KR20190133017A - 개선된 항원 결합 수용체 구성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 종양 연관 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 구성의 항원 결합 수용체에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 종양 세포의 표면 상의 항원에 효율적이고 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항원 결합 수용체, 및 그 항원 결합 수용체로 형질감염/형질도입된 T 세포에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정한 질환의 치료를 위한 방법에서 T 세포의 생성 및 용도를 비롯하여 본 발명의 항원 결합 수용체 및/또는 T 세포를 포함하는 약학 조성물/약물을 제공한다.
Description
본 발명은 일반적으로 종양 연관 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 구성의 항원 결합 수용체에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 종양 세포의 표면 상의 항원과 효율적이고 특이적으로 결합/상호작용하는 항원 결합 수용체, 및 항원 결합 수용체로 형질감염/형질도입된 T 세포에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정한 질환의 치료를 위한 방법에서 T 세포의 생성 및 용도를 비롯하여 본 발명의 항원 결합 수용체 및/또는 T 세포를 포함하는 약학 조성물/약물을 제공한다.
양자 T 세포 요법 (ACT)은 암-특이적 T 세포를 사용하는 강력한 치료 접근법이다 (Rosenberg and Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). ACT는 키메라 항원 수용체를 사용하는 유전자 조작에 의해 특이적으로 만든 T 세포 또는 자연 발생 종양-특이적 세포를 사용할 수 있다 (Rosenberg and Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). ACT는 후기 및 아니면 난치성 질환 예컨대 급성 림프성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 흑색종을 앓는 환자에서도 성공적으로 치료할 수 있고 차도를 유도할 수 있다 (Dudley et al., J Clin Oncol 26(32) (2008), 5233-5239; Grupp et al., N Engl J Med 368 (16) (2013), 1509-1518; Kochenderfer et al., J Clin Oncol. (2015) 33(6):540-549, doi: 10.1200/JCO.2014.56.2025. Epub 2014 Aug 25).
그러나, 인상적인 임상 효능에도 불구하고, ACT는 또한 도입된 키메라 항원 수용체의 벗어난 효과 또는 건강한 조직 내 표적 항원의 발현으로 인해 생명-위협적 독성을 초래할 수 있다. 실제로, 대부분의 표적화 항원은 종양-연관되지만 완전히 종양-선택적인 것은 아니다. 결과적인 표적-외 효과는 몇몇 실험에서 심각한 독성을 초래하였는데, 예를 들어 암 세포에 의해 고도로 발현되지만 건강한 세포에서는 낮은 수준인 ErbB2를 표적화하는 CAR T 세포는 심폐 상피에 대해 급성 독성을 야기시켰다 (Morgan et al., Mol Ther 18 (2010), 843-851). 현재 평가된 독성을 극복하기 위한 한가지 전략은 표적 항원에 대한 CAR 친화성의 감소이다. 그러나, 이들 접근법도 역시 의도하는 작용 부위에서 ACT의 효능을 제한할 수 있다.
추가적으로, ACT는 종양 부위에서 축적되면, T 세포 반응은 다양한 수단에 의해 억제된다는 사실로 인해 더욱 제한적이다. 종양 미세환경은 억제자 세포, 종양 또는 기질 세포로부터 분비된 가용성 인자 및 영양 고갈에 의해 효율적인 침윤을 방지할 수 있다. 게다가, T 세포는 활성화되면, 예를 들어 세포독성 T 림프구-연관 항원-4 (CTLA-4) 및 프로그램된 세포 사멸-1 (PD-1)을 포함한 T 세포 반응을 억제하는 다수의 면역 억제성 수용체를 발현한다. 향후 임상 모델은 종양 특이성 및 세포독성을 유지하면서 T 세포 억제에 대응하고 극복하는 것이 필요하다.
따라서, 표적화 종양 요법, 특히 양자 T 세포 요법은 암 환자의 필요를 충족시키기 위해서 여전히 보다 차별화된 도구를 필요로 한다. 따라서, ACT의 안전성 및 효능을 개선시키고 상기 단점들을 극복할 잠재성을 갖는 새로운 수단을 제공하는 것이 여전히 요구된다.
본 발명은 일반적으로 별개 표적, 즉 종양 연관 항원 (TAA)에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 항원 결합 수용체 및 이들 항원 결합 수용체를 발현하는 T 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 표적 세포, 즉 종양 세포에 하나 이상의 항원 결합 수용체의 결합 시 T 세포의 강력하고 선택적인 활성화를 야기시킨다.
일 양상에서 본 발명은 앵커링 경막 도메인, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이고, 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다.
일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다.
일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이고, 특히 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이고, 특히 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인 또는 이의 단편이고, 특히, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체은 CD3z의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 항원 결합 수용체은 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하고, 공자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포외 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서 앵커링 경막 도메인에 연결된다.
일 실시형태에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:20)을 포함한다.
일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 임의로 펩티드 링터를 통해서, 공동-신호전달 도메인 또는 신호전달 도메인에 연결된다.
일 실시형태에서, 신호전달 및/또는 공동-신호전달 도메인은 임의로 적어도 하나의 펩티드 링커를 통해서 연결된다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 중쇄 불변 (CH) 도메인 및 경쇄 불변 도메인 (CL)을 포함하고, 여기서 CH 도메인 또는 CL 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서, C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에 연결된다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체은 하나의 공동-신호전달 도메인을 포함하고, 공동-신호전달 도메인은 N-말단에서 앵커링 경막 도메인의 C-말단에 연결된다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 추가적으로 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 자극성 신호전달 도메인은 N-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 C-말단에 연결된다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원, 또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 테나신 (TNC) 및 프로그램된 사멸-리간드 1(PDL1)로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) (d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:12의 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:10의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:36 및 SEQ ID NO:41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20과 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1과 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) (d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1과 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:78의 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:77의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:78의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:77의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1과 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:74 및 SEQ ID NO:85로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:76 및 SEQ ID NO:75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1과 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:79 및 SEQ ID NO:82로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:81 및 SEQ ID NO:84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1과 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CEA와 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 EFGMN (SEQ ID NO:138);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WINTKTGEATYVEEFKG (SEQ ID NO:139); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 WDFAYYVEAMDY (SEQ ID NO:140)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 KASAAVGTYVA (SEQ ID NO:141);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASYRKR (SEQ ID NO:142); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 HQYYTYPLFT (SEQ ID NO:143)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CEA와 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DTYMH (SEQ ID NO:148);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIDPANGNSKYVPKFQG (SEQ ID NO:149); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 FGYYVSDYAMAY (SEQ ID NO:150)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RAGESVDIFGVGFLH (SEQ ID NO:151);
(e) CDR L2 아미노산 서열 RASNRAT (SEQ ID NO:152); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQTNEDPYT (SEQ ID NO:153)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 실시형태에서, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 코딩하는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물을 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질도입된 T 세포, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 벡터를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는
(i) Fab (VH-CH-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체;
(ii) Fab (VL-CL-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체;
(iii) crossFab (VL-CH-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체; 및
(iv) crossFab (VH-CL-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 세포는본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 Fab (VH-CH-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 Fab (VL-CL-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 crossFab (VL-CH-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 crossFab (VH-CL-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 scFab 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 scFv, Fab 또는 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원, 또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원, 또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 제1 종양 연관 항원 (TAA)에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 세포는 TAA에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1)에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 세포는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 및 테나신 (TNC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 세포는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 세포는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 형질도입된 T 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)가 공동-형질도입된다.
일 실시형태에서, 약물로서 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공한다.
일 실시형태에서, 악성 질환의 치료에서 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 치료는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 사용을 위한 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 사용을 위한 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 형질도입된 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 단리된 세포로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 사용을 위한 형질도입된 T 세포를 제공하고, 여기서 형질도입된 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 단리된 세포로부터 유래되지 않는다.
일 실시형태에서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 추가적으로 대상체로부터 T 세포를 단리하는 단계, 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 벡터를 단리된 T 세포에 형질도입시켜 형질도입된 T 세포를 생성시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 구성체 또는 비바이러스 벡터 구성체가 형질도입된다. 일 실시형태에서, 비바이러스 벡터 구성체는 슬리핑 뷰티 미니서클 벡터이다. 일 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 정맥내 주입을 통해서 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여 전에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉된다. 일 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여 전에 적어도 하나의 사이토카인, 바람직하게 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-15 (IL-15), 및/또는 인터루킨-21, 또는 이의 변이체와 접촉된다. 일 실시형태에서, 질환은 악성 질환이다. 일 실시형태에서, 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 표적 세포의 용해를 유도시키기 위한 방법을 제공하고, 방법은 표적 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 발현한다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 테나신 (TNC), 및 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1)로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 발현한다.
일 실시형태에서, 약물의 제조를 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포의 용도를 제공한다. 일 실시형태에서, 약물은 악성 질환의 치료를 위한 것이다. 일 실시형태에서, 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
도 1은 본 발명의 상이한 항원 결합 수용체 구성, 특히 Fab, crossFab 및 scFab 구성의 아키텍처를 도시한다. 도 1A는 Fab 구성의 아키텍처를 도시한다. Ig 중쇄 및 Ig 경쇄로 이루어진 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이 도시되어 있다. 중쇄에 부착되어, 링커는 항원 인식 도메인을 자극성 신호전달 도메인 (SSD)과 융합시킨 세포내 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)에 융합된 앵커링 경막 도메인 (ATD)과 연결시킨다. 도 1B는 중쇄 및 경쇄가 교환된 Fab 구성의 아키텍처를 도시한다. Ig 중쇄 및 Ig 경쇄로 이루어진 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이 도시되어 있다. 경쇄 불변 도메인에 부착되어, 링커는 항원 인식 도메인을 자극성 신호전달 도메인 (SSD)와 융합시킨 세포내 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)와 융합된 앵커링 경막 도메인 (ATD)과 연결시킨다. 도 1C는 scFab 구성의 아키텍처를 도시한다. 그 둘 모두가 링커에 의해 연결된 Ig 중쇄 및 Ig 경쇄로 이루어진 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이 도시되어 있다. 중쇄에 부착되어, 링커는 항원 인식 도메인을 자극성 신호전달 도메인 (SSD)과 융합시킨 세포내 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)에 융합된 앵커링 경막 도메인 (ATD)과 연결시킨다. 도 1D는 VH-VL 교환된 crossFab 구성의 아키텍처를 도시한다. Ig 중쇄 및 Ig 경쇄로 이루어진 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이 도시되어 있고, 여기서 VH 및 VL 도메인은 교환된다. 중쇄 불변 도메인에 부착되어, 링커는 항원 인식 도메인을 자극성 신호전달 도메인 (SSD)과 융합시킨 세포내 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)에 융합된 앵커링 경막 도메인 (ATD)과 연결시킨다. 도 1E는 CH-CL 교환된 crossFab 구성의 아키텍처를 도시한다. Ig 중쇄 및 Ig 경쇄로 이루어진 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이 도시되어 있고, 여기서 CH 및 CL 도메인은 교환된다. 경쇄 불변 도메인에 부착되어, 링커는 항원 인식 도메인을 자극성 신호전달 도메인 (SSD)과 융합시킨 세포내 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)에 융합된 앵커링 경막 도메인 (ATD)과 연결시킨다. 도 1F는 그 둘 모두가 링커에 의해 연결된, 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 이루어진, 세포외 항원 인식 도메인을 갖는 고전적인 scFv 구성의 아키텍처를 도시한다. 가변 경쇄에 부착되어, 링커는 항원 인식 도메인을 자극성 신호전달 도메인 (SSD)과 융합시킨 세포내 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)에 융합된 앵커링 경막 도메인 (ATD)과 연결시킨다.
도 2는 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 예시적인 발현 구성체의 모듈식 조성물을 예시하는 개략도를 도시한다. 도 2A 및 도 2B는 예시적인 Fab 구성을 도시한다. 도 2C는 예시적인 scFab 구성을 도시한다. 도 2D 및 도 2E는 예시적인 crossFab 구성을 도시한다. 도 2F는 고전적인 scFv 구성을 도시한다.
도 3은 저카트 (Jurkat) NFAT T 세포 리포터 어세이의 개략도를 도시한다. 종양 연관 항원 (TAA)은 항-TAA 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인식될 수 있다. 이러한 인식은 발광도 (cps)를 측정하여 검출할 수 있는 세포의 활성화를 야기시킨다.
도 4는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론이 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 5는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 풀이 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 6은 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 풀이 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 7은 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 8은 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 사멸 어세이를 도시한다. 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 2는 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 예시적인 발현 구성체의 모듈식 조성물을 예시하는 개략도를 도시한다. 도 2A 및 도 2B는 예시적인 Fab 구성을 도시한다. 도 2C는 예시적인 scFab 구성을 도시한다. 도 2D 및 도 2E는 예시적인 crossFab 구성을 도시한다. 도 2F는 고전적인 scFv 구성을 도시한다.
도 3은 저카트 (Jurkat) NFAT T 세포 리포터 어세이의 개략도를 도시한다. 종양 연관 항원 (TAA)은 항-TAA 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인식될 수 있다. 이러한 인식은 발광도 (cps)를 측정하여 검출할 수 있는 세포의 활성화를 야기시킨다.
도 4는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론이 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 5는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 풀이 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 6은 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 풀이 이펙터 세포로서 사용되었다.
도 7은 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 도시한다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 8은 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포를 사용한 사멸 어세이를 도시한다. 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하였다.
정의
용어는 하기에서 달리 정의하지 않으면, 당분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본 명세서에서 사용된다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 관여 이후에 수용체-보유 세포를 자극하여 이펙터 기능을 수행하게 하는 신호전달 사건을 유발시키는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), 및 FcαRI (CD89)를 포함한다.
항체-의존적 세포-매개 세포독성 ("ADCC")은 면역 이펙터 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 야기시키는 면역 기전이다. 표적 세포는 일반적으로 Fc 영역의 N-말단인 단백질 부분을 통해서, Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 특이적으로 결합하는 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "감소된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 기전에 의해 표적 세포 주변 배지 중 항체의 소정 농도에서, 소정 시점에 용해되는 표적 세포의 개수의 감소, 및/또는 ADCC의 기전에 의해 소정 시점에 표적 세포의 소정 개수의 용해를 달성하는데 요구되는 표적 세포 주변의 배지 중 항체의 농도 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 돌연변이되지 않았지만, (당업자에게 공지된) 동일한 표준 제조, 정제, 제제화 및 저장 방법을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되는 동일 항체에 의해 매개된 ADCC에 대한 것이다. 예를 들어, ADCC를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 이의 Fc 도메인에 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC의 감소는 Fc 도메인 내 이러한 아미노산 돌연변이가 없는 동일 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해서이다. ADCC를 측정하기 위한 적합한 어세이는 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831).
작용제의 "유효량"은 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기시키는데 필요한 양을 의미한다.
"친화성"은 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 수용체) 및 이의 결합 파트너 (예를 들어, 리간드) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 표시하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 "결합 친화성"은 결합쌍의 구성원 (예를 들어, 항원 결합 모이어티 및 항원 및/또는 수용체 및 이의 리간드) 간 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 의미한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 및 결합 속도 상수 (각각 koff 및 kon)의 비율인, 해리 상수 (KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 당량의 친화성은 속도 상수의 비율이 동일하게 남아있는 한, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본 명세서에 기술된 것들을 포함하여, 당분야에 공지된 충분히-확립된 방법으로 측정될 수 있다. 친화성을 측정하기 위해 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명법 (SPR)이고 측정에 바람직한 온도는 25℃이다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산을 비롯하여, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것을 비롯하여, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린으로 이후에 변형되는 아미노산이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산으로서 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조는 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다. 아미노산은 그들의 통상적으로 공지된 3글자 기호를 통해서 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회가 추천하는 1글자 기호를 통해 본 명세서에서 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하는 의미이다. 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의 조합은 최종 구성체에 도달하게 할 수 있고, 단 최종 구성체는 바람직한 특징을 보유한다. 아미노산 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어, 항원 결합 모이어티의 결합 특징을 변경하기 위한 목적을 위해, 비보존성 아미노산 치환, 즉 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비천연 발생 아미노산 또는 20개 표준 아미노산의 천연 발생 아미노산 유도체 (예를 들어, 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록시리신)에 의한 치환을 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당분야에 충분히 공지된 유전자 또는 화학 방법을 사용해 생성시킬 수 있다. 유전자 방법은 부위-지정 돌연변이유발법, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 방법에 의한 아미노산의 측쇄 기를 변경시키는 방법, 예컨대 화학적 변형이 또한 유용할 수 있다는 것을 고려한다. 동일한 아미노산 돌연변이를 표시하기 위해 본 명세서에서 다양한 명명법이 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329의 프롤린의 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되고, 제한없이 그들이 바람직한 항원-결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다클론 항체 및 항체 단편을 포함한, 다양한 항체 구조를 포괄한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 항체는 전체 면역글로불린 분자를 비롯하여 이러한 면역글로불린 분자의 일부에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 이 용어는 본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 변형 및/또는 변경된 항체 분자, 특히 돌연변이된 항체 분자에 관한 것이다. 이 용어는 또한 재조합적으로 또는 합성적으로 생성/합성된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 항체는 용어 면역글로불린과 상호교환적으로 사용된다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 제한없이 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv 또는 scFab), 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 일정한 항체 단편의 고찰을 위해서, 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 고찰을 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조하고, 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 출원 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 디아바디는 2가 또는 이특이적일 수 있는 2개 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]를 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하는 항체 단편이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조). 항체 단편은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제한없이 온전한 항체의 단백질가수분해적 분해를 비롯하여 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함한, 다양한 기술로 제조될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자"는 이의 광범위한 의미로 항원성 결정부에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 유도체, 예를 들어 이의 단편을 비롯해 항원 결합 수용체 및 이의 유도체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원성 결정부에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 의미한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 이것이 부착된 독립체 (예를 들어, 면역글로불린 또는 항원 결합 수용체)가 표적 부위, 예를 들어 항원성 결정부를 보유하는 특별한 유형의 종양 세포 또는 종양 기질 또는 종양 세포 상의 항원 결정부에 결합되는 면역글로불린에 대해 유도될 수 있게 한다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 이의 표적 항원을 통해서 신호전달을 활성화시킬 수 있고, 예를 들어 신호전달은 T 세포 상의 항원 결합 수용체와 항원성 결정부의 결합 시에 활성화된다. 본 발명의 맥락에서, 항원 결합 모이어티는 본 명세서에 더욱 정의되는 바와 같은 항체 및 이의 단편을 비롯하여 항원 결합 수용체 및 이의 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 도메인을 포함한다. 일정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 본 명세서에서 더욱 정의되고 당분야에 공지된 바와 같은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5개 이소타임 중 어느 하나를 포함한다: α, δ, ε, γ, 또는 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 2개 이소타입 중 어느 하나를 포함한다: κ 및 λ.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항원 결합 수용체"는 앵커링 경막 도메인, 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 항원 결합 수용체는 상이한 공급원 유래의 폴리펩티드 부분으로 만들어질 수 있다. 따라서, 또한 "융합 단백질" 및/또는 "키메라 단백질"로서 이해할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 본래 개별 단백질을 코딩하는 둘 이상의 유전자 (또는 바람직하게 cDNA)의 연결을 통해 생성된 단백질이다. 이러한 융합 유전자 (또는 융합 cDNA)의 번역은 바람직하게 본래 단백질 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩티드를 생성시킨다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료법에서 사용을 위한 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성된다. 본 발명의 항원 결합 수용체에 대한 추가의 상세한 설명은 하기 본 명세서에 기술되어 있다. 본 발명의 맥락에서, CAR (chimeric antigen receptor)은 그 자체가 CD3z 및 CD28의 세포내 신호전달 도메인과 융합된 앵커링 경막 도메인에 스페이서 서열에 의해 융합된 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 부분을 포함하는 항원 결합 수용체로 이해된다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위 또는 항원 결합 수용체는 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab, crossFab, scFab 또는 scFv 분자는 전형적으로 1개의 항원 결합 부위를 갖는다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부분 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부분 또는 항원 결합 수용체를 의미한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인 (또한 가변 영역이라고도 함)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원과의 결합에 관여하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존성 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co, page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 일반적으로 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ATD"는 세포의 세포막(들)으로 통합될 수 있는 폴리펩티드 스트렛치를 한정하는 "앵커링 경막 도메인"을 의미한다. ATD는 세포외 및/또는 세포내 폴리펩티드 도메인에 더욱 융합될 수 있고 이들 세포외 및/또는 세포내 폴리펩티드 도메인은 역시 세포막에 한정될 것이다. 본 발명의 항원 결합 수용체의 문맥에서, ATD는 본 발명의 항원 결합 수용체의 한정 및 막부착을 부여한다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 ATD, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 추가로, ATD는 추가의 세포내 신호전달 도메인에 융합될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 수용체의 문맥에서 사용되는 용어 "∼에 결합하는"은 "항원-상호작용-부위" 및 서로의 항원의 결합 (상호작용)을 정의한다. 용어 "항원-상호작용-부위"는 본 발명의 항원 결합 수용체에 따라서, 특별한 항원 또는 특별한 항원 그룹과 특이적 상호작용하는 능력을 보이는 폴리펩티드의 모티프를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해한다. 용어 "특이적으로 인식하는"은 본 발명에 따라서 항원 결합 수용체가 본 명세서에서 정의하는 바와 같은 종양 연관 항원 (TAA)과 특이적으로 상호작용할 수 있고/있거나 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 항원 결합 수용체의 항원 결합 모이어티는 동일한 분자 상의 항이한 에피토프를 인식할 수 있고/있거나, 상호작용할 수 있고/있거나 결합할 수 있다. 이 용어는 항원 결합 수용체의 특이성, 즉 본 명세서에 정의된 바와 같은 분자의 특별한 영역들을 구별하는 이의 능력에 관한 것이다. 이의 특별한 항원과 항원-상호작용-부위의 특이적 상호작용은 그 결과로 예를 들어 항원을 포함하는 폴리펩티드의 입체형태의 변화 유도, 항원을 포함하는 폴리펩티드의 올리고머화, 항원 결합 수용체의 올리고머화 등에 기인하여, 신호의 개시를 일으킬 수 있다. 따라서, 항원-상호작용-부위의 아미노산 서열의 특별한 모티프 및 항원은 그들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과를 비롯하여 상기 구조의 이차적 변형의 결과로서 서로 결합된다. 따라서, 용어 ∼에 결합하는은 선형 에피토프에 관한 것뿐만 아니라 또한 입체구성적 에피토프, 구조적 에피토프, 또는 표적 분자의 2개 영역 또는 이의 일부분으로 이루어진 불연속 에피토프에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 입체구성적 에피토프는 폴리펩티드가 천연 단백질로 폴딩될 때 분자의 표면 상에 함께 오게되는 1차 서열에서 떨어져 있는 둘 이상의 개별 아미노산 서열에 의해 정의된다 (Sela, Science 166 (1969), 1365 및 Laver, Cell 61 (1990), 553-536). 게다가, 용어 "∼에 결합하는"은 용어 "∼와 상호작용하는"과 본 발명의 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 특별한 표적 항원성 결정부에 결합하는 항원 결합 수용체 또는 항체의 항원 결합 모이어티 (예를 들어, Fab, crossFab, scFab 또는 scFv 도메인)의 능력은 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 장비에서 분석) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 어세이 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))를 통해서 측정될 수 있다. 일 실시형태에서, 미관련된 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는 특히 SPR에 의해 측정되는 표적 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10% 미만이다. 일정한 실시형태에서, 표적 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 본 발명에 따라 사용되는 용어 "특이적 결합"은 본 발명의 분자가 유사한 구조의 (폴리-) 펩티드와 교차 반응하지 않거나 또는 본질적으로 교차 반응하지 않는 것을 의미한다. 조사 중인 구성체의 패널의 교차-반응성은 예를 들어 관심 항원을 비롯하여 미관련 항원에 대해 통상의 조건 하에서 항원 결합 모이어티의 패널의 결합을 평가하여 시험될 수 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)] 및 [Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)]). 관심 항원에 결합하지만 미관련 항원에는 결합하지 않거나 또는 본질적으로 결합하지 않는 구성체 (즉, Fab 단편, scFv 등)만이 관심 항원에 특이적인 것으로 간주되고 본 명세서에 제공된 방법에 따른 추가 실험에 선택된다. 이들 방법은 특히 구조적으로 및/또는 기능적으로 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 의한 결합 실험, 차단 및 경쟁 실험을 포함할 수 있다. 결합 실험은 또한 FACS 분석, 표면 플라스몬 공명 (SPR, 예를 들어, BIAcore®), 분석적 초원심분리, 등온 적정 열량계, 형광 이방성, 형광 분광법 또는 방사성 표지 리간드 결합 어세이를 포함한다.
본 명세서에서 적용되는 용어 "CDR"은 당분야에 충분히 공지된 "상보성 결정 영역"에 관한 것이다. CDR은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특이적 리간드와 접촉하는 면역글로불린 또는 항원 결합 수용체의 일부분이다. CDR은 분자의 가장 가변적인 부분이고 이들 분자의 항원 결합 다양성에 기여한다. 각각의 V 도메인에 3개의 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3이 존재한다. CDR-H는 가변 중쇄의 CDR 영역을 의미하고 CDR-L은 가변 경쇄의 CDR 영역에 관한 것이다. VH는 가변 중쇄를 의미하고 VL은 가변 경쇄를 의미한다. Ig-유래 영역의 CDR 영역은 "Kabat" (Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) 또는 "Chothia" (Nature 342 (1989), 877-883)에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "CD3z"는 "T-세포 수용체 T3 제타 사슬" 및 "CD247"으로도 알려진, T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 사슬을 의미한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "키메라 수용체" 또는 "CAR"은 CD3z 및 CD28의 세포내 신호전달 도메인에 스페이서 서열에 의해 융합된 항원 결합 모이어티 (예를 들어, scFv 도메인)의 세포외 부분으로 구성된 항원 결합 수용체를 의미한다. 본 발명은 추가로 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다. 용어 "CAR"은 이의 광범위한 형태로 임의로 하나 또는 몇개의 펩티드 링커를 통해서, CD3z 및 이의 단편 및 CD28 및 이의 단편을 포함하는 세포외 부분으로 구성된 항원 결합 수용체를 포함하는 것으로 이해된다.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스"는 이의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 5개의 주요한 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇개는 서브클래스 (이소타입) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 더욱 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ라고 한다.
"crossover Fab 분자" (또한 "crossFab" 또는 "crossover Fab 단편"이라고 함)란 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 분자를 의미하며, 즉 crossFab 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 따라서, crossFab 단편은 중쇄 가변 및 경쇄 불변 영역 (VH-CL)으로 구성된 폴리펩티드, 및 경쇄 가변 및 중쇄 불변 영역 (VL-CH1)으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 명확함을 위해서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 본 명세서에서 중쇄라고 하고 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 본 명세서에서 crossFab 단편의 경쇄라고 한다.
"Fab" 또는 "통상의 Fab" 분자란 이의 천연 구성의, 즉 중쇄 가변 및 불변 영역 (VH-CH1)으로 구성된 중쇄, 및 경쇄 가변 및 불변 영역 (VL-CL)으로 구성된 경쇄를 포함하는, Fab 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CSD"는 공자극성 신호전달 도메인을 의미한다.
용어 "이펙터 기능"은 항체 이소타입에 따라 다양한, 항체의 Fc 영역에 기인한 그들의 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포의 식균작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조작하다", "조작된", "조작하는"은 펩티드 골격의 임의 조작 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작하는은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 개별 아미노산의 측쇄기의 변형을 비롯하여, 이들 접근법의 조합을 포함한다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 엘리먼트와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편에 도입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서도, 전사하려는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일정한 실시형태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"Fab 분자"는 항원 결합 분자의 중쇄 ("Fab 중쇄")의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄 ("Fab 경쇄")의 VL 및 CL 도메인으로 이루어진 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 확장되는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 달리 명시하지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 번호매김은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같이, EU 지수라고도 하는, "EU 번호매김" 체계에 따른다. 본 명세서에서 사용되는 Fc 도메인의 서브유닛은 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개 폴리펩티드 중 하나, 즉 안정하게 자기-회합할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기의 서열로 표시된다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전체 길이 항체"는 2개의 "전체 길이 항체 중쇄" 및 2개의 "전체 길이 항체 경쇄"로 이루어진 항체를 의미한다. "전체 길이 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-HR-CH2-CH3로 축약되는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역 (HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2 (CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3 (CH3); 및 IgE 서브클래스의 항체 경우 임의로 항체 중쇄 불변 도메인 4 (CH4)로 이루어진 폴리펩티드이다. 바람직하게 "전체 길이 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 이루어진 폴리펩티드이다. "전체 길이 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단으로, VL-CL로 축약되는, 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL)으로 이루어진 폴리펩티드이다. 항체 경쇄 불변 도메인 (CL)은 κ (카파) 또는 λ (람다)일 수 있다. 2개의 전체 길이 항체 사슬은 전체 길이 항체 중쇄의 힌지 영역 사이 및 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 폴리펩티드간 디술파이드 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전체 길이 항체의 예는 IgG (예를 들어, IgG 1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD, 및 IgE)와 같은 천연 항체이다
"융합된"이란 성분 (예를 들어, Fab 및 경막 도메인)이 하나 이상의 펩티드 링커를 통해서 또는 직접적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 것을 의미한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 이러한 세포의 자손을 포함하여, 외생성 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 초대 형질전환된 세포 및 계대수와 무관하게 그로부터 유래된 자손을 포함한 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용물이 완전하게 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 명세서에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명에 따라서 사용되는 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 포유동물 배양된 세포, 몇가지만 언급하면, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포뿐만 아니라, 유전자이식 동물, 유전자이식 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직에 포함된 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변이고/이거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")인 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 의미한다. 일반적으로, 천연의 4개-사슬 항체는 6개 HVR을 포함하는데, VH (H1, H2, H3)에 3개, 및 VL (L1, L2, L3)에 3개를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역 (CDR)로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 최고의 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여된다. VH의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역 (HVR)은 또한 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하고, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부분에 대해서 상호교환적으로 본 명세서에서 사용된다. 이러한 특정한 영역은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기술되어 있고, 그 정의는 서로에 대해 비교시 아미노산 잔기의 서브셋 또는 중복을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항원 결합 수용체 또는 이의 변이체 및/또는 항체의 CDR을 언급하는 정의의 적용은 본 명세서에서 정의하고 사용하는 용어의 범주 내에 포함하고자 한다. 상기 인용된 참조 각각에 의해 정의되는 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 기재된다. 특정한 CDR을 포괄하는 정확한 잔기의 수는 CDR의 서열 및 크기에 의존하여 다양할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어지면 어떠한 잔기가 특정한 CDR을 포함하는가를 통상적으로 결정할 수 있다.
Kabat 등은 또한 임의 항체에 적용가능한 가변 영역 서열에 대한 번호매김 체계를 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외에 임의의 실험 데이타에 의존하지 않고, 임의 가변 영역 서열에 대해 이러한 카밧 번호매김 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "카밧 번호매김"은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Servieces, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 기재된 번호매김 체계를 의미한다. 달리 명시하지 않으면, 항원 결합 모이어티 가변 영역 내 특별한 아미노산 잔기 위치의 번호매김에 대한 참조는 카밧 번호매김 체계에 따른다. 서열 목록의 폴리펩티드 서열은 카밧 번호매김 체계에 따라 번호매겨지지 않는다. 그러나, 서열 목록의 서열의 번호매김을 카밧 번호매김으로 전환시키는 것은 당업자의 통상의 기술 내에서 충분하다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 제한없이 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 인간이외의 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된 핵산" 분자 또는 폴리뉴클레오티드란 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예는 이종성 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 용액 중 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 그 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 또는 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 비롯하여, 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 제조된 이러한 분자를 더 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절성 엘리먼트 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95%가 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 달리 말해서, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%가 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서, 기준 서열의 뉴클레오티드의 최대 5%는 결실될 수 있거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5%의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 그룹으로 또는 기준 서열 내 잔기 중에서 개별적으로 산재된, 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 실질적으로, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또 는 99%가 동일한지 여부는 통상적으로 기지의 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩티드에 대해 하기에 논의되는 것 (예를 들어, ALIGN-2)을 사용하여 결정될 수 있다.
"단리된 폴리펩티드" 또는 이의 변이체 또는 유도체란 이의 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 특정한 정제 수준이 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 이의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 천연으로서 또는 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 재조합 폴리펩티드로서, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)"은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 서열 동일성 백분율을 획득하기 위해 갭을 도입하고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환은 고려하지 않은 후에, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당분야의 기술 내에서 다양한 방식으로 획득될 수 있다. 당업자는 비교하려는 서열의 전체 길이 상에서 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위해 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서의 목적을 위해서, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용해 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.가 만들었고, 소스 코드는 미국 저작권 협회 (U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에서 사용자 문서로 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)에서 공공으로 입수가능하거나 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D을 포함하는 UNIX 운용 체계 상에서 사용을 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 가변적이지 않다. ALIGN-2이 아미노산 서열 비교에 적용되는 상황에서, 소정 아미노산 서열 B에 대해, 그와, 또는 그에 대응하는 소정 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성의 % (소정 아미노산 서열 B에 대해, 그와, 또는 그에 대응하는 일정한 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 포함하는 소정 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
여기서 X는 그 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로서 점수매겨진 아미노산 잔기의 수이고 Y는 B의 아미노산 잔기의 총 개수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 갖지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 달리 특별히 명시하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성 %는 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 얻어진다.
용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 의해 포함된 푸린- 및 피리미딘 염기를 포함하는 염기의 서열에 관한 것으로, 상기 염기는 핵산 분자의 1차 구조를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 핵산 분자는 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, DNA의 합성 형태 및 둘 이상의 이들 분자를 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 또한, 용어 핵산 분자는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본 명세서에 기술된 핵산 분자는 당업자가 쉽게 이해하게 되는 바와 같이, 비천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다.
용어 "패키지 삽입부"는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료 제폼의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지시서를 의미하는데 사용된다.
용어 "약학 조성물"은 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가하게 유독한 추가 성분을 함유하지 않는 조제물을 의미한다. 약학 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 (들)를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 무독성인, 활성 성분이외의, 약학 조성물 중 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 제한없이 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (펩티드 결합이라고도 알려짐)을 통해 선형적으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 의미한다. 용어 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산의 임의 사슬을 의미하고, 생성물의 특별한 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 사슬, 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬을 언급하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 폴리펩티드의 정의 내에 포함되고, 용어 폴리펩티드가 임의의 이들 용어 대신에 또는 그와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 폴리펩티드는 또한 제한없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩티드의 발현후 변형의 생성물을 의미하고자 한다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술로 제조될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 화학 합성을 포함하여 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 그들이 반드시 그러한 구조를 가질 필요는 없지만, 정해진 3차원 구조를 가질 수 있다. 정해진 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩되었다고 하고, 정해진 3차원 구조를 갖지 않지만, 대신에 다수의 상이한 입체구성을 채택할 수 있는 것은 언폴딩되었다고 한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구성체, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), 바이러스 유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 통상의 포스포디에스테르 결합 또는 비통상의 결합 (예를 들어, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA)에 존재하는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 핵산 분자는 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 존재하는, DNA 또는 RNA 단편을 의미한다.
"감소된 결합"은 예를 들어 SPR에 의해 측정시 개별 상호작용에 대한 친화성의 감소를 의미한다. 명확함을 위해서 이 용어는 또한 0 (또는 분석 방법의 검출 한계 이하)까지 친화성의 감소, 즉 상호작용의 완전한 제거를 포함한다. 반 대로, "증가된 결합"은 개별 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 의미한다.
용어 "조절 서열"은 그들이 결찰되는 코딩 서열의 발현을 실행하는데 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 의존적으로 상이하다. 원핵생물에서, 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 종결인자를 포함한다. 진핵생물에서 일반적으로 제어 서열은 프로모터, 종결인자, 및 일부 예에서, 인핸서, 트랜스활성인자 또는 전사 인자를 포함한다. 용어 "제어 서열"은 그 존재가 발현에 필수적인 모든 성분을 최소로 포함하고자 하고, 또한 추가의 유리한 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일-사슬"은 펩티드 결합에 의해 선형적으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 의미한다. 일정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 scFv 단편, 즉 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인이다. 일정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일-사슬 Fab 분자이고, 즉 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성하는 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시형태에서, Fab 경쇄 의 C-말단은 단일-사슬 Fab 분자 내 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "SSD"는 자극성 신호전달 도메인을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료" (및 이의 문법적 별형 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료하려는 개체에서 질환의 자연적 과정을 변경시키려는 시도의 임상적 중재술을 의미하고 임상 병리학적 과정 동안 또는 예방학적으로 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 제한없이 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환의 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 세포는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 둔화시키는데 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "표적 항원성 결정부"는 "표적 항원", "표적 에피토프", "종양 연관 항원" 및 "표적 세포 항원"과 동의어이고, 항체가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위 (예를 들어, 아미노산의 인접하는 스트렛치 또는 비인접한 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체구성적 구성)를 의미한다. 유용한 항원성 결정부는 예를 들어 종양 세포의 표면, 바이러스-감염된 세포의 표면, 다른 질환 세포의 표면, 면역 세포의 표면 상에서, 혈류 및/또는 세포외 매트릭스 (ECM)에서 유리되어 존재할 수 있다. 본 명세서에서 항원으로서 언급되는 단백질 (예를 들어, CD20, CEA, FAP, TNC)은 달리 표시하지 않으면 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원 유래 단백질의 임의의 천연 형태일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 표적 항원은 인간 단백질이다. 본 명세서에서 특이적 표적 단백질을 언급하는 경우에, 그 용어는 "전체 길이"의, 미처리된 표적 단백질을 비롯하여 표적 세포에서 처리된 표적 단백질의 임의 형태를 포괄한다. 이 용어는 또한 표적 단백질의 천연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이싱 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적인 인간 표적 단백질은 제한없이 CD20, CEA, FAP, TNC, MSLN, FolR1, HER1 및 HER2를 포함한다. 특이적 표적 항원성 결정부에 결합하는 항원 결합 수용체의 능력은 효소-연결된 면역흡착 어세이 (ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 장비에서 분석) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적 결합 어세이 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))를 통해서 측정할 수 있다. 일 실시형태에서, 미관련된 단백질에 대한 항원 결합 수용체의 결합 정도는 예를 들어 SPR로 측정시 표적 항원에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 친화성 해리 상수 (KD)로 표적 항원에 결합된다.
본 명세서에서 사용되는 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 이펙터 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 의미한다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 어세이는 본 명세서에 기술되고 당분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따라서 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 당분야에서 통상적으로 공지되어 있다. 특히, 본 명세서에서 용어 "T 세포 수용체"는 임의의 T 세포 수용체를 의미하고, 단 하기의 3개 기준을 충족한다: (i) 종양 특이성, (ii) 항원 또는 표적이 (대부분의) 종양 세포에서 발현되어야 하는 것을 의미하는, (대부분의) 종양 세포의 인식, 및 (iii) TCR이 치료하려는 대상체의 HLA-유형과 일치. 이러한 문맥에서, 상기 언급된 3개 기준을 충족하는 적합한 T 세포 수용체는 NY-ESO-1 (서열 정보(들)는 예를 들어, PCT/GB2005/001924 참조함) 및/또는 HER2neu (서열 정보(들)는 WO-A1 2011/0280894를 참조함)를 인식하는 수용체와 같이, 당분야에 공지되어 있다.
작용제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료적 유효량"은 바람직한 치료적 또는 예방적 결과를 획득하기 위해, 필요한 시간 기간 동안 및 용량에서 유효한 양을 의미한다. 예를 들어 작용제의 치료적 유효량은 질환의 불리한 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나 또는 예방한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구성체"와 동의어이고 표적 세포에서 작동적으로 회합된 특별한 유전자의 발현을 도입시켜서 유도시키는데 사용되는 DNA 분자를 의미한다. 이 용어는 자기-복제 핵산 구조로서 벡터를 비롯하여 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합되는 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 리보핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩된 단백질은 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항원 결합 수용체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
항원 결합 수용체 구성
본 발명은 표적 항원, 즉 종양 연관 항원 (TAA)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이고, 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체에 의한 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, CD3+ T 세포, γδ T 세포 또는 자연 살해 (NK) T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포의 형질도입 및 예를 들어 종양으로 그들의 표적화된 동원에 관한 것이다.
본 발명의 개념의 증거로서, 첨부된 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체 pETR17097 (SEQ ID NO:22에 표시된 DNA 서열로 코팅된 SEQ ID NO:7)은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 구축되었다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 단백질 (SEQ ID NO:22에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID NO:7)을 발현하는 형질도입된 T 세포 (저카트 NFAT T 세포)는 CD20 양성 종양 세포에 의해 강력하게 활성화될 수 있다. 본 발명자는 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체의 다수 구성을 더 제공한다. 본 발명의 Fab 및 crossFab 구성은 이들 구성 중 하나에 따른 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체에 의한 T 세포의 차별화된 활성화에 기인하여 특히 바람직하다. T 세포의 차별적인 활성화는 Fab 및 crossFab 구성으로 입증되었고 scFv 구성과 비교되었다. 본 발명에 따른 Fab 및 crossFab 구성은 별개 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 경쇄의 올바른 쌍형성을 보장하고, 놀랍게도 scFv 구성과 비교하여 T 세포의 차별화된 활성화를 야기시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 하나 초과의 Fab 기반 항원 결합 수용체는 동일한 세포, 즉 T 세포 내에서 본 발명에 따라 발현될 수 있고, 여기서 본 발명의 항원 결합 수용체가 올바르게 조립되고 항원 결합 수용체의 기능적 특성, 예를 들어 T 세포의 활성화가 강력한 채로 남아있다. 이것은 결합제 친화성을 변화시키지 않고 T 세포 반응을 조율할 가능성을 더 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 한 세포에서 항원 결합 수용체의 이러한 조합, 특히 다수의 Fab 및 crossFab 구성의 조합을 제공한다.
Fab 또는 cross Fab 항원 결합 모이어티를 포함하는 본 발명의 항원 결합 수용체가 형질도입된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포는 강력하게 활성화되었고 종양-연관 항원 (TAA)에 의해 종양 세포로 동원된다는 것을 발견하였다. 통합 Fab 및/또는 crossFab 항원 결합 모이어티는 추가의 T 세포 자극 (예를 들어, CD3 신호전달)에 의존하여, T 세포의 차별화된 활성화, 및 고전적인 scFv 구성과 비교해 종양 세포의 용해를 야기시킨다는 것을 본 발명에서 놀랍게도 예상치 않게 확인되었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 항원 결합 수용체 구성은 본 발명의 Fab 구성이 보다 안정하므로, 통상의 scFv 기반 접근법보다 상당한 장점을 보유한다. 중요하게, 파지 디스플레이 라이브러리의 사용에 의해 유래되고/되거나 생성시킨 항원 결합 모이어티는 본 발명의 항원 결합 수용체로 쉽게 전환될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다재다능한 치료적 플랫폼을 제공하고, 여기서 기지의 공급원 또는 새롭게 개발된 결합제로부터 유래된 세포 항원을 표적화하는 항원 결합 모이어티는 종양으로의 T 세포 안내 및 특이적 결합 후 T 세포 활성화를 제공하기 위해 결합 및 신호전달 수용체로 쉽게 통합될 수 있다. 중요하게, 하나를 초과하는 항원 결합 수용체는 하나의 세포에 통합되어 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포의 결합 및 활성화를 위한 다수의 특이성을 제공할 수 있다. 종양 세포의 표면 상의 종양 항원(들)에 결합 후에, 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질도입된 T 세포는 활성화되고 종양 세포는 이후에 용해될 것이다. 플랫폼은 다양한 (현존 또는 새롭게 개발된) 표적 결합제의 사용 또는 상이한 항원 특이성을 갖는 다수의 항원 결합 수용체의 동시-적용을 가능하게 하여 탄력적이고 특이적이다. T 세포 활성화의 정도는 면역 체크포인트 억제제에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티/모이어티들 및 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티/모이어티들의 조합에 의해서 그리고 상이한 항원 결합제 구성으로 전환되어 더욱 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 형질도입된 T 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같이 명시된 항원 (들) 또는 항원 (들) 및 면역 체크포인트 억제제의 조합에 노출없이 불활성이다.
본 발명의 맥락에서, 항원 결합 수용체는 T 세포 내 또는 T 세포 상에서 천연적으로 존재하지 않는 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 항원 결합 수용체는 본 발명에 따라서 항원 결합 수용체를 발현하는 세포에 대해 조율된 결합 특이성을 제공할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 수용체(들)가 형질도입된 세포, 예를 들어 T 세포는 표적 항원을 발현하는 세포 (예를 들어, 종양 세포)에 특이적으로 결합할 수 있게 되지만 미관련된 건강한 세포에는 결합하지 않거나 또는 본질적으로 결합하지 않는다. 특이성은 하나 이상의 항원 결합 수용체(들)의 세포외 도메인의 하나 또는 몇개의 항원 결합 모이어티에 의해 제공되고, 이러한 항원 결합 모이어티는 본 명세서에서 정의된 바와 같인 종양 연관 항원에 특이적으로 간주된다. 본 발명의 문맥 및 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 종양 세포와 결합하고/상호작용하지만 건강한 세포/조직과는 결합하지 않고/상호작용하지 않는다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 개별 항원 결합 수용체의 역가에 영향을 미치지 않고 다양한 조합으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 Fab 단편을 포함하는 제1 항원 결합 수용체는 crossFab 단편을 포함하는 제2 항원 결합 수용체와 조합될 수 있다. 또한, 본 발명은 상이한 수용체의 가능한 조합으로 더욱 확장되는 crossFab 구성뿐만 아니라 Fab 구성 둘 모두의 2개의 개별 입체구성를 기술하였다. 뿐만 아니라, scFab 구성은 확장된 조합적 유연성을 더욱 설명한다. 중요하게, 본 명세서에 기술된 바와 같이 상이한 항원 결합 수용체의 올바른 조합은 항원 결합 수용체의 폴리펩티드 서브유닛의 올바른 쌍형성, 즉 Fab 구성의 중쇄 및 경쇄의 올바른 조립을 보장한다.
항원 결합 모이어티
개념의 증거로서, 본 발명의 예시적인 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 것이 제공되고, 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다.
일정한 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 통상의 Fab 단편, 즉, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄로 이루어진 Fab 분자이다. 일정한 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 crossFab 단편, 즉 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄로 이루어진 Fab 분자이고, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 일정한 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 scFv 단편이다. 특정한 이러한 실시형태에서, 가변 중쇄 (VH)의 C-말단은 임의로 펩티드 링커를 통해서 scFv 분자의 가변 경쇄 (VL)의 N-말단에 연결된다. 일정한 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 단일-사슬 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성한 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시형태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 임의로 펩티드 링커를 통해서, 단일-사슬 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다.
종양 연관 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 예를 들어 포유동물 면역계의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 당분야에 공지되어 있고 예를 들어 문헌 [Burns in Methods in Molecular Biology 295:1-12 (2005)]에 기술되어 있다. 대안적으로, 본 발명의 항원 결합 모이어티는 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리의 스크리닝을 통해 단리될 수 있다. 조합 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법은 예를 들어, [Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)]에서 고찰된다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 바람직한 결합 특징을 보유하는 항원 결합 모이어티에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양하나 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 [Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016)]; [Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)] 및 [Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)]를 비롯하여 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 고찰되어 있고, 예를 들어 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)] 및 [Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 더욱 기술되어 있다. 일정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 개별적으로 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 클로닝되어 파지 라이브러리로 무작위로 조합되고, [Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-사슬 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서, 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원 유래의 라이브러리는 하이브리도마 제작 요구없이 면역원에 대해 고친화성 항원 결합 모이어티를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레파토리를 (예를 들어, 인간 유래) 클로닝하고 [Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 임의의 면역화없이 광범위한 비자기 및 또한 자기 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 [Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 고도의 가변성 CDR3 영역을 코딩하고 시험관 내에서 재배열을 수행하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하고, 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 절편을 클로닝하여 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하는 공개 특허는 에를 들어, 미국 특허 제5,750,373호; 제7,985,840호; 제7,785,903호 및 제8,679,490호를 비롯하여 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 및 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다. 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하기 위해 당분야에 공지된 방법의 추가 예는 리보솜 및 mRNA 디스플레이를 비롯하여, 박테리아, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포 상에허 항체 디스플레이 및 선택을 위한 방법을 포함한다. 효모 표면 디스플레이를 위한 방법은 예를 들어, [Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)] 및 [Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)]를 비롯하여 [Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)]에 고찰되어 있다. 리보솜 디스플레이를 위한 방법은 예를 들어, [He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)] 및 [Hanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)]에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 항원 결합 수용체 구성의 특정한 장점은 구성을 변화시키지 않고 라이브러리 유래 항원 결합 모이어티의 간단한 통합이고, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래된 Fab 항원 결합제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 Fab 및/또는 crossFab 구성에 포함될 수 있다. 따라서, Fab 디스플레잉 파지 라이브러리로부터 유래된 항원 결합 모이어티는 구성, 예를 들어 음성적으로 라이브러리 유래된 결합제의 결합 특성에 영향을 미칠 수 있는 scFv 구성을 변화시키지 않고 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 본 명세서는 표적 항원, 즉 종양 연관 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다. 따라서, 형질도입된 세포, 즉 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 T 세포는 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있다.
개념의 증거로서, 본 발명의 예시적인 실시형태에서, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체 및 상기 항원 결합 수용체를 발현하는 이펙터 세포를 제공한다. 표적 세포는 CD20 폴리펩티드를 발현하는 것이고 CD20 폴리펩티드를 특이적으로 발현하거나 또는 과발현하는 세포 유형이다. 세포는 특정 세포 유형의 암성이거나 또는 정상인 세포일 수 있다. 세포는 자가면역에 관여되는 정상 B 세포일 수 있다. 일 실시형태에서 세포는 암 세포, 바람직하게 악성 B 세포이다. 다른 종양 연관 항원은 본 발명에 따라서 그리고 본 명세서에 기술된 바와 같이 표적화될 수 있다.
따라서, 특별한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:12의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:10의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 Fab 단편은 SEQ ID NO:8의 중쇄 및 SEQ ID NO:9의 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 scFv 단편이고, 여기서 상기 가변 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 입체구성 중 하나를 갖는다: a) VH-링커-VL 또는 b) VL-링커-VH. 바람직한 실시형태에서, scFv 단편은 입체구성 VH-링커-VL을 갖는다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 scFv 단편은 SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 crossFab 단편이다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 crossFab 단편은 SEQ ID NO:37의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:38의 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 (VH-CH1), 경쇄 (VL-CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 scFab 단편이고, 여기서 상기 중쇄 및 경쇄 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 입체구성 중 하나를 갖는다: a) VL-CL-링커-VH-CH1 또는 b) VH-CH-링커-VL-CL. 바람직한 실시형태에서, scFab 단편은 입체구성 VL-CL-링커-VH-CH1을 갖는다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 scFab 단편은 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 포함한다.
대안적인 특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다. 따라서, 특정한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:78의 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:77의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:78의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:77의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다.
일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 Fab 단편은 SEQ ID NO:75의 중쇄 및 SEQ ID NO:76의 경쇄를 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 scFv이고, 여기서 상기 가변 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 입체구성 중 하나를 갖는다: a) VH-링커-VL 또는 b) VL-링커-VH. 바람직한 실시형태에서, scFv 단편은 입체구성 VH-링커-VL을 갖는다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 cFv 단편은 SEQ ID NO:88의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 crossFab 단편이다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 crossFab 단편은 SEQ ID NO:80의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:81의 폴리펩티드를 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 (VH-CH1), 경쇄 (VL-CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 scFab 단편이고, 여기서 상기 중쇄 및 경쇄 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 입체구성 중 하나를 갖는다: a) VL-CL-링커-VH-CH1 또는 b) VH-CH-링커-VL-CL. 바람직한 실시형태에서, scFab 단편은 입체구성 VL-CL-링커-VH-CH1을 갖는다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 scFab 단편은 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 포함한다.
대안적인 특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 암배 항원 (CEA)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함한다. 따라서, 특정한 일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 EFGMN (SEQ ID NO:138);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WINTKTGEATYVEEFKG (SEQ ID NO:139); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 WDFAYYVEAMDY (SEQ ID NO:140)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 KASAAVGTYVA (SEQ ID NO:141);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASYRKR (SEQ ID NO:142); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 HQYYTYPLFT (SEQ ID NO:143)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
다른 특정한 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DTYMH (SEQ ID NO:148);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIDPANGNSKYVPKFQG (SEQ ID NO:149); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 FGYYVSDYAMAY (SEQ ID NO:150)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RAGESVDIFGVGFLH (SEQ ID NO:151);
(e) CDR L2 아미노산 서열 RASNRAT (SEQ ID NO:152); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQTNEDPYT (SEQ ID NO:153)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:146 및 SEQ ID NO:156으로부터 선택된 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:147 및 SEQ ID NO:157로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:146의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:147의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:156의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:157의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 scFv이고, 상기 가변 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 입체구성 중 하나를 갖는다: a) VH-링커-VL 또는 b) VL-링커-VH. 바람직한 실시형태에서, scFv 단편은 입체구성 VH-링커-VL을 갖는다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 scFv 단편은 SEQ ID NO:145 및 SEQ ID NO:155로 부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 (VH-CH1), 경쇄 (VL-CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 scFab 단편이고, 여기서 상기 중쇄 및 경쇄 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 입체구성 중 하나를 갖는다: a) VL-CL-링커-VH-CH1 또는 b) VH-CH-링커-VL-CL. 바람직한 실시형태에서, scFab 단편은 입체구성 VL-CL-링커-VH-CH1을 갖는다.
본 발명의 추가의 대안적인 특정한 실시형태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체 및 상기 항원 결합 수용체를 발현하는 이펙터 세포를 제공한다. 표적 세포는 CEA 폴리펩티드를 발현하는 것이고 CEA 폴리펩티드를 특이적으로 발현하거나 또는 과발현하는 세포 유형이다. 세포는 특정한 세포 유형의 암성 또는 정상 세포일 수 있다. 일 실시형태에서 세포는 암 세포이다. 따라서, 특별한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab이다.
앵커링 경막 도메인
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 포유동물 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 프로테아제는 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하는 경막 도메인의 아미노산 서열을 가수분해할 수 있는 단백질가수분해 효소를 의미한다. 이 용어 프로테아제는 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 특히 CD-명명법에 의해 정해진 경막 단백질의 임의의 앵커링 경막 도메인은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원과의 결합 시 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 활성화시키는, 본 발명의 항원 결합 수용체를 생성시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 앵커링 경막 도메인은 쥐과/마우스 또는 바람직하게 인간 경막 도메인의 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 앵커링 경막 도메인에 대한 예는 예를 들어, SEQ ID NO:14로 본 명세서에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CD28의 경막 도메인이다 (SEQ ID NO:29에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨). 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체의 경막 도메인은 SEQ ID NO:14에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고/그로 이루어질 수 있다 (SEQ ID NO:29에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨).
개념의 증거로서, 본 발명의 예시적인 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:22에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)을 포함하고, SEQ ID NO:97 (SEQ ID NO:96에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)로서 본 명세서에서 표시된 CD28의 단편/폴리펩티드 (인간 CD28의 Uniprot 등재 번호는 P10747임 (서열의 버전 번호 173 및 버전 1)) 부분을 포함하는 것이 제공된다. 대안적으로, 특히 CD 명명법으로 제공되는, 경막 도메인을 갖는 임의의 단백질은 본 발명의 항원 결합 수용체 단백질의 앵커링 경막 도메인으로서 사용될 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:97에 표시된 인간 전체 길이 CD28 (SEQ ID NO:96에 표시된 cDNA에 의해 코딩됨)의 아미노산 153 내지 179, 154 내지 179, 155 내지 179, 156 내지 179, 157 내지 179, 158 내지 179, 159 내지 179, 160 내지 179, 161 내지 179, 162 내지 179, 163 내지 179, 164 내지 179, 165 내지 179, 166 내지 179, 167 내지 179, 168 내지 179, 169 내지 179, 170 내지 179, 171 내지 179, 172 내지 179, 173 내지 179, 174 내지 179, 175 내지 179, 176 내지 179, 177 내지 179 또는 178 내지 179에 위치된 CD28의 앵커링 경막 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:14에 표시된 바와 같은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:29에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
(b) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
(b) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일 실시형태에서 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 scFab 단편은 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) SEQ ID NO:76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
(b) SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
대안적인 실시형태에서 PDL1에 특이적으로 결합하는 crossFab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) SEQ ID NO:84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
대안적인 실시형태에서, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 수용체는
(a) 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 융합된 SEQ ID NO:80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
(b) SEQ ID NO:81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일 실시형태에서 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편을 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 scFab 단편은 임의로 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커를 통해서, SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 C-말단에서 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 포함한다.
자극성 신호전달 도메인 (SSD) 및 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)
바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 항원 결합 수용체는 바람직하게 T 세포 활성화를 제공하는, 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체는 쥐과/마우스 또는 인간 CD3z (인간 CD3z의 UniProt 등재 번호는 P20963 (서열번호 2를 갖는 버전 번호 177; 쥐과/마우스 CD3z의 UniProt 등재 번호는 P24161 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9D3G3 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 143 및 서열 번호 1을 가짐)임), Fcgr3A (인간 FCGR3A의 UniProt 등재번호는 P08637 (서열번호 2를 갖는 버전 번호 178)임), 또는 NKG2D (인간 NKG2D의 UniProt 등재 번호는 P26718 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 151)임; 쥐과/마우스 NKG2D의 UniProt 등재 번호는 O54709 (서열번호 2를 갖는 버전 번호 132)임)의 단편/폴리펩티드 단편인 자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 제공하는 항원 결합 수용체에 포함되는 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, Fcgr3A 또는 NKG2D의 전체 길이의 폴리펩티드 부분/단편일 수 있다. CD3z의 쥐과/마우스 전체 길이의 아미노산 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO: 94 (SEQ ID NO:95에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩된 쥐과 마우스)로서 표시된다. 인간 전체 길이 CD3z의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:92 (SEQ ID NO:93으로 표시된 DNA 서열에 의해 코딩되는 인간)로서 본 명세서에서 표시된다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 자극성 도메인으로서 CD3z, Fcgr3A 또는 NKG2D의 단편을 포함할 수 있고, 단 적어도 하나의 신호전달 도메인이 포함된다. 특히, CD3z, Fcgr3A, 또는 NKG2D의 임의의 부분/단편은 적어도 하나의 신호전달 모티브가 포함되는 한 자극성 도메인으로서 적합하다. 그러나, 더 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 인간 기원으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:92 (CD3z) (SEQ ID NO:93 (CD3z)로 표시된 DNA 서열에 의해 코딩된 인간)로서 본 명세서에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함될 수 있는 인간 CD3z의 단편/폴리펩티드 부분은 SEQ ID NO:16 (SEQ ID NO:31에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 활성을 갖는 것을 특징으로 하고 SEQ ID NO:16에 표시된 바와 같은 서열 또는 SEQ ID NO:16과 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 서열을 포함한다. 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함하는 항원 결합 수용체의 특별한 입체구성이 하기 및 실시예 및 도면에 제공된다. 자극성 신호전달 활성은 예를 들어, ELISA (IL-2, IFNγ, TNFα)로 측정되는 증강된 사이토카인 방출, 증강된 증식 활성 (증강된 세포수로 측정), 또는 LDH 방출 어세이로 측정시 증강된 용해 활성으로 결정될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체는 바람직하게 T 세포에 대해 추가의 활성을 제공하는 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 제공하는 항원 결합 수용체는 쥐과/마우스 또는 인간 CD28 (인간 CD28의 UniProt 등재 번호는 P10747 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 173)이고; 쥐과/마우스 CD28의 UniProt 등재 번호는 P31041 (서열번호 2를 갖는 버전 번호 134)임), CD137 (인간 CD137의 UniProt 등재 번호는 Q07011 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 145)이고; 쥐과/마우스 CD137의 UniProt 등재 번호는 P20334 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 139)임), OX40 (인간 OX40의 UniProt 등재 번호는 P23510 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 138)이고; 쥐과/마우스 OX40의 UniProt 등재 번호는 P43488 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 119)임), ICOS (인간 ICOS의 UniProt 등재 번호는 Q9Y6W8 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 126)임); 쥐과/마우스 ICOS는 Q9WV40 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9JL17 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 102 및 서열 버전 2)임), CD27 (인간 CD27의 UniProt 등재 번호는 P26842 (서열번호 2를 갖는 버전 번호 160)임); 쥐과/마우스 CD27의 UniProt 등재 번호는 P41272 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 137)임), 4-1-BB (쥐과/마우스 4-1-BB의 UniProt 등재 번호는는 P20334 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 140)이고; 인간 4-1-BB의 UniProt 등재 번호는 Q07011 (서열 버전을 갖는 버전 번호 146)임), DAP10 (인간 DAP10은 Q9UBJ5 (서열번호 1을 갖는 버전 번호 25)이고; 쥐과/마우스 DAP10의 UniProt 등재 번호는 Q9QUJ0 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9R1E7 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 101 및 서열 번호 1)임) 또는 DAP12 (인간 DAP12의 UniProt 등재 번호는 O43914 (버전 번호 146 및 서열번호 1)이고; 쥐과/마우스 DAP12의 UniProt 등재 번호는 O054885 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9R1E7 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 123 및 서열번호 1)임)의 폴리펩티드 부분/단편인 공자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 일정한 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 하나 이상의, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 본 명세서에 정의된 바와 같은 공자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 제1 공자극성 신호전달 도메인으로서 쥐과/마우스 또는 바람직하게 인간 CD28의 폴리펩티드 부분/단편을 포함할 수 있고 제2 공자극성 신호전달 도메인은 쥐과/마우스 또는 바람직하게 인간 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 인간 기원으로부터 유래된 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 따라서, 더 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함된 공자극성 신호전달 도메인(들)은 SEQ ID NO:15 (SEQ ID NO:30에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 항원 결합 수용체에 임의로 포함될 수 있는 공자극성 신호전달 도메인은 전체 길이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 폴리펩티드 부분/단편이다. 쥐과/마우스 전체 길이 CD28의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:99 (SEQ ID NO:98에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩된 쥐과/마우스)로 표시된 바와 같다. 그러나, 인간 서열이 본 발명의 맥락에서 가장 바람직하기 때문에, 본 명세서에 제공되는 항원 결합 수용체 단백질에 임의로 포함될 수 있는 공자극성 신호전달 도메인은 인간 전체 길이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12의 폴리펩티드 부분/단편이다. 인간 전체 길이 CD28의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:97 (SEQ ID NO:96에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩된 인간)로서 본 명세서에서 표시된다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인로서 CD28 또는 이의 단편을 포함한다. 본 명세서에서 제공하는 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편을 포함할 수 있고, 단 CD28의 적어도 하나의 신호전달 도메인이 포함된다. 특히, CD28의 임의의 부분/단편은 CD28의 적어도 하나의 신호전달 모티브가 포함되는 한 본 발명의 항원 결합 수용체에 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체 단백질에 포함되는 CD28 폴리펩티드는 SEQ ID NO:15 (SEQ ID NO:30에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 본 발명에서, 공자극성 신호전달 도메인으로서 기능하는 CD28의 세포내 도메인은 서열(들) YMNM (SEQ ID NO:132) 및/또는 PYAP (SEQ ID NO:133)을 갖는 CD28 폴리펩티드의 세포내 도메인으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 인간 기원으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함될 수 있는 인간 CD28의 폴리펩티드 부분/단편은 SEQ ID NO:15 (SEQ ID NO:30에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)에 표시된 아미노산을 포함할 수 있고 또는 그로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 활성을 갖는 것을 특징으로 하고, SEQ ID NO:15에 표시된 서열 또는 SEQ ID NO:15와 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 서열을 포함한다. 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)을 포함하는 항원 결합 수용체의 특별한 입체구조는 하기 및 실시예 및 도면에 제공된다. 공자극성 신호전달 활성은 ELISA에 측정시 증가된 사이토카인 방출 (IL-2, IFNγ, TNFα), 증강된 증식 활성 (증강된 세포수로 측정), 또는 LDH 방출 어세이로 측정시 증강된 용해 활성을 통해 결정될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 인간 CD28 유전자 (Uni Prot 등재 번호: P10747 (등재 버전: 173의 수탁 번호 및 서열의 버전 1))로부터 유래될 수 있고 형질도입된 T 세포처럼, 본 명세서에 기술된 형질도입된 세포의 사이토카인 생성, 증식 및 용해 활성으로서 정의되는, CD28 활성을 제공한다. CD28 활성은 사이토카인 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 인터루킨 2 (IL-2)의 ELISA 또는 유세포측정에 의한 사이토카인의 방출, 예를 들어 ki67-측정에 의해 측정된 T 세포의 증식, 유세포측정에 의한 세포 정량, 또는 표적 세포의 실시간 임피던스 측정으로 평가되는 용해 활성으로 측정될 수 있다 (예를 들어, [Thakur et al., Biosens Bioelectron. 35(1) (2012), 503-506]; [Krutzik et al., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202]; [Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296]; [Ge et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99(5) (2002), 2983-2988]; Duwell et al., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837], [Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161]에 기술된 바와 같은 예를 들어 ICELLligence 장비를 사용함). 공자극성 신호전달 도메인 PYAP (SEQ ID NO:133의 AA 208 내지 211 및 YMNM (SEQ ID NO:132의 AA 191 내지 194)는 상기에 열거된 CD28 폴리펩티드의 기능 및 기능적 효과에 유리하다. YMNM 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:132에 표시되어 있고; PYAP 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:133에 표시되어 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 수용체에서, CD28 폴리펩티드는 바람직하게 서열 YMNM (SEQ ID NO:132) 및/또는 PYAP (SEQ ID NO:133)을 갖는 CD28 폴리펩티드의 세포내 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 서열 YMNM (SEQ ID NO:132) 및/또는 PYAP (SEQ ID NO:133)를 갖는 CD28 폴리펩티드의 세포내 도메인은 예를 들어, 형질도입된 T 세포와 같이, 본 명세서에 기술된 형질도입된 세포의 사이토카인 생성, 증식 및 용해 활성으로서 정의된, CD28 활성을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열 (인간) (SEQ ID NO:30으로 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)을 갖는다. 그러나, 본 발명의 항원 결합 수용체에서, 이들 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 각각 FMNM (SEQ ID NO:134) 및/또는 AYAA (SEQ ID NO:135)로 돌연변이될 수 있다. 이들 돌연변이 중 하나는 증식하는 능력에 영향없이 사이토카인을 방출하는 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 세포의 능력을 감소시키고, 유리하게 생존능 및 따라서 형질도입된 세포의 치료적 잠재성을 연장시키는데 사용될 수 있다. 또는, 달리 말해서, 이러한 비기능적 돌연변이는 바람직하게 생체내에서 본 명세서에 제공된 항원 결합 수용체가 형질도입된 세포의 지속성을 증강시킨다. 그러나 이들 신호전달 모티브는 본 명세서에 제공된 항원 결합 수용체의 세포내 도메인 내 임의 부위에 존재할 수 있다.
링커 및 신호 펩티드
게다가, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 링커 (또는 "스페이서")를 포함할 수 있다. 링커는 일반적으로 최대 20개 아미노산 길이를 갖는 펩티드이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및/또는 자극성 신호전달 도메인 사이에 링커를 포함할 수 있다. 이러한 링커는 그들이 항원 결합 수용체의 상이한 폴리펩티드 (즉, 세포외 도메인, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및/또는 자극성 신호전달 도메인)가 독립적으로 폴딩되고 예상되로 거동되는 가능성을 증가시키는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있는 세포외 도메인, 포유동물 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖지 않는 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인은 단일-사슬 다기능성 폴리펩티드 사슬에 포함될 수 있다. 융합 구성체는 예를 들어 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인들(들), 앵커링 경막 도메인(들), 공자극성 신호전달 도메인(들) 및/또는 자극성 신호전달 도메인(들)을 포함하는 폴리펩티드(들)로 이루어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 단일 사슬 구성체가 아닌 항원 결합 모이어티를 포함하고, 즉 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 단편이다. 바람직하게 이러한 구성체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄와 조합된 단일 사슬 중쇄 또는 경쇄 융합 폴리펩티드를 포함하게 되고, 예를 들어, 중쇄 융합 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄(들), 앵커링 경막 도메인(들), 공자극성 신호전달 도메인(들) 및/또는 자극성 신호전달 도메인(들)을 포함하고, 면역글로불린 경쇄(들)과 조합되거나, 또는 경쇄 융합 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄(들), 앵커링 경막 도메인(들), 공자극성 신호전달 도메인(들) 및/또는 자극성 신호전달 도메인(들)을 포함하고 면역글로불린 중쇄(들)와 조합된다. 따라서, 항원 결합 모이어티, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인은 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 동일하거나 또는 상이한 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체에서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인과 앵커링 경막 도메인 사이의 링커는 SEQ ID NO:20에 표시된 아미노 및 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 따라서, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및/또는 자극성 도메인은 펩티드 링커에 의해서 또는 대안적으로 도메인의 직접 융합에 의해서 서로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서 세포외 도메인에 포함되는 항원 결합 모이어티는 10개 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된, 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질인 단일-사슬 가변 단편 (scFv)이다. 링커는 일반적으로 유연성을 위해 글리신을 비롯하여, 가용성의 경우 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 연결할 수 있거나, 또는 그 반대일 수도 있다. 예를 들어, 링커는 SEQ ID NO:19에 표시된 바와 같은 아미노 및 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 일부 실시형태에서, 세포외 도메인에 포함된 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 단일 사슬 Fab 단편 또는 scFab이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서 중 하나를 갖고: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL, 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 천연 디술파이드 결합을 통해 안정화된다.
본 발명에 따른 일부 실시형태에서, 세포외 도메인에 포함된 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 크로스오버 단일 사슬 Fab 단편이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기서 VH 및 VL은 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함께 형성하고, 상기 링커는 적어도 30개 아미노산의 폴리펩티드이다.
본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체 또는 이의 일부분은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 T 세포막의 표면으로 단백질을 보낼 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 수용체에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:136 (SEQ ID NO:137에 표시된 DNA 서열에 의해 코딩됨)에 표시된 바와 같은 아미노 및 아미노산 서열을 가질 수 있다.
T 세포 활성화 항원 결합 수용체
본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체의 성분은 항원 결합 수용체를 활성화시키는 T 세포를 생성시키기 위해 다양한 입체구성으로 서로 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인에 연결된, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)으로 구성된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, VH 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서, VL 도메인의 N-말단과 C-말단에 융합된다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인 및/또는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 특별한 이러한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인, 앵커링 경막 도메인, 및 임의로 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, VH 도메인은 C-말단에서 VL 도메인의 N-말단과 융합되고, VL 도메인은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되며, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 임의로, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 이러한 특정한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인, 앵커링 경막 도메인, 자극성 신호전달 도메인 및 공자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, VH 도메인은 C-말단에서 VL 도메인의 N-말단과 융합되고, VL 도메인은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되며, 여기서 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 대안적인 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 자극성 신호전달 도메인 대신에 앵커링 경막 도메인에 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, 여기서 VH 도메인은 C-말단에서 VL 도메인의 N-말단과 융합되고, VL 도메인은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다.
대안적인 실시형태에서, 결합 모이어티 중 하나는 scFab 단편이다. 바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 임의로 펩티드 링커를 통해서, scFab의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합된다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인 및/또는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 이러한 특별한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 scFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 및 임의로 자극성 신호전달 도메인로 본질적으로 이루어지고, scFab는 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 바람직하게, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 scFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 자극성 신호전달 도메인 및 공자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, scFab는 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 자극성 신호전달 도메인 대신에 앵커링 경막 도메인에 연결된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 scFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, scFab는 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 펩티드 링커를 통해 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다.
바람직한 실시형태에서, 결합 모이어티의 하나는 Fab 단편 또는 crossFab 단편이다. 바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과, 임의로 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 대안적인 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 경쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과, 임의로 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인 및/또는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 이러한 특별한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 Fab 또는 crossFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 및 임의로 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 바람직하게, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 Fab 또는 crossFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 자극성 신호전달 도메인 및 공자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 자극성 신호전달 도메인 대신에 앵커링 경막 도메인에 연결된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체은 Fab 또는 crossFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 펩티드 링커를 통해 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다.
항원 결합 모이어티, 앵커링 경막 도메인 및 자극성 신호전달 및/또는 공자극성 신호전달 도메인은 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해서 또는 직접적으로 서로 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당분야에 공지되어 있고 본 명세서에 기술되어 있다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10의 수, 전형적으로 2 내지 4이다. 항원 결합 모이어티 및 앵커링 경막 모이어티를 연결시키기 위해 바람직한 펩티드 링커는 SEQ ID NO:20에 따른 GGGGS (G4S)이다. 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)를 연결시키는데 적합한 예시적인 펩티드 링커는 SEQ ID NO:19에 따라 GGGSGGGSGGGSGGGS (G4S)4 이다.
추가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역 (의 일부분)을 포함할 수 있다. 특히 항원 결합 모이어티가 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합된 경우에, 추가적인 펩티드 링커와 함께 또는 없이, 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부분을 통해서 융합될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티를 갖는 항원 결합 수용체는 특히 항원 결합 수용체의 높은 발현을 필요로 하는 경우에, 유용하고 바람직하다. 이러한 경우에서, 표적 세포 항원에 특이적인 하나를 초과하는 항원 결합 모이어티의 존재는 항원 결합 수용체의 발현 효율을 제한할 수 있다. 그러나, 다른 경우에서, 예를 들어 표적 부위에 대한 표적화를 최적화하거나 또는 표적 세포 항원의 가교를 가능하게 하기 위해서, 표적 세포 항원에 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체를 갖는 것이 유리할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:14)이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체은 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 이전에 본 명세서에 기술된 바와 같이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:15)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 서열 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:16)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 실시형태에서, Fab 단편을 포함하는 항원 결합 수용체는 리포터 단백질, 특히 GFP 또는 이의 증강된 유사체에 융합된다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 펩티드 링커를 통해서, C-말단에서 eGFP (enhanced green fluorescent protein)의 N-말단과 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:21의 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A)이다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 Fab-ATD-CSD-SSD를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 Fab-G4S-ATD-CSD-SSD를 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 서열 GGGGS를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 임의로 펩티드 링커를 통해서, 항원 결합 수용체의 C-말단에 첨가될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 Fab 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1), CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2), CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4), CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5) 및 CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:1의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3, SEQ ID NO:4의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인, 특히 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인, 특히 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) SEQ ID NO:1의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:4의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) SEQ ID NO:4의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:5의 경쇄 CDR 2, SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:1의 중쇄 CDR 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄를 포함하는, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 포함하는 Fab 단편이다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:8의 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:9의 경쇄를 포함하는, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로 ;
(i) SEQ ID NO:9의 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:8의 중쇄를 포함하는, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:50의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:70으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 Fab 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68), CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69), CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71), CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72) 및 CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) SEQ ID NO:68의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3, SEQ ID NO:71의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:68의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:71의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) SEQ ID NO:71의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2, SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:68의 중쇄 CDR 1, SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO:76의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:75의 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:76의 경쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) SEQ ID NO:76의 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:75의 중쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:74의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:76의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:85의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:75의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 crossFab 단편이다. 일정한 실시형태에서, 본 명세서에서 하기에 기술된 바와 같이 항원 결합 수용체는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역은 카복시-말단 펩티드 결합을 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 공유하고 (즉, 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 치환된 crossFab 중쇄를 포함함), 이후에 카복시-말단 펩티드 결합을 앵커링 경막 도메인과 공유한다 (VL-CH1-ATD). 일부 실시형태에서 항원 결합 수용체는 폴리펩티드를 더 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역은 카복시-말단 펩티드 결합을 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 공유한다 (VH-CL). 일정한 실시형태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 디술파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 대안적인 실시형태에서 항원 결합 수용체는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역은 카복시-말단 펩티드 결합을 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 공유하고 (즉, 항원 결합 모이어티는 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 치환된 crossFab 중쇄를 포함함), 이후에 카복시-말단 펩티드 결합을 앵커링 경막 도메인과 공유한다 (VH-CL-ATD). 일부 실시형태에서 항원 결합 수용체는 폴리펩티드를 더 포함하고, 여기서 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역은 카복시-말단 펩티드 결합을 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 공유한다 (VL-CH1). 일정한 실시형태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 디술파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 중쇄 불변 도메인의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합된다. 대안적인 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 경쇄 불변 도메인의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:14)이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 이전에 본 명세서에 기술된 바와 같이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 서열: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:15)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:16)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 실시형태에서, crossFab 단편을 포함하는 항원 결합 수용체는 리포터 단백질, 특히 GFP 또는 이의 증강된 유사체에 융합된다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (enhanced green fluorescent protein)의 N-말단과, 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:21의 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A)이다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 crossFab-ATD-CSD-SSD를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 crossFab-G4S-ATD-CSD-SSD를 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 서열 GGGGS를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 임의로 펩티드 링커를 통해서 항원 결합 수용체의 C-말단에 첨가될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 crossFab 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1), CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2), CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4), CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5) 및 CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:1의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3, SEQ ID NO:4의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는, CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 분자인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는, 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:1의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:4의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 2를 포함하는 경쇄를 포함하는, 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) SEQ ID NO:4의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:5의 경쇄 CDR 2, SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:1의 중쇄 CDR 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 포함하는 crossFab 단편이다.
대안적인 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 포함하는 crossFab 단편이다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로;
(i) SEQ ID NO:42의 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:43의 경쇄를 포함하는, 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로;
(i) SEQ ID NO:37의 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:38의 중쇄를 포함하는, 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:43의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
다른 특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 crossFab-ATD-CSD-SSD을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 crossFab-G4S-ATD-CSD-SSD을 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 GGGGS 서열을 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 임의로 펩티드 링커를 통해서 항원 결합 수용체의 C-말단에 첨가될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 crossFab 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68), CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69), CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71), CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72) 및 CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로:
(i) SEQ ID NO:68의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3, SEQ ID NO:71의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 분자인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인11; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로;
(i) SEQ ID NO:68의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:71의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로;
(i) SEQ ID NO:71의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2, SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:68의 중쇄 CDR 1, SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:81이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO:80의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 포함하는 crossFab 단편이다.
대안적인 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:83의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO:84의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄를 포함하는 crossFab 단편이다.
일 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로;
(i) SEQ ID NO:83의 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:84의 경쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
대안적인 실시형태에서 본 발명은
a) N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) SEQ ID NO:80의 경쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:81의 중쇄를 포함하는, PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:82의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:84의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDl1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:79의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:81의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 융합 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다.
일정한 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체, Fab 경쇄 폴리펩티드 및 Fab 중쇄 융합 폴리펩티드는 임의로 링커 펩티드를 통해서 서로 융합된다. 따라서, 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 단일 사슬 Fab (scFab) 단편이다. 일 실시형태에서, Fab 경쇄 폴리펩티드 및 Fab 중쇄 융합 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해서 서로 융합된다. 일 실시형태에서 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO:54)을 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFab의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 임의로 펩티드 링커를 통해 융합된다. 일 실시형태에서 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:20)을 포함한다. 일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:14)의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 이전에 본 명세서에 기술된 바와 같이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:15)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체은 자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:16)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 실시형태에서, scFab를 포함하는 항원 결합 수용체는 리포터 단백질, 특히 GFP 또는 이의 증강된 유사체와 융합된다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (enhanced green fluorescent protein)의 N-말단과, 본 명세서에 기술된 바와 같이 임의로 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:21에 따른 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A)이다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFab-ATD-CSD-SSD를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFab-G4S-ATD-CSD-SSD를 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 서열 GGGGS를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해서 첨가될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1), CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2), CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4), CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5) 및 CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로:
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편인 항원 결합 모이어티로서, 여기서 scFab 단편은 SEQ ID NO:1의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:4의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5의 경쇄CDR 2 및 SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFab는 SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 SEQ ID NO:10의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFab는 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:12 및 경쇄 가변 도메인 (VL) SEQ ID NO:10을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFab는 SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFab-ATD-CSD-SSD을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFab-G4S-ATD-CSD-SSD를 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 서열 GGGGS를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해서 첨가될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68), CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69), CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71), CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72) 및 CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편인 항원 결합 모이어티로서, scFab 단편은 SEQ ID NO:68의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:71의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:72의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다
일 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로,
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFab는 SEQ ID NO:78의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 SEQ ID NO:77의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFab는 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:78 및 경쇄 가변 도메인 (VL) SEQ ID NO:77을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFab는 SEQ ID NO:87의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인;
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 포함한다.
기술된 바와 같은 Fab 중쇄 및 경쇄의 융합은 Fab 중쇄 및 경쇄의 쌍형성을 개선시킬 수 있고, 또한 본 발명의 항원 결합 수용체의 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다. 항원 결합 수용체의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시키는 대안적인 전략은 예를 들어 도 2에 예시된 바와 동일한 플라스미드로부터 중쇄 및 경쇄 구성체 둘 모두의 발현을 할 수 있는 내부 리보솜 진입 부위의 사용이다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편이다. 일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과, 임의로 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 일 실시형태에서 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:20)을 포함한다. 일 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:14)의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 공자극성 신호전달 도메인 (CSD)을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 본 명세서에 기술된 바와 같이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 공자극성 신호전달 도메인은 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:15)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정한 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:16)을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 실시형태에서, scFv 단편을 포함하는 항원 결합 수용체는 리포터 단백질, 특히 GFP 또는 이의 증강된 유사체에 융합된다. 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (enhanced green fluorescent protein)의 N-말단과, 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 펩티드 링커를 통해 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:21에 따른 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A)이다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFv-ATD-CSD-SSD을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFv-G4S-ATD-CSD-SSD를 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 서열 GGGGS를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해 첨가될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1), CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2), CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4), CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5) 및 CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 단편인 항원 결합 모이어티로서, scFv 단편은 SEQ ID NO:1의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:4의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5의 경쇄CDR 2 및 SEQ ID NO:6의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFv는 SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:65로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:66으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:65 및 경쇄 가변 도메인 (VL) SEQ ID NO:66을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv인 항원 결합 모이어티로서, scFv는 SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:60의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 앵커링 경막 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 단편이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 공자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD)을 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFv-ATD-CSD-SSD를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 입체구성 scFv-G4S-ATD-CSD-SSD을 갖고, 여기서 G4S는 SEQ ID NO:20의 서열 GGGGS를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질은 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해서 첨가될 수 있다.
일 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 단편이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv이고, 여기서 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68), CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69), CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71), CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72) 및 CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)을 포함한다.
일 실시형태에서 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 단편인 항원 결합 모이어티로서, scFv 단편은 SEQ ID NO:68의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR), SEQ ID NO:69의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:70의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:71의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:72의 경쇄CDR 2 및 SEQ ID NO:73의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv인 항원 결합 모이어티로서, scFv는 SEQ ID NO:78 및 SEQ ID NO:90로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:91로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFv는 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:90 및 경쇄 가변 도메인 (VL) SEQ ID NO:91을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단의 순서로
(i) PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티로서, scFv는 SEQ ID NO:89의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:20의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:14의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 공자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:15의 공자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:16의 자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다.
특정한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:88의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 PDL1과 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:88의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 실시형태에 따라서, 항원 결합 수용체의 성분 (예를 들어, VH 및 VL, 항원 결합 모이어티, 앵커링 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인, 자극성 신호전달 도메인)은 직접적으로 또는 다양한 링커, 특히 본 명세서에 기술되거나 또는 당분야에 공지된 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해서 융합될 수 있다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 n은 일반적으로 1 내지 10의 수, 바람직하게 1 내지 4이다.
Fab 및 crossFab 도메인의 변형
다른 양상에서, 그리고 하나를 초과하는 항원 결합 수용체가 본 명세서에 기술된 바와 동일한 세포, 즉 동일한 T 세포에 포함되면 올바른 쌍형성을 개선시키기 위해서, 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 또는 crossFab 단편을 포함하는 제1 항원 결합 수용체 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 또는 crossFab 단편을 포함하는 제2 항원 결합 수용체는 상이한 하전된 아미노산 치환 (소위 "하전된 잔기")을 함유할 수 있다. 이들 변형은 교차 또는 비교차 CH1 및 CL 도메인에 도입된다. 이러한 변형은 예를 들어 WO2015/150447, WO2016/020309 및 PCT/EP2016/073408에 기술되어 있다.
특정한 일 양상에서, 본 발명은 Fab를 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이고, 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산은 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정한 일 양상에서, 본 발명은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이고, CL 도메인에서 위치 123의 아미노산 (EU 번호매김)은 아르기닌 (R)으로 치환되었고 위치 124의 아미노산 (EU 번호매김)은 리신 (K)으로 치환되었으며 CH1 도메인에서 위치 147 (EU 번호매김) 및 위치 213의 아미노산 (EU 번호매김)은 글루탐산 (E)으로 치환되었다.
추가 양상에서 본 발명은 세포, 즉 T 세포로 공동 형질도입될 수 있는 2종의 항원 결합 수용체에 관한 것이고, 중쇄 및 경쇄의 올바른 쌍형성은 개선된다. 이러한 일 양상에서, (i) 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 124의 아미노산 (카밧에 따른 번호매김)은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH1 도메인에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 음으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나, (ii) 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 124의 아미노산 (카밧에 따른 번호매김)은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH1 도메인에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 음으로 하전된 아미노산으로 치환된다.
다른 양상에서, (i) 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 124의 아미노산은 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카밧에 따른 번호매김) (바람직한 일 실시형태에서, 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)에 의해 독립적으로)에 의해 독립적으로 치환되고, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH 도메인에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)에 의해 독립적으로 치환되고/되거나, (ii) 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서, 위치 124의 아미노산은 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카밧에 따른 번호매김) (바람직한 일 실시형태에서, 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)에 의해 독립적으로)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH 도메인에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D)에 의해 독립적으로 치환된다.
일 양상에서, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 124 및 123의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 K에 의해 치환된다.
일 양상에서, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 123의 아미노산은 R에 의해 치환되고 위치 124의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 K에 의해 치환된다.
일 양상에서, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH 도메인에서 위치 147 및 213의 아미노산 (카밧의 EU 지수에 따라 번호매김)은 E에 의해 치환된다.
일 양상에서, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 124 및 123의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH 도메인에서 위치 147 및 213의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 E에 의해 치환된다.
일 양상에서, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 123의 아미노산은 R에 의해 치환되고 위치 124의 아미노산은 K에 의해 치환되며, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH 도메인에서 위치 147 및 213의 아미노산 (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)은 둘 모두가 E에 의해 치환된다.
일 양상에서, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CL 도메인에서 위치 124 및 123의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 CH 도메인에서 위치 147 및 213의 아미노산은 E에 의해 치환되며, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 VL 도메인에서 위치 38의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 제1 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 VH 도메인에서 위치 39의 아미노산은 E에 의해 치환되고, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 VL 도메인에서 위치 38의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 제2 항원 결합 수용체의 Fab 또는 crossFab 단편의 VH 도메인에서 위치 39의 아미노산은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따라 번호매김).
예시적인 T 세포 활성화 항원 결합 수용체
본 발명의 개념의 증거로서, 첨부된 도면 및 도 1A에서 예시적으로 표시된 바와 같이, 항원 결합 수용체 "항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17097" (SEQ ID NO: 7, 9)는 CD20에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것이 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17097"의 서열 (아미노산 및 DAN)는 표 2 및 표 3에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-CD20-crossFab(VH-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17098" (SEQ ID NO: 36, 38)는 CD20에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것이 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-CD20-crossFab(VH-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17098"의 서열 (아미노산)은 표 4에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-CD20-crossFab(VL-CH)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 41, 43)는 CD20에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것이 구축된다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-CD20-crossFab(VL-CH)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산 및 DNA)은 표 5 및 6에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-CD20-Fab(VL-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 50, 8)는 CD20에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것이 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-CD20-Fab(VL-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산)은 표 7에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 51)는 CD20에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 scFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것이 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산 및 DNA)는 표 8 및 9에 표시되어 있다.
추가 증거 및 참고로서, 항원 결합 수용체 "항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162" (SEQ ID NO:60)는 CD20에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 안정한 scFv 항원 결합 모이어티를 포함하는 것이 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항체 결합 분자 "항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162"의 서열 (아미노산 및 cDNA)는 표 10 및 11에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-PDL1-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 74, 76)는 PDL1에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것을 구축하였다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-PDL1-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산)은 표 12에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-PDL1-crossFab(VH-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 79, 81)는 PDL1에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것을 구축하였다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-PDL1-crossFab(VH-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산)은 표 13에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-PDL1-crossFab(VL-CH)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 82, 84)는 PDL1에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것을 구축하였다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-PDL1-crossFab(VL-CH)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산)은 표 14에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-PDL1-Fab (VL-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 85, 75)는 PDL1에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것을 구축하였다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-PDL1-Fab(VL-CL)-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산)은 표 15에 표시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가 증거로서, 항원 결합 수용체 "항-PDL1-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO: 86)는 PDL1에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 scFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것을 구축하였다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-PDL1-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD"의 서열 (아미노산)은 표 16에 표시되어 있다.
추가의 증거 및 참고로서, 항원 결합 수용체 "항-PDL1-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162" (SEQ ID NO:88)는 PDL1에 결합하고/그에 대해 유도되고/그와 상호작용하는 하나의 안정한 scFv 항원 결합 모이어티를 포함하는 것을 구축하였다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 공자극성 신호전달 도메인으로서 CD28의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서 CD3z의 단편을 더 포함한다. 항체 결합 분자 "항-PDL1-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162"의 서열 (아미노산)은 표 17에 표시되어 있다.
키트
본 발명의 추가 양상은 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 및/또는 세포, 바람직하게 본 발명의 항원 결합 수용체가 형질도입된 T 세포를 포함하거나 또는 그로 이루어진 키트이다. 본 발명의 키트의 일부는 바이알 또는 보틀 또는 용기 또는 다수용기 유닛의 조합에 개별적으로 포장될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 키트는 부모 세포, 바람직하게 본 명세서에 기술된 바와 같은 T 세포를 본 발명의 항원 결합 수용체(들)로 형질도입시킬 수 있고 GMP (good manufacturing practice; 우수 의약품 제조 관리 기준) (http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm 하에 유럽연합 집행위원회가 공개한 우수 의약품 제조 관리 기준에 대한 지침에서 기술된 바와 같은, 우수 의약품 제조 관리 기준) 조건 하에서 인큐베이션시킬 수 있는 (밀폐된) 백 세포 인큐베이션 시스템을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 단리/수득된 환자 T 세포를 본 발명의 항원 결합 수용체(들)로 형질도입시킬 수 있고 GMP 하에 인큐베이션시킬 수 있는 (밀폐된) 백 세포 인큐베이션 시스템을 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 맥락에서, 키트는 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체(들)를 코딩하는 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 특히 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유리하게 사용될 수 있고 예를 들어 연구 도구 또는 의료 도구로서 본 명세서에 언급된 다양한 적용분에야 적용될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게 당업자에게 공지된 표준 절차를 따른다.
본 문맥에서, 환자 유래 세포, 바람직하게 T 세포는 상기 기술된 바와 같은 키트를 사용하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 수용체로 형질도입될 수 있다. 본 발명의 키트가 형질도입된 환자 유래 세포는 항원 결합 모이어티의 표적, 예를 들어 종양 연관 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 획득하게 되고 그를 통해 표적 세포의 제거/용해를 유도할 수 있게 된다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체의 세포외 도메인의 결합은 그 세포를 활성화시키고 종양 세포와 물리적으로 접촉하게 된다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 수용체 분자를 발현하는 T 세포는 생체 내 및/또는 시험관 내에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 표적 세포를 용해시키는 능력을 갖는다. 상응하는 표적 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같이 적어도 하나의 항원 결합 모이어티에 의해 인식되는, 표면 분자, 즉 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생된 종양-특이적 항원을 발현하는 세포를 포함한다. 이러한 표면 분자는 하기 본 명세서에서 특징규명된다.
표적 세포의 용해는 당분야에 공지된 방법으로 검출될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 특히 생리학적 시험관내 어세이를 포함한다. 이러한 생리학적 어세이는 예를 들어, 세포막 무결성의 소실에 의해 세포 세멸을 모니터링할 수 있다 (예를 들어, FACS 기반 프로피듐 아이오다이드 어세이, 트립판 블루 유입 어세이, 측광성 효소 방출 어세이 (LDH), 방사측정 51Cr 방출 어세이, 형광측정 유로피움 방출 및 칼세인 AM 방출 어세이). 추가의 어세이는 예를 들어 측광성 MTT, XTT, WST-1 및 alamarBlue 어세이, 방사측정 3H-Thd 도입 어세이에 의한 세포 생존능의 모니터링, 세포 분열 활성을 측정하는 클론원성 어세이, 및 미토콘드리아 경막 구배를 측정하는 형광측정 로다민123 어세이를 포함한다. 또한, 아폽토시스는 예를 들어 FACS-기반 포스파티딜세린 노출 어세이, ELISA-기반 TUNEL 시험, 캐스파제 활성 어세이 (측광성, 형광측정 또는 ELISA-기반) 또는 변화된 세포 형상의 분석 (수축, 막 수포)을 통해서 모니터링될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포
본 발명의 추가 양상은 본 발명의 항원 결합 수용체(들)를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포이다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체는 T 세포의 표면 내 및/또는 그 위에 천연적으로 포함되지 않고 정상 (비형질도입) T 세포 내 또는 그 위에서 (내생적으로) 발현되지 않는 분자에 관한 것이다. 따라서, T 세포 내 및/또는 그 위의 본 발명의 항원 결합 수용체는 T 세포에 인공적으로 도입된다. 본 발명의 맥락에서 상기 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포는 본 명세서에 정의된 바와 같이 치료하려는 대상체로부터 단리/수득될 수 있다. 따라서, 인공적으로 도입되어 이후에 상기 T 세포의 표면 내 및/또는 위에 제시되는 항원 결합 수용체는 (시험관 내 또는 생체 내에서) 종양 연관 항원에 접근가능한 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 도메인을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 인공적으로 도입된 이들 분자는 하기 본 명세서에 기술된 바와 같이 (레트로바이러스 또는 렌티바이러스) 형질도입 후 상기 T 세포의 표면 내 및/또는 그 위에 제시된다. 따라서, 형질도입 이후에, 본 발명에 따른 T 세포는 종양 연관 항원, 바람직하게 종양 세포의 표면 상에 제시/접근가능한 항원일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하는 형질도입된 T 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자 또는 본 발명의 항원 결합 수용체의 발현을 유도할 수 있는 본 발명의 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "형질도입된 T 세포"는 유전자 변형된 T 세포 (즉, 핵산 분자가 의도적으로 도입된 T 세포)에 관한 것이다. 본 명세서에서 제공된 형질도입된 T 세포는 본 발명의 벡터를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 명세서에서 제공된 형질도입된 T 세포는 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자 및/또는 본 발명의 벡터를 포함한다. 본 발명의 형질도입된 T 세포는 외래 DNA (즉, T 세포에 도입된 핵산 분자)를 일시적으로 또는 안정적으로 발현하는 T 세포일 수 있다. 특히, 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 게놈으로 안정하게 통합될 수 있다. mRNA 형질감염을 사용하여, 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자는 일식적으로 발현될 수 있다. 바람직하게, 본 명세서에서 제공하는 형질도입된 T 세포는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 통해서 T 세포로 핵산 분자를 도입시켜 유전자 변형시켰다. 따라서, 항원 결합 수용체의 발현은 항상적일 수 있고 항원 결합 수용체의 세포외 도메인이 세포 표면 상에서 검출가능할 수 있다. 항원 결합 수용체의 이러한 세포외 도메인은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체의 완전한 세포외 도메인뿐만 아니라 이의 일부분을 포함할 수 있다. 필요한 최소 크기는 항원 결합 수용체에서 항원 결합 모이어티의 항원 결합 부위이다.
발현은 또한 항원 결합 수용체가 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에서 T 세포에 도입되는 경우에 조건성일 수 있거나 또는 유도성일 수 있다. 이러한 유도성 또는 억제성 프로모터의 예는 알콜 디히드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터 및 트랜스활성인자 단백질 AlcR을 함유하는 전사 시스템일 수 있다. 상이한 농업용 알콜-기반 제제를 사용하여 alcA 프로모터에 연결된 관심 유전자의 발현을 제어한다. 뿐만 아니라, 테트라사이클린-반응성 프로모터 시스템은 테트라사이클린의 존재 하에서 유전자 발현 시스템을 활성화시키거나 또는 억제시키는 기능을 할 수 있다. 이 시스템의 엘리먼트의 일부는 테트라사이클린 억제인자 단백질 (TetR), 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO), 및 TetR 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 서열의 융합체인 테트라사이클린 트랜스활성인자 융합 단백질 (tTA)을 포함한다. 또한, 스테로이드-반응성 프로모터, 금속-조절 또는 발병기전-관련 (PR) 단백질 관련 프로모터가 사용될 수 있다.
발현은 사용된 시스템에 의존적으로, 항상적 또는 구성적일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 본 명세서에서 제공된 형질도입된 T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 항원 결합 수용체의 세포외 부분 (즉, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 세포 표면 상에서 검출될 수 있는 한편, 세포내 부분 (즉, 공자극성 신호전달 도메인(들) 및 자극성 신호전달 도메인)은 세포 표면에서 검출가능하지 않다. 항원 결합 수용체의 세포외 도메인의 검출은 이러한 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 세포외 도메인이 결합할 수 있는 항원을 사용하여 수행될 수 있다. 세포외 도메인은 유세포측정 또는 현미경을 통해 이들 항체 또는 항원을 사용해 검출될 수 있다.
본 발명의 형질도입된 세포는 임의의 면역 세포일 수 있다. 이들은 제한없이 B-세포, T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, γδ T 세포, 선천성 림프 세포, 마크로파지, 단핵구, 수지상 세포 또는 호중구를 포함한다. 우선적으로, 상기 면역 세포는 림프구, 우선적으로 NK 또는 T 세포이다. 상기 T 세포는 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 포함한다. 백혈구의 표면 상에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 촉발은 세포가 기원하는 계통과 무관하게 표적 세포에 대한 세포의 세포독성을 야기하게 될 것이다. 세포독성은 항원 결합 수용체에 대해 선택된 자극성 신호전달 도메인 또는 공자극성 신호전달 도메인과 무관하게 일어나게 되고 추가의 사이토카인의 외생적 공급에 의존하지 않는다. 따라서, 본 발명의 형질도입된 세포는 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+-T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 종양-침윤성 림프구 (TIL) 세포, 골수 세포, 또는 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게, 본 명세서에서 제공하는 형질도입된 세포는 T 세포 (예를 들어, 자기유래 T 세포), 더 바람직하게, 형질도입된 세포는 CD8+ T 세포이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 CD8+ T 세포이다. 또한, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 자기유래 T 세포이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 바람직하게 자기유래 CD8+ T 세포이다. 대상체로부터 단리된 자기유래 세포 (예를 들어, T 세포)의 사용이외에도, 본 발명은 또한 동종이계 세포의 사용을 고려한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 형질도입된 세포는 또한 동종이계 세포, 예컨대 동종이계 CD8+ T 세포일 수 있다. 동종이계 세포의 사용은 세포, 바람직하게 T 세포가 외래 항원-제시 세포 (APC)에 의해 제시된 특이적 항원 에피토프를 인식할 수 있다는 사실을 기반으로 하고, 단 APC는 T 세포에 의해 인식되는 항원 에피토프와 함께, 특이적 반응 세포 개체군, 즉 T 세포 개체군을 제한하는, MHC 분자, 클래스 I 또는 클래스 II를 발현한다. 따라서, 용어 동종이계는 예를 들어 본 명세서에 기술된 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 세포에 의해서 치료하게 되는 개체/대상체에게 상용성인 인간 백혈구 항원 (HLA)인 미관련 도너 개체/대상체로부터의 미관련 유래의 세포를 의미한다. 자기유래 세포는 본 명세서에 기술된 형질도입된 세포로 치료하려는 대상체로부터 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이 단리/수득된 세포를 의미한다.
본 발명의 형질도입된 세포는 추가의 핵산 분자, 예를 들어 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산 분자로 공동-형질도입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 T 세포에 본 발명의 벡터를 형질도입시키는 단계, 상기 형질도입된 세포 내 또는 그 위에서 항원 결합 수용체의 발현을 허용하는 조건 하에 형질도입된 T 세포를 배양하는 단계 및 상기 형질도입된 T 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 형질도입된 세포는 바람직하게 다음의 과정에 의해 생성된다: 세포 (예를 들어, T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포)는 대상체 (바람직하게, 인간 환자)로부터 단리/수득된다. 환자 또는 도너로부터 세포 (예를 들어, T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포)를 단리/수득하기 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있고 본 발명의 맥락에서 환자 또는 도너 유래의 세포 (예를 들어, T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포)는 골수의 제거 또는 채혈에 의해 단리될 수 있다. 환자의 샘플로서 세포를 단리/수득 후, 세포 (예를 들어, T 세포)는 샘플의 다른 성분으로부터 분리된다. 샘플로부터 세포 (예를 들어, T 세포)를 분리하기 위한 방법은 공지되어 있고, 제한없이, 예를 들어 환자 또는 도너 유래의 말초 혈액 샘플로부터 세포를 수득하기 위한 백혈구분리반출술, FACSort 장비를 사용한 세포의 단리/수득, 미세조작기 또는 수동으로 생존 세포를 보유하는 신선한 생검 표본으로부터 사멸 세포의 현존 채취를 포함한다 (예를 들어, [Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342]; [Robbins, Clin. Oncol. 29 (201 1), 917-924] 또는 [Leisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573-58] 참조). 단리/수득된 세포 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 이후에 예를 들어 항-CD3 항체를 사용하고/하거나, 항-CD3 및 항-CD28 단일클론 항체를 사용하고/하거나, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 인터루킨-2 (IL-2)를 사용하여 배양 및 확장시킨다 (예를 들어, [Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342] 또는 [Dudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239] 참조).
후속 단계에서 세포 (예를 들어, T 세포)는 당분야에 공지된 방법을 통해 인공적으로/유전자적으로 변형/형질도입시킨다 (예를 들어, [Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386] 참조). 세포 (예를 들어, T 세포)에 형질도입시키기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 제한없이 핵산 또는 재조합 핵산이 형질도입되는 경우에, 예를 들어 전기천공 방법, 칼슘 포스페이트 방법, 양이온 지질 방법 또는 리포솜 방법을 포함한다. 형질도입하려는 핵산은 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약, 예를 들어 Lipofectamine (Invitrogen 제품, 카탈로그 번호: 11668027)을 사용하여 통상적으로 고도로 효율적으로 형질도입될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터는 그 벡터가 플라스미드 벡터 (즉, 바이러스 벡터가 아닌 벡터)인 한 상기 언급된 핵산과 동일한 방식으로 형질도입될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 세포 (예를 들어, T 세포)를 형질도입시키기 위한 방법은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 T 세포 형질도입, 비바이러스 벡터 (예를 들어, 슬리핑 뷰티 미니서클 벡터)를 비롯하여 mRNA 형질감염을 포함한다. "mRNA 형질감염"은 형질도입시키려는 세포에서, 관심 단백질, 예컨대 이 경우에서는 본 발명의 항원 결합 수용체를 일시적으로 발현시키기 위한 당업자에게 충분히 공지된 방법을 의미한다. 간단히 세포는 전기천공 시스템 (예컨대, 예를 들어 Gene Pulser, Bio-Rad)을 사용해 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 mRNA로 전기천공되고 그 이후에 상기 기술된 바와 같은 표준 세포 (예를 들어, T 세포) 배양 프로토콜에 의해 배양될 수 있다 ([Zhao et al., Mol Ther. 13(1) (2006), 151-159] 참조). 본 발명의 형질도입되는 세포는 T 세포, 가장 바람직하게 CD8+ T 세포이고, 렌티바이러스, 또는 가장 바람직하게 레트로바이러스 T 세포 형질도입에 의해 생성된다.
이러한 문맥에서, T 세포를 형질도입시키기 위해 적합한 레트로바이러스 벡터는 예컨대 SAMEN CMV/SRa (Clay et al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa (Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 및 LXSN (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423), 또는 pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136)와 같이 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 세포 (예를 들어, T 세포)를 형질도입시키기 위해 적합한 렌티바이러스 벡터는 예를 들어 PL-SIN 렌티바이러스 벡터 (Hotta et al., Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI (Campeau et al., PLoS One 4(8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (Addgene Catalogoue No.:22036), FUGW (Lois et al., Science 295(5556) (2002), 868-872), pLVX-EF1 (Addgene Catalogue No.: 64368), pLVE (Brunger et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806), pCDH1-MCS1-EF1 (Hu et al., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang et al., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon et al., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang et al., Sci Signal. 6(287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie et al., J Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (Addgene Catalogoue No.: 62053), pLS (Miyoshi et al., J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik et al., J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi et al., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser et al., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821), pBOB (Marr et al., J Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5-11), 또는 pLEX (Addgene Catalogue No.: 27976)가 있다.
본 발명의 형질도입된 T 세포/T 세포들은 바람직하게 그들의 천연 환경 밖에서, 제어된 조건 하에 성장된다. 특히, 용어 "배양하는"은 다세포 진핵생물 (바람직하게 인간 환자)로부터 유래되는 세포 (예를 들어, 본 발명의 형질도입된 세포(들))가 시험관 내에서 성장하는 것을 의미한다. 세포를 배양하는 것은 그들의 본래 조직 근원으로부터 분리시킨 세포를 살아있게 유지시키는 실험실 기술이다. 본 명세서에서 본 발명의 형질도입된 세포는 상기 형질도입된 세포 내 또는 그 위에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양된다. 발현을 가능하게 하는 조건 또는 이식유전자 (즉, 본 발명의 항원 결합 수용체의 것)는 당분야에서 통상적으로 공지되어 있고 예를 들어, 효현성 항-CD3- 및 항-CD28 항체, 및 사이토카인 예컨대 인터루킨 2 (IL-2), 인터루킨 7 (IL-7), 인터루킨 12 (IL-12) 및/또는 인터루킨 15 (IL-15)의 첨가를 포함한다. 배양되는 형질도입된 세포 (예를 들어, CD8+ T)에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 발현 이후에, 형질도입된 세포는 배양물 (즉, 배양 배지)로부터 회수 (즉, 재추출)된다.
따라서, 또한 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 세포, 바람직하게 T 세포, 특히 CD8+ T 이다.
핵산 분자
본 발명의 추가 양상은 본 발명의 하나 또는 몇개의 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 및 벡터이다. 본 발명의 항원 결합 수용체를 코딩하는 예시적인 핵산 분자는 SEQ ID NO:22, 46, 55 및 64에 표시되어 있다. 본 발명의 핵산 분자는 조절 서열의 제어 하에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체의 유도되는 발현을 가능하게 하는 프로모터, 전사 인핸서 및/또는 서열이 적용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 핵산 분자는 항상성 또는 유도성 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 적합한 프로모터는 예를 들어 CMV 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), UBC 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), PGK (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), EF1A 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), CAGG 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), SV40 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), COPIA 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), ACT5C 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), TRE 프로모터 (Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611), Oct3/4 프로모터 (Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)), 또는 Nanog 프로모터 (Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24)가 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터(들)에 관한 것이다. 본 명세서에서 용어 벡터는 도입된 숙주 세포 (즉, 형질도입된 세포)에서 자체적으로 복제될 수 있는 원형 또는 선형 핵산 분자에 관한 것이다. 많은 적합한 벡터는 분자 생물학의 당업자에게 공지되어 있고, 그의 선택은 바람직한 기능에 따라 좌우되고 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함한다. 당업자에게 충분히 공지된 방법, 예를 들어 참고로, [Sambrook et al. (loc cit.) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)]에 기술된 방법을 사용하여 다양한 플라스미드 및 벡터를 구축할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포에 전달을 위해 리포솜으로 재구성될 수 있다. 하기에 더욱 상술되는 바와 같이, 클로닝 벡터는 DNA의 개별 서열을 단리하는데 사용되었다. 관련 서열은 특정한 폴리펩티드의 발현이 필요한 박현 벡터에 전달될 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322, pGA18 및 pGBT9를 포함한다. 전형적인 발현 벡터는 pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT를 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 코딩하는 상기 핵산 분자(들)에 작동적으로 연결된 조절 서열인 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터(들)에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서 벡터는 폴리시스트론일 수 있다. 이러한 조절 서열 (제어 엘리먼트)은 당업자에게 공지되어 있고, 프로모터, 스플라이스 카세트, 번역 개시 코돈, 번역 및 벡터(들)에 삽입부를 도입시키기 위한 삽입 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 핵산 분자(들)는 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 발현을 가능하게 하는 상기 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 상기 벡터(들)는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터(들)라는 것을 파악한다. 작동적으로 연결된은 그렇게 기술된 성분들이 그들이 그들의 의도하는 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재하는 근접위치를 의미한다. 코딩 서열에 작동적으로 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 상용성인 조건 하에서 획득되는 방식으로 결찰된다. 제어 서열이 프로모터인 경우에, 바람직하게 이중 가닥 핵산이 사용된다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 맥락에서 언급된 벡터(들)는 발현 벡터(들)이다. 발현 벡터는 선택된 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 구성체이고 선택된 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공한다. 발현 벡터(들)는 예를 들어 클로닝 벡터(들), 이원 벡터(들) 또는 통합 벡터(들)일 수 있다. 발현은 바람직하게 번역가능한 mRNA로 핵산의 전사를 포함한다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포에서 발현을 보장하는 조절 엘리먼트는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 진핵생물 세포의 경우에서 그들은 정상적으로 전사의 개시를 보장하는 프로모터 및 임의로 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 원핵생물 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절 엘리먼트는 예를 들어 이. 콜라이에서의 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵생물 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 조절 엘리먼트의 예에는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-, SV40, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이 있다.
전사의 개시를 담당하는 엘리먼트 이외에도 이러한 조절 엘리먼트는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류에 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 사용되는 발현 시스템에 따라서, 폴리펩티드를 세포 구획으로 유도시킬 수 있거나 또는 배지로 분비시킬 수 있는 신호 펩티드를 코딩하는 리더 서열이 언급된 핵산 서열의 코딩 서열에 첨가될 수 있고 당분야에 충분히 공지되어 있으며, 또한 예를 들어 첨부된 실시예를 참조한다.
리더 서열(들)은 번역, 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게, 주변세포질 공간 또는 세포외 매질로 번역된 단백질 또는 이의 일부분의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열과 적절한 단계로 조립된다. 임의로, 이종성 서열은 바람직한 특징, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순한 정제를 부여하는 N-말단 식별 펩티드를 포함하는 항원 결합 수용체를 코딩할 수 있고, 상기를 참고한다. 이러한 문맥에서, 적합한 발현 벡터는 당분야에 공지되어 있고 예컨대 오카야마-베르그 (Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150) 또는 pSPORT1 (GIBCO BRL)이 있다.
본 발명의 맥락에서, 발현 제어 서열은 진핵생물 세포를 형질도입 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터의 진핵생물 프로모터 시스템일 수 있지만, 원핵생물 세포를 위한 제어 서열도 역시 사용될 수 있다. 벡터가 적절한 세포에 도입되면, 세포는 뉴클레오티드 서열의 높은 발현 수준에 적합한 조건 하에서 그리고 바람직하게 유지된다. 추가의 조절 엘리먼트는 전사를 비롯하여 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 유리하게, 본 발명의 상기 기술된 벡터는 선별 및/또는 득점 (scorable) 마커를 포함한다. 형질감염된 세포 및 예를 들어, 식물 조질 및 식물의 선별에 유용한 선별 마커 유전자는 당분야에 충분히 공지되어 있고, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr에 대한 선별을 기반으로 하는 항대사산물 내성 (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), 아미노글리코시드, 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 내성을 부여하는, npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995), 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485)를 포함한다. 추가의 선별 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있게 하는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 세포가 만노스를 이용할 수 있게 하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (WO 94/20627), 및 오르니틴 디카복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 디카복실라제) (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) 또는 블라스티시딘 S에 대한 내성을 부여하는 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) 유래 디아미나제 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)가 기술된 바 있다.
유용한 득점 마커가 또한 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 유리하게, 상기 마커는 루시퍼라제 코딩 유전자 (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), 녹색 형광발광 단백질 (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) 또는 β-글루쿠로니다제 (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907)이다. 이러한 실시형태는 언급된 벡터를 함유하는 세포, 조직 및 유기체의 간단하고 신속한 스크리닝에 특이 유용하다.
상기 기술된 바와 같이, 언급된 핵산 분자(들)는 예를 들어, 양자 T 세포 요법뿐만 아니라 또한 유전자 요법 목적을 위해서, 세포에서 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하기 위한 벡터(들)의 일부분으로서 또는 단독으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 항원 결합 수용체 중 어느 하나를 코딩하는 DNA 서열(들)을 함유하는 핵산 분자 또는 벡터(들)는 세포에 도입되어서 관심 폴리펩티드를 생성시킨다. 생체외 또는 생체내 기술을 통해 세포로 치료적 유전자를 도입시키는 것을 기반으로 하는 유전자 요법은 유전자 전달의 가장 중요한 적용 중 하나이다. 시험관내 또는 생체내 유전자 요법을 위한 유전자-전달 시스템 또는 방법을 위한 적합한 벡터, 방법 또는 유전자 전달 시스템은 문헌에 기술되어 있고, 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 [Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539]; [Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919]; [Anderson, Science 256 (1992), 808-813]; [Verma, Nature 389 (1994), 239]; [Isner, Lancet 348 (1996), 370-374]; [Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086]; [Onodera, Blood 91 (1998), 30-36]; [Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699]; [Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292]; [Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51]; [Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716]; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859; US 5,589,466; 또는 [Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640]를 참조한다. 언급된 핵산 분자(들) 및 벡터(들)는 세포에 직접 도입 또는 리보솜, 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스)를 통한 도입을 위해 디자인될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 세포는 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, CD3+ T 세포, γδ T 세포 또는 자연 살해 (NK) T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포이다.
상기에 따라서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 항원 결합 수용체의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드 및 박테리오파지를 구동시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 바이러스 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연합 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 파필로마 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 표적화된 세포 개체군으로 언급된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 전달을 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 충분히 공지된 방법은 예를 들어, Sambrook 등 (loc cit.), Ausubel (1989, loc cit.) 또는 다른 표준 참고서에 기술된 기술을 사용해 재조합 벡터(들)를 구축하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 언급된 핵산 분자 및 벡터는 표적 세포로 전달을 위해 리포솜으로 재구성될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 가변적인, 충분히 공지된 방법을 통해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 클로라이드 형질감염이 원핵생물 세포에 일반적으로 이용되는 반면, 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있으며, [Sambrook, 상동]을 참조한다. 언급된 벡터는 특히 pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo일 수 있다. 벡터 pEF-DHFR, pEF-ADA 및 pEF-neo는 당분야에서, 예를 들어, 문헌 [Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-7025] 및 [Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150]에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 벡터를 형질전환 또는 형질감염시킨 T 세포를 제공한다. 상기 T 세포는 T 세포 또는 이의 전구체 세포에 상기 기술된 벡터 중 적어도 하나 또는 상기 기술된 핵산 분자 중 적어도 하나를 도입시켜 생성시킬 수 있다. T 세포에 상기 적어도 하나의 벡터 또는 적어도 하나의 핵산 분자의 존재는 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 상기 기술된 항원 결합 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다. 본 발명의 벡터는 폴리시스트론일 수 있다.
T 세포 또는 이의 전구체 세포에 도입되는 기술된 핵산 분자(들) 또는 벡터(들)은 세포의 게놈에 통합될 수 있거나 또는 염색체외에서 유지될 수 있다.
종양 특이적 항원
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 항원 결합 수용체는 세포 표면 분자, 즉 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생되는 종양-특이적 항원에 대해 특이성을 갖는 항원-상호작용-부위/항원 결합 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 항원-상호작용-부위는 본 명세서에 기술된 항원 결합 수용체를 포함하는 본 명세서에 기술된 바와 같이 형질도입된 T 세포를 종양 세포와 물리적으로 접촉하게 되고, 여기서 형질도입된 T 세포는 활성화된다. 본 발명의 형질도입된 T 세포의 활성화는 본 명세서에 기술된 바와 같이 종양 세포의 용해를 일으킬 수 있다.
종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생되는 종양 마커/종양 연관 항원의 예는 하기 본 명세서에 제공되어 있고 제한없이, FAP (섬유아세포 활성화 단백질), CEA (암배 항원), p95 (p95HER2), BCMA (B-세포 성숙화 항원), EpCAM (상피 세포 부착 분자), MSLN (메소텔린), MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), HER-1 (인간 상피 성장 인자 1), HER-2 (인간 상피 성장 인자 2), HER-3 (인간 상피 성장 인자 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 인간 영양아층 세포-표면 항원 2 (Trop-2) 암 항원 12-5 (CA-12-5), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련 (HLA-DR), MUC-1 (뮤신-1), A33-항원, PSMA (전립선-특이적 막 항원), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3), PDL1 (프로그램된 사멸-리간드 1), PSMA (전립선 특이적 막 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), 카본 언히드라제 IX (CA-IX), 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드를 포함한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체, 종양 세포의 표면 상에 천연적으로 발생되는 항원/마커는 FAP (섬유아세포 활성화 단백질), CEA (암배 항원), p95 (p95HER2), BCMA (B-세포 성숙화 항원), EpCAM (상피 세포 부착 분자), MSLN (메소텔린), MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), HER-1 (인간 상피 성장 인자 1), HER-2 (인간 상피 성장 인자 2), HER-3 (인간 상피 성장 인자 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 인간 영양아층 세포-표면 항원 2 (Trop-2) 암 항원 12-5 (CA-12-5), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련 (HLA-DR), MUC-1 (뮤신-1), A33-항원, PSMA (전립선-특이적 막 항원), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3), PDL1 (프로그램된 사멸-리간드 1), PSMA (전립선 특이적 막 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), 카본 언히드라제 IX (CA-IX), 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
A33-항원, BCMA (B-세포 성숙화 항원), 암 항원 12-5 (CA-12-5), 카본 언히드라제 IX (CA-IX), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA (암배 항원), EpCAM (상피 세포 부착 분자), FAP (섬유아세포 활성화 단백질), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3), 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), HER-1 (인간 상피 성장 인자 1), HER-2 (인간 상피 성장 인자 2), HER-3 (인간 상피 성장 인자 3), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련 (HLA-DR), MSLN (메소텔린), MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), MUC-1 (뮤신-1), PDL1 (프로그램된 사멸-리간드 1), PSMA (전립선 특이적 막 항원), PSMA (전립선-특이적 막 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), p95 (p95HER2), 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), 인간 영양아층 세포-표면 항원 2 (Trop-2)의 (인간) 구성원의 서열(들)은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이타로부터 입수가능하고 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=reviewed%3Ayes에서 검색할 수 있다. 이들 (단백질) 서열은 또한 주석달린 변형 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 제공하는 간결한 서열의 상동성 서열, 및 또한 유전적 대립유전자 변이체 등을 사용하는 기술 및 방법을 제공한다. 바람직하게 본 명세서의 간결한 서열의 이러한 변이체 등이 사용된다. 바람직하게, 이러한 변이체는 유전자 변이체이다. 당업자는 또한 게놈 DNA를 비롯하여 mRNA/cDNA의 등재 번호를 포함할 수 있는, 이들 데이타은행 등재 항목에서 이들 (단백질) 서열의 관련 코딩 영역을 쉽게 추론할 수 있다. (인간) FAP (섬유아세포 활성화 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q12884 (등재 버전 168, 서열 버전 5)로부터 수득될 수 있고; (인간) CEA (암배 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P06731 (등재 버전 171, 서열 버전 3)로부터 수득될 수 있거나; (인간) EpCAM (상피 세포 부착 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P16422 (등재 버전 117, 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) MSLN (메소텔린)의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 Q13421 (버전 번호 132; 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P36888 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q13414 (2차 수탁 번호) (버전 번호 165 및 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸)의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 Q6UVK1 (버전 번호 118; 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) 폴레이트 수용체 1 (FOLR1)의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 P15328 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q53EW2 (2차 수탁 번호) (버전 번호 153 및 서열 버전 3)로부터 수득될 수 있거나; (인간) 영양막 세포-표면 항원 2 (Trop-2)의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 P09758 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q15658 (2차 수탁 번호) (버전 번호 172 및 서열 버전 3)로부터 수득될 수 있거나; (인간) PSCA (전립선 줄기 세포 항원)의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 O43653 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q6UW92 (2차 수탁 번호) (버전 번호 134 및 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) HER-1 (상피 성장 인자 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P00533 (등재 버전 177, 서열 버전 2)으로부터 수득될 수 있거나; (인간) HER-2 (수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P04626 (등재 버전 161, 서열 버전 1)으로부터 수득될 수 있거나; (인간) HER-3 (수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P21860 (등재 버전 140, 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) CD20 (B-림프구 항원 CD20)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P11836 (등재 버전 117, 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) CD22 (B-림프구 항원 CD22)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P20273 (등재 버전 135, 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) CD33 (B-림프구 항원 CD33)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P20138 (등재 버전 129, 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) CA-12-5 (뮤신 16)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q8WXI7 (등재 버전 66, 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있거나; (인간) HLA-DR의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q29900 (등재 버전 59, 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) MUC-1 (뮤신-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P15941 (등재 버전 135, 서열 버전 3)로부터 수득될 수 있거나; (인간) A33 (세포 표면 A33 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q99795 (등재 버전 104, 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) PDL1 (프로그램된 사멸-리간드 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q9NZQ7 (등재 버전 148, 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) PSMA (글루타메이트 카르복시펩티다제 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q04609 (등재 버전 133, 서열 버전 1)로부터 수득될 수 있거나; (인간) 트랜스페린 수용체의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q9UP52 (등재 버전 99, 서열 버전 1) 및 P02786 (등재 버전 152, 서열 버전 2)으로부터 수득될 수 있거나; (인간) TNC (테나신)의 서열은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P24821 (등재 버전 141, 서열 버전 3)로부터 수득될 수 있거나; 또는 (인간) CA-IX (카본산 언히드라제 IX)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q16790 (등재 버전 115, 서열 버전 2)로부터 수득될 수 있다.
치료적 용도 및 치료 방법
본 명세서에서 제공하는 분자 또는 구성체 (즉, 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 및 키트)는 의학적 상황에서, 특히 악성 질환의 치료를 위해 특히 유용하다. 예를 들어, 종양은 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있다. 따라서, 일정한 실시형태에서, 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트는 악성 질환의 치료에서 사용되고, 특히 여기서 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
치료의 종양 특이성은 본 발명의 항원 결합 수용체(들)의 항원 결합 모이어티/모이어티들에 의해 제공된다.
본 문맥에서 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암/암종 또는 혈액의 암일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 경구암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 췌장암, 신장 세포 암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨생식관의 암, 예를 들어, 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관의 암, 식도암, 타액분비선의 암 및 갑상선의 암 또는 혈액학적 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 종양성 질환 및/또는 림프종은 이들 의학적 징후(들)에 대해 유도된 특별한 구성체로 치료될 수 있다. 본 발명의 형질도입된 T 세포에 대한 표시는 종양 항원에 대한 항원 결합 수용체의 특이성에 의해 제공된다. 예를 들어, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 경구암은 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생된 종양-특이적 항원과 같은) (인간) EpCAM에 대해 유도된 항원 결합 수용체로 치료될 수 있다.
위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 경구암은 HER1, 바람직하게 인간 HER1에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 뿐만 아니라, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암은 MCSP, 바람직하게 인간 MCSP에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암은 FOLR1, 바람직하게 인간 FOLR1에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암은 Trop-2, 바람직하게 인간 Trop-2에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암은 PSCA, 바람직하게 인간 PSCA에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암은 EGFRvIII, 바람직하게 인간 EGFRvIII에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암은 MSLN, 바람직하게 인간 MSLN에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위암, 유방암 및/또는 자궁경부암은 HER2, 바람직하게 인간 HER2에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위암 및/또는 폐암은 HER3, 바람직하게 인간 HER3에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종은 CD20, 바람직하게 인간 CD20에 의해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종은 CD22, 바람직하게 인간 CD22에 의해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 골수성 백혈병은 CD33, 바람직하게 인간 CD33에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장암은 CA12-5, 바람직하게 인간 CA12-5에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 백혈병 및/또는 비인두 암종은 HLA-DR, 바람직하게 인간 HLA-DR에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암은 MUC-1, 바람직하게 인간 MUC-1에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 결장암은 A33, 바람직하게 인간 A33에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 췌장암은 PSMA, 바람직하게 인간 PSMA에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 경구암은 트랜스페린 수용체, 바람직하게 인간 트랜스페린 수용체에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 췌장암, 폐암 및/또는 유방암은 트랜스페린 수용체, 바람직하게 인간 트랜스페린 수용체에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다. 신장암은 CA-IX, 바람직하게 인간 CA-IX에 대해 유도된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 의해 치료될 수 있다.
하나를 초과하는 본 명세서에 기술된 T 세포는 공동-적용될 수 있고/있거나, 본 발명에 따른 하나를 초과하는 항원 결합 수용체는 동일한 T 세포에서 공동-발현 및/또는 공동-형질도입될 수 있다. 본 발명은 단일 항원 결합 수용체가 본 발명의 T 세포에서 발현 및/또는 형질도입되는 상황과 비교하여 단일 항원 결합 수용체의 활성을 감소시키지 않고 동일한 세포 내에서 하나를 초과하는 항원 결합 수용체를 조합하는 단계를 더 포함한다.
이러한 문맥에서, 본 발명은 또한 질환, 악성 질환 예컨대 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및/또는 혈액의 암의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 발명의 맥락에서 질환의 치료를 위한 특정한 방법은
(a) T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 대상체로부터 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 수용체로 형질도입시키는 단계; 및
(c) 형질도입된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 형질도입된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포, 및/또는 치료적 항체/항체들은 정맥내 주입을 통해 상기 대상체에게 공동-투여된다.
게다가, 본 발명의 맥락에서 본 발명은 질환의 치료를 위한 방법을 제공하, 방법은
(a) T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 대상체로부터 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 수용체로 형질도입시키는 단계;
(c) 임의로 상기 단리된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 T 세포 수용체로 공동-형질도입시키는 단계;
(d) T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 확장시키는 단계; 및
(e) 형질도입된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 언급된 단계 (d) (T 세포 예컨대 TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 의해 확장시키는 단계를 언급)는 또한 (자극성) 사이토카인 예컨대 인터루킨-2 및/또는 인터루킨-15 (IL-15)의 존재 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 단계 (d) (T 세포 예컨대 TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 의해 확장시키는 단계를 언급)는 또한 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-7 (IL-7) 및/또는 인터루킨-21 (IL-21)의 존재 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 형질도입된 T 세포의 투여는 정맥내 주입에 의해 수행될 것이다. 본 발명의 맥락에서 형질도입된 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 단리/수득될 수 있다.
조성물
뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항원 결합 수용체(들)를 포함하는 조성물 (약물), 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 코딩하는 핵산 분자(들) 및 벡터(들), 및/또는 하나 이상의 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 맥락에서, 조성물은 임의로 담체, 안정화제 및/또는 부형제의 적합한 제제를 더 포함하는 약학 조성물이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포를 포함하는 약학 조성물 (약물)이 제공된다.
본 발명에 따라서, 용어 "약학 조성물"은 환자, 바람직하게 인간 환자에게 투여를 위한 조성물에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 환자가 질환을 앓는 본 발명의 맥락에서, 상기 질환은 악성 질환, 특히 상피, 내피 또는 중피 기원의 암/암종 또는 혈액의 암이다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 경구암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 췌장암, 신장 세포 암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨관의 암, 예를 들어, 고환암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관의 암, 식도암, 타액분비선의 암 및 갑상선의 암 또는 혈액학적 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 약학 조성물/약물은 조직 또는 종양으로 비경구, 경피, 내강내, 동맥내, 정맥내, 척추강내 투여 또는 직접 주사를 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 형질도입된 T 세포를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 조성물/약물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약학 조성물/약물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포를 포함하고, 특히 상기 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 수득되었다.
상기 약학 조성물(들)/약물(들)은 주입 또는 주사를 통해서 환자에게 투여되는 것이 특히 고려된다. 본 발명의 맥락에서 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포는 주입 또는 주사를 통해서 환자에게 투여될 것이다. 적합한 조성물/약물의 투여는 상이한 방식, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물/약물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 당분야에 충분히 공지되어 있고 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 충분히 공지된 통상의 방법으로 제제화될 수 있다. 이들 약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 용량 용법은 참관의 및 임상적 요인들에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 충분히 공지된 바와 같이, 어느 한 환자를 위한 용량은 환자의 체격, 신체 표면적, 연령, 투여하려는 특정 화합물, 성별, 투여 시기 및 경로, 전신 건강, 및 동시발생적으로 투여되는 다른 약물을 포함하여, 많은 인자들에 따라 좌우된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정규 투여로서 용법은 1일 당 1 ㎍ 내지 5 g 유닛의 범위여야 한다. 그러나, 연속 주입을 위해 보다 바람직한 용량은 1시간 당 체중 킬로그램 당 0.01 ㎍ 내지 2 mg, 바람직하게 0.01 ㎍ 내지 1 mg, 보다 바람직하게 0.01 ㎍ 내지 100 ㎍, 보다 더 바람직하게 0.01 ㎍ 내지 50 ㎍ 및 가장 바람직하게 0.01 ㎍ 내지 10 ㎍ 유닛의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 용량은 하기 본 명세서에 나열된다. 과정은 주기적인 평가를 통해 모니터링될 수 있다. 용량은 가변적일 것이지만 DNA의 정맥내 투여에 바람직한 용량은 대략 106 내지 1012 카피의 DNA 분자이다.
본 발명의 조성물은 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구, 예를 들어 정맥내일 것이고, 형질도입된 T 세포는 또한 예를 들어 동맥 내 부위에 카테터를 통해서, 표적 부위에 대해 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조제물은 멸균 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수용성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 염수 및 완충 배지를 포함한, 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링커 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스 기반의 것) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 단백질성 담체, 예를 들어 바람직하게 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 세포 이외에도 약학 조성물의 의도하는 용도에 따라서, 추가의 생물학적 활성제를 포함할 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 작용제는 위장계에 작용하는 약물, 정균제로서 작용하는 약물, 고뇨산혈증을 예방하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물 (예를 들어, 코르티코스테로이드), 순환계에 작용하는 약물 및/또는 당분야에 공지된 T 세포 공자극성 분자 또는 사이토카인과 같은 작용제일 수 있다.
본 발명의 조성물(들)/약물(들)의 투여를 위해 가능한 징후는 악성 질환 예컨대 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암, 특히 상피 암/암종 예컨대 유방암, 결장암, 췌장암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨관의 암, 예를 들어, 난소암, 고환암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 폐암, 위암, 담관의 암, 식도암, 타액분비선의 암 및 갑상선의 암 또는 혈액학적 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환이다.
본 발명은 다른 화합물, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 세포 증식 또는 세포 자극을 위한 활성화 신호를 제공할 수 있는 분자와의 공동-투여 프로토콜을 더욱 고려한다. 상기 분자는 예를 들어 T 세포에 대한 추가의 주요 활성화 신호 (예를 들어, 추가의 공자극성 분자: B7 패밀리의 분자, Ox40L, 4.1 BBL, CD40L, 항-CTLA-4, 항-PD-1), 또는 추가의 사이토카인 인터루킨 (예를 들어, IL-2)일 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은 또한 임의로 검출을 위한 수단 및 방법을 더 포함하는 진단 조성물일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 약물로서 사용을 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 키트, 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포를 제공한다. 본 발명의 맥락에서, 약물로서 사용을 위한 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공되고, 여기서 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함 및/또는 발현하는, 형질도입된 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포는 대상체에게 투여되고, 상기 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포는 치료하려는 대상체로부터 수득되었다. 상기 약물은 악성 질환 특히 상피, 내피 또는 중피 기원 또는 혈액의 암/암종의 치료 방법에서 적용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 경구암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 췌장암, 신장 세포 암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨관의 암, 예를 들어, 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관의 암, 식도암, 타액분비선의 암 및 갑상선의 암 또는 혈액학적 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
뿐만 아니라, 본 발명의 맥락에서 항원 결합 수용체는 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생되는 종양-특이적 항원에 결합한다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 경구암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 췌장암, 신장 세포 암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨관의 암, 예를 들어, 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관의 암, 식도암, 타액분비선의 암 및 갑상선의 암 또는 혈액학적 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따라서, 종양 항원, 바람직하게 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생된 종양-특이적 항원과 같은) 인간 종양 연관 항원에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 하나 이상, 바람직하게 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 분자 또는 구성체 (즉, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체)는 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 경구암의 치료에서 사용을 위해 제공되고, 여기서 본 명세서에 정의된 본 발명의 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 종양 연관 항원에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 것이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 상피, 내피 또는 중피 기원 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, 종양 연관 항원에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 경구암의 치료에서 사용을 위한, 종양 항원에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 제공한다.
일 실시형태에서, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 경구암의 치료에서 사용을 위한 HER1, 바람직하게 인간 HER1에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 다른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 위암, 유방암 및/또는 자궁경부암의 치료에서 사용을 위한, HER2, 바람직하게 인간 HER2에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 위암 및/또는 폐암의 치료에서 사용을 위한 HER3, 바람직하게 인간 HER3에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, CEA, 바람직하게 인간 CEA에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한 p95, 바람직하게 인간 p95에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한 BCMA, 바람직하게 인간 BCMA에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, MSLN, 바람직하게 인간 MSLN에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한 MCSP, 바람직하게 인간 MCSP에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, CD19, 바람직하게 인간 CD19에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료에서 사용을 위한, CD20, 바람직하게 인간 CD20에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료에서 사용을 위한 CD22, 바람직하게 인간 CD22에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, CD38, 바람직하게 인간 CD38에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, CD52Flt3, 바람직하게 인간 CD52Flt3에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, FolR1, 바람직하게 인간 FolR1에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 경구암의 치료에서 사용을 위한, Trop-2, 바람직하게 인간 Trop-2에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장암의 치료에서 사용을 위한, CA-12-5, 바람직하게 인간 CA-12-5에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 위장암, 백혈병 및/또는 비인두 암종의 치료에서 사용을 위한, DR, 바람직하게 인간 HLA-DR에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암의 암 치료에서 사용을 위한, MUC-1, 바람직하게 인간 MUC-1에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 결장암의 치료에서 사용을 위한, A33, 바람직하게 인간 A33에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 췌장암의 치료에서 사용을 위한, PSMA, 바람직하게 인간 PSMA에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, PSCA, 바람직하게 인간 PSCA에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, 트랜스페린-수용체, 바람직하게 인간 트랜스퍼링-수용체에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, 테나신, 바람직하게 인간 테나신에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, CA-IX, 바람직하게 인간 XA-IX에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
일 실시형태에서, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용을 위한, PDL1, 바람직하게 PDL1에 대해 유도되고/그에 결합하고/그와 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공된다.
예시적인 실시형태
1. 앵커링 경막 도메인, 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab 단편, 특히 Fab 또는 crossFab 단편이다.
2. 실시형태 1의 항원 결합 수용체로서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다.
3. 실시형태 1 또는 2 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이고, 특히 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함한다.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이고, 특히 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함한다.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인 또는 이의 단편이고, 특히, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함한다.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 수용체는 CD3z의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 항원 결합 수용체는 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
10. 실시형태 9의 항원 결합 수용체로서, 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하고, 공자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함한다.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 세포외 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서 앵커링 경막 도메인에 연결된다.
12. 실시형태 11의 항원 결합 수용체로서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:20)을 포함한다.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 앵커링 경막 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서 공동-신호전달 도메인 또는 신호전달 도메인에 연결된다.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 신호전달 및/또는 공동-신호전달 도메인은 임의로 적어도 하나의 펩티드 링커를 통해서 연결된다.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 중쇄 불변 (CH) 도메인 및 경쇄 불변 도메인 (CL)을 포함하고, CH 도메인 또는 CL 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서, C 말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에 연결된다.
16. 실시형태 4 내지 15 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 수용체는 하나의 공동-신호전달 도메인을 포함하고, 공동-신호전달 도메인은 N-말단에서 앵커링 경막 도메인의 C-말단에 연결된다.
17. 실시형태 16의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 수용체는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하고, 자극성 신호전달 도메인은 N-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 C-말단에 연결된다.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원, 또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 테나신 (TNC) 및 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1)로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i) (a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)
를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:12의 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:10의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
24. 실시형태 23의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:7의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:9의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
25. 실시형태 23의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:50의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:8의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
26. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편이고, 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:36 및 SEQ ID NO:41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
27. 실시형태 26의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:36의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:38의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
28. 실시형태 26의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:41의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:43의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
29. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
30. 실시형태 29의 항원 결합 수용체로서, SEQ ID NO:51의 폴리펩티드를 포함한다.
31. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
32. 실시형태 1 내지 10 또는 31 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:78의 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:77의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
33. 실시형태 1 내지 19 ? 31 내지 32 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:78의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:77의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
34. 실시형태 1 내지 10 또는 31 내지 33 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합하는 Fab 단편이고, 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:74 및 SEQ ID NO:85로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:76 및 SEQ ID NO:75로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
35. 실시형태 34의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:74의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:76의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
36. 실시형태 34의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:85의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:75의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
37. 실시형태 1 내지 19 및 31 내지 33 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 crossFab 단편으로서, 항원 결합 수용체는
a) SEQ ID NO:79 및 SEQ ID NO:82로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:81 및 SEQ ID NO:84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 제2 폴리펩티드를 포함한다.
38. 실시형태 37의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:79의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:81의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
39. 실시형태 37의 항원 결합 수용체로서,
a) SEQ ID NO:82의 제1 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:84의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
40. 실시형태 1 내지 19 및 31 내지 33 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 scFab 단편이고, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:85의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
41. 실시형태 40의 항원 결합 수용체로서, SEQ ID NO:85의 폴리펩티드를 포함한다.
42. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 EFGMN (SEQ ID NO:138);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WINTKTGEATYVEEFKG (SEQ ID NO:139); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 WDFAYYVEAMDY (SEQ ID NO:140)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 KASAAVGTYVA (SEQ ID NO:141);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASYRKR (SEQ ID NO:142); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 HQYYTYPLFT (SEQ ID NO:143)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
43. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DTYMH (SEQ ID NO:148);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIDPANGNSKYVPKFQG (SEQ ID NO:149); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 FGYYVSDYAMAY (SEQ ID NO:150)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RAGESVDIFGVGFLH (SEQ ID NO:151);
(e) CDR L2 아미노산 서열 RASNRAT (SEQ ID NO:152); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQTNEDPYT (SEQ ID NO:153)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
44. 실시형태 1 내지 19 및 42 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:146 및 SEQ ID NO:156로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:147 및 SEQ ID NO:157로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
45. 실시형태 1 내지 19 및 42 내지 44 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:146의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:147의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
46. 실시형태 1 내지 19 및 42 내지 44 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:156의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:157의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
47. 실시형태 1 내지 46 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 CH1 및 CL 도메인 내 하전된 아미노산 (하전된 잔기)의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, CL 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다.
48. 실시형태 47의 항원 결합 수용체로서, CL 도메인에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)에 의해 치환되고, CH1 도메인에서 위치 147 및 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (카밧 EU 지수에 따라 번호매김)에 의해 치환된다.
49. 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
50. 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 코딩하는 조성물.
51. 실시형태 49의 폴리뉴클레오티드 또는 실시형태 50의 조성물에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
52. 실시형태 49의 폴리뉴클레오티드 또는 실시형태 50의 조성물을 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
53. 실시형태 49의 폴리뉴클레오티드, 실시형태 50의 조성물 또는 실시형태 52의 벡터를 포함하는 형질도입된 T 세포.
54. 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포.
55. 실시형태 54의 형질도입된 T 세포로서, 세포는
(i) Fab (VH-CH-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체;
(ii) Fab (VL-CL-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체;
(iii) crossFab (VL-CH-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체; 및
(iv) crossFab (VH-CL-ATD) 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이하의 항원 결합 수용체를 포함한다.
56. 실시형태 53 내지 55 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 여기서 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하며, 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함한다.
57. 실시형태 53 내지 55 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 여기서 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 다른 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 Fab (VH-CH-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 Fab (VL-CL-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함한다.
58. 실시형태 53 내지 55 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 crossFab (VL-CH-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 crossFab (VH-CL-ATD) 항원 결합 모이어티를 포함한다.
59. 실시형태 53 내지 55 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 scFab 항원 결합 모이어티를 포함하며, 세포는 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 scFv, Fab 또는 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함한다.
60. 실시형태 53 내지 59 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루얼진 군으로부터 선택된 항원, 또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함한다.
61. 실시형태 54 내지 60 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원, 또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC)의 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
62. 실시형태 53 내지 61 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 제1 종양 연관 항원 (TAA)에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 세포는 TAA에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
63. 실시형태 53 내지 62 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1)에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 세포는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 및 테나신 (TNC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
64. 실시형태 53 내지 63 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 세포는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 세포는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 수용체를 포함한다.
65. 실시형태 53 또는 64 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 형질도입된 T 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)로 공동-형질도입된다.
66. 약물로서 사용을 위한 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체 또는 실시형태 53 내지 65 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포.
67. 악성 질환의 치료에서 사용을 위한 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체 또는 실시형태 53 내지 65 중 어느 하나의형질도입된 T 세포로서, 치료는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여 단계를 포함한다.
68. 실시형태 53 또는 65에 따라 사용을 위한 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포로서, 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
69. 실시형태 66 내지 68 중 어느 하나에 따라 사용을 위한 형질도입된 T 세포로서, 형질도입된 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 단리된 세포로부터 유래된다.
70. 실시형태 66 내지 68 중 어느 하나에 따라 사용을 위한 형질도입된 T 세포로서, 형질도입된 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 단리된 세포로부터 유래되지 않는다.
71. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
72. 실시형태 71의 방법으로서, 대상체로부터 T 세포를 단리하는 단계 및 실시형태 49의 폴리뉴클레오티드, 실시형태 50의 조성물 또는 실시형태 52의 벡터를 단리된 T 세포에 형질도입시켜 형질도입된 T 세포를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다.
73. 실시형태 72의 방법으로서, T 세포는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 구성체 또는 비바이러스 벡터 구성체가 형질도입된다.
74. 실시형태 73의 방법으로서, 비바이러스 벡터 구성체는 슬리핑 뷰티 미니서클 벡터이다.
75. 실시형태 71 내지 74 중 어느 하나의 방법으로서, 형질도입된 T 세포는 정맥내 주입에 의해 대상체에게 투여된다.
76. 실시형태 71 내지 75 중 어느 하나의 방법으로서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여 전에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉된다.
77. 실시형태 71 내지 76 중 어느 하나의 방법으로서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여 전에 적어도 하나의 사이토카인, 바람직하게 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-15 (IL-15), 및/또는 인터루킨-21, 또는 이의 변이체와 접촉된다.
78. 실시형태 71 내지 77 중 어느 하나의 방법으로서, 질환은 악성 질환이다.
79. 실시형태 71 내지 78 중 어느 하나의 방법으로서, 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
80. 표적 세포의 용해를 유도시키기 위한 방법으로서, 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포와 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
81. 실시형태 80의 방법으로서, 표적 세포는 암 세포이다.
82. 실시형태 80 또는 81 중 어느 하나의 방법으로서, 표적 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), CA-IX 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 발현한다.
83. 실시형태 80 내지 82 중 어느 하나의 방법으로서, 표적 세포는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 테나신 (TNC), 및 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1)로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 발현한다.
84. 약물의 제조를 위한 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나의 항원 결합 수용체, 실시형태 49의 폴리뉴클레오티드, 실시형태 50의 조성물, 또는 실시형태 53 내지 65 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포의 용도.
85. 실시형태 84의 용도로서, 약물은 악성 질환의 치료를 위한 것이다.
86. 실시형태 85의 용도로서, 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
이들 및 다른 실시형태가 개시되며 본 발명의 설명 및 실시예에 포괄된다. 본 발명에 따라 적용되는 항체, 방법, 용도 및 화합물 중 어느 하나에 관한 추가 문헌은 예를 들어 전자 장비를 사용하여 공공 도서관 및 데이타베이스에서 검색할 수 있다. 예를 들어, 인터넷에서 이용가능한 공용 데이타베이스 "Medline"은 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html에서 이용할 수 있다. 추가의 데이타베이스 및 주소, 예컨대 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ 는 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 http://www.lycos.com 을 사용해 얻을 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반 설명을 고려하여 다양한 다른 실시형태가 실시될 수 있다는 것을 이해한다.
재조합 DNA 기술
문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같은 DNA를 조작하기 위한 표준 방법이 사용되었다. 분자 생물학적 시약은 제조사의 지시서에 따라 사용되었다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 문헌 [Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 시퀀싱
DNA 서열은 이중 가닥 시퀀싱을 통해 결정하였다.
유전자 합성
바람직한 유전자 절편은 적절한 주형을 사용한 PCR을 통해 생성시키거나 또는 자동 유전자 합성을 통해 PCR 생성물 및 합성 올리고뉴클레오티드로부터 Geneart AG (Regensburg, Germany)에서 합성하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 측접된 유전자 절편은 표준 클로닝/시퀀싱 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA는 형질전환된 박테리아로부터 정제하여 UV 분광법으로 농도를 결정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 시퀀싱을 통해 확증하였다. 유전자 절편은 개별 발현 벡터로 서브클로닝이 가능하도록 적합한 제한효소 부위를 갖도록 디자인되었다. 모든 구성체는 진핵생물 세포로 분비되도록 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 디자인되었다.
단백질 정제
단백질은 표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상청액으로부터 정제되었다. 간략하게, 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼 (GE healthcare)에 적용하였고 PBS로 세척하였다. 항체의 용리는 pH 2.8과 이후 샘플의 즉각적인 중화에 의해 달성하였다. 응집된 단백질은 PBS 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, GE Healthcare)를 통해 단량체 항체로부터 분리시켰다. 단량체 항체 분획을 모으고, 예를 들어 MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 (필요하면) 농축시켰고, 냉동시키고 -20℃ 또는 -80℃에 저장하였다. 샘플의 일부분은 예를 들어 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통한 후속 단백질 분석 및 분석적 특징규명을 위해 제공되었다.
SDS-PAGE
NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen)은 제조사의 지시서에 따라 사용되었다. 특히, 10% 또는 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 겔 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MES (환원성 겔, NuPAGE® 항산화제 러닝 완충액 첨가제 포함) 또는 MOPS (비환원성 겔) 러닝 완충액이 사용되었다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태의 결정을 위해서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)가 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 간략하게, 단백질 A 정제된 항체를 Agilent HPLC 1100 시스템 상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중의 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼 또는 Dionex HPLC-시스템 상에서 2 x PBS 중의 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare)에 적용되었다. 용리된 단백질은 UV 흡광도 및 피크 영역의 적분에 의해 정량되었다. BioRad 겔 여과 표준물 151-1901가 표준물로서 제공되었다.
저카트 NFAT T 세포의 렌티바이러스 형질도입
렌티바이러스 벡터를 생성시키기 위해서, 항원 결합 수용체의 올바른 조립을 위한 개별 DNA 서열을 항상적으로 활성화되는 인간 사이토메갈로바이러스 최초기 프로모터 (CMV) 하에서 렌티바이러스 폴리뉴클레오티드 벡터에 인프레임으로 클로닝되었다. 레트로바이러스 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE), 중심 폴리푸린 트랙 (cPPT) 엘리먼트, pUC 복제 기원 및 박테리아의 증식 및 선별을 용이하게 하는 항생제 내성을 코딩하는 유전자를 함유하였다.
기능적 바이러스 입자를 생성시키기 위해서, Lipofectamine LTX™ 기반 형질감염은 60-70% 융합성 Hek293T 세포 (ATCC CRL3216) 및 CAR 함유 벡터를 비롯하여 pCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV 전달 벡터를 3:1:1:1 비율로 사용하여 수행하였다. 48시간 후에 상청액을 수집하고, 5분 동안 250 g에서 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 0.45 또는 0.22 μm 폴리에테르술폰 필터를 통해 여과시켰다. 농축된 바이러스 입자 (Lenti-x-Concentrator, Takara)를 사용하여 저카트 NFAT 세포 (Signosis)에 형질도입시켰다. 양성 형질도입 세포는 FACSARIA 분류기 (BD Bioscience)를 사용하여 풀로서 또는 단일 클론으로서 분류되었다. 적절한 밀도로 세포 확장 후 저카트 NFAT T 세포를 실험에 사용하였다.
실시예 1
본 명세서에서는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포 및 표적 세포로서 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 분류된 단일 클론을 사용한 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 기술한다 (도 4). 양성 대조군으로서, 96웰 플레이트 (Cellstar Greiner-bio-one, CAT-No. 655185)의 일부 웰을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 10 ㎍/mL CD3 항체 (Biolegend®)로 4℃에서 밤샘 동안 또는 37℃에서 적어도 1시간 동안 코팅시켰다. CD3 항체 코팅된 웰을 2회 PBS로 세척하였고, 마지막 세척 단계 후에 PBS를 완전히 제거하였다. 항원 결합 수용체 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하도록 조작된 저카트 NFAT 야생형 세포 또는 저카트 NFAT CAR 세포 (또한 이펙터 세포라고 함)를 계측하였고 Cedex HiRes를 사용하여 그들 생존능을 조사하였다. 세포수는 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 그리고 세포 현탁액의 적절한 분취액을 210g에서 5분 동안 실온 (RT)에서 펠렛화시켰고 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지)에 재현탁시켰다. 관심 항원을 발현하는 표적 세포를 계측하고 역시 그들 생존능을 조사하였다. 세포수는 성장 배지 중에 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 표적 세포 및 이펙터 세포는 10:1, 5:1, 2:1 또는 1:1 E:T 비율 (웰 당 총 110.000 세포)로, 삼중으로 96웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one )에 200 ㎕의 최종 부피로 플레이팅하였다. 그 후에 96웰 플레이트를 2분 동안 190g 및 RT에서 원심분리하였고 Parafilm®으로 밀봉하였다.
습도 대기 인큐이션으로 37℃ 및 5% CO2 에서 20시간 후에, 각 웰의 내용물은 다채널 파이펫을 사용해 10회 아래 위로 파이펫팅하여 혼합하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 새로운 투명 바닥 96웰 플레이트 (Greiner-bio-one)로 옮기고 100 ㎕의 ONE-Glo™ 루시퍼라제 어세이 (Promega)를 첨가하였다. 300 rpm 및 RT의 회전 진탕기에서 암실에 15분 동안 인큐베이션 후, 발광도는 Tecan® Spark10M 플레이트 판독기, 검출 시간으로서 1초/웰을 사용해 측정하였다.
막대 다이아그램은 상이한 E:T 비율에 의존적으로 그리고 표적 세포와의 상이한 공배양 시간에 의존적으로 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화를 보여준다. 저카트 NFAT T 세포 활성화는 표적 세포와의 공배양 지속시간에 의존적이고 E:T 비율에 의존적인 것으로 확인된다. 모든 시험된 조건의 경우 20시간의 인큐베이션 시간은 최고 발광 신호를 나타낸다. 또한, 상이한 E:T 비율 중에서, 10:1 E:T 비율은 최고의 검출가능한 발광 신호를 보인다. 저카트 NFAT 야생형 T 세포는 발광 신호의 오직 시간 의존적 증가만을 보이며, 그리하여 40시간 이후에 최고 발광 신호를 검출할 수 있다. 검출된 발광 신호는 E:T 비율과 독립적이며 일반적으로 또한 개별 시점에서 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 대해 검출된 각 발광 신호보다 분명하게 낮다. 일반적으로, 최고 발광 신호는 세포가 CD3 항체 코팅된 웰에서 인큐베이션되면 검출가능하다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포는 형질도입되지 않은 저카트 NFAT 대조군 T 세포와 비교하여 더 높은 신호를 보인다. 각 시점은 기술적 이중물의 평균을 나타낸다.
실시예 2
여기서는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포 또는 표적 세포로서 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 분류된 단일 클론을 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 기술한다 (도 5). 양성 대조군으로서, 96웰 플레이트 (Cellstar Greiner-bio-one, CAT-No. 655185)의 웰을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 10 ㎍/mL CD3 항체 (Biolegend®)로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. CD3 항체 코팅된 웰을 2회 PBS로 세척하였고, 최종 세척 단계 후에 PBS를 완전히 제거하였다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하도록 조작된 저카트 NFAT 야생형 세포 또는 저카트 NFAT T 세포 (또한 이펙터 세포라고 함)를 계측하였고, Cedex HiRes를 사용해 그들 생존능을 조사하였다. 세포주는 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 그리고, 세포 현탁액의 적절한 분취액을 210g에서 5분 동안 실온 (RT)에서 펠렛화시켰고 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지)에 재현탁시켰다. 관심 항원을 발현하는 표적 세포를 역시 계측하고 그들 생존능에 대해 조사하였다. 세포수는 성장 배지 중에 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 표적 세포 및 이펙터 세포는 5:1 E:T 비율 (웰 당 총 110.000 세포)로 삼중으로 96웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one)에 200 ㎕의 최종 부피로 플레이팅하였다. 이후에 96웰 플레이트를 2분 동안 190g 및 RT에서 원심분리하고 Parafilm®으로 밀봉하였다.
습도 대기 인큐베이션으로 37℃ 및 5% CO2 에서 20시간 후에 각 웰의 내용물은 다채널 파이펫을 사용해 10회 아래 위로 파이펫팅하여 혼합하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 새로운 흰색 투명 바닥 96웰 플레이트 (Greiner-bio-one)로 옮겼고 100 ㎕의 ONE-Glo™ 루시퍼라제 어세이 (Promega)를 첨가하였다. 300 rpm 및 RT의 회전 진탕기에 암실에서 15분 동안 인큐베이션 후에 발광도는 Tecan® Spark10M 플레이트 판독기를 사용해, 검출 시간으로서 1초/웰로 측정하였다.
막대 다이아그램은 표적 세포와 공배양 시 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포 및 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 활성화를 보여준다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포 또는 저카트 NFAT 대조군 T 세포가 표적 세포없이 배양되면, 발광 신호는 검출되지 않았다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포 또는 저카트 NFAT 대조군 T 세포가 CD3 항체 코팅된 플레이트에서 표적 세포와 공배양될 때 최고 발광 신호가 검출되었다. 놀랍게도, crossFab 구성은 CD3 매개 신호전달과 함께 저카트 NFAT T 세포의 강력한 활성화를 야기시킨다. 각 시점은 기술적 삼중물의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다.
실시예 3
여기서는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포 및 표적 세포로서 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 사용하여 수행된 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 기술한다 (도 6).
양성 대조군으로서, 96웰 플레이트 (Cellstar Greiner-bio-one, CAT-No. 655185)의 웰은 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 10 ㎍/mL CD3 항체 (Biolegend®)로 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 적어도 1시간 동안 코팅되었다. CD3 항체 코팅된 웰은 2회 PBS로 세척하였고, 최종 세척 단계 이후에 PBS를 완전히 제거하였다. 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하도록 조작된 저카트 NFAT 야생형 T 세포 또는 저카트 NFAT T 세포 (또한 이펙터 세포라고함)를 계측하였고 Cedex HiRes를 사용해 그들 생존능을 조사하였다. 세포수는 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 그리고 세포 현탁액의 적절한 분취액은 210g에서 5분 동안 실온 (RT)에서 펠렛화하였고 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지)에 재현탁시켰다. 관심 항원을 발현하는 표적 세포는 역시 계측하고 그들 생존능에 대해 조사하였다. 세포수는 성장 배지 중에 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 표적 세포 및 이펙터 세포는 10:1, 5:1, 2:1 또는 1:1 E:T 비율 (웰 당 총 110.000 세포)로 삼중으로 96웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one)에 200 ㎕의 최종 부피로 플레이팅하였다. 이후에 96웰 플레이트는 2분 동안 190g 및 RT에서 원심분리하였고 Parafilm®으로 밀봉하였다.
습도 대기 인큐베이션으로 37℃ 및 5% CO2 에서 20시간 후에, 각 웰의 내용물은 다채널 파이펫을 사용해 10회 아래위로 파이펫팅하여 혼합하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 새로운 흰색 투명 바닥 96웰 플레이트 (Greiner-bio-one)로 옮기고 100 ㎕의 ONE-Glo™ 루시퍼라제 어세이 (Promega)를 첨가하였다. 300 rpm 및 RT에서 회전 진탕기 중에 암실에서 15분 인큐베이션 후, 발광도는 Tecan® Spark10M 플레이트 판독기, 검출 시간으로서 1초/웰을 사용하여 측정하였다.
막대 다이아그램은 상이한 E:T 비율로 SUDHL4 표적 세포와 20시간의 공배양 후에 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 활성화를 보여준다. 상이한 E:T 비율 중에서, 10:1 및 5:1 E:T 비율은 최고 발광 신호를 보인다 (도 6 검은색 막대). 또한 CD3 항체 코팅된 웰에서 10:1 E:T 비율로 공배양된 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포는 CD3 자극없는 동일 조건과 비슷하게 높은 발광 신호를 보인다.
또한 저카트 NFAT 야생형 세포는 상이한 E:T 비율과 독립적으로 임의의 활성화를 보이지 않지만, CD3 항체 코팅된 웰에서 10:1 E:T 비율로 공배양하면, 분명한 발광 신호를 검출가능하여, 그들 기능성이 증명된다.
또한 대조군 실험은 표적 세포 또는 항-CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 T 세포 단독을 비롯하여 표적 세포가 있는 CD3 항체 코팅된 웰은 임의의 활성화를 보이지 않는 것을 보여준다. 각 시점은 기술적 삼중물의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다.
실시예 4
여기서는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포 및 표적 세포로서 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포 또는 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 사용해 수행된 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 기술한다 (도 7).
양성 대조군으로서, 96웰 플레이트 (Cellstar Greiner-bio-one, CAT-No. 655185)의 웰을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 10 ㎍/mL CD3 항체 (Biolegend®)로 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 적어도 1시간 동안 코팅시켰다. CD3 항체 코팅된 웰을 2회 PBS로 세척하였고, 최종 세척 단계 후에 PBS를 완전히 제거하였다. 항-CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 또는 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (또한 이펙터 세포라고함)를 발현하도록 조작된 저카트 NFAT 야생형 T 세포 또는 저카트 NFAT T 세포를 계측하고 Cedex HiRes를 사용해 그들 생존능을 조사하였다. 세포수는 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 그리고, 세포 현탁액의 적절한 분취액은 210g에서 5분 동안 실온 (RT)에서 펠렛화하였고 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지)에 재현탁시켰다. 관심 항원을 발현하는 표적 세포를 역시 계측하고 그들 생존능에 대해 조사하였다. 세포수는 성장 배지 중 1x106 생존 세포/mL로 조정하였다. 표적 세포 및 이펙터 세포는 10:1, 5:1, 2:1 또는 1:1 E:T 비율 (웰 당 총 110.000 세포)로 삼중으로 96웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one)에 200 ㎕의 최종 부피로 플레이팅되었다. 이후에 96웰 플레이트를 2분 동안 190g 및 RT에서 원심분리하고 Parafilm®으로 밀봉하였다.
흡도 대기 인큐베이션으로 37℃ 및 5% CO2 에서 20시간 후에 각 웰의 내용물은 다채널 파이펫을 사용해 10회 아래 위로 파이펫팅하여 혼합하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 새로운 흰색 투명 바닥 96웰 플레이트 (Greiner-bio-one)로 옮기고 100 ㎕의 ONE-Glo™ 루시퍼라제 어세이 (Promega)를 첨가하였다. 300 rpm 및 RT에서 회전 진탕기 중에 암실에서 15분 인큐베이션 후, 발광도는 Tecan® Spark10M 플레이트 판독기, 검출 시간으로서 1초/웰을 사용해 측정하였다.
막대 다이아그램은 SUDHL4 표적 세포와 5:1 E:T 비율로 20시간 공배양 후 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포의 활성화를 보여준다. CD3 항체 코팅된 웰에서 표적 세포와 공배양된 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 저카트 NFAT T 세포는 최고 발광 신호를 보였고, CD3 자극없는 동일한 조건과 비슷하다. 놀랍게도, crossFab 구성은 저카트 NFAT T 세포의 차등적인 활성화를 야기시켰는데, 강력한 활성화는 CD3 매개 신호전달과 함께 확인된다. 또한 저카트 NFAT 야생형 세포는 임의의 활성화를 보이지 않지만, 10:1 E:T 비율로 CD3 항체 코팅된 웰에서 공배양되면 분명한 발광 신호가 검출가능하여 그들 기능성이 증명된다. 각 막대는 기술적 삼중물의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다.
실시예 5
여기서는 표적 세포로서 CD20을 발현하는 SUDHDL4 종양 세포 및 표적 세포로서 항-CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD를 발현하는 T 세포의 풀을 사용해 수행된 사멸 어세이를 기술한다 (도 8).
냉동된 PBMC를 해동시키고 CD3/CD28 코팅된 웰 중 T 세포 배지 (CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 SFM, Cat. A1048501과 200 U/mL의 IL-2)에 파종하여 그들을 2일 동안 활성화시켰다. 동시에 HEK 세포를 일시적으로 형질감염시켜 바이러스 입자를 생성시켰다. T 세포는 스핀펙션을 사용해 32℃, 800 rpm에서 90분 동안 형질도입되었다.
2 Mio SUDHL4 세포는 1분 59초 동안 5000 rad로 조사되었고 96웰 플레이트에 파종되었다. 형질도입된 T 세포는 상층에 파종되어 5일 동안 공배양되었다. 그 다음으로 세포를 회수하고 퓨로마이신 선별 (1 ㎍/mL)을 위해 추가 3일 동안 두어서 형질도입된 T 세포가 아닌 피더 세포는 제거하였다. 이펙터 세포라고도 하는, 나머지 T 세포를 회수하였고, 계측하고, 그들 생존능을 조사하였다. 적절한 세포수를 스핀 다운하고 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 이펙터 세포를 10 ㎕ 부피로 파종하였다. SUDHL4를 회수하고, 계측하고 그들 생존능을 조사하였다. 세포수는 5:1 E: T 비율을 얻도록 조정하였다. 384웰 플레이트의 웰 당 최종 부피는 20 ㎕였다. 자발적인 최대 방출의 대조군으로서 표적 세포 단독은 10 ㎕의 부피로 파종되었고 20 ㎕의 총 부피까지 채워주었다. 또한 이펙터 세포 단독은 10 ㎕로 파종되었고 T 세포 배지로 20 ㎕ 까지 채워주었다.
20시간 또는 40시간의 인큐베이션 시간 후에, Promega의 CytoTox-Glo™ 세포독성 어세이 (Cat. G9291)를 사용하여 사멸된 세포의 캐스파제 활성을 검출하였다. 표적 세포의 최대 방출을 결정하기 위해서, 12 ㎕의 용해 완충액을 적절한 웰에 첨가하였고 플레이트를 15분 동안 회전 진탕기 (Eppendorf, 300 rpm)에서 인큐베이션시켰다. 그 이후에 12 ㎕의 어세이 완충액을 모든 웰에 첨가하였고 플레이트를 추가 10분 동안 회전 진탕기에서 인큐베이션시켰다. 발광도는 0.5초 동안 발광 플레이트 판독기 (Victor)에서 측정되었다.
사멸 데이타를 계산하기 위해서, 이펙터 세포의 자발적 방출을 비롯하여 표적 세포의 자발적 방출의 총합을 계산하고 나서 공배양된 표적 및 이펙터 세포의 측정된 값에서 감산하였다. 그것을 100%에서의 최대 방출과 비교하여 사멸율을 더욱 계산하였다. 막대 다이아그램은 20시간 및 40시간 이후에 항-CD20 형질도입된 CAR T 세포에 의한 사멸률을 나타내는 기술적 삼중물의 평균을 나타낸다.
예시적인 서열
SEQUENCE LISTING
<110> F.Hoffmann-La Roche Ltd
<120> Improved antigen binding receptor formats
<130> P34241
<160> 157
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 ( GA101) CDR H1 Kabat
<400> 1
Tyr Ser Trp Ile Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 ( GA101) CDR H2 Kabat
<400> 2
Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 ( GA101) CDR H3 Kabat
<400> 3
Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 ( GA101) CDR L1 Kabat
<400> 4
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 ( GA101) CDR L2 Kabat
<400> 5
Gln Met Ser Asn Leu Val Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 ( GA101) CDR L3 Kabat
<400> 6
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-Fab heavy chain-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD fusion
pETR 17097
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
245 250 255
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
260 265 270
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
275 280 285
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
290 295 300
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
305 310 315 320
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
325 330 335
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
340 345 350
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
355 360 365
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
370 375 380
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
385 390 395 400
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-Fab heavy chain
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 9
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-Fab light chain
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101) VL
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CL
<400> 11
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101) VH
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CH1
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28ATD
<400> 14
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 15
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28CSD
<400> 15
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD3zSSD
<400> 16
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 17
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 17
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
85 90 95
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
100 105 110
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
115 120 125
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
130 135 140
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
165 170 175
Leu Pro Pro Arg
180
<210> 18
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> eGFP
<400> 18
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> (G4S)4 linker
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> G4S linker
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> T2A linker
<400> 21
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 22
<211> 2659
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17097
<400> 22
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60
atcgtgatga cccagactcc actctccctg cccgtcaccc ctggagagcc cgccagcatt 120
agctgcaggt ctagcaagag cctcttgcac agcaatggca tcacttattt gtattggtac 180
ctgcaaaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatttatc aaatgtccaa ccttgtctct 240
ggcgtccctg accggttctc cggatccggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300
agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgcgctc agaatctaga acttccttac 360
accttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaaccgtacg gtggctgcac catctgtctt 420
catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct 480
gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc 540
gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag 600
cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 660
cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagaa 720
tagaattccc cgaagtaact tagaagctgt aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca 780
ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt tccccggact gagtatcaat aggctgctcg 840
cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac 900
catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc 960
actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa 1020
tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagtgcct attgagctaa ctggtagtcc 1080
tccggcccct gattgcggct aatcctaact gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg 1140
gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt 1200
ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg 1260
attggccatc cggtgtgcaa cagggcaact gtttacctat ttattggttt tgtaccatta 1320
tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc tcaacacaat caaacgccac 1380
catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca gctaccggtg tgcactccca 1440
ggtgcaattg gtgcagtctg gcgctgaagt taagaagcct gggagttcag tgaaggtctc 1500
ctgcaaggct tcgggatacg ccttcagcta ttcttggatc aattgggtgc ggcaggcgcc 1560
tggacaaggg ctcgagtgga tgggacggat ctttcccggc gatggggata ctgactacaa 1620
tgggaaattc aagggcagag tcacaattac cgccgacaaa tccactagca cagcctatat 1680
ggagctgagc agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat tactgtgcaa gaaatgtctt 1740
tgatggttac tggcttgttt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct ccagcgctag 1800
caccaagggc ccctccgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac 1860
agccgctctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa 1920
cagcggagcc ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gttctggcct 1980
gtatagcctg agcagcgtgg tcaccgtgcc ttctagcagc ctgggcaccc agacctacat 2040
ctgcaacgtg aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag 2100
ctgcggaggg ggcggatcct tctgggtgct ggtggtggtg ggcggcgtgc tggcctgcta 2160
cagcctgctg gtgaccgtgg ccttcatcat cttctgggtg aggagcaaga ggagcaggct 2220
gctgcacagc gactacatga acatgacccc caggaggccc ggccccacca ggaagcacta 2280
ccagccctac gcccccccca gggacttcgc cgcctacagg agcagggtga agttcagcag 2340
gagcgccgac gcccccgcct accagcaggg ccagaaccag ctgtataacg agctgaacct 2400
gggcaggagg gaggagtacg acgtgctgga caagaggagg ggcagggacc ccgagatggg 2460
cggcaagccc aggaggaaga acccccagga gggcctgtat aacgagctgc agaaggacaa 2520
gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag aggaggaggg gcaagggcca 2580
cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgacg ccctgcacat 2640
gcaggccctg ccccccagg 2659
<210> 23
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-Fab-VL
<400> 23
gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180
tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300
tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 24
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Fab CL
<400> 24
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 25
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-Fab-VH
<400> 25
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttcgggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctccagc 357
<210> 26
<211> 309
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Fab CH1
<400> 26
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 180
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgc 309
<210> 27
<211> 647
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IRES EV71 internal ribosomal entry side
<400> 27
cccgaagtaa cttagaagct gtaaatcaac gatcaatagc aggtgtggca caccagtcat 60
accttgatca agcacttctg tttccccgga ctgagtatca ataggctgct cgcgcggctg 120
aaggagaaaa cgttcgttac ccgaccaact acttcgagaa gcttagtacc accatgaacg 180
aggcagggtg tttcgctcag cacaacccca gtgtagatca ggctgatgag tcactgcaac 240
ccccatgggc gaccatggca gtggctgcgt tggcggcctg cccatggaga aatccatggg 300
acgctctaat tctgacatgg tgtgaagtgc ctattgagct aactggtagt cctccggccc 360
ctgattgcgg ctaatcctaa ctgcggagca catgctcaca aaccagtggg tggtgtgtcg 420
taacgggcaa ctctgcagcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattcct 480
atattggctg cttatggtga caatcaaaaa gttgttacca tatagctatt ggattggcca 540
tccggtgtgc aacagggcaa ctgtttacct atttattggt tttgtaccat tatcactgaa 600
gtctgtgatc actctcaaat tcattttgac cctcaacaca atcaaac 647
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> G4S linker
<400> 28
ggagggggcg gatcc 15
<210> 29
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28ATD
<400> 29
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 30
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28CSD
<400> 30
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD3zSSD
<400> 31
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 32
<211> 540
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 32
ttctgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgaccgtg 60
gccttcatca tcttctgggt gaggagcaag aggagcaggc tgctgcacag cgactacatg 120
aacatgaccc ccaggaggcc cggccccacc aggaagcact accagcccta cgcccccccc 180
agggacttcg ccgcctacag gagcagggtg aagttcagca ggagcgccga cgcccccgcc 240
taccagcagg gccagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag ggaggagtac 300
gacgtgctgg acaagaggag gggcagggac cccgagatgg gcggcaagcc caggaggaag 360
aacccccagg agggcctgta taacgagctg cagaaggaca agatggccga ggcctacagc 420
gagatcggca tgaagggcga gaggaggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 480
ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccagg 540
<210> 33
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> T2A linker
<400> 33
tccggagagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 60
agg 63
<210> 34
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> eGFP
<400> 34
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtga 717
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atcgtgatga cccagactcc actctccctg cccgtcaccc ctggagagcc cgccagcatt 120
agctgcaggt ctagcaagag cctcttgcac agcaatggca tcacttattt gtattggtac 180
ctgcaaaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatttatc aaatgtccaa ccttgtctct 240
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agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgcgctc agaatctaga acttccttac 360
accttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttagaat 720
agaattcccc gaagtaactt agaagctgta aatcaacgat caatagcagg tgtggcacac 780
cagtcatacc ttgatcaagc acttctgttt ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc 840
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tattcctata ttggctgctt atggtgacaa tcaaaaagtt gttaccatat agctattgga 1260
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gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag aaatgtcttt 1740
gatggttact ggcttgttta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc cagcgctagc 1800
accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 1860
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agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg 1980
tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc 2040
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 2100
tgcggagggg gcggatcctt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac 2160
agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttctgggtga ggagcaagag gagcaggctg 2220
ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc aggaggcccg gccccaccag gaagcactac 2280
cagccctacg ccccccccag ggacttcgcc gcctacagga gcagggtgaa gttcagcagg 2340
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ggcaagccca ggaggaagaa cccccaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggacaag 2520
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgaga ggaggagggg caagggccac 2580
gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 2640
caggccctgc cccccaggtc cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 2700
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atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 2820
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 2880
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 2940
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 3000
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ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 3180
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 3240
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 3300
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aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 3420
gacgagctgt acaagtga 3438
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
225 230 235 240
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
245 250 255
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
260 265 270
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
275 280 285
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
290 295 300
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
305 310 315 320
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
325 330 335
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
340 345 350
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
355 360 365
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370 375 380
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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100 105 110
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115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
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50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
65 70 75 80
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp
210 215 220
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
245 250 255
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
260 265 270
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
275 280 285
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
290 295 300
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
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Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
325 330 335
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
340 345 350
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
355 360 365
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
370 375 380
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
385 390 395 400
Pro Arg
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
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Glu Cys
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Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
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<223> crossFab CH1
<400> 45
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100 105
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<211> 2664
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-crossFabVH-CL CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17098
<400> 46
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
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gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca ccttccgacg agcagctgaa gtccggcacc 480
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gcggcctgcc catggagaaa tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagtgcct 1080
attgagctaa ctggtagtcc tccggcccct gattgcggct aatcctaact gcggagcaca 1140
tgctcacaaa ccagtgggtg gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact 1200
ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt 1260
tgttaccata tagctattgg attggccatc cggtgtgcaa cagggcaact gtttacctat 1320
ttattggttt tgtaccatta tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc 1380
tcaacacaat caaacgccac catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca 1440
gctaccggtg tgcactccga catcgtgatg acccagactc cactctccct gcccgtcacc 1500
cctggagagc ccgccagcat tagctgcagg tctagcaaga gcctcttgca cagcaatggc 1560
atcacttatt tgtattggta cctgcaaaag ccagggcagt ctccacagct cctgatttat 1620
caaatgtcca accttgtctc tggcgtccct gatcggttct ccggttccgg gtcaggcact 1680
gatttcacac tgaaaatcag cagggtggag gctgaggatg ttggagttta ttactgcgct 1740
cagaatctag aacttcctta caccttcggc ggagggacca aggtggagat caaatccagc 1800
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 1860
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 1920
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 1980
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 2040
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 2100
aagagctgcg gagggggcgg atccttctgg gtgctggtgg tggtgggcgg cgtgctggcc 2160
tgctacagcc tgctggtgac cgtggccttc atcatcttct gggtgaggag caagaggagc 2220
aggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagga ggcccggccc caccaggaag 2280
cactaccagc cctacgcccc ccccagggac ttcgccgcct acaggagcag ggtgaagttc 2340
agcaggagcg ccgacgcccc cgcctaccag cagggccaga accagctgta taacgagctg 2400
aacctgggca ggagggagga gtacgacgtg ctggacaaga ggaggggcag ggaccccgag 2460
atgggcggca agcccaggag gaagaacccc caggagggcc tgtataacga gctgcagaag 2520
gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagaggag gaggggcaag 2580
ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta cgacgccctg 2640
cacatgcagg ccctgccccc cagg 2664
<210> 47
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> crossFab CL
<400> 47
gctagcgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 60
ggcaccgctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aacagccagg aatccgtgac cgagcaggac 180
tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtctagccc cgtgaccaag 300
tctttcaacc ggggcgagtg ctga 324
<210> 48
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> crossFab CH1
<400> 48
tccagcgcta gcaccaaggg cccctccgtg ttccccctgg cccccagcag caagagcacc 60
agcggcggca cagccgctct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga gcccgtgacc 120
gtgtcctgga acagcggagc cctgacctcc ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctgcag 180
agttctggcc tgtatagcct gagcagcgtg gtcaccgtgc cttctagcag cctgggcacc 240
cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg 300
gagcccaaga gctgc 315
<210> 49
<211> 3444
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-crossFabVH-CL CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP
pETR17098
<400> 49
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcaattgg tgcagtctgg cgctgaagtt aagaagcctg ggagttcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ccggatacgc cttcagctat tcttggatca attgggtgcg gcaggcgcct 180
ggacaagggc tcgagtggat gggacggatc tttcccggcg atggggatac tgactacaat 240
gggaaattca agggcagagt cacaattacc gccgacaaat ccactagcac agcctatatg 300
gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag aaatgtcttt 360
gatggttact ggcttgttta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagctagc 420
gtggccgctc cctccgtgtt catcttccca ccttccgacg agcagctgaa gtccggcacc 480
gcttctgtcg tgtgcctgct gaacaacttc tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag 540
gtggacaacg ccctgcagtc cggcaacagc caggaatccg tgaccgagca ggactccaag 600
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg accctgtcca aggccgacta cgagaagcac 660
aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag ggcctgtcta gccccgtgac caagtctttc 720
aaccggggcg agtgctgata aggaattccc cgaagtaact tagaagctgt aaatcaacga 780
tcaatagcag gtgtggcaca ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt tccccggact 840
gagtatcaat aggctgctcg cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc gaccaactac 900
ttcgagaagc ttagtaccac catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca caaccccagt 960
gtagatcagg ctgatgagtc actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgttg 1020
gcggcctgcc catggagaaa tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagtgcct 1080
attgagctaa ctggtagtcc tccggcccct gattgcggct aatcctaact gcggagcaca 1140
tgctcacaaa ccagtgggtg gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact 1200
ttgggtgtcc gtgtttcctt ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt 1260
tgttaccata tagctattgg attggccatc cggtgtgcaa cagggcaact gtttacctat 1320
ttattggttt tgtaccatta tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc 1380
tcaacacaat caaacgccac catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca 1440
gctaccggtg tgcactccga catcgtgatg acccagactc cactctccct gcccgtcacc 1500
cctggagagc ccgccagcat tagctgcagg tctagcaaga gcctcttgca cagcaatggc 1560
atcacttatt tgtattggta cctgcaaaag ccagggcagt ctccacagct cctgatttat 1620
caaatgtcca accttgtctc tggcgtccct gatcggttct ccggttccgg gtcaggcact 1680
gatttcacac tgaaaatcag cagggtggag gctgaggatg ttggagttta ttactgcgct 1740
cagaatctag aacttcctta caccttcggc ggagggacca aggtggagat caaatccagc 1800
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 1860
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 1920
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 1980
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 2040
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 2100
aagagctgcg gagggggcgg atccttctgg gtgctggtgg tggtgggcgg cgtgctggcc 2160
tgctacagcc tgctggtgac cgtggccttc atcatcttct gggtgaggag caagaggagc 2220
aggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagga ggcccggccc caccaggaag 2280
cactaccagc cctacgcccc ccccagggac ttcgccgcct acaggagcag ggtgaagttc 2340
agcaggagcg ccgacgcccc cgcctaccag cagggccaga accagctgta taacgagctg 2400
aacctgggca ggagggagga gtacgacgtg ctggacaaga ggaggggcag ggaccccgag 2460
atgggcggca agcccaggag gaagaacccc caggagggcc tgtataacga gctgcagaag 2520
gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagaggag gaggggcaag 2580
ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta cgacgccctg 2640
cacatgcagg ccctgccccc caggtccgga gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt 2700
gacgtggagg agaatcccgg ccctagggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 2760
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gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 2880
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 2940
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 3000
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 3060
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gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 3180
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gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 3300
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 3360
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<213> Artificial sequence
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fusion
<400> 50
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
245 250 255
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
260 265 270
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
275 280 285
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
290 295 300
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
305 310 315 320
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
325 330 335
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
340 345 350
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
355 360 365
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
370 375 380
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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Leu Pro Pro Arg
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<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val
245 250 255
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser
260 265 270
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro
290 295 300
Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
305 310 315 320
Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
325 330 335
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe
340 345 350
Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
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Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp
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Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
485 490 495
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
500 505 510
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
515 520 525
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
530 535 540
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
545 550 555 560
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
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Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
580 585 590
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
595 600 605
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
625 630 635 640
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
645 650 655
Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-scFab
<400> 52
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1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val
245 250 255
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser
260 265 270
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro
290 295 300
Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
305 310 315 320
Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
325 330 335
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe
340 345 350
Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
465 470
<210> 53
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<223> scFab-CL
<400> 53
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1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
100 105
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> (G4S)6G2 linker
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 55
<211> 2031
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD fusion pETR170101
<400> 55
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agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgcgctc agaatctaga acttccttac 360
accttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420
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aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540
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agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660
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atctttcccg gcgatgggga tactgactac aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt 1020
accgccgaca aatccactag cacagcctat atggagctga gcagcctgag atctgaggac 1080
acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc tttgatggtt actggcttgt ttactggggc 1140
cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct agcaccaagg gcccctccgt gttccccctg 1200
gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc acagccgctc tgggctgcct ggtcaaggac 1260
tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg aacagcggag ccctgacctc cggcgtgcac 1320
accttccccg ccgtgctgca gagttctggc ctgtatagcc tgagcagcgt ggtcaccgtg 1380
ccttctagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac 1440
accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag agctgcggag ggggcggatc cttctgggtg 1500
ctggtggtgg tgggcggcgt gctggcctgc tacagcctgc tggtgaccgt ggccttcatc 1560
atcttctggg tgaggagcaa gaggagcagg ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc 1620
cccaggaggc ccggccccac caggaagcac taccagccct acgccccccc cagggacttc 1680
gccgcctaca ggagcagggt gaagttcagc aggagcgccg acgcccccgc ctaccagcag 1740
ggccagaacc agctgtataa cgagctgaac ctgggcagga gggaggagta cgacgtgctg 1800
gacaagagga ggggcaggga ccccgagatg ggcggcaagc ccaggaggaa gaacccccag 1860
gagggcctgt ataacgagct gcagaaggac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc 1920
atgaagggcg agaggaggag gggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc 1980
gccaccaagg acacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag g 2031
<210> 56
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> scFab-VL
<400> 56
gacatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180
tctggcgtcc ctgatcggtt ctccggttcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300
tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 57
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> scFab-CL
<400> 57
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 58
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)- scFab-VH
<400> 58
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttcgggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 59
<211> 2806
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP fusion
pETR170101
<400> 59
atggagctgt atcatcctct tcttggtagc aacagctacg ggtgtgcatt ccgacatcgt 60
gatgacccag actccactct ccctgcccgt cacccctgga gagcccgcca gcattagctg 120
caggtctagc aagagcctct tgcacagcaa tggcatcact tatttgtatt ggtacctgca 180
aaagccaggg cagtctccac agctcctgat ttatcaaatg tccaaccttg tctctggcgt 240
ccctgatcgg ttctccggtt ccgggtcagg cactgatttc acactgaaaa tcagcagggt 300
ggaggctgag gatgttggag tttattactg cgctcagaat ctagaacttc cttacacctt 360
cggcggaggg accaaggtgg agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt 420
cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 480
cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa 540
ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac 600
cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 660
tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtg gcggcggagg 720
atctggtggc ggaggtagtg gtggtggtgg atctggcgga ggcggctccg gcggaggtgg 780
aagcggaggt ggtggttccg gaggacaggt gcaattggtg cagtctggcg ctgaagttaa 840
gaagcctggg agttcagtga aggtctcctg caaggcttcg ggatacgcct tcagctattc 900
ttggatcaat tgggtgcggc aggcgcctgg acaagggctc gagtggatgg gacggatctt 960
tcccggcgat ggggatactg actacaatgg gaaattcaag ggcagagtca caattaccgc 1020
cgacaaatcc actagcacag cctatatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc 1080
cgtgtattac tgtgcaagaa atgtctttga tggttactgg cttgtttact ggggccaggg 1140
aaccctggtc accgtctcct cagctagcac caagggcccc tccgtgttcc ccctggcccc 1200
cagcagcaag agcaccagcg gcggcacagc cgctctgggc tgcctggtca aggactactt 1260
ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg acctccggcg tgcacacctt 1320
ccccgccgtg ctgcagagtt ctggcctgta tagcctgagc agcgtggtca ccgtgccttc 1380
tagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa 1440
ggtggacaag aaggtggagc ccaagagctg cggagggggc ggatccttct gggtgctggt 1500
ggtggtgggc ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt 1560
ctgggtgagg agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag 1620
gaggcccggc cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc 1680
ctacaggagc agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca 1740
gaaccagctg tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa 1800
gaggaggggc agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg 1860
cctgtataac gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa 1920
gggcgagagg aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac 1980
caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaggtccg gagagggcag 2040
aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctaggg tgagcaaggg 2100
cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg 2160
ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct 2220
gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct 2280
gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt 2340
caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg 2400
caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga 2460
gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa 2520
ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa 2580
cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca 2640
gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca 2700
gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt 2760
gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtga 2806
<210> 60
<211> 436
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD fusion
pETR17162
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
165 170 175
Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
260 265 270
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
275 280 285
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
290 295 300
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
325 330 335
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
405 410 415
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
420 425 430
Leu Pro Pro Arg
435
<210> 61
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-ds-scFv
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
165 170 175
Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)- ds-Fab VH
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)- ds-Fab VL
<400> 63
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 1364
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD fusion pETR17162
<400> 64
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcaattgg tgcagtctgg cgctgaagtt aagaagcctg ggagttcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ccggttacgc cttcagctat tcttggatca attgggtgcg gcaggcgcct 180
ggacaatgtc tcgagtggat gggacggatc tttcccggcg atggggatac tgactacaat 240
gggaaattca agggcagagt cacaattacc gccgacaaat ccactagcac agcctatatg 300
gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag aaatgtcttt 360
gatggttact ggcttgttta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggaggg 420
ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctgacatc 480
gtgatgaccc agactccact ctccctgccc gtcacccctg gagagcccgc cagcattagc 540
tgcaggtcta gcaagagcct cttgcacagc aatggcatca cttatttgta ttggtacctg 600
caaaagccag ggcagtctcc acagctcctg atttatcaaa tgtccaacct tgtctctggc 660
gtccctgacc gcttctccgg ttccgggtca ggcactgatt tcacactgaa aatcagcagg 720
gtggaggctg aggatgttgg agtttattac tgcgctcaga atctagaact tccttacacc 780
ttcggctgtg ggaccaaggt ggagatcaag gagggggcgg atccttctgg gtgctggtgg 840
tggtgggcgg cgtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac cgtggccttc atcatcttct 900
gggtgaggag caagaggagc aggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagga 960
ggcccggccc caccaggaag cactaccagc cctacgcccc ccccagggac ttcgccgcct 1020
acaggagcag ggtgaagttc agcaggagcg ccgacgcccc cgcctaccag cagggccaga 1080
accagctgta taacgagctg aacctgggca ggagggagga gtacgacgtg ctggacaaga 1140
ggaggggcag ggaccccgag atgggcggca agcccaggag gaagaacccc caggagggcc 1200
tgtataacga gctgcagaag gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg 1260
gcgagaggag gaggggcaag ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca 1320
aggacaccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc cagg 1364
<210> 65
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)- ds-Fab VH
<400> 65
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggtta cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaat gtctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 66
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)- ds-Fab VL
<400> 66
gacatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120
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tctggcgtcc ctgaccgctt ctccggttcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300
tacaccttcg gctgtgggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 67
<211> 2151
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20-(GA101)-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP fusion
pETR17162
<400> 67
gccaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac cggtgtgcat 60
tcccaggtgc aattggtgca gtctggcgct gaagttaaga agcctgggag ttcagtgaag 120
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tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcaagaaat 360
gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
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gacatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 540
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 600
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tctggcgtcc ctgaccgctt ctccggttcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 720
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 780
tacaccttcg gctgtgggac caaggtggag atcaaaggag ggggcggatc cttctgggtg 840
ctggtggtgg tgggcggcgt gctggcctgc tacagcctgc tggtgaccgt ggccttcatc 900
atcttctggg tgaggagcaa gaggagcagg ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc 960
cccaggaggc ccggccccac caggaagcac taccagccct acgccccccc cagggacttc 1020
gccgcctaca ggagcagggt gaagttcagc aggagcgccg acgcccccgc ctaccagcag 1080
ggccagaacc agctgtataa cgagctgaac ctgggcagga gggaggagta cgacgtgctg 1140
gacaagagga ggggcaggga ccccgagatg ggcggcaagc ccaggaggaa gaacccccag 1200
gagggcctgt ataacgagct gcagaaggac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc 1260
atgaagggcg agaggaggag gggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc 1320
gccaccaagg acacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag gtccggagag 1380
ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc tagggtgagc 1440
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 1500
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 1560
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 1620
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 1680
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 1740
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1800
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1860
tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1920
gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 1980
cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 2040
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 2100
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagtg a 2151
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-PDL1 CDR H2 Kabat
<400> 69
Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-PDL1 CDR H3 Kabat
<400> 70
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti- PDL1 CDR 1 L1 Kabat
<400> 71
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti- PDL1 CDR L2 Kabat
<400> 72
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti- PDL1 CDR L3 Kabat
<400> 73
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 74
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 74
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
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180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
225 230 235 240
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
245 250 255
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
260 265 270
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
275 280 285
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
290 295 300
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
305 310 315 320
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
325 330 335
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
340 345 350
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
355 360 365
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
370 375 380
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
385 390 395 400
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 75
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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20 25 30
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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340 345 350
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
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Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
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Cys
225
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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fusion
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
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115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
305 310 315 320
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
325 330 335
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340 345 350
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
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Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<400> 83
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Ala Ser
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210
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Cys
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<212> PRT
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<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu
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Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
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Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
245 250 255
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
260 265 270
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
275 280 285
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
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275 280 285
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Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
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Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
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Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
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Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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<213> Homo sapiens
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Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
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<213> Homo sapiens
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100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 102
<211> 768
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 102
atgggcaaca actgctataa cgtggtggtg attgtgctgc tgctggtggg ctgcgaaaaa 60
gtgggcgcgg tgcagaacag ctgcgataac tgccagccgg gcaccttttg ccgcaaatat 120
aacccggtgt gcaaaagctg cccgccgagc acctttagca gcattggcgg ccagccgaac 180
tgcaacattt gccgcgtgtg cgcgggctat tttcgcttta aaaaattttg cagcagcacc 240
cataacgcgg aatgcgaatg cattgaaggc tttcattgcc tgggcccgca gtgcacccgc 300
tgcgaaaaag attgccgccc gggccaggaa ctgaccaaac agggctgcaa aacctgcagc 360
ctgggcacct ttaacgatca gaacggcacc ggcgtgtgcc gcccgtggac caactgcagc 420
ctggatggcc gcagcgtgct gaaaaccggc accaccgaaa aagatgtggt gtgcggcccg 480
ccggtggtga gctttagccc gagcaccacc attagcgtga ccccggaagg cggcccgggc 540
ggccatagcc tgcaggtgct gaccctgttt ctggcgctga ccagcgcgct gctgctggcg 600
ctgattttta ttaccctgct gtttagcgtg ctgaaatgga ttcgcaaaaa atttccgcat 660
atttttaaac agccgtttaa aaaaaccacc ggcgcggcgc aggaagaaga tgcgtgcagc 720
tgccgctgcc cgcaggaaga agaaggcggc ggcggcggct atgaactg 768
<210> 103
<211> 256
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 103
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 104
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 104
atgtgcgtgg gcgcgcgccg cctgggccgc ggcccgtgcg cggcgctgct gctgctgggc 60
ctgggcctga gcaccgtgac cggcctgcat tgcgtgggcg atacctatcc gagcaacgat 120
cgctgctgcc atgaatgccg cccgggcaac ggcatggtga gccgctgcag ccgcagccag 180
aacaccgtgt gccgcccgtg cggcccgggc ttttataacg atgtggtgag cagcaaaccg 240
tgcaaaccgt gcacctggtg caacctgcgc agcggcagcg aacgcaaaca gctgtgcacc 300
gcgacccagg ataccgtgtg ccgctgccgc gcgggcaccc agccgctgga tagctataaa 360
ccgggcgtgg attgcgcgcc gtgcccgccg ggccatttta gcccgggcga taaccaggcg 420
tgcaaaccgt ggaccaactg caccctggcg ggcaaacata ccctgcagcc ggcgagcaac 480
agcagcgatg cgatttgcga agatcgcgat ccgccggcga cccagccgca ggaaacccag 540
ggcccgccgg cgcgcccgat taccgtgcag ccgaccgaag cgtggccgcg caccagccag 600
ggcccgagca cccgcccggt ggaagtgccg ggcggccgcg cggtggcggc gattctgggc 660
ctgggcctgg tgctgggcct gctgggcccg ctggcgattc tgctggcgct gtatctgctg 720
cgccgcgatc agcgcctgcc gccggatgcg cataaaccgc cgggcggcgg cagctttcgc 780
accccgattc aggaagaaca ggcggatgcg catagcaccc tggcgaaaat t 831
<210> 105
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 106
<211> 816
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 106
atgtatgtgt gggtgcagca gccgaccgcg ctgctgctgc tggcgctgac cctgggcgtg 60
accgcgcgcc gcctgaactg cgtgaaacat acctatccga gcggccataa atgctgccgc 120
gaatgccagc cgggccatgg catggtgagc cgctgcgatc atacccgcga taccctgtgc 180
catccgtgcg aaaccggctt ttataacgaa gcggtgaact atgatacctg caaacagtgc 240
acccagtgca accatcgcag cggcagcgaa ctgaaacaga actgcacccc gacccaggat 300
accgtgtgcc gctgccgccc gggcacccag ccgcgccagg atagcggcta taaactgggc 360
gtggattgcg tgccgtgccc gccgggccat tttagcccgg gcaacaacca ggcgtgcaaa 420
ccgtggacca actgcaccct gagcggcaaa cagacccgcc atccggcgag cgatagcctg 480
gatgcggtgt gcgaagatcg cagcctgctg gcgaccctgc tgtgggaaac ccagcgcccg 540
acctttcgcc cgaccaccgt gcagagcacc accgtgtggc cgcgcaccag cgaactgccg 600
agcccgccga ccctggtgac cccggaaggc ccggcgtttg cggtgctgct gggcctgggc 660
ctgggcctgc tggcgccgct gaccgtgctg ctggcgctgt atctgctgcg caaagcgtgg 720
cgcctgccga acaccccgaa accgtgctgg ggcaacagct ttcgcacccc gattcaggaa 780
gaacataccg atgcgcattt taccctggcg aaaatt 816
<210> 107
<211> 272
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 107
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 108
<211> 597
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 108
atgaaaagcg gcctgtggta tttttttctg ttttgcctgc gcattaaagt gctgaccggc 60
gaaattaacg gcagcgcgaa ctatgaaatg tttatttttc ataacggcgg cgtgcagatt 120
ctgtgcaaat atccggatat tgtgcagcag tttaaaatgc agctgctgaa aggcggccag 180
attctgtgcg atctgaccaa aaccaaaggc agcggcaaca ccgtgagcat taaaagcctg 240
aaattttgcc atagccagct gagcaacaac agcgtgagct tttttctgta taacctggat 300
catagccatg cgaactatta tttttgcaac ctgagcattt ttgatccgcc gccgtttaaa 360
gtgaccctga ccggcggcta tctgcatatt tatgaaagcc agctgtgctg ccagctgaaa 420
ttttggctgc cgattggctg cgcggcgttt gtggtggtgt gcattctggg ctgcattctg 480
atttgctggc tgaccaaaaa aaaatatagc agcagcgtgc atgatccgaa cggcgaatat 540
atgtttatgc gcgcggtgaa caccgcgaaa aaaagccgcc tgaccgatgt gaccctg 597
<210> 109
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro
165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
<210> 110
<211> 600
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 110
atgaaaccgt atttttgccg cgtgtttgtg ttttgctttc tgattcgcct gctgaccggc 60
gaaattaacg gcagcgcgga tcatcgcatg tttagctttc ataacggcgg cgtgcagatt 120
agctgcaaat atccggaaac cgtgcagcag ctgaaaatgc gcctgtttcg cgaacgcgaa 180
gtgctgtgcg aactgaccaa aaccaaaggc agcggcaacg cggtgagcat taaaaacccg 240
atgctgtgcc tgtatcatct gagcaacaac agcgtgagct tttttctgaa caacccggat 300
agcagccagg gcagctatta tttttgcagc ctgagcattt ttgatccgcc gccgtttcag 360
gaacgcaacc tgagcggcgg ctatctgcat atttatgaaa gccagctgtg ctgccagctg 420
aaactgtggc tgccggtggg ctgcgcggcg tttgtggtgg tgctgctgtt tggctgcatt 480
ctgattattt ggtttagcaa aaaaaaatat ggcagcagcg tgcatgatcc gaacagcgaa 540
tatatgttta tggcggcggt gaacaccaac aaaaaaagcc gcctggcggg cgtgaccagc 600
<210> 111
<211> 200
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 111
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg
1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val
35 40 45
Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro
65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr
115 120 125
Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu
130 135 140
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile
145 150 155 160
Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp
165 170 175
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys
180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser
195 200
<210> 112
<211> 279
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 112
atgattcatc tgggccatat tctgtttctg ctgctgctgc cggtggcggc ggcgcagacc 60
accccgggcg aacgcagcag cctgccggcg ttttatccgg gcaccagcgg cagctgcagc 120
ggctgcggca gcctgagcct gccgctgctg gcgggcctgg tggcggcgga tgcggtggcg 180
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gaagatggca aagtgtatat taacatgccg ggccgcggc 279
<210> 113
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
85 90
<210> 114
<211> 237
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 114
atggatccgc cgggctatct gctgtttctg ctgctgctgc cggtggcggc gagccagacc 60
agcgcgggca gctgcagcgg ctgcggcacc ctgagcctgc cgctgctggc gggcctggtg 120
gcggcggatg cggtgatgag cctgctgatt gtgggcgtgg tgtttgtgtg catgcgcccg 180
catggccgcc cggcgcagga agatggccgc gtgtatatta acatgccggg ccgcggc 237
<210> 115
<211> 79
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 115
Met Asp Pro Pro Gly Tyr Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Gln Thr Ser Ala Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Met Ser Leu
35 40 45
Leu Ile Val Gly Val Val Phe Val Cys Met Arg Pro His Gly Arg Pro
50 55 60
Ala Gln Glu Asp Gly Arg Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
65 70 75
<210> 116
<211> 342
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 116
atggggggac ttgaaccctg cagcaggctc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60
ggtctccgtc ctgtccaggc ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120
ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180
gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240
aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300
gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaat ga 342
<210> 117
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
Lys
<210> 118
<211> 345
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 118
atgggggctc tggagccctc ctggtgcctt ctgttccttc ctgtcctcct gactgtggga 60
ggattaagtc ccgtacaggc ccagagtgac actttcccaa gatgcgactg ttcttccgtg 120
agccctggtg tactggctgg gattgttctg ggtgacttgg tgttgactct gctgattgcc 180
ctggctgtgt actctctggg ccgcctggtc tcccgaggtc aagggacagc ggaagggacc 240
cggaaacaac acattgctga gactgagtcg ccttatcagg agcttcaggg tcagagacca 300
gaagtataca gtgacctcaa cacacagagg caatattaca gatga 345
<210> 119
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 119
Met Gly Ala Leu Glu Pro Ser Trp Cys Leu Leu Phe Leu Pro Val Leu
1 5 10 15
Leu Thr Val Gly Gly Leu Ser Pro Val Gln Ala Gln Ser Asp Thr Phe
20 25 30
Pro Arg Cys Asp Cys Ser Ser Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile
35 40 45
Val Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Leu Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr
50 55 60
Ser Leu Gly Arg Leu Val Ser Arg Gly Gln Gly Thr Ala Glu Gly Thr
65 70 75 80
Arg Lys Gln His Ile Ala Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln
85 90 95
Gly Gln Arg Pro Glu Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Gln Tyr
100 105 110
Tyr Arg
<210> 120
<211> 164
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 121
<211> 492
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 121
atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60
gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120
atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagag 180
ccccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480
ccccctcgct aa 492
<210> 122
<211> 164
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 122
Met Lys Trp Lys Val Ser Val Leu Ala Cys Ile Leu His Val Arg Phe
1 5 10 15
Pro Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr Ala
35 40 45
Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn
100 105 110
Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Pro Arg
<210> 123
<211> 495
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 123
atgaagtgga aagtgtctgt tctcgcctgc atcctccacg tgcggttccc aggagcagag 60
gcacagagct ttggtctgct ggatcccaaa ctctgctact tgctagatgg aatcctcttc 120
atctacggag tcatcatcac agccctgtac ctgagagcaa aattcagcag gagtgcagag 180
actgctgcca acctgcagga ccccaaccag ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga 240
gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag 300
cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca 360
gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc 420
ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag gacacctatg atgccctgca tatgcagacc 480
ctggcccctc gctaa 495
<210> 124
<211> 254
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 125
<211> 762
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 125
atgtggcagc tgctgctgcc gaccgcgctg ctgctgctgg tgagcgcggg catgcgcacc 60
gaagatctgc cgaaagcggt ggtgtttctg gaaccgcagt ggtatcgcgt gctggaaaaa 120
gatagcgtga ccctgaaatg ccagggcgcg tatagcccgg aagataacag cacccagtgg 180
tttcataacg aaagcctgat tagcagccag gcgagcagct attttattga tgcggcgacc 240
gtggatgata gcggcgaata tcgctgccag accaacctga gcaccctgag cgatccggtg 300
cagctggaag tgcatattgg ctggctgctg ctgcaggcgc cgcgctgggt gtttaaagaa 360
gaagatccga ttcatctgcg ctgccatagc tggaaaaaca ccgcgctgca taaagtgacc 420
tatctgcaga acggcaaagg ccgcaaatat tttcatcata acagcgattt ttatattccg 480
aaagcgaccc tgaaagatag cggcagctat ttttgccgcg gcctgtttgg cagcaaaaac 540
gtgagcagcg aaaccgtgaa cattaccatt acccagggcc tggcggtgag caccattagc 600
agcttttttc cgccgggcta tcaggtgagc ttttgcctgg tgatggtgct gctgtttgcg 660
gtggataccg gcctgtattt tagcgtgaaa accaacattc gcagcagcac ccgcgattgg 720
aaagatcata aatttaaatg gcgcaaagat ccgcaggata aa 762
<210> 126
<211> 261
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 126
Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln Trp Leu Leu Pro Pro Leu
1 5 10 15
Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp Arg Gln Ser Ala Ala Leu
20 25 30
Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro Trp Ile Gln Val Leu Lys
35 40 45
Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly Thr His Asn Pro Gly Asn
50 55 60
Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Arg Ser Ile Arg Ser Gln Val
65 70 75 80
Gln Ala Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Leu Gly
100 105 110
Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr Pro Gln Arg Val Phe Leu
115 120 125
Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His Ser Trp Arg Asn Lys Leu
130 135 140
Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His
145 150 155 160
His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys Ala Asn His Ser His Ser
165 170 175
Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly Ser Thr Gln His Gln Ser
180 185 190
Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile
195 200 205
Ser Leu Val Trp Tyr His Thr Ala Phe Ser Leu Val Met Cys Leu Leu
210 215 220
Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr Val Arg Arg Asn Leu Gln
225 230 235 240
Thr Pro Arg Glu Tyr Trp Arg Lys Ser Leu Ser Ile Arg Lys His Gln
245 250 255
Ala Pro Gln Asp Lys
260
<210> 127
<211> 786
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 127
atgtttcaga atgcacactc tggaagccaa tggctacttc caccactgac aattctgctg 60
ctgtttgctt ttgcagacag gcagagtgca gctcttccga aggctgtggt gaaactggac 120
cccccatgga tccaggtgct caaggaagac atggtgacac tgatgtgcga agggacccac 180
aaccctggga actcttctac ccagtggttc cacaacggga ggtccatccg gagccaggtc 240
caagccagtt acacgtttaa ggccacagtc aatgacagtg gagaatatcg gtgtcaaatg 300
gagcagaccc gcctcagcga ccctgtagat ctgggagtga tttctgactg gctgctgctc 360
cagacccctc agcgggtgtt tctggaaggg gaaaccatca cgctaaggtg ccatagctgg 420
aggaacaaac tactgaacag gatctcattc ttccataatg aaaaatccgt gaggtatcat 480
cactacaaaa gtaatttctc tatcccaaaa gccaaccaca gtcacagtgg ggactactac 540
tgcaaaggaa gtctaggaag tacacagcac cagtccaagc ctgtcaccat cactgtccaa 600
gatccagcaa ctacatcctc catctctcta gtctggtacc acactgcttt ctccctagtg 660
atgtgcctcc tgtttgcagt ggacacgggc ctttatttct acgtacggag aaatcttcaa 720
accccgaggg agtactggag gaagtccctg tcaatcagaa agcaccaggc tcctcaagac 780
aagtga 786
<210> 128
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly
50 55 60
Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn
65 70 75 80
Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
85 90 95
Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln
100 105 110
Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met
115 120 125
Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp
130 135 140
Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile
145 150 155 160
Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro
165 170 175
Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
210 215
<210> 129
<211> 648
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 129
atgggctgga ttcgcggccg ccgcagccgc catagctggg aaatgagcga atttcataac 60
tataacctgg atctgaaaaa aagcgatttt agcacccgct ggcagaaaca gcgctgcccg 120
gtggtgaaaa gcaaatgccg cgaaaacgcg agcccgtttt ttttttgctg ctttattgcg 180
gtggcgatgg gcattcgctt tattattatg gtggcgattt ggagcgcggt gtttctgaac 240
agcctgttta accaggaagt gcagattccg ctgaccgaaa gctattgcgg cccgtgcccg 300
aaaaactgga tttgctataa aaacaactgc tatcagtttt ttgatgaaag caaaaactgg 360
tatgaaagcc aggcgagctg catgagccag aacgcgagcc tgctgaaagt gtatagcaaa 420
gaagatcagg atctgctgaa actggtgaaa agctatcatt ggatgggcct ggtgcatatt 480
ccgaccaacg gcagctggca gtgggaagat ggcagcattc tgagcccgaa cctgctgacc 540
attattgaaa tgcagaaagg cgattgcgcg ctgtatgcga gcagctttaa aggctatatt 600
gaaaactgca gcaccccgaa cacctatatt tgcatgcagc gcaccgtg 648
<210> 130
<211> 232
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 130
Met Ala Leu Ile Arg Asp Arg Lys Ser His His Ser Glu Met Ser Lys
1 5 10 15
Cys His Asn Tyr Asp Leu Lys Pro Ala Lys Trp Asp Thr Ser Gln Glu
20 25 30
Gln Gln Lys Gln Arg Leu Ala Leu Thr Thr Ser Gln Pro Gly Glu Asn
35 40 45
Gly Ile Ile Arg Gly Arg Tyr Pro Ile Glu Lys Leu Lys Ile Ser Pro
50 55 60
Met Phe Val Val Arg Val Leu Ala Ile Ala Leu Ala Ile Arg Phe Thr
65 70 75 80
Leu Asn Thr Leu Met Trp Leu Ala Ile Phe Lys Glu Thr Phe Gln Pro
85 90 95
Val Leu Cys Asn Lys Glu Val Pro Val Ser Ser Arg Glu Gly Tyr Cys
100 105 110
Gly Pro Cys Pro Asn Asn Trp Ile Cys His Arg Asn Asn Cys Tyr Gln
115 120 125
Phe Phe Asn Glu Glu Lys Thr Trp Asn Gln Ser Gln Ala Ser Cys Leu
130 135 140
Ser Gln Asn Ser Ser Leu Leu Lys Ile Tyr Ser Lys Glu Glu Gln Asp
145 150 155 160
Phe Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val Gln Ile
165 170 175
Pro Ala Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ser Leu Ser Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Thr Leu Val Glu Ile Pro Lys Gly Ser Cys Ala Val Tyr
195 200 205
Gly Ser Ser Phe Lys Ala Tyr Thr Glu Asp Cys Ala Asn Leu Asn Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Met Lys Arg Ala Val
225 230
<210> 131
<211> 696
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 131
atggcgctga ttcgcgatcg caaaagccat catagcgaaa tgagcaaatg ccataactat 60
gatctgaaac cggcgaaatg ggataccagc caggaacagc agaaacagcg cctggcgctg 120
accaccagcc agccgggcga aaacggcatt attcgcggcc gctatccgat tgaaaaactg 180
aaaattagcc cgatgtttgt ggtgcgcgtg ctggcgattg cgctggcgat tcgctttacc 240
ctgaacaccc tgatgtggct ggcgattttt aaagaaacct ttcagccggt gctgtgcaac 300
aaagaagtgc cggtgagcag ccgcgaaggc tattgcggcc cgtgcccgaa caactggatt 360
tgccatcgca acaactgcta tcagtttttt aacgaagaaa aaacctggaa ccagagccag 420
gcgagctgcc tgagccagaa cagcagcctg ctgaaaattt atagcaaaga agaacaggat 480
tttctgaaac tggtgaaaag ctatcattgg atgggcctgg tgcagattcc ggcgaacggc 540
agctggcagt gggaagatgg cagcagcctg agctataacc agctgaccct ggtggaaatt 600
ccgaaaggca gctgcgcggt gtatggcagc agctttaaag cgtataccga agattgcgcg 660
aacctgaaca cctatatttg catgaaacgc gcggtg 696
<210> 132
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 YMNM
<400> 132
Tyr Met Asn Met
1
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 PYAP
<400> 133
Pro Tyr Ala Pro
1
<210> 134
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 FMNM
<400> 134
Phe Met Asn Met
1
<210> 135
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 AYAA
<400> 135
Ala Tyr Ala Ala
1
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Signal peptide
<400> 136
Ala Thr Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val His Ser
20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Signal peptide DNA sequence
<400> 137
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactcc 57
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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Glu Phe Gly Met Asn
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 139
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (98/99) CDR 1 L1 Kabat
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Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (98/99) CDR L2 Kabat
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Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 144
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
180 185 190
Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
260 265 270
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
275 280 285
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
290 295 300
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
325 330 335
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
405 410 415
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
420 425 430
Leu Pro Pro Arg
435
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<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (98/99)-scFv
<400> 145
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
180 185 190
Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
245 250
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<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (98/99)-VH
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (98/99)-VL
<400> 147
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66) CDR H1 Kabat
<400> 148
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66) CDR H2 Kabat
<400> 149
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66) CDR H3 Kabat
<400> 150
Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66) CDR 1 L1 Kabat
<400> 151
Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66) CDR L2 Kabat
<400> 152
Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66) CDR L3 Kabat
<400> 153
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 154
<211> 437
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66)-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD fusion
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly
165 170 175
Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro
225 230 235 240
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
260 265 270
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
275 280 285
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
290 295 300
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
305 310 315 320
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
325 330 335
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
340 345 350
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
355 360 365
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
370 375 380
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
385 390 395 400
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
420 425 430
Ala Leu Pro Pro Arg
435
<210> 155
<211> 252
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66)-scFv
<400> 155
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
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225 230 235 240
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<223> Anti-CEA (T84.66)-VH
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<400> 157
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Claims (29)
- 앵커링 경막 도메인, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 Fab, crossFab 또는 scFab인 항원 결합 수용체.
- 제1항에 있어서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경막 도메인인 항원 결합 수용체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이고, 특히 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z의 세포내 도메인 또는 이의 단편이고, 특히 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인 또는 이의 단편이고, 특히, 적어도 하나의 공자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 수용체는 CD3z의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 항원 결합 수용체는 CD28의 세포내 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 공자극성 신호전달 도메인을 포함하는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 중쇄 불변 도메인 (CH) 및 경쇄 불변 도메인 (CL)을 포함하고, CH 도메인 또는 CL 도메인은 C-말단에서 임의로 펩티드 링커를 통해, 앵커링 경막 도메인의 N-말단에 연결되는 것인 항원 결합 수용체.
- 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 수용체는 하나의 공동-신호전달 도메인을 포함하고, 공동-신호전달 도메인은 N-말단에서 앵커링 경막 도메인의 C-말단에 연결되는 것인 항원 결합 수용체.
- 제11항에 있어서, 항원 결합 수용체는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 추가적으로 포함하고, 자극성 신호전달 도메인은 N-말단에서 공자극성 신호전달 도메인의 C-말단에 연결되는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 테나신 (TNC) 및 프로그램된 사멸-리간드 1(PDL1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 항원 결합 수용체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i) (a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 YSWIN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIFPGDGDTDYNGKFKG (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 NVFDGYWLVY (SEQ ID NO:3)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) (d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 QMSNLVS (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 AQNLELPYT (SEQ ID NO:6)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 수용체. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 PDL1에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i) (a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DSWIH (SEQ ID NO:68);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:69); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 RHWPGGFDY (SEQ ID NO:70)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) (d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:71);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASFLYS (SEQ ID NO:72); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQYLYHPAT (SEQ ID NO:73)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 수용체. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i) (a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 EFGMN (SEQ ID NO:138);
(b) CDR H2 아미노산 서열 WINTKTGEATYVEEFKG (SEQ ID NO:139); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 WDFAYYVEAMDY (SEQ ID NO:140)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) (d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 KASAAVGTYVA (SEQ ID NO:141);
(e) CDR L2 아미노산 서열 SASYRKR (SEQ ID NO:142); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 HQYYTYPLFT (SEQ ID NO:143)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 수용체. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 항원 결합 모이어티는
(i) (a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 DTYMH (SEQ ID NO:148);
(b) CDR H2 아미노산 서열 RIDPANGNSKYVPKFQG (SEQ ID NO:149); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 FGYYVSDYAMAY (SEQ ID NO:150)
을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
(ii) (d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RAGESVDIFGVGFLH (SEQ ID NO:151);
(e) CDR L2 아미노산 서열 RASNRAT (SEQ ID NO:152); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 QQTNEDPYT (SEQ ID NO:153)
을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 항원 결합 수용체. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제18항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포.
- 제20항에 있어서, 세포는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 제1 항원 결합 수용체를 포함하고, 제1 항원 결합 수용체는 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하며, 세포는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 제2 항원 결합 수용체를 포함하고, 제2 항원 결합 수용체는 crossFab 항원 결합 모이어티를 포함하는 것인 형질도입된 T 세포.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항 또는 제20항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 사용을 위한 것인 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항 또는 제20항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 악성 질환의 치료에서 사용을 위한 것이고, 치료는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여 단계를 포함하는 것인 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
- 제23항에 있어서, 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택되는 것인 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
- 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료 방법.
- 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포와 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 유도 방법.
- 약물의 제조를 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체, 제18항의 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 제20항 또는 제21항의 형질도입된 T 세포의 용도.
- 제27항에 있어서, 약물은 악성 질환의 치료를 위한 것인 용도.
- 실시예 중 어느 하나 또는 첨부된 도면 중 어느 하나를 참조로 실질적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체.
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