CN109153975A - 制备嵌合抗原受体表达细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备可以被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的方法，以及包含所述免疫效应细胞的组合物和反应混合物。

Description

制备嵌合抗原受体表达细胞的方法
相关申请
本申请要求于2015年12月28日提交的美国系列号62/271695和2016年12月7日提交的美国系列号62/431204的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包括已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其整体并入本文。在2016年12月27日创建的所述ASCII副本被命名为N2067-7100WO_SL.txt，大小为257,808字节。
技术领域
本发明一般涉及制备工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的方法，以及包括其的组合物。
背景技术
使用自体T细胞、特别是使用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞的过继细胞转移(ACT)治疗，在一些血液癌症试验中显示前景。
自体基因修饰的T细胞的生产目前是一个复杂的过程，其从患者材料起始(例如，从白细胞去除术(leukapheresis)获得的)，从该患者材料获得表达CAR的工程化的治疗性T细胞。患者白细胞去除术材料可具有高水平的细胞组分变异性。在患者与患者之间以及在一种疾病状态下该起始材料的细胞组成中可以差别很大。细胞杂质可以包括粒细胞、单核细胞、红细胞、循环母细胞和血小板。自体细胞治疗产品制造过程还必须与患者的不同治疗史、疾病状态等相抗衡，这将进一步影响起始材料的细胞内容物(Burger等人2014、Kaiser等人2015、Ramos等人2009)。此外，起始材料中的这些杂质会对制造过程、产品的最终质量和产品的治疗效果产生负面影响。
因此，需要提供更一致的生产表达CAR的细胞治疗产品的方法和过程，从而流水线化生产过程、提高产品质量并最大化产品的治疗功效。
发明内容
本公开涉及制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的方法，以及包括其的组合物。
因此，一方面，本公开的特征在于制备或富集可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，其中所述方法包括进行淘析(elutriation)。该方法包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品、解冻冷冻输入样品以产生解冻的样品、和对解冻的样品进行淘析并收集免疫效应细胞，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
在一个实施方案中，冷冻输入样品是血浆单采血液成分术(apheresis)样品。
在一个实施方案中，该方法还包括以下中的一项、两项、三项或全部：
i)在流动条件下除去CD19+细胞；
ii)使用包含碘克沙醇(例如在水中的60％碘克沙醇)(例如Optiprep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心；
iii)用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液(例如D5 1/2NS介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠))进行洗涤步骤(例如，在解冻的样品上)，例如，其中使用细胞处理装置例如细胞洗涤装置或用于密度梯度离心的装置(例如CS5(CellSaver5+)仪器)进行洗涤步骤；和
iv)在流动条件下进行CD3/CD28+细胞的阳性选择。
在一个实施方案中，该方法进一步包括调节解冻样品的粘度的步骤，例如通过向解冻样品中加入等渗溶液，例如PBS。
在一个实施方案中，使用约30-82mL/min或50-80mL/min的流速进行淘析，和/或对于每个级分收集体积为约250-1250mL或300-1000mL。在一个实施方案中，使用约30、40、50、60、70、72或82mL/min，例如约70或72mL/min的流速进行淘析。在一个实施方案中，使用约30-40、40-50、50-60、60-70、70-72、70-82、72-82mL/min的流速进行淘析。在一个实施方案中，使用约250、400、500、900或975mL，例如约400或975mL的收集体积进行淘析。在一个实施方案中，使用约250-400、400-500、500-900、900-1000或1000-1259mL的收集体积进行淘析。在一个实施方案中，以约2400rpm进行淘析。在一个实施方案中，以约2000-2800、2200-2600或2300-2500rpm进行淘析。
在一个实施方案中，输入样品包含至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％或40％的单核细胞。在一个实施方案中，输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的T细胞。在一个实施方案中，输入样品包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞。
在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的B细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的CD4+CD25+细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的CD8+CD25+细胞。
在一个实施方案中，方法导致至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞回收产率。
在一个实施方案中，输出样品与编码CAR的核酸接触。在一个实施方案中，在输出样品与编码CAR的核酸接触后，输出样品包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的CAR+细胞。在这样的实施方案中，输出样品包含至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CAR+CD4+中枢记忆细胞。在这样的实施方案中，输出样品包含至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CAR+CD8+中枢记忆细胞。
在一个实施方案中，在输出样品与编码CAR的核酸接触后，输出样品产生每个表达CAR的细胞(例如转导的细胞)少于1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pg的IFN-γ(IFN-γ)。本文例如在实施例中描述了IFN-γ(IFN-γ)释放测定法。在一个实施方案中，在输出样品与编码CAR的核酸接触后，输出样品包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30的细胞毒性水平(例如EC50rec)。本文中例如实施例中描述了细胞毒性测定法。
另一方面，本公开的特征在于制备或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，其中所述方法包括进行密度梯度离心(本文也称为密度离心)。该方法包括提供包含免疫效应细胞的输入样品，和使用包含碘克沙醇(例如水中的60％碘克沙醇)(例如Optiprep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心方法进一步包括进行以下的一项、两项、三项或全部：
i)在流动条件下除去CD19+细胞；
ii)对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；
iii)用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5 1/2NS介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤(例如，密度离心之前)，例如其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤；并在流动条件下阳性选择CD3/CD28+细胞。
在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法不包括以下中的一项或多项：使用包含乙二醇的溶液，例如Ficoll溶液；或在包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液(例如D5 1/2NS介质)中进行洗涤步骤，例如其中使用CS5仪器进行洗涤步骤；或进行阳性选择步骤。
在一个实施方案中，使用细胞分离装置(例如Sepax2装置)进行密度离心。
在一个实施方案中，输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％或15％的T细胞。在一个实施方案中，输入样品包含至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的单核细胞。在一个实施方案中，输入样品包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的B细胞。
在一个实施方案中，输出样品包含至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的B细胞。
在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法导致至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞回收产率。
另一方面，本公开的特征在于制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，其中所述方法包括阴性选择步骤以除去癌症相关抗原表达细胞，例如CD19表达(CD19+)细胞。该方法包括提供包含免疫效应细胞的输入样品，和在流动条件下从输入样品除去CD19+细胞，例如使用流通装置，例如本文所述的细胞处理系统，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。在一个实施方案中，CD19+细胞包括B细胞。在一个实施方案中，CD19+细胞包括淋巴母细胞。
在一个实施方案中，本文描述的阴性选择方法还包括进行以下中的一项、两项、三项或全部：
i)对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；
ii)使用包含碘克沙醇(例如水中60％碘克沙醇)(例如Optiprep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质的密度离心步骤；
iii)使用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5 1/2NS介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤(例如，在除去CD19+细胞之前和/或在输入样品解冻之后)，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤；和
iv)在流动条件下CD3/CD28+细胞的阳性选择。
在一个实施方案中，本文所述的阴性选择方法不包括进行淘析或密度离心。
在一个实施方案中，通过磁分离将CD19+细胞从输入样品中除去。在一个实施方案中，磁分离包括使细胞与分离试剂接触。在一个实施方案中，分离试剂包含磁性或顺磁性元件和CD19结合元件。在一个实施方案中，磁分离包括流式细胞术或FACS。在一个实施方案中，通过FACS除去CD19+细胞。在一个实施方案中，磁分离包括使用磁性细胞分离装置，例如CliniMAC装置。在一个实施方案中，通过CliniMAC装置除去CD19+细胞。在一个实施方案中，通过本文所述的流通装置除去CD19+细胞，例如本文所述的细胞处理系统。
在一个实施方案中，输入样品包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的CD19+细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的CD19+细胞。在一个实施方案中，与输入样品相比输出样品包含少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的CD19+细胞百分比。
在一个实施方案中，输入样品包含至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％或40％的单核细胞。在一个实施方案中，输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的T细胞。在一个实施方案中，输入样品(例如，洗涤后的输入样品)包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的B细胞。
在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的B细胞。
在一个实施方案中，本文所述的阴性选择方法导致至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞回收产率。
另一方面，本公开的特征在于制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，其中所述方法包括阳性选择。方法包括提供包含免疫效应细胞的输入样品，和在流动条件下从输入样品中阳性选择CD3+/CD28+细胞，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品，例如其中在流动条件下进行阳性选择。
在一个实施方案中，本文描述的阳性选择方法还包括进行以下中的一项、两项、三项或全部：
i)例如在流动条件下除去CD19+细胞；对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；
ii)使用包含碘克沙醇(例如水中60％的碘克沙醇)(例如Optiprep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心；和
iii)用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5 1/2NS介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤(例如，在除去CD19+细胞之前和/或在输入样品解冻之后)，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤。
在一个实施方案中，本文描述的阳性选择方法进一步包括对输入样品进行淘析(例如，其中输入样品是解冻的输入样品)。任选地，淘析与除去CD19+细胞(例如，如以上(i)中所述)、进行密度离心(例如，如以上(ii)中所述)和进行洗涤步骤(例如，如以上(iii)中所述)中的一项或多项(例如，1项、2项或全部)一起进行。
在一个实施方案中，本文所述的阳性选择方法还包括在进行阳性选择之前进行淘析、洗涤步骤(任选地)和密度离心(例如使用Ficoll或OptiPrep介质)。在一个实施方案中，本文所述的阳性选择方法还包括在进行阳性选择之前进行洗涤步骤(任选地)和密度离心(例如，使用Ficoll或OptiPrep介质)。在一个实施方案中，本文所述的阳性选择方法不包括进行淘析。在一个实施方案中，本文所述的阳性选择方法还包括使用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液(例如D5 1/2NS缓冲液)、例如使用CS5+仪器进行洗涤。
在一个实施方案中，阳性选择包括使输入样品与分离试剂接触，该分离试剂包含磁性或顺磁性元件和CD3和/或CD28结合元件。在一个实施方案中，对CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括将输入样品与分离试剂温育约10至90分钟、约10至60分钟、约10至45分钟、约12至90分钟、约12至60分钟、约12至45分钟、约15至90分钟、约15至60分钟、约15至45分钟，例如约30分钟或约20分钟。在一个实施方案中，分离试剂包含偶联(例如，共价或非共价偶联)至抗-CD3和/或抗-CD28抗体的珠子。在一个实施方案中，阳性选择使用磁分离元件(例如珠子)与T细胞的比例约为3:1。
在一个实施方案中，阳性选择包括使包含免疫效应细胞和磁分离元件的流体在封闭系统(例如室或袋)中流动，在该封闭系统中发生磁分离。在一个实施方案中，流动以一定速度进行，使得发生(任选结合免疫效应细胞的)元件的磁分离。在一个实施方案中，对CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括少于约6、5、6、3、2或1分钟、或少于约50、40、30、20、10、5、4、3、2或1秒的分离或停留时间。
在一个实施方案中，使用磁性装置(例如Dynamag CTS)、包括如本文所述的磁性元件的流通装置或磁性元件的其它配置来进行阳性选择。
在一个实施方案中，使用装置来进行阳性选择，所述装置包含至少一个细胞悬液模块；至少一个流通磁分离/脱珠模块(debeading module)；至少一个非磁性输出模块；至少一个磁性输出模块；任选地，在磁分离/脱珠模块外部的至少一个产生磁力和/或梯度的磁性部件；以及任选地，至少一个缓冲模块。在一个实施方案中，装置还包括在磁分离/脱珠模块外部的至少一个产生磁力和/或梯度的磁性部件。在一个实施方案中，装置还包含至少一个缓冲模块。在一个实施方案中，磁分离/脱珠模块包括由壁限定并具有x方向、y方向和z方向的室；配置在室的相对端上的入口和出口，例如在x方向上、在y方向上或在z方向上；邻近或接近室壁的至少两个磁体，其配置成在室内的入口和出口之间建立零梯度线。在一个实施方案中，免疫效应细胞流过室，其中在室中的每个点位于磁体的2cm内。
在一个实施方案中，阳性选择方法包括(例如，在步骤a)和b)之间)使免疫效应细胞与包含右旋糖和/或氯化钠的溶液例如D5 1/2NS介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)接触，任选地，其中溶液处于环境温度下，例如在约20-25℃。在一个实施方案中，免疫效应细胞例如在步骤a)和b)期间存在于柔性容器(例如袋)中。在一个实施方案中，方法包括(例如，在步骤a)和b)之间，例如在使免疫效应细胞与盐溶液接触后)将袋放置在绝热材料上，例如放置在包括纸(例如纸巾或湿巾)的多层上。在一个实施方案中，方法包括(例如，在步骤b)之后)在约37℃温育细胞约10分钟。在一个实施方案中，方法包括(例如，在步骤b)之后)在约36-38、35-39或34-40℃温育细胞，例如约10分钟。在一个实施方案中，温育步骤持续约8-12、5-15或5-20分钟。在一个实施方案中，在Plasmatherm装置中进行温育。
在阳性选择方法的一个实施方案中，包含免疫效应细胞的输入样品包含至少20％的单核细胞。在一个实施方案中，包含免疫效应细胞的输入样品包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％的单核细胞。
在一个实施方案中，阳性选择方法例如以列出的顺序包括以下中的一项或多项(例如，2、3、4或全部)：
a)解冻包括来自患有血液恶性肿瘤的患者的免疫效应细胞的冷冻输入样品(例如白细胞去除术样品)，任选地其中样品包括>20％的淋巴母细胞；
b)例如在环境温度下(例如20-25℃)在洗涤溶液(例如X-VIVO15介质(Lonza)，称为'改良介质'(MM))中洗涤免疫效应细胞；
c)使输入样品与分离试剂接触，该分离试剂包含磁性或顺磁性元件和CD3和/或CD28结合元件；
d)在旋转器上例如以2-6rpm、例如以4rpm旋转输入样品和分离试剂，其中旋转持续例如10-30分钟，例如20分钟；和
e)进行阳性选择例如30秒至2分钟、例如1分钟以富集结合分离试剂的细胞。
在一个实施方案中，阳性选择方法包括例如以列出的顺序的以下中的一项或多项(例如，2、3、4、5、6或全部)：
a)解冻包括来自患有血液恶性肿瘤的患者的免疫效应细胞的冷冻输入样品(例如白细胞去除术样品)，任选地其中样品包括>20％的单核细胞；
b)例如在环境温度下(例如20-25℃)在洗涤溶液(例如包括约5％右旋糖和0.45％氯化钠，例如D5 1/2NS)中洗涤免疫效应细胞；
c)将包括细胞的柔性容器放置在绝热材料上，例如放置在包括纸(例如纸巾或湿巾)的多层上；
d)使输入样品与分离试剂接触，该分离试剂包含磁性或顺磁性元件和CD3和/或CD28结合元件；
e)例如在37℃温育输入样品和分离试剂例如5-15分钟、例如10分钟；
f)在旋转器上例如以2-6rpm、例如以4rpm旋转输入样品和分离试剂，其中旋转持续例如10-30分钟、例如20分钟；和
g)进行阳性选择例如30秒至2分钟、例如1分钟，以富集结合分离试剂的细胞。
在一个实施方案中，样品例如输入样品来自患有血液恶性肿瘤的患者，例如本文所述的血液恶性肿瘤，例如ALL或DLBCL。
在一个实施方案中，输入样品包含约1x105个有核细胞/ml、2x105个有核细胞/ml、5x105个有核细胞/ml、7x105个有核细胞/ml、1x106个有核细胞/ml、2x106个有核细胞/ml、5x106个有核细胞/ml、7x106个有核细胞/ml、1x107个有核细胞/ml、2x107个有核细胞/ml、5x107个有核细胞/ml、7x107个有核细胞/ml、1x107个有核细胞/ml、2x108个有核细胞/ml、5x108个有核细胞/ml和7x108个有核细胞/ml。在一个实施方案中，输入样品包含约1-1.5×107个T细胞。
在一个实施方案中，输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的单核细胞。在一个实施方案中，输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的肿瘤细胞，例如淋巴母细胞。在一个实施方案中，输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的免疫效应细胞，例如T细胞。在一个实施方案中，输入样品包含至少约5％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞，例如CD45+CD19+B细胞。在一个实施方案中，输入样品包含至少约5％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞，例如CD45-CD19+B细胞。
在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的肿瘤细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％的免疫效应细胞，例如T细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的T细胞，例如CD3+CD45+T细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞，例如CD45+CD19+B细胞。在一个实施方案中，输出样品包含少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞，例如CD45-CD19+B细胞。在一个实施方案中，输出样品包含至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或20％的T细胞。
另一方面，本公开的特征在于制备可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，其中所述方法包括：
i)提供输入样品，例如包含免疫效应细胞的冷冻输入样品或新鲜输入样品；任选地，其中输入样品是冷冻输入样品，解冻冷冻输入样品以产生解冻样品；
ii)进行富集步骤，其中富集步骤包括：对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；或使用包含碘克沙醇(例如在水中60％碘克沙醇)(例如Optiprep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤；和
iii)进行选择步骤，其中选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
另一方面，本公开的特征在于制备可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
i)提供输入样品，例如包含免疫效应细胞的冷冻输入样品或新鲜输入样品；
ii)任选地，其中输入样品是冷冻输入样品，解冻冷冻输入样品以产生解冻样品；
iii)进行富集步骤，其中富集步骤包括：
1)对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；或
2)使用包含碘克沙醇(例如在水中60％碘克沙醇)(例如Optiprep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤；和
iv)进行选择步骤，其中选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择或例如对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
另一方面，本公开的特征在于制备可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，其中所述方法包括：
i)提供包含免疫效应细胞的输入样品，例如冷冻输入样品或新鲜输入样品；
ii)进行富集步骤，其中富集步骤包括：进行淘析或密度离心(例如使用Ficoll或Optiprep介质)；
iii)进行选择步骤，其中选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。在一个实施方案中，例如通过使用流通装置在流动条件下进行选择步骤。
本文所述的任何方法或组合物的其它特征或实施方案包括以下一项或多项：
本文所述任何方法的任何实施方案中的输入样品是来自受试者的生物样品，其包含免疫效应细胞(例如T细胞和/或NK细胞)。在一个实施方案中，输入样品是血液样品，例如全血样品。在一个实施方案中，输入样品是单采血液成分术样品，例如白细胞去除术样品。在一个实施方案中，输入样品是新鲜样品，其中样品已经从受试者获得并且在从受试者获得的1天、2天、5天或7天内使用本文所述的任何方法进行处理。在一个实施方案中，输入样品是冷冻或冷冻保存的样品，例如在-20℃或液氮中冷冻或以每分钟1℃的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的单核细胞(和任选地多达40％、70％或95％的单核细胞)。在本文所述的任何方法的实施方案中，输入样品包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的肿瘤细胞，例如淋巴母细胞(和任选地多达50％或95％的单核细胞)。在本文所述任何方法的实施方案中，输入样品包含少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的免疫效应细胞，例如T细胞(和任选地多于20％的T细胞)。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞(和任选地多于1％或0.1％的单核细胞)。在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品包含少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的肿瘤细胞(和任选地多于1％或0.1％的肿瘤细胞)。在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％,或99.9％的免疫效应细胞，例如T细胞(和任选地多达60％或95％的T细胞)。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品与输入样品相比包括少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的单核细胞百分比。在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品与输入样品相比包括少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的肿瘤细胞百分比。在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品与输入样品相比包含至少50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的免疫效应细胞(例如T细胞)百分比。
在本文所述任何方法的实施方案中，方法进一步包括例如通过转导将编码CAR的核酸引入输出样品中的一种或多种免疫效应细胞中。本文描述了用于引入编码CAR的核酸的其它方法。
在本文所述任何方法的实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，例如包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。
在本文所述的任何方法的实施方案中，方法进一步包括测定转导效率的步骤。在本文所述任何方法的实施方案中，转导导致至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的转导效率。
在本文所述任何方法的实施方案中，方法进一步包括用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液(例如D5介质)例如使用CS5+仪器对输入样品进行洗涤的步骤。
在本文所述的任何方法的实施方案中，免疫效应细胞是人免疫效应细胞。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品包含CD8+T细胞。在本文所述的任何方法的实施方案中，输出样品包含CD4+T细胞。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输入样品来自患有与肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原，例如CD19)相关的疾病的患者，选自增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病变如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期、或者是与本文所述的肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应证。在一个实施方案中，疾病是本文所述的癌症，例如本文描述为与本文所述的靶相关的癌症。在一个实施方案中，血液癌症是白血病。在一个实施方案中，癌症选自一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其它血液癌症或血液病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)组成的各种血液疾病，以及与本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病包括但不限于非典型和/或非典型癌症、恶性肿瘤、癌前病变或表达如本文所述的肿瘤抗原的增殖性疾病；及其任何组合。在另一个实施方案中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输入样品来自患有癌症的患者，所述癌症选自：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其它血液癌症或血液病症包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和白血病前期、非典型和/或非典型癌症、恶性肿瘤、癌前病变或增殖性疾病，及其任何组合。
在本文所述的任何方法的实施方案中，输入样品来自患有ALL的患者。
在本文所述的任何方法的实施方案中，方法进一步包括测定输出样品中细胞上的一种或多种细胞表面标记物例如CD45、CD19、CD3、CD28、CD25或CD14的步骤。
在本文所述任何方法的实施方案中，方法进一步包括用刺激免疫效应细胞增殖(例如刺激CD3/TCR复合物相关信号)的试剂和/或刺激T细胞表面上共刺激分子的配体(例如抗CD3抗体和抗CD28抗体)刺激输出样品。
在本文所述的任何方法的实施方案中，方法进一步包括例如通过转导、转染或电穿孔引入编码CAR的核酸。
另一方面，本公开的特征在于通过本文公开的方法(例如上面公开的方法)产生的反应混合物。
另一方面，本公开的特征在于包含至少80％、85％、90％或95％的T细胞和少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的单核细胞的反应混合物，其中反应混合物中的细胞总数加起来达到100％。在一个实施方案中，反应混合物总共包含至少1x106、2x106、5x106、1x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108个细胞。在一个实施方案中，反应混合物包含少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞。在一个实施方案中，反应混合物包含少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的癌细胞，例如淋巴母细胞。
在本文所述的任何反应混合物中，一种或多种T细胞表达CAR，例如本文所述的任何CAR。
在本文所述的任何反应混合物中，反应混合物还包括编码CAR的核酸，例如，其中核酸置于T细胞内或T细胞外。
尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是下面描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献(例如，序列数据库参考编号)通过引用整体并入本文。例如，本文(例如在本文的任何表中)提到的所有GenBank、Unigene和Entrez序列均通过引用并入。除非另外指明，否则本文中(包括本文任何表中)指定的序列登录号是指截至2015年12月28日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，包括所有序列变体。
另外，这些材料、方法和实例仅仅是说明性的而不是限制性的。标题、副标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅仅是为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素按字母顺序进行，或者步骤或元素必须彼此离散。从说明书和附图以及权利要求中，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1A是具有流通磁分离/脱珠模块的细胞处理系统的示意图；
图1B是具有多个并联的流通磁分离/脱珠模块的细胞处理系统的示意图；
图1C是具有多个串联的流通磁分离/脱珠模块的细胞处理系统的示意图；
图1D是具有返回回路的细胞处理系统的示意图；
图1E是细胞处理系统的示意图，其中细胞悬液和缓冲模块分别连接到流通磁分离/脱珠模块；
图1F是包括旋转膜脱珠模块的细胞处理系统的示意图；
图1G是细胞处理系统的示意图，包括多个流通磁分离/脱珠模块和多个旋转膜脱珠模块；
图1H是具有流通磁分离/脱珠模块的细胞处理系统的另一示意图；
图2A是x-方向磁体配置中的流通磁分离/脱珠模块的横截面示意图；
图2B是图2A的流通磁分离/脱珠模块的半透明三维示意图；
图3是具有膜和子膜流体注入口的流通磁分离/脱珠模块的侧面纵向截面示意图；
图4A是处于零梯度配置的流通磁分离/脱珠模块的横截面示意图；
图4B是图4A的流通磁分离/脱珠模块的半透明三维示意图；
图4C是处于零梯度配置以产生零梯度过滤器的流通磁分离/脱珠模块的顶部纵向截面示意图；
图4D是处于多个零梯度配置以产生多个零梯度过滤器的流通磁分离/脱珠模块的顶部纵向截面示意图；
图5A是旋转膜脱珠模块的纵向截面示意图；
图5B是具有第一磁体配置的旋转膜脱珠模块的横截面示意图；
图5C是具有第二磁体配置的旋转膜脱珠模块的横截面示意图；
图6是细胞上的流体力和磁力的图；
图7A、图7B和图7C是图2B的流通磁分离/脱珠模块的图，其中在磁分离期间存在细胞；
图8A和图8B是图2B的流通磁分离/脱珠模块的图，其中在磁脱珠期间存在细胞；
图9是比较使用图2A和2B的流通磁分离/脱珠模块的脱珠结果和使用传统停流模块的脱珠结果的图(方框代表四分位数和中位数)；
图10A是流通磁分离/脱珠模块的顶部纵向x-y横截面示意图，其中在模块入口(左侧)附近和模块出口(右侧)附近存在顺磁性颗粒结合的细胞。
图10B是流通磁分离/脱珠模块的侧面纵向横截面示意图，其中在模块入口(左侧)附近和模块出口(右侧)附近存在顺磁性颗粒结合的细胞。
图11是类似于图4A的顺磁性颗粒结合的细胞和未结合的细胞的磁分离期间的流通磁分离/脱珠模块的图；
图12是图4C的流通磁分离/脱珠模块的图，其中在顺磁性颗粒结合的细胞和未结合的细胞的磁分离期间存在细胞；
图13是图4C的流通磁分离/脱珠模块的图，其中在顺磁性颗粒与脱珠的未结合的细胞磁分离期间存在细胞；和
图14是图5的旋转膜脱珠模块的图，其中在脱珠期间存在细胞。
图15A和图15B是显示在Sepax SmartWash和在改良介质(图15A)或在水性D51/2NS溶液(图15B)中重悬后细胞的图片。
图16A和图16B是比较不同洗涤方案后细胞回收的图。图16A显示CS5+洗涤和SepaxSmartWash程序后细胞回收的比较，其中两个程序均在水性D51/2NS溶液中进行。图16B显示CS5洗涤后和在改良介质中温育细胞2小时后与在水性D51/2NS溶液中的细胞比较的细胞回收比较。
图17是显示方法B中的步骤与新的OptiPrep方法比较的图。
图18是显示Sepax 2NeatCell袋和管套件的设置的示意图。
图19A、19B、19C、19D和19E是显示通过方法B(使用Ficoll产品的密度梯度离心)或通过新的Sepax与OptiPrep方法(OptiPrep产品)产生的产物的表型比较的图。图19A显示T细胞产率。图19B显示B细胞产率。图19C显示单核细胞产率。图19D通过表型显示终产物的相对组成。图19E通过表型显示终产物的绝对组成。
图20是显示用于优化阳性选择(FAST)的无菌袋套件的示意图。
图21是显示用于优化阳性选择(FAST)的改良盖子的示意图。
图22是显示迄今临床批次的活细胞数目的图。黑色线表示方法B处理的批次。彩色线表示FAST方法处理的批次。
图23A、23B和23C显示实施例5中实验1的细节。图23A是结果的示意性概述和总结。图23B是实验组1的一系列FAST前、后的富集曲线。图23C是实验组2的一系列FAST前、后的富集曲线。
图24A、24B和24C显示实施例5中实验2的细节。图24A是结果的示意性概述和总结。图24B是实验组1的一系列FAST前、后的富集曲线。图24C是实验组2的一系列FAST前、后的富集曲线。
图25A和25B显示实施例5中实验3的细节。图25A是结果的示意性概述和总结。图25B是一系列FAST前、后的富集图。
图26A和26B是显示进行CD19阴性选择的结果的表格。图26A显示来自健康供体和ALL患者的单采血液成分术样品中CD19+细胞除去的可行性。图26B显示在进行不同富集方案(TR149、TR150和TR151)之前和之后不同细胞类型，T细胞、单核细胞和CD19 B细胞的分布。
图27是显示方法B步骤的示意图。“APH样品”表示输入单采血液成分术样品，其可以是新鲜的或冷冻的。“CS5”表示洗涤步骤，例如使用细胞洗涤或细胞处理系统如CS5+仪器。“Sepax”表示使用Ficoll进行密度梯度分离。“阳性选择”表示基于Dynabead的“静态”分离，例如使用CD3/CD28 Dynabead。
图28是显示例如在流动条件下(右)的目前的“静态”磁分离(左)和“动态”磁分离的示意图。“选择”(中)示意图显示与其靶分子相关的磁分离试剂的分离，所述靶分子被磁性元件吸引，从而将靶分子与不想要的分子分离出来。
图29A、29B和29C显示用CD19(图29A)、PMA(图29B)和间皮素(图29C)刺激后的IFNγ释放测定法的结果。使用沿X轴列出的不同方案制备测试的免疫效应细胞样品。
图30A、30B和30C显示细胞毒性测定法的结果。图30A和30B显示使用沿X轴列出的不同方案制备的每种免疫效应物样品的特异的裂解百分比。图30C显示从图30A和30B获得的细胞毒性结果，表示为倒数EC50单位。
图31是作为输入细胞数函数的非流通脱珠方法和流通脱珠方法的收获产率的图；和
图32是作为输入细胞数函数的非流通脱珠方法和流通脱珠方法的收获产率的分箱图。
详细说明
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“a”和“an”是指物品的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说，“an element”是指一个元件或多于一个元件。
当提及如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意味着涵盖指定值的±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％的变化，因为这样的变化适合于进行所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或可选地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两个，当在免疫效应细胞中时，其为细胞提供对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性以及细胞内信号产生。在一些实施方案中，CAR至少包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包括源自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽处于相同的多肽链中(例如，包括嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如处于不同的多肽链中。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，当二聚化分子存在时，其可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域与细胞内信号传导结构域偶联。在一个实施方案中，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。一方面，细胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3ζ的初级信号传导结构域)。在一个实施方案中，细胞质信号传导结构域还包括如下定义的至少一个共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激分子是本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包括刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基末端(N-末端)的任选的前导序列。在一个实施方案中，CAR进一步包括在细胞外抗原结合结构域的N-末端的前导序列，其中前导序列任选地在CAR细胞处理和CAR定位至细胞膜期间从抗原结合结构域(例如scFv)切割。
包括靶向特定肿瘤抗原X的抗原结合结构域(例如scFv或TCR)的CAR(例如本文所述的那些)也被称为XCAR。例如，包括靶向CD19的抗原结合结构域的CAR被称为CD19CAR。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递信息发挥作用，通过产生第二信使的确定信号传导途径调节细胞活性，或通过对这些信使应答而作为效应物发挥作用。
如本文所用，术语“抗体”是指源自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以来自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指保留与抗原表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域)、由抗体片段形成的多特异性抗体，所述抗体片段如包括通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段、抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。也可以将抗原结合片段掺入单结构域抗体、最大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、纳米抗体(nanobody)、胞内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段接枝到基于多肽(例如纤连蛋白III型(Fn3))的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链可变区的抗体片段和至少一个包括重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区例如通过合成接头(例如短的柔性多肽接头)连续连接，并且能够作为单链多肽表达，其中scFv保留衍生其的完整抗体的特异性。除非特别指出，如本文所用的scFv可以以下任一顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可包括VL-接头-VH或可包括VH-接头VL。
包括抗体或其抗体片段的CAR部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个实施方案中，CAR的抗原结合结构域包括抗体片段。在另一个实施方案中，CAR包含包括scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包括多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性，多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体针对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
包括抗体或其抗体片段的本发明的CAR部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包括抗体片段。另一方面，CAR包含包括scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”是指抗体分子在其天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子以其天然存在的构象存在的两种类型多肽链中较小的一种。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，通常，每个重链可变区中有三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和HCDR3)，每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。可以使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定给定CDR的精确氨基酸序列边界，所述方案包括Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)中的那些或其组合。在Kabat编号方案下，在一些实施方案中，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia编号方案下，在一些实施方案中，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于作为Kabat CDR、Chothia CDR或两者中的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且对应于VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，如，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应该解释为通过以下方法产生的抗体：合成编码抗体的DNA分子、该DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中使用本领域可获得的和已知的重组DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特定的具有免疫活性的细胞的活化，或两者。本领域技术人员将会理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合配置以编码引发所需免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来自生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其它生物组分的流体。
术语“自体”是指来自同一个体的任何材料，其随后被重新引入到该个体中。
术语“同种异体”是指来自与个体相同物种的不同动物的任何材料，该材料被引入该个体。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或两个以上的个体被认为是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传学上充分不同而在抗原上相互作用。
术语“异种”是指来自不同物种的动物的任何材料。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统传播到身体的其它部位。本文描述了各种癌症的例子，包括但不限于乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，两个术语都包括实体和液体肿瘤，例如弥散或循环的肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括癌前期以及恶性癌症和肿瘤。
本文所用术语“衍生自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不意味着或包括对衍生自第二分子的第一分子的方法或来源限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需功能，即在适当条件下产生信号的能力。这不意味着或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定方法的限制，例如，这并不意味着为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并缺失不需要的序列，或施加突变，以获得细胞内信号传导结构域。
短语“与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病”包括但不限于与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的病症，包括，例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病变如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应证。在一个实施方案中，与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一个实施方案中，与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的其它疾病包括但不限于例如与本文所述的肿瘤抗原的表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病变或增殖性疾病。与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施方案中，肿瘤抗原表达细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞在一个点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19表达相关的疾病或与表达CD19的细胞相关的疾病，包括例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病变，如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应证。在一个方面，与CD19表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如急性髓性白血病(AML)、B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达相关的其它癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓增生性肿瘤；组织细胞病症(例如肥大细胞病症或浆细胞样浆细胞样树突状母细胞瘤)；肥大细胞病症，例如系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；B细胞幼淋巴细胞性白血病、浆细胞性骨髓瘤、以及“白血病前期”，其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)组成的各种血液疾病的多样化集合。与CD19表达相关的其它疾病包括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病变或增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施方案中，肿瘤抗原表达细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞在一个点上产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。在其它实施方案中，疾病是CD19阴性癌症，例如CD19阴性复发癌症。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞在一个点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括但不限于与CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病变，如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19、CD20、CD22或ROR1中的一种或多种的细胞相关的非癌症相关适应证。为了避免疑义，与B细胞抗原表达相关的疾病可包括与目前不表达B细胞抗原(但曾经一度表达抗原)的细胞相关的疾病，例如，因为抗原表达已被下调(例如由于用靶向B细胞抗原的分子(例如靶向B细胞的CAR)治疗)。如本文所述，短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括与CD19表达相关的疾病。在实施方案中，表达CAR的细胞用于治疗与B细胞抗原相关的疾病。在实施方案中，通过本文的方法产生的CAR包含靶向B细胞抗原的抗原结合结构域。
本文所用的术语“复发”是指例如在先用治疗(例如癌症治疗)治疗后，在初始反应期后(例如完全反应或部分反应)，疾病(例如癌症)的再现。初始反应期可包括癌细胞水平降到低于某个阈值，例如低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。再现可包括癌细胞水平升高到某个阈值以上，例如高于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。例如，例如在B-ALL的情况下，在完全反应之后，再现可包括例如血液、骨髓(>5％)或任何髓外部位中的母细胞的再现。在这种情况下，完全反应可包括<5％的BM母细胞。更一般地，在一个实施方案中，反应(例如完全反应或部分反应)可包括不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施方案中，初始反应期持续至少1、2、3、4、5或6天；至少1、2、3或4周；至少1、2、3、4、6、8、10或12个月；或至少1、2、3、4或5年。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无反应的疾病，例如癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗之前或在治疗开始时对治疗有抗性。在其它实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变成抗性。难治性癌症也被称为耐受性癌症。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体或抗体片段。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本文描述的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能测定法来测试改变的CAR。
术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或CAR情况下的肿瘤抗原)结合而诱导的初级应答，从而介导信号转导事件如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导或经由适当的NK受体或CAR信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导改变某些分子的表达。
术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以刺激方式调节免疫细胞活化的细胞质信号传导序列，所述刺激方式针对免疫细胞信号传导途径的至少一些方面。在一个方面，信号是例如通过TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合而启动的初级信号，其导致介导T细胞应答，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式发挥作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有信号传导基序，其称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在本发明中特别使用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(Fc Epsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的具体CAR中，本发明的任何一种或多种CARS中的细胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是提供为SEQ ID NO：9(突变体CD3ζ)的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。在本发明的特定CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是SEQ ID NO：10(野生型人CD3ζ)中提供的序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞，如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)，其在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可产生促进含CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应功能的信号。例如在CART细胞中，免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，细胞内信号传导结构域是转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质的部分。虽然可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整的链。因此术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，细胞内信号传导域可以包括初级细胞内信号传导结构域。示例性的初级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共同受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可包括已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI和CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBank Acc No BAG36664.1提供的蛋白质，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基，“ζ刺激结构域”或者“CD3ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。一方面，ζ的细胞质结构域包括GenBank Acc No BAG36664.1的残基52至164，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基，这些等同残基是其功能性直向同源物。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3ζ刺激结构域”是SEQ ID NO：9提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3ζ刺激结构域”是SEQ ID NO：10提供的序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是有效免疫应答所需的。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化的NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以包括衍生其的分子的完整细胞内部分或完整天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段。
细胞内信号传导结构域可以包括衍生其的分子的完整细胞内部分或完整天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段。
术语“4-1BB”是指具有GenBank Acc No.AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基的TNFR超家族的成员；“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank Acc.No.AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO：7提供的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。
本文使用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫效应物应答。免疫效应细胞的实例包括T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓样来源的吞噬细胞。
如本文使用的术语“免疫效应功能或免疫效应应答”是指增强或促进对靶细胞免疫攻击的功能或应答，例如免疫效应细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答是指促进靶细胞杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。
术语“效应功能”是指专门的细胞功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
如本文可互换使用的术语“耗尽”或“除去”是指在例如进行选择步骤(例如阴性选择步骤)之后样品中的细胞、蛋白质或大分子的水平或量的减少或降低。除去可以是细胞、蛋白质或大分子的完全或部分耗尽。在一个实施方案中，除去为与进行该过程之前样品中的细胞、蛋白质或大分子的水平或量相比，细胞、蛋白质或大分子的水平或量至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％减少或降低。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸(例如rRNA、tRNA和mRNA)序列或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学性质。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码蛋白质。编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提供，用作基因或cDNA转录模板的非编码链可以指编码蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。
除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。在编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可以含有内含子的程度上，短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子。
术语“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统的任何材料或在其内部产生的任何材料。
术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统以外引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包括分离的核酸的物质组合，其可用于将分离的核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应该解释为进一步包括促进核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包括在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；其可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活的慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其它实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源”或“同一性”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间，如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每个分子的位置都被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数的直接函数；例如，如果两个序列中一半位置(例如十个亚基长度的聚合物中五个位置)是同源的，则两个序列50％同源；如果90％的位置(例如10个中的9个)相匹配或同源，则两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包括既不存在于受体抗体也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段的性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且FR区的全部或大部分是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“完全人”是指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”是指从天然状态中改变或移除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存物质中部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，如，例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，对于通常存在的核酸碱基使用以下缩写。“A”是指腺苷、“C”是指胞嘧啶、“G”是指鸟苷、“T”是指胸苷、“U”是指尿苷。
术语“有效连接”或“转录控制”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能性连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列被放置于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。有效连接的DNA序列可以彼此连续，并且例如在需要连接两个蛋白编码区时，其处于相同的阅读框内。
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如化学合成)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖包括天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，所述类似物或衍生物与参照核酸具有相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列也隐含包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；and Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，对可以包括蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。如本文所用，该术语是指短链和较长的链，其中短链在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物，较长的链在本领域通常称为蛋白质，蛋白质有很多种类。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指被细胞合成机制识别的DNA序列，或引入合成机制的DNA序列，其是启动多核苷酸序列的特定转录所需的。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列有效连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在其它情况下，该序列还可以包括表达基因产物所需的增强子序列和其它调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指核苷酸序列,，其当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效连接时，基本上仅在细胞中存在对应于启动子的诱导子时使基因产物在细胞中产生。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸有效连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指与正常细胞相比，完全或作为片段(例如MHC/肽)优选表达于癌细胞表面的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，其可用于针对癌细胞的药物制剂的优选靶向。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标记物，例如谱系标记物，例如B细胞上的CD19。在某些方面，本发明的肿瘤抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。在一些实施方案中，癌症相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比，过表达1倍、过表达2倍、过表达3倍或更多倍。在一些实施方案中，癌症相关抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，癌症相关抗原将完全或作为片段(例如，MHC/肽)仅仅在癌细胞的细胞表面上表达，不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，本发明的CAR包含CAR，其包括结合MHC呈递肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)。通常，源自内源性蛋白质的肽充满主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫治疗的独特类别的细胞表面靶。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的背景下靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，可以通过筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)来鉴定TCR样抗体。
在scFv上下文中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸残基)组成的肽接头，以将重链可变区和轻链可变区连接一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包括氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：15)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9和n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：28)。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO：29)的多个重复。在本发明范围内还包括WO2012/138475中描述的接头，在此引入作为参考)。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽，RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的“前部”或5'端。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。其存在对于核糖体识别和RNase保护是重要的。帽添加与转录相关联，并且共转录发生，使得每个都影响另一个。转录开始后不久，正在合成的mRNA 5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。该酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指体外合成的RNA，例如mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包括用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“poly(A)”是通过聚腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施方案中，polyA为50至5000(SEQ ID NO：30)，例如大于64、例如大于100、例如大于300或400个poly(A)序列被化学修饰或酶修饰以调节mRNA功能性，如定位、稳定性或翻译的效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酸部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端聚腺苷酸化。3'poly(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用将腺嘌呤核苷酸的长序列(通常数百个)添加到前体mRNA。在高等真核生物中，poly(A)尾被添加到含有特定序列的转录物上(聚腺苷酸化信号)。poly(A)尾和与之结合的蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出和翻译也很重要。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但是另外也可以在细胞质中稍后发生。转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用被切割。切割位点的特征通常为在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基添加到切割位点的游离3'端。
如本文所用，“瞬时”是指在数小时、数天或数周的期间内表达未整合的转基因，其中表达的时间期间少于基因整合到基因组中或包括在宿主细胞中稳定的质粒复制子内表达的时间。
单采血液成分术是将全血从个体中取出、分离成选择的成分、并将其余部分返回到循环中的方法。一般来说，有两种分离血液成分的方法，即离心和非离心。白细胞去除术导致患者白血细胞的活性选择和除去。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由于施用一种或多种治疗(例如本发明的一种或多种治疗剂，如CAR)而降低或改进增殖性疾病的进展、严重性和/或持续时间，或改进增殖性疾病的一种或多种症状(例如，一种或多种可识别的症状)。在具体的实施方案中，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指改进增殖性病症的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，其不一定可被患者辨别。在其它实施方案中，术语治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指身体上(例如通过稳定可辨别的症状)、生理学上(例如通过稳定身体参数)或二者上抑制增殖性疾病的进展。在其它实施方案中，术语治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指降低或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指多个信号转导分子之间的生物化学关系，所述信号转导分子在信号从细胞的一部分向细胞的另一部分的传递中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传递信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已从其天然存在状态下通常与其相关的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指均质细胞群。在其它情况下，这个术语简单地指的是从其天然状态下与其天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞在体外培养。在其它方面，细胞不是体外培养的。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”是指特定过度增殖性疾病常见的抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原衍生自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的方法。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
术语“特异性结合”是指抗体或配体，其识别和结合样品中存在的同源结合配偶体蛋白，但该抗体或配体基本上不识别或结合样品中其它分子。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，如从1至6的范围描述应该被认为具有特定公开的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些，并且包括子范围如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。无论范围的宽度如何，这都适用。
描述
本文提供了制备可用CAR(例如本文所述的CAR)工程化的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的方法，以及包括此类细胞的反应混合物和组合物。本文提供的方法改进了适于表达CAR的细胞的产率和质量，例如纯度。不希望受理论束缚，认为可被工程化以表达CAR的细胞的产率和质量的改进改进了引入编码CAR的核酸的效率并且改进了所得表达CAR的细胞的扩增。因此，本文所述的方法和组合物提供了用于治疗受试者疾病的改进的表达CAR的细胞产物。
在一个方面，本公开的特征在于除去不想要的物质、非靶细胞或可负面影响CAR表达或表达CAR的细胞的治疗功效的细胞的方法。例如，本文所述的方法可以用于除去或消除以下任何一种或多种：单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板、B细胞、癌细胞，例如淋巴母细胞(lyphoblast)、冷冻保护剂(来自冷冻样品)、血红蛋白或细胞碎片。例如，本文所述的方法可用于富集或增加以下任何一种或多种的数目：T细胞(CD4+和/或CD8+T细胞)、NK细胞、树突细胞。本文所述的每种方法单独或与本文所述的每种或全部方法组合实施获得改进的适合工程化以表达CAR的起始材料。
新鲜单采血液成分术材料通常用于制备适合表达CAR的细胞。使用冷冻的(例如冷冻保存)的单采血液成分术材料提供了易于运输的优点，从而消除了任何限制患者的位置在表达CAR的细胞产品制造设施附近，并允许表达CAR细胞的制造方法的工业化过程和需要其的患者对治疗产品的更大的可达性。目前用于制造表达CAR的细胞的方法针对新鲜单采血液成分术材料的处理进行了优化，并且不能用于从冷冻的单采血液成分术样品中获得适于CAR表达的类似质量或产率。相反，本文描述的方法可用于从冷冻(例如，冷冻保存)的单采血液成分术样品处理和制造适于CAR表达的细胞。在起始材料被冷冻(例如冷冻保存)的实施方案中，本文所述的方法任选地包括解冻步骤，其中使冷冻的细胞解冻，例如，没有操作者或装置的干扰以加速解冻过程，或使冷冻细胞经历加速解冻过程的装置或方法，例如通过使用解冻装置，例如PlasmaTherm。在这样的实施方案中，解冻材料具有与周围环境相同的温度，例如与房间的环境温度相同的温度或与解冻材料中加入、洗涤所使用或温育所使用的缓冲液相同的温度。本文描述的方法尤其可用于从冷冻或解冻的输入样品(例如，冷冻或解冻的单采血液成分术样品)产生或富集可以被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群。
如本文所提及的方法B是目前使用的用于富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞的标准方案。方法B包括使用Ficoll进行密度梯度纯化，和使用CD3/CD28 Dynabead进行阳性选择，其中输入样品是新鲜的单采血液成分术材料。本文描述的方法提供了期望的适于表达CAR的免疫效应细胞的更高的富集、改进的质量和产率。
另一方面，本公开的特征在于例如通过本文所述的任何制造方法制备被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其中工程化的免疫效应细胞表现出抗肿瘤特性。在一个实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。示例性抗原是本文所述的癌症相关抗原(即，肿瘤抗原)。一方面，用CAR转化细胞并在细胞表面表达CAR。在一些实施方案中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如T细胞、NK细胞)。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些这样的实施方案中，细胞可以稳定表达CAR。在另一个实施方案中，用编码CAR的核酸例如mRNA、cDNA、DNA转染细胞(例如T细胞、NK细胞)。在一些这样的实施方案中，细胞可以瞬时表达CAR。
此外，本公开提供表达CAR的细胞组合物及其在用于治疗癌症或恶性肿瘤或自身免疫性疾病等疾病的药物或方法中的用途，所述疾病包括表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞或组织。
淘析
在一个方面，本文描述的方法的特征在于除去不需要的细胞(例如单核细胞和母细胞)的淘析方法，从而导致改进期望的适于CAR表达的免疫效应细胞的富集。在一个实施方案中，针对从先前冷冻的样品(例如，解冻的样品)中富集期望的适于CAR表达的免疫效应细胞优化了本文所述的淘析方法。在一个实施方案中，与从本领域已知的淘析方案中收集的细胞制剂相比，本文所述的淘析方法提供了具有改进的纯度的细胞制剂。
为了促进生产后勤(远程样品收集、运输、储存和生产单位调度)，细胞原材料通常是冷冻保存的全血或单采血液成分术材料，其在开始制造之前需要解冻。然而，来自解冻的先前冷冻材料的细胞密度和尺寸与新鲜材料的细胞密度和尺寸非常不同。因此，通常用于分离工程化以表达CAR的细胞的标准淘析方案很大程度上不能从冷冻保存并解冻的全血或单采血液成分术材料中除去单核细胞、粒细胞或任何更大尺寸的细胞。这种情况对后续CART制造步骤的结果产生负面影响，导致糟糕的产率、产品质量问题和不合规格的工艺偏差。虽然淘析可以除去单核细胞，但它不能有效除去母细胞，因为母细胞与T淋巴细胞具有相似的密度和尺寸。
在一个实施方案中，本文所述的淘析方法包括通过用某些等渗溶液(例如PBS)稀释而使用优化粘度的起始样品(例如细胞样品，例如解冻的细胞样品)，并针对淘析装置收集的每个级分使用流速和收集体积的优化的组合。实施例1中描述了修改的淘析程序的例子。
表4中提供了用于从单核细胞分离淋巴细胞(例如T细胞)的淘析设置的示例性范围。在表4中指定为“Ex”的列中还提供了示例性淘析程序的流速、离心和体积的设置。
表4.淘析设置的范围
在一个实施方案中，从淘析步骤中收集一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个级分。在一个实施方案中，从淘析步骤中收集五个级分。在收集五个级分的实施方案中，第三级分(F3)或第四级分(F4)或第三级分和第四级分的组合含有期望的淋巴细胞群和最少量的单核细胞、粒细胞和其它非淋巴细胞。在一个实施方案中，使用不同的流速收集每个级分。在一个实施方案中，对于每个级分，流速从用于收集先前级分的流速增加。在一个实施方案中，使用不同的收集体积来收集一个或多个级分。
在一个实施方案中，使用流速约20-90mL/min、约30-90mL/min、约40-90mL/min、约50-90mL/min、约60-90mL/min、约70-90mL/min、约40-85mL/min、约50-82mL/min、约60-82mL/min、约70-82mL/min、约50-80mL/min、约60-80mL/min、约70-80mL/min进行淘析。在一个实施方案中，使用流速约30-82mL/min或约50-80mL/min进行淘析。在一个实施方案中，使用流速约30、40、50、60、70、72、80或82mL/min进行淘析。在一个实施方案中，使用流速约70mL/min或72mL/min进行淘析。
在一个实施方案中，含有期望的淋巴细胞群并具有最少量单核细胞、粒细胞、其它非淋巴细胞和其它不需要组分的一个或多个级分的流速为约20-90mL/min、约30-90mL/min、约40-90mL/min、约50-90mL/min、约60-90mL/min、约70-90mL/min、约40-85mL/min、约50-82mL/min、约60-82mL/min、约70-82mL/min、约50-80mL/min、约60-80mL/min、约70-80mL/min。在一个实施方案中，含有期望的淋巴细胞群的一个或多个级分的流速为约50-82mL/min、约50-80mL/min、约60-82mL/min、约60-80mL/min、约70-82mL/min、约70-80mL/min、约70-75mL/min、约70-72mL/min。在一个实施方案中，含有期望的淋巴细胞群的一个或多个级分的流速为约70mL/min或72mL/min。
在一个实施方案中，使用收集体积约250-1250mL、约250-1000mL、约300-1000mL、约400-1000mL、约500-1000mL、约600-1000mL、约700-1000mL、约800-1000mL、约900-1000mL、约250-975mL、约300-975mL、约400-975mL、约500-975mL、约600-975mL、约700-975mL、约800-975ml、约300-900mL、约300-800mL、约300-700mL、约300-600mL、约300-500mL或约300-400mL进行淘析。在一个实施方案中，使用收集体积约250、400、500、900或975mL进行淘析。在一个实施方案中，使用收集体积约400mL或约975mL进行淘析。
在一个实施方案中，含有期望的淋巴细胞群并具有最少量单核细胞、粒细胞、其它非淋巴细胞和其它不需要组分的一个或多个级分的收集体积为约250-1250mL、约250-1000mL、约300-1000mL、约400-1000mL、约500-1000mL、约600-1000mL、约700-1000mL、约800-1000mL、约900-1000mL、约250-975mL、约300-975mL、约400-975mL、约500-975mL、约600-975mL、约700-975mL、约800-975ml、约300-900mL、约300-800mL、约300-700mL、约300-600mL、约300-500mL或约300-400mL。在一个实施方案中，含有期望的淋巴细胞群的一个或多个级分的收集体积为约250、400、500、900或975mL。在一个实施方案中，含有期望的淋巴细胞群的一个或多个级分的收集体积为约400mL或约975mL。
在一个实施方案中，本文所述的淘析方法由淘析装置进行。例如，淘析装置是Caridian BCT ElutraTM细胞分离系统(Terumo BCT 71800)。Caridian BCT ElutraTM细胞分离系统(Terumo BCT 71800)是一种封闭系统，其利用连续逆流淘析技术主要基于尺寸、其次基于比重进行细胞分离。由介质流入分离室产生的相反力和由离心力产生的沉降速度导致细胞在分离室内通过尺寸和密度自行排列，其中它们被自动虹吸到收集袋中。设计定制的Elutra设置以允许组合粒细胞的淋巴细胞和单核细胞分布在不同级分中。可以根据制造商的指示操作Elutra。
密度梯度离心
过继性细胞治疗产品的制造需要处理期望的细胞，例如免疫效应细胞，使其与血细胞和存在于外周血单采血液成分术起始材料中的血液成分的复杂混合物分离。使用密度梯度离心通过Ficoll溶液已经成功分离了外周血来源的淋巴细胞样品。但是，Ficoll不是用于分离治疗用细胞的优选试剂，因为Ficoll不具备临床应用资格。另外，Ficoll含有乙二醇，对细胞有潜在毒性。此外，Ficoll密度梯度离心解冻的冷冻保存后的单采血液成分术产物，产生次优的T细胞产物，例如如本文实施例中所述。例如，在通过Ficoll溶液的密度梯度离心分离的细胞制剂中观察到最终产品中T细胞的丧失、具有相对增加的非T细胞，尤其是不想要的B细胞、母细胞和单核细胞。
不希望受理论束缚，认为免疫效应细胞例如T细胞在冷冻保存期间脱水，变得比新鲜细胞更稠密。不希望受理论束缚，还认为免疫效应细胞(例如T细胞)比其它血细胞更长时间保持更稠密，因此与其它细胞相比，在Ficoll密度梯度分离期间其更容易损失。因此，不希望受到理论的限制，与Ficoll或与Ficoll具有相同密度(例如1.077g/mL)的其它介质相比，相信密度大于Ficoll的介质提供期望的免疫效应细胞的改进的分离。
在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度介质。在一个实施方案中，密度梯度介质包括在水中的约60％的碘克沙醇。
在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法包括使用密度大于Ficoll的密度梯度介质。在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法包括使用密度大于1.077g/mL，例如大于1.077g/mL、大于1.1g/mL、大于1.15g/mL、大于1.2g/mL、大于1.25g/mL、大于1.3g/mL、大于1.31g/mL的密度梯度介质。在一个实施方案中，密度梯度介质具有约1.32g/mL的密度。
在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法包括使用包含碘克沙醇的密度梯度介质，例如在水中约60％的碘克沙醇，并且其密度大于Ficoll，例如大于1.077g/mL，例如约1.32g/mL。在一个实施方案中，本文所述的密度梯度离心法包括使用密度梯度介质OptiPrepTM(Sigma)。OptiPrepTM是现成的60％(w/v)碘克沙醇的无菌和内毒素测试溶液，密度为1.320±0.001g/ml。相反，Ficoll密度梯度溶液的密度仅为1.077g/ml。OptiPrepTM与Ficoll相比的另一个优势是可获得GMP等级的OptiPrepTM，因此符合治疗用途。
不希望受理论束缚，认为利用OptiPrep密度梯度离心步骤(例如使用解冻的单采血液成分术材料)不太可能保留不想要的B细胞和单核细胞，因此认为其进一步改进了期望的目标免疫效应细胞(例如T细胞)的收集，以用于随后的活化和转导步骤。因此，不希望受理论束缚，认为与Ficoll相比，OptiPrep的更高的密度允许期望的免疫效应细胞(例如T细胞)的加强的纯化和回收，并同时除去不想要的非T细胞类型，否则这些非T细胞类型可能干扰制造表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)产品制造的持续成功的结果。
在一个实施方案中，使用细胞分离装置进行密度梯度离心。细胞分离装置的例子包括Sepax2(Biosafe)。例如，在密度梯度离心步骤之前或之后进行洗涤步骤(例如本文所述的改进的洗涤步骤)的实施方案中，可以使用与密度梯度离心步骤中使用的相同装置进行洗涤步骤。
通过选择富集
本文提供了用于选择特定细胞的方法，以改进期望的适于CAR表达的免疫效应细胞的富集。在一个实施方案中，选择包括阳性选择，例如选择期望的免疫效应细胞。在另一个实施方案中，选择包括阴性选择，例如选择不需要的细胞，例如除去不需要的细胞。在实施方案中，本文描述的阳性选择方法或阴性选择方法在流动条件下进行，例如通过使用流通装置，例如本文所述的流通装置。
可以进一步优化目前的选择方法，例如使用CD3/CD28 CTSTM的阳性选择，以用于富集。首先，在选择期间使用的Dynabead的量通常不基于存在于密度梯度离心(例如Sepax Ficoll)后样品中的CD45+/3+细胞(例如CD45+/3+细胞)的百分比，而是基于存在于原始患者材料中的细胞(例如CD45+/3+细胞)的百分比。考虑到由密度梯度离心步骤(例如Sepax Ficoll分离步骤)引起的组成的显著变化，该计算通常导致T细胞百分比的降低和单核细胞含量的增加。其次，两小时温育时间为非特异性结合到非靶细胞(即，非CD3和/或非CD28细胞)上以及非靶细胞通过内吞作用(例如，单核细胞)摄取珠子提供了充裕的机会，这些问题可能会损害阳性选择产品中的T细胞产率和纯度。最后，用于选择的磁性装置和操作可能是次优的。目前，磁分离发生在大量流体体积(200ml)内，这又导致磁性标记的细胞和磁性表面之间较大的距离。这限制了可用于分离的磁力，因此降低了分离灵敏度并需要更长的分离时间。另外，磁分离目前在统计学上进行，将样品置于磁性表面的顶部5分钟，然后除去负级分。这种延长的分离时间对于细胞是有害的，由于“堆积”效应细胞活力在过程中经常受到负面影响，并且为非靶细胞结合或内化珠子提供了进一步的机会。
与当前的选择方法相反，本文描述的选择方法包括例如在流动条件下“动态”发生的分离，而不是当前的“静态”分离过程。在一个实施方案中，流动条件下的分离包括磁分离试剂，例如选择性地结合靶抗原的磁珠、输入样品和磁体，其中磁分离试剂和输入样品通过(例如流过)磁体。在某些实施方案中，磁分离试剂和输入样品连续通过(例如流过)磁体。不受理论束缚，该动态技术能够减少温育时间(即，使样品与分离试剂接触)和分离时间，从而最小化对靶细胞的负面影响并显著降低非特异性结合的可能性和/或非靶群摄取珠子。此外，本文所述的选择方法不需要对选择试剂(CD3/CD28 CTSTM)进行任何修改，也不需要对用于选择的试剂的量(3：1的珠子与T细胞比例)进行任何修改。
在一个实施方案中，如本文所述，在流动条件下的分离或选择包括基于流通抗体的选择技术(FAST)方案。表12展示了当前选择技术和FAST方案之间不同参数的概况。
表12：当前阳性选择和FAST阳性选择之间的比较
在一个实施方案中，本文所述的选择方法包括比当前标准方案更短的分离试剂和输入样品的温育时间，然后进行磁分离。在一个实施方案中，温育期间少于2小时，例如少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于25分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。在一个实施方案中，温育在缓慢旋转下进行。
图20中显示了用于本文描述的选择方法的示例性套件。在一个实施方案中，套件包括三个袋的组装，其可以通过长钉(spike)或通过无菌焊接连接到另外的样品/缓冲袋。此外，在图21中显示的修改的DynaMag盖子用于分离，其将分离期间的最大体积限制为低体积，例如少于100mL、少于90mL少于80mL、少于70mL、少于60mL、少于50mL、少于40ml，例如约50ml。不希望受理论束缚，分离期间使用的低体积被认为优化了在分离过程中起作用的磁力并使分离时间最小化。经修改的DynaMag盖子还限制了珠子：细胞缀合物离开磁体的最大距离，并且在位置选择过程中对经历的磁体进行了标准化。
在一个实施方案中，本文描述的套件的一个或多个袋是三角形袋。在一个实施方案中，选择袋是三角形袋，并且能够在“流通”模式下进行磁分离，因为袋在选择袋的相对端处提供端口。在这样的实施方案中，细胞可以连续地流过磁性元件(例如，如DynaMag的磁板)，从而能够实时分离磁性标记的颗粒，而未标记的细胞不会被磁场吸引并将向外流动。这种流通配置使得系统特别适合自动化。修改的分离袋需要图21的修改的盖子以容纳额外的端口。
在一个实施方案中，选择袋不是三角形袋。在选择袋不是三角形袋的实施方案中，温育时间少于2小时，例如，少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于25分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟或少于5分钟。
阳性选择
在实施方案中，本文所述的阳性选择方法包括选择(例如富集)期望的免疫效应细胞。在一个实施方案中，本文所述的阳性选择方法包括选择CD3+/CD28+细胞。在其它实施方案中，本文所述的阳性选择方法包括选择以下中的一种或多种：CD3+细胞、CD28+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞或CD45+细胞。
本文所述的选择方法中使用的分离试剂包含磁性或顺磁性元件和抗原结合元件。在一个实施方案中，分离试剂包含珠子，例如具有与抗原结合元件偶联(例如，共价或非共价)的磁性或顺磁性性质的珠子。在一个实施方案中，抗原结合元件是抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，用于CD3+/CD28+细胞阳性选择中的分离试剂包含与CD3和/或CD28结合元件(例如抗CD3和/或抗CD28抗体或抗体片段)(例如共价或非共价)偶联的珠子。
阴性选择
本文还提供用于阴性选择或除去不需要的细胞(例如，单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板和B细胞)的输入样品的阴性选择方法，从而富集所得输出样品中期望的免疫效应细胞，例如T细胞。在一个实施方案中，本文所述的阴性选择方法在流动条件下进行，例如使用流通装置，例如本文所述的流通装置。
在一个实施方案中，本文所述的阴性选择方法包括阴性选择单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板、B细胞或癌细胞(例如淋巴母细胞)中的一种或多种。
在期望除去或移除单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板或B细胞中的一种或多种的实施方案中，阴性选择方法选择表达以下中一个或多个的细胞：CD19、CD25、CD14或由单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板或B细胞表达的其它表面标记物或蛋白质。
在受试者患有血液癌症的实施方案中，癌细胞可能存在于单采血液成分术样品中，并且可能期望除去癌细胞。在一个实施方案中，本文所述的阴性选择方法包括阴性选择CD19+细胞，例如淋巴母细胞。在另一个实施方案中，本文所述的阴性选择方法包括阴性选择表达以下一个或多个的癌细胞：CD19、CD33、CD123、CLL-1、BCMA、ROR1或FLT3。
本文所述的选择方法中使用的分离试剂包含磁性或顺磁性元件和抗原结合元件。在一个实施方案中，分离试剂包含珠子，例如具有与抗原结合元件偶联(例如，共价或非共价)的磁性或顺磁性性质的珠子。在一个实施方案中，抗原结合元件是抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，用于CD19+细胞的阴性选择中的分离试剂包含与CD19结合元件(例如抗CD19抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价)的珠子。在一个实施方案中，用于CD14+细胞的阴性选择中的分离试剂包含与CD14结合元件(例如抗CD14抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价)的珠子。在一个实施方案中，用于CD25+细胞的阴性选择的分离试剂包含与CD25结合元件(例如抗CD25抗体或抗体片段)偶联(例如，共价或非共价)的珠子。
示例性流通装置
如本文所述，选择方法可以在流动条件下进行，例如通过使用也称为细胞处理系统的流通装置来进一步富集期望的适合CAR表达的免疫效应细胞(例如T细胞)的细胞制剂。本部分描述了在流动条件下用于这种选择方法的示例性流通装置。
在一个实施方案中，细胞处理系统包含至少一个细胞悬液模块；至少一个缓冲模块；至少一个流通磁分离/脱珠模块；至少一个非磁性输出模块；和至少一个磁性输出模块。
在该系统的一些变型中，其可以包含至少一个返回回路，该返回回路返回至少一个流通磁分离/脱珠模块的上游；至少两个并联的流通磁分离/脱珠模块；至少两个串联的流通磁分离/脱珠模块，至少一个附加模块或其任何组合。所述至少一个附加模块可以包含至少一个旋转膜脱珠模块；至少两个并联的旋转膜脱珠模块；或至少两个串联的旋转膜脱珠模块。任何旋转膜脱珠模块可以包括邻近或接近圆柱形侧壁的至少一个磁体。
在更具体的变型中，流通磁分离/脱珠模块包括由壁限定并具有x方向、y方向和z方向的室；沿y方向室的相对端上配置的入口和出口；以及至少两个邻近或接近室壁并配置成在室内的入口和出口之间建立零梯度线的磁体。
在另一个更具体的变型中，其可以单独存在或者与第一更具体的变型组合，旋转膜脱珠模块包括由圆柱形侧壁部分地限定的脱珠室；具有内部并与圆柱形侧壁同轴取向的多孔旋转膜；样品入口；连接到旋转膜内部的废物输出模块；以及连接到脱珠室的细胞输出模块。
在另一个实施方案中，流通磁分离/脱珠模块包括由壁限定并具有x方向、y方向和z方向的室；在y方向上配置在室的相对端上的入口和出口；以及至少两个邻近或接近室壁并配置成在室内的入口和出口之间建立零梯度线的磁体。
在该模块的一些变型中，其包含至少两个入口和至少两个出口；至少三个邻近或接近室壁并配置成在入口和出口之间的室内建立至少两个零梯度线的磁体；在z方向上在室的相对侧上以两个阵列配置的至少四个磁体；在z方向上在室的相对侧上以两个阵列配置的至少四个磁体，其从z方向上的室的相对侧上的一个入口附近至一个出口附近在x-y平面上交叉定向；邻近室壁的子膜注入端口，其也邻近至少两个磁体，以及邻近子膜的膜；或其任何组合。
在另一个实施方案中，旋转膜脱珠模块包括由圆柱形侧壁部分地限定的脱珠室；具有内部并与圆柱形侧壁同轴取向的多孔旋转膜；样品入口；连接到旋转膜内部的废物输出模块；连接到脱珠室的细胞输出模块；以及邻近或接近圆柱形侧壁的至少一个磁体。
在该模块的一些变型中，其可以包括试剂模块，其孔径大于待脱珠颗粒的孔径并且小于待脱珠细胞的孔径，或者两者。
在又一个实施方案中，流通细胞处理方法包括使包含顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬液流过流通磁分离/脱珠模块以产生未结合的细胞产物。顺磁性颗粒结合的细胞通过流动步骤继续在流通磁分离/脱珠模块中移动。流通磁分离/脱珠模块包括由壁限定的流动室和至少两个邻近或接近至少一个壁配置的磁体，细胞悬液流过该流动室。
在该方法的一些变型中，细胞悬液层流通过流通磁分离/脱珠模块；细胞悬液还包含未结合的细胞，细胞悬液流过流通磁分离/脱珠模块，分离顺磁性颗粒结合的细胞与未结合的细胞；细胞悬液还包含游离顺磁性颗粒，细胞悬液流过流通磁分离/脱珠模块，分离游离顺磁性颗粒与未结合的细胞或其任何组合。
本文所述的方法还可以包括使用返回回路使分离的未结合的细胞第二次或在随后的时间流过流通磁分离/脱珠模块；使用返回回路使分离的顺磁性颗粒结合的细胞第二次或在随后的时间流过流通磁分离/脱珠模块；使顺磁性颗粒结合的细胞在流通磁分离/脱珠模块中第二次或在随后的时间内脱珠，以产生顺磁性颗粒和脱珠的未结合的细胞；使产生的顺磁性颗粒和脱珠的未结合的细胞第三次或在随后的时间流过流通磁分离/脱珠模块以分离顺磁性颗粒和脱珠的未结合的细胞或其任何组合。
在可与所有其它变型组合的另一种变型中，定向磁体以建立一条与流动方向交叉的零梯度线，使得顺磁性颗粒结合的细胞仅在一个方向上被牵拉至零梯度线，但在两个其它方向上不受来自磁体的磁力影响。
在可与所有其它变型组合的另一种变型中，室还包括磁入口(通过该磁入口任何顺磁性颗粒进入流动室)；非磁入口；与非磁入口相对的磁出口；以及与磁入口相对的非磁出口，其中零梯度线将所有顺磁性颗粒和任何顺磁性颗粒结合的细胞引导至磁出口。
细胞悬液还可以包含未结合的细胞，并且非磁入口可以比磁入口大，而非磁出口比磁出口大，使得从非磁入口流动的流体跨越到非磁出口，防止任何未结合的细胞流入磁出口。
或者，细胞悬液还可以包含未结合的细胞，并且非磁入口和磁入口可以具有基本上相同的尺寸，或者非磁出口和磁出口可以具有基本上相同的尺寸或两者，并且流体进入入口的相应流速、流体流出出口的相应流速或二者可以被调节，使得从非磁入口流动的流体跨越到非磁出口，防止任何未结合的细胞流入磁出口。
在可与所有其它变型组合的另一种变型中，该方法可以包括使顺磁性颗粒结合的细胞流过旋转膜脱珠模块以产生未结合的细胞产物。所述旋转膜脱珠模块可以包括：圆柱形脱珠室(顺磁性颗粒结合的细胞流过所述圆柱形脱珠室)，所述室部分地由圆柱形侧壁限定并且包括同轴旋转膜；以及至少一个磁体，所述至少一个磁体邻近或接近圆柱形侧壁配置，以在圆柱形脱珠室内建立至少一个零梯度线。
本公开涉及用于在顺磁性颗粒存在下，在细胞悬液中的顺磁性颗粒结合细胞或未结合的细胞的流通分离、脱珠、顺磁性颗粒分离、或其任何组合的系统和方法。该系统和方法使用流通磁分离/脱珠模块、旋转膜脱珠模块或两者。尽管本文所述的系统和方法可用于从任何类型的细胞除去顺磁性颗粒，但它们特别适用于从待用于细胞治疗的细胞中除去顺磁性颗粒。另外，虽然说明书的某些部分集中于顺磁性颗粒结合的细胞的阳性选择，但由于通常仅在阳性选择方法中进行脱珠，因此所述系统和方法也可用于阴性选择。当用于阴性选择时，通常会去掉任何脱珠模块和步骤。
分离和脱珠系统和模块
图1A是用于细胞悬液中的顺磁性颗粒结合的细胞的流通分离、脱珠、顺磁性颗粒分离或其任何组合的细胞处理系统2的示意图。系统2包括细胞悬液模块4、缓冲模块6、流通磁分离/脱珠模块8、非磁性输出模块10和磁性输出模块12。系统2任选地还可以包含至少一个附加模块16、至少一个返回回路14或两者。
系统2另外可包括流体管道(如管或软管)、连接器、阀、开关、夹、焊接部位、壳体、马达、泵、其它机械机构、电路、监测装置和控制装置。系统2可以进一步包括被编程以控制系统2的计算机或任何其部件以进行流通分离过程、流通脱珠过程、流通顺磁性颗粒分离过程或其任何组合。
系统2可具有静态配置，或者它可能具有适应性配置。一种适应性配置可以允许交换模块或插入附加模块。另一种适应性配置可以具有不可改变的模块组，但是可以改变流体到至少一个模块的路径。其它适应性配置可以允许交换和添加模块以及改变流体路径。系统2的部件可以促进适应性配置。例如，系统2中的编程计算机可以检测或使用关于哪些模块存在的信息或者可以控制流体路径。另外，系统2可以具有壳体或流体导管(其伴随连接器、阀、夹子或开关)，其允许在相同位置移除或插入不同模块。模块或其它部件可能包括识别元件，如条形码或射频识别(RFID)芯片，以允许自动检测其存在或不存在。模块或其它部件也可以包括一个或多个指示元件，其可以确保符合优质生产规范和其它安全规定。例如，温度敏感指示元件可以指示模块或其它部件已经加热消毒或没有经历可能损害其完整性或有效性的温度。指示元件也可以清楚地识别使用过的模块或其它部件。指示元件也可以由系统2自动检测，有助于最小化人为错误。
对特定过程不需要的系统2的部件可不存在、不连接或关闭。例如，可以存在单个输出模块而不是分开的非磁性输出模块10和磁性输出模块12，如图1H所示。另外，也如图1H所示，系统2的部件可具有与如图1A所示的不同的路径和连接的流体管道，这取决于阀、夹子、焊接部位、开关和连接器的配置。
细胞悬液模块4含有在悬液中悬浮的待分离或脱珠的细胞。如果要分离细胞，那么通常细胞悬液含有顺磁性颗粒结合的细胞和未结合的细胞。顺磁性颗粒结合的细胞可以是期望的细胞，在这种情况下，将在系统2中发生对顺磁性颗粒结合的细胞的阳性选择，或者顺磁性颗粒结合的细胞可能是不想要的，在这种情况下，将发生对顺磁性颗粒结合的细胞的阴性选择。
如果细胞待脱珠，或者如果顺磁性颗粒要与细胞分离，那么顺磁性颗粒结合的细胞是期望的细胞。它们可能之前使用系统2或另一系统从不想要的细胞分开。在存在不想要的细胞不成问题或不存在待分离的不想要的细胞的情况下，待脱珠的细胞可能之前未经历分离过程。
细胞可以直接从生物样品如血液或从细胞培养物中获得。
悬浮流体可以是能够在整个分离、脱珠或颗粒除去过程中支持细胞活力的任何流体。例如，其可以是培养介质、冷冻剂(如含DMSO的流体)、具有设定或控制的pH的另一种流体或具有营养素的另一种流体。它也可以是缓冲液，其可以与缓冲模块6中的缓冲液相同或不同。悬浮流体可以与缓冲液具有不同的粘度。它也可以具有与细胞进入系统2的介质不同的粘度，其可以是非常稠密的，如高密度Ficoll。
缓冲模块6中的缓冲液可以是任何可以与悬浮流体组合的液体，同时允许悬浮流体继续支持细胞的活力。例如，缓冲液可以具有设定或控制的pH值。缓冲液可以包括一种或多种细胞相容性盐。尽管在缓冲模块6中单独提供缓冲液，一旦缓冲液与细胞悬液混合，它就被认为是悬浮流体的一部分。
悬浮流体或缓冲液可以含有抗微生物剂，但是如果细胞稍后将被提供给患者，则通常没有抗微生物剂，除非系统2移除这些试剂(如通过旋转膜脱珠模块或其它模块)，或者除非它们稍后被另外的过程、模块或系统移除。
顺磁性颗粒可以由任何顺磁性和/或可磁化材料形成，如金属或金属合金。通常，顺磁性材料对细胞或任何稍后接受细胞的患者是无毒的，或者其被包被以避免毒性。可以选择顺磁性材料以实现高的磁饱和通量(ms)。通常，哪些顺磁性材料是适合的受到系统2中使用的磁体和使用磁体的模块配置的影响，因为这些元件影响将顺磁性材料驱动为磁饱和。
顺磁性颗粒可以包被结合剂，如生长剂、受体或配体、抗原、抗体或其任何结合片段或其嵌合变体，如嵌合抗原受体配体。结合剂在某些情况下可以是可逆的，允许顺磁性颗粒自发地脱离或使用特定化学剂脱离。结合剂还可以包括光可裂解接头，在该情况下，系统2可以包括光源(特别是高功率光源)作为模块或作为另一模块的一部分以允许接头的光切割以及细胞和顺磁性颗粒的分离。在一些情况下，涂层可与细胞相互作用。在其它情况下，涂层可以与待除去的细胞悬液的至少一种不想要的组分相互作用。不想要的组分可以是活性的或者非活性的，并且可能之前对细胞或细胞悬浮流体是有用的功能。不需要的组分的实例包括抗体、生长因子、其它蛋白质和聚合物。
不同类型的顺磁性颗粒(如具有不同结合剂的颗粒或由不同磁性材料形成的颗粒)可存在于一些细胞悬液中，允许复合物分离或反复除去结合剂。另外，也可以用任何结合剂包被的非顺磁性颗粒也可以与细胞结合。
其它不是顺磁性的颗粒也可以存在于细胞悬液中，并且可以用任何用于包被顺磁性颗粒的物质包被。
模块可以由任何生物相容性材料如细胞储存袋形成或衬有任何生物相容性材料如细胞储存袋。与细胞悬液或缓冲液接触的系统2的流体管道和任何其它部件也可以由任何生物相容性材料形成或衬有任何生物相容性材料。
将接触细胞悬液或缓冲液的系统2的部件可以在与细胞悬液接触之前是无菌的。
系统2的组件可以是一次性的。特别是与细胞悬液接触的部件可以是一次性的以避免污染和无菌性问题。
图2A是x方向磁体配置的流通磁分离/脱珠模块8的横截面示意图，图2B是相同配置的相同磁分离模块8的半透明三维示意图。流通磁分离/脱珠模块8包括由壁52限定的流动室50。外部偶极磁体54产生磁力线56。磁体54容纳在可移动平台60上。流通磁分离/脱珠模块8还包括入口62和出口64，细胞悬液可以通过其在y方向上流过模块8。
尽管图2A和2B显示了磁体54的一个阵列，流通磁分离/脱珠模块8可以具有两个或更多个阵列，如图4A所示，并且阵列中可以具有多于两个的磁体。另外，磁体54可以处于永久位置，在这种情况下，分离/脱珠模块8可以缺少可移动平台60或者可以具有可移动流动室50。此外，虽然磁体54被显示为x方向配置，但是它们可以处于x-y平面中的任何角度，包括y方向或x-y交叉方向。
入口62和出口64可具有足以建立细胞悬液层流通室50的任何配置。入口几何形状、出口几何形状和流速都影响细胞悬液流通室50。在一些情况下可接受湍流。
壁52可以是刚性结构，或者其可以是柔性的。例如，它们可能是细胞储存袋或其它类似部件的壁。当壁52是柔性的时，室50在z方向上的尺寸可以根据细胞悬液流通室50的流速而变化。
室50在z方向上的尺寸可以在5μm至100μm之间、5μm至500μm之间、或5μm至1000μm之间、5μm至1cm之间或通常100μm、500μm、1000μm、或1cm或更少。x、y和z方向上的尺寸可以被限制以实现足够高的流体力，以使细胞或顺磁性颗粒移动通过室50。
磁体54可以具有高磁场强度。例如，它们可能含有稀土金属，如钕或钐与另一种金属(如钴)的合金。磁体54可以是如所述的偶极磁体，或者它们可以是其它类型的磁体，例如四极磁体。磁体54可以具有可调整的磁场强度。例如，它们可以是电磁体。可以配置磁体54，以最大化对室50的相同侧上的磁体的磁吸引，以最大化对室50的相对侧上的磁体的磁排斥，或两者。尽管图2A显示了特定的磁体配置，但是可根据待实现的效果使用其中磁体极性相反或一致的配置。
图3是具有位于子膜流体注入口72和磁体54上方的膜70的流通磁分离/脱珠模块8的侧面纵向截面示意图。来自缓冲模块6或另一流体模块的流体可以通过流体注入口72引入以帮助脱珠的细胞定位在膜70附近。
可移动平台60可以在z方向上移动，从而允许磁体54在z方向上从邻近室50(如图2A和2B所示)或贴近室50(未显示)的位置移动到远离室50的位置(如图7C所示)。例如，远离室50的位置可以距离最近的壁52至少1cm。远处的位置足以防止磁体54经由它们的磁场对室50中的任何顺磁性颗粒的任何实质性影响。如果在磁体54和室50之间插入磁绝缘材料，则位置距离可以实质上更小。如果磁体54具有可调整的磁场强度而不是被移动，则它们可以被简单地调整到较低的磁场强度或零磁场强度以避免对室50中的任何顺磁性颗粒的任何实质影响。
特别是当使用零梯度配置时，模块8可以具有磁体54的顶部阵列和磁体54的底部阵列，如4A和4B所示。可移动平台60可以在x-y平面上旋转，或者磁体54可以永久地定向，使得磁体54处于x-y交叉定向配置中，如在图4C的流通磁分离/脱珠模块8的顶部纵向截面示意图中描述的。为了用于零梯度配置中，流通磁分离/脱珠模块8可以具有两个入口62(非磁入口62a和磁入口62b)和两个出口64(磁出口64a和非磁出口64b)。在这种情况下，当模块8在使用中时，在x-y交叉定向方向上的零梯度线58形成零梯度滤器。包括额外的磁体54可以在同一模块8中提供两条零梯度线58a和58b，如图4D所示，允许将不同的顺磁性颗粒分离入不同的出口64a和64b，或提供备用滤器。
零梯度线58可以是零梯度带，如果磁体54彼此充分间隔开而不是如图2A和2B所示的相邻，则其具有x方向的维度。
与流通磁分离/脱珠模块一起使用的磁体可以位于细胞悬液流过的室的外部，或室的内部。如果磁体是内部的，它们可以包被生物相容性材料。特别是如果磁体是内部的，它们可以是一次性的。
图1B是细胞处理系统2的示意图，其包括并联的多个流通磁分离/脱珠模块8a、8b和8c。尽管仅显示了三个流通磁分离/脱珠模块8，但是所述多个可以是大于二个的任意数量。当流通磁分离/脱珠模块8并联时，模块将典型地具有相同的类型和相同的配置，使得每个模块进行相同的功能。并联流通磁分离/脱珠模块8对于与附加模块组合时的快速细胞悬液处理或流体体积管理可能特别有用。此外，由于模块需要全部同时使用，因此将流通磁分离/脱珠模块8并联放置在控制流体流动方面提供了灵活性。
图1C是细胞处理系统2的示意图，其包括串联的多个流通磁分离/脱珠模块8a、8b和8c。尽管仅显示了三个流通磁分离/脱珠模块8，但是所述多个可以是大于二个的任意数量。当流通磁分离/脱珠模块8串联时，它们可以具有相同的类型和配置，使得每个都进行相同的功能，但是通常它们将具有不同的类型和配置，使得每个进行不同的功能。例如，模块8a可以分离顺磁性颗粒结合的细胞和未结合的细胞，模块8b可以脱珠顺磁性颗粒结合的细胞，并且模块8c可以在更大磁场梯度下脱珠顺磁性颗粒结合的细胞。
图1D是细胞处理系统2的示意图，其中返回回路14引导顺磁性颗粒结合的细胞回流经过流通磁分离/脱珠模块8。与没有返回回路14的类似系统相比，这种系统可用于实现顺磁性颗粒结合的细胞与未结合的细胞的更好分离，或未结合的细胞与顺磁性颗粒更好的脱珠或分离。流体可以被阀或开关引导到返回回路14或磁性输出模块12。
图1E是细胞处理系统2的示意图，其中细胞悬液模块4和缓冲模块6分别连接到流通磁分离/脱珠模块8。当流通磁分离/脱珠模块8具有两个入口62和两个出口64、以及磁体54在x-y交叉定向配置(如图5所示和所述)时，这种系统可能特别有用。
图1F是细胞处理系统2的示意图，其具有位于流通磁分离/脱珠模块8下游的旋转膜脱珠模块18。旋转膜脱珠模块18连接至废物输出模块20和细胞输出模块22。在该系统2中，流通磁分离/脱珠模块8分离顺磁性颗粒结合的细胞和未结合的细胞，而旋转膜脱珠模块18进行全部脱珠，或者流通磁分离/脱珠模块8也可以进行脱珠。如果将试剂(如化学剂)添加到旋转膜脱珠模块18中的悬浮流体中，则可以任选地存在试剂模块24。尽管在图1F中描述了一个旋转膜脱珠模块18，系统2可以包括串联或并联的多个模块18。当模块18串联时，化学剂可能仅被添加到最后的模块18中以使细胞暴露于化学剂最小化。
试剂模块24中的试剂可以是减弱颗粒和细胞之间的结合的任何化学剂。颗粒可以是顺磁性颗粒，也可以是非顺磁性颗粒。
图5A是旋转膜脱珠模块18的纵向截面示意图。该模块18包括样品入口80，其允许细胞悬浮流体流入圆柱形脱珠室82，其由圆柱形侧壁84部分地限定，并包括同轴定向的圆柱形旋转膜86。壁84在外部衬有磁体88。脱珠室18允许已经流过旋转膜86的流体通过废物输出模块20排出，而剩余的流体和细胞通过细胞输出模块22排出。旋转膜86的平均孔径小于细胞的平均直径，但大于任何将要通过脱珠除去的非顺磁性颗粒。平均孔径也可以大于将要除去的任何顺磁性颗粒，从而允许通过旋转膜作为初级颗粒除去方法、或作为备用的磁性除去来除去这些顺磁性颗粒。
如图5B所示，磁体88可以基本上围绕壁84，或者如图5C所示，其可以沿壁84间隔一定距离。磁体88可以安装在可移动的平台上，以允许它们从邻近壁88(如图5A-5C所示)或贴近壁88(未显示)的位置移动到远离壁84的位置。例如，远处的位置可以是离壁84至少1cm。这种移动到远处的位置防止磁体88经由它们的磁场对室82中的任何顺磁性颗粒具有实质上的影响。如果将磁绝缘材料插入在磁体88和室82之间，则远离的位置可以比不存在磁绝缘材料的情况更短。如果磁体88具有可调整的磁场强度而不是被移动，则它们可以被简单地调整到较低的磁场强度或零磁场强度，以避免对室82中的任何顺磁性颗粒的实质影响。
尽管在图5中显示了多个磁体88，可以仅具有单个磁体88。
磁体88可以具有高磁场强度。例如，它们可能含有稀土金属，如钕或钐与另一种金属(如钴)的合金。磁体88可以是偶极磁体、四极磁体或任何其它类型的磁体。磁体88可以具有可调整的磁场强度，例如，它们可以是电磁体。可以配置磁体88以最大化磁吸引力，例如包裹的配置。
与旋转膜模块一起使用的磁体可以位于细胞悬液流过的室的外部，或室的内部。如果磁体是内部的，它们可以包被生物相容性材料。特别是如果磁体是内部的，它们可以是一次性的。
适用于本文公开的模块中的示例性旋转膜包括在细胞处理系统(Fresenius Kabi,Fenwal,Lake Zurich,IL)中使用的4-μm轨道蚀刻聚碳酸酯旋转膜和在磁性细胞分离系统(Baxter,Deerfield,IL)中使用的旋转膜。
来自图1A-1F的元件，包括如图2-4所述的流通磁分离/脱珠模块8或如图5所描述的磁性旋转膜脱珠模块18，可以在细胞处理系统2中相互组合，这取决于要进行的特定细胞处理。这些元件可以如图所示组合，或者以其它合理的变型组合。例如，试剂模块24可以包括在图1A中描绘的系统中，使得当用于脱珠时，化学剂可以被添加到流通磁分离/脱珠模块8中的悬浮流体中。可以配置模块(包括附加的缓冲模块或输出模块)并用于确保适当的流体体积和流速，特别是在模块8和18中。
在图1G中显示了细胞处理系统2与多个模块和回路组合的一个例子。该系统包括与第一流通磁分离/脱珠模块8a连接的细胞悬液模块4和缓冲模块6a，其具有非磁性输出模块10a和磁性输出模块12a。磁性输出模块12a串联连接到第二流通磁分离/脱珠模块8b，其也连接到缓冲模块6b且具有非磁性输出模块10b和磁性输出模块12以及返回回路14a。返回回路14a回到模块8b。磁性输出模块12b通向第一旋转膜脱珠模块18a，其具有废物输出模块20a和细胞输出模块22a。细胞输出模块22a通向第二串联的旋转膜脱珠模块18b，其也连接到试剂模块24以及废物输出模块20b、返回回路14b和细胞输出模块22b。返回回路14b回到第二串联的流通磁分离/脱珠模块8b。
在图1H中显示了细胞处理系统2的另一个例子，其具有多个附加模块，所述附加模块具有特定的流体管道。细胞悬液模块4和卫星模块30(其可以是空的或可以包括缓冲液)连接到流通磁分离/脱珠模块8。流通磁分离/脱珠模块8分别连接到缓冲模块6和存储模块26。存储模块26进一步连接到回收模块28。许多连接使用长钉管32进行。该系统还沿着各种流体管道包括滚动夹34、焊接部位36、滑动夹38和弹簧夹40。
细胞处理系统2可以包括各种附加模块16，如磁柱、其它物理分离模块、细胞洗涤模块、细胞浓缩模块和介质交换模块。
细胞分离和脱珠方法
系统2可以在流通过程中用于分离顺磁性颗粒结合的细胞和未结合的细胞、用于脱珠磁性颗粒结合的细胞、用于分离顺磁性颗粒和未结合的细胞或其任何组合。在流通过程中，所有细胞在流通磁分离/脱珠模块8中继续移动。无、不超过0.01％或不超过0.05％或不超过1％的穿过模块8的顺磁性颗粒结合的细胞沿着壁52停止。
流通磁分离/脱珠过程
在使用图1A的系统的流通过程中，流通磁分离/脱珠模块8可以任选地通过使来自缓冲模块6的缓冲液流过该模块到非磁性输出模块10或磁性输出模块12或另一输出或附加模块16来启动。含有顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬液流过模块8。
如果系统2被配置用于分离，则细胞悬液被导向非磁性输出模块10。模块8可以被周期性地配置为不吸引顺磁性颗粒，而来自缓冲模块6的缓冲液流过该模块到磁性输出模块12。为了确保更好的分离细胞和高纯度的磁性或非磁性细胞产物，可以将细胞悬液引导通过回路14用于第二次或后继通过模块8。顺磁性颗粒结合的细胞可以被引导至附加部件16，如配置用于脱珠的流通磁分离/脱珠模块8或旋转膜脱珠模块18。
如果系统2被配置用于脱珠，则在流过模块8之后，细胞悬液被引导至非磁性输出模块10。或者，细胞悬液可以被引导通过回路14以在引导到非磁性输出模块10之前第二次或后续通过模块8。
使用流通磁分离/脱珠模块8的过程使每个顺磁性颗粒结合的细胞100与至少一个结合的顺磁性颗粒102一起经历流体(剪切或曳)力104。每个细胞100也经历磁力106，如图6所示。流体力104和磁力106可以以顺磁性颗粒102保持与顺磁性颗粒结合的细胞100结合的方式组合，从而允许细胞100与未结合的细胞分离。流体力104和磁力106也可以以使顺磁性颗粒102从顺磁性颗粒结合的细胞分离的方式组合，从而允许细胞100脱珠。次要力，例如扩散和重力，也作用于顺磁性颗粒102，但它们对脱珠的影响通常比流体力和磁力小得多，在计算通过模块的正确流速时经常被忽略。
系统2通常可以被配置成使得期望的细胞尽可能快地不再经过模块，从而减少对细胞的损伤。例如，在脱珠配置中只有磁性输出模块12可以包括至流通磁分离/脱珠模块8的返回回路，允许更容易地脱珠的细胞流过模块8的次数比具有更顽固结合的顺磁性颗粒的次数更少。
流通模块8可以是层流或湍流。磁力106受顺磁性颗粒102的饱和通量(ms)影响。磁力106也受顺磁性颗粒102所经历的磁场56的强度的影响，其受磁体54的强度以及室50在z方向上的深度和细胞100在该室内的位置的影响。磁力106进一步受顺磁性颗粒102在移动通过室50时经历的磁场梯度的影响，其受磁体54的强度和位置以及顺磁性颗粒102相对于磁体54的位置的影响。
另外，流体力受流体流动速度的影响，其在室中心通常是最高的，在壁处为零，这意味着附着在壁上的细胞可能没有足够的流体力将其从它们的顺磁性颗粒上分离，沿着壁的细胞可以大部分是静止的并且可以保护下游细胞免受流体力的影响。这导致期望细胞的损失，并且可通过细胞悬液连续流过室50来避免。这种损失可以通过流通方法避免，其中细胞不被磁力静止。也可以通过模块来避免，所述模块中壁处的速度不为零或接近零，例如活塞流模块，其中流体流速在室内是均匀的。
流通分离过程
可以使用如图2A和2B所示配置的流通磁分离/脱珠模块8进行流通分离过程。流速使得流体力104和磁力106允许顺磁性颗粒102保持与细胞100结合。流速也使得细胞100不被流体力裂解。
图7A显示当顺磁性颗粒结合的细胞100和未结合的细胞110最近进入室50时图2B的模块8。在图7B中，细胞100已停止，而未结合的细胞110以其原始速度继续运行。在图7C中，磁体已经移开，细胞100继续移动，但未结合的细胞110已经离开室50。
离开室50(而磁体54邻近或接近室50)的悬浮流体进入非磁性输出模块10。周期性地，来自细胞悬液模块4的细胞悬液流停止并且缓冲液从缓冲模块6流入室50，而磁体54从室50移开以允许顺磁性颗粒结合的细胞100被缓冲液冲到磁性输出模块12中。
特别是当重复以允许细胞多次通过模块8时，这种流通分离过程可以在细胞悬液进入非磁性输出模块10之前从细胞悬液移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的顺磁性颗粒结合的细胞100。单次通过过程的效率可能较低，其中细胞仅通过模块8一次。例如，在单次通过过程，模块8可以在细胞悬液进入非磁性输出模块10之前从细胞悬液中除去至少25％或至少50％的顺磁性颗粒结合的细胞100。单次或多次通过流通磁分离/脱珠模块8的非磁性输出或磁性输出可以得到顺磁性颗粒结合的细胞产物，其具有在流通分离过程之前在细胞悬液中存在的不超过1％的未结合的细胞110并含有至少99％的顺磁性颗粒结合的细胞100，未结合的细胞产物，其具有在流通过程之前细胞悬液中存在的不超过1％的顺磁性颗粒结合细胞100并含有至少99％的未结合的细胞110，或两者。
流通脱珠过程
也可以使用如图2A和2B所示配置的流通磁分离/脱珠模块8进行流通脱珠过程。流速使得流体力104和磁力106平均作用在细胞悬液中的细胞上，当细胞100通过室50时从细胞100分离至少一个顺磁性颗粒102。流速也使得细胞不被流体力裂解。
图8A显示当顺磁性颗粒结合的细胞100a和100b最近进入室50时的图2B的模块8。细胞100a具有一个顺磁性颗粒102，而细胞100b具有两个顺磁性颗粒102。在图8B中，一个顺磁性颗粒102各自已经从细胞100a和细胞100b两者分离并且已经停留在壁52上，而细胞100a和100b继续通过室50。细胞100a不再具有任何顺磁性颗粒102，而细胞100b保留一个顺磁性颗粒102。可以使细胞100b第二次通过模块8以除去该第二顺磁性颗粒102。或者，可以配置模块8使得细胞100b保留在室50中，类似于图7中的顺磁性颗粒结合的细胞，而细胞100a通过室50出来。
这种流通脱珠过程可以从细胞中除去至少99％的顺磁性颗粒。
当使用包括从磁性输出模块12的再循环回路14的系统2脱珠CLT0119T细胞时，将磁性输出中的细胞再悬浮于来自缓冲模块6的缓冲液中，并且第二次、然后再第三次通过模块8。在图9中提供该过程的结果与常规停流过程的结果的比较。图9呈现了端到端产率，即最终产品中的细胞数与进入脱珠系统中的细胞数的比。
图3中所示的流通磁分离/脱珠模块8可以以与图2A和2B所示的模块8类似的方式用于脱珠细胞。通过端口72引入的流体向细胞100供应足以将它们从膜70移除的力。因为悬浮流体的速度在膜70附近接近零，这些细胞否则可能不会分离或脱珠或可能丢失。
这种流通脱珠过程还可以从细胞中除去至少99％的顺磁性颗粒。
流通零梯度过滤过程
可以使用如图4A和4B所示配置的流通磁分离/脱珠模块8进行流通分离过程。流速使得流体力104和磁力106允许顺磁性颗粒102保持与细胞100结合。流速也使得细胞100不在室50中停止并且也不会被流体力裂解。各种配置如图10-13所示，并且可以被修改，例如以调整入口62和出口64的数量和比例尺寸，以用于不同的零梯度过滤过程。例如，通过具有不同尺寸的入口62和出口64实现的相同效果，也可以通过提供不同流速(通常由泵控制)、通过相同尺寸的入口和出口来实现。
图10呈现了在零梯度配置中顺磁性颗粒结合的细胞100如何流过模块8的基本描述。如图10A所示，进入模块8之后的细胞100(左图)在它们几乎离开模块8(右图)之前被沿x方向牵拉至零梯度线58。如图10A和10B所示，细胞100在进入模块8(左图)或者甚至接近退出时(右图)在y方向或z方向上不经历磁力作用。
图11显示了具有如图4A所示定向的磁体54的零梯度模块8。在该模块中，流体经由入口62进入。具有磁性颗粒102的细胞100沿零梯度线58并被引导至磁出口64b。未结合的细胞110不受零梯度线58的影响并流向非磁出口64a和64c。在此配置中，一些未结合的细胞110也将进入磁出口64b。
图12显示了移动通过图4C的模块8的细胞。具有顺磁性颗粒102的细胞100沿零梯度线58并被引导至磁出口64a。未结合的细胞110不受零梯度线58的影响并流向非磁出口64b。因此，零梯度线58作为磁性过滤器发挥作用，同时允许所有细胞继续移动通过室50而不被推向任何壁52。如所示，非磁入口62a大于磁入口62b并且非磁出口64b大于磁出口64a。如果模块8中的流体流动是层流，则来自非磁入口62a的流体跨越到非磁出口64b，防止任何未结合的细胞110进入磁出口64a。该方法也可以与湍流一起使用，但由于未结合的细胞从磁出口64a损失而效率较低。
该流通分离过程可以在细胞悬液进入非磁性输出模块10之前从细胞悬液移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的顺磁性颗粒结合的细胞100。通过流通磁分离/脱珠模块8的非磁性输出或磁性输出的多次通过可以产生顺磁性颗粒结合的细胞产物，其具有在流通分离过程之前在细胞悬液中存在的不超过1％的未结合的细胞11且含有至少99％的顺磁性颗粒结合的细胞100，未结合的细胞产物，其具有在流通过程之在细胞悬液中存在的不超过1％的顺磁性颗粒结合的细胞100并包含至少99％的未结合的细胞110，或两者。
流通零梯度顺磁性颗粒分离过程
也可以使用如图4C所示配置的流通磁分离/脱珠模块8进行流通顺磁性颗粒分离过程。图13显示了移动通过模块8的脱珠的、未结合的细胞110和顺磁性颗粒102。细胞110之前例如通过旋转膜脱珠模块18、非旋转膜脱珠模块或相同或独立模块8在脱珠配置中脱珠。或者，细胞110可能已经存在但不与顺磁性颗粒102结合。顺磁性颗粒102沿零梯度线58并被引导至磁出口64a。脱珠的、未结合的细胞110不受零梯度线58的影响并流到非磁出口64b。因此，零梯度线58作为磁性过滤器发挥作用，同时允许细胞110继续移动通过室50而不被推向任何壁52。
该流通顺磁性颗粒分离过程可以从细胞悬液中除去至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的珠子。
该过程与除去顺磁性颗粒组合也可以除去细胞悬液中不想要的组分。
尽管上文分别描述了细胞分离过程和颗粒分离过程，但它们可以同时、在相同的模块或系统中发生。例如，分离模块通常会从细胞悬液中除去顺磁性颗粒结合的细胞和游离的顺磁性颗粒。
旋转膜脱珠过程
在使用图1F的系统2的流通过程中，分离的顺磁性颗粒结合的细胞100通过样品入口80被引导到旋转膜模块18中，如图14所示。在脱珠室82内，旋转膜86在细胞悬液中产生再循环Taylor-Couette流，除了从入口80流通室82到出口20和22产生的流体力外，该循环Taylor-Couette流也产生流体力。结果，尽管顺磁性颗粒102仍然经历流体力和磁力，但这些力的关系和它们如何引起脱珠很难建模。然而，流体力至少受旋转膜80的尺寸和旋转速度、细胞悬液通过室82的流速和悬浮流体的粘度的影响。磁力受顺磁性颗粒102的性质、磁体88的性质以及模块18的设计，特别是细胞100和磁体88之间的距离的影响。流体力通常不高而不能裂解细胞。Taylor-Couette流动足以使细胞保持远离和脱离与壁84和旋转膜86的接触。
从细胞100移除的顺磁性颗粒102迁移到壁84，并且特别是迁移到零梯度线或沿壁84的带。任何非顺磁性颗粒120也仅通过流体力从细胞100移除。非顺磁性颗粒120通过旋转膜86中的孔，然后经由废物出口模块20离开室82。从任选的试剂室24添加的任何化学剂122也通过旋转膜86中的孔并且经由废物出口模块20离开室82。这限制了细胞100对化学剂120的暴露。脱珠的、未结合的细胞110经由细胞出口模块22离开室82。
顺磁性颗粒102可以周期性地从壁84移除，例如通过使细胞悬液停止流过室82，将磁体88移动到远离壁84的位置，然后使缓冲液流过室82。
一些顺磁性颗粒102也可以通过旋转膜80并被移除。如果磁体88不存在或离室82足够远，则可以通过旋转膜80来完成所有的顺磁性颗粒的移除。
该流通脱珠过程还可以从细胞中除去至少80％、至少90％、至少95％或99％的顺磁性颗粒，从细胞中除去至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的所有非顺磁性颗粒，或两者。
旋转膜也可用于分离顺磁性颗粒102和未结合的细胞102。
旋转膜86可具有足够小的孔径以排除细胞悬液中的所有细胞。
旋转膜模块18也可用于从细胞悬液中除去不想要的组分。这些组分可以简单地通过旋转膜88过滤，或者它们可以与顺磁性颗粒102、非顺磁性颗粒120或两者的涂层相互作用，并且与颗粒一起被除去。脱珠和除去不需要的组分可能会分开或同时发生。
其它脱珠和顺磁性颗粒分离过程
由于采用了模块化设计，因此系统2也与其它脱珠和顺磁性颗粒分离过程相容。人们只需要插入适当的附加模块16。例如，包括磁柱和物理分离方法的柱通常用于脱珠细胞并且可以作为附加模块16被包括。
其它掺入过程
由于其模块化设计，系统2与其它掺入过程相容。这些过程可以在至少一个附加模块16中发生。例如，模块可以用于洗涤细胞。模块也可用于浓缩细胞。模块可用于交换细胞所在的介质。一个模块可以用于这些步骤中的多于一个的步骤。
多模块流通过程
如图1G所示系统2可用于多模块流通过程。任选地，来自缓冲模块6a的缓冲液可以流过流通磁分离/脱珠模块8a以及任选地模块8b、18a和18b中的一个或多个。含有期望的顺磁性颗粒和非顺磁性颗粒结合的细胞和不想要的未结合的细胞的细胞悬液流过如图4所示配置的模块8a，但是可选地模块8a可以如图2A和2B所示配置用于分离。未结合的细胞作为废物被引导至非磁性输出模块10a。顺磁性颗粒结合的细胞通过磁输出模块12a被引导到流通磁分离/脱珠模块8b。模块8b如图2A和2B所示配置用于脱珠。顺磁性颗粒结合的细胞在作为废物进入磁输出模块12b之前至少一次流过返回回路14a。脱珠的、未结合的细胞经由非磁性输出模块10b被送到旋转膜脱珠模块18a。任何剩余的顺磁性颗粒和非顺磁性颗粒被除去，其中非顺磁性颗粒流入废物输出模块20a，而未结合的顺磁性颗粒保留在模块18中，并且未结合的细胞和具有顺磁性颗粒、非顺磁性颗粒或两者的细胞流入细胞输出模块22a。细胞输出模块22a通向第二旋转膜模块18b。从试剂模块24添加的化学剂能够促进从细胞除去顺磁性颗粒或非顺磁性颗粒或两者。非顺磁性颗粒和化学剂流入废物模块20b。顺磁性颗粒保留在模块18中。未结合的细胞和具有顺磁性颗粒、非顺磁性颗粒或二者的细胞在作为流通过程的最终细胞产物被递送至细胞输出模块22b之前至少一次流入返回回路14b。
临床应用
本文中的所有过程可根据临床优质生产规范(cGMP)标准进行。
这些过程可用于细胞纯化、富集、收获、洗涤，浓缩或用于细胞介质交换，特别是在制造过程开始时在收集原始起始材料(特别是细胞)期间以及在制造过程中用于细胞治疗的细胞的选择或扩增。
这些细胞可以包括任意多个细胞。这些细胞可以是相同的细胞类型、或混合细胞类型。此外，细胞可以来自一个供体，如自体供体或用于细胞治疗的单一同种异体供体。细胞可以通过例如白细胞去除术或单采血液成分术从患者获得。细胞可以包括T细胞，例如可以包括具有大于50％T细胞、大于60％T细胞、大于70％T细胞、大于80％T细胞或90％T细胞的群。
选择过程可特别地在培养和扩增之前用于选择细胞。例如，用抗CD3和/或抗CD28包被的顺磁性颗粒可用于选择用于扩增的T细胞或用于引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其它蛋白质的核酸。这种过程用于生产治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的CTL019T细胞。
本文公开的脱珠过程和模块特别地可用于制造用于细胞治疗的细胞中，例如在培养和扩增之前或之后用于纯化细胞。例如，用抗CD3和/或抗CD28抗体包被的顺磁性颗粒可用于选择性地扩增T细胞，例如通过引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其它蛋白质的核酸而修饰或将被修饰的T细胞，使得T细胞表达CAR。在制造这样的T细胞期间，可以使用脱珠过程或模块将T细胞从顺磁性颗粒分离。这种脱珠过程或模块用于生产例如用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)的CTL019T细胞。
在本文举例说明的一个这样的过程中，通过单采血液成分术(例如白细胞去除术)从供体(例如，待用自体嵌合抗原受体T细胞产物治疗的患者)收集细胞(例如T细胞)。然后可以任选地例如通过淘析步骤纯化收集的细胞。然后可以将顺磁性颗粒(例如抗CD3/抗CD28包被的顺磁性颗粒)加入到细胞群中以扩增T细胞。该过程还可以包括转导步骤，其中将编码一种或多种期望的蛋白质(例如CAR，例如靶向CD19的CAR)的核酸导入细胞中。可以将核酸导入慢病毒载体中。然后可以将细胞(例如慢病毒转导的细胞)例如在存在合适的培养基时扩增数天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。在扩增之后，可以使用本文中公开的脱珠过程/模块分离期望的T细胞和顺磁性颗粒。该过程可以包括根据本公开的过程中的一个或多个脱珠步骤。然后可以配制脱珠细胞以施用于患者。例如，在WO2012/079000中进一步描述了CAR T细胞及其制备的实例，其通过引用整体并入本文。本公开的系统和方法可以用于在WO2012/079000中描述或与其相关的任何细胞分离/纯化/脱珠过程。
与常规系统和方法相比，本文中的系统和方法可以类似地通过浪费更少的期望细胞、导致更少的细胞损伤、并且更可靠地从细胞中移除磁性和任何非顺磁性颗粒，而对化学剂的暴露更少或不暴露而有益于其它细胞治疗产物。
尽管上面仅具体描述了本公开的示例性实施方案，但应该理解的是，在不脱离本公开的精神和预期范围的情况下，这些示例的修改和变化是可能的。例如，除了所描述的那些之外，磁性模块和包括它们的系统可以以各种配置来配置和使用。另外，系统和方法可以包括本文未具体描述的附加部件和步骤。例如，方法可以包括引发，其中首先将流体引入到部件中以除去气泡并减少对细胞悬液或缓冲液运动的抵抗力。此外，实施方案可以仅包括本文所述的系统的一部分，与本文所述的方法一起使用。例如，实施方案可以涉及可用于非一次性设备内的一次性模块、软管等，以形成能够分离或脱珠细胞以产生细胞产物的完整系统。
本文描述的流通装置或细胞处理系统的各个方面的实施方案可以在任何以下编号的段落中定义：
1.一种细胞处理系统，包括：
至少一个细胞悬液模块；
至少一个缓冲模块；
至少一个流通磁分离/脱珠模块；
至少一个非磁性输出模块；和
至少一个磁性输出模块。
2.根据段落1所述的细胞处理系统，还包括返回到至少一个流通磁分离/脱珠模块的上游的至少一个返回回路。
3.根据段落1所述的细胞处理系统，其包含至少两个并联的流通磁分离/脱珠模块。
4.根据段落1所述的细胞处理系统，其包含至少两个串联的流通磁分离/脱珠模块。
5.根据段落1所述的细胞处理系统，其还包含至少一个附加模块。
6.根据段落5所述的细胞处理系统，其中所述至少一个附加模块包含至少一个旋转膜脱珠模块。
7.根据段落6所述的细胞处理系统，其包含至少两个并联的旋转膜脱珠模块。
8.根据段落6所述的细胞处理系统，其包含至少两个串联的旋转膜脱珠模块。
9.根据段落5所述的细胞处理系统，其中至少一个附加模块包含至少一个物理分离模块。
10.根据段落9所述的细胞处理系统，其中至少一个附加模块包含至少一个磁柱模块。
11.根据段落5所述的细胞处理系统，其中至少一个附加模块包含至少一个介质交换模块。
12.根据段落5所述的细胞处理系统，其中至少一个附加模块包含至少一个细胞浓缩模块。
13.根据段落5所述的细胞处理系统，其中至少一个附加模块包含至少一个细胞洗涤模块。
14.根据段落1所述的细胞处理系统，其中流通磁分离/脱珠模块包括：
由壁限定的室，其具有x方向、y方向和z方向；
在y方向上配置在室的相对端上的入口和出口；和
邻近或接近室壁的至少两个磁体，其配置成在室内的入口和出口之间建立零梯度线。
15.根据段落6所述的细胞处理系统，其中旋转膜脱珠模块包括：
由圆柱形侧壁部分地限定的脱珠室；
具有内部并与圆柱形侧壁同轴取向的多孔旋转膜；
样品入口；
连接到旋转膜内部的废物输出模块；和
连接到脱珠室的细胞输出模块。
16.根据段落15所述的细胞处理系统，其中旋转膜脱珠模块还包括邻近或邻近圆柱形侧壁的至少一个磁体。
17.一种流通磁分离/脱珠模块，其包括：
由壁限定并具有x方向、y方向和z方向的室；
在y方向上配置在室的相对端上的入口和出口；和
至少两个邻近或接近室壁的磁体，并配置成在室内的入口和出口之间建立零梯度线。
18.根据段落17所述的模块，其包含至少两个入口和至少两个出口。
19.根据段落17所述的模块，还包括邻近或接近室壁的至少三个磁体，所述至少三个磁体配置成在室内的入口和出口之间建立至少两个零梯度线。
20.根据段落17所述的模块，还包括在z方向上在室的相对侧上以两个阵列配置的至少四个磁体。
21.根据段落18所述的模块，还包括在z方向上在室的相对侧上以两个阵列配置的至少四个磁体，其从z方向上的室的相对侧上的一个入口附近至一个出口附近在x-y平面上交叉定向。
22.根据段落17所述的模块，其进一步包括：
邻近室壁的子膜注入端口，其也邻近至少两个磁体，和
邻近子膜的膜。
23.一种旋转膜脱珠模块，其包括：
由圆柱形侧壁部分地限定的脱珠室；
具有内部并与圆柱形侧壁同轴取向的多孔旋转膜；
样品入口；
连接到旋转膜内部的废物输出模块；
连接到脱珠室的细胞输出模块；和
邻近或接近圆柱形侧壁的至少一个磁体。
24.根据段落23所述的旋转膜脱珠模块，其还包括试剂模块。
25.根据段落23所述的旋转膜脱珠模块，其中所述多孔旋转膜的孔径大于待脱珠颗粒的孔径并且小于待脱珠细胞的孔径。
26.一种流通细胞处理的方法，包括使包含顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬液流过流通磁分离/脱珠模块以产生未结合的细胞产物，
其中顺磁性颗粒结合的细胞通过流动步骤继续在流通磁分离/脱珠模块中移动，和
其中流通磁分离/脱珠模块包括：
由壁限定的流动室，细胞悬液流过该流动室；和
至少两个邻近或接近至少一个壁配置的磁体。
27.根据段落26所述的方法，其中细胞悬液层流通过流通磁分离/脱珠模块。
28.根据段落26所述的方法，其中细胞悬液还包含未结合的细胞，并且细胞悬液流过流通磁分离/脱珠模块分离顺磁性颗粒结合的细胞与未结合的细胞。
29.根据段落28所述的方法，其中细胞悬液还包含游离顺磁性颗粒，并且细胞悬液流过流通磁分离/脱珠模块分离游离顺磁性颗粒与未结合的细胞。
30.根据段落28所述的方法，还包括使用返回回路使分离的未结合的细胞第二次或在随后的时间流过流通磁分离/脱珠模块。
31.根据段落28所述的方法，还包括使用返回回路使分离的顺磁性颗粒结合的细胞第二次或在随后的时间流过流通磁分离/脱珠模块。
32.根据段落31所述的方法，还包括使顺磁性颗粒结合的细胞在流通磁分离/脱珠模块中第二次或在随后的时间内脱珠，以产生顺磁性颗粒和脱珠的未结合的细胞。
33.根据段落32所述的方法，还包括使产生的顺磁性颗粒和脱珠的未结合的细胞第三次或在随后的时间流过流通磁分离/脱珠模块以分离顺磁性颗粒和脱珠的未结合的细胞。
34.根据段落26所述的方法，其中定向磁体以建立一条与流动方向交叉的零梯度线，使得顺磁性颗粒结合的细胞仅在一个方向上被牵拉至零梯度线，但在两个其它方向上不受两个磁体的磁力影响。
35.根据段落26所述的方法，其中室还包括:
磁入口，通过该磁入口任何顺磁性颗粒进入流动室；
非磁入口；
与非磁入口相对的磁出口；和
与磁入口相对的非磁出口，其中零梯度线将所有顺磁性颗粒和任何结合的细胞引导至磁出口。
36.根据段落35所述的方法，其中细胞悬液还包含未结合的细胞，并且其中非磁入口比磁入口大，非磁出口比磁出口大，其中从非磁入口流动的流体跨越到非磁出口，防止任何未结合的细胞流入磁出口。
37.根据段落35所述的方法，其中细胞悬液还包含未结合的细胞，其中非磁入口和磁入口具有基本上相同的尺寸，或者非磁出口和磁出口具有基本上相同的尺寸或两者，并且其中流体进入入口的相应流速、流体流出出口的相应流速或二者被调节，使得从非磁入口流动的流体跨越到非磁出口，防止任何未结合的细胞流入磁出口。
38.根据段落26所述的方法，还包括使顺磁性颗粒结合的细胞流过旋转膜脱珠模块以产生未结合的细胞产物，其中所述旋转膜脱珠模块包括：
圆柱形脱珠室，顺磁性颗粒结合的细胞流过所述圆柱形脱珠室，所述室部分地由圆柱形侧壁限定并且包括同轴旋转膜；和
至少一个磁体，所述至少一个磁体邻近或接近圆柱形侧壁配置，以在圆柱形脱珠室内建立至少一个零梯度线。
39.根据段落26所述的方法，还包括使顺磁性颗粒结合的细胞流过磁柱模块以产生未结合的细胞产物。
40.根据段落26所述的方法，还包括使顺磁性颗粒结合的细胞或未结合的细胞产物流过细胞洗涤模块。
41.根据段落26所述的方法，还包括使顺磁性颗粒结合的细胞或未结合的细胞产物流过介质交换模块。
42.根据段落26所述的方法，其进一步包括使顺磁性颗粒结合的细胞或未结合的细胞产物流过细胞浓缩模块。
43.一种制造细胞治疗组合物的方法，所述方法包括：
使细胞群与包被一种或多种试剂的顺磁性颗粒接触，所述试剂有助于扩增细胞群内的一种或多种细胞类型；
将核酸引入细胞群内的细胞；
扩增细胞群内的细胞；
根据段落26至42中任一项所述的方法、或使用段落1至16中任一项所述的系统、或段落17-25中任一项所述的模块脱珠细胞群；和
配制用于细胞治疗的细胞群。
44.根据段落43所述的方法，其中有助于扩增一种或多种细胞类型的一种或多种试剂包括抗CD3抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、及其组合。
45.根据段落43至44中任一项所述的方法，其中通过慢病毒或mRNA转导引入核酸。
46.根据段落43至45中任一项所述的方法，其中细胞治疗是嵌合抗原受体T细胞治疗。
47.根据段落46所述的方法，其中细胞治疗是抗CD19嵌合抗原受体T细胞治疗。
改进的洗涤步骤
单采血液成分术(例如白细胞去除术)产物的细胞组成在患者之间是非常不同的。具有高的粒细胞(例如嗜中性粒细胞)百分比的白细胞去除术产物已经与使用方法B在CART细胞制造期间细胞聚集升高的情况相关。不希望受理论束缚，认为这种不可逆的聚集通过干扰富集过程(例如阳性选择)而导致细胞数量和纯度的总体降低，而减少可用的细胞数量和负面影响细胞产率。另外，不希望受理论束缚，细胞纯度和产率的降低直接影响后续过程性能(例如，转导效率和扩增)以及终产物细胞数量和质量。这样做的净结果降低了制造能够在处理周期结束时达到剂量规格的产品的能力。因此，不希望受到理论的束缚，据信防止聚集可以减少细胞损失并改进T细胞纯度，这可以为随后的处理步骤产生更好的质量和数量的起始材料，并产生整体改进的治疗产品。
在目前现有技术的制造过程中，例如在方法B中，在Plasmatherm(Genesis)上解冻患者细胞的白细胞去除术材料、使用CellSaver 5+仪器(Haemonetics)洗涤、然后重悬于基于称为'改良培养基'的X-VIVO15培养基(Lonza)的细胞扩增培养基中，或重悬于缓冲的等渗盐水溶液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中，用于随后的Ficoll淋巴细胞选择。根据实施例2中提供的方案制备改良培养基。然而，如实施例2所述，将解冻的细胞转移到改良培养基或PBS溶液中可导致细胞聚集。
因此，本文还提供了用于洗涤细胞以防止聚集的改进方法，其与随后的制造步骤(例如通过刺激(例如用抗CD3/CD28 CTS Dynabead(Thermo Fisher))的阳性选择)相容。另外，本文描述的改进的洗涤步骤例如在解冻的细胞上进行，以除去亚细胞碎片、游离血红蛋白和冷冻保护剂，以实现体积降低，并且能够实现随后的密度梯度分离。在一个实施方案中，洗涤步骤用替代改良培养基或PBS溶液的细胞重悬缓冲液进行。在一个实施方案中，洗涤步骤用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液进行。在一个实施方案中，缓冲液包含约5％至约0.45％的氯化钠，例如D5 1/2NS介质。在一个实施方案中，缓冲液稳定细胞悬液并防止聚集，例如持续至少30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时小时、5.5小时或6小时。
在一个实施方案中，使用装置(例如细胞分离装置，例如与用于密度梯度离心相同的装置)进行本文所述的改进的洗涤步骤。例如，使用Sepax 2 RM装置(Biosafe)进行改进的洗涤步骤。
在一个实施方案中，本文公开的洗涤步骤可用于新鲜的单采血液成分术样品或预先冷冻的(例如解冻的)单采血液成分术样品。在实施方案中，本文公开的洗涤步骤可以在本文描述的任何淘析、密度梯度离心或选择方法之前或之后使用。在另一个实施方案中，本文公开的洗涤步骤在密度梯度离心(例如使用OptiPrep介质的密度梯度离心)步骤之后进行。
改进的制造方法
本文提供了与本领域当前使用的方法相比，用于更大程度地改进适合表达CAR的免疫效应细胞的质量和产率的方法。在一个实施方案中，在前面部分中描述的在流动条件下的淘析、密度梯度离心、阳性和阴性选择以及改进的洗涤步骤可以彼此任意组合使用或与本领域中目前使用的或本文描述的其它方法使用，以分离或富集适合表达CAR的期望的免疫效应细胞。
通常，用于产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的方法包括：提供输入样品、进行富集步骤和进行选择步骤，从而产生包括适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。用于产生表达CAR的免疫效应细胞群的方法包括产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的方法，并且还包括刺激步骤，例如其中刺激细胞增殖或持续，并且还包括引入编码CAR的核酸。关于CAR的刺激和引入/表达的额外公开在以下部分中进一步描述。
在一个实施方案中，输入样品是新鲜样品，例如从受试者获得的新鲜单采血液成分术、白细胞去除术或全血样品。在另一个实施方案中，输入样品是冷冻样品。在输入样品是冷冻样品(例如冷冻或冷冻保存的单采血液成分术、白细胞去除术或全血样品)的实施方案中，该方法包括解冻冷冻样品或提供解冻的样品。冷冻，例如冷冻保存的样品可以通过被动或主动方式解冻。通过被动方式解冻包括允许样品解冻，例如达到周围环境的温度，例如达到室温或达到样品转移或混合的缓冲液或溶液的温度。通过主动方式解冻包括使用解冻样品的装置，例如，使样品达到周围环境的温度比通过被动方式解冻更快。
在一个实施方案中，富集步骤包括进行淘析或密度梯度离心。淘析可以使用本领域已知的淘析条件或本文描述的用于淘析冷冻或预先冷冻的样品的改进设置来进行。密度梯度离心可以使用Ficoll或包含碘克沙醇(例如在水中的约60％碘克沙醇)的介质(例如OptiPrepTM)来进行。
在本文描述的任何方法中，选择步骤包括进行阳性选择步骤和/或阴性选择步骤。阳性选择步骤可以包括在静态或流动条件下，例如使用分离试剂(例如与抗CD3和/或抗CD28抗体偶联的珠子)，选择CD3+/CD28+细胞。阴性选择步骤可以包括例如使用分离试剂(例如与抗CD19抗体偶联的珠子)阴性选择CD19+B细胞或CD19+淋巴母细胞。
在本文所述的任何方法中，洗涤步骤可在样品收集之后、样品解冻之后、富集步骤之前、富集步骤之后、选择步骤之前或选择步骤之后进行，或其任何组合。
在本文进一步描述用于产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的示例性方法，其包括淘析、密度梯度离心、阳性或阴性选择(例如在流动条件下)或改进的洗涤步骤中的一种或多种。
在一个实施方案中，用于产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的方法包括提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品；解冻冷冻的输入样品，以产生解冻的样品；进行富集步骤，其中所述富集步骤包括对所述输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；和进行选择步骤，其中选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或对例如CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择。
在另一个实施方案中，用于产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的方法包括提供包含免疫效应细胞的新鲜或冷冻的输入样品；任选地，其中所述输入样品是冷冻的输入样品，解冻所述冷冻的输入样品以产生解冻样品；进行富集步骤，其中所述富集步骤包括使用包含碘克沙醇(例如在水中的60％碘克沙醇)的介质(例如OptiPrep介质)和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤；和进行选择步骤，其中选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或对例如CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择。
在另一个实施方案中，用于产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的方法包括提供包含免疫效应细胞的新鲜或冷冻的输入样品；进行富集步骤，其中富集步骤包括进行淘析或密度离心(例如使用Ficoll或Optiprep介质)；和在流动条件下进行例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择步骤。
在另一个实施方案中，用于产生或富集可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞群的方法包括提供包含免疫效应细胞的新鲜或冷冻的输入样品；进行富集步骤，其中富集步骤包括进行淘析或密度离心(例如使用Ficoll或Optiprep介质)；和在流动条件下进行例如对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择步骤；
在本文所述的任何方法中，洗涤步骤可在样品收集之后、样品解冻之后、富集步骤之前、富集步骤之后、选择步骤之前或选择步骤之后进行，或其任何组合。
可以定义控制极限，其识别输入样品性质的范围或阈值，或者在本文所述的方法中的一个或多个步骤之后，指示或确定下一步骤，以便优化所需免疫效应细胞的富集，并确保制造成功和产品质量。在实施方案中，控制极限可以根据获得输入样品的受试者的癌症类型而不同。举例而言，对从患有ALL或DLBCL的受试者获得的输入样品中存在的单核细胞的控制极限如下：如果单核细胞>输入样品的20％，例如全血细胞的白细胞去除术，则最佳方法包括在流动条件下淘析和/或CD3/CD28阳性选择；或者如果单核细胞<输入样品的20％，则洗涤输入样品并根据母细胞含量确定最佳方法。在另一个实例中，对从患有ALL或DLBCL的受试者获得的输入样品中存在的母细胞的控制极限如下：如果母细胞≥获得的白细胞去除术WBC的20％，则应该进行淘析(以除去单核细胞、粒细胞和细胞碎片)和/或修饰的CD19阴性选择(以除去母细胞)或其它技术以除去母细胞；或者如果母细胞<获得的白细胞去除术的20％，则洗涤白细胞去除术材料以及基于单核细胞含量来确定过程。
在一个实施方案中，在富集适于表达CAR的免疫效应细胞后，使用本领域已知的或本文所述的任何方法刺激免疫效应细胞例如增殖，例如如标题为“免疫效应细胞的活化和扩增”部分所述。
在富集适于表达CAR的免疫效应细胞之后，任选地在如本文所述的刺激和/或扩增之后，可以将编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸引入免疫效应细胞。用于引入核酸(例如编码CAR)的方法在本领域中是公知的并且在本文中描述，例如，如标题为“编码CAR的核酸构建体”、“RNA转染”和“非病毒递送方法”的部分所述。
免疫效应细胞的来源
本部分提供其它方法或步骤，用于获得包括期望的免疫效应细胞的输入样品、分离和处理期望的免疫效应细胞(例如T细胞)、和除去不想要的物质(例如不想要的细胞)。本部分中描述的其它方法或步骤可与流动条件下的淘析、密度梯度离心、选择或前面部分中描述的改进的洗涤步骤中的任一个组合使用。
可以从受试者获得细胞(例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞)的来源。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞例如T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术以及本文公开的任何方法，以其任意的步骤组合，从受试者采集的血液单位获得。在一个方面，来自个体循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞、包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并且任选地将细胞置于合适的缓冲液或介质中用于随后的处理步骤。在一个实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个备选实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可缺少镁或者可缺少许多(如果不是全部的)二价阳离子。在另一个实施方案中，使用本文所述的改进的洗涤步骤洗涤细胞。
在没有钙的情况下初始活化步骤可导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，如无Ca、无Mg的PBS，PlasmaLyte A或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以除去单采血液成分术样品中不想要的成分，并将细胞直接重悬在培养基中。
在一个方面，通过裂解红细胞和除去单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心或逆流离心淘析)，从外周血淋巴细胞中分离期望的免疫效应细胞，例如T细胞。
本文所述的方法可以包括例如使用例如本文所述的阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，该亚群是除去T调节细胞的群，除去CD25+的细胞。在一些实施方案中，除去T调节细胞的群包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(例如IL-2)从群中除去T调节细胞(例如CD25+T细胞)。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与基质(例如珠子)缀合或以其它方式包被在基质(例如珠子)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的基质缀合。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25除去试剂从群中除去T调节细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞与CD25除去试剂的比例为1e7个细胞比20uL、或1e7个细胞比15uL、或1e7个细胞比10uL、或1e7个细胞比5uL、或1e7个细胞比2.5uL、或1e7个细胞比1.25uL。在一个实施方案中，例如对于T调节细胞，例如除去CD25+的细胞，使用大于5亿个细胞/ml。另一方面，使用6亿、7亿、8亿或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待除去的免疫效应细胞群包括约6x109个CD25+T细胞。在其它方面，待除去的免疫效应细胞群包括约1x109至1x1010个CD25+T细胞以及其间的任何整数值。在一个实施方案中，所得的除去T调节细胞的群具有2x109个T调节细胞(例如CD25+细胞)或更少(例如1×109、5×108、1×108、5×107、1×107、或更少的CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用具有去除管设备(例如管162-01)的CliniMAC系统从群中除去T调节细胞，例如CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在去除设备(例如DEPLETION2.1)上运行。
不希望受到特定理论的约束，在单采血液成分术之前或在制造CAR表达的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞负调节子的水平(例如，降低不想要的免疫细胞例如TREG细胞的数量)显著降低了受试者复发的风险。例如，除去TREG细胞的方法是本领域已知的。降低TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、去除CD25的mTOR抑制剂及其组合。
在一些实施方案中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前减少(例如去除)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前使样品(例如单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段或CD25结合配体)接触，例如以除去TREG细胞。
不希望受到特定理论的束缚，在单采血液成分术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞负调节子的水平(例如，降低不想要的免疫细胞例如TREG细胞的数量)可以降低受试者复发的风险。在一个实施方案中，在收集用于制造表达CAR的细胞产物的细胞之前，用一种或多种降低TREG细胞的治疗预处理受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞的治疗复发的风险。在一个实施方案中，降低TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用一种或多种环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25-去除或其组合中。在一个实施方案中，降低TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用一种或多种环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25-去除、mTOR抑制剂或其组合。施用一种或多种环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25去除或其组合可以发生在输注表达CAR的细胞产物之前、之中或之后。施用一种或多种环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25去除、mTOR抑制剂或其组合可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在一些实施方案中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如去除)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前使样品(例如单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段或CD25结合配体)接触，例如以除去TREG细胞。
在一个实施方案中，在收集用于制造表达CAR的细胞产物的细胞之前用环磷酰胺预处理受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。在一个实施方案中，在收集用于制造表达CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)产物的细胞之前，用抗GITR抗体预处理受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一个实施方案中，在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前修改表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)制造过程以除去TREG细胞。在一个实施方案中，在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前，使用CD25去除来除去TREG细胞。
在一个实施方案中，待除去的细胞群既不是调节性T细胞也不是肿瘤细胞，而是对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞，例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15或潜在地由免疫抑制细胞表达的其它标记物的细胞。在一个实施方案中，预期此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时被移除、或在所述去除之后被移除、或以另一顺序被移除。
本文描述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如多于一个去除步骤。通过阴性选择可完成富集T细胞群，例如可以使用针对阴性选择细胞特有的表面标记物的抗体组合。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，所述方法使用针对阴性选择细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
本文所述的方法可进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包括CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群中移除细胞，从而提供除去T调节性的群，例如除去CD25+和除去肿瘤抗原的细胞，其适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞与T调节性(例如CD25+)细胞同时移除。例如，可将抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段连接至相同的基质(例如珠子)，所述基质(例如珠子)可用于移除细胞或抗CD25抗体或其片段，或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接到分开的珠子上，其混合物可用于移除细胞。在其它实施方案中，移除T调节细胞(例如CD25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是相继的，并可以例如以任一顺序发生。
还提供了包括从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂，例如PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一种或多种)的群中移除细胞的方法，从而提供除去T调节性(例如除去CD25+)细胞和除去检查点抑制剂的细胞(例如除去PD1+、LAG3+和/或TIM3+的细胞)的群。示例性的检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如TGFβ)，例如，如本文所述。在一个实施方案中，表达检查点抑制剂的细胞与T调节性(例如CD25+)细胞同时被移除。例如，可将抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段连接至相同的珠子上，所述珠子可用于移除细胞或抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制剂抗体或其片段，可连接到分开的珠子上，其混合物可用于移除细胞。在其它实施方案中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的移除和表达检查点抑制剂的细胞的移除是相继的，并且可以例如以任一顺序发生。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合的珠子(如M-450CD3/CD28T)温育足以进行期望的T细胞阳性选择的一段时间来分离T细胞。在一个实施方案中，时间约为30分钟。在另一个实施方案中，时间范围从30分钟到36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间为至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个实施方案中，时间为10至24小时，例如24小时。在与其它细胞类型相比有更少的T细胞的任何情况下，如在从肿瘤组织或从免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。此外，使用更长的温育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠子的时间和/或通过增加或降低珠子与T细胞的比例(如本文进一步描述的)，可对于或针对在培养开始时或在过程中的其它时间点优先选择T细胞亚群。另外，通过增加或降低珠子或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可对于或针对在培养开始时或在其它期望的时间点优先选择T细胞亚群。
在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白或其它适当的分子(例如其它细胞因子)中的一种或多种的T细胞群。用于筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号WO2012/126712中描述的方法来确定。
为了通过阳性选择或阴性选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠子)的浓度。在某些方面，可能期望显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(例如增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。另一方面，使用7500万、8000万、8500百万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可导致增加的细胞产率、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或更有效地从存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)中捕获。这样的细胞群可能具有治疗价值并且将是期望获得的。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能期望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择了表达大量结合颗粒的期望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。一方面，使用的细胞浓度是5×106/ml。在其它方面，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml，以及之间的任何整数值。
在其它方面，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2-10℃或在环境温度下温育不同的时间长度。
在一个实施方案中，群的多种免疫效应细胞不表达甘油二酯激酶(DGK)，例如是DGK缺陷型。在一个实施方案中，群的多种免疫效应细胞不表达Ikaros，例如是Ikaros缺陷型。在一个实施方案中，群的多种免疫效应细胞不表达DGK和Ikaros，例如是DGK和Ikaros缺陷型。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过移除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在此情况下将是有用的，一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS或含有10％Dextran 40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％Dextran 40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或包含例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻介质，然后将细胞以每分钟1°的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它控制冷冻方法，以及立即在-20℃或液氮中不受控制的冷冻方法。
在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所述解冻并洗涤并在室温下静置1小时，然后使用本发明的方法活化。
在本发明的上下文中还考虑在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的一段时间从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，待扩增的细胞来源可以在需要的任何时间点收集，并且分离和冷冻期望的细胞(如T细胞)以用于之后的任何数量的疾病或病症的免疫效应细胞治疗，所述疾病或病症将受益于免疫效应细胞治疗，如本文所述的那些。在一个方面，血液样品或单采血液成分术取自一般健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采血液成分术取自具有发展疾病风险但还没有发展成疾病的一般健康的受试者，将感兴趣的细胞分离并冷冻以备后用。在某些方面，可以将T细胞扩增、冷冻并在稍后使用。在某些方面，在诊断为如本文所述特定疾病后不久、但在任何治疗之前从患者收集样品。另一方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术中分离细胞，所述相关治疗方式包括但不限于用治疗剂的治疗，如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、放疗、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐射。
在本发明的另一方面中，在使受试者具有功能性T细胞的治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是使用损害免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久患者通常从治疗中恢复的期间，由于其离体扩增的能力，所获得的T细胞质量可能是最佳的或改进的。类似地，在使用本文所述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以用于增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中考虑在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在某些方面，动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案可以用于在受试者中产生条件，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的，特别是在治疗后确定的时间窗口。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞从已接受低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者获得。在一个实施方案中，在低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的足够时间、或足够给药后收获被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比例已经、至少短暂地增加了。
在其它实施方案中，已经或将被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群可以通过与一定量的mTOR抑制剂接触离体处理，所述mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比例。
已经认识到，本申请的方法可以利用包含5％或更少，例如2％的人AB血清的培养基条件，并且利用已知的培养基条件和组合物，例如Smith等人,“Ex vivo expansion ofhuman T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS ImmuneCell Serum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。
在一个实施方案中，本申请的方法可以利用包含无血清培养基的培养基条件。在一个实施方案中，无血清培养基是OpTmizer CTS(LifeTech)、Immunocult XF(Stemcelltechnologies)、CellGro(CellGenix)、TexMacs(Miltenyi)、Stemline(Sigma)、Xvivo15(Lonza)、PrimeXV(Irvine Scientific)或StemXVivo(RandD systems)。无血清培养基可补充有血清替代物，如LifeTech的ICSR(免疫细胞血清替代品)。血清替代物(例如ICSR)的水平可以例如高达5％，例如约1％、2％、3％、4％或5％。
在一个实施方案中，T细胞群是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质的细胞，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。可以通过遗传方法产生DGK缺陷型细胞，例如施用RNA干扰剂，例如siRNA、shRNA、miRNA以减少或预防DGK表达。或者，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理来产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施方案中，T细胞群是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，可通过遗传方法产生Ikaros缺陷型细胞，例如施用RNA干扰剂，例如siRNA、shRNA、miRNA，以减少或预防Ikaros表达。或者，可以通过用Ikaros抑制剂例如来那度胺治疗产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施方案中，T细胞群是DGK缺陷型和Ikaros缺陷型，例如不表达DGK和Ikaros，或具有减少或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文所述的任何方法产生这种DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一个实施方案中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异体的表达CAR的细胞
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如缺乏功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)的表达的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可被例如工程化使得其在其表面上不表达任何功能性TCR，被工程化使得其不表达一个或多个包含功能性TCR的亚基(例如，被工程化使得其不表达(或表现出降低的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)或被工程化使得其在其表面上产生非常少的功能性TCR。或者，T细胞可以表达显著受损的TCR，例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式。术语“基本上受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引起不利的免疫反应。
本文描述的T细胞可以例如被工程化使得其不在其表面上表达功能性HLA。例如，可以将本文所述的T细胞工程化，使得细胞表面表达的HLA(例如HLA 1类和/或HLA II类)下调。在一些实施方案中，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达完成HLA的下调。
在一些实施方案中，T细胞可缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLAII类。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可通过任何合适的方法获得，包括敲除或敲减TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)敲减TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如，通过在此描述的任何方法。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如所述抑制性分子可以降低表达CAR的细胞引起免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)。抑制性分子例如通过抑制DNA、RNA或蛋白质水平的抑制作用，可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施方案中，如本文所述，可使用抑制性核酸，例如抑制性核酸(例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施方案中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)的siRNA或shRNA抑制细胞(例如T细胞)中TCR表达和/或HLA表达。
siRNA和shRNA以及示例性shRNA的表达系统例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和650段中描述，其通过引用整体并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
本文所用的“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组成簇的规则间隔短回文重复序列或包括这样一组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指来源于CRISPR和Cas的系统，其可用于在细胞(例如T细胞)中沉默或突变本文所述的TCR和/或HLA基因和/或抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第651-658段中描述，其全部内容通过引用并入本文。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活剂样效应核酸酶，其是一种人工核酸酶，可用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第659-665段中，其全部内容通过引用并入本文。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种人工核酸酶，可用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)。
ZFN及其用途例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第666-671段中描述，其全部内容通过引用并入本文。
端粒酶表达
端粒在体细胞持续性中起着至关重要的作用，其长度由端粒酶(TERT)维持。CLL细胞中的端粒长度可能非常短(Roth等人,“Significantly shorter telomeres in T-cellsof patients with ZAP-70+/CD38chronic lymphocytic leukaemia”British Journal ofHaematology,143,383-386.,2008年8月28日)，并且在制造的表达CAR的细胞(例如CART19细胞)中甚至可能更短，而限制了它们在过继转移至患者后扩增的可能性。端粒酶表达可挽救表达CAR的细胞免于复制疲惫。
虽然不希望受任何具体理论的束缚，在一些实施方案中，由于T细胞中端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持续性；因此，用端粒酶基因转染可延长T细胞的端粒并改进患者中T细胞的持续性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancer inthe clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如T细胞)异位(ectopically)表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本公开提供了产生表达CAR的细胞的方法，其包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基例如TERT例如hTERT)的核酸接触。细胞可以在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与核酸接触。
端粒酶表达可以是稳定的(例如，核酸可以整合到细胞的基因组中)或瞬时的(例如核酸不整合，并且表达在一段时间例如几天后下降)。可以通过用编码端粒酶亚基的DNA和选择性标记物转染或转导细胞、并选择稳定的整合体来实现稳定的表达。备选地或组合地，可以通过位点特异性重组，例如使用Cre/Lox或FLP/FRT系统实现稳定表达。
瞬时表达可涉及用核酸(例如DNA或RNA，如mRNA)转染或转导。在一些实施方案中，瞬时mRNA转染避免了有时与用TERT稳定转染相关的遗传不稳定性。例如在国际申请WO2014/130909中描述了外源性端粒酶促活性的瞬时表达，所述国际申请的全部内容通过引用并入本文。在实施方案中，根据由Moderna Therapeutics商业化的信使RNATherapeutics TM平台进行端粒酶亚基的基于mRNA的转染。例如，该方法可以是在美国专利号8710200、8822663、8680069、8754062、8664194或8680069中描述的方法。
在一个实施方案中，hTERT具有GenBank Protein ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic subunit Gene,IsUp-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell第90卷,第4期,1997年8月22日,第785–795页)：
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO：108的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，hTERT具有SEQ ID NO：108的序列。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或两个末端包含(例如，不超过5、10、15、20或30个氨基酸的)缺失。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或两个末端包含(例如，不超过5、10、15、20或30个氨基酸的)转基因氨基酸序列。
在一个实施方案中，hTERT由GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell第90卷,第4期,1997年8月22日,第785–795页)：
在一个实施方案中，hTERT由具有与SEQ ID NO：23的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的核酸编码。在一个实施方案中，hTERT由SEQID NO：23的核酸编码。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供被工程化以含有一种或多种CAR的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)，所述CAR将免疫效应细胞导向癌症。这通过CAR上对癌症相关抗原特异的抗原结合结构域实现。有两类癌症相关抗原(肿瘤抗原)可以被本文所述的CAR靶向：(1)在癌细胞表面表达的癌症相关抗原；和(2)本身是细胞内的癌症相关抗原，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递到癌细胞的表面上。
因此，例如通过本文所述的方法获得的免疫效应细胞可以被工程化以含有靶向以下癌症相关抗原(肿瘤抗原)之一的CAR：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、Plysialic acid、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、legumain、HPV E6,E7、MAGE-A1、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶和mut hsp70-2。
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如在相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如在不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案以及双特异性抗体分子的各种配置在例如2015年3月13日提交的WO2015/142675的第455-458段中描述，其通过引用整体并入。
在一个方面，双特异性抗体分子的特征在于对CD19具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列(例如scFv)，例如包括本文所述的scFv或包括来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR，以及对不同抗原上的第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
嵌合TCR
在一个方面，可以将本发明的抗体和抗体片段(例如CD19抗体和片段)移植到T细胞受体(“TCR”)链的一个或多个恒定结构域，例如TCRα或TCRβ链，以产生嵌合TCR。不受理论束缚，据信嵌合TCR在抗原结合后将通过TCR复合物发出信号。例如，本文公开的scFv可以移植到TCR链的恒定结构域，例如细胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分，例如TCRα链和/或TCRβ链。作为另一个实例，抗体片段(例如本文所述的VL结构域)可以移植到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段(例如本文所述的VH结构域)可以移植到TCRβ链的恒定结构域(或者可选地，VL结构域可以移植到TCRβ链的恒定结构域和VH结构域可以移植到TCRα链)。作为另一个实例，抗体或抗体片段的CDR可以移植到TCRα和/或β链中以产生嵌合TCR。例如，本文公开的LCDR可以移植到TCRα链的可变结构域中，本文公开的HCDR可以移植到TCRβ链的可变结构域，反之亦然。例如可以通过本领域已知的方法产生这种嵌合TCR(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy 2000；7:1369–1377；Zhang T等人,Cancer GeneTher 2004；11:487–496；Aggen等人,Gene Ther.2012Apr；19(4):365-74)。
非抗体支架
在实施方案中，抗原结合结构域包括非抗体支架，例如纤连蛋白、锚蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小模块化免疫药物、maxybody、蛋白质A或affilin。非抗体支架具有与细胞上的靶抗原结合的能力。在实施方案中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括非抗体支架。可以使用各种各样的非抗体支架，只要所得多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上靶抗原的结合区。
非抗体支架包括：纤连蛋白(Novartis，MA)、锚蛋白(Molecular Partners AG，Zurich，Switzerland)、结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA和Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、maxybody(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(ScilProteins GmbH,Halle,Germany)。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包括结合靶细胞表面上的反配体(counterligand)的分子的细胞外结构域或其反配体结合片段。
免疫效应细胞可包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码CAR的序列，其中CAR包含特异性结合肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)，和细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域可以包括共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。如别处所述，本文所述的方法可包括用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导细胞，例如来自除去T调节细胞的群的细胞。
在具体的方面，CAR包含scFv结构域，其中scFv之前可以是如SEQ ID NO：1中提供的任选的前导序列，之后是如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38中提供的任选的铰链序列、如SEQ ID NO：6中提供的跨膜区、包括SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16的细胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的CD3ζ序列，例如，其中结构域是连续的并在相同的阅读框内以形成单一的融合蛋白。
在一个方面，示例性CAR构建体包括任选的前导序列(例如本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和细胞内刺激结构域(例如，本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性的CAR构建体包括任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)。
示例性的前导序列如SEQ ID NO：1所提供。示例性的铰链/间隔序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所提供。示例性跨膜结构域序列如SEQ ID NO：6所提供。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO：7所提供。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO：16所提供。示例性的CD3ζ结构域序列如SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10所提供。
在一个方面，免疫效应细胞包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含编码CAR的核酸分子，其中所述核酸分子包含编码抗原结合结构域的核酸序列，其中所述序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列是连续的并在相同的阅读框内。可用于CAR的示例性细胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB等中的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
可以使用本领域已知的重组方法获得编码期望分子的核酸序列，如通过从表达核酸分子的细胞筛选文库、通过从已知包含核酸分子的载体获得核酸分子、或者通过使用标准技术从含有核酸分子的细胞和组织中直接分离。或者，可以合成而不是克隆产生感兴趣的核酸。
例如，使用逆转录病毒或慢病毒载体构建体将编码CAR的核酸导入免疫效应细胞。
也可以使用例如可直接转染到细胞中的RNA构建体将编码CAR的核酸导入免疫效应细胞。产生用于转染的mRNA的方法包括用特别设计的引物进行模板的体外转录(IVT)，然后进行polyA加入，以产生构建体，其含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如本文所述的3'和/或5'UTR)、5'帽(例如，本文所述的5'帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文所述的IRES)、待表达的核酸、和polyA尾巴，通常长度为50-2000个碱基(例如，在实施例中描述的，例如SEQ ID NO：35)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导入细胞，例如T细胞。
抗原结合结构域
在一个方面，多种免疫效应细胞(例如除去T调节细胞的群)包含编码CAR的核酸，所述CAR包含靶特异性结合元件，另外也称为抗原结合结构域。结合元件的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域来识别配体，所述配体作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记物发挥作用。因此，可作为本文所述的CAR中的抗原结合结构域的配体发挥作用的细胞表面标记物的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一个方面中，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向肿瘤抗原，例如，本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是结合如下抗原的任何结构域:包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，比如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)，且结合本领域已知的备选的支架以抗原结合结构域形式(比如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体(TCR)或其片段，例如单链TCR等)起作用。在某些情况下，抗原结合结构域来源于与CAR的最终用处相同的物种是有利的。例如，为了用于人类，CAR的抗原结合结构域包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的残基可能是有利的。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包括抗CD19抗体或其片段，例如scFv。例如，抗原结合结构域包含表1中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是例如本文所述的任何接头序列，或任选地，可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ IDNO:104)。
表1：抗CD19抗体结合结构域
表2：其它的抗CD19抗体结合结构域
表2A：其它的鼠抗CD19抗体结合结构域
根据本公开可以使用任何CD19CAR，例如任何已知的CD19CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；描述于美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,LeukLymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood 122(25):4129-39(2013)；和16th Annu MeetAm Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,摘要10中的CD19 CAR。
可以使用CAR表达细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19，CD123，EGFRvIII，间皮素等，如例如WO 2014/130635，WO 2014/130657，和WO 2015/090230中所述，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，其经由用自失活的复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导通过稳定插入介导，所述载体含有EF-1α启动子控制下的CTL019转基因。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞的百分比递送给受试者。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合人CD19，例如，可以包括根据WO2014/153270(并入本文作为参考)的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合CD123，例如，可以包括根据WO2014/130635(并入本文作为参考)的表1-2的CAR分子(例如CAR1-CAR8任一个)或抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的CD123 CAR，例如US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中描述的CD123 CAR，二者均通过引用并入本文。在实施方案中，CD123CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所示的核苷酸序列，二者均通过引用并入本文。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据WO2014/130657(其通过引用并入本文)的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如US2014/0322275A1描述的EGFRvIII CAR，US2014/0322275A1通过引用并入本文。在实施方案中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322275A1中所示的核苷酸序列，US2014/0322275A1通过引用并入本文。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据WO2015/090230(其通过引用并入本文)的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的间皮素CAR，例如WO 2015/090230中描述的间皮素CAR，WO 2015/090230通过引用并入本文。在实施方案中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有WO 2015/090230中所示的核苷酸序列，WO 2015/090230通过引用并入本文。
在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的BCMA CAR分子，例如US-2016-0046724-A1中所述的BCMA CAR。在实施方案中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列，US-2016-0046724-A1通过引用并入本文。
在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的CLL1 CAR，例如US2016/0051651A1中描述的CLL1 CAR，US2016/0051651A1通过引用并入本文。在实施方案中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有US2016/0051651A1中所示的核苷酸序列，US2016/0051651A1通过引用并入本文。
在一个实施方案中，CAR分子包括本文描述的CD33 CAR，例如US2016/0096892A1中描述的CD33 CAR，US2016/0096892A1通过引用并入本文。在实施方案中，CD33CAR包含氨基酸，或具有US2016/0096892A1中所示的核苷酸序列，US2016/0096892A1通过引用并入本文。
根据本文所述的任何方法或组合物，在实施方案中，CAR分子包括本文所述的CD123 CAR，例如US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所述的CD123 CAR，US2014/0322212A1和US2016/0068601A1均通过引用并入本文。在实施方案中，CD123 CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所示的核苷酸序列，US2014/0322212A1和US2016/0068601A1均通过引用并入本文。在其它实施方案中，CAR分子包括本文所述的CD19 CAR分子，例如US-2015-0283178-A1中描述的CD19 CAR分子，例如CTL019。在实施方案中，CD19CAR包含氨基酸，或具有US-2015-0283178-A1中所示的核苷酸序列，US-2015-0283178-A1通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的BCMACAR分子，例如US-2016-0046724-A1中所述的BCMA CAR。在实施方案中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列，US-2016-0046724-A1通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的CLL1 CAR，例如US2016/0051651A1中描述的CLL1 CAR，US2016/0051651A1通过引用并入本文。在实施方案中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有US2016/0051651A1中所示的核苷酸序列，US2016/0051651A1通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的CD33 CAR，例如US2016/0096892A1中所述的CD33 CAR，US2016/0096892A1通过引用并入本文。在实施方案中，CD33CAR包含氨基酸，或具有US2016/0096892A1中所示的核苷酸序列，US2016/0096892A1通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如US2014/0322275A1中所述的EGFRvIII CAR，US2014/0322275A1通过引用并入本文。在实施方案中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322275A1中所示的核苷酸序列，US2014/0322275A1通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包括本文所述的间皮素CAR，例如WO 2015/090230中描述的间皮素CAR，WO 2015/090230通过引用并入本文。在实施方案中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有WO 2015/090230中所示的核苷酸序列，WO 2015/090230通过引用并入本文。
示例性的CD19 CAR包含本文(例如本文所述的一个或多个表格中)所述的CD19CAR，或Xu等人Blood 123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood 122.25(2013):4129-39,Cruz等人Blood 122.17(2013):2965-73,NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207中所述的抗CD19 CAR，这些文献中每一个通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文所述抗体(例如WO2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US2014/0322212A1、US2016/0068601A1、US2016/0051651A1、US2016/0096892A1、US2014/0322275A1或WO2015/090230中所述的抗体，这些文献通过引用并入本文)的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR：HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文所述抗体(例如WO2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US2014/0322212A1、US2016/0068601A1、US2016/0051651A1、US2016/0096892A1、US2014/0322275A1或WO2015/090230中所述的抗体，这些文献通过引用并入本文)的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR：LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包括上文列出的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施方案中，抗原结合结构域是WO2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US2014/0322212A1、US2016/0068601A1、US2016/0051651A1、US2016/0096892A1、US2014/0322275A1或WO2015/090230中描述的抗原结合结构域，这些文献通过引用并入本文。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向BCMA并描述于US-2016-0046724-A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CD19并描述于US-2015-0283178-A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CD123并描述于US2014/0322212A1、US2016/0068601A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CLL1并描述于US2016/0051651A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CD33并描述于US2016/0096892A1中。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA和GFR ALPHA-4等等，例如描述在如WO2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO2016/014576、WO 2015/090230、WO2016/014565、WO2016/014535和WO2016/025880，这些文献通过引用整体并入本文。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合人源化CD19，例如可以包括CAR分子或根据WO2014/153270的表3的抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)，WO2014/153270通过引用并入本文。编码CD19 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO2014/153270中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任何一个)或根据WO2014/130635的表1-2的抗原结合结构域，WO2014/130635通过引用并入本文。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130635中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任何一个)或根据WO2016/028896的表2、6和9中的抗原结合结构域，WO2016/028896通过引用并入本文。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/028896中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可特异性结合EGFRvIII，例如可包括CAR分子或根据WO2014/130657的表2或SEQ ID NO：11的抗原结合结构域，WO2014/130657通过引用并入本文。编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130657中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD33，例如可以包括CAR分子(例如，CAR33-1至CAR-33-9中的任何一个)或根据WO2016/014576的表2或9的抗原结合结构域，WO2016/014576通过引用并入本文。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014576中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可特异性结合间皮素，例如可包括CAR分子或根据WO2015/090230的表2-3的抗原结合结构域，WO2015/090230通过引用并入本文。编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VLCDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2015/090230中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合BCMA，例如可以包括CAR分子或根据WO2016/014565的表1或16、SEQ ID NO：271或SEQ ID NO：273的抗原结合结构域，WO2016/014565通过引用并入本文。编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014565中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可特异性结合CLL-1，例如可包括CAR分子或根据WO2016/014535的表2的抗原结合结构域，WO2016/014535通过引用并入本文。编码CLL-1CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014535中具体说明。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可特异性结合GFR ALPHA-4，例如可包括CAR分子或根据WO2016/025880的表2的抗原结合结构域，WO2016/025880通过引用并入本文。编码GFR ALPHA-4CAR分子和抗原结合结构域(例如包括一个、两个、三个VH CDR和一个、两个、三个VL CDR，根据Kabat或Chothia)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/025880中具体说明。
在一个实施方案中，本文所述的任何CAR分子(例如，CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA和GFR ALPHA-4中的任意)的抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如全部三个)来自以上列出的抗体的重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3和/或来自以上列出的抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含以上列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自以上列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或一个、两个、三个(例如全部三个)来自以上列出的抗体的轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含以上列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675中描述的肿瘤抗原，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自以下一种或多种:CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也被称为CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319，和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(AB1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoHglycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；FOS相关抗原1；肿瘤蛋白质p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾uibiguitous 1(RU1)；肾uibiguitous 2(RU2)；legumain；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hosp 70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自以上列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或一个、两个、三个(例如全部三个)来自以上列出的抗体的轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含以上列出或描述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
一方面，抗肿瘤抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个方面，如本文所述的抗癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体和其片段以野生型或增强的亲和力结合本文所述的癌症相关抗原蛋白。
在一些情况下，可根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起可以产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果使用短多肽接头(例如5-10个氨基酸)，则防止链内折叠。也需要链间折叠将两个可变区带到一起以形成功能性表位结合位点。对于接头方向和大小的例子，参见例如Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，这些文献通过引用并入本文。
scFv可以在其VL和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸残基的接头。该接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列的组，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO：25)。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：28)。接头长度的变化可保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的效力。
另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。制备这种TCR的方法在本领域中是已知的。参见例如Willemsen RA等人Gene Therapy 7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther 11:487–496(2004)；Aggen等人,GeneTher.19(4):365-74(2012)(参考文献通过引用整体并入本文)。例如，可以工程化scTCR，使得含有通过接头(例如，柔性肽)连接的来自T细胞克隆的Vα和Vβ基因。这种方法对本身是细胞内的癌症相关的靶非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，在各种实施方案中，CAR可以被设计为包含连接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包含临近跨膜区的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜(蛋白)所来源的蛋白的细胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所来源的蛋白的细胞内区相关的一个或多个另外的氨基酸(例如细胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与CAR的其它结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同CART中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以来自天然或来自重组来源。如果来源是天然的，则该结构域可以来自任何膜结合或跨膜蛋白。一方面，无论CAR何时结合靶，跨膜结构域都能够向细胞内结构域传递信号。本发明中特定用途的跨膜结构域可至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可至少包括例如KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19的跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)连接到CAR的细胞外区，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。在一个实施方案中，铰链或间隔区包括SEQ IDNO：2的氨基酸序列(例如由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包括SEQ ID NO：6的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一个方面，铰链或间隔区包括IgG4铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔区包括以下氨基酸序列的铰链：ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:36)。在一些实施方案中，铰链或间隔区包括由以下核苷酸序列编码的铰链：
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:37)。
在一个方面，铰链或间隔区包括IgD铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔区包括以下氨基酸序列的铰链：RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:38)。在一些实施方案中，铰链或间隔区包括由以下核苷酸序列编码的铰链：
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:103)。
一方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，其将主要包括疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端找到苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质区之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包括GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头由以下核苷酸序列编码：GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:8)。
在一个方面，铰链或间隔区包括KIR2DS2铰链。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责活化已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。
用于本文描述的CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和共同起作用以启动抗原受体接合后的信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，还需要次级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两种不同类型的细胞质信号序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些细胞质信号序列(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些细胞质信号序列(次级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激性方式或抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别使用的含有ITAM的初级细胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d的那些。在一个实施方案中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3ζ的初级信号传导结构域，例如本文描述的CD3ζ序列。
在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比活性已经改变(例如增加或减少)的突变ITAM结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括含有被修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
共刺激信号传导结构域
CAR的细胞内信号传导结构域可以包括单独的CD3ζ信号传导结构域，或者其可以与在本发明CAR的情况下有用的任何其它期望的细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR部分。在一个实施方案中，细胞内结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。一方面，细胞内结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除了(淋巴细胞对抗原有效应答所需的)抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这些分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体，等等。例如，已证明CD27共刺激在体外增强人CART细胞的扩增、效应功能和存活，并增加人T细胞持续性和体内抗肿瘤活性(Song等人Blood.2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其它实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C和PAG/Cbp。
CAR的细胞质部分内的细胞内信号传导序列可以以随机的或指定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(例如长度在2至10个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间)可以在细胞内信号传导序列之间形成连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双链体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，可以使用单个氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸作为合适的接头。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含两个或更多个，例如2、3、4、5个或更多个共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或更多个，例如2、3、4、5个或更多个共刺激信号传导结构域被接头分子(例如本文所述的接头分子)分开。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。一方面，细胞内信号传导结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO：7的信号传导结构域。一方面，CD3ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO：9的信号传导结构域。
一方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。一方面，CD27的信号传导结构域包含以下的氨基酸序列：QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:16)。在一个方面，CD27的信号传导结构域由以下核酸序列编码：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:14)。
在一个方面，本文描述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包含例如针对相同靶或不同靶(例如，不同于本文所述的癌症相关抗原或本文所述的不同癌症相关抗原的靶，例如CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β)的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施方案中，第二CAR包含针对与癌症相关抗原相同的癌细胞类型表达的靶的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原的第一CAR，所述第一CAR包含具有共刺激信号传导结构域但不是初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；以及靶向第二种不同抗原的第二CAR，所述第二CAR包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。不希望受理论束缚，将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上，以及将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制在表达两个靶的细胞中。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR和靶向不同靶抗原(例如与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)的第二CAR，所述第一癌症相关抗原CAR包括结合本文所述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，所述第二CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和靶向不同于第一靶抗原的抗原(例如，与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)的第二CAR，所述第一CAR包括结合本文所述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，所述第二CAR包括抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
另一方面，本公开的特征在于表达CAR的细胞(例如CART细胞)的群。在一些实施方案中，表达CAR的细胞的群包括表达不同CAR的细胞的混合物。
例如，在一个实施方案中，CART细胞的群可包括表达CAR的第一细胞和表达CAR的第二细胞，该第一细胞表达的CAR具有针对本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域，该第二细胞表达的CAR具有不同的抗原结合结构域，例如针对本文所述的不同癌症相关抗原的抗原结合结构域，例如针对与第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合的癌症相关抗原不同的本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域。
作为另一个实例，表达CAR的细胞的群可以包括表达CAR的第一细胞和表达CAR的第二细胞，该第一细胞表达的CAR包含针对本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域，该第二细胞表达的CAR包含针对与本文所述的癌症相关抗原不同的靶的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群包含例如表达包括初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞和表达包括次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。
另一方面，本公开的特征在于细胞群，其中群中的至少一个细胞表达具有本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR，和表达另一种试剂的第二细胞，例如所述试剂增强表达CAR的细胞的活性。例如，在一个实施方案中，所述试剂可以是抑制抑制性分子的试剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如PD-1可以降低表达CAR的细胞引发免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的试剂包含第一多肽，例如与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)相结合的抑制性分子。在一个实施方案中，所述试剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ或任何这些的片段)的第一多肽，以及第二多肽，所述第二多肽为本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包括共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27、OX40或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域))。在一个实施方案中，所述试剂包含PD-1的第一多肽或其片段，以及本文所述的细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。
本文表1中提供了抗CD19结合结构域的序列。可使用表1中所述的任何抗原结合结构域以及下文提供的一种或多种另外的CAR组分产生完整的CAR构建体。
·前导(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
·前导(核酸序列)(SEQ ID NO:12)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
·前导(核酸序列2)(SEQ ID NO:127)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
·前导(核酸序列3)(SEQ ID NO:128)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
·CD8铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD·CD8铰链(核酸序列)(SEQID NO:13)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
·CD8铰链(核酸序列2)(SEQ ID NO:129)
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
·CD8跨膜(氨基酸序列)(SEQ ID NO:6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
·跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:17)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
·跨膜(核酸序列2)(SEQ ID NO:130)
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
·4-1BB细胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
·4-1BB细胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:18)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
·4-1BB细胞内结构域(核酸序列2)(SEQ ID NO:131)
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
·CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
·CD3ζ(核酸序列2)(SEQ ID NO:132)
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
·CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)
(SEQ ID NO:10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
·CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:21)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
EF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:11).
Gly/Ser(SEQ ID NO:25)
GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:26):该序列可包含1-6"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:29)
GGGS
PolyA(SEQ ID NO:30):A5000
PolyA(SEQ ID NO:31):A100
PolyT(SEQ ID NO:32):T5000
PolyA(SEQ ID NO:33):A5000
PolyA(SEQ ID NO:34):A400
PolyA(SEQ ID NO:35)”A2000
·Gly/Ser(SEQ ID NO:15):该序列可包含1-10"Gly Gly Gly Ser"重复单元
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
可用于本文所述方法中的示例的CD19 CAR构建体在表3中显示:
表3:CD19 CAR构建体
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案、Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
scFv结构域的人源化CDR序列的重链可变结构域序列示于表3A中和轻链可变结构域序列示于表3B中。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表3A重链可变结构域CDR(Kabat)
表3B轻链可变结构域CDR
CAR与其它分子或试剂的共表达
第二CAR的共表达
在一个方面，本文描述的表达CAR的细胞可以进一步包括第二CAR，例如，包含针对例如相同靶(例如CD19)或不同靶(例如，不是CD19的靶，例如本文所述的靶)的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原的第一CAR和靶向第二种不同抗原的第二CAR，所述第一CAR包括具有共刺激信号传导结构域但不是初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，所述第二CAR包括具有初级信号传导结构域但不是共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上，将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上，可将CAR活性限制于表达两个靶的细胞中。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，所述第二CAR靶向另一抗原并包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，所述第二CAR靶向另一抗原且包括针对所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含本文所述的XCAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而不是癌细胞(例如也表达X的正常细胞)上存在的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)的细胞内结构域。
在一个实施方案中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以是使得抗原结合结构域不彼此相互作用的那样。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域，例如作为不与第二CAR的抗原结合结构域形成结合的片段，例如scFv，例如，第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单结构域抗原结合(SDAB)分子，其包括互补决定区是单结构域多肽的部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4-链抗体的单结构域、工程化的结构域和不是源自抗体的那些的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以源自鱼中存在的免疫球蛋白的可变区，如，例如源自在鲨鱼血清中发现的称为新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR(“IgNAR”)可变区的单结构域分子的方法描述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14：2901-2909中。
根据另一方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，已知其为不含轻链的重链。这种单结构域分子披露于，例如，WO 9404678和Hamers-Casterman,C等人(1993)Nature 363:446-448。为了清楚起见，源自天然缺乏轻链的重链分子的该可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以区分来自四链免疫球蛋白的常规VH。这种VHH分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和原驼。除骆驼科外，其它物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；这样的VHH在本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现具有多个嵌合膜嵌入受体的细胞可能不是期望的，例如，因为其抑制一种或多种抗原结合结构域结合其同源抗原的能力，所述嵌合膜嵌入受体包括受体的抗原结合结构域之间相互作用的抗原结合结构域。因此，本文公开了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，所述嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还公开了编码第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的核酸，所述嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一个实施方案中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体中的一种的抗原结合结构域包含scFv，而另一种包含单个VH结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。
在一些实施方案中，本文的组合物包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域是scFv，而另一种不是scFv。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域包括纳米抗体。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域包含骆驼VHH结构域。
在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域包含scFv，而另一种包含单个VH结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域包含scFv，另一种包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一和第二CAR中的一种的抗原结合结构域包含scFv，另一种包含骆驼VHH结构域。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不被第二CAR的存在而降低。在一些实施方案中，在第二CAR存在时第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合，是在第二CAR不存在时第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域的彼此结合低于两者都是scFv抗原结合结构域时。在一些实施方案中，第一和第二CAR的抗原结合结构域的彼此结合比如果两者都是scFv抗原结合结构域时的结合至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，例如，少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
共表达增强CAR活性的试剂
另一方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种试剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或适合性的试剂。
例如，在一个实施方案中，所述试剂可以是抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的试剂。在一些实施方案中，调控或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子例如PD1可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷或TGFβ。
在实施方案中，试剂，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如，如本文所述的抑制性蛋白质或系统，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)可用于抑制调控或调节(例如抑制)表达CAR的细胞中T细胞功能的分子的表达。在一个实施方案中，试剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一个实施方案中，调控或调节(例如抑制)T细胞功能的试剂在表达CAR的细胞中被抑制。例如，抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的表达的dsRNA分子与编码CAR的组件(例如CAR的所有组件)的核酸连接。
在一个实施方案中，抑制抑制性分子的试剂包括与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)连接的第一多肽(例如抑制性分子)。在一个实施方案中，所述试剂包含例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，所述抑制性分子如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷或TGFβ，或任何这些的片段(例如这些中任一个的细胞外结构域的至少部分)，所述第二多肽是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述试剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。PD1是还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA的CD28受体家族的抑制性成员。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示PD1的两种配体，PD-L1和PD-L2在与PD1结合时下调T细胞活化(Freeman等人2000J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人2001NatImmunol 2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人癌症中是丰富的(Dong等人2003J Mol Med 81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res 10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一个实施方案中，试剂包含抑制性分子(例如程序性死亡1(PD1))的细胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如41BB和CD3ζ(在本文中也称为PD1 CAR))融合。在一个实施方案中，当与本文所述的XCAR组合使用时，PD1 CAR改进T细胞的持久性。在一个实施方案中，CAR是包含PD1的细胞外结构域(如SEQ ID NO：105中的下划线所示)的PD1 CAR。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnw yrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelr vterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:105)。
在一个实施方案中，PD1 CAR包含以下提供的氨基酸序列(SEQ ID NO：106)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsq pgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpag qfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:106)。
在一个实施方案中，所述试剂包含编码PD1 CAR(例如本文所述的PD1 CAR)的核酸序列。在一个实施方案中，PD1 CAR的核酸序列如下所示，其中PD1 ECD在下文SEQ ID NO：107中加下划线
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccgg atggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggc gataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgt caaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgac tcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgc ggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagag ctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(SEQ ID NO:107)。
在另一个实例中，在一个实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的试剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其它实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性结合CD83的配体，例如如本文所述。共刺激分子配体的例子包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL和LIGHT。在实施方案中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施方案中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施方案中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施方案中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施方案中，共刺激分子配体是CD70。在实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞可进一步被工程化以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共表达
在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)还包含趋化因子受体分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达增强向分泌CCL2或CXCL1的实体瘤(包括黑色素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,JImmunother.2010Oct；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，据信在表达CAR的细胞中表达识别由肿瘤(例如实体瘤)分泌的趋化因子的趋化因子受体可以改进表达CAR的细胞向肿瘤的归巢、促进表达CAR的细胞向肿瘤的浸润、并且增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包括天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适用于本文描述的表达CAR的细胞(例如CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)或其趋化因子结合片段。在一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子来选择与本文所述的CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞进一步包括(例如表达)CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两个不同的载体上。在本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同载体上的实施方案中，CAR和趋化因子受体分子各自在两个不同启动子的控制下或在相同启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供免疫效应细胞，例如通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞，其包括编码本文所述的一个或多个CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。一方面，核酸分子作为DNA构建体提供。
本文所述的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其组合。在一个实施方案中，核酸分子是编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其它实施方案中，核酸分子是包括任何前述核酸分子的载体。
一方面，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如scFv)由核酸分子编码，所述核酸分子的序列已经过用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化。在一个方面，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，所述核酸分子的整个序列已经过用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化。密码子优化是指发现在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)出现的频率在不同物种中有偏向。这种密码子简并允许相同的多肽由不同核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如至少美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
因此，在一个方面，例如通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含结合本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和包含刺激结构域例如共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域，例如本文所述的ζ链)的细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的细胞内信号传导结构域)。
本发明还提供了载体，其中插入了编码CAR的核酸分子，例如本文所述的核酸分子。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合以及在子细胞中的增殖。慢病毒载体相对于源自致癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。逆转录病毒载体也可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)和感兴趣的转基因，例如编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可能缺乏病毒结构基因，如gag、pol和env。示例性的γ-逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其它γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011Jun；3(6):677–713。
在另一个实施方案中，包含编码期望的CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子(如睡美人、crisper、CAS9和锌指核酸酶)完成编码CAR的核酸的表达。见下面June等人2009Nature Reviews Immunology 9.10:704-716，其通过引用整体并入本文。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸有效连接至启动子并将该构建体掺入表达载体中来实现。载体可适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节期望核酸序列表达的启动子。
核酸可以被克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的并且描述于例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY以及其它病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择性标记物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了一个便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并在体内或离体递送至受试者的细胞。本领域已知许多逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域已知许多腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录启动的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp区域，尽管已表明许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前启动子元件之间的间距可以增加至50bp。取决于启动子，单个元件看起来可以共同或独立发挥功能以活化转录。示例性的启动子包括CMVIE基因、EF-1α、泛蛋白C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR编码核酸分子的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基表达，其负责酶促将氨酰基tRNA递送至核糖体。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒中，并已被证明可有效地驱动从克隆到慢病毒载体中的核酸分子表达CAR。参见例如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包含实施例中提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应局限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这种表达时，该分子开关能够打开其有效连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时，该分子开关关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个例子是磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在实施方案中，可能需要截短的PGK启动子(例如与野生型PGK启动子序列相比具有一个或多个，例如1、2、5、10、100、200、300或400个核苷酸缺失的PGK启动子)。
下文提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:109)
示例性截短的PGK启动子:
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:110)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:111)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:112)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:113)
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加型复制和在原核生物中进行复制的元件(例如SV40起点和ColE1或其它本领域已知的元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染过程。选择标记和报告基因都可以在适当的调控序列的侧翼以确保在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评估调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不是受体生物体或组织表达的基因，并且其编码的多肽表达通过某种容易检测到的性质(例如酶促活性)证实。在将DNA引入受体细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人,2000FEBSLetters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知技术制备或商业获得。一般而言，具有显示最高的报告基因表达水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
在实施方案中，载体可以包含两个或更多个编码CAR(例如本文所述的CAR，例如CD19 CAR和第二CAR，例如抑制性CAR或特异性结合不是CD19的抗原的CAR)的核酸序列。在这样的实施方案中，两个或更多个编码CAR的核酸序列由相同框架中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链编码。在这方面，两个或更多个CAR可以例如被一个或多个肽切割位点分开(例如，自身切割位点或细胞内蛋白酶的底物)。肽切割位点的实例包括T2A、P2A、E2A或F2A位点。
将基因引入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可以通过任何方法例如本领域已知的方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY。将多核苷酸引入宿主细胞的合适方法是磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体已经成为将基因插入哺乳动物(例如人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。现有技术的靶向递送核酸的其它方法是可用的，如使用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸的递送系统递送多核苷酸。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑将脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部中，分散在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸连接的连接分子连接到脂质体，包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬液包含在脂质中、含有胶束或与胶束复合、或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体结合组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，如胶束，或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂肪物质或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物种类。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质的储备溶液可储存在约-20℃。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，涵盖由封闭脂质双层或聚集体的产生形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体的特征在于具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，其自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞中的方法如何，或使细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中存在重组核酸序列，可以进行各种测定法。这样的测定法包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定法，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定法，如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的物质。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文所述的CAR分子包含自然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任何以下自然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与适体分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。国际公开号WO2014/145252中描述了包含NKR组分的CAR分子的示例性配置和序列，WO2014/145252的内容通过引用并入本文。
拆分CAR
在一些实施方案中，表达CAR的细胞使用拆分CAR。在公布WO2014/055442和WO2014/055657中更详细地描述了拆分CAR的方法。简言之，拆分CAR系统包括表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，表达CAR的细胞仅在两种抗原存在下才被完全活化。
调控嵌合抗原受体的策略
在一些实施方案中，期望CAR活性能够被控制的可调控CAR(RCAR)，以优化CAR治疗的安全性和有效性。有多种方式可调控CAR活性。例如，使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶的诱导型凋亡(参见例如Di Stasa等人,N Engl.J.Med.2011Nov.3；365(18):1673-1683)可以在本发明的CAR治疗中作为安全开关使用。在一个实施方案中，表达本发明的CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)进一步包含诱导型凋亡开关，其中人胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)或修饰形式融合至人FKB蛋白的修饰，其以允许条件二聚化。在存在小分子如雷帕霉素(例如AP 1903、AP20187)的情况下，可诱导的胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)被活化并导致表达本发明的CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于胱天蛋白酶的诱导型凋亡开关(或这种开关的一个或多个方面)的实例已经描述于例如US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638；所有这些通过引用并入本文。
在另一个实例中，表达CAR的细胞也可表达可诱导的胱天蛋白酶-9(iCaspase-9)分子，其在二聚体药物(例如，rimiducid(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))施用时导致Caspase-9活化和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有二聚化的化学诱导剂(CID)结合结构域，其在CID存在的情况下介导二聚化。这导致可诱导和可选择地去除表达CAR的细胞。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全开关以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如Song等人Cancer GeneTher.2008；15(10):667-75；Clinical Trial Id.No.NCT02107963；和Di Stasi等人N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
用于调节本发明CAR治疗的替代策略包括利用例如通过缺失表达CAR的细胞(例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞也可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。这样的受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如、整联蛋白ανβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/basigin、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但缺乏细胞质结构域内的一个或多个区的形式)。
例如，本文所述的表达CAR的细胞还可表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺乏信号传导能力但保留被能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗)识别的表位，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后去除表达CAR的细胞(参见例如WO2011/056894和Jonnalagadda等人,Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一策略包括在本文所述的表达CAR的细胞中表达组合来自CD32和CD20抗原的靶表位的高度紧凑的标记物/自杀基因，其结合利妥昔单抗，导致选择性除去表达CAR的细胞，例如通过ADCC(参见例如Philip等人,Blood.2014；124(8)1277-1287)。本文所述的其它除去表达CAR的细胞的方法包括施用CAMPATH，一种单克隆抗CD52抗体，其选择性结合并靶向成熟淋巴细胞(例如表达CAR的细胞)，用于例如通过诱导ADCC破坏。在其它实施方案中，可使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性靶向表达CAR的细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少表达CAR的细胞的数量。在其它实施方案中，CAR配体(例如抗独特型抗体)可以与诱导细胞杀伤的试剂(例如毒素)偶联，从而减少表达CAR的细胞的数量。或者，可以配置CAR分子本身，使得可以调节活性，例如打开和关闭，如下所述。
在其它实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞也可表达被T细胞除去剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20并且T细胞除去剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在此类实施方案中，一旦期望减少或除去表达CAR的细胞，例如以减轻CAR诱导的毒性，则施用T细胞除去剂。在其它实施方案中，T细胞除去剂是抗CD52抗体，例如阿仑单抗，如本文实施例中所述。
在其它实施方案中，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施方案中通常包含两个多肽，其中本文所述的标准CAR的组分(例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域)分布在单独的多肽或成员上。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，当二聚化分子存在时该二聚化开关可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR利用二聚化开关，如在WO2014127261中描述的那些，WO2014127261通过引用并入本文。本文中以及例如2015年3月13日提交的国际公布号WO2015/090229的段落527-551中提供了这种可调节的CAR的附加描述和示例性配置，该文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，RCAR包含开关结构域，例如，如SEQ ID NO：114所示的FKBP开关结构域，或包含具有结合FRB的能力的FKBP片段，例如，如SEQ ID NO：115所示。在一些实施方案中，RCAR包含开关结构域，其包含例如如SEQ ID NO：116所示的FRB序列，或例如如SEQ ID No.117-122中任意所示的突变FRB序列。
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(SEQ ID NO:114)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(SEQ ID NO:115)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(SEQ ID NO:116)
表13.对二聚化分子具有增加的亲和性的示例性突变FRB
RNA转染
本文公开了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。RNA CAR及其使用方法描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的段落553-570中，其通过引用整体并入本文。
免疫效应细胞可以包含由信使RNA(mRNA)编码的CAR。在一个方面，将编码本文所述的CAR的mRNA引入例如通过本文所述的方法制备的免疫效应细胞中，用于产生表达CAR的细胞。
在一个实施方案中，可将体外转录的RNA CAR作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。使用合适的引物和RNA聚合酶，来自任何来源的感兴趣DNA可以通过PCR直接转化成用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适当的DNA来源。期望用于体外转录的模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板包含胞外区，该胞外区包含针对本文所述的肿瘤相关抗原的抗体的单链可变结构域；铰链区(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域，如CD8a的跨膜结构域)；以及包括细胞内信号传导结构域(例如本文所述的细胞内信号传导结构域，例如包括CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域)的细胞质区。
在一个实施方案中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。或者，DNA可以是通常在天然存在的生物体中不表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是含有基因的部分的DNA序列，该基因的部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的DNA的部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。
使用PCR产生用于体外转录mRNA的模板，所述mRNA用于转染。进行PCR的方法在本领域是公知的。用于PCR的引物被设计为具有基本上互补于待用作PCR模板的DNA区的区域。如本文所用，“基本上互补”是指引物序列中大部分或全部碱基互补、或一个或多个碱基非互补或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶退火或杂交。引物可以设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以设计引物以扩增通常在细胞中转录的核酸部分(可读框)，包括5'和3'UTR。也可以设计引物以扩增编码感兴趣的特定结构域的核酸部分。在一个实施方案中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可以通过本领域公知的合成方法产生用于PCR的引物。“正向引物”是含有与待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“上游”指相对于编码链而言待扩增DNA序列的5位置。“反向引物”是含有与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指相对于编码链而言待扩增DNA序列的3'位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶可用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。实施方案中的RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度在1至3000个核苷酸之间。可通过不同的方法改变待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度，所述方法包括但不限于设计PCR的引物，其与UTR的不同区域退火。使用该方法，本领域普通技术人员可以修饰在转染转录的RNA之后实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是感兴趣核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。或者，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来添加对于感兴趣核酸不是内源性的UTR序列。对感兴趣的核酸不是内源性的UTR序列的使用可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR以基于本领域公知的UTR的特性来增加转录RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可含有内源性核酸的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源性的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并非所有RNA实现高效翻译都需要。本领域已知对于许多mRNA需要Kozak序列。在其它实施方案中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的核酸外切酶降解。
为了在不需要基因克隆的情况下确保从DNA模板合成RNA，应将转录启动子连接到待转录序列上游的DNA模板上。当将用作RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子就会掺入待转录的可读框上游的PCR产物中。在一个实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方案中，mRNA具有5'端的帽和3'多聚(A)尾，其决定了细胞中核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性。例如，在环状DNA模板上，质粒DNA、RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长的连环产物。在3'UTR端线性化质粒DNA的转录产生正常尺寸的mRNA，其在真核转染中也是无效的，即使其在转录后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以将转录物的3'端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将polyA/T延伸整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可能导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板通常被缺失和其它畸变高度污染的原因。这使得克隆步骤不仅费时费力，而且往往不可靠。这就是为什么允许不用克隆而构建具有polyA/T 3'延伸的DNA模板的方法是非常理想的。
转录DNA模板的polyA/T区段可以在PCR期间中通过使用含有polyT尾的反向引物如100T尾(SEQ ID NO：123)(尺寸可以是50-5000T(SEQ ID NO：32))、或PCR后通过任何其它方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。聚(A)尾还为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚(A)尾是100-5000个腺苷(例如，SEQ ID NO：33)。
使用聚(A)聚合酶(如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可进一步延长RNA的聚(A)尾。在一个实施方案中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加至300至400个核苷酸(SEQ ID NO：34)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的连接可以增加mRNA的稳定性。这样的连接可以含有修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物掺入聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供了稳定性。在一个实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot等人Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA也可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其启动不依赖于帽的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的启动。可以包括任何适合于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和生存力的因子，如可以包括糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法，例如商业上可获得的方法中的任一种将RNA引入靶细胞中，所述方法包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)),(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，MA)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.),Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
非病毒递送方法
在一些方面，可以使用非病毒方法将编码本文所述CAR的核酸递送到细胞或组织或受试者中。
在一些实施方案中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施方案中，转座子是能够将自身插入基因组中的位置的一段DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的DNA片段，或能够从较长的核酸剪接出来并插入基因组中的另一位置的DNA片段。例如，转座子包括由用于转座的侧翼基因的反向重复序列组成的DNA序列。
使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见例如Aronovich等人Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res.15(2008):2961–2971；Huang等人Mol.Ther.16(2008):580–589；Grabundzija等人Mol.Ther.18(2010):1200–1209；Kebriaei等人Blood.122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515–16；Bell等人Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65；和Ding等人Cell.122.3(2005):473-83，其全部通过引用并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其它供体DNA)转座至靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，将转座子(包括转基因)从质粒切出，并将其插入宿主细胞的基因组中。参见例如Aronovich等人上文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见例如Grabundzija等人Nucleic AcidsRes.41.3(2013):1829-47；和Singh等人Cancer Res.68.8(2008):2961–2971，所有这些文献通过引用并入本文。示例性转座酶包括Tc1/海员型转座酶，例如SB10转座酶或SB11转座酶(例如，可从巨细胞病毒启动子表达的高活性转座酶)。参见例如Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献通过引用并入本文。
使用SBTS允许转基因(例如编码本文所述的CAR的核酸)有效整合和表达。本文提供例如使用转座子系统如SBTS产生稳定表达本文所述的CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法。
根据本文所述的方法，在一些实施方案中，将含有SBTS组分的一一个或多个核酸(例如质粒)递送至细胞(例如T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如质粒DNA)递送的标准方法递送核酸，例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂转染。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如编码本文所述的CAR的核酸)的转座子。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述的CAR的核酸)的转座子以及编码转座酶的核酸序列。在其它实施方案中，提供了具有两个核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，并且第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，第一和第二核酸共同递送到宿主细胞中。
在一些实施方案中，通过使用使用SBTS的基因插入和使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化的大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶)的基因编辑的组合产生表达本文所述的CAR的细胞(例如，T或NK细胞)。
在一些实施方案中，使用非病毒递送方法允许重编程细胞(例如T或NK细胞)，并将细胞直接输注至受试者。非病毒载体的优点包括但不限于产生满足患者群所需的足够量的便利性和相对低的成本、存储期间的稳定性和缺乏免疫原性。
制造/生产方法
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在用细胞(例如，如本文所述的免疫效应细胞)处理后施用T细胞除去剂，从而减少(例如，去除)表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)。这种T细胞除去剂可用于有效除去表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)以减轻毒性。在一些实施方案中，根据本文的方法制造表达CAR的细胞，例如根据本文的方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施方案中，在施用细胞(例如本文所述的免疫效应细胞群)之后一周、二周、三周、四周或五周施用T细胞除去剂。
在一个实施方案中，T细胞除去剂是例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡来除去表达CAR的细胞的试剂。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原(例如靶抗原)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如，受体)。此类靶蛋白的实例包括但不限于，EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如，整联蛋白ανβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族的成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/basigin、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7和EGFR，以及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位、但缺少细胞质结构域内的一个或多个区域的形式)。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞共表达CAR和靶蛋白，例如天然表达靶蛋白或被工程化以表达靶蛋白。例如，细胞(例如免疫效应细胞群)可以包括包含CAR核酸(例如，如本文所述的CAR核酸)和编码靶蛋白的核酸的核酸(例如载体)。
在一个实施方案中，T细胞除去剂是CD52抑制剂，例如抗CD52抗体分子，例如阿仑珠单抗。
在其它实施方案中，细胞(例如免疫效应细胞群)表达如本文所述的CAR分子(例如CD19 CAR)和被T细胞除去剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20。在靶蛋白是CD20的实施方案中，T细胞除去剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。
在任何前述方法的进一步实施方案中，所述方法还包括将细胞(例如造血干细胞)或骨髓移植到哺乳动物中。
另一方面，本发明的特征在于在细胞移植之前调理哺乳动物的方法。该方法包括向哺乳动物施用有效量的包含CAR核酸或多肽(例如CD19CAR核酸或多肽)的细胞。在一些实施方案中，细胞移植是干细胞移植，例如造血干细胞移植或骨髓移植。在其它实施方案中，在细胞移植之前调理受试者包括减少受试者中表达靶的细胞(例如表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞)的数量。
免疫效应细胞(例如T细胞)的活化和扩增
通过本文所述的方法产生或富集的免疫效应细胞(如T细胞)可以使用以下中描述的方法活化或扩增，例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
通常，免疫效应细胞的群体(例如除去T调节细胞的细胞)可以通过与连接有刺激CD3/TCR复合体相关的信号的活性剂和刺激T细胞表面上的共刺激性分子的配体的表面接触进行扩增。特别地，可以如本文所述的刺激T细胞群，比如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗-CD2抗体接触，或通过与钙离子载体协同与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗-CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可以如本领域已知的其它常用方法那样使用抗-CD28抗体的实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，可以通过不同的方案提供用于T细胞的初次刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的活性剂可以在溶液中或被偶联至表面。当与表面偶联时，可以把所述活性剂偶联到相同的表面(即，“顺式”形式)或单独的表面(即，“反式”形式)。备选地，可以把一种活性剂偶联到表面，且另一种活性剂可以在溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的活性剂与细胞表面结合，且提供一级活化信号的活性剂在溶液中或被偶联至表面。在某些方面，两种活性剂都可以在溶液中。在一个方面，活性剂可以呈可溶性形式，然后被交联至表面，比如表达将会与该活性剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在这点上，关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)，参见例如美国专利申请公开号:20040101519和20060034810，考虑其在本发明中用于活化和扩增T细胞。
在一个方面，把两种活性剂都固定在珠上，在相同的珠上，即“顺式”，或在不同的珠上，即“反式”。例如，提供一级活化信号的活性剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的活性剂是抗-CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种活性剂以等同的分子数量被共同固定在相同珠上。在一个方面，使用与所述珠结合的每种抗体的1:1的比率，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与所述珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特别的方面，与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个方面，与所述珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100及其中所有整数值。在一个方面，与粒子结合的抗-CD28抗体比抗CD3抗体多，即CD3:CD28的比率小于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特别的方面，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个进一步的方面，使用1:50的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:10的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用的与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在还有一个方面中，使用3:1的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。
可以使用1:500至500:1及其间任何整数值的粒子与细胞的比率来刺激T细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样，粒子与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒子尺寸。例如，小尺寸珠可能仅结合少数细胞，而较大珠可结合许多细胞。在某些方面，细胞与粒子的比率范围为1:100至100:1及其中任何整数值，并且在进一步的方面，也可以使用包括1:9至9:1的及其中任何整数值的比率来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗-CD3-和抗-CD28偶联的粒子与T细胞的比率可以如上所述变化，然而某些合适值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个合适的比率为至少1:1的粒子/T细胞。在一个方面，使用1:1或更小的粒子与细胞的比率。在一个特别的方面，合适的粒子:细胞比率为1:5。在进一步的方面，粒子与细胞的比率可以根据刺激的天数变化。例如，在一个方面，在第一天，粒子与细胞的比率为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中加入另外的粒子，直到10天，最终比率为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特别的方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为1:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:5。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:5。在一个特别的方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为2:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:10。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员应当理解多种其它比率都可以适用于本发明。特别地，比率将根据粒径及细胞尺寸和类型而变化。在一个方面，在第一天，最典型的使用比率为约1:1、2:1和3:1左右。
在进一步的方面，将细胞比如T细胞与活性剂包被的珠混合，接着分离珠和细胞，然后培养细胞。在备选的方面，在培养之前，活性剂-包被的珠和细胞没有分离，而是一起培养。在一个进一步的方面，首先通过施加力(比如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过允许附着了抗-CD3和抗-CD28的顺磁性的珠(3x28珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如，比率1:1的M-CD3/CD28T顺磁性的珠)在缓冲液中混合，缓冲液例如为PBS(不含二价阳离子，比如钙和镁)。此外，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，样品中靶细胞可能非常少，且仅占样品的0.01％，或全部样品(即，100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文之内。在某些方面，可能期望显著减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和粒子的最大接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、8 0亿n/ml、70亿/ml、60亿/ml、5 0亿/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0千万个细胞/ml的浓度。在仍然一个方面，使用从7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些方面将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，通过例如本文所述的方法扩增用编码CAR,例如，本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，将细胞在培养中扩增几个小时(例如，约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，18，21小时)到约14天(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14天)。在一个实施方案中，细胞被扩增4至9天。在一个实施方案中，细胞被扩增8天或更短，例如，7,6或5天。在一个实施方案中，所述细胞在培养中扩增5天，所得细胞比相同的培养条件下培养扩增9天的相同的细胞更有效。效力可以通过例如，由不同的T细胞的功能，例如增殖，靶细胞杀伤，细胞因子的产生，活化，迁移，或它们的组合来定义。在一个实施方案中，相比于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，扩增了5天的细胞，例如，本文所述的CD19 CAR细胞显示细胞倍增的至少1、2、3或4倍增加。在一个实施方案中，所述细胞，例如，表达本文所述的CD19 CAR的细胞培养扩增了5天，并且相比于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，所得的细胞显示出更高的促炎细胞因子产生，例如，IFN-γ和/或GM-CSF的水平。在一个实施方案中，相比于在相同培养条件下扩增9天的相同细胞，扩增了5天的细胞，例如，本文所述的CD19 CAR细胞显示出促炎细胞因子产生，例如，IFN-γ和/或GM-CSF的水平以pg/ml计至少1、2、3、4、5、10倍或更多倍的增加。
也可能需要几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以为60天或以上。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如,极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15,(Lonza))，其可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素-1(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括，但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂比如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、OptimizeR,具有加入的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适合量的血清(或血浆)或定义的激素组、和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不在输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞保持在载体生长必需的条件下，例如适合的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在合适的培养基(如，本文中所描述的培养基)中扩增，所述培养基包括导致细胞在14天的扩增期间增加至少200倍(例如，200倍，250倍，300倍，350倍)的一种或多种白介素，例如，如通过本文所述的方法如流式细胞术测定。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩增。
在实施方案中，本文描述的方法，例如，CAR表达细胞的制造方法，包括例如，用抗CD25抗体或其片段，或CD25-结合配体IL-2从细胞群体除去调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。从细胞群体除去调节性T细胞，例如，CD25+T细胞的方法在本文中描述。在实施方案中，这些方法，例如，制造方法，进一步包括将细胞群(例如，其中调节性T细胞，例如CD25+T细胞已耗尽的细胞群；或已预先接触抗CD25抗体，或其片段，或CD25-结合配体的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，细胞群(例如，已经预先接触抗CD25抗体，其片段，或CD25-结合配体的细胞群)在IL-15和/或IL-7的存在下扩增。
在一些实施方案中，在制造CAR表达细胞期间，本文所述的CAR表达细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽，白介素15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽例如,hetIL-15的组合的组合物离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽的组合物在制造CAR表达细胞期间例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合的组合物在制造CAR表达细胞期间，例如，离体接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞与包含hetIL-15的组合物在制造CAR表达细胞期间，例如，离体接触。
在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞与包含hetIL-15的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文描述的CAR表达细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，接触导致淋巴细胞亚群例如，CD8+T细胞的存活和增殖。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术成分术外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制T细胞群(TC,CD8+)的辅助T细胞群(TH,CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体的离体T细胞扩增产生T细胞群，该细胞群在约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包括越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，向受试者输注主要包括TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则使该亚组在更大程度上扩增可能是有益的。
进一步，除了CD4和CD8标志之外，其它表型标志显著变化，但大部分在细胞扩增过程中可再重现。因此，这样的可重现性使能够针对特定目的裁剪活化的T细胞产物。
一旦构建本文所述的CAR,则可以使用多种试验来评价分子的活性，比如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在不存在再刺激下维持T细胞扩增和在适合的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价本发明CAR的效应的试验在下文进一步详细描述。
可以使用原代T细胞中CAR表达的Western印迹分析来检测单体和二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第695段所述，其通过引用整体并入本文。
可以通过流式细胞测量术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如，用αCD3/αCD28aAPC刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，接着在要被分析的启动子的控制下用表达GFP的慢病毒载体转导。示例性的启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在第6天，通过流式细胞测量术测量CD4+和/或CD8+T细胞亚组中培养物的GFP荧光。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，在第0天，用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，并在第1天使用表达CAR的双顺反子慢病毒载体用CAR转导以及使用2A核醣体跳跃序列用eGFP转导。在抗-CD3和抗-CD28抗体(K562-BBL-3/28)的存在下，用本文所述的癌症相关抗原+K562细胞(如本文所述的表达K562的癌症相关抗原),野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激培养物，之后洗涤。每隔一天，向培养物中加入100IU/ml的外源性IL-2。通过流式细胞术，使用基于珠的计数对GFP+T细胞计数。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在不存在再刺激下保持的CAR+T细胞扩增。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用指定的CAR转导，在培养的第8天，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量CAR表达细胞活性，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第698段所述，其通过引用全部并入本文。
可以评估剂量依赖性CAR治疗应答，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第699段所述，其全部内容通过引用并入本文。
之前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第700段所述，其全部内容通过引用并入本文。
细胞毒性可以通过标准的51Cr释放测定来评估，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第701段所述，其全部内容通过引用并入本文。
还可以通过测量粘附细胞电阻抗的变化来评估细胞毒性，例如使用xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)。在一些实施方案中，在多个时间点测量细胞毒性。
成像技术可用于评估荷瘤动物模型中CAR的特异性运输和增殖，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的段落702所述，其全部内容通过引用并入本文。
其他测定法，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些也可用于评估本文所述的CAR。
备选地或与本文公开的方法组合，公开了用于以下一种或多种的方法和组合物:检测和/或定量CAR表达细胞(例如体外或体内(例如临床监测))；免疫细胞扩增和/或活化；和/或CAR特异性选择，其涉及使用CAR配体。在一个示例性实施方案中，CAR配体是结合CAR分子，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域的抗体(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或结合细胞外结合结构域的恒定区的抗体)。在其它实施方案中，CAR配体是CAR抗原分子(例如本文所述的CAR抗原分子)。
一方面，公开了一种用于检测和/或定量CAR表达细胞的方法。例如，CAR配体可用于在体外或体内检测和/或定量CAR表达细胞(例如，临床监测患者中CAR表达细胞或对患者给药)。该方法包括:
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包括标签，珠，放射性或荧光标记的CAR配体)；
获取CAR表达细胞(例如，获取含有CAR表达细胞的样品，例如制造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使CAR表达细胞与CAR配体接触，从而检测存在的CAR表达细胞的水平(例如，量)。CAR表达细胞与CAR配体的结合可以使用标准技术如FACS，ELISA等检测。
另一方面，公开了扩增和/或激活细胞(例如免疫效应细胞)的方法。该方法包括:
提供CAR表达细胞(例如，第一CAR表达细胞或瞬时表达CAR细胞)；
在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下使所述CAR表达细胞与CAR配体例如本文所述的CAR配体接触，从而产生活化和/或扩增的细胞群体。
在某些实施方案中，CAR配体存在于基质(例如，固定化或附着到基质，例如非天然存在的基质)上。在一些实施方案中，基质是非细胞基质。非细胞基质可以是选自例如板(例如，微量滴定板)，膜(例如硝酸纤维素膜)，基质，芯片或珠粒的固相支持体。在实施方案中，CAR配体存在于基质中(例如，在基质表面上)。CAR配体可以固定，连接或共价或非共价结合(例如交联)至基质。在一个实施方案中，将CAR配体连接(例如共价连接)到珠粒上。在上述实施方案中，免疫细胞群可以在体外或离体扩增。该方法还可以包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞群体，例如使用本文所述的任何方法。
在其它实施方案中，扩增和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分子例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可固定在基质例如一个或多个珠粒上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。
另一方面，提供了一种用于选择或富集CAR表达细胞的方法。该方法包括使CAR表达细胞与本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体的结合选择细胞。
在其它实施方案中，提供了用于消耗，减少和/或杀死CAR表达细胞的方法。该方法包括使CAR表达细胞与本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少CAR表达细胞的数量和/或杀死CAR表达细胞。在一个实施方案中，CAR配体与毒性剂(例如毒素或细胞消融性药物)偶联。在另一个实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可以在本文公开的方法中使用的示例性抗CAR抗体描述于例如WO2014/190273和Jena et al.,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody toDetect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”,PLOS March 2013 8:3e57838,，其内容通过引用并入。
在一些方面和实施方案中，本文的组合物和方法针对T细胞的特定子集进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号PCT/US2015/043219中所述，其内容通过引用全部并入本文。在一些实施方案中，与对照T细胞(例如表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，T细胞的优化子集显示增强的持续性。
在一些实施方案中，CD4+T细胞包含本文所述的CAR,所述CAR包含适于CD4+T细胞(例如，优化，例如导致增强的持久性)的细胞内信号传导结构域，例如ICOS结构域。在一些实施方案中，CD8+T细胞包含本文所述的CAR,所述CAR包含适于CD8+T细胞(例如，优化，例如导致增强的持久性)的细胞内信号传导结构域，例如4-1BB结构域，CD28结构域或ICOS结构域以外的另一共刺激结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
在一方面，本文描述了治疗受试者，例如患有癌症的受试者的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的:
1)包含CAR(CARCD4+)的CD4+T细胞
其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域和
细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS结构域；和
2)包含CAR(CARCD8+)的CD8+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB结构域，CD28结构域或除ICOS结构域之外的另一共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，所述方法还包括施用:
3)包含CAR(第二CARCD8+)的第二CD8+T细胞，其包含:
抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域和
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含不存在于CARCD8+上的细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种表达CAR的细胞可以通过生物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以天然存在或合成的生物相容性(例如，基本上不诱导炎症或免疫应答)和/或可生物降解的聚合物。示例性的生物聚合物描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的段落1004-1006中，其通过引用整体并入本文。
药物组合物和治疗
在一些方面，本公开提供了治疗患者的方法，其包括施用如本文所述产生的表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其它治疗组合。在一些方面，本公开提供了治疗患者的方法，其包括施用包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物，任选地与一种或多种其它治疗组合。在一些方面，本公开提供了运送或接收包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物的方法。在一些方面，本公开提供了治疗患者的方法，其包括接收如本文所述产生的表达CAR的细胞，并且进一步包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其它治疗组合。在一些方面，本公开提供了治疗患者的方法，其包括产生如本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步包括将表达CAR的细胞施用于患者，任选地与一种或多种其它治疗组合。其他治疗可以是例如癌症治疗，如化疗。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与减少Treg细胞群的分子组合施用于受试者。减少(例如除去)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25去除、环磷酰胺施用、调节GITR功能。不希望受理论束缚，认为在单采血液成分术之前或在施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞的数量，减少了在肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如Treg)的数量并降低了受试者复发的风险。
在一个实施方案中，将本文所述的治疗(例如表达CAR的细胞)与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子(如除去调节性T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体)组合施用于受试者。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一个实施方案中，在表达CAR的细胞之前施用GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或Treg除去GITR抗体)。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在实施方案中，在施用(例如，注入或再注入)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前，向受试者施用环磷酰胺。在实施方案中，在施用(例如，注入或再注入)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前，向受试者施用环磷酰胺和抗GITR抗体。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液癌症如ALL或CLL)。在一个实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有ALL。在实施方案中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌。示例性的GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，如美国专利号:6,111,090、欧洲专利号:090505B1、美国专利号:8,586,023、PCT公开号:WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白和抗GITR抗体，或例如美国专利号:7,025,962、欧洲专利号:1947183B1、美国专利号:7,812,135、美国专利号:8,388,967、美国专利号:8,591,886、欧洲专利号:EP 1866339、PCT公开号:WO 2011/028683、PCT公开号:WO 2013/039954、PCT公开号:WO2005/007190、PCT公开号:WO 2007/133822、PCT公开号:WO2005/055808、PCT公开号:WO 99/40196、PCT公开号:WO2001/03720、PCT公开号:WO99/20758、PCT公开号:WO2006/083289、PCT公开号:WO 2005/115451、美国专利号:7,618,632和PCT公开号:WO 2011/051726中所述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如本文所述的GITR激动剂)组合施用于受试者。在一个实施方案中，GITR激动剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
本文所述的方法可以进一步包括在药物组合物中配制表达CAR的细胞。药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如本文所述的多种表达CAR的细胞)与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。可以配制组合物，例如用于静脉内施用。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如没有)可检测水平的污染物，所述污染物例如选自内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠子、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，所述细菌选自粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、白假丝酵母(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和化脓链球菌组A(Streptococcus pyogenes group A)中的至少一种。
当指出“免疫有效量”、“抗癌有效量”、“抑癌有效量”或“治疗量”时，可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者(受试者)状态的个体差异确定待施用组合物的精确量。通常可以说包含本文所述的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量施用，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以在这些剂量下多次施用。可以通过使用在免疫治疗中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含约1x 106、1.1x 106、2x106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含至少约1x 106、1.1x 106、2x106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含多至约1x 106、1.1x 106、2x106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含约1.1x 106–1.8x 107个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含约1x107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含至少约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x109或5x 109个细胞。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如CD19 CAR细胞)包含多至约1x107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。
在某些方面，可能期望向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)，然后再重新抽血(或进行单采血液成分术)，从而活化免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)，并将这些活化和扩增的免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)再注入患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)可以从10cc至400cc的抽出血液中活化。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽出血液中活化免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)。
可以以任何方便的方式进行主题组合物的施用。本文描述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内，例如通过皮内或皮下注射施用给患者。免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位内。
实施例
通过参考以下实验的实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并非旨在限制，除非另有说明。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
实施例1：鉴定与制造成功和产物质量相关的起始单采血液成分术材料的性质
单核细胞已被鉴定为对CART制造和终产物质量有负面影响的细胞亚型。单核细胞可以通过作为抑制因子的来源、非特异性结合/吞噬包被抗-CD3/CD28抗体的珠子而负面影响T细胞活化和转导，并且通过充当病毒基因载体的吸收池来降低基因转导效率(Powell等人2009)。解冻后，患者白细胞去除术材料中单独或在存在于母细胞时单核细胞的存在，使累积群倍增(cPDL)从没有显著单核细胞存在(<20％WBC)的批次的平均值5.5减少到平均cPDL为2.7(单核细胞>WBC的20％)。cPDL<4.5的任何批次被归类为“次优”，因为不能达到预定剂量(转导的T细胞数量)、损害了转导效率(<2％)和/或无法测量的效力(<5x背景)。相当大比例的制造批次(33％)呈现制造挑战。
当对含有大量单核细胞或B细胞母细胞的解冻白细胞样品(leukopak sample)进行目前标准的CART细胞制造方案(方法B)时，下面显示了几个不良结果的例子。由于总白细胞接种数是固定的，具有相对高百分比的单核细胞或CD19+B细胞母细胞的患者批次的直接后果意味着在第0天可以接种较少数量的T细胞。
另外，样品中如此高百分比的单核细胞或B细胞母细胞随后被珠子刺激、在培养中经过几天的慢病毒转导和扩增，起到损害T细胞活化和扩增潜能的作用。很可能，由于非T细胞发生凋亡和细胞死亡，细胞培养基受到细胞碎片的损害和毒化，较不能够支持健康T细胞的选择性扩增。
下表5中显示的结果表明当将含有高水平单核细胞和B细胞的解冻单采血液成分术材料置于当前标准的CAR T细胞制造方案(方法B)中时，产生的问题。例如，解冻后白细胞样品患者F1含有47.1％的CD14+单核细胞。该样品经历次优的细胞生长，在第11天收获时不符合规格(OOS)。
表5.含有高量单核细胞或CD19+B母细胞的患者单采血液成分术材料的实例及其对细胞扩增和功能的影响
白细胞(leukopak)样品患者P1以55.5％的母细胞(CD19+白血病细胞)开始，并显示次优的细胞生长和T细胞回收率，不能满足目前临床使用的剂量要求。
实施例2：淘析方法的比较
作为修改的淘析程序的一个例子，已证明下表6中列出的淘析设置能够将淋巴细胞从单核细胞中分离出来。简而言之，将冷冻的单采血液成分术材料解冻，用PBS稀释，然后连接到淘析装置，其中已经连接所有需要的淘析介质。启动该系统，随后将细胞引入室中。同时，还将淘析介质引入室中以提供逆流并实现细胞类型分离。通常级分3(F3)或级分3和级分4(F3+F4)的组合含有具有最少量的单核细胞、粒细胞和其它非淋巴细胞的靶淋巴细胞群。
表6：样品淘析设置
针对各自处理含有高量单核细胞的单采血液成分术材料的能力在当前标准的Ficoll方法(方法B)和修改的淘析程序(Elutriation)之间进行了头对头的比较。解冻后，将来自5个不同正常供体的白细胞(leukopak)样品分成两半，一组使用标准方法(方法B)处理，另一组使用修改的淘析处理。所得结果显示在表7中。
表7：通过当前的方法B中的Ficoll步骤或通过修改的淘析程序处理健康供体单采血液成分术材料的选定实施例。
上表7中显示的结果清楚地显示了新的Elutra方法在开始后续制造步骤之前在第0天从细胞样品中移除单核细胞的效力。例如，发现供体4841在解冻的单采血液成分术样品中含有24％单核细胞。用标准(方法B)方案处理一半样品后，第0天细胞含有44％单核细胞。如此高量的非T细胞负面影响在制造过程结束时收获的细胞中的T细胞产率(只有38％的收获细胞是T细胞)。相反，如本发明公开的内容所述，使用修改的Elutra方法制造的一半样品在第0天仅显示2％的单核细胞“污染”，其中在制造结束时T细胞产率和回收率大幅改进(收获细胞的91％是T细胞)。如下表8所示，在处理弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的白细胞去除术材料中也证实了该分离效率，发现含有高百分比的单核细胞。
表8：解冻的先前冷冻保存的DLBCL患者白细胞去除术材料的淘析
实施例3：修改的洗涤步骤降低稳定细胞并减少聚集
在当前的制造方法B中，患者细胞白细胞去除术材料在Plasmatherm(Genesis)上解冻，使用CellSaver 5+仪器(Haemonetics)洗涤，然后重悬于基于X-VIVO15介质(Lonza)的细胞扩增培养基(称为“改良培养基”(MM))中，或重悬于缓冲的等渗盐水溶液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，用于后续淋巴细胞Ficoll选择。根据下表9中提供的组分制备改良培养基。
表9改良培养基的组分
将解冻的细胞转移到改良培养基或PBS溶液中可引起细胞聚集。为了减轻细胞聚集，研究了替代的细胞重悬缓冲液。发现具有5％右旋糖和0.45％氯化钠的水溶液(本文可互换地称为右旋糖/NaCl，'D5'或D5 1/2NS)稳定细胞悬液并防止聚集。悬浮在D5中的细胞是稳定的，并且在室温下保持至少2小时不聚集。D5溶液也与后续的制造步骤(包括通过用抗CD3/CD28 CTS Dynabead(Thermo Fisher)刺激的T细胞的阳性选择)相容。
使用Sepax 2RM装置(Biosafe)洗涤解冻的白细胞(leukopak cells)以除去亚细胞碎片，游离血红蛋白和冷冻保护剂，以实现体积减小，并确保随后的Ficoll密度梯度分离。为了减少单核细胞污染，同时也防止细胞聚集，使用D5培养基而不是改良培养基进行Sepax 2SmartWash方案。图15A和15B显示2小时后在改良培养基中记录的细胞大量聚集的照片(图15A)，而在D5溶液中保持相同时间长度的细胞显示很少或没有聚集(图15B)。
提供了关于如何进行涉及Sepax SmartWash D5水性溶液的修改过程的其它技术细节。操作员在生物安全柜(BSC)内打开Sepax一次性使用的细胞处理套件，并将解冻的白细胞去除术细胞袋和介质袋连接到一次性套件。该套件安装在Sepax 2装置上，选择SmartWash步骤，输出体积为115mL。SmartWash离心步骤使细胞沉淀，然后用D5溶液重悬至最终体积115mL。
下面给出使用D5溶液的修改的制造过程的逐步细节：
步骤1.将白细胞(Leukopak)解冻并与5％右旋糖和0.45％氯化钠的水性溶液(7-10体积的溶液比1体积的白细胞)混合。
步骤2.使细胞在环境温度下平衡30分钟。
第3步.使用D5溶液中的SmartWash程序，使用Sepax 2细胞洗涤移除Cryomedia和碎片。
步骤4.细胞重悬在水性D5溶液中。
步骤5.在水性D5溶液中、而不是使用改良培养基进行T细胞的阳性选择。
步骤6.当D5溶液中的阳性选择完成时，移除阴性级分(非T细胞)，并将阳性级分(T细胞)重悬在改良培养基中以用于后续的细胞扩增步骤。
使用D5水溶液制备用于CAR T细胞制造的解冻的单采血液成分术细胞的该修订方案可以直接在Sepax装置上进行，并且不需要使用CellSaver 5Plus(CS5+)仪器(Haemonetics)洗涤细胞。下面的图16A显示的结果证实与CS5+洗涤相比，Sepax SmartWash步骤提供更好的细胞产率。
如上所述，D5(5％右旋糖和0.45％氯化钠)水性溶液的使用起到防止不想要的解冻单采血液成分术细胞材料的聚集的作用，特别是当存在高百分比的粒细胞(例如嗜中性粒细胞)时。上面的图16A显示的结果表明Sepax SmartWash方案优于CS5+洗涤，即使两种方案都使用D5水溶液进行。
下面的图16B证实，与使用改良培养基代替D5时看到的细胞损失接近50％相比，使用D5水性溶液防止CS5+细胞洗涤和2小时环境温度温育后的细胞损失。
实施例4：密度梯度离心的比较
在这个实施例中，对使用冷冻保存然后解冻的正常供体单采血液成分术材料的5轮头对头比较进行比较，以确定包括OptiPrep密度梯度介质纯化的简化过程是否代表技术进步。操作员进行了Sepax 2NeatCell方案，其中要求Ficoll的方案，被替换为OptiPrep。图18显示了Sepax 2NeatCell单次使用的一次性管套件(Biosafe CS900.2)如何与细胞袋和介质袋装配的示意图。
在Plasmatherm解冻后，根据方法B方案(CS5+洗涤、Sepax2体积减少和Ficoll梯度纯化)处理每个正常供体来源的白细胞样品的一半。使用我们开发的Sepax和OptiPrep方法处理每个解冻白细胞样品的另一半。然后对通过2种不同方法纯化的细胞材料分别进行CART细胞制造过程中相同的后续步骤(抗CD3/CD28珠子刺激、LV转导、载体清洗和细胞扩增)。在第9天收集细胞产物，并使用细胞表面标记物特异性抗体(抗CD3、抗CD19、抗CD14)进行流式细胞术以定量相对细胞表型和亚组组成。附加/插入的Excel文件“Sepax和OptiPrep数据表格”包括这些分析的完整数据文件，总结果汇总于下表10中。
表10.比较使用方法B(Ficoll)或'Sepax和OptiPrep'方法制备的解冻的正常供体单采血液成分术材料的产物概况的结果汇总
这些分析的结果表明，用新的Sepax和OptiPrep方法制备的产物含有显著更绝对的CD3+T细胞(8.25x10e8vs.2.29x10e8)、改进的CD+细胞产率(46％vs.15％)、更少的CD19+B细胞(10％vs.41％)和更少的CD14+单核细胞(16％vs.34％)。另外，由Sepax和OptiPrep方法产生的终产物比方法B制备的产物中含有的CD3+T细胞的量(30.85％)多出一倍以上(66.02％)。这些数据以图形显示在图19A、19B、19C、19D和19E中。
实施例5：阳性选择方法的比较
进行了三次实验，比较了使用FAST与当前的阳性选择方案(方法B)。这些实验的结果显示通过优化的FAST方案的可靠的T细胞富集，其中产物T细胞纯度高于90％，与输入组合物无关。结果还表明通过FAST方法对非T细胞群(包括单核细胞、B细胞和母(Nalm6)细胞)的非常有效的去除。
FAST阳性选择作为母细胞百分比超过20％的样品的应急方案在患者中应用。迄今为止，三批次采用FAST处理。所有三个批次均成功扩增以满足剂量要求，其生长曲线与方法B批次的生长曲线相当或比其优越。图22提供临床FAST批次(白色)的生长曲线的图概述，将其与方法B(黑色)的生长曲线进行比较。值得注意的是，与方法B相比，FAST批次提供了可比较的或优越的扩增，在第0天和第3天之间具有减少的细胞损失。在起始材料中所有临床FAST批次具有>70％的母细胞。
实验1：
实验1的细节：首先在实验FAST006中测试使用FAST阳性选择代替当前的阳性选择方法。该实验由两个实验组组成(图23A)，其共享CS5+洗涤步骤。实验组1遵循方法B，使用CS5+洗涤，接着进行Sepax 2-Ficoll富集，但用FAST代替阳性选择。实验组2测试了另一种方法，其中省略了Sepax 2-Ficoll富集并且进行直接的FAST阳性选择。如图23A顶部部分的示意图所示，分配到实验组1(3×10e9总细胞)的总细胞是分配到实验组2(1×10e9总细胞)的三倍。
实验1的结果：在实验组1和2中，优化的FAST阳性选择产生高的终产物T细胞纯度(第1组为94％，第2组为90％)，其中所有非T细胞群均高度去除。在实验组1(图23B)中，在Sepax2-Ficoll之后回收的CD45+/CD3+T细胞的百分比降至41％(从原始供体材料中的51％)，但T细胞纯度(94％)在FAST阳性选择后重建。尽管输入细胞数量低三倍，但实验组2(图23C)在终产物中产生最大数量的T细胞(约3倍多的T细胞)，最终纯度为90％。
实验1的总结：本实验取得了概念验证的结果，证明用修改的FAST方案取代当前的阳性选择模式是合理的。在两个实验组中，FAST方案后的最终T细胞纯度均为90％或更高。确定了跳过Sepax 2-Ficoll富集步骤的选项，但需要进一步验证。
实验2：
实验2的细节：在本实验中，使用包含高百分比的单核细胞的供体单采血液成分术重复进行使用FAST阳性选择代替当前的阳性选择方法。实验由两个实验组组成(参见顶部示意图)。实验组1遵循方法B，使用CS5+洗涤，接着进行Sepax 2-Ficoll富集，但用FAST代替阳性选择。实验组2测试了另一种方法，其中CS5洗涤步骤之后立即进行FAST阳性选择。每组使用冷冻白细胞(LKPK)的四分之一。
实验2的结果：在实验组1和2中，优化的FAST阳性选择产生了高的终产物T细胞纯度(第1组中95％，第2组中92％)，具有所有非T细胞群的可靠地高去除。在实验组1(图24A的左侧)中，在Sepax 2-Ficoll步骤后CD45+/CD3+T细胞的百分比从原始供体材料中的56％下降到38％，单核细胞百分比为28％，而B细胞构成总样品的18％。在FAST选择后，几乎所有单核细胞和B细胞被除去，这实现了95％的最终T细胞纯度(图24B)。在实验组2(图24A的右侧)中，使用FAST直接纯化CS5+洗涤后的物质，其产生几乎完全除去单核细胞的终产物，其中最终T细胞纯度为92％。同样在该实验中，实施修改的方案，其中省略了Sepax 2-Ficoll富集，终产物中产生最高的T细胞数。将来自实验该阶段的细胞放回培养物并转导。波浪扩增后第10天收获细胞。
实验2的总结：重复使用FAST阳性选择作为当前阳性选择方案的替代。无论是在CS5+洗涤后还是在Sepax2-Ficoll之后使用，该优化的方案实现了非T细胞群的高度移除，移除了样品中几乎所有的单核细胞，并产生了具有高T细胞纯度的中间产物。分析和报告培养物中FAST分离的细胞的性能，包括转导。
实验3：
实验3的细节：在该实验中，用高单核细胞供体分析使用FAST阳性选择进一步纯化淘析后的样品。另外，通过将Nalm6细胞(CD45-/CD19+)掺入到淘析后样品中，模拟在处理患有肿瘤的患者单采血液成分术样品时经常观察到的高B细胞母细胞状态。
实验3的结果：如图25A所示，淘析含有20％T细胞和43％单核细胞的正常供体单采血液成分术材料，以将样品中单核细胞百分比降低至26％，并使T细胞百分比富集至32％。此时，掺入(spike in)与T细胞和单核细胞相当数量的Nalm6细胞，产生含有29％T细胞、20％单核细胞和24％母细胞(Nalm6)的样品。使用FAST阳性选择处理该有意掺杂的样品产生了除去几乎全部单核细胞和Nalm6细胞的终产物，其中最终T细胞纯度为95％。
实验3的总结：可以在淘析后实施FAST阳性选择，并且在该实验中显示能够高度可靠地去除单核细胞和母(Nalm6)细胞。对该困难样品进行FAST选择后的最终T细胞纯度从淘析后29％的T细胞纯度变为95％。
结论
在一系列实验中提出了FAST阳性选择，并显示在一系列输入样品材料中提供可靠的T细胞富集。使用从1E8到2E9细胞的总细胞数量、从20％到50％的输入T细胞纯度、从2％到30％的输入单核细胞百分比和从2％到100％的输入母细胞\Nalm6级分测试该方法。在迄今为止测试的所有情况下，FAST产生T细胞纯度为90％或更高的终产物。概述了一个替代策略，其中移除了Sepax Ficoll富集步骤以在CS5之后立即进行FAST阳性选择，该替代策略也显示提供高纯度产物和终产物中最高数量的T细胞方面的潜力。
实施例6：通过阴性选择去除CD19+B细胞
测试了从单采血液成分术样品中去除CD19的可行性。使用来自健康供体和患有ALL的患者的单采血液成分术样品。洗涤单采血液成分术样品，然后使用CliniMAC进行CD19阴性选择。图26A显示了CD19去除的结果。这些结果表明，使用CliniMAC的CD19去除证实能够从健康供体单采血液成分术中移除B细胞。此外，使用CliniMAC的CD19去除能够从ALL患者的单采血液成分术中移除B细胞，其中单采血液成分术样品具有非常高的母细胞％。具体而言，ALL患者单采血液成分术样品中的B细胞从77％大幅减少至<0.1％。
接下来，使用包括CD19去除步骤的方案测试T细胞富集的功效。包括CD19去除阴性选择步骤的富集方案与不包括阴性选择步骤(而是包括阳性选择步骤)的富集方案进行比较。名称为TR149的方案包括洗涤步骤、使用Ficoll和Sepax2装置的密度梯度离心以及使用CD3/CD28 Dynabead的阳性选择步骤(也称为方法B)。名称为TR150的方案包括淘析、洗涤步骤和使用CliniMAC的CD19去除步骤(例如，阴性选择)。名称为TR151的方案包括淘析、洗涤步骤和使用CD3/CD28 Dynabead的阳性选择步骤。
图26B显示了例如在进行富集方案之前，以及在由富集方案产生的样品(本文称为“接种细胞”)中，在单采血液成分术中的T细胞、B细胞和单核细胞的百分比。
使用CliniMAC(TR150)通过阴性选择去除CD19将接种细胞中的B细胞(从单采血液成分术样品中的17.7％)消除至0％。与不包括B细胞去除步骤的其它方案相比，从单采血液成分术样品中去除B细胞导致T细胞富集的改进(例如，对于TR150，接种细胞中80％T细胞，与之相比，对于TR149和TR151，接种细胞中20-30％T细胞)。另外，与先前研究的结果一致，淘析步骤(例如，在TR150和TR151中)将单核细胞百分比从单采血液成分术样品中的15％降低至接种细胞中<1.5％，同时仍保持良好的T细胞回收率。
总之，这些结果表明，在使用富集方案后，CD19去除能够将B细胞百分比降低至<1％，并导致高的T细胞产率(>80％)。
实施例7：效力测定法
使用两种测定法来评估在不同富集方案后富集的表达CAR的免疫效应细胞的效力，以确定不同富集条件是否产生具有不同CAR定向效力的免疫效应细胞。如表11所示，对来自两个不同供体的单采血液成分术进行不同的富集方案。然后刺激细胞并转导以表达CD19 CAR。
表11：样品和富集条件的总结
IFNγ释放测定法
在作为靶细胞的表达CD19的细胞(表达CD19的K562细胞)、作为阴性对照的表达间皮素的细胞(表达间皮素的K562细胞)或作为阳性对照的PMA存在下共培养细胞。24小时后，收获共培养物上清液，并通过ELISA定量IFNγ水平。将IFNγ释放定量为pg/转导的细胞以校正转导效率的变化。
结果显示，CD19刺激导致IFNγ释放，如图29A所示，其中IFNγ释放水平在当使用标准方案(例如方法B)富集细胞时观察到的IFNγ释放的范围内。如预期的，所有样品响应PMA并在PMA刺激后释放IFNγ(图29B)。由淘析产生的转导细胞产生最高水平的IFNγ。在间皮素刺激后样品表现出最小的响应和IFNγ释放(图29C)。
细胞毒性分析
通过在范围从1：10，000到10：1的不同效应细胞：靶细胞的比例下共表达表达萤光素酶的CD19细胞(NALM6，靶细胞)和表达CAR的细胞(效应细胞)，测试从表11中所述的富集条件产生的表达CAR的细胞的细胞毒性。24小时后，在读板器上测量发光(相对光单位，RLU)。特异性裂解(SpLy)计算为：100-(样品RLU/maxRLU)*100。使用％CAR+细胞(如通过流式细胞术测量)将铺板的效应细胞：靶细胞比例重新计算为CTL效应细胞：靶细胞比例，以校正转导率的变化。
如图30A和30B所示，所有样品均达到完全S形杀伤曲线，表明实现了特异性杀伤。具有增加的杀伤效力的细胞在图上具有更靠左的曲线。细胞毒性测定法的结果也报道为EC50的倒数值。从CTL E：T和％特异性裂解曲线的四参数逻辑拟合计算EC 50。图中的红色虚线表示30位健康供体的中值水平。如图30C所示，所有样品具有良好的EC50rec，约为或高于中值水平。最高的EC50rec来自淘析的样品。
实施例8：流通装置
提供以下实施例仅用于说明目的，并不旨在涵盖整个发明。该实施例的各方面可以与本文描述的本发明的其它方面组合。
在该实施例中，T细胞在培养中经过9天的时间扩增，然后收获并根据先前的步骤使用非流通脱珠过程或根据本公开的流通脱珠过程进行脱珠。样品具有约1e8个有核活细胞至约3e10个有核活细胞之间的有核活细胞。顺磁性颗粒与有核活细胞的比例在约3：1至1：3之间，其中具有较低的总有核活细胞的样品表现出较高的顺磁性颗粒与有核活细胞的比例。顺磁性颗粒与细胞的比例是细胞回收率的重要因素。较高的顺磁性颗粒与有核活细胞的比例增加了有核活细胞与顺磁性颗粒结合的机会并在顺磁性颗粒除去过程中丢失。
在非流通脱珠过程中，将样品收集在1升血小板袋(Terumo Medical Corp.，Somerset，NJ)中，并且静置在零度的平板床磁板(DYNAMAGTM CTSTM，Thermo FisherScientific，Waltham,MA)顶部5分钟，然后在30度倾斜下静置1分钟。接下来，将包含非磁性级分的袋中的液体从袋中转移出来以形成终产物。磁性级分作为废物留在袋内。
在流通脱珠过程中，样品持续流过放置在平板床磁板(DYNAMAGTM CTSTM，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)上的CSD400Y9CRYOSTORETM锥形袋(OriGen Biomedical，Austin，TX)。由于持续流过袋并经过磁体，样品被动态脱珠，其中当顺磁性颗粒经过袋移动时，顺磁性颗粒除去有核活细胞。通过袋一段时间后的液体形成终产物。磁性级分作为废物保留在袋内。几乎没有有核活细胞被捕获在磁性级分中。这与非流通脱珠过程形成对比，所述与顺磁性颗粒结合的有核活细胞被吸引到磁体并丢失在废物中。
38次非流通脱珠过程运行和36次流通脱珠过程运行的元数据分析表明当使用流通脱珠过程时，有核活细胞的回收率显著增加。图31。在样品中较少数量的细胞中(如少于1.6e9的总有核活细胞)，有核活细胞回收率的增加特别显著。在这样的总有核活细胞的数量下，流通脱珠过程显示76％的平均回收率，相比之下，非流通脱珠过程的平均回收率仅为34％。图32。回收率10-20％的增加也见于样品中较多数量的细胞。
回收率的这种差异是由于流通脱珠过程从有核活细胞中动态移除顺磁性颗粒的能力，因此即使它们在收获之前最初与顺磁性颗粒结合，这些细胞也不会丢失。
实施例9：阳性选择方法
可对从患有血液恶性肿瘤的患者收集的白细胞去除术进行FAST阳性选择。患者样品可以包含>20％的淋巴母细胞。在步骤的至少一部分期间，细胞可存在于柔性容器中，例如细胞袋，例如矩形Origen CS250袋。首先，如果白细胞去除术样品是冷冻的，则进行解冻步骤。然后例如可以使用CellSaver5+装置例如在环境温度例如20-25℃下洗涤细胞。洗涤溶液可包含5％HABS(人AB血清)MM，例如X-VIVO15。然后可以使细胞与分离试剂接触，该分离试剂包含磁性或顺磁性珠子和CD3和CD28结合抗体。然后可以在旋转器上旋转细胞，例如以2-6rpm，例如以4rpm，并且旋转可以持续例如10-30分钟，例如20分钟。在旋转期间，细胞可处于环境温度，例如20至25℃之间。然后可以进行阳性选择以富集结合分离试剂的细胞，例如30秒至2分钟，例如1分钟。
实施例10：阳性选择方法
可对从患有血液恶性肿瘤的患者收集的白细胞去除术样品进行FAST阳性选择。在程序的至少一部分期间，细胞可存在于柔性容器中，例如细胞袋，例如矩形Origen CS250袋。首先，如果白细胞去除术样品是冷冻的，则进行解冻步骤。然后例如可以使用CellSaver5+装置例如在环境温度例如20-25℃下洗涤细胞。洗涤溶液可包含5％右旋糖、0.45％氯化钠(例如D51/2NS)。如果在洗涤步骤和后续步骤之间存在保持，则可将细胞袋置于绝热材料上，例如包含纸(例如纸巾或湿巾)的多层。然后可以使细胞与分离试剂接触，该分离试剂包含磁性或顺磁性珠子和CD3和CD28结合抗体。然后可以将细胞培养在例如37℃，例如5-15分钟，例如10分钟。然后可以在旋转器上旋转细胞，例如以2-6rpm，例如以4rpm，并且旋转可以持续例如10-30分钟，例如20分钟。绝热材料可置于用于细胞的柔性容器和旋转器的细胞板的一侧之间。在旋转期间，细胞可处于高于环境温度下，例如20至37℃之间。然后可以进行阳性选择以富集结合分离试剂的细胞，例如30秒至2分钟，例如1分钟。
等同方案
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用整体并入本文。虽然已经参考具体方面公开了本发明，但显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其它技术人员可以设计出本发明的其它方面和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等同变型。

Claims (60)

1.一种制备可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
a)提供包含免疫效应细胞的冷冻输入样品，
b)解冻冷冻输入样品以产生解冻的样品，和
c)对解冻的样品进行淘析并收集免疫效应细胞，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
2.权利要求1所述的方法，其中所述冷冻输入样品是血浆单采血液成分术样品。
3.权利要求1或2所述的方法，还包括以下的一项、两项、三项或全部：
d)在流动条件下除去CD19+细胞；
e)使用包含碘克沙醇，例如在水中的60％碘克沙醇，例如Optiprep介质和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心；
f)用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤(例如，在解冻的样品上)，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤；和
g)在流动条件下进行CD3/CD28+细胞的阳性选择。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其包括调节解冻样品的粘度的步骤，例如通过向解冻样品中加入等渗溶液，例如PBS。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：
使用约30-82mL/min或50-80mL/min的流速进行淘析，和/或对于每个级分收集体积为约250-1250mL或300-1000mL；例如使用约30、40、50、60、70、72或82mL/min，例如约70或72mL/min的流速进行淘析；
使用约250、400、500、900或975mL，例如约400或975mL的收集体积进行淘析；和/或
以约2400rpm进行淘析。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述输入样品包含：
至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％或40％的单核细胞；
少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的T细胞；和/或
至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含：
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞；
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞；
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的B细胞；
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的CD4+CD25+细胞；和/或
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的CD8+CD25+细胞。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞回收产率。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述输出样品与编码CAR的核酸接触。
10.权利要求9所述的方法，其中在输出样品与编码CAR的核酸接触后，输出样品包含：
至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CAR+CD4+中枢记忆细胞；
至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的CAR+细胞；和/或
至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CAR+CD8+中枢记忆细胞。
11.权利要求9或10所述的方法，其中在输出样品与编码CAR的核酸接触后，输出样品：
产生每个转导的细胞少于1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pg的IFN-γ；和/或
包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30的细胞毒性水平(例如EC50rec)。
12.一种制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
a)提供包含免疫效应细胞的输入样品，和
b)使用包含碘克沙醇，例如在水中的60％碘克沙醇，例如Optiprep介质和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
13.权利要求12所述的方法，还包括进行以下的一项、两项、三项或全部：
c)在流动条件下除去CD19+细胞；
d)对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；
e)用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠))进行洗涤步骤(例如，在密度离心之前)，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤；和
f)在流动条件下阳性选择CD3/CD28+细胞。
14.权利要求12或13所述的方法，其不包括以下的一项或多项：使用包含乙二醇的溶液，例如Ficoll溶液；或在包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5介质中进行洗涤步骤，例如其中使用CS5仪器进行洗涤步骤；或进行阳性选择步骤。
15.权利要求12-14中任一项所述的方法，其中使用细胞分离装置，例如Sepax2装置进行密度离心。
16.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述输入样品包含：
少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％或15％的T细胞；
至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的单核细胞；和/或
至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的B细胞。
17.权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含：
至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞；
少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞；和/或
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的B细胞。
18.权利要求12-17中任一项所述的方法，其具有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞回收产率。
19.一种制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
a)提供包含免疫效应细胞的输入样品，和
b)在流动条件下例如使用流通装置从输入样品中除去CD19+细胞，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
20.权利要求19所述的方法，还包括进行以下的一项、两项、三项或全部：
c)对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；
d)使用包含碘克沙醇，例如水中60％碘克沙醇，例如Optiprep介质和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质的密度离心步骤；
e)使用右旋糖和/或氯化钠缓冲液，例如D5介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤(例如，在除去CD19+细胞之前和/或在输入样品解冻之后)，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤；和
f)在流动条件下CD3/CD28+细胞的阳性选择。
21.权利要求19或20所述的方法，其不包括进行淘析或密度离心。
22.权利要求19-21中任一项所述的方法，其中CD19+细胞包括B细胞，例如淋巴母细胞。
23.权利要求19-37中任一项所述的方法，其中输入样品包含：
至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％或50％的CD19+细胞；
至少10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、35％或40％的单核细胞；和/或
少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的T细胞。
24.权利要求19-38中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含：
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的CD19+细胞；
与输入样品相比少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的CD19+细胞百分比；
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞；
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的T细胞；和/或
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.01％的B细胞。
25.权利要求19-24中任一项所述的方法，其中通过磁分离除去CD19+细胞。
26.权利要求25所述的方法，其中所述磁分离包括：
使细胞与分离试剂接触，所述分离试剂包含磁性或顺磁性元件和CD19结合元件；
流式细胞术；和/或
使用磁性细胞分离装置，例如CliniMAC装置。
27.权利要求25所述的方法，其中通过FACS除去CD19+细胞。
28.权利要求19-27中任一项所述的方法，其具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％T细胞的T细胞回收产率。
29.权利要求19-28中任一项所述的方法，其中输入样品(例如，洗涤后的输入样品)包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的B细胞。
30.一种制备可被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
a)提供包含免疫效应细胞的输入样品，和
b)在流动条件下从输入样品中阳性选择CD3+/CD28+细胞，从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
31.权利要求30所述的方法，其还包括进行以下的一项、两项、三项或全部：
c)例如在流动条件下除去CD19+细胞；
d)对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；
e)使用包含碘克沙醇，例如水中60％的碘克沙醇，例如Optiprep介质和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤；
f)用右旋糖和/或氯化钠缓冲液，例如D5介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤(例如，在除去CD19+细胞之前和/或在输入样品解冻之后)，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤。
32.权利要求30所述的方法，其还包括：
在进行阳性选择之前进行淘析、洗涤步骤(任选地)和密度离心(例如使用Ficoll或OptiPrep介质)，和/或
在进行阳性选择之前进行洗涤步骤(任选地)和密度离心(例如，使用Ficoll或OptiPrep介质)。
33.权利要求30-32中任一项所述的方法，其不包括进行淘析。
34.权利要求30-33中任一项所述的方法，其包括使用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5 1/2NS缓冲液，例如使用CS5+仪器进行洗涤。
35.权利要求30-34中任一项所述的方法，其中CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括使输入样品与分离试剂接触，该分离试剂包含磁性或顺磁性元件和CD3和/或CD28结合元件。
36.权利要求30-35中任一项所述的方法，其中对CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括将输入样品与分离试剂温育约10至90分钟、约10至60分钟、约10至45分钟、约12至90分钟、约12至60分钟、约12至45分钟、约15至90分钟、约15至60分钟、约15至45分钟，例如约30分钟或约20分钟。
37.权利要求36所述的方法，其中所述分离试剂包含偶联(例如，共价或非共价偶联)至抗-CD3和/或抗-CD28抗体的珠子。
38.权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含：
至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或20％的T细胞；
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞；
至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的T细胞，例如CD3+CD45+T细胞。
39.权利要求30-38中任一项所述的方法，其使用磁性装置例如Dynamag CTS或磁性元件的其它配置和/或磁分离元件(例如珠子)与T细胞的比例约为3:1进行。
40.权利要求30-39中任一项所述的方法，其中对CD3+/CD28+细胞的阳性选择包括少于约6、5、6、3、2或1分钟、或少于约50、40、30、20、10、5、4、3、2或1秒的分离或停留时间。
41.权利要求30-40中任一项所述的方法，所述方法包括使包含免疫效应细胞和磁分离元件的流体在封闭系统，例如室或袋中流动，其中在该封闭系统中发生磁分离，其中任选地流动以一定速度进行，使得发生(任选结合免疫效应细胞的)元件的磁分离。
42.权利要求30-41中任一项所述的方法，其使用装置来进行，所述装置包括：
至少一个细胞悬液模块；
至少一个流通磁分离/脱珠模块；
至少一个非磁性输出模块；
至少一个磁性输出模块；
任选地，在磁分离/脱珠模块外部的至少一个产生磁力和/或梯度的磁性部件；
和任选地，至少一个缓冲模块。
43.权利要求42所述的方法，其中所述磁分离/脱珠模块包括：
由壁限定并具有x方向、y方向和z方向的室；
配置在室的相对端上的入口和出口，例如在x方向上、在y方向上或在z方向上；
邻近或接近室壁的至少两个磁体，其配置成在室内的入口和出口之间建立零梯度线。
44.权利要求30-43中任一项所述的方法，其中所述输入样品包含：
约1×107个细胞/ml，
至少约5％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞，例如CD45+CD19+B细胞；和/或
至少约5％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的B细胞，例如CD45-CD19+B细胞。
45.权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含：
少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞，例如CD45+CD19+B细胞；
少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞，例如CD45-CD19+B细胞。
46.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述输入样品包含：
至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的单核细胞；
至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的肿瘤细胞，例如淋巴母细胞；和/或
少于60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的免疫效应细胞，例如T细胞。
47.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含：
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的单核细胞；
少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的肿瘤细胞；
至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％的免疫效应细胞，例如T细胞；
与输入样品相比少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的单核细胞百分比；
与输入样品相比少于50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的肿瘤细胞百分比；和/或
与输入样品相比至少50％、45％、40％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、2％、2％或1％的免疫效应细胞，例如T细胞百分比。
48.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括例如通过转导将编码CAR的核酸引入输出样品中的一种或多种免疫效应细胞中，其中任选地所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，例如包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，并且其中任选地，所述转导导致至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的转导效率。
49.权利要求48所述的方法，其进一步包括测定转导效率的步骤和/或用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5介质，例如使用CS5+仪器对输入样品进行洗涤的步骤。
50.前述权利要求中任一项的方法，其中所述免疫效应细胞是人免疫效应细胞。
51.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述输出样品包含CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。
52.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述输入样品来自患有癌症的患者，所述癌症选自一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其它血液癌症或血液病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增生状况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、白血病前期、非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增殖性疾病、及其任何组合。
53.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：
测定输出样品中细胞上的一种或多种细胞表面标记物例如CD45、CD19、CD3、CD28、CD25或CD14的步骤；和/或
刺激免疫效应细胞的步骤，例如，通过在转导前例如使细胞与结合CD3和/或CD28的试剂，例如偶联CD3和/或CD28抗体的基质(如珠子)接触。
54.一种制备可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
i)提供输入样品，例如包含免疫效应细胞的冷冻输入样品或新鲜输入样品；
ii)任选地，其中输入样品是冷冻输入样品，解冻冷冻输入样品以产生解冻的样品；
iii)进行富集步骤，其中富集步骤包括：
1.对输入样品进行淘析，其中输入样品任选地是解冻的输入样品；或
2.使用包含碘克沙醇，例如水中60％的碘克沙醇，例如Optiprep介质和/或具有大于Ficoll的密度(例如，大于1.077g/ml，例如约1.32g/ml)的介质进行密度离心步骤；和
iv)进行选择步骤，其中选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择或例如对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
55.一种制备可被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞)群的方法，所述方法包括：
a)提供包含免疫效应细胞的输入样品，例如冷冻的输入样品或新鲜输入样品；
b)进行富集步骤，其中富集步骤包括：
进行淘析或密度离心(例如使用Ficoll或Optiprep介质)；
c)在流动条件下进行选择步骤，例如通过使用流通装置，其中所述选择是例如对CD3/CD28+细胞的阳性选择，或例如对CD19+、CD25+或CD14+细胞的阴性选择；
从而产生包含适合表达CAR的免疫效应细胞的输出样品。
56.权利要求54或55所述的方法，其还包括：
用包含右旋糖和/或氯化钠的缓冲液，例如D5介质(5％右旋糖和0.45％氯化钠)进行洗涤步骤，例如，其中使用CS5(CellSaver5+)仪器进行洗涤步骤；
用刺激免疫效应细胞增殖，例如刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和/或刺激T细胞表面上共刺激分子的配体，例如抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激输出样品；和/或
例如通过转导、转染或电穿孔引入编码CAR的核酸。
57.使用根据权利要求1-56中任一项所述的方法获得的反应混合物。
58.一种反应混合物，其包含至少80％、85％、90％或95％的T细胞和少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的单核细胞，其中反应混合物中的细胞总数加起来达到100％，其中任选一种或多种T细胞表达CAR。
59.权利要求58所述的反应混合物，其包含：
总共至少1x106、2x106、5x106、1x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108个细胞；
少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的B细胞；和/或
少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的癌细胞，例如淋巴母细胞。
60.权利要求57-59中任一项所述的反应混合物，其进一步包含编码CAR的核酸，例如，其中所述核酸存在于T细胞内或T细胞外。
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