CN116813775A - Cd22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CD22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体，更详细地，涉及与CD22特异性结合的人源化抗体、包含上述抗体或CD19xCD22抗体的嵌合抗原受体、表达上述嵌合抗原受体的嵌合抗原受体‑T(CAR‑T)细胞以及包含它们的用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物。可将本发明的基于与CD22特异性结合的人源化抗体的CD22嵌合抗原受体T细胞及双特异性CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞有用地用作用于预防或治疗与CD22(或CD19)表达相关的疾病或与B细胞相关的疾病的组合物。

Description

CD22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体
本申请是申请日为2021年11月19日，申请号为202111374408.1，发明名称为“CD22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体”的分案申请。
技术领域
本发明涉及CD22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体，更详细地，涉及与CD22特异性结合的人源化抗体、包含上述抗体或CD19xCD22抗体的嵌合抗原受体、表达上述嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞及包含它们的用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物。
背景技术
CD22在包括非霍金斯淋巴瘤(non-Hogkins lymphoma，NHL)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukaemia，B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocyticleukaemia，B-CLL)及尤其急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphocytic leukaemia，ANLL)的大部分的B细胞白血病及淋巴瘤中表达。
为了治疗或诊断这种与CD22表达相关的疾病等，正在研发CD22特异性抗体。在国际公开专利WO 1998-041641号中公开了在VH44及VL100位具有半胱氨酸残基的重组抗CD22抗体，在国际公开专利WO 1998-042378号中公开了用于治疗B细胞恶性肿瘤的抗CD22抗体。
如上所述，为了生产用于治疗的抗体，主要利用小鼠来生产单克隆抗体(monoclonal antibody)。但是，如源自小鼠的单克隆抗体的非人抗体在人体内被视为外来抗原，因此，诱发免疫反应，半衰期短，从而具有治疗效果有限的问题。
为了解决上述问题，研发了利用人抗体取代仅除与抗体的抗原结合的位点之外的剩余位点的人源化抗体。目前使用的利用人源化抗体取代小鼠抗体的方法如下：选择与所要取代的抗体最相似的人抗体基因，通过称为互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)移植的方法仅将小鼠抗体的互补决定区位点取代为人抗体互补决定区位置。如上所述的人源化抗体将大部分的基因人源化，因此具有可减少人体内的免疫反应的优点。
另外，为了治疗B细胞疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应等，正在研发上述各种B细胞表面标志物(抗原)特异性抗体，除CD22抗原之外，CD19为最常用作靶等的抗原，还进行靶向其的嵌合抗原受体T细胞的许多临床研究。但是，根据不表达CD19的白血病等细胞，靶抗原表达量具有差异，仅靶向一种抗原的单一嵌合抗原受体或单一嵌合抗原受体T细胞治疗可发生因肿瘤细胞的免疫逃避战略而损失靶抗原等的问题。实际上，在B细胞ALL(acute lymphocytic leukemia，急性淋巴细胞白血病)患者的情况下，观察到了不表达CD19的CD19阴性复发(初对CD19嵌合抗原受体T疗法反应的B细胞ALL患者的最大25％)，该现象被证实为对于嵌合抗原受体T细胞治疗的肿瘤细胞的耐药性机制(Maude,S.L.,etal.,N.Engl.J.Med.,378:439-448,2018)。
为了解决这个问题，正在研发靶向双抗原或多抗原的嵌合抗原受体T细胞，若同时靶向两种抗原，则可减少抗原损失变异体的可能性。
因此，在本发明中，为了在人体内减少免疫反应，筛选与CD22结合的抗体，利用其来制备了人源化抗CD22抗体，利用本发明的人源化抗CD22抗体来制备了靶向CD22的嵌合抗原受体及嵌合抗原受体T细胞。
进而，制备了靶向CD22及CD19的双特异性嵌合抗原受体(Bivalent CAR或Bispecific CAR)及双特异性嵌合抗原受体T细胞，确认了嵌合抗原受体在本发明中制备的CD22嵌合抗原受体T细胞及双特异性CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞正常表达，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供CD22特异性人源化抗体、编码上述抗体的多核苷酸、表达上述抗体的载体、利用上述载体转化的重组细胞。
本发明的再一目的在于，提供包含上述CD22特异性人源化抗体的嵌合抗原受体、编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸、包含上述多核苷酸的载体以及包含上述多核苷酸或载体的表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
本发明的另一目的在于，提供包含CD19及CD22特异性抗体的双特异性嵌合抗原受体、编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸、包含上述多核苷酸的载体以及包含上述多核苷酸或载体的表达双特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
本发明的还有一目的在于，提供包含上述免疫效应细胞的用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物。
技术方案
为了实现如上所述的目的，本发明提供与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段，其包括：由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ IDNO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。
并且，本发明提供多核苷酸，其编码上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段。
并且，本发明提供载体，其包含编码上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段的多核苷酸。
并且，本发明提供重组细胞，其生产利用上述载体转化的与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段。
为了实现再一目的，本发明提供靶向CD22的嵌合抗原受体，为包含CD22结合域、跨膜结构域(transmembrane domain)、共刺激域(costimulatory domain)以及细胞内信号转导结构域(intracellular signal transduction domain)的嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)，其特征在于，上述CD22结合域为与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段，上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段包括：由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者由SEQ IDNO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。
在本发明的一优选实施例中，上述跨膜结构域为选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152及PD1组成的组中的蛋白质，共刺激域为选自由CD28、4-1BB、OX-40及ICOS组成的组中的蛋白质，上述信号转导结构域可源自CD3ζ。
在本发明的再一优选实施例中，本发明还可包含位于上述CD22结合域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链区(hinge region)，上述铰链区可源自CD8α。
并且，本发明提供多核苷酸，其编码上述嵌合抗原受体。
并且，本发明提供载体，其包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸。
并且，本发明提供免疫效应细胞，其包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸或者包含上述多核苷酸的载体，并表达上述嵌合抗原受体。
为了实现另一目的，本发明提供靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体，为包含CD19结合域及CD22结合域、跨膜结构域、共刺激域以及细胞内信号转导结构域的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，上述CD22结合域为与CD22特异性结合的抗体或其片段，上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段包括：重链可变区，包含由SEQ ID NO:1的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:2的氨基酸表示的CDR2区及由SEQ ID NO:3的氨基酸表示的CDR3区；以及轻链可变区，由SEQ ID NO:4的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:5的氨基酸表示的CDR2区及由SEQ ID NO:6的氨基酸表示的CDR3区。
在本发明的一优选实施例中，上述CD19结合域与CD22结合域能够以与CD19特异性结合的抗体的轻链可变区-与CD22特异性结合的抗体的重链可变区-与CD22特异性结合的抗体的轻链可变区-与CD19特异性结合的抗体的重链可变区的顺序连接。
在本发明的再一优选实施例中，上述与CD19特异性结合的抗体的轻链可变区可包含由SEQ ID NO:44的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:45的氨基酸表示的CDR2区以及由SEQ ID NO:46的氨基酸表示的CDR3区，优选地，可由SEQ ID NO:48的氨基酸序列表示。
在本发明的另一优选实施例中，上述与CD19特异性结合的抗体的重链可变区可包含由SEQ ID NO:41的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:42的氨基酸表示的CDR2区及由SEQ ID NO:43的氨基酸表示的CDR3区，优选地，可由SEQ ID NO:47的氨基酸序列表示。
在本发明的还有一实施例中，上述跨膜结构域为选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152及PD1组成的组中的蛋白质，共刺激域为选自由CD28、4-1BB、OX-40及ICOS组成的组中的蛋白质，上述信号转导结构域可源自CD3ζ。
在本发明的又一实施例中，本发明还可包含位于上述CD22结合域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链区，上述铰链区可源自CD8α。
并且，本发明提供多核苷酸，其编码上述双特异性嵌合抗原受体。
并且，本发明提供载体，其包含编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸。
并且，本发明提供免疫效应细胞，其包含编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸或者包含上述多核苷酸的载体，并表达上述双特异性嵌合抗原受体。
为了实现还有一目的，本发明提供用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物，其包含：上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段；或者上述免疫效应细胞。
在本发明的一优选实施例中，由B细胞介导的疾病可选自由肿瘤、淋巴瘤、非霍金斯淋巴瘤(non-Hogkins lymphoma，NHL)、侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性延迟性非霍金斯淋巴瘤、难治性非霍金斯淋巴瘤、难治性延迟性非霍金斯淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)、伯基特淋巴瘤及套细胞淋巴瘤组成的组中。
发明的效果
在本发明中，制备了与CD22特异性结合的人源化抗体，利用其来制备了靶向CD22的单一嵌合抗原受体T细胞及靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体T细胞。
确认了在本发明中制备的CD22嵌合抗原受体T细胞及双特异性CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞有效识别CD22抗原来使嵌合抗原受体T细胞活化，并确认了有效杀死表达CD22的细胞。
进而，确认了双特异性CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞在动物模型中显示出优秀的抗肿瘤效果，可将本发明的基于与CD22特异性结合的人源化抗体的CD22嵌合抗原受体T细胞及双特异性CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞有用地用作用于预防或治疗与CD22(或CD19)表达相关的疾病或与B细胞相关的疾病的组合物。
附图说明
图1为利用流式细胞仪(FACS)确认在本发明中筛选的2G1抗体及人源化2G1抗体对于CD22的结合力的数据。
图2为示出靶向CD22的嵌合抗原受体(单一嵌合抗原受体(single CAR))的示意图。
图3为示出利用表达CD22嵌合抗原受体的慢病毒的CD22嵌合抗原受体表达细胞制备方法的示意图。
图4的(A)部分为示出将CD22嵌合抗原受体表达慢病毒转化到HEK293细胞株的方法的示意图，图4的(B)部分为示出转化的HEK293细胞对于CD22肽的结合能力的方法的示意图。
图5为在利用表达基于人源化抗CD22抗体2G1(V4)及2G1(V12)的CD22嵌合抗原受体的慢病毒转化的HEK293FT细胞中确认CD22嵌合抗原受体表达程度的数据。
图6为示出利用表达CD22嵌合抗原受体的慢病毒的CD22嵌合抗原受体T细胞制备方法的示意图。
图7的(A)部分为示出利用外周血单核细胞(PBMC)的CD22嵌合抗原受体T细胞制备方法的示意图，图7的(B)部分为示出CD22嵌合抗原受体T细胞对于CD22肽的结合能力的方法的示意图。
图8为确认基于人源化抗CD22抗体2G1(V4)及2G1(V12)的CD22嵌合抗原受体T细胞的CD22结合能力的数据。
图9为确认基于人源化抗CD22抗体的2G1(V4)及2G1(V12)的CD22嵌合抗原受体T细胞对于U2932细胞(CD22表达细胞)及K562细胞(CD22未表达细胞)的杀伤效果的数据。
图10为确认基于人源化抗CD22抗体2G1(V4)及2G1(V12)的CD22嵌合抗原受体T细胞对于NALM6细胞(CD22表达细胞)及K562细胞(CD22未表达细胞)的杀伤效果的数据。
图11为示出靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体(Bispecific CAR)的示意图。
图12为示出利用表达靶向CD19及CD22的双特异性CD19xCD22嵌合抗原受体的慢病毒的CD19xCD22嵌合抗原受体表达细胞制备方法的示意图。
图13为在利用表达抗CD19抗体FMC63和基于人源化抗CD22抗体2G1(V4)的CD19xCD22嵌合抗原受体的慢病毒转化的HEK293FT细胞中确认CD19xCD22(V4)嵌合抗原受体表达程度的数据。
图14为在利用表达抗CD19抗体和基于人源化抗CD22抗体2G1(V12)的CD19xCD22嵌合抗原受体(V12)的慢病毒转化的HEK293FT细胞中确认CD19xCD22(V12)嵌合抗原受体表达程度的数据。
图15为示出利用表达CD19xCD22嵌合抗原受体的慢病毒的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞制备方法的示意图。
图16a至图16c为为了确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的活化而在CD3+CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞(图16a)、CD4+CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞(图16b)及CD8+CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞(图16c)中确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞与CD22肽及CD19肽同时结合的数据。
图17a至图17c为为了确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的活化而在靶细胞的存在下确认通过抗CD19抗体和基于小鼠(mouse)2G1抗体的CD19xCD22(小鼠)嵌合抗原受体T细胞(图17a)、抗CD19抗体和基于2G1(V4)抗体的CD19xCD22(V4)嵌合抗原受体T细胞(图17b)及抗CD19抗体和基于2G1(V12)抗体的CD19xCD22(V12)嵌合抗原受体T细胞(图17c)的干扰素γ(IFNγ)表达程度的数据。
图18a至图18b为确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞对于NALM6细胞(CD19和CD22表达细胞)(图18a)、K562细胞(CD19和CD22未表达细胞)、K562/CD19+细胞(CD19表达细胞)、K562/CD22+细胞(CD22表达细胞)、K562/CD19+/CD22+细胞(CD19和CD22表达细胞)(图18b)的杀伤效果的数据。
图19a至图19b为了确认CD19xCD22(V4)嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果而在图19a示出利用IVIS SpectrumCT拍摄在向小鼠注入的NALM6/Luc细胞中表达的发光的图像、在图19b利用小鼠的存活率曲线示出在图19a中实施的实验中的抗肿瘤效果的数据。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
与CD22特异性结合的人源化抗体
在一方面，本发明涉及一种与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段，其包括：由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。
在本发明中，术语“人源化抗体”为具有与人产生的抗体的氨基酸序列相应的氨基酸序列的抗体和/或利用如在本申请中公开的用于制备人抗体的技术中的一种来制备的抗体。人源化抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
在本发明中，上述抗体可以为单克隆抗体。在本发明中，术语“单克隆抗体”还称为单株抗体或单抗，为单一抗体形成细胞生成的抗体，具有一级结构(氨基酸排列)均匀的特征。仅识别一种抗原决定簇来通常培养融合癌细胞和抗体生产细胞的杂交瘤细胞(hybridoma cell)来生产，但还可利用确保的抗体基因序列且利用其他重组蛋白质表达宿主细胞来生产。并且，上述抗体还可根据需求将除互补决定区部分之外的剩余部分人源化来使用。
在本发明中，术语“CDR”，即，“互补决定区”是指在重链及轻链部分的可变区内发现的非连续(non-contiguous)抗原结合位点。
在本发明中，术语“抗体”不仅可使用具有两个全长轻链及两个全长重链的的完整形态，还可使用抗体分子的片段。抗体分子的片段是指至少具有肽标签(表位)结合功能的片段，包括scFv、Fab、F(ab')、F(ab')2、单域(single domain)等。
在抗体片段中，Fab为具有轻链及重链的可变区、轻链的恒定区及重链的第一恒定区(CH1)的结构，具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于，在重链第一恒定区结构域的C末端具有包含一个以上的半胱氨酸残基的铰链区。F(ab')2抗体通过Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键来生成。Fv为仅具有重链可变区及轻链可变区的最小抗体片段，双链Fv(dsFv)的重链可变区与轻链可变区通过二硫键连接，单链Fv(scFv)的重链的可变区与轻链的可变区通常通过肽衔接物共价键合。这种抗体片段可利用蛋白质水解酶获取，优选地，可通过基因重组技术制备。
本发明的与CD22特异性结合的单克隆抗体可将CD22蛋白的全部或一部分肽用作免疫原(或抗原)来制备。更详细地，首先，将作为免疫原的CD22蛋白、包含CD22蛋白的融合蛋白或包含CD22蛋白的载体(carrier)根据需求与作为免疫增强剂的佐剂(adjuvant)(例，弗氏佐剂(Freund adjuvant))一同向除人类之外的哺乳动物的皮下、肌肉、静脉、脚垫肉或腹腔内注射一次以上来引起免疫作用(immunization)。上述除人类之外的哺乳动物优选为小鼠、大鼠、仓鼠、旱獭、鸡、兔、猫、狗、猪、山羊、羊、驴、马或牛(包括以生产源自其他动物的抗体的方式操作的转基因(transgenic)动物，例如生产人抗体的转基因小鼠。)，更优选为小鼠、大鼠、仓鼠、旱獭、鸡或兔。从第一次免疫开始，每隔1天～21天实施1次～4次免疫，在最终免疫后的约1天～10天后，可从起到免疫作用的哺乳动物获取生产抗体的细胞。免疫次数及时间间隔可根据所使用的免疫原的特征等适当变更。
分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞(hybridoma)的制备可根据Keira及Mirstein等的方法(Nature,1975,Vol.256,p.495-497)及与其类似的方法实施。如上所述，可通过对包含在选自由从起到免疫作用的除人类之外的动物摘取的脾、淋巴结、骨髓或扁桃体组成的组成的一种，优选地，包含在脾的生产抗体的细胞与没有自身抗体生产能力的源自哺乳动物的骨髓瘤细胞(myeloma cells)进行细胞融合来制备杂交瘤细胞。上述哺乳动物可以为小鼠、大鼠、旱獭、仓鼠、鸡、兔或人，优选地为小鼠、大鼠、鸡或人。
细胞融合使用例如包括聚乙二醇或仙台病毒在内的融合促进剂或通过电脉冲的方法，如一例，在包含融合促进剂的融合培养基，以约1∶1至1∶10的比例悬浮抗体生产细胞和可无限增殖的源自哺乳动物的细胞，并在此状态下，在约30℃至40℃的温度下培养约1分钟至5分钟。作为融合培养基，可利用如包括MEM培养基、RPMI1640培养基及IMDM培养基(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)在内的通常使用的培养基为佳，优选地，排除牛血清等的血清类。
筛选用于生产上述单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆的方法可执行如下的方法，即，首先，将通过如上所述的方式获取的融合细胞移至HAT培养基等的选择用培养基，在约30℃至40℃的温度下培养约3天至3周，由此杀死除杂交瘤细胞之外的细胞。接着，在微量滴定板(microtiter plate)等培养杂交瘤细胞后，通过如放射性物质标记免疫抗体(RIA，radioactive substance-marked immuno antibody)或酶联免疫吸附试验(ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的免疫分析方法查找在上文中记述的除人之外的动物的免疫反应中使用的免疫原与培养上清液的反应性增加的部分。并且，在上述中找到的生产单克隆抗体的克隆显示出上述免疫原特异性结合力。
本发明的单克隆抗体可通过在体内或体外培养如上所述的杂交瘤细胞来获取。当培养时，使用用于培养源自哺乳动物的细胞的通用方法，为了从培养物等收集单克隆抗体，使用用于纯化抗体的本领域中的通用方法。作为各个方法，可例举盐析、透析、过滤、浓缩、离心分离、分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析、凝胶电泳和等电点电泳等，它们可根据需求组合来适用。之后，纯化的单克隆抗体可进行浓缩干燥来根据用途制备为液相或固相。
并且，本发明的单克隆抗体可通过下述方式获取，即，通过聚合酶链式反应法或化学合成来使编码重链及轻链可变区的脱氧核糖核酸与编码重链及轻链的恒定区的基质的脱氧核糖核酸(例如，参照日本2007-252372号公报)分别连接的基因，并移植到可表达其基因的公知的表达载体(pcDNA 3.1(由Invitrogen公司出售))等来制备转化体，在CHO细胞或大肠杆菌等的宿主中表达来生产抗体，利用蛋白A或G(Protein A或G)柱等从这些培养液纯化抗体。
在本发明的具体一实施例中，为了制备与CD22特异性结合的抗体，制备及筛选生产抗CD22抗体的杂交瘤细胞来筛选了与CD22特异性结合的抗体(scFv)，并将其命名为2G1。
确认上述2G1抗体包括：重链可变区，包含由SEQ ID NO:1的氨基酸表示的CDR1区(GFSLTSYDI)、由SEQ ID NO:2的氨基酸表示的CDR2区(IWTGGGT)及由SEQ ID NO:3的氨基酸表示的CDR3区(VPHYYGYAMDYW)；以及轻链可变区，包含由SEQ ID NO:4的氨基酸表示的CDR1区(QDINKY)、由SEQ ID NO:5的氨基酸表示的CDR2区(YTS)及由SEQ ID NO:6的氨基酸表示的CDR3区(LQYDNLLT)。
具体地，2G1抗体包括由SEQ ID NO:7的氨基酸表示的重链可变区及由SEQ ID NO:8的氨基酸表示的轻链可变区，确认上述重链可变区被SEQ ID NO:9的碱基序列编码且轻链可变区被SEQ ID NO:10的碱基序列编码。
在本发明的具体再一实施例中，制备了将作为抗CD22抗体的2G1改变为与人相应的结构的人源化抗体(humanized antibody)，并将其命名为2G1(V4)及2G1(V12)。
上述2G1(V4)及2G1(V12)的重链可变区互补决定区和轻链可变区互补决定区与2G1相同，对除互补决定区部分之外的剩余部分进行了人源化处理。优选地，2G1(V4)包括由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区，2G1(V4)抗体的重链可变区可被SEQ ID NO:13的碱基序列编码且轻链可变区而被SEQ ID NO:14的碱基序列编码。
并且，2G1(V12)包括由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ IDNO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区，2G1(V12)抗体的重链可变区可被SEQ ID NO:17的碱基序列编码且轻链可变区可被SEQ ID NO:18的碱基序列编码。
本发明的CD22特异性抗体优选为scFv(单链可变片段(single chain variablefragment))，可通过基因重组技术制备来使重链可变区与轻链可变区通过衔接物连接。优选地，上述衔接物可由SEQ ID NO:19的氨基酸序列表示或者被SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的碱基序列编码，但并不限定于此。
在以轻链可变区-衔接物-重链可变区连接的情况下，2G1抗体(小鼠抗体)可由SEQID NO:23的氨基酸序列表示或者被SEQ ID NO:24的碱基序列编码，2G1(V4)抗体可由SEQID NO:25的氨基酸序列表示或者被SEQ ID NO:26的碱基序列编码，2G1(V12)抗体可由SEQID NO:27的氨基酸序列表示或者被SEQ ID NO:28的碱基序列编码。
在再一方面，本发明涉及一种编码与上述CD22特异性结合的抗体的多核苷酸。
在本发明中，术语“多核苷酸”通常是指以任意长度分离的核酸分子(nucleicacid molecule)、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或者其类似物。上述多核苷酸可通过(1)如聚合酶链式反应扩增的体外(in-vitro)扩增；(2)克隆及重组；(3)如消化(digestion)及凝胶电泳分离的纯化；(4)如化学合成的合成制备，优选地，分离的多核苷酸可通过重组脱氧核糖核酸技术制备。在本发明中，编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包括适用合成寡核苷酸的限制性片段操作(restriction fragment operation)或剪接重叠延伸聚合酶链式反应(Splicing by overlapping extension polymerase chainreaction，SOE PCR)，但并不局限于此，可通过本领域公知的各种方法制备。
在另一方面，本发明涉及包含编码与上述CD22特异性结合的抗体的多核苷酸的载体及利用上述载体转化的重组细胞。
在本发明中，术语“载体(expression vector)”是指包含启动子等的必须调节元件来使靶基因在适当的宿主细胞内表达的基因制备物。载体可选自质粒、逆转录病毒(retroviral)载体及慢病毒(lentiviral)载体中的一种以上。若转化为适当的宿主，在载体可与宿主基因组无关地复制并发挥功能，或者在一部分情况下，可整合到基因组本身中。
并且，载体可包含使编码区在适合的宿主中准确表达的表达控制元件。这种调节元件对于普通技术人员而言是周知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点(ribosome-binding site)、增强子(enhancer)及基因转录(transcription)或用于调节信使核糖核酸(mRNA)翻译(translation)的其他调节元件。表达调节序列的特定结构可根据物种或细胞类型的功能而异，通常，包含如TATA盒(box)、加帽(capped)序列、CAAT序列等的分别参与转录起始及翻译起始的5'非转录序列及5'或3'非翻译序列。例如，5'非转录表达调节序列可包括启动子区，上述启动子区可包含用于转录及调节功能性连接的核酸的启动子序列。
在本发明中，术语“启动子”是指足以指示转录的最小序列。并且，可包含足以表达被细胞类型特异性或外部信号或制剂诱导的可调节的启动子依赖性基因的启动子构建体，这种构建体可位于基因的5'或3'部分。可包含保守型启动子及诱导型启动子二者。启动子序列可源自原核生物、真核生物或病毒。
在本发明中，术语“转化体”是指具有编码一种以上的靶蛋白的多核苷酸的载体引入至宿主细胞来转化的细胞，作为通过将表达载体引入至宿主细胞来制备转化体的方法具有在文献(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual(第二版),ColdSpring Harbor Laboratory,1.74,1989)中记载的磷酸钙法或氯化钙/氯化铷法、电穿孔法(electroporation)、电注射法(electroinjection)、PEG等的化学处理方法、利用基因枪(gene gun)等的方法等。
若在营养培养基培养表达上述载体的转化体，则可大量制备、分离抗体蛋白。培养基和培养条件可根据宿主细胞适当选择通用的培养基和培养条件来使用。当培养时，需适当调节温度、培养基的pH值及培养时间等的条件，以适应细胞的生育和蛋白质的大量生产。
为了生产抗体，本发明的载体可转化到宿主细胞，优选地，可转化到哺乳动物细胞。本领域已研发了可表达完全糖基化的蛋白质的适当的宿主细胞株的数量，包括COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、COS-7(例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，ATCC CRL-10)、CHO(例如，ATCC CRL 1610)及BSC-1(例如，ATCC CRL-26)细胞株、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8653、SP2/0-Agl4、293细胞、HeLa细胞等，这些细胞可从如美国菌种保藏中心(ATCC，American Type Culture Collection，美国)容易获取。优选的宿主细胞包括如黑色素瘤及淋巴瘤细胞的源自淋巴细胞的细胞。
靶向CD22的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor)
在还有一方面，本发明涉及一种靶向CD22的嵌合抗原受体，为包含CD22结合域、跨膜结构域、共刺激域以及细胞内信号转导结构域的嵌合抗原受体，其特征在于，上述CD22结合域为与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段，上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段包括：由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ IDNO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。
在本发明中，术语“嵌合抗原受体(CAR)”通常是指包含抗原以及具有与一种以上的胞内域结合的能力的胞外域的融合蛋白。嵌合抗原受体为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部分，可包含抗原结合域、跨膜结构域、共刺激域及细胞内信号转导结构域。嵌合抗原受体可基于抗体的抗原(例如，CD22)特异性来与T细胞受体激活胞内域组合。基因修饰的嵌合抗原受体表达T细胞可特异性识别靶抗原表达恶性细胞并消除其。
在本发明中，术语“CD22结合域(CD22-binding domain)”是指通常可与CD22蛋白特异性结合的结构域。例如，CD22结合域可包含与在B细胞表达的人CD22多肽或其片段特异性结合的抗CD22抗体或其片段。
在本发明中，术语“结合域(binding domain)”可与“胞外域(extracellulardomain)”、“细胞外结合域(extracellular binding domain)”、“抗原特异性结合域(antigenspecific binding domain)”及“细胞外抗原特异性结合域(extracellularantigen-specific biding domain)”互换使用，是指具有与靶抗原(例如，CD22)特异性结合的能力的嵌合抗原受体结构域或片段。
在本发明中，上述抗CD22抗体或其片段为上述的抗CD22抗体，为单克隆抗体，优选为scFv。具体地，可利用本发明的CD22特异性人源化抗体即2G1(V4)或2G1(V12)抗体来制备。
在本发明中，上述嵌合抗原受体可以为除CD22结合域之外还包含B细胞表面标志物结合域的双特异性嵌合抗原受体，上述B细胞表面标志物可以为CD1O、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85或CD86，优选为CD19。
在本发明中，可在CD22结合域的N末端还包含信号肽(signal peptide)，上述“信号肽”通常是指用于引导蛋白质转导的肽链。信号肽可以为具有5个至30个氨基酸长度的短肽，在本发明中，优选地，利用了SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在本发明中，还可包含位于CD22结合域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链区，上述铰链区源自CD8α，优选地，可由SEQ ID NO:37的氨基酸序列表示。上述“铰链区”通常是指抗原结合区与免疫细胞Fc受体(FcR)结合区之间的连接区。
在本发明中，“跨膜结构域”通常是指穿过细胞膜并与细胞内信号转导结构域连接来起到信号转导作用的嵌合抗原受体的结构域。上述跨膜结构域可源自选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152及PD1组成的组中的蛋白质，优选地，可由SEQ ID NO:38的氨基酸序列表示。
在本发明中，“共刺激域”通常是指可提供作为对于淋巴细胞的抗原的有效反应所需的细胞表面分子的免疫刺激分子的胞内域。上述记载的共刺激域可包含CD28的共刺激域，可包含如OX40及4-1BB的共刺激域的肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的共刺激域，优选为可由SEQ ID NO:39的氨基酸序列表示的4-1BB。
在本发明中，“细胞内信号转导结构域”通常是指位于细胞内部且可转导信号的结构域。在本发明中，细胞内信号转导结构域为嵌合抗原受体的细胞内信号转导结构域。例如，细胞内信号转导结构域可选自CD3ζ胞内域、CD28胞内域、4-1BB胞内域及OX40胞内域，优选为由SEQ ID NO:40的氨基酸序列表示的CD3ζ。
嵌合抗原受体编码多核苷酸及嵌合抗原受体表达载体
在又一方面，本发明涉及一种编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸。
在本发明中，编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸可包含编码CD22结合域的多核苷酸、编码跨膜结构域的多核苷酸、编码共刺激域的多核苷酸以及编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。
编码上述CD22结合域的多核苷酸可以为本发明的CD22特异性人源化2G1(V4)或2G1(V12)抗体，为轻链可变区与重链可变区通过衔接物连接的scFv形态，具体碱基序列如上所述。
优选地，本发明的编码嵌合抗原受体的多核苷酸可包含由SEQ ID NO:26的碱基序列表示的2G1(V4)抗体或由SEQ ID NO:28的碱基序列表示2G1(V12)抗体、由SEQ ID NO:32的碱基序列表示的跨膜结构域、由SEQ ID NO:33的碱基序列表示的4-1BB(共刺激域)以及由SEQ ID NO:34的碱基序列表示的CD3ζ(细胞内信号转导结构域)。
当在CD22结合域的N末端包含信号肽时，还可包含由SEQ ID NO:30的碱基序列表示的信号肽。并且，在编码CD22结合域的多核苷酸与跨膜结构域之间还可包含编码铰链区的多核苷酸，优选为由SEQ ID NO:31的碱基序列表示的CD8铰链区。
在又一方面，本发明涉及包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸的载体。
在本发明中，上述载体为重组病毒载体，优选为慢病毒载体，包含可操作地连接的EF1α启动子、编码信号肽的多核苷酸、编码CD22结合域的多核苷酸、编码跨膜结构域的多核苷酸以及编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸，为了增加蛋白质表达，还可包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE，woodchuck hepatitis virus post-transcriptionalregulatory element)(图3)。
上述EF1α启动子可由SEQ ID NO:29的碱基序列表示，可根据需求包含与上述SEQID NO:27的碱基序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。
并且，上述启动子可操作地连接来诱导作为CD22结合域的抗CD22抗体(scFv)的表达。
如图3所示，在本发明的一具体实例中，制备了插入有编码CD22嵌合抗原受体的多核苷酸的慢病毒载体，将制备的载体转化到293FT细胞来制备了CD22嵌合抗原受体表达细胞。并且，如图5所示，确认在制备的CD22嵌合抗原受体表达细胞中表达靶向CD22的嵌合抗原受体。
用于向宿主细胞内引入多核苷酸的生物学方法包括脱氧核糖核酸及核糖核酸载体的使用。病毒载体，尤其逆转录病毒载体成为为了将基因插入至哺乳动物，例如人细胞内而最广泛使用的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒及腺相关病毒等。
用于向宿主细胞内引入多核苷酸的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠及包括水包油乳业、胶束、混合胶束及脂质体的的基于脂质的系统。在试验管内及体内用作递送载体的例示性胶体系统为脂质体(例如，人工膜囊泡)。还可利用核酸的最新技术的靶向递送，例如，使用靶向纳米颗粒或其他适合的亚微米尺寸递送系统的用于递送多核苷酸的其他方法。
在利用非病毒递送系统的情况下，例示性的递送载体为脂质体。为了向宿主细胞内引入核酸(试验管内、体外或体内)而考虑使用脂质制剂。在另一实施方式中，核酸可与脂质关联。与脂质关联的核酸可在脂质体的水性内部胶囊化、在脂质体的脂质双层内散布、通过与脂质体及寡核苷酸二者关联的连接分子粘附在脂质体、在脂质体内捕获、与脂质体复合物化、分散在包含脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质内、与胶束一同包含或者复合物化或者与脂质不同地关联。脂质、脂质/脱氧核糖核酸或脂质/表达载体关联组合物并不局限于溶液中的任意特定结构。
嵌合抗原受体表达免疫效应细胞
在又一方面，本发明涉及一种免疫效应细胞，其包含编码基于上述CD22特异性人源化抗体的嵌合抗原受体的多核苷酸或包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的载体，用于表达基于上述CD22特异性人源化抗体的嵌合抗原受体。
在本发明中，上述免疫效应细胞可以为源自哺乳动物的离析细胞，优选为T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、骨髓细胞、单核细胞或巨噬细胞，更优选为T细胞。
在本发明中，可通过将本发明的嵌合抗原受体载体引入至免疫效应细胞，例如T细胞或自然杀伤细胞内来制备表达上述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
具体地，嵌合抗原受体载体可通过电穿孔法、lipofectamine 2000(Invitrogen)等的本领域公知的方法引入至细胞内。例如，免疫效应细胞通过慢病毒载体转染来将转运嵌合抗原受体分子的病毒基因组整合到宿主基因组，由此可保障靶基因的长期且稳定地表达。如另一例，转位子(transposon)可用于将嵌合抗原受体转运质粒(transposon)及转移酶转运质粒引入至靶细胞内。如另一例，嵌合抗原受体分子可通过基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas9)添加至基因组中。
可从对象体获取用于制备表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的免疫效应细胞，上述“对象体”包含可引发免疫反应的活有机体(例如，哺乳动物)。对象体的实例包括人类、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因种。可从包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积血、脾组织及肿瘤的诸多来源获取T细胞。
可通过普通技术人员公知的任意多个技术，例如FicollTM分离来从由对象体收集的血液单位获取上述T细胞。细胞通过分离单采术从血液中获取，分离单采术生成物通常包含T细胞、单核细胞、粒细胞、包括B细胞的淋巴细胞、其他有核白细胞、红细胞及血小板。
通过分离单采术收集的细胞消除血浆分馏物，可洗涤细胞以将其置于适当的缓冲液或培养基中，以用于后续处理步骤。T细胞裂解红细胞，例如，通过PERCOLLTM梯度的离心分离或逆流离心分离去除单核细胞，由此从外周血液淋巴细胞离析。
在本发明的再一具体实例中，如图6及图7所示，分离从外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)活化的T细胞后，将CD22嵌合抗原受体慢病毒转导至T细胞来制备CD22嵌合抗原受体T细胞，具体地，利用人源化2G1(V4)及2G1(V12)来分别制备CD22嵌合抗原受体T细胞。
为了确认制备的CD22嵌合抗原受体T细胞的活性，确认了CD3、CD4或CD8对于活化的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的CD22肽的结合能力。如图8所述，确认了在本发明中制备的CD22嵌合抗原受体T细胞与CD22肽结合。
在本发明的具体另一实例中，确认CD22嵌合抗原受体T细胞对于靶细胞的杀伤效果的结果，如图9所示，确认了CD22嵌合抗原受体T细胞示出对表达CD22的U2932细胞及NALM6细胞特异性地杀伤效果。
即，本发明的基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的嵌合抗原受体及利用其的嵌合抗原受体T细胞可有用地用作用于预防或治疗与B细胞或CD22表达相关的疾病的组合物。
靶向CD19/CD22的双特异性嵌合抗原受体(Bispecific CAR)
在又一方面，本发明涉及一种靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体(CD19xCD22 bispecific CAR)，为包含CD19结合域及CD22结合域、跨膜结构域、共刺激域以及细胞内信号转导结构域的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，上述CD22结合域为与CD22特异性结合的抗体或其片段，上述与CD22特异性结合的抗体或其片段包括：重链可变区，包含由SEQ ID NO:1的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:2的氨基酸表示的CDR2区及由SEQ ID NO:3的氨基酸表示的CDR3区；以及轻链可变区，包含由SEQ ID NO:4的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:5的氨基酸表示的CDR2区以及由SEQ ID NO:6的氨基酸表示的CDR3区。
在本发明中，与上述CD22特异性结合的抗体或其片段可以为包括由SEQ ID NO:7的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:8的氨基酸序列表示的轻链可变区的抗CD22抗体，或者为包括由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区，或者由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区的人源化抗CD22抗体。
在本发明中，上述双特异性(bispecific或bivalent)嵌合抗原受体为同时结合两种不同类型抗原的嵌合抗原受体，在本发明中，优选地，制备了靶向CD19及CD22二者的双特异性嵌合抗原受体，上述CD19结合域可无限制地使用公知的抗CD19抗体序列。
嵌合抗原受体的具体内容与上述说明相同，如图11所示，上述双特异性嵌合抗原受体的CD19结合域与CD22结合域以环(环嵌合抗原受体(LoopCAR))形态连接。即，能够以与CD19特异性结合的抗体的轻链可变区(CD19VL)-与CD22特异性结合的抗体的重链可变区(CD22VH)-与CD22特异性结合的抗体的轻链可变区(CD22VL)-与CD19特异性结合的抗体的重链可变区(CD19VH)顺序连接。
与上述CD19特异性结合的抗体的轻链可变区可包含由SEQ ID NO:44的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:45的氨基酸表示的CDR2区及由SEQ ID NO:46的氨基酸表示的CDR3区，优选地，可由SEQ ID NO:48的氨基酸序列表示。
与上述CD19特异性结合的抗体的重链可变区可包含由SEQ ID NO:41的氨基酸表示的CDR1区、由SEQ ID NO:42的氨基酸表示的CDR2区及由SEQ ID NO:43的氨基酸表示的CDR3区，优选地，可由SEQ ID NO:47的氨基酸序列表示。
可通过基因重组技术制备上述CD19结合域及CD22结合域来使它们通过衔接物连接，优选地，CD19VL与CD22VH或CD22VL与CD19VH可通过由SEQ ID NO:51的氨基酸序列表示的衔接物(图11的衔接物1(linker 1))连接，CD22VH与CD22VL可通过由SEQ ID NO:54的氨基酸序列表示的衔接物(图11的衔接物6(linker 6)连接，但并不限定于此，可使用由不影响抗体活性的任意氨基酸序列组成的肽。
编码靶向CD19/CD22的双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸及靶向CD19/CD22的双 特异性嵌合抗原受体表达载体
在又一方面，本发明涉及编码上述靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸。
在本发明中，编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸可包含编码CD19结合域的多核苷酸及编码CD22结合域的多核苷酸、编码跨膜结构域的多核苷酸、编码共刺激域的多核苷酸以及编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸。
优选地，本发明的编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸包含：由与CD19特异性结合的抗体的轻链可变区(CD19VL，SEQ ID NO:50)-与CD22特异性结合的抗体的重链可变区(CD22VH，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17)-与CD22特异性结合的抗体的轻链可变区(CD22VL，SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18)-与CD19特异性结合的抗体的重链可变区(CD19VH，SEQ ID NO:49)组成的双特异性抗体；由SEQ ID NO:32的碱基序列表示的跨膜结构域；由SEQ ID NO:33的碱基序列表示的4-1BB(共刺激域)；以及由SEQ IDNO:34的碱基序列表示的CD3ζ(细胞内信号转导结构域)。
在上述“CD19VL与CD22VH”或“CD22VL与CD19VH”通过由SEQ ID NO:51的氨基酸序列表示的衔接物连接的情况下，对于上述衔接物的多核苷酸可由SEQ ID NO:52或SEQ IDNO:53的碱基序列表示，在“CD22VH与CD22VL”通过由SEQ ID NO:54的氨基酸序列表示的衔接物的情况下，上述衔接物的多核苷酸可由SEQ ID NO:55的碱基序列表示，但并不限定于此，可使用不影响抗体活性的编码氨基酸序列的任意多核苷酸。
当在CD19/CD22结合域的N末端包含信号肽时，还可包含由SEQ ID NO:30的碱基序列表示的信号肽。并且，在编码CD22结合域的多核苷酸与跨膜结构域之间还可包含编码铰链区的多核苷酸，优选为由SEQ ID NO:31的碱基序列表示的CD8铰链区。
在又一方面，本发明涉及包含编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸的载体。
在本发明中，上述载体为重组病毒载体，优选为慢病毒载体，包含可操作地连接的EF1α启动子、编码信号肽的多核苷酸、编码CD19结合域及CD22结合域的多核苷酸、编码跨膜结构域的多核苷酸以及编码细胞内信号转导结构域的多核苷酸，为了增加蛋白质表达，还可包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(图12)。
上述EF1α启动子可由SEQ ID NO:29的碱基序列表示，可根据需求包含与上述SEQID NO:27的碱基序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。
并且，上述启动子可操作地连接来诱导作为CD19xCD22结合域的抗CD19/CD22抗体(CD19VL-CD22VH-CD22VL-CD19VH)的表达，载体的具体内容与上述说明相同。
在本发明的一具体实施例中，如图12所示，制备了插入有编码CD19xCD22嵌合抗原受体的多核苷酸的慢病毒载体，将制备的载体转化到293FT细胞来制备了CD19xCD22嵌合抗原受体表达细胞。并且，如图13及图14所示，确认在制备的CD19xCD22嵌合抗原受体表达细胞中表达靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体。
靶向CD19xCD22的双特异性嵌合抗原受体表达免疫效应细胞
在又一方面，本发明涉及一种免疫效应细胞，其包含编码上述双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸或包含编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸的载体，用于表达上述双特异性嵌合抗原受体。
在本发明中，上述免疫效应细胞可以为源自哺乳动物的离析细胞，优选为T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、骨髓细胞、单核细胞或巨噬细胞，更优选为T细胞。并且，嵌合抗原受体表达免疫效应细胞的具体内容与上述说明相同。
在本发明的一具体实例中，通过与制备CD22嵌合抗原受体T细胞相同的方法(图7)从外周血单核细胞分离活化的T细胞后，将CD19xCD22嵌合抗原受体慢病毒转导至T细胞来制备了CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞，具体地，利用2G1抗体(小鼠)、人源化2G1(V4)及2G1(V12)来分别制备了CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞。
为了确认制备的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的活性，确认了CD3、CD4或CD8对于活化的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的CD22肽及CD19肽的结合能力。如图16a至图16c所示，确认了在本发明中制备的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞同时与CD22肽及CD19肽结合。
在本发明的再一具体实例中，为了确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的活化，在靶细胞的存在下，确认了通过CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的干扰素γ表达程度。结果，如图17a至图17c所示，在不表达CD19及CD22的K562细胞中，T细胞未活化，相反，在表达CD19及CD22的NALM6细胞的存在下，T细胞活化，由此确认了干扰素γ表达增加。
在本发明的具体另一实例中，确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞对于靶细胞的杀伤效果的结果，如图18a至图18b所示，确认了CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞显示出对于表达CD19及CD22的NALM6细胞的杀伤效果。
进而，在本发明的还有一具体实例中，为了确认CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果，向肿瘤内注射通过在异种移植肿瘤细胞的小鼠模型利用人源化2G1-V4抗体来制备的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞后，观察了肿瘤大小。结果如图19a至图19b所示，确认与用作阳性对照组的与SV40病毒结合的基于抗体的帕利珠单抗(Palivizumab)嵌合抗原受体T细胞相比，本发明的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果优秀，当将CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞处理为5×106个以上时，确认肿瘤细胞大部分被杀死来未观察到肿瘤组织。
即，本发明的靶向CD19xCD22的双特异性嵌合抗原受体及CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞可有用地用作用于预防或治疗与B细胞或CD19xCD22表达相关的疾病的组合物。
用于预防或治疗由B细胞介导的疾病或与CD19xCD22表达相关的疾病的组合物
在又一方面，本发明涉及用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物，其包含与CD22特异性结合的人源化抗体、表达靶向CD22的嵌合抗原受体的免疫效应细胞、或者表达与CD19xCD22特异性结合的双特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
在本发明中，上述B细胞优选为表达CD19或CD22的细胞，上述疾病可选自由肿瘤/癌症、淋巴瘤、非霍金斯淋巴瘤、侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性延迟性非霍金斯淋巴瘤、难治性非霍金斯淋巴瘤、难治性延迟性非霍金斯淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤及套细胞淋巴瘤组成的组中。
在本发明中，上述组合物可包含由B细胞介导的疾病的治疗剂，上述治疗剂以和与CD19或CD22特异性结合的抗体共价键和的状态存在，或者可与本发明的CD22嵌合抗原受体免疫效应细胞或CD19xCD22嵌合抗原受体免疫效应细胞组合给药。
上述治疗剂包含低分子药物、肽药物、毒素(例如，细胞毒素)等。
上述低分子药物示出感兴趣的药剂学活性，通常，可以为分子量约为800Da以下或2000Da以下的化合物。无机低分子是指不包含碳原子的分子，相反，有机低分子是指至少包含一个碳原子的化合物。
上述肽药物是指包含高分子化合物的氨基酸，其不仅包括天然存在及非天然存在的肽、寡肽、环形肽、多肽及蛋白质，还包括肽模拟。上述肽药物可以通过化学合成获取或者在遗传编码的来源(例如，重组来源)产生。肽药物的分子量的范围为200Da至10kDa或其以上。
上述毒素优选为细胞毒素，细胞毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素(例如，PE35、PE37、PE38、PE40等)、皂草素、白树毒素、PAP蛋白、肉毒杆菌毒素、异株泻根毒蛋白、苦瓜丁及布加宁，但并不局限于此。
并且，上述治疗剂可以为抗癌剂。抗癌剂包含减少癌细胞的增殖，包括整合细胞毒性药剂及细胞增殖抑制剂的非肽(即，非蛋白质)化合物。抗癌剂的非限制性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物质、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱及甾类激素。还可使用肽化合物。
在上述药学组合物中，与CD22特异性结合的人源化抗体、CD22嵌合抗原受体免疫效应细胞或CD19xCD22嵌合抗原受体免疫效应细胞为用于治疗或诊断的组合物内的唯一活性成分，或者例如，可与如抗T细胞、抗干扰素γ或抗脂多糖(LPS)抗体的其他抗体成分或如黄嘌呤的包含非抗体成分的其他活性成分一同使用。
优选地，药学组合物包含治疗有效量的本发明的抗体。在此使用的术语“治疗有效量”是指改善或预防目标疾病或状态所需的治疗剂的量，或意味着示出可检测程度的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于某一抗体，治疗有效剂量最初可通过细胞培养分析法或以通常的如啮齿类、兔、狗、猪或灵长类的动物模型确定。动物模型还可用于确定适当的浓度范围和给药途径。这种信息可用于确定对于人体给药有用的剂量或途径。
用于人类患者的精确有效量可根据疾病状态的严重程度、患者的一般健康状态、患者的年龄、体重及性别、饮食、给药时间、给药频率、药物成分、反应敏感性及对于治疗的耐受性/反应不同。上述量可通过常规实验确定，在临床医生的判断范围内。通常，有效剂量为0.01mg/kg～50mg/kg，优选为0.1mg/kg～20mg/kg，更优选为约15mg/kg。
组合物可向患者单独给药，或者与其他制剂、药剂或急速组合来给药。
给药本发明的抗体的剂量根据所要治疗的状态的性质、恶性淋巴瘤或白血病的等级及抗体是否为了预防疾病而使用或者为了治疗当前状态而使用不同。
给药频率根据抗体分子的半衰期、药效的持续性而不同。若抗体分子具有短半衰期(例，2小时～10小时)，则需要提供每天一次以上的剂量。或者，若抗体分子具有长半衰期(例，2天～15天)，则需要提供每天一次、一周一次、或者每一个月或两个月一次的剂量。
并且，为了抗体的给药，药学组合物可包含药剂学上可接受的载体。载体不得引起其本身对于接受组合物的个体有害的抗体的生成，必须是无毒的。适当的载体可以为如蛋白质、多肽、脂质体、多糖类、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物及非活性病毒粒子的缓慢代谢的大分子。
药剂学上可接受的盐可使用如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐及硫酸盐的无机酸盐或者如乙酸、丙酸、丙二酸及苯甲酸的有机酸盐。
治疗组合物内的药剂学上可接受的载体还可包含如水、盐水、甘油及乙醇的液体。此外，这种组合物内存在如湿润剂、乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质。为了使患者摄取药学组合物，上述载体可制剂化为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液及悬浮液。
用于给药的优选形态包括如通过注射(injection)或注入(infusion)(例如，一次性(bolus)注射或连续注入)的适合胃肠外给药的形态。当生成物用于注入或注射时，可采用油或水溶性赋形剂内的悬浮剂、溶液或乳液形态，这可包括如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂的处方剂。或者，抗体分子可以为无水形态，使用之前可通过适当的无菌溶液重新配制。
一旦制剂化时，本发明的组合物可直接给药至患者。接受治疗的患者可以为动物。但是，优选地，组合物因为了向人类患者给药而配置。
本发明的药学组合物可通过包括口服、静脉、肌内、动脉内、骨髓内、鞘内、心室内、透皮(transdermal)、透皮(transcutaneous)(例，参照WO 98/20734)、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径的任意途径给药，但并不局限于此。当给药本发明的药学组合物时，可使用无针注射器(hypospray)。通常，治疗组合物可制备为作为液体溶液或悬浮液的可注射的物质。并且，可制备为注入前适合液体赋形剂内服液或悬浮液的固体形态。
组合物的直接递送通常通过注射、皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌内注射来执行，或者可递送至组织的间隙(interstitial)空间。并且，组合物可给药至伤口部位。剂量处理可以为单剂量方案或多剂量方案。
组合物内的活性成分可以为抗体分子。其本身容易在胃肠道中降解。因此，若组合物通过使用胃肠道的途径给药，则组合物需要包含如下的制剂，即，保护抗体使其免于降解，一旦被胃肠道吸收就释放抗体。
药剂学上可接受的载体的完整理论可使用雷氏药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Company,NJ,1991)。
以下，为了帮助理解本发明，公开优选实施例。但是，下述实施例仅为了更容易理解本发明而提供，本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1
制备及筛选与CD22特异性结合的抗体
为了筛选CD22肽特异性抗体，制备生产与CD22结合的抗体来筛选了抗体。
首先，免疫CD22蛋白(ACRObiosystems Inc.,cat#CD2-H52H8，美国)来摘取脾细胞，通过与小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合来制备了杂交瘤细胞。
用于细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞不具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT，HypoxanthineGuanidine-Phosphoribosyl-Transferase)，因此，在HAT培养基中无法存活，但杂交瘤细胞可与脾细胞融合来在HAT培养基中存活。若利用其，则可仅使杂交瘤细胞增殖，因此，通常在HAT培养基中增殖至确立杂交瘤细胞为止。
为了从增殖的杂交瘤细胞中筛选生产与CD22结合的抗体的杂交瘤细胞，使用了有限稀释法。首先，每96孔成为一个细胞以下后，通过酶联免疫吸附试验确认从一个细胞增殖的克隆获取的抗体是否与CD22结合，并筛选了与CD22结合的克隆。反复3次上述过程来筛选了生产与CD22结合的抗体的杂交瘤细胞。通过如上所述的方法获取了与CD22结合的抗体。
将上述抗体命名为2G1，并分析它们的碱基序列和氨基酸序列。在下述表1示出根据序列分析结果的与各抗体的重链可变区及轻链可变区有关的序列信息，在表1中，下划线部分是指互补决定区(complementarity determining region，CDR)。
表1
2G1抗体的序列信息
/>
实施例2
制备基于2G1抗体的人源化抗体
制备了将在上述实施例1中筛选的2G1抗体变更为对应于人的结构的人源化抗体。
具体地，将人抗体的生殖系列碱基序列(germline sequence)作为骨架(frame)来通过将与CD22结合的小鼠抗体的互补决定区更换为人抗体的互补决定区的CDR移植(CDRgrafting)方法制备了将小鼠2G1抗体人源化的抗体。将人源化抗体命名为2G1(V4)及2G1(V12)，并分析氨基酸序列。在下述表2及表3示出根据序列分析结果的与抗体的重链可变区及轻链可变区有关的序列信息，在表2及表3中，下划线部分是指互补决定区。
表2
2G1(V4)抗体的序列信息
/>
表3
2G1(V12)抗体的序列信息
/>
实施例3
确认筛选的抗体对于CD22的特异性
在本发明中，为了确认上述实施例1的2G1抗体(小鼠)、实施例2的人源化2G1(V4)及2G1(V12)抗体对于CD22的特异性，执行流细胞分析(flow cytometer)。
首先，将表达CD22的1×106个B细胞淋巴瘤U2932(B-cell lymphoma U2932cell)与1μg的2G1抗体分别反应30分钟后，利用二抗染色表面(surface)后，使用流细胞分析仪测量。
使用PE偶联的抗CD22抗体(PE-conjugated anti-CD22 antibody；BiolegendInc.,cat#302506，美国)作为阳性对照组，使用PE偶联的抗小鼠免疫球蛋白G抗体(PE-conjugated goat anti-mouse IgG；Biolegend Inc.,cat#405307，美国)作为二抗。
结果，如图1所示，确认2G1抗体、人源化2G1(V4)及2G1(V12)抗体均与表达CD22的细胞特异性结合。
实施例4
制备靶向CD22的嵌合抗原受体(CD22嵌合抗原受体)表达载体
在本发明中，利用在上述实施例2中制备的人源化2G1(V4)及2G1(V12)抗体制备了表达靶向CD22的嵌合抗原受体的慢病毒载体(CD22嵌合抗原受体慢病毒)。
如图3的示意图所示，在体外(in vitro)合成由EF1α启动子(SEQ ID NO:29)、编码信号肽的多核苷酸(SEQ ID NO:30)、编码CD22结合域的多核苷酸(由SEQ ID NO:26表示的2G1(V4)或由SEQ ID NO:28表示的2G1(V12))、编码CD8铰链区的多核苷酸(SEQ ID NO:31)、编码跨膜结构域的多核苷酸(SEQ ID NO:32)、编码4-1BB(共刺激域)的多核苷酸(SEQ IDNO:33)、编码CD3ζ(细胞内信号转导结构域)的多核苷酸(SEQ ID NO:34)以及编码土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件的多核苷酸(SEQ ID NO:35)组成的嵌合抗原受体脱氧核糖核酸，并插入到第三代慢病毒载体。
慢病毒载体与pMDLg/pRRE(Addgene,cat##12251)、pMD2.G(Addgene,cat##12259)、pRSV-Rev(Addgene,cat##12253)的三种载体一同利用HEK293FT细胞共转染(co-transfection)后，生产CD22嵌合抗原受体慢病毒。为了共转染，使用Lipofectamine3000transfection kit(Invitrogen,cat#L3000-015)和Opti-MEM+GlutaMAX(gibco,cat#51985-034)培养基来将三种载体和HEK293FT细胞培养4小时。
在利用慢病毒载体转染的HEK293FT中确认是否表达CD22特异性嵌合抗原受体的结果(图4的B部分)，如图5所示，确认抗CD22抗体正常表达。
实施例5
制备CD22嵌合抗原受体T细胞
在本发明中，将在上述实施例4中制备的CD22嵌合抗原受体慢病毒载体转化到T细胞来分别制备基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的CD22嵌合抗原受体T细胞。
具体地，如图7所示的示意图，在血液中分离外周血液单核细胞后，使用T细胞活化珠(T cell activation bead；Miltenyl Biotec,cat#130-091-441)来活化T细胞。向活化的T细胞转导在上述实施例4中制备的CD22嵌合抗原受体慢病毒来制备了CD22嵌合抗原受体T细胞。
通过流细胞分析(Flow Cytometry)方法确认了CD22嵌合抗原受体T细胞的CD22肽结合能力。利用抗CD3、抗CD4、抗CD8抗体将在上述中制备的CD22嵌合抗原受体T细胞(2G1(V4)及2G1(V12))分别分类为CD3、CD4或CD8活化的CD22嵌合抗原受体T细胞后，与FITC-CD22肽反应后，使用流式细胞仪测量了荧光强度。
结果，如图8所示，确认CD3、CD4或CD8活化的CD22嵌合抗原受体T细胞均与CD22肽结合。
实施例6
确认对于CD22表达细胞的CD22嵌合抗原受体T细胞的杀伤效果
在本发明中，确认了基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的CD22嵌合抗原受体T细胞对于靶细胞的杀伤效果。
利用不表达CD22的K562细胞(人红白血病细胞系(human erythroleukemic cellline))、表达CD22的U2932细胞(B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma))及NALM6细胞(人B细胞前体白血病(human B cell precursor leukemia))作为靶细胞，以与CD22嵌合抗原受体T细胞成为1∶4、1∶2、1∶1、1∶0.5及1∶0.25比例的方式分别混合来培养8小时后，测量发光(CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay,Promega,cat.NO G9291)。使用测量的值并利用下述数学式1来计算了细胞死亡程度。
数学式1：
％细胞毒性(Cytotoxicity)＝[(实验(Experimental)-效应自发(EffectorSpontaneous)-靶自发(Target Spontaneous))/(靶最大值(Target Maximum)-靶自发(Target Spontaneous))]×100
实验：从靶细胞及嵌合抗原受体T细胞复合培养的培养基导出的发光(Luminescence)值
效应自发：仅从嵌合抗原受体T细胞的培养基导出的发光值
靶自发：仅从靶细胞的培养基导出的发光值
靶最大值：从靶细胞的100％裂解(利用裂解试剂(Lysis Reagent))导出的发光值
结果，如图9及图10所示，确认基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的CD22嵌合抗原受体T细胞特异性杀死表达CD22的U2932细胞及NALM6细胞。
在本发明中，通过上述实验确认了基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的CD22嵌合抗原受体T细胞特异性杀死源自弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cellLymphoma)的U2932细胞及源自急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)的NALM6细胞。
即，本发明的基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的嵌合抗原受体及利用其的嵌合抗原受体T细胞可有用地用作用于预防或治疗与B细胞或CD22表达相关的疾病的组合物。
实施例7
制备靶向CD19/CD22的双特异性嵌合抗原受体表达载体
通过与上述实施例4相同的方法制备了表达靶向CD19及CD22的双特异性嵌合抗原受体的慢病毒载体(CD19xCD22嵌合抗原受体慢病毒)。
如图11的示意图所示，在体外合成由EF1α启动子(SEQ ID NO:29)、编码信号肽的多核苷酸(SEQ ID NO:30)、编码CD19/CD22结合域的多核苷酸、编码CD8铰链区的多核苷酸(SEQ ID NO:31)、编码跨膜结构域的多核苷酸(SEQ ID NO:32)、编码4-1BB(共刺激域)的多核苷酸(SEQ ID NO:33)、编码CD3ζ(细胞内信号转导结构域)的多核苷酸(SEQ ID NO:34)及编码土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件的多核苷酸(SEQ ID NO:35)组成的嵌合抗原受体脱氧核糖核酸，并插入到第三代慢病毒载体。
在本发明中，CD19结合域利用公知的抗CD19抗体(FMC63)，CD22结合域利用本发明的2G1抗体、2G1(V4)抗体及2G1(V12)抗体。
上述CD19xCD22结合域以与CD19特异性结合的抗体的轻链可变区(CD19VL)-与CD22特异性结合的抗体的重链可变区(CD22VH)-与CD22特异性结合的抗体的轻链可变区(CD22VL)-与CD19特异性结合的抗体的重链可变区(CD19VH)顺序连接(环嵌合抗原受体(LoopCAR))，编码它们的多核苷酸的序列信息如下：CD19x2G1，由SEQ ID NO:50的碱基序列表示的CD19VL-由SEQ ID NO:52的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物1)-由SEQ ID NO:9的碱基序列表示的CD22VH-由SEQ ID NO:55的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物6)-由SEQ ID NO:10的碱基序列表示的CD22VL-由SEQ ID NO:53的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物1)-由SEQ ID NO:49的碱基序列表示的CD19VH；CD19x2G1(V4)，由SEQ ID NO:50的碱基序列表示的CD19VL-由SEQ ID NO:52的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物1)-由SEQ ID NO:13的碱基序列表示的CD22VH-由SEQ ID NO:55的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物6)-由SEQ ID NO:14的碱基序列表示的CD22VL-由SEQ ID NO:53的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物1)-由SEQ ID NO:49的碱基序列表示的CD19VH；CD19x2G1(V12)，由SEQ ID NO:50的碱基序列表示的CD19VL-由SEQ ID NO:52的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物1)-由SEQ ID NO:17的碱基序列表示的CD22VH-由SEQ ID NO:55的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物6)-由SEQ ID NO:18的碱基序列表示的CD22VL-由SEQ ID NO:53的碱基序列表示的衔接物(图11的衔接物1)-由SEQ ID NO:49的碱基序列表示的CD19VH。
慢病毒载体与pMDLg/pRRE(Addgene,cat##12251)、pMD2.G(Addgene,cat##12259)、pRSV-Rev(Addgene,cat##1225)的三种载体一同利用HEK293FT细胞共转染后，生产CD19/CD22嵌合抗原受体慢病毒。为了共转染，使用Lipofectamine 3000transfection kit(Invitrogen,cat#L3000-015)和Opti-MEM+GlutaMAX(gibco,cat#51985-034)培养基来将三种载体和HEK293FT细胞培养4小时。
在利用慢病毒载体转染的HEK293FT中确认是否表达CD19xCD22特异性嵌合抗原受体的结果，如图13及图14所示，确认抗CD19/抗CD22抗体正常表达。
实施例8
制备CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞
在本发明中，通过与实施例5相同的方法将在上述实施例7中制备的CD19xCD22嵌合抗原受体慢病毒载体转化到T细胞来分别制备CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞即CD19x2G1、C19x2G1(V4)及CD19x2G1(V12)。
通过流细胞分析方法确认了CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的CD22肽结合能力。利用抗CD3、抗CD4、抗CD8抗体将CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞(CD19x2G1、CD19x2G1(V4)及CD19x2G1(V12))分别分类为CD3、CD4或CD8活化的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞后，与PE-CD19肽及FITC-CD22肽反应，并利用流细胞分析仪测量了荧光强度。
结果，如图16a至图16c所示，确认CD3、CD4或CD8活化的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞均与CD19肽及CD22肽同时结合。
实施例9
确认CD22表达细胞中的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞活化
在本发明中，为了确认在上述实施例8中制备的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞是否CD22表达细胞特异性活化，在靶细胞的存在下，确认了通过CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的干扰素γ表达程度。
靶细胞利用不表达CD19及CD22的K562细胞(ATCC，cat#CCL-243)及表达CD19及CD22的NALM6细胞(人类B细胞前体白血病)，将CD19/CD22嵌合抗原受体T细胞与靶细胞以2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1的比例反应规定时间后，利用表面和内部抗体(surface&intraantibody)染色并通过流细胞分析仪测量(干扰素r，CD4、CD8染色)。
结果，如图17a至图17c所示，确认了在不表达CD19及CD22的K562细胞中，T细胞未活化，相反，在表达CD19及CD22的NALM6细胞的存在下，T细胞活化来使干扰素γ表达增加。
实施例10
确认对于CD22或CD19表达细胞的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的杀伤效果
在本发明中，确认了基于人源化抗CD22抗体(2G1(V4)及2G1(V12))的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞对于靶细胞的杀伤效果。
利用不表达CD19及CD22的K562细胞(人红白血病细胞系)和表达CD19及CD22的NALM6细胞(人B细胞前体白血病)作为靶细胞，以与CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞成为1∶4、1∶2、1∶1、1∶0.5及1∶0.25比例的方式分别混合来培养8小时后，测量发光(CytoTox-GloCytotoxicity Assay,Promega,cat#G9291)。使用测量的值并利用实施例6的数学式1来计算了细胞死亡程度。
结果，如图18a所示，确认了基于源自小鼠的2G1的CD19x2G1嵌合抗原受体T细胞、基于2G1的人源化抗体的CD19x2G1(V4)嵌合抗原受体T细胞和基于2G1的其他人源化抗体的CD19x2G1(V12)嵌合抗原受体T细胞特异性杀伤表达CD22和CD19的NALM6细胞。
在本发明中，将不表达CD19和CD22的K562细胞(ATCC，cat#CCL-243)制备为表达CD19或CD22或CD19xCD22的三种细胞K562/CD19+、K562/CD22+、K562/CD19+/CD22+，确认了基于人源化抗体的CD19x2G1(V4)嵌合抗原受体T细胞对于靶细胞的杀伤效果。结果，如图18b所示，确认CD19x2G1(V4)嵌合抗原受体T细胞特异性杀死表达CD22或CD19或CD19/CD22的细胞。
实施例11
确认动物模型中的CD19/CD22嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果
在本发明中，利用异种移植肿瘤细胞的小鼠模型确认了CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果。
向9周龄的NOD/SCID小鼠通过静脉注射注入1×106个的NALM6/Luc细胞后，在第5天，通过静脉注射分别注入低数量(Low)0.5×106个、中间数量(medium)1×106个、高数量(high)5×106个的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞，作为阳性对照组，注入1.25×107个的帕利珠单抗嵌合抗原受体T细胞。在注入细胞后的第3天、第8天、第15天、第22天及第29天，利用IVIS SpectrumCT体外拍摄在NAML6/Luc的细胞中表达的发光(luminescence)，并通过抑制NALM6/Luc细胞的增殖来观察到抗肿瘤效果。
结果，如图19a所示，与用作阳性对照组的源自与SV40病毒结合的抗体帕利珠单抗的scFv的帕利珠单抗嵌合抗原受体T细胞和未注入嵌合抗原受体T细胞的动物组相比，确认了本发明的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤效果优秀，当将CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞处理为5×106个以上时，确认大部分肿瘤细胞被杀死并未观察到注入嵌合抗原受体T细胞并表达发光至29天为止的肿瘤细胞。
将这种结果在图19b以存活率曲线示出的结果，确认了注入中间数量(medium)1×106、高数量(high)5×106的CD19xCD22嵌合抗原受体T细胞的小鼠均存活至29天为止。

Claims (12)

1.一种与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段，其特征在于，包括：
由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者
由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。
2.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1所述的与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段。
3.一种载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段的多核苷酸。
4.一种重组细胞，其特征在于，用于生产利用权利要求3所述的载体转化的与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段。
5.一种靶向CD22的嵌合抗原受体，为包含CD22结合域、跨膜结构域、共刺激域以及细胞内信号转导结构域的嵌合抗原受体，其特征在于，
上述CD22结合域为与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段，
上述与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段包括：
由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示的轻链可变区；或者
由SEQ ID NO:15的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的轻链可变区。
6.根据权利要求5所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，
上述跨膜结构域为选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152及PD1组成的组中的蛋白质，
共刺激域为选自由CD28、4-1BB、OX-40及ICOS组成的组中的蛋白质，
上述信号转导结构域为CD3ζ。
7.根据权利要求5所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，在上述结合域的C末端与跨膜结构域的N末端之间还包含铰链区。
8.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求5至7中任一项所述的嵌合抗原受体。
9.一种载体，其特征在于，包含编码权利要求5至7中任一项所述的嵌合抗原受体的多核苷酸。
10.一种免疫效应细胞，其特征在于，包含：
多核苷酸，编码权利要求5至7中任一项所述的嵌合抗原受体；或者
载体，包含编码权利要求5至7中任一项所述的嵌合抗原受体的多核苷酸。
11.一种用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物，其特征在于，包含：
权利要求1所述的与CD22特异性结合的人源化抗体或其片段；或者
权利要求10所述的免疫效应细胞。
12.根据权利要求11所述的用于预防或治疗由B细胞介导的疾病的药学组合物，其特征在于，上述由B细胞介导的疾病选自由肿瘤、淋巴瘤、非霍金斯淋巴瘤、侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性侵袭性非霍金斯淋巴瘤、复发性延迟性非霍金斯淋巴瘤、难治性非霍金斯淋巴瘤、难治性延迟性非霍金斯淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤及套细胞淋巴瘤组成的组中。
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