KR20200012859A - 키메라 활성화 수용체 및 키메라 자극 수용체를 발현하는 세포 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 면역 세포(예컨대, T 세포)를 제공하며, 상기 면역 세포는 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) 및 키메라 신호전달 수용체(CSR) 작제물을 포함한다. 상기 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 및 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(TCR-associated signaling molecule)를 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하고, 상기 CSR은 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인 및 면역 세포에 자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 또한, 이러한 세포의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/490,576호, 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/490,578호, 및 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/490,580호에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
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기술분야
본 발명은 면역 세포(예컨대, T 세포)에 관한 것으로, 상기 면역 세포는 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) 및 키메라 신호전달 수용체(CSR) 작제물을 포함한다. 상기 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 및 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(TCR-associated signaling molecule)를 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하고, 상기 CSR은 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인 및 면역 세포에 자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
T-세포 매개 면역은 항원(Ag)-특이적 T 림프구를 발현시켜 바이러스, 세균, 기생충 감염 또는 악성 세포를 제거하기 위한 적응 과정이다. 그것은 또한 자가-항원의 비정상적인 인식을 수반하여, 자가면역 염증성 질병을 초래할 수 있다. T 림프구의 Ag 특이성은 Ag-제시 세포(APC) 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시되는 고유 항원성 펩티드의 T 세포 수용체(TCR)를 통한 인식에 기초한다(문헌[Broere, et al., Principles of Immunopharmacology, 2011]). 각각의 T 림프구는 흉선에서의 성숙 시에 발달적 선택의 결과로서 세포 표면 상에 고유 TCR을 발현시킨다. TCR은 αβ 이종이량체 또는 γδ 이종이량체 중 어느 하나로서 2가지 형태로 발생된다. T 세포는 세포 표면 상에 αβ 형태 또는 γδ 형태 중 어느 것인가의 TCR을 발현시킨다. 4개의 사슬, α/β/γ/δ는 모두 고도로 다형성인 "면역글로불린 가변 영역"-유사 N-말단 도메인 및 "면역글로불린 불변 영역"-유사 제2 도메인으로 이루어진 특징적인 세포외 구조를 갖는다. 이들 도메인 각각은 특징적인 도메인내 이황화물 가교를 갖는다. 불변 영역은 세포막에 근접해 있고, 이어서 연결 펩티드(connecting peptide), 막관통 영역 및 짧은 세포질 꼬리(tail)가 뒤따른다. 이종이량체 TCR의 2개의 사슬들 사이의 공유 결합은 세포외 불변 영역과 막관통 영역을 가교하는 짧은 연결 펩티드 서열 내에 위치된 시스테인 잔기에 의해 형성되는데, 이것은 상응하는 위치에서 쌍을 이룬 TCR 사슬 시스테인 잔기와 이황화물 결합을 형성한다(문헌[The T cell Receptor Factsbook, 2001]).
αβ 및 γδ TCR은 비-다형성 막-결합 CD3 단백질과 회합되어 기능성 팔량체 TCR-CD3 복합체를 형성하는데, 이것은 TCR 이종이량체 및 3개의 이량체 신호전달 분자, CD3δ/ε, CD3γ/ε 및 CD3ζ/ζ 또는 ζ/η로 이루어진다. 각각의 하위단위의 막관통 도메인 내의 이온화가능한 잔기들은 복합체를 함께 유지하는 상호작용의 극성 네트워크를 형성한다. T 세포 활성화를 위하여, TCR N-말단 가변 영역은 표적 세포의 표면 상에 제시된 펩티드/MHC 복합체를 인식하는 반면, CD3 단백질은 신호 전달에 참여한다(문헌[Call et al., Cell. 111(7):967-79, 2002]; 문헌[The T cell Receptor Factsbook, 2001]).
통상적인 TCR로도 불리는 αβ TCR은 대부분의 림프구 상에서 발현되고, 글리코실화된 다형성 α 및 β 사슬로 이루어진다. 상이한 αβ TCR들은, 치수 및 형상이 비교적 일정한 MHC II(대부분 APC 세포 표면 상에서 발현됨) 및 MHC I(모든 유핵 세포 상에서 발현됨) 분자의 표면 내에 매립된 상이한 펩티드들 사이에서 구별될 수 있다. γδ TCR은 αβ TCR과 구조적으로는 유사하더라도, MHC 제시와는 무관한 방식으로 탄수화물-, 뉴클레오티드-, 또는 인-보유 항원을 인식한다(문헌[The T cell Receptor Factsbook, 2001]; 문헌[Girardi et al., J. Invest. Dermatol. 126(1):25-31, 2006]; 문헌[Hayes et al., Immunity. 16(6):827-38, 2002]).
지난 20년간, 많은 수의 종양 항원의 확인과 조합하여 면역학 및 종양 생물학에서의 기초적 진보는 세포-기반 면역요법 분야에서 상당한 진전으로 이어져 왔다. T 세포 요법은 자가 T 세포 및 생체외(ex vivo) 증폭된 T 세포를 환자에 전달하여 암을 치료하려는 목적으로 세포-기반 면역요법 분야에서 큰 부분을 차지하고 있으며, 그 결과 몇몇 주목할 만한 항종양 반응을 보여왔다(문헌[Blattman et al., Science. 305(5681):200-5, 2004]). 예를 들어, 생체외에서 증폭된 천연 발생 종양 침윤 림프구(TIL)의 투여는 간, 폐, 연조직 및 뇌를 포함하는 다수의 부위에서의 부피가 큰 침습성 종양을 포함하는 흑색종 환자에서 50 내지 70% 범위의 목적 반응 속도를 달성하였다(문헌[Rosenberg et al., Nat. Rev. Cancer. 8(4):299-308, 2008]; 문헌[Dudley ME et al., J. Clin. Oncol. 23(10):2346-57, 2005]).
TIL 요법의 광범위한 적용에 대한 주요 제한은 항종양 잠재력을 갖는 인간 T 세포를 생성하는 데 있어서의 어려움이다. 대안적인 접근법으로서, 외인성 고친화성 TCR이 T 세포 조작을 통해 환자의 정상 자가 T 세포 내로 도입될 수 있다. 림프구-고갈된(lympho-depleted) 환자 내로의 이들 세포의 입양 전달은 암, 예컨대 흑색종, 결직장 암종, 및 활막 육종에서의 암 퇴행을 달성하는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Kunert R et al., Front. Immunol. 4:363, 2013]). 활막 육종에 대한 항 NY-ESO-1 TCR을 사용한 최근의 I상 임상 시험은 66%의 전체 반응률을 보고하였으며, T 세포 요법을 제공받은 환자들 중 한 명에서 완전한 반응이 달성되었다(문헌[Robbins PF et al., Clin. Cancer Res. 21(5):1019-27, 2015]).
TCR-조작된 T 세포 요법의 이점들 중 하나는 이러한 요법이 잠재적인 세포내 종양-특이적 단백질들의 전체 어레이를 표적화할 수 있다는 것으로, 이때 이들 단백질은 프로세싱되고 MHC 제시를 통해 세포 표면으로 전달된다. 더욱이, TCR은 고도로 감수성이어서 단지 수 개의 항원성 펩티드/MHC 분자에 의해 활성화될 수 있으며, 이는 다시 사이토카인 분비, T 세포 증식 및 정의된 표적 세포의 세포용해를 포함한 세포용해 T 세포 반응을 촉발시킬 수 있다. 따라서, 항체 또는 소분자 요법과 비교하여, TCR-조작된 T 세포는 표적 세포내 항원의 아주 적은 카피로 표적 세포를 사멸시키는 그의 능력으로 인해 특히 가치가 있다(문헌[Kunert R et al., Front. Immunol. 4:363, 2013]).
그러나, 대부분이 하이브리도마 또는 디스플레이 기술을 통해 발견되는 치료적 항체와 달리, 표적-특이적 TCR의 확인은 환자 T 세포로부터의 표적 펩티드/MHC 특이적 TCR 클론의 확립 및 최적의 표적 항원-결합 친화도를 갖는 올바른 α-β 사슬 조합에 대한 스크리닝을 필요로 한다. 매우 종종, 환자 T 세포로부터의 TCR의 클로닝 후에 파지/효모 디스플레이를 사용하여 TCR의 표적 결합 친화도를 추가로 향상시킨다. 전체 프로세스는 많은 영역에서 전문성을 필요로 하며 시간 소모적이다(문헌[Kobayashi E et al., Oncoimmunology. 3(1):e27258, 2014]). TCR 회수 프로세스에서의 어려움은 TCR-조작된 T 세포 요법의 광범위한 적용을 크게 방해해 왔다. 그것은 또한 치료-관련 독성에 의해 방해받아 왔는데, 이는 특히, 종양 세포 상에서 과발현되지만 또한 건강한 세포 상에서도 발현되는 항원에 대한 TCR에 의한 경우, 또는 탈표적(off-target) 펩티드/MHC 복합체를 인식하는 TCR에 의한 경우에 그러하다(문헌[Rosenberg SA et al., Science. 348(6230):62-8, 2015]).
표적화된 암 면역요법을 위하여 T 세포와 결합하는 상이한 접근법이 최근에 개발되어 왔다. 이러한 새로운 접근법은 키메라 항원 수용체 T 세포 요법(CAR-T)으로 불린다. 그것은 단일클론 항체의 정교한 표적화 특이성을 세포독성 T 세포에 의해 제공되는 강력한 세포독성 및 장기간 지속성과 병합시킨다. CAR은 세포 표면 항원을 인식하는 세포외 도메인, 막관통 영역, 및 세포내 신호전달 도메인으로 구성된다. 세포외 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv) 내로 융합된 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄로부터의 항원-결합 가변 영역으로 이루어진다. 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM), 예컨대 CD3ζ 또는 FcRγ로부터의 것들, 및 하나 이상의 공동자극성 신호전달 도메인, 예컨대 CD28, 4-1BB 또는 OX40으로부터의 것들을 함유한다(문헌[Barrett DM et al., Annu. Rev. Med. 65:333-47, 2014]; 문헌[Davila ML et al., Oncoimmunology. 1(9):1577-1583, 2012]). T 세포 표면 상에 그래프팅된 CAR에 의한 표적 항원의 결합은 TCR-펩티드/MHC 복합체 상호작용과 무관하게 T 세포 이펙터 기능을 촉발시킬 수 있다. 따라서, CAR이 구비된 T 세포는, T 세포 상의 TCR의 MHC 유형과 매칭되지는 않지만 표적 세포-표면 항원을 발현하는 세포를 포함한 매우 다양한 세포를 공격하도록 방향전환될 수 있다. 이러한 접근법은 MHC-제한 TCR 인식의 제약을 극복하고, 항원 제시 또는 MHC 분자 발현에서의 손상을 통한 종양 탈출을 피한다. 임상 시험은 신경아세포종(문헌[Louis CU et al., Blood. 118(23):6050-6056, 2011)], B-ALL(문헌[Maude, SL, et al., New England Journal of Medicine 371:16:1507-1517, 2014]), CLL(문헌[Brentjens, RJ, et al. Blood 118:18:4817-4828, 2011]), 및 B 세포 림프종(문헌[Kochenderfer, JN, et al. Blood 116:20:4099-4102, 2010])에서 CAR-T 요법의 임상적으로 유의한 항종양 활성을 보여주어 왔다. 한 연구에서는, CD19-CAR T 요법으로 치료된 B-ALL을 가진 30명의 환자에서 90% 완전 관해율을 보고하였다(문헌[Maude, SL, et al.], 상기 참조).
지금까지 연구된 모든 CAR은 높은 세포 표면 발현을 갖는 종양 항원에 관한 것이었다. 알려진 모든 종양-특이적 항원의 95%를 나타내는, 저-카피수 세포-표면 종양 항원 및 세포내 종양 항원을 표적화하기 위하여, 더 강력하고 효과적인 조작된 세포 요법을 개발할 필요성이 있다(문헌[Cheever, et al., Clin. Cancer Res. 15(17):5323-37, 2009]).
T 세포 수용체 이펙터 기능과 함께 항체 특이성을 갖는 키메라 수용체 분자를 조작하기 위한 몇몇 시도가 이루어져 왔다. 예를 들어, 문헌[Kuwana, Y, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149(3):960-968, 1987]; 문헌[Gross, G, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:10024-10028, 1989]; 문헌[Gross, G & Eshhar, Z, FASEB J. 6(15):3370-3378, 1992]; 및 미국 특허 제7,741,465호를 참조한다. 오늘날까지, 이들 키메라 수용체 중 어느 것도 임상 사용을 위해 채택되지 않았으며, 인간 T 세포에서의 개선된 발현 및 기능성을 갖는 항체-TCR 키메라 수용체에 대한 신규한 설계가 필요하다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. PCT 출원 PCT/US2016/058305호는 이로써 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 태양에서, 본 출원은 면역 세포(예컨대, T 세포)를 제공하며, 상기 면역 세포는 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) 및 키메라 신호전달 수용체(CSR) 작제물을 포함한다. 상기 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 및 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하고, 상기 CSR은 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인 및 면역 세포에 자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 면역 세포가 제공되며, 상기 면역 세포는 a) 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) - caTCR은 i) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈; 및 ii) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진함 -; 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR) - CSR은 i) 표적 리간드와 결합하거나 상호작용할 수 있는 리간드-결합 모듈; ii) 막관통 모듈; 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함하며, 리간드-결합 모듈과 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 동일한 분자로부터 유래되지 않고, CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 도메인이 결여되어 있음 - 를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 caTCR 및 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 제공되며, caTCR 및 CSR 각각은 하나 이상의 핵산에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 핵산이 제공되며, 상기 하나 이상의 핵산은 a) 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) - caTCR은 i) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈; 및 ii) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하고, caTCR은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어짐 -; 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR) - CSR은 i) 표적 리간드와 결합하거나 상호작용할 수 있는 리간드-결합 모듈; ii) 막관통 모듈; 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함하며, 리간드-결합 모듈과 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 동일한 분자로부터 유래되지 않고, CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 도메인이 결여되어 있고, CSR은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어짐 - 를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 벡터를 포함하는 면역 세포가 제공된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원을 제시하는 표적 세포를 사멸시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 표적 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, caTCR을 포함하거나 caTCR을 인코딩하는 핵산에 의해 형질도입된 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
도 1은 상이한 항원-결합 모듈을 갖는 몇몇 caTCR 분자의 개략도를 나타낸다.
도 2는 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD19 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 NALM6(CD19+)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 3은 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD19 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 NALM6의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 4는 암 세포주 NALM6에 의한 자극 후 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD19 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 5는 암 세포주 BV173 또는 NALM6에 의한 자극 후 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 6은 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2(AFP+/GPC3+) 및 HepG2-GPC3.ko(AFP+/GPC3-)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 7은 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2 및 HepG2-GPC3.ko의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 8은 암 세포주 HepG2에 의한 자극 후 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 9는 암 세포주 HepG2에 의한 자극 후 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 10은 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 Raji, BV173, NALM6, 및 Jeko-1(각각 CD19+/CD20+)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 11은 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 Raji의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 12는 암 세포주 Raji에 의한 자극 후 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD20 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13e는 예시적인 이중특이성 caTCR 분자의 개략 구조를 도시한다.
도 14 및 도 15는 암 세포주 NALM6에 의한 자극 후 항-CD19 caTCR-1-0 및 항-CD19 CSR을 발현하는 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 16은 모의 처리를 받거나, 또는 항-CD19 caTCR-1, 또는 항-CD19 CSR-1과 조합된 항-CD19 caTCR-1을 발현하는 T 세포의 단회 종양내 주사를 받은 NALM6의 피하 마우스 모델에서의 종양 성장을 나타낸다.
도 17은 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포 또는 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR-1 둘 모두를 발현하는 T 세포에 의해 처리된 마우스에서의 혈청 사이토카인 수준을 나타낸다. 스튜던트 t-검정(Student t-test)을 사용하여 2개의 군에서의 혈청 사이토카인 수준의 통계학적 유의성을 분석한다(**P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001).
도 18은 모의 처리를 받거나, 또는 항-AFP CAR, 또는 항-GPC3 CSR과 조합된 항-AFP CAR을 발현하는 T 세포의 단회 종양내 주사를 받은 HepG2의 피하 마우스 모델에서의 종양 성장을 나타낸다.
도 2는 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD19 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 NALM6(CD19+)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 3은 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD19 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 NALM6의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 4는 암 세포주 NALM6에 의한 자극 후 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD19 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 5는 암 세포주 BV173 또는 NALM6에 의한 자극 후 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 6은 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2(AFP+/GPC3+) 및 HepG2-GPC3.ko(AFP+/GPC3-)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 7은 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2 및 HepG2-GPC3.ko의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 8은 암 세포주 HepG2에 의한 자극 후 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 9는 암 세포주 HepG2에 의한 자극 후 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 10은 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 Raji, BV173, NALM6, 및 Jeko-1(각각 CD19+/CD20+)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 11은 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 Raji의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 12는 암 세포주 Raji에 의한 자극 후 단독으로의 항-CD19 caTCR-1-0, 단독으로의 항-CD20 CSR, 또는 항-CD19 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13e는 예시적인 이중특이성 caTCR 분자의 개략 구조를 도시한다.
도 14 및 도 15는 암 세포주 NALM6에 의한 자극 후 항-CD19 caTCR-1-0 및 항-CD19 CSR을 발현하는 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 16은 모의 처리를 받거나, 또는 항-CD19 caTCR-1, 또는 항-CD19 CSR-1과 조합된 항-CD19 caTCR-1을 발현하는 T 세포의 단회 종양내 주사를 받은 NALM6의 피하 마우스 모델에서의 종양 성장을 나타낸다.
도 17은 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포 또는 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR-1 둘 모두를 발현하는 T 세포에 의해 처리된 마우스에서의 혈청 사이토카인 수준을 나타낸다. 스튜던트 t-검정(Student t-test)을 사용하여 2개의 군에서의 혈청 사이토카인 수준의 통계학적 유의성을 분석한다(**P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001).
도 18은 모의 처리를 받거나, 또는 항-AFP CAR, 또는 항-GPC3 CSR과 조합된 항-AFP CAR을 발현하는 T 세포의 단회 종양내 주사를 받은 HepG2의 피하 마우스 모델에서의 종양 성장을 나타낸다.
본 출원은 면역 세포(예컨대, T 세포)를 제공하며, 상기 면역 세포는 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) 및 키메라 신호전달 수용체(CSR) 작제물을 포함한다. caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈, 및 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함한다. CSR은 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인 및 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 도메인을 포함하고, 기능성 1차 면역 세포 신호전달 서열을 포함하지 않는다. 표적 항원 및 표적 리간드는 세포 표면 상에 발현되는 단백질, 또는 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체(본 명세서에서 "pMHC 복합체" 또는 "pMHC"로 지칭됨), 예컨대 질병에 걸린 세포의 표면 상에 존재하는 MHC-제시된 질병-관련 항원 펩티드일 수 있다. caTCR은 T 세포 수용체 활성화를 제어하는 천연 발생 기전에 의해 조절되고, CSR을 통한 신호전달은 caTCR에 의해 매개되는 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
본 발명자들은 caTCR 및 CSR 작제물을 포함하는 일련의 신규한 T 세포를 개발하였다. 이러한 T 세포는, CSR의 부재 하에서 단지 caTCR만을 발현하는 세포와 대비하여 표적 세포 결합에 대한 반응으로의 증가된 사이토카인 발현을 가지면서, 표적-보유 종양 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내었다. 이들 세포 내에의 CSR의 포함은 단지 caTCR만을 발현하는 세포와 대비하여 탈과립, 증식, 및 생존력을 추가로 향상시켰다.
따라서, 본 출원은 표적 항원에 특이적인 caTCR 및 표적 리간드에 특이적인 CSR을 포함하는 면역 세포를 제공하며, 상기 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 및 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(TCR-associated signaling molecule)를 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하고, 상기 CSR은 a) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인 및 면역 세포에 자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 도메인을 포함하고, b) 기능성 1차 면역 세포 신호전달 서열을 포함하지 않는다. caTCR은 항원-결합 모듈 및/또는 TCRM에 있어서 변이를 갖는 다수의 포맷들 중 임의의 것을 취할 수 있다. 예를 들어, caTCR은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티(moiety)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 막관통 도메인, 연결 펩티드, 및 세포내 도메인 중 하나 이상에 있어서의 변이체를 포함한, α/β 또는 γ/δ TCR로부터 유래된 하나 이상의 서열을 포함하는 TCRM을 가질 수 있다. 도 1을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다. CSR도 유사하게 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는 리간드-결합 모듈을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원과 표적 리간드는 동일하다. 일부 실시 형태에서, caTCR의 항원-결합 모듈과 CSR의 리간드-결합 모듈은 동일하거나, 항원 특이성을 부여하는 동일한 서열, 예컨대 CDR 또는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원과 표적 리간드는 상이하다.
또 다른 태양에서, a) caTCR 및 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산, b) caTCR 및 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 면역 세포, 및 c) i) caTCR 및 CSR, 또는 ii) caTCR 및 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 면역 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.
또한, 치료 목적을 위한 caTCR 및 CSR을 포함하는 면역 세포의 제조 및 사용 방법뿐만 아니라, 그러한 방법에 유용한 키트 및 제조 물품이 제공된다. 또한, caTCR 및 CSR을 포함하는 면역 세포를 사용하여 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
정의
용어 "항체" 또는 "항체 모이어티"는 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원-결합을 담당한다. 양쪽 사슬 내의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 고도로 가변적인 루프(경쇄(LC)-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 LC CDR, 중쇄(HC)-CDR1, HC-CDR2, 및 HC-CDR3을 포함하는 HC CDR)를 함유한다. 본 명세서에 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), 또는 알-라지카니(Al-Lazikani)의 규약에 의해 정의되거나 확인될 수 있다(문헌[Al-Lazikani 1997]; 문헌[Chothia 1985]; 문헌[Chothia 1987]; 문헌[Chothia 1989]; 문헌[Kabat 1987]; 문헌[Kabat 1991]). 중쇄 또는 경쇄의 3개의 CDR은 프레임워크 영역(framework region, FR)으로 알려진 플랭킹 스트레치(flanking stretch)들 사이에 개재되며, 이들은 CDR보다 더 고도로 보존되고 스캐폴드를 형성하여 초가변 루프를 지탱한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원-결합에 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 부류들에 배정된다. 항체의 5개의 주요 부류 또는 동종형(isotype)은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이며, 이들은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 한다. 주요 항체 부류들 중 몇몇은 lgG1(γ1 중쇄), IgG2(γ2 중쇄), lgG3(γ3 중쇄), lgG4(γ4 중쇄), lgA1(α1 중쇄), 또는 lgA2(α2 중쇄)와 같은 하위부류로 나누어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편을 지칭하며, 이에는, 예를 들어 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편이 포함된다. 항원-결합 단편은 모(parent) 항체 또는 모 항체 단편(예를 들어, 모 scFv)이 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 그래프팅된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 등몰 농도의 제1 항체 모이어티의 존재 하에서 제1 항체 모이어티가 제2 항체 모이어티의 표적 항원-결합을 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)만큼 억제할 때 제1 항체 모이어티는 표적 항원에 결합하기 위하여 제2 항체 모이어티와 "경쟁"하거나, 또는 그 역으로도 성립한다. 항체들을 그들의 교차-경쟁에 기초하여 "비닝(binning)"하기 위한 고처리량 프로세스가 PCT 공개 WO 03/48731호에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "~에 특이적이다"는 생물학적 분자를 포함한 이종 분자 집단의 존재 하에서 표적의 존재를 결정짓는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 표적과 항체 또는 항체 모이어티 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, (에피토프일 수 있는) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 그의 결합보다 더 큰 친화도, 결합력(avidity)으로, 더 용이하게, 그리고/또는 더 긴 지속기간으로 상기 표적에 결합하는 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는 항원(예를 들어, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 단백질 복합체)의 하나 이상의 항원 결정기와, 다른 표적에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배인 결합 친화도로 반응한다.
용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 T 세포의 표면 상에서 쌍을 이루는 αβ 또는 γδ 사슬로 구성된 이종이량체성 수용체를 지칭한다. 각각의 α, β, γ 및 δ 사슬은 다음 2개의 Ig-유사 도메인으로 구성된다: 상보성 결정 영역(CDR)을 통해 항원 인식을 부여하는 가변 도메인(V), 이어서 연결 펩티드 및 막관통(TM) 영역에 의해 세포막에 고착되는 불변 도메인(C). TM 영역은 CD3 신호전달 장치의 불변성 하위단위와 회합된다. 각각의 V 도메인은 3개의 CDR을 갖는다. 이들 CDR은 주요 조직적합성 복합체에 의해 인코딩된 단백질(pMHC)에 결합된 항원성 펩티드 사이의 복합체와 상호작용한다(문헌[Davis and Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402]; 문헌[Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544]; 문헌[Murphy (2012), xix, 868 p.]).
용어 "TCR-회합 신호전달 분자"는 TCR-CD3 복합체의 일부인 세포질 면역수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 분자를 지칭한다. TCR-회합 신호전달 분자는 CD3γε, CD3δε, 및 ζζ(CD3ζ 또는 CD3ζζ로도 알려짐)를 포함한다.
CD3을 발현하는 세포와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "활성화"는, 제한 없이 세포 증식 및 사이토카인 생성을 포함한 CD3 신호전달 경로의 하류 이펙터 기능에 있어서의 검출가능한 증가를 유도하기에 충분히 자극된 세포의 상태를 지칭한다.
단백질의 일부분을 언급할 때 용어 "모듈"은 단백질을 구성하는 하나 이상의 폴리펩티드의 구조적으로 및/또는 기능적으로 관련된 일부분들을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 이량체 수용체의 막관통 모듈은 막에 걸쳐 이어져 있는 수용체의 각각의 폴리펩티드 사슬의 일부분들을 지칭할 수 있다. 모듈은 또한 단일 폴리펩티드 사슬의 관련 부분을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 단량체 수용체의 막관통 모듈은 막에 걸쳐 이어져 있는 수용체의 단일 폴리펩티드 사슬의 일부분들을 지칭할 수 있다. 모듈은 또한 단지 폴리펩티드의 단일 일부분만을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 핵산"은 게놈의 핵산, cDNA의 핵산, 또는 합성 기원의 핵산 또는 이들의 어떠한 조합을 의미하는 것으로 의도되며, 그의 기원에 의해 "단리된 핵산"은 (1) "단리된 핵산"이 자연계에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 회합되지 않거나, (2) 그것이 자연계에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연계에서 발생하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 불연속 항원 결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이들 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]; 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)]; 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; 문헌[Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997)]; 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]; 문헌[Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)]; 문헌[Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003)]; 및 문헌[Honegger and 
, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)]에 의해 기재되어 있으며, 여기서 이들 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기들의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그래프팅된 항체 또는 이들의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 정의의 적용도 본 명세서에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참고문헌들 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 비교로서 하기 표 1에 기재되어 있다. CDR 예측 알고리즘 및 인터페이스는 당업계에 알려져 있으며, 이에는, 예를 들어 문헌[Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)]; 문헌[Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307 (2010)]; 및 문헌[Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43: D432-D438 (2015)]이 포함된다. 본 단락에 인용된 참고문헌의 내용은 본 발명에 사용하기 위하여 그리고 본 명세서의 하나 이상의 청구항에서의 가능한 포함을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
[표 1]
용어 "키메라 항체"는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것으로부터 유래된 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 반면, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것으로부터 유래된 항체뿐만 아니라, 본 발명의 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 항체를 지칭한다(미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조).
항체 또는 항체 모이어티와 관련하여 용어 "반합성"은 항체 또는 항체 모이어티가 하나 이상의 천연 발생 서열 및 하나 이상의 천연 비발생(즉, 합성) 서열을 가짐을 의미한다.
항체 또는 항체 모이어티와 관련하여 용어 "완전 합성"은 항체 또는 항체 모이어티가 고정된 천연 발생 VH/VL 프레임워크 쌍을 갖지만, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 6개의 모든 CDR의 천연 비발생(즉, 합성) 서열을 가짐을 의미한다.
비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역(HVR)으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드들 사이 또는 2개의 핵산 분자들 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 양쪽 서열 내의 한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 하위단위에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 각각의 DNA 분자 내의 한 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들 분자는 그 위치에서 "상동"이다. 2개의 서열들 사이의 "상동성의 %" 또는 "% 서열 동일성"은, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하여, 2개의 서열에 의해 공유된 매칭되거나 상동인 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누어서 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 10개 중 6개가 매칭되거나 상동인 경우, 2개의 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC와 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 2개의 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬될 때 이루어진다. % 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR), 또는 MUSCLE 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대한의 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 MUSCLE을 사용하여 생성된다(문헌[Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004]; 문헌[Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004]).
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인"("H1" 도메인의 "C1"로도 지칭됨)은 통상 약 아미노산 118부터 약 아미노산 215(EU 넘버링 체계)까지 연장된다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴된 버전인 그리고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 어떤 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 결합을 지칭하는 것으로, 그 결과로서 후자가 발현된다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열들은 인접해 있으며, 2개의 단백질 코딩 영역을 결합시킬 필요가 있는 경우, 동일한 판독 프레임 내에 있다.
용어 "유도성 프로모터"는 하나 이상의 특정 신호를 추가하거나 제거함으로써 활성이 조절될 수 있는 프로모터를 지칭한다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 특정 조건 세트 하에서, 예를 들어 프로모터를 활성화시키고/시키거나 프로모터의 억제를 완화시키는 유도제 또는 조건의 존재 하에서, 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 활성화시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 방법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 원하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 질병에 기인되는 하나 이상의 증상 경감, 질병 정도의 저하, 질병의 안정화(예를 들어, 질병의 악화를 예방 또는 지연), 질병의 확산(예를 들어, 전이)을 예방 또는 지연, 질병 재발의 예방 또는 지연, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선, 질병 관해(부분 관해 또는 완전 관해)의 제공, 질병을 치료하는 데 필요한 하나 이상의 다른 의약품 용량의 감소, 질병 진행의 지연, 삶의 질의 상승 또는 개선, 체중 획득의 증가, 및/또는 생존 연장. 또한, "치료"에는 질병의 병리학적 결과(예컨대, 암에서의 종양 부피)의 감소가 포함된다. 본 발명의 방법은 이들 치료 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
용어 "재발", "재연" 또는 "재발성"은 질병 소멸의 임상 평가 후에 암 또는 질병의 복귀를 지칭한다. 원격 전이 또는 국소 재발의 진단이 재연으로 간주될 수 있다.
용어 "불응성" 또는 "저항성"은 치료에 반응하지 않은 암 또는 질병을 지칭한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 caTCR 또는 caTCR을 포함하는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적에 관하여 경험적으로 그리고 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 개체에서 질병 또는 장애를 "치료하는" 데 효과적인, 본 명세서에 개시된 바와 같은 caTCR 또는 caTCR을 포함하는 조성물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 caTCR 또는 caTCR을 포함하는 조성물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시킬 수 있고/있거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도까지 둔화, 및 바람직하게는 정지)할 수 있고/있거나; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도까지 둔화, 및 바람직하게는 정지)할 수 있고/있거나; 종양 성장을 어느 정도까지 억제할 수 있고/있거나; 암과 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 caTCR 또는 caTCR을 포함하는 조성물이 기존의 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 그것을 사멸시킬 수 있는 정도까지, 그것은 세포분열억제성(cytostatic) 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료적 유효량은 성장 억제량이다. 일부 실시 형태에서, 치료적 유효량은 환자의 무진행 생존율을 개선하는 양이다. 감염성 질병, 예컨대 바이러스성 감염의 경우에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 caTCR 또는 caTCR을 포함하는 조성물의 치료적 유효량은 병원체에 의해 감염된 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 병원체-유래 항원의 생성 또는 방출을 감소시킬 수 있고/있거나; 감염되지 않은 세포로의 병원체의 확산을 억제(즉, 어느 정도까지 둔화, 및 바람직하게는 정지)할 수 있고/있거나; 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장시키는 양이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 적합한"은 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직한 물질을 의미하며, 예를 들어 이러한 물질은 임의의 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나, 이를 함유한 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성 시험 및 제조 시험의 요구되는 기준을 충족하고/하거나, 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug administration)에 의해 작성된 불활성 성분 지침서(Inactive Ingredient Guide)에 포함되어 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 실시 형태는 실시 형태로 "이루어지는" 및/또는 "실질적으로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서의 "약" 값 또는 파라미터에 관한 언급은 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 변화량을 포함한다(그리고 기술한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 값 또는 파라미터가 "아닌" 것에 관한 언급은 일반적으로 값 또는 파라미터 "이외의" 것을 의미하고 기재한다. 예를 들어, 본 방법이 유형 X의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 상기 방법이 X 이외의 유형의 암을 치료하는 데 사용된다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수형 "부정관사(a)", "또는" 및 "정관사(the)"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.
caTCR + CSR 면역 세포
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR 및 CSR에 따른 caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포)를 제공한다(그러한 면역 세포는 또한 본 명세서에서 "caTCR + CSR 면역 세포"로 지칭된다). 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR 및 CSR을 인코딩하는 핵산을 포함하며, caTCR 및 CSR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 T 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 면역 세포의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 유전자 발현을 파괴하기 위한 세포의 변형은, 예를 들어 RNA 간섭(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA), 유전자 편집(예를 들어, CRISPR- 또는 TALEN-기반 유전자 녹아웃) 등을 포함한 당업계에 알려진 임의의 그러한 기법을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 면역 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 인코딩하는 핵산을 포함하며, caTCR 및 CSR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열, caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열, 및 CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열은 각각 상이한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 일부 또는 전부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 벡터는, 예를 들어, 포유류 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 하나 이상은 면역 세포의 숙주 게놈 내로 통합된다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열은 각각 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 일부 또는 전부는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 표면 상에 발현하는 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 caTCR + CSR 면역 세포는 a) caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열; b) caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열; 및 c) CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 포함하며; 제1 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬은 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열로부터 발현되어 caTCR을 형성하고, CSR 폴리펩티드 사슬은 CSR 핵산으로부터 발현되어 CSR을 형성하고, caTCR 및 CSR은 면역 세포의 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열은 제1 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유되고, 제2 caTCR 핵산 서열은 제2 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유되고, CSR 핵산 서열은 제3 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열 및 CSR 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 동일한 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열 및 CSR 핵산 서열 각각은 개별적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 일부 또는 전부는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 일부 또는 전부는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 면역 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 그의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 일부 또는 전부는 면역 세포의 숙주 게놈에 통합된 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 표면 상에 발현하는 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 caTCR + CSR 면역 세포는 a) caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 벡터; b) caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 벡터; 및 c) CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제3 프로모터를 포함하는 제3 벡터를 포함하며, 제1 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬은 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열로부터 발현되어 caTCR을 형성하고, CSR 폴리펩티드 사슬은 CSR 핵산 서열로부터 발현되어 CSR을 형성하고, caTCR 및 CSR은 면역 세포의 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 면역 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 그의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 벡터는 면역 세포의 숙주 게놈에 통합된 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 표면 상에 발현하는 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 caTCR + CSR 면역 세포는 a) i) caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 및 ii) caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제1 벡터; 및 b) CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제3 프로모터를 포함하는 제2 벡터를 포함하며, 제1 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬은 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열로부터 발현되어 caTCR을 형성하고, CSR 폴리펩티드 사슬은 CSR 핵산 서열로부터 발현되어 CSR을 형성하고, caTCR은 면역 세포의 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 면역 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 그의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 벡터는 면역 세포의 숙주 게놈에 통합된 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다. 핵산 서열들 중 임의의 것이 교체되는 실시 형태, 예컨대 제1 또는 제2 caTCR 핵산 서열이 CSR 핵산 서열로 교체되는 실시 형태가 또한 고려됨이 이해되어야 한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 표면 상에 발현하는 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 caTCR + CSR 면역 세포는 a) i) caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열 및 ii) caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열을 포함하며, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있는, 제1 벡터; 및 b) CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 벡터를 포함하며, 제1 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬은 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열로부터 발현되어 caTCR을 형성하고, CSR 폴리펩티드 사슬은 CSR 핵산 서열로부터 발현되어 CSR을 형성하고, caTCR 및 CSR은 면역 세포의 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터는 제1 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결되고; 제1 caTCR 핵산 서열의 3' 말단을 제2 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 연결하는 핵산 링커가 존재하는데, 핵산 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열은 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사된다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터는 제2 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결되고; 제2 caTCR 핵산 서열의 3' 말단을 제1 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 연결하는 핵산 링커가 존재하는데, 핵산 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열은 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사된다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터 및/또는 제2 프로모터는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 면역 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 그의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 면역 세포의 숙주 게놈 내로 통합된 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다. 핵산 서열들 중 임의의 것이 교체되는 실시 형태, 예컨대 제1 또는 제2 caTCR 핵산 서열이 CSR 핵산 서열로 교체되는 실시 형태가 또한 고려됨이 이해되어야 한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 표면 상에 발현하는 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 caTCR + CSR 면역 세포는 a) caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열; b) caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열; 및 c) CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열은 단일 프로모터의 제어 하에 있고; 제1 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬은 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열로부터 발현되어 caTCR을 형성하고, CSR 폴리펩티드 사슬은 CSR 핵산 서열로부터 발현되어 CSR을 형성하고, caTCR 및 CSR은 면역 세포의 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 프로모터는 핵산 서열들 중 하나에 작동가능하게 연결되며, 이 핵산 서열은 핵산 링커들에 의해 나머지 다른 핵산 서열들에 연결되어, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열이 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사되도록 하며, 이때 핵산 링커들은 개별적으로, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프로모터는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 면역 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 그의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 면역 세포의 숙주 게놈 내로 통합된 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
키메라 항체/T 세포 수용체(caTCR) 작제물
일 태양에서, 본 명세서에 기재된 표적 항원-특이적 키메라 항체/T 세포 수용체(caTCR)는 표적 항원(예컨대, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 복합체)에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 천연 발생 TCR 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 적어도 하나의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. caTCR은 항원 특이성을 제공하는 항원-결합 모듈, 및 CD3 동원 및 신호전달을 가능하게 하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함한다. 항원-결합 모듈은 천연 발생 T 세포 수용체 항원-결합 모이어티가 아니다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 TCRM 내의 폴리펩티드 사슬의 아미노-말단에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다. TCRM은 하나 이상의 TCR, 예컨대 αβ 및/또는 γδ TCR의 막관통 도메인(TCR-TM)으로부터 유래된 막관통 모듈을 포함하며, 선택적으로 TCR의 연결 펩티드 또는 이의 단편 및/또는 하나 이상의 TCR 세포내 도메인 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 폴리펩티드 사슬은, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 연결 펩티드, 막관통 도메인, 및 선택적으로 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, TCRM은 1개 또는 2개의 천연 비발생 TCR 막관통 도메인을 포함한다. 천연 비발생 TCR 도메인은 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 그리고/또는 상응하는 도메인의 일부분을 다른 TCR로부터의 유사한 도메인의 일부분으로 대체함으로써 변형된 천연 발생 TCR의 상응하는 도메인일 수 있다. caTCR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있으며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 항원-결합 모듈 및 TCRM을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, caTCR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 하나 이상의 T 세포 공동자극성 신호전달 서열을 추가로 포함한다. 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은, 개별적으로, 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCRD 및/또는 제2 TCRD에 대해 카르복시-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR에는 T 세포 공동자극성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 항원-결합 모듈과 TCRM 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 모듈은 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인을 연결하는 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다.
본 명세서에 기재된 caTCR은 이 섹션에 기재된 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 caTCR의 각각의 성분(예를 들어, 항원-결합 모듈, TCRD, TCR-TM, 스페이서 모듈, 안정화 모듈, T 세포 공동자극 서열, 및 다양한 링커 등)에 대한 임의의 특징이 마치 각각 하나하나의 모든 조합이 개별적으로 기재된 것처럼 서로 조합되고, CSR의 임의의 특징과 조합되고, SSE의 임의의 특징과 조합될 수 있는 것으로 의도된다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈(예컨대, 항체 모이어티)은 a) 다른 분자에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함)인 친화도; 또는 b) 다른 분자에 대한 결합에 대한 그의 Kd의 약 1/10배 이하(예컨대, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 이하 또는 그 이하 중 어느 하나)의 Kd로 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사면역침전 검정(RIA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 Biacore 기기를 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정, 또는 예를 들어 Sapidyne 기기를 이용하는 속도론적 배제 검정(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
안정화 도메인의 예에는 하기가 포함된다: Fc 영역; 힌지 영역; CH3 도메인; CH4 도메인; CH1 또는 CL 도메인; 류신 지퍼 도메인(예를 들어, jun/fos 류신 지퍼 도메인, 예를 들어 문헌[Kostelney et al, J. Immunol, 148: 1547-1553, 1992] 참조; 또는 효모 GCN4 류신 지퍼 도메인); 아이소류신 지퍼 도메인; 이량체화 세포-표면 수용체(예를 들어, 인터류킨-8 수용체(IL-8R); 또는 인테그린 이종이량체, 예컨대 LFA-1 또는 GPIIIb/IIIa)의 이량체화 영역; 분비된 이량체화 리간드(예를 들어, 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 인터류킨-8(IL-8), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 또는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF); 예를 들어, 문헌[Arakawa et al, J. Biol. Chem. 269:27833-27839, 1994], 및 문헌[Radziejewski et al, Biochem. 32: 1350, 1993] 참조)의 이량체화 영역; 코일드 코일(coiled coil) 이량체화 도메인(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2014152878호; 문헌[Fletcher et al, ACS Synth. Biol. 1:240-250, 2012]; 및 문헌[Thomas et al., J. Am. Chem. Soc. 135(13):5161-5166, 2013] 참조); 및 적어도 하나의 시스테인 잔기(예를 들어, 약 1개, 2개, 또는 3개 내지 약 10개의 시스테인 잔기)를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드와 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 제2 폴리펩티드 사이에 이황화물 결합(들)이 형성될 수 있도록 한, 폴리펩티드.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 TCRM은 a) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 b) 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 T 세포 수용체(예컨대, αβ TCR 또는 γδ TCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래되고, 제2 TCR-TM은 T 세포 수용체의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. TCR-회합 신호전달 분자의 동원은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는, 예를 들어 TCR-CD3 복합체 표면 발현에 대한 FACS 분석 또는 caTCR과의 CD3 하위단위의 공동-면역침전이 있다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 TCRM의 제1 TCR-TM은 TCR α 사슬(예를 들어, 진뱅크(GenBank) 수탁 번호: CCI73895)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, TCRM의 제2 TCR-TM은 TCR β 사슬(예를 들어, 진뱅크 수탁 번호: CCI73893)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 TCR δ 사슬(예를 들어, 진뱅크 수탁 번호: AAQ57272)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 제2 TCR-TM은 TCR γ 사슬(예를 들어, 진뱅크 수탁 번호: AGE91788)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 TCRM의 제1 및 제2 TCR-TM은 각각 TCR α 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 1)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체 및 TCR β 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 2)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 각각 TCR δ 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 3)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체 및 TCR γ 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 4)의 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 각각 서열 번호 5 및 6의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 각각 서열 번호 7 및 8의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 막관통 도메인의 변이체는, 제한 없이, 참조 서열과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 막관통 도메인은 참조 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 막관통 도메인에 대해 아미노-말단에 있는 제1 연결 펩티드를 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 막관통 도메인에 대해 아미노-말단에 있는 제2 연결 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 연결 펩티드는 각각 TCR α 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 1)의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분 및 TCR β 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 2)의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 연결 펩티드는 각각 서열 번호 27 또는 28의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분 및 서열 번호 29 또는 30의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 연결 펩티드는 각각 TCR δ 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 3)의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분 및 TCR γ 사슬 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 4)의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 연결 펩티드는 각각 서열 번호 31 또는 32의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분 및 서열 번호 33 또는 34의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR-TM에 대해 카르복시-말단에 있는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR-TM에 대해 카르복시-말단에 있는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인은 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 TCR 세포내 도메인은 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCR 세포내 도메인은 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 중 어느 하나 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 천연 발생 TCR의 하나의 사슬의 단편 또는 이의 변이체이고/이거나, 제2 TCRD는 천연 발생 TCR의 다른 하나의 사슬의 단편 또는 이의 변이체이다. 일부 실시 형태에서, TCRD들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 제1 연결 펩티드 내의 잔기와 제2 연결 펩티드 내의 잔기 사이의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 각각의 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ를 동원하여 caTCR-CD3 복합체를 형성할 수 있다(즉, caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진시킨다).
고려되는 caTCR 작제물은, 예를 들어 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR, 세포 표면-제시된 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 caTCR, 및 세포 표면 항원 및 세포 표면-제시된 펩티드/MHC 복합체 둘 모두에 특이적으로 결합하는 caTCR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 탠덤 scFv, 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(dual-affinity retargeting, DART) 항체, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, 화학적으로 가교결합된 항체, 이종다량체성 항체, 또는 이종접합 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 직접 연결되지 않은 2개의 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 완전 인간, 인간 항체 프레임워크 영역을 갖는 반합성, 또는 인간화 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, VH 항체 도메인 및 VL 항체 도메인 CDR은 동일한 항체 모이어티로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, VH 항체 도메인 및 VL 항체 도메인 CDR 중 일부는 상이한 항체 모이어티로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, VH 항체 도메인 및/또는 VL 항체 도메인은 인간, 인간화, 키메라, 반합성, 또는 완전 합성 항체 도메인이다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 완전 인간 서열 및 하나 이상의 합성 영역을 포함하는 반합성인 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 완전 인간 VL 및 반합성 VH를 포함하는 반합성 항체 모이어티이며, 이때 반합성 VH는 완전 인간 FR1, HC-CDR1, FR2, HC-CDR2, FR3, 및 FR4 영역 및 합성 HC-CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 반합성 VH는 약 5 내지 약 25개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 서열을 갖는 완전 합성 HC-CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 반합성 VH 또는 합성 HC-CDR3은, 약 5 내지 약 25개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 서열을 가지며, 여기서 서열 내의 각각의 아미노산은 서로 독립적으로, 시스테인이 제거된 표준 인간 아미노산으로부터 무작위로 선택되는, 완전 합성 HC-CDR3 영역을 포함하는 반합성 라이브러리(예컨대, 반합성 인간 라이브러리)로부터 획득된다. 일부 실시 형태에서, 합성 HC-CDR3은 약 10 내지 약 19개(예컨대, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 중 어느 하나)의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 반합성 VL 및 반합성 VH를 포함하는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은, 고정된 인간 VH/VL 프레임워크 쌍을 포함하지만, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 6개의 모든 CDR에 대해서는 무작위화된 합성 서열을 포함하는 완전-합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 하나 이상의 항체 모이어티(예컨대, 단일클론 항체)로부터 유래된 특이적 CDR 서열, 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 그러한 서열의 소정의 변이체를 포함하는 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 변이체 서열 내의 아미노산 치환은 항원-결합 모듈이 표적 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 표적 항원 결합 친화도를 실질적으로 개선하거나 또는 어떤 다른 특성, 예컨대 표적 항원의 관련 변이체와의 교차-반응성 및/또는 특이성에 실질적으로 영향을 미치는 변경이 또한 고려된다.
일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 항체 모이어티로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 안정화 도메인 또는 이의 변이체, 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 안정화 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 안정화 모듈은 CH3 항체 도메인을 포함하는 제1 안정화 도메인 또는 이의 변이체, 및 CH3 항체 도메인을 포함하는 제2 안정화 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈 내에 함유된 항체 중쇄 불변 도메인(예를 들어, CH1 또는 CH3)은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgM, 또는 IgE 중쇄로부터 유래되며, 선택적으로 인간으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈 내에 함유된 항체 중쇄 불변 도메인(예를 들어, CH1 또는 CH3)은, 유래가 되는 서열과 대비하여 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실)을 포함하는 변이체이다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈 내에 함유된 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 카파 또는 람다 경쇄로부터 유래되며, 선택적으로 인간으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈 내에 함유된 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은, 유래가 되는 서열과 대비하여 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실)을 포함하는 변이체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 안정화 도메인은 그들의 서로에 대한 결합 친화도를 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 안정화 도메인은, 그들의 서로에 대한 결합 친화도를 증가시키고/시키거나 천연 비발생 이황화물 결합을 도입시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 노브-인투-홀(knob-into-hole) 변형을 포함한다(예를 들어, 문헌[Carter P. J Immunol Methods. 248:7-15, 2001] 참조). 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 노브-인투-홀 변형을 포함하는 항체 불변 도메인 영역(예를 들어, CH3 도메인)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은, 회합을 향상시키도록 정전기 스티어링(electrostatic steering)에 의해 변형된 항체 불변 도메인 영역(예를 들어, CH3 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2006106905호 및 문헌[Gunasekaran K, et al. J Biol Chem. 285:19637-46, 2010] 참조). 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다.
일부 실시 형태에서, caTCR은, 선택적으로 안정화 모듈을 포함하는, 본 명세서에 기재된 TCRM에 연결된 본 명세서에 기재된 항원-결합 모듈을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR은 TCRD들 중 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 연결된 항원-결합 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 TCRM과 항원-결합 모듈 사이에 안정화 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 모듈은 약 5 내지 약 70개(예컨대, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개(이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 하나 이상의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 보조 세포내 도메인은 제1 및/또는 제2 TCRD에 대해 카르복시-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 보조 세포내 도메인은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 보조 세포내 도메인은 개별적으로 TCR 공동자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR 공동자극성 도메인은 면역 공동자극성 분자(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR 공동자극성 도메인은 서열 번호 51 내지 56 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물, 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 항원은 질병에 걸린 세포에서 발현되는 질병-관련 항원이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합한다. 펩티드/MHC 복합체는, 예를 들어, 질병에 걸린 세포에서 발현되는 질병-관련 항원으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 표면-제시된 복합체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 질병-관련 항원은 질병에 걸린 세포의 표면 상에서는 통상 발현되지 않는다(예를 들어, 질병-관련 항원은 세포내 또는 분비 단백질이다). 일부 실시 형태에서, 질병은 암이고, 질병-관련 항원은 암 세포에서 발현되는 종양-관련 항원이다. 일부 실시 형태에서, 종양-관련 항원은 발암단백질(oncoprotein)이다. 일부 실시 형태에서, 발암단백질은 원발암유전자에서의 돌연변이의 결과이고, 발암단백질은 돌연변이를 포함하는 네오에피토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 세포 표면 종양-관련 항원(예를 들어, 네오에피토프를 포함하는 발암단백질)에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 암 세포의 표면 상에서는 통상 발현되지 않는 종양-관련 항원(예를 들어, 네오에피토프를 포함하는 발암단백질) (예를 들어, 세포내 또는 분비된 종양-관련 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 질병은 바이러스성 감염이고, 질병-관련 항원은 감염된 세포에서 발현되는 바이러스-관련 항원이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 세포 표면 바이러스-관련 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서는 통상 발현되지 않는 바이러스-관련 항원(예를 들어, 세포내 또는 분비된 바이러스-관련 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, caTCR 작제물은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM(예컨대, 약 0.1 pM, 1.0 pM, 10 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 또는 500 nM(이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 중 어느 하나)의 Kd로 표적 항원에 결합한다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 포함하며, 세포 표면 항원은 CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)이다. 완전 항원, 예를 들어 세포 표면 항원에 대한 특이적 결합은 때때로 "MHC-비제한 결합"으로 지칭된다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 포함하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된다. 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체에 대한 특이적 결합은 때때로 "MHC-제한 결합"으로 지칭된다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 질병-관련 항원(예컨대, 종양-관련 또는 바이러스-인코딩된(virally-encoded) 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 클래스 I 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 포함하며, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-B이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-C이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74, 또는 HLA-A80이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A02이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01 내지 555 중 어느 하나, 예컨대 HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22, 또는 HLA-A*02:24이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01이다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 질병-관련 항원(예컨대, 종양-관련 또는 바이러스-인코딩된 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 클래스 II 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 포함하며, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DP이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DQ이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DR이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈, 및 b) TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 및 제2 TCR-TM을 포함하는 TCRM을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 TCRM 내의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬의 아미노-말단에 연결된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, TCRM은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 항원-결합 모듈은 TCRM 폴리펩티드 사슬들 중 하나 또는 둘 모두의 아미노-말단에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 TCR-TM에 대해 아미노-말단에 있는 TCR의 적어도 하나의 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 TCR-TM에 대해 카르복시-말단에 있는 TCR의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함하는 적어도 하나의 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 TCR 사슬의 단편으로부터 유래된 TCRD를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRD들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 TCR-TM에 대해 카르복시-말단에 있는 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR에는 공동자극성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 VH 항체 도메인 및 VL 항체 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 인간, 인간화, 키메라, 반합성, 또는 완전 합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 안정화 도메인들을 연결하는 적어도 하나의 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 이종다량체, 예컨대 이종이량체이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR은 αβ TCR이고, 제1 및 제2 TCR-TM은 TCR α 및 β 하위단위 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, TCR은 γδ TCR이고, 제1 및 제2 TCR-TM은 TCR γ 및 δ 하위단위 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인은 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함하고/하거나, 제2 TCR 세포내 도메인은 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이고/이거나, 제2 TCRD는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 천연 발생 αβ TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 천연 발생 αβ TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인은 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함하고/하거나, 제2 TCR 세포내 도메인은 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이고/이거나, 제2 TCRD는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 천연 발생 αβ T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 천연 발생 γδ TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 천연 발생 γδ TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인은 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함하고/하거나, 제2 TCR 세포내 도메인은 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이고/이거나, 제2 TCRD는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 천연 발생 γδ T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열 중 어느 하나 내에 함유된 연결 펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나 내에 함유된 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 1 및 2 내에 함유된 막관통 도메인의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 caTCR 내에서 그것이 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나와 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열 중 어느 하나 내에 함유된 연결 펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나 내에 함유된 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 1 및 2 내에 함유된 막관통 도메인의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 서열 번호 3 또는 4 내에 함유된 막관통 도메인으로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 서열 번호 3 또는 4 내에 함유된 막관통 도메인으로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 3 또는 4 내에 함유된 막관통 도메인으로부터의 약 10개 이하(예컨대, 약 9, 8, 7, 6, 5개 이하, 또는 그 이하)의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래되고, 다른 하나의 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 키메라 서열은 그것이 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열과 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열 중 어느 하나 내에 함유된 연결 펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나 내에 함유된 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 1 및 2 내에 함유된 막관통 도메인의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열 중 어느 하나 내에 함유된 연결 펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나 내에 함유된 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 3 및 4 내에 함유된 막관통 도메인의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 caTCR 내에서 그것이 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나와 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열 중 어느 하나 내에 함유된 연결 펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나 내에 함유된 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 3 및 4 내에 함유된 막관통 도메인의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 서열 번호 1 또는 2 내에 함유된 막관통 도메인으로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 서열 번호 1 또는 2 내에 함유된 막관통 도메인으로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 또는 2 내에 함유된 막관통 도메인으로부터의 약 10개 이하(예컨대, 약 9, 8, 7, 6, 5개 이하, 또는 그 이하)의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 1 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래되고, 다른 하나의 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 2 내에 함유된 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 키메라 서열은 그것이 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열과 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열 중 어느 하나 내에 함유된 연결 펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나 내에 함유된 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 3 및 4 내에 함유된 막관통 도메인의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 5 및 6의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 caTCR 내에서 그것이 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나와 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 5 및 6의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 아미노산 서열 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 서열 번호 7 또는 8로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 서열 번호 7 또는 8로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 7 또는 8로부터의 약 10개 이하(예컨대, 약 9, 8, 7, 6, 5개 이하, 또는 그 이하)의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 7로부터 유래되고, 다른 하나의 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 8로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 키메라 서열은 그것이 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열과 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 5 및 6의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 caTCR 내에서 그것이 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나와 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 다른 하나의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - TCR-TM들 중 적어도 하나는 서열 번호 5 또는 6으로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 서열 번호 5 또는 6으로부터의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 5 또는 6으로부터의 약 10개 이하(예컨대, 약 9, 8, 7, 6, 5개 이하, 또는 그 이하)의 연속 아미노산의 일부분을 포함하는 키메라 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 5로부터 유래되고, 다른 하나의 TCR-TM 내의 키메라 서열은 서열 번호 6으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 키메라 서열은 그것이 제2 TCR-TM 내의 키메라 서열과 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드 및 제2 연결 펩티드 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인 및 제2 TCR 세포내 도메인 각각은 서로 독립적으로 서열 번호 35 또는 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예컨대, 이중특이성)이다.
상이한 태양들이 하기의 다양한 섹션에서 더 상세히 논의된다.
TCR-TM 변이체
일부 실시 형태에서, caTCR의 TCR-TM들은 T 세포 수용체로부터 유래되며, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된 T 세포 수용체로부터의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 (1차 서열로 또는 공간적으로) 근접해 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산으로부터 3개 이하(예컨대, 0, 1, 2 또는 3개)의 아미노산만큼 떨어져 있다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산으로부터 약 15 옹스트롬 이하(예컨대, 약 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, 또는 1 옹스트롬 이하 중 어느 하나)만큼 떨어져 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된 α, β, γ, 또는 δ TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, TCR 하위단위의 막관통 도메인은 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, TCR 하위단위의 막관통 도메인은 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1 내에 함유된 막관통 도메인(예를 들어, 서열 번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 α TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, α TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 1 내에 함유된 막관통 도메인에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, α TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 1 내에 함유된 막관통 도메인에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 α TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, α TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 5에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, α TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 5에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 2 내에 함유된 막관통 도메인(예를 들어, 서열 번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 β TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, β TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 2 내에 함유된 막관통 도메인에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, β TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 2 내에 함유된 막관통 도메인에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 β TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, β TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 6에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, β TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 6에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인(예를 들어, 서열 번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 δ TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, δ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, δ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인(예를 들어, 서열 번호 7)의 아미노산 서열이 서열 번호 7 내의 하기의 아미노산에 상응하는 아미노산에서의 하나 이상의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다: L4, M6, V12, N15, F245, 및 L25. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 7 내의 V12 및 N15에 상응하는 아미노산에서의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 7에서의 하기의 치환에 상응하는 하나 이상의 치환에 의해 변형된 것을 포함한다: L4C, M6V, V12F, N15S, F245S, 및 L25S. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 3 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 7에서의 V12F 및 N15S 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은 서열 번호 9 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 δ TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, δ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 7에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, δ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 7에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 7의 아미노산 서열이 서열 번호 7 내의 하기의 아미노산에 상응하는 아미노산에서의 하나 이상의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다: L4, M6, V12, N15, F245, 및 L25. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 7의 아미노산 서열이 서열 번호 7 내의 V12 및 N15에 상응하는 아미노산에서의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 7의 아미노산 서열이 서열 번호 7에서의 하기의 치환에 상응하는 하나 이상의 치환에 의해 변형된 것을 포함한다: L4C, M6V, V12F, N15S, F245S, 및 L25S. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 7의 아미노산 서열이 서열 번호 7에서의 V12F 및 N15S 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은 서열 번호 9 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인(예를 들어, 서열 번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 γ TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, γ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, γ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인(예를 들어, 서열 번호 8)의 아미노산 서열이 서열 번호 8 내의 하기의 아미노산에 상응하는 아미노산에서의 하나 이상의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다: Y1, Y2, M3, L5, L8, V12, V13, F15, A16, I18, C19, C20, 및 C21. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 8 내의 Y2, M3, A16, 및 I18에 상응하는 아미노산에서의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 8 내의 L8, V12, 및 F15에 상응하는 아미노산에서의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 하기의 치환에 상응하는 하나 이상의 치환에 의해 변형된 것을 포함한다: Y1Q, Y2L, Y2I, M3V, M3I, L5C, L8F, V12F, V13Y, F15S, A16V, A16I, I18V, I18L, C19M, C20M, 및 C21G. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 Y2L, M3V, A16V, 및 I18V 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 Y2I, M3I, A16I, 및 I18L 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 4 내에 함유된 막관통 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 L8F, V12F, 및 F15S 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은 서열 번호 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 T 세포 수용체로부터 유래된 천연 비발생 TCR-TM은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 γ TCR 하위단위의 막관통 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, γ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 8에서의 5개 이하의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, γ TCR 하위단위의 막관통 도메인은 서열 번호 8에서의 단일 아미노산 잔기의 치환에 의해 변형된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 상응하는 비치환된 잔기보다 더 소수성인 잔기로 치환된다. 일부 실시 형태에서, 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 각각의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 TCRM 내의 아미노산에 근접해 있다.
일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8 내의 하기의 아미노산에 상응하는 아미노산에서의 하나 이상의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다: Y1, Y2, M3, L5, L8, V12, V13, F15, A16, I18, C19, C20, 및 C21. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8 내의 Y2, M3, A16, 및 I18에 상응하는 아미노산에서의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8 내의 L8, V12, 및 F15에 상응하는 아미노산에서의 치환(예컨대, 더 소수성인 잔기에 의한 치환)에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 하기의 치환에 상응하는 하나 이상의 치환에 의해 변형된 것을 포함한다: Y1Q, Y2L, Y2I, M3V, M3I, L5C, L8F, V12F, V13Y, F15S, A16V, A16I, I18V, I18L, C19M, C20M, 및 C21G. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 Y2L, M3V, A16V, 및 I18V 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 Y2I, M3I, A16I, 및 I18L 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은, 서열 번호 8의 아미노산 서열이 서열 번호 8에서의 L8F, V12F, 및 F15S 치환에 상응하는 치환에 의해 변형된 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 천연 비발생 TCR-TM은 서열 번호 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7 및 9 내지 13의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 8 및 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및 제2 TCR-TM은 표 2에 열거된 임의의 caTCR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 서열 번호 33 또는 34의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCR 세포내 도메인은 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다.
[표 2]
항원-결합 모듈
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따르면, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티가 제1 항체 모이어티 사슬 및 제2 항체 모이어티 사슬을 포함하는 다량체인 경우, caTCR은 제1 또는 제2 항체 모이어티 사슬에 연결된 제1 TCRD 및 다른 하나의 항체 모이어티 사슬에 연결된 제2 TCRD를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따르면, 항원-결합 모듈은 CH1 및 CL 도메인을 포함하는 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 중쇄로부터 유래되며, 선택적으로 인간으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은, 유래가 되는 서열과 대비하여 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실)을 포함하는 변이체이다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37 내지 47 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CL 도메인은 카파 또는 람다 경쇄로부터 유래되며, 선택적으로 인간으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CL 도메인은, 유래가 되는 서열과 대비하여 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실)을 포함하는 변이체이다. 일부 실시 형태에서, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 및/또는 CL 도메인은 그들의 서로에 대한 결합 친화도를 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 및/또는 CL 도메인은, 그들의 서로에 대한 결합 친화도를 증가시키고/시키거나 천연 비발생 이황화물 결합을 도입시키는 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따르면, 항체 모이어티는 표적 항원에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD19에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2017066136A2호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD19에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD20에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD22에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 2018년 3월 30일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/650,955호 참조, 이 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD22에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/490,586호 참조, 이 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 ROR1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/187220호 및 WO2016/187216호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 ROR2에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/142768호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 BCMA에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090327호 및 WO2016/090320호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPRC5D에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090329호 및 WO2016/090312호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 FCRL5에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090337호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 WT-1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2012/135854호, WO2015/070078호, 및 WO2015/070061호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 AFP에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/161390호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 HPV16-E7에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/182957호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 NY-ESO-1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/210365호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PRAME에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/191246호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 EBV-LMP2A에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/201124호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 KRAS에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/154047호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PSA에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2017/015634호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 하나의 Fab 사슬, 및 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 다른 Fab 사슬을 포함하는 Fab이다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37 내지 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
caTCR 작제물
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 - 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 TCRM과 항체 모이어티 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7 및 9 내지 13의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 8 및 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 - 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및 제2 TCR-TM은 표 2에 열거된 임의의 caTCR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 서열 번호 33 또는 34의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCR 세포내 도메인은 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 및 제2 TCR-TM은 각각 서열 번호 7 및 8, 9 및 8, 7 및 14, 7 및 15, 7 및 16, 10 및 16, 7 및 17, 7 및 18, 7 및 19, 7 및 20, 7 및 21, 7 및 22, 11 및 23, 12 및 24, 7 및 25, 또는 13 및 26의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 - 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 - 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 서열 번호 33 또는 34의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCR 세포내 도메인은 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD에 연결된 제1 Fab 사슬을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD에 연결된 제2 Fab 사슬을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성하고, 제1 Fab 사슬과 제2 Fab 사슬은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab-유사 항원-결합 모듈을 형성한다. 일부 실시 형태에서, a) 제1 Fab 사슬은 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하고, 제2 Fab 사슬은 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하거나; 또는 b) 제1 Fab 사슬은 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하고, 제2 Fab 사슬은 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR은 a) 제1 TCRD에 연결된 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 Fab 사슬을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 b) 제2 TCRD에 연결된 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 Fab 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 a) 제1 TCRD에 연결된 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제1 Fab 사슬, 및 b) 제2 TCRD에 연결된 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제2 Fab 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRD들 중 하나 또는 둘 모두와 이들의 연결된 Fab 사슬 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합이 존재한다. 일부 실시 형태에서, CH1 및/또는 CL 도메인은 Fab 사슬들의 서로에 대한 결합 친화도를 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1과 CL 도메인은 교체되어, Fab 사슬들 중 하나는 VH 및 CL 항체 도메인을 포함하고 다른 하나의 Fab 사슬은 VL 및 CH1 항체 도메인을 포함하게 되도록 한다. 일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 안정화 도메인은 제1 TCRD와 그의 연결된 Fab 사슬 사이에 위치되고, 다른 하나의 안정화 도메인은 제2 TCRD와 그의 연결된 Fab 사슬 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 서열 번호 7 및 9 내지 13의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD에 연결된 제1 Fab 사슬을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 8 및 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD에 연결된 제2 Fab 사슬을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성하고, 제1 Fab 사슬과 제2 Fab 사슬은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab-유사 항원-결합 모듈을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및 제2 TCR-TM은 표 2에 열거된 임의의 caTCR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, a) 제1 Fab 사슬은 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하고, 제2 Fab 사슬은 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하거나; 또는 b) 제1 Fab 사슬은 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하고, 제2 Fab 사슬은 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37 내지 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 서열 번호 33 또는 34의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCR 세포내 도메인은 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD에 연결된 제1 Fab 사슬을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD에 연결된 제2 Fab 사슬을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬 - 제1 및 제2 TCR-TM은 각각 서열 번호 7 및 8, 9 및 8, 7 및 14, 7 및 15, 7 및 16, 10 및 16, 7 및 17, 7 및 18, 7 및 19, 7 및 20, 7 및 21, 7 및 22, 11 및 23, 12 및 24, 7 및 25, 또는 13 및 26의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성하고, 제1 Fab 사슬과 제2 Fab 사슬은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab-유사 항원-결합 모듈을 형성한다. 일부 실시 형태에서, a) 제1 Fab 사슬은 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하고, 제2 Fab 사슬은 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하거나; 또는 b) 제1 Fab 사슬은 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하고, 제2 Fab 사슬은 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37 내지 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인은 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고, CL 도메인은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 서열 번호 33 또는 34의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCR 세포내 도메인은 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 서열 번호 7 및 8의 서열을 갖는 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab' - Fab'은 VH, CH1, 및 부분 힌지 항체 도메인을 포함하는 제1 Fab' 사슬 및 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 Fab' 사슬을 포함하고, 제1 Fab' 사슬은 제1 또는 제2 TCRD에 연결되고, 제2 Fab' 사슬은 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRD들 중 하나 또는 둘 모두와 이들의 연결된 Fab' 사슬 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합이 존재한다. 일부 실시 형태에서, CH1 및/또는 CL 도메인은 Fab' 사슬들의 서로에 대한 결합 친화도를 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1과 CL 도메인은 교체되어, 제1 Fab' 사슬은 VH, CL, 및 부분 힌지 항체 도메인을 포함하고 제2 Fab' 사슬은 VL 및 CH1 도메인을 포함하게 되도록 한다. 일부 실시 형태에서, Fab'은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fab'은 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 안정화 도메인은 제1 TCRD와 그의 연결된 Fab' 사슬 사이에 위치되고, 다른 하나의 안정화 도메인은 제2 TCRD와 그의 연결된 Fab' 사슬 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 (Fab')2 - (Fab')2는 VH, CH1, 및 부분 힌지 항체 도메인을 포함하는 제1 및 제2 (Fab')2 사슬 및 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제3 및 제4 (Fab')2 사슬을 포함하고, 제1 (Fab')2 사슬은 제1 또는 제2 TCRD에 연결되고, 제2 (Fab')2 사슬은 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRD들 중 하나 또는 둘 모두와 이들의 연결된 (Fab')2 사슬 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일부 실시 형태에서, CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합이 존재한다. 일부 실시 형태에서, CH1 및/또는 CL 도메인은 (Fab')2 사슬들의 서로에 대한 결합 친화도를 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CH1과 CL 도메인은 교체되어, 제1 및 제2 (Fab')2 사슬은 VH, CL, 및 부분 힌지 항체 도메인을 포함하고 제3 및 제4 (Fab')2 사슬은 VL 및 CH1 도메인을 포함하게 되도록 한다. 일부 실시 형태에서, (Fab')2는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, (Fab')2는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 안정화 도메인은 제1 TCRD와 그의 연결된 (Fab')2 사슬 사이에 위치되고, 다른 하나의 안정화 도메인은 제2 TCRD와 그의 연결된 (Fab')2 사슬 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv - Fv는 VH 항체 도메인을 포함하는 제1 Fv 사슬 및 VL 항체 도메인을 포함하는 제2 Fv 사슬을 포함하고, 제1 Fv 사슬은 제1 또는 제2 TCRD에 연결되고, 제2 Fv 사슬은 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRD들 중 하나 또는 둘 모두와 이들의 연결된 Fv 사슬 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일부 실시 형태에서, Fv는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fv는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 안정화 도메인은 제1 TCRD와 그의 연결된 Fv 사슬 사이에 위치되고, 다른 하나의 안정화 도메인은 제2 TCRD와 그의 연결된 Fv 사슬 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 scFv - 제1 scFv는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하고, 제1 scFv는 제1 또는 제2 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 scFv에 연결된, 또는 제1 scFv에 연결되지 않은 TCRD에 연결된 제2 항원-결합 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원-결합 모듈은 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원-결합 모듈은 표적 항원 이외의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원-결합 모듈은 제2 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv와 그의 연결된 TCRD 사이에 그리고/또는 제2 항원-결합 모듈과 그의 연결된 scFv 또는 TCRD 사이에 펩티드 링커가 존재한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 안정화 도메인은 제1 scFv와 그의 연결된 TCRD 사이에 위치되고, 다른 하나의 안정화 도메인은 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 caTCR은 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 상기 caTCR은 a) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -; 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 scFv, 및 제2 scFv - 제1 및 제2 scFv는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하고, 제1 scFv는 제1 또는 제2 TCRD에 연결되고, 제2 scFv는 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 TCRD는 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 제1 scFv의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 표적 항원 이외의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 scFv는 개별적으로 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 scFv는 개별적으로 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 안정화 도메인은 제1 scFv와 그의 연결된 TCRD 사이에 위치되고, 다른 하나의 안정화 도메인은 제2 scFv와 그의 연결된 TCRD 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다.
다중특이성 caTCR
일부 실시 형태에서, caTCR은 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개, 또는 그 이상)의 상이한 표적 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 다중특이성 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개, 또는 그 이상)의 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은 동일한 표적 항원 상의 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개, 또는 그 이상)의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은 각각의 항원 또는 에피토프에 대한 항원-결합 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은 적어도 하나의 항원 또는 에피토프에 대한 2개 초과의 항원-결합 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은, 각각이 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4개, 또는 그 이상)의 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이성 항원-결합 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 caTCR은 삼중특이성이다.
다중특이성 분자는 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 분자이다(예를 들어, 이중특이성 항체는 2개의 항원 또는 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다). 2 초과의 결합가(valency) 및/또는 특이성을 갖는 다중특이성 caTCR이 또한 고려된다. 이중특이성 항체는, 예를 들어 문헌[Brinkmann U. and Kontermann R.E. (2017) MABS, 9(2), 182-212]에 기재되어 있다. 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다. 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]을 참조한다. 당업자는 당업계에 알려진 개별 다중특이성 분자들의 적절한 특징을 선택하여 다중특이성 caTCR을 형성할 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 실시 형태에서, caTCR(본 명세서에서 "다중특이성 caTCR"로도 지칭됨)은 a) 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 모듈; 및 b) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD(TCRD1) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD(TCRD2)를 포함하는 TCRM을 포함하며; TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인은 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함하고/하거나, 제2 TCR 세포내 도메인은 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이고/이거나, 제2 TCRD는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 모이어티, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 천연 발생 αβ T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및 제2 TCR-TM 둘 모두는 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개의 아미노산 치환(예를 들어, 단일 아미노산 치환)을 포함하고/하거나, 제2 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개의 아미노산 치환(예를 들어, 단일 아미노산 치환)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산은 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 치환된 아미노산은 CD3과의 결합에 관여하는 제1 또는 제2 TCRM-TM 내의 아미노산에 근접해 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 각각의) 치환된 아미노산은 그들의 상응하는 비치환된 아미노산보다 더 소수성이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 서열 번호 7 및 9 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 TCR-TM은 서열 번호 8 및 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
이중특이성 caTCR의 예시적인 구조가 도 13a 내지 도 13e에 나타나 있으며, 여기서는 표적 항원이 CD19 및 CD22이지만, 당업자는 다른 표적 항원 또는 에피토프를 표적화하는 이중특이성 caTCR이 동일한 구조 포맷을 사용하여 제조될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
예를 들어, 이중-가변 도메인(DVD) IgG로부터 유래된 DVD(문헌[DiGiammarino et al., mAbs 3(5): 487-494] 참조)가 caTCR에서 이중특이성 항원-결합 모듈로서 사용될 수 있다(도 13a). 외부 가변 도메인과 내부 가변 도메인의 융합을 위한 다양한 링커가 DVD-Ig를 위해 개발되고 최적화되어 왔으며, 이들은 DVD 모듈을 갖는 이중특이성 caTCR을 작제하는 데 유용할 수 있다. 그러나, DVD 모듈에서의 가변 도메인 적층 접근법은 내부 가변 도메인의 접힘 및 표적 결합 친화도에 영향을 줄 수 있다. 2개의 가변 도메인 사이의 링커 및 2개의 가변 도메인의 순서가 caTCR의 효능에 영향을 줄 수 있다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 a) 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab를 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 모듈; 및 b) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD(TCRD1) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD(TCRD2)를 포함하는 TCRM을 포함하며; TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 (i) N-말단에서 C-말단으로 VH1-L1-VH2-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VL1-L2-VL2-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; (ii) N-말단에서 C-말단으로 VH1-L1-VL2-CL-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VL1-L2-VH2-CH1-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; (iii) N-말단에서 C-말단으로 VL1-L1-VH2-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VH1-L2-VL2-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; 또는 (iv) N-말단에서 C-말단으로 VL1-L1-VL2-CL-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VH1-L2-VH2-CH1-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, VH1과 VL1은 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 형성하고, VH2와 VL2는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 형성하고, TCRD1과 TCRD2는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하는 TCRM을 형성하고, L1 및 L2는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, L1 및/또는 L2는 약 5 내지 약 50개(예를 들어, 약 5 내지 10개, 약 10 내지 15개, 또는 약 15 내지 30개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 동일한 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 이중특이성 caTCR이 도 13a에 나타나 있다.
크로스-오버 이중-가변 도메인(CODV) IgG로부터 유래된 CODV(문헌[Steinmetz, et al.; mAbs (2016), 8(5): 867-878] 참조)가 caTCR에서 이중특이성 항원-결합 모듈로서 사용될 수 있다(도 13b). CODV는 각각의 Fv에 대해 비교적 방해받지 않는 항원-결합 부위를 가능하게 한다. 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 융합을 위한 다양한 링커가 CODV-Ig를 위해 개발되고 최적화되어 왔으며, 이들은 CODV 모듈을 갖는 이중특이성 caTCR을 작제하는 데 유용할 수 있다. 그러나, CODV 모듈의 적절한 접힘이 어려울 수 있으며, CODV 모듈에 사용되는 긴 링커는 면역원성의 잠재적인 근원이 되어 단백질 분해적 절단에 취약할 수 있다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 a) 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fv 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fv를 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 모듈; 및 b) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD(TCRD1) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD(TCRD2)를 포함하는 TCRM을 포함하며; TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 CH1 및 CL을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 (i) N-말단에서 C-말단으로 VH1-L1-VH2-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VL2-L2-VL1-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; 또는 (ii) N-말단에서 C-말단으로 VL1-L1-VL2-CL-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VH2-L2- VH1-CH1-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, VH1과 VL1은 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 형성하고, VH2와 VL2는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 형성하고, TCRD1과 TCRD2는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하는 TCRM을 형성하고, L1 및 L2는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, L1 및/또는 L2는 약 5 내지 약 50개(예를 들어, 약 5 내지 20개, 약 15 내지 30개, 또는 약 30 내지 50개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 동일한 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 이중특이성 caTCR이 도 13b에 나타나 있다.
scFv-융합 단백질로부터 유래된 이중특이성 항원-결합 모듈, 예컨대 문헌[Chen et al., mAbs 8(4): 761-774]에 기재된 것들이 이중특이성 caTCR에 사용될 수 있다(도 13c). 유사한 융합 포맷을 갖는 이중특이성 항체의 발현은 이러한 포맷의 적절한 접힘 및 안정성을 입증하였다. 불변 도메인에 대한 scFv의 융합을 위한 다양한 링커가 이들 이중특이성 항체를 위해 개발되고 최적화되어 왔으며, 이들은 유사한 scFv 융합 도메인을 갖는 이중특이성 caTCR을 작제하는 데 유용할 수 있다. 그러나, scFv들 사이의 입체 장애가 표적 항원에 대한 scFv들의 결합을 손상시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 a) 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 scFv 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 모듈; 및 b) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD(TCRD1) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD(TCRD2)를 포함하는 TCRM을 포함하며; TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 CH1 및 CL을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 (i) N-말단에서 C-말단으로 scFv1-L1-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 scFv2-L2-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; 또는 (ii) N-말단에서 C-말단으로 scFv2-L1-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 scFv1-L2-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, scFv1은 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하고, scFv2는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하고, TCRD1과 TCRD2는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하는 TCRM을 형성하고, L1 및 L2는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, L1 및/또는 L2는 약 5 내지 약 50개(예를 들어, 약 5 내지 10개, 약 10 내지 15개, 또는 약 15 내지 30개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 동일한 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, L1과 L2는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 이중특이성 caTCR이 도 13c에 나타나 있다.
IgG-scFv 이중특이성 항체 또는 Fab-scFv-Fc 이중특이성 항체로부터 유래된 이중특이성 항원-결합 모듈이 이중특이성 caTCR에 사용될 수 있다. 하나의 포맷(도 13d)에서는, scFv가 Fab의 VH 또는 VL에 부착되는데, 이는 scFv의 더 큰 가요성 및 이에 따른 표적 항원에 대한 Fab의 더 큰 접근을 가능하게 한다. 그러나, scFv-Fab 모듈은 안정성 문제를 가질 수 있다. 제2 포맷(도 13e)에서는, Fab는 제1 TCRD에 융합되고 scFv는 제2 TCRD에 융합된다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 a) 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 scFv 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab를 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항원-결합 모듈; 및 b) 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD(TCRD1) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD(TCRD2)를 포함하는 TCRM을 포함하며; TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진한다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 (i) N-말단에서 C-말단으로 scFv-L1-VH-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VL-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬; 또는 (ii) N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 scFv-L2-VL-CL-TCRD2를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, scFv는 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하고, VH와 VL은 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 형성하고, TCRD1과 TCRD2는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하는 TCRM을 형성하고, L1 및 L2는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, L1 및/또는 L2는 약 5 내지 약 50개(예를 들어, 약 5 내지 10개, 약 10 내지 15개, 또는 약 15 내지 30개)의 아미노산 길이이다. 예시적인 이중특이성 caTCR이 도 13d에 나타나 있다.
일부 실시 형태에서, caTCR은 (i) N-말단에서 C-말단으로 VL-CL-L1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 scFv-L2-TCRD2를 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬; (ii) N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1-L1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, N-말단에서 C-말단으로 VL-CL을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 scFv-L2-TCRD2를 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬; (iii) N-말단에서 C-말단으로 scFv-L1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, N-말단에서 C-말단으로 VH- CH1을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VL-CL-L2-TCRD2를 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬; 또는 (iv) N-말단에서 C-말단으로 scFv-L1-TCRD1을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, N-말단에서 C-말단으로 VL-CL을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1-L2-TCRD2를 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, scFv는 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하고, VH와 VL은 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 형성하고, TCRD1과 TCRD2는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하는 TCRM을 형성하고, L1 및 L2는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, L1 및/또는 L2는 약 5 내지 약 50개(예를 들어, 약 5 내지 10개, 약 10 내지 15개, 또는 약 15 내지 30개)의 아미노산 길이이다. 예시적인 이중특이성 caTCR이 도 13e에 나타나 있다. scFv와 TCRD 사이의 펩티드 링커의 길이 및 Fab와 TCRD 사이의 펩티드 링커의 길이는, 이들이 표적 항원에 대한 scFv 및 Fab의 접근성에 영향을 줄 수 있기 때문에 최적화될 수 있다.
다중특이성 caTCR의 다중특이성 항원-결합 모듈은 표적 항원들 또는 에피토프들의 임의의 적합한 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 적어도 하나의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 세포 표면 항원은 CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 적어도 하나의 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 펩티드/MHC 복합체는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, KRAS, 히스톤 H3.3, 및 PSA(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 제1 세포 표면 항원 및 제2 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 CD19 및 CD22에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 CD19 및 CD20에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 제1 펩티드/MHC 복합체 및 제2 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 모듈은 세포 표면 항원 및 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합한다.
키메라 공동자극성 수용체(CSR) 작제물
본 명세서에 기재된 리간드-특이적 키메라 공동자극성 수용체(CSR)는 표적 리간드(예컨대, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 복합체)에 특이적으로 결합하고 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. CSR은 리간드-결합 특이성을 제공하는 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 면역 세포를 자극할 수 있게 하는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함한다. CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, CSR에는 어떠한 1차 면역 세포 신호전달 서열도 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 공동자극성 신호전달 모듈을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 공동자극성 신호전달 모듈을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, CSR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포에서의 CSR의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포에서의 CSR의 발현은 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다.
본 발명의 CSR에 사용하기 위한 공동자극성 면역 세포 신호전달 도메인의 예에는 T 세포 수용체(TCR)의 공동수용체의 세포질 서열 - 이것은 caTCR 결합 후에 신호 전달을 개시하도록 caTCR과 협력 작용할 수 있음 - 뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
일부 상황 하에서는, 단독으로의 TCR을 통해 발생된 신호가 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며, 그러한 2차 또는 공동자극성 신호가 또한 요구된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, T 세포 활성화는 다음 2개의 별개의 부류의 세포내 신호전달 서열에 의해 매개된다: TCR을 통한 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(본 명세서에서 "1차 T 세포 신호전달 서열"로 지칭됨) 및 2차 또는 공동자극성 신호를 제공하도록 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것들(본 명세서에서 "공동자극성 T 세포 신호전달 서열"로 지칭됨)이다.
자극성 방식으로 작용하는 1차 면역 세포 신호전달 서열은 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. ITAM-함유 1차 면역 세포 신호전달 서열의 예에는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다. "기능성" 1차 면역 세포 신호전달 서열은 적절한 수용체에 작동가능하게 결합될 때 면역 세포 활성화 신호를 전달할 수 있는 서열이다. 1차 면역 세포 신호전달 서열의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있는 "비기능성" 1차 면역 세포 신호전달 서열은 면역 세포 활성화 신호를 전달할 수 없다. 본 명세서에 기재된 CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 서열, 예컨대 ITAM을 포함하는 기능성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, CSR에는 어떠한 1차 면역 세포 신호전달 서열도 결여되어 있다.
공동자극성 면역 세포 신호전달 서열은 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD27, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 세포 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 표적 항원을 제시하는 세포의 표면 상에 제시된 분자이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR의 표적 항원은 암 세포 상에 제시된 암-관련 항원이고, 표적 리간드는 암 세포의 표면 상에서 발현되는 보편적 분자, 예컨대 인테그린이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA를 포함한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 면역 관문 분자이다. 일부 실시 형태에서, 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 아폽토시스 분자이다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 리간드-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하며, 세포 표면 항원은, 제한 없이, CD19, CD20, CD22, CD47, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA를 제한 없이 포함한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD19에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2017066136A2호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD19에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD20에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD22에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 2018년 3월 30일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/650,955호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD22에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/490,586호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 ROR1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/187220호 및 WO2016/187216호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 ROR2에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/142768호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 BCMA에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090327호 및 WO2016/090320호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPRC5D에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090329호 및 WO2016/090312호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 FCRL5에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090337호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 WT-1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2012/135854호, WO2015/070078호, 및 WO2015/070061호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 AFP에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/161390호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 HPV16-E7에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/182957호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 NY-ESO-1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/210365호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PRAME에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/191246호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 EBV-LMP2A에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/201124호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 KRAS에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/154047호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PSA에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2017/015634호 참조).
일부 실시 형태에서, 리간드-결합 모듈은 표적 리간드에 대한 수용체의 세포외 도메인의 전부 또는 일부분이다(또는 이로부터 유래된다). 일부 실시 형태에서, 수용체는, 예를 들어 FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, 및 TIM-3을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 막관통 모듈은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 하나 이상의 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 모듈은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CD8의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 OX40의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 OX40의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 86 또는 87의 아미노산 서열을 포함하는 CD27의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 분자는 서열 번호 88 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는 CD30의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 공동자극성 신호전달 모듈 중 임의의 것들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 모듈은 2개의 CSR 모듈을 연결하는 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 모듈은 약 5 내지 약 70개(예컨대, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개(이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 리간드-결합 모듈(예컨대, 항체 모이어티)은 a) 다른 분자에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함)인 친화도; 또는 b) 다른 분자에 대한 결합에 대한 그의 Kd의 약 1/10배 이하(예컨대, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 이하 또는 그 이하 중 어느 하나)의 Kd로 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사면역침전 검정(RIA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 Biacore 기기를 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정, 또는 예를 들어 Sapidyne 기기를 이용하는 속도론적 배제 검정(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 표적 리간드(예컨대, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 복합체)에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인(LBD); b) 막관통 도메인; 및 c) 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 CSR은 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 세포 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA를 포함한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 면역 관문 분자이다. 일부 실시 형태에서, 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 아폽토시스 분자이다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 표적 리간드에 대한 수용체의 세포외 도메인의 전부 또는 일부분이다(또는 이로부터 유래된다). 일부 실시 형태에서, 수용체는, 예를 들어 FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, 및 TIM-3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154를 포함한 막관통 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질의 단편(fTMP)을 포함하며, fTMP는 CSR 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 면역 세포 공동자극성 분자의 단편(fCSM)을 포함하며, fCSM은 CSR 막관통 도메인 및 CSR 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 신호전달 도메인 중 임의의 것들 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 도메인은 2개의 CSR 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 표적 리간드에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 막관통 도메인; 및 c) 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 표적 리간드는 세포 표면 항원이고, 상기 CSR은 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 면역 관문 분자이다. 일부 실시 형태에서, 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 아폽토시스 분자이다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 표적 리간드에 대한 수용체의 세포외 도메인의 전부 또는 일부분이다(또는 이로부터 유래된다). 일부 실시 형태에서, 수용체는, 예를 들어 FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, 및 TIM-3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154를 포함한 막관통 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질의 단편(fTMP)을 포함하며, fTMP는 CSR 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 면역 세포 공동자극성 분자의 단편(fCSM)을 포함하며, fCSM은 CSR 막관통 도메인 및 CSR 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 신호전달 도메인 중 임의의 것들 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 도메인은 2개의 CSR 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 표적 리간드에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 막관통 도메인; 및 c) 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 표적 리간드는 펩티드/MHC 복합체이고, 상기 CSR은 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA를 포함한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154를 포함한 막관통 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질의 단편(fTMP)을 포함하며, fTMP는 CSR 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 면역 세포 공동자극성 분자의 단편(fCSM)을 포함하며, fCSM은 CSR 막관통 도메인 및 CSR 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 신호전달 도메인 중 임의의 것들 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 도메인은 2개의 CSR 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 표적 리간드(예컨대, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 복합체)에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 막관통 도메인; 및 c) 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 리간드-결합 도메인은 항체 모이어티이고, CSR은 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 세포 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA를 포함한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 면역 관문 분자이다. 일부 실시 형태에서, 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 아폽토시스 분자이다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154를 포함한 막관통 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질의 단편(fTMP)을 포함하며, fTMP는 CSR 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 면역 세포 공동자극성 분자의 단편(fCSM)을 포함하며, fCSM은 CSR 막관통 도메인 및 CSR 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 신호전달 도메인 중 임의의 것들 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 도메인은 2개의 CSR 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 도메인은 표 3에 열거된 임의의 CSR에 따라 선택된다.
[표 3]
일부 실시 형태에서, CSR은 CD28의 fCSM을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인; 및 c) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; 및 b) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 표적 리간드-결합 도메인 및 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 CSR 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CSR은 4-1BB의 fCSM을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인; 및 c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; 및 b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 표적 리간드-결합 도메인 및 서열 번호 91 또는 92의 아미노산 서열을 포함하는 CSR 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CSR은 CD27의 fCSM을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인; 및 c) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 CD27의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; 및 b) 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 CD27의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 표적 리간드-결합 도메인 및 서열 번호 93 또는 94의 아미노산 서열을 포함하는 CSR 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CSR은 CD30의 fCSM을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인; 및 c) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 CD30의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; 및 b) 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 CD30의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 표적 리간드-결합 도메인 및 서열 번호 95 또는 96의 아미노산 서열을 포함하는 CSR 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CSR은 OX40의 fCSM을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인; 및 c) 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 OX40의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; 및 b) 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 OX40의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 표적 리간드-결합 도메인 및 서열 번호 97 또는 98의 아미노산 서열을 포함하는 CSR 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 표적 리간드(예컨대, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 복합체)에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 표적 리간드-결합 도메인; b) 막관통 도메인; 및 c) 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 리간드-결합 도메인은 표적 리간드에 대한 수용체의 세포외 도메인의 전부 또는 일부분이고(또는 이로부터 유래되고), 상기 CSR은 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 세포 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 동일한 면역 세포에서 발현되는 caTCR의 표적 항원과 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 면역 관문 분자이다. 일부 실시 형태에서, 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 아폽토시스 분자이다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드 수용체는, 예를 들어 FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, 및 TIM-3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 도메인은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 신호전달 도메인 중 임의의 것들 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 도메인은 2개의 CSR 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CD28의 단편은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 103을 포함하는 펩티드 링커, 및 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD20에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CD28의 단편은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 103을 포함하는 펩티드 링커, 및 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 GPC3에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CD28의 단편은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 103을 포함하는 펩티드 링커, 및 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD20에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CD28의 단편은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 103을 포함하는 펩티드 링커, 및 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 53 또는 54의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 4-1BB의 단편은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, 및 4-1BB의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD8의 단편; 및 c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 4-1BB의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, CD8의 단편, 및 4-1BB의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD8의 단편; 및 c) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 OX40의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, CD8의 단편, 및 OX40의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 OX40의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, OX40의 단편은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, 및 OX40의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD8의 단편; 및 c) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD27의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, CD8의 단편, 및 CD27의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 86 또는 87의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD27의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD27의 단편은 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, 및 CD27의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; b) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD8의 단편; 및 c) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD30의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, CD8의 단편, 및 CD30의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CSR은 CD19에 특이적으로 결합하며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 88 또는 89의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD30의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 VL 도메인, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커, 및 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD30의 단편은 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 서열 번호 104를 포함하는 펩티드 링커, 및 CD30의 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포에서의 CSR의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 유도성 프로모터를 포함한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포에서의 CSR의 발현은 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 그러한 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 caTCR을 통한 신호전달에 반응성인 프로모터 또는 조절성 요소에 작동가능하게 연결된 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR을 인코딩하는 핵산 서열은 활성화된 T-세포의 핵-인자(NFAT)-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다(예를 들어, 문헌[Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)]; 문헌[Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7]; 문헌[Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706]; 및 문헌[Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759] 참조). 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 서열 번호 85의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR을 인코딩하는 핵산 서열은 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
분비형 2차 이펙터(SSE) 작제물
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, T 세포)는 분비형 2차 이펙터(SSE)를 분비할 수 있다. 그러한 면역 세포는 또한 본 명세서에서 "caTCR + CSR + SSE 면역 세포"로 지칭된다. SSE는 caTCR + CSR + SSE 면역 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 향상시키는데, 이때 SSE는 caTCR + CSR + SSE 면역 세포에서 기능적으로 발현되고 그로부터 분비된다. 일부 실시 형태에서, SSE는 다른 면역 세포(예컨대, 방관자(bystander) T 세포 또는 NK 세포)를 표적 질병 세포(예컨대, 표적 암 세포)로 방향전환시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, SSE는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포) 및 질병 세포(예컨대, 암 세포)를 표적화하는 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체)이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 면역억제 환경, 예컨대 면역억제 종양 환경으로부터 caTCR + CSR + SSE 면역 세포를 보호한다. 일부 실시 형태에서, SSE는 caTCR + CSR + SSE 면역 세포 상에서의 자극성 수용체의 자가분비 활성화를 제공한다. 일부 실시 형태에서, SSE는 외인성 성장 인자 또는 자극성 사이토카인이다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR + SSE 면역 세포에서의 SSE의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR + SSE 면역 세포에서의 SSE의 발현은 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다.
일부 실시 형태에서, SSE는 T 세포 및 질병 세포를 표적화하는 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체)이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 T 세포의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, T 세포 표면 항원은 CD3이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 질병-관련 항원(예컨대, 암-관련 항원)에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 질병-관련 항원은 질병 세포(예를 들어, 암 세포)의 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 질병-관련 항원은 글리피칸-3(GPC3), CD47, 뮤신-16(MUC16), CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16, 또는 FoxP3(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 탠덤 scFv, 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 및 이중 가변 도메인(DVD) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중특이성 항체이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 이중특이성 항체이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 T 세포 표면 항원을 표적화하는 제1 scFv 및 질병-관련 항원을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 CD3을 표적화하는 제1 scFv 및 질병-관련 항원을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 질병-관련 항원은 GPC3, CD47, MUC16, CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16, 또는 FoxP3(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 CD3을 표적화하는 제1 scFv 및 GPC3을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, VH 도메인은 VL 도메인에 대해 아미노-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, VL 도메인은 VH 도메인에 대해 아미노-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv는 제2 scFv에 대해 아미노-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 제1 scFv에 대해 아미노-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, SSE는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, SSE는 CD3을 표적화하는 제1 scFv 및 CD47을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 CD3을 표적화하는 제1 scFv 및 MUC16을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 NK 세포 및 질병-관련 항원(예컨대, 암-관련 항원)을 표적화하는 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체)이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 NK 세포의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, NK 세포 표면 항원은 CD16a이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 질병-관련 항원(예컨대, 암-관련 항원)에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 질병-관련 항원은 질병 세포(예를 들어, 암 세포)의 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 질병-관련 항원은 GPC3, CD47, MUC16, CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16, 또는 FoxP3(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 탠덤 scFv, 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 및 이중 가변 도메인(DVD) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중특이성 항체이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 이중특이성 항체이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 NK 세포 표면 항원을 표적화하는 제1 scFv 및 질병-관련 항원을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 CD16a를 표적화하는 제1 scFv 및 질병-관련 항원을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 질병-관련 항원은 GPC3, CD47, MUC16, CD19, CD20, CD22, EpCAM, EGFR, HER2, CEA, PSMA, AFP, PSA, BCMA, FCRL5, NY-ESO, HPV16, 또는 FoxP3(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 CD16a를 표적화하는 제1 scFv 및 GPC3을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 CD16a를 표적화하는 제1 scFv 및 CD47을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 CD16a를 표적화하는 제1 scFv 및 MUC16을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 SSE는 질병-관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하며, 항체 모이어티는 질병-관련 항원에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD19에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2017066136A2호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD19에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD20에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD22에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 2018년 3월 30일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/650,955호 참조, 이 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 CD22에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/490,586호 참조, 이 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 ROR1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/187220호 및 WO2016/187216호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 ROR2에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/142768호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 BCMA에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090327호 및 WO2016/090320호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPRC5D에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090329호 및 WO2016/090312호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 FCRL5에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/090337호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 WT-1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2012/135854호, WO2015/070078호, 및 WO2015/070061호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 AFP에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/161390호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 HPV16-E7에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/182957호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 NY-ESO-1에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/210365호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PRAME에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/191246호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 EBV-LMP2A에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/201124호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 KRAS에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/154047호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PSA에 특이적인 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2017/015634호 참조). 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 a) T 세포의 표면 항원(예를 들어 CD3) 또는 NK 세포의 표면 항원(예컨대 CD16a)에 특이적으로 결합하는 제1 scFv 및 b) 항체 모이어티 - 항체 모이어티는 제2 scFv임 - 를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 펩티드 링커에 의해 연결된 제1 scFv와 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv는 제2 scFv에 대해 아미노-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 제1 scFv에 대해 아미노-말단에 있다.
일부 실시 형태에서, SSE는 하나 이상의 가용성 면역억제 인자를 표적화하는 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체)이다. 그러한 SSE는 가용성 면역억제 인자를 그들의 표적으로부터 격리시켜 그들의 면역억제 효과를 감소시키는 포획제(trap)로서 작용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, SSE는 하나 이상의 가용성 면역억제 인자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역억제 인자는 면역억제성 사이토카인이다. 일부 실시 형태에서, 면역억제성 사이토카인은 TGF-β 패밀리 구성원(예컨대, TGF-β 1 내지 4), IL-4, 및 IL-10(이들의 변이체 또는 돌연변이체를 포함함)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, SSE는 탠덤 scFv, 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 및 이중 가변 도메인(DVD) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중특이성 항체이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 이중특이성 항체이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, SSE는 제1 면역억제성 사이토카인(예컨대, TGFβ)을 표적화하는 제1 scFv 및 제2 면역억제성 사이토카인(예컨대, IL-4)을 표적화하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 면역 관문 분자를 표적화하는 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 억제성 면역 관문 분자의 길항제이다. 일부 실시 형태에서, 억제성 면역 관문 분자는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, HVEM, BTLA, KIR, LAG-3, TIM-3, 및 A2aR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, SSE는 자극성 면역 관문 분자의 효능제이다. 일부 실시 형태에서, 자극성 면역 관문 분자는 CD28, ICOS, 4-1BB, OX40, CD27, 및 CD40으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 PD-1을 표적화하는 길항적 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 PD-1에 특이적인 길항적 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2016/210129호 참조). 일부 실시 형태에서, 길항적 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 길항적 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 CD47을 표적화하는 길항적 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 길항적 항체 모이어티는 CD47에 특이적인 길항적 항체 모이어티의 CDR 또는 가변 도메인(VH 및/또는 VL 도메인)(예를 들어, 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는 이들 내에 함유된 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 길항적 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 길항적 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시 형태에서, SSE는 a) 다른 분자에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000배 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함)인 친화도; 또는 b) 다른 분자에 대한 결합에 대한 그의 Kd의 약 1/10배 이하(예컨대, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000배 이하 또는 그 이하 중 어느 하나)의 Kd로 표적 항원에 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사면역침전 검정(RIA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 Biacore 기기를 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정, 또는 예를 들어 Sapidyne 기기를 이용하는 속도론적 배제 검정(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, SSE는 면역억제성 수용체의 리간드에 특이적으로 결합하는 가용성 분자이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 면역억제성 수용체의 세포외 도메인으로부터 유래된 리간드-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 수용체의 세포외 도메인의 일부분이다. 일부 실시 형태에서, 면역억제성 수용체는 FasR, TNFR1, TNFR2, SIRPα, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, CD40, 및 TIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, SSE는 면역억제성 수용체에 특이적으로 결합하고 그것에 길항하는 가용성 분자이다. 일부 실시 형태에서, SSE는 면역억제성 수용체에 대한 리간드의 세포외 도메인으로부터 유래된 수용체-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 수용체-결합 도메인은 리간드의 세포외 도메인의 일부분이다. 일부 실시 형태에서, 리간드는 FasL, PD-L1, PD-L2, CD47, CD80, CD86, ICOSL, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40L, 및 GAL9로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, SSE는 외인성 자극성 사이토카인이다. 본 명세서에 기재된 외인성 사이토카인은 외인성 유전자로부터 발현되는 사이토카인이다. 일부 실시 형태에서, 외인성 자극성 사이토카인은 IL-12 패밀리 구성원이다. 일부 실시 형태에서, IL-12 패밀리 구성원은 IL-12, IL-23, IL-27, 또는 IL-35이다. 일부 실시 형태에서, 외인성 자극성 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-18, 또는 IL-21이다. 일부 실시 형태에서, 외인성 자극성 사이토카인은 caTCR + CSR + SSE 면역 세포 상에서의 사이토카인에 대한 수용체의 자가분비 활성화를 제공할 수 있다.
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR + SSE 면역 세포에서의 SSE의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR + SSE 면역 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 유도성 프로모터를 포함한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 SSE를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR + SSE 면역 세포에서의 SSE의 발현은 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 그러한 실시 형태에서, caTCR + CSR + SSE 면역 세포는 caTCR을 통한 신호전달에 반응성인 프로모터 또는 조절성 요소에 작동가능하게 연결된 SSE를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, SSE를 인코딩하는 핵산 서열은 활성화된 T-세포의 핵-인자(NFAT)-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다(예를 들어, 문헌[Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)]; 문헌[Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7]; 문헌[Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706]; 및 문헌[Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759] 참조). 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 서열 번호 85의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, SSE를 인코딩하는 핵산 서열은 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
핵산
본 명세서에 기재된 caTCR, CSR 및/또는 SSE를 인코딩하는 핵산 분자가 또한 고려된다. 일부 실시 형태에서, 임의의 caTCR, CSR 및 SSE에 따르면, caTCR, CSR 및/또는 SSE를 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입되는 벡터를 제공한다.
간략하게 요약하면, 본 명세서에 기재된 caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE를 인코딩하는 핵산에 의한 caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE의 발현은, 핵산이, 예를 들어 프로모터(예를 들어, 림프구-특이적 프로모터) 및 3' 비번역 영역(UTR)을 포함한 5' 및 3' 조절성 요소에 작동가능하게 연결되도록, 핵산을 적절한 발현 벡터 내로 삽입함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 진핵생물 숙주 세포에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 및 발현 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 포함한다.
본 발명의 핵산은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참조하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드(cosmid)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 대상이 되는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열화 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)])에, 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 01/96584호; 국제 특허 출원 공개 WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호 참조).
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고, 당업계에 알려진 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스가 단리되고, 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터가 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구인데, 그 이유는, 이들은 도입유전자의 장기간의 안정한 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는, 이들이 비증식성 세포, 예컨대 간세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서, 발암-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가된 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성이라는 추가된 이점을 갖는다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 상류에 30 내지 110 bp의 영역 내에 위치되지만, 다수의 프로모터가 마찬가지로 출발 부위의 하류에 기능성 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소간의 간격은 빈번하게 가요성이어서, 요소들이 서로에 대해 역전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서는, 활성의 감소가 시작되기 전에 프로모터 요소간의 간격이 증가되어 50 bp로 떨어질 수 있다.
적합한 프로모터의 한 예는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 강력한 구성적 프로모터 서열로서, 이것에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 적합한 프로모터의 다른 예는 연장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있으며, 이에는 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대 제한 없이, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은, 발현이 요구될 때에는 그것에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 또는 발현이 요구되지 않을 때에는 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 진핵 세포에서 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 호르몬-조절 요소(예를 들어, 문헌[Mader, S. and White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607] 참조), 합성 리간드-조절 요소(예를 들어, 문헌[Spencer, D. M. et al 1993) Science 262: 1019-1024] 참조), 및 이온화 방사선-조절 요소(예를 들어, 문헌[Manome, Y. et al. (1993) Biochemistry 32: 10607-10613]; 문헌[Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153] 참조)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 시험관내 또는 생체내 포유류 시스템에서 사용하기 위한 추가의 예시적인 유도성 프로모터 시스템이 문헌[Gingrich et al. (1998) Annual Rev. Neurosci 21:377-405]에 검토되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 Tet 시스템이다. 그러한 시스템은 문헌[Gossen et al. (1993)]에 의해 기재된 Tet 시스템에 기초한다. 예시적인 실시 형태에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 Tet 작동자(TetO) 부위를 포함하는 프로모터의 제어 하에 있다. 불활성 상태에서는, Tet 억제인자(TetR)가 TetO 부위에 결합하고 프로모터로부터의 전사를 억제할 것이다. 활성 상태에서, 예를 들어 유도제, 예컨대 테트라사이클린(Tc), 안하이드로테트라사이클린, 독시사이클린(Dox), 또는 이들의 활성 유사체의 존재 하에서, 유도제는 TetO로부터의 TetR의 방출을 야기하여, 전사가 일어날 수 있게 한다. 독시사이클린은 1-다이메틸아미노-2,4a,5,7,12-펜타하이드록시-11-메틸-4,6-다이옥소-1,4a,11,11a,12,12a-헥사하이드로테트라센-3-카르복스아미드의 화학명을 갖는 테트라사이클린 패밀리의 항생제의 구성원이다.
일 실시 형태에서, TetR은 포유류 세포, 예를 들어 뮤린 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 대부분의 아미노산은 유전자 코드의 축퇴로 인해 하나 초과의 코돈에 의해 인코딩되어, 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열의 어떠한 변경 없이도 주어진 핵산의 뉴클레오티드 서열의 실질적인 변이를 가능하게 한다. 그러나, 많은 유기체는 코돈 사용빈도(codon usage)에 있어서 차이를 나타내는데, 이는 또한 "코돈 편향(codon bias)"(즉, 주어진 아미노산을 위한 특정 코돈(들)의 사용에 대한 편향)으로 알려져 있다. 코돈 편향은 종종 특정 코돈에 대한 tRNA의 우세한 종의 존재와 상관되며, 이는 다시 mRNA 번역의 효율을 증가시킨다. 따라서, 특정 유기체(예를 들어, 원핵생물)로부터 유래된 코딩 서열은 코돈 최적화를 통해 상이한 유기체(예를 들어, 진핵생물)에서 개선된 발현을 위해 조정될 수 있다.
Tet 시스템의 다른 구체적인 변형은 하기의 "Tet-Off" 및 "Tet-On" 시스템을 포함한다. Tet-Off 시스템에서는, 전사가 Tc 또는 Dox의 존재 하에서 불활성이다. 그러한 시스템에서는, 테트라사이클린-제어된 전사활성화 단백질(tTA) - 이는 단순 헤르페스 바이러스로부터의 VP16의 강력한 전사활성화 도메인에 융합된 TetR로 구성됨 - 이 테트라사이클린-반응성 프로모터 요소(TRE)의 전사 제어 하에 있는 표적 핵산의 발현을 조절한다. TRE는 프로모터(통상, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 전초기 프로모터로부터 유래된 최소 프로모터 서열)에 융합된 TetO 서열 연쇄체로 구성된다. Tc 또는 Dox의 부재 하에서, tTA는 TRE에 결합하고 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. Tc 또는 Dox의 존재 하에서, tTA는 TRE에 결합할 수 없고, 표적 유전자로부터의 발현은 불활성으로 유지된다.
역으로, Tet-On 시스템에서는, 전사가 Tc 또는 Dox의 존재 하에서 활성이다. Tet-On 시스템은 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화인자, rtTA에 기초한다. tTA와 마찬가지로, rtTA는 TetR 억제인자 및 VP16 전사활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 그러나, TetR DNA 결합 모이어티에서의 4개의 아미노산 변화는 rtTA의 결합 특성을 변경시켜, 그것이 단지 Dox의 존재 하에서만 표적 도입유전자의 TRE 내의 TetO 서열을 인식할 수 있도록 한다. 따라서, Tet-On 시스템에서는, TRE-조절된 표적 유전자의 전사가 Dox의 존재 하에서만 rtTA에 의해 자극된다.
다른 유도성 프로모터 시스템은 E. 콜라이(E. coli)로부터의 lac 억제인자 시스템이다(문헌[Brown et al., Cell 49:603-612 (1987)] 참조). lac 억제인자 시스템은 lac 작동자(lacO)를 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절함으로써 기능한다. lac 억제인자(lacR)는 LacO에 결합하고, 이에 따라 관심 폴리뉴클레오티드의 전사를 방지한다. 관심 폴리뉴클레오티드의 발현은 적합한 유도제, 예를 들어 아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 유도된다.
본 발명에 사용하기 위한 다른 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 활성화된 T-세포의 핵-인자(NFAT) 시스템이다. 전사 인자의 NFAT 패밀리는 T 세포 활성화의 중요한 조절인자이다. NFAT 반응 요소는, 예를 들어 IL-2 프로모터에서 발견된다(예를 들어, 문헌[Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)]; 문헌[Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7]; 문헌[Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706]; 및 문헌[Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759] 참조). 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 유도성 프로모터는 하나 이상의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상의) NFAT 반응 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 6개의 NFAT 반응 요소를 포함하며, 이때 NFAT 반응 요소는, 예를 들어 서열 번호 83의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 유도성 프로모터는 최소 프로모터, 예컨대 최소 TA 프로모터에 연결된 하나 이상의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 이상의) NFAT 반응 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 최소 TA 프로모터는 서열 번호 84의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 서열 번호 85의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
폴리펩티드 또는 이의 일부분의 발현을 평가하기 위하여, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 태양에서, 선택가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에서 운반되어 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두에는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기에 적절한 조절성 서열이 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는, 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예를 들어 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하는 데 그리고 조절성 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고 어떠한 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제, 분비 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 최고 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 확인된다. 그러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어, 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR, CSR 및 SSE에 따른 caTCR 및/또는 CSR을 인코딩하는 핵산이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 caTCR의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 CSR의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 caTCR 및 CSR의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 핵산 서열 각각은 별개의 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 적어도 일부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 전부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 벡터는, 예를 들어, 포유류 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체이고, CSR은 단일 CSR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체이며, 핵산은 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 제2 caTCR 사슬을 인코딩하는 제2 핵산, 및 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제2 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유되고, 제3 핵산 서열은 제3 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제3 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제3 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제2 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제2 및 제3 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제1 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열은 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있고, 제2 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있고, 제3 핵산 서열은 제3 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 프로모터 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 프로모터 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 멀티시스트론(multicistronic) 벡터에서 단일 프로모터의 제어 하에서 단일 전사체로서 발현된다. 예를 들어, 문헌[Kim, JH, et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 하나 이상은 유도성이다. 일부 실시 형태에서, CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제3 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 면역 세포 활성화에 반응하는 하나 이상의 요소, 예컨대 NFAT 반응 요소를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 숙주 세포(예컨대 T 세포)에서 유사한(예컨대, 실질적으로 또는 대략 동일한) 발현 수준을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열 중 일부는 숙주 세포(예컨대, T 세포)에서의 발현 수준이 적어도 약 2배(예컨대, 적어도 약 2, 3, 4, 5배 또는 그 이상 중 어느 하나)만큼 상이하다. 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 결정될 수 있다. mRNA 발현 수준은 노던 블롯팅, 정량적 RT-PCR, 마이크로어레이 분석 등을 포함한 다양한 잘 알려진 방법을 사용하여 핵산으로부터 전사된 mRNA의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 단백질 발현의 수준은 면역 세포화학적 염색, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯 분석, 발광 검정, 질량 분석, 고성능 액체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 등을 포함한 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시 형태의 특징들은 조정되고 조합되어 임의의 수의 핵산 서열을 포함하는 실시 형태들, 예를 들어 caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE를 인코딩하는 핵산이 5개 이상의 핵산 서열을 포함하는 경우(예를 들어, caTCR 및 SSE 각각이 2개 이상의 별개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우)를 포괄할 수 있음이 이해되어야 한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 핵산이 제공되며, 상기 핵산은 a) 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체 caTCR - 핵산은 i) 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열, 및 ii) 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열을 포함함 -; 및 b) 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 단일 CSR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체 CSR - 핵산은 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 추가로 포함함 - 을 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열은 제1 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유되고, 제2 caTCR 핵산 서열은 제2 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유되고, CSR 핵산 서열은 제3 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열 및 CSR 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 동일한 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열 및 CSR 핵산 서열 각각은 개별적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, CSR 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 면역 세포 활성화에 반응하는 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 핵산 서열은 NFAT-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 일부 또는 전부는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
일부 실시 형태에서, a) 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) - 제1 벡터는 i) 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터, 및 ii) 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함함 -; 및 b) 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체 CSR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) - 제2 벡터는 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제3 프로모터를 포함함 - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 벡터는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
일부 실시 형태에서, a) 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) - 제1 벡터는 i) 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열; 및 ii) 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열을 포함하며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있음 -; 및 b) 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체 CSR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터) - 제2 벡터는 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제3 프로모터를 포함함 - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터는 제1 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결되고; 제1 caTCR 핵산 서열의 3' 말단을 제2 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 연결하는 핵산 링커가 존재하는데, 핵산 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사된다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터는 제2 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결되고; 제2 caTCR 핵산 서열의 3' 말단을 제1 caTCR 핵산 서열의 5' 말단에 연결하는 핵산 링커가 존재하는데, 핵산 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 벡터는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다. 핵산 서열들 중 임의의 것이 교체되는 실시 형태, 예컨대 제1 또는 제2 caTCR 핵산 서열이 CSR 핵산 서열로 교체되는 실시 형태가 또한 고려됨이 이해되어야 한다.
일부 실시 형태에서, 벡터(예컨대, 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터)가 제공되며, 상기 벡터는 a) 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체 caTCR을 인코딩하는 핵산 - 핵산은 i) 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열, 및 ii) 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열을 포함함 -; 및 b) 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체 CSR을 인코딩하는 핵산 - 핵산은 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 포함함 - 을 포함하며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있고, CSR 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터는 caTCR 핵산 서열들 중 하나에 작동가능하게 연결되며, 이 핵산 서열은 핵산 링커에 의해 다른 하나의 caTCR 핵산 서열에 연결되어, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열이 제1 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사되도록 하며, 이때 핵산 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 프로모터는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 면역 세포 활성화에 반응하는 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 프로모터는 NFAT-유래 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 서열 번호 85의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
일부 실시 형태에서, 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)가 제공되며, 상기 벡터는 a) 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체 caTCR을 인코딩하는 핵산 - 핵산은 i) 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열, 및 ii) 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열을 포함함 -; 및 b) 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체 CSR을 인코딩하는 핵산 - 핵산은 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 포함함 - 을 포함하며, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열은 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터는 핵산 서열들 중 하나에 작동가능하게 연결되며, 이 핵산 서열은 핵산 링커들에 의해 나머지 다른 핵산 서열들에 연결되어, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열이 프로모터의 제어 하에서 단일 RNA로서 전사되도록 하며, 이때 핵산 링커들은 개별적으로, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 자가-절단 2A 펩티드(예컨대, P2A, T2A, E2A, 또는 F2A)를 인코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프로모터는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다.
세포 내로 유전자를 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 세균, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션(lipofection), 입자 충격, 현미주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 인산칼슘 형질감염에 의해 수행된다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 그리고 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되어 왔다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 1형 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 지질-기반 시스템 - 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함함 - 을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용이 (시험관내, 생체외 또는 생체내에서의) 숙주 세포 내로의 핵산의 도입을 위해 고려된다. 다른 태양에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀 내에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀 내에 함유되거나 그와 복합체화되거나, 또는 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액 중에 단순히 산재되어, 가능하게는, 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질 내에서 천연적으로 발생하는 지방 소적(fatty droplet)뿐만 아니라, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포 내의 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 그러한 검정은, 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 검정(예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본 명세서에 기재된 검정에 의함)을 포함한다.
caTCR, CSR 및 SSE의 제조
일부 실시 형태에서, 항체 모이어티를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR, CSR 및 SSE에 따르면, 항체 모이어티(예를 들어, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 scFv)는 단일클론 항체로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 단일클론 항체로부터의 VH 및 VL 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 단일클론 항체로부터의 CH1 및 CL 도메인, 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 단일클론 항체는, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)] 및 문헌[Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272]에 의해 기재된 것들과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 햄스터, 마우스, 또는 다른 적절한 숙주 동물이 전형적으로 면역제(immunizing agent)로 면역화되어, 면역제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유인한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역제는 관심 단백질의 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 적어도 2개의 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요구되는 경우 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나, 비인간 포유류 공급원이 요구되는 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]을 참조한다. 불멸화 세포주는 통상 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소, 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상, 래트 또는 마우스의 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함할 것인데("HAT 배지"), 이들은 HGPRT-결손 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시 형태에서, 불멸화 세포주는, 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준의 발현을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것들이다. 일부 실시 형태에서, 불멸화 세포주는 뮤린 골수종 세포주인데, 이는, 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Salk Institute Cell Distribution Center 및 미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 획득될 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단일클론 항체의 생성을 위해 기재되어 있다(문헌[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63]).
이어서, 하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 폴리펩티드에 대해 유도된 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해, 또는 방사면역검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 그러한 기법 및 검정은 당업계에 알려져 있다. 단일클론 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌[Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석(limiting dilution) 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(문헌[Goding, 상기 참조]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물 내의 복수(ascites)와 같이 생체내에서 성장될 수 있다.
하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수로부터 단리되거나 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체 모이어티를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR, CSR 및 SSE에 따르면, 항체 모이어티는 항체 모이어티 라이브러리(예컨대, scFv 또는 Fab 단편을 제시하는 파지 라이브러리)로부터 선택되는 클론으로부터의 서열을 포함한다. 클론은 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체 단편들에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 갖는 항체를 위하여 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 그러한 방법은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)]에 검토되어 있으며, 예를 들어 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; 문헌[Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
소정의 파지 디스플레이 방법에서는, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리(repertoire)들이 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이어서 이들은 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대해 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브(naive) 레퍼토리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여, 어떠한 면역화 없이도 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 단일 항체 공급원을 제공할 수 있으며, 이는 문헌[ Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 의해 기재된 바와 같다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성에 의해 제조될 수 있으며, 이는, 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 의해 기재된 바와 같다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보에는, 예를 들어 미국 특허 제5,750,373호 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호가 포함된다.
항체 모이어티는 파지 디스플레이를 사용하여 표적 항원(예컨대, 펩티드/MHC 클래스 I/II 복합체 또는 세포 표면 항원)에 특이적인 항체에 대한 라이브러리를 스크리닝하여 제조될 수 있다. 라이브러리는 적어도 1 × 109개(예컨대, 적어도 약 1 × 109, 2.5 × 109, 5 × 109, 7.5 × 109, 1 × 1010, 2.5 × 1010, 5 × 1010, 7.5 × 1010, 또는 1 × 1011개 중 어느 하나)의 고유 인간 항체 단편의 다양성을 갖는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는, 모든 인간 중쇄 및 경쇄 하위패밀리를 포함하는, 건강한 공여자로부터의 인간 PMBC 및 비장으로부터 추출된 DNA로부터 작제된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 다양한 질병을 가진 환자, 예컨대 자가면역 질병을 가진 환자, 암 환자, 및 감염성 질병을 가진 환자로부터 단리된 PBMC로부터 추출된 DNA로부터 작제된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 반합성 인간 라이브러리인데, 여기서 중쇄 CDR3은 완전히 무작위화되며, (시스테인을 제외한) 모든 아미노산은 임의의 주어진 위치에 존재할 가능성이 동일하다(예를 들어, 문헌[Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005] 참조). 일부 실시 형태에서, 반합성 인간 라이브러리의 중쇄 CDR3은 약 5 내지 약 24개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 중 어느 하나)의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 완전-합성 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 비인간 파지 디스플레이 라이브러리이다.
높은 친화도로 표적 항원에 결합하는 파지 클론은 고체 지지체(예컨대, 용액 패닝(solution panning)의 경우 비드, 또는 세포 패닝의 경우 포유류 세포)에 결합된 표적 항원에 대한 파지의 반복적 결합을 수행한 후, 결합되지 않은 파지 제거 및 특이적으로 결합된 파지의 용리를 수행함으로써 선택될 수 있다. 용액 패닝의 예에서, 표적 항원은 고체 지지체에 대한 고정화를 위해 비오티닐화될 수 있다. 비오티닐화 표적 항원을 파지 라이브러리 및 고체 지지체, 예컨대 스트렙타비딘-접합된 Dynabeads M-280과 혼합하고, 이어서 표적 항원-파지-비드 복합체를 단리한다. 이어서, 결합된 파지 클론을 용리시키고, 이를 사용하여, 발현 및 정제에 적절한 숙주 세포, 예컨대 E. 콜라이 XL1-Blue를 감염시킨다. 세포 패닝의 예에서는, AFP 펩티드가 로딩된 T2 세포(TAP-결손, HLA-A*02:01+ 림프아구 세포주)를 파지 라이브러리와 혼합하고, 이후에 세포를 수집하고, 결합된 클론을 용리시키고, 이를 사용하여, 발현 및 정제에 적절한 숙주 세포를 감염시킨다. 패닝은, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 풍부화하기 위해, 용액 패닝, 세포 패닝, 또는 둘 모두의 조합 어느 경우에 대해서도 다회(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상 중 어느 하나)의 라운드 동안 수행될 수 있다. 풍부화된 파지 클론은, 예를 들어 ELISA 및 FACS를 포함한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 표적 항원에 대한 특이적 결합에 대해 시험될 수 있다.
인간 및 인간화 항체 모이어티
caTCR, CSR 및 SSE 항체 모이어티는 인간 또는 인간화 항체 모이어티일 수 있다. 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 모이어티의 인간화 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 전형적으로 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체 모이어티는, 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 결합능(capacity)을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이들의 단편(수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체 모이어티는 또한, 수용자 항체 모이어티 또는 유입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열 어느 곳에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 모이어티는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것들이다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
일반적으로, 인간화 항체 모이어티는 비인간 공급원으로부터 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 받아들여진다. 일부 실시 형태에 따르면, 인간화는 Winter 및 그 동료들의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있는데(문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]), 이는, 설치류 CDR 또는 인간 항체 모이어티의 상응하는 서열에 대한 CDR 서열을 치환시킴으로써 행해진다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체 모이어티는 비인간 종들로부터의 상응하는 서열에 의해 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적게 치환된 항체 모이어티(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체 모이어티는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체 모이어티이다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체 모이어티가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 동물(예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선(germ-line) 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 가져오는 것으로 기재되어 있다. 인간 배선 면역글로불린 유전자 배열을 그러한 배선 돌연변이 마우스 내로 전달하면, 항원 시험투여 시에 인간 항체가 생성될 것이다(예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993)]; 문헌[Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; 문헌[Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호; 제5,545,807호; 및 국제 특허 출원 공개 WO 97/17852호 참조). 대안적으로, 인간 항체는 유전자도입 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입하여 제조될 수 있다. 항원 시험투여 시에, 인간 항체 생성이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 조립(assembly), 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 점에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 흡사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; 문헌[Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; 문헌[Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)]; 문헌[Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)]; 문헌[Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업계에 알려진 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다(문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). Cote 등 및 Boerner 등의 기법이 또한 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용가능하다(문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]).
추가 변이체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 항원-결합 모듈의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항원-결합 모듈의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항원-결합 모듈의 아미노산 서열 변이체는 항원-결합 모듈을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는, 예를 들어 항원-결합 모듈의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 작제물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 갖기만 한다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 획득되도록 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항원-결합 모듈 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이생성에 대한 관심 부위는 항체 모이어티의 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환이 관심 항원-결합 모듈 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 보유된/개선된 항원 결합성 또는 감소된 면역원성을 위해 스크리닝될 수 있다.
보존적 치환이 하기 표 4에 나타나 있다.
[표 4]
아미노산은 공통된 측쇄 특성에 따라 상이한 부류로 그룹화될 수 있다:
a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙 항체 모이어티인데, 이는, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 하나 이상의 CDR 잔기를 돌연변이시키고, 변이 항체 모이어티를 파지 상에 디스플레이하고, 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 예를 들어 항체 모이어티 친화도를 개선하기 위해, HVR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 HVR "빈발부위(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 특이성 결정 잔기(SDR)에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 작제 및 재선택에 의한 친화성 성숙은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다.
친화성 성숙의 일부 실시 형태에서, 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-유발(error-prone) PCR, 사슬 셔플링(chain shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이생성)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 다양성이 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 모이어티 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 HVR-유도 접근법을 수반하는데, 여기서는 몇몇 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
일부 실시 형태에서, 치환, 삽입, 또는 결실이 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있는데, 이는, 그러한 변경이 항원에 결합하는 항체 모이어티의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한에 있어서이다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 HVR "빈발부위" 또는 SDR의 외부에서 행해질 수 있다. 상기에 제공된 변이 VH 및 VL 서열의 일부 실시 형태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2, 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항원-결합 모듈의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"으로 불린다. 이 방법에서는, 표적 잔기 또는 표적 잔기 집단(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체하여 항원-결합 모듈과 항원의 상호작용에 영향을 주는지의 여부를 결정한다. 초기 치환에 대해 기능적 감수성을 보여준 아미노산 위치에서 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항원-항원-결합 모듈 복합체의 결정 구조를 결정하여 항원-결합 모듈과 항원 사이의 접점을 확인할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개인 잔기부터 100개 이상인 잔기를 함유하는 폴리펩티드에까지 이르는 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항원-결합 모듈을 포함한다. 항원-결합 모듈의 다른 삽입 변이체에는 항원-결합 모듈의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소(예를 들어, ADEPT의 경우)에 대한 항원-결합 모듈의 N- 또는 C-말단 융합체가 포함된다.
유도체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 SSE에 따른 SSE는, 당업계에 알려져 있고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/무수 말레산 공중합체, 폴리아미노산(단일중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단일중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물 중에서의 그의 안정성으로 인해 제조 시에 이점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선하고자 하는 caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE의 특정 특성 또는 기능, caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE 유도체가 규정된 조건 하에서 요법에 사용될지의 여부 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티와 caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE의 접합체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 이러한 파장에는, 통상의 세포는 손상시키지 않지만, caTCR- 및/또는 CSR- 및/또는 SSE-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
caTCR + CSR 면역 세포의 제조
일 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 caTCR 및 CSR을 발현하는 면역 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)를 제공한다. caTCR 및 CSR을 발현하는 면역 세포(예컨대, T 세포) (caTCR + CSR 면역 세포, 예컨대 caTCR + CSR T 세포)를 제조하는 예시적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원(예컨대, 질병-관련 항원)에 특이적으로 결합하는 caTCR(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR) 및 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 CSR)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 포함함)을 면역 세포 내로 도입함으로써 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, caTCR + CSR T 세포)가 생성될 수 있다. 면역 세포 내로의 하나 이상의 핵산의 도입은 당업계에 알려진 기법, 예컨대 본 명세서에서 핵산에 대해 기재된 것들을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, caTCR + CSR T 세포)는 생체내에서 복제되어, 표적 항원(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 발현과 관련된 질병의 지속적인 제어로 이어질 수 있는 장기간 지속성을 가져올 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포를, 예를 들어 암 또는 바이러스성 감염을 포함한, 표적 항원의 발현과 관련된 질병 및/또는 장애(본 명세서에서 "표적 항원-양성" 또는 "TA-양성" 질병 또는 장애로도 지칭됨)를 갖거나 이들이 발생될 위험이 있는 환자의 치료를 위하여, 림프구 주입을 사용하여 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 자가 림프구 주입이 치료에 사용된다. 치료를 필요로 하는 환자로부터 자가 PBMC를 수집하고, 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 T 세포를 활성화 및 증폭시키고, 이어서 환자에게 다시 주입한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현하는 T 세포(본 명세서에서 "caTCR + CSR T 세포"로도 지칭됨)가 제공된다. 본 발명의 caTCR + CSR T 세포는 강력한 생체내 T 세포 증폭을 거칠 수 있고, 혈액 및 골수 중에서 연장된 시간 동안 고수준으로 지속되는 표적 항원-특이적 기억 세포를 확립할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 환자에게 주입된 본 발명의 caTCR + CSR T 세포는 표적 항원-관련 질병을 가진 환자에서 생체내에서, 표적 항원-제시 세포, 예컨대 표적 항원-제시 암 또는 바이러스-감염된 세포를 제거할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 환자에게 주입된 본 발명의 caTCR + CSR T 세포는 적어도 하나의 통상적인 치료에 불응성인 표적 항원-관련 질병을 가진 환자에서 생체내에서, 표적 항원-제시 세포, 예컨대 표적 항원-제시 암 또는 바이러스-감염된 세포를 제거할 수 있다.
T 세포의 증폭 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원을 대상체로부터 획득한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직, 및 종양을 포함한 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 당업계에서 이용가능한 다수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, T 세포는 당업자에게 알려진 다수의 기법, 예컨대 FICOLL™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 획득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포가 성분채집술에 의해 획득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 처리 단계를 위하여 적절한 완충액 또는 배지 중에 세포를 넣을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시 형태에서, 세척 용액에는 칼슘이 부재하고, 마그네슘이 부재할 수 있거나 전부는 아니지만 다수의 2가 양이온이 부재할 수 있다. 당업자는 세척 단계가 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예컨대 제조자의 사용설명서에 따라 반자동화 "관류형" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용함으로써 달성될 있음을 용이하게 인식할 것이다. 세척 후에, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예컨대 Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충제를 함유하거나 함유하지 않는 다른 식염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 중에 직접 재현탁시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 세정(counterflow centrifugal elutriation)에 의해, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포가 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28(즉, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와의 인큐베이션에 의해 단리된다. 일부 실시 형태에서, 기간은 약 30분이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상(이들 값 사이의 모든 범위를 포함함)의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시 형태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 백혈병을 가진 환자로부터의 T 세포의 단리를 위하여, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형에 비하여 T 세포가 적게 존재하는 어떠한 상황에서 T 세포를 단리하는 데 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있으며, 이는, 예를 들어 종양 조직으로부터 또는 면역-손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 경우이다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 간단히 시간을 단축 또는 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있게 하고/하거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시 시점에서 또는 프로세스 동안의 다른 시점에서 우선적으로 선택되거나 선택에서 제외될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시 시점에서 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택되거나 선택에서 제외될 수 있다. 당업자는 다회의 선택 라운드가 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시 형태에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 증폭 프로세스에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가의 선택 라운드를 거칠 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체들의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 단일클론 항체들의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착 또는 유세포측정을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위하여, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절성 T 세포를 풍부화하거나 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시 형태에서, T 조절성 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단의 단리를 위하여, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 변동될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위하여, 비드와 세포가 함께 혼합된 부피를 유의하게 감소시키는(즉, 세포 농도를 유의하게 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 약 20억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 10억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1억 개의 세포/ml 초과가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만 개의 세포/ml 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개의 세포/ml 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1억2500만 또는 약 1억5000만 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 높은 농도를 사용하면, 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 증폭이 증가될 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원, 예컨대 CD28-음성 T 세포를 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터의 세포의 더 효율적인 포획을 가능하게 한다. 그러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 획득하기에 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 세포 농도의 사용은, 통상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더욱 효율적인 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, T 세포는 치료 직후에 환자로부터 획득된다. 이와 관련하여, 소정의 암 치료, 특히 면역 시스템을 손상시키는 약물에 의한 치료 후에, 치료 직후 환자가 통상적으로 치료로부터 회복 중일 기간 동안에, 획득된 T 세포의 품질은 생체외에서 증폭되는 그들의 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 증폭을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락 내에서, 이러한 회복 단계 동안에 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하는 것이 고려된다. 또한, 일부 실시 형태에서, 동원(예를 들어, GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 요법이, 특히 치료 후 규정된 시간 범위 동안, 특정 세포 유형의 재분포, 재순환, 재생, 및/또는 증폭이 유리한 대상체에서 조건을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형에는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역 시스템의 다른 세포가 포함된다.
바람직한 caTCR, CSR 및 선택적으로 SSE를 발현시키기 위해 T 세포를 유전자 변형시키기 전이든 후이든 상관없이, T 세포는 일반적으로, 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증폭될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상에서 공동자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 증폭된다. 특히, T 세포 집단은, 예를 들어 표면 상에 고정된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단이, T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중 어느 하나의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예에는 9.3, B-T3, XR-CD28(프랑스 브장송 소재의 Diaclone)이 포함되며, 이들은 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법과 마찬가지로 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998]; 문헌[Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999]; 문헌[Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
유전자 변형
일부 실시 형태에서, 본 발명의 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, caTCR + CSR T 세포)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 caTCR 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 바이러스 벡터에 의해 면역 세포(예컨대, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 T 세포)를 형질도입시킴으로써 생성된다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이들은 면역 세포로의 전달 후에 에피솜 게놈 또는 통합된 게놈을 갖는다. 유전자 요법 절차의 검토에 대해서는, 문헌[Anderson, Science 256:808-813 (1992)]; 문헌[Nabel & Feigner, TIBTECH 11 :211 - 217 (1993)]; 문헌[Mitani & Caskey, TIBTECH 11 :162-166 (1993)]; 문헌[Dillon, TIBTECH 11 : 167-175 (1993)]; 문헌[Miller, Nature 357:455-460 (1992)]; 문헌[Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1 154 (1988)]; 문헌[Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)]; 문헌[Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(l):31-44 (1995)]; 및 문헌[Yu et al., Gene Therapy 1 :13-26 (1994)]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 caTCR + CSR 면역 세포 게놈 내로 통합된 하나 이상의 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 게놈 내로 통합된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 caTCR + CSR T 세포이다.
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 내인성 TCR 사슬들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 T 세포이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이고/이거나, caTCR + CSR 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 유전자 발현을 파괴하기 위한 세포의 변형은, 예를 들어 RNA 간섭(예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA), 유전자 편집(예를 들어, CRISPR- 또는 TALEN-기반 유전자 녹아웃) 등을 포함한 당업계에 알려진 임의의 그러한 기법을 포함한다.
일부 실시 형태에서, T 세포의 내인성 TCR 사슬들 중 하나 또는 둘 모두의 발현이 감소된 caTCR + CSR T 세포가 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 생성된다. 유전자 편집의 CRISPR/Cas 시스템의 검토에 대해서는, 예를 들어 문헌[Jian W & Marraffini LA, Annu. Rev. Microbiol. 69, 2015]; 문헌[Hsu PD et al., Cell, 157(6):1262-1278, 2014]; 및 문헌[O'Connell MR et al., Nature 516: 263-266, 2014]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, T 세포의 내인성 TCR 사슬들 중 하나 또는 둘 모두의 발현이 감소된 caTCR + CSR T 세포가 TALEN-기반 게놈 편집을 사용하여 생성된다.
풍부화
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR + CSR 면역 세포에 따른 caTCR + CSR 면역 세포에 대한 이종 세포 집단을 풍부화하는 방법이 제공된다.
표적 항원 및 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, caTCR + CSR T 세포)의 특정 하위집단이 양성 선택 기법에 의해 풍부화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, caTCR + CSR T 세포)는 원하는 caTCR + CSR 면역 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 표적 항원-접합된 비드 및/또는 표적 리간드-접합된 비드와 함께 인큐베이션함으로써 풍부화된다. 일부 실시 형태에서, 기간은 약 30분이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상(이들 값 사이의 모든 범위를 포함함)의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시 형태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 이종 세포 집단 내에 낮은 수준으로 존재하는 caTCR + CSR 면역 세포의 단리를 위하여, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형에 비하여 caTCR + CSR 면역 세포가 적게 존재하는 어떠한 상황에서 caTCR + CSR 면역 세포를 단리하는 데 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 당업자는 다회의 선택 라운드가 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
양성 선택에 의해 원하는 caTCR + CSR 면역 세포 집단의 단리를 위하여, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 변동될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위하여, 비드와 세포가 함께 혼합된 부피를 유의하게 감소시키는(즉, 세포 농도를 유의하게 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 약 20억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 10억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1억 개의 세포/ml 초과가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만 개의 세포/ml 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개의 세포/ml 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1억2500만 또는 약 1억5000만 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 높은 농도를 사용하면, 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 증폭이 증가될 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 caTCR 및/또는 CSR을 약하게 발현할 수 있는 caTCR + CSR 면역 세포의 더 효율적인 포획을 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 임의의 그러한 실시 형태들 중 일부에서, 풍부화는 caTCR + CSR 면역 세포의 탈진(exhaustion)을 최소화하거나 실질적으로 전혀 야기하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 풍부화는 탈진되는 caTCR + CSR 면역 세포가 약 50% 미만(예컨대, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 미만 중 어느 하나)이 되게 한다. 면역 세포 탈진은 본 명세서에 기재된 임의의 수단을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 그러한 실시 형태들 중 일부에서, 풍부화는 caTCR + CSR 면역 세포의 최종 분화를 최소화하거나 실질적으로 전혀 야기하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 풍부화는 최종 분화되는 caTCR + CSR 면역 세포가 약 50% 미만(예컨대, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 미만 중 어느 하나)이 되게 한다. 면역 세포 분화는 본 명세서에 기재된 임의의 수단을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 그러한 실시 형태들 중 일부에서, 풍부화는 caTCR + CSR 면역 세포 상의 caTCR 및/또는 CSR의 내재화를 최소화하거나 실질적으로 전혀 야기하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 풍부화는 내재화되는 caTCR + CSR 면역 세포 상의 caTCR 및/또는 CSR이 약 50% 미만(예컨대, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5% 미만 중 어느 하나)이 되게 한다. caTCR + CSR 면역 세포 상의 caTCR 및/또는 CSR의 내재화는 본 명세서에 기재된 임의의 수단을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 그러한 실시 형태들 중 일부에서, 풍부화는 caTCR + CSR 면역 세포의 증가된 증식을 가져온다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 풍부화는 풍부화 후의 caTCR + CSR 면역 세포의 수에 있어서 적어도 약 10%(예컨대, 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000% 또는 그 이상 중 어느 하나)의 증가를 가져온다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현하는 caTCR + CSR 면역 세포에 대한 이종 세포 집단을 풍부화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 이종 세포 집단을 표적 항원 또는 그 안에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 제1 분자 및/또는 표적 리간드 또는 그 안에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 제2 분자와 접촉시켜 제1 분자에 결합된 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하는 복합체 및/또는 제2 분자에 결합된 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; b) 복합체를 이종 세포 집단으로부터 분리하여, caTCR + CSR 면역 세포가 풍부화된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 분자는 개별적으로 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 미립자(예컨대, 비드)이다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 표면(예컨대, 웰의 하부)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 분자는 개별적으로 태그로 표지된다. 일부 실시 형태에서, 태그는 형광 분자, 친화성 태그, 또는 자성 태그이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 제1 및/또는 제2 분자로부터 caTCR + CSR 면역 세포를 용리하는 단계 및 용리액을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
라이브러리 스크리닝
일부 실시 형태에서, 표적 항원에 특이적인 후보 caTCR 작제물을 단리하기 위하여, caTCR 라이브러리, 예를 들어 복수의 caTCR을 인코딩하는 핵산의 라이브러리를 발현하는 세포를 표적 항원 또는 그 안에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 포획 분자에 노출시킨 후, 포획 분자에 특이적으로 결합하는 라이브러리의 친화성 구성원들을 단리할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자는 고체 지지체 상에 고정화된다. 일부 실시 형태에서, 지지체는 비드, 미세적정 플레이트, 면역튜브(immunotube), 또는 그러한 목적에 유용한 당업계에 알려진 임의의 재료의 표면일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상호작용은 태깅된 포획 분자(예를 들어, 비오티닐화 포획 분자)를 갖는 용액 중에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 절차는 비특이적 및 비반응성 라이브러리 구성원을 제거하기 위한 1회 이상의 세척 단계(패닝(panning))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용액 중 복합체를 정제하기 위하여, 이들은 고정화에 의해 또는 원심분리에 의해 수집된다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원이 가용성 비오티닐화 포획 분자 상에 포획된 후, 스트렙타비딘 비드 상에 친화성 복합체(친화성 구성원 및 포획 분자)를 고정화한다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는, 예를 들어 자성 비드(예를 들어, Bangs Laboratories, Polysciences inc., Dynal Biotech, Miltenyi Biotech 또는 Quantum Magnetic으로부터의 것), 비자성 비드(예를 들어, Pierce 및 Upstate Technology), 단분산 비드(예를 들어, Dynal Biotech 및 Microparticle Gmbh), 및 다분산 비드(예를 들어, Chemagen)를 포함한다. 자성 비드의 사용은 서적(문헌[Uhlen, M, et al (1994) in Advances in Biomagnetic Separation, BioTechniques press, Westborough, MA])에 철저히 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원은 양성 선택에 의해 정제된다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원은 음성 선택에 의해 정제되어 원치 않는 라이브러리 구성원을 제거한다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원은 양성 선택 단계 및 음성 선택 단계 둘 모두에 의해 정제된다.
일부 실시 형태에서, 표적 리간드에 특이적인 후보 CSR 작제물을 단리하기 위하여, CSR 라이브러리, 예를 들어 복수의 CSR을 인코딩하는 핵산의 라이브러리를 발현하는 세포를 표적 리간드 또는 그 안에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 포획 분자에 노출시킨 후, 포획 분자에 특이적으로 결합하는 라이브러리의 친화성 구성원들을 단리할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자는 고체 지지체 상에 고정화된다. 일부 실시 형태에서, 지지체는 비드, 미세적정 플레이트, 면역튜브, 또는 그러한 목적에 유용한 당업계에 알려진 임의의 재료의 표면일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상호작용은 태깅된 포획 분자(예를 들어, 비오티닐화 포획 분자)를 갖는 용액 중에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 절차는 비특이적 및 비반응성 라이브러리 구성원을 제거하기 위한 1회 이상의 세척 단계(패닝(panning))를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용액 중 복합체를 정제하기 위하여, 이들은 고정화에 의해 또는 원심분리에 의해 수집된다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원이 가용성 비오티닐화 포획 분자 상에 포획된 후, 스트렙타비딘 비드 상에 친화성 복합체(친화성 구성원 및 포획 분자)를 고정화한다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 실시 형태에서, 비드는, 예를 들어 자성 비드(예를 들어, Bangs Laboratories, Polysciences inc., Dynal Biotech, Miltenyi Biotech 또는 Quantum Magnetic으로부터의 것), 비자성 비드(예를 들어, Pierce 및 Upstate Technology), 단분산 비드(예를 들어, Dynal Biotech 및 Microparticle Gmbh), 및 다분산 비드(예를 들어, Chemagen)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원은 양성 선택에 의해 정제된다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원은 음성 선택에 의해 정제되어 원치 않는 라이브러리 구성원을 제거한다. 일부 실시 형태에서, 친화성 구성원은 양성 선택 단계 및 음성 선택 단계 둘 모두에 의해 정제된다.
일반적으로, 라이브러리 작제물을 제조하는 데 사용되는 기법은 알려진 유전자 조작 기법에 기초할 것이다. 이와 관련하여, 라이브러리 내의 발현될 caTCR 또는 CSR을 인코딩하는 핵산 서열이 사용될 발현 시스템의 유형에 적절한 발현 벡터 내로 도입된다. 세포, 예컨대 CD3+ 세포에서의 디스플레이에 사용하기에 적절한 발현 벡터는 잘 알려져 있고 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 어느 하나의 실시 형태에 따른 복수의 caTCR을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 라이브러리는 복수의 caTCR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 어느 하나의 실시 형태에 따른 복수의 CSR을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 라이브러리는 복수의 CSR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원에 특이적인 caTCR을 인코딩하는 서열에 대하여 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 핵산 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 핵산 라이브러리를 복수의 세포 내로 도입하여, caTCR이 복수의 세포의 표면 상에 발현되도록 하는 단계; b) 복수의 세포를 표적 항원 또는 그 안에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 포획 분자와 함께 인큐베이션하는 단계; c) 포획 분자에 결합된 세포를 수집하는 단계; 및 d) 단계 c)에서 수집된 세포로부터 caTCR을 인코딩하는 서열을 단리함으로써, 표적 항원에 특이적인 caTCR을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1회 이상의 세척 단계는 단계 b)와 단계 c) 사이에서 수행된다. 일부 실시 형태에서, 복수의 세포는 복수의 CD3+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자는 고체 지지체 상에 고정화된다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자에 결합된 세포를 수집하는 단계는 고체 지지체에 결합된 포획 리간드로부터 세포를 용리하는 단계 및 용리액을 수집하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자는 태그로 표지된다. 일부 실시 형태에서, 태그는 형광 분자, 친화성 태그, 또는 자성 태그이다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자에 결합된 세포를 수집하는 단계는 세포 및 표지된 리간드를 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 복합체로부터 해리된다.
일부 실시 형태에서, 표적 리간드에 특이적인 CSR을 인코딩하는 서열에 대하여 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 핵산 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 핵산 라이브러리를 복수의 세포 내로 도입하여, CSR이 복수의 세포의 표면 상에 발현되도록 하는 단계; b) 복수의 세포를 표적 리간드 또는 그 안에 함유된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 포획 분자와 함께 인큐베이션하는 단계; c) 포획 분자에 결합된 세포를 수집하는 단계; 및 d) 단계 c)에서 수집된 세포로부터 CSR을 인코딩하는 서열을 단리함으로써, 표적 리간드에 특이적인 CSR을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 1회 이상의 세척 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1회 이상의 세척 단계는 단계 b)와 단계 c) 사이에서 수행된다. 일부 실시 형태에서, 복수의 세포는 복수의 CD3+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자는 고체 지지체 상에 고정화된다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자에 결합된 세포를 수집하는 단계는 고체 지지체에 결합된 포획 리간드로부터 세포를 용리하는 단계 및 용리액을 수집하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자는 태그로 표지된다. 일부 실시 형태에서, 태그는 형광 분자, 친화성 태그, 또는 자성 태그이다. 일부 실시 형태에서, 포획 분자에 결합된 세포를 수집하는 단계는 세포 및 표지된 리간드를 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 복합체로부터 해리된다.
MHC 단백질
MHC 클래스 I 단백질은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 2개의 주요 클래스 중 하나이며(다른 하나는 MHC 클래스 II임), 신체의 거의 모든 유핵 세포 상에서 발견된다. 이들의 기능은 세포 내로부터의 단백질의 단편을 T 세포에 디스플레이하는 것으로; 건강한 세포는 무시될 것인 반면, 외래 단백질 또는 돌연변이된 단백질을 함유하는 세포는 면역 시스템에 의해 공격받을 것이다. MHC 클래스 I 단백질은 사이토졸 단백질로부터 유래된 펩티드를 제시하기 때문에, MHC 클래스 I 제시의 경로는 종종 사이토졸 또는 내인성 경로로 불린다. 클래스 I MHC 분자는 프로테아좀에 의해 사이토졸 단백질의 분해로부터 주로 생성된 펩티드에 결합한다. 이어서, MHC I:펩티드 복합체가 세포의 원형질 막 내로 삽입된다. 펩티드는 클래스 I MHC 분자의 세포외 부분에 결합된다. 따라서, 클래스 I MHC의 기능은 세포독성 T 세포(CTL)에 세포내 단백질을 디스플레이하는 것이다. 그러나 또한, 클래스 I MHC는 교차-제시(cross-presentation)로 알려진 과정에서 외인성 단백질로부터 생성된 펩티드를 제시할 수 있다.
MHC 클래스 I 단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬, α 및 β2-마이크로글로불린(β2M)으로 이루어진다. 2개의 사슬은 β2M과 α3 도메인의 상호작용을 통해 비공유적으로 연결된다. 단지 α 사슬만이 다형성이고 HLA 유전자에 의해 인코딩되는 반면, β2M 하위단위는 다형성이 아니고 β-2 마이크로글로불린 유전자에 의해 인코딩된다. α3 도메인은 원형질 막-스패닝하고, T-세포의 CD8 공동수용체와 상호작용한다. α3-CD8 상호작용은 MHC I 분자를 정위치에 유지하고, 한편 세포독성 T 세포의 표면 상의 T 세포 수용체(TCR)는 그의 α1-α2 이종이량체 리간드와 결합하고, 결합된 펩티드를 항원성에 대해 확인한다. α1 및 α2 도메인은 접혀서 펩티드가 결합할 홈을 구성한다. MHC 클래스 I 단백질은 8 내지 10개의 아미노산 길이의 펩티드에 결합한다.
MHC 클래스 II 분자는 단지 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 단핵 식세포, 일부 내피 세포, 흉선 상피 세포, 및 B 세포 상에서만 통상적으로 발견되는 분자들의 패밀리이다. 클래스 II 펩티드에 의해 제시된 항원은 세포외 단백질(클래스 I에서와 같은 사이토졸이 아님)로부터 유래되며; 이에 따라, 항원 제시의 MHC 클래스 II-의존성 경로는 세포내이입성(endocytic) 또는 외인성 경로로 불린다. MHC 클래스 II 분자의 로딩은 식세포작용에 의해 일어나며; 세포외 단백질이 세포내이입되고, 리소좀에서 분해되고, 생성된 에피토프 펩티드 단편이 MHC 클래스 II 분자 상에 로딩된 후, 이들은 세포 표면으로 이주된다.
MHC 클래스 I 분자와 마찬가지로, 클래스 II 분자는 또한 이종이량체이지만, 이 경우에는 2개의 동종 펩티드, α 및 β 사슬로 이루어진다. 하위명칭 α1, α2 등은 HLA 유전자 내의 별개의 도메인을 지칭하고; 각각의 도메인은 유전자 내의 상이한 엑손에 의해 통상 인코딩되며, 일부 유전자는 리더 서열, 막관통 서열 등을 인코딩하는 추가의 도메인을 갖는다. MHC 클래스 II 분자의 항원-결합 홈은 양쪽 말단에서 개방되어 있는 반면, 클래스 I 분자 상의 상응하는 홈은 각각의 말단에서 폐쇄되어 있기 때문에, MHC 클래스 II 분자에 의해 제시된 항원은 더 길며, 일반적으로 15 내지 24개 아미노산 잔기 길이이다.
인간 백혈구 항원(HLA) 유전자는 MHC 유전자의 인간 버전이다. 인간에서의 3개의 주요 MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C이며, 한편 3개의 사소한 것은 HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G이다. 인간에서 항원 제시에 관여하는 3개의 주요 MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DP, HLDA-DQ, 및 HLA-DR이며, 한편 다른 MHC 클래스 II 단백질, HLA-DM 및 HLA-DO는 항원의 내부 처리 및 로딩에 관여한다. HLA-A는 인간에서의 유전자 중에서 가장 빠르게 진화하는 코딩 서열로 순위가 매겨진다. 2013년 12월 현재, 1740개의 활성 단백질 및 117개의 널 단백질을 코딩하는 2432개의 HLA-A 대립유전자가 알려져 있었다. HLA-A 유전자는 염색체 6의 짧은 아암(arm) 상에 위치되어 있고, HLA-A의 더 큰 α-사슬 구성성분을 인코딩한다. HLA-A α-사슬의 변이는 HLA 기능에 있어서 핵심이다. 이러한 변이는 집단에서의 유전자적 다양성을 촉진한다. 각각의 HLA는 소정 구조의 펩티드에 대해 상이한 친화성을 갖기 때문에, 더 다양한 HLA는 세포 표면 상에 '제시되는' 더 다양한 항원을 의미하며, 이는 집단의 하위세트가 임의의 주어진 외래 침습자에게 저항할 가능성을 향상시킨다. 이는 단일 병원체가 전체 인간 집단을 파괴할 능력을 가질 가능성을 감소시킨다. 각각의 개체는 그들의 부모 각각으로부터 하나씩 최대 2개의 HLA-A를 발현할 수 있다. 일부 개체는 양쪽 부모로부터 동일한 HLA-A를 물려받아서, 그들의 개별 HLA 다양성을 감소시키겠지만; 대다수의 개체는 HLA-A의 2개의 상이한 카피를 제공받을 것이다. 모든 HLA 군에 대해 이러한 동일한 패턴이 일어난다. 다시 말하면, 사람은 단지 2432개의 알려진 HLA-A 대립유전자들 중 1개 또는 2개만을 발현할 수 있다.
모든 대립유전자는 적어도 4자리 분류, 예를 들어 HLA-A*02:12를 수용한다. A는 대립유전자가 속하는 것이 어느 HLA 유전자인지를 나타낸다. 많은 HLA-A 대립유전자가 존재하여, 혈청형에 의한 분류가 카테고리화를 단순화한다. 그 다음의 숫자 쌍은 이러한 배정을 나타낸다. 예를 들어, HLA-A*02:02, HLA-A*02:04, 및 HLA-A*02: 324는 모두 A2 혈청형(*02 접두사에 의해 지정됨)의 구성원이다. 이 군은 HLA 적합성(compatibility)을 담당하는 주요 인자이다. 이후의 모든 숫자는 혈청형 분석에 의해 결정될 수 없으며, 유전자 서열분석을 통해 지정된다. 두 번째 숫자 세트는 어떤 HLA 단백질이 생성되는지를 나타낸다. 이들은 발견된 순서로 배정되며, 2013년 12월 현재, 456개의 상이한 HLA-A02 단백질(명칭 HLA-A*02:01 내지 HLA-A*02:456으로 배정됨)이 알려져 있다. 가장 짧은 가능한 HLA 명칭은 이들 세부내용 둘 모두를 포함한다. 이를 넘어서는 각각의 연장은 단백질을 변화시킬 수 있거나 변화시키지 않을 수 있는 뉴클레오티드 변화를 의미한다.
일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 질병-관련 항원(예컨대, 종양-관련 또는 바이러스-인코딩된 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 클래스 I 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하며, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-B이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-C이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74, 또는 HLA-A80이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A02이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01 내지 555 중 어느 하나, 예컨대 HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22, 또는 HLA-A*02:24이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01이다. HLA-A*02:01은 모든 백인의 39 내지 46%에서 발현되며, 이에 따라 본 발명에 사용하기에 적합한 MHC 클래스 I 단백질의 선택을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, Fab-유사 항원-결합 모듈은 질병-관련 항원(예컨대, 종양-관련 또는 바이러스-인코딩된 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 클래스 II 단백질을 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하며, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DP이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DQ이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DR이다.
Fab-유사 항원-결합 모듈을 생성하는 데 사용하기에 적합한 펩티드는, 예를 들어, 당업자에게 알려진 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 HLA(예컨대, HLA-A*02:01) 결합 모티프 및 절단 부위의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. MHC 결합 부위를 예측하기 위하여, 그러한 모델은 ProPred1(문헌[Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237, 2001)]에 더 상세하게 기재됨), 및 SYFPEITHI(문헌[Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93, 2007] 참조)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일단 적절한 펩티드가 확인되었으면, 당업자에게 잘 알려진 프로토콜에 따라 펩티드 합성이 행해질 수 있다. 비교적 작은 크기 때문에, 본 발명의 펩티드는 통상적인 펩티드 합성 기법에 따라 용액 중에서 또는 고체 지지체 상에서 직접 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 구매가능하며, 알려진 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 용액상(solution phase)에서의 펩티드의 합성은 합성 펩티드의 대규모 생산을 위한 잘 확립된 절차가 되었으며, 그렇기 때문에 본 발명의 펩티드를 제조하기에 적합한 대안적인 방법이다(예를 들어, 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis by John Morrow Stewart and Martin et al. Application of Almez-mediated Amidation Reactions to Solution Phase Peptide Synthesis, Tetrahedron Letters Vol. 39, pages 1517-1520, 1998] 참조).
약제학적 조성물
caTCR + CSR 면역 세포 조성물(예컨대, 약제학적 조성물, 이는 본 명세서에서 제형으로도 지칭됨)이 본 명세서에 또한 제공되며, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 caTCR에 따른 caTCR 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
조성물은, 동일한 세포 유형의 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하고 동일한 caTCR 및 CSR을 발현하는 동종 세포 집단, 또는 상이한 세포 유형의 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하고/하거나 상이한 caTCR을 발현하고/하거나 상이한 CSR을 발현하는 복수의 caTCR + CSR 면역 세포 집단을 포함하는 이종 세포 집단을 포함할 수 있다. 조성물은 caTCR + CSR 면역 세포가 아닌 세포를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물이 제공되며, 상기 조성물은, 동일한 세포 유형의 caTCR + CSR 면역 세포(예컨대, caTCR + CSR T 세포)로 구성되고 동일한 caTCR 및 CSR을 발현하는 동종 세포 집단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물이 제공되며, 상기 조성물은, 상이한 세포 유형의 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하고/하거나 상이한 caTCR을 발현하고/하거나 상이한 CSR을 발현하는 복수의 caTCR + CSR 면역 세포 집단을 포함하는 이종 세포 집단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은, 서로 독립적으로, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 조성물 내의 모든 caTCR + CSR 면역 세포는 동일한 세포 유형을 갖는다(예를 들어, 모든 caTCR + CSR 면역 세포는 세포독성 T 세포이다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 세포 유형을 갖는다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 세포독성 T 세포로 이루어지고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 자연 살해 T 세포로 이루어진다). 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단이 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현하는 경우, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 질병 또는 장애와 관련된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다(예를 들어, 각각의 표적 항원은 암, 예컨대 유방암과 관련되어 있다). 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단이 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현하는 경우, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 질병 또는 장애와 관련된 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다(예를 들어, 각각의 표적 리간드는 암, 예컨대 유방암과 관련되어 있다). 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
따라서, 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 복수의 caTCR + CSR 면역 세포 집단을 포함하며, 조성물 내의 모든 caTCR + CSR 면역 세포는 동일한 세포 유형을 가지며(예를 들어, 모든 caTCR + CSR 면역 세포는 세포독성 T 세포임), 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과 상이한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단이 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현하는 경우, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 질병 또는 장애와 관련된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다(예를 들어, 각각의 표적 항원은 암, 예컨대 유방암과 관련되어 있다). 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 복수의 caTCR + CSR 면역 세포 집단을 포함하며, 조성물 내의 모든 caTCR + CSR 면역 세포는 동일한 세포 유형을 가지며(예를 들어, 모든 caTCR + CSR 면역 세포는 세포독성 T 세포임), 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과 상이한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단이 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현하는 경우, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 질병 또는 장애와 관련된 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다(예를 들어, 각각의 표적 리간드는 암, 예컨대 유방암과 관련되어 있다). 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
일부 실시 형태에서, 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 복수의 caTCR + CSR 면역 세포 집단을 포함하며, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과 상이한 세포 유형을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 모든 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 상이한 세포 유형을 갖는다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은, 서로 독립적으로, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 유형을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단이 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현하는 경우, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 질병 또는 장애와 관련된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR을 발현한다(예를 들어, 각각의 표적 항원은 암, 예컨대 유방암과 관련되어 있다). 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 나머지 다른 것들과는 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다(예를 들어, 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 나머지 다른 caTCR + CSR 면역 세포 집단들은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다). 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 caTCR + CSR 면역 세포 집단이 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현하는 경우, 각각의 caTCR + CSR 면역 세포 집단은 동일한 질병 또는 장애와 관련된 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 CSR을 발현한다(예를 들어, 각각의 표적 리간드는 암, 예컨대 유방암과 관련되어 있다). 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 약제학적 조성물이다.
조성물의 제조 동안 다양한 점에서, 세포를 동결보존하는 것이 필요하거나 유익할 수 있다. 용어 "동결된/동결시키는"과 "동결보존된/동결보존시키는"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 동결은 동결 건조를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 세포의 동결은 파괴적일 수 있지만(문헌[Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272] 참조), 그러한 손상을 방지하기 위해 이용가능한 다수의 절차들이 존재한다. 예를 들어, 손상은 (a) 동결보호제의 사용, (b) 동결 속도의 제어, 및/또는 (c) 분해 반응을 최소화하기에 충분히 낮은 온도에서의 저장에 의해 피할 수 있다. 예시적인 동결보호제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(문헌[Lovelock and Bishop, 1959, Nature 183:1394- 1395]; [Ashwood-Smith, 1961, Nature 190:1204-1205]), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(문헌[Rinfret, 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576]), 폴리에틸렌 글리콜(문헌[Sloviter and Ravdin, 1962, Nature 196:548]), 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨(문헌[Rowe et al., 1962, Fed. Proc. 21 :157]), D-소르비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린 클로라이드(문헌[Bender et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520]), 아미노산(문헌[Phan The Tran and Bender, 1960, Exp. Cell Res. 20:651]), 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트(문헌[Lovelock, 1954, Biochem. J. 56:265]), 및 무기 염(문헌[Phan The Tran and Bender, 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388]; 문헌[Phan The Tran and Bender, 1961, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, llbery ed., Butterworth, London, p. 59])을 포함한다. 특정 실시 형태에서, DMSO가 사용될 수 있다. (예를 들어, 20 내지 25% 농도로의) 혈장의 첨가는 DMSO의 보호 효과를 증대시킬 수 있다. DMSO의 첨가 후, 세포는 동결될 때까지 0℃에서 유지될 수 있는데, 그 이유는 1%의 DMSO 농도가 4℃ 초과의 온도에서 독성일 수 있기 때문이다.
세포의 동결보존에서는, 제어된 느린 냉각 속도가 중요할 수 있고 상이한 동결보호제(문헌[Rapatz et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25]) 및 상이한 세포 유형은 상이한 최적의 냉각 속도를 갖는다(예를 들어, 줄기 세포의 생존율 및 이들의 이식능(transplantation potential)에 대한 냉각 속도의 효과에 대해서는 문헌[Rowe and Rinfret, 1962, Blood 20:636]; 문헌[Rowe, 1966, Cryobiology 3(1):12-18]; 문헌[Lewis, et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32]; 및 문헌[Mazur, 1970, Science 168:939-949] 참조). 물이 얼음으로 변하는 융합 단계의 열은 최소한이어야 한다. 냉각 절차는, 예를 들어 프로그램가능 동결 장치 또는 메탄올조(methanol bath) 절차의 사용에 의해 수행될 수 있다. 프로그래밍가능 동결 장치는 최적의 냉각 속도의 결정을 가능하게 하고 재현가능한 표준 냉각을 용이하게 한다.
특정 실시 형태에서, DMSO-처리된 세포는 얼음 상에서 예비냉각되고, 냉각된 메탄올이 담긴 트레이로 옮겨질 수 있으며, 이어서 이것은 -80℃의 기계식 냉장고(예를 들어, Harris 또는 Revco)에 넣어진다. 메탄올조 및 샘플의 열전쌍 측정은 1 내지 3℃/min의 냉각 속도를 나타낸다. 적어도 2시간 후에, 시편은 -80℃의 온도에 도달하였을 수 있고 액체 질소(-196℃) 중으로 직접 넣어질 수 있다.
완전히 동결시킨 후, 세포는 장기간형 극저온 저장 용기로 신속하게 옮겨질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 샘플은 액체 질소(-196℃) 또는 증기(-1℃) 중에서 극저온 저장될 수 있다. 그러한 저장은 고효율 액체 질소 냉장고의 이용가능성에 의해 용이해진다.
세포의 조작, 동결보존, 및 장기간 저장을 위한 추가의 고려사항 및 절차는 하기의 예시적인 참고문헌에서 찾아볼 수 있다: 미국 특허 제4,199,022호; 제3,753,357호; 및 제4,559,298호; 문헌[Gorin, 1986, Clinics In Haematology 15(1):19-48; 문헌[Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, July 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp. 107-186]; 문헌[Livesey and Linner, 1987, Nature 327:255]; 문헌[Linner et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34(9):1 123-1 135]; 문헌[Simione, 1992, J. Parenter. Sci. Technol. 46(6):226-32]).
동결보존 후에, 동결된 세포는 당업자에게 알려진 방법에 따라 사용하기 위해 해동될 수 있다. 동결된 세포는 바람직하게는 신속하게 해동되고, 해동 시에 즉시 냉각된다. 특정 실시 형태에서, 동결된 세포가 담긴 바이알은 온수조 중에 그의 목부까지 침지될 수 있으며; 세포 현탁액이 해동되어 온수로부터 내부 얼음 덩어리로 열전달을 증가시킴에 따라 온화한 회전이 세포 현탁액의 혼합을 보장할 것이다. 얼음이 완전히 녹자마자, 바이알은 얼음 상에 즉시 놓일 수 있다.
특정 실시 형태에서, 해동 동안 세포 덩어리 형성을 방지하기 위해 방법들이 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 동결 전 및/또는 후에 하기를 첨가하는 것을 포함한다: DNase(문헌[Spitzer et al., 1980, Cancer 45:3075-3085]), 저분자량 덱스트란 및 시트레이트, 하이드록시에틸 전분(문헌[Stiff et al., 1983, Cryobiology 20:17-24]) 등. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 인간에게 독성인 동결보호제가 사용되는 경우, 그것은 치료적 사용 전에 제거되어야 한다. DMSO는 심각한 독성을 갖지 않는다.
예시적인 담체 및 세포 투여 방식은 미국 특허 출원 공개 제2010/0183564호의 14 및 15 페이지에 기재되어 있다. 추가의 약제학적 담체는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다.
특정 실시 형태에서, 세포는 배양 배지로부터 수집되고, 세척되고 치료적 유효량으로 담체 내로 농축될 수 있다. 예시적인 담체는 식염수, 완충 식염수, 생리 식염수, 물, 행크 용액(Hanks' solution), 링거액, Nonnosol-R(Abbott Labs), Plasma-Lyte A(R)(미국 일리노이주 모턴 그로브 소재의 Baxter Laboratories, Inc.), 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 담체에는 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 인간 혈청 성분 또는 소태아 혈청이 보충될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 주입용 담체는 5% HAS 또는 덱스트로스를 함유하는 완충 식염수를 포함한다. 추가의 등장제는 다가 당 알코올을 포함하며, 이에는 3가 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리스리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 또는 만니톨이 포함된다.
담체는 완충제, 예컨대 시트르산염 완충제, 석신산염 완충제, 타르트산염 완충제, 푸마르산염 완충제, 글루콘산염 완충제, 옥살산염 완충제, 락트산염 완충제, 아세트산염 완충제, 인산염 완충제, 히스티딘 완충제, 및/또는 트라이메틸아민 염을 포함할 수 있다.
안정제는 폭넓은 카테고리의 부형제를 지칭하며, 이는 기능상 벌킹제(bulking agent)에서 용기 벽에 대한 세포 접착을 방지하는 것을 돕는 첨가제에 이르기까지의 범위일 수 있다. 전형적인 안정제는 다가 당 알코올; 아미노산, 예컨대 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 및 트레오닌; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 및 사이클리톨, 예컨대 이노시톨; PEG; 아미노산 중합체; 황-함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, 알파-모노티오글리세롤, 및 티오황산나트륨; 저분자량 폴리펩티드(즉, 10개 미만의 잔기); 단백질, 예컨대 HSA, 소혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 예컨대 자일로스, 만노스, 프룩토스 및 글루코스; 이당류, 예컨대 락토스, 말토스 및 수크로스; 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트란을 포함할 수 있다.
필요하거나 유익한 경우, 조성물은 주사 부위에서 통증을 덜기 위하여 국소 마취제, 예컨대 리도카인을 포함할 수 있다.
예시적인 방부제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜탄올을 포함한다.
조성물 내의 세포의 치료적 유효량은 102개 초과의 세포, 103개 초과의 세포, 104개 초과의 세포, 105개 초과의 세포, 106개 초과의 세포, 107개 초과의 세포, 108개 초과의 세포, 109개 초과의 세포, 1010개 초과의 세포, 또는 1011개 초과의 세포일 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 제형에서, 세포는 일반적으로 1 리터 이하, 500 ml 이하, 250 ml 이하 또는 100 ml 이하의 부피이다. 따라서, 투여된 세포의 밀도는 전형적으로 104개의 세포/ml 초과, 107개의 세포/ml 초과, 또는 108개의 세포/ml 초과이다.
본 명세서에 기재된 caTCR 및/또는 CSR 및/또는 SSE를 인코딩하는 임의의 핵산을 포함하는 핵산 조성물(예컨대, 약제학적 조성물, 이는 본 명세서에서 제형으로도 지칭됨)이 또한 본 명세서에 제공된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 실시 형태에서, 핵산 조성물은 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정제, 완충제, 및/또는 방부제; 및/또는 수성 비히클, 예컨대 정제수, 수성 당 용액, 완충 용액, 생리 식염수, 수성 중합체 용액, 또는 RNase 무함유 물 중 임의의 것을 추가로 포함한다. 첨가되는 그러한 첨가제 및 수성 비히클의 양은 핵산 조성물의 사용 형태에 따라 적합하게 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 제형은, 예를 들어 주사, 주입, 관류, 또는 세척에 의한 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물 및 제형은 골수, 정맥내, 진피내, 동맥내, 결절내, 림프내, 복막내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 경막내, 종양내, 근육내, 방광내, 및/또는 피하 주사를 위해 추가로 제형화될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균성이어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
caTCR + CSR 면역 세포를 사용한 치료 방법
본 발명의 caTCR + CSR 면역 세포는, 예를 들어 암 및 감염성 질병(예컨대, 바이러스성 감염)을 포함한, 표적 항원(TA) 발현과 관련된 질병 및/또는 장애(본 명세서에서 "표적-항원 양성" 또는 "TA-양성" 질병 또는 장애로도 지칭됨)를 치료하기 위해 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에게 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 출원은 개체에서 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어, 부신피질 암종, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결직장암, 식도암, 교아세포종, 신경교종, 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 췌장암, 크롬친화세포종, 형질세포종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 육종, 위암, 자궁암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 바이러스성 감염은, 예를 들어, 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), B형 간염 바이러스(HBV), 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 전염성 연속종 바이러스(MCV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1(HTLV-1), HIV(인간 면역결핍 바이러스), 및 C형 간염 바이러스(HCV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 야기된다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR은 αβ TCR이고, 제1 및 제2 TCR-TM은 TCR α 및 β 하위단위 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, TCR은 γδ TCR이고, 제1 및 제2 TCR-TM은 TCR γ 및 δ 하위단위 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 연결 펩티드 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함하고/하거나, 제2 연결 펩티드는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 연결 펩티드 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 연결 펩티드와 제2 연결 펩티드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함하고/하거나, 제2 TCRD는 제2 TCR 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR 세포내 도메인은 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함하고/하거나, 제2 TCR 세포내 도메인은 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 세포내 도메인으로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCRD는 제1 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이고/이거나, 제2 TCRD는 제2 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위의 단편이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 T 세포 공동자극성 신호전달 서열(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, 또는 CD40으로부터의 것)을 포함하는 적어도 하나의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 안정화 도메인은 항체 도메인, 예컨대 CH1 및 CL 항체 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진한다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물, 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 항원은 질병-관련 항원, 예컨대 종양-관련 또는 바이러스-인코딩된 항원이다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면 항원은 CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원은 표면-제시된 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 펩티드/MHC 복합체는 질병-관련 항원(예컨대, 종양-관련 또는 바이러스-인코딩된 항원)으로부터 유래된 펩티드 및 MHC 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 펩티드/MHC 복합체는 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하며, 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, MHC 단백질은 MHC 클래스 I 단백질이다. 일부 실시 형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A이다. 일부 실시 형태에서, HLA-A는 HLA-A02이다. 일부 실시 형태에서, HLA-A02는 HLA-A*02:01이다. 일부 실시 형태에서, CSR의 표적 리간드는 세포 표면 항원이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, CSR의 표적 리간드와 caTCR의 표적 항원은 동일하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드와 표적 항원은 상이하다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 질병-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 암-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 또는 FCRL5이다. 일부 실시 형태에서, 암-관련 리간드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA를 포함한 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드/MHC 복합체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 면역 관문 분자이다. 일부 실시 형태에서, 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 아폽토시스 분자이다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 리간드-결합 도메인은 표적 리간드에 대한 수용체의 세포외 도메인의 전부 또는 일부분이다(또는 이로부터 유래된다). 일부 실시 형태에서, 수용체는, 예를 들어 FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, 및 TIM-3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR의 막관통 도메인은, 예를 들어 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR의 공동자극성 신호전달 도메인은 면역 세포 공동자극성 분자(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함함)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 신호전달 도메인 중 임의의 것들 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 도메인은 2개의 CSR 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 천연 발생 αβ TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 천연 발생 αβ TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 천연 발생 γδ TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 천연 발생 γδ TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 서열 번호 5의 아미노산 서열로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 caTCR 내에서 그것이 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나와 상호작용할 수 있도록 위치된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 서열 번호 7의 아미노산 서열로부터 유래된 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 8의 아미노산 서열로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 하나 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및/또는 제2 TCR-TM 각각은 서로 독립적으로 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 5개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 TCR-TM은 그의 유래가 되는 아미노산 서열과 대비하여 단일 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나는 caTCR 내에서 그것이 제2 TCR-TM 내의 치환된 아미노산들 중 적어도 하나와 상호작용할 수 있도록 위치된다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM 및 제2 TCR-TM은 표 2에 열거된 임의의 caTCR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, CSR 도메인은 표 3에 열거된 임의의 CSR에 따라 선택된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 b) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 - 항원-결합 모듈은 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 면역 세포 공동자극성 분자 단편(fCSM)을 포함하며, 공동자극성 분자 단편은 서열 번호 51 내지 56 및 86 내지 89 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 막관통 도메인은 CD8로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질 단편(fTMP)을 포함하며, 막관통 단백질 단편은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인 뒤에 오는 스페이서 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 103 또는 104의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 도메인은 표 3에 열거된 임의의 CSR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원은 CD19이다. 일부 실시 형태에서, 표적 리간드는 CD19이다. 일부 실시 형태에서, caTCR 항원-결합 모듈은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 Fab-유사 항원-결합 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원은 CD19이고, 표적 리간드는 CD19이다. 일부 실시 형태에서, CSR 리간드-결합 도메인은 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원은 CD19이고, 표적 리간드는 CD20이다. 일부 실시 형태에서, CSR 리간드-결합 도메인은 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원은 AFP 펩티드/MHC 복합체(예를 들어, AFP158/HLA-A02 복합체)이고, 표적 리간드는 GPC3이다. 일부 실시 형태에서, caTCR 항원-결합 모듈은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 Fab-유사 항원-결합 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, CSR 리간드-결합 도메인은 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
일부 실시 형태에서, CD19-관련 질병(예컨대, 암)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) CD19에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 b) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 Fab 사슬 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제2 Fab 사슬을 포함하는 Fab-유사 항원-결합 모듈 - 제1 Fab 사슬은 제1 및 제2 TCRD 중 하나에 연결되고, 제2 Fab 사슬은 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 CD19에 특이적으로 결합하는 scFv, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 면역 세포 공동자극성 분자 단편(fCSM)을 포함하며, 공동자극성 분자 단편은 서열 번호 51 내지 56 및 86 내지 89 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 막관통 도메인은 CD8로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질 단편(fTMP)을 포함하며, 막관통 단백질 단편은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인 뒤에 오는 스페이서 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 103 또는 104의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 도메인은 표 3에 열거된 임의의 CSR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, CSR 리간드-결합 도메인은 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, CD19-관련 질병은 백혈병, 예를 들어 급성 림프아구성 백혈병(ALL)이다.
일부 실시 형태에서, CD19/CD20-관련 질병(예컨대, 암)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) CD19에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 b) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 Fab 사슬 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제2 Fab 사슬을 포함하는 Fab-유사 항원-결합 모듈 - 제1 Fab 사슬은 제1 및 제2 TCRD 중 하나에 연결되고, 제2 Fab 사슬은 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 면역 세포 공동자극성 분자 단편(fCSM)을 포함하며, 공동자극성 분자 단편은 서열 번호 51 내지 56 및 86 내지 89 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 막관통 도메인은 CD8로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질 단편(fTMP)을 포함하며, 막관통 단백질 단편은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인 뒤에 오는 스페이서 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 103 또는 104의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 도메인은 표 3에 열거된 임의의 CSR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, CSR 리간드-결합 도메인은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
일부 실시 형태에서, AFP/GPC3-관련 질병(예컨대, 암, 예를 들어 간암)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) AFP 펩티드/MHC 복합체(예를 들어, AFP158/HLA-A02 복합체)에 특이적으로 결합하는 caTCR 및 b) 키메라 신호전달 수용체(CSR)를 표면 상에 제시하는 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, a) caTCR은 i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 제1 TCR-TM을 포함하는 제1 TCRD 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD - 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있는 TCRM을 형성함 -, 및 b) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제1 Fab 사슬 및 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제2 Fab 사슬을 포함하는 Fab-유사 항원-결합 모듈 - 제1 Fab 사슬은 제1 및 제2 TCRD 중 하나에 연결되고, 제2 Fab 사슬은 다른 하나의 TCRD에 연결됨 - 을 포함하고; b) CSR은 i) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 GPC3에 특이적으로 결합하는 scFv, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 면역 세포 공동자극성 분자 단편(fCSM)을 포함하며, 공동자극성 분자 단편은 서열 번호 51 내지 56 및 86 내지 89 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 막관통 도메인은 CD8로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, CSR은 막관통 단백질 단편(fTMP)을 포함하며, 막관통 단백질 단편은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 도메인 뒤에 오는 스페이서 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 103 또는 104의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR 도메인은 표 3에 열거된 임의의 CSR에 따라 선택된다. 일부 실시 형태에서, CSR 리간드-결합 도메인은 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
표적 항원-관련 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 또한 고려되며, 상기 방법은 상이한 caTCR 및/또는 상이한 CSR을 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 개체에서 표적 항원-관련 질병을 치료하기 위한 임의의 방법에 따르면, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 이종 caTCR + CSR 면역 세포 조성물이다.
일부 실시 형태에서, 개체는 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 임상 환자, 임상 시험 지원자, 실험 동물 등이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 약 60세보다 어리다(예를 들어, 약 50, 40, 30, 25, 20, 15, 또는 10세 중 어느 하나보다 어린 나이를 포함함). 일부 실시 형태에서, 개체는 약 60세보다 나이가 많다(예를 들어, 약 70, 80, 90, 또는 100세 중 어느 하나보다 많은 나이를 포함함). 일부 실시 형태에서, 개체는 본 명세서에 기재된 질병 또는 장애(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염) 중 하나 이상으로 진단되거나 또는 환경적으로 또는 유전자적으로 그것에 걸리기 쉽다. 일부 실시 형태에서, 개체는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 위험 인자를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 표적 항원 발현을 수반하는 질병 또는 장애를 치료하기 위하여 제2, 제3, 또는 제4 작용제(예를 들어, 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 화학요법제를 포함함)와 병용하여 투여된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 사이토카인(예컨대, IL-2)과 병용하여 투여된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물은 MHC 단백질의 발현을 증가시키고/시키거나 MHC 단백질에 의한 펩티드의 표면 제시를 향상시키는 작용제와 병용하여 투여된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는, 예를 들어 IFN 수용체 효능제, Hsp90 억제제, p53 발현 증강제, 및 화학요법제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 IFN 수용체 효능제이며, 이에는, 예를 들어 IFNγ, IFNβ, 및 IFNα가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 Hsp90 억제제이며, 이에는, 예를 들어, 타네스피마이신(17-AAG), 알베스피마이신(17-DMAG), 레타스피마이신(IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932(CUDC-305), PU-H71, 가네테스핍(STA-9090), NVP-AUY922(VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248, 및 XL888이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 p53 발현 증강제이며, 이에는, 예를 들어 5-플루오로우라실 및 누틀린-3이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 화학요법제이며, 이에는, 예를 들어 토포테칸, 에토포시드, 시스플라틴, 파클리탁셀, 및 빈블라스틴이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-양성 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 사이토카인(예컨대, IL-2)과 병용하여 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물과 사이토카인은 동시에 투여된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물과 사이토카인은 순차적으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-양성 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법에서 표적 항원을 발현하는 세포는 표적 항원 및 MHC 클래스 I 단백질을 포함하는 복합체를 그의 표면 상에 정상적으로 제시하지 않거나 비교적 낮은 수준으로 제시하며, 상기 방법은, MHC 클래스 I 단백질의 발현을 증가시키고/시키거나 MHC 클래스 I 단백질에 의한 표적 항원의 표면 제시를 향상시키는 작용제와 병용하여 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제는, 예를 들어 IFN 수용체 효능제, Hsp90 억제제, p53 발현 증강제, 및 화학요법제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 IFN 수용체 효능제이며, 이에는, 예를 들어 IFNγ, IFNβ, 및 IFNα가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 Hsp90 억제제이며, 이에는, 예를 들어, 타네스피마이신(17-AAG), 알베스피마이신(17-DMAG), 레타스피마이신(IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932(CUDC-305), PU-H71, 가네테스핍(STA-9090), NVP-AUY922(VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248, 및 XL888이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 p53 발현 증강제이며, 이에는, 예를 들어 5-플루오로우라실 및 누틀린-3이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 화학요법제이며, 이에는, 예를 들어 토포테칸, 에토포시드, 시스플라틴, 파클리탁셀, 및 빈블라스틴이 포함된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물과 작용제는 동시에 투여된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포 조성물과 작용제는 순차적으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 실시 형태에 따른 caTCR 및 CSR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 유전자 전달을 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참조하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
암 치료는, 예를 들어 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 지속기간, 무진행 생존율, 전체 반응 속도, 반응 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다. 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법이 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 방사선 영상화를 통한 반응의 측정이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 치료 효능은 식 100 - (T/C × 100)을 사용하여 계산된 % 종양 성장 억제(%TGI)로서 측정되며, 여기서 T는 처리된 종양의 평균 상대 종양 부피이고, C는 처리되지 않은 종양의 평균 상대 종양 부피이다. 일부 실시 형태에서, %TGI는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 또는 95% 초과이다.
바이러스성 감염 치료는, 예를 들어 바이러스 부하, 생존 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다.
질병
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 표적 항원과 관련된 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않은 종양, 또는 아직 실질적으로 혈관화되지 않은 종양뿐만 아니라, 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비고형 종양(예컨대, 혈액학적 종양, 예를 들어 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나, 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 caTCR + CSR 면역 세포로 치료되는 암의 유형은 암종, 아세포종, 및 육종, 및 소정의 백혈병 또는 림프계 악성 질병, 양성 및 악성 종양, 및 악성 질병, 예를 들어 육종, 암종, 및 흑색종을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적(또는 혈행성) 암의 예에는 백혈병 - 급성 백혈병(예컨대, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예컨대, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병)을 포함함 -, 진성적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(무통성 및 고분화도 형태), 다발성 골수종, 형질세포종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질병, 골수이형성 증후군, 모발상 세포 백혈병 및 골수이형성증이 포함된다.
고형 종양은 낭포 또는 액체 영역을 통상 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형은 그들을 형성하는 세포 유형(예컨대, 육종, 암종, 및 림프종)으로 명명된다. 고형 종양, 예컨대 육종 및 암종의 예에는 부신피질 암종, 담관암종, 섬유육종, 점액육종, 지질육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 위암, 림프계 악성 질병, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 갑상선암(예를 들어, 수질성 갑상선 암종 및 유두상 갑상선 암종), 크롬친화세포종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암종(hepatoma), 담관 암종, 융모막암종, 빌름스 종양, 자궁경부암(예를 들어, 자궁경부 암종 및 비침윤성 자궁경부 이형성증), 결직장암, 항문, 항문관, 또는 직장항문의 암, 질암, 외음부암(예를 들어, 편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 및 섬유육종), 음경암, 구인두암, 식도암, 두부암(예를 들어, 편평 세포 암종), 경부암(예를 들어, 편평 세포 암종), 고환암(예를 들어, 정상피종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 라이디히 세포 종양, 섬유종, 섬유선종, 선종양(adenomatoid) 종양, 및 지방종), 방광 암종, 신장암, 흑색종, 자궁암(예를 들어, 자궁내막 암종), 요로상피암(예를 들어, 편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종, 요관암, 및 방광암), 및 CNS 종양(예컨대, 신경교종(예컨대, 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교아세포종(다형성 교아세포종(glioblastoma multiforme)으로도 알려짐), 성상세포종, CNS 림프종, 배아종, 수아세포종, 슈반세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이)이 포함된다.
암 치료는, 예를 들어 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 지속기간, 무진행 생존율, 전체 반응 속도, 반응 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다. 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법이 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 방사선 영상화를 통한 반응의 측정이 포함된다.
다른 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 병원체-관련(예컨대, 바이러스-인코딩된) 항원을 표적화함으로써 감염성 질병을 치료하는 데 유용할 수 있다. 예방되거나 치료될 감염은, 예를 들어 바이러스, 세균, 원생동물, 또는 기생충에 의해 야기될 수 있다. 표적 항원은 병원체에 의해 야기되는 질병의 원인이 되는 병원성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있거나, 병원균에 의해 감염된 숙주에서 면역학적 반응을 유도할 수 있다. caTCR + CSR 면역 세포에 의해 표적화될 수 있는 병원성 항원은 하기로부터 유래된 항원을 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 아나플라스마 속(Anaplasma genus), 아나플라스마 파고시토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 안실로스토마 브라질리엔세(Ancylostoma braziliense), 안실로스토마 두오데날레(Ancylostoma duodenale), 아르카노박테리움 하이몰리티쿰(Arcanobacterium haemolyticum), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 아스페르길루스 속(Aspergillus genus), 아스트로바이러스 과(Astroviridae), 바베시아 속(Babesia genus), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라이(Bartonella henselae), BK 바이러스, 블라스토시스티스 호미니스(Blastocystis hominis), 블라스토미세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 속(Borrelia genus), 보렐리아 종(Borrelia spp), 브루셀라 속(Brucella genus), 브루기아 말라이이(Brugia malayi), 부니아바이러스 과(Bunyaviridae family), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 및 다른 부르크홀데리아 종, 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 칼리시바이러스 과(Caliciviridae family), 캄필로박터 속(Campylobacter genus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 종(Candida spp), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아이(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), CJD 프리온, 클로노르키스 시넨시스(Clonorchis sinensis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 종(Clostridium spp), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 콕시디오이데스 종(Coccidioides spp), 코로나바이러스, 코리네박테리움 디프테리아이(Corynebacterium diphtheriae), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 크림-콩고 출혈성 열병 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토스포리디움 속(Cryptosporidium genus), 거대세포바이러스(CMV), 뎅기 바이러스(DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 디엔타모에바 프라길리스(Dientamoeba fragilis), 에볼라바이러스(EBOV), 에키노콕쿠스 속(Echinococcus genus), 에를리키아 차핀시스(Ehrlichia chaffeensis), 에를리키아 에윈기이(Ehrlichia ewingii), 에를리키아 속(Ehrlichia genus), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 엔테로콕쿠스 속(Enterococcus genus), 엔테로바이러스 속(Enterovirus genus), 엔테로바이러스, 주로 콕사키 A 바이러스 및 엔테로바이러스 71(EV71), 에피데르모피톤 종(Epidermophyton spp), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O157:H7, O111 및 O104:H4, 파스시올라 헤파티카(Fasciola hepatica) 및 파스시올라 기간티카(Fasciola gigantica), FFI 프리온, 사상충상 아과(Filarioidea superfamily), 플라비바이러스, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테리움 속(Fusobacterium genus), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 기아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis), 그나토스토마 종(Gnathostoma spp), GSS 프리온, 구아나리토 바이러스, 하이모필루스 두크레이이(Haemophilus ducreyi), 하이모필루스 인플루엔자이(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 헤니파바이러스(Henipavirus)(헨드라 바이러스 니파 바이러스), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1 및 2(HSV-1 및 HSV-2), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), HIV(인간 면역결핍 바이러스), 호르타이아 웨르넥키이(Hortaea werneckii), 인간 보카바이러스(HBoV), 인간 헤르페스바이러스 6(HHV-6) 및 인간 헤르페스바이러스 7(HHV-7), 인간 메타뉴모바이러스(hMPV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1(HTLV-1), 일본 뇌염 바이러스, JC 바이러스, 주닌 바이러스, 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV), 킹겔라 킹가이(Kingella kingae), 클렙시엘라 그라눌로마티스(Klebsiella granulomatis), 쿠루 프리온, 라사 바이러스, 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레이시마니아 속(Leishmania genus), 렙토스피라 속(Leptospira genus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 마쿠포 바이러스, 말라세지아 종(Malassezia spp), 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 메타고니무스 요카가와이(Metagonimus yokagawai), 미크로스포리디아 필룸(Microsporidia phylum), 몰루스쿰 콘타기오숨(Molluscum contagiosum) 바이러스(MCV), 볼거리 바이러스, 미코박테리움 레프라이(Mycobacterium leprae) 및 미코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 미코플라스마 뉴모니아이(Mycoplasma pneumoniae), 나이글레리아 포울레리(Naegleria fowleri), 네카토르 아메리카누스(Necator americanus), 네이세리아 고노로에아이(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 노카르디아종(Nocardia spp), 온코세르카 볼불루스(Onchocerca volvulus), 오리엔티아 트수트수가무시(Orientia tsutsugamushi), 오르토믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae family)(인플루엔자), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 파라고니무스 종(Paragonimus spp), 파라고니무스 웨스테르마니(Paragonimus westermani), 파보바이러스 B19, 파스테우렐라 속(Pasteurella genus), 플라스모디움 속(Plasmodium genus), 뉴모시스티스 지로벡시이(Pneumocystis jirovecii), 폴리오바이러스, 라비에스 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 리노바이러스, 리노바이러스류, 리케치아 아카리(Rickettsia akari), 리케치아 속(Rickettsia genus), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 티피(Rickettsia typhi), 리프트 밸리 열 바이러스, 로타바이러스, 풍진 바이러스, 사비아 바이러스, 살모넬라 속(Salmonella genus), 사르콥테스 스카비에이(Sarcoptes scabiei), SARS 코로나바이러스, 스키스토소마 속(Schistosoma genus), 시겔라 속(Shigella genus), 신 놈브레 바이러스, 한타바이러스, 스포로트릭스 스켄키이(Sporothrix schenckii), 스타필로콕쿠스 속(Staphylococcus genus), 스타필로콕쿠스 속(Staphylococcus genus), 스트렙토콕쿠스 아갈락티아이(Streptococcus agalactiae), 스트렙토콕쿠스 뉴모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트롱길로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis), 타이니아 속(Taenia genus), 타이니아 솔리움(Taenia solium), 진드기-매개 뇌염 바이러스(TBEV), 톡소카라 카니스(Toxocara canis) 또는 톡소카라 카티(Toxocara cati), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 트리코피톤 종(Trichophyton spp), 트리쿠리스 트리키우라(Trichuris trichiura), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 우레아플라스마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 바리셀라 조스터(Varicella zoster) 바이러스(VZV), 바리셀라 조스타(Varicella zoster) 바이러스(VZV), 바리올라 마조르(Variola major) 또는 바리올라 미노르(Variola minor), vCJD 프리온, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae), 웨스트 나일 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 우케레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 황열 바이러스, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis).
일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포는 발암성 감염성 질병, 예컨대 발암성 바이러스에 의한 감염을 치료하는 데 사용된다. 발암성 바이러스는 CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1, 및 HCV를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. caTCR의 표적 항원은 바이러스성 발암단백질일 수 있으며, 이에는 Tax, E7, E6/E7, E6, HBx, EBNA 단백질(예를 들어, EBNA3 A, EBNA3 C, 및 EBNA 2), v-사이클린, LANA1, LANA2, LMP-1, K-bZIP, RTA, KSHV K8, 및 이들의 단편이 포함되지만 이로 한정되지 않는다(문헌[Ahuja, Richa, et al., Curr. Sci., 2014] 참조).
제조 물품 및 키트
본 발명의 일부 실시 형태에서, 표적 항원-양성 질병, 예컨대 암(예를 들어, 부신피질 암종, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결직장암, 식도암, 교아세포종, 신경교종, 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 췌장암, 크롬친화세포종, 형질세포종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 육종, 위암, 자궁암 또는 갑상선암) 또는 바이러스성 감염(예를 들어, CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1, 또는 HCV에 의한 감염)의 치료에 유용한 물질들이 담긴 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 첨부 문서(package insert)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에 기재된 질병 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 하피(hypodermic) 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포이다. 라벨 또는 첨부 문서는 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 첨부 문서는 환자에게 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 본 명세서에 기재된 병용 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
첨부 문서는 해당 치료적 제품의 사용에 관한 표시, 용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 경고에 관한 정보가 들어 있는 치료적 제품의 시판용 패키지에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 첨부 문서는 조성물이 표적 항원-양성 암(예컨대, 부신피질 암종, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결직장암, 식도암, 교아세포종, 신경교종, 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 췌장암, 크롬친화세포종, 형질세포종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 육종, 위암, 자궁암 또는 갑상선암)을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 다른 실시 형태에서, 첨부 문서는 조성물이 표적 항원-양성 바이러스성 감염(예를 들어, CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1, 또는 HCV에 의한 감염)을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다.
추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정세균 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있으며, 이에는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기가 포함된다.
또한, 다양한 목적에, 예를 들어 본 명세서에 기재된 표적 항원-양성 질병 또는 장애의 치료에 유용한 키트가, 선택적으로 제조 물품과 조합하여 제공된다. 본 발명의 키트는 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기(또는 단위 투여 형태 및/또는 제조 물품)를 포함하며, 일부 실시 형태에서는 다른 작용제(예컨대, 본 명세서에 기재된 작용제) 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 첨부 문서(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 쓰여진 설명서이지만, 기계-판독가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 담긴 설명서)가 또한 허용가능하다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 키트는 caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포를 포함하는 조성물, 및 b) 유효량의 적어도 하나의 다른 작용제를 포함하며, 다른 작용제는 MHC 단백질의 발현을 증가시키고/시키거나 MHC 단백질(예를 들어, IFNγ, IFNβ, IFNα, 또는 Hsp90 억제제)에 의한 펩티드의 표면 제시를 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포를 포함하는 조성물, 및 b) 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 위하여 개체에게 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포를 포함하는 조성물, b) 유효량의 적어도 하나의 다른 작용제 - 다른 작용제는 MHC 단백질의 발현을 증가시키고/시키거나 MHC 단백질(예를 들어, IFNγ, IFNβ, IFNα, 또는 Hsp90 억제제)에 의한 펩티드의 표면 제시를 향상시킴 -, 및 c) 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 위하여 개체에게 caTCR + CSR 면역 세포 조성물 및 다른 작용제(들)를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. caTCR + CSR 면역 세포 조성물과 다른 작용제(들)는 별개의 용기 내에 또는 단일 용기 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나의 별개의 조성물을 포함하거나, 또는 2개 이상의 조성물을 포함할 수 있는데, 여기서 하나의 조성물은 caTCR + CSR 면역 세포를 포함하고 다른 조성물은 다른 작용제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 포함하는 하나 이상의 조성물, 및 b) caTCR 및 CSR을 면역 세포(예컨대, 개체로부터 유래된 면역 세포, 예를 들어 T 세포 또는 자연 살해 세포)와 배합하여 caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포를 포함하는 조성물을 형성하는 것, 및 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 포함하는 하나 이상의 조성물, 및 b) 면역 세포(예컨대, 세포독성 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 포함하는 하나 이상의 조성물, b) 면역 세포(예컨대, 세포독성 세포), 및 c) caTCR 및 CSR을 면역 세포와 배합하여 caTCR 및 CSR을 표면 상에 제시하는 면역 세포를 포함하는 조성물을 형성하는 것, 및 caTCR + CSR 면역 세포 조성물을 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 caTCR 및 CSR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트), 및 b) 핵산(또는 핵산 세트)을 발현시키기 위한 숙주 세포(예컨대, 면역 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트), 및 b) i) 숙주 세포(예컨대, 면역 세포, 예를 들어 T 세포) 내에서 caTCR 및 CSR을 발현시키는 것, ii) caTCR 및 CSR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) caTCR 및 CSR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 개체로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) caTCR 및 CSR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트), b) 핵산(또는 핵산 세트)을 발현시키기 위한 숙주 세포(예컨대, 면역 세포), 및 c) i) 숙주 세포 내에서 caTCR 및 CSR을 발현시키는 것, ii) caTCR 및 CSR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) caTCR 및 CSR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 표적 항원-양성 질병(예컨대, 암 또는 바이러스성 감염)의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다.
본 발명의 키트는 적합한 포장물 내에 존재한다. 적합한 포장물에는 바이알, 병, 자르(jar), 유연 포장물(예를 들어, 밀봉된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 키트는 선택적으로 추가의 성분, 예컨대 완충액 및 해석을 제공하는 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알(예컨대, 밀봉된 바이알), 병, 자르, 유연 포장물 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
caTCR + CSR 면역 세포 조성물의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 예를 들어, 연장된 기간 동안, 예컨대 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 7개월, 8개월, 9개월, 또는 그 이상 동안 중 어느 하나에서 개체의 효과적인 치료를 제공하기에 충분한 투여량으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 caTCR + CSR 면역 세포 조성물이 담긴 키트가 제공될 수 있다. 키트는 또한 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 포장된 다회 단위 용량의 caTCR 및 CSR, 및 약제학적 조성물 및 사용 설명서를 포함할 수 있다.
당업자는 몇몇 실시 형태가 본 발명의 범주 및 사상 내에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 이제, 본 발명을 하기의 비제한적인 실시예를 참조하여 더 상세히 설명할 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
예시적인 실시 형태
실시 형태 1. 일 실시 형태에서, 면역 세포가 제공되며, 상기 면역 세포는
a) 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) - 상기 caTCR은
i) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈; 및
ii) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며,
상기 TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진함 -; 및
b) 키메라 신호전달 수용체(CSR) - 상기 CSR은
i) 표적 리간드와 결합하거나 상호작용할 수 있는 리간드-결합 모듈;
ii) 막관통 모듈; 및
iii) 상기 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함하며,
상기 리간드-결합 모듈과 상기 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 동일한 분자로부터 유래되지 않고, 상기 CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 도메인이 결여되어 있음 - 를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 2. 실시 형태 1에 있어서, 상기 CSR에는 어떠한 1차 면역 세포 신호전달 서열도 결여되어 있는, 면역 세포.
실시 형태 3. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 상기 표적 항원은 세포 표면 항원인, 면역 세포.
실시 형태 4. 실시 형태 3에 있어서, 상기 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물, 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 5. 실시 형태 4에 있어서, 상기 세포 표면 항원은 CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 6. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 상기 표적 항원은 펩티드 및 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질을 포함하는 복합체인, 면역 세포.
실시 형태 7. 실시 형태 6에 있어서, 상기 펩티드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 8. 실시 형태 1 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 TCR-TM은 제1 T 세포 수용체의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래되고, 상기 제2 TCR-TM은 상기 제1 T 세포 수용체의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 9. 실시 형태 8에 있어서, 상기 TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적인, 면역 세포.
실시 형태 10. 실시 형태 9에 있어서, 상기 TCRM은 상기 제1 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 하는, 면역 세포.
실시 형태 11. 실시 형태 8 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개의 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 상기 제2 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개의 아미노산 치환을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 12. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 TCR-TM은 단일 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 상기 제2 TCR-TM은 단일 아미노산 치환을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 13. 실시 형태 8 내지 실시 형태 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 T 세포 수용체는 γ/δ T 세포 수용체인, 면역 세포.
실시 형태 14. 실시 형태 8 내지 실시 형태 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 T 세포 수용체는 α/β T 세포 수용체인, 면역 세포.
실시 형태 15. 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원-결합 모듈은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 모이어티인, 면역 세포.
실시 형태 16. 실시 형태 15에 있어서, 상기 항원-결합 모듈은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 상기 VH 도메인은 상기 TCRD들 중 하나의 아미노-말단에 연결되고, 상기 VL 도메인은 다른 하나의 TCRD의 아미노-말단에 연결되는, 면역 세포.
실시 형태 17. 실시 형태 16에 있어서, 상기 VH 도메인은 CH1 도메인을 통해 TCRD들 중 하나에 연결되고, 상기 VL 도메인은 CL 도메인을 통해 다른 하나의 TCRD에 연결되는, 면역 세포.
실시 형태 18. 실시 형태 15에 있어서, 상기 caTCR은 적어도 하나의 추가의 항원-결합 모듈을 추가로 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 19. 실시 형태 18에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 항원-결합 모듈은 항체 모이어티인, 면역 세포.
실시 형태 20. 실시 형태 18 또는 실시 형태 19에 있어서, 상기 caTCR은 다중특이성인, 면역 세포.
실시 형태 21. 실시 형태 15 내지 실시 형태 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원-결합 모듈은 상기 TCRD들 중 하나의 아미노-말단에 융합된 scFv를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 22. 실시 형태 21에 있어서, 상기 caTCR은 상기 제1 TCRD의 아미노-말단에 융합된 제1 scFv 및 상기 제2 TCRD의 아미노-말단에 융합된 제2 scFv를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 23. 실시 형태 22에 있어서, 상기 제1 scFv는 상기 제2 scFv와 상이한 표적에 결합하는, 면역 세포.
실시 형태 24. 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR은 상기 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 상기 항원-결합 모듈은 상기 제1 TCRD 및 상기 제2 TCRD 중 하나 또는 둘 모두의 아미노-말단에 연결되는, 면역 세포.
실시 형태 25. 실시 형태 1 내지 실시 형태 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 상기 제1 안정화 도메인과 상기 제2 안정화 도메인은 상기 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는, 면역 세포.
실시 형태 26. 실시 형태 25에 있어서, 상기 안정화 모듈은 CH1-CL 모듈, CH2-CH2 모듈, CH3-CH3 모듈, 및 CH4-CH4 모듈로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 27. 실시 형태 25 또는 실시 형태 26에 있어서, 상기 제1 안정화 도메인과 상기 제2 안정화 도메인 사이에 공유 결합이 존재하는, 면역 세포.
실시 형태 28. 실시 형태 27에 있어서, 상기 공유 결합은 이황화물 결합인, 면역 세포.
실시 형태 29. 실시 형태 25 내지 실시 형태 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 안정화 모듈은 상기 항원-결합 모듈과 상기 TCRM 사이에 위치되는, 면역 세포.
실시 형태 30. 실시 형태 25 내지 실시 형태 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR은
a) 상기 제1 TCRD의 아미노-말단에 융합된 제1 안정화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 TCRD의 아미노-말단에 융합된 제2 안정화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 상기 항원-결합 모듈은 상기 제1 안정화 도메인 및 상기 제2 안정화 도메인 중 하나 또는 둘 모두의 아미노-말단에 융합되는, 면역 세포.
실시 형태 31. 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 상기 표적 항원에 결합하는, 면역 세포.
실시 형태 32. 실시 형태 1 내지 실시 형태 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCR-회합 신호전달 분자는 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 33. 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원과 상기 표적 리간드는 동일한, 면역 세포.
실시 형태 34. 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원과 상기 표적 리간드는 상이한, 면역 세포.
실시 형태 35. 실시 형태 34에 있어서, 상기 표적 리간드는 상기 표적 항원을 제시하는 세포의 표면 상에서 발현되는 리간드인, 면역 세포.
실시 형태 36. 실시 형태 1 내지 실시 형태 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 리간드는 질병-관련 리간드인, 면역 세포.
실시 형태 37. 실시 형태 36에 있어서, 상기 표적 리간드는 암-관련 리간드인, 면역 세포.
실시 형태 38. 실시 형태 37에 있어서, 상기 암-관련 리간드는 CD19, CD20, CD22, CD47, IL4, GPC-3, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D, 및 FCRL5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 39. 실시 형태 37에 있어서, 상기 암-관련 리간드는 WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, 및 PSA로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드/MHC 복합체인, 면역 세포.
실시 형태 40. 실시 형태 36에 있어서, 상기 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드인, 면역 세포.
실시 형태 41. 실시 형태 1 내지 실시 형태 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 리간드는 면역조절 분자인, 면역 세포.
실시 형태 42. 실시 형태 41에 있어서, 상기 면역조절 분자는 면역억제성 수용체이고, 상기 CSR은 상기 면역억제성 수용체의 길항제인, 면역 세포.
실시 형태 43. 실시 형태 41에 있어서, 상기 면역조절 분자는 면역자극성 수용체이고, 상기 CSR은 상기 면역억제성 수용체의 효능제인, 면역 세포.
실시 형태 44. 실시 형태 41에 있어서, 상기 표적 리간드는 면역 관문 분자인, 면역 세포.
실시 형태 45. 실시 형태 44에 있어서, 상기 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, ICOSL, B7-H3, B7-H4, HVEM, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40, 및 GAL9로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 46. 실시 형태 41에 있어서, 상기 표적 리간드는 억제성 사이토카인, 면역 세포.
실시 형태 47. 실시 형태 1 내지 실시 형태 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 리간드는 아폽토시스 분자인, 면역 세포.
실시 형태 48. 실시 형태 47에 있어서, 상기 아폽토시스 분자는 FasL, FasR, TNFR1, 및 TNFR2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 49. 실시 형태 1 내지 실시 형태 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 리간드-결합 모듈은 항체 모이어티인, 면역 세포.
실시 형태 50. 실시 형태 49에 있어서, 상기 CSR의 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 및 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 51. 실시 형태 50에 있어서, 상기 CSR의 항체 모이어티는 scFv인, 면역 세포.
실시 형태 52. 실시 형태 1 내지 실시 형태 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 리간드-결합 모듈은 수용체의 세포외 도메인으로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 53. 실시 형태 52에 있어서, 상기 수용체는 FasR, TNFR1, TNFR2, PD-1, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD27, TIM-3, IL-10R, IL-6R, 및 IL-4R로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 54. 실시 형태 1 내지 실시 형태 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 CSR의 막관통 모듈은 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 55. 실시 형태 1 내지 실시 형태 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 TCR의 공동자극성 수용체의 세포내 도메인으로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 56. 실시 형태 55에 있어서, 상기 공동자극성 수용체는 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, CD27, 및 CD40으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 57. 실시 형태 1 내지 실시 형태 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 CSR의 발현은 유도가능한, 면역 세포.
실시 형태 58. 실시 형태 57에 있어서, 상기 CSR의 발현은 상기 면역 세포의 활성화 시에 유도가능한, 면역 세포.
실시 형태 59. 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR의 항원-결합 모듈은 CD19에 결합하는 항체 모이어티를 포함하고, 상기 CSR의 리간드-결합 모듈은 CD19에 결합하는 scFv를 포함하고, 상기 막관통 모듈 및 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 둘 모두 CD28로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 60. 실시 형태 59에 있어서, CD19에 결합하는 상기 항체 모이어티는 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CD19에 결합하는 상기 scFv는 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 CSR은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 61. 실시 형태 60에 있어서, 상기 caTCR은 서열 번호 72 및 73 또는 서열 번호 74 및 75의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고/포함하거나, 상기 CSR은 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 62. 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR의 항원-결합 모듈은 AFP에 결합하는 항체 모이어티를 포함하고, 상기 CSR의 리간드-결합 모듈은 GPC3에 결합하는 scFv를 포함하고, 상기 막관통 모듈 및 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 둘 모두 CD28로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 63. 실시 형태 62에 있어서, AFP에 결합하는 상기 항체 모이어티는 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, GPC3에 결합하는 상기 scFv는 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 CSR은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 64. 실시 형태 63에 있어서, 상기 caTCR은 서열 번호 68 및 69 또는 서열 번호 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고/포함하거나, 상기 CSR은 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 65. 실시 형태 1 내지 실시 형태 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 caTCR의 항원-결합 모듈은 CD19에 결합하는 항체 모이어티를 포함하고, 상기 CSR의 리간드-결합 모듈은 CD20에 결합하는 scFv를 포함하고, 상기 막관통 모듈 및 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 둘 모두 CD28로부터 유래되는, 면역 세포.
실시 형태 66. 실시 형태 65에 있어서, CD19에 결합하는 상기 항체 모이어티는 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CD20에 결합하는 상기 scFv는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 CSR은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CD28의 단편을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 67. 실시 형태 66에 있어서, 상기 caTCR은 서열 번호 72 및 73 또는 서열 번호 74 및 75의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고/포함하거나, 상기 CSR은 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 68. 일 실시 형태에서, 실시 형태 1 내지 실시 형태 67 중 어느 하나의 caTCR 및 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 제공되며, 상기 caTCR 및 CSR 각각은 상기 하나 이상의 핵산에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다.
실시 형태 69. 일 실시 형태에서, 하나 이상의 핵산이 제공되며, 상기 하나 이상의 핵산은
a) 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) - 상기 caTCR은
i) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈; 및
ii) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, 상기 TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진하고, 상기 caTCR은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어짐 -; 및
b) 키메라 신호전달 수용체(CSR) - 상기 CSR은
i) 표적 리간드와 결합하거나 상호작용할 수 있는 리간드-결합 모듈;
ii) 막관통 모듈; 및
iii) 상기 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함하며, 상기 리간드-결합 모듈과 상기 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 동일한 분자로부터 유래되지 않고, 상기 CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 서열이 결여되어 있고, 상기 CSR은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어짐 - 를 인코딩한다.
실시 형태 70. 실시 형태 68 또는 실시 형태 69에 있어서, 상기 caTCR과 CSR은 동일한 핵산 분자 상에서 인코딩되는, 하나 이상의 핵산.
실시 형태 71. 실시 형태 68 또는 실시 형태 69에 있어서, 상기 caTCR과 CSR은 상이한 핵산 분자 상에서 인코딩되는, 하나 이상의 핵산.
실시 형태 72. 실시 형태 68 내지 실시 형태 71 중 어느 하나에 있어서, 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 CSR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산.
실시 형태 73. 실시 형태 72에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 상기 면역 세포의 활성화 시에 유도가능한, 하나 이상의 핵산.
실시 형태 74. 실시 형태 72에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 활성화된 T-세포(NFAT)-유래 프로모터의 핵-인자인, 하나 이상의 핵산.
실시 형태 75. 일 실시 형태에서, 실시 형태 68 내지 실시 형태 74 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다.
실시 형태 76. 실시 형태 75에 있어서, 상기 벡터들 중 적어도 하나는 상기 caTCR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 적어도 하나의 다른 벡터는 상기 CSR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 벡터.
실시 형태 77. 실시 형태 75에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산을 포함하는 단일 벡터를 포함하는, 하나 이상의 벡터.
실시 형태 78. 일 실시 형태에서, 실시 형태 68 내지 실시 형태 74 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산 또는 실시 형태 75 내지 실시 형태 77 중 어느 하나의 하나 이상의 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
실시 형태 79. 일 실시 형태에서, 실시 형태 68 내지 실시 형태 74 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산 또는 실시 형태 75 내지 실시 형태 77 중 어느 하나의 하나 이상의 벡터를 포함하는 면역 세포가 제공된다.
실시 형태 80. 실시 형태 79에 있어서, 상기 면역 세포는 실시 형태 68 내지 실시 형태 74 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산 또는 실시 형태 75 내지 실시 형태 77 중 어느 하나의 하나 이상의 벡터로부터 발현되는 caTCR을 추가로 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 81. 실시 형태 79 또는 실시 형태 80에 있어서, 상기 면역 세포는 실시 형태 68 내지 실시 형태 74 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산 또는 실시 형태 75 내지 실시 형태 77 중 어느 하나의 하나 이상의 벡터로부터 발현되는 CSR을 추가로 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 82. 실시 형태 1 내지 실시 형태 67 및 실시 형태 79 내지 실시 형태 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
실시 형태 83. 실시 형태 1 내지 실시 형태 67 및 실시 형태 79 내지 실시 형태 82 중 어느 하나에 있어서,
a) 상기 caTCR은 상기 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 상기 항원-결합 모듈은 상기 TCRD들 중 하나 또는 둘 모두의 아미노-말단에 연결된 1개 또는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
b) 상기 CSR은 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 면역 세포는
i) 상기 caTCR의 제1 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 서열;
ii) 상기 caTCR의 제2 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 핵산 서열; 및
iii) 상기 CSR을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 84. 실시 형태 83에 있어서,
a) 제1 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터;
b) 제2 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터; 및
c) 제3 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제3 핵산 서열을 포함하는 제3 벡터를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 85. 실시 형태 83에 있어서,
a)
i) 제1 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제1 핵산 서열; 및
ii) 제2 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제2 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및
b) 제3 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제3 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 86. 실시 형태 83에 있어서,
a) 제1 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제1 핵산 서열;
b) 제2 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제2 핵산 서열; 및
c) 제3 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제3 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 87. 실시 형태 84 내지 실시 형태 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 프로모터 및/또는 상기 제2 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터인, 면역 세포.
실시 형태 88. 실시 형태 84 내지 실시 형태 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 제3 프로모터는 유도성 프로모터인, 면역 세포.
실시 형태 89. 실시 형태 83에 있어서,
a) 단일 제1 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제1 핵산 서열 및 상기 제2 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 및
b) 제2 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제3 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 90. 실시 형태 83에 있어서,
a) 단일 제1 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제1 핵산 서열 및 상기 제2 핵산 서열; 및
b) 제2 프로모터의 제어 하에 있는 상기 제3 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 91. 실시 형태 89 또는 실시 형태 90에 있어서, 상기 제1 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터인, 면역 세포.
실시 형태 92. 실시 형태 89 내지 실시 형태 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 프로모터는 유도성 프로모터인, 면역 세포.
실시 형태 93. 실시 형태 88 또는 실시 형태 92에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 상기 면역 세포의 활성화 시에 유도가능한, 면역 세포.
실시 형태 94. 실시 형태 88 또는 실시 형태 92에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터인, 면역 세포.
실시 형태 95. 실시 형태 83에 있어서, 상기 제1 핵산 서열, 상기 제2 핵산 서열, 및 상기 제3 핵산 서열 모두가 단일 프로모터의 제어 하에 있는 상기 핵산 서열들을 포함하는 벡터를 포함하는, 면역 세포.
실시 형태 96. 실시 형태 84 내지 실시 형태 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터들은 면역 세포 게놈 내로 통합되는, 면역 세포.
실시 형태 97. 일 실시 형태에서, 실시 형태 1 내지 실시 형태 67 및 실시 형태 79 내지 실시 형태 96 중 어느 하나의 면역 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
실시 형태 98. 일 실시 형태에서, 표적 항원을 제시하는 표적 세포를 사멸시키는(또는 표적 항원-관련 질병을 치료하는) 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 표적 세포를 실시 형태 1 내지 실시 형태 67 및 실시 형태 79 내지 실시 형태 96 중 어느 하나의 면역 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시 형태 99. 실시 형태 98에 있어서, 상기 접촉은 생체내에서 수행되는, 방법.
실시 형태 100. 실시 형태 98에 있어서, 상기 접촉은 시험관내에서 수행되는, 방법.
실시 형태 101. 일 실시 형태에서, 표적 항원-관련 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 실시 형태 97의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 102. 실시 형태 101에 있어서, 상기 표적 항원-관련 질병은 암인, 방법.
실시 형태 103. 실시 형태 102에 있어서, 상기 암은 부신피질 암종, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결직장암, 식도암, 교아세포종, 신경교종, 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 췌장암, 크롬친화세포종, 형질세포종, 신경아세포종, 난소암, 전립선암, 육종, 위암, 자궁암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시 형태 104. 실시 형태 101에 있어서, 상기 표적 항원-관련 질병은 바이러스성 감염인, 방법.
실시 형태 105. 실시 형태 104에 있어서, 상기 바이러스성 감염은 거대세포바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), B형 간염 바이러스(HBV), 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 전염성 연속종 바이러스(MCV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1(HTLV-1), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 C형 간염 바이러스(HCV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 야기되는, 방법.
실시 형태 106. 실시 형태 101 내지 실시 형태 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포는 상기 개체에 대해 자가인, 방법.
실시 형태 107. 일 실시 형태에서, caTCR을 포함하거나 caTCR을 인코딩하는 핵산에 의해 형질도입된 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 실시 형태 68 내지 실시 형태 74 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산 또는 실시 형태 75 내지 실시 형태 77 중 어느 하나의 하나 이상의 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
실시예
재료 및 방법
세포 샘플, 세포주, 및 항체
세포주 HepG2(ATCC HB-8065; HLA-A2+, AFP+), SK-HEP-1(ATCC HTB-52; HLA-A2+, AFP-), Raji(ATCC CCL-86; CD19+), CA46(ATCC CRL-1648; CD19+), Jurkat(ATCC CRL-2899, CD19-), J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153), Jeko-1(ATCC CRL-3006; CD19+), THP-1(ATCC TIB-202, CD19-), Daudi(ATCC CCL-213; CD19+), HeLa (ATCC CCL-2), MDA-MB-231(ATCC HTB-26) 및 MCF-7(ATCC HTB-22)을 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수하였다. Jurkat는 T 세포 백혈병으로부터 유래된 인간 T 림프구 세포주이다. J.RT3-T3.5는 Jurkat 세포로부터 유래된 돌연변이주로서, 이는 T 세포 수용체 β 사슬이 결여되어 있다. Raji는 CD19를 발현하는 버킷 림프종 세포주이다. Raji-CD19 녹아웃(Raji-CD19KO) 세포주를 CRISPR 기술에 의해 생성하였다. 3개의 상이한 가이드 서열을 설계하여 Raji 세포에서 CD19를 표적화하였다. CRISPR-Cas9 벡터를 Origene으로부터 구매하였으며, 각각의 가이드를 pCas-가이드 벡터 내로 개별적으로 클로닝하였다. 전기천공 후 3일째에, 각각의 가이드에 의한 녹아웃의 효율을 유세포측정에 의해 평가하였으며, 최상의 CD19-녹아웃 풀을 제한 희석에 의해 클론 선택을 위해 선택하였다. 선택된 클론은 서열분석에 의해 완전한 CD19 녹아웃으로 확인되었다. 모든 세포주를 37℃/5% CO2에서 10% FBS 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM 중에서 배양하였다.
FITC 또는 APC에 접합된 인간 HLA-A02에 대한 단일클론 Ab(클론 BB7.2), 및 FITC 또는 APC에 접합된 그의 동종형 대조군 마우스 IgG 2b, 인간 또는 마우스 CD3에 대한 항체, 인간 T 세포 수용체의 다양한 하위단위, 3xFlag 태그, HA 태그, PE 또는 FITC와 접합된 염소 F(ab)2 항-인간 IgG, 형광-접합된 염소 F(ab')2 항-마우스 Ig(Invitrogen)를 구매하였다. AFP158/HLA-A*02:01-특이적 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 개발하고, Eureka Therapeutics에서 자체적으로 생성하였다. 유세포측정 데이터를 BD FACSCanto II를 사용하여 수집하고, FlowJo 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다.
모든 펩티드를 구매하고, Elim Biopharma에 의해 합성하였다. 펩티드는 90% 초과의 순도였다. 펩티드를 10 mg/mL로 식염수 중에 희석시키거나 DMSO 중에 용해시키고, -80℃에서 동결시켰다. 비오티닐화 단일쇄 AFP158/HLA-A*02:01 및 대조군 펩티드/HLA-A*02:01 복합체 단량체를, 재조합 HLA-A*02:01 및 베타-2 마이크로글로불린(β2M)으로 펩티드를 재접힘함으로써 생성하였다. 단량체는 BirA 효소에 의해 HLA-A*02:01 세포외 도메인(ECD)의 C-종결 말단에 연결된 BSP 펩티드를 통해 비오티닐화하였다. 형광-표지된 스트렙타비딘을 비오티닐화 펩티드/HLA-A*02:01 복합체 단량체와 혼합하여 형광-표지된 펩티드/HLA-A*02:01 사량체를 형성하였다.
인간 CD19-특이적 또는 AFP158/HLA-A*02:01-특이적 CAR 또는 caTCR을 함유하는 렌티바이러스를, 예를 들어, 키메라 작제물을 인코딩하는 벡터로 293T 세포를 형질감염시킴으로써 생성하였다. 1차 인간 T-세포를 100 U/ml의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에서 CD3/CD28 비드(Dynabeads®, Invitrogen)로 1일 자극 후에 형질도입에 사용하였다. 농축된 렌티바이러스를 레트로넥틴(Takara)-코팅된 6웰 플레이트 내에서 96시간 동안 T-세포에 적용하였다. 항-AFP 및 항-CD19 키메라 작제물의 형질도입 효율을 각각 PE-접합된 스트렙타비딘 또는 항-myc 항체와 함께 비오티닐화 AFP158/HLA-A*02:01 사량체("AFP158 사량체")를 사용하여, 유세포측정에 의해 평가하였다. 일수 5에 그리고 그 후 매 3 내지 4일마다 반복 유세포측정 분석을 행하였다.
세포주를 caTCR 작제물의 2개의 하위단위를 인코딩하는 1개 또는 2개의 벡터에 의해 형질도입시켰다. 형질도입 후 5일째에, 항-HA(항-HA 태그 항체 - ChIP 등급, Abcam) 또는 항-Flag 항체(토끼에서 생성된 항-Flag 항체, Sigma)를 사용하여 웨스턴 블롯을 위해 세포 용해물을 생성하였다.
종양 세포독성을 Cytox 96 비방사성 LDH 세포독성 검정(Promega)에 의해 검정하였다. CD14, CD16, CD19, CD20, CD36, CD56, CD66b, CD123, 글리코포린 A 발현 세포를 음성 고갈시키는 EasySep 인간 T 세포 단리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 PBMC-풍부화된 전혈으로부터 CD3+ T 세포를 제조하였다. 예를 들어 제조자의 프로토콜에 따라 CD3/CD28 Dynabeads(Invitrogen)를 사용하여, 인간 T 세포를 활성화시키고 증폭시켰다. 활성화된 T 세포(ATC)를 10% FBS + 100 U/ml IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지 중에서 배양 및 유지하고, 일수 7 내지 14에서 사용하였다. 활성화된 T 세포(면역 세포)와 표적 세포를 다양한 이펙터 대 표적 비(예를 들어, 2.5:1 또는 5:1)로 16시간 동안 공동배양하고 세포독성에 대해 검정하였다.
실시예 1. 키메라 항체/T 세포 수용체(caTCR) 설계
다양한 키메라 항체-T 세포 수용체(caTCR) 설계가 고려되며, 6개의 상이한 예가 도 1에 나타나 있다(caTCR-1, caTCR-2, caTCR-3, caTCR-4, caTCR-5, 및 caTCR-6). 이들 설계에서는, 다양한 항체 모이어티(Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 또는 scFv)가 T 세포 수용체 α/β 사슬 또는 γ/δ 사슬의 아미노-말단에 융합되어, T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있는 caTCR 이종이량체를 형성하는데, 이때 T 세포 수용체 α/β 사슬 또는 γ/δ 사슬에는 가변 및 불변 도메인이 결여되어 있고, 그들의 연결 펩티드(불변 도메인 뒤의 영역), 그들의 막관통 도메인, 또는 이들의 변이체, 및 임의의 세포내 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. 천연 TCR에서, Vα/Vβ 또는 Vδ/Vγ 도메인은 TCR의 항원-결합 도메인을 형성한다. 본 설계는 Vα-Cα/Vβ-Cβ 또는 Vδ-Cδ/Vγ-Cγ 영역을 다양한 항체 모이어티로 대체하고, 적어도 하나의 변이 TCR 막관통 도메인을 도입하여, 작제물에 항체의 결합 특이성을 부여하여, 단지 천연 발생 TCR 막관통 도메인만을 갖는 TCR 또는 관련 작제물과 대비하여 TCR 복합체 내의 보조 분자, 예컨대 CD3δε, CD3γε 및 CD3ζζ를 동원하는 작제물의 능력을 향상시키게 된다. caTCR 작제물을 하기와 같이 명명하였다: caTCR-[설계#]-[변이체 위치][#]. 설계# 1은 Fab 항체 모이어티를 갖는 caTCR에 상응하고, 설계# 2는 Fab' 항체 모이어티를 갖는 caTCR에 상응하고, 설계# 3은 (Fab')2 항체 모이어티를 갖는 caTCR에 상응하고, 설계# 4는 Fv 항체 모이어티를 갖는 caTCR에 상응하고, 설계# 5는 단일 scFv 항체 모이어티를 갖는 caTCR에 상응하고, 설계# 6은 2개의 scFv 항체 모이어티를 갖는 caTCR에 상응한다(도 1 참조). 변이체 위치 없음 및 # 0(예를 들어, caTCR-1-0)은 천연 발생 TCR 도메인을 갖는 작제물에 상응하고, # 1 이상은 변이체 위치에서 특이적 변이체를 갖는 caTCR에 상응한다(예를 들어, caTCR-1-TM1은 1개의 막관통 도메인 변이체에 상응하고, caTCR-1-EC1은 1개의 세포외 도메인 변이체에 상응함; 표 2 참조).
caTCR-1(IgVH-IgCH1-TCRδ/IgVL-IgCL-TCRγ) 설계에서, 항체 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(IgVH-IgCH1)은 TCRδ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vδ-Cδ 영역 뒤의 TCRδ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRδ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인(IgVL-IgCL)은 TCRγ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vγ-Cγ 영역 뒤의 TCRγ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRγ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다.
caTCR-1의 일 실시 형태에서, 하나의 사슬은 TCRδ 사슬의 막관통 도메인 및 연결 펩티드의 전부 또는 일부분을 포함하는 TCRδ 사슬의 카르복시-말단 부분에 융합된 IgCH1 도메인(서열 번호 37 내지 47 중 어느 하나)에 융합된 항-AFP158/HLA-A*02:01 항체의 IgVH 도메인(서열 번호 62)을 포함하고, 다른 하나의 사슬은 TCRγ 사슬의 막관통 도메인 및 연결 펩티드의 전부 또는 일부분을 포함하는 TCRγ 사슬의 카르복시-말단 부분에 융합된 IgCL 도메인(서열 번호 48)에 융합된 항-AFP158/HLA-A*02:01 항체의 IgVL 도메인(서열 번호 63)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR 막관통 도메인은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR 막관통 도메인들 중 적어도 하나는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 천연 비발생 변이체이다. 일부 실시 형태에서, TCRδ 사슬의 카르복시-말단 부분은 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 연결 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRδ 사슬의 카르복시-말단 부분은 서열 번호 7, 및 9 내지 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRγ 사슬의 카르복시-말단 부분은 서열 번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 갖는 연결 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRγ 사슬의 카르복시-말단 부분은 서열 번호 8, 및 14 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
caTCR-2(IgVH-IgCH1-힌지-TCRδ/IgVL-IgCL-링커-TCRγ) 설계에서, 항체 중쇄의 가변 도메인, 제1 불변 도메인, 및 힌지(IgVH-IgCH1-힌지)는 TCRδ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vδ-Cδ 영역 뒤의 TCRδ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRδ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 링커에 융합된 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인(IgVL-IgCL-링커)은 TCRγ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vγ-Cγ 영역 뒤의 TCRγ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRγ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다.
caTCR-3(IgVH-IgCH1-힌지-TCRδ/IgVH-IgCH1-힌지-TCRγ + IgVL-IgCL) 설계에서, 항체 중쇄의 가변 도메인, 제1 불변 도메인, 및 힌지(IgVH-IgCH1-힌지)는 TCRδ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vδ-Cδ 영역 뒤의 TCRδ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRδ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 항체 중쇄의 가변 도메인, 불변 도메인, 및 힌지(IgVH-IgCH1-힌지)는 TCRγ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vγ-Cγ 영역 뒤의 TCRγ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRγ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인(IgVL-IgCL)은 IgVH-IgCH1 도메인과 회합된다.
caTCR-4(IgVH-TCRδ/IgVL-TCRγ) 설계에서, 항체 중쇄의 가변 도메인(IgVH)은 TCRδ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vδ-Cδ 영역 뒤의 TCRδ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRδ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인(IgVL)은 TCRγ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vγ-Cγ 영역 뒤의 TCRγ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRγ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다.
caTCR-5(IgVH-IgVL-TCRδ/TCRγ) 설계에서, 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인에 융합된 항체 중쇄의 가변 도메인(IgVH-IgVL 또는 IgVL-IgVH)은 TCRδ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vδ-Cδ 영역 뒤의 TCRδ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRδ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. Vγ-Cγ 영역 뒤의 TCRγ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지의 TCRγ 사슬의 아미노-말단 부분이 결실되며, 선택적으로, TCRγ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다.
caTCR-6(IgVH-IgVL-TCRδ/IgVH-IgVL-TCRγ) 설계에서, 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인에 융합된 항체 중쇄의 가변 도메인(IgVH-IgVL 또는 IgVL-IgVH)은 TCRδ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vδ-Cδ 영역 뒤의 TCRδ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRδ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다. 상응하는 항체 경쇄의 가변 도메인에 융합된 항체 중쇄의 가변 도메인(IgVH-IgVL 또는 IgVL-IgVH)은 TCRγ 사슬의 아미노-말단 부분을 Vγ-Cγ 영역 뒤의 TCRγ 사슬의 세포외 도메인 내의 연결 펩티드의 경계 또는 내부 위치까지 대체하며, 선택적으로, TCRγ 사슬의 막관통 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형된다.
실시예 2: 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 키메라 자극 수용체에 의해 형질도입된 T 세포의 작제 및 특성화
항-CD19 결합 모이어티(서열 번호 58 및 59)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 CD28 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 51)을 포함하는 키메라 공동자극성 수용체(CSR; 이는 본 명세서에서 "CSR1"로도 지칭됨) 및 caTCR-1 작제물(caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5) 둘 모두를 생성하였다. 단독으로의 CSR, 단독으로의 caTCR-1-0, CSR과 조합된 caTCR-1-0, 또는 CSR과 조합된 caTCR-1 내지 TM5 중 어느 하나에 의해 1차 T 세포를 형질도입시켰다. 세포 표면 염색에 의해 형질도입 효율을 결정하였으며, 모의 T-세포와의 혼합에 의해 모든 caTCR-1 T-세포는 대략 40% 수용체 양성으로 매칭되었다.
시험관내 사멸
CD80/86 음성 NALM6 세포(CD19를 발현하는 백혈병 세포)를 2.5:1의 이펙터 대 표적 비로 T-세포 자극을 위한 표적 세포로 사용하였다. 16시간 인큐베이션 후에, Cytox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 특이적 T-세포 용해를 측정하였다.
항-CD19-caTCR-1-0 또는 항-CD19-caTCR-1-TM5 중 어느 하나와 함께 항-CD19-CSR의 발현은 시험관내에서 NALM6 종양 세포를 용해시킬 수 있는 완전히 기능적인 세포독성 T-세포를 생성하였다(도 2). 단지 caTCR-1-0만을 발현하는 T 세포, 및 caTCR-1(caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5) 및 CSR 둘 모두를 발현하는 T 세포가 모두 거의 100%의 NALM6 표적 세포를 용해시킬 수 있었기 때문에, 2가지 T 세포 유형 사이에 사멸된 표적 세포의 수의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
사이토카인 분비
시험관내 사멸 반응의 상층액 내로 방출된 사이토카인의 농도를 Bio-plex Pro 인간 사이토카인 8-plex 키트(BioRad)를 사용하여 Bioplex200(Luminex)으로 측정하였다. caTCR과 조합하여 CSR을 발현하는 T 세포(CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포)는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 세포독성 사이토카인을 방출하였다(도 3).
세포내 사이토카인 발현
분비 억제제 브레펠딘 A(BFA)의 존재 하에서 T-세포를 표적 세포로 1:2의 E:T 비로 4시간 동안 자극하였다. T-세포를 투과화시키고 사이토카인 특이적 항체를 사용하여, 종양 자극에 반응하여 발현되는 사이토카인을 검출하였다. 유세포측정을 사용하여 사이토카인-양성 세포의 백분율을 결정하였다. CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 세포내 사이토카인을 발현하였다(표 5).
[표 5]
종합하면, 결과는 CSR의 첨가가 caTCR T-세포의 감수성 및 반응성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. CSR-caTCR 이중 양성 T 세포 내에서 발현되고 그로부터 방출된 사이토카인의 증가된 양은 caTCR-1 및 CSR 둘 모두의 공동자극이 T-세포의 세포독성능(cytotoxic potential)을 상승시킨다는 것을 나타낸다.
탈과립
T 세포가 종양 세포를 용해시키는 1차 기전은 표적 세포 내로 방출되는 세포독성 분자의 분비형 과립을 생성함으로써 이루어진다. CD107a는 탈과립 활성의 마커로서 사용될 수 있고, CD107a의 증가된 발현은 세포독성 T-세포 기능의 증가와 상관된다.
T 세포를 형광-접합된 항-CD107a와 혼합하고, 세포내이입 억제제 모넨신의 존재 하에서 표적 세포를 1:2의 E:T 비로 사용하여 4시간 동안 자극하였다. T-세포 표면 상에서 검출되는 CD107a의 양은 항원 인식에 의해 유도된 세포독성 탈과립 정도의 직접적인 척도이다. caTCR T-세포 상에의 CSR의 결합은 T-세포 탈과립을 증가시켰는데, 이는 CSR이 치료적 T-세포를 의도된 종양 세포에 대해 더 반응성이 되게 함을 추가로 입증한다(도 4).
증식
유전자적으로 변형된 T-세포의 증식 및 지속성은 암을 치료할 때 입양 T-세포 전달 요법의 성공에 있어서 중요하다. T-세포 증식 및 지속성에 대한 CSR의 효과를 검정하기 위하여, 본 발명자들은 T 세포를 세포내 염료 CFSE로 표지하고, 종양 세포로 자극될 때 T-세포가 분열됨에 따라 염료의 희석을 관찰하였다. 또한, 본 발명자들은 지정된 날에 남아 있는 CFSE-양성 세포의 수를 계수함으로써 T-세포의 지속성을 측정할 수 있었다.
각각의 T-세포들을 하룻밤 혈청 기아상태에 두고, CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)를 사용하여 CFSE로 표지하였다. 100,000개의 T-세포를 2:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 유세포측정을 사용하여, 지정된 날에 T-세포가 분열됨에 따라 CFSE 염료의 연속 희석을 관찰하였다. T-세포의 총수를 FAC를 사용하여 계수하였다.
CFSE 희석은 CSR 자극에 의해 증가하였는데, 이는 이들 T-세포가 더 높은 증식능을 가졌음을 나타낸다(도 5). 중요한 점으로, 세포수의 증가가 또한 있는데, 이는, 세포가 더 우수하게 증식할 뿐만 아니라 그들의 지속성이 또한 유지됨을 의미한다(표 6).
[표 6]
결과는, 표적 리간드 및 표적 항원 둘 모두를 발현하는 종양 세포로 CSR 및 caTCR 둘 모두를 동시에 자극할 수 있었고, CSR과 caTCR의 공동자극이 caTCR T-세포의 세포독성, 증식능, 및 지속성을 향상시켰음을 보여준다. 이들은 입양 전달을 사용하여 caTCR-기반 요법의 치료 잠재력을 증가시킬 모든 특성이다.
실시예 3. 항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 작제 및 특성화
항-AFP 결합 모이어티(서열 번호 62 및 63)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 caTCR-1 작제물(caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5)을 생성하였다. 항-GPC3 결합 모이어티(서열 번호 64 및 65)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 CD28 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 51)을 포함하는 CSR(즉, CSR1)을 생성하였다.
시험관내 사멸
HEPG2 세포(AFP 및 GPC3을 발현하는 인간 간 암 세포) 및 HEPG2-GPC3.KO 세포(GPC3 유전자의 표적화된 녹아웃을 갖는 HEPG2 세포)를 T-세포 자극을 위한 표적 세포로서 2.5:1의 이펙터 대 표적 비로 사용하였다. 16시간 인큐베이션 후에, Cytox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 특이적 T-세포 용해를 측정하였다.
항-AFP-caTCR-1-0 또는 항-AFP-caTCR-1-TM5 중 어느 하나와 함께 항-GPC3-CSR의 발현은 시험관내에서 HEPG2 세포를 용해시킬 수 있는 완전히 기능적인 세포독성 T-세포를 생성하였다(도 6). 단지 caTCR-1-0만을 발현하는 T 세포는 caTCR-1(caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5) 및 CSR 둘 모두를 발현하는 것들(약 55% 내지 약 65%)보다 훨씬 더 적은 특이적 사멸(약 15%)을 가졌다. 대조적으로, HEPG2-GPC3.KO 표적 세포를 사용할 때, 특이적 사멸은 caTCR 및 CSR 둘 모두를 발현하는 T 세포에 대해 약 10%로 감소되었는데(도 6), 이는 CSR과 그의 표적 리간드의 결합이 증가된 세포독성을 담당함을 나타낸다.
사이토카인 분비
시험관내 사멸 실험의 상층액 내로 방출된 사이토카인의 농도를 Bio-plex Pro 인간 사이토카인 8-plex 키트(BioRad)를 사용하여 Bioplex200(Luminex)으로 측정하였다. CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포는 caTCR 표적 항원 및 CSR 표적 리간드 둘 모두를 발현하는 HEPG2 표적 세포에 대해 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 세포독성 사이토카인을 방출하였다(도 7). 대조적으로, CSR 표적 리간드가 결여되어 있는 HEPG2-GPC3.KO 표적 세포에 대해서는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하거나 caTCR 및 CSR 둘 모두를 발현하는 T 세포들 사이에 차이가 거의 또는 전혀 없었다.
세포내 사이토카인 발현
분비 억제제 브레펠딘 A(BFA)의 존재 하에서 T-세포를 표적 세포(HEPG2)로 1:2의 E:T 비로 4시간 동안 자극하였다. T-세포를 투과화시키고 사이토카인 특이적 항체를 사용하여, 종양 자극에 반응하여 발현되는 사이토카인을 검출하였다. 유세포측정을 사용하여 사이토카인-양성 세포의 백분율을 결정하였다. CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 세포내 사이토카인을 발현하였다(표 7).
[표 7]
종합하면, 결과는 CSR의 첨가가, 상이한 caTCR 표적 항원 및 CSR 표적 리간드를 갖는 caTCR + CSR T-세포의 감수성 및 반응성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이들 CSR-caTCR 이중 양성 T 세포 내에서 발현되고 그로부터 방출된 사이토카인의 증가된 양은 caTCR-1 및 CSR 둘 모두의 공동자극이 T-세포의 세포독성능을 상승시킨다는 추가의 증거를 제공한다.
탈과립
T 세포를 형광-접합된 항-CD107a와 혼합하고, 세포내이입 억제제 모넨신의 존재 하에서 HEPG2 표적 세포를 1:2의 E:T 비로 사용하여 4시간 동안 자극하였다. caTCR T-세포 상에의 CSR의 결합은 T-세포 탈과립을 증가시켰는데, 이는 CSR이 치료적 T-세포를 의도된 종양 세포에 대해 더 반응성이 되게 함을 추가로 입증한다(도 8).
증식
T 세포를 세포내 염료 CFSE로 표지하고, 염료 희석 및 지정된 날에 남아 있는 CFSE-양성 세포의 수를 측정하였다.
각각의 T-세포들을 하룻밤 혈청 기아상태에 두고, CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)를 사용하여 CFSE로 표지하였다. 100,000개의 T-세포를 2:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 유세포측정을 사용하여, 지정된 날에 T-세포가 분열됨에 따라 CFSE 염료의 연속 희석을 관찰하였다. T-세포의 총수를 FAC에 의해 계수하였다.
CFSE 희석은 CSR 자극에 의해 증가하였는데, 이는 이들 T-세포가 더 높은 증식능을 가졌음을 나타낸다(도 9). 중요한 점으로, 세포수의 증가가 또한 있는데, 이는, 세포가 더 우수하게 증식할 뿐만 아니라 그들의 지속성이 또한 유지됨을 의미한다(표 8).
[표 8]
결과는, 리간드 양성 종양 세포로 CSR 및 caTCR 둘 모두를 동시에 자극할 수 있었고, CSR과 caTCR의 공동자극이 caTCR T-세포의 세포독성, 증식능, 및 지속성을 향상시켰음을 보여준다. 이들은 입양 전달을 사용하여 caTCR-기반 요법의 치료 잠재력을 증가시킬 모든 특성이다.
실시예 4. 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD20 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 작제 및 특성화
항-CD20 결합 모이어티(서열 번호 60 및 61)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 CD28 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 51)을 포함하는 항-CD20 CSR(즉, "CSR1")을 생성하였으며, 이것을 항-CD19 결합 모이어티를 사용하여 생성된 항-CD19 caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5(서열 번호 58 및 59)를 발현하는 것과 동일한 벡터 상에서 발현시켰다.
시험관내 사멸
Raji, BV173, NALM6, 및 Jeko-1 세포(CD19 및 CD20을 발현하는 세포주)를 2.5:1의 이펙터 대 표적 비로 T-세포 사멸을 위한 표적 세포로 사용하였다. 16시간 인큐베이션 후에, Cytox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 특이적 T-세포 용해를 측정하였다.
항-CD19-caTCR-1-0 또는 항-CD19-caTCR-1-TM5 중 어느 하나와 함께 항-CD20-CSR의 발현은 시험관내에서 다양한 CD19-양성, CD20-양성 종양 세포를 용해시킬 수 있는 완전히 기능적인 세포독성 T-세포를 생성하였다(도 10).
사이토카인 분비
Raji 시험관내 사멸 실험의 상층액 내로 방출된 사이토카인의 농도를 Bio-plex Pro 인간 사이토카인 8-plex 키트(BioRad)를 사용하여 Bioplex200(Luminex)으로 측정하였다. CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 GM-CSF, IFNγ, 및 TNFα를 방출하였다(도 11).
탈과립
T 세포를 형광-접합된 항-CD107a와 혼합하고, 세포내이입 억제제 모넨신의 존재 하에서 Raji 표적 세포를 1:2의 E:T 비로 사용하여 4시간 동안 자극하였다. caTCR T-세포 상에의 CSR의 결합은 T-세포 탈과립을 증가시켰는데, 이는 CSR이 치료적 T-세포를 의도된 종양 세포에 대해 더 반응성이 되게 함을 추가로 입증한다(도 12).
실시예 2 내지 실시예 4는 CSR이 다양한 항원-표적화 모이어티와 조합하여 사용되어 폭넓은 스펙트럼의 질병에 걸린 세포에 대하여 caTCR-발현 T 세포의 치료 잠재력을 증가시킬 수 있는 모듈형 분자임을 나타낸다.
실시예 5: 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 키메라 자극 수용체 변이체에 의해 형질도입된 T 세포의 작제 및 특성화
항-CD19 결합 모이어티(서열 번호 58 및 59)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 키메라 공동자극성 수용체(CSR) 및 caTCR-1-0 작제물(본 실시예에서는 "caTCR-1"로 지칭됨) 둘 모두를 생성하였다. 항-CD19 결합 모이어티를 CSR 서열에 융합시킴으로써 상이한 CSR들을 제조하였다. CSR1은 CD28 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 90)을 포함한다. CSR2는 CD8 막관통 서열 및 4-1BB 세포내 신호전달 서열(서열 번호 91)을 포함한다. CSR3은 4-1BB 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 92)을 포함한다. CSR4는 CD8 막관통 서열 및 CD27 세포내 신호전달 서열(서열 번호 93)을 포함한다. CSR5는 CD27 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 94)을 포함한다. CSR6은 CD8 막관통 서열 및 CD30 세포내 신호전달 서열(서열 번호 95)을 포함한다. CSR7은 CD30 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 96)을 포함한다. CSR8은 CD8 막관통 서열 및 OX40 세포내 신호전달 서열(서열 번호 97)을 포함한다. CSR9는 OX40 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 98)을 포함한다.
1차 T 세포를 단독으로의 항-CD19 CSR에 의해, 또는 항-CD19 CSR과 조합된 항-CD19 caTCR-1에 의해 형질도입시켰다. 세포 표면 염색에 의해 형질도입 효율을 결정하였으며, 모의 T-세포와의 혼합에 의해 모든 caTCR-형질도입된 T-세포는 대략 40% 수용체 양성으로 매칭되었다.
항-CD19 CSR을 단독으로 발현하는 T 세포
시험관내 사멸
Raji 또는 NALM6 세포를 2.5:1의 이펙터 대 표적 비로 T-세포 자극을 위한 표적 세포로 사용하였다. 16시간 인큐베이션 후에, Cytox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 특이적 T-세포 용해를 측정하였다. 항-CD19 CSR-6, CSR-7, CSR-8 또는 CSR-9를 단독으로 발현하는 T 세포는 형질도입되지 않은 모의 T 세포에 비하여 사멸된 표적 세포의 수가 상승되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
사이토카인 분비
시험관내 사멸 반응의 상층액 내로 방출된 사이토카인의 농도를 Bio-plex Pro 인간 사이토카인 8-plex 키트(BioRad)를 사용하여 Bioplex200(Luminex)으로 측정하였다. 항-CD19 CSR-6, CSR-7, CSR-8 또는 CSR-9를 단독으로 발현하는 T 세포는 Raji 또는 NALM6과 함께 인큐베이션될 때 유의한 양의 IFNγ을 방출하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR을 발현하는 T 세포
2개의 상이한 실험 배치(batch)에서, 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR 둘 모두를 발현하는 각각의 T-세포들을 하룻밤 혈청 기아상태에 두고, CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)를 사용하여 CFSE로 표지하였다. T-세포를 NALM6과 2:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 유세포측정을 사용하여, 지정된 날에 T-세포가 분열됨에 따라 CFSE 염료의 연속 희석을 관찰하였다. T-세포의 총수를 FAC에 의해 계수하였다. 이들 실험을 두 번째 공여자로부터 획득된 1차 T 세포를 사용하여 반복하였다. 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR 둘 모두를 발현하는 모든 T 세포에서 CFSE 희석이 관찰되었는데, 이는, 이들 T 세포의 높은 증식능을 나타낸다(도 14 및 도 15). 추가로, 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR 둘 모두를 발현하는 T 세포는 10일의 기간에 걸쳐 유의한 지속성을 나타내었다(표 9). 대조 실험에서, 항-CD19 CSR-1 내지 항-CD19 CSR-5 중 어느 하나를 단독으로 발현하는 T 세포는 시간 경과에 따라 증가된 증식능 또는 지속성을 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
[표 9]
실시예 6: 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 생체내 효능 연구
항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR-1 둘 모두를 발현하는 T 세포의 생체내 항-종양 활성을 인간 CD19+ NALM-6 프리-B 급성 림프아구성 백혈병(ALL) 모델에서 시험하였다. 루시페라제-발현 NALM-6 세포를 NOD SCID 감마(NSG) 면역-손상된 마우스 내로 정맥내(i.v.) 이식하고, 종양-유래 생물발광을 측정함으로써 종양 부하를 평가하였다. 종양 이식 후 6일째에, 마우스를 총 생물발광 플럭스에 기초하여 하기의 처리군에 무작위 배정하였다: (1) 5 × 106개의 형질도입되지 않은 공여자-매칭된(모의) T 세포의 i.v. 주사, (2) 항-CD19 caTCR-1을 단독으로 발현하는 2×106개의 T 세포의 i.v. 주사 및 (3) 항-CD19 caTCR-1 및 항-CD19 CSR-1 둘 모두를 발현하는 2×106개의 T 세포의 i.v. 주사("caTCR-1 CSR-1 T 세포"; n = 6 마리의 마우스/군). 마우스에서 T 세포 주입으로부터 생기는 건강 효과를 그들의 전반적인 외관, 체중, 및 유해 반응의 다른 임상 징후(저체온, 호흡 곤란, 및 뒷다리 마비/약화를 포함함)를 모니터링함으로써 평가하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, caTCR-1 T 세포 및 caTCR-1 CSR-1 T 세포 처리 둘 모두가 종양 성장 억제를 가져왔지만, caTCR-1 CSR-1 T 세포가 caTCR-1 T 세포와 대비하여 향상된 항-종양 활성을 나타내었다. caTCR-1 T 세포-처리된 마우스 및 caTCR-1 CSR-1 T 세포-처리된 마우스 전부는 연구 지속기간 동안 정상 보행, 자세, 및 활동/반응성을 나타내었다. 게다가, caTCR-1 T 세포-처리된 마우스 및 caTCR-1 CSR-1 T 세포-처리된 마우스는 연구 동안 체중 손실이 없었다. 전체적으로, 처리된 마우스에서 관찰가능한 비정상적인 파라미터의 부재는 caTCR-1 CSR-1 T 세포 요법의 안전성을 입증한다.
생체내 사이토카인 방출 수준을 결정하기 위하여, NALM-6 종양-보유 마우스에 항-CD19 CAR-T 세포 또는 caTCR-1 CSR-1 T 세포를 투여한 후 24시간째에, 임상 사이토카인 방출 증후군과 관련된 것들을 포함한 주요 사이토카인을 분석하였다. 사이토카인 수준을 BioRad Bio-Plex 키트를 사용하여 Luminex Magpix 기술로 정량화하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, caTCR-1 CSR-1 T 세포-처리된 마우스는 CAR-T 처리된 마우스보다 유의하게 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 가졌다.
실시예 7: 항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 생체내 효능 연구
항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR-1 둘 모두를 발현하는 T 세포(예를 들어, 작제물 정보에 대해서는 실시예 3 참조)의 생체내 항-종양 활성을 확립된 인간 AFP+/HLA-A2+ Hep G2 간암 이종이식편 모델에서 시험하였다. Hep G2 세포를 SCID-베이지 마우스의 우측 옆구리에 피하(s.c.) 이식하였다. 종양이 약 100 ㎣에 도달하였을 때, 마우스에 하기 중 하나를 종양내(i.t.) 주사하였다: (1) 5×106개의 형질도입되지 않은 공여자-매칭된(모의) T 세포, (2) 동일한 항-AFP 결합 모이어티(서열 번호 62 및 63)를 포함하는 항-AFP CAR을 발현하는 2×106개의 T 세포, 또는 (3) 항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR-1 둘 모두를 발현하는 2×106개의 T 세포(n = 6 마리의 마우스/군). 마우스에서 T 세포 주입으로부터 생기는 건강 효과를 그들의 전반적인 외관, 체중, 및 유해 반응의 다른 임상 징후(저체온, 호흡 곤란, 및 뒷다리 마비/약화를 포함함)를 모니터링함으로써 평가하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 항-AFP CAR T 세포 처리 및 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포 처리 둘 모두는 현저하고 유의한(**** P < 0.0001; 던넷(Dunnett)의 다중 비교 검정) 종양 성장 억제로 이어졌다. 항-AFP CAR-T 처리된 마우스 및 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포-처리된 마우스 전부는 연구 지속기간 동안 정상 보행, 자세, 및 활동/반응성을 나타내었다. 게다가, 항-AFP CAR-T 처리된 마우스 및 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포-처리된 마우스는 연구 동안 체중 손실이 없었다. 전체적으로, 처리된 마우스에서 관찰가능한 비정상적인 파라미터의 부재는 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포 요법의 안전성을 입증한다.
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> Eureka Therapeutics, Inc.
Liu, Hong
Zhang, Pengbo
Horan, Lucas
Xu, Yiyang
Staley, Binnaz K.
Liu, Lianxing
Yun, Hongruo
<120> CELLS EXPRESSING CHIMERIC ACTIVATING RECEPTORS AND
CHIMERIC STIMULATING RECEPTORS AND USES THEREOF
<130> 75004-20010.40
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/490,580
<151> 2017-04-26
<150> US 62/490,578
<151> 2017-04-26
<150> US 62/490,576
<151> 2017-04-26
<160> 105
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 1
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1 5 10 15
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
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<223> Synthetic Construct
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
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<220>
<223> Synthetic Construct
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<220>
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<220>
<223> Synthetic Construct
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<220>
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 51
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro
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20 25 30
Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<220>
<223> Synthetic Construct
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
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Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
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Ile Thr Leu Tyr Cys
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
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Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr
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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu
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Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
130 135 140
Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
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Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro
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Tyr Cys Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg
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Ser Asn Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 78
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Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Gln Leu
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Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
130 135 140
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210 215 220
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 79
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Tyr Cys Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg
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Ser Asn Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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<220>
<223> Synthetic Construct
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195 200 205
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ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180
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<212> DNA
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<223> Synthetic Construct
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ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
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Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr Pro Glu Asn
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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65 70 75 80
Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln
85 90 95
Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu
100 105 110
Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly
115 120 125
Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln
130 135 140
Pro Leu Met Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro
145 150 155 160
Leu Gln Asp Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr
180 185 190
Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu
195 200 205
Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu
210 215 220
Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu
225 230 235 240
Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu
245 250 255
Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
260 265
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<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 97
Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
20 25 30
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
50 55 60
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
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100 105 110
Leu Ala Lys Ile
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1 5 10 15
Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala
20 25 30
Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Trp Val Glu Val Pro Gly Gly
35 40 45
Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln
65 70 75 80
Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg
85 90 95
Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys
100 105 110
Ile
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn Trp
100 105 110
Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
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<400> 100
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
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35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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<400> 101
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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65 70 75 80
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Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Thr Gly
1 5
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<220>
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<400> 105
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
260 265 270
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Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
485 490 495
Val Glu Ile Lys
500
Claims (40)
- 면역 세포로서,
a) 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) - 상기 caTCR은
i) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈; 및
ii) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며,
상기 TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(TCR-associated signaling molecule)의 동원을 촉진함 -; 및
b) 키메라 신호전달 수용체(CSR) - 상기 CSR은
i) 표적 리간드와 결합하거나 상호작용할 수 있는 리간드-결합 모듈;
ii) 막관통 모듈; 및
iii) 상기 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공할 수 있는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함하며,
상기 리간드-결합 모듈과 상기 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 동일한 분자로부터 유래되지 않고, 상기 CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 도메인이 결여되어 있음 - 를 포함하는, 면역 세포. - 제1항에 있어서, 상기 CSR에는 어떠한 1차 면역 세포 신호전달 서열도 결여되어 있는, 면역 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 항원은 세포 표면 항원인, 면역 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 항원은 펩티드 및 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질을 포함하는 복합체인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 TCR-TM은 제1 T 세포 수용체의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래되고, 상기 제2 TCR-TM은 상기 제1 T 세포 수용체의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 면역 세포.
- 제5항에 있어서, 상기 TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적인, 면역 세포.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제1 T 세포 수용체는 γ/δ T 세포 수용체인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 모듈은 다중특이성인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 상기 제1 안정화 도메인과 상기 제2 안정화 도메인은 상기 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는, 면역 세포.
- 제9항에 있어서, 상기 안정화 모듈은 CH1-CL 모듈, CH2-CH2 모듈, CH3-CH3 모듈, 및 CH4-CH4 모듈로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원과 상기 표적 리간드는 동일한, 면역 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원과 상기 표적 리간드는 상이한, 면역 세포.
- 제12항에 있어서, 상기 표적 리간드는 상기 표적 항원을 제시하는 세포의 표면 상에서 발현되는 리간드인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 리간드는 질병-관련 리간드인, 면역 세포.
- 제14항에 있어서, 상기 표적 리간드는 암-관련 리간드인, 면역 세포.
- 제14항에 있어서, 상기 표적 리간드는 바이러스-관련 리간드인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 리간드는 면역조절 분자인, 면역 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 면역억제성 수용체이고, 상기 CSR은 상기 면역억제성 수용체의 길항제인, 면역 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 면역조절 분자는 면역자극성 수용체이고, 상기 CSR은 상기 면역억제성 수용체의 효능제인, 면역 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 표적 리간드는 면역 관문 분자인, 면역 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 표적 리간드는 억제성 사이토카인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 리간드는 아폽토시스 분자인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-결합 모듈은 항체 모이어티(moiety)인, 면역 세포.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-결합 모듈은 수용체의 세포외 도메인으로부터 유래되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CSR의 막관통 모듈은 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 TCR의 공동자극성 수용체의 세포내 도메인으로부터 유래되는, 면역 세포.
- 제26항에 있어서, 상기 공동자극성 수용체는 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, CD27, 및 CD40으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CSR의 발현은 유도가능한, 면역 세포.
- 제28항에 있어서, 상기 CSR의 발현은 상기 면역 세포의 활성화 시에 유도가능한, 면역 세포.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 caTCR의 항원-결합 모듈은 CD19에 결합하는 항체 모이어티를 포함하고, 상기 CSR의 리간드-결합 모듈은 CD19에 결합하는 scFv를 포함하고, 상기 막관통 모듈 및 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 둘 모두 CD28로부터 유래되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 caTCR의 항원-결합 모듈은 AFP에 결합하는 항체 모이어티를 포함하고, 상기 CSR의 리간드-결합 모듈은 GPC3에 결합하는 scFv를 포함하고, 상기 막관통 모듈 및 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 둘 모두 CD28로부터 유래되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 caTCR의 항원-결합 모듈은 CD19에 결합하는 항체 모이어티를 포함하고, 상기 CSR의 리간드-결합 모듈은 CD20에 결합하는 scFv를 포함하고, 상기 막관통 모듈 및 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈은 둘 모두 CD28로부터 유래되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 caTCR 및 CSR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서,
상기 caTCR 및 CSR 각각은 상기 하나 이상의 핵산에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어진, 하나 이상의 핵산. - 제33항의 하나 이상의 핵산을 포함하는, 하나 이상의 벡터.
- 제33항의 하나 이상의 핵산, 제34항의 하나 이상의 벡터를 포함하는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 표적 항원을 제시하는 표적 세포를 사멸시키는(또는 표적 항원-관련 질병을 치료하는) 방법으로서,
상기 표적 세포를 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법. - 표적 항원-관련 질병의 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 질병을 치료하는 방법으로서,
제37항의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - caTCR을 포함하거나 caTCR을 인코딩하는 핵산에 의해 형질도입된 면역 세포에 공동자극성 신호를 제공하는 방법으로서,
제33항의 하나 이상의 핵산 또는 제34항의 하나 이상의 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
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