JP3472584B2 - IKK−βタンパク質、核酸及び方法 - Google Patents
IKK−βタンパク質、核酸及び方法Info
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- JP3472584B2 JP3472584B2 JP50737399A JP50737399A JP3472584B2 JP 3472584 B2 JP3472584 B2 JP 3472584B2 JP 50737399 A JP50737399 A JP 50737399A JP 50737399 A JP50737399 A JP 50737399A JP 3472584 B2 JP3472584 B2 JP 3472584B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Description
【発明の詳細な説明】
緒言
発明の分野
この発明の分野は転写因子の活性に関与するタンパク
質である。
質である。
背景
サイトカイン類は、潜伏転写因子の活性等を改変する
ことにより遺伝子発現における変化をトリガーする(Hi
llとTreisman,1995)。核因子κB(NF−κB)は如何
にそのような外部刺激が活性な転写因子に転換されるか
の顕著な例である(Vermaら,1995)。NH−κB系は、数
多くの免疫及び炎症性応答遺伝子並びに重要なウィルス
遺伝子の発現を制御する関連転写因子のRelファミリー
のメンバーのホモ及びヘテロダイマーからなる(Lenard
oとBaltimore,1989;BaeuerleとHenkel,1994)。NF−κ
B転写因子の活性はその細胞下局在化により調節される
(Vermaら,1995)。大抵の細胞型において、NF−κBは
50kDaと65kDaのサブユニットからなるヘテロダイマーと
して存在する。このヘテロダイマーは抑制タンパク質の
IκBファミリーのメンバーであるIκBαと結合して
細胞質に隔絶される(FincoとBaldwin,1995;ThanosとMa
niatis,1995;Vermaら,1995)。IκBαはNF−κBの核
局在化シグナルをマスクし、それによってNF−κBの核
トランスロケーションを防ぐ。核中に転位置し同族DNA
配列に結合する活性な転写因子へのNF−κBの転換に
は、26sプロテアソームでのIκBαのリン酸化と続く
ユビキチン依存性分解が必要となる。IκBαのシグナ
ル誘導リン酸化はセリン32と36で起こる。これらのセリ
ンの一方又は両方の突然変異により、IκBαはユビキ
チン結合とタンパク分解性分解に対して耐性にする(Ch
enら,1995)。
ことにより遺伝子発現における変化をトリガーする(Hi
llとTreisman,1995)。核因子κB(NF−κB)は如何
にそのような外部刺激が活性な転写因子に転換されるか
の顕著な例である(Vermaら,1995)。NH−κB系は、数
多くの免疫及び炎症性応答遺伝子並びに重要なウィルス
遺伝子の発現を制御する関連転写因子のRelファミリー
のメンバーのホモ及びヘテロダイマーからなる(Lenard
oとBaltimore,1989;BaeuerleとHenkel,1994)。NF−κ
B転写因子の活性はその細胞下局在化により調節される
(Vermaら,1995)。大抵の細胞型において、NF−κBは
50kDaと65kDaのサブユニットからなるヘテロダイマーと
して存在する。このヘテロダイマーは抑制タンパク質の
IκBファミリーのメンバーであるIκBαと結合して
細胞質に隔絶される(FincoとBaldwin,1995;ThanosとMa
niatis,1995;Vermaら,1995)。IκBαはNF−κBの核
局在化シグナルをマスクし、それによってNF−κBの核
トランスロケーションを防ぐ。核中に転位置し同族DNA
配列に結合する活性な転写因子へのNF−κBの転換に
は、26sプロテアソームでのIκBαのリン酸化と続く
ユビキチン依存性分解が必要となる。IκBαのシグナ
ル誘導リン酸化はセリン32と36で起こる。これらのセリ
ンの一方又は両方の突然変異により、IκBαはユビキ
チン結合とタンパク分解性分解に対して耐性にする(Ch
enら,1995)。
多面的サイトカインである腫瘍壊死因子(TNF)及び
インターロイキン−1(IL−1)はIκBリン酸化と続
くNF−κB活性化の生理的誘導物質である(Osbornら,1
989;Begら,1993)。TNF及びIL−1は細胞表面レセプタ
ーの異なるファミリーを介してNF−κB活性化を導くシ
グナル伝達カスケードを開始させるが(Smithら,1994;D
inarello,1996)、両方の経路は、シグナルトランスデ
ューサーとしてアダプタータンパク質のTNFレセプター
関連因子(TRAF)ファミリーのメンバーを利用する(Ro
theら,1995;Hsuら,1996;Caoら,1996b)。TRAFタンパク
質は元来は、75kDaのTNFレセプター(TNFR2)、CD40、C
D30、及びリンホトキシン−βレセプターを含むTNFレセ
プターファミリーの幾つかのメンバーの細胞質ドメイン
に直接随伴することが見出された(Rotheら,1994;Huら,
1994;Chengら,1995;Mosialosら,1995;SongとDonner,199
5;Satoら,1995;Leeら,1996;Gedrichら,1996;Ansieauら,
1996)。また、TRAFタンパク質はアダプタータンパク質
TRADDにより55kDaのTNFレセプター(TNFR1)に間接的に
補充される(Hsuら,1996)。TNFよるNF−κBの活性化
にはTRAF2が必要となる(Rotheら,1995;Hsuら,1996)。
TRAF5もまたTNFレセプターファミリーのメンバーによる
NF−κB活性化に関係していた(Nakanoら,1996)。こ
れに対して、TRAF6はIL−1によりNF−κB活性化に関
与する(Caoら,1996b)。IL−1処理の際、TRAF6は、IL
−1レセプター複合体に結合するセリン−スレオニンキ
ナーゼであるIRAKに付随する(Caoら,1996a)。
インターロイキン−1(IL−1)はIκBリン酸化と続
くNF−κB活性化の生理的誘導物質である(Osbornら,1
989;Begら,1993)。TNF及びIL−1は細胞表面レセプタ
ーの異なるファミリーを介してNF−κB活性化を導くシ
グナル伝達カスケードを開始させるが(Smithら,1994;D
inarello,1996)、両方の経路は、シグナルトランスデ
ューサーとしてアダプタータンパク質のTNFレセプター
関連因子(TRAF)ファミリーのメンバーを利用する(Ro
theら,1995;Hsuら,1996;Caoら,1996b)。TRAFタンパク
質は元来は、75kDaのTNFレセプター(TNFR2)、CD40、C
D30、及びリンホトキシン−βレセプターを含むTNFレセ
プターファミリーの幾つかのメンバーの細胞質ドメイン
に直接随伴することが見出された(Rotheら,1994;Huら,
1994;Chengら,1995;Mosialosら,1995;SongとDonner,199
5;Satoら,1995;Leeら,1996;Gedrichら,1996;Ansieauら,
1996)。また、TRAFタンパク質はアダプタータンパク質
TRADDにより55kDaのTNFレセプター(TNFR1)に間接的に
補充される(Hsuら,1996)。TNFよるNF−κBの活性化
にはTRAF2が必要となる(Rotheら,1995;Hsuら,1996)。
TRAF5もまたTNFレセプターファミリーのメンバーによる
NF−κB活性化に関係していた(Nakanoら,1996)。こ
れに対して、TRAF6はIL−1によりNF−κB活性化に関
与する(Caoら,1996b)。IL−1処理の際、TRAF6は、IL
−1レセプター複合体に結合するセリン−スレオニンキ
ナーゼであるIRAKに付随する(Caoら,1996a)。
NF−κB−誘導キナーゼ(NIK)はTRAF2−相互作用タ
ンパク質として同定されたMAPキナーゼキナーゼキナー
ゼ(MAP3K)ファミリーのメンバーである(Malininら,1
997)。NIKは過剰発現されたときNF−κBを活性化し、
そのTRAF2−相互作用C末端ドメインを含む(NIK
(624-947))又はそのキナーゼドメインに2つの重要な
リシン残基を欠く(NIK(KK429-430AA))NIKのキナーゼ
不活性突然変異体が、TNF−、IL−1−、及びTRAF2−誘
導NF−κB活性化を抑制するドミナントネガティブ阻害
剤として挙動する(Malininら,1997)。最近、NIKは、T
RAF5及びTRAF6を含むTRAFファミリーの更なるメンバー
と結合することが見出された。NIKの触媒的に不活性な
突然変異体もまたTRAF5−及びTRAF6−誘発NF−κB活性
化を抑制し、よってTRAFの下流のTNF及びIL−1により
トリガーされるNF−κBシグナル伝達カスケードにおけ
る共通のメディエータとしての統一概念をNIKに提供す
る。
ンパク質として同定されたMAPキナーゼキナーゼキナー
ゼ(MAP3K)ファミリーのメンバーである(Malininら,1
997)。NIKは過剰発現されたときNF−κBを活性化し、
そのTRAF2−相互作用C末端ドメインを含む(NIK
(624-947))又はそのキナーゼドメインに2つの重要な
リシン残基を欠く(NIK(KK429-430AA))NIKのキナーゼ
不活性突然変異体が、TNF−、IL−1−、及びTRAF2−誘
導NF−κB活性化を抑制するドミナントネガティブ阻害
剤として挙動する(Malininら,1997)。最近、NIKは、T
RAF5及びTRAF6を含むTRAFファミリーの更なるメンバー
と結合することが見出された。NIKの触媒的に不活性な
突然変異体もまたTRAF5−及びTRAF6−誘発NF−κB活性
化を抑制し、よってTRAFの下流のTNF及びIL−1により
トリガーされるNF−κBシグナル伝達カスケードにおけ
る共通のメディエータとしての統一概念をNIKに提供す
る。
ここで、我々は、NIK−相互作用タンパク質として新
規なキナーゼIκBキナーゼであるIKK−βを開示す
る。IKK−βは未知の機能のセリン−スレオニンキナー
ゼをコードすると推論された過去に同定されたオープン
リーディングフレームの概念的翻訳物と配列類似性を有
する(「保存されたヘリックス・ループ・ヘリックス遍
在性キナーゼ(Conserved Helix−loop−helix Ubiquit
ous Kinase)」又はCHUK,ConnellyとMarcu;Mockら,199
5)。IKK−βの触媒的に不活性な突然変異体は、TNF及
びIL−1刺激により並びにTRAF及びNIK過剰発現により
誘発されるNF−κB活性化を抑制することが示され;一
過性に発現したIKK−βは内在性IκBβ複合体に随伴
することが示され;そしてIKK−βがIκBαをセリン3
2及び36上でリン酸化することが示される。本明細書に
おいてIκBのSer32とSer36はコンセンサス配列DSGL/I
XSM/Lの一部分である2つのセリン残基(例えばIκB
αのser32と36、IκBβのser19と23、及びメチオニン
の使用に応じてIκBεのser157と161あるいは18と2
2)を集合的に指す。
規なキナーゼIκBキナーゼであるIKK−βを開示す
る。IKK−βは未知の機能のセリン−スレオニンキナー
ゼをコードすると推論された過去に同定されたオープン
リーディングフレームの概念的翻訳物と配列類似性を有
する(「保存されたヘリックス・ループ・ヘリックス遍
在性キナーゼ(Conserved Helix−loop−helix Ubiquit
ous Kinase)」又はCHUK,ConnellyとMarcu;Mockら,199
5)。IKK−βの触媒的に不活性な突然変異体は、TNF及
びIL−1刺激により並びにTRAF及びNIK過剰発現により
誘発されるNF−κB活性化を抑制することが示され;一
過性に発現したIKK−βは内在性IκBβ複合体に随伴
することが示され;そしてIKK−βがIκBαをセリン3
2及び36上でリン酸化することが示される。本明細書に
おいてIκBのSer32とSer36はコンセンサス配列DSGL/I
XSM/Lの一部分である2つのセリン残基(例えばIκB
αのser32と36、IκBβのser19と23、及びメチオニン
の使用に応じてIκBεのser157と161あるいは18と2
2)を集合的に指す。
発明の概要
本発明は、IKK−βポリペプチド、関連する核酸、及
びIKK−β−特異的構造及び活性及びIKK−β機能、特に
IκBキナーゼ活性を有するそのポリペプチドドメイン
に関する方法及び組成物を提供する。IKK−βポリペプ
チドは、NFκB活性化を調節することができ、よって細
胞機能の重要な調節因子を提供する。該ポリペプチド
は、主題のIKK−βポリペプチドコード核酸由来の形質
転換宿主細胞から組換え的に産生されても哺乳動物細胞
から生成されてもよい。本発明は、開示されたIKK−β
遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離IKK−βハ
イブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗
体のようなIKK−β−特異的結合薬剤、及び主題組成物
を製造し、診断法(例えば、IKK−β転写物に対する遺
伝子ハイブリダイゼーションスクリーン)、治療法(例
えばTNFシグナル伝達を阻害するIKK−βキナーゼ阻害
剤)及び生物薬剤工業(例えば免疫原、他の転写調節因
子を単離するための試薬、薬理学的リード薬剤のために
化学ライブラリをスクリーニングするための試薬等々)
に使用する方法を提供する。
びIKK−β−特異的構造及び活性及びIKK−β機能、特に
IκBキナーゼ活性を有するそのポリペプチドドメイン
に関する方法及び組成物を提供する。IKK−βポリペプ
チドは、NFκB活性化を調節することができ、よって細
胞機能の重要な調節因子を提供する。該ポリペプチド
は、主題のIKK−βポリペプチドコード核酸由来の形質
転換宿主細胞から組換え的に産生されても哺乳動物細胞
から生成されてもよい。本発明は、開示されたIKK−β
遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離IKK−βハ
イブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗
体のようなIKK−β−特異的結合薬剤、及び主題組成物
を製造し、診断法(例えば、IKK−β転写物に対する遺
伝子ハイブリダイゼーションスクリーン)、治療法(例
えばTNFシグナル伝達を阻害するIKK−βキナーゼ阻害
剤)及び生物薬剤工業(例えば免疫原、他の転写調節因
子を単離するための試薬、薬理学的リード薬剤のために
化学ライブラリをスクリーニングするための試薬等々)
に使用する方法を提供する。
発明の詳細な説明
ヒトIKK−βポリペプチドをコードしている天然cDNA
の核酸配列は配列番号:1として示され、概念的全長翻訳
物は配列番号:2として示される。本発明のIKK−βポリ
ペプチドは配列番号:1の不完全翻訳物及び配列番号:2の
欠失変異体を含み、その翻訳物及び欠失変異体はIKK−
β特異的アミノ酸配列及び結合特異性又は機能を有す
る。
の核酸配列は配列番号:1として示され、概念的全長翻訳
物は配列番号:2として示される。本発明のIKK−βポリ
ペプチドは配列番号:1の不完全翻訳物及び配列番号:2の
欠失変異体を含み、その翻訳物及び欠失変異体はIKK−
β特異的アミノ酸配列及び結合特異性又は機能を有す
る。
本発明のIKK−βポリペプチドドメインは、IKK−αか
ら区別可能なアミノ酸配列、一般には配列番号:2の少な
くとも11、好ましくは少なくとも21、より好ましくは少
なくとも31、より好ましくは少なくとも41の連続残基、
特に配列番号:2の残基1−190及び残基217−756を有
し、IKK−βドメイン特異的活性又は機能、例えばIKK−
β特異的キナーゼ又はキナーゼ抑制活性、NIK結合又は
結合抑制活性、IκB結合又は結合抑制活性、NFκB活
性化又は抑制活性又は抗体活性をもたらす。好ましいド
メインはIκBのセリン32と36の少なくとも一方、好ま
しくは両方をリン酸化させる(Verma,I.M.ら(199
5))。
ら区別可能なアミノ酸配列、一般には配列番号:2の少な
くとも11、好ましくは少なくとも21、より好ましくは少
なくとも31、より好ましくは少なくとも41の連続残基、
特に配列番号:2の残基1−190及び残基217−756を有
し、IKK−βドメイン特異的活性又は機能、例えばIKK−
β特異的キナーゼ又はキナーゼ抑制活性、NIK結合又は
結合抑制活性、IκB結合又は結合抑制活性、NFκB活
性化又は抑制活性又は抗体活性をもたらす。好ましいド
メインはIκBのセリン32と36の少なくとも一方、好ま
しくは両方をリン酸化させる(Verma,I.M.ら(199
5))。
IKK−β特異的活性又は機能は、簡便なインビトロ、
細胞ベース、又はインビボアッセイ:例えば動物でのイ
ンビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ(例えば遺伝
子療法、遺伝子組換え等々)等々により決定することが
できる。結合アッセイは、結合標的とのIKK−βポリペ
プチドの分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを
包含する。結合標的は、例えばIKK−β基質のような天
然の細胞内結合標的、IKK−β調節タンパク質あるいはI
KK−β活性又はその局在化を直接変調するその他の制御
因子;あるいは抗体のような特異的免疫タンパク質、又
は以下に記載するようなスクリーニングアッセイにおい
て同定されるもののようなIKK−β特異的薬剤のような
非天然結合標的でもよい。IKK−β−結合特異性は、キ
ナーゼ活性又は結合平衡定数(通常少なくとも約10
7M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より好ましくは
少なくとも約109M-1)により、IKK−β−発現細胞にお
けるネガティブ変異体として機能し、異種性宿主(例え
ばげっ歯類又はウサギ)中でIKK−β特異的抗体を誘発
する等々の主題タンパク質の能力により、検定すること
ができる。とにかく、主題IKK−βポリペプチドのIKK−
β結合特異性はIKK−α(配列番号:4)を必ず区別す
る。IKK−β結合特異性を有するIKK−βポリペプチドの
例を表1に示す。
細胞ベース、又はインビボアッセイ:例えば動物でのイ
ンビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ(例えば遺伝
子療法、遺伝子組換え等々)等々により決定することが
できる。結合アッセイは、結合標的とのIKK−βポリペ
プチドの分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを
包含する。結合標的は、例えばIKK−β基質のような天
然の細胞内結合標的、IKK−β調節タンパク質あるいはI
KK−β活性又はその局在化を直接変調するその他の制御
因子;あるいは抗体のような特異的免疫タンパク質、又
は以下に記載するようなスクリーニングアッセイにおい
て同定されるもののようなIKK−β特異的薬剤のような
非天然結合標的でもよい。IKK−β−結合特異性は、キ
ナーゼ活性又は結合平衡定数(通常少なくとも約10
7M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より好ましくは
少なくとも約109M-1)により、IKK−β−発現細胞にお
けるネガティブ変異体として機能し、異種性宿主(例え
ばげっ歯類又はウサギ)中でIKK−β特異的抗体を誘発
する等々の主題タンパク質の能力により、検定すること
ができる。とにかく、主題IKK−βポリペプチドのIKK−
β結合特異性はIKK−α(配列番号:4)を必ず区別す
る。IKK−β結合特異性を有するIKK−βポリペプチドの
例を表1に示す。
表1. IKK−β結合特異性を有するIKK−βポリペプチド
の例 hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基1−9)hIKK−βΔ1
(配列番号:2、残基11−17)hIKK−βΔ1(配列番号:
2、残基21−29)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基42−5
1)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基73−89)hIKK−β
Δ1(配列番号:2、残基90−99)hIKK−βΔ1(配列番
号:2、残基120−130)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基
155−164)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基180−190)
hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基217−229)hIKK−βΔ
1(配列番号:2、残基300−350)hIKK−βΔ1(配列番
号:2、残基419−444)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基
495−503)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基565−590)
hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基610−627)hIKK−βΔ
1(配列番号:2、残基677−690)hIKK−βΔ1(配列番
号:2、残基715−740)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基
747−756) 本発明に係るIKK−βポリペプチドは単離されるか純
粋である:「単離」ポリペプチドは、天然の状態では付
随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、こ
の量は、与えられた試料中の全ポリペプチドの好ましく
は少なくとも約0.5%,より好ましくは少なくとも約5
%を構成し、純粋なポリペプチドは与えられた試料中の
全ポリペプチドの少なくとも約90%、好ましくは少なく
とも約99%を構成する。IKK−βポリペプチドとポリペ
プチドドメインは合成されても、組換え技術により産生
されても、あるいは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞
から精製されてもよい。非常に広範な分子及び生化学的
方法が主題組成物の生化学合成、分子発現及び精製に利
用でき、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual(分子クローニング、実験室マニュアル)(Sambroo
kら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー)、Current Protocols in Molecular Biology(分子
生物学における現在のプロトコール)(Ausubelら編、G
reene Publ.Assoc.,Wiley−Interscience,NY)あるいは
当該分野でその他知られているものを参照されたい。
の例 hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基1−9)hIKK−βΔ1
(配列番号:2、残基11−17)hIKK−βΔ1(配列番号:
2、残基21−29)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基42−5
1)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基73−89)hIKK−β
Δ1(配列番号:2、残基90−99)hIKK−βΔ1(配列番
号:2、残基120−130)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基
155−164)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基180−190)
hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基217−229)hIKK−βΔ
1(配列番号:2、残基300−350)hIKK−βΔ1(配列番
号:2、残基419−444)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基
495−503)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基565−590)
hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基610−627)hIKK−βΔ
1(配列番号:2、残基677−690)hIKK−βΔ1(配列番
号:2、残基715−740)hIKK−βΔ1(配列番号:2、残基
747−756) 本発明に係るIKK−βポリペプチドは単離されるか純
粋である:「単離」ポリペプチドは、天然の状態では付
随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、こ
の量は、与えられた試料中の全ポリペプチドの好ましく
は少なくとも約0.5%,より好ましくは少なくとも約5
%を構成し、純粋なポリペプチドは与えられた試料中の
全ポリペプチドの少なくとも約90%、好ましくは少なく
とも約99%を構成する。IKK−βポリペプチドとポリペ
プチドドメインは合成されても、組換え技術により産生
されても、あるいは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞
から精製されてもよい。非常に広範な分子及び生化学的
方法が主題組成物の生化学合成、分子発現及び精製に利
用でき、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual(分子クローニング、実験室マニュアル)(Sambroo
kら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー)、Current Protocols in Molecular Biology(分子
生物学における現在のプロトコール)(Ausubelら編、G
reene Publ.Assoc.,Wiley−Interscience,NY)あるいは
当該分野でその他知られているものを参照されたい。
本発明は、主題キナーゼプロテインに特異的な結合薬
剤で、基質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然細胞内
結合標的等々を含むもの、かかる薬剤を同定し調製する
方法、及び診断法、治療法及び製薬開発におけるその用
途を提供する。例えば、特異的結合薬剤は、様々な診断
及び治療用途、特に疾病又は疾病予後に例えばNF−κB
活性化のような主題タンパク質を含む経路の不適切な利
用に関与する場合に有用である。新規なIKK−β特異的
結合薬剤には、IKK−β特異的レセプター、例えば特異
的抗体のような体細胞性組換えポリペプチドレセプター
又はT細胞抗原レセプター(例えばHarlowとLane(198
8)Antibodies,A Laboratory Manual(抗体、実験室マ
ニュアル)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー)及び例えば一重、二重及び三重ハイブリッドス
クリーニングのようなアッセイで同定されるその他の天
然の結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリの
スクリーニングで同定される非天然細胞内結合薬剤等々
が包含される。特に興味深い薬剤はIKK−β機能、例え
ばIKK−β依存性転写活性化を変調する。例えばIKK−β
IκBキナーゼ活性の広範な阻害剤を、IκBを含むシ
グナル伝達を調節するために使用しても良い。IKK−β
IκBキナーゼ阻害剤の例には、セリン/スレオニンキ
ナーゼ(例えばPKC)阻害剤の既知のクラス、例えばATP
と基質結合の競合阻害剤、抗性物質、IKK−β誘導ペプ
チド阻害剤等々が含まれる。表2及び3を参照された
い。IKK−β特異性と活性は、プロテインキナーゼのパ
ネルを使用する高収量キナーゼアッセイにおいて即座に
定量される(引用文献と実施例を参照されたい)。
剤で、基質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然細胞内
結合標的等々を含むもの、かかる薬剤を同定し調製する
方法、及び診断法、治療法及び製薬開発におけるその用
途を提供する。例えば、特異的結合薬剤は、様々な診断
及び治療用途、特に疾病又は疾病予後に例えばNF−κB
活性化のような主題タンパク質を含む経路の不適切な利
用に関与する場合に有用である。新規なIKK−β特異的
結合薬剤には、IKK−β特異的レセプター、例えば特異
的抗体のような体細胞性組換えポリペプチドレセプター
又はT細胞抗原レセプター(例えばHarlowとLane(198
8)Antibodies,A Laboratory Manual(抗体、実験室マ
ニュアル)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー)及び例えば一重、二重及び三重ハイブリッドス
クリーニングのようなアッセイで同定されるその他の天
然の結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリの
スクリーニングで同定される非天然細胞内結合薬剤等々
が包含される。特に興味深い薬剤はIKK−β機能、例え
ばIKK−β依存性転写活性化を変調する。例えばIKK−β
IκBキナーゼ活性の広範な阻害剤を、IκBを含むシ
グナル伝達を調節するために使用しても良い。IKK−β
IκBキナーゼ阻害剤の例には、セリン/スレオニンキ
ナーゼ(例えばPKC)阻害剤の既知のクラス、例えばATP
と基質結合の競合阻害剤、抗性物質、IKK−β誘導ペプ
チド阻害剤等々が含まれる。表2及び3を参照された
い。IKK−β特異性と活性は、プロテインキナーゼのパ
ネルを使用する高収量キナーゼアッセイにおいて即座に
定量される(引用文献と実施例を参照されたい)。
好適な阻害剤には、海生生物により生産されたスタウ
ロスポリン(Omura Sら,J Antibiot(Tokyo)1995 Jul;
48(7):535−48)のような天然化合物、及びEGFレセ
プタープロテインキナーゼをまた強力に阻害するPD1530
35のような合成化合物(Fry DWらScience 1994 Aug 19;
265(5157):1093−5)が含まれる。合成プロテインキ
ナーゼ阻害剤のチロホスチンファミリーのメンバーもま
た有用である;これらには純粋なATPコンピティターで
ある化合物、純粋な基質コンピティターである化合物、
及びATPと基質の両方と競合する混合コンピティターで
ある化合物が含まれる(Levitzki AとGazit A,Science
1995 Mar 24;267(5205):1782−8)。更なるIKK−β
阻害剤には、哺乳動物細胞により内在的に生産されるペ
プチド系基質コンピティター、例えばPKI(プロテイン
キナーゼ阻害剤,Seasholtz AFら,Proc Natl Acad Sci U
SA 1995 Feb 28;92(5):1734−8)、又はcdcキナー
ゼを阻害するタンパク質(Correa−Bordes J及びNurse
P,Cell 1995 Dec 15;83(6):1001−9)が含まれる。
更なる小ペプチドベース基質競合性キナーゼ阻害剤とア
ロステリック阻害剤(ATP又は基質競合と独立の抑制機
構)は確立された方法(Hvalby OらProc Natl Acad Sci
USA 1994 May 24;91(11):4761−5;Barja Pら,Cell I
mmunol 1994 Jan;153(1):28−38;Villar−Palasi C,
Biochim Biophys Acta 1994 Dec 30;1224(3):384−
8;Liu WZら,Biochemistry 1994 Aug 23;33(33):10120
−6)により直ぐに産生される。
ロスポリン(Omura Sら,J Antibiot(Tokyo)1995 Jul;
48(7):535−48)のような天然化合物、及びEGFレセ
プタープロテインキナーゼをまた強力に阻害するPD1530
35のような合成化合物(Fry DWらScience 1994 Aug 19;
265(5157):1093−5)が含まれる。合成プロテインキ
ナーゼ阻害剤のチロホスチンファミリーのメンバーもま
た有用である;これらには純粋なATPコンピティターで
ある化合物、純粋な基質コンピティターである化合物、
及びATPと基質の両方と競合する混合コンピティターで
ある化合物が含まれる(Levitzki AとGazit A,Science
1995 Mar 24;267(5205):1782−8)。更なるIKK−β
阻害剤には、哺乳動物細胞により内在的に生産されるペ
プチド系基質コンピティター、例えばPKI(プロテイン
キナーゼ阻害剤,Seasholtz AFら,Proc Natl Acad Sci U
SA 1995 Feb 28;92(5):1734−8)、又はcdcキナー
ゼを阻害するタンパク質(Correa−Bordes J及びNurse
P,Cell 1995 Dec 15;83(6):1001−9)が含まれる。
更なる小ペプチドベース基質競合性キナーゼ阻害剤とア
ロステリック阻害剤(ATP又は基質競合と独立の抑制機
構)は確立された方法(Hvalby OらProc Natl Acad Sci
USA 1994 May 24;91(11):4761−5;Barja Pら,Cell I
mmunol 1994 Jan;153(1):28−38;Villar−Palasi C,
Biochim Biophys Acta 1994 Dec 30;1224(3):384−
8;Liu WZら,Biochemistry 1994 Aug 23;33(33):10120
−6)により直ぐに産生される。
表2. 選択された小分子IKKキナーゼ阻害剤
HA−1001 Iso−H712 A−318
チェレリスレン2 PKC19−31 HA100419,20
スタウロスポリン3,4,5 H−713,3,14 K−252a16,5
カルホスチンC6,7,8,9 H−8915 KT582316
K−252b10 KT572016 ML−921
PKC19−3611 cAMP−depPKinhib17 KT592622
引用文献
1.Hagiwara,M.らMol.Pharmacol.32:7(1987)
2.Harbert,J.M.らBiochem Biophys Res Com 172:993(1
990) 3.Schachtele,C.らBiochem Biophys Res Com 151:5542
(1988) 4.Tamaoki,T.らBiochem Biophys Res Com 135:397(198
6) 5.Tischler,A.S.らJ.Neurochemistry 55:1159(1990) 6.Bruns,R.F.らBiochem Biophys Res Com 176:288(199
1) 7.Kobayashi,E.らBiochem Biophys Res Com 159:548(1
989) 8.Tamaoki,T.らAdv2nd Mass Phosphoprotein Res 24:49
7(1990) 9.Tamaoki,T.らBiotechnology 8:732(1990) 10.Yasuzawa,T.J.Antibiotics 39:1972(1986) 11.House,C.らScience 238:1726(1987) 12.Quick,J.らBiochem Biophys Res Com 167:657(199
2) 13.Bouli,N.M.とDavis,M.Brain Res.525:198(1990) 14.Takahashi,I.らJ.Pharmacol.Exp.Ther.255:1218(19
90) 15.Chijiwa,T.らJ.Biol.Chem.265:5267(1990) 16.Kase,H.らBiochem Biophys Res Com 142:436(198
7) 17.Cheng,H.C.らJ.Biol.Chem.261:989(1986) 18.Inagaki,M.らMol.Pharmacol.29:577(1986) 19.Asano,T.とHidaka,H.J Pharmaco.Exp Ther 231:141
(1984) 20.Hidaka,H.らBiochemistry 23:5036(1984) 21.Nagatsu,T.らBiochem Biophys Res Com 143:1045(1
987) 22.Nakanishi,S.らMol.Pharmacol.37:482(1990) 表3. 選択されたペプチジルIKK−βキナーゼ阻害剤 hIκBα,残基24−39,32Ala hIKK−β,Δ5−203 hIκBα,残基29−47,36Ala hIKK−β,Δ1−178 hIκBα,残基26−46,32/36Ala hIKK−β,Δ368−756 hIκBβ,残基25−38,32Ala hIKK−β,Δ460−748 hIκBβ,残基30−41,36Ala hIKK−α,Δ1−289 hIκBβ,残基26−46,32/36Ala hIKK−α,Δ12−219 hIκBε,残基24−40,32Ala hIKK−α,Δ307−745 hIκBε,残基31−50,36Ala hIKK−α,Δ319−644 hIκBε,残基27−44,32/36Ala 従って、本発明は、例えばセリン/スレオニンキナー
ゼ阻害剤に細胞を接触させることにより、IKK−βキナ
ーゼ活性を変調する工程を含む細胞中にIκBを含むシ
グナル伝達を変調する方法を提供する。細胞は培養中か
インサイツ、すなわち天然宿主内に常在していてもよ
い。好適な阻害剤は哺乳動物宿主において経口的に活性
である。診断用途に対しては、阻害剤又は他のIKK−β
結合剤は、例えば蛍光、放射性、化学発光、又は、結合
薬剤に直接抱合されるか結合薬剤に特異的なプローブに
抱合される他の容易に検出可能な分子でしばしば標識さ
れる。
990) 3.Schachtele,C.らBiochem Biophys Res Com 151:5542
(1988) 4.Tamaoki,T.らBiochem Biophys Res Com 135:397(198
6) 5.Tischler,A.S.らJ.Neurochemistry 55:1159(1990) 6.Bruns,R.F.らBiochem Biophys Res Com 176:288(199
1) 7.Kobayashi,E.らBiochem Biophys Res Com 159:548(1
989) 8.Tamaoki,T.らAdv2nd Mass Phosphoprotein Res 24:49
7(1990) 9.Tamaoki,T.らBiotechnology 8:732(1990) 10.Yasuzawa,T.J.Antibiotics 39:1972(1986) 11.House,C.らScience 238:1726(1987) 12.Quick,J.らBiochem Biophys Res Com 167:657(199
2) 13.Bouli,N.M.とDavis,M.Brain Res.525:198(1990) 14.Takahashi,I.らJ.Pharmacol.Exp.Ther.255:1218(19
90) 15.Chijiwa,T.らJ.Biol.Chem.265:5267(1990) 16.Kase,H.らBiochem Biophys Res Com 142:436(198
7) 17.Cheng,H.C.らJ.Biol.Chem.261:989(1986) 18.Inagaki,M.らMol.Pharmacol.29:577(1986) 19.Asano,T.とHidaka,H.J Pharmaco.Exp Ther 231:141
(1984) 20.Hidaka,H.らBiochemistry 23:5036(1984) 21.Nagatsu,T.らBiochem Biophys Res Com 143:1045(1
987) 22.Nakanishi,S.らMol.Pharmacol.37:482(1990) 表3. 選択されたペプチジルIKK−βキナーゼ阻害剤 hIκBα,残基24−39,32Ala hIKK−β,Δ5−203 hIκBα,残基29−47,36Ala hIKK−β,Δ1−178 hIκBα,残基26−46,32/36Ala hIKK−β,Δ368−756 hIκBβ,残基25−38,32Ala hIKK−β,Δ460−748 hIκBβ,残基30−41,36Ala hIKK−α,Δ1−289 hIκBβ,残基26−46,32/36Ala hIKK−α,Δ12−219 hIκBε,残基24−40,32Ala hIKK−α,Δ307−745 hIκBε,残基31−50,36Ala hIKK−α,Δ319−644 hIκBε,残基27−44,32/36Ala 従って、本発明は、例えばセリン/スレオニンキナー
ゼ阻害剤に細胞を接触させることにより、IKK−βキナ
ーゼ活性を変調する工程を含む細胞中にIκBを含むシ
グナル伝達を変調する方法を提供する。細胞は培養中か
インサイツ、すなわち天然宿主内に常在していてもよ
い。好適な阻害剤は哺乳動物宿主において経口的に活性
である。診断用途に対しては、阻害剤又は他のIKK−β
結合剤は、例えば蛍光、放射性、化学発光、又は、結合
薬剤に直接抱合されるか結合薬剤に特異的なプローブに
抱合される他の容易に検出可能な分子でしばしば標識さ
れる。
開示したIKK−βポリペプチドのアミノ酸配列は、選
択された発現系に対して最適化されたIKK−βポリペプ
チドコード核酸を逆翻訳するために使用されるか(Holl
erら(1993)Gene 136,323−328;Martinら(1995)Gene
154,150−166)、天然のIKK−βコード核酸配列の単離
に使用される変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプ
ローブを産生するために使用される(「GCG」ソフトウ
ェア、ジェネティクス・コンピュータ・グループ・イン
ク、マディソンWI)。IKK−βコード核酸配列は、IKK−
β発現ベクターに使用され、例えば発現及びスクリーニ
ングのために組換え宿主細胞に、例えばIKK−β変調細
胞機能に関与する疾患に対する候補薬の効能等の機能性
研究等々のための遺伝子組換え動物に導入される。
択された発現系に対して最適化されたIKK−βポリペプ
チドコード核酸を逆翻訳するために使用されるか(Holl
erら(1993)Gene 136,323−328;Martinら(1995)Gene
154,150−166)、天然のIKK−βコード核酸配列の単離
に使用される変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプ
ローブを産生するために使用される(「GCG」ソフトウ
ェア、ジェネティクス・コンピュータ・グループ・イン
ク、マディソンWI)。IKK−βコード核酸配列は、IKK−
β発現ベクターに使用され、例えば発現及びスクリーニ
ングのために組換え宿主細胞に、例えばIKK−β変調細
胞機能に関与する疾患に対する候補薬の効能等の機能性
研究等々のための遺伝子組換え動物に導入される。
本発明はまた、配列番号:1に含まれるIKK−βcDNA特
異的配列を有し、それとの特異的ハイブリダイゼーショ
ンを行う(すなわちIKK−αcDNA、配列番号:3の存在下
で配列番号:1と特異的にハイブリダイズする)のに充分
な核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製/増幅
プライマーを提供する。このようなプライマー又はプロ
ーブは、配列番号:1の少なくとも12、好ましくは少なく
とも24、より好ましくは少なくとも36、最も好ましくは
少なくとも96の塩基、特に配列番号:1のヌクレオチド1
−567及びヌクレオチド693−2268を含んでなる。特異的
ハイブリダイゼーションを実証するには一般にストリン
ジェントな条件、例えば42℃の温度で5xSSPE(0.18M Na
Cl、0.01M NaPO4、pH7.7、0.001M EDTA)中に30%のホ
ルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃
において0.2xSSPEで洗浄を行ったとき結合したまま残る
条件、好ましくは42℃の温度で5xSSPEバッファー中に50
%のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズ
し42℃において0.2xSSPEバッファーで洗浄を行ったとき
結合したまま残る条件が必要となる。IKK−β核酸はま
た例えばBLASTX(Altschulら(1990)Basic Local Alig
nment Search Tool,J Mol Biol 215,403−410)のよう
な整合化アルゴリズムを使用して区別することもでき
る。
異的配列を有し、それとの特異的ハイブリダイゼーショ
ンを行う(すなわちIKK−αcDNA、配列番号:3の存在下
で配列番号:1と特異的にハイブリダイズする)のに充分
な核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製/増幅
プライマーを提供する。このようなプライマー又はプロ
ーブは、配列番号:1の少なくとも12、好ましくは少なく
とも24、より好ましくは少なくとも36、最も好ましくは
少なくとも96の塩基、特に配列番号:1のヌクレオチド1
−567及びヌクレオチド693−2268を含んでなる。特異的
ハイブリダイゼーションを実証するには一般にストリン
ジェントな条件、例えば42℃の温度で5xSSPE(0.18M Na
Cl、0.01M NaPO4、pH7.7、0.001M EDTA)中に30%のホ
ルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃
において0.2xSSPEで洗浄を行ったとき結合したまま残る
条件、好ましくは42℃の温度で5xSSPEバッファー中に50
%のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズ
し42℃において0.2xSSPEバッファーで洗浄を行ったとき
結合したまま残る条件が必要となる。IKK−β核酸はま
た例えばBLASTX(Altschulら(1990)Basic Local Alig
nment Search Tool,J Mol Biol 215,403−410)のよう
な整合化アルゴリズムを使用して区別することもでき
る。
主題の核酸は、合成/非天然配列のものであり、及び
/又は単離される、すなわちその天然の状態で付随して
いる物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量
は、好ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少
なくとも約0.5%,より好ましくは少なくとも約5%を
構成し、通常は、天然染色体上に結合しているもの以外
のヌクレオチド(群)に結合した天然配列又は非天然配
列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番
号1の核酸配列又はそのフラグメントを含んでなる組換
え核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然染
色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置し
ている末端か、天然染色体上に結合しているもの以外の
配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある10kb、好ま
しくは2kbよりも小さい負のフランキング領域が隣に位
置している末端に含んでいる。核酸は通常はRNAもしく
はDNAであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を含
んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしばし
ば好適である。
/又は単離される、すなわちその天然の状態で付随して
いる物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量
は、好ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少
なくとも約0.5%,より好ましくは少なくとも約5%を
構成し、通常は、天然染色体上に結合しているもの以外
のヌクレオチド(群)に結合した天然配列又は非天然配
列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番
号1の核酸配列又はそのフラグメントを含んでなる組換
え核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然染
色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置し
ている末端か、天然染色体上に結合しているもの以外の
配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある10kb、好ま
しくは2kbよりも小さい負のフランキング領域が隣に位
置している末端に含んでいる。核酸は通常はRNAもしく
はDNAであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を含
んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしばし
ば好適である。
主題の核酸には、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼ
ーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸等々と
しての使用;IKK−β遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検
出し、更なるIKK−β相同体及び構造類似体をコードす
る核酸を検出又は増幅するための使用を含む広範な応用
範囲が見出される。診断法では、IKK−βハイブリダイ
ゼーションプローブが、臨床及び実験室試料中の野生型
及び変異体IKK−β対立遺伝子を同定する際に使用され
る。変異体対立遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立
遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブを産
生するために使用される。治療法では、治療用IKK−β
核酸が活性なIKK−βの細胞発現もしくは細胞内濃度又
は利用能を変調するために使用される。
ーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸等々と
しての使用;IKK−β遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検
出し、更なるIKK−β相同体及び構造類似体をコードす
る核酸を検出又は増幅するための使用を含む広範な応用
範囲が見出される。診断法では、IKK−βハイブリダイ
ゼーションプローブが、臨床及び実験室試料中の野生型
及び変異体IKK−β対立遺伝子を同定する際に使用され
る。変異体対立遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立
遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブを産
生するために使用される。治療法では、治療用IKK−β
核酸が活性なIKK−βの細胞発現もしくは細胞内濃度又
は利用能を変調するために使用される。
本発明はIKK−β変調性細胞機能のレベルで活性な薬
剤、化合物又は薬剤用のリード化合物を同定する効率的
な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング法
は、天然のIKK−β結合標的との相互作用を変調する化
合物、特にIκB誘導基質、特にIκB及びNIK基質と
のIKK−βリン酸化を変調する化合物に対するアッセイ
を含む。標識インビトロタンパク−タンパク結合アッセ
イ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ等々を含む結
合薬剤に対する広範なアッセイが提供される。該方法
は、リード化合物に対しての化学ライブラリの自動でコ
スト性能の良い高処理スクリーニングに受け入れられ
る。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業で
使用される;例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及び
インビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のた
めの活性を最適化し毒性を最小化することができる。
剤、化合物又は薬剤用のリード化合物を同定する効率的
な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング法
は、天然のIKK−β結合標的との相互作用を変調する化
合物、特にIκB誘導基質、特にIκB及びNIK基質と
のIKK−βリン酸化を変調する化合物に対するアッセイ
を含む。標識インビトロタンパク−タンパク結合アッセ
イ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ等々を含む結
合薬剤に対する広範なアッセイが提供される。該方法
は、リード化合物に対しての化学ライブラリの自動でコ
スト性能の良い高処理スクリーニングに受け入れられ
る。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業で
使用される;例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及び
インビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のた
めの活性を最適化し毒性を最小化することができる。
インビトロ結合アッセイでは、他のペプチド又はポリ
ペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ等との融合
産物の一部であってもよいIKK−βポリペプチドを含む
成分の混合物を使用する。アッセイ混合物は、天然の細
胞内IKK−β結合標的を含む。特定の実施態様では、結
合標的はIκBセリン32及び/又は36を含んでなる基質
である。このような基質は、セリン32及び/又は36残基
と、少なくとも5、好ましくは少なくとも10、より好ま
しくは少なくとも20の天然に生じる直ぐ隣りに位置する
残基(例えば、セリン36ペプチドに対して、IκBα、
βもしくはε由来基質に対してそれぞれ残基26−46、22
−42、又は12−32もしくは151−171の残基)を各側に含
むIκBα、βもしくはεペプチドを含んでなる。天然
の全長結合標的を使用することもできるが、その部分が
アッセイにおいて簡便に測定可能な主題IKK−βポリペ
プチドに対して結合親和性とアビディティをもたらす限
り、かかる部分(例えばペプチド)を使用することがし
ばしば好ましい。アッセイ混合物はまた候補薬理剤を含
有する。候補薬剤には、典型的には有機化合物である
が、数多くの化学クラスが包含され、好ましくは小さな
有機化合物が含まれ、合成又は天然化合物のライブラリ
を含む広範な供給源から得られる。様々な他の試薬もま
た混合物に含めても良い。これらには、(キナーゼアッ
セイに対する)ATP又はATP類似体、塩、バッファー、中
性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアー
ゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等々のような様
々なその他の試薬を含有する。
ペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ等との融合
産物の一部であってもよいIKK−βポリペプチドを含む
成分の混合物を使用する。アッセイ混合物は、天然の細
胞内IKK−β結合標的を含む。特定の実施態様では、結
合標的はIκBセリン32及び/又は36を含んでなる基質
である。このような基質は、セリン32及び/又は36残基
と、少なくとも5、好ましくは少なくとも10、より好ま
しくは少なくとも20の天然に生じる直ぐ隣りに位置する
残基(例えば、セリン36ペプチドに対して、IκBα、
βもしくはε由来基質に対してそれぞれ残基26−46、22
−42、又は12−32もしくは151−171の残基)を各側に含
むIκBα、βもしくはεペプチドを含んでなる。天然
の全長結合標的を使用することもできるが、その部分が
アッセイにおいて簡便に測定可能な主題IKK−βポリペ
プチドに対して結合親和性とアビディティをもたらす限
り、かかる部分(例えばペプチド)を使用することがし
ばしば好ましい。アッセイ混合物はまた候補薬理剤を含
有する。候補薬剤には、典型的には有機化合物である
が、数多くの化学クラスが包含され、好ましくは小さな
有機化合物が含まれ、合成又は天然化合物のライブラリ
を含む広範な供給源から得られる。様々な他の試薬もま
た混合物に含めても良い。これらには、(キナーゼアッ
セイに対する)ATP又はATP類似体、塩、バッファー、中
性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアー
ゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等々のような様
々なその他の試薬を含有する。
得られた混合物は、候補の薬理剤が存在しなかったら
IKK−βポリペプチドが細胞結合標的、部分又は類似体
に標準結合親和性をもって特異的に結合するような条件
下でインキュベートされる。混合物成分を、要求された
結合をもたらす任意の順序で添加することができ、最適
な結合を容易にする任意の温度でインキュベーションを
実施することができる。インキュベート期間は同様に最
適結合となるように選択されるが、迅速な高処理スクリ
ーニングを容易にするように最小化される。
IKK−βポリペプチドが細胞結合標的、部分又は類似体
に標準結合親和性をもって特異的に結合するような条件
下でインキュベートされる。混合物成分を、要求された
結合をもたらす任意の順序で添加することができ、最適
な結合を容易にする任意の温度でインキュベーションを
実施することができる。インキュベート期間は同様に最
適結合となるように選択されるが、迅速な高処理スクリ
ーニングを容易にするように最小化される。
インキュベート後、IKK−βポリペプチドと一又は複
数の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便な方法で
検出される。IKK−βキナーゼ活性に対しては、「結
合」はIKK−β基質のリン酸化の変化により一般に検出
される。この実施態様では、キナーゼ活性は標識リン酸
塩の基質への移動により定量することができ、ここで、
標識は、放射能、発光、光学もしくは電子密度等々のよ
うな直接的検出をもたらすものでも、あるいはエピトー
プタグ等々のような間接的検出をもたらすものでもよ
い。標識と他のアッセイ成分、例えば光学又は電子密
度、放射線、非放射性エネルギー移動等々の性質に応じ
て、様々な方法を使用して標識を検出することができ、
あるいは抗体抱合体等々で間接的に検出される。
数の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便な方法で
検出される。IKK−βキナーゼ活性に対しては、「結
合」はIKK−β基質のリン酸化の変化により一般に検出
される。この実施態様では、キナーゼ活性は標識リン酸
塩の基質への移動により定量することができ、ここで、
標識は、放射能、発光、光学もしくは電子密度等々のよ
うな直接的検出をもたらすものでも、あるいはエピトー
プタグ等々のような間接的検出をもたらすものでもよ
い。標識と他のアッセイ成分、例えば光学又は電子密
度、放射線、非放射性エネルギー移動等々の性質に応じ
て、様々な方法を使用して標識を検出することができ、
あるいは抗体抱合体等々で間接的に検出される。
薬剤の存在下での結合アフィニティーと比較して薬剤
の非存在下における標的に対するIKK−βポリペプチド
の結合アフィニティーの差は、薬剤がIKK−β結合標的
に対するIKK−βポリペプチドの結合を変調することを
示している。同様に、以下に記載される細胞ベースアッ
セイにおいても、薬剤の存在及び不存在下におけるIKK
−β依存性転写活性化の差は、薬剤がIKK−β機能を変
調することを示している。本明細書において使用される
差は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも50
%、より好ましくは少なくとも90%の差を表す。
の非存在下における標的に対するIKK−βポリペプチド
の結合アフィニティーの差は、薬剤がIKK−β結合標的
に対するIKK−βポリペプチドの結合を変調することを
示している。同様に、以下に記載される細胞ベースアッ
セイにおいても、薬剤の存在及び不存在下におけるIKK
−β依存性転写活性化の差は、薬剤がIKK−β機能を変
調することを示している。本明細書において使用される
差は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも50
%、より好ましくは少なくとも90%の差を表す。
次の実験部分と実施例は例証のために提供するもので
限定をなすものではない。
限定をなすものではない。
実験
IKK−βの同定
NIK媒介NF−κB活性化のメカニズムを調べるため
に、我々は、最初に、酵母二重ハイブリッドタンパク質
相互作用クローニングによりNIKに直接結合するタンパ
ク質を同定した(FieldとSong,1989)。酵母転写因子GA
L4のDNA結合ドメインに融合したNIKをコードする発現ベ
クターを産生した。このベクターはヒトB細胞cDNAライ
ブラリの二重ハイブリッドスクリーニングにおいて餌と
して使用した。およそ600万の形質転換体から、his及び
lacZレポーター遺伝子の活性化により測定して8つの陽
性のクローンを得た。これらのクローンから、3つがTR
AFファミリーのメンバーであるTRAF3をコード化し(Hu
ら,1994;Chengら,1995;Mosialosら,1995;Satoら,199
5)、一つがIKK−αと我々が呼ぶ新規なタンパク質をコ
ード化した。酵母細胞への再形質転換によりNIKとIKK−
αの間の相互作用が証明された。全長ヒトIKK−αクロ
ーンは、IKK−αの二重ハイブリッドクローンの5'末端
から産生したプローブでジャーカットcDNAライブラリを
スクリーニングすることにより単離した。IKK−αは、
N末端セリン−スレオニンキナーゼ触媒作用ドメイン、
C末端ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン及びヘ
リックス・ループ・ヘリックスとキナーゼドメインの間
に並列したロイシンジッパー様両親媒性βヘリックスを
含む。
に、我々は、最初に、酵母二重ハイブリッドタンパク質
相互作用クローニングによりNIKに直接結合するタンパ
ク質を同定した(FieldとSong,1989)。酵母転写因子GA
L4のDNA結合ドメインに融合したNIKをコードする発現ベ
クターを産生した。このベクターはヒトB細胞cDNAライ
ブラリの二重ハイブリッドスクリーニングにおいて餌と
して使用した。およそ600万の形質転換体から、his及び
lacZレポーター遺伝子の活性化により測定して8つの陽
性のクローンを得た。これらのクローンから、3つがTR
AFファミリーのメンバーであるTRAF3をコード化し(Hu
ら,1994;Chengら,1995;Mosialosら,1995;Satoら,199
5)、一つがIKK−αと我々が呼ぶ新規なタンパク質をコ
ード化した。酵母細胞への再形質転換によりNIKとIKK−
αの間の相互作用が証明された。全長ヒトIKK−αクロ
ーンは、IKK−αの二重ハイブリッドクローンの5'末端
から産生したプローブでジャーカットcDNAライブラリを
スクリーニングすることにより単離した。IKK−αは、
N末端セリン−スレオニンキナーゼ触媒作用ドメイン、
C末端ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン及びヘ
リックス・ループ・ヘリックスとキナーゼドメインの間
に並列したロイシンジッパー様両親媒性βヘリックスを
含む。
潜在的なIKK−α関連遺伝子を同定するために、我々
はヒト発現配列タグ(EST)の公のデータベースを検索
した。我々は二つのEST(W68756及びAA128064)を同定
したが、これらはIKK−αと配列類似性を持つ異なるペ
プチドをコード化しうることを決定した。IKK−α関連c
DNAは、ジャーカットcDNAライブラリ(ヒトT細胞)
を、ESTの一つからの配列に対応するオリゴヌクレオチ
ドプローブで探索することによりクローン化された。配
列解析により、2つのESTが同じ遺伝子の異なったフラ
グメントを含んでいたことが証明された。得られた最も
長いcDNAクローンは〜3.2kbの挿入断片(配列番号:1)
と756アミノ酸のオープンリーディングフレーム(配列
番号:2)を有していた。我々は、このcDNAによりコード
化されるタンパク質をIKK−βとして設計した。
はヒト発現配列タグ(EST)の公のデータベースを検索
した。我々は二つのEST(W68756及びAA128064)を同定
したが、これらはIKK−αと配列類似性を持つ異なるペ
プチドをコード化しうることを決定した。IKK−α関連c
DNAは、ジャーカットcDNAライブラリ(ヒトT細胞)
を、ESTの一つからの配列に対応するオリゴヌクレオチ
ドプローブで探索することによりクローン化された。配
列解析により、2つのESTが同じ遺伝子の異なったフラ
グメントを含んでいたことが証明された。得られた最も
長いcDNAクローンは〜3.2kbの挿入断片(配列番号:1)
と756アミノ酸のオープンリーディングフレーム(配列
番号:2)を有していた。我々は、このcDNAによりコード
化されるタンパク質をIKK−βとして設計した。
ヒト細胞におけるIKK−βとNIKの相互作用
IKK−βのNIKとの相互作用は、哺乳動物細胞免疫共沈
降アッセイにおいて確認された。C末端フラッグエピト
ープタグを含むヒトIKK−βをMycエピトープタグNIKで
の293ヒト胚性腎臓細胞において一過性に同時発現させ
た。細胞溶解物をフラッグエピトープに対するモノクロ
ーナル抗体を使用して免疫沈降させ、共沈するNIKを抗M
yc抗体での免疫ブロット分析により検出した。このアッ
セイにおいて、IKK−βはNIKを共沈させることができ、
酵母二重ハイブリッド分析によるIKK−βについて検出
した両タンパク質間の相互作用を確認する。また、殆ど
のN末端キナーゼドメイン(IKK−β
(Δ5−203、すなわち1−4及び204−756))を欠く
欠失変異体IKK−βタンパク質はNIKと結合することがで
き、IKK−βのαヘリックスC末端の半分がNIKとの相互
作用を媒介することを示している。
降アッセイにおいて確認された。C末端フラッグエピト
ープタグを含むヒトIKK−βをMycエピトープタグNIKで
の293ヒト胚性腎臓細胞において一過性に同時発現させ
た。細胞溶解物をフラッグエピトープに対するモノクロ
ーナル抗体を使用して免疫沈降させ、共沈するNIKを抗M
yc抗体での免疫ブロット分析により検出した。このアッ
セイにおいて、IKK−βはNIKを共沈させることができ、
酵母二重ハイブリッド分析によるIKK−βについて検出
した両タンパク質間の相互作用を確認する。また、殆ど
のN末端キナーゼドメイン(IKK−β
(Δ5−203、すなわち1−4及び204−756))を欠く
欠失変異体IKK−βタンパク質はNIKと結合することがで
き、IKK−βのαヘリックスC末端の半分がNIKとの相互
作用を媒介することを示している。
NF−κB活性化に対するIKK−β及びIKK−β変異体の影
響 NF−κB活性化におけるIKK−βの可能な役割を調べ
るために、我々は、IKK−βの一過性過剰発現がNF−κ
B依存性レポーター遺伝子を活性化させるかどうかを調
べた。E−セレクチン−ルシフェラーゼレポーター作成
物(SchindlerとBaichwal,1994)及びIKK−β発現ベク
ターをHeLa細胞中に同時形質移入した。IKK−β発現は
レポーター遺伝子を用量依存的に活性化させ、ルシフェ
ラーゼ活性の最大の誘導はベクター対照と比較して約20
倍であった。同様な結果は293細胞において得られ、そ
こではIKK−βの過剰発現がおよそ20倍のレポーター遺
伝子活性を誘導した。従って、IKK−βは過剰発現した
ときNF−κBの活性化を誘発する。
響 NF−κB活性化におけるIKK−βの可能な役割を調べ
るために、我々は、IKK−βの一過性過剰発現がNF−κ
B依存性レポーター遺伝子を活性化させるかどうかを調
べた。E−セレクチン−ルシフェラーゼレポーター作成
物(SchindlerとBaichwal,1994)及びIKK−β発現ベク
ターをHeLa細胞中に同時形質移入した。IKK−β発現は
レポーター遺伝子を用量依存的に活性化させ、ルシフェ
ラーゼ活性の最大の誘導はベクター対照と比較して約20
倍であった。同様な結果は293細胞において得られ、そ
こではIKK−βの過剰発現がおよそ20倍のレポーター遺
伝子活性を誘導した。従って、IKK−βは過剰発現した
ときNF−κBの活性化を誘発する。
我々は次に293細胞中のレポーター遺伝子アッセイに
おけるシグナル誘導NF−κB活性化の際にNIKになお随
伴するキナーゼ不活性IKK−β(Δ5−203)の過剰発現
の影響を決定した。IKK−β(Δ5−203)の過剰発現は
NIK(624-947)の過剰発現と同様なTNF−及びIL−1−誘
導レポーター遺伝子活性化を阻止した。IKK−β
(Δ5−203)はTRAF2、TRAF6及びNIKの過剰発現により
誘発されるNF−κB依存性レポーター遺伝子活性を阻害
したことがまた見出された。これらの結果を併せると、
触媒的に不活性なIKK−β突然変異体はTNF−、IL−1、
TRAF−及びNIK−誘発NF−κB活性化のドミナントネガ
ティブな阻害剤である。これは、IKK−βがNIKの下流の
TNF及びIL−1によるNF−κB活性化の共通のメディエ
ータとして機能することを示している。
おけるシグナル誘導NF−κB活性化の際にNIKになお随
伴するキナーゼ不活性IKK−β(Δ5−203)の過剰発現
の影響を決定した。IKK−β(Δ5−203)の過剰発現は
NIK(624-947)の過剰発現と同様なTNF−及びIL−1−誘
導レポーター遺伝子活性化を阻止した。IKK−β
(Δ5−203)はTRAF2、TRAF6及びNIKの過剰発現により
誘発されるNF−κB依存性レポーター遺伝子活性を阻害
したことがまた見出された。これらの結果を併せると、
触媒的に不活性なIKK−β突然変異体はTNF−、IL−1、
TRAF−及びNIK−誘発NF−κB活性化のドミナントネガ
ティブな阻害剤である。これは、IKK−βがNIKの下流の
TNF及びIL−1によるNF−κB活性化の共通のメディエ
ータとして機能することを示している。
括弧内の文献
Ansieau,S.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,1405
3−14058。
3−14058。
Baeuerle,P.A.とHenkel,T(1994)Annu.Rev.Immunol.1
2,141−179。
2,141−179。
Beg,A.A.ら(1993)Mol.Cell.Biol.13,3301−3310。
Cao,Z.,Henzel,W.J.,及びGao,X.(1996a)Science 271,
1128−1131。
1128−1131。
Cao,Z.ら(1996b)Nature 383,443−446。
Chen,Z.ら(1995)Genes Dev.9,1586−1597。
Cheng,G.ら(1995)Science 267,1494−1498。
Connelly,M.A.とMarcu,K.B.(1995)Cell.Mol.Biol.Re
s.41,537−549。
s.41,537−549。
Dinarello,C.A.(1996)Biologic basis for interleuk
in−1 in disease.Blood 87,2095−2147。
in−1 in disease.Blood 87,2095−2147。
Fields,S.とSong,O.−k.(1989)Nature 340,245−24
6。
6。
Finco,T.S.とBaldwin,A.S.(1995)Immunity 3,263−27
2。
2。
Gedrich,R.W.ら(1996)J.Biol.Chem.271,12852−1285
8。
8。
Hill,C.S.とTreisman,R.(1995)Cell 80,199−211。
Hsu,H.,Shu,H.−B.,Pan,M.−P.,及びGoeddel,D.V.(199
6)Cell 84,299−308。
6)Cell 84,299−308。
Hu,H.M.ら(1994)J.Biol.Chem.269,30069−30072。
Lee,S.Y.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,9699−
9703。
9703。
Lenardo,M.とBaltimore,D.(1989)Cell 58,277−229。
Malinin,N.L.ら(1997)Nature 385,540−544。
Mockら(1995)Genomics 27,348−351。
Mosialos.G.ら(1995)Cell 80,389−399。
Nakano,H.ら(1996)J.Biol.Chem.271,14661−14664。
Osborn,L.,Kunkel,S.,及びNabel,G.J.(1989)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86,2336−2340。
l.Acad.Sci.USA 86,2336−2340。
Rothe,M.,Sarma,V.,Dixit,V.M.,及びGoeddel,D.V.(199
5)Science 269,1424−1427。
5)Science 269,1424−1427。
Rothe,M.,Wong,S.C.,Henzel,W.J.,及びGoeddel,D.V.(1
994)Cell 78,681−692。
994)Cell 78,681−692。
Sato,T.,Irie,S.,及びReed,J.C.(1995)FEBS Lett.35
8,113−118。
8,113−118。
Schindler,U.,とBaichwal,V.R.(1994)Mol.Cell.Biol.
14,5820−5831。
14,5820−5831。
Smith,C.A.,Farrah,T.,及びGoodwin,R.G.(1994)Cell
76,959−962。
76,959−962。
Song,H.Y.とDonner,D.B.(1995)Biochem.J.809,825−8
29。
29。
Thanos,D.,とManiatis,T.(1995)Cell 80,529−532。
Verma,I.M.ら(1995)Genes Dev.9,2723−2735。
実施例
1. IKK−β−IκBαリン酸化アッセイに対するプロ
トコール A. 試薬: −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
トコール A. 試薬: −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−キナーゼ:PBSに20μg/mlで入れた10-8−10-5MのIKK−
β(配列番号:2)。
β(配列番号:2)。
−基質:PBSに40μg/mlで入れた10-7−10-4Mのビオチン
化基質(ヒトIκBβの残基26−46からなる21残基ペプ
チド)。
化基質(ヒトIκBβの残基26−46からなる21残基ペプ
チド)。
−阻害バッファー:PBS中に5%BSA、0.5%トウィーン2
0;室温で1時間。
0;室温で1時間。
−アッセイバッファー:100mMのKCl、10mMのMgCl2、1mM
のMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、1%の
グリセロール、0.5%のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBS
A、プロテアーゼ阻害剤カクテル。
のMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、1%の
グリセロール、0.5%のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBS
A、プロテアーゼ阻害剤カクテル。
−[32P]γ−ATPの10x保存液:100μCi[32P]γ−ATP
を伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、4
℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
を伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、4
℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル(1000X):10mlのPBS中
に10mgのトリプシン阻害剤(BMB#109894)、10mgのア
プロチニン(BMB#236624)、25mgのベンズアミジン
(シグマ#B−6506)、25mgのロイペプチン(BMB#101
7128)、10mgのAPMSF(BMB#917575)、及び2mMのNaVo3
(シグマ#S−6508)。
に10mgのトリプシン阻害剤(BMB#109894)、10mgのア
プロチニン(BMB#236624)、25mgのベンズアミジン
(シグマ#B−6506)、25mgのロイペプチン(BMB#101
7128)、10mgのAPMSF(BMB#917575)、及び2mMのNaVo3
(シグマ#S−6508)。
B. アッセイプレートの調製:
−4℃で一晩かけてウェル当り120μlの保存Nアビジ
ンでコーティング。
ンでコーティング。
−200μlのPBSで2回洗浄。
−150μlの阻害バッファーで阻害。
−200μlのPBSで2回洗浄。
C. アッセイ:
−40μlのアッセイバッファー/ウェルを添加。
−40μlのビオチン化基質(アッセイバッファー中に2
−200pmol/40ul)を添加。
−200pmol/40ul)を添加。
−40μlのキナーゼ(アッセイバッファー中に0.1−10p
mol/40ul)を添加。
mol/40ul)を添加。
−10μlの化合物又は抽出物を添加。
−10μlの[32P]γ−ATPの10x保存液を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−200μlのPBSで4回洗浄することにより反応を停止。
−150μlのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D. (各プレート上にある)全アッセイ用の対照:
a.非特異的結合
b.80%阻害の非放射性ATP。
2. 高収量IKK−β−NIK結合アッセイに対するプロトコ
ール A. 試薬: −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
ール A. 試薬: −ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−阻害バッファー:PBS中に5%のBSA、0.5%のトウィー
ン20;室温で1時間。
ン20;室温で1時間。
−アッセイバッファー:100mMのKCl、20mMのHEPES、pH7.
6、1mMのMgCl2、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、
50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロ
テアーゼ阻害剤カクテル。
6、1mMのMgCl2、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、
50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロ
テアーゼ阻害剤カクテル。
−32P IKK−βポリペプチドの10xストック:200,000−25
0,000cpmの標識IKK−β(ベックマンカウンター)が補
填された10-8−10-6Mの「非放射性」IKK−β。スクリー
ニングの間、4℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
0,000cpmの標識IKK−β(ベックマンカウンター)が補
填された10-8−10-6Mの「非放射性」IKK−β。スクリー
ニングの間、4℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル(1000X):10mlのPBS中
に10mgのトリプシン阻害剤(BMB#109894)、10mgのア
プロチニン(BMB#236624)、25mgのベンズアミジン
(シグマ#B−6506)、25mgのロイペプチン(BMB#101
7128)、10mgのAPMSF(BMB#917575)、及び2mMのNaVo3
(シグマ#S−6508)。
に10mgのトリプシン阻害剤(BMB#109894)、10mgのア
プロチニン(BMB#236624)、25mgのベンズアミジン
(シグマ#B−6506)、25mgのロイペプチン(BMB#101
7128)、10mgのAPMSF(BMB#917575)、及び2mMのNaVo3
(シグマ#S−6508)。
−NIK:PBS中の10-7−10-5Mのビオチン化NIK
B. アッセイプレートの調製:
−4℃で一晩かけてウェル当り120μlの保存N−アビ
ジンでコーティング。
ジンでコーティング。
−200μlのPBSで2回洗浄。
−150μlの阻害バッファーで阻害。
−200μlのPBSで2回洗浄。
C. アッセイ:
−40μlのアッセイバッファー/ウェルを添加。
−10μlの化合物又は抽出物を添加。
−10μlの33P−IKK−β(20−25,000cpm/0.1−10pmol/
ウェル=10-9−10-7M最終濃度)を添加。
ウェル=10-9−10-7M最終濃度)を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−40μMのビオチン化NIK(アッセイバッファー中に0.1
−10pmol/40ul)を添加。
−10pmol/40ul)を添加。
−室温で1時間インキュベート。
−200μMのPBSで4回洗浄することにより反応を停止。
−150μMのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D. (各プレート上にある)全アッセイ用の対照:
a.非特異的結合
b.80%阻害の可溶性(非ビオチン化NIK)。
本明細書中において引用した刊行物と特許出願の全て
を、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典
明示により特に個々に取り込まれることが示されている
ように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を
理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳
細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請
求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と
修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かる
であろう。
を、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典
明示により特に個々に取り込まれることが示されている
ように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を
理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳
細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請
求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と
修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かる
であろう。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:Goeddel,David V.
Woronicz,John
(ii)発明の名称:IKK−βタンパク質、核酸及び方法
(iii)配列の数:4
(iv)通信宛先:
(A)宛先:SCIENCE & TECHNOLOGY LAW GROUP
(B)通り:268 BUSH STREET,SUITE 3200
(C)都市:SAN FRANCISCO
(D)州:CALIFORNIA
(E)国:米国
(F)ジップ:94104
(v)コンピューター読取可能形態:
(A)媒体の型:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PCコンパチブル
(C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0,Vers
ion #1.30 (vi)本出願のデータ: (A)出願番号: (B)出願日: (C)分類: (viii)代理人情報 (A)氏名:OSMAN,RICHARD A (B)登録番号:36,627 (C)参照/書類番号:T97−006−1 (ix)遠距離通信情報: (A)電話:(415)343−4341 (B)テレファックス:(415)343−4342 (2)配列番号:1 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:2268塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:cDNA (xi)配列: (2)配列番号:2 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:756アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:ペプチド (xi)配列: (2)配列番号:3 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:2238塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:cDNA (xi)配列: (2)配列番号:4 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:745アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:ペプチド (xi)配列:
ion #1.30 (vi)本出願のデータ: (A)出願番号: (B)出願日: (C)分類: (viii)代理人情報 (A)氏名:OSMAN,RICHARD A (B)登録番号:36,627 (C)参照/書類番号:T97−006−1 (ix)遠距離通信情報: (A)電話:(415)343−4341 (B)テレファックス:(415)343−4342 (2)配列番号:1 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:2268塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:cDNA (xi)配列: (2)配列番号:2 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:756アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:ペプチド (xi)配列: (2)配列番号:3 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:2238塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:cDNA (xi)配列: (2)配列番号:4 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:745アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:ペプチド (xi)配列:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
C12Q 1/02 G01N 33/53 D
1/48 C12N 15/00 ZNAA
G01N 33/53 5/00 A
(72)発明者 ウォロニッツ,ジョン
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94080,サウス サンフランシスコ,コ
ーポレイト ドライブ 2,トゥラリッ
ク インコーポレイテッド内
(56)参考文献 Cellular and Mole
cular Biology Rese
arch,1995,Vol.41,No.
6,p.537−549
The EMBO Journal,
1995,Vol.14,No.12,p.2876
−2883
Molecular and Cel
lular Biology,1996,V
ol.16,No.4,p.1295−1304
Cell,1997,Vol.88,p.
213−222
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/12
C12N 15/54
C12N 9/12
C12Q 1/02
C12Q 1/48
BIOSIS/WPI(DIALOG)
PubMed
SwissProt/PIR/GeneS
eq
GenBank/EMBL/DDBJ/G
eneSeq
Claims (6)
- 【請求項1】配列番号:2で表されるアミノ酸配列を有す
る単離IKK−βポリペプチド。 - 【請求項2】配列番号:1で表されるヌクレオチド配列を
有する単離された又は組換え核酸。 - 【請求項3】請求項1に記載のポリペプチドをコードす
る組換え核酸。 - 【請求項4】請求項3に記載の核酸を含んでなる細胞。
- 【請求項5】請求項1に記載のIKK−βポリペプチドの
調製方法において、請求項3に記載の核酸を宿主細胞又
は細胞抽出物中に導入し、上記核酸が転写物として発現
し、該転写物が上記ポリペプチドを含んでなる翻訳産物
として発現される条件下で上記宿主細胞又は抽出物をイ
ンキュベートし、上記翻訳産物を単離する工程を含んで
なる方法。 - 【請求項6】IKK−βポリペプチドの結合標的に対する
相互作用を変調する薬剤のスクリーニング方法におい
て、 請求項1に記載のIKK−βポリペプチド、前記ポリペプ
チドの結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤
が存在しない場合に上記ポリペプチドが基準親和性をも
って上記結合標的に特異的に結合する条件下でインキュ
ベートし、 上記結合標的に対する上記ポリペプチドの結合親和性を
検出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、 薬剤偏向親和性と基準親和性の間の差が、上記結合標的
に対する上記ポリペプチドの結合を上記薬剤が変調する
ことを示す方法。
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US20030044852A1 (en) * | 2000-08-10 | 2003-03-06 | Joslin Diabetes Center, Inc., A Massachusetts Corporation | Methods for treatment of insulin resistance |
US6869956B2 (en) * | 2000-10-03 | 2005-03-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating inflammatory and immune diseases using inhibitors of IκB kinase (IKK) |
CZ20032287A3 (cs) * | 2001-02-01 | 2004-02-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Způsoby léčení zánětlivých a imunitních nemocí za použití inhibitorů IkB kinázy (IKK) |
DE10115073A1 (de) * | 2001-03-27 | 2002-10-10 | Procorde Gmbh | Verwendung von Inhibitoren von IKK-ß und Verfahren zum Auffinden solcher Inhibitoren |
US6794158B2 (en) * | 2001-04-09 | 2004-09-21 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Fluorescence polarization assay |
WO2003041640A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-22 | The General Hospital Corporation | METHODS FOR TREATING ISCHEMIC REPERFUSION INJURY USING IkB KINASE-BETA INHIBITORS |
WO2003049742A1 (en) * | 2001-12-11 | 2003-06-19 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Method for administering birb 796 bs |
ATE386030T1 (de) * | 2002-02-25 | 2008-03-15 | Boehringer Ingelheim Pharma | 1,4-disubstituierte benzokondensierte cycloalkyl- harnstoffverbindungen zur behandlung von zytokinvermittelten erkrankungen |
US8053243B2 (en) * | 2004-04-12 | 2011-11-08 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Detection of nitrosylated proteins |
WO2007106884A2 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Theralogics, Inc. | Methods of treating muscular wasting diseases using nf-kb activation inhibitors |
US7888498B2 (en) * | 2006-05-22 | 2011-02-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of IKK-B gene |
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US10799514B2 (en) | 2015-06-29 | 2020-10-13 | Reveragen Biopharma, Inc. | Non-hormonal steroid modulators of NF-kappa beta for treatment of disease |
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---|---|---|---|---|
AU726383B2 (en) * | 1996-08-26 | 2000-11-02 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Stimulus-inducible I (KAPPA)B kinase (IKK) signalsome |
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Cellular and Molecular Biology Research,1995,Vol.41,No.6,p.537−549 |
Molecular and Cellular Biology,1996,Vol.16,No.4,p.1295−1304 |
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