（Ｂ７－１およびＢ７－２）により係合されると、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能が阻害される。したがって、遺伝子編集組成物を使用して、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ－４などの上述の免疫チェックポイントタンパク質を含むがこれらに限定されない任意の免疫チェックポイントタンパク質を標的とし、不活性化することができる。
細胞のゲノム内の任意の遺伝子が標的遺伝子であるか、または標的部位を含有し得る。遺伝子は、目的の任意の生物学的プロセスまたは分子機能における公知のまたは推定的役割を有し得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞共刺激、メモリーＴ細胞分化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、エピジェネティック調節、適応免疫応答、腫瘍細胞に対する免疫応答、他の免疫機能、またはこれらの組合せにおける公知のまたは推定的役割を有する遺伝子は、標的遺伝子または標的部位である可能性がある。そのようなおよび他の生物学的プロセスに関与する遺伝子は、公知であり、当業者より決定され得る。例えば、遺伝子オントロジー（ＧＯ）データベースおよび分子シグネチャーデータベース（ＭＳｉｇＤＢ）は、様々な生物学的機能に関連する遺伝子および／または遺伝子産物のリストを提供している。一部の実施形態では、表２または表３（実施例１で提供される）に収載されている遺伝子は、標的遺伝子または標的部位である可能性がある。一部の実施形態では、標的遺伝子または標的部位は、Ｒｅｎｅライブラリー（配列番号３～４，０８７）および／またはＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー（配列番号４，０８８～１２，１３４）から選択される１つまたは複数のガイドＲＮＡの標的とされる遺伝子または部位である。
一部の実施形態では、標的となる遺伝子または標的部位は、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ、ＰＥＬＩ１、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２、ＬＡＩＲ１、およびＵＳＢ１から選択される。一部の実施形態では、例示的な標的遺伝子または標的部位としては、ＰＤＣＤ１およびＴＲＡＣが挙げられるが、これらに限定されない。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
調節配列に作動するように連結された１つまたは複数のＣＡＲ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの）を含有する１つまたは複数のＣＡＲ発現カセットが、遺伝子編集組成物の一部として提供される。そのような調節配列は、限定せずに、プロモーター、スプライス受容体、ＩＲＥＳ、２Ａペプチド、三重らせん、ポリアデニル化シグナル、またはこれらの組合せを含み得る。標的部位に組み込まれると、１つまたは複数のＣＡＲは、レシピエント細胞（例えば、Ｔ細胞）内で発現される。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞を使用する免疫療法が、血液学的および非血液学的悪性病変のための有望な新しい処置として急速に浮上している。ＣＡＲは、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を有する、操作された受容体である。Ｔ細胞の膜内のＣＡＲの位置に基づいて、ＣＡＲを３つの主要な別個のドメインに分けることができ、これらのドメインには、細胞外抗原結合ドメイン、続いてスペース領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。最も一般的には免疫グロブリンの可変領域に由来する、抗原結合部分は、いわゆる「ｓｃＦｖ」を形成するようにリンカーにより連携されたＶＨおよびＶＬ鎖で構成されている。ｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間に介在するセグメントは、「スペーサードメイン」であり、これは、一部の実施形態では、定常ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインである。一部の場合、スペーサードメインおよび膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する。Ｔ細胞活性化を媒介する細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ αおよびβ鎖のＣ領域に由来するＣＤ３ζ共受容体シグナル伝達ドメインと、１つまたは複数の共刺激ドメインとを含む。
ＣＡＲを、悪性細胞などの選択された標的に特異的な、Ｔ細胞などの免疫応答性細胞を生成するために使用することができ、多種多様な受容体キメラ構築物が記載されている（米国特許第５，８４３，７２８号、同第５，８５１，８２８号、同第５，９１２，１７０号、同第６，００４，８１１号、同第６，２８４，２４０号、同第６，３９２，０１３号、同第６，４１０，０１４号、同第６，７５３，１６２号、同第８，２１１，４２２号；およびＰＣＴ公開ＷＯ９２１５３２２を参照されたい）。代替ＣＡＲ構築物は、後続の世代に属すると見なされることがある。第一世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζまたはＦｃＲガンマのどちらかの膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに柔軟なリンカーによって、例えば、ＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインによって連結された、例えば、特定の抗体のＶＨに連結されたＶＬを含む、抗原に対して特異的な抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＦｃＲγ；米国特許第７，７４１，４６５号、米国特許第５，９１２，１７２号、米国特許第５，９０６，９３６号を参照されたい）から概してなる。第二世代ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの１つまたは複数の共刺激分子の細胞内ドメインをエンドドメイン内に取り込んでいる（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８／ＯＸ４０／４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９１１，９９３号、同第８，９１６，３８１号、同第８，９７５，０７１号、同第９，１０１，５８４号、同第９，１０２，７６０号、同第９，１０２，７６１号を参照されたい）。第三世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩ ｌａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、またはＣＤ２８シグナル伝達ドメインなどの、共刺激エンドドメインの組合せを含む（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９０６，６８２号、米国特許第８，３９９，６４５号、米国特許第５，６８６，２８１号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４１３４１６５、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２０７９０００を参照されたい）。あるいは、共刺激を、ＣＡＲを抗原特異的Ｔ細胞において発現させることにより編成することができ、これらの抗原特異的Ｔ細胞は、それらの天然αβＴＣＲの、例えばプロフェッショナル抗原提示細胞上の抗原による、係合後に、付随する共刺激によって活性化および拡大されるように選択される。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、がん、炎症性疾患、ニューロン障害、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、またはこれらの組合せに特異的な、１つまたは複数の抗原を標的とする（例えば、認識する、および／またはそれらに結合する）。当業者は、当分野における一般的知識および／または日常の実験に基づいて、特定の疾患、障害または状態についてのＣＡＲの標的とされることになる適切な抗原を決定することができるであろう。
ＣＡＲの標的とされる可能性があるがんに特異的な例示的な抗原としては、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ １５２、ＣＤ １９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒ ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＲの標的とされる可能性がある炎症性疾患に特異的な例示的な抗原としては、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ １２５、ＣＤ １４７（ベイシジン）、ＣＤ １５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のａ鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンａ４、インテグリンα４β７、Ｌａｍａ ｇｌａｍａ、ＬＦＡ－１（ＣＤ １１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂ β７、スクレロスチン（scleroscin）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦベータ１、ＴＮＦ－ａ、ＶＥＧＦ－Ａ、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＲの標的とされる可能性があるニューロン障害に特異的な例示的な抗原としては、ベータアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＲの標的とされる可能性がある糖尿病に特異的な例示的な抗原としては、Ｌ－Ｉβ、ＣＤ３、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＲの標的とされる可能性がある心血管疾患に特異的な例示的な抗原としては、Ｃ５、心臓ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンアルファ－ｌｉｂ）、フィブリンＩＩ、ベータ鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ １８）、スフィンゴシン－１－リン酸、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＡＲの標的とされる可能性がある感染性疾患に特異的な例示的な抗原（または抗原関連ウイルス）としては、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、エンドトキシン、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、インフルエンザＡ血球凝集素、リポテイコ酸、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦα、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ－４、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＢＯＲＩＳ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＧＤ２、クローディン、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、サイクリン、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＢＶ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ８０６、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＦＡＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、フコシル、融合体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＧＰＣ３、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、イディオタイプ、ＩＬ１２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＭ１９、ＩＸ、ＬＣＫ、レグマイン、ｌｇＫ、ＬＭＰ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ、メランＡ／ＭＡＲＴ１、メソテリン、ＭＥＴ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＵＣ１、変異型ｐ５３、ＭＹＣＮ、ＮＡ１７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄ－Ｌ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＹ－ＴＥＳ１、ｐ５３、Ｐａｇｅ４、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＧＦＲ－β、ＰＬＡＣ１、ポリシアル酸プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、変異型Ｒａｓ、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ３、ｓＬｅ（ａ）、精子タンパク質１７、ＳＳＸ２、ＳＴｎ、サバイビン、Ｔｉｅ２、Ｔｎ、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ１、およびＸＡＧＥから選択される１つまたは複数の抗原を標的とする。
好ましくは、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ＢＢｚ）または抗ＣＤ２２ ＣＡＲ（例えば、ＣＤ２２ＢＢｚ）であり得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、二重特異性であり得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、多価であり得る。例えば、ＷＯ２０１４／４０１１９８８およびＵＳ２０１５００３８６８４に記載されているＣＡＲを含むがこれらに限定されない、二重特異性または多重特異性（多価）ＣＡＲは、方法および組成物における使用が企図される。
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現カセットは、代替的にまたは加えて、レポーター遺伝子などの目的の遺伝子を含有する。レポーター遺伝子は、成功事象、例えばトランスフェクション、形質導入および／または組換え、の指標として使用される可能性がある任意の遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、発現位置もしくはレベルを報告するために目的の調節配列もしくは遺伝子に融合させるか、または例えば、トランスフェクション効率を標準化する対照として、機能を果たすことができる。レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、目に見えない基質を発光または着色生成物に変換する酵素を含む。レポーター遺伝子は、そうでなければ細胞を死滅させるまたは損なわせることになる毒性化合物、例えば抗生物質または除草剤の存在下で成長する能力を付与する、選択可能なマーカーも含む。選択可能なマーカーは、化合物、例えば異常な炭水化物またはアミノ酸を利用する能力も付与し得る。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネティシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
ＣＡＲ発現カセットは、各々個々に組成物に含有され、個々にまたは全体として細胞に導入され得る。あるいは、これらの構成成分は、細胞への導入用の単一の組成物で提供され得る。好ましくは、１つまたは複数のＣＡＲ発現カセットは、単一のウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ血清型にパッケージングされたＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９ベクターで提供される。
相同アーム
遺伝子編集組成物を使用して、内因性ＤＮＡ配列内に標的化された二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。ＤＳＢは、切断部位付近で所望のＤＮＡ配列改変を達成するために利用され得る、細胞のＤＮＡ修復経路を活性化する。特定の実施形態では、１つまたは複数の相同配列との相同組換えが、ＤＳＢ部位で、１つまたは複数のｃｒＲＮＡおよび／またはＣＡＲなどの目的の配列を導入するために、促進される。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、核酸標的化複合体の一部としてのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによりニッキングまたは切断される標的配列内でのまたはその付近での相同組換えを可能にするために、１つまたは複数の相同配列（相同アームと呼ばれる）を含有する。相同アームは、任意の好適な長さ、例えば、約１０もしくは約１０を超える、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、相同アームは、標的配列の一部分に相補的であるか、またはそれと相同である。最適にアラインメントされたとき、相同アームは、標的配列の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、約１つもしくは約１つより多くの、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００の、またはそれより多くのヌクレオチド）とオーバーラップしている可能性がある。一部の実施形態では、相同アームと標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適にアラインメントされたとき、相同アームの最近接ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００またはそれを超えるヌクレオチド以内である。
特定の実施形態では、ＡＡＶ鋳型は、次の構成成分を含有する：５’相同アーム、置き換え配列（例えば、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよび／またはＣＡＲ発現カセット）、および３’相同アーム。相同アームは、染色体内への組換え、したがって、置き換え配列での内因性ゲノム配列の一部分の置き換えに備えるものである。一部の実施形態では、相同アームは、最遠位の切断部位に隣接している。一部の実施形態では、５’相同アームの３’末端は、置き換え配列の５’末端の隣の位置である。一部の実施形態では、５’相同アームは、置き換え配列の５’末端から５’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００または２０００ヌクレオチド伸長し得る。一部の実施形態では、３’相同アームの５’末端は、置き換え配列の３’末端の隣の位置である。一部の実施形態では、３’相同アームは、置き換え配列の３’末端から３’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００または２０００ヌクレオチド伸長し得る。
一部の実施形態では、５’および３’相同アームは、ＴＲＡＣ遺伝子座、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座の第１エクソンと相同である。相同アームが相同であり得る他の遺伝子座としては、他のＴＣＲ遺伝子座、例えば、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＡＶ１－１およびＴＲＢＶ１；免疫遺伝子、例えば、ＰＤ－１およびＢ２Ｍ；セーフハーバー、例えば、ＡＡＶＳ１；遺伝子間領域、ならびに他のゲノム領域が挙げられるが、これらに限定されない。
相同組換え修復（ＨＤＲ）では、切断された標的ＤＮＡ配列との相同性を有するドナーポリヌクレオチドは、切断された標的ＤＮＡ配列の修復の鋳型として使用され、その結果、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の伝達が生じる。しかるが故に、新しい核酸材料をその部位に挿入／コピーすることができる。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナーオリゴヌクレオチド」とは、切断部位に挿入されることになる核酸配列（例えば、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよび／またはＣＡＲ発現カセット）を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、切断部位におけるゲノム配列との十分な相同性、例えば、切断部位に隣接している、例えば、切断部位から約５０塩基以内またはそれ未満の、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内の、または切断部位に直接隣接している、ヌクレオチド配列との例えば約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の相同性を、それとそれが相同性を有するゲノム配列との相同組換え修復を支援するために、概して含有する。ドナー配列は、概して、それが置き換わるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同組換え修復を支援するのに十分な相同性が存在するのであれば、ゲノム配列を基準として少なくとも１つまたは複数の単一塩基変化、挿入、欠失、反転または再配置を含有していてもよい。一部の実施形態では、ドナー配列は、２つの相同領域が隣接している非相同配列（例えば、ｃｒＲＮＡ発現カセットおよび／またはＣＡＲ発現カセット）を含み、したがって、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列の間の相同組換え修復によって、標的領域に非相同配列が挿入される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の相同アームと、置き換え配列（本明細書では、以降、ＨＤＲ鋳型と呼ばれる）とを含有する配列は、一本鎖状または二本鎖状である。一部の実施形態では、ＨＤＲ鋳型は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ＨＤＲ鋳型は、相同組換えに関与することにより標的位置の構造を変更する。一部の実施形態では、ＨＤＲ鋳型は、標的位置の配列を変更する。一部の実施形態では、ＨＤＲ鋳型は、改変されたまたは天然に存在しないヌクレオチド配列の、標的核酸への組込みをもたらす。標的遺伝子における標的位置との相同性を有するＨＤＲ鋳型を使用して、標的配列の構造を変更することができる。ＨＤＲ鋳型は、標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれより多くのヌクレオチドについての配列の変化をもたらす、配列を含み得る。
Ｂ．改変および／またはスクリーニングされることになる細胞
遺伝子編集組成物および方法を使用して、任意の細胞型のゲノム改変およびその後のスクリーニングを達成することができる。例えば、細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、齧歯動物、サル、ラットまたはマウス細胞であり得る。細胞は、非哺乳動物真核細胞、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）、脊椎のある魚（例えば、サケ）または甲殻類（例えば、カキ、クレーム、ロブスター、エビ）細胞であり得る。細胞はまた、植物細胞であり得る。
好ましい実施形態では、細胞は、皮膚細胞、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、神経細胞、ヒト胚性幹細胞、血液細胞（例えば、白血球）、および多能性幹細胞を含むがこれらに限定されない、ヒト細胞である。より好ましくは、改変されることになる細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、およびエフェクターメモリーＴ細胞；またはＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｆｈ細胞、およびＴｒｅｇ細胞；またはガンマ－デルタＴ細胞／ｇｄＴ細胞）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、または他の免疫細胞であり得る。
一部の実施形態では、細胞は、樹立細胞系からのものであり得、またはそれらは、初代細胞であり得、「初代細胞」は、対象に由来し、培養物の限られた数の継代または分割のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた、細胞および細胞培養物を指す。
Ｔ細胞源
拡大および遺伝子改変の前に、細胞（例えば、Ｔ細胞）を、罹患したまたは健康な対象から得ることができる。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの試料から、Ｔ細胞を得ることができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技法を使用して対象から収集した１単位の血液から得ることができる。１つの好ましい実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス産物は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む、リンパ球を概して含有する。アフェレーシスにより収集された細胞は、血漿画分を除去するために、および後続の処理ステップ用の適切な緩衝液または培地に細胞を入れるために、洗浄され得る。一部の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。洗浄溶液は、カルシウムおよび／もしくはマグネシウムを欠いていることがあり、または全てではないが多くの二価カチオンを欠いていることがある。洗浄後、細胞を、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋不含、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝剤を含むもしくは含まない他の生理食塩溶液などに、再懸濁させることができる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させることができる。
一部の実施形態では、Ｔ細胞を、末梢血リンパ球から、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により、または向流遠心水簸により、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、単離することができる。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、正または負の選択技法により、さらに単離することができる。例えば、一部の実施形態では、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞の正の選択に十分な期間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとのインキュベーションにより、単離することができる。
Ｃ．医薬組成物
遺伝子改変細胞、または遺伝子改変細胞の集団を、薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する、医薬組成物が提供される。細胞の集団は、単離された遺伝子改変細胞（例えば、任意の記載される構成成分および方法、例えばＣＬＡＳＨシステム、を使用して得られたＣＡＲ Ｔ細胞）を拡大することにより、得ることができる。細胞を、二重特異性または多重特異性になるように（例えば、二重特異性または多重特異性ＣＡＲを発現させることにより、２つまたはそれより多くのＣＡＲを発現させることにより、など）改変することができる。細胞は、罹患したまたは健康な対象から、遺伝子改変の前に、単離されたものであり得る。細胞への遺伝子編集組成物（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよび１つまたは複数のＡＡＶベクター）の導入を、ｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つもしくは複数のＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９および／または抗ＣＤ２２ ＣＡＲ）、および／または１つもしくは複数の所望の遺伝子の突然変異を含む、細胞を含有し、遺伝子には、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＨＬＡ遺伝子、組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子、表２または表３に収載されている遺伝子、ＴＲＡＣ、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ、ＰＥＬＩ１、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２、ＬＡＩＲ１、およびＵＳＢ１が含まれるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される担体」は、身体のある組織、臓器または部分から、身体の別の組織、臓器または部分への目的の化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを表す。例えば、担体は、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル化材料、またはこれらの組合せであり得る。担体の各構成成分は、それが製剤の他の成分と適合性でなければならないことから、「薬学的に許容される」ものであり得る。それはまた、それが接触し得る任意の組織または臓器と接触して使用することに好適でなければならず、これは、それが、その治療利益を過度に上回る毒性、刺激作用、アレルギー応答、免疫原性またな任意の他の合併症のリスクを伴ってはならないという意味である。
組成物を、薬学的に許容される担体と会合している細胞の１つまたは複数で構成されている医薬組成物に適便に製剤化することができる。例えば、使用され得る典型的な担体および従来の医薬組成物調製方法を開示している、Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, by E.W. Martin Mack Pub. Co., Easton, PAを参照されたい。これらは、最も典型的には、ヒトへの組成物の投与のための標準的な担体であろう。そのような医薬組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存薬を含み得る。
医薬組成物を、対象に、局所（例えば、特定の領域、生理系、組織、臓器、または細胞型に限定される）処置が所望されるのか、または全身処置が所望されるのかに依存して、および処置されることになるエリアに依存して、いくつかの仕方で投与することができる。しかるが故に、医薬組成物を任意の投与経路による送達用に製剤化することができる。「投与経路」は、エアロゾル、経鼻、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、経粘膜、経皮、非経口、輸注、埋め込みもしくは移植、持続注入、局所的適用、および／または注射を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の投与経路を指し得る。
非経口投与は、使用される場合、一般に注射によって特徴付けられる。注射剤は、従来の形態で、液体溶液もしくは懸濁液のどちらかとして、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに好適な固体形態、またはエマルジョンとして、調製することができる。好適な非経口投与経路としては、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および脈管構造へのカテーテルによる点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば、眼内注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入（例えば、浸透圧ポンプによる）を含む、皮下注射または堆積；カテーテルまたは他の留置デバイス（例えば、インプラント）による直接適用が挙げられる。
非経口投与用の調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、滅菌水性または非水性懸濁液およびエマルジョンを含み、これらは、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤も含有し得る。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール溶液／水溶液、アルコール性／水性エマルジョンまたは懸濁液を含み、これらには、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補給物、電解質補給物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などを含む。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、保存薬および他の添加剤も、存在し得る。
一部の実施形態では、組成物は、対象に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、嚢胞内、筋肉内、静脈内注射により、非経口、または腹腔内投与される。組成物を、対象の炎症部位、対象の局所性疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに、直接注射することができる。医薬組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因により決定されることになるが、適切な投薬量は、臨床試験により決定され得る。
ＩＩＩ．ＣＡＲ－Ｔ生成方法
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞または細胞の集団（例えば、Ｔ細胞）を作製する方法が提供される。ＣＡＲは、細胞外標的結合ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＡＲを細胞膜に繋留する膜貫通ドメインと、活性化シグナルを伝達する１つまたは複数の細胞内ドメインとを概して含むモジュール様式で、設計される。共刺激ドメインの数に依存して、ＣＡＲを、第一（ＣＤ３ｚのみ）、第二（１つの共刺激ドメイン＋ＣＤ３ｚ）、または第三世代ＣＡＲ（１つより多くの共刺激ドメイン＋ＣＤ３ｚ）に分類することができる。Ｔ細胞へのＣＡＲ分子の導入は、さらなる抗原特異性を有するＴ細胞をうまく再指向し、完全Ｔ細胞活性化を駆動するために必要なシグナルを提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞による抗原認識は、標的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の無傷表面抗原への結合に基づくため、細胞の標的化は、ＭＨＣ拘束性、共受容体依存性でも、標的エピトープのプロセシングおよび有効な提示にも依存するものでもない。
概して、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲを含有し発現するようにレシピエントＴ細胞のゲノムを改変することにより生成される。レシピエントＴ細胞は、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、および調節性Ｔ細胞から選択することができる。ゲノムは、Ｃｐｆ１などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼにより編集され得、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが１つまたは複数のガイドＲＮＡにより方向付けられる部位で、ゲノムＤＮＡを切断する。ＣＡＲを含有するベクターは、標的部位での（例えば、ＤＮＡ切断部位でのまたはその付近での）ＣＡＲの標的組込みを助長する相同アームを有し得る。ＣＡＲは、内因性もしくは外因性プロモーターにより調節されるか、またはその制御下で発現され得る。
特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法は、Ｔ細胞を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼおよびＡＡＶベクターと接触させるステップであって、ＡＡＶベクターが、（ｉ）第１のガイドＲＮＡおよび必要に応じて第２のガイドＲＮＡをコードするｃｒＲＮＡ発現カセットと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットと、（ｉｉｉ）標的ゲノム組込みのための５’および３’相同組換え修復（ＨＤＲ）アームとを含む、ステップを含む。接触させるステップは、ＣＡＲ発現カセットがゲノムに組み込まれ、その後、発現されるような、Ｔ細胞のゲノム編集に好適な条件下で行われる。好適な条件としては、限定せずに、遺伝子編集組成物を細胞に導入すること、それらを発現させること、および／または必要に応じてそれらが機能することを可能にする（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが翻訳され、その結果、エンドヌクレアーゼタンパク質が発現される；ｃｒＲＮＡおよび／またはＣＡＲ発現カセットが、ゲノムに組み込まれ、転写され、および／または翻訳される）、細胞培養および／または他の条件（例えば、培地、ｐＨ、温度、ＣＯ２含有量など）を挙げることができる。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする；５’および３’ＨＤＲアームは、ＴＲＡＣ遺伝子座と相同である；ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットは、ＨＤＲによりＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれる；ならびにこれらの組合せ。
本明細書で論じられるスクリーニングおよび他のアッセイの結果を使用して、他の改変細胞の発生を誘導することができる。例えば、重要なものとして同定された遺伝子を、当技術分野において公知の他の手段を使用して、ノックアウト、またはノックダウン、または他の方法で標的とすることができる。したがって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットと、配列番号３～１２，１３４からなる群から選択される１つまたは複数のガイドＲＮＡの標的とされる１つまたは複数の遺伝子遺伝子座における発現の低減または消失とをコードする異種核酸構築物を有する細胞も、提供される。これらの細胞は、ガイドＲＮＡを発現する必要がない。標的遺伝子の発現の低減を、例えば＿＿＿により、（すなわち、永久的な）遺伝子突然変異もしくはノックにより、あるいは、例えば、細胞に一過性にトランスフェクトされるか、または細胞にトランスフェクトされたもしくはそのゲノムに組み込まれた発現構築物から発現され得るアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉおよび外部ガイド配列を含むがこれらに限定されない、阻害性核酸を使用することにより、モジュレートすることができる。そのような細胞を、本明細書で論じられる方法、特に治療方法のいずれかにおいて使用することができる。
以下は、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成および特徴付けるために使用され得る例示的な材料およびプロトコールを提供する。
Ａ．材料
１．プラスミドおよびＤＮＡ
（ｉ）ＮＳＬ－ＬｂＣｐｆ１－ＮＳＬ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ｐｓｅｕｄｏ－Ｕの完全置換でｍＲＮＡ転写物を改変し、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧを使用してキャップしたもの（Ｃａｐ １）。ｍＲＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼおよびホスファターゼ処置でポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、シリカ膜により精製され、１ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．４中の溶液としてパッケージングされ得る。
（ｉｉ）プラスミド：Ｒｅｎｅライブラリー、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー、または他のｃｒＲＮＡから選択されるｃｒＲＮＡを有するまたは有さない、ＡＡＶ６／ＡＡＶ９、ＰＤＦ６、ＡＡＶベクター（ｐＸＤ０６０、ｐＸＤ０１７、ｐＸＤ０７１を含む）、またはそれらのベクターのいずれかの誘導体。
２．細胞系
（ｉ）ヒト末梢血ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、または他のドナー）
（ｉｉ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
（ｉｉｉ）ＮＡＬＭ６細胞（ＡＴＣＣ）
３．キットおよび化学薬品
抗体および染色試薬：
ＡＰＣ抗ヒトＴＩＧＩＴ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３７２７０５
ＡＰＣ／シアニン７抗ヒトＣＤ８ａ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３００９２６
ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ１９７（ＣＣＲ７）抗体－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３５３２１６
ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３抗体－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３００３０６
ＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：４０９３０４
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０（商標）抗ヒトＣＤ８－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３４４７３２
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１（商標）抗ヒトＣＤ６２Ｌ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３０４８２８
ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒト／マウスグランザイムＢ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３７２２１２
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１（商標）抗ヒトＣＤ３６６（Ｔｉｍ－３）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３４５００８
ＦＩＴＣ抗ヒトＴＮＦ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：５０２９０６
ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３５６１０９
ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒトＣＤ２７－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３９３２０９
ＰＥ抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２，２４６）タグ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：６３７３１０
ＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１９７（ＣＣＲ７）抗体－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３５３２２５
ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４５ＲＯ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３０４２１０
ＡＰＣ抗ヒトＩＦＮ－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：５０６５１０
ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒトＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３６９３１２
ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒα）［クローン：Ａ０１９Ｄ５］－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３５１３１５
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１（商標）抗ヒトＣＤ２１０（ＩＬ－１０Ｒ）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３０８８１５
ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒトＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３３９０１１
ＰＥ／シアニン７抗ヒトＣＤ２４４（２Ｂ４）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３２９５１９
ＡＰＣ／シアニン７抗ヒトＣＤ２９４（ＣＲＴＨ２）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３５０１１３
ＡＰＣ／シアニン７抗ヒトＣＤ２８－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３０２９６５
ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ６９［クローン：ＦＮ５０］－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：３１０９０３
ヒトモノクローナルＢＬＩＭＰ１／ＰＲＤＭ１抗体－Ｒ＆Ｄ；カタログ番号：ＭＡＢ３６０８１
Ｂｌｉｍｐ－１／ＰＲＤＩ－ＢＦ１（Ｃ１４Ａ４）ウサギｍＡｂ－ＣＳＴ；カタログ番号：９１１５
組換えヒトＳｉｇｌｅｃ－２／ＣＤ２２ Ｆｃキメラタンパク質－Ｒ＆Ｄ；カタログ番号：１９６８－ＳＬ－０５０
Ｐｉｅｒｃｅ（商標）組換えビオチン化タンパク質Ｌ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：２１１８９
細菌およびウイルス株：
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：Ｃ７３７３０３
Ｅｎｄｕｒａ（商標）エレクトロコンピテント細胞－Ｌｕｃｉｇｅｎ；カタログ番号：６０２４２－２
ｑＰＣＲプローブ：
ＩＤ２ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０４１８７２３９＿ｍ１
ＲＡＳＡ３ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０７１０４３＿ｍ１
ＰＣＤＨ８ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１５９９１０＿ｍ１
ＩＦＩＴ３ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０１９２２７５２＿ｓ１
ＴＮＦＳＦ４ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６７１９５＿ｍ１
ＲＩＮ３ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０１１１２０８１＿ｍ１
ＰＴＰＮ１４ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１９３６４３＿ｍ１
ＣＤＣＡ７ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００２３０５８９＿ｍ１
ＲＵＮＸ３ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００２３１７０９＿ｍ１
ＦＯＸＯ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０５４５７６＿ｍ１
ＴＢＸ２１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００２０３４３６＿ｍ１
ＢＡＴＦ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００２３２３９０＿ｍ１
ＣＸＣＲ６ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７４８４３＿ｍ１
ＰＲＦ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６９４７３＿ｍ１
ＳＴＡＴ６ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００５９８６２５＿ｍ１
ＳＴＡＴ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０１３９９６＿ｍ１
ＳＯＣＳ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００７０５１６４＿ｓ１
ＩＬ１３ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７４３７９＿ｍ１
ＷＮＴ１１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１８２９８６＿ｍ１
ＫＬＦ２ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００３６０４３９＿ｇ１
Ｓ１ＰＲ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７３４９９＿ｍ１
ＩＲＦ４ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０５６５３４＿ｍ１
ＮＦＫＢ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ００７６５７３０＿ｍ１
ＧＡＰＤＨ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１
ＰＲＤＭ１＿ＩＳＯ１ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：ＡＰＵ６６６７
ＰＲＤＭ１＿ＩＳＯ２ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：ＡＰＲＷＨ２Ｄ
ＰＲＤＭ１＿ＩＳＯ３ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ アッセイＩＤ：ＡＰＴ２ＤＭＡ
化学薬品、ペプチド、および組換えタンパク質：
ＤＰＢＳ、カルシウム不含、マグネシウム不含－Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１４１９０２５０
ＲＰＭＩ １６４０培地－Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１１８７５－０９３
ＤＭＥＭ、高グルコース、ピルビン酸塩－Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１１９９５０６５
ウシ胎児血清－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：Ｆ４１３５－５００ＭＬ
ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）－Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１５１４０１２２
２－メルカプトエタノール－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：Ｍ６２５０－１０ＭＬ
Ｘ－ＶＩＶＯ １５ 血清不含造血細胞培地－Ｌｏｎｚａ；カタログ番号：ＢＥ０２－０６０Ｆ
Ｃｏｒｎｉｎｇ；ヒトＡＢ血清；男性ドナー；ＡＢ型；ＵＳ；１００ｍＬ、３５－０６０－ＣＩ １／ＥＡ－Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号：ＭＴ３５０６０ＣＩ
ＡＣＫ溶解緩衝剤－Ｌｏｎｚａ；カタログ番号：１０－５４８Ｅ
ＰＥＩ ＭＡＸ－Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号：２４７６５－１
ＰＥＧ８０００－Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号：Ｖ３０１１
ＲＩＰＡ緩衝剤－Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ；カタログ番号：ＢＰ－１１５
プロテアーゼ阻害剤カクテル－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：７８４３７
Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：２３２２７
ＬＳカラム－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号：１３０－０４２－４０１
ヒトＣＤ８ Ｔ細胞単離キット－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号：１３０－０９６－４９５
ストレプトアビジンマイクロビーズ－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号：１３０－０４８－１０２
ＦｃＲブロッキング試薬、ヒト－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号：１３０－０５９－９０１
Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＮＨＳ活性化アガローススラリー－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：２６２００
組換えヒトＩＬ－２（担体不含）－Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号：５８９１０４
ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）固定／透過処理溶液キット－ＢＤ；カタログ番号：５５４７１４
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液－Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ；カタログ番号：ＱＥ０９０５０
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ－Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号：５１１０６
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ－ＮＥＢ；カタログ番号：Ｍ０３０２Ｌ
プロテイナーゼＫ－Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号：１９１３１
リボヌクレアーゼＡ－Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号：１９１０１
Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ－ＮＥＢ；カタログ番号：Ｅ２６１１
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：Ｆ５４８Ｌ
ＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：Ｋ１０８２
ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号：２８７０６
Ｅ－Ｇｅｌ（商標）Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：１２３７３０３１
ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ－ＮＥＢ；カタログ番号：Ｅ７５３０Ｓ
ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ－ＮＥＢ；カタログ番号：Ｅ７３３５Ｓ
Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ；カタログ番号：ＦＣ－１２１－１０３０
Ｎｅｘｔｅｒａ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ；カタログ番号：ＦＣ－１２１－１０１１
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：１５５９６０２６
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニ単離キット－Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号：７４１３４
Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：Ｍ１３０２－４０ＫＵ
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：１８４１８０２０
ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：４３５２０４２
ＢｐｉＩ（ＢｂｓＩ）（１０Ｕ／μＬ）－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：ＥＲ１０１２
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：Ｅ１０１４－２５ＫＵ
４－２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ、１０－ｗｅｌｌ－ＢｉｏＲａｄ；カタログ番号：４５６１０９４
ウシ血清アルブミン－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：Ａ９４１８－１００Ｇ
Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：３２１０６
ＥＤＴＡ－Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：Ｅ８００８－１００ＭＬ
ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－Ｋ＋ Ｓａｌｔ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；カタログ番号：１２２７９９
Ｎｅｏｎ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １００ μＬ Ｋｉｔ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：ＭＰＫ１００２５。
Ｂ．機器
（ｉ）ＰＣＲサーモサイクラー
（ｉｉ）組織培養フード
（ｉｉｉ）１５ｃｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
（ｉｖ）レトロネクチン被覆プレート（Ｔａｋａｒａ）
（ｖ）Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
（ｖｉ）バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）
（ｖｉｉ）ピペットおよびチップ
（ｖｉｉｉ）次世代シークエンシングマシン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
（ｉｘ）細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）
（ｘ）Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
（ｘｉ）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）
（ｘｉｉ）ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
（ｘｉｉｉ）ＦｌｏｗＪｏソフトウェア９．９．４（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）
Ｃ．ＡＡＶベクターの構築
１．ｃｒＲＮＡ発現ベクターの設計および構築
（ｉ）ＨＤＲ鋳型の標的送達によるノックアウト用の遺伝子を同定する。ＴＲＡＣを例として使用するが、Ｃｐｆ１ ＰＡＭ配列を有する任意の遺伝子を標的とすることができる。
（ｉｉ）Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇまたは他のコンピュータパイプラインを用いてＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ（２０ｂｐ）を設計する。
ｃｒＴＲＡＣ：ＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣ（配列番号１２，１３５）
（ｉｉｉ）２つのＬｂＣｐｆ１ダイレクトリピートと付着末端とを有するオリゴヌクレオチドを合成する。
（ｉｖ）ＦＤ ＢｂｓＩでｐＸＤ０６０、ｐＸＤ０１７またはｐＸＤ０７１を消化し、Ｕ６プロモーターの後にガイドを挿入する。
２．ＣＡＲ配列生成
（ｉ）ＣＤ２２ＢＢｚ ＣＡＲの生成は、以前に記載されたように行うことができる（Haso, W., et al., Blood., 121(7):1165-74 (2013)。ヒトＣＤ２２に特異的なＣＤ２２結合ｓｃＦｖ（ｍ９７１）、続いて、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）細胞内ドメインとＣＤ３ζ細胞内ドメインとに連結されたＣＤ８ヒンジ膜貫通領域。
（ｉｉ）ＣＤ１９結合ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３）の配列は、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ８５２９５２）から見つけることができ、この配列の後に、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）細胞内ドメインとＣＤ３ζ細胞内ドメインとに連結されたＣＤ８ヒンジ膜貫通領域が続き得る（Kochenderfer, JN., et al., J. Immunother., 32(7):689-702 (2009)）。異なる仕方でＣＤ１９ＢＢｚ ＣＡＲを検出するために、Ｆｌａｇまたは他のタグ配列をＣＤ８αリーダー配列の後に付加させることができる。
（ｉｉｉ）ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）を使用して、ｍ９７１－ＢＢｚおよびＦＭＣ６３－ＢＢｚを合成する。
３．ＨＤＲ鋳型設計
（ｉ）初代ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴＲＡＣ遺伝子座の左および右相同アームを、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有する遺伝子座特異的プライマーセットを使用するＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲアニーリング温度（６０℃）。
（ｉｉ）アンプリコンをシークエンシングする
４．ＡＶＶ－ｃｒＲＮＡ－ＨＤＲ－ＣＡＲベクタークローニング
（ｉ）ＧｉｂｓｏｎアセンブリーによりＨＤＲ配列をＡＡＶベクター（ｐＸＤ０６０）にクローニングする。試料をサーモサイクラーにおいて５０℃で３０分間インキュベートする。
（ｉｉ）ｐＸＤ０７１（ＣＤ１９ＣＡＲ）構築：ｐＸＤ０４０を消化し、次いで、ＧｉｂｓｏｎアセンブリーによりＣＡＲ配列をＭＣＳにクローニングする。
Ｄ．ＡＡＶ産生および力価測定
１．ＡＡＶ産生
（ｉ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、１５ｃｍ組織培養皿の中のＡＡＶ構築物、ＡＡＶ２導入遺伝子ベクター、パッケージング（ｐＤＦ６）プラスミド、およびＡＡＶ６／９血清型プラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と一緒にトランスフェクトする。
（ｉｉ）トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの７２時間後にＰＢＳを用いて収集する。
２．ＡＡＶ精製および力価測定
（ｉ）トランスフェクトされた細胞を純粋なクロロホルムと混合する（１／１０体積）。
（ｉｉ）細胞を３７℃で激しく振盪しながら１時間インキュベートする。
（ｉｉｉ）ＮａＣｌを１Ｍの最終濃度まで添加する。
（ｉｖ）２０，０００ｇで、４℃で１５分間、遠心分離する。
（ｖ）水性層を別の管に移し、クロロホルム層を廃棄する。
（ｖｉ）ＰＥＧ８０００を試料に１０％（ｗ／ｖ）まで添加し、溶解するまで振盪する。
（ｖｉｉ）混合物を４℃で１時間インキュベートし、次いで、２０，０００ｇで、４℃で遠心分離する。
（ｖｉｉｉ）上清を廃棄し、ＭｇＣｌ２を含有するＤＰＢＳにペレットを懸濁させる。
（ｉｘ）試料をユニバーサルヌクレアーゼで処置し、３７℃で３０分間インキュベートする。
（ｘ）クロロホルム（１：１体積）を添加し、振盪し、１２，０００ｇで４℃で１５分間、遠心分離する。
（ｘｉ）水性層を単離し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯにより濃縮する。ＡＡＶを高濃度で濃縮するため、感染させるときの体積を低減させることができ、ＡＡＶの毒性を低下させることができる。ＡＡＶをアリコートに分割し、－８０℃で保管するべきである。
（ｘｉｉ）プロモーターＵ６を標的とした特別注文のＴａｑｍａｎアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｑＰＣＲによりウイルスの力価を測定する。
Ｅ．Ｔ細胞電気穿孔
ヒト初代末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞を健康なドナーから獲得することができる（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｔ細胞を、５％ヒトＡＢ血清と組換えヒトＩＬ－２ ３０Ｕ／ｍＬとを含有するＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）で培養することができる。
（ｉ）電気穿孔の前に２日間、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化する。
（ｉｉ）磁気ホルダーを使用してＤｙｎａｂｅａｄｓを除去する。
（ｉｉｉ）電気穿孔緩衝剤Ｒ（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ）中、１０μＬチップ反応当たり２×１０５個の細胞または１００μＬチップ反応当たり２×１０６個の細胞の密度で、細胞を調製する。
（ｉｖ）反応体積に従って１μｇまたは１０μｇの改変ＮＬＳ－ＬｂＣｐｆ１－ＮＬＳ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）と混合する。
（ｖ）プログラム２４（１，６００Ｖ、１０ｍｓおよび３パルス）で電気ショックを与える。
（ｖｉ）電気穿孔後直ちに２００μｌまたは１ｍＬの予温Ｘ－ＶＩＶＯ培地（抗生物質不含）に細胞を移入する。
（ｖｉｉ）電気穿孔の２～４時間後に指示体積のＡＡＶ（培養体積の２０％以下のＡＡＶ体積）をＴ細胞に添加する。ＣＡＲは、２～３日後に発現され始め、標的細胞での刺激後に富化されることになる。
Ｆ．フローサイトメトリーによるＣＡＲ－Ｔ検出
（ｉ）５日間にわたる電気穿孔の後、１×１０６のＣＤ２２ＢＢｚ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を０．２μｇのＣＤ２２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）と共に１００μＬのＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＥ－ＩｇＧ－ＦｃおよびＦＩＴＣ－ＣＤ３抗体で３０分間、染色する。
（ｉｉ）ＣＤ１９ＣＡＲ検出のために、ＣＤ１９ＢＢｚ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＡＰＣ－抗ＦｌａｇおよびＦＩＴＣ－ＣＤ３抗体と共に３０分間インキュベートする。
（ｉｉｉ）細胞を２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで標識細胞を定量化し、選別する。
（ｉｖ）染色パターンを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア９．９．４（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して解析することができる。
Ｇ．Ｔ７Ｅ１アッセイ
電気穿孔の５日後、バルク形質導入Ｔ細胞を回収し、Ｔ細胞を選別する。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して収集することができる。
（ｉ）ＰＣＲは、切断部位周囲のゲノムＤＮＡから標的遺伝子座を増幅する。
（ｉｉ）２％Ｅ－ｇｅｌ ＥＸ上でＰＣＲアンプリコンを泳動させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製する（公知のバンドサイズを用いて）。
（ｉｉｉ）精製後、２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性させ、アニーリングし、Ｔ７Ｅ１、３７℃、４５分（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化する。
（ｉｖ）消化されたＰＣＲ産物を２％Ｅ－ｇｅｌ ＥＸにロードし、Ｅ－Ｇｅｌ（商標）Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＤＮＡ断片存在量を定量化する。
Ｈ．ＨＤＲ定量化およびＮＧＳシークエンシング解析
１．半定量的Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲ
（ｉ）Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲに３つのプライマーを使用する：
ＴＲＡＣ第１：左ＴＲＡＣ相同アームの配列に結合する
ＴＲＡＣ第２：このＡＡＶドナーの外側のゲノム配列に結合する
ＣＤ２２ＣＡＲ第３プライマー：ｍ９７１－ＢＢｚカセットに含有されている配列を認識する
（ｉｉ）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞から単離されたゲノムＤＮＡを有する未感染対照から得られた産物との比較により、アンプリコン（標識ＴＲＡＣ－ＨＤＲ）濃度を正規化する。
（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物を製造業者のプロトコール（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製に使用することができる。
（ｉｖ）調製されたライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００計器または同等物で１００ｂｐのシングルエンドリードでシークエンシングすることができる。
２．インデル定量化
（ｉ）ゲノムＤＮＡ（Ｔ７Ｅ１アッセイと同じ試料）の切断部位周囲での増幅からの一部のＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製に使用することができる。
（ｉｉ）調製されたライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００計器または同等物（ライブラリー当たり２９００万～７４００万リードを生成する）で１００ｂｐのペアードエンドリードでシークエンシングすることができる。
（ｉｉｉ）対のリードを、－ＭオプションでＢＷＡ－ＭＥＭを使用してアンプリコン配列（インデックスを生成するためにＦＡＳＴＡ形態で提供される予想配列）にマッピングする。
（ｉｖ）アンプリコン内の予想切断部位の＋／－７５ｂｐウィンドウから外れるＳＡＭファイル中の１００ｂｐリードを廃棄する。
（ｖ）ソフトクリップリード（ＣＩＧＡＲ文字列中の文字「Ｓ」で同定される）を廃棄する。
（ｖｉ）ＣＩＧＡＲ文字列内の文字「Ｉ」または「Ｄ」の存在によりインデルリードを同定する。
（ｖｉｉ）規定されたウィンドウ内の合計（インデル＋野生型リード）に対するインデルのパーセンテージとして切断効率を定量化する。
Ｉ．共培養物の機能アッセイ
１．安定した細胞系の生成
（ｉ）ＧＦＰ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むレンチウイルスを生成する。
（ｉｉ）レトロネクチン被覆（Ｔａｋａｒａ）プレートにおける８００ｇで４５分間、３２℃でのスピノキュレーションにより２分の１に濃縮したレンチウイルスに、ＮＡＬＭ６細胞（ＡＴＣＣ）を感染させる。
（ｉｉｉ）２日間の感染後、ＧＦＰ陽性細胞（ＮＡＬＭ６－ＧＬ）をフローサイトメトリーにより選別する。
（ｉｖ）さらに２日間、培養した後、第２の選別ラウンドを行う。
（ｖ）細胞を１５０μｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と共にインキュベートし、ＩＶＩＳシステムにより生物発光シグナル強度を測定してルシフェラーゼ発現を評定する。
２．がん細胞の細胞溶解アッセイ（死滅アッセイ）
（ｉ）２×１０４のＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞を９６ウェルプレートに播種する。
（ｉｉ）改変Ｔ細胞を、ＮＡＬＭ６－ＧＬと、指示されたＥ：Ｔ比で２４時間、共培養する。
（ｉｉｉ）１５０μｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を各ウェルに添加し、プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によりルシフェラーゼアッセイ強度を測定して細胞増殖を評定する。
３．Ｔ細胞疲弊アッセイ
（ｉ）ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞と、適切なＥ：Ｔ比（例えば、０．２：１）で、適切な期間（例えば、２４時間）、共培養する。
（ｉｉ）細胞を収集し、ＤＰＢＳによって１回洗浄する。細胞を１００μＬのＤＰＢＳ中の０．２μｇのＣＤ２２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に３０分間インキュベートする。
（ｉｉｉ）細胞をＰＥ－ＩｇＧ－Ｆｃ、ＰＤ－１－ＦＩＴＣ、ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣおよびＬＡＧ３－Ｐｅｒｃｐ／ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で３０分間、染色する。
（ｉｖ）染色された細胞をフローサイトメトリーにより測定する。
４．ＩＦＮγおよびＴＮＦ－αの細胞内染色
（ｉ）５日間の感染後、ブレフェルジンＡおよび２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を補充した新鮮培地において、ＡＡＶ形質導入ＣＤ２２ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＡＬＭ６と１：１のＥ：Ｔ比で共培養する。
（ｉｉ）インキュベーションの５時間後、表面ＣＡＲを収集し、染色する。
（ｉｉｉ）固定／透過処理溶液（ＢＤ）により細胞を固定および透過処理し、細胞内染色用の抗ＩＦＮγ－ＡＰＣまたは抗ＴＮＦ－α－ＦＩＴＣを添加する。
（ｉｖ）３０分後、染色された細胞をＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝剤により洗浄し、フローサイトメトリーにより細胞を測定する。
ＩＶ．使用方法
Ａ．スクリーニング
スクリーニングを行う方法が提供される。概して、スクリーニングは、目的の１つまたは複数の表現型に関与する遺伝子を同定するために設計される。例示的な細胞表現型としては、腫瘍／腫瘍微小環境浸潤の増加、標的細胞親和性の増加、標的細胞への細胞傷害性の増大、持続性の増大、拡大／増殖の増加、疲弊の軽減、抗がん代謝機能の向上、免疫回避を防止する能力の増大、非特異的サイトカイン産生の低減、オフターゲット毒性の低下、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の軽減（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで導入されたとき）、およびこれらの組合せが挙げられる。スクリーニングは、機能喪失または機能獲得である。スクリーニングを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、培養細胞で）またはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、マウスまたはラットなどの対象において）行うことができる。
概して、スクリーニングは、細胞を、ガイドＲＮＡおよび／またはＣＡＲならびにＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）を含有するベクターのライブラリーと、接触させるステップを含む。スクリーニングは、細胞が遺伝子改変（例えば、ＣＡＲのノックインおよびその後の発現、ならびに／または標的遺伝子もしくは標的部位の変更）を受けることを可能にする条件下で行われる。スクリーニング方法は、所望の表現型を示す細胞を富化するように細胞に選択圧をかけるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、選択された細胞において富化されているまたは存在量が多い（例えば、対照ガイドＲＮＡと比較して）ガイドＲＮＡを同定するステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、選択された細胞において枯渇されているまたは存在量が少ない（例えば、対照ガイドＲＮＡと比較して）ガイドＲＮＡを同定するステップを含む。ガイドＲＮＡの富化または枯渇は、選択前の時点（例えば、０日目）、非標的化ガイドＲＮＡ、またはこれらの組合せと比べての富化または枯渇である。各ガイドＲＮＡの標的とされる遺伝子は公知であるので、ガイドＲＮＡの同定によって、目的の表現型に寄与する遺伝子の同定が可能になる。スクリーニングの結果を、スクリーニングにより同定される１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の改変（例えば、突然変異）を含有する細胞を独立して生成することにより、検証することができる。同じまたは異なるガイドＲＮＡを検証に使用することができる。
ＣＡＲを含有する細胞の所望の表現型を増強する１つまたは複数の遺伝子を同定するための例示的なスクリーニングは、（ａ）細胞の集団を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、および複数のベクターを含有するライブラリーと、接触させるステップであって、各ベクターが、独立して、（ｉ）第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードするｃｒＲＮＡ発現カセットと；（ｉｉ）ＣＡＲ発現カセットと；（ｉｉｉ）相同組換え修復（ＨＤＲ）による標的ゲノム組込みのための５’および３’相同アームとを含有する、ステップ、ならびに（ｂ）所望の表現型を示す細胞を選択するステップを含む。一部の好ましい実施形態では、複数のＡＡＶベクターにおける各ＡＡＶベクターは、特有の第２のガイドＲＮＡを含有する。接触させるステップは、ｃｒＲＮＡおよびＣＡＲ発現カセットの標的ゲノム組込みならびにそれらにコードされたガイドＲＮＡおよびＣＡＲの発現を可能にする条件下で行われる。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とし、第２のガイドＲＮＡは、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞共刺激、メモリーＴ細胞分化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、エピジェネティック調節、適応免疫応答、腫瘍細胞に対する免疫応答、および／もしくは他の免疫機能、またはこれらの組合せに関与する遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、第１のガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とし、および／または細胞の集団内の第２のガイドＲＮＡは、ゲノム内の任意の遺伝子、例えば、表２もしくは表３から選択される１つもしくは複数の遺伝子を、全体として標的とする。
方法は、選択された細胞に存在するｃｒＲＮＡ発現カセットを同定するステップであって、その結果、所望の表現型を増強する遺伝子が、ｃｒＲＮＡ発現カセットによりコードされるガイドＲＮＡによるそれらの標的化に基づいて同定される、ステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ発現カセットの同定を、ゲノムＤＮＡをシークエンシングすることにより達成することができる。
Ｂ．処置方法
遺伝子改変細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を含有する医薬組成物の有効量を対象に投与することにより、対象の免疫応答を誘導するまたは増加させる方法が、提供される。
薬剤および組成物も、疾患、障害または状態を処置する方法において使用され得る。例示的な方法は、疾患、障害または状態を有する対象（例えば、ヒト）を、遺伝子改変細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を含有する医薬組成物の有効量を対象に投与することにより、処置するステップを含む。一部の実施形態では、疾患、障害または状態は、抗原の高度発現または特異的発現に関連している。一部の実施形態では、対象に投与される細胞は、抗原を標的とするＣＡＲを含有する／発現する。
一部の実施形態では、細胞は、疾患、障害もしくは状態を有する対象から、または健康なドナーから、遺伝子改変の前に単離される。例えば、一部の実施形態では、処置方法は、（ｉ）対象から細胞（例えば、Ｔ細胞）を得るステップ、（ｉｉ）異種ＣＡＲを発現するように細胞を改変するステップ、および（ｉｉｉ）改変された細胞の有効量を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、疾患、障害または状態に関連する抗原を認識する。いずれの処置方法も、遺伝子改変を受ける前および／または受けた後の細胞の集団を拡大するステップをさらに含み得る。
一部の実施形態では、ＣＡＲの組込みおよび発現に加えて、細胞は、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ、ＰＥＬＩ１、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２、ＬＡＩＲ１、ＵＳＢ１、および表２または表３に収載されている遺伝子から選択される、１つまたは複数の遺伝子（またはその遺伝子産物）の機能低下または機能喪失を引き起こす１つまたは複数の突然変異により、さらに改変される。
処置されることになる疾患
組成物を投与される対象は、疾患、障害または状態、例えば、これらに限定されるものではないが、がん、炎症性疾患、ニューロン障害、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、感染性疾患、免疫系障害、例えば自己免疫疾患、またはこれらの組合せを有し得る。
１．がん
がんは、（ｉ）成長シグナルの自給自足；（ｉｉ）抗成長シグナルに対する非感受性；（ｉｉｉ）アポトーシスの回避；（ｉｖ）持続的血管新生；（ｖ）組織浸潤および転移；（ｖｉ）無限の複製能；（ｖｉｉ）エネルギー代謝のリプログラミング；ならびに（ｖｉｉｉ）免疫破壊の回避を含む、ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇにより提案された顕著な特徴をがん細胞に獲得させる、遺伝的不安定性の疾患である（Cell.,144:646-674, (2011)）。
方法に従って処置され得る腫瘍は、腫瘍が由来する組織の胚起源によって分類される。癌腫は、内胚葉または外胚葉組織、例えば、皮膚または内臓および腺の上皮層から生じる腫瘍である。さほど頻繁に生じない肉腫は、中胚葉結合組織、例えば、骨、脂肪および軟骨に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病は、単一細胞として増殖するが、リンパ腫は、腫瘍塊として成長する傾向がある。悪性腫瘍は、身体の非常に多くの臓器または組織に現れてがんを樹立し得る。
組成物および方法は、一般に、癌腫、肉腫、リンパ腫および白血病の処置に好適である。記載される組成物および方法は、対象における腫瘍細胞の成長／増殖もしくは生存能力を遅延もしくは阻害すること、腫瘍の数、成長もしくはサイズを低減させること、腫瘍の転移を阻害もしくは低減させること、および／または腫瘍発生もしくは成長に関連する症状を抑止もしくは軽減することにより、良性または悪性腫瘍を有する対象を処置するまたは和らげるのに有用である。
一部の実施形態では、がんは、液性がん（例えば、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄系白血病、骨髄増殖性新生物、濾胞性リンパ腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、およびワルデンストレームマクログロブリン血症）である。
一部の実施形態では、がんは、固形がんである。用語「固形がん」は、嚢胞も液体エリアも通常は含有しない組織の異常な塊を指す。固形がんは、良性であることも、悪性であることもある。種々のタイプの固形がんが、それらを形成する細胞の種類に由来する名前を有する。固形がんの例としては、中皮腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺扁平上皮がん、大細胞肺がん、膵臓がん、膵管腺癌、食道腺癌、乳がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、皮膚がん、黒色腫、腎がん、肝臓がん、脳がん、胸腺腫、肉腫、癌腫、子宮がん、腎臓がん、消化管がん、尿路上皮がん、咽頭がん、頭頸部がん、直腸がん、食道がん、もしくは膀胱がん、またはこれらの転移が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2023538303000011
Figure 2023538303000012
提供される組成物および方法で処置され得るがんのタイプとしては、骨、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、結腸直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭（nasopharangeal）、膵臓、前立腺、皮膚、胃および子宮の、がん、例えば、脈管のがん、例えば多発性骨髄腫、腺癌および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、組成物は、複数のがんのタイプを同時に処置するために使用される。組成物を使用して複数の位置の転移または腫瘍を処置することもできる。
２．免疫系障害
免疫系障害も処置することができる。免疫系障害の非限定的な例としては、２２ｑ１１．２欠失症候群、軟骨形成不全および重症複合免疫不全、アデノシンデアミナーゼ２欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、抗インターフェロン－ガンマ自己抗体による成人発症型免疫不全、無ガンマグロブリン血症、非ブルトン型、アイカルディ・グティエール症候群、アイカルディ・グティエール症候群５型、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、脱毛症、完全脱毛症、全身性脱毛症、アミロイドーシスＡＡ、アミロイドーシス家族性内臓型、毛細血管拡張症性運動失調症、自己免疫性リンパ増殖症候群、ＣＬＴＡ４ハプロ不全（haploinsuffiency）に起因する自己免疫性リンパ増殖症候群、多腺性自己免疫性症候群１型、常染色体優性高ＩｇＥ症候群、常染色体劣性早期発症型炎症性腸疾患、常染色体劣性高ＩｇＥ症候群、裸リンパ球症候群２、バース症候群、ブラウ症候群、ブルーム症候群、閉塞性細気管支炎、Ｃ１ｑ欠損症、カンジダ症家族性慢性皮膚粘膜、常染色体劣性、軟骨毛髪低形成症、ＣＨＡＲＧＥ症候群、チェディアック・東症候群、ケルビズム、脂肪異栄養症および高熱を伴う慢性非定型好中球性皮膚症、慢性移植片対宿主病、慢性肉芽腫症、慢性乳児神経皮膚関節症候群、慢性皮膚粘膜カンジダ症（ＣＭＣ）、コーエン症候群、皮膚肉芽腫症を伴う複合免疫不全、分類不能型免疫不全症、補体成分２欠損症、補体成分８欠損症１型、補体成分８欠損症２型、先天性肺胞タンパク症、クリオグロブリン血症、皮膚マスト細胞腫、周期性好中球減少症、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト欠損症、樹状細胞、単球、Ｂリンパ球、およびナチュラルキラーリンパ球欠損症、先天性異常角化症、常染色体優性先天性異常角化症、常染色体劣性先天性異常角化症、Ｘ連鎖先天性異常角化症、疣贅状表皮発育異常症、家族性アミロイドーシス、フィンランド型、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、家族性混合型クリオグロブリン血症、フェルティー症候群、糖原病１Ｂ型、グリシェリ症候群２型、橋本脳症、橋本症候群、血球貪食性リンパ組織球症、ヘネカム症候群、免疫不全を伴う肝静脈閉鎖症、遺伝性葉酸吸収不全、ヘルマンスキー・パラドック症候群２、単純ヘルペス脳炎、Ｈｏｙｅｒａａｌ Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群、高ＩｇＥ症候群、高ＩｇＤ症候群、ＩＣＦ症候群、特発性急性好酸球性肺炎、特発性ＣＤ４陽性Ｔリンパ球減少症、ＩＬ１２ＲＢ１欠損症、胸腺の非存在に起因する免疫欠乏、カウシウム流入障害１に起因するＴ細胞不活性化を伴う免疫機能不全、カルシウム流入障害２に起因するＴ細胞不活性化を伴う免疫機能不全、１型高ＩｇＭを伴う免疫不全、２型高ＩｇＭを伴う免疫不全、３型高ＩｇＭを伴う免疫不全、４型高ＩｇＭを伴う免疫不全、５型高ＩｇＭを伴う免疫不全、胸腺腫を伴う免疫不全、無汗性外胚葉形成不全を伴わない免疫不全、免疫調節異常、多腺性内分泌障害・腸疾患Ｘ連鎖型、免疫グロブリンＡ欠損症２、多発性腸閉塞、ＩＲＡＫ－４欠損症、成長ホルモン単独欠損症３型、川崎病、大顆粒リンパ球性白血病、白血球接着不全症１型、ＬＲＢＡ欠損症、ループス、リンパ球性下垂体炎、マジード症候群、メルカーソン・ローゼンタール症候群、ＭＨＣクラス１欠損症、マックル・ウエルズ症候群、多巣性線維硬化症、多発性硬化症、ＭＹＤ８８欠損症、新生児全身性エリテマトーデス、ネザートン症候群、好中球二次顆粒欠損症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、オーメン症候群、常染色体劣性大理石骨病７型、回帰性リウマチ、パピヨン・ルフェルブル症候群、部分型アンドロゲン不応症、ＰＡＳＬＩ病、ピアソン症候群、小児多発性硬化症、周期熱、アフタ性口内炎、咽頭炎およびリンパ節炎、ＰＧＭ３－ＣＤＧ、好中球減少を伴う多形皮膚萎縮症、妊娠性そう痒性蕁麻疹様丘疹、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症およびざ瘡、再発性多発軟骨炎、細網異形成症、サルコイドーシス、セイ・バーバー・ミラー症候群、シムケ免疫性骨形成不全、シュニッツラー症候群、選択的ＩｇＡ欠損症、選択的ＩｇＭ欠損症、重症複合免疫不全、完全ＲＡＧ１／２欠損に起因する重症複合免疫不全、電離放射線感受性を有する重症複合免疫不全、重症複合免疫不全、常染色体劣性重症先天性好中球減少症３型、重症先天性好中球減少症Ｘ連鎖型、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、シングルトン・メルテン症候群、ＳＬＣ３５Ｃ１－ＣＤＧ（ＣＤＧ－ＩＩｃ）、特異抗体欠損症、脊椎内軟骨異形成、スティーブンス・ジョンソン症候群、Ｔ細胞免疫不全、先天性脱毛症および爪ジストロフィー、ＴＡＲＰ症候群、毛髪肝腸症候群、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、双胎間輸血症候群、Ｖｉｃｉ症候群、ＷＨＩＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ウッズ・ブラック・ノーベリー症候群、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群１、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群２、エプスタイン・バーウイルス感染および新生物を伴うＸ連鎖マグネシウム欠乏症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、ならびにＺＡＰ－７０欠損症が挙げられる。
組成物および方法を使用して、自己免疫疾患または障害を処置することもできる。上記の免疫系障害と相互排他的でない、例示的な自己免疫疾患または障害としては、アカラシア、アジソン病、成人型スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索および神経性ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキ－心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、ならびにウェゲナー肉芽腫症（または多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ））が挙げられる。
有効量
医薬組成物の有効量または治療有効量は、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状を処置する、抑止するもしくは和らげるのに、または所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果、例えば、がんなどの疾患もしくは障害の根底にある病態生理学的機序の１つもしくは複数についての低減、阻害もしくは逆行を別様に提供するのに十分な投薬量であり得る。
一部の実施形態では、医薬組成物の投与は、抗がん応答を惹起し、投与される量は、レシピエントにおいて所望の抗がん効果を達成するのに有効な量として表され得る。例えば、一部の実施形態では、医薬組成物の量は、レシピエントにおけるがん細胞の生存能力または増殖を阻害するのに有効である。一部の実施形態では、医薬組成物の量は、レシピエントにおける腫瘍負荷量の低減に、またはがん細胞の総数の低減に、およびこれらの組合せに有効である。他の実施形態では、医薬組成物の量は、がん患者におけるがんの１つまたは複数の症状または兆候を軽減するのに有効である。がんの兆候は、がんのマーカー、例えば、患者の血液中のＰＳＭＡレベルを含み得る。
必要とされる医薬組成物の有効量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、処置される障害の重症度、治療用化合物の特質（活性、薬物動態、薬力学、およびバイオアベイラビリティーを含む）、ならびにその投与様式に依存して、対象によって異なるであろう。したがって、あらゆる医薬組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかし、当業者は、開示される教示を考えれば、日常の実験のみを使用して適切な量を決定することができる。例えば、医薬組成物を投与するための有効な投薬量およびスケジュールを経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは、当技術分野における技能の範囲内である。さらなるガイダンスについては、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000)を参照されたい。一部の実施形態では、組成物の投与のための投薬量範囲は、例えば、がん細胞増殖もしくは生存能力の低減を生じさせるのにまたは腫瘍負荷量を低減するのに十分なほど大きい範囲である。
投薬量は、有害な副作用、例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど大きくてはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態および性別、投与経路、他の薬物がレジメンに含まれているどうか、ならびに処置されることになる疾患のタイプ、病期および位置によって変わることになる。投薬量は、何らかの禁忌がある場合、個々の医師によって調整され得る。処置に使用される組成物の有効投薬量が特定の処置の過程で増加または減少し得ることも理解されるであろう。投薬量の変化は、結果として生じ、診断アッセイの結果から明らかになり得る。
一般に、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物は、１０４～１０９個の細胞／ｋｇ体重、好ましくは、１０５～１０６個の細胞／ｋｇ体重の、これらの範囲内の全ての整数値を含む、投薬量で投与され得る。ＣＡＲ Ｔ細胞組成物を、これらの投薬量で１回または複数回、投与することもできる。免疫療法において一般に公知である注入技法を使用することにより、細胞を投与することができる。特定の患者のための最適な投薬量および処置レジームを、薬の分野の当業者は、疾患の徴候について患者をモニターし、相応して処置を調整することによって容易に決定することができる。一部の実施形態では、単位投薬量が、静脈内注射、経口投与、吸入、または腫瘍内注射用の単位剤形中にある。
１つまたは複数の所望の治療目標、例えば、処置の開始時と比べてがん細胞の量の低減、またはレシピエントにおけるがん細胞の完全な非存在、を達成するのに十分な時間にわたって、処置を継続することができる。患者における抗がん処置の進行をモニターするための公知の任意の手段を使用して、処置の進行をモニターすることができる。一部の実施形態では、投与は、処置の中で毎日、または週に１回、または週のうちの何日かに１回、行われる。一部の実施形態では、処置レジメンは、最大２、３、４もしくは５日間、数週間もしくは数カ月にわたって、または最大６カ月間、または６カ月を超えて、例えば、最大１年間、２年間、３年間、または最大５年間、行われる。
併用療法
組成物を、単独で、または１つもしくは複数の従来の治療、例えば、処置される疾患もしくは障害のための従来の治療と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、従来の治療は、１つまたは複数の追加の活性薬剤と組み合わせた１つまたは複数の組成物の投与を含む。追加の活性薬剤は、同じ、または異なる作用機序を有し得る。一部の実施形態では、組合せは、疾患または障害（例えば、がん）の処置に相加効果をもたらす。一部の実施形態では、組合せは、疾患または障害の処置に相加効果を超える効果をもたらす。
追加の治療または手順は、組成物の投与と同時にまたは逐次的であってもよい。一部の実施形態では、追加の治療は、投薬サイクルと投薬サイクルの間、または組成物の投薬レジームの一部である休薬期間中に行われる。
併用療法は、治療剤を含む単一の医薬組成物の使用により、または同じもしくは異なる時間に２つもしくはそれより多くの別個の組成物を投与することにより達成され得る。複数の治療をいずれの順序で施してもよく、数分から数週間の範囲の間隔で他の処置に先行、またその後に続くこともある。他の薬剤が別々に適用される実施形態では、薬剤が患者に対して有利な併用効果を依然として発揮することができるような時間枠内に治療を投与することが好ましい。そのような場合、両方のモダリティが互いに約１２～２４時間以内に、より好ましくは、互いに約６～１２時間以内に投与され得ることが企図される。しかし、一部の状況では、数日（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日、またはそれを超える日数）から数週間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８週間、またはそれを超える週数）が、それぞれの投与と投与の間に経過する場合、処置の期間を延長することが望ましいこともある。
一部の実施形態では、追加の治療または手順は、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、がんワクチン（例えば、樹状細胞ワクチン）、凍結療法または遺伝子療法である。免疫療法は、１つまたは複数の免疫チェックポイント遮断剤の投与を含むが、これに限定されない。例示的な免疫チェックポイント遮断剤としては、抗体またはその抗原結合性断片、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３またはこれらの組合せの阻害剤である抗体またはその抗原結合性断片、例えば、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、ＰＤＲ００１（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、ニボルマブ（抗ＰＤ１ ｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、およびＲＧ７８７６（ＣＤ４０アゴニストｍＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
併用療法での使用に好適であるさらなる治療剤は、従来のがん治療薬、例えば、化学療法剤、サイトカイン、およびケモカインを含む。使用され得る化学療法剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害薬、アントラサイクリン系薬剤、細胞傷害性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定のタイプのがん（慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍）における分子異常を直接標的とする、モノクローナル抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）またはＧＬＩＶＥＣ（登録商標））も、使用され得る。他の好適な抗がん剤としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体、例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））およびｒｈｕＦＡｂ Ｖ２（ラニビズマブ、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、他の抗ＶＥＧＦ化合物を含む、血管新生阻害剤；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））およびその誘導体、例えば、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））；エンドスタチン；アンジオスタチン；受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、例えば、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、パゾパニブ、アキシチニブ、およびラパチニブ；トランスフォーミング増殖因子－αまたはトランスフォーミング増殖因子－β阻害剤；ならびに上皮増殖因子受容体に対する抗体、例えば、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））およびセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））が、挙げられる。
使用され得るさらなる代表的な化学療法剤としては、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン、エピルビシン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド（hydroxycarb amide）、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン（innotecan）、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン（daunorubici）、ロムシチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テニポシド、テガフール－ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソールおよびその誘導体、トラツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブ、ならびにリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）またはＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアポトーシス促進剤としては、フルダラビンタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ－ＰＧＪ（２）５、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、組成物および方法は、例えば、原発性腫瘍の転移を予防するために、腫瘍の外科的切除の前にまたはそれと併せて使用される。一部の実施形態では、組成物および方法は、身体自体の抗腫瘍免疫機能を増強するために使用される。
Ｖ．キット
遺伝子編集組成物、試薬、組成物、および他の材料を、方法の実施にまたは方法の実施の補助に有用なキットとして、任意の好適な組合せで一緒に包装することができる。所与のキット内の構成成分が方法で一緒に使用するために設計され、それに適している場合、有用である。例えば、対象への投与のための１つまたは複数の組成物を有するキットは、滅菌針、アンプル、管、入れ物または他の好適な容器内に予め測定された投薬量の組成物を含み得る。キットは、投薬量および投薬レジメンについての使用説明書を含み得る。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）と、ＡＡＶ ｃｒＲＮＡライブラリーと、その使用のための教材とを含有するキットが提供される。好ましい実施形態では、ライブラリーは、各ベクターが、１つまたは複数のｃｒＲＮＡ（例えば、２つの別個のｃｒＲＮＡ）をコードするｃｒＲＮＡ発現カセットと必要に応じてＣＡＲ発現カセットとを独立して含有する、複数のベクターを含む。一部の実施形態では、キットは、ＡＡＶ ｃｒＲＮＡライブラリーを全体として含有する、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を含有し得る。教材は、キットの組成物および方法の有用性を伝えるために使用され得る、刊行物、記録、図表または任意の他の表現手段を含み得る。例えば、教材は、キット構成成分を使用する方法、例えば、トランスフェクション、形質導入、感染を実行する、およびスクリーニングを実施する方法、についての使用説明書を提供し得る。
方法および組成物が、別段の指示がない限り、特定の合成方法にも、特定の分析技法にも、特定の試薬にも限定されず、しかるが故に変わり得ることを理解されたい。使用される用語法が特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定となるように意図されたものでないことも、理解されたい。
以下の番号の項を参照することにより、本発明をさらに理解することができる。
１．２つまたはそれより多くの複数のベクターを含むライブラリーであって、各ベクターが、
１つまたは複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、５’相同アーム、ｃｒＲＮＡ発現カセット、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセット、および３’相同アーム
を含む、ライブラリー。
２．各ベクターのｃｒＲＮＡ発現カセットが、独立して、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードし、第１のガイドＲＮＡが、複数のベクターにわたって同一である、項１のライブラリー。
３．第２のガイドＲＮＡが、複数のベクターにわたって各ベクターに特有のものである、項１または２のライブラリー。
４．ライブラリーの、コードされるガイドＲＮＡのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の配列が、配列番号３～１２，１３４からなる群から選択される、項１～３のいずれか一項のライブラリー。
５．約１００～約３００，０００、約１，０００～約５，０００、または約５０００～約１０，０００の別個のガイドＲＮＡを全体として含む、項１～４のいずれか一項のライブラリー。
６．配列番号３～４，０８７（Ｒｅｎｅライブラリー）、配列番号４，０８８～１２，１３４（Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー）、または配列番号３～１２，１３４によりコードされるガイドＲＮＡを全体として含む、項１～７のいずれか一項のライブラリー。
７．各ｃｒＲＮＡ発現カセットが、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む、項１～６のいずれか一項のライブラリー。
８．各ｃｒＲＮＡ発現カセットが、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードする配列を含む、項１～７のいずれか一項のライブラリー。
９．ＣＡＲ発現カセットが、ＣＡＲをコードする配列に作動するように連結されたＥＦＳプロモーターおよび／またはポリアデニル化シグナル配列を含む、項１～８のいずれか一項のライブラリー。
１０．各ベクターのｃｒＲＮＡ発現カセットおよび／またはＣＡＲ発現カセットが、５’相同アームと３’相同アームの間に位置する、項１～９のいずれか一項のライブラリー。
１１．５’および３’相同アームが、ＴＲＡＣ遺伝子座と相同である、項１～１０のいずれか一項のライブラリー。
１２．各ベクターが、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、項１～１１のいずれか一項のライブラリー。
１３．ＣＡＲが、１つまたは複数のがん特異的抗原またはがん関連抗原を標的とする、項１～１２のいずれか一項のライブラリー。
１４．ＣＡＲが、抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたは抗ＣＤ２２ ＣＡＲである、項１～１３のいずれか一項のライブラリー。
１５．第２のガイドＲＮＡが、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞共刺激、メモリーＴ細胞分化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、エピジェネティック調節、適応免疫応答、腫瘍細胞に対する免疫応答、他の免疫機能、またはこれらの組合せに関与する遺伝子を標的とする、項２～１４のいずれか一項のライブラリー。
１６．ベクターが、
ＴＲＡＣ標的化ｃｒＲＮＡをコードする配列を伴うもしくは伴わない、ＢｂｓＩクローニング部位に必要に応じて挿入された１つもしくは複数の追加のｃｒＲＮＡコード配列を伴うもしくは伴わない、および／または既存のＣＡＲコード配列もしくはその代わりに用いられる別のＣＡＲコード配列を伴う、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは
上述のもののいずれかに対して７５％またはそれより高い配列同一性を有する配列バリアントを含む、
項１～１５のいずれか一項のライブラリー。
１７．各ベクターが、ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、必要に応じて、ＡＡＶが、ＡＡＶ６である、項１～１６のいずれか一項のライブラリー。
１８．項１～１７のいずれか一項のベクター。
１９．項１８のＡＡＶベクターを含む細胞の集団。
２０．必要に応じて、各細胞が、ライブラリーに含まれる多くて１つまたは２つのＡＡＶベクターを含む、項１～１７のいずれか一項のライブラリーを全体として含む細胞の集団。
２１．ＣＡＲを含む細胞の所望の表現型を増強する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）項２０の細胞の集団を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、ベクターに含有されるガイドＲＮＡおよびＣＡＲのゲノム組込みおよび発現に好適な条件下で接触させるステップ；ならびに
（ｂ）所望の表現型を示す細胞を選択するステップ
を含む、方法。
２２．ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットが、ＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれる、項２１の方法。
２３．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするウイルスベクター、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質とＲＮＡの複合体として提供される、項２１または２２の方法。
２４．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、電気穿孔により提供される、項２３の方法。
２５．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１、またはその活性バリアント、誘導体もしくは断片である、項２１～２４のいずれか一項の方法。
２６．所望の表現型が、腫瘍／腫瘍微小環境浸潤の増加、標的細胞親和性の増加または最適化、標的細胞への細胞傷害性の増大、持続性の増大、拡大／増殖の増加、疲弊の軽減、抗がん代謝機能の向上、免疫回避を防止する能力の増大、非特異的サイトカイン産生の低減、オフターゲット毒性の低下、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の軽減、およびこれらの組合せを含む群から選択される、項２１～２５のいずれか一項の方法。
２７．選択するステップが、細胞の集団を、ＣＡＲにより認識される１つもしくは複数の抗原を含む標的細胞と、規定された期間、共培養すること、フローサイトメトリーに基づくもしくは親和性に基づく選別、免疫マーカーに基づく選択、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍浸潤、ＣＡＲ－抗原相互作用、指向性進化、またはこれらの組合せを含む、項２１～２６のいずれか一項の方法。
２８．細胞の集団が、標的細胞と繰り返し共培養される、項２７の方法。
２９．期間が、約１～約６０日を含む、項２７または２８の方法。
３０．標的細胞が、がん細胞を含む、項２７～２９のいずれか一項の方法。
３１．選択された細胞に存在するｃｒＲＮＡ発現カセットを同定するステップをさらに含む、項２１～３０のいずれか一項の方法。
３２．ｃｒＲＮＡ発現カセットを同定するステップが、選択された細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む、項３１の方法。
３３．所望の表現型を増強する１つまたは複数の遺伝子が、ｃｒＲＮＡ発現カセットによりコードされるガイドＲＮＡの標的とされる遺伝子として同定される、項３１または３２の方法。
３４．細胞の集団が、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｆｈ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、または他の免疫細胞を含む、項２１～３３のいずれか一項の方法。
３５．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、項３４の方法。
３６．ＣＡＲと、項２１～３５のいずれか一項の方法により同定された１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異とを含む、単離されたＣＡＲ Ｔ細胞。
３７．１つまたは複数の突然変異が、１つもしくは複数の遺伝子またはその遺伝子産物の機能の低下を引き起こす、項３６のＣＡＲ Ｔ細胞。
３８．１つまたは複数の遺伝子が、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ、ＰＥＬＩ１、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２、ＬＡＩＲ１、およびＵＳＢ１を含む群から選択される、項３６または３７のＣＡＲ Ｔ細胞。
３９．１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異を含まないＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、メモリーの増加、細胞増殖の増加、持続性の増大、標的細胞に対する細胞傷害性の増大、Ｔ細胞最終分化の減少、および／またはＴ細胞疲弊の軽減を示す、項３６～３８のいずれか一項のＣＡＲ Ｔ細胞。
４０．項３６～３９のいずれか一項のＣＡＲ Ｔ細胞を拡大することにより得られる、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団。
４１．項４０のＣＡＲ Ｔ細胞の集団と、薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
４２．疾患、障害または状態を有する対象を処置する方法であって、項４１の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法。
４３．疾患、障害または状態が、抗原の高度発現または特異的発現に関連している、項４２の方法。
４４．ＣＡＲ Ｔ細胞が、抗原を標的とする、項４３の方法。
４５．細胞が、健康なドナーから、または疾患、障害もしくは状態を有する対象から、１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異の導入前に単離された、項４２～４４のいずれか一項の方法。
４６．疾患、障害または状態が、がん、炎症性疾患、ニューロン障害、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、感染性疾患、または自己免疫疾患である、項４２～４５のいずれか一項の方法。
４７．がんが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫を含む群から選択される白血病またはリンパ腫である、項４６の方法。
４８．対象が、ヒトである、項４２～４７のいずれか一項の方法。
４９．配列番号３～１２，１３４からなる群から選択される１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む１つまたは複数のｃｒＲＮＡ発現カセットとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットとを含む異種核酸構築物を含む細胞。
５０．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットをコードする異種核酸構築物と、配列番号３～１２，１３４およびからなる群から選択される１つまたは複数のガイドＲＮＡの標的とされる１つまたは複数の遺伝子遺伝子座における発現の低減または消失とを含む細胞。
５１．異種核酸構築物が、細胞のゲノム内のＴＲＡＣ遺伝子遺伝子座に存在し、必要に応じて、ＣＡＲが、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２２ ＣＡＲである、項４９または５０の細胞。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。
（実施例１）
超並列ＣＡＲ－Ｔ操作のためのＣＬＡＳＨ系の確立
材料および方法
ＣＬＡＳＨ ＡＡＶ構築物の設計および生成
ＣＬＡＳＨ ＡＡＶベクター（ｐＡＡＶ－ＬＨＡ－Ｕ６－ＤＲ－ｃｒＴＲＡＣ－ＤＲ－ＢｂｓＩ－ＥＦＳ－ＣＡＲ－ｓｃＦｖ－ＲＨＡまたはｐＸＤ６０）を生成するために、ＴＲＡＣ ＨＤＲアームおよびＣＤ２２ＢＢｚ／ＣＤ１９ＢＢｚ ＣＡＲを以前に報告された通りに増幅した（Dai X., et al., Nat. Methods, 16:247-254 (2019)）。ＴＲＡＣ遺伝子座の第１のエクソンを標的とする１個のガイド、および二重ＢｂｓＩ切断部位を含有するｃｒＲＮＡカセットを、左ＴＲＡＣアームの後ろに挿入した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーおよび伝統的な制限クローニングを使用して、異なる断片をクローニングした。
ＲｅｎｅおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓ Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡライブラリーの設計
Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーは、９５４種の遺伝子（表２を参照）を標的とする８，０４７種のｃｒＲＮＡ（配列番号４，０８８～１２，１３４）を含有し、遺伝子当たり約８種のｃｒＲＮＡおよび１０００種の非標的化対照（ＮＴＣ）を有する。次の遺伝子リストからスーパーセットとして目的の遺伝子を選んだ：Ｔ細胞疲弊（Wherry EJ., et al., Immunity 27, 670-684 (2007)）、エピジェネティック調節因子（Arrowsmith CH., et al., Nature reviews Drug discovery 11, 384-400 (2012)）、Ｔ細胞共刺激（ＧＯ：００３１２９５）、メモリーＴ細胞分化（ＧＯ：００４３３７９）、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路（ＧＯ：００５０８５２）、適応免疫応答（ＧＯ：０００２２５０）、腫瘍細胞に対する免疫応答（ＧＯ：０００２４１８）、Ｔ細胞増殖（ＧＯ：００４２０９８）およびＴＥＴ２。Ｒｅｎｅライブラリーは、Ｔ細胞疲弊、エピジェネティック調節因子、Ｔ細胞共刺激（ＧＯ：００３１２９５）、メモリーＴ細胞分化（ＧＯ：００４３３７９）およびＴＥＴ２を含む、４７２種の遺伝子（表３を参照）を標的とする４，０８５種のｃｒＲＮＡ（配列番号３～４，０８７）を含有する。合計５００種の非標的化対照（ＮＴＣ）ｃｒＲＮＡを、Ｒｅｎｅライブラリーにスパイクした。Ｄｅｅｐ Ｃｐｆ１（Kim HK., et al., Nat Biotechnol., 36(3):239-241 (2018)）を使用した選択のために全ｃｒＲＮＡをスコア化した。
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ライブラリーおよび個々のｃｒＲＮＡのクローニングおよび調製
ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙによってＲｅｎｅおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーを合成した。ＲｅｎｅおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーの両方を、２ラウンドＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってＰＣＲ産物を精製した。ＤｅｓｃａｒｔｅｓのｃｒＲＮＡライブラリーを、ＢｂｓＩ消化による直鎖化およびＧｉｂｓｏｎアセンブリーによってＣＬＡＳＨ ＡＡＶプラスミドへとクローニングした。ＧｉｂｓｏｎアセンブリーＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー産物を、電気穿孔によって高効率コンピテント細胞（Ｅｎｄｕｒａ）へと形質転換した。コロニー計数による電気穿孔後に、≧１００×の推定ｃｒＲＮＡライブラリーカバレッジが観察された。全ての細菌をプールに収集し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドライブラリーを精製した。ライブラリープラスミドにおけるｃｒＲＮＡの表現をＮＧＳによって検証した。
ＡＡＶ６のパッケージングおよび精製
Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー、空ベクター、または個々の遺伝子標的化ＣＬＡＳＨベクターを、ＡＡＶ６血清型ベクターによってパッケージングして、ヒトＴ細胞を標的化した。手短に説明すると、ＡＡＶ６血清型プラスミド、充填プラスミドｐＤＦ６およびＡＡＶ６導入遺伝子ベクタープラスミドを１．７：２：１の比で添加し、次いでポリエチレンイミンを添加し、ボルテックスによって十分に混合した。溶液を室温に１０～２０分間置き、次いでこれを、１５ｃｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）における８０～９０％集密度でＨＥＫ２９３ＦＴ細胞上に滴下して添加した。トランスフェクション７２時間後に、トランスフェクトされた細胞をＰＢＳにより捕集した。ＡＡＶ精製のために、トランスフェクトされた細胞を純粋クロロホルムと混合し（１：１０体積）、激しく振盪しつつ３７℃で１時間インキュベートした。１Ｍの最終濃度となるように純粋ＮａＣｌを添加し、次いで試料を２０，０００ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。水層を別のチューブに移し、一方でクロロホルム層を廃棄した。１０％（ｗ／ｖ）となるようにＰＥＧ８０００を添加し、続いて激しく振盪して溶解させ、混合物を４℃で１時間インキュベートした。試料を２０，０００ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。次いで、上清を廃棄し、ペレットを、ＭｇＣｌ２を含有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）に再懸濁した。溶解された溶液を、ユニバーサルヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処置し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。クロロホルムを添加し（１：１体積）、続いてボルテックスにかけ、１４，０００ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。水層を１００ｋＤａ分子カットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内に落とし、３０００ｇで遠心分離して、ウイルスを濃縮した。Ｕ６プロモーターに標的化されたカスタムＴａｑｍａｎアッセイを使用した定量的ＰＣＲによってウイルスを用量設定した。
ライブラリースケールＡＡＶ形質導入
ヒト初代末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。製造業者のプロトコールに従ってヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。５％ヒトＡＢ血清および組換えヒトＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍＬを含むＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）においてＴ細胞を培養した。２日間にわたりＴ細胞解凍後に電気穿孔を行った。電気穿孔緩衝剤Ｒ（Ｎｅｏｎトランスフェクション系キット）中、１００μＬチップ反応当たり約２．５×１０６個の細胞の密度で細胞を調製した。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー電気穿孔につき合計２０回の反応を設定した。反応毎に、Ｔ細胞を１０μｇの修飾ＮＬＳ－ＬｂＣｐｆ１ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）と混合し、プログラム２４（１，６００Ｖ、１０ミリ秒および３回のパルス）で電気ショックを与えた。電気穿孔後に、細胞を１ｍＬの予熱したＸ－ＶＩＶＯ培地（５％ヒトＡＢ血清を含むが抗生物質を含まない）に直ちに移した。細胞当たりのウイルス粒子（ｖｐ）の推定数（ＭＯＩ＝１×１０３～１０４ｖｐ／ｃ）における指し示されている体積のＡＡＶ６を、２～４時間にわたる電気穿孔後にＴ細胞に添加した。パッケージングの際に空／欠陥ＡＡＶが存在し、これによりＡＡＶが非感染性となるという事実により、実際の感染性ｖｐは多くの場合より低く、機能的感染力を、１×１０３～１０４ｖｐ／ｃよりも低くする。Ｔ細胞が、２つ以上のＡＡＶを有し得ることが可能であるが、Ｔ細胞は、２コピーのゲノムのみを有し、したがって、ＣＬＡＳＨ ＨＤＲノックイン設計は、ｃｒＲＮＡ組込みに上限を定め、よって、各細胞は、２個以下の異なる組み込まれたｃｒＲＮＡを有することができる。形質導入５日後に、ＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージが１０．９％であり、匹敵するスクリーニング期間（term）において０．１０９６の有効感染多重度（有効ＭＯＩ）を生じることが観察された。
ヒトＴ細胞における超並列ＨＤＲノックインの検証
５日間にわたる電気穿孔の後に、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することにより、超並列操作されたＴ細胞プールのゲノムＤＮＡを抽出した。Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを使用して、ｇＤＮＡから組み込まれた断片を増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｙａｌｅ）によってシークエンシングした。
複製
全実験を少なくとも２回の生物学的複製により行った。実験的複製は、適宜、各図の対応する記載に指し示されている。
結果
現在、様々な課題のため、ハイスループットＣＡＲ－Ｔ操作のための手法は存在しない。したがって、ＡＡＶの有利な特色とＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１遺伝子編集系に基づきＣＬＡＳＨ系を築いた。ＡＡＶベクターを活用して、導入遺伝子に３種の構成成分がコードされた：標的化されたノックインのための相同組換え修復（ＨＤＲ）アーム、ＣＡＲ発現カセット、および遺伝的マニピュレーションのためのＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）発現カセット（図１）。ＨＤＲを使用して、ゲノム内のいかなる場所を標的化することもできるが、臨床的に関連性があるＣＡＲノックインのためにＴＲＡＣ遺伝子座を先ず標的化した。持続性等のその表現型について全バリアントを直接的に比較できるように、ＣＡＲ発現カセットの基礎を標準化することができる。ｃｒＲＮＡは、単一エレメントであり得る、または単純な分子クローニングによってプールされた様式で容易に操作することができる。トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）独立の利点により、同じポリメラーゼＩＩＩプロモーター下で発現されるように複数のｃｒＲＮＡを操作することができる。３種の構成成分を発現するＡＡＶベクター（ＣＬＡＳＨ ＡＡＶベクター、略してＣＬＡＳＨベクター）を操作した：（１）ＣＤ２２－ｓｃＦｖ、膜貫通ドメイン（ＴＭ）およびシグナル伝達ドメイン（４－１ＢＢ、ＣＤ３ｚ）を有する抗ＣＤ２２ ＣＡＲ構築物（略してＣＡＲ２２）；（２）ノックインを容易にするための、ＴＲＡＣの第１のエクソンの５’末端を標的化する構成的ｃｒＲＮＡ；ならびに（３）いかなるセットの遺伝子に対する実際的にいかなる数のｃｒＲＮＡも検査するための、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１直列反復配列（ＤＲ）によってｃｒＴＲＡＣから分離されたワイルドカード（wildcard）ｃｒＲＮＡカセット。これらの構成成分には全て、同じ位置に同時にノックインされ得るように、５’－および３’－ＴＲＡＣ ＨＤＲアームが隣接している（図１）。ＣＬＡＳＨ ＡＡＶベクターは、これにより、１つの設定において３つの別個の機能を提供した：ＴＲＡＣ遺伝子座へのノックイン、ＣＡＲ発現、および標的化された突然変異誘発。
ヒト初代Ｔ細胞における超並列ＣＡＲノックインを可能にするために、ＣＬＡＳＨ媒介性ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞操作のためのワークフローを開発し最適化した（図１）。このワークフローにおいて、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡを電気穿孔によってヒト初代ＣＤ８ Ｔ細胞に先ず送達し、次いでＣＬＡＳＨベクターまたはライブラリーをコードするＡＡＶ６により形質導入する。ＣＬＡＳＨのＣＡＲ生成効率を検査するために、形質導入後５日目に、Ｔ細胞へのＣＡＲのオンターゲット組込みをＦＡＣＳによって測定した。ＴＣＲと表面複合体を形成するＣＤ３について染色することにより、ＴＲＡＣノックダウン効率（ＣＤ３－）は、＞６０％であると決定され、それぞれドナー２およびドナー３ ＣＤ８ Ｔ細胞において３７．４％および５１％のＣＡＲ２２のオンターゲット組込み（ＣＤ３－ＣＡＲ２２＋）であった。
免疫学的に関連性がある標的による超並列ＣＡＲ－Ｔ操作（ＣＡＲ－Ｔ大量操作）を達成するために、２種のＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡライブラリーを、標的化された突然変異誘発によりワイルドカードｃｒＲＮＡ位置を多様化させるように設計した。最初のライブラリーであるＤｅｓｃａｒｔｅｓは、９５４種の免疫遺伝子（表２を参照）を標的とする８，０４７種のｃｒＲＮＡを含有し、大部分の遺伝子について遺伝子当たり８種のｃｒＲＮＡ、および１０００種の非標的化対照（ＮＴＣ）を有した（図２Ａ）。Ｔ細胞疲弊（Wherry et al., 2007）、エピジェネティック調節因子（Arrowsmith et al., 2012）、Ｔ細胞共刺激、メモリーＴ細胞分化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路、適応免疫応答、腫瘍細胞に対する免疫応答、Ｔ細胞増殖、および同様にエピジェネティック調節因子であるＴＥＴ２に関係付けられる遺伝子セットから、スーパーセットとして免疫遺伝子を選んだ。同様に、より精密化された遺伝子セットを標的とする４，０８５種のｃｒＲＮＡを含有する、より小さいライブラリーであるＲｅｎｅも設計した（表３）。Ｄｅｅｐ Ｃｐｆ１（Kim et al., 2018）を使用して選択のために全ｃｒＲＮＡをスコア化して、潜在的な遺伝子編集効率を増強し、潜在的なオフターゲット効果を低減させた。これらのライブラリーをＣＬＡＳＨ ＡＡＶベクターへとクローニングした。ベクター特異的プライマー読み取りを使用した次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によってライブラリー組成を検証した。
（ｉ）ＣＬＡＳＨ構築物全体が、ヒトＴ細胞ゲノムにおけるＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれたか否か、および（ｉｉ）ノックインのスケールが、Ｔ細胞の同じプールにおける複数の構築物について達成されたか否かを検査するために、５’－および３’－ＨＤＲアームの外側にあるゲノム領域に隣接する特異的プライマーを使用して、ＡＡＶドナーではなくゲノム領域を増幅し、挿入された領域をシークエンシングした。サンガーシークエンシング結果は、第１に、設計されたノックイン領域が、ゲノムＤＮＡに実際に存在したこと；および第２に、多様なｃｒＲＮＡがヒトＴ細胞の標的化されたプールに存在することを指し示す、ｃｒＲＮＡワイルドカード領域に明らかな配列縮重があったことを示した。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＡＡＶプラスミドおよびＴＲＡＣ遺伝子座におけるプールされたＤｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞ゲノムＤＮＡのサンガーシークエンシング結果は、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＡＡＶプラスミドプールおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＬＡＳＨノックインゲノムＤＮＡプールの両方でライブラリー部位における縮退を示したが、いずれのベクター対照においてもこれを示さなかった。観察されたプールされたノックインの成功により、このＣＬＡＳＨ系は、このようにして、ヒトＴ細胞におけるカスタム定義されたライブラリースケールでの定義されたゲノムに組み込まれたＣＡＲのハイスループット生成のためのプラットフォームを提供した。
（実施例２）
ＣＬＡＳＨは、プールされたＣＡＲ－Ｔバリアントのハイスループット操作および長期共培養における選択を媒介する
材料と方法
長期ＣＡＲ－Ｔ共培養のＣＬＡＳＨ時間経過動態
ＮＬＳ－ＬｂＣｐｆ１ｍＲＮＡによる電気穿孔の後に、Ｔ細胞をベクターまたはＤｅｓｃａｒｔｅｓ ＡＡＶ６に感染させた。５日間にわたる電気穿孔の後に、陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ３およびＣＡＲ特異的抗体による染色によって決定した。ｃｒＲＮＡ当たり２０×形質導入細胞の最小表現により、複製当たり２×１０６個の陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。低いＥ：Ｔ（０．２：１）比でＴ細胞をＮＡＬＭ６と共培養した。ＮＡＬＭ６のクリアランス後に、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞が疲弊されるまで、新たなラウンドの刺激を行った。各ラウンドの刺激後に、Ｔ細胞を収集し、液体窒素中で凍結した。ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。
ＣＬＡＳＨ ＣＡＲ－Ｔ共培養時間経過読み取り
各ラウンドの刺激後に、ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってＴ細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。二段階ＰＣＲ戦略を使用してｃｒＲＮＡライブラリー読み取りを行い、この戦略において、第１のＩｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを使用して、ｇＤＮＡから組み込まれた断片を増幅し、第２のＰＣＲが、適切なシークエンシングアダプターを第１のＰＣＲの産物に付加する。第１ラウンドＰＣＲに関して、サーモサイクリングパラメーターは、９８℃で１分間、２０サイクルの（９８℃で１秒間、６０℃で５秒間、７２℃で２５秒間）および７２℃で２分間であった。各ＰＣＲ反応において、ｉｎ ｖｉｔｒｏのために２μｇの総ｇＤＮＡを使用し、ｉｎ ｖｉｖｏのために５ｕｌ ＤＮＡ抽出溶液を使用した。合計３～４回の反応を使用して、ライブラリーの全表現を捕捉した。生体試料毎にＰＣＲ産物をプールし、バーコードを付けた第２のＰＣＲプライマーによる増幅のために使用した。第２ラウンドＰＣＲに関して、サーモサイクリングパラメーターは、９８℃で１分間、２８サイクルの（９８℃で１秒間、６１℃で５秒間、７２℃で１０秒間）および７２℃で２分間であった。特有にバーコードを付けた別々の生体試料を組み合わせる前に、第２のＰＣＲ産物をプールし、次いで生体試料毎に正規化した。次に、プールされた産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２％Ｅ－ゲルＥＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からゲル精製した。次いで、精製されたプールされたライブラリーをＨｉＳｅｑまたはＮｏｖａＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりシークエンシングした。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのための抗体は全て、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。フロー用抗体は全て、特に断りのない限り、染色のために１：２００希釈で使用した。表面染色のために、氷上で３０分間、ＰＢＳ中２％ＦＢＳの染色緩衝剤における表面マーカー抗体で細胞を染色した。解析前に、試料をＰＢＳ中２％ＦＢＳで２回洗浄した。ＣＡＲ染色のため、ＣＤ２２ＢＢｚ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、１００ｕＬ染色緩衝剤における０．２ｕｇ ＣＤ２２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）と共に３０分間インキュベートし、次いでＰＥ－ＩｇＧ－Ｆｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞内サイトカイン染色解析のために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＮＡＬＭ６を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において１：１ Ｅ：Ｔ比でプレーティングし、検査毎に０．２μｌのブレフェルジンＡ溶液（１０００×、クローンＢＦＡ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加して５時間おいた。インキュベーション後に、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから得た次の抗体を使用して、製造業者の使用説明書に従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）固定／透過処理溶液キット（ＢＤ）を使用して、細胞内サイトカイン染色を行った：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５抗ヒト／マウスグランザイムＢ（クローンＱＡ１６Ａ０２）、ＦＩＴＣ抗ヒトＴＮＦα［クローンＭＡｂ１１］、ＡＰＣ抗ヒトＩＦＮγ（クローンＢ２７）。
標準統計解析
全ての統計方法は、図中の対応する記載に記載されている。全ての解析のためにＰ値および統計的有意性を推定した。独立、両側性、マン・ホイットニー検定を使用して、２群を比較した。一元配置ＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡ、ダネット多重比較検定、チューキー多重比較検定を使用して、複数の群を比較した。両側独立ｔ検定を使用して、２群間のデータを解析した。複数の群比較のためにホルム・シダック方法を使用した多重ｔ検定を使用した。特異的ｐ値およびＩ型エラーカットオフ（０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１）に基づき、異なるレベルの統計的有意性にアクセスした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．およびＲＳｔｕｄｉｏを使用してデータ解析を行った。
結果
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、特に、Ｔ細胞機能障害をもたらし得るウイルスまたは腫瘍抗原への慢性曝露下では、不十分なＴ細胞増大化および持続性によって限定される（Savoldo B., et al., Clin Invest., 121(5):1822-6(2011)；Shin H., and Wherry EJ., Curr Opin Immunol., 19:408-415 (2007)）。よって、ＣＬＡＳＨ系を使用して、より持続的な形態のＣＡＲ－Ｔを迅速に同定した。スモールスケール実験において、より低いエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比でのＣＡＲ－Ｔ細胞と抗原特異的腫瘍細胞との反復した共培養が、各ラウンドの共培養後に、Ｔセントラルメモリー細胞集団（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）減少ならびに継続的曝露によりＩＦＮγおよびＴＮＦαを発現する能力減少により、Ｔ細胞分化を有意に促進したことが観察された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ長期培養系は、その撹乱が慢性抗原曝露によるＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命および細胞傷害性を増加させ得る遺伝子を同定するように設計した（図２Ｂ）。上で確立されたパイプラインにより、ＡＡＶ－ＣＬＡＳＨ Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂを使用して、ＴＲＡＣノックインヒトＣＡＲ－Ｔバリアントのプールを迅速に生成した。空ＣＬＡＳＨベクターを使用して、その他の点では同一であるが追加の突然変異誘発がない、対照ノックインＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。ベクターまたはＤｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＡＡＶ６による形質導入後に、対照またはプール突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞を、５４日間にわたり０．２のＥ：Ｔ比でＮＡＬＭ６細胞と共に反復的に共インキュベートし、ゲノムＤＮＡプレップおよびディープシークエンシングのために各ラウンドでそれらの画分を捕集した。各ＣＬＡＳＨ Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ ＣＡＲ－Ｔプールが、マッチした時系列を有するように、３種の独立した系列により長期培養を行った。
最初に（０日目に）、ベクターおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞プールは、同様の免疫表現型を示した。組織培養の間に、複数ラウンドの共培養後のがん細胞対ＣＡＲ－Ｔ細胞比の動的変更が観察され、プール内の選択を指し示した（図２Ｂ）。５４日目における最後のラウンドの刺激の後に、ベクターＣＡＲ－Ｔは、死滅能力を失っており、９０．６％ＮＡＬＭ６細胞（ＣＤ８－ＣＡＲ２２－）が残っており、一方、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、劇的により効率的な腫瘍細胞クリアランスを有しており、２．７％のみのＮＡＬＭ６細胞（ＣＤ８－ＣＡＲ２２－）が残っていた。ベクターおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるセントラルメモリーＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは、刺激前に異なっていなかった。しかし、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーは、プールにおける有意に増加したＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋細胞集団によって指し示される通り、５４日目にＴ細胞終末分化を有意に防止した（図２Ｃ）。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－ＬｉｂプールＣＡＲ－Ｔ細胞が、長期共培養後に細胞傷害性を維持するか否か調べるために、５時間にわたる特異的抗原による再刺激後にＦＡＣＳによって細胞内ＩＦＮγおよびＴＮＦαを測定した。ベクターＣＡＲ－Ｔと比較して、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞プールは、エンドポイント（ｄ５４）でより高いレベルのＩＦＮγを示したが、ＴＮＦαはそうではなかった（図２Ｄ～図２Ｅ）。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞プールは、ＰＤ－１およびＬＡＧ３の表面レベル減少を伴うＴ細胞疲弊低減を示したが、ＴＩＧＩＴに変化はなかった（図２Ｆ～図２Ｈ）。総体的集団レベルでのプール突然変異体ｖｓ．野生型ＣＡＲ対照の間の差における観察は、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂプールにおける突然変異体バリアントの少なくともサブセットが、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞の様々な表現型のシフトに寄与したことを指し示した。
長期共培養における候補ＣＡＲ－Ｔバリアントの同定および検証
バリアントの実際の組成および動態を決定するために、ライブラリー読み取り方法を最適化し、全試料に及ぶＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーにおけるｃｒＲＮＡ表現を決定した、ＣＡＲ－Ｔ：がん細胞共培養の時間経過全体における全捕集時点で全実験的複製においてＮＧＳを行った。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＬＡＳＨノックインＣＡＲ－Ｔプールのゲノム読み取りにおけるｃｒＲＮＡ表現の相関解析を行った。諸時点にわたるｃｒＲＮＡライブラリー表現のピアソン相関を、ｌｏｇ２ ｒｐｍ値に基づき計算した。各時点で捕集された試料に関するｃｒＲＮＡ表現が、天然にクラスター形成し、他の時点の試料よりも互いに相関し、高い程度の一貫性を示唆することが観察された。諸時点に沿った対応する試料のｃｒＲＮＡ表現もまた、他の２つの非マッチング試料よりも、他の時点におけるマッチした試料に類似しており、時間経過トラジェクトリーに沿ったマッチした試料の一貫性を示す、相関ヒートマップにおけるタイルパターンを呈し、これにより、高レベルの技術的再現性を実証する。全３回の複製において、ライブラリーの多様性は、経時的に低減し、ＣＡＲ－Ｔライブラリープールは、このプロセスにおける時間勾配を指し示す累積分布関数（ＣＤＦ）プロットに示される通り、経時的にｃｒＲＮＡのより小さい画分によってますます支配されるようになった。
（実施例３）
その機能喪失がＣＡＲ－Ｔバリアントの持続性を増強する遺伝子の同定および検証
材料および方法
Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡライブラリー表現解析の一次および動的時間経過
各試料からの未加工のリード計数を、百万個当たりのリード数（reads per million）（ｒｐｍ）に変換し、次いである特定の解析のためにｌｏｇ２転換した。Ｒにおけるｃｏｒ関数を使用してヒートマップのためのピアソン相関を計算し、ｇｇｐｌｏｔのｓｔａｔ＿ｅｃｄｆを使用して経験的累積分布関数をコンピュータ処理およびプロットした。ＲＩＧＥＲおよび偽発見率（ＦＤＲ）に基づく判断基準を使用して、上位候補遺伝子を決定した。ＣＲＩＳＰＲスクリーニングのＲＩＧＥＲ解析のため、リード計数表を使用して、各日ｖｓ０日目試料から捕集されたＴ細胞試料に関する対数の倍の変化を計算して、ランダムな順序によって破壊されたランクにおけるタイ（tie）により、ｓｇＲＮＡをスコアおよびランク付けした。次いで、これらのデータを、ＲＩＧＥＲ（github.com/broadinstitute/rigerj）のＪａｖａ（登録商標）に基づくインプリメンテーションへの入力として使用して、候補遺伝子の同定のために複数のｓｇＲＮＡに及ぶ一貫した富化に基づくＰ値および遺伝子ランキングを生成した（Shalem O., et al., Science, 343:84-87 (2014)）。遺伝子ランキングのコンピュータ処理のために、２番目に高いランキングのｓｇＲＮＡおよび加重和スコアリング方法の両方を使用した。ＦＤＲに基づく解析のために、ｃｒＲＮＡは、全ての非標的化対照の存在量に基づき１．０％または５．０％の偽発見率（ＦＤＲ）閾値を使用して富化された場合、統計的に有意であると決定された。複数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング読み取りに及び一次および動的時間経過ｃｒＲＮＡ表現解析の両方を行った。ベン図および他の視覚化、ヒートマップ、ならびに統計解析を含むもののために、カスタムＲスクリプトを使用した。
個々の遺伝子撹乱によるＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔの生成
ＢｂｓＩ消化による直鎖化および急速ライゲーションキット（ＮＥＢ）によって、個々のｃｒＲＮＡをＣＬＡＳＨベクタープラスミドにクローニングした。ライゲーションされた産物を、４２℃９０秒間の熱ショックによってＳｔｂｌ３コンピテント細胞へと形質転換した。単一クローンを採取し、ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってプラスミドを単離した。プラスミド配列は、Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｙａｌｅ）によって確認された。
Ｔ７Ｅ１アッセイ
電気穿孔およびＡＡＶ形質導入の５日後に、陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩによって選別した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。適切なプライマーを使用して、ｃｒＲＮＡに隣接するゲノム領域のＰＣＲ増幅を行った。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＣＲのためのサーモサイクリングパラメーターは、９８℃で２分間、３５サイクルの（９８℃で１秒間、６０℃で５秒間、７２℃で１５秒間）および７２℃で２分間であった。次に、製造業者のプロトコールに従って、Ｔ７Ｅ１アッセイのためにＰＣＲアンプリコンを使用した。両側性独立ウエルチｔ検定によって統計的有意性を評価した。
Ｎｅｘｔｅｒａライブラリープレップおよびアンプリコンシークエンシング
製造業者のプロトコールに従って、Ｎｅｘｔｅｒａライブラリー調製のためにＴ７Ｅ１実験から記載されたＰＣＲ産物を使用した（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）。手短に説明すると、製造業者の推奨に従ってＮｅｘｔｅｒａ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｔａｇｍｅｎｔ Ｍｉｘを使用して、１ｎｇの精製されたＰＣＲ産物を断片化およびタグ付けし、続いて、インデックス付けプライマーおよびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターによる限定サイクルＰＣＲを行った。この増幅の後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００、Ｎｏｖａｓｅｑまたは均等物において１００ｂｐペアードエンドリードを使用して、ＤＮＡを精製およびシークエンシングした。インデル定量化のために、－ＭオプションによるＢＷＡ－ＭＥＭを使用して、予想されるアンプリコン配列にリードをマッピングした。次いで、アンプリコン内の予想される切断部位の＋／－７５ｂｐウィンドウ内に完全にマッピングされたＳＡＭファイル由来の１００ｂｐリードを同定した（ソフトクリップ（soft-clipped）リードは廃棄）。次いで、ＣＩＧＡＲストリング内の「Ｉ」または「Ｄ」文字の存在によってインデルリードを同定した。定義されるウィンドウ内の総（インデルプラス野生型）リードにわたるインデルのパーセンテージとして、切断効率を定量化した。
ＣＬＡＳＨ ＣＡＲ－Ｔ ｃｒＲＮＡスクリーニング処理
Ｃｕｔａｄａｐｔを使用して、未加工のシングルエンド（single-end）ｆａｓｔｑリードファイルをフィルタリングおよびマルチプレックス化解除（demultiplex）した。フォワード読み取りＰＣＲプライマーに含まれるバーコードについてリードをマルチプレックス化解除した。ｃｒＲＮＡの直ちに上流にある余分な配列を同定および除去するために、次の設定を使用した：ｃｕｔａｄａｐｔ －ｇ ＴＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＧＴＧＴＡＧＡＴ（配列番号１２，１３６） －ｅ ０．１ －ｍ １９ －－廃棄－トリミングされていない。次いで、Ｂｏｗｔｉｅ １．２．２におけるボウタイ－ビルドコマンドを使用して生成されたボウタイ（bowtie）インデックスを使用して、２０ｂｐ ｃｒＲＮＡ配列を、設計されたＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー配列にマッピングした。マッピングは、次の設定：ボウタイ －ｖ １ －ｍ １を使用し、ライブラリー内の各ｃｒＲＮＡにマッピングされたリードの数を定量化した。複数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ ＣＬＡＳＨ ｃｒＲＮＡライブラリー読み取りに及び、また、ＭＩＰｓ ｃｒＲＮＡ表現読み取りのために、この処理を使用した。
がんモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＲ－Ｔ表現のＣＬＡＳＨ時間経過
ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、インハウスで繁殖させた。６～８週齢の間のＮＳＧマウスを使用し、５×１０５個のＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞を静脈内に接種した。処置に先立ち、マウスを異なる群にランダムに割り当てた。２×１０６個のベクターＣＡＲ－Ｔ細胞またはＤｅｓｃａｒｔｅｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、３日後にマウスに注入して戻した。７、１１および１４日目にＮＳＧマウスを安楽死させた。脾臓および骨髄を直ちに捕集した。２分間にわたるＡＣＫ（塩化アンモニウム・カリウム（Ammonium-Chloride-Potassium））溶解緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とのインキュベーションによって赤血球細胞を溶解した。洗浄後に、ＦＡＣＳについて記載された通りに細胞表面マーカーを標識し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩによって評価した。ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を選別し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。
ＭＩＰｓライブラリー選択およびクローニング
ＭＩＰｓライブラリーは、検証由来の７種の上位ヒット遺伝子を標的とする５６種のｃｒＲＮＡを含有し、遺伝子当たりおよそ８種のｃｒＲＮＡを有する。Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーから５６種のｃｒＲＮＡを選択した。ＭＩＰｓ ＡＡＶベクターを生成するために、ＢｂｓＩ消化による直鎖化および急速ライゲーションによって、予め混合したｃｒＲＮＡをＰＸＤ６０プラスミドにクローニングした。ＭＩＰｓライブラリー産物を、電気穿孔によって高効率コンピテント細胞（Ｅｎｄｕｒａ）へと形質転換した。コロニー計数によって電気穿孔の後に、＞３００×（１６，８００個のコロニー）の推定ｃｒＲＮＡライブラリーカバレッジが観察された。全ての細菌をプールに収集した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドライブラリーを精製した。ライブラリープラスミドにおけるｃｒＲＮＡの表現をＮＧＳによって検証した。ライブラリースケールＡＡＶ形質導入と同様に、ＭＩＰｓライブラリー形質導入を行った。ＭＩＰｓライブラリー電気穿孔のために３回の反応を設定した。
ＭＩＰＳプローブ設計
以前に発表されたプロトコール（ウェブサイト：github.com/shendurelab/MIPGEN）に従ってＭＩＰＳプローブを設計し、次いで、カスタマイズされた選択アルゴリズムによって処理した。ＭＩＰｇｅｎを使用して１０７種のＭＩＰｓプローブを設計した。手短に説明すると、全５６種の特有のｃｒＲＮＡの各ｃｒＲＮＡの予測される切断部位に隣接する７７ｂｐを標的化領域として選び、これらの座標を有するベッド（bed）ファイルを入力として使用した。これらの座標は、重複する領域を含有し、これらはその後、３１種の特有の領域へと統合された。各プローブは、伸長プローブ配列、ライゲーションプローブ配列、およびＰＣＲデュプリケート除去のための６ｂｐ縮退バーコード（ＮＮＮＮＮＮ）を含有する。５，６７５ｂｐの総アンプリコンをカバーする、合計１０７種のＭＩＰプローブを設計した（配列番号１２，１３９～１２，２４５）。ＭＩＰ標的サイズに関する統計は次の通りであった：最小、１５４ｂｐ；最大、３３１ｂｐ；平均、１８３ｂｐ；中央値、１６３ｂｐ。標準オリゴ（oligo）合成（ＩＤＴ）を使用してＭＩＰｓのそれぞれを合成し、正規化し、プールした。
ＭＩＰＳ標的捕捉シークエンシング
１０日間の電気穿孔の後に、ＭＩＰＳライブラリーおよび対照群由来のＣＡＲ陽性細胞をＦＡＣＳ（ＢＤ）によって選別し、次いでＣＡＲ－Ｔ細胞ゲノムＤＮＡをＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離した。標準プロトコールに従って実験ワークフローを行った。簡潔に説明すると、５０～１００ｎｇの高品質、非断片化ゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションのために使用した。ギャップ充填およびライゲーションの後に、リンカー配列に相補的なユニバーサルプライマーによるＰＣＲにおける鋳型として環状化ＤＮＡ分子を使用した。次いで、ＰＣＲ増幅ステップにおいて、試料特異的バーコード配列およびＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを導入した。この増幅の後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００、Ｎｏｖａｓｅｑまたは均等物における１００ｂｐペアードエンドリードを使用して、ＤＮＡを精製およびシークエンシングした。
ＭＩＰＳデータ解析
プラスミドおよび試料におけるＭＩＰＳライブラリーｃｒＲＮＡ表現のために、ＭＩＰｓ ｃｒＲＮＡを有するサブセットライブラリーを使用して、上に記載されている通りに標準スクリーニング処理およびマッピングを行った。突然変異に基づくＭＩＰｓ標的捕捉シークエンシング解析のために、未加工のペアエンドｆａｓｔｑリードファイルを先ず、参照ｈｇ３８ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓゲノムアセンブリーにマッピングし、ＢＷＡおよびＳＡＭＴｏｏｌｓを使用して選別した。粗いフィルタリングのために、ＢＥＤＴｏｏｌｓを使用して、標的ｃｒＲＮＡ領域の付近にあるリードを選択し（＋／－１０００ｂｐ）、次いで、パラメーターｐｉｌｅｕｐ２ｉｎｄｅｌ －－ｍｉｎ－ｃｏｖｅｒａｇｅ １ －－ｍｉｎ－ｒｅａｄｓ２ １ －－ｍｉｎ－ｖａｒ－ｆｒｅｑ ０．００１ －－ｐ－ｖａｌｕｅ ０．０５により、ＳＡＭＴｏｏｌｓおよびＶａｒｓｃａｎ ｖ２．４．１．を使用して、バリアントコーリングのためにインデックス付けおよび使用した。次いで、ｃｒＲＮＡ切断領域への細密なマッピングのために、生成されたＶＣＦファイルを使用した。
切断領域を定義するために、ｃｒＲＮＡを先ず、その切断部位が１６ｂｐ以内でまたはそれに等しく近接しているか否かに基づき崩壊させた。マッピングのために、ｃｒＲＮＡ切断領域は、崩壊されたｃｒＲＮＡについて、切断部位の最大／最小から＋／－８ｂｐとして定義した（したがって、崩壊されていないｃｒＲＮＡは、１６ｂｐウィンドウを有するであろうが、崩壊されたｃｒＲＮＡは、それよりも大きくなるであろう）。挿入のために、ゲノムにおけるバリアント位置ポイントを、ＶＣＦ出力によって定義される通りに維持した。欠失のために、ゲノムにおけるバリアント位置ポイントを、欠失の中央ポイントを反映するように調整した。バリアントを、上述に基づき、ｃｒＲＮＡ切断領域にマッピングした。切断効率をｃｒＲＮＡ表現と比較する解析を含むさらなる下流解析は、崩壊されたｃｒＲＮＡ参照に基づいた。ライブラリーおよび関連する切断効率バープロットにおけるＭＩＰｓ ｃｒＲＮＡ表現のために、ライブラリーシークエンシングにおいてほぼ０個のリードを有するｃｒＲＮＡ（ＭＩＰ１についてはＰＲＤＭ－ｃｒ６およびＰＲＤＭ－ｃｒ７、ＭＩＰ３についてはＰＲＤＭ－ｃｒ１）を視覚化のために除去した（ただし、これらは、他のあらゆる解析および統計検定には含まれた）。ライブラリー表現によって正規化されたＭＩＰｓ切断効率を含む解析のために、標的領域毎の平均合計バリアント頻度を、（平均ライブラリーリード）／中央値（平均ライブラリーリード）として定義される正規化因数で割った。カスタムＲスクリプトを使用して統計検定および視覚化を行った。
結果
一連の解析を行って、ＤｅｓｃａｒｔｅｓプールにおけるＣＡＲ－Ｔのいずれのバリアントが、より持続的であり、増強されたエフェクター機能を潜在的に有するか同定した。全ｃｒＲＮＡの全体的な時間経過ヒートマップから、ｃｒＲＮＡの大部分が経時的に減少し、ｃｒＲＮＡの多くが、３２日目までに枯渇したことが観察された。しかし、ｃｒＲＮＡの別個のセットは、変動する程度で持続的クラスターとして出現した。富化されたヒットを同定するために、個々のｃｒＲＮＡおよび個々の遺伝子について後期時点（例えば、ｄ３２）および終末時点（ｄ５４）における時間経過の試験を行った。ｃｒＲＮＡの画分は、１．０％の偽発見率（ＦＤＲ）で３２日目に高度に富化され、より少ないｃｒＲＮＡが５４日目に富化された。ゼロ地点ベースライン（０日目）に対する３２日目または５４日目ｃｒＲＮＡ存在量の比較は、持続的ｃｒＲＮＡの迅速に減衰する分布を明らかにし、少数の富化されたｃｒＲＮＡがベースラインを上回った（図３Ａ～図３Ｂ）。これらのｃｒＲＮＡの例は、様々な時点までの変動する程度の持続性を示した。代表的な高度に富化されたｃｒＲＮＡは、ＰＲＤＭ１／ＢＬＩＭＰ－１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ／ＨＬＡ－ＨおよびＰＥＬＩ１等のいくつかの潜在的な候補遺伝子を標的とする。ＲＩＧＥＲ解析も、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＨＦＥおよびＰＥＬＩ１を含むいくつかの同様の高ランク候補遺伝子を明らかにした。
経時的に３回の複製にわたり同じ遺伝子を標的とする個々のｃｒＲＮＡの挙動を試験するために、ｃｒＲＮＡは、互いに対して内部比較し、推定的に中立の挙動である、１，０００種のＮＴＣの平均および９９％信頼区間（ＣＩ）と外部比較し、遺伝子毎に同じプロットにおいて視覚化した。ある特定の公知Ｔ細胞疲弊表面マーカー（ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３）、Ｔ細胞機能に以前に関係付けられた転写調節因子（ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２）、および時間経過の解析から同定された特徴付けが不十分な（under-characterized）候補（ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＰＥＬＩ１およびＬＡＩＲ１）を試験した。ＮＴＣ平均は、２０日間の減衰中央値を有したが、別個のＣＡＲ－Ｔバリアントを表す別個のｃｒＲＮＡは、ｄ２０またはより後期の時点（ｄ３２、ｄ４１またはｄ５４）においてより高いレベルで持続することが観察された。ＴＥＴ２は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＲ－Ｔ増大化および持続性を抑制する肝要な因子として以前に同定された（Fraietta JA, et al., Nature, 558:307-312 (2018)）。１つのＴＥＴ２突然変異体ＣＡＲ－Ｔバリアント、ならびにＮＲ４Ａ２、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＰＥＬＩ１およびＬＡＩＲ１の複数の突然変異体バリアントは、ＮＴＣ ＣＡＲ－Ｔと比較して増強された持続性を示した。
それらの時間経過動態に基づき、ＣＡＲ－Ｔ機能において以前に報告されたことがない次の７種の候補遺伝子をさらに調べた：ＤＰＦ３、ＨＦＥ／ＨＬＡ－Ｈ、ＬＡＩＲ１／ＣＤ３０５、ＵＳＢ１、ＰＥＬＩ１、ＰＲＤＭ１／ＢＬＩＭＰ－１およびＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０。ＣＡＲ－Ｔ細胞のこれらの遺伝的変異体が、増強された抗腫瘍表現型を有するか否か検査するために、個々のＣＡＲ－Ｔバリアントを先ず、ＣＡＲ２２、およびこれらの遺伝子のそれぞれを標的とする上位ランクｃｒＲＮＡをコードする単一のＡＡＶ－ＣＬＡＳＨベクターを使用して再び生成した。次に、切断効率を、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイによって、次いでＮＧＳによって測定し、ＬＡＩＲ１を除いた全遺伝子が高効率遺伝子編集を示し（ＤＰＦ３、ＨＦＥ、ＵＳＢ１、ＰＥＬＩ１、ＰＲＤＭ１およびＳＬＡＭＦ１は、８０％を超えるインデルを達成した）、これらの大部分がフレーム外（out-of-frame）にあったことを見出した。メモリー細胞集団をフローサイトメトリーによって測定したところ、セントラルメモリーＴ細胞集団が、ベクター対照ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＤＰＦ３、ＬＡＩＲ１、ＰＥＬＩ１、ＰＲＤＭ１およびＳＬＡＭＦ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔにおいて増加したことが観察された（図３Ｃ～図３Ｅ）。細胞内ＩＦＮγおよびＴＮＦαレベルの定量化は、ＤＰＦ３、ＨＦＥおよびＵＳＢ１編集ＣＡＲ－Ｔ細胞が、５時間にわたるＮＡＬＭ６による刺激後に、より高いレベルのＩＦＮγおよびＴＮＦαを有することを示した（図３Ｆ～図３Ｋ）。ＰＥＬＩ１突然変異体は、より低いレベルのＩＦＮγおよびＴＮＦαの両方を示した；ＰＲＤＭ１およびＬＡＩＲ１突然変異体は、より低いレベルのＩＦＮγを示したが、ＴＮＦαでは示さなかった。ＳＬＡＭＦ１突然変異体は、ベクターと比べて、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのレベルの示される変化は僅かからほとんどなしであった（図３Ｆ～図３Ｋ）。
ｃｒＲＮＡによる遺伝子編集の能力が、ＣＬＡＳＨ実験におけるそのスクリーニング成績と相関したか否か決定するために、ＣＬＡＳＨ－ＭＩＰＳ（分子反転プローブシークエンシング）実験をＴ細胞において行った。本実験において、ゲノムに組み込まれたｃｒＲＮＡライブラリー読み取りによってｃｒＲＮＡ存在量を測定し、生物学的３回複製を使用してＭＩＰＳによって個々のｃｒＲＮＡの実際の遺伝子編集効率を測定した。次いで、結果を、ＣＬＡＳＨ実験におけるｃｒＲＮＡのスクリーニング成績と比較した。７種の上位候補遺伝子を標的とする５６種のｃｒＲＮＡのミニプールを上述の通りに設計し、ＣＬＡＳＨベクターおよびＣＬＡＳＨｅｄヒトＣＤ８ Ｔ細胞にクローニングして（上述の通りにｍＲＮＡ電気穿孔およびＡＡＶ６形質導入によって）、ＣＡＲ－Ｔミニプールを生成した。（１）ゲノムバリアントを測定するためのＭＩＰＳの感度；（２）プールされた様式での編集事象の希釈による、特異的ｃｒＲＮＡ標的部位のそれぞれにおける実際のゲノム編集事象を捕捉するＭＩＰＳの能力；および（３）Ｔ細胞における相対的遺伝子編集課題を考慮して、ミニプールのサイズを決定した。ライブラリー読み取りは、ミニプールのｃｒＲＮＡ存在量のマッピングに成功した。ｃｒＲＮＡの大部分が失われるステージ（例えば、ｄ５４）ではなく、選択のために相当な期間が経過したバランスを取った時点として、ｄ３２データを使用して、個々のｃｒＲＮＡの遺伝子編集の能力（ＭＩＰＳによって測定）を、ＣＬＡＳＨ－Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ実験におけるそのスクリーニング成績と比較した。個々の遺伝子の異なるｃｒＲＮＡセットは、プールされた様式での遺伝子編集効率（ＭＩＰＳ）およびスクリーニング成績（ＣＬＡＳＨ）の間に変動する強度の相関を示したが、測定された全遺伝子／全ｃｒＲＮＡを考慮すると、全体的な遺伝子編集効率（ＭＩＰＳ）は、平均スクリーニング成績（ＣＬＡＳＨ）と有意に相関した。遺伝子編集効率が、ｃｒＲＮＡ存在量によって正規化されるか否かに関係なく、この有意な相関も持続する。これらのデータは、ｃｒＲＮＡのスクリーニング成績が、Ｔ細胞における遺伝子編集に関するその能力と有意に相関し、検査されたｃｒＲＮＡの大部分が高い遺伝子編集効率を個々に示したという事実と共に、スクリーニングにおいて富化されたｃｒＲＮＡが大部分は、上位候補遺伝子のための真のカッターおよびスクリーニング実行者を表すことを指し示す。
がんモデルにおけるＣＬＡＳＨ媒介性ヒトＣＡＲ－Ｔバリアントｉｎ ｖｉｖｏ選択
いずれのＣＡＲ－Ｔバリアントが、より優れた抗腫瘍表現型を有するかさらに同定するために、時間経過ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＬＡＳＨ－Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ実験を行って、白血病マウスモデルにおいてＣＡＲ－Ｔ持続性を増加させ得る遺伝的撹乱を同定した。ＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞をＮＳＧマウスに移植することにより、白血病誘導を行った。誘導３日後に、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔバリアントを養子移入によってマウスに注入した。７日目、１１日目および１４日目に骨髄および脾臓試料を捕集した。ＣＡＲ－Ｔ注入後１４日目に、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－Ｌｉｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞のレシピエントにおいて、より高いＣＡＲ－Ｔ：がん細胞比が観察された（図３Ｌ）。次いで、これらのｉｎ ｖｉｖｏ試料におけるＤｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーのｃｒＲＮＡライブラリー表現を読み取り、ディープシークエンシングデータを解析して、注射前の０日目ＣＡＲ－Ｔ細胞プールと比較して、１４日目ｉｎ ｖｉｖｏ試料における富化されたｃｒＲＮＡを同定した。ｃｒＲＮＡの画分は、ＦＤＲ １．０％で１４日目ｉｎ ｖｉｖｏ 試料において高度に富化されていることが観察されており、これは例えば、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＢＸ２１、ＳＩＲＴ７、ＧＰＲ６５、ＰＲＤＭ１およびＰＲＤＭ４である。次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方に由来する独立した時点から得た富化された遺伝子セットを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＬＡＳＨの結果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ長期共培養ＣＬＡＳＨ実験と比較した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ３２日目、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ５４日目、ｉｎ ｖｉｖｏ ７日目、ｉｎ ｖｉｖｏ １１日目およびｉｎ ｖｉｖｏ １４日目の間での、富化された遺伝子の実質的な重複（図３Ｍ）。ＬＡＭＰ３、ＦＣＲＬ４、ＭＹＨ１０、ＧＡＴＡ３、ＥＮＴＰＤ１、ＰＲＭＴ１、ＢＴＮ１Ａ１およびＰＲＤＭ１を含む、８種の遺伝子が、５％のＦＤＲで、これらの５種の遺伝子セットの全てにわたり有意に富化された（図３Ｍ）。
（実施例４）
ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞は、増加したメモリー細胞集団、より強い抗原刺激性増殖および維持された細胞傷害性を示す。
材料および方法
ＣＡＲ－Ｔ精製
ストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＡＲ陽性Ｔ細胞を精製した。手短に説明すると、１×１０７個の細胞を、１００μＬ標識緩衝剤に懸濁し、次いで、１μｇ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）組換えビオチン化タンパク質Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および１０μｌ ＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に１５分間４℃でインキュベートした。細胞を洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、１０μＬストレプトアビジンマイクロビーズで１５分間氷上にて標識した。洗浄後に、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従って、分離のためにＭＡＣＳカラムに懸濁液をロードした。
死滅アッセイ（共培養）
レンチウイルスを使用して、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子をＮＡＬＭ６細胞系に安定に形質導入した。２×１０４個のＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞を９６ウェルプレートに播種した。操作されたＣＡＲ－Ｔ、ベクターＣＡＲ－Ｔまたは正常ＣＤ８ Ｔ細胞を、指し示されるＥ：Ｔ比でＮＡＬＭ６－ＧＬと２４時間共培養した。ＮＡＬＭ６－ＧＬにおけるルシフェラーゼ発現を検査するために、１５０μｇ／ｍｌ Ｄ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を各ウェルに添加した。１０分後に、プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってルシフェラーゼ強度を測定した。ルミネセンスによって直接的腫瘍細胞死滅を定量化した。ルミネセンス単位を対照に対して正規化した（いかなるエフェクター細胞も用いないＮＡＬＭ６－ＧＬ、ＬＵｃ）。
計算式：％細胞傷害性（Cytotoxity）＝１００－ＬＵ試料／ＬＵｃ×１００。
ウエスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝剤（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）によって細胞を溶解し、氷上で３０分間インキュベートした。１３，０００ｇで４℃にて３０分間遠心分離した後に、タンパク質上清を捕集した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してタンパク質濃度を決定した。４～２０％Ｔｒｉｓ－ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において還元条件下でタンパク質試料を分離し、一次抗体ＰＲＤＭ１／Ｂｌｉｍｐ－１マウスｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ １：１０００）と、続いて二次抗マウスＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：１０，０００）を使用したウエスタンブロッティングによって解析した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００によりブロットを撮像した。
免疫沈降
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む氷冷ＲＩＰＡ緩衝剤によってＰＲＤＭ１欠損ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはベクター細胞を３０分間溶解した。製造業者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従って、ＮＨＳ活性化アガロースビーズにおいて固定化されたＢＬＩＭＰ１／ＰＲＤＭ１抗体（ＣＳＴ）を添加した。細胞ライセートをビーズと共に４℃でインキュベートし、１時間回転させた。１分間３，０００ＲＰＭでのスピンダウン後に上清を廃棄した。ビーズを氷冷ＴＢＳで４回洗浄し、ＳＤＳローディング緩衝剤と共に１０分間煮沸した。４～２０％Ｔｒｉｓ－ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にタンパク質試料をロードした。
ゲル内（In-gel）消化および質量分析
タンパク質含有ゲルスライスをトリプシンで一晩消化した。その結果得られるペプチド混合物をゲルから抽出し、標準ＴＯＰ２０方法手順を使用して、１２０分間液体クロマトグラフィー（緩衝剤Ａ：０．１％ギ酸水；緩衝剤Ｂ：０．１％ギ酸ＭｅＣＮ；勾配：０％～９５％緩衝剤Ｂ；流速：０．１μｌ／分）およびタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接的に流した。手短に説明すると、３９５～１，６００ｍ／ｚイオンのためのＭＳ１ ｍ／ｚ領域を６０Ｋ分解能で捕集し、上位２０個の最も豊富なイオンのためのイオントラップにおけるＭＳ／ＭＳの誘発に使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法において９０秒間にわたる５００個のイオンの有効動的排除を使用した。ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙポンプ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、３００ｎｌ／分流速でペプチドを溶出した。５μｍ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ ＡＱビーズ（Ｗａｔｅｒｓ）をインハウスで５ｃｍ充填したトラッピングカラム１００ミクロンＩＤにおいて２μｌ／分の流速で試料を１５分間トラップし、３μｍ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ ＡＱビーズ（Ｗａｔｅｒｓ）をインハウスで充填した２０ｃｍ ７５ミクロンＩＤ解析カラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）へと勾配で溶出した。
Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに対してＳｃａｆｆｏｌｄ Ｑ＋／Ｑ＋Ｓバージョン４．０を使用して質量スペクトルを解析した。ＭＳ１ピークのために２０ｐｐｍの質量偏差を設定し、最大で２の見逃しによる、最大許容ＭＳ／ＭＳピークとして０．６Ｄａを設定した。ペプチドおよびタンパク質レベルの両方で最大偽発見率（ＦＤＲ）を０．０１に設定した。最低限必要なペプチドの長さは、５アミノ酸であった。
ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１ゲノムワイドＡＡＶ組込みライブラリー調製
ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１オフターゲット組込み事象のゲノムワイドプロファイリングを行うために、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（Tsai, SQ. et al., Nat Biotechnol., 33:187-197 (2015)）から修正された方法を開発した。手短に説明すると、９日間のＡＡＶ形質導入の後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ＴＥ緩衝剤においてＭｉｓｅｑ共通オリゴを試料バーコードオリゴ（Ａ０１～Ａ０６）とアニーリングすることにより、アダプターを作製した。９５℃で１秒間から；４℃へとゆっくりと下降（およそ－２℃／分）にアニーリングプログラムを設定した。Ｓ２２０集中的超音波装置（focused ultrasonicator）（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用することにより、ｇＤＮＡを約１，５００ｂｐに断片化した。製造業者のプロトコールに従ってＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）末端修復／ｄＡ－テーリングモジュール（ＮＥＢ）を使用することにより、末端修復およびｄＡ－テーリングを行った。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを室温で１時間使用することにより、修復されたＤＮＡを、アニールされたアダプターとライゲーションした。０．９×ＳＰＲＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用することにより試料を清浄化した。ストレプトアビジンビーズ精製による二段階ＰＣＲ戦略を使用して、ゲノムワイドオフターゲット組込みライブラリーを作製し、この戦略において、第１のＰＣＲを使用して、ビオチン化プライマーを使用して、ｇＤＮＡ由来の組み込まれたＣＡＲ遺伝子を有する断片である餌を仕掛け、ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用することによりビオチン化断片を精製した。次に、第２のＰＣＲは、適切なシークエンシングバーコードを、第１のＰＣＲ由来の産物に付加した。ＰＣＲ（ＮＥＢ）のためにＱ５を使用した。２ラウンドＰＣＲのためのサーモサイクリングパラメーターは、９８℃で３０秒間；７サイクルの、９８℃で１０秒間、７０℃（－１℃／サイクル）、７２℃で１分間；１３サイクルの、９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で１分間；７２℃で１分間、および４℃で保持であった。生体試料毎にＰＣＲ産物を正規化し、プールした。１ｋｂ未満のＤＮＡを選択した。カスタムシークエンシングプライマーとＭｉｓｅｑ（２×３００ｂｐペアエンド）を使用することにより試料をシークエンシングした。
ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１ゲノムワイドＡＡＶ組込みデータ解析
Ｃｕｔａｄａｐｔ ３．２、ＢＷＡ ０．７．１７およびＳＡＭｔｏｏｌｓ １．１２を使用して、ペアードエンドリードを処理して、オフターゲット組込み事象を同定した。ｃｕｔａｄａｐｔ －ＧＧＴＴＴＡＣＴＣＧＡＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡ（配列番号１２，１３７） －ｅ ０．２ －ｍ ２０ －－廃棄－トリミングされていないを使用して、ＴＲＡＣ エレメントを含有するＲ２リードを先ずトリミングおよび選択した。次いで、ｃｕｔａｄａｐｔ －ＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ（配列番号１２，１３８） －ｅ ０．２ －ｍ ２０ －Ｏ １５ －－廃棄－トリミングされていないを使用して、ＩＴＲリードを含有するＲ２リードをトリミングおよび選択した。次いで、ＢＷＡを使用して、ＩＴＲトリミングされたリードを、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓゲノムアセンブリーＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８）にマッピングした。位置において二重計数することなく、マッピングされたリードがゲノムを標的化する場所を理解するために、出発位置を使用してリードを単一塩基対座標に変換し、次いでｂｅｄＧｒａｐｈフォーマットに変換した。ＴＲＡＣエレメントを含有するＲ２リードを使用して、シークエンシングの深さに対してリードを正規化した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ ２．９．２ならびにＧｅｎｏｍｉｃＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓおよびｇｇｂｉｏを含むＲパッケージを使用して、視覚化を生成した。
ＴＲＡＣ組込みＰＣＲ
９日間のＣＬＡＳＨ－ベクターＡＡＶ形質導入の後に、ｇＤＮＡを抽出した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＣＲのためのサーモサイクリングパラメーターは、９８℃で２分間、３５サイクルの（９８℃で１秒間、６０℃で５秒間、７２℃で１分間）および７２℃で２分間であった。ＤＮＡを精製し、サンガーシークエンシングによってシークエンシングした。
結果
複数の独立したｃｒＲＮＡによってスコア化された時間経過共培養およびがんモデルの両方における強い持続性動態に基づき、ＰＲＤＭ１バリアントは、ＣＡＲ－Ｔ操作のための有望な候補を表した。ＰＲＤＭ１は、正常ＣＤ８ Ｔ細胞の主要調節因子として以前に同定された（Rutishauser et al., Immunity, 31:296-308. (2009)）。ＰＲＤＭ１編集が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍免疫を促進するための増強された潜在力を有し得ることが仮定された。ＰＲＤＭ１の標的化が、ＣＡＲ－Ｔ細胞持続性および他の抗腫瘍効果を改善し得るか否かさらに調べるために、一連の実験を行った。先ず、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイおよびＮＧＳによって、複数のＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡの切断効率を、ドナー２抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２２ ＣＡＲ）において個々に測定した。ＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡの多くは、高効率遺伝子編集を示した（６／８が８０％超；７／８が７８％超；１／８のみが５０％を下回る － ＰＲＤＭ１－ｃｒ７が４７％）。次に、別の形態のＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞／ＣＤ１９ ＣＡＲ）と共に、別の健康なドナーにおけるＰＲＤＭ１－ｃｒ１切断効率を検査した。
ＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡが、ＣＡＲ－Ｔ細胞における機能的遺伝子産物（ｍＲＮＡおよびタンパク質）にどのような影響を与えるかについてさらに試験するために、共培養動態における後期ステージ時点での高い存在量における上位２種のｃｒＲＮＡスコアリングを選んだ。これら２種のＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡは、ＰＲＤＭ１タンパク質の異なるドメインを標的とする。ＰＲＤＭ１タンパク質は、選択的スプライシングによって産生される３種の異なるアイソフォームを有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｏ７５６２６；図４Ａ）。これら２種のＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡが、ＰＲＤＭ１ ｍＲＮＡ発現を破壊することができるか否か調べるために、これらのアイソフォームを潜在的にコードするｍＲＮＡ転写物に特異的な３種の異なるプローブを設計した（アイソフォーム１の５プライム領域を標的とするプローブＩＳＯ１、ＳＥＴ／ＰＲドメイン内のＰＲＤＭ１－ｃｒ１切断部位を標的とするＩＳＯ２、およびＰＲＤＭ１のジンクフィンガードメイン内のＰＲＤＭ１－ｃｒ２切断部位を標的とするＩＳＯ３）。ＰＲＤＭ１遺伝子の破壊が、ＩＳＯ１プローブによって検出される通り、ＰＲＤＭ１ ｍＲＮＡ転写物の急激な増加をもたらすことが観察された。この現象は、ＰＲＤＭ１が、強いフィードバック機構を介してそれ自体で自己調節されるという以前の研究と符合する（Magnusdottir E., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 104(38):14988-93(2007)；Martins G., and Calame K. Annu Rev Immunol., 26:133-169 (2008)）。しかし、ＰＲＤＭ１ ｍＲＮＡは、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＩＳＯ２プローブによって、またはＰＲＤＭ１－ｃｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＩＳＯ３プローブによって検出することができなかった。
この機構をさらに調べるために、異なるドナーから生成された抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＰＲＤＭ１タンパク質発現をさらに検査した。共培養動態において後期ステージ時点で高い存在量にてスコア化された上位２種のｃｒＲＮＡにより、ＰＲＤＭ１の異なるドメインを標的とする２種の異なるＡＡＶ－ＣＬＡＳＨベクターを生成した。これらのＣＬＡＳＨベクターを使用して、ヒト初代ＣＤ８ Ｔ細胞を形質導入して、１種の形態の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰＲＤＭ１－ｃｒ１のみ）と共に、２種の形態のＰＲＤＭ１突然変異体抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰＲＤＭ１－ｃｒ１およびＰＲＤＭ１－ｃｒ２）を生成した（図４Ａ）。異なるドナーにおいて形質導入５日後に試験した場合、両方のｃｒＲＮＡが、標的部位において高効率ＰＲＤＭ１遺伝子編集を生成した（図４Ｂ～図４Ｄ）。ＰＲＤＭ１ ｃｒＲＮＡが、ＣＡＲ－Ｔ細胞において機能的遺伝子産物（タンパク質およびｍＲＮＡ）にどのような影響を与えるかについてさらに試験するために、異なるドナーから生成されたＣＡＲ２２ Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１タンパク質発現を検査した。ＰＲＤＭ１－ｃｒ２が、ＰＲＤＭ１タンパク質の強い低減をもたらし、さらに興味深いことに、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１が、同じＰＲＤＭ１特異的抗体によって認識される、より小さいサイズのタンパク質の産生をもたらすことが観察された。このサイズ低減タンパク質の配列を調べるために、抗ＰＲＤＭ１抗体を使用して免疫沈降を行い、質量分析によってペプチド同定を行った（ＩＰ－ＭＳ）。ＩＰ－ＭＳ結果は、全３回の複製において、ベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１標的化ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＰＲＤＭ１－ｃｒ１切断部位付近にあるペプチドを検出することができないことを示した。よって、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１は、アイソフォーム２でもアイソフォーム３でもない、新たな突然変異体バリアントを生成した。
異なるガイドＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集によって標的化される特異的タンパク質ドメインは、異なる機能的突然変異体をもたらし得るため、多くの場合、機能的ドメインにおける特異的突然変異を明らかにすることが重要となる。ＰＲＤＭ１－ｃｒ１によって産生されるＰＲＤＭ１遺伝子産物の突然変異体バリアントの性質を決定するために、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１切断部位の付近にある２種のプライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡを同定した。興味深いことに、２本のバンドが、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１群において提示された。上のバンドは、野生型と、小さいインデルを有する同様のサイズの遺伝子産物との混合物を表し（「ノイズ」ピークによって反映される）、Ｎｅｘｔｅｒａ－ＮＧＳ結果と符合した。さらに、より下にあるＤＮＡ断片には１２０ｂｐインフレーム欠失があり、これは、ＰＲＤＭ１エクソン３に正確に対応した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したマウス細胞系において、ＫｒａｓおよびＣｔｎｎｂ１における遺伝子編集誘導性エクソンスキッピングが観察された（Mou, H. et al., Genome Biol 18, 108, doi:10.1186/s13059-017-1237-8 (2017)）。ＰＲＤＭ１エクソン３は、ＰＲＤＭ１（ＰＲＤＩ－ＢＦ１またはＢｌｉｍｐ－１）タンパク質におけるＮ末端ＰＲドメインのコードの原因となる主な領域である。以前の研究は、ＰＲドメインの破壊が、複数の標的遺伝子における抑圧的機能の劇的な喪失をもたらし得ることを示した。これらの結果は、ＣＬＡＳＨ ＰＲＤＭ１－ｃｒ１が、ＰＲＤＭ１エクソン３スキッピングバリアントを生成し、ヒト初代Ｔ細胞においてトランケートされたＰＲＤＭ１タンパク質を産生したことを実証した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１－ｃｒ１およびＰＲＤＭ２－ｃｒ２機能を比較するために、形質導入５日後に生成された細胞をフローサイトメトリーによって解析し、エフェクターからメモリーへの移行（ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８およびＩＬ７Ｒ）、細胞傷害性（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢ／ＧＺＭＢ）およびＴ細胞疲弊（ＬＡＧ３およびＴＩＭ３）の表現型を評価した。データは、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１およびＰＲＤＭ２－ｃｒ２バリアントの両方が、より高いエフェクターからメモリーへの移行マーカー（図４Ｅ～図４Ｈ）、ＧＺＭＢ、ＩＦＮγおよびＴＮＦαにおいて明らかな通り、より低いエフェクターマーカー（ただし、ＣＡＲがないヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ８ Ｔ細胞は、全群にわたりベースラインエフェクターサイトカインレベルを示した）（図４Ｉ～図４Ｋ）、ならびにＬＡＧ３およびＴＩＭ３において明らかな通り、より低い疲弊マーカー（図４Ｌ～図４Ｍ）を含む、同様の表現型を有することを示した。興味深いことに、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔは、ＰＲＤＭ１－ｃｒ２と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＩＬ７Ｒ、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３表現型において、より顕著な効果を有する（図４Ｅ～図４Ｆ、図４Ｌ、図４Ｍ）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１効果をさらに確認するために、形質導入５日後に異なる健康なドナーにおけるメモリーマーカーＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌを測定した。以前の結果と符合して、全５名のドナーにおけるＰＲＤＭ１－ｃｒ１の編集によって、両方のマーカーが増加した（図４Ｎ～図４Ｏ）。その上、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２名の異なるドナーにおいてＮＡＬＭ６がん細胞刺激に応答して、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高い抗原特異的増殖能力および細胞傷害性を有することが見出されたが、形質導入後ｄ１１／ｄ１２の後に、増殖効果のみが著しくなる（図４Ｐ～図４Ｑ）。各ラウンドの刺激について、長期サイトカイン放出もモニターした。特異的抗原に応答したＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生は、初めにベクターＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低いことが観察された。しかし、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞は、各ラウンドでＩＦＮγを産生する能力を失い続けたが、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、この能力を維持することができ、結果として、実験のエンドポイント（ラウンド７）において、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高い割合のＩＦＮγ産生株細胞を有した（図４Ｒ）。ＴＮＦαについて２群の間に差はほとんど観察されなかった。グランザイムＢは、ベクターと比較して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において一貫してより低かった。共培養実験エンドポイントにおいて、ベクター細胞と比較して、長期培養され、抗原を経験したＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、３名の独立したドナーから生成されたＣＡＲにおいて、全Ｅ：Ｔ比にわたり、ＮＡＬＭ６がん細胞に対して有意により高い細胞傷害性効果を有することが観察された（図４Ｓ～図４Ｔ）。これらのデータは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔが、増強されたメモリー表現型を有し、継続的な抗原曝露下でより長期のエフェクター機能を維持することができることを指し示した。
ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１媒介性ＡＡＶ組込みのゲノムワイドプロファイリング
以前の研究は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系が、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑおよびＢＬＩＳＳを使用することにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと比較して、より高い編集特異性を有することを示した（Kleinstiver, BP. et al., Nature biotechnology 34, 869-874 (2016)；Kim, D. et al., Nature biotechnology 34, 863-868 (2016)；Yan, WX., et al., Nature communications 8, 1-9 (2017)）。近年の研究は、ディーププロファイリングを行い、ＣＲＩＳＰＲノックイン実験における組込みアウトカムの不均一性を明らかにした（Canaj, H. et al., bioRxiv 841098; doi: 10.1101/841098 (2019)）。これらの研究を考慮して、ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１媒介性ゲノムワイドＡＡＶ組込みをプロファイルおよび定量化するために、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑに基づく新たな方法（Tsai, SQ. et al., Nat Biotechnol., 33:187-197 (2015)）が開発され、Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡ電気穿孔なしのＡＡＶのみ対照によりＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞に適用された。ゲノムＤＮＡ試料を３回複製して捕集し、超音波処理によって剪断し、末端修復およびｄＡ－テーリングの後に産物をアダプターとライゲーションした。ＣＬＡＳＨベクターの特有の一部を標的とする５’ビオチン化プライマーは、組み込まれた配列に未知の餌配列を仕掛けるように設計した。ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズへの結合を介して、ＣＬＡＳＨ特有配列を含有するこれらの接合部を富化した。第２ラウンドネステッドＰＣＲにおいて、シークエンシングバーコードを付加した。
ＩＴＲに基づくクエリー配列を使用して、コンピュータ処理パイプラインを確立して、キメラオフターゲットリードおよびヒトゲノムにおけるその場所を同定した。ヒトゲノム全体にわたる正規化されたリードのＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）に基づく視覚化は、ＡＡＶのみ対照におけるクリーンなベースラインレベル、およびＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１試料に関する少数の検出可能なピークを示した。Ｃｉｒｃｏｓプロット視覚化は、ヒトゲノム全体にわたるオフターゲット組込み事象の分布および相対的頻度により同様のパターンを示し、ピークの場所は、中央に標識された。Ｃｐｆ１ ｍＲＮＡなしでＡＡＶベクターのみを受ける試料における０．１５％と比較して、ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１試料におけるオフターゲット組込み事象の平均ゲノムワイド合計頻度が０．６２％であることが観察された。ＣＤ８Ａ、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＶＴ１、ＴＲＡＣおよびＰＲＤＭ１周囲のゲノム遺伝子座において、ある特定の検出可能なオフターゲット組込み事象が観察された。例えば、ＰＲＤＭ１遺伝子座における平均オフターゲット組込み頻度は、０．２％であり、ＴＲＡＣ遺伝子座においては０．０５％であり、ＣＤ８Ａ遺伝子座においては０．１％であった。ＩＧＶに基づく視覚化のさらなるズームイン像は、個々の遺伝子レベルでオフターゲット組込み事象のための場所を示した。これらの実験は、ＣＬＡＳＨ－ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ生成に伴い発生するゲノムワイドＡＡＶオフターゲット組込み事象を測定し、百分率よりも小さい（sub-percentage）レベルで全体的なゲノムの合計オフターゲット組込み率を推定した。
（実施例５）
ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔは、ｉｎ ｖｉｖｏで増強された治療有効性を示す
材料および方法
ＰＲＤＭ１ ｖｓ 対照ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ時間経過ｍＲＮＡ－ｓｅｑ実験
Ｔ細胞を、ＮＬＳ－ＬｂＣｐｆ１ｍＲＮＡによる電気穿孔の後に、ＣＬＡＳＨベクターおよびＰＲＤＭ１－ｃｒ１ ＣＡＲ２２ ＡＡＶ６に感染させた。５日間にわたる電気穿孔の後に、以前に記載された通りに、陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ３およびＣＡＲ特異的抗体による染色によって決定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、４～７日毎に低いＥ：Ｔ（０．２：１）比でＮＡＬＭ６と共培養し、合計５ラウンドを行った。各ラウンドの刺激後に、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＡＲ－Ｔ細胞を収集した。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＲＮＡライブラリープレップキットを使用してｍＲＮＡライブラリー調製を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のためのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）マルチプレックスオリゴによって提供されるバーコードを付けたプライマー（インデックスプライマーセット１）を使用して試料をマルチプレックス化した。Ｎｏｖａｓｅｑ系（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりライブラリーをシークエンシングした。
ｍＲＮＡ－ｓｅｑ処理
転写物定量化のための設定－ｂ １００によるＫａｌｌｉｓｔｏ ｑｕａｎｔアルゴリズム（Bray NL., et al., Nature biotechnology, 34:525-527 (2016)）を使用して、ｍＲＮＡシークエンシングから得たＦＡＳＴＱファイルを解析した。Ｓｌｅｕｔｈ（Pimental H., et al., Nat. Methods, 14(7):687-690 (2017)）を使用して差次的発現解析を行った。１×１０－３のＱ値カットオフを使用したＤＡＶＩＤ解析（Sherman BT., and Lempicki RA., Nat. Protoc., 4(1):44-57 (2009)）のために差次的に上方調節および下方調節された遺伝子を選択した。遺伝子計数のｌｏｇ２－正規化と、それに続く遺伝子によるスケーリングによって時間経過ヒートマップのためのＺ－スコアを計算し、各時点でＰＲＤＭ１ ｖｓ ベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞を比較するようにセットアップされた対比によりｌｉｍｍａによって諸時点にわたり差次的に発現される遺伝子を決定した。段階的方法としての「ｔｗｏ．ｗａｙｓ．ｆｏｒｗａｒｄ」および他の点ではデフォルト設定を使用したＲパッケージｍａＳｉｇＰｒｏにより、時間経過クラスター解析を行った。ｇｇｐｌｏｔ２等の標準Ｒパッケージおよびベン図を使用して、ボルケーノプロットおよびヒートマップ等、差次的に発現される遺伝子の視覚化を生成した。
マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＲ－Ｔ有効性検査
Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを購入し、インハウスで繁殖させた。６～８週齢の間の雄および雌ＮＳＧマウスの両方を使用し、５×１０５個のＮＡＬＭ６－ＧＬ細胞を静脈内に接種した。処置に先立ち、マウスを異なる群にランダムに割り当てた。３日後に、１．２×１０６個の正常ＣＤ８ Ｔ細胞、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞またはＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに注入した。３～５日毎にＩｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）を使用して、マウス毎のバイオルミネセントシグナルを捕捉した。手短に説明すると、バイオルミネセンスシグナルを生成するために、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射し、生体画像ソフトウェアによって画像を解析した。処置後にｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞表現型を検査するために、１８日目にＮＳＧマウスを安楽死させた。末梢血、脾臓および骨髄を直ちに捕集した。ＡＣＫ（塩化アンモニウム・カリウム）溶解緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）との２分間のインキュベーションによって、赤血球細胞を溶解した。洗浄後に、ＦＡＣＳのために細胞表面マーカーを上に記載されている通りに標識し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩによって測定した。
ランダム化
動物実験において、マウスを性別、ケージおよび同腹仔関係（littermate）によってランダム化した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験はランダム化されなかった。
盲検化（Blinding）
腫瘍負荷を測定する場合、動物の正体および処置群に関して研究者を盲検化した。研究者はｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では盲検化されなかった。ＮＧＳデータ解析において、キーコード処理されたメタデータを使用して、本来のデータの初期処理について研究者を盲検化した。
結果
次いで、そのベクター対応物と比較したＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞の前臨床治療有効性をｉｎ ｖｉｖｏで検査した。免疫不全ＮＯＤ．Ｐｒｋｄｃ（ＳＣＩＤ）／Ｉｌ２ｒγ－／－（ＮＳＧ）マウスにおけるＮＡＬＭ６－ＧＬ白血病腫瘍モデルにおいて、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔの養子移入によって有効性検査を行い、続いて、腫瘍負荷のモニタリングを行った（図５Ａ）。腫瘍誘導に使用する前に、ＮＡＬＭ６細胞は先ず、ＣＤ１９；ＣＤ２２二重陽性であることを確認した。ＩＶＩＳイメージングを行って、形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞、ベクター形質導入された抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＰＲＤＭ１編集された抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した白血病性動物における腫瘍負荷を追跡し、ＰＲＤＭ１突然変異体抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に増強された白血病抑制を示したことを観察した。Ｔ細胞養子移入１９日後（腫瘍誘導２２日後）から開始して、ベクターおよびＰＲＤＭ１抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞処置マウスの間の腫瘍負荷に相当な差が観察された（図５Ｂ）。これらのデータは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔが、白血病のマウスモデルにおいてがんに対するより強いｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有することを示した。
結果をさらに検証するために、ＣＤ１９抗原に対する異なるＣＡＲ構築物を有する独立したＡＡＶ－ＣＬＡＳＨベクター（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＡＲ１９）を構築した。ベクター対照ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と共に、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同様に生成し、続いて、同様のがん誘導および養子移入処置レジメンを使用したｉｎ ｖｉｖｏ有効性検査を行った。ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞において同様の結果が観察され、ＰＲＤＭ１ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、有意に増強された白血病抑制を示した（図５Ｃ）。両方の群において処置した動物から血液および臓器を単離し、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続的ＣＡＲ－Ｔの存在量を定量化した。ＣＡＲ－Ｔ注入２週間後に、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞のレシピエントの血液、骨髄および脾臓において、より多い数のＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ対腫瘍比が観察された（図５Ｄ～図５Ｆ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの知見と符合して、骨髄および脾臓由来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ベクター群と比較して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、有意により高いレベルのＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋（Ｔｃｍ）を示した（図５Ｇ～図５Ｉ）。これらのデータは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで、増加した持続性およびメモリーマーカー発現と共に、増強された有効性を有することを指し示した。
ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞の前臨床治療有効性（ベクター対応物と比較した）を、がんを有する動物の生存の文脈においてｉｎ ｖｉｖｏでさらに評定した。免疫不全ＮＯＤ．Ｐｒｋｄｃ（ＳＣＩＤ）／Ｉｌ２ｒγ－／－（ＮＳＧ）マウスにおけるＮＡＬＭ６－ＧＬ白血病腫瘍モデルを使用して、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔの養子移入による有効性検査と、それに続くエンドポイント生存の評価を行った。不十分なボディ・コンディション・スコア（ＢＣＳ＜＝１）または実際の死亡のどちらが早い方のいずれかとして、エンドポイント生存を記録した。２種の実験を行い、一方は、腫瘍誘導後３日目におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の養子移入を用い、他方は、８日目における養子移入を用いた。両方の実験において、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された白血病を有する動物が、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された動物よりも有意に長い生存を示すことが観察された（図５Ｊ～図５Ｋ）。これらのデータは、ＰＲＤＭ１ 突然変異体 ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔが、白血病のマウスモデルにおいてがんに対するより強いｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有することを示す。
これらの結果をさらに検証するために、ベクター対照抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と共に、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同様に検査した。抗ＣＤ２２ ＣＡＲについて、ただし、腫瘍誘導後３日目にＣＡＲ－Ｔ細胞のみの養子移入を用いて、上述の通りにｉｎ ｖｉｖｏ有効性検査を行った。結果は、ＰＲＤＭ１突然変異体抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された白血病を有する動物が、ベクターＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された動物よりも有意に長い生存を示したことを示した（図５Ｌ）。これらのデータは、ＰＲＤＭ１突然変異体抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔが、白血病のマウスモデルにおいてがんに対するより強いｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有することを示す。
ＰＲＤＭ１表現型の分子基盤および特にＣＡＲ－Ｔ細胞における増強された有効性の基礎をさらに理解するために、時間経過トランスクリプトミクス実験を、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびベースラインとしての形質導入されていないヒトＣＤ８ Ｔ細胞において生物学的に３回複製して行った。これらのトランスクリプトームプロファイルは、時系列に沿った、継続的な同族がん抗原刺激によるＣＡＲ－Ｔ遺伝子発現のシステマティックランドスケープを明らかにした。ＰＲＤＭ１およびベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の間の直接比較において、差次的に発現される遺伝子の別個のセットが同定され（図６Ａ）、高度に有意な下流標的のパネルを明らかにする。ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔは、ＰＣＤＨ８、ＳＥＬＬ／ＣＤ６２Ｌ、ＰＴＰＮ１４、ＲＡＳＡ３、ＫＬＦ２、ＳＴＡＴ６、ＳＴＡＴ１、ＰＲＤＭ１それ自身、ＩＲＦ４およびＮＦＫＢ１等の遺伝子の有意な誘導；ならびにＣＣＬ５、ＢＡＴＦ、ＣＸＣＲ６、ＩＬ１３、ＰＲＦ１、ＩＦＩＴ１３、ＩＤ２およびＲＵＮＸ３等の遺伝子の抑圧を示した（図６Ａ）。
興味深いことに、遺伝子発現の変更は、両方向で勾配パターンを示した；時間と共に（よって、追加のラウンドの刺激に沿った）、ＰＲＤＭ１誘導性遺伝子の増加する発現およびＰＲＤＭ１抑圧性遺伝子の減少する発現。時間因子効果を厳密に定量化およびデコンボリューション（deconvolve）するために、時系列クラスター解析を行った。ＭａＳｉｇＰｒｏ時間経過クラスター解析は、ＰＲＤＭ１突然変異体ｖｓ対照ＣＡＲ－Ｔ群の間で時間に沿った同様の発現パターンおよび同様の挙動を有する遺伝子をそれぞれ含有する異なる遺伝子クラスターの実験全体にわたる発現プロファイルを明らかにした。この解析は、２群の間で時間経過に沿った完全に異なる挙動を有する遺伝子の９つの別個のクラスターを明らかにした：クラスター１遺伝子は、ＰＲＤＭ１およびベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方で経時的に（よって刺激により）減少する；全てのクラスターの中で最大クラスターであるクラスター２は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞において経時的に強く増加するが、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞においては増加しない遺伝子を含有する（代表例は、ＨＡＶＣＲ２およびＷＮＴ１１を含む）；クラスター３は、対照において経時的に減少するが、対比して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞においてそれとは反対に挙動し、増加する遺伝子を含有する（代表例は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ６、ＮＦＫＢ１およびＩＲＦ４を含む）；クラスター４は、対照において経時的に安定しているが、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において急激に下落する遺伝子を含有する；クラスター５は、対照において経時的に安定しているが、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において急激に増加する遺伝子を含有する；クラスター６は、対照において経時的に急激に減少するが、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において安定したままである遺伝子を含有する（代表例は、ＫＬＦ２、ＦＯＸＯ１、ＣＤ２８、ＣＤ２２６、ＣＤＣＡ７を含む）；クラスター７もまた、２群が経時的に反対方向に向かう二分（dichotomy）遺伝子であり、遺伝子は、対照において増加するが、ＰＲＤＭ１群において減少する；クラスター８は、対照において経時的に増加するが、ＰＲＤＭ１群において先ず迅速に下落し、次いで低レベルで安定するようになる遺伝子を含有する（代表例は、ＬＡＧ３およびＩＤ２を含む）；最後のかつまた最小のクラスターであるクラスター９は、ＰＲＤＭ１およびベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方で共有されたかつ一貫した誘導パターンを有する遺伝子を含有する。
遺伝子の異なるクラスターにおいていかなる経路が富化されるかについての全体的な像を得るために、各クラスターにおける遺伝子セットの富化された生物学的プロセスのジーンオントロジー解析を行った。同様の遺伝子セット挙動を有する２つのクラスター（クラスター１および９）は両者共に、転写因子が富化される。興味深いことに、ＰＲＤＭ１およびベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞が異なって挙動するクラスターは、別個のシグネチャーを有する：ＰＲＤＭ１編集が時間依存的誘導を阻害するクラスター２における遺伝子は、シグナルトランスダクション、細胞接着および炎症応答が富化される；同様に、ＰＲＤＭ１編集が迅速な下方調節をもたらすクラスター４における遺伝子は、ケモカイン媒介性シグナル伝達経路、炎症応答の正の調節、Ｉ型インターフェロン産生の負の調節および免疫応答が富化される。それに一致して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔにおいて遺伝子が誘導されるのではなく抑制されるクラスター７および８において、富化される経路は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路の負の調節、Ｔ細胞活性化の調節およびまたしても、炎症応答を含む。対比して、ＰＲＤＭ１が経時的な遺伝子発現の減少を防止するクラスター６において、有糸分裂核分裂、細胞分裂、染色体分配、姉妹染色分体接着、細胞増殖、有糸分裂細胞周期のＧ１／Ｓ移行、およびＤＮＡ複製を含む増殖において強いシグネチャーが見出され、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、継続的な抗原刺激および複数ラウンドのがん細胞死滅の後であっても強い増殖能を維持するという表現型と符合した。ペアワイズ群比較を使用して、同じデータセットにおいて差次的発現解析も行った。本来的に、クラスタリングに基づかない差次的発現解析は、クラスター特異的シグネチャーを捕捉することができないが、３つの時点から得たこれらの差次的発現結果はまた、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞増殖およびアポトーシス、Ｔ細胞分化、シグナルトランスダクション、炎症応答ならびに免疫応答の集団的シグネチャーを検証した（図６Ｂ～図６Ｃ）。
（実施例６）
ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔは、複数の免疫学的プログラムの配線を替えた
材料および方法
ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮＡ－ｓｅｑに記載されている通りにＲＮＡを抽出した。製造業者のプロトコールに従ってＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｉｇｍａ）およびオリゴｄＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ｑＰＣＲのためのｃＤＮＡを生成した。ＰＲＤＭ１突然変異体配列解析のために、ｃＤＮＡを鋳型として使用することにより、ＰＲＤＭ１－ｃｒ１切断部位の付近にあるプライマーを使用することによりＰＣＲを行った。ＲＮＡ－ｓｅｑ検証のために、ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲマスターミックスおよびＴａｑｍａｎ遺伝子アッセイプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したｑＰＣＲに供した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓリアルタイム装置を使用して試料を処理し、相対的ｍＲＮＡ発現をＧＡＰＤＨ対照に対して正規化した。ΔΔＣｔ方法により相対的ｍＲＮＡ発現を決定した。
結果
ＰＲＤＭ１編集されたＣＡＲ－Ｔにおける遺伝子発現シグネチャーは、Ｔ細胞分化、メモリー特色、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞活性化、サイトカインおよびケモカイン産生、ならびにシグナル伝達経路等の根底にある免疫学的プログラムの調査を促した。いくつかのクラスター６遺伝子であるＣＤ２８およびＩＬ７Ｒ（Ｔ細胞メモリー表面マーカーのうち２つである）は、ベクター対照と比較して、ＰＲＤＭ１編集されたＣＡＲ－Ｔにおいて、全３つの時点（ＮＡＬＭ６刺激のラウンド）にわたり有意に上方調節されたことが観察された（図７Ａ～図７Ｂ）。時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑと符合して、同様にクラスター６遺伝子であるＫＬＦ２およびＳ１ＰＲ１等の上流調節因子は、継続的な抗原曝露により降下する傾向を示したが、この効果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＰＲＤＭ１の編集によって反転された（図７Ｃ～図７Ｄ）。次いで、エフェクターおよびメモリーＴ細胞の分化を調節する転写因子（ＴＦ）を試験した（Chang JT., et al., Nat Immunol., 15(12):1104-15 (2014)；Michelini RH., et al., J Exp Med. 210(6):1189-200 (2013)）。ＴＢＸ２１、ＩＤ２およびＲＵＮＸ３等のエフェクター駆動性ＴＦは、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞において有意に下方調節されたことが観察された。対比して、寿命の長いメモリー細胞の形成に必須の因子であるＦＯＸＯ１は、最初の２ラウンドの刺激でＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において上方調節された（図７Ｅ～図７Ｆ）。加えて、Ｔおよび他の免疫細胞の増殖のための主要調節因子であるＮＦκＢ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ６およびＣＤＣＡ７ならびに関連遺伝子は、ベクター対照細胞と比較して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において有意に増加し、継続的な抗原刺激により経時的に徐々に減少した（図７Ｇ～図７Ｊ）。他方では、Ｔ細胞の増殖を阻害する遺伝子であるＩＦＩＴ３およびＳＯＣＳ１は、ベクター対照と比較して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において時間依存的様式で下方調節された。これらの根底にある主要経路の変更は、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔの増加した持続性および継続性増殖能と符合する。
ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において、Ｔ細胞機能の経路のための他の中心的マーカーをさらに試験した。エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞分化を調節する転写因子のＡＰ－１／ＡＴＦスーパーファミリーをコードするクラスター７遺伝子であるＢＡＴＦ（Kurachi M., et al., Nat. Immunol., 15(4):373-83(2014)）は、通常のベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞において抗原刺激により迅速に誘導されたが、この誘導は、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞において消失し（図７Ｊ）、時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑと符合した。ＣＸＣＲ６（クラスター７）、ＩＬ１３（クラスター７）およびＰＲＦ１（クラスター８）を含む、炎症性ケモカイン／サイトカインをコードするいくつかの遺伝子もまた、やはり時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑに合致して、ベクター対照と比較して、ＰＲＤＭ１突然変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞において劇的に下方調節されることが観察された。細胞成長、分化、有糸分裂サイクルおよび発癌性形質転換を含む種々の細胞プロセスを調節するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーをコードするクラスター５遺伝子であるＰＴＰＮ１４（Pike KA. and Tremblay ML., Front. Immunol., 9:2504 (2018)）は、ベクター対照と比較して、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において高度に誘導された。対比して、ＷＮＴ／ベータ－カテニン経路シグナル伝達受容体をコードするクラスター２遺伝子であるＷＮＴ１１（Van Loosdregt, J., and Coffer, PJ., J. Immunol., 201(8):2193-2200 (2018)）は、ベクター対照Ｔ細胞においてＮＡＬＭ６刺激によって迅速に誘導されたが、その誘導は、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において完全に消失しており、これは、クラスター２遺伝子挙動のシグネチャーである。加えて、ＰＣＤＨ８は、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞において強い誘導を示したが、ベクター対照ＣＡＲ－Ｔ細胞ではこれを示さず、ＲＩＮ３は、ベクター対照において強い誘導を示したが、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞ではこれを示さなかった。
ＰＲＤＭ１の撹乱が、ＣＡＲ－ＴにおけるＴ細胞疲弊を低減させ得ることが仮定された。時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑと符合して、フローサイトメトリー解析は、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、やはりＲＮＡ－ｓｅｑ時間経過のクラスター２に含まれるＨＡＶＣＲ２遺伝子によってコードされる正準免疫チェックポイントであるＴＩＭ３の減少したレベルを有することを示した（図７Ｌ）。ＬＡＧ３、２Ｂ４／ＣＤ２４４およびＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１等の追加の表面チェックポイントもまた、Ｔ細胞表面で有意にかつ一貫して低減されており（図７Ｍ～図７Ｏ）、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞における疲弊の頑強な減衰を指し示した。まとめると、これらのデータは、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、増加したメモリー表現型、減少したＴ細胞終末分化、増強された細胞増殖、および慢性がん抗原曝露後の低減されたＴ細胞疲弊により、対照ＣＡＲ－Ｔを上回る改善を示したことを実証する（図７Ｐ）。
ＣＬＡＳＨは、免疫療法における「生きている薬物（living drug）」として現在考慮されているＣＡＲ－Ｔ細胞の大規模スケール操作のための多用途プラットフォームである。非ウイルスかつＤＮＡに基づくｃＤＮＡ導入遺伝子ノックインと対比して、ＣＬＡＳＨ系は、プールされた様式でウイルスベクターを単純に創出することにより、高度に効率的なヒトＴ細胞形質導入と共にラージスケール撹乱を可能にするＡＡＶベクターを活用する。ＴＲＡＣ等の特異的な遺伝子座へのＣＡＲ遺伝子の標的化された送達のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターにおけるランダム組込みと比較して、Ｔ細胞効力を増強し、腫瘍拒絶を増加させることができる（Eyquem J., et al., Nature 543, 113-117 (2017)）。非ウイルスＤＮＡ電気穿孔が使用されて、正常ヒトＴ細胞のゲノムにノックインする中間的な数（３６）の導入遺伝子が創出された（Roth TL., et al., Cell, 181(3):728-744.e21 (2020)）が、ＣＡＲ－Ｔ細胞ではできなかった。
ＣＬＡＳＨ系は、同じベクターにおいて別のユーザー定義ｃｒＲＮＡを運搬することにより、ＴＲＡＣへのＡＡＶ－ＨＤＲ媒介性ＣＡＲ－Ｔノックインおよび第３の撹乱の導入を容易にする。各構築物の間で異なり、高度なスケールアップが困難であるｃＤＮＡの限界と対比して、ワイルドカードｃｒＲＮＡの柔軟性と共に、プールにおける多数のｃｒＲＮＡを容易にスケールアップするための単純性は、ＣＬＡＳＨにより超並列撹乱を行うことを単純にする。よって、ＣＬＡＳＨは、大規模に標的化された多様性を有する安定にノックインされたＣＡＲ構築物を操作するために、多数のヒトＴ細胞の同時形質導入を可能にする。したがって、その結果得られるＴ細胞バリアントプールは、不偏かつ定量的な様式で、プールからの所望の表現型のハイスループット選択またはスクリーニングを直ちに可能にする。実施例において実証される通り、ノックインプールの表現は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって直接的に読み取ることができる。
ラージスケールＣＲＩＳＰＲスクリーニングが、レンチウイルスベクターにより（Dong MB., et al., Cell, 178(5):1189-1204.e23 (2019)；Shifrut M., et al., Cell, 175:1958-1971. e1915 (2018)；Ting PY., et al., Nat. Methods, 15(11):941-946 (2018)；Ye L., et al., Nat Biotechnol., 37(11):1302-1313 (2019)）、さらに近年では、トランスポゾン系によって、ヒトおよびマウス初代Ｔ細胞に適用された。しかし、ゲノムにランダムに組み込む既存のレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンに基づくＣＲＩＳＰＲライブラリーとは異なり、ＣＬＡＳＨ系は、全ＣＡＲ－Ｔバリアントを同じ遺伝子座へと正確に標的化し、よって、位置効果を制御して一連のバリアントを創出し、これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞のゲノムにおける挿入突然変異誘発を回避する。同じポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、ｃｒＲＮＡのストリング（例えば、ｃｒＴＲＡＣ－ｃｒＷｉｌｄｃａｒｄ）を駆動して、ノックイン／ノックアウト構築物全体を、ＡＡＶベクターの４．７ｋｂパッケージング限界に余裕をもってフィットさせることができるため、ｔｒａｃｒ非依存的Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１系もまた、マルチプレックス化された標的化された突然変異誘発を容易にする。Ｔ細胞の他に、ＣＬＡＳＨ技術は、他の初代免疫細胞または幹細胞等の多くの他の細胞型に適用され得る。
ＣＬＡＳＨ系を使用して、長期がん抗原刺激後にＣＡＲ－Ｔ細胞持続性を増強する免疫学的に関連性がある遺伝的撹乱を包括的に調査した。臨床的に関連性がある標的にヒットする確率を最大化するために、免疫に集中した、Ｔ細胞中心のライブラリーである、ＲｅｎｅおよびＤｅｓｃａｒｔｅｓを設計した。ＡＡＶ－ＣＬＡＳＨ－Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーは、大型の、機能的に多様なＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞プールを効率的に生成し、これを、抗原特異的がん細胞共培養による長期ＣＡＲ－Ｔ培養に供した。共培養系それ自体が、増加したＴ細胞終末分化、低い増殖および不十分なサイトカイン放出能力を伴う、疲弊したＣＡＲ－Ｔ細胞と符合した表現型を示した（Wherry EJ., Nature immunology 12, 492-499(2011)）。長期共培養選択圧は、死滅能力、細胞増殖を増加させることにより、またはＴ細胞疲弊を克服することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞生存を促進することができる一連の遺伝子を富化させた。これらの遺伝子の中でも、上位ヒットの１つであるＴＥＴ２は、破壊後にＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性および持続性を改善することが示され（Fraietta et al., 2018）、プラットフォームの妥当性を実証している。
ＮＧＳおよび解析を使用したＣＬＡＳＨ ＣＡＲ－Ｔ時間経過ライブラリー動態のシステマティックデコンボリューションは、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリーにおける個々の遺伝子の定量的効果の包括的なマップを明らかにした。これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞における機能をモジュレートするいくつかの候補を同定した。ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、進行型白血病における強力な抗腫瘍効果を媒介するセントラルメモリー表現型を呈した。最後に、時間経過ＲＮＡ－ｓｅｑ解析は、ＰＲＤＭ１撹乱の機能的意義の動的評価を可能にした。
ＰＲＤＭ１は、Ｂ細胞およびＴ細胞分化のための重大な意味をもつ転写調節因子として以前に公知であった（Rutishauser et al., 2009）。近年の研究は、ＰＲＤＭ１が、患者におけるＴＩＧＩＴおよびＰＤ－１の上方調節によりＴ細胞疲弊を媒介することを明らかにした（Zhu L., et al., J Hematol Oncol., 10(1):124 (2017)）。しかし、これらは、ＣＡＲ－Ｔではなく正常初代細胞において行われた。よって、この調査を、ＣＡＲ－Ｔ設定で直接的に行った。ＰＲＤＭ１－ｃｒ１の興味深い事例では、この構築物は、トランケートされたタンパク質産物をもたらすＰＲＤＭ１の特有のエクソン３スキップ突然変異体を生成することができる。ＣＬＡＳＨ操作されたＣＡＲ－Ｔにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１撹乱が、ＣＤ２２ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲ設定の両方において、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで増加した増殖能力およびセントラルメモリー表現型を顕在化することが観察された。ＰＲＤＭ１ ＣＤ２２ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲは両者共に、それぞれの対照ＣＡＲと比較して、優れた有効性を示した。本実施例は、ＰＲＤＭ１ ＣＡＲ－Ｔが、白血病モデルにおいて対照対応物よりも優れていることを実証する。
ＰＲＤＭ１は、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ等、タンパク質またはコリプレッサー複合体をリクルートして、ヒストンを修飾し、転写を抑圧することが以前に報告された（Gyory I., et al., Nature immunology 5:299-308 (2004)）。追加の研究は、ＢＣＬ６、ＩＤ３およびｃＭＹＣ等、予測されるＰＲＤＭ１結合部位を含有するいくつかの差次的に発現される遺伝子を見出した（Crotty S., et al., Nature immunology 11, 114-120 (2010)；Martins G. and Calame K. Annu Rev Immunol., 26:133-169 (2008)）。ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１のノックアウトは、サイトカイン応答性を継続し、ＣＤ２５およびＣＤ２７の発現増加に起因する増殖を増加させた（Shin HM., et al., Immunity 39, 661-675 (2013)）。ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１撹乱の機構に関する上述の研究は、ある特定の保存された経路を示したが、これらは、おそらくＣＡＲ－Ｔ特異的設定が原因で、以前の研究と同一ではなかった。ＢＣＬ６、ＣＤ２５およびＣＤ２７は、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１の編集後に増加しなかった。ＰＲＤＭ１標的化ｃｒＲＮＡが、ＰＲドメインのみを変化させ、したがって、ジンクフィンガードメインを不変のままにした可能性がある。以前の研究は、ＰＲＤＭ１のプロモーター過剰メチル化媒介性サイレンシングが、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の病態形成に寄与し得ることを報告した（Iqbal J., et al., Leukemia 23, 1139-1151 (2009)）。しかし、ＰＲＤＭ１の機能喪失型突然変異は、ＮＫＴＣＬにおいてめったに観察されない（Kucuk C., et al., Ther Adv Med Oncol . 12:1758835919900856 (2020)）。ＰＲＤＭ１操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の病原性または発癌性形質転換が観察されなかったという事実と、ＣＡＲ－Ｔ細胞の大部分が、過剰増殖ではなく持続性の欠如が原因で、ｉｎ ｖｉｖｏで弱るという事実を考慮すると、ＰＲＤＭ１編集が、都合よい治療域を付与して、管理可能な毒性または他の副作用リスクにより、ＣＡＲ－Ｔ治療有効性の増強を可能にすることができると考えてよさそうである。
実施例は、白血病モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ ＣＬＡＳＨ系を実証するが、この系は、ノックインＣＡＲ構築物を単純にスイッチすることにより、他の腫瘍型および他の形態のＣＡＲ－Ｔに適用することもできる。不十分なＴ細胞輸送能力および多くの進行型固形腫瘍における免疫抑制的な環境が原因で、固形腫瘍へのＣＡＲ－Ｔ細胞の適用に成功するには課題がある（Lim, WA., and June, CH., Cell 168:724-740 (2017)）。ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＲ－Ｔ細胞腫瘍浸潤もしくは時間依存的持続性モデルを使用し、固形腫瘍ＣＡＲ－Ｔ持続性を増強するためのＣＡＲ－Ｔの新たなバリアントを選択して、またはある特定のより洗練された設定では、腫瘍微小環境における抑制的構成成分を克服するために新たなＣＡＲ－Ｔの超並列操作のための複数のトランスジェニックレポーターもしくは免疫マーカーを利用して、それらの課題に取り組むことができる。がん処置に関連する様々な免疫欠損を克服し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造を単純化するために、同種異系間またはユニバーサルＣＡＲ－Ｔ系のモデルにおけるＣＬＡＳＨの適用は、機能的内在性ＴＣＲを除去するための遺伝子編集の使用等、新たな戦略の開発を容易にし、本方法を拡大することができる。ＣＬＡＳＨ系の多用途性は、効率および精度を有するＣＡＲ－Ｔのオンデマンド操作のための複数の新たな場を開く。
他に規定がなければ、使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示の発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。引用されている刊行物およびそれらが引用されている材料は、特に参照により本明細書に組み込まれる。
当業者は、記載されている方法および組成物の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するであろう、または単なるルーチン実験法を使用してこれらを確かめることができるであろう。そのような均等物は、次の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (51)

  1. ２つまたはそれより多くの複数のベクターを含むライブラリーであって、各ベクターが、
    １つまたは複数の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、５’相同アーム、ｃｒＲＮＡ発現カセット、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセット、および３’相同アームを含む、ライブラリー。
  2. 各ベクターの前記ｃｒＲＮＡ発現カセットが、独立して、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードし、前記第１のガイドＲＮＡが、前記複数のベクターにわたって同一である、請求項１に記載のライブラリー。
  3. 前記第２のガイドＲＮＡが、前記複数のベクターにわたって各ベクターに特有のものである、請求項１または２に記載のライブラリー。
  4. 前記ライブラリーの、コードされるガイドＲＮＡのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の配列が、配列番号３～１２，１３４からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のライブラリー。
  5. 約１００～約３００，０００、約１，０００～約５，０００、または約５０００～約１０，０００の別個のガイドＲＮＡを全体として含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のライブラリー。
  6. 配列番号３～４，０８７（Ｒｅｎｅライブラリー）、配列番号４，０８８～１２，１３４（Ｄｅｓｃａｒｔｅｓライブラリー）、または配列番号３～１２，１３４によりコードされるガイドＲＮＡを全体として含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のライブラリー。
  7. 各ｃｒＲＮＡ発現カセットが、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のライブラリー。
  8. 各ｃｒＲＮＡ発現カセットが、第１のガイドＲＮＡおよび第２のガイドＲＮＡをコードする配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のライブラリー。
  9. 前記ＣＡＲ発現カセットが、前記ＣＡＲをコードする配列に作動するように連結されたＥＦＳプロモーターおよび／またはポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のライブラリー。
  10. 各ベクターの前記ｃｒＲＮＡ発現カセットおよび／またはＣＡＲ発現カセットが、前記５’相同アームと３’相同アームの間に位置する、請求項１から９のいずれか一項に記載のライブラリー。
  11. 前記５’および３’相同アームが、ＴＲＡＣ遺伝子座と相同である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のライブラリー。
  12. 各ベクターが、前記ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする、請求項１から１１のいずれか一項に記載のライブラリー。
  13. 前記ＣＡＲが、１つまたは複数のがん特異的抗原またはがん関連抗原を標的とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載のライブラリー。
  14. 前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたは抗ＣＤ２２ ＣＡＲである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のライブラリー。
  15. 前記第２のガイドＲＮＡが、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞共刺激、メモリーＴ細胞分化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、エピジェネティック調節、適応免疫応答、腫瘍細胞に対する免疫応答、他の免疫機能、またはこれらの組合せに関与する遺伝子を標的とする、請求項２から１４のいずれか一項に記載のライブラリー。
  16. 前記ベクターが、
    ＴＲＡＣ標的化ｃｒＲＮＡをコードする配列を伴うもしくは伴わない、ＢｂｓＩクローニング部位に必要に応じて挿入された１つもしくは複数の追加のｃｒＲＮＡコード配列を伴うもしくは伴わない、および／または既存のＣＡＲコード配列もしくはその代わりに用いられる別のＣＡＲコード配列を伴う、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは
    上述のもののいずれかに対して７５％またはそれより高い配列同一性を有する配列バリアント
    を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のライブラリー。
  17. 各ベクターが、ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、必要に応じて、前記ＡＡＶが、ＡＡＶ６である、請求項１から１６のいずれか一項に記載のライブラリー。
  18. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 請求項１８に記載のＡＡＶベクターを含む細胞の集団。
  20. 必要に応じて、各細胞が、前記ライブラリーに含まれる多くて１つまたは２つのＡＡＶベクターを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のライブラリーを全体として含む細胞の集団。
  21. ＣＡＲを含む細胞の所望の表現型を増強する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、
    （ａ）請求項２０に記載の細胞の集団を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、前記ベクターに含有される前記ガイドＲＮＡおよびＣＡＲのゲノム組込みおよび発現に好適な条件下で接触させるステップ；ならびに
    （ｂ）前記所望の表現型を示す細胞を選択するステップ
    を含む、方法。
  22. 前記ｃｒＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＲ発現カセットが、前記ＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれる、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするウイルスベクター、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質、または前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質とＲＮＡの複合体として提供される、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、電気穿孔により提供される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１、またはその活性バリアント、誘導体もしくは断片である、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記所望の表現型が、腫瘍／腫瘍微小環境浸潤の増加、標的細胞親和性の増加または最適化、標的細胞への細胞傷害性の増大、持続性の増大、拡大／増殖の増加、疲弊の軽減、抗がん代謝機能の向上、免疫回避を防止する能力の増大、非特異的サイトカイン産生の低減、オフターゲット毒性の低下、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の軽減、およびこれらの組合せを含む群から選択される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記選択するステップが、前記細胞の集団を、前記ＣＡＲにより認識される１つもしくは複数の抗原を含む標的細胞と、規定された期間、共培養すること、フローサイトメトリーに基づくもしくは親和性に基づく選別、免疫マーカーに基づく選択、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍浸潤、ＣＡＲ－抗原相互作用、指向性進化、またはこれらの組合せを含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記細胞の集団が、前記標的細胞と繰り返し共培養される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記期間が、約１～約６０日を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記標的細胞が、がん細胞を含む、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 選択された細胞に存在するｃｒＲＮＡ発現カセットを同定するステップをさらに含む、請求項２１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ｃｒＲＮＡ発現カセットを同定する前記ステップが、前記選択された細胞のゲノムＤＮＡをシークエンシングすることを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 所望の表現型を増強する前記１つまたは複数の遺伝子が、前記ｃｒＲＮＡ発現カセットによりコードされる前記ガイドＲＮＡの標的とされる遺伝子として同定される、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記細胞の集団が、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｆｈ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、または他の免疫細胞を含む、請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３４に記載の方法。
  36. ＣＡＲと、請求項２１から３５のいずれか一項に記載の方法により同定された１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の突然変異とを含む、単離されたＣＡＲ Ｔ細胞。
  37. 前記１つまたは複数の突然変異が、前記１つもしくは複数の遺伝子またはその遺伝子産物の機能の低下を引き起こす、請求項３６に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
  38. 前記１つまたは複数の遺伝子が、ＰＲＤＭ１、ＤＰＦ３、ＳＬＡＭＦ１、ＴＥＴ２、ＨＦＥ、ＰＥＬＩ１、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、ＴＥＴ２、ＮＲ４Ａ２、ＬＡＩＲ１、およびＵＳＢ１を含む群から選択される、請求項３６または３７に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
  39. 前記１つまたは複数の遺伝子に前記１つまたは複数の突然変異を含まないＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、メモリーの増加、細胞増殖の増加、持続性の増大、標的細胞に対する細胞傷害性の増大、Ｔ細胞最終分化の減少、および／またはＴ細胞疲弊の軽減を示す、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のＣＡＲ Ｔ細胞。
  40. 請求項３６から３９のいずれか一項に記載のＣＡＲ Ｔ細胞を拡大することにより得られる、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団。
  41. 請求項４０に記載のＣＡＲ Ｔ細胞の集団と、薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
  42. 疾患、障害または状態を有する対象を処置する方法であって、請求項４１に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
  43. 前記疾患、障害または状態が、抗原の高度発現または特異的発現に関連している、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、前記抗原を標的とする、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記細胞が、健康なドナーから、または前記疾患、障害もしくは状態を有する前記対象から、前記１つまたは複数の遺伝子に前記１つまたは複数の突然変異の導入前に単離された、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記疾患、障害または状態が、がん、炎症性疾患、ニューロン障害、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、感染性疾患、または自己免疫疾患である、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記がんが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫を含む群から選択される白血病またはリンパ腫である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記対象が、ヒトである、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 配列番号３～１２，１３４からなる群から選択される１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む１つまたは複数のｃｒＲＮＡ発現カセットとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットとを含む異種核酸構築物を含む細胞。
  50. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットをコードする異種核酸構築物と、配列番号３～１２，１３４からなる群から選択される１つまたは複数のガイドＲＮＡの標的とされる１つまたは複数の遺伝子遺伝子座における発現の低減または消失とを含む細胞。
  51. 前記異種核酸構築物が、前記細胞のゲノム内のＴＲＡＣ遺伝子遺伝子座に存在し、必要に応じて、前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２２ ＣＡＲである、請求項４９または５０に記載の細胞。
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