CZ20032287A3

CZ20032287A3 - Způsoby léčení zánětlivých a imunitních nemocí za použití inhibitorů IkB kinázy (IKK)

Info

Publication number: CZ20032287A3
Application number: CZ20032287A
Authority: CZ
Inventors: James R. Burke; Steven Nadler; Yuping Qiu; Robert M. Townsend; Fred Christopher Zusi
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2004-02-18
Also published as: EP1363993A4; AU2002247059B2; PL364111A1; JP2004529088A; WO2002060386A2; MXPA03006817A; NO20033429L; NO20033429D0; EP1363993A2; HUP0304045A2; CA2436770A1; WO2002060386A3; HUP0304045A3

Description

Způsoby léčení zánětlivých a imunitních nemocí za použití inhibitorů IkB kinázy (IKK 5

Ob 1 asi. techniky

Vynález se týká způsobů použití inhibitorů IkB kinázy (IKK) k léčení zánětlivých a imunitních nemocí, inhibitorů IKK a farmaceutických prostředků obsahujících takové inhibitory, spolu s farmaceuticky nebo fyziologicky přijatelným nosičem nebo excipientem.

Dosavadní stav techniky

Faktor tumorové nekrézy (TNF-«5 je mocný cytokin mající prozánětlivé vlastnosti, který, pokud jsou stimulovány, uvolňují četné buněčné typy. Studie ukázaly závislost mezi zvýšenýmihladinami TNF-α a řadou nemocí, jako jsou septický šok, liematopoiesis, nádory a zánětllvé nemoci centrálního nervového systému, jako jsou HIV, encephalitida, mozková malarie a meningnitida. Je již známo, že meurodenerativní nemoci, jako jsou Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc a Creusfeld-Jacobova nemoc, souvisejí také se zvýšenými hladinami TNF~<x (například ftrvin a kol., The Role of Inflammation and Cytokines in Brain Injury” Neuroscience and Biobehavioral Reviews, sv. 20, č. 3 str. 445 až 452, 19965. Proto se zkoumaly a vyvinuly různé třídy sloučenin k inhibici produkce TNF-α jak se zřetelem jak na transkripci tak translaci, jako jsou například kortlkosteroidy, rolipram (inhibitor fosfodiesterázy IV, potlačující syntesu TNF-α mRNA5, calphostin a cytokin imidazolového typu potlačující protizánět1ivé drogy (CSAID5 (například Dinarello “Role of Pro- and Anti-inflammatory Cytokines During Inflammation: Experimenta1 and Clinical Findings, Review, sv. 0393-974X str. 91 až 103, 19975.

V poslední době se pozornost soustřeďuje na úlohu nukleo2 • · · · • · vého faktoru-kB (NFkB) v aktivační cestě, která vede k produkci TNF-α a jiných zánětlivých cytokinů a genových typů. Vedle TNF-α, HF-kB modulují mnohé geny podílející se na imunitní funkci a zánětu, včetně interleukinu (IL)-2, IL-6, IL-8, IL-2Ra, GM-CSF. mezibuněčné adhezní molekuly (ICAM-1) a cévní buněčné adhezní molekuly-1 (VCAM-1). Inhibice NF-kB a/nebo jeho aktivační cesty poskytuje prostředek k léčení širokého oboru nemocí, včetně nemocí autoimunních, Alzeheimerovy nemoci, aterosklerózy a onkogeneze (například Baldwin, The NFkB a IkB Proteins: New Discoveries and Insights, Annual Rev. Immunol-, sv. 14, str. 649-81, 1996): Christman a kol., Irapact of Basic Research on Tomorow s Medicine, The Role of Nuclear Factor-kB in Pulmonary Diseases, Chest, sv. 117, str. 1482-1487, 2000).

NF-kB je transkripční aktivátor, který má ústřední úlohu v regulaci transkripce řady genii, včetně genů, které kódují proteiny podílející se na zánětlivých a imunitních odezvách. Reprezetativními příklady genfl řízených NF-kB jsou cytokinový faktor tumorové nekrózy (TNF-a), IL-Ιβ, IL-6 a IL-8; adhezní molekuly E-selektinu a cévní buněčné adhezní molekuly-1 (vascular cell adhesion molecule (VCAM-1)); a enzym syntázy oxidu dusnatého (NO) (Siebenlist a kol., Annu. Rev.Cell. Biol- 10, str. 405 až 455, 1994; Bauerle a Baltimore, Cell 87, str. 13 až 20, 1997). Ukázalo se také, že NF-kB je indukovatelný různými stimuly vedle medlátoríl imunitní funkce, jako je UV-záření, růstové faktory a virová infekce.

Transkripční faktor NF-kB sídlí normálně v cytoplasmě v nestimulovaných buňkách jako inaktivní komplex se členem inhibitoru kB (IkB) rodiny inhibičních proteinů. Třída IkB proteinů zahrnuje IkB-a, IkB-β a IkB-E, z nichž každý obsahuje ankyrinové opakování pro vytváření komplexu s NF-kB (Vhitesíde a kol., EMBO J. 16, str. 1413 až 1426, 1997), V případě IkB-a, nejpečlivěji studovaným členem této třídy, je výsledkem stimulace buněk činidly, která aktivují na NF-kB závislou genovou transkripci, fosforylace IkB-α na serinu-32 a serinu-36 (Brovn a kol.. Science 267, str. 1485 až 1488, 1995).

bo IkB kinázu β. ΙΚΚβ) le uvolněn do buněk a

Zjistilo se, že potenciální inhibitory NF-kB a/nebo cesty NF-kB zahrnují interleukin-10, glukokortikoidy, salicyláty, oxid dusnatý a ostatní činidla potlačující imunitu. IkB je cytoplasmický protein, který řídí aktivitu NF-kB zadržováním NF-kB v cytoplasmě. IkB je fosforylován kinázou IkB (IKK), která má dvě isoformy, IKK-1 (nebo IkB kinázu a, IKK-a) a IKK-2 CnePo fosforyláci IkB IKK, je NF-kB rychpřemístí se do jádra, kde se váže na promotory mnoha genů a přeregulovává transkripci pro-zánětlivých genů. Inhibitory IKK mohou blokovat fosforyláci IkB a dalších postupných efektů, zvláště efektů, které souvisejí s NF-kB transkripčními faktory. Je známo, že glukokortikoidy inhibují aktivitu NF-kB dvěma mechanismy: přeregulováním hladin proteinu IkB a inhibici podjednotek NF-kB. Je známo, že oxid dusnatý inhibuje NF-kB přeregulací IkB. Tyto interakční mechanismy jsou však složité, například produkce oxidu dusnatého v lymfocytech zvyšuje aktivitu NF-kB.

Fosforylace IkB-α je kritická pro svoji následnou všudypřítonnost a proteolýzu, při kterých NF-kB se uvolňuje ze svého komplexu s IkB. NF-kB pak může být přemístěn do jádra a nakonec aktivovat transkripci genu (Finco a kol., Proč. Nati. Acad. Sel. USA 91, str. 11884 až 11888, 1994: Baldi a kol., J. Biol. Chem. 271, str. 376 až 379, 1996: Roff a kol., J- Blol. Chem. 271, str. 7844 až 7850. 1996). Substituce jak šeřinu 32 tak šeřinu 36 IkB alaninem zabraňuje signálem vyvolanou aktivaci NF-kB a vede také k IkB (například IkB-α), který není fosforylován, všude přítomen nebo proteolyticky digerován (Roff a kol., J. Biol. Chem. 271, str. 7844 až 7850, 1996). Analogické šeřiny byly Identifikovány jak v IkB-β tak v IkB~E a jeví se, že fosforylace v těchto zbytcích reguluje proteolytickou degradaci těchto proteinů podobným mechanismem jako ··· · · · · ·· · • · · · · ··· · · · • · ···· · · · · ·····« ·· ·· ·· ··

IkB-α (Velí a kol., J. Biol. Chem. 272, str. 9942 až 9949. 1997; Vhiteside a kol., EMBO J. 16, str. 1413 až 1426, 1997).

Obzvláště v závislosti na fosforylací, všudypřítomnosti a degradaci IkB se z komplexu IkB/NF-kB uvolňuje NF-kB a nechá se přemísťovat z cytoplasmy do jádra za aktivace řadu genů, zejména genii, které jsou účastníky zánětlivých a imunitních odezev. Jelikož NF-kB má významnou důležitost v zánětlivých a imunitních odezvách, mflže být inhibice signálu, indukujícího fosforylací IkB, významným cílem pro nová protizánět1 ivá a s Imunitou související činidla v léčení nemocí a poruch souvisejících se zánětlivým a imunitním systémem, jak zde popsáno.

Kináza IkB (IKK) je enzym s vysokou molekulovou hmotností (500 až 900 kD) s mnoha subjednotkám i, který fosforyluje IkB-a v poloze serinu-32 a serinu-36 a byl izolován z Hela-buněk (Chen a kol., Cell 84, str. 853 až 862, 1996; Lee a kol., Cell 88, str. 2.13 až 222, 1997; DiDonato a kol., Nátuře 388, str. 548 až 554 1997). Identifikovány byly dvě katalytické pod jednotky, s názvy IKK-1 a IKK-2, klonovaly se a ukázalo se, že jsou silně expresovány v lidských tkáních (DiDonato a kol., Nátuře 388, str. 548 až 554, 1997; Zandi a kol. Cell 91, str. 243 až 252, 1997; Mercurío a kol., Science 278, str. 860 až 866, 1997: Voronicz a kol., Science 278, str. 866 až 869, Biol. Chem. 273, str. 30736 až 30741, Cell 90, str.

1997; Li a kol., J. 1998; Régnier a kol.,

373 až 383, 1997)

Katalytické subjednotky IKK-1 a IKK-2 IKK jsou vysoce homo log i cké, mají 50¾ sekvenční identitu a 70¾ sekvenční podobnost. IKK-1 a IKK-2 jsou proteiny 85 a 87-kDa. Obě kinázy obsahují katalytickou doménu následovanou leucin zípperovou doménou a helix-loop-helix (HLH) doménu (Mercurío a kol., Science 278, str. 860 až 866, 1997). Je-li jedna subjednotka rekombinantně expresována bez druhé subjednotky, je kterákoli stále schopna katalyzovat fosforylací IkB (Li a kol., J. Biol. Chem.

• · · · ·· ·· · · • · · ···· · · · 9 99 9 9 999 9 9 9 • ·· ·

273, str. 30736 až 30741, 1998). Kterákoli z nich, IKK-1 nebo IKK-2, má významnou úlohu v signalizaci IkB pro všudypřítomnost a další degradaci.

Kromě toho ukázaly studie in vitro, že ΙΚΚβ v plné délce může autofosforylovat a fosforylovát své substráty, rovněž IkB-α, autofosforyláce však není schopna ani forma obsahující N-koncovou kinázovou doménu, ani C-koncovou HLH doménu obsahující formu IKK (americký patentový spis číslo US 6 077701, Chu a kol.). Americký patentový spis číslo 6 077 701 uvádí, že sloučeniny, které zvyšují aktivitu ΙΚΚβ a nebo vazbu na IkB, mohou být potenciálními terapeutickými cíli pro zánětlivé choroby .

Poznatek, že IKK je zahrnut v signálu indukovatelné degradace IkB-« poskytuje jak antimediátorovou Inhibici IKK-1 tak použití dominantně-negativních, katalyticky inaktivních mutantO IKK-1 a IKK-2 (Dil)onato a kol., Nátuře 388, str.548 až 554, 1997: Mercurio a kol., Science 278, str. 860 až 866, 1997: Voronicz a kol., Science 278, str. 866 až 869, 1997). Jak cytokiny tak 1ipopolysacharldy ruší (LPS)-vyvolanou aktivaci NF-kB. Tyto testy in vitro podmiňují úlohu IKK v aktivování NF-kB.

Exisují tyto a jiné kinázy, které mohou fosforylovat IkB a které se účastní aktivace NF-kB. Ukázalo se například, že dvě kinázy (pp90rsk a IKK-E) fosforylují IkB-α na serinu-32 a/ nebo serinu-36. Nadměrná exprese těchto kináz a použití dominantních negativních mutantfl na tyto kinázy naznačila úlohu pro ně ve fosforylaci IkB v buňkách (Ghoda a kol., J. Biol. Chem. 272, str. 21281 až 21288, 1997; Peters a kol., Mol. Cell. 5 str. 513 až 522, 2000). Existence množiny IkB kináz je indlkativnl pro nadbytek signálních cest. Proto je možné, že inhibitor IKK-1 a/nebo IKK-2 nemusí nutně vykazovat protizánětlivé nebo imunosupresivní účinky díky nadbytku signálních • ·· · • · ♦ · · · • · • »tt • · ► 4 • ft cest v alespoň některých buňkách.

Bylo proto provedeno několik studií in vitro k dalšímu zkoumání IKK a jeho vlastností. Studie buněčné biologie typu In vitro (například nadměrná exprese bud' IKK-1 nebo IKK-2 nebo dominantních versí těchto kináz (DiDonato a kol., Nátuře 388, str. 548 až 554, 1997 Mercurio a kol., Science 278, str. 860 až 866, 1997: Woronicz a kol., Science 278, str. 866 až 869, 1997; Regnier a kol., Cell 90, str. 373 až 383, 1997: Zandi a kol., Cell 91, str. 243 až 252), které se jeví jako zahrnující IKK-1 a IKK-2 do aktivace NF-kB, jsou někdy artefaktní. Zvláštní příklad takové artefaktní studie zahrnuje kinázy známé jako vyvolávající kinázu NF-kB, NIK.

Nadměrná exprese NIK v buňkách aktivovala IKK a NF-kB, zatímco exprese kinázy-inakt1vních forem enzymu blokovaly stimulovanou aktivaci IKK a NF-kB (Mallnin a kol., Nátuře 385, str. 540 až 544, 1997; Song a kol., Proč. Nat. Acad. Sel. USA 94, str. 9792 až 9796, 1997). Na základě uvedeného a studií na dihybridních kvasinkách vykazujících silnou interakci mezi NIK a IKK (Regnier a kol., Cell 90, str. 373 až 383, 1997) se považuje NIK za nezbytný pro aktivaci IKK a v důsledku NF-kB.

Další studie ukázaly, že je interakce NIK-IKK protein-protein významná pro odezvy závislé na NF-kB (světový patentový spis číslo WO 99/43704, zveřejněný 2. září 1999, Goeddel a kol.; americký patentový spis číslo 5 851812; 5 916760 a 5 939302). Goeddel a kol. předvedl, že přechodná nadměrná exprese IKKp vyvolává aktivitu 1 uciferázového reporterového genu jak v buňkách HeLa tak 293 a nadměrná exprese klnázy-neaktivní IKKp, která stále souvisí s NIK, blokuje aktivaci. Bylo však dále zjištěna, že buňky odvozené z myší, nemající dostatek NIK, nezrušily aktivaci NF-kB (Karin a Ben-Nariah, Ann. Rev. Immunol. 18, str. 621 až 663, 2000). Proto, ačkoli některé studie naznačují význam NIK jako potenciálního cíle k inhibici • · · · • AA · A A · · A A

AAAA A A·· A A A • ·«······ A ·

A A · · · · · A A A

AAAA AAA AA AA A· ·· aktivace NF-kB, nebyly experimentální výsledky predveditelné in vivo, jak o tom referuje Karin a Ben-Nariah. Je tedy velmi důležité interpretovat pokusy na bázi in vitro a přísné biologicky založené, používající nadměrně expresované proteiny vždy s velkou opatrností.

Ačkoli je několik známých syntetických inhibitorů IKK, žádný z nich nemá úspěšnou úlohu in vivo v inhibici nemocí. Například se ukázalo, že aspirin (kyselina acetylsalicylová) a salicyláty jsou Inhibitory IKK-1 a IKK-2, avšak pouze při vysokých nefyziologickýeh koncentracích, které jsou mnohem vyšší než koncentrace potřebné k blokování syntesy prostaglandinu inhibici cyklooxygenázy (Yin a kol., Nátuře 396, str. 77 až 80, 1998). Proto jsou tato činidla nevhodná k použití v léčení nebo k testování úlohy IKK v nemoci.

Podobně jako v případě aspirinu se ukázalo v případě kyseliny 5-aminosalicyklické že inhibuje IKK (Yan a Polk, J. Blol. Chem. 274, str. 36631 až 36636, 1999), avšak tato sloučenina má několik jiných aktivit, včetně inhibice prostaglandinu a syntézy leukotrienu (Peskar a kol., Deg. Dlsc. Sci. 32, str. 51S až 56S, 1987: Horu a kol., Scand. J. Gastroenterol 26, str. 867 až 879, 1991), což tím vylučuje její použití k testování úlohy IKK v nemoci.

Sullndac je inhibitor cyklooxygenázy, o kterém se prokázalo, že inhibuje také IKK-2 (Yamamoto a kol., J. Biol. Chen. 274, str. 27307 až 27314, 1999). Avšak podobně jako u aspirinu studie prokázaly, že koncentrace sulindacu potřebná k inhibici IKK by byla značně větší než k inhibici cyklooxygenázy. Proto je toto činidlo k testování úlohy IKK u nemocí nevhodné.

Jinými inhibitory IKK, zvláště IKK-2, jsou cyklopentanonpros taglaridlny, jako je 15dPGJ2 (Rossi a kol.. Nátuře 403, str. 103 až 108, 2000). Avšak 15dPGJ2 může také aktivovat per•99* ·« 99 • 99 «9·9 ·· · •999 · 999 9 · 9

999 99 999 9 9

9 9999 9999

9999 999 ·· 99 99 99 oxisom proliferátorem aktivovaný reeeptor-gamma (PPAR-gama) , nukleární receptor, který interferuje s transkripční aktivitou NF~kB. Proto nelze vysvětlit jakýkoli prot. izánět 1 ivý účinek aktivitou PPAR-gama spíše než inhibici IKK. Proto není tento inhibitor specifický pro inhibici ve směru působení zánětů vyvolaných NF-kB cestou IKK.

Další inhibitor IKK arsenít. je reaktivní toxin prostředí, o kterém se zjistilo, že inhibuje jak IKK-1 tak IKK-2 (Kapahi a kol., J. Biol. Chem. 275, str. 36062 až 36066, 2000). Vzhledem k jeho toxickým účinkům terapeutické přednosti in vivo vylučují léčebné využití u pacientů.

V literatuře jsou popsány sloučeniny strukturálně odlišné od sloučeniny vzorce 6 (americký 4 229452 a US 4 200750, Warner a kol.; Med. Chem. 30, str. 133 až 139, 1995: J. Med. Chem. 33, str. 943 až 955 patentový spis číslo US Colotta a kol., Eur. J.

Ceccarelli a kol., (Eur1998; světový patentový spis číslo V0 97/17079 z 29. května 1997).

Publikace Aventis Pharna Deutschland GMBH (V0 01/68648) popisuje zvláštní substituované beta-karbolinové sloučeniny. Světový patentový spis číslo W0 01/68648 popisuje IKK inhibibitorové sloučeniny odlišné od předmětného vynálezu, u kterých se ukázalo že fungují a prokázala se jejich účinnost na řadě in vivo živočišných modelů nemocí nebo patologií souvisejících se záněty, například na živočišných modelech artritidy, zánětlivého střevního onemocnění, zánětu plic a přežívání štěpů.

Publikace Astrazeneca AB (světový patentový spis číslo W0 01/58890) popisuje zvláštní heteroaromatické deriváty karboxamidu, které jsou strukturálně odlišné od sloučenin podle vynálezu. Sloučeniny podle světového patentového spisu číslo W0 01/58890 nedokládají účinnost in vivo IKK inhibitorových sloučenin podle vynálezu na živočišných modelech nemocí souvisejí··♦· · · ♦ · · « 4 * · · 4 9

9 9 9 · 9 · · · · · • 944 44 444 9 9

9 4 9 4 · 9999

9999 999 ·· 99 99 ·

9 4 94 9 cích se záněty a/nebo s imunitním systémem.

Na živočišných modelech nemocí (jako je usmrcení myši), určených k testování inhibice IKK se ukázalo, že delece IKK-1 nebo IKK-2 jsou embryonicky smrtelné (Li a kol., Science 285, str. 321 až 325, 1999: Hu a kol., Science 284, str. 316 až 320, 1999). Proto použití IKK zabíjení myší k předvedení úlohy IKK v onemocnění není ani praktické ani proveditelné. Na rozdíl od toho se podle vynálezu dokládá, že inhibitory katalytické? aktivity IKK-1 a IKK-2 jsou účinné v myších modelech nemocí. Má se zato. že takové modely předvídají podobné účinky u lidských pacientů. Proto způsoby léčby, modely in vivo a účinnost inhibitorů IKK pod 1evyná1ezu, jsou mimořádně přínosné a výhodné pro pokrok v objevování a využívání léčiv pro zánětlivé nemoci a choroby imunitního systému. Tyto živočišné modely jsou proto důležitým nástrojem ke studiu lidských nemocí, zejména zánětlivých nemocí a nemocí souvisejících s imunitou.

Teti 'acyklické sloučeniny na bázi laktamu, vhodné jako antagonisty NMDA (N-methy1-D-aspartátu) a receptory AMPA («-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionát) jsou popsány v literatuře (světový patentový spis číslo VO 94/07893, Preparatlon of 511.1 OH -imidazol 11,2-a] indenol 1,2-e] pyrazin-4-onu AMPA/KA Receptor Antagonist, Aloup a kol.: Mignani, Aloup a kol., “Synthesis and Pharmacological Properties of 5H,10H-imidazo(l,2a]indenol1,2-elpyrazin-4-one, a New Competitive AMPA/KA Receptor Antagonist“, Drug. Dec. Res., sv. 48(3), str. 12 až 29, 1999: An Efficient Preparátlve Routě to Fusedm Iraidazot1,2-a]-Pyrazin-4-one Derivatives Het-erocycles sv. 50, č.l, str. 259 až 267, 1999). Sloučeniny, jako jsou laktamy, se uvádějí jako uži tečné pro blokování excitačních aminokyselinových receptorů, nacházejících se v mozku a v míše, jsou popsány v amerických patentových spisech číslo US 5 153196 a US 5 196421 (Eli Lilly and Company). Tricykllcké sloučeniny mající amino-substituenty, považované za užitečné ligandy mozkových receptorů, jsou •4 4 4 4 4

4 4 44 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 44 44 • 4 4 4

44 popsány v literatuře (americké patentové spisy číslo 5 182386 (Neurogen Corp.); US 4 160097; US 4 172947; US 4 191766; US 4 191.767; US 4 198508, US 4 200750; US 4 225724 a US 4 236015; světový patentový spis číslo W0 97/19079; S. Ceccarelli a kol., Imidazoli 1,2a]chinoxalin-4-amines- A Novel Class of Nonxanthine Al-Adenoslne Receptor Antagonists, European Journal of Medical Chemistry 33, str. 943 až 955, 1998). Pokud je známo, nebyly dosud 4-aminosubstituované tetracyklické sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I popsány.

Stále pokračuje úsilí v oblasti farmaceutického výzkumu vyvinout nové sloučeniny a prostředky mající zvýšenou účinnost, biologickou dostupnost a rozpustnost, mající málo vedlejších účinků a/nebo poskytující spotřebiteli volbu možností. Zejména v oblasti imunitní odezvy, odpovídají mnozí jedinci různě v závislosti na typu léčby a použitém chemickém činidle. Pokračuje studium mechanismů působení, aby se zlepšilo pochopení imunitní odezvy a vyvinutí sloučenin účinných v léčbě poruch imunitního systému.

Vzhledem k nedostatku bezpečných, účinných a nových léčiv k léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí je poptávka po nových protizánětlivých lécích a činidlech, které snižují, odtraňují a/nebo zmírňují zánětlivé nebo s imunitou související nemoci. Kromě toho objev přídavných proteinů, ú~ častnících se procesu zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí a poruch je významný pro potlačování zánětlivých a nepříznivých imunitních příznaků, procesů a nemocí a poruch, jež s nimi souvisejí. Identifikace a charakterizace proteinů, podílejících se na IKK-zprostředkovaných buněčných procesech, by obohatily stav techniky a byly by výhodné pro poskytnutí léčby těm, kteří trpí takovými poruchamni a nemocemi.

•9 9999

9 • 9·9

9 9« * 9 9 9

9 99

9 9 9

9 «·

Podstata vynálezu

Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch spočívá podle vynálezu v tom, že se podává savcům v případě potřeby inhibitor IKK v množství účinném k léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

Vynález se týká způsobu prevence a léčení zánětlivých, nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch použitím IkB kinázy (IKK), sloučeniny obecného vzorce I. Týká se také inhibitoru IKK, 4-(2 -aminoethy1)amino-l,8-dimethylimidazod,2-a)chinoxalinu, používaného k prevenci a léčbě zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

Vynález se týká způsobu prevence a léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch s použitím IKK inhibitorů bud’ samotných, nebo popřípadě kombinaci s alespoň jedním biologicky aktivním činidlem.

Vynález se týká také inhibitorů IKK k prevenci a léčbě zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

Vynález se týká také farmaceutických prostředků obsahujících inhibitory IKK ve farmaceuticky přijatelném nosiči, excipientu nebo ředidle k použití pro prevenci a léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

Vynález se týká také způsobu prevence a léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch. Způsob s výhodou představuje použití inhibitorů IKK k prevenci a k léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, přičemž se příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení uvádějí následující nemoci: artritida, odhojování transplantátů, zánětlivé onemocnění střev, osteoartritida, ·· ···· ·· ·· ·* 9999

9 9 9 9 9 9 · 9 9

999 9 9 99 999

999 99 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 99 99 99 astma, chronická obstruktivní plicní nemoc, ateroskleróza, lupénka, rozptýlená skleróza, mrtvice, systemický lupus erythematosus, Alzheimerova nemoc, mozková ischemie, traumatické poranění mozku, Park insonova nemoc, arayotropní laterální skleróza, subarachnoidní krvácivost a ostatní nemoci nebo poruchy spojené s nadměrnou produkcí mediátorfl zánětů v mozku a v centrálním nervovém systému.

Vynález se týká také způsobů inhibice i) katalytické aktivity IKK, i i) fosfory láce IkB a/nebo iii) exprese genu NF-kB pomocí inhibitorů IKK pro preveci a léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

Obzvláště se vynález týká inhibitoru IKK, 4-(2 -aminoethy1)ami no-1,8-dimethy1 imidazo-<1,2-a)chi noxa 1 i nu, známého též jako sloučenina vzorce 6 nebo její farmaceuticky přijatelné soli, vhodné jako preventivní a/nebo terapeutické činidlo při způsobech léčení zánětliových a imunitních chorob. Vynález se týká sloučeniny vzorce 6

kde znamená Me methylovou skupinu.

Ještě v jiném provedení se vynález týká 4-amino substituovaného benzochi no 1 i nových, benzochinoxalinových a benzochinazolinových sloučenin majících kondenzované pětičlenné heterocykly (například pyrazo1y1ové, imidazo1y1ové a thiazolylové cykly). Tyto sloučeniny jsou vhodné jako protizánět1 ivá činidla a/nebo k léčení stavů spojených s aktivitou TNF-α a NF-kB.

• fc «fcfcfc • · · fcfcfcfc · • fcfcfc • fcfc · • fcfc « fcfc fcfcfc • fcfc · fcfc fcfcfcfc • fc • fc • · ·

Vynález se také také 4-araino substituovaných sloučenin benzochinolinových, benzochi noxa 1 i nových a benzochinazo1 i nových majících kondenzované pětičlenné heterocykly (například pyrazolylove, midazolylove a thiazolylové cykly), zvláště sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu. Sloučeniny jsou vhodné jako proti zánět 1 ivá činidla a/nebo se hodí k prevenci a k léčení stavfl spojených s TNF-a a NF-kB.

Vynález se dále týká sloučeniny obecného vzorce I

kde znamená

X skupinu NR¹ , CR¹ nebo atom síry,

Y^; a Y² atom dusíku nebo atom uhlíku, za předpokladu, že

a) když X znamená skupinu CR¹, znamená alespoň jeden ze symbolů Y¹ a Y² atom dusíku a

b) když jeden ze symbolů Y¹ a Y² znamená atom uhlíku a druhý Y¹ a Y² znamená atom dusíku a/nebo X znamená skupinu NR¹ nebo atom síry, znamená A pětičlennou heteroarylovovou skupinu s alespoň dvěma heteroatomy ,

R¹

R² atom vodíku, atom halogenu, skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, kyanoskupinu, skupinu OR^ , NR^R⁶, C(=D)R^b, CO2 R^ nebo arylovou.

vou , ;kupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, alkenyloalkinylovou, a 1 koxyskupi nu, alkylthioskupinu.

ΦΦ ·Φ·Φ ♦ · φφ φφ ΦΦΦ» • · · · φ φ φ * φ · • ΦΦΦ · φ φφ · · φ • ····♦♦··· · • · · · · φ · · φ · • ΦΦΦ ΦΦΦ φφ φφ φφ φφ skupinu arylovou. heteroarylovou, heterocyklickou. cykloalkylovou nebo substituovanou cykloa1ky1ovou,

R³ a R⁴ na sobě nezávisle skupinu ze souboru zahrnujícího atom halogenu, skupinu alkylovou. substituovanou alkylovou, nitroskuplnu, kyanoskupinu, skupinu OR⁷, NR⁷R⁸ , C<=O)R⁷, C0₂R⁷, CC=CONR⁷R« , NR^yC(=II)R«, NR^yCC=fi)0R⁸ ,

S < O R⁷ . NR⁷ S02 R⁸ a S02 NR⁷ R⁸ ,

R^Ď . R⁶ ,

R⁷ a R⁸ na sobě nezávisle skupinu ze souboru zahrnujícího atom vodíku, skupinu alkylovopu, substituovanou alkylovou a fenylovou nebo R^& a R^b nebo R⁷ a R⁸ spolu s atomem dusíku, na který jsou vázány, heterocyklickou nebo heteroarylovou skupinu NR^bR⁶ nebo NR⁷R⁸ a m, n, a p na sobě nezávisle 0, 1 nebo 2.

nebo její farmaceuticky přijatelné soli, která je vhodná k léčení zánětlivých chorob nebo poruch:

S výhodou znamená R² , jak uvedeno shora, alkylovou skupinu prípadnně substituovanou skupinou OR nebo NR R‘‘ .

Vynález se týká také farmaceutických prostředků obsahujících alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo. Způsob prevence a léčení zánětlivých, nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch spočívá podle vynálezu v tom, že se podává savcům, potřebujícím takovou prevenci a/nebo léčbu, účinné množství alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce I.

Vynález se dále týká soupravy (kltu) k léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, obsahující jeden nebo několik inhibitorů IKK, sloučeninu vzorce 6 a/nebo shora popsané sloučeniny obecného vzorce 1.

9*9·

99 9 • · 9 «999 * 9 · • 999 9 9 9· · 9 9 • 999 99 999 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9« 99

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis připopojených obrázků a vysvětlení jednotlivých výrazů.

Seznam obrázků na výkresech

Na obr. 1. je znázorněn účinek 4-(2 -aminoethyljamino-l,8-dlmethy1imidazoí1,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6) na výskyt choroby v myším modelu kolagenem vyvolané artritidy. Sloučenina se podává jednou denně v preventivním dávkování, x P<0,05, Fisherův test přesnosti.

Na ose	x jsou dny a	na ose	y	je výskyt v
Cárá	-i —	platí pro	nos ič,
čára		platí pro	dávku	10	mg/kg,
čára		platí pro	dávku	30	mg/kg,
čára	-Δ	platí pro	dávku	100	mg/kg.
Na obr.	2	je znázorněn účinek 4-(2 -aminoethyl)amino

methylimidazoC1,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzuorce 6) na průměr gross klinického skoré pro všechny myši v každém léčení v myším modelu kolagenem vyvolané artritidy na základě klinických skoré odpovídajících studovanému dni. Testovaná sloučenina je podávána jednou denně v preventivním dávkování.

x P<0,05, Mann-Vhitneyův U-test.

Na ose x jsou dny, na ose y klinické skoré.

Čára 1	plat i	pro	nos i č,
čára θ	platí	pro	dávku	10	mg/kg,
čára —O—	platí	pro	dávku	30	mg/kg,
čára Ó	platí	pro	dávku	100	mg/kg.

Na obr. 3 je znázorněn účinek 4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimethy 1 iinidazod,2-a)chinoxa1 inu (sloučeniny vzorce 6) v myším modelu kolagenem vyvolané artritidy na základě klinického skoré odpovídájícho dnům po nástupu nemoci. Testovavaná sloučenina se podává jednou denně ve stanoveném způsobu dávkování pro nemoc.

φφ φφφφ

ΦΦ ΦΦ·Φ φ φ φ φφφ » φ φ φ φ φ φ · φ φ φφ φ φ φ φ φφ φφ χ Ρ<0,05, Mann-Vhitneyův U~test.

Na ose x	jsou dny	, na	ose y	klinické
Cárá	— 1 ~	platí	pro	nos i č,
čára	—®— platí ..M	pro	dávku	10	mg/kg
čára		platí	pro	dávku	80	mg/kg
čára	.......	platí	pro	dávku	100	mg/kg

Vynález se týká způsobu prevence a léčby zánětllvých nebo s Imunitou souvisejících nemocí nebo poruch s použitím inhibitorů IkB kinázy (IKK). Takové způsoby jsou účinné in vivo v Inhibici aktivity IKK u savců, včetně lidí a biologických systémů, například živočišných modelů nemoci.

V jednom svém provedení vynález se týká způsobu inhibice katalytické aktivity IKK s použitím inhibitorů. Inhibitory podle vynálezu s výhodou zabraňují katalytické aktivitě IKK (příklad 2). Například mohou inhibitory obsahovat malé molekuly Inhibitorů enzymu, které se vážou přímo na enzym, s výhodou na IKK a výhodněji na IKK-2. Bez nároků na jakoukoliv teorii se má zato, že vázání inhibitoru na aktivní místo IKK také inhibuje vazbu substrátu, jako je například IkB nebo ATP.

Podle jednoho provedení se vynález týká nového Inhibitoru IKK, 4-(2 -am1noethy1)amino-i,8-dimethylimidazoC1,2-a)chinoxalinu, (sloučenina vzorce 6), přičemž sloučenin podle vynálezu může být použito pro prevenci a léčení zánětllvých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

Podle jiného provedení se vynález týká 4-amino substituované benzochinolinové, benzochinoxalinové a benzochinazollnové sloučeniny mající kondenzované pětičlenné heterocykly (například pyrazolylové, imidazolylové a thiazolylové cykly). Tyto sloučeniny jsou vhodné jako protizánět1Ivá činidla a/nebo pro léčení stavů spojených s aktivitou TNF-α a NF-kB.

• 4 4444 44 44 *4 «444

444 4444 44 4

444 4 4 44 444

444 44 444 4 4

4 4444 4444

4444 444 44 44 44 44

Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících inhibiční sloučeniny IKK nebo jejich soli a soupravy (kitu) obsahující inhibiční sloučeniny IKK nebo jejich soli.

K dokonalému pochopení popisu vynálezu ve všech jeho aspektech se uvádějí významy jednotlivých výrazů^: Definice mají být vodítkem a objasněním a nemají vynález a jeho provedení ni jak omezovat.

Výrazem IkB se míní inhibitor kB. Do rodiny IkB patří IkBa, IkB0 a IkBE, z nichž každý obsahuje alkyrinové repetice k vytvoření komplexu s NF-kB.

Výrazem IKK se míní IkB-kináza (IKK). IKK zahrnuje dvě katalytické podjedriotky, IKK-1 a IKK-2, známé též pod označením IKKa a IKKp.

Výrazem aktivace IKK se míní přeměna neaktivního IKK proteinu na aktivní IKK protein. který funguje jako IkB kináza. Aktivované IKK fosforyláty serin-32 a serin-36 IkB tak vyznačují IkB pro všudypřítomnost a degradaci.

Výrazem inhibitory IKK se míní sloučeniny nebo molekuly, které předcházejí, blokují, odstraňují, antagonizují, potlačují nebo redukují aktivaci IKK, jak shora uvedeno. Kromě toho inhibitory IKK inhibují aktivity IKK, s výhodou aktivity IKK in vivo tak, že nastane jedna nebo několik následujících možností: 1) inhibice katalalytické aktivity IKK, 2) inhibice fosforylace IkB, s výhodou katlyzovaná fosforylace IkB a/nebo 3) inhibice aktivace genové exprese závislé na NF-kB.

Výrazem selektivní inhibitor se míní inhibitor jednoho proteinu vyšší měrou než ostatních proteinů. Inhibitor se považuje za selektivní pro jeden protein oproti jinému proteinu, pokud je s výhodou alespoň pětinásobně větší rozdíl v inhibicl ·(* ·ΦΦ·

9 9

9 9 9 jednoho proteinu oproti jinému proteinu. Výhodněji je alespoň osminásobný rozdíl v inhibici jednoho proteinu oproti jinému proteinu.

Výrazem “nucleární faktor-kB neboli NF-kB se míní všudypřítomně expresovaná rodinu eukaryotických transkripěních faktorů. Do této rodiny patří homodimer nebo heterodimer DNA-vázající proteiny odvozené od c-Rel, protoonkogen. který řídí expresi mnoha kB-závíských imunitních, zánětlivých genů a genů antiapoptotické odezvy.

Výrazem ”NF-kB-závislá genová exprese se míní geny související s imunitou a zánětlivé geny, které jsou pod regulačním řízením kB-zesilovače transkripce. Ve většině buněk existují NF-kB ve spícím stavu v cytoplasmě vázané na Inhibiční proteiny kolektivně nazývané IkB, které skrývají signál nukleární lokalizace, čímž brání nukleární translokaci. Aktivace NF~kB může být vyvolána cytokiny, jako je TNF-« a IL-1, kde jak TNF-α tak IL-1 signalizují výsledky v postupné fosforylaci a aktivaci kaskády proteinů. Specificky aktivace IKK nebo modifikace katalytického působení IKK vede k fosforylaci, všudypřítomnosti a degradaci IkB.

Výrazem “léčení, ošetřování se míní prevence, redukce, nebo zlepšení, částečná nebo úplná úleva nebo vyléčení nemoci, poruchy nebo stavu. NF-kB má významnou úlohu v zánětlivé a 1ínunitní odezvě, proto inhibice IkB fosfory láce může také být významným cílem pro nová protizánětlivé a s imunitou souvisej í c í č i nidla.

Výr 'azem stav související s NF-kB se míní nemoci, které jsou charakterizovány uvolňováním NF-kB z cytoplasmy (například po fosforylaci IkB))

Výrazem stav související s TNF-α se míní stav vyznaču• 4 4<·4 « 4 « ·*· «4 4444 ·* 4 4

4 4 4 * 4 · « 4 44 4 4 4 • 44 4 · 4 4 4 » 44 4 4 44 4

44 44 44 jící se zvýšenými hladinami TNF-«. podle vynálezu zahrnuje výraz NF-kB stav související s NF-kB, není však na něj omezen, neboť. NF-kB se podílí na aktivitě a přeregulaci ostatních prozánětlivých proteinů a genů.

Výrazem “zánětlivé nebo imunitní nemoci nebo poruchy se míní jak stavy spojené s IKK tak stavy spojené s NF-kB, stavy spojené s THF-α spojené, například jakékoli stavu nebo poruchy spojené s uvolňováním NF-kB a/nebo se zvýšenými hladinami TNF-a včetně stavil, o nichž je specificky pojednáno dále.

Výrazem “biologická dostupnost“ se míní rozumí rychlost a míra, jakou je účinná složka nebo podíl absorbován z farmaceutického prostředku a stane se dostupným v místě působení. U drogových produktů, které nemají být absorbovány do krevního řečiště, může být biologická dostupnost posuzována opatřeními zaměřenými k reflektování rychlosti a míry, jakou se účinná složka nebo účinný podíl stanou dostupnými v místě působení.

Výrazem prodroga“ se míní terapeutické činidlo, jež je připraveno v neaktivní formě, které po podání subjektu prodělá chemickou přeměnu metabolickými nebo chemickými procesy působením endogenních enzymů nebo jiných cheraiálií a/nebo stavů za uvolnění účinné složky podle vynálezu a/nebo její soli a/nebo solvátu. Například sloučeniny obsahující karboxyskupinu mohou vytvářet fyziologicky hydrolyzovatelné estery, které slouží jako prodrogy tím, že jsou hydrolyzovány v těle k vytvoření sloučenin obecného vzorce I a II.

Vý rázem alkylová skupina se míní uhlovodíková skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem s 1 až 12 atomy uhlíku, s výhodou 1 až 8 atomů uhlíku. Nejvýhodnějšími jsou nižší alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku. Indexy u písmene “C definují přesněji počet atomů uhlíku, které může příslušná skupina obsahovat. Například Ci-6alkyl znamená alkylovou skupi- 20 - ·· ···· ft ft « ft ftftft • ft • ft ·« ft* ftft ···· ··*· V ft · • · ftft ftftft • ftftft ftftftft · • ft· · · · · ftft ftft ftft ftft nu s přímým nebo s rozvětveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku, jako je například skupina methylová, ethylová, n-propylová, Isopropylová, n-butylová, terc-butylová a n-pentylová.

Výrazem “substituovaná alkylová skupina se míní shora definovaná alkylová skupina s jedním, dvěma nebo třemi substituenty volenými ze souboru zahrnujícího atom halogenu, aminoskupinu, kyanoskupinu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, alkylthioskupinu, skupinu -C(=O)H, -CO2H, -(C=0)alkylovou, -CCtealkylovou, cykloalkylovou, substltuovanonou cykloalkylovou skupinu, skupinu arylovou, heteroarylovou nebo heterocyklickou. Výrazem substituovaná alkylová skupina se míní skupina polyf1uoralky1ová, tedy skupina, kde jsou dva nebo několik atomů vodíku a1 kýlového řetězce nahraženy atomem fluoru například skupina trifuomethylová. Výraz substituovaná alkylová skupina zahrnuje také shora definovanou alkylovou skupinu mající substituent NR R, přičemž znamená R a R na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, skupin -C(“=O)H, -CO2H, -CC^Djalkylovou, -Cttealkylovou, cykloalkylovou, subst1tuovanonou cykloalky lovou, arylovou, heteroarylovou nebo heterocyklickou skupinu. Nebo R a R spolu dohromady vytvářejí heterocyklickou nebo heteroaryiovovou skupinu. Substituovanou nižší alkylovou skupinou nebo substituovanou alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku se míní alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku s jedním až třemi substituenty volenými ze shora uvedeného souboru obecně pro alkylové skupiny.

Výrazem alkoxy se míní alkylové shora uvedené skupiny vázané prostřednictvím atomu kyslíku (-0-) a výrazem alkyalthio se míní shora definované alkylové skupiny vázané prostřednictvím atomu síry (S). Jakožto takové skupiny se příkladně uvádějí methoxyskupina, methy1thioskupina, ethoxyskupina, ethylthioskupina, n-propoxyskupina, n-propy1thioskupina, Isopropoxyskupina, isopropylthioskupina, n-butoxyskupina, n- 21 ·· ···· ·* ·· ·· ···· ··· ···· ·· · • ··· · · ·· · · · • ········· · • · ···· ·<·· ···· ··· ·· ·«· ·· ··

-butylthioskupina, terc-butoxyskupina, terc-butylthioskupina. n-pentoxyskupina a n-penty1thíoskupina.

Výrazem alkenyl se míní uhlovodíková skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 12 atomy uhlíku a alespoň s jednu dvojnou vazbu. Nejvýhodnějšími alkenylovými skupinami jsou alkenylové skupiny se 2 až 6 atomy uhlíku a s jednou dvojnou vazbou. Jako alkenylové skupiny se příkladně uvádějí skupina ethenylová, 1-methy1-ethenylová, 1-nebo 2-propenylová, 1-methy1-1-propenylová, 1-methy1-2-propenylová, 1,1-dimethy1 -2-propenylová, 2-methy1-2-propenylová, 1-, 2- nebo 3-butenylová, l-metliy 1 -1-buteny lová , 2-methy1-1-butenylová, 3-methyl-1-buteny1ová, 3,3-dimethy1-1-butenylová, 2,3-dlmethy1-1-butenylová, 1-methy1-2-buteny1ová, 1,1-dimethy1-2-butenylová, 2-methy1-2-butenylová, 3-methyl-2-butenylová, 1,3-butadienylová, 1,3-d imet.hy 1 -1,3-butadieny lová, 1-, 2, 3- nebo 4-pentenylová skupina.

Výrazem alkinyl se míní uhlovodíková skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem se 2 až 12 atomy uhlíku a alespoň s jednou trojnou vazbu. Nejvíhodnějšími alklnylovými skupinami jsou alkinylové skupiny se 2 až 6 atomy uhlíku a s jednou trojnou vazbou. Jako alkinylové skupiny se příkladně uvádějí skupina ethinylová, 1- nebo 2-proplnylová, 1-methy1-2-propinylová, 1,1-dimethy1-2-propiynylová, 1-, 2- nebo 3-butlnylová,

3-methy1-1-butinylová, 3,3-dlmethyl-1-butunylová, 1-methy1-2-butinylová,·1,1-dimethy1-2-butlnylová, 1-, 2-, 3- nebo 4-penti ny1ováVýrazem amino je-li použít samotný, se míní skupina NH2Je-li ho použito k definování substituentu, jako jsou 4-amino substituované tetraeykly, míní se výrazem amino skupina NR R , kde R a R mají význam uvedený u alkylové skupiny Výrazem karbonyl se míní skupina -C(=0)~ a karboxy skupina -CO2- - Tak karbonyl Ci-^alkyl znamená skupinu -C-C=O) spojenou s Ci-4alky1ovou skupinou.

Výrazem halo nebo halogen se míní at-om chloru, bromu, f1uoru nebo j od u.

Výrazem cykloalkyl se míní plně nasycené a částečně nenasycené uhlovodíkové cykly se 3 až 9, s výhodou 3 až 7 atomy uhlíku stejně jako cykly mající kondenzovaný arylový kruh, jako je indan nebo mfistek s 3 nebo 4 atomy uhlíku jako bicykloheptanová skup i na.

Výrazem substituovaný cykloalkyl se míní cykly mající jeden, dva nebo tři substituenty, s výhodou jeden substituent, volený ze souboru zahrnutícího skupin alkylovou, substituovanovou alkylovou, alkoxyskupinu, alkylthioskupinu, atom halogenu, hydroxyskupi nu, kyanoskupinu, aminoskupinu, skupinu NHCalkylovou), -NHCcykloalkylovou), -NCalkylovou)2· skupinu -CO2H, -C2O nižší alkylovou, arylovou, heterocykloskupina, skupinu heteroarylovou, skupinu ketoCMZl), =N-OH, =N-Onižší alkylovou a pětičlennovou nebo šestičlennovou ketalovou, tedy skupinu 1,3-d i oxo1anovou nebo 1,3-di oxanovou.

Výrazem “aryl se míní skupina fenylová, í-naftylová a 2-naftylová, přednost se dává fenylové skupině. Výrazem aryl se míní skupina cyklická O, 1, 2, nebo 3 substituenty volenými ze souboru zahrnujícího skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, alkoxyskupinu, alkylthioskupinu, atom halogenu, hydroxyskup i nu, nitroskupinu, kyanoskupinu, aminoskupinu, skupinu -NHCalkylovou), -NHCcykloalkylovou),-NCalkylovou)2, -CO2H, (OO)alkýlovou, -CO2-alky1ovou, cykloalkylovou, substituovanou cyk1oa1ky1ovou, -CC^e0)NH2, -CC=D)NHCa1 kýlovou), -(C=0)NH(cykloalky lovou) , -(C=r.DN<aJ kýlovou)? , -NH-CH2 “CO2 Η, -NH-CH2-CO2-al-kylovou, fenylovou, benzylovou, feny1ethylovou, fenyloxyskupinu, feny 1thioskupinu, heterocyklickou a heteroarylovou • · · · skup i nu.

Výrazem heterocyklo nebo heterocykl“ se míní substituované nebo nesubstituované nearomatické monocyklické tříčlenné až sedmičlenné skupiny, sedmičlenné až jedenáctičlenné bicykl ické skupiny a deset-ičlenné až patnáctičlenné tricyklické skupiny, které mají alespoň jeden het-eroatom (kyslík, síru nebo dusík) v alespoň jednom kruhu. Monocyklickým heterocyklem je s výhodou pětičlenná až šestičlenná skupina, bicyklickým heterocyklem je s výhodou 5,6-členný 6,6-členný cyklický systém a t-ricykl ickým heterocyklem Je s výhodou systém mající jeden pětičlenný a dva šestičlenné kruhy nebo tři šestičlenné kruhy. Každý cyklus heterocyklické skupiny obsahující heteroatom může obsahovat jeden nebo dva atomy kyslíku nebo síry a/ nebo jeden až čtyři atomy dusíku, za předpokladu, že celkový počet heteroatomů v každém kruhu je čtyři nebo méně a dále za předpokladu, že kruh obsahuje alespoň jeden atom uhlíku. Kondenzované kruhy doplňující bicyklické nebo tricyklické skupiny mohou obsahovat pouze atomy uhlíku a mohou být nasycené, částečně nasycené nebo nenasycené. Atomy dusíku a síry mohou být popřípadě oxidované a atomy dusíku mohou být popřípadě kvarternizované. Heterocyklická skupina může být připojena ke každému dostupnému atomu dusíku nebo uhlíku.

Kdykoli se použije výrazu heterocyklo nebo heterocykl, může kterýkoli kruh heterocyklické skupiny obsahovat popřípadě jeden, dva nebo tři substituenty volené ze souboru zahrnujícího atom halogenu, amlnoskupinu, kyanoskupinu, skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou skupinu, -NH(alkylovou), -NHCcykloalkylovou), -NCalkylskupínu>2, alkoxyskupinu, alkylthioskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu, skupinu fenylovou, benzylovou, fenylethy1ovou, fenyloxyskupinu, feny1thiosklupinu, skupinu -CO2H, CO2-alkylovou, cykloalkylovou, substituovanou cykloalkylovou, skupinu -<C.'=Q)NH2, -(C=O)-NHCalkylovou), - (C=0) - NIKcykloa 1 ký lovou) , - (C=O)N( alky 1 ovou)2 , -NH-CH2 -CO2 H ,

-NH-CHz-Cífe-alky lovou , het.erocykl ickou, hetroary lovou , ketoskupinu, skupinu =N-OH, «Ν-Onižší alkylovou a pětičlennovou nebo šestitičlennovou ketalovou, například 1,3-dioxolanovou nebo 1,3-dioxanovou skupinu.

Jako monocyklické skupiny se uvádějí například skupina tetrahydrothieny1ová, tetrahydrofurylová, azetídinylová, pyrrol i diny lová , oxet-anylová, imidazol iny lová, oxazol idlny lová , isooxazol iny lová, tli iazol idiny lová, isothiazolidinylová, tetrahydrof urany lová, piperidinylová, piperaziny1ová, 2-oxopiperazinylová, 2-oxopiperidinylová, 2-oxopyrrolidinylová, 2-oxozepinylová, azepinylová, 4-piperidonylová, tetrahydropyranylová , morfolinylová, thiamorfolinylová, raorfolinylová, thiamorfolinylová, thiamorfolinylsulfoxidová, thiaraorfolinylsulfonová, 1,3-dioxolanová a tetrahydro-1,1-dioxothiely1. Jako bicyklická heterocyk1ická skupina se uvádí například skupina chinuklidí ny1ová.

Výrazem ’* heteroary 1 se míní substituované nebo nesubstltuované aromatické pěticlenné nebo šestičlenné monocyklické skupiny, devítičlenné až desetičlenné bicyklické skupiny a jedenáetičlenné až čtrnáctičlenné tricyklické skupiny, které mají alespoň jeden heteroatom (kyslík, síru nebo dusík) v alespoň jednom kruhu. Monocyklickým heteroarylem je s výhodou pětičlenná až šestičlenná skupina, bicyklickým heteroarylem je s výhodou 5,6-členný 6,6-členný cyklický systém a tricyklickým heteroary lem je s výhodou systém mající jeden pět, i členný a dva šestičlenné kruhy nebo tři šestičlenné kruhy. Každý cyklus heteroary lové skupiny obsahující heteroatom může obsahovat jeden nebo dva atomy kyslíku nebo síry a/nebo jeden až čtyři atomy dusíku, za předpokladu, že celkový počet heteroatomů v každém kruhu je čtyři nebo méně a dále za předpokladu, že kruh obsahuje alespoň jeden atom uhlíku. Kondenzované kruhy doplňující bicyklické nebo tricyklické skupiny mohou obsahovat pouze atomy uhlíku a mohou být nasycené, částečně nasycené nebo nenasy» I • · cerié. Atomy dusíku a síry mohou být popřípadě oxidované a atomy dusíku mohou být popřípadě kvartemizované. Heterarylová skupina může být připojena ke každému dostupnému atomu dusíku nebo uhlíku.

V případě heteroary1u, může kterýkoli kruh heteroarylové skupiny obsahovat popřípadě jeden, dva nebo tři substituenty volené ze souboru zahrnujícího atom halogenu, aminoskupinu, kyanoskupinu, skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, -NHCalkylovou), -NHCcykloalkýlovou), -NCalkylovou)2, alkoxyskupinu, alky 1thioskupinu, hydroxyskupinu, nitroskupinu, skupinu fenylovou, benzylovou, fenylethylovou, fenyloxyskuplnu, feny1thiosklupinu, skupinu -CO2H, CO2-alkylovou, cykloalkylovou, substituovanou cykloalky lovou, skupinu -CC-=0)NH2 , -COO)NH(a1ky1 ovou) , -(C=0) NH (cyk 1 oa 1 ky 1 ovou) , - <C=0)N(a1ky1ovou)2, -NH-CH2-CO2Η, -NH-CH2-CO2-alkylovou, heterocyklickou a h e t, r o arylovou skupinu.

Jako monocyklické heteroarylové skupiny se uvádějí například skupina pyrrolylová, parazolylová, pyrazolinylová, imidazo lylová, oxazolylová, isooxazolylová, thiazolylová, thiadiazolylová, isothiazolylová, furanylová, thienylová, oxadlazolylová, pyridylová, paryziny1ová, pyrimidinylová, paridazinylová, triazinylová a triazolylová.

Jako bicyklické heteroarylové slupiny se uvádějí například skupina indolylová, isoindolylová, benzothiazoly1ová, benzodioxolylová, benzoxazolylová, benzothienylová, chinollnylová, tetrahydroisochinollnylová, isochino1inylová, benzimidazolylová, benzopyrany1ová, indolizinylová, benzofuranylová. isobenzofuranylová, chromonylová. kumarinylová, benzopyranylová, cinnolinylová, chi noxa 1 iny1ová, chinazolinylová, 1ndazoly1ová, pyrro1opyr i dylová, f uropyr i d i ny1ová, d i hydro i so i ndo1y1ová, tetrahydrochinolinylová, nafthyridinylová a pteridinylová skupí na.

_ · · · <

• · ·

Jako tricyklické heterroarylové skupiny se uvádějí například skupina karbazolylová, benzindolylová, fenanthrollnylová, akrId1nylová, fenanthridinylová a xanthenylová skupina.

Jelikož je exprese genu, závislého na NF-kB, spojena s aktivací na IKK závislé fosforylaci IkB a genů zhrnutých v zánětlivých a s Imunitou souvisejících nemocech nebo poruchách, týká se.· jedno provedení vynálezu obecně prevence a léčení zánětlivých a s imunitou souvisejících nemocí, poruch nebo stavů pomocí inhibitorů IKK. Zvláště se jedno provedení vynálezu týká 1 ) způsobů inhibice? IKK k prevenci a/nebo k léčení zánětlivých a s imunitou souvisejících nemocí, poruch nebo stavů: 2) způsobů inhibice aktivace genové exprese závislé na NF-kB inhibicí na IKK závislé fosforyláce IkB pro prevenci a lečemi zánětlivých a s imunitou souvisejících nemocí, poruch nebo stavů; 3) inhibitorů IKK: 4) použití inhibitorů IKK a způsobů podle vynálezu a 5) příkladných IKK inhibičních sloučenin, k teré 1nh i bu j i IKK.

Jedno provedení vynálezu objasňuje použití in vivo inhibitoru IKK pro způsoby léčení a prevence zánětlivých a s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch (příklady 4 až 7). Podle známého stavu techniky neexistovalo žádné předvedení in vivo skutečné terapeutické účinností Inhibitorů IKK k léčení a k prevenci zánětlivých a s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, jako je například astma, zánětlivé onemocnění střev, odhojování transplantovaných tkání nebo orgánů, například štěpu, vůči zamítnutí hostitelem a pllcních nemocí například týkajících se infiltrace zánětlivých buněk do plic.

Proto se vynález také týká terapeutických a profylaktických způsobů léčby a prevence zánětlivých a s Imunitou souvisejících nemocí, poruch nebo stavů, podáváním jedinci, s výhodou savci, v případě potřeby účinného množství alespoň jednoho Inhibitoru IKK nebo jeho solí samotných nebo v kombinaci s ji·· ··♦· • · • « · · ným inhibitorem IKK- Kromě toho může být použito jiných terapeuticky nebo biologicky účinných činidel v kombinaci s inhibitory IKK, například drog, hormonů nebo syntetických činidel, příkladně níže popsaných. F'ři způsobu podle vynálezu se mohou biologicky účinná činidla podávat před, současně nebo po padání jednoho nebo několika inhibitorů IKK podle vynálezu.

Inhibitorů IKK může být také použito podle popsaného způsobu ve spojení s jinými drogami, jako je cyklosporin A nebo CTLA4-lg, ke zmírnění odhojování transplantátů. Cyklosporin A je mocná imunosupresivni sloučenina běžně používaná terapeuticky u lidí k zabránění odhojování štěpu po transplantaci pevných orgánů. Většina běžných terapeutických protokolů zahrnuje cyklosporin A v kombinaci s ostatními imunosupresivnírai drogami, jako jsou steroidy a antiproliferativní činidla jako je kyselina inykofenolová. Když se sloučeniny zkoumají z hlediska klinické účinnosti v transplanátech pevných orgánů, zahrnu j i protokoly léčení pacientů testovanými sloučeninami spolu se standardními léčivy včetně cyklosporinu A. F’roto k pokročení s klinickým vývojem nových sloučenin, musejí nové sloučeniny pracovat účinně dobře s cyklosporinem A.

CTLA4-lg je imunoglobulinový kondenzovaný protein, který se váže na ligandy pro CD28 a CTLA4 (Linsley a kol-, J- Exp. Med. 174, str. 561 až 569, 1991). CTLA4-lg je slibné činidlo, které působí v léčbě odhojování transplantátů (Larsen a kol., Nátuře 381, str. 434 až 438, 1996). Jelikož některé formy CTLA4-lg by se mohly stát standardním ošetřováním pro transplantaci, měly by význam nové sloučeniny vyvinuté k prevenci odhojování štěpů, zejména ve spojení s CTLA4-lg.

Vynálezu dále zahrnuje způsoby inhibice enzymu IKK, spočívající v podávání jedinci trpícímu zánětlivou nebo s imunitou související nemocí nebo poruchou, inhibitoru IKK v množství účinném k inhibici katalytické aktivity IKK a na IKK zá• · 9 9 _ 9 9 9 999 9 9 ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 • 9·· · · 99 99

999 99 999 9

9 9999 99

9999 999 99 99 99 vislé fosfory láce kB. Bez snahy vázat se na jakoukoliv teorii, zahrnuje mechanismus inhibice IKK inhibici katalytické aktivity IKK, jak IKK-1 tak IKK-2, s výhodou IKK-2, vázáním na aktivní místo enzymu a inhibici vazby a/nebo fosforyláce substrátů jako je IkB a ATP (příklad 2).

Jedno provedení vynálezu se týká způsobu inhibice fosforylace inhiblčního proteinu IkB, který spočívá v podávání inhibitorů IKK v množství účinném k inhibici fosforylace proteinu IkB. Zvláště je výhodná Inhibice IkB-α fosforylace a především inhibice IkB-a fosforylace v případě serlnu-32 a serínu-36.

Podle vynálezu se může používat sloučenin, které inhibují IKK, tedy inhibitorů IKK ve způsobech prevence a léčení zánětlivých nebo s imunitním systémem souvisejících stavů, nemocí nebo poruch. Příklady takových nemocí, poruch a stavů jsou artritida, revmatoidní artritida, psoriatická artritida, osteoartritida, akutní pancreatitida, chronická pankreatitida, lupénka, g1omerulonefritIda, sérová nemoc, lupus (systematický lupus erythewatosis), urticaria, sclerasclerma, kontaktní derinatitida, derrnatomyos i t ida, alopecia, atopický enzem, ichthyosis rhinítis, zánětlivé onemocnění střev (Crohnova a vředovitá kolitítida), Alzheimerova nemoc, mozková ischemie, traumatické poranění mozku, Parkinsonova nemoc, Creutzfeld-Jakobova nemoc, HIV encefa1 ititoda, mozková malarie a meningitida, ateroskleróza, ataxia telangiectasis, septický šok, rozptýlená skleróza, amyotropní laterální skleróza, aterosk1eróza, subarachnoidní krvácivost, autoimunitní nemoci, systemický lupus erythematosus, rozptýlená skleróza, hematopoiesis, plicní nemoci, dýchací alergie, astma, akutní respirační úzkostný syndrom, senná horečka, alergická rýma, alergické dýchací nemoci, herpes simplex typ 1 (HSV-1), herpes simplex typ 2 (HSV-2), cytoroega1ovirus, Epsteín-Barr, lidský virus Imunitní nedostatečnosti (HIV), Addisonova nemoc (autoimunitni nemoc adrenál·· ··*· ·« ·· “· · · · · · · • ··· 9 9 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 ·· ··· ·

9 nich žláz), idiopatická adrenální nedostatečnost, autoimunitní polyglandulární nemoc (také známá jako autoImunitní polyglandularní syndrom), houbové infekce, mycosis fungoides, chronická obstruktivní plicní porucha, odhojování tkání a transplantovaných orgánů (například ledviny, jater, srdce, plic, pankreasu, kostní dřeně, rohovky, tenkého střeva, pokožkových allotransplantátů, pokožkových homotransplantátů a heterotransplantátů), mrtvice, obkologické nemoci, rakovina, nádory, rakovina prsu, raklov ina prostaty a Hodgkinův lymfom.

Inhibitorů IKK podle vynálezu může být použito k prevenci k léčení a ke zmírnění chorob a stavů, obzvláště zánětlIvých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo stavů. Bez nároků na jakoukoliv teorii se inhibitorů IKK používá k prevenci a léčení nemocí, poruch nebo stavů charakterizovaných aktivací NF-kB cestou fosfory láce IkB prostřednitvím IKK. Zvláště se vynález týká Inhibitorů IKK, které inhibují katalytickou aktivitu enzymu IKK, čímž blokují fosforylací IkB a transkripční aktivaci ve směru exprese genu kB, jako je NF-kB.

V jednom provedení vynálezu má inhibitor IKK IC50 aktivitu proti IKK v rozmezí 0,01 pM až přibližně 50 pM. S výhodou má inhibitor IKK hodnotu IC50 proti aktivitě IKK v rozmezí přibližně 0,01 pM až přibližně 10 pM, výhodněji přibližně 0,01 pM až přibližně 5 pM, a nejvýhodněji přibližně 0,01 pM až přibližně 1 pM .

V ještě jiném provedení se vynález týká Inhibitorů IKK, které mají selektivitu pro IKK-2 oproti IKK-1 (příklad 2). S výhodou má selektivní inhibitor IKK nejméně pětinásobně větší selektivitu pro IKK-2 než pro IKK-1. Výhodněji má selektivní inhibitor IKK nejméně osminásobně větší selektivitu pro J.KK-2 než pro IKK-1. Zvláště je například inhibice aktivity IKK-2 přibližně 5 až 500 násobná, nebo 8 až 100 násobná oproti inhibici aktivity IKK-1, s výhodou 10 až 100 násobná oproti oři ·· ftft’··

JO -» · · • ftftft • ft ftftftft

Inhibici aktivity IKK-1 a výhodněji přibližně 10 až 50 násobná.

Ve výhodném provedení vynálezu vykazují selektivní inhibitory přibližně 50¾ inhibici aktivity IKK a IC50 oproti aktivitě IKK od přibližně 0,01 pM až přibližně 50 pM. S výhodou mají selektivní inhibitory IC50 oproti aktivitě IKK přibližně 0,01 pM až přibližně 10 pM a s výhodou přibližně 0,01 pM až přibližně 5 pM . Nejvýhodněji mají selektivní inhibitory IC50 přibližně 0,01 pM až přibližně 1 pM.

S výhodou se vynález týká IKK inhibitorů selektivních na IKK-2. S výhodou vykazuje selektivní IKK-2 Inhibitor IC50 proti aktivitě IKK-2 v rozmezí přibližně 0,01 pM až přibližně 5 ).iM a zvláště IC50 proti aktivitě IKK-2 v rozmezí přibližně 0,01 pM až přibližně IpM.

V jiném význaku se vynálezu týká biologická dostupnosti inhibičních sloučenin. Například farmakokinetika sloučeniny vzorce 6 v myších je popsána v příkladu 3. Zpravidla účinná orální biologická dostupnost pro inhibitor IKK podle vynálezu je přibližně 10¾ až přibližně 100¾. s výhodou přibližně 50¾ až přibližně 100¾. a výhodněji přibližně 80¾ až přibližně 100¾. Z farmakoklnetického hlediska určují hodnoty biologické dostupnosti pro danou sloučeninu relativní podíl orálně podávané dávky, který se absorbuje do systemlckého oběhu ve srování s hodnotami biologické dostupnosti pro roztok, suspenzi nebo i ntravenozn i dávkovač 1 formmu.

Vynález se dále týká způsobů testování inhibičního potenciálu inhibitorů IKK. Zvláště analyzuje příklad 2 testované sloučeniny a jejich kapacitu inhibovat aktivity IKK měřením koncentrace fosfory1 ováného substrátu, specificky IkB, a koncentrace testovaného inhibitoru IKK nutnou k dosažení 50¾ inhibice aktivity IKK.

• ft · ftftft • · · ·· · ftft ftft — ftftft · · · · ftft · • ftftft · · ftft ftftft • ········· · • ft ···· ···· ftftftft ftftft ftft ftft ftft ftft

Jedno provedení vynálezu se týká poskytuje příznivého a výhodného působení při studii in vivo inhibitorů IKK na živočiších, přičemž se dokládá účinnost sloučeniny použitím způsobů podle vynálezu. Například 4-(2 -aminomethy1)ami no-1,8-dimethy1 imidazo(1,2-a)chi noxa 1 in, sloučenina vzorce 6, nebo její sůl podle vynálezu inhibuje katalytickou aktivitu kínázy IkEt blokováním aktivního místa IKK, které je zodpovědné za fosfory láci proteinu IkB. Kromě toho zde popsané příklady dokládají, že inhibitory IKK jsou obzvlášť užitečné v metodách léčení zánětlivých a s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch na několika různých modelech nemocí živočichů, které jsou prediktivní pro podobné použití a účinky u lidských pacientů.

Sloučeniny a prostředky podle vynálezu jsou také užitečné v léčení stavů, které jsou charakterizovány uvolňováním NF-kB a/nebo zesílení hladin TNF-α. K inhibici nebo potlačení NF-kB a/nebo TNF-α může docházet lokálně, například v určitých tkáních subjektu nebo méně extensivně v subjektu léčeném na takovou nemoc. K inhibici nebo potlačení NF-kB a/nebo TNF-α může docházet jedním nebo několika mechanismy, například inhibici nebo potlačením kterýchkoli kroků na cestě (nebo cestách) výhodné inhibice IKK. Vynález se proto týká způsobů léčení takových stavů, při kterých se podává subjektu, který takové ošetřili potřebuje, účinné množství alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce I, sloučeniny vzorce 6 nebo jejich soli. Může se také použít jiných terapeutických prostředků, jaké jsou popsány níže v kombinaci s inhibitory IKK, sloučeniny vzorce 6 a/ nebo sloučenin obecného vzorce I. Při způsobech podle vynálezu mohou být terapeutická činidla podávána před, současně nebo následně po podání sloučeniny podle vynálezu.

Sloučenina vzorce 6 má strukturní obecný vzorec

(6)

N'

H ·· ·««· ·· ·» « ♦ · « • * · · * * · · a • · · a «· ·« • *· « • a • » · • » · • · · * · » · ·· ·· kde znamená Me methylovou skupinu

Sloučenina vzorce 6 neboli 4-(2 -aminomethy1)amino~l,8-dimethy1imidazoCl,2-alehi noxa 1in také do rozsahu vynálezu. Pokud vytváří soli, které spadají není uvedeno jinak, míní se sloučeninou IKK níže.

podle vynálezu také její sůl, jak je popsáno

Vynález se dále týká sloučeniny obecného vzorce I

X.kde znamená

(I)

X skupinu NR¹ , CR¹ nebo atom síry,

Y¹ a Y² atom dusíku nebo atom uhlíku, za předpokladu, že

a) když X znamená skupinu CR¹, znamená alespoň jeden ze symbolů Y¹ a Y² atom dusíku a bl když jeden ze symbolů Y¹ a Y² znamená atom uhlíku a druhý Y¹ a Y² znamená atom dusíku a/nebo X znamená skupinu NR¹ nebo atom síry, znamená A pětičlennou heteroarylovovou skupinu s alespoň dvěma heteroatomy ,

R¹ atom vodíku, atom halogenu, skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, kyanoskupinu, skupinu 0R^&, NR^R⁶, C(=O)R^b, C02R^b nebo arylovou,

R² skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, alkenylovou, alkinylovou, alkoxyskupinu, a1ky1thioskupi nu, skupinu arylovou, heteroarylovou, heterocyklickou, cykloalkylovou nebo substituovanou cykloalkylovou,

R³ a R⁴ na sobě nezávisle skupinu ze souboru zahrnujícího atom halogenu, skupinu alkylovou, substituovanou alkylovou, nitroskupinu, kyanoskupinu, skupinu OR⁷, NR⁷R⁸, .♦« *» « 9 · *99

32_Λ*· 9494 • «9 • 9 >999 «4«

9999 « * « 9 »

9 9 • 9 9 9

99

C ( =0 5 R⁷ , C02 R ⁷ , C C =0 5 NR ⁷ R⁸ , N R ⁷ C ( =0 5 R⁸ , NR⁷ C C =0 5 OR⁸ , S(0M'⁷, NR⁷S02R⁸ a S0₂NR⁷R⁸,

R^b , R⁶ ,

R⁷ a R⁸ na sobě nezávisle skupinu ze souboru zahrnujícího atom vodíku, skupinu alkylovopu, substituovanou alkylovou a fenylovou nebo R^b a R^b nebo R⁷ a R⁸ spolu s atomem dusíku, na který jsou vázány, heterocyklickou nebo heteroaryl ovou skupinu NR^bR⁶ nebo NR⁷R⁸ a m, nap na sobě nezávisle 0, 1 nebo 2.

Vynález se týká také sloučeniny obecného vzorce If

kde znamená

X skupinu NR¹ , CR¹ nebo atom síry,

Y¹ a Y² atom dusíku nebo atom uhlíku, za předpokladu, že

b) když jeden ze symbolů Y¹ a Y² znamená atom uhlíku a druhý Y¹ a Y² znamená atom dusíku nebo X znamená skupinu NR¹ nebo atom síry, znamená A pětičlennou heteroary1ovovou skupinu s alespoň dvěma heteroatomy ,

R¹ atom vodíku, atom halogenu, skupinu nižší alkylovou nebo substituovanou nižší alkylovou skupinu,

R² alkylovou nebo substituovanou alkylovou skupinu.

Výhodnějšími jsou sloučeniny obecného vzorce If, kde zna• Φ

·· ·«·* • · · • ··· · · • · ···· ···

C · • · • · • · ·· • · ·· ·· ··»· meriá

X skupinu NR¹ nebo CR¹ ,

R¹ atom vodíku, atom halogenu, nižší alkylovou nebo trifluormethylovou skupinu,

R- skupinu alkylovou s 1 až 2 atomy uhlíku popřípadě substituovanou skupinou OR⁹ nebo ΝΡ^θΡ¹¹, kde znemaná

R^y atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu.

R¹⁰ a R¹¹ (i) na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou s 1 až 2 atomy uhlíku, skupinu alkylovou substituovanou skupinou alkylovou s 1 až 2 atomy uhlíku, nebo skupinu -(C=0)a1ky1ovou s 1 až 2 at.omy uhlíku v alky lovem podílu, nebo (ií) spolu dohromady pětičlennou až šestičlennou heterocyklickou nebo heteroarylovou skupinu.

Nejvýhodnější jsou sloučeniny obecného vzorce If, kde zna mená

A skupinu vzorce

R¹ atom vodíku, atom halogenu, methylovou, ethylovou nebo trif1uormethy1ovou skupí nu,

R² skupinu alkylovou s 1 až 2 atomy uhlíku popřípadě substituovanou skupinou ze souboru zahrnujícího skupinu hydroxylovou, NH₂, NH(alkyl)2. NH(substituovaný alkyl), Nísubstituo34 váný alkyl)2. NH ( C«=O)a 1 ky 1 a skupinu piperidinylovou, přičemž alkylové podíly mají vždy 1 až 2 atomy uhlíku.

S výhodou R¹ neznamená hydroxylovou skupinu nebo alkylovou skupinu substituovanou hydroxylovou skupinou.

Vazba, vyjádřená pevnou a čárkovanou čarou (například ) znamená, že, podle okolností, jde o jednoduchou nebo dvojnou vazbu mezi dvěma sousedními atomy. Například v případě zB jestliže X znamená atom síry nebo skupinu NH, jsou vazbou mezi sousedními A a B vazby jednoduché. Avšak v případě jestliže X znamená skupinu CR¹ nebo atom dusíku, je jedna vazba mezi sousedními A a B vazba dvojná a druhá jednoduchá.

Pracovníci v oboru volí skupiny a substituenty se záměrem získat stabilní podíly a sloučeniny.

Sloučeniny obecného vzorce I a/nebo vzorce 6 vytvářejí soli, které vynález rovněž zahrnuje, pokud tedy není uvedeno jinak, rozumí se sloučeninami podle vynálezu také jejich soli. Výrazem sůl nebo “soli” se míní soli s kyselinami a/nebo se zásadami, připravované reakcemi s anorganickými a/nebo s organickými kyselinami a zásadami. Kromě toho tento výraz zahrnuje také soli s podvojnými ionty (vnitřní soli), například pokud sloučenina obecného vzorce I obsahuje jak zásaditý podíl, například aminoskupinu nebo pyridinovou nebo imidazolovou skupinu, tak kyselý podíl například zbytek karboxylové kyseliny. Farmaceuticky přijatelné, (to znamená netoxické, fyziologicky přijatelné) soli jsou výhodné, například přijatelných kovů a • · • · • · ···· · · · ···· · · · · · · ·

aminů, ve kterých kation nepřispívá podstatně k toxické nebo biologické aktivitě soli. Užitečné mohou však být také jiné soli, například pro izolaci nebo čištění sloučenin a může se takových solí používat během způsobu přípravy a vynález je proto rovněž zahrnuje. Soli sloučenin obecného vzorce I se mohou připravovat například reakcí sloučenin obecného vzorce I s množstvím kyseliny nebo zásady, například s ekvivalentním množstvím, v prostředí, ve kterém se například sůl sráží, nebo ve vodném prostředí s následnou lyofllizací.

Příkladně se jako adiční soli s kyselinou uvádějí acetáty (například připravované reakcí s kyselinou octovou nebo trihalogenoctovou jako trifluoroctovou), adipátý, algináty, askorbáty, aspartáty, benzoáty, benzensulfonáty, bisulfáty, boráty, butyráty, citráty, kamforáty, kamforsulfonáty, cyklopentanpropionáty, diglukonáty, dodecylsulfáty, ethansulfonáty, fumaráty, glukoheptanoáty, g1ycerolfosfáty, hemlsulfáty, heptanoáty, hexanoáty, hydrochlorIdy (připravované reakcí s kyselinou chlorovodíkovou), hydrobromidy (připravované reakcí s bromovodíkem), hydrojodidy, 2-hydroxyethansulfonáty, laktáty, maleáty (připravované reakcí s kyselinou maleinovou), methansulfonáty (připravované reakcí s kyselinou methansulfonovou), 2-naftalensulfonáty, nikotináty, nitráty, oxaláty, pektináty, peroxysulfáty, 3-fenylpropionáty, fosfáty, pikráty, pivaláty, propionáty, sallcyláty, sukcináty, sulfáty, (například připravované reakcí s kyselinou sírovou), sulfonáty (zde připomínané), tartráty, thiokyanáty, toluensulfonáty například tosyláty a undekanoáty- .

Příkladně se jako adiční soli se zásadou uvádějí amoniové soli; soli s alkalickými kovy, jako jsou sodík, lithium a draslík: soli s kovy alkalických zemin, jako jsou vápník a hořčík; soli zinku, hliníku a barya; soli s organickými zásadami (například s organickými aminy) jako jsou trialkylaminy, například troethylamin, prokain, dibenzylamin, N-benzyΙ-β-fe9 9 9 9

9

9 99 nethylamin, 1-efenanin, N, N' -dibenzylethylendiamin, dehydroabietylamin, N-ethylpiperidin, benzylamin, dicyklohexylamin nebo podobné farmaceuticky přijatelné aminy; a soli s aminokyselinami, jako jsou arginin a lysin. Skupiny, obsahující zásaditý atom dusíku, se mohou kvartem i zovat, za použití činidel, jako jsou nižší alkylhalogenidy (například methylchlorid, et.hylchlorid, propylchlorid a buty1chlorid, methylbromid, ethylbromid, propylbromid a butylbromid, methyljodid, ethyljodid, propyljodid a butylJodid), dialkylsulfáty (například diraethylsulfát, diet-hylsulfát, dibutylsulfát a diamylsulfát) , halogenidy s dlouhým řetězcem (například decylchlorid, laurylchlorid, myristylchlorid a stearylchlorid, decylbromid, laurylbromid, myristy1bromid a steary1bromid, decyljodid, lauryljodid, myristy1jodid a steary1jodid), ara1ky1ha1ogenidy (například benzylbromid a fenethylbromid). Výhodné jsou sodné a draselné sol i .

Sloučeniny obecného vzorce I a sloučenin vzorce 6a jejich soli mohou být také v tautomerní fonmě, přičemž se atom vodíku přemísťuje na jiné části molekuly a chemické vazby mezi atomy noleku se v důsledku toho přemístí. Všechny možné tautomerní formy vynález zahrnuje. Sloučeniny podle vynálezu mohou být přídavně jako trans a cis (E a Z) izomery a mohou obsahovat jedno nebo několik chirálních center, a existují proto v enantiomerních a diastereomerních formách- Vynález zahrnuje všechny takové izomery, jakož také směsi cis a trans izomerů, směsi diastereomerů a racemické směsi enantiomerů (optické izomery). Pokud není specificky uvedena konfigurace (cis, trans, R nebo S) sloučeniny (nebo asymetrického atomu uhlíku), jsou míněny všechny izomery nebo směsi izomerů.

Vynález se také týká farmaceutických nebo fyziologických prostředků obsahujících alespoň jeden IKK inhibitor nebo jeho sůl, které s výhodou obsahují farmaceuticky nebo fyziologicky přijatelné vehikulu, například nosič, ředidlo nebo excipient.

• ·

·· ···· ·· ··

Dále tyta farmaceutické nebo fyziologické prostředky obsahují jeden nebo několik IKK inhibitorů nebo jejich solí buď samotných nebo v kombinaci s biologicky aktivním činidlem, jako jsou příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, drogy, steroidy nebo syntetické sloučeniny, zvláště pro použití při způsobech podle vynálezu. Farmaceutické prostředky mohou s výhodou obsahovat jakékoliv IKK inhibitory podle vynálezu, například 4-(2'-aminoethy1)amino-l,8-dimethy1imidazot1,2-a)chinoxalin (sloučenina vzorce 6) nebo jakoukoliv jinou sloučeninu obecného vzorce I. Takové farmaceutické nebo fyziologické prostředky se mohou podávat v souhlase s jednotlivou potřebou léčby například savcům, jako jsou opice, psi, kočky, skot, koně, králíci a hlavně lidé pro každý shora popsaný terapeutický nebo preventivní účel.

Zvláště se vynález týká farmaceutických prostředků pro ošetřování stavů, které souvisejí s aktivitou NF-kB, TNF-a a/nebo enzymů modulujících NF-kB, TNF-α hladiny jako IKK. Takové prostředky mohou obsahovat jiná terapeutická činidla a mohou se formulovat popisovaným způsobem.

Podle jednoho provedení se vynález týká IKK inhibitorů nebo farmaceutických nebo fyziologických prostředků, které je obsahují, a které se mohou podávat samotné nebo v kombinaci s alespoň jedním jiným biologicky aktivním činidlem a které se mohou vnášet do jakéhokoliv starilního biologicky kompatibilního farmaceuticky a fyziologicky přijatelného nosiče, excipientu nebo ředidla, jako jsou příkladně, tedy nikoliv jako jakéholiv omezení, solanka, pufrovaná solanka, dextróza a voda. Prostředky se pacientovi mohou podávat samotné nebo popřípadě v kombinaci s jiným biologicky aktivním činidlem, drogou nebo hormony.

Přídavně při způsobu podle vynálezu se IKK inhibitory nebo jejich soli nebo farmaceutické nebo fyziologické prostřed• · · · ·· ··· · ky, které je obsahují, mohou podávat jakýmkoliv vhodným způsobem podle ošetrovávaného stavu, který může záviset na potřebném specifickém místě ošetření nebo na množství drogy, které se má dodávat, přičemž takové způsoby zahrnují podání příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, orální, nasální, intravenózní, intramuskulární, intraarteriální, intramedulární, intrathekální, intraventrikulární, transdermální, subkutanní, intraperitoneální, intranasální, enterální, topické a sublinguální. S výhodou IKK inhibitory se podávají orálně, nasál ně, topicky a inhalací.

Podávání prostředků, obsahujících IKK inhibitor, může zahrnovat lokální nebo systemické podání včetně injekcí, orálního podání, roprašováním částic, nebo kateterem a topicky. Může se používat různých způsobů podávání prostředků obsahujících IKK inhibitor přímo na specifické místo těla. Například v případě topického podání je výhodné obecně pro nemoci pokožky používat transdermální náplasti a/nebo zesilovačů permeace, přičemž jsou takové prostředky v oboru obecně známé. Systemické podávání je výhodné pro rakovinové a předrakovinové stavy, jakkoliv se mohou používat jiné způsoby.

Jak dávka IKK inhibitoru tak prostředku, který ho obsahuje a způsoby podání se stanovují na základě následujících faktorů: specifický IKK inhibitor nebo terapeutický prostředek, který ho obsahuje; stav, věk a hmotnost pacienta; pokročilost onemocnění: a další s ošetřováním související faktory. S výhodou IKK inhibitor nebo terapeutický prostředek, který ho obsahuje podle vynálezu zyyšuje nebo snižuje genovou expresi NF-kB. Může se používat způsobů v oboru známých pro stanovení účinnosti mechanizmu voleného pro změnu exprese NF-kB genu, jako jsou hybridizace nukleotidové sondy kvantitativní RT-PCR nebo detekce NF-kB specifických protilátek (například Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

k mRNA NF-kB genu, proteinu za použití ·· ····

Kromě aktivních složek mohou farmaceutické prostředky obsahovat vhodné, farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla nebo excipienty zahrnující pomocné látky, které usnadňují zpracování aktivních sloučenin na prostředky, kterých se farmaceuticky může používat. Podrobnosti o formulačních způsobech a o podávání jsou známy z literatury (například poslední vydání publikace Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publisning Co.: Easton, Pa)).

Farmaceutické prostředky pro orální podíní se moho formulovat za použití farmaceuticky přijatelných nosičů dobře známých v oboru pro dávkovači formy vhodné pro orální podání. Takové nosiče umožňují formulovat farmaceutické prostředky ve formě například tablet, pilulek, dražé, kapslí, kapalin, gelů, sirupů, emulzí a suspenzí pro podání pacientovi.

Prostředky podle vynálezu se mohou podávat orálně ve formě tablet, kapslí, granulí, prášků nebo kapalin včetně sirupů; topicky ve formě roztoku, suspenzí, gelů, krémů nebo mastí; nasálně ve formě inhalačních sprejů; parenterálně například subkutánně, intravenózně, intramuskulárriě nebo intrasternální injekcí nebo infuzí (například ve formě sterilních vstřikovatelných roztoků nebo nevodných roztoků nebo suspenzí); rektálně ve formě čípků; sublinguálně; bukálne; nebo liposomálně.

Farmaceutické prostředky pro orální podání se mohou připravovat kombinací aktivních sloučenin s pevným excipientem a popřípadě mletím získané směsi a zpracováním směsi na granule po přidání vhodných pomocných látek popřípadě k získání tablet jebo jader dražé. Jakožto vhodné excipienty se uvádějí glycidová nebo proteinová plnidla, jako jsou cukry včetně laktózy, sacharózy, latinitu nebo sorbitu; škrob kukuřičný, pšeničný, rýžový, bramborový nebo z jiných rostlin; celulózsa jako methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, nabo natriumkarboxymethy1celulóza; klovatiny jako arabská klovatina a tragakant;

• ·· · a proteiny jako želatina a kolagen. Popřípadě se mohou přidávat desintegrační činidla nebo solubi1izační činidla, jako jsou příčně zesítěný polyviny1pyrrolidon, agar, kyselina algová nebo její fyziologicky přijatelné soli, jako je alginát sodný.

Farmaceutické prostředky, které se mohou podávat orálně při způsobu podle vynálezu, zahrnují tvrdé želatinové kapsle jakož také měkké želatinové kapsle a povlečené kapsle s želatinou a povlakem, jako příklad z glycerolu a sorbitu. Tvrdé želatinové kapsle mohou obsahovat aktivní složky ve směsi s činidly ze souboru zahrnujícího plnidla a pojidla, jako jsou laktóza nebo škroby, mazadla, jako jsou mastek a stearát hořečnatý; a popřípadě stabilizátory. V případě měkkých želatinových kapslí může být aktivní sloučenina rozpuštěná nebo suspendovaná ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, kapaliny nebo kapalný polyethylenglykol popřípadě se stab i 1 i zátory.

Jakožto příklady prostředků pro orální podání se uvádějí suspenze, které obsahují například mikrokrystlickou celulózu pro dodání objemovosti, algovou kyselinu nebo alginát sodný jakožto suspenzační činidlo, methylcelulózu ke zvýšení viskozity a sladidlo nebo ochucovací činidlo o sobě známé v oboru; a tablety pro okamžité uvolňování, které mohou obsahovat například mikrokrystlickou celulózu, dikalcimfosfát, škrob, stearát hořečnatý, a/nebo lakt-ózu a/nebo jiné excipienty, pojidla, nastavovače, desintegranty, ředidla a mazadla v oboru známá. Sloučeniny podle vynálezu se momou podávat orálně subliguálním a/nebo bukálním podáváním například jako tablety vyráběné vstřikováním, lisováním nebo lyofilizací. Příkladné prostředky mohou také zahrnovat rychle se rozpouštějící ředidla, jako jsou mannit, laktóza, sacharáza a/nebo cyklodextriny. Prostředky mohou obsahovat také vysokomolekulární excipienty, jako jsou celulózy (AVICEL^H) nebo polyethylenglykoly (PEG);

• · ♦···

AAAA • · ·

AAAA

A • AAA AAA excipient napomáhající mukosální adhezi jako hydroxy propyl celulóza (HPC), hydroxypropylmethylcelulóza (HPMC), natriumkarboxymethylcelulóza (SCMC) a/nebo kopolymer maleinanhydridu (například GANTREZ^R); a činidla řídící rychlost, uvolňování jako jsou polykrylové kopolymery (například CARBOPOL 934^R). Mazadla, kluzné prostředky, ochucovacx činidla, barviva a stabilizátory se také mohou přidávat pro usnadnění výroby a použití

Příkladné prostředky pro rektální použití zahrnují čípky, které mohou obsahovat nedráždivé excipienty například kakaové máslo, syntetické glyceridové estery nebo polyethylenglykoly, které jsou pevné při teplotě okolí avšak ztekucují se a/nebo se rozpouštějí v rektální dutině za uvoňování drogy.

Jádra dražé se mohou používat spolu s fyziologicky vhonými povlaky, jako jsou koncentrované roztoky cukru, které mohou také obsahovat arabskou klovatinu, mastek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglýko1 a/nebo oxid titaničitý, lakové roztoky a vhodná organická rozpouštědla nebo rozpouštědlové směsi. Do tablet nebo dražé se mohou přidávat barviva a pigmentové povlaky pro identifikaci produktu nebo k charakterizaci množstí účinné látky, to je dávky.

Farmaceutické prostřediy pro parenterální podání podle vynálezu se mohou formu1vat ve vodných roztocích, s výhodou ve fyziologicky kompatibilních pufrech, jako jsou Hankfiv roztok, Ringerflv roztok nebo fyziologicky pufrovaná solanka. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je natřiumkarboxymethylcelulóza, sorbit nebo cext-ran. Kromě toho se suspenze aktivních sloučenin může připravovat jako vhodná olejová injekční suspenze. Jakožto vhodná lyofilní rozpouštědla nebo vehikula se uvádějí mastné oleje, jako je sazamový olej nebo syntetické estery mastných kyselin, jako jsou ethyloleát nebo triglyceridy nebo liposomy. Popřípadě mohou suspenze obsahovat také vhodné stabilizátory nebo či·· 4444

4444

4 •4 ·

4 4 4 4

4 · 4

4 • 44

4 nidla zvyšující solubilitu sloučenin k umožnění přípravy vysoce koncentrovaných roztoků. Přídavné příkladné prostředky pro parenterální podání zahrnují vstřikovat-elné roztoky nebo suspenze, které mohou obsahovat například vhodné netoxické parenterálně přijatelná ředidla nebo rozpouštědla, jako jsou manit, 1,3-butandiol, voda, Ringerův roztok, izotomnický roztok chloridu sodného nebo jiná dispergační činidla nebo smáčedla a suspenzační činidla včetně syntetických monoglyceridů a diglyceridů a mastných kyselin včetně kyseliny olejové.

Pro topické nebo nasální podání obsahují farmaceutické prostředky penetranty nebo permeaci zvyšující činidla pro permeaci barier. Takové penetranty jsou v oboru obecně známy. Příkladné prostředky pro topické podání zahrnují topické nosiče například minerální olej gelováný polyethylenem (PLÁŠTIBASE¹¹). Příkladné prostředky pro nasální aerosoly nebo pro inhalační podání zahrnují roztoky, které mohou obsahovat například benzylakohol nebo jiná vhodná konzervační činidla, promotory absorpce ke zvýšení absorpce a/nebo biologické dostupnosti a/nebo solubi1izační nebo dispergační činidla, která jsou v oboru k takovým účelům obecně známá.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou vyrábět o sobě známými způsoby například obvyklým míšením, rozpouštěním, granulaeí, zpracováním na dražé, rozmělňováním na prášek, emulgací, zapouzdřováním, absorpcí nebo lyofilizaci.

Dávkovači jednotky farmaceutických prostředků podle vynálezu mohou obsahovat netoxická farmacueticky přijatelná vehikula nebo ředidla. Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat ve formě umožňující okamžité uvolnění nebo prodloužené uvolňování- Okamžité uvolnění nebo prodloužené uvolňování se může dosahovat vhodnými farmaceutickými prostředky nebo zvláště v případě prodlouženého uvolňování zařízením, jako jsou subkutanní implantáty nebo osmotické pumpičky.

·* ««»« *· ····

• · · • · · · ·« ·«

IKK inhibitor nebo farmaceutický prostředek, který ho obsahuje, může být ve formě soli a může vytvářet s četnými kyselinami, příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, s kyselinou chlorovodíkovou, sírovou, octovou, mléčnou, vinnou, maleinovou a jantarovou. Soli jsou rozpustnější ve vodných roztocích nebo v protonických rozpouštědlech než odpovídající formy volné zásady. V jiných případech jsou výhodnými prostředky lyofi Iizované prášky, které mohou obsahovat jednu nebo několik následujících složek'- 1 až 50 mM histidinu, 0,1 až 2 % sacharózy a 2 až 7 % mannitu při hodnotě pH v rozmezí 4,5 až 5,5 při zkombinování s pufrem bezprostředně před použitím. Po přípravě farmaceutického prostředku se prostředek vnese do vhodného konteineru a označí se pro použití za daných podmínek. Pro podání IKK inhibitorů takové označení zahrnuje množství, frekvenci a způsob podání.

Farmaceutické prostředky, obsahující jeden nebo několik

IKK inhibitorů vhodných pro použití podle vynlezu, zahrnují prostředky, ve kterých je aktivní sloučenina obsažena v účinném množství k dosažení záměru použití. Stanovení účinného množství nebo dávky je úkolem pracovníka v oboru. Pro každou sloučeninu se terapeuticky účinná dávka může stanovit testem v buněčné kultuře například za použití neoplastických buněk, nebo za použití živočišných modelů, obvykle myší, krys, králíků, psů nebo vepřů. Živočišných modelů se také může používat ke stanovení vhodné dávky, oboru koncentrace a cesty podání. Takových informací se může používat a mohou se extrapolovat ke stanovení užitečné dávky, oboru koncentrací a cesty podání lidem. Jako vodítko se uvádí, že podle vynálezu s účinným množstvím IKK inhibitoru se dosahuje inhibice IKK aktivity v rozmezí přibližně 20 až 100 %, s výhodou v rozmezí přibližně 50 až 100 % a ještě výhodněji v rozmezí přibližně 80 až 100 % a nejvýhodněji v rozmezí přibližně 90 až 100 % při ošetřování zánětlivých a/nebo na imunitě závislých nemocí.

·· ·»·· ·* ···· ·· ·· • í · ···· · « · • · ·· ···· ·· · • ········· φ • * · · · · · · · · ·*·· ·»' '· ♦ · .* „*

Terapeuticky účinnou dávkou se míní množství aktivní složky nebo sloučeniny, jako IKK inhibitoru, které zmírňuje, snižuje nebo eliminuje symptomy, stav nemoc nebo poruchu. Terapeutická účinnost a toxicita se mohou stanovit o sobě známými způsoby ve farmacii v buněčných kulturách nebo v pokusech na živočiších, například stanovením ED50 (dávka terapeuticky účinná v 50 % populace) a LD50 (dávka letální pro 50 % populace). Velikost dávky terapeutického až toxického působení se označuje jako terapeutický index, který se vyjadřuje jako poměr ED50/LD50- Výhodné jsou farmaceutické prostředky, které mají velké terapeutické indexy. F’racovníci hodnoty získané v testech buněčných kultůr v oboru používají a při studiích na živočiších pro stanovení dávek pro humánní účely. Výhodná dávka farmaceutického prostředku je v oboru koncentrací, které zahrnují ED50 s malou toxicitou nebo prosté toxicity. Dávka se mění v závislosti na dávkovači formě, na citlivosti pacienta a na cesty podání.

IJrč i tá dávka subjekt se mění v a četnost podávání pro každý jednotlivý závislosti na různých faktorech. Přesné dávkování stanovuje lékař, který bere v úvahu faktory týkající se jednotlivého požadovaného ošetřování. Dávka a podávání se nastavuje k dosaženi dostatečné hladiny IKK inhibitoru k udržování žádoucího působení. Faktory, na které se bere zřetel, zahrnují závažnost ošetřovaného stavu, obecný zdravotní stav pacienta, věk, hmotnost, pohlaví, stravu, a způsob, dobu a frekvenci podávání, rychlost vylučování, kombinace drog, reakční citlivost, snášení/odezvu na terapii. Jako vodítko se dlouho působící farmaceutické prostředky mohou podávat každý třetí nebo čtvrtý den, každý týden, nebo jednou za dva týdny v závislosti na poločase a rychlosti vylučování příslušného prostředku.

Normální dávkované množství je v rozmezí přibližně 0,1 až přibližně 100000 pg až do celkové dávky 1 g v závislosti na ► ««·« • * • φφφ ·* • φφφ φφφ ·· ·· ► · · 4 » Φ ΦΦ ► Φ Φ « » · Φ « ·· ΦΦ • φ φφφφ cestě podání. Vodítkem pro určitá dávkování a způsoby uvolňování jsou v literatuře, jsou stanovitelné empiricky a jsou obecně dosažitelné a rutinně stanovitelné pracovníky v oboru. Jedna nebo několik dávek se může podávat například denně, ob den nebo podle týdenního rozpisu. Účinnou dávku sloučeniny podle vynálezu může stanovit pracovník v oboru a taková dávka zahrnuje například množství pro savce v rozmezí přibližně 0,05 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti účinné sloučeniny za den, která se může podat najednou nebo ve formě několika rozdělených dávek například jednou až čtyřikrát za den. Jakožto výhodné subjekty ošetřování se uvádějí živočichové, zvláště savci, jako jsou lidé a domácí zvířata jako například psi, kočky a koně.

Sloučeniny podle vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli zahrnují také prodrogy, farmaceuticky přijatelné soli takových prodrog a jiné biologické ekvivalenty. Vynález zahrnuje také prodrogy a solváty sloučenin podle vynálezu. Pracovníkům v oboru je známo, že prodrogy jsou pro způsob podle vynálezu vhodné. Takové prodrogy se s výzhodou podávají orálně, jelikož k jejich hydrolýze dochází v četných případech v podstatě za působení trávicích enzymů- Parenterální podání se může použít, pokud je ester jako takový aktivní, nebo v případech, kdy dochází k hydrolýze v krvi. Jakožto příklady hydrolyzovatelných esterů sloučenin podle vynálezu obecného vzorce I se uvádí ester alky1benzylový, 4-methoxybenzylový, indanylová, ft-alylový, methoxymethylový, alkanoylalkylový například acetoxymethylový, pivaloy1oxymethylový, nebo propionyl oxymethyl ový , alkoxykarbonyloxyalkýlový Cpřičemž se alkylovými, alkoxy a alkanoylovými podíly míní vždy skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku) například methoxykarbony1oxymethylový nebo ethoxykarbony1oxymethylový, glycyloxymethylový, fenylglycyloxymethylový, (5-methyl-2-oxo-l,3-dloxolen-4-y1)methylový a jiné známé fyziologicky hydrolyzovatelné estery, například penici1 lnového a cefalosporinového typu. Takové estery se mohou připravovat způsoby známými pracovníkům v oboru.

·· ·«·· • · *

• · · ·

Sloučeniny a prostředky podle vynálezu se mohou používat samotné nebo v kombinaci navzájem nebo s jinými vhodnými terapeutickými činidly užitečnými pro ošetřování stavů spojených s NF-kB a TNFet. Jakožto příklady takových jiných terapeutických činidel se uvádějí kortkosteroidy, roliprám, kalphostin, CSftID, v poloze 4 substituované imoidazot1,2-alchinoxaliny (americký patentový spis číslo US 4 200750; Ceccarelli a kol., viz shora), interleukin-10-glukokortikoidy, salicyláty, oxid dusnatý a jiné imunosupresanty; nukleární translokační inhibitory jako deoxyspergualin (DSG); nesteroidní protizánětlivé drogy (NSAID), jako jsou ibuprofen, celecoxib a rofecoxib; steroidy, jako jsou prednison a dexamethason; antivirová činidla, jako abacavir; antiproliferační čindila, jako jsou methotrexát, leflunomid, FK506 (tacrolimus, Prograf); cytotoxické drogy, jako jsou azathiprin a cyklof osf amid; TNFcc inhibitory, jako jsou tenidap, anti-TNF protilátky nebo rozpustný TNF receptor a rapamycin (Sirolimus nebo Rapamune) nebo jejich deriváty; a jiné protirakovinové drogy a ošetření včetně radiačního a daunorubicinem.

Shora uvedená terapeutická činidla při použití v kombinaci se sloučeninami podle vynálezu se mohou používat například v množstvích uvedených v publikaci Physicians' Desk Reference (PDR) nebo ve množstvích určených lékařem.

Pracovníci v oboru jsou schopni různými modifikacemi sloučenin, prostředků a popsaných schémat využívat podstatu vynálezu- Vynález zahrnuje všechny takové modifikace v rozsahu vynálezu .

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

··*« • ·* · « ·

999

9999 999

9 I 9 99 ř · · 4 » · · <

·· 99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob přípravy inhibitoruIKK, 4-(2 -aminoethy1)amino-l,8dimethy1imidazol1,2-a)chinoxa1 inu (sloučeniny 6)

Inhibitor IKK, sloučenina 4-(2 -aminoethy1)amino-1,8-dimethylimidazod,2-a)chinoxalin, neboli sloučenina vzorce 6, se dá připravovat způsobem podle dále uvedeného schéma. Výchozí látky jsou obchodně dostupné nebo se dají úracovníky v oboru snadno připravit a/nebo může pracovník v oboru provádět modifikace způsobu za použití známých metod a praktik.

Chem i cké schéma pro přípravu sloučeniny vzorce 6

Sloučeninu vzorce 6, neboli 4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimet.hyl imidazol 1,2-a)chinoxal in lze připravit podle uvedeného schéma^: nechá se reagovat 3-fluor-4-nitrotoluen (sloučenina vzorce 1) s ethyl-5-met.hyl imidazol-4-karboxylátem (sloučenina vzorce 2) o sobě známými kroky k postupnému vytvoření imidazochinoxalon-2-karboxylové kyseliny (sloučenina vzorce 3). Po dekarboxy1aci této kyseliny (sloučenina vzorce 3) ve vysoce •9 99*9 «9 9

9 4

9 9 • 9 4 9 «9 ·<

»· «·*· et μ » * · 9 9 · 9 • ··♦ 9 9 99 » 9 9 · » t , * · 9 9 9«

444 » ··< 94 φ· vroucím rozpouštědle, jako je difenylether (Ph2 0) se získá 1,8-dimethy1imidazochinoxanol (sloučenina vzorce 4). Sloučenina vzorce 4 se pak chloruje známými činidly, jako je oxychlorid fosforečný (POClg) a N, N-diethylani 1 in (PhNRt.2 ) za získání 4-chlor-l,8-dimethy1imidazochinoxalinu (sloučenina vzorce 5). Sloučenina vzorce 5 se pak kondenzuje s 1,2-diaminoethanem nebo s ethylendiaminem, čímž se získá ýžádaný 4-(2 -aminoethyl)amino-1,8-dimethy1imidazod,2-a)chinoxalin (sloučenina vzorce 6) .

Příprava reakčních činidel a výchozích látek pro přípravu sloučeninu vzorce 6

3-fluor-4-nitrotoluen (sloučenina vzorce 1)

Sloučenina vzorce 1 je obchodný produkt (společnost Aldrlch Chemical Company (Milwaukee- WI)

Ethy1-5-methy1imidazo1-4-karboxylát (sloučenina vzorce 2)

Sloučenina vzorce 2 je obchodně dostupný produkt (společnost Aldrich Chemical Company, Milwaukee, VI)

Příprava imidazochinoxalon-2-karboxylové kyseliny (sloučeniny vzorce 3)

Nechají se reagovat sloučenina vzorce 1 a sloučenina vzorce 2 a po několika krocích se získá sloučenina vzorce 3 způsobem, lterý popsal Trieber a kol. (německá, 6. října 1994, zveřejněná přihláška vynálezu číslo 4 329 970.

Příprava 4,5-dihydro-l,8-dimethy1imidazod,2-a)-4-onu (sloučeniny vzorce 4)

Suspenze 4,5-dihydro-1,8-dimethy1imidazod,2-a)chinoxalin- 49 ··«··· ·. ,« ,, ... ··· «··· * ··· · · ·· · · · • · · · · · ··· · ♦ ··· ··· ·· «·

9 >· ·<

vzorce 3) (32 g, 124 'váním pod zpětným chla4-on-karboxylove kyseliny (sloučeniny mol) v difeny1etheru (400 ml) se zahř o

dičem udržuje dvě hodiny na teplotě 260 C. Po vychladnutí suspenze na teplotu místnosti se přidají hexany (CeHi-t, 500 ml) k dalšímu vysrážení produktu. Pevná látka se odfiltruje, čímž se získá 4,5-dihydro-l,8-dimethy1iraidazoG,2-a)-4-on, sloučenina vzorce 4, v podobě bílé pevné látky (29,6 g) .

^AH nukleární magnetická rezonance, NMR (500 MHz, hexadeuteriodimethylsulfoxid, de-DMSO) 6 11,7 (s,lH), 7,91 (s,lH), 7,31 (s,lH), 7,29 (d, J=S,1 Ηζ,ΙΗ), 7,22 (d, H=8,3 Hz, 1H);

MS (ESI), m/z 232,04 [(M+H)⁺, vypočteno pro sloučeninu vzorce 4, C12H10CIN3O 231,06.

Příprava 4-chlor-l,8-dimethylimidazoíl,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 5)

Směs 4,5-dihydro-l,8-dimethylimidazoí1,2-a)-4-onu (sloučeniny vzorce 4) (29,6 g, 139 mmol) a N,N-diethyani1 inu (45 ml) se vaří pod zpětným chladičem po dobu jedné hodiny v oxychloridu fosforečném (250 ml).Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, zbytek se zředí chloroformem (1000 ml) a opatrně se neutralizuje studeným roztokrm uhličitanu sodného. Vodná vrstva se extrahuje chloroformem. Spojená organická vrstva se suší síranem hořečnatým, zfiltruje se a zkoncentruje. Bleskovou chromatografií (eluční činidlo systém ethgylacetát/hexany 60=40) se získá 4-chlor-l,8-dimethylimidazo(1,2-a)chinoxalin, sloučenina vzorce 5 v podobě bílé pevné látky (25 g).

¹HNMR (500 Hz,CDC1₃) δ 8,07) s,lH), 7,93 (d,J=8,3 Hz,2H), 7,54 (d, J=0,7 Ηζ,ΙΗ), 7,41 (dd, J=8,4, 1,2 Ηζ,ΙΗ), 2,97 (s,4H), 2,59 (s,3H) 2,81 (s,3H), 2,41 (s,3H):

MS (ESI),m/z 214,13[(M+H)⁺, vypočteno pro sloučeninu vzorce 4, C12H11N3O 213,09.

·· ····

Příprava 4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimethylimidazo(l,2-a-)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6)

Roztok 4-chlor-l,8-dimethylimidazod,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 5) (5,8 g, 21 mmol) v ethylendiaminu (300 o

ml) se udržuje 16 hodin na teplotě 60 C v prostředí dusíku. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Zbytek se zředí ethylacetátem (200 ml), promyje se nasycebým roztokem uhličitanu sodného a solankou, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a zkoncentruje. Bleskovou chromatografií s methanolem se získá pevná látka, která se rozpustí v chloroformu a zfiltruje se k odstranění silikagelu. Filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá 4-(2 -ami noethyl)amino-l,8-dimethylimidazo(1,2-a)chinoxa lin, sloučenina vzorce 6, v podobě bílé pevné látky (4,67 g). iHNMR (500 Hz,CDC1₃) «7,88 (s,lH), 7,63 (d,J=8,3 Ηζ,ΙΗ), 7,26 (s.lH), 7,22 (d,J=8,3,Hz 1,H), 6,31 (s, 1H), 3,63 (zdánlivý g, J=5,9 Hz,2H)), 2,88 (s,3H), 1,38 (br,2H), MS (ESI),m/z 256,15 t (M-*-H)⁺ , vypočteno pro sloučeninu 6, C14H17N5 255,15].

Příprava hydrochloridové soli 4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimethy 1 imidazod , 2-a)chlnoxal inu (sloučeniny 6)

Sloučenina vzorce 6, 4-(2 -aminoethyl)ainino-l,8-dimethylimidazod , 2-a)chinoxal in, (4,67 g, 18,3 mmol) se rozpustí ve směsi vodné kyseliny chlorovodíkové (1,0 N (1,0 N, 18,3 inl) a vody (50 ml) při teplotě místnosti. Po odstranění vody hydrofilizerem se získá hydrochioridová sůl 4-(2 -aminoethyl)amino-1,8-dimethylimidazod,2-a)chinoxalinu v podobě bílé pevné látky (5,22 g).

Hydrochloridové soli sloučeniny 6 se dává přednost v popsaných metodách, ačkoli i ostatní soli, například acetáty, sulfáty, citráty i volné báze sloučeniny vzorce 6 se také hodí k použití .

V příkladech 2-7 je použito solné formny 4-(2 -aminoet• · · · • « hy 1 )ainino-l, 8-d i methy 1 imidazo( 1,2-a)ehinoxal inu.

Příklad 2

Analýza inhibičního potenciálu inhibitorů IKK s použitím 4- (2 -aminoethyl)anino-l,8-dimethylimidazoí1,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6)

Zkouška IKK-l/IKK-2

Zkoušky měření inhibičního potenciálu testovaných sloučenin, obzvláště sloučeniny 6, (4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimethy1imidazo(1,2-a)chinoxalinu) proti aktivitě IKK používají ³³P-značeného ATP a rekombinantního IkB-α jako substrátů. Při tomto zkoušce se přidá testovaná sloučenina do roztoku 0,5 mM IkB-α ve 40 mM tris-HCl, hodnota pH 8, obsahujícího 4 mM chloridu hořečnatého, 1 mM dithiothreitolu a 2 mM ³³P-značeného ATP- Enzym IKK (bud subjednotkový komplex HeLa buněk, rekombinantně expresovaný IKK-1, nbo rekombinantně expresovný IKK-2) se pak přidá k zahájení reakce. Subjednotkový komplex se izoluje způsobem, který popsal Lee a kol. (Cell 88, str. 213 až 222,1997) nebo Mercurio a kol. (278, str. 860 až 866, .1997). Rekombinantní IKK-1 a IKK-2 se expresu jí způsosobem, který popsal Burke a kol. (J. Biol. Chem 274,str. 36146 až 36152, 1999). Po 10-minutové inkubaci se reakce ukončí přísadou EDTA na konečnou koncentraci 31 mM. K oddělení fosforylovaného IkB-α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se provede gelová elektroforéza (SDS-PAGE z nezreagovaného ATP dodecylsulfátu polyakrylamidu sodného. Provede se fosfoimagerová analýza množství ³³p vneseného do IkB-α a inhibice aktivity IKK testovanou sloučeninou se vypočte z kontrolních vzorků neobsahujících žádný inhibitor- Hodnota C50 je definována jako koncentrace testované sloučeniny, která vyvolá 50¾ inhibici aktivity IKK.

·· ··· ·

Výsledky v tabulce I ukazují inhibici aktivity IKK pomocí ³³P-značeného ATP a IkB-« jako substrátů pro prorekombinantně expresovaný IKK-1 a IKK-2, přičemž koncentrace testované sloučeniny 5 μΜ a 0,5μΜ dosahuje 50% inhibici aktivity IKK. Inhibitor IKK, sloučenina vzorce 6, inhibuje IKK-2 při IC50, což je desetinásobně méně než potřeba pro inhibici IKK-1 50%. Jak z tabulky I vyplývá, inhibuje sloučenina 6 IKK-2 s větší účinností než IKK-1, což ukazuje na selektivitu této sloučeniny pro inhibici IK-2 oproti IKK-1.

Tabulka I

Testovaná sloučenina	IKK-1 IC50	IKK-2 IC50
sloučenina vzorce G	5 μΜ	0,5 μΜ

Příklad 3

Farmakokinetiká sloučeniny vzorce G u myší

Sloučenina vzorce 6 se podává myším BALB/c jednak orálně (p.o.), jednak intravenozně (i.v.). Krev se odebírá po různých hodinách (0,5 až 4 hodinách) po dávce a hladiny drogy v krvi se měří kapalinovou chromatografií - hmotovou spektrální analýzou. Orální biologická dostupnost pro 100% sloučeniny vzorce 6 je vypočtena z plochy pod křivkou (AUC) z vynesené závislosti hladiny v plasmě vůči času po dávce p.o. a pak dělením AUC z dávky i.v. Poločas i.v. 7,9 hodin byl vypočten ze zřejmé koncové eliminace fáze po dávce i.v. Obecně je orální biologická dostupnost přibližně 10 % až přibližně 100 %, výhodněji přibližně 50 % až přibližně 100 % a nejvýhodněji přibližně 80 % až přibližně 100 %.

» 9 99 9 • 9 • 9 99 •· 99··

Příklad 4

Měření střední doby přežití transplanotovaných srdcí u myší BALB/C

Myší neonatalní transplantáty srdce na ucho

Srdeční transplanmtáty se provedou způsobem, který popsal Fulmer a kol. (Fulmer R.I. a kol., The American Journal of Anatomy 113, str. 273 až 281, 1963). Neonatální srdce se získají z nově narozených myší C57BL/6 maximálně do 48 hodin po narození. Srdce se transplantují anestetizovaným hostitelským myším BALC/c provedením malé incise na bázi ear pinna a vytvořením kapsy mírným odklopením srsti od ucha. Incise umožňuje vložení dárcovského srdce subkutánně do kapsy. Po operaci nezačne obvykle srdeční tkáň bít 3 až 5 dní po transplantaci, dokud se neustaví cévní spojení. Pulsace srdce se měří stahovou aktivitou sledovanou příslušným elektrokardiogafem monitorovaným přístrojem (ECG). Stahová aktivita transplantovaného štěpu se sleduje denně. Doba odhojení štěpu se definuje jako den po transplantaci, kdy stahová aktivita ustane. Bez terapeutického zásahu hostitel vykaná Imunitní odezvu vůči transplantovanému srdci (tedy odhojení transplantátu). Tato imunitní odezva způsobí, že srdce přestane bít obvykle 10 až 14 dní po transplantaci.

Sloučeniny se podávaly v denních dávkách bud' samotné nebo v kombinaci s jinými terapiemi, jako je podávání Cyklosporinu A (15 mg/kg orálně, p.o.) nebo CTLA4-lg (200 ug ve 200 μΐ PBS intraperitoneálně pouze ve dnech 0, 2 a 4). V tabulce II jsou uvedeny účinky testovaných sloučenin na střední dobu přežívání transplantovaných srdcí buď samotných nebo v kombinaci s Cyklosporinem A (CsA). Tabulka III udává účinky samotných testovaných sloučenin na střední dobu přežití transplantovaných srdcí nebo v jejich kombinaci s CTLA4-lg.

• · · · ·· ····

Tabulka II

Testovaná sloučenina Střední doba Statistická významnost přežití štěpu

nosič (voda)		12	dní
Cyk 1 os poi' i n A	, 15 mg/kg p.o.	14	dní
sloučenina 6,	50 mg/kg,p.o.	12	dní
Cyklosporin A	, 15 mg/kg p.o.
plus		29	dní	P	<0,01	vflč i	nos i č i
sloučenina 6,	50 mg/kg,p.o.			P	<0,01	vůči	CsA samot

Tabulka III

nosič (voda)	12 dní
CTLA4-lg			22	dní	P<0,01 vflči nosiči
sloučenina 6,	50	mg/kg,p- o.	12	dní
sloučenina 6,	1OO	mg/kg p.o.	18	dní	P<0,01 vflči nosiči
CTLA4-lg
plus sloučenina 6,	50	mg/kg,p.o.	32	dní	P <0,01 vflči nosiči P <0,02 vflči CTLA4-lg
					samotná
CTLA4-lg
Ρ1 us sloučenina 6,	100	i mg/kg,p.o.	>60 dní	P <0,01 vflči nosiči P <0,01 vflči CTLA4-lg samotná

Synergistické účinky mezi sloučeninou vzorce 6 a Cyklosporinem A nebo CTLA4-lg ukazují, že inhibitor IKK je vysoce účinný při ošetření in vivo odhojení transplantátu pevného orgánu, obzvláště je-li podán společně s jinými imunosupresivními činidly- Jelikož nejsou tato činidla plně účinná, jsou-li •0 0000

0 0000 ·« 0 ·

0 0 0000 00 0 ···· · 000 0 0 0 9 000 00 000 0 0 • 9 0000 0000 ···· ··· 00 00 00 00 podávána samotná, dostávají pacienti s transplantáty koktail imunosupresivních činidel.

Příklad 5

Účinek inhibitoru IKK, 4-(2 -aminoethy 1 )amino-l, 8-dimet.hy 1 imidazoCl,2-a)chinoxalinu, (sloučeniny vzorce 6) na nástup onemocnění v myším modelu collagenem vyvolané artritidy

Kolagenem vyvolaná artritida

Myšího modelu kolagenem vyvolané artritidy je v široké míře používáno ke studiu mechanismu a potenciálních terapií pro reumatoidní artritidu u lidí (Staines a kol. Br. J. Rheumatol. 33, str. 798 až 807, 1994; Feldmann a kol-, Annu. Rev. Immunol. 14, str. 397 až 440, 1996).

Samci myší DBA/lLacJ ve věku šesti až osmi týdnů (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se imuniziují subkutánně nultý a 21. den použitím 100 g hovězího kolagenu typu II ve 0,1 ml činidla RIBI Adjuvant System (RAS) s inonofosforylovýiu lipidem A (RIBI Immuno Chem. Research, Hamilton, MT). V tomto modelu se nástup onemocnění objevuje během jednoho týdne po druhé injekc i ko1agenu.

Při ošetřování v preventivním modelu se sloučeniny podávají denně ode dne nultého do 41 dne. Na obr. 1 je graf procenta myší v každé ošetřované skupině (6 až 10 živočichů ve skupině), které vykazují známky onemocnění nezávisle na závažnosti. Výsledkem podávání 4-(2 -aminoethy1)amino-l,8-dimethy1imidazod,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6) ve množství 100 mg/kg je významný rozdíl nemoci ve srovnání s podáním samotného nos i če.

V ustaveném (terapeutickém) způsobu se začalo s podáváním • · ··»·

•4 4··· • · · · « · · · • · · · »1 ·· testovaných sloučenin pouze když zanícení tlapky zvířete dosáhlo hodnotícího stupně 2 (jak definováno dále), přičemž byl živočich nahodile zařazen do ošetřované skupiny. Léčení pokračovalo denně u všech 4 tlapek jak uvedeno dále.

Po 21- dni se myši pravidelně monitorují z hlediska vývoje a závažnosti zánětu tlapek. Každá tlapka se vizuálně hodnotí podle následujícího klinického posuzovacího schéma uvedeného v tabulce IV.

Tabulka IV

Skoré

Popis normalni jeden nebo (několik) zanícených spojů na prstech plantární povrch tlapky zanícený a tloušťka tlapky zvětšená ankylosis (významně snížená pohyblivost horní spojky na ohyb/rozšíření)

Klinické skoré u všech čtyř tlapek se sumarizují pro každou myš a průměr ± střední směrodatná odchylka (SD) se vypočte pro každou ošetřovanou skupinu. Výskyt onemocnění je definován jako procento živočichů v ošetřované skupině, kteří vykazují jakoukoli známku onemocnění nezávisle na závažnosti.

Histologické posouzení zahrnuje histologické vyhodnocení a zařazení do skupin semikvantitativně tibiotarsálních spojů usmrcených myší, specificky zkoumání závažnosti zánětu, synoviální hyperplasie, resorpce kosti a kartilážovou erozi. Kumulativní posudky artritisového poškození pro každou skupinu se porovnají neparanetrickou Kruskal-Val1isovou analysou variance.

Na obr. 2 je průměrné celkové klinické vyhodnocení pro

9999 • · 9999 9999 • 99 9 99 9 99 99 «9 99 všechny myši v každém ošetřování kolagenem vyvolané artritidy myšího modelu kontrolovaném každého dne studie. Testovaná sloučenina se podává jednou denně v preventivním dávkování. Tabulka V ukazuje histologické vyhodnocení účinku4-(2 -aminoethy1)amino-l,8-dimethylimidazoC1,2-a)chinoxalinu, (sloučeniny vzorce 6) na skoré kumulativního poškození artritidou ± směrrdatná odchylka (sem) po usmrcení myší na konci studie myšího modelu kolagenem vyvolané artritidy. Výsledkem podávání 4-(2 aminoethy1)amino-l,8-dimethy1imidazo(1,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6) ve množství 30 a 100 mg/kg je histologicky kumulativní poškození artritidou 0,4 a O, což je paralelou výsledků vyznačených na obr. 2

Preventivní způsob

Tabulka V

Ošetření	Kumulativní poškození ai ( + sem)	skoré rtritidou	Statistická významnost
nosič (voda)		4,4±1,5
sloučenina 6,	10 mg/kg,p-o.	5,3+1,7
sloučenina 6,	30 mg/kg,p.o.	0,4+0,4	P=0,02
sloučenina 6,	100 mg/kg p.o.	0,0	P=0,004

x vs skupina ošetřená nosičem

Na obr. 3 jsou znázorněny účinky 4-(2 -aminoethyl)amino1,8-dimethy1imidazod,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6) podávané v ustáleném stavu onemocnění (po nástupu onemocnění) na průměrné gross klinické skoré pro všechny myši v každém ošetřování v myším modelu kolagenem vyvolané artritidy zjištěné ve dnech následujících po nástupu onemocnění4 4 ♦ * · 4 • ♦ • ··· ♦ 4 4··

Tabulka VI ukauje histologické vyhodnocení účinku 4-(2 aminoethy1)amino-l,8-dimethylimidazoC1,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6) na kumulativní skoře poškození artritidou v ustáleném stavu nemoci myšího modelu kolagenem vyvolané artritidy dva týdny po nástupu onemocnění.

Ustálený stav

Tabulka VI

Ošetření Kumulativní skoré Statistická významnost* poškození artritis (+ sem)

nosič (voda)		7,0±0,5
sloučenina	6,	10 mg/kg,p.o.	4,2,±1,0	P= 0,02
s1oučen i na	6,	30 mg/kg,p.o.	2,l±0,9	P=0,004
sloučenina	6,	100 mg/kg p.o.	0,9±0,5	P=0,001

* vs skupina ošetřená nosičem

Myší model kolagenem vyvolané artritidy zahrnuje mnohé biochemické a patologické mechanismy, jako je tomu u rheumatoidní artritidy u lidí, a používá se ho k prevenci a léčení artritidy podáním 4-(2 -aminoethy1)amino-l,8-dimethylimidazo(1,2-a)chinoxalinu, (sloučeniny vzorce 6). Obr. 1 a 2 a tabulka V ukazují, že denní podávání 30 mg/kg (p.o) sloučeniny vzorce 6 zabraňuje nástupu onemocnění a podávání 100 mg/kg (p. o.) sloučeniny vzorce 6 zabraňuje preventivně jakémukoli nástupu onemocnění. Podává-li se inhibitor IKK po nástupu onemocnění (tedy v ustáleném stavu léčby), ukazuje obr. 3 a tabulka VI, že podávání 30 mg/kg (p.o.) sloučeniny vzorce 6 významně inhibuje progresi nemoci ve srování s živočichy ošetřovanými nosičem, zatímco dávka 100 mg/kg (p.o.) sloučeniny • · ··· · • · « « ♦ · ·« ♦ · · · • ·♦· 9 t 9 9 9 ♦ ·«·« · » · « ·♦····· ·· · · ·« ·· vzorce 6 skutečně vede k významnému narušení nemoci. Tyto výsledky dokládají přednosti vynálezu při zánětlivých nemocech nebo poruchách, jako je rheumatoidní artritida, kterých se dosahuje preventivním bráněním nebo zmirňováním inhibici aktivity IKK podle vynálezu.

Příklad 6

Vliv inhibitoru IKK (4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-di-methy1inidazod,2-a)ehinoxalinu) (sloučeniny vzorce 6) na nástup onemocnění v myším modelu zánětlivého onemocnění střev vyvolaného dextransulfátem sodným

Myší model zánětlivého onemocnění střev vyvolaného dextransulfátem sodným

Kollitida, vyvolaná dextransulfátem sodným (DSS) u myší, vykazuje podobné nebo stejné pathologické mechanismy zánětlivého onemocněni střev (IBD), jaké jsou pozorovány u lidí a používá se ke studovánmí různých způsobů léčení (Okayasu a kol., Gastroenterology 98, str. 694 až 702, 1990; ftxelsson a kol., Aliment. Pharmacol. Ther. 12, str. 925 až 934, 1998). Myších modelů se používá jako předvídačů IBD u lidí a k vyvinutí účinných způsobů léčení lidí.

V tomto modelu se myším Swissa-Vebster (8-týdennín, pět myší ve skupině) podává v pitné vodě 6¾ DSS během 7 po sobě následujících dnů k vyvinutí zánětu střev. Testované sloučeniny se podávají denně během celé studie. Devátého dne se myši usmrtí a střeva se vyjmou ke klinickému a histologickému vyšetřen i .

Klinické odstupňování se stanoví hrubým klinickým vyhodnocením poškození do stupnice od O (normální) do 3 (závažné), jak uvedeno v tabulce VII

Tabulka VII ·· 9··♦ ·· ·* »· **· · · · 9 «9 • ··· 999« · 9 • 9 · · 99 999 9 • · · · 9 9 · 9 •999999 99 ·· «9 ♦ ···

Stupeň Popis normální poměrně normální délka tlustého střeva, mírné zvětšení tloušťky tkáně zkrácená délka tlustého střeva, tloušťka po celé délce tlustého střeva se ztrátou striaeí. Několik zarudlých míst podstatné zkrácení s velmi tlustou tkání obsahující vystupující léze

Pro histologické zatřídění byly řezy střev odstupňovány podle závažnosti crypt poškození a stupně zánětu. Podrobně je crypt poškození odstupňováno v tabulce VIII, kde crypt je částí glandulární úpravy tlustého střeva.

Tabulka VIII

Stupeň Popis

O normální nedotčený crypt ztráta basi láru-jedné třetiny cryptu ztráta basiláru-dvě třetiny cryptu ztráta celého cryptu s intaktním povrchem epithelu ztráta celého cryptu s epitheliální erozí

Účast, tkáně je odstupňována v tabulce IX. Veškeré znaky poškození cryptu nebo zanícení, nezávisle na závažnosti tvoří účast tkáně.

• A

Tabulka IX

AA AAAA • A • AAA • A · ·

A AAA

AA Α·ΑΑ A A

A A A A AA AA

Stupeň Popis bez účasti účast 1-25 %

účast	26	až	50%
účast	51	až	75 %
účast	76	až	100 %

Histologické záříděni poškození je definováno jako součin stupně poškození cryptu a stupně začlenění tkáně. Zatřídění závažnoasti zánětu je v tabulce X.

Tabulka X

Stupeň	Pop i s
0	normální.	nevýrazné
1	minimální
3	střední
4	mírné
5	závažné

Histologické zatřídění zánětu je součinem závažnosti stupně zánětu a stupně rozsahu účasti tkáně. Zatřídění poškození cryptu a zatřídění zánětlivost-i se provádí na každém řezu tlustého střeva a pro každý rez se určí střední zatřídění a standardní ochylka. Stanoví se kumulativní poškození cryptu a zatřídění zánětlivosti pro každou skupinu. Tabulka XI udává klinické zatřídění tlustých střev myší s kolitidou vyvolanou DSS. Výsledky v tabulce XII udávají kumulativní poškození a zatřídění zánětlivosti tlustých střev myší s kolitidou vyvolanou DSS.

9*9 9 • 9

999

9 > 9 9

9 9

99

Tabulka XI

Ošetření Střední klinické zatřídění

neošetřeno		2,50 ± 0,45
sloučenina 6,	30 mg/kg,p.o.	1,10 ± 0,49x
sloučenina 6,	100 mg/kg p.o.	1,00 + 0,35x
χ Statistická	významnost vůči neošetřené skupině, P<0,05
Tabulka XII
Ošetřen í	Hist-ologické zatřídění Histologické zatřídění
	skupiny se středním	skupiny se středním
	poškozením	zánícením
neošetřeno	8,52 ± 0,81	12,33 + 0,40
sloučenina 6,	4,83 ± 0,55x	7,58 + 0,81x
30 mg/kg,p.o.
sloučenina 6,	5,66 ± 0,86x	6,82 ± 0,85x
100 mg/kg p.o.

* Statistická významnost vůči neošetřené skupině, P<0,05

Výsledky ukazují, že 4-(2 -aminoethy1)amino-l,8-di-methylimidazod ,2-a)chinoxal in, (sloučenina vzorce 6) preventivně působí a léčí IBD v dobře ustáleném myším modelu zánětlivého onemocnění střev (IBD) u lidí. Tabulky XI a XII ukazují při denním podávání inhibitoru IKK (sloučeniny vzorce 6) se pozoruje statisticky významný pokles klinického a histologického zatřídění v porovnání s neošetřenými hlodavci- Takové výsledky dokládají výhody poskytované vynálezem při inhibici enzymu IKK pří prevencivně a/zmírfíování zánětlivých nemocí nebo poruch, jako je IBI).

φφ φφφφ φφ φφ * * φφφφ φφ φφφφ φ φφφ φ φ • φφφ ΦΦΦΦΦ· • ····»·· ··« φφφ φφ φφ ·« ·· ΦΦ·· φ

• φ

φφ

Příklad 7

Účinek inhibitoru 4-(2 -aminoethyl)amino~l,8-di-methy1imidazo(1,2-a)chinoxalinu na nástup onemocnění v myším modelu ovalbuminem vyvolané infiltrace zánětlivých buněk do plic senzitizovaných myší

Infiltrace zánětlivých buněk do plic ovalbuminem ovlivněných myší

Zánět plic s infiltrací eosinofilfl a jiných zánětlivých buněk je charakteristickým znakem astma a ostatních alergických respiračních poruch. Ke zjištění, zda inhibitor IKK je účinný při léčení respiračních poruch in vivo, které trápí mnoho pacientů, se podávaly testované sloučeniny v myším modelu plicního zánětu podobně jako popsal Kung a kol. (Kung T.T. a kol., Int. Arch. Allergy Iminunol. 105, str. 83 až 90, 1994).

U myšího modelu zánětu plic se sensitizovaly myši BALB/c intraperitoneální injekcí 0,1 ml na oxidu hlinitém vysráženém antigenů obsahujícím 40 pg ovalbuminu adsorbovaného na gelu hydroxidu hlinitého v nultém, 10. a 14. dnu dostaly myši intranasální dávku 100 jjg ovalbuminu v 50 μΐ solankly (PBS). Myši byly injektovány intraperitoneálně antigenem k jejich sensítizaci před intranasální výzvou k vyvolání zánětu plic. Testovaná sloučenina se podala 14- a 17 dne. Osmnáctého dne byla shromážděna bronchoalveolární výplachová tekutina (BAL) BB k měření celkové zánětlivé infiltrace (eosinořily, monocyty, lymfocyty a neurofily). V tabulce XIII je vliv 4-(2 -aminoethyl )amino-l,8-di-methylimidazo(1,2-a)chinoxalinu (sloučeniny vzorce 6) na ovalbuminem vyvolanou infiltraci zánětlivých buněk do plic sensitizovaných myší po denním podávání sloučeniny.

Tabulka XIII

Testovaná sloučenina

Celek zánětlivých buněk v BAL

Statistická významnost vs. nosičové kontrola nosič (voda sloučenina 6

5,8xl0⁶ ±1,2xl0⁶ mg/kg, p.o. 2,8xl.0⁶ ±1,3xl0⁶ P=0,13 sloučenina 6, 100 mg/kg p.o. 2,2xl0⁶±0,3xl0⁶ P=0,02

Statistická významnost vs. neošetřená skupina, PC0.05

Ovalbuminem vyvolaná infiltrace zánětlivých buněk do plic myší poskytuje modelový systém pro zánět plic, zvláště pro astma a jiné alergické dýchací poruchy u lidí. Sloučenina vzorce 6 (4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-di-methylimidazo(1,2-a)chinoxalin se podává v myším modelu zánětu plic k léčení zánětu a s imunitou souvisejících stavů. Výsledky uvedené v tabulce XIII ukazují, že podávání sloučeniny vzorce 6 po ovalbuminové výzvě sens i t.izovaným myším vedlo ke statisticky významnému poklesu celkového počtu zánětlivých buněk v plicích, jak je zjištěno měřením broncholaveolárního výplachu v porovnání s neléčenými hlodavci. Tyto výsledky podporují přednosti poskytované tímto vynálezem, ve kterém zánětlivé nemoci nebo poruchy, jako je astma a chronická obstruktivní plicní porucha jsou zmírněny aktivitou inhibice IKK.

Příklad 8

Zkouška produkce THF-a

THP-1 (lidská monocytytická buněčná linie) získaná z ATCC se kultivuje v RPMI-1640 doplněném 10 % FBS, pyruvátem sodným, HEPES, 2-merkaptoethanolem, pěnici 11 lnem/streptomycinem. Do 96-dfilkové titrační destičky obsahující bulíky THP-1 (l,4xl0⁶/ ml, 2,5xl0^Ď buněk/dfilek) ve 180 μΐ RPMI-1640 se přidá 20 μΐ • 9 « 9 99

9 • 9·9 •9 9999 ·* 99 • 9 9 9 9 9 « • 9 99 9 · 9 • 9 9 999 9 9 • 9 9 9 9 «9 «

99 99 99 testované sloučeniny v 10% DMSO. Zpravidla se v testu požívá množství testované sloučeniny 0,1 až 100 μΜ. Po jedné hodině o

při teplotě 37 C se do každého důlku vnese 20 μΐ 1000 ng/ml 1ipopolysaeharidu (LPS od Salmonella typhosa, Sigma). Po dalších šesti hodinách na teplotě 37 C se supernatanty seberou po pětiminutovém odstřeďování destičky na získání pelety buněk. Množství TNFa v těchto supernatantech se měří pomocí ΤΝΓα-specifickým hodnocení ELISA (Pharmingen). Po odečtení množství TNF« v kontrole, která nebyla ošetřena LPS, se vypočte procento inhibice oproti kontrole ošetřené LPS, avšak bez přidání testované sloučeniny. Vypočtou se hodnoty IC50 z procenta inhibice při různých dávkách. V testu produkce TNF« se zjišťuje, že sloučenina vzorce 6 má hodnotu IC50 4 μΜ. Sloučeniny podle příkladů 12 až 19 vykazují hodnoty IC50 pod 9 μΜ, s výhodnými a výhodnějšími sloučeninami majícími IC50 pod 2 μΜ a 1 μΜ v této zkoušce.

Příklad 9

Degradace IkBa v buňkách THP-1 stimulovaná TNF<z

Stimulace TNF« monocyklických buněk THP-1 vede k proteolytické degradaci IkBa. Jak na IKK-závislá fosforyláce tak na ligáze závislá IkBa jsou nezbytnými kroky v TNFa stimulované cestě cílené IkB-α pro proteolytickou degradaci proteosomem.

Buňky THP-1 se suspendují v RPMI-1640 doplněném 10 % zárodečného hovězího séra předem inkubovaného po dobu 60 minut s testovaným činidlem, pak stimulovaným 15 minut s TNFa (100 ng/ml, R&D Systems). Celkové buněčné lysáty se frakcionují elektroforézou dodecylsulfátpolyaklrylamidu sodného následovanou Western blot analýzou. IkB-oc se detekuje polyklonální protilátkou od Santa Cruz (katalog #sc-4094) a reakčními činidly ECL (Amersham). Filmy se snímají systémem Kodak ID analýzy obrazu ke kvantifikování množství IkBa. Sloučeniny obecného »··* • · • ··»

9999

99

9 9

9 99

9 9 9

99 • · « · 99 99 vzorce I vykázaly až 100% inhibici TNF« vyvolané degradace IkBa v buňkách THP-1 při 10 μΜ. Ve zkoušce degradace IkBor měla sloučenina vzorce 6 hodnotu IC50 5 μΜ při měření THP-α vyvolané degradace IkEla v THP-1.

Příklad 10

LPS-vyvolané sérum TNFoc v myších

K měření aktivity proti TNF« závislé na NF-kB in vivo se podávají testované sloučeniny myším BALB/c následně vybuzeným Intravenozní dávkou E.coli LPS (lpg ve 100 μΐ fosfátem pufrované solance). Jednu hodinu po LPS se odebírá myším krev a měří se hladiny TNFoc v séru systémem EIA (R&D Systems). Inhibice se vypočítává z kontrolních živočichů, kteří dostali vybuzení LPS bez testované sloučeniny. Sloučeniny obecného vzorce I prokázaly inhibici hladin LPS-vy volaného sera TNFoc in vivo v rozsahu 30 až 65 % při 10 mg/kg p.o., v rozsahu přibližně 70 až 90% při 30 mg/kg p.o. a v rozsahu přibližně 90 % při 100 mg/kg p.o.. Sloučenina vzorce 6 prokázala inhibici LPS-vyvolané hladiny TNF v séru in vivo v rozsahu přibližně 27 až 63 % při 10 mg/kg p.o., v rozsahu přibližně 53 až 89% při 30 mg/kg p.o. a v rozsahu přibližně 83 až 92 % při 50 mg/kg p.o.

Testováné sloučeniny obecného vzorce I jsou aktivní jako inhibitory cesty TNFoc a NF-kB.

Příklad 11

Způsoby přípravy ve vztahu ke sloučeném obecného vzorce I

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu se připravují způsoby znázorněnými na následujících schématech I až V v tomto příkladu. Výchozí materiály jsou obchodně dostupné nebo se dají snadno připravit pracovníky v oboru a/nebo je mohou při44 44*4

4

444

4444 «· 44

4 4 4 4 4 4

4444 44 4 β 4 4 4 4 i 4

44 4 4 *4 4

44 44 44 pravit, pracovníci v oboru podle schémat I až V za použití známých metod.

Ve všech schématech mají sloučeniny a symboly R¹ , R² , R³ , a R⁴ shora popsaný význam pro sloučeninu obecného vzorce I, pokud není uvedeno jinak a výchozí látky zvolí pracovníci v oboru podle požadovaných významů symbolů R¹ , R² , R³ a R⁴. Skupiny označené R , rozpouštědla, teploty, tlaky a ostatní podmínky reakce mohou zvolit pracovníci v oboru. Například v těchto schématech mohou chlorační činidla zahrnovat oxychlorid fosforečný, katalytickými činidly mohou být kovy jako palladium a rozpouštědla mohou být volena ze souboru zahrnujícího 1,2-dichlorbenzen, methylenchlorid, DMF, THF, alkoholy, ethery, dloxan, acetonitril, vodu, směsi etherů a vody.

Zkratky

Pro snadnou orientaci se ve schématech a v příkladech používají zkratky, které mají následující význam:

Me	= methyl	ET	= ethy1
MeOH	= methanol	EtOH	= ethanol
i-PrOH	= isopropanol	Ph	= f eny1
Bz	= benzy1	DCM	= dichlormethan
DMF	= dimethy1formámid	DMSO	= dimethylsulfoxid
NaOH	= hydroxid sodný	TEA nebo Et3N= triethylamii
TFA	= kyselina trifluoroctová	THF	= tetrahydrofuran
K2CO3	= uhličitan draselný	Na2S2 O3	= thiosulfát sodný
min	= minuty	L	= li tr
ml	= mililitr	μΐ	= mikrolitr
0	= gram	mg	= míli gram
mol	= mol	mmol	= milimol
meq	= milí ekv i va1ent	RT	= teplota místnost
sat sat d = nasycený	aq	= vodný
TLC =	chromatografie v tenké	HPLC	= vysoce výkonná

- 68 ·· »»·· • « » • *»· • « • · «· ·* ·» .··· « » ♦ · · · · * » ·« » * ► * «· · « 4 « « » « » * 4 4 4 4 ·· ·» ·« 44 vrstvě

LC/MS = vysoce výkonná kapalná chromatograf ie/hmot.ová MS spektro-metr i e

NMR = jaderná magnetická mp rezonance kapalinová chromatograf ie hmotová spektrometrie teplota tání

Definice termínů použitých v reakčních schématech v příkladu

Následují definice pojmů použitých v popise a v re eakčních schématech.

Vytváření acetalu, ketalu, thioacetalu nebo thioketalu jsou procesy známé v oboru a jsou ipopsány v literatuře (například Protective Groups in Organic Synthesis, druhé vydání T.W. Green a P.G.W. Wuts. John Wiley & Sons, New York, 1991, kapitola 4 a odkazy)

Vytváření halogenidu kyseliny zahrnuje způsoby převádění karboxylové kyseliny na halogenid kyseliny. Například se taková reakce můžep provádět z použití thionylchloridu, oxalylchloridu nebo oxalylbromidu v přítomnosti DMF v DCM za použití chloridu nebo bromidu fosforitého.

Alkylace zahrnuje alkylační postupy, jako je alkylace alkoholové nebo ketonové skupiny zpracováním organickou nebo anorganickou zásadou ve vhodném rozpouštědle, následovanou adicí alkylačního činidla jako alkylhalogenid, allylhalogenid nebo benzylhalogenid, mesylát nebo tosylát na získání enolátu, fenolátu nebo thiofenolátu.

Aromatická substituce zahrnuje všchny metody aromatické substituce známé v oboru, včetně nukleofilní substituce aromatických halogenidů vodou v přítomnosti kyseliny sírové nebo řvQ ~ ··♦· ·· ·* ·· ···· s **<··· * • ··· · · ·♦ · · * • ··*·····» · • * «··« ··«· l««< ··· «« «> ·» ·« trifluoroctové, nebo alkoxidy, aryl oxidy, t-hioalkoxidy nebo thíoary1oxidy v inertním organickém rozpouštědle. K podpoření reakce ary1halogenidfi alkoxidy může být použito solí mědi a k podpoření reakce s thiooalkoxidy může být použitoo solí PdCO).

Aromatická halogenace“ zahrnuje adici chloru, bromu nebo jodu do aromatického kruhu případně v přítomnosti katalyzátoru například železa nebo Lewisovy kyseliny. Zahrnuje také reakci N-chloramidfi a N-bromamidfi katalyzovanou přísadou kyselin. K jodizaci může být použito jodu se solemi mědi, s trifluormethansulfonátem stříbra, s thaliumacetátem nebo s oxidačním činidlem jako je kyselina dusičná, jodičná, oxid sírový nebo peroxid vodíku. Použít lze také monochloridu jodu.

Příčné zesítění” znamená způsoby kopulace známé pracovníkům v oboru. Takové způsoby zahrnují reakci vinylového nebo aromatického triflátu, bromidu nebo jodidu s cínem (reakce typu Stille), se zinkem, s hořčíkem nebo reakci s derivátem boronátu (reakce typu Suzuki) katalyžovaného palladiem(o), palladiemdl.), niklem (O) nebo niklem (II) jako katalyzátorem. Přidat lze také s výhodou jodid mědi, lithiy nebo zinku, nebo trifenylarsin, trls(2-fury1)fosfin nebo tris(2,4,G-trimethoxyfeny1)fosfin. Použije-li se derivátu kyseliny boru, provádí se reakce v přítomnosti anorganické zásady jako je fosforečnan nebo uhličitan draselný nebo uhličitan sodný. Zesítující kopulační reakce se provádějí v inertním organickém rozpouštědle.

Reakce Grignardového typu zahrnuje adici organokovové sloučeniny na karbony1-obsahující sloučeninu. Reakce zahrnuje přísadu Grignardova činidla, alkyllithia nebo aryllithia, sloučenin alkylzinku, alkylhliníku, organotitanu, organozirkonu nebo organocéru v inertním organickém rozpouštědle, jako je ethylesther, THF, DCM, bezen a toluen. Vytváření komplexu ketonu nebo Grgnardova činidla s halogenidy céru, s chloristáno70 ·· ···· ·· ·· ·· ···· • · · ···· ·· · • ··· · · ·· · · · • ········· · • · ···· ···· ···· ··» ·· »» «· ·· vými solemi nebo tetraalkylamoniumhalogenidy může být někdy výhodné ke zlepšemní adičních reakcí. Označení reakce Grignardova typu také zahrnuje adici Grignardova činidla na chlorid kyseliny, který nejdříve reagoval s tributylfosflnem k vytvoření odpovídající fosfoniové soli. Reakce se provádí v inertním organickém rozpouštědle.

”Hydrolýza zahrnuje hydrolyzu esterových a karbonylových chránících skupin. Například může být methylester nebo ethylester rozrušen vodným roztokem alkoxidíl sodných nebo draselných v THF nebo EtOH. Hydrolýza terč-butylesterů se s výhodou provádí za kyselých podmínek jako v prostředí 90¾ kyseliny trifluoroctové nebo 6N roztoku kyseliny chlorovodíkové v rozpouštědlech, jako je THF nebo DCM. ftlkylestery se mohou rozrušit v přítomnosti katalyzátorů Pd<0) v anorganickém rozpouštědle. Silylestery jako je trimethylsilylester se mohou štěpit tetrabutylamoniumfluoridem v THF. Hydrolýzu ketalů a acetalů lze provádět za kyselých podmínek jako v přítomnosti IN kyseliny chlorovodíkové, 80¾ kyseliny octová nebo p-toluensulfonové v rozpouštědlech, jako je THF nebo aceton.

Tvoření iminu je proces v oboru známý. Například keton může reagovat s aminem v přítomností kyseliny s vysoušecím činidlem nebo bez něho. Použít lze různých anorganických nebo organických kyselin, jako jsou například chlorid zinečnatý, titáničitý, kyselina chlorovodíková, sírová, trif1uoroctová, octová, p-toluensulfonová, v rozpouštědlech jako je DCM, EtOH, benzen, toluen, THF a DHF.

• · · · · ·

Schéma I

Benzoimidazochinoxal iny

4b 5b

Benzoimidazochinoxaliny obecného vzorce Ia (kde znamená Y¹v obecném vzorci I atom dusíku, X znamená skupinu CR¹ a R¹ atom vodíku) se připraví jak uvedeno shora. Substituované 2,3-diaminonaftaleny obecného vzorce 1 se nechají reagovat například s diethyloxalátem nebo oxalylchloridem za získání chinoxalindionfi obecného vzorce 2. Diony obecného vzorce 2 se nechají reagovat za získání dichloridfl obecného vzorce 3. Dichloridy obecného vzorce 3 se nechají reagovat s aminovými činidly zahrnujícími aminoacetaldehydacetal a vhodný primární βίαιη CR²-NH2) a cyklizují se, přičemž poradí reakcí může být nastaveno v závislosti na reaktivitě atomu chloru.

Například dichloridy obecného vzorce 3 mohou napřed reagovat s aminoacetaldehydacetalem k získání aminochlorderivátů obecného vzorce 4a. ftminochlorderiváty obecného vzorce 4a mof z • · · · · · • ·

9 99

hou být. cyklizovány na ch 1 orbenzoim i dazoch i noxa 1 i n obecného vzorce 5a, který může pak reagovat s různými primárnímui aminy CR²-NH2> na sloučeniny obecného vzorce Ia.

Alternativně jestliže má nežádoucí atom chloru větší reaktivitu (například díky substituci R³ a R^-4) k adici aminových reakčních činidel může být reversován, jak patrno ze sloučenin obecného vzorce 4b a 5b. Dichlorid obecného vzorce 3 se nechá reagovat s primárními aminy (R²-NH2> na aminochlorderiváty o<3.

becného vzorce 4b, které pak mohou rěgovat s aminoaceta1dehydaceta lem na diaminosloučeniny obecného vzorce 5b, které se cyklizují na sloučeninu obecného vzorce Ia.

Příkladně zahrnují aminoaceta1dehydacetaly aminoacetaldehyd, dimethy1aceta1 nebo aminoactea1dehyd, diethylacetal. Cyklizace se provádí obvykle za kyselých podmínek.

Schéma II

1-substi tuované benzo-i m i dazoch i noxa1 i ny

Ri

V poloze 1 substituovaný benzoimidazo(1,2-a)chinoxalin obecného vzorce Ib (kde znamená Y¹ v obecném vzorci I atom dusíku, X skupinu CR¹ a R¹ substituovanou nižší alkylovou skupinu) se může připravovat podle schéma II. Dichlorové sloučeniny obecného vzorce 3 se připravují způsobem podle schéma I a reakcí se substituovanými propargy1aminy (R¹-C=C-CH2-NH2) ζθ získání aminechlorovaného derivátu obecného vzorce 6a, který se eyklizuje za získání v poloze 1 substituovaného chlorbenzo73 imidazoimidazochinoxalinu obecného vzorce 7. Vhodné primární aminy se nechávají reagovat se seloučeninou obecného vzorce 7 za získání sloučeniny obecného vzorce Ib.

Nebo se může nastavit reakce, přičemž dichlorované sloučeniny obecného vzorce 3 se nejdříve nechávají reagovat se vhodnými primárními aminy za získání derivátů obecného vzorce 4b, které se cyklizují shora popsaným způsobem za zísmání sloučeniny obecného vzorce IbSchéma III

Benzopyrazolochinoxaliny

Ic • · ··· ·

Benzopyrazolochinazoliny obecného vzorce Ic (přičemž znamená Y² v obecném vzorci I atom dusíku, X skupinu CHR¹ a R¹ má shora uvedený význam) se mohou připravovat způsobem podle schéma III. Sloučeniny obecného vzorce 8c a 9c se kondenzují v přítomnosti katalyzátoru reakcí Stillova typu za získání kopulovaného produktu obecného vzorce 10, který se hydrolyzuje za získání sloučeniny obecného vzorce 11. Zpracováním sloučeniny obecného vzorce 11 například difenylfosforylazidera a následným zahříváním se získá jako meziprodukt isokyanát obecného vzorce lib, který spontánně cyklizuje za reakčních podmínek za získání sloučeniny obecného vzorce 12. Zpracováním sloučeniny obecného vzorce 12 chloračním činidlem se získá chlorovaná sloučenina obecného vzorce 13, která se nechává reagovat se vhodnými primárními aminy (R²-NH2) za získání sloučeniny obecného vzorce Ic.

Schéma lila

Sloučeninai obecného vzorce 8 a 9 podle schéma III se může připravovat způsobem podle schéma III. Substituované 3-amino-2-naftoové kyseliny obecného vzorce 8a se mohou převádět na substituované 3-jod-2-naftoové kyseliny obecného vzorce 8b například diazotací následovanou zpracováním jodidovou solí.

• ·

Esterifikací sloučeniny obecného vzorce 8b se získají estery 3-jod-2-naftoové kyseliny obecného vzorce 8. V poloze 4 substituované pyrazoly obecného vzorce 9a se mohou zpracovávat p-toluensulfonačním činidlem, například p-toluensulfonylchloridem za získání p-toluensulfonamidu obecného vzorce 9b. Deprotonací sloučeniny obecného vzorce 9b silnou zásadou, například terc-butyl1 ithiera, a zpracováním sloučeninou cínu, například trimethylehlorciničitaném, se získá sloučenina obecného vzorce 9.

Schéma IV

Benzoimidazochinoliny obecného vzorce Id (přičemž znamená X v obecném vzorci I skupinu NR¹ a R¹ methylovou skupinu) se připravují způsobem podle schéma IV. Substituované estery 3-jod-2-naftoové kyseliny obecného vzorce 8, připravené způso« · · · • · · ·

bem podle schéma lila, se převádějí na deriváty bóru obecného vzorce 14 za použití ktalyzátoru a jako reakčního Činidla například bis(pinakolát)diboronu. Kondenzací sloučeniny obecného vzorce 14 s 1-methyl-5-bromimidazolem v přítomnosti katalyzátoru reakcí typu Suzuki se získá kopulovaný ester obecného vzorce 15. Ester obecného vzorce 15 se hydrolyzuje za získání kyseliny obecného vzorce 16, která se převádí zpracováním difenylfosforylazidem (přes isokyanátový meziprodukt - jako sloučenina obecného vzorce 11b) a s terč-butanolem na chráněný amin obecného vzorce 17. Zpracování kyselinou převádí sloučeninu obecného vzorce 17 na volný amin obecného vzorce 1.8, který se zhařívá ve vysokovroucím inertním rozpouštdle, jako je 1,2-dichlorbenzen, s karbonyldiimidazolem za získání cyklizovaného produktu obecného vzorce 19. Zpracování chloračním činidlem převádí sloučeninu obecného vzorce 19 na chlorovaný drivát obecného vzorce 20, který se mflže převádět zpracováním vhodným primárním aminem (R²-NH2) na sloučeniny obecného vzorce Id.

Schéma V

Benzolglth i azolo[4,5-c]chi no1 iny

• · · ·

Benzothiazolochinoliny se mohou připravovat způsobem podle schéma V. Ester substituované 3-boronáto-2-naftoové kyseliny obecného vzorce 14 se kondenzuje s 5-brorathiazolem v reakci typu Suzuki kata1yzovanou kovem, jako je palladium, za získání sloučeniny obecného vzorce 21. Ester obecného vzorce 21 se hydrolyzuje za o sobě známých podmínek za získání kyseliny obecného vzorce 22, která se pak převádí zpracováním difeny1fosforylazidem (přes isokyanátový meziprodukt podobně jako v případě sloučeniny obecného vzorce 11b) a terč-butanolem na chráněný amin obecného vzorce 23. Zpracováním kyselinou se může převádět sloučenina obecného vzorce 23 na volný amin obecného vzorce 24, který se zharívá ve vysokovroucím inertním rozpouštědle, jako je 1,2-dichlorbenzen, s karbonyldiimidazolem a poskytuje cyklizovaný produkt obecného vzorce 25. Sloučenina obecného vzorce 25 se může převádět na chlorovaný derivát obecného vzorce 26 zpracováním chloračním činidlem a sloučenina obecného vzorce 26 se převádí zpracováním vhodnými primárními aminy (R²-NH2) na sloučeninu obecného vzorce Ie.

Následující příklady objasňují provádění vynálezu, nejsou však míněny jako jakákoliv jeho omezení. Reakční činidla a výchozí sloučeniny podle přípravu 1 až 19 jsou užitečné pro přípravu sloučenin obecného vzorce I. nebo jejich solí, jak je objasněno schématy I až V. V následujících přípravách se reakce v nepřítomnosti vody provádějí v prostředí dusíku nebo argonu za použití obchodně dostupných suchých rozpouštědel nebo čerstvě destilovaných rozpouštědel. Teploty tání se stanovují v otevřené kapilární trubici za použití zařízení Thomas-Hoover pro stanovení teploty tání. Sloupcová chromatografie se prová78 • * ♦999

9

99 99 9999 ♦ · 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • · 9999 9999

999999 99 99 99 99 dí za použití silikagelu 60 EM Science (o velikosti částic přibližně 37 až 61 μπ, 230 až 400 mesh) s určeným rozpouštědlovým systémem jako elučním činidlem. Chromatogryfie v tenké vrstvě se provádí za použití destiček E. Merck silikagel 60 E254 (0,5 mm). Stanovení čistoty chromatografií HPLC se provádí buď za použtií HP 1090 DR5 s diodovým detektorem a se sloupcem Waters Nova-Pak C18 (3,9 x 150 mm) nebo za použití Shimadzu LC-10AS s SPD-10AV UV-Vis detektorem a s jedním z následujících sloupců; YMC Combiscreen ODS-A (4,6 x 50 mm); HP Zorvax SB-C18 (4,6 x 750 mm). Infračervená spektra a ¹H NMR spektra se zaznamenávají a chemické posuny se vyjadřují v dílech na milion (ppm nebo 6) s rozpouštědlem v použití jako vnitřního standardu. Kopu lační konstanty se uvádějí v Hertz a multiplety se označují následovně; singlet (s), dublet (d), triplet (t), kvartet (g), multiplet (m) a široý (br). Nízká rezoluční hmotová spektra se stanovují na spektrometru Finnigan Matt ZSQ-7000 (pozitivní/negativní ESI) pracujícím v negativním iontovém modu.

Přírava reakčních činidel a výchozích látek pro přípravu sloučenin obecného vzorce I

Příprava 1

1,4-Di hydrobenzolg]ch i noxalin-2,3-dion

H

Směs 2,3-diaminonaftalenu (2,87 g, 18,14 mmol) a diethyloxalátu (30 ml, 223 mmol) se udržuje na teplotě zpětného toku po dobu 14 hodin, ochladí se na teplotu místnosti a zfiltruje se. Zbytek se promyje ethanolem a usuší se ve vakuu, čímž se získá 1,4-dihydrobenzotg]chinoxa1in-2,3-dion v podobě hnědé ·· ···· • · • · · · • · ·· · pevné látky ¢3,15 g, 82¾ výtěžek) o teplotě tání vyšší než 350 o

c.

IR (KBr, cm’¹) 3045, 2942, 2869, 1716, 1642, 1406, 877;

¹H NMR CDMSO) 6 12,11 (s,2H), 7,84-7,81 (m,2H), 7,54 <s,2H),

7,39 (dd, J=6,3, 3,0, 2H);

LC/MS 92,5% <220 nm), m/z <M+H⁺) = 213.

Příprava 2

2,3-Dlchlorbenzolg]ch i noxa11n

Cl

Míchá se Cl g, 4,72 mmol) 1,4-dihydrobenzolglchinoxa1in-2,3-dionu ve 2 ml oxychloridu fosforečného po dobu pěti hodin za teploty zpětného toku. Směs se zkoncentruje odpařením a usuší se ve vysokém vakuu. Do zbytku se pečlivě přidá nasycený roztok uhličitanu draselného, pevná látka se odfiltruje a promyje se vodou, čímž se získá 2,3-dichlorbenzolg]chinoxa1in v podobě hnědé pevné látky (1,00 g, 85¾ výtěžek) o teplotě tání 239 až 242 C.

IR (KBr, cm-¹) 1200, 1109, 998, 886, 748;

¹H NMR (DMSO) S 8,78 (s,2H), 8,31-8,28 (m,2H), 7,75-7,73 (m,

2H) .

Příprava 3

2-Chlor-3-(propargylamino)benzolg]chinoxalin

·· ··* · ·· ···· • · • ···

9· ·· • · 1 * · ··

Směs 2,3-dichlorbenzotg]chinoxa1 inu <0,634 g, 2,55 mmol), propargylaminu <0,21 g, 3,05 mmol) a triethylaminu <0,53 ml, 3,83 mmol) v 15 ml dioxanu se zahřívá pod zpětným chladičem po dobu čtyř a půl hodin. Reakční směs se odpaří ve vakuu, surový produkt se chromatografuje (dichlormethan) a tak se získá 2-chlor-3-(propargylam ino)benzo[g]chinoxalin v podobě žluté pevné látky (0,496 g, 73¾ výtěžek) o teplotě tání 169 až 172 o

c.

IR (KBr, cm“¹) 3412, 3283, 3235, 1570, 1508, 1335;

!H NMR (DMSO) δ 8,44 <s,lH), 8,26 (s,2H), 8,16-8,06 (m,3H),

7,58-7,54 (rn.lH), 7,51-7,48 (m,lH), 4,28 (dd, J=6,1, 2,5, 2H), 3,12 (t, J=2,5, 1H);

LC/MS 97,8 % (220 nm), ra/z (M-+-H+) = 268.

Příprava 4

4-Chlor-1-methy1 benzolglimidazol1,2-a]ch inoxali n

2-Chlor-3-(propargylamino)benzolg]chinoxalin (0,42 g, 1,57 mmol) se zpracuje 4 ml kyseliny sírové a reakční směs se míchá při teplotě 80 C po dobu jedné hodiny, ochladí se na teplotu místnosti a vlije se do ledové vody. Směs se opatrně neutralizuje vodným roztokem hydroxidu sodného, zfiltruje se, promyje se vodou a usuší se ve vakuu, čímž se získá 4-chlor-l-methylbenzolg]imidazol1,2-a]chinoxalin v podobě béžové pevné látky (0,124 g, 30¾ výtěžek) o teplotě tání 221 až 223 C.

IR (KBr, cm“¹) 1538, 1479, 1456, 1398, 1101, 919;

NMR (DMSO) δ 8,79 <s,lH), 8,53 (s,lH), 8,23 (d, J=8,1, 1H),

8,13 (d, J=8,5, 1H), 7,69-7,59 (m,3H), 3,04 <s, 3H);

LC/MS 100 ¾ <220 nm), m/z (M+H*) 268.

φφφφ •Φ φφφφ φ φ φφφφ φ· φφ φφ » · φ · * φ

Φ ·Φ · Φ φ · φ φφφ φ • t? Φ φ φ φ φ φ φ φ φ

Příprava 5

3-Jod-2-naftoová kyselina

Do kádinky obsahující čistou 3-amino-2-naftoovou kyselinu (6,01 g, 80% čistoa, 25,69 mmol) se přidá roztok koncentrované kyseliny chlorovodíkové (10,0 ml) a voda (15,0 ml). Po vytvoření růžové pasty se směs míchá 17 minut, směs se ochladí na teplotu 0 C a zpracuje přidáváním po kapkách v průběhu osmi minut roztokem vody (10 ml) a dusitanu sodného (2,54 g, 36,81 mmol). Po jedné minutě se hnědá reakční směs zpracuje studeným (0 C) vodným (10 ml) rotokem jodidu draselného (10,0 g, 60,24 mmol) přidávaným po kapkách (v průběhu 12 minut). Chladicí lázeň se odstraní, přidá se voda (15 ml) a reakční směs se míchá po dobu 10 minut při teplotě místnosti a zahříváním se posléze o

udržuje na teplotě 95 C po dobu 65 minut. Reakční směs se zředí vodou (50 ml) a extrahuje se ethylacetátem (250 ml). Organická vrstva se promyje vodou (50 ml) a solankou, vysuší se síranem horečnatým, zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografi 1 (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidlo ethylacetát), čímž se získá

3-jod-2-naftoová kyselina v podobě jodově zbarvené načechrané pevné látky (přibližně 6,5 g).

¹H NMR (DMSO, δ = 2,50): 13,36 (br s,lH), 8,63 (s.lH), 8,37 (s, 1H), 8,05 (d, J=7,9, 111), 7,93 (d, J=8,0, 1H) , 7,67-7,60 (m,2H).

Příprava 6

Methy1-3-j od-2-naf toát

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • ftftft ft ft ftft · · · • ····«··«· ft • · ···· ftftftft • ftftft ftftft ftftftft ftft ftft

Do 3-jod-2-naftoová kyseliny (Příprava 5) (6,50 g) se přidá methanol (100 ml) a koncentrovaná kyselina sírová (2 ml) a získaná heterogenní směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 13 hodin. Reakční směs se nechá vychladnout na teplotu místnosti, neutralizuje se hydrogenuhličitaném sodným (6,0 g) a těkavý podíl se odstraní ve vakuu. Zbytek se rozdělí mezi vodu (50 ml) a ethylacetát (300 ml). Organická vrstva se promyje roztokem thiosíranu sodného (4,2 g + 50 ml vody) a solankou, vysuší se (síranem hořečnatým), zflitruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografli (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidlo systém 10 % ethylacetátu/hexany), čímž se získá methy1-3-jod-2-naftoát v podobě světle žluté látky (5,50 g, ze dvou stupňů je kombinovaný výtěžek 69¾).

!H NMR (DMSO, 5 = 2,50)·· 8,66 (s,lH), 8,39 (s,lH), 8,06 (d,

J=8,0, 1H), 7,95 (d, J=8,0, 1H), 7,69-7,62 (m,2H), 3,91 (s,3H) (DC1) m/z (M+H⁺) = 313,0

Analýza pro C12H9JO2 vypočteno: C 46,18 H 2,91, nalezeno: C 46,28 H 2,85

Příprava 7

4-Methy 1 -1- (4-t.ol uensulf ony 1 )pyrazol

Přidá se p-TsCl (9,81 g, 51,46 mmol) po částech v průběhu několika minut do d ich 1 ormethanového roztoku (100 ml) 4-rnet• 44 4

4444 • 4 • 4 44 » 4 · · 4 4

I · 44 «44

I 4 4 4 4 4 4 4 » · 4 4 · 4 4 4

44 «4 4« hylpyrazolu (4,00 g, 48,72 mmol) a pyridinu (6 ml,74,18 mmol). Reakční směs se míchá po dobil 95 minut, zředí se dichlormethanem (250 ml) a promyje se roztokem hydrogenuhličitanu sodného [směs nasyxceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (20 ml) a vody (40 ml)] a vodou (60 ml). Organická vrstva se vysuší (síranem hořečnatým), zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidlo dichlormethan), čímž se získá 4-methy1-1-(4-to1uensulfony1)pyrazol v podobě bílé pevné látky (10,88 g, 95% výtěžek).

!H NMR (CDC1₃, δ = 7,26): 7,87 (d, J=8,4, 2H), 7,84 (s,lH),

7,54 (s,lH), 7,32 (d, J=8,40, 2H), 2,41 (s,3H), 2,06 (s, 3H). (ESI) m/z (M-+H+) = 236,7

Analýza pro C11H12N2O2S vypočteno: C 55,91 H 5,12 N 11,86 nalezeno: C 55,81 H 4,94 N 11,76

Příprava 8

4-Methy1-1-(4-to1uensu1fony 1)-5-trimethy1stanný1pyrazo1

Přidá se terc-butyl1 ithi um (1,7 M/pentan) v průběhu deseo ti minut do studené (-78 C) tetrahydrofuranové (60 ml) semisupepenze 4-methy1-1-(4-toluensu1fony1)pyrazolu (Příprava 7) (6,01 g, 25,43 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 10 minut a zpracuje se po kapkách (v průběhu 20 minut) sloučeninou MesSnCl (28 ml 1,0M/tetrahydrofuran, 28,0 mmol). Získaná směs se míchá po dobu 4,3 hodin, přičemž se lázeň nechá ohřát na o

teplotu -55 C a pak po dobu 70 minut při teplotě místnosti. Reakční směs se zředí ethylacetátem (250 ml), promyje se vodou ♦· «·«· • · • ··· ·· • ί · · « * * · · · · • · ·· · · · • · · · 4 « · · • · · · · « « « ·· ·9 ·· ·9 • 4· · (50 inl) a solankou, vysuší (síranem horečnatým), zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidlo systém 15 až 20 % ethylacetátu/hexany), čímž se získá 4methy1-1-(4-toluensu1fony1)-5-trimethy1stanný1pyrazol v podobě husté bílé pevné látky (4,406 g, 43% výtěžek). Nespotřebovaný parazol z Přípravy 7 se rovněž získá (1,954 g, 33% výtěžek).

Ml NMR (DMSO, δ = 2,50): 7,74 (s.lH), 7,70 (d, J=8,3, 2H),

7,45 (d, J=8,3, 2H), 2,38 (s,3H), 2,08 (s,3H, satelitní píky v důsledku Sn-H s J=4,5), 0,45 (s, 9H, satelitní píky v důsledku Sn-H s J=59,8 a 57,3).

(ESI) m/z (M+H⁺) = 400,9.

Příprava 9

Methyl-3-(4-methy1-1-(4-toluensulfony 1)pyrazol-5-yl)-2-naf toát

Dimethy lf ormamid (26,0 inl) se přidá do směsi methy 1-3-jod-2-naftoátu (Příprava 6) (2,017 g, 6,463 mmol) 4-methyl-l-(4-toluensulfony1)-5-tr imethy1stanný1pyrazolu (Příprava 8) (2,895 g, 7,254 mmol), Pd2dba3 (236 mg, 0,258 mmol), Ph3As (317,2 mg, 1,036 mmol) a jodidu měďného (130,7 mg, 0,686 mmol). Heterogenní směsí se nechává několik minut probublávat dusík, reakční směs se míchá po dobu sedmi minut při teplotě o

místnosti a po dobu 12 hodin při teplotě 90 C. Těkavé podíly se odstraní ve vakuu a zbylý viskózní zbytek se podrobí bleskové chromatografií (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidlo systém 0 až 10 % ethylacetátu/dichlormethan), čímž se získá methyl-3-(4-methyl-1-(4-toluensulfony1)pyrazol-5-y1)-2-naftoát v podobě žluté pevné látky (1,485 g, 55% výtěžek).

AAAA

AA AAAA • A AAAA

AA AA ¹H NMR (DMSO, S = 2,50): 8,73 (s,lH), 8,23 (d, J=7,7, 1H),

8,05 (d, J=7,7, 1H), 7,83 (s,lH), 7,81 (s,lH), 7,77-7,71 (m,

2H), 7,50 (d, J=8,2, 2H), 7,38 (d, J=8,2, 2H), 3,66 (s, 3H),

2,38 (s,3H), 1,77 (s,3H) (ESI) m/z (M+H⁺) = 421,0.

Příprava 10

3-(4-Methy 1 pyrazol-5-y 1 ) -2-naf toová kysel ina

Tetrahydrofuran (12 ral), methanol (8,0 ml) a roztok hydroxidu sodného (7,5 ml Ι,ΟΝ/voda) se přidá do methy1-3-(4-methy1-1-(4-toluensulfony1)pyrazol-5-y1)-2-naftoátu (Příprava 9) (1,240 g, 2,949 mmol) a reakční směs se zahříváním udržuje na o

teplotě 80 C po dobu 4,2 hodin. Reakční směs se zředí vodou (20 ml), okyselí se na hodnotu pH přibližně 4,5 IN kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje se ethylacetátem (75 ml, 2x). Spojené organické vrstvy se promyjí solankou, vysuší se (síranem hořečnatým) zfiltrují se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografi i (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidlo systém 10 % methanolu/ dichlormethan), čímž se získá 3-(4-methylpyrazol-5-y1)-2-naftoová kyselina v podobě slabě žluté pevné látky (300 mg, 40% výtěžek).

¹H NMR (DMSO, 6 = 2,50; pozoruje se jeden taut-omer): 12,7 (br s,2H), 8,37 (s,lH), 8,08 (d, J=7,9, 1H),

8,01 (d, J=8,0, 1H), 7,93 (s,lH), 7,65-7,58 (m,2H), 7,47 (s,

1H), 2,01 (s, 3H).

(ESI) m/z (M+H⁺) = 252,99.

4 44*4 • 4 «444 • 4 • 4 «4 » 4 4 4

44

Příprava 11

1-Methy1benzo[ g])pyrazolo!1,5-clchi nazoli n-5-on

Triethylamin (300 pl, 2,152 mmol) a (Ph0)2P0N3 (440 pl, 2,064 mmol) se vnese do benzenové (10 ml) suspenze 3-(4-methy 1 pyrazol -5-y 1 )-2-naf toové kyseliny (Příprava 10), (257 g,

1,019 mmol) a reakční směs se zahříváním udržuje na teplotě 50 o

C po dobu dvou hodin. Těkavé složky se odstraní ve vakuu a zbylá žlutá pevná látka se rozpustí v o-dichlorbenzenu (8,0 o

ml) a směs se zahříváním udržuje na teplotě 150 C po dobu čtyř hodin. V průběhu dalšího zahřívání se postupně vyvíjí plyn za současného vytváření suspenze. Reakční směs se nechá vychladnout na teplotu místnosti, sraženina se odfiltruje a promyje hojně etherem, čímž se získá 1-methylbenzolg])pyrazoloí1,5-e]chinazolin-5-on v podobě načechrané světle žluté pevné látky (170,8 mg, 67% výtěžek).

!H NMR (DMSO, 6 = 2,50)'- 11,86 (s,lH), 8,57 (s.lH), 8,13 (d,J= 8,2, 1H), 7,99 (s,lH), 7,92 (d, J=8,3, 1H), 7,22 (s.lH), 7,56 (app t, J=7,21, 1H), 7,49 (app t, J=7,48, 1H), 2,6 (s,3H). (ESI) m/z (M+H⁺) = 250,00.

Příprava 12

Přidá se PhNEt2 (1,5 ml) a oxychlorid fosforečný (15,0 ·· ···· «· «« ·» *«*· • 99 4 9 9 9 9 9 9

999 9 9 99 999 • 999 99 999 9 9 • 9 9 9 9 9 4 9 9 9 • 994 944 44 99 99 99 ml) clo 1-methyl benzol g] )pyrazolo[ 1,5-e] ch i nazol i n-5-onu (Příprava 11) (184,7 mg, 0,741 mmol) a reakční heterogenní směs se zahřívá pod zpětným chladičem po dobu 46 hodin. V průběhu zahřívání se suspenze (výchozí látka) postupně začne rozpouštět. Tmavě zelená reakční směs se zfiltruje k odstranění nespotřebovaného výchozího materiálu (16,2 mg, 8,8 %) a z filtrátu se ve vysokém vakuu odstraní vtšina oxychloridu fosforečného. Zbytek se rozdělí mezi vodu (30 ml) a ethylacetát (70 ml). Organická vrstva se promyje solankou, vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (vzorek se vnese na silikagel, eluční činidla systém 10 % ethylacetátu/hexany), čímž se získá 1-methy1-5-ch1orbenzotg])pyrazolo[1,5-c1chinazolin v podobě špinavě bílé pevné látky (153 mg, 77% výtěžek).

1H NMR (DMSO, 6 = 2,50): 8,80 (s,lH), 8,46 (s,lH), 8,29-8,27 (ιη,ΙΗ), 8.19 (s,lH), 8,17-8,15 (m.lH), 7,70-7,65 (m,2H), 2,70 (s,3H).

(ESI) m/z (M+H+) = 267,980.

Příprava 13

Methy1-3-(4,4,5,5-tetrámethy1-1,3,2-d ioxaborolan-2-y1) -2-naftoát

Do roztoku 4,4,4' ,4'5,5,5' ,5'-oktamethy1-2,2'-bi -1,3,2-dioxaborolanu (30,0 g, 0,118 mmol) a methy1-3-jod-2-naftoátu (Příprava 6) (33,5 g, 0,107 mmol) v dimethylsulfoxidu (600 ml) se přidá chlorid palladnatý (dppf) (2,62 g, 0,21 mmol) a acetát draselný (31,51 g, 0,321 mol). Reakční směs se odplynní a o

promyje se dusíkem a zahříváním se udržuje na teplotě 85 C po

- rh - ·· ·♦·· ♦* ·* ·· *···

D O *44« «4 4 • 4 44 >444 4 4 «

444 44 444 4 4 • · 4444 4444 • 444 444 «4 4« 44 44 dobu 18 hodin. Hnědá reakční směs se ochladí na teplotu místnosti, zředí se vodou (1,5 1) a extrahuje se ethylacetátem (2,5 1 pak 2 x 500 ml). Spojené organické vrstvy se promyjí solankou (9 x 500 ml), vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltrují se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (eluční činidlo systém 2 % methanolu/trichlormethan), čímž se získá methyl-3-(4,4,5,5-tetramethy1-1,3,2-dioxaborolan-2-y1)-2-naftoát v podobě žluté pevné látky (19,5 g, 68¾ výtěžek).

*H NMR (CDCI3)- 8,50 (s,lH), 7,99 (s,lH), 7,90 (d, J=8,1, 1H) , 7,86 (d, J=8,l, 1H), 7,57 (m.lH), 7,54 (m,lH), 3,98 (s,3H),

1,47 (s,12H).

(ESI) m/z (M+H⁺) = 313,16.

Příprava 14

Methy1-3-(1-methy1imidazol-5-y1)-2-naftoát

Do směsi methy1-3-(4,4,5,5-tetramethy1-1,3,2-dioxaborolan-2-y1)-2-naftoátu (Příprava 13) (15,37 g, 49,3 mmol) a 5-brora-1-methy1-1H-imidazolu (9,06 g, 49,3 mmol) v systému toluen/ethanol (350 ml/36ml) se přidá Pd(PPh3)4 (11,37 g, 9,84 mmol), uhličitan sodný (20,9 g, 197,2 mmol) a voda (106 ml). Reakční směs se odplynní, promyje se dusíkem a zahřívá se pod zpětným chladičem po dobu 20 hodin. Směs se ochladí na teplotu místnosti, neutralizuje se kyselinou chlorovodíkovou (1,0 N, 100 ml) a zkoncentruje se ve vakuu. Zbytek se rozdělí mezi vodu (300 ml) a ethylacetát (1 1). Organická vrstva se promyje vodou (2 1) a solankou, vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se pod89 ·· ···· * <

• ·<· ·· ·* ···<»·· · • ··· ·· ·< ··· • ··« ·· ··· · · • · ···· ···· ···· ··· ·· 9· ·· ·· ·· ···· ¹ H NMR (C1)C1₃) 8.1, 1H), 7,77 robí bleskové chromatografi i (eluční činidlo systém 1,5 % methanolu/trichlormethan), čímž se získá methy1-3-(1-methy1imidazo 1-5-yi)-2-naftoát v podobě lehce žluté pevné látky (9,5 g, 72¾ výtěžek).

8,53 (s,lH), 7,99 (d, J=8,1, 1H), 7,80 (d, J= (s.lH), 7,56 (m,lH), 7.54 (m,lH), 7,54 (s,lH),

6,94 (s.lH), 3,73 (s,3H), 3,29 (s,3H).

(ESI) m/z (M+H⁺) = 267,11.

Příprava 15

- ( 1 -Methy 1 iin i dazol -5 -y 1 ) - 2-naf toová kysel i na

BOC

Roztok methy1-3-(1-methy1imidazol-5-y1)-2-naftoátu (Příprava 14) <8,5 g, 32 mmol) v systému tetrahydrofuran/methanol (3/2, 120 ml) se zpracovává vodným roztokem hydroxidu sodného (1,0 N, 48 ml). Po 20 hodinách na teplotě místnosti se směs neutralizuje vodnou kyselinou chlorovodíkovou (1,0 N, 20 ml). Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Pevný zbytek se zpracuje methanolem (5 ml) a opět se odpaří. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (eluční činidlo systém 5 ¾ methano1u/ethy lacetát.) , čímž se získá 3 - (1 -methy liro idazo1-5-y1)-2-naftoová kyselina v podobě bledě žluté pevné látky (6,0 g, 74¾ výtěžek).

*H NMR (CDC1₃): 8,34 (s,lH), 7,95 <d, J=8,1, 1H)

8,1, 1H), 7,72 (s,lH), 7,53 (s,lH), 7,52 (m,lH),

6,83 (s,lH), 3,16 (s,3H).

(ESI) m/z (M+H-*-) = 253,10.

7,90 (d, J= 7,50 (m.lH), • · ··

Příprava 16

1,1-Dimethylethy1-3-((1-methy1imidazol-5-y 1)-2-nafty 1)karbamát

Do směsi 3-(1-methy1imidazol-5-y1)-2-naftoové kyseliny (Příprava 15) (1,0 g, 3,95 mmol) a triethylaminu (1,1 ml, 7,91 mmol) ve 20 ml terc-butanolu se přidá difenylfosforylazid (1,63 g, 5,93 mmol). Zahříváním se udržuje po dobu 40 minut na o

teplotě 80 Ca směs se ochladí na teplotu místnosti. Suspenze se zředí ethylacetátem (300 ml) a promyje se jednou vodou 50 ml a třikrát solankou, vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografii (eluční činidlo systém 0,5 % methanol u/et-hy lacetát.) , čímž se získá l,l-dimethylethyl-3-((l-methy 1 im i dazol-5-y 1 )-2-naf ty .1 ) karbamát v podobě bledě žluté pevné látky (0,67 g, 51% výtěžek).

¹ H NMR (CDClj): 8,34 (s,lH), 7,95 (d, J=8,1, 1H), 7,90 (d, J= 8,1, 1H), 7,72 (s,lH), 7,53 (s,lH), 7,52 (m,lH), 7,50 (m.lH) 6,83 (s,lH), 3,16 (s,3H), 1,43 (s,9H).

(ESI) m/z (M+H+) = 324,15.

Příprava 17

5-(3-Am i no-2-nafty 1)-1-methylim i dazo1 \

• ·· · • · • · ·

Roztok 1,1-dimethylethyl-3-((1-raethylimidazol-5-yl)-2-nafty1)karbamátu (Příprava 16) (1,0 g, 2,98 mmol) v systému trifluoroctová kyselina/dichlormethan (1=10, 50 ml) se míchá při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Po zkoncentrování se zbytek zředí ethylacetátem (200 ml) promyje se vodným roztokem hydrogenuhličitanu (100 ml a solankou. Organická vrstva se vysuší (síranem hořečnatým), zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (eluční činidlo systém 5 % methanolu/ethylacetát), čímž se získá 5-(3-amino-2-nafty 1)-1-methy1imidazol v podobě světle žluté pevné látky (0,49 g, 70¾ výtěžek).

¹H NMR (CDCI3): 7,65 (d, J=8,1, 1H), 7,59 (d, J=8,1, 1H), 7,57 (s,lH), 7,56 (s,lH), 7,36 (m,lH), 7,22 (m,lH), 7,13 (s,lH),

7,03 (s,lH), 3,96 (b,2H), 3,46 (s,3H).

(ESI) m/z (M+H+) = 224,08.

Příprava 18

1-Methy1-4,5-d ihydrobenzolg]imidazol4,5-clch inoli n-4-on \

H

Směs 5-(3-amino-2-nafty 1)-l-methylimidazolu (Příprava 17) (0,48 g, 2,14 mmol) a 1,1'-karbonyldiimidazolu (0,42 g, 2,57 mmol) v o-dichlorbenzenu (22 ml) se zahříváním udržuje na o

teplotě 180 C po dobu pěti hodin. Suspenze se ochladí na teplotu místnosti, zfiltruje se a vysuší se ve vakuu. Tak se získá 1-methy1-4,5-d i hydrobenzolg]imidazo14,5-clch inoli n-4-on jako světle žlutá pevná látka (0,22 g, 42¾ výtěžek).

*H NMR (DMSO): 11,57 (s,lH), 8,71 (s,lH), 8,15 (s,lH), 8,10 (d, J=8,4, 1H), 7,89 (d, J=8,4, 1H), 7,84 (s.lH), 7,53 (m,lH),

7,46 (m.lH), 4,30 (s,3H).

» ·· · · 9 9 9 9

9 9 · 9 « • ··· · · ·· » ·····< • · · · <

(ESI) m/z (M+H+) = 250,08.

Příprava 19

1-Methyl-4-ch1orbenzoíglim idazo[4,5-c]chino1in

Do směsi 1-methy1-4,5-dihydrobenzo[g]imidazo[4,5-c]chinolin-4-onu (Příprava 18) (200 mg, 0,80 mmol) a PhNEtz (2,5 ml, 1,6 mmol) se přidá oxychlorid fosforečný (8,0 ml). Reakční směs se zahřívá pod zpětným chladičem po dobu čtyř hodin. Po ochlazení se nadbytek oxychloridu fosforečného odstraní ve vakuu. Zbytek se zředí ethylacetátem (150 ml) a zpracuje se hydrogenuh1 iči taném sodným (1 g) k neutralizaci kyseliny. Organická vrstva se promyje solankou, vysuší se (síranem hořečnatým), zf11 tru je se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (eluční činidlo ethylacetát), čímž se získá 1-methy1-5-chlorbenzo[glimidazo[4,5-c]chinolin v podobě světle žluté pevné látky (0,18 g, 90% výtěžek ) .

NMR (CDC13): 8,61 (s,lH), 8,57 (s,lH), 8,01 (d, J=8,8, 1H), 7,98 (d, J=8,8, 1H), 7,89 (s,lH), 7,57 (m,lH), 7,54 (m,lH),

4,35 (s,3H).

(ESI) m/z (M+H⁺) = 268,08.

Následující příklady 12 až 19 popisují způsoby přípravy sloučenin podle vynálezu.

Příklad 12

1-Methy1-4-methy1arai nobenzolglimidazol1,2-alchinoxa1 in • ·

Do roztoku 4-chlor-l-methylbenzotg]imidazol1,2-a]chino xalinu <0,063 g, 0,236 mmol) (Příprava 4 v příkladu 11) ve 4 ml tetráhydrofuranu se přidá methylamin (40% ve vodě, 0,16 ml, 1,88 mmol). Reakční zkumavka se utěsní a směs se míchá při teplotě 80 C po dobu 18 hodin. Ochlazená směs se vyjme do ethylacetátu, promyje se vodou a solankou vysuší se (síranem sodným) a odpaří se. Získaný zbytek se překrysta1uje z isopropanolu za získání l-methyl-4-methylaminobenzo[g]imidazo[l,2-a]chi noxa 1 i nu v podobě béžových jehlic (0,043 g, 69% výtěžek) o teplotě tání 201 až 202 C.

IR (KBr, cm“¹) 3324, 1575, 1557, 1411, 1121;

iH NMR (DMSO) S 8,62 (s.lH), 8,10 <s,lH), 8,08 (d, J=8,1, 1H),

7,94 (d, J=8,l, 1H), 7,77 (br d, J=4,5,1H), 7,49-7,45 (m,2H)

7,35 <s,lH), 3,06 <d, J=4,6, 3H), 2,98 (s,3H);

MS (⁺ESI, M-+H⁺) m/z = 263;

HPLC: 99,5 % <230 nm);

HRMS vypočteno pro C16H14N4: 262,1219, nalezeno 262,1226. Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle příkladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 12 je IC50 0,23 μΜ.

Příklad 13

1-Methyl-4-(2-N-methylaminoethylamino)benzo[g]imidazol1,2-a]chinoxalin hydrochlorid

NHMe.HCI

N N

H • · · ·

Do roztoku 4-ch1or-1-methy1 benzolg]imidazoll,2-a]chinoxalinu <0,075 g, 0,281 mmol) (Příprava 4 v příkladu 11) ve 4 ml tetrahydrofuranu se přidá N-methylethylendiamin <0,20 ml, 2,25 mmol). Reakční zkumavka se utěsní a směs se míchá při teplotě 80 C po dobu 18 hodin. Ochlazená směs se vyjme do ethylacetátu, promyje se vodou a solankou vysuší se (síranem sodným) a odpaří se. Získaný zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC (eluční činidlo systém dichlormethan/methanol 8:2) za získání 1-methy1-4-<2-N-methylamí noethy lam i no)benzolg]imidazol1,2-a]chinoxalinu. Pevná látka se rozpustí v systému dichlormethan/ethanol a přidá se roztok IN kyseliny chlorovodíkové v ethanolu k vytvoření hydrochloridové soli, která se odfiltruje, promyje se ethanolem a usuší se ve vakuu, čímž se získá l-methyl-4-(2-N-methylaminoethylamino)benzolg]imidazot1,2-a]chi noxa 1in hydrochlorid v podobě špinavě bílé pevné látky (0,025 g, 26¾ výtěžek) o teplotě tání o

265 až 275 C za rozkladu.

IR (KBr, cm“¹) 3448, 2958, 2780, 1656, 1532, 1420;

NMR (CD₃0D) 8,72 <s,lH), 8,42 (s,lH), 8,13-8,11 (m,lH),

8,01-7,98 (m, 1H), 7,63-7,57 (m,3H), 4,23-4,20 <m,2H), 3,543,51 (m,2H), 3,07 (s,3H), 2,86 (s,3H);

MS (+ESI, M+H⁺) m/z - 306;

HPLC·- 98,3 ¾ (230 nm);

HRMS vypočteno pro C18H19N5: 306,1719, nalezeno 306,1708. Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle příkladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 13 je IC50 0,35 μΜ.

Příklad 1.4

1-Methy1-4-methylamí nobenzot g]pyrazolol1,5-c]chi nazoli n

N N

H • ·· · • · · · · · • · • ···

Směs 4-methy1-1-(4-to1uensu1fony1 ) - 5 -1 r imethy1stanny1pyrazolu (Příprava 8 v příkladu 11) <24,0 mg, 0,0896 mmol) a met hylamlnu (3,0 ml 2,0 M/THF, 6,0 mmol) v tlakové zkumavce se o

zahříváním udržuje na teplotě 60 C po dobu pěti hodin. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a zpracuje se hydrogenuhliěi taném sodným (57 mg) a vodou (2 kapky z pipety ) a míchá se po dobu pěti minut. Přidá se silikagel a těkavé složky se odstraní ve vakuu. Získaný silikagel se podrobí bleskové chromatografii (eluční činidlo systém 20 % ethylacetátu/hexany), čímž se získá l-methyl-4-methylaminobenzo[g]pyrazolo[l,5-c]chinazolin v podobě světle žluté pevné látky (23 mg, 98¾ výtěžek).

*H NMR CDMSO, 6 = 2,50): 8,60 <s,lH), 8,10 Cs, d, J=8,3, 1H), 8,03 (s,lH), 8,01 (s, 1H), 7,95 Cd, J=8,01, 1H). 7,92 Cg, J=4,7, 1H), 7,50 (t, J=7,5, 1H), 7,44 (t, J=7,4, 1H), 3,09 Cd, J=4,7, 3H), 2,66 <s, 3H);

ESI, CM-+-H+) = 263,02.

Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle příkladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 14 je IC50 0,67 μΜ.

Příklad 15

1-Methy1-4-(2-N-methylam i noethylam i nolbenzo[g]pyrazolo[1,5-c]ch i nazoli n

N-Methylethylendiamin <250 μΐ, 2,836 mmol) se přidá rychle do tetrahydrofuranové (2,0 ml) sem i suspenze 4-methyl-1-(4-to 1uens u1f ony 1)-5-tr imethy1stanný 1pyrazo1u (Pří prava 8 v příkladu 11) (30,5 mg, 0,114 mmol). Reakční směs se míchá o

při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny a při teplotě 75 C po dobu 2,3 hodin. Po vychladnutí směsi na teplotu místnosti se reakční směs zpracuje hydrogenuhličitanem sodným (57 mg) a vodou (2 kapky z pipety) a míchá se po dobu několika minut. Těkavé složky včetně nadbytku diaminu se odstraní ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (na silikagelu, eluční činidlo systém 0 až 100 % methanolu/ethylacetát), čímž se získá l-methyl-4-(2N-methylaminoethylamino)benzotg]pyrazolol1,5-c]chinazolin v podobě žluté voskovité pevné látky (43,4 mg, což je o 8,6 mg více než teoretický výtěžek ) .

NMR (DMSO, 6 = 2,50); 8,60 (s,lH), 8,10 (d, J=8,1, 1H),

8,02 (s,2H, signální překrytí), 7,95 (d, J=8,1, 1H), 7,73 (t.,

J=5,5, 1H), 7,51 (ddd, J=8,2, 6,8, 1,1, 1H), 7,45 (ddd, J=

8,0, 6,9, 1,0, 1.H), 3,66 (apt g, J=6,l, 2H), 2,82 (t, J=6,3,

2H), 2,66 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 1,81 (s, 1H);

ESI, (M+H+) = 306,05.

Příklad 16

1-Methy1-4-methylam inobenzoig]imidazo[4,5-c]chi nolin

Směs 1-methy1-4-chlorbenzolg]imidazo[4,5-c]chinolinu (Příprava 19 v příkladu 11) (130 mg, 0,49 mmol) a methylaminu (2,0 M/THE, 1,5 ml, 2,92 mmol) se v tlakové zkumavce zahříváo ním udržuje na teplotě 80 C po dobu 18 hodin. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti, zředí se ethylacetátem (100 ml) promyje se nasyceným roztokem uhličitanu sodného (50 ml) a solankou. Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a odpaří se ve vakuu. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (eluční činidla systém 5 % methanol u/ethy1acetát), čímž se získá 1-methy1-4-methylaminobenzo• · · » φ · · · φ φ · · [ gl im i dazot 4,5-c] ch i nol i n v podobě mdle bílé pevné látky (5,2 mg, 4% výtěžek).

*Η NMR (CDC1₃): 8,44 (s,lH), 8,35 (s, 1H), 7,94 (d, J=8,3, 1H) 7,90 (d, J=8,3, 1H), 7,72 (s,lH), 7,46 (m, 1H), 7,40 (m,lH),

5,95 (b, 1H), 4,28 (s, 3H), 3,31 (s, 3H):

ESI, m/z (M+H⁺) = 263,14.

Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle příkladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 16 je IC50 0,80 μΜ.

Příklad 17

1-Methy1-4-(2-N-methylam inoethylamino)benzo[g]imidazo[4,5-cl chinolin

Roztok 1-methy1-4-chlorbenzoig]imidazo[4,5-c3 chinolinu (Příprava 19 v přikladu 11) (130 mg, 0,49 mmol) v ethylendiao minu (3,2 ml, 49 mmol) se zahříváním udržuje na teplotě 60 C po dobu 18 hodin. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Zbytek se zředí ethylacetátem (50 ml) a promyje se solankou (20 ml). Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a zkoncentruje se. Získaný surový produkt se podrobí bleskové chromatografií (eluční činidlo methanol), čímž se získá 1-methy 1 -4-(2-N-methylaminoethy1amino)benzo[g]imidazo[4,5-c]chino lin v podobě mdle bílé pevné látky (6,9 mg, 5% výtěžek)*H NMR (CDCl3)^; 8,52 (s,lH), 8,33 (s, 1H), 7,96 (d, J=8,3, 1H) 7,94 (d, J=8,3, 1H), 7,77 (s,lH), 7,46 (m, 1H), 7,42 (m,lH), 6,22 (b, 1H), 4,36 (s, 3H), 3,85 (m, 2H), 3,10 (m,2H), 1,60 (b, 1H);

ESI, M/z (M+H⁺) = 292,18Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle pří98 • · ··· ·

kladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 17 je IC50 1,0 μΜ.

Příklad 18

1-Methy1-4-(2-hydroxyethylami no)benzolg]imidazoll,2-a]chi noxalin

OH

Do roztoku 4-chlor-l-met.hylbenzotg] imidazol 1,2-a] chinoxal inu (0,060 g, 0,225 mmol) (Příprava 4 v příkladu 11) ve 2 ml tetrahydrofuranu se přidá 2-aminoethanol (0,11 ml, 1,80 mmol). Reakční zkumavka se utěsní a reakční směs se zahříváním udržuje na teplotě 80 C po dobu 16 hodin. Vychladlá směs se vyjme do ethylacetátu, promyje se vodou a solankou, vysuší se síranem sodným a odpaří se. Získaný produkt se prekrystaluje z isopropanolu podle příkladu 18 za získání l-methyl-4-(2-hydroxyethylamino)benzotg]imidazol1,2-a]chinoxalinu (0,062 g, 94¾ výtěžek) o teplotě tání 186 až 188 C.

IR (KBr, cm-¹) 3370, 3147, 1549, 1485, 1414;

NMR (DMS0-d6) 8,64 (s,lH), 8,10-8,09 (m,2H), 7,96 (d, J=7,5,

3,66 (m, 4H), 3,00 (s, 3H);

MS (⁺ESI, M+H-*-) m/z = 293;

HPLC: 98,8 ¾ (230 nm);

Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle příkladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 18 je IC50 0,87 μΜ.

Příklad 19

1-Methy1-4-(2-p iperid i n-l-ylethylam i no)benzolg]imidazo11,2-a]chinoxalin ·;ΙΤ

I

9 : ·.

Η

Do roztoku 4-chlor-l-methylbenzolg]imidazol1,2-a]chinoxalinu (0,055 g, 0,206 mol) (Příprava 4 v příkladu 11) ve 5 ml tetrahydrofuranu se přidá 1-(2-aminoethy1)piperidin (0,24 ml, 1,65 mmol). Reakční zkumavka se utěsní a reakční směs se zahříváním udržuje na teplotě 80 C po dobu 17 hodin. Vychladlá směs se vyjme do ethylacetátu, promyje se vodou a solankou, vysuší se síranem sodným a odpaří se. Získaný produkt se překrystaluje z isopropanolu za získání l-methyl-4-(2-piperidin-1 -y let-hy lamí no ) benzol g] im i dazot 1,2-a] chinoxal inu (0,063 g ,

84¾ výtěžek) o teplotě tání 170 až 172 C.

IR (KBr, cm-¹) 3300, 2932, 1557, 1483, 1408;

^τΗ NMR (DMS0-d6) 8,61 (s.lH), 8,07-8,06 (m,2H), 7,94 (d, J=7.6. 1H), 7,49-7,34 (ra,4H), 3,66 (br g, J=6,5, 2H), 2,97 (s,3H),

2,59 (br t, J=6,5, 2H ) , 2,44 (br s, 4H), 1,54-1,39 (m,6H);

MS (-ESI, M+H-? m/z = 360;

HPLC; 97,6 % (230 nra);

Inhibiční aktivita IKK-1 se měří za použití testu podle příkladu 2, přičemž inhibiční potenciál sloučeniny podle příkladu 18 je IC50 1,7 pM.

Veškerá citovaná literatura slouží k lepšímu pochopení podstaty vynálezu. Jsou ovšem možné obměny shora popsaných způsobů v rámci vynálezu, jak je pracovníkům v oboru běžné.

Průmyslová využitelnost

Inhibitor IkB kinázy zvláště 4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimethy1imidazo-(l,2-a)chinoxalin pro výrobu farmaceutických prostředků k ošetřování a k prevenci zánětlivých onemocnění nebo s imunitou souvisejících onemocnění

Claims

1. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, vyznačující se tím, že se podává savcům v případě potřeby inhibitor IKK v množství účinném k léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že inhibitor IKK se podává v kombinaci s alespoň jedním biologicky aktivním činidlem ze souboru zahrnujícího (i) drogy, (ii) hormony a (iii) syntetické sloučeniny.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že inhibitor IKK inhibuje aktivitu IKK přibližně z 20 až 100

4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK IC50 v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 50 μΜ.

5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK IC50 v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 1 μΜ.

6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m, že inhibitor IKK selektivně inhibuje IKK-2.

7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m , že inhibitor IKK vykazuje alespoň přibližně pětinásobnou nebo vyšší selektivitu pro IKK-2 než pro IKK-1.

8. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t. i m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK-2 IC50 v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 5 μΜ.

101

44 444·

44 4444

4 4 4 4 4 4 «444

4444 444 44 44 44 44

9- Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK-2 IC50 v rozmezí přibližné 0,01 jjM až přibližně 1 11M.

10. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že inhibitor IKK vykazuje biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

11. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že inhibitorem IKK je 4-C2 -aminoethy1)amino-l,8-dimethy1imidazo-(1,2-a)chinoxalin

12. Způsob podle nároku 1 , vyznač u j í c í s e tím, že nemocí nebo poruchou je zánětlivé onemocnění nebo porucha 13. Způsob podle nároku 1 , vyznač u j í c í s e tím, že nemocí nebo poruchou je s Imunitou souvisej íc í 0- nemocnění 14. nebo porucha. Způsob podle nároku 1 , vyznač u j í c í s e

tím, že zánětlivým onemocněním nebo s imunitou souvisejícím onemocněním je artritida, lupénka, rýma, zánětlivé onemocnění střev, pulmonární onemocnění, Alzheimerova nemoc, mozková ischemie, traumatické poranění mozku, Parkinsonova nemoc, rozptýlená skleróza, ateroskleróza, amyotropní laterální skleróza, subaraehnoidní krvácivost, astma, akutní respirační stresový syndrom, chronická obstruktivní plicní nemoc, systemieký lupus erythematosus a odliojování transplantátů.

15. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch podle nároku 1, vyznačující se t. í m, že se inhibuje IKK katalytická aktivita podáváním savcům v případě potřeby inhibitoru IKK v množství účinném k inhibici katalytické aktivity IKK.

102 • fc ··♦· • fc fcfcfcfc

9 9 ···· fc fc • fcfcfc · fcfc·· fc fcfcfc ·· ··· • fcfcfcfc fc • fc fcfc fc ·

16- Způsob podle nároku 15,vyznačující se t í m, že inhibitor IKK se podává v kombinaci s alespoň jedním biologicky aktivním činidlem ze souboru zahrnujícího (i) drogy, (i i) hormony a (iii) syntetické sloučeniny.

17. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že inhibitor IKK inhibuje aktivitu IKK přibližně z 20 až 100

18. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK ICso v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 50 μΜ.

19. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t- í m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK ICso v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 1 μΜ.

20. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se tím, že inhibitor IKK selektivně inhibuje IKK-2.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že inhibitor IKK vykazuje alespoň přibližně pětinásobnou nebo vyšší selektivitu pro IKK-2 než pro IKK-1.

22. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK-2 ICso v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 5 μΜ.

23. Způsob podle nároku 15,vyznačuj ící se t í m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK-2 IC50 v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 1 μΜ.

24. Způsob podle nároku 15,vyznačující se t í m, že inhibitor IKK vykazuje biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

···· • *

25.

103

99 9999 • · • ·♦· ··

25. Způsob podle nároku 15,vyznačující se t. í m, že inhibitorem IKK je 4-(2 -aminoethy1)amino-l,8-dimethy1 i midazo-(1,2-a)ch1noxa1 i n.

26.

Způsob podle nároku 15,vyznačující se t i m, že zánětlivým onemocněním nebo s imunitou souvisejícím onemocněním je artritida, lupénka, rýma, zánětlivé onemocnění střev, pulmanámi onemocnění, ftlzheiměrová nemoc, mozková ischemie, traumatické poranění mozku, Parkinsonova nemoc, rozptýlená skleróza, ateroskleróza, amyotropní laterální skleróza, subarachnoidní krvácivost, astma, akutní respirační stresový syndrom, chronická obstruktivní plicní nemoc, systemický lupus erytheinatosus a odhojování transplantátů.

27. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch podle nároku 1, vyznačující se ti m, že se inhibuje fosforylace IkB podáváním savcům v případě potřeby inhibitoru IKK v množství účinném k inhibici foforylace IkB.

28. Způsob inhibice aktivace na NF-kB závisející genové exprese spojený s inhibici IKK katalytické aktivity a/nebo IkB fosforylace, vyznačující se tím, že se podává savcům v případě potřeby množství inhibitoru IKK účinném k inhibici katalytické aktivity IKK a/nebo IkB fosforylace, čímž se inhibuje aktivace genové exprese závislá na NF-kB.

29. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, vyznačující se tím, že se podává savcům v případě potřeby inhibitor IKK v množství účinném k inhibici IkB kinázy (IKK), přičemž IKK inhibice způsobuje (i) inhibici IKK katalytické aktivity, (i i) inhibici foforylace IkB nebo (iii) inhibici genové exprese závislé na NF-kB.

4 4 4 4

4 4 44

4 4 4 4

44 44

104 «4 ·»»·

4 4 • 444 ·· 4444

4 4 4

4 4 4 • · 4

4 4 4 4

44 44

30. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch podle nároku 1, vyznaču j íc í se t i m, že se podává savcům v případě potřeby inhibitor

IKK v množství účinném k léčení zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, přičemž IKK inhibitor vykazuje (i) inhibici IKK katalytické aktivity v rozsahu přibližně 20 až 100 %, (ii) selektivní inhibici IKK-2, (iii) IC50 oproti IKK aktivitě v rozmezí přibližně 0,01 pM až přibližně 50 pM a

Civ) biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

31. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch podle nároku 15, vyznaču j íc i se tím, že se inhibuje IKK katalytická aktivita podáváním savcům v případě potřeby inhibitoru IKK v množství účinném k inhibici IKK katalytické aktivity, přičemž IKK inhibitor vykazuje (i) inhibici IKK katalytické aktivity v rozsahu přibližně 20 až 100 %, (ii) selektivní inhibici IKK-2, (iii) IC50 oproti IKK aktivitě v rozmezí přibližně 0,01 pM až přibližně 50 pM a (iv) biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

32. Způsob ošetřování zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch podle nároku 27, vyznaču j íc i se ti m, že se inhibuje fosforylace IkB podáváním savcům v případě potřeby inhibitoru IKK v množství účinném k inhibici fosforylace IkB, přičemž IKK inhibitor vykazuje (i) inhibici IKK katalytické aktivity v rozsahu přibližně 20 až 1OO %,

- 105 ♦ · ···· * 4 4 • ·44 • 4 • 4 •« 4 4 ·· 4 44 4

4 4·· · 4 · • 4 44 4 4 4 • 44 444 4 4 • 44 4 4 · 4 ·

49 44 44 44 (i i) selektivní inhibici IKK-2, (iii) IC50 oproti IKK aktivitě v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 50 μΜ a (iv) biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

33. Způsob inhibice aktivace na NF-kB závisející genové exprese spojený s inhibici IKK katalytické aktivity a/nebo IkB fosforyláce podle nároku 28,vyznačující se tím, že se podává savcům v případě potřeby množství inhibitoru IKK účinné k inhibici katalytické aktivity IKK a/nebo IkB fosforylace, a tím se inhibuje aktivace genové exprese závislé na NF-kB, přičemž IKK inhibitor vykazuje (i) inhibici IKK katalytické aktivity v rozsahu přibližně 20 až 100 %, (ii) selektivní inhibici IKK-2, (iii) IC50 oproti IKK aktivitě v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 50 μΜ a (iv) biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

34. 4-(2 -Aminoethy1)amino-1,8-dimethy1imidazo-(1,2-a)chinoxa1 i n vzorce kde znamená Me methylovou skupinu.

35. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t i m, že obsahuje sloučeninu podle nároku 34 a farmaceuticky přijatelný nosič excipient nebo ředidlo.

- 106 φφ φφφφ Φφ φφ ·* φφφφ φφφ φφφφ φφ φ φφφφ φ φ φφ φφφ φ ΦΦΦΦΦ φφφφ φ φ · φφφφ φφφφ

Φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ

36. Kit, vyznačující se tím, že obsahuje (i) IKK inhibitor nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, Cli) ředidlo IKK Inhibitoru a popřípadě, (iii) alespoň jedno další biologicky aktivní činidlo a (iv) návod k použití.

37. Kit podle nároku 36, vyznačující se t i m, že obsahuje jako IKK inhibitor 4-(2 -aminoethyl)amino-1,8-dimethylimidazo-(1,2-a)chinoxalin.

38. Kit podle nároku 36.vyznačující se t. i m, že obsahuje jako alespoň jedno biologicky aktivní činidlo (i) drogy, (ii) hormony nebo (iii) syntetické sloučeniny

39. Způsob prevence zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch, vyznačující se tím, že se podává savcům v případě potřeby inhibitor IKK v množství účinném k prevenci zánětlivých nebo s imunitou souvisejících nemocí nebo poruch.

40. Zpflsob podle nároku 39,vyznačující se t i m, že se podává inhibitor IKK v kombinaci s alespoň jedním biologicky aktivním činidlem voleným ze souboru zahrnujícího (i) drogy, (ii) hormony a (iii) syntetické sloučeniny.

41.

tím, že až 100 %.

Zpflsob podle nároku 39,vyznačující se inhibitor IKK inhibuje aktivitu IKK přibližně z 20

42- Zpflsob podle nároku 39,vyznačuj ící se tím, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK ICbo v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 50 μΜ.

43. Zpflsob podle nároku 39, vyznačující se t i m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK IC50

9· 9 9

9 9 9 9 • 9 99

9 9 9 9 9

9 9 * 9

99 99 s e

107 •9 999·

9 9 9 • 999 9 9 9

9» ·9 9 ·

9 ·

9 · • 9

9 · v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 1 μΜ.

44. Způsob podle nároku 39, vyznačuj i c i t i m, že inhibitor IKK selektivně inhibuje IKK-2.

45. Způsob podle nároku 44, vyznačující se t i m , že inhibitor IKK vykazuje alespoň přibližně pětinásobnou nebo vyšší selektivitu pro IKK-2 než pro IKK-1.

46. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK-2 ICso v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 5 μΜ.

47. Způsob podle nároku 39, vyznačující se t i m, že inhibitor IKK vykazuje aktivitu oproti IKK-2 ICso v rozmezí přibližně 0,01 μΜ až přibližně 1 μΜ.

48. Způsob podle nároku 39, vyznačující se t i m, že inhibitor IKK vykazuje biologickou dostupnost v rozmezí přibližně 10 % až přibližně 100 %.

49. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že inhibitorem IKK je 4-(2 -aminoethyl)amino-l,8-dimethylimidazo-(l,2-a)chinoxalin.

50. Způsob podle nároku 39, vyznačující se t i m, že zánětlivým onemocněním nebo s imunitou souvisejícím onemocněním je artritida, lupénka, rýma, zánětlivé onemocnění střev, pulmonární onemocnění, Alzlieimerova nemoc, mozková ischemie, traumatické poranění mozku, Parkinsonova nemoc, rozptýlená skleróza, ateroskleróza, amyotropní laterální skleróza, subarachnoidní krvácivost, astma, akutní respirační stresový syndrom, chronická obstruktivní plicní nemoc, systemický lupus erythematosus a odhojování transplantátů-