WO2010000903A2 - Composición capaz de modular la actividad de ikkalpha para el tratamiento de enfermedades que cursan con acantolisis - Google Patents

Composición capaz de modular la actividad de ikkalpha para el tratamiento de enfermedades que cursan con acantolisis Download PDF

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WO2010000903A2
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Mª Llanos CASANOVA HERNÁNDEZ
Rodolfo Moreno Maldonado
Ana María BRAVO MORAL
Ángel RAMÍREZ MERINO
José Manuel NAVARRO ESPINEL
José Luís JORCANO NOVAL
Angustias PAGE PEÑUELAS
María Jesús FERNÁNDEZ-ACEÑERO
María Concepción VILLANUEVA SÁNCHEZ
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Centro De Investigaciones Energéticas, Medioambientales Y Tecnológicas (Ciemat)
Universidade De Santiago De Compostela
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    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases

Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology and medicine, and specifically refers to a composition capable of modulating the activity of the IKKalpha for the treatment of diseases that occur with a chololysis, and more specifically for the treatment of squamous cell or squamous cell carcinomas of the pemphigus. It also refers to a method of selection of drugs useful in the treatment of diseases that occur with Chololysis and a method for the collection of data useful in the diagnosis of said diseases.
  • neoplasms both benign and malignant of the skin
  • the skin is also one of the main sites of metastasis of other neoplasms.
  • epithelial neoplasms are one of the main causes of disease in humans: basal cell carcinoma (CBC) and squamous cell squamous cell carcinoma (CBC) are the most frequent of all malignant neoplasms of the skin.
  • CBC basal cell carcinoma
  • CBC squamous cell squamous cell carcinoma
  • the CEC is a malignant tumor of the keratinizing cells of the epidermis and its annexes. It compromises the skin and mucous membranes with squamous epithelium.
  • the chololysis consists in the loss of connection between the keratinocytes of the epidermis as a result of the destruction of the intercellular desmosomes that leads to the formation of intraepidermal fissures and vesicles.
  • Table 1 shows a classification of the diseases that occur with a clolysis.
  • Hailey-Hailey disease or familial benign pemphigus is an autosomal dominant disorder that affects the ATP2C1 gene on chromosome 3.
  • This gene encodes a calcium pump whose function is to contribute this element to the interior of the Golgi apparatus and is essential for synthesis protein
  • the alteration of this ATP-loop entails a decrease in calcium at said level causing a deficit in the synthesis of intercellular adhesion proteins.
  • the pemphigus group is a group of pathologies of autoimmune origin, the chololysis is produced because there are autoantibodies directed in the case of vulgar and vegetative pemphigus against desmoglein 3 and 1 and in the case of foliaceous and erythematous pemphigus against desmoglein 1.
  • Darier's disease is an autosomal dominant disorder (localized in the ATP2A2 gene of chromosome 12) in which an alteration of the keratinization occurs.
  • herpesvirus infection there is also a spinal cell in addition to the viral cytopathic effect with balonization and multinucleated cell formation, as well as in the spinal cell, a solitary tumor that predominantly affects the trunk of middle-aged individuals.
  • Incidental chololysis has been described in many epithelial, fibrohistiocytic, melanocytic or inflammatory lesions.
  • epithelial lesions seborrheic keratosis, illuminated condylomas, basal cell carcinoma and classic squamous cell carcinoma have been described.
  • fibrohistiocytic lesions it has been described in the dermatofibroma, in the fibrous papule and in scars, in melanic lesions it has been described in melanocytic nevus and it has been postulated that it could be a marker of melanocytic atypia and in malignant melanomas.
  • the authors of the present invention have shown that the stimulation of the expression of IKKalpha increases both the early and late differentiation of human keratinocytes through a mechanism dependent on cadherin-E, and that the expression of high levels of IKKalpha in epidermal cells
  • Mouse tumors induce, when these cells are inoculated in immunosuppressed mice, a change in the histological variant of squamous cell carcinomas (CECs) that occur, so that instead of developing conventional CECs, they give rise to some Pseudoglandular tumors similar to human chololitic CECs (CECAs).
  • CECs squamous cell carcinomas
  • murine CECAs are characterized by an elevated expression of cadherin-E (cytosolic location instead of being in the cell membrane) and absence of keratins K1 and K10, differentiation markers that until now had always been found to express themselves in a way proportional to IKKalpha and cadherin-E.
  • Molecular properties of human CECAs, tumors of poor prognosis, high aggressiveness and high risk of metastasizing have been characterized for the first time, finding that human CECAs have the same characteristics as murine CECAs induced by IKKalpha: they express high levels of IKKalpha and of caherina-E in the absence of K1 and K10.
  • IKKalpha is responsible for the appearance of the histological variant of human ECSC, and that IKKalpha would be the molecule responsible for the phenomenon of chololysis in humans, both in tumors and in other diseases that occur with Chololysis
  • a first aspect of the invention relates to a composition, from now on the composition of the invention, which comprises a modulating agent for the activity of IKKalpha for the treatment of diseases that occur with a spolysis.
  • IKKalpha or "IKK ⁇ ” (also called in the literature IKK1, I-kappa-B kinase 1, IKK-a kinase or conserved helix-loop ubiquitous kinase) as used herein refers to the alpha subunit of the IKB complex kinase, kappaB kinase (IKK).
  • the IKK complex is formed by two catalytic subunits IKKalpha and IKK beta and a regulatory subunit (IKKgamma) and is fundamental in the regulation of the activity of the transcription factor NF-kappaB (Nuclear Factor kappa B).
  • the catalytic activity of IKKalpha in particular is important in the regulation of the activity of this factor.
  • IKKalpha has other functions such as the modification of the histone function, which is critical for the activation of the expression of NF-kappaB-dependent genes.
  • IKKa is associated with acetyl transferases and histone deacetylases and thus influences the transcriptional regulation of non-NF-kappaB-dependent genes.
  • IKKalpha refers to both the gene and the human IKKalpha protein.
  • IKKalpha is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the IKKalpha protein, and which would comprise various variants from:
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 b) nucleic acid molecules whose complementary chain hybridizes with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98 % or 99% with SEQ ID NO: 1. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses Ia activity and structural characteristics of the IKKalpha protein.
  • the activity of IKKalpha can be modulated by the modification of the levels and / or the activity of the IKKalpha protein, or by the modification of the levels to which the IKKalpha gene is transcribed such that the levels of activity of the IKKalpha protein in The cell is modulated.
  • the modulating agents can also be agonists (substances that are capable of binding to a receptor and eliciting a response in the cell, specifically an increase in the activity of IKKalpha), as antagonists (substances that not only do not activate the receptor, but also actually blocks its activation by agonists). In the context of the present invention, inhibition is the preferred form of modulation.
  • the modulating agents included in the composition of the invention are selected from a list comprising: a) an organic molecule, b) an RNA molecule, c) an antisense oligonucleotide, d) an antibody, or e) a ribozyme.
  • organic molecules that can specifically bind to IKKalpha without binding to other polypeptides or proteins.
  • the organic molecules will preferably have a weight of 100 to 20,000 daltons, more preferably 500 to 15,000 daltons, and more preferably 1000 to 10,000 daltons. Bookstores of organic molecules are commercially available.
  • the route of administration it can be, without limitation, intraperitoneal, intrathecal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal or dermal.
  • organic molecules modulating the activity of IKKalpha are, but not limited to, the hydrochloride of N- (1, 8-Dimethylimidazo [1,2-a] quinoxalin-4-yl) -1, 2-ethanediamine (BMS-
  • antisense technology nucleotide sequences specifically complementary to a particular DNA or RNA sequence could form complexes and block transcription or translation.
  • post-transcriptional gene silencing and in particular of interference RNA (interfering RNA or RNAi)
  • tools have been developed that allow the specific inhibition of the expression of a gene.
  • the inhibition of the expression of the IKKalpha protein would therefore constitute the inhibition of its biological activity, and in particular, of the activity that is contributing to the aggravation of the tumor characteristics of the cancer cells and / or to the appearance of a chololysis.
  • antisense polynucleotides are understood ribonucleotide or deoxyribonucleotide chains that can inhibit the production of the IKKalpha protein by one of these three mechanisms:
  • Antisense oligonucleotides capable of modulating the activity of IKKalpha are known in the state of the art. For example, and without limiting our, it could be a sequence of ribonucleotides or RNA that belongs to the so-called siRNA (small interfering RNA), small interfering RNA or silencing RNA, capable of inhibiting the genetic expression of the IKKalpha protein.
  • siRNA small interfering RNA
  • small interfering RNA small interfering RNA
  • silencing RNA small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA or small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA or small interfering RNA
  • this specific gene is IKKalpha.
  • the present invention includes by way of illustration as siRNA, but not limited to, those set forth in US patent application 2007/0191300 (corresponding to the sequences SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8).
  • siRNA capable of hybridizing a nucleic acid molecule that encodes the protein Human IKKalpha that is collected in SEQ ID NO: 1.
  • siRNA construct that contains at least any one of the possible nucleotide sequences of siRNA capable of inhibiting the expression of IKKalpha, and notwithstanding that they are additionally part of the present invention any of the RNA sequences and constructions of the invention described above that are subject to modifications, preferably chemical, that lead to greater stability against the action of ribonucleases and thereby greater efficiency.
  • siRNA capable of inhibiting the translation of these mRNAs also forms part of the invention.
  • siRNA sequence of the invention or of the RNA construction of the invention would be evident to one skilled in the art, and could be carried out by chemical synthesis, which also allows the incorporation of chemical modifications both in the different nucleotides of the product such as the incorporation of other chemical compounds at any of the ends.
  • the synthesis could also be carried out enzymatically using any of the RNAs polymerases available. Enzymatic synthesis also allows some chemical modification of inhibitor products or RNAs.
  • the design of the nucleotide sequence of the siRNA of the invention would also be evident to one skilled in the art. Thus, it could be done through a random design in which 19-25 bases of the target mRNA are selected without taking into account the sequence or positional information that it has in the transcript.
  • Another non-limiting alternative of the present invention would be the conventional design by simple parameters developed by the pioneers of the technique (Calipel, A. et al., 2003. J Biol Chem. 278 (43): 42409-42418) completed with an analysis BLAST nucleotide.
  • Another possibility could be a rational design, in which a computer procedure is used to identify the optimal siRNA targets in an mRNA. The target sequences are analyzed in groups of 19 nucleotides at the same time and those with the best characteristics are identified based on an algorithm that incorporates a large number of thermodynamic and sequence parameters.
  • a genetic DNA construct could also be part of the composition of the invention, which would direct the in vitro or intracellular transcription of the siRNA sequence or RNA construct of the invention, and comprising at least one of the following types of sequences: a) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, comprising, at least, the sequence encoding the siRNA of the invention or the RNA construct of the invention for transcription, or, b) nucleotide sequence of DNA, preferably double stranded, corresponding to a gene expression system or vector comprising the sequence coding for the RNA sequence of the invention operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence of interest, and with other sequences necessary or appropriate for transcription and its regulation suitable in time and place, for example, start and end signals, cut sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), etc.
  • compositions of the present invention allow the transfection of the siRNA of the invention into a cell, in vivo or in vitro.
  • the transfection could be carried out, but not limited to, direct transfection or vectors that facilitate the access of the siRNA inside the cell.
  • vectors are, without limitation, retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, Herpes simplex viruses, non-viral DNA plasmids, cationic liposomes and molecular conjugates.
  • the siRNAs of the present invention, as well as RNA or DNA precursors of these siRNAs can be conjugated with release peptides or other compounds to favor the transport of these siRNAs into the cell.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts with) the protein. IKKalpha.
  • portions of immunologically active immunoglobulin molecules include F (ab) and F (ab ') 2 fragments that can be generated by treating the antibody with an enzyme such as pepsin. It can be a monoclonal or polyclonal antibody.
  • the antibodies capable of binding to the IKKalpha protein can be used to inhibit the activity of said protein.
  • Anti-IKK ⁇ antibodies are commercially available (such as, but not limited to, Anti-IKK ⁇ antibodies marketed by Sigma-Aldrich 16139, I7778, I7903, which recognize as peptide antigens corresponding to amino acids (718-732), (699 715) and (716-734) of the human IKB Kinase ⁇ (I KKa or IKKalpha)
  • the antibodies, or fragments thereof, could be able to inhibit the activity of the IKKalpha protein that contributes to the acquisition of the characteristics typical of the estrolisis.
  • Antibodies can be polyclonal (typically include different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen).
  • the monoclonal antibody can be altered biochemically, by genetic manipulation, or it can be synthetic, possibly lacking the antibody in whole or in parts, of portions that are not necessary for the recognition of the IKK alpha and being substituted by others that communicate additional advantageous properties to the antibody.
  • the antibody can also be recombinant, chimeric, humanized, synthetic or a combination of any of the foregoing.
  • a "recombinant antibody or polypeptide” is one that has been produced in a host cell that has been transformed or transfected with the nucleic acid encoding the polypeptide, or produces the polypeptide as a result of homologous recombination.
  • rAc can be expressed and directed to specific cellular sub-compartments when the appropriate sequences for intracellular traffic are incorporated.
  • These antibodies are called intrabodies, and have proven effective not only to divert proteins from their usual compartment or block interactions between proteins involved in signaling pathways, but also to activate proteins. intracellular
  • DNA capable of transcribing to a peptide, antibody or antibody fragment, for use in the treatment of diseases that occur with Acantolysis.
  • Said genetic construction of DNA would direct the in vitro or intracellular transcription of the antibody sequence or fragment thereof, and comprises, at least, one of the following types of sequences: a) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, which it comprises, at least, the coding sequence of the antibody of the invention or of the antibody fragment of the invention for its transcription in vitro, or intracellular, b) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, corresponding to a system or vector of gene expression comprising the sequence coding for the antibody sequence or antibody fragment of the invention operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence of interest, and with other sequences necessary or appropriate for transcription and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, sites of cutting, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activ
  • ribozyme refers to a catalytic polynucleotide (typically RNA), which can be constructed to specifically recognize, by hybridization, an mRNA and fragment it or eliminate its expression. Ribozymes can be introduced into the cell as catalytic RNA molecules or as genetic constructs that are expressed to RNA catalytic molecules.
  • clolysis is defined as the loss of connection between the keratinocytes of the epidermis as a result of the destruction of intercellular desmosomes, which leads to the formation of blisters and to the total disunity and subsequent detachment of keratinocytes.
  • the clolysis appears classically in Hailey-Hailey disease, Darier's disease, transient chololytic dermatitis, pemphigus group, herpesvirus infection or verrucous dyskeratoma. In addition, it can occur in staphylococcal scalded skin syndrome, impetigo, actinic chololytic keratosis or squamous cell carcinoma. Finally, the clolysis can also be an incidental finding. It has been described in many benign and malignant epithelial disorders, fibrohistiocytic lesions, melanocytic lesions and inflammatory lesions. These histopathological changes can appear both within the lesion and on the adjacent healthy skin. The cause of this incidental finding remains unknown.
  • the composition of the invention is used for the treatment of a disease that is selected from the list comprising: Hailey-Hailey disease (familial benign chronic pemphigus), Darier's disease, dermatitis transient chololytic disease (Grover's disease), the pemphigus group, herpesvirus infection or verrucous dyskeratoma, staphylococcal scalded skin syndrome, impetigo, actinic chololytic keratosis, or squamous epidermoid carcinoma.
  • the composition of the invention is used for the treatment of squamous cell carcinoma.
  • the composition of the invention is used for the treatment of pemphigus.
  • the composition of the invention is used for the treatment of vulgar pemphigus.
  • pemphigus refers to an autoimmune disease, clinically characterized by blisters and erosions located in the skin and / or mucous membranes.
  • the patients present with circulating peripheral blood IgG autoantibodies directed against different proteins of the desmosomes, producing a break in the intercellular junctions between the keratinocytes, and the subsequent appearance of blisters.
  • pemphigus Within the pemphigus group we will distinguish different entities: vulgar pemphigus, vegetative pemphigus, leaf pemphigus, erythematous pemphigus, herpetiform pemphigus, IgA pemphigus, drug-induced pemphigus and paraneoplastic pemphigus.
  • the 3 entities with the greatest clinical relevance are pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus and pemphigus paraneoplastic.
  • Pemphigus vulgaris is the most common clinical form of pemphigus and represents 85% of the total. It is characterized by flaccid intraepidermal blisters that originate from estrolisis. It usually affects individuals between Ia and Ia 3 to 5 Ia decade of life, with no sex predilection.
  • Paraneoplastic pemphigus is a polymorphic mucocutaneous rash, associated with internal neoplasia, usually lymphoproliferative disorders. It is an autoimmune disease due to autoantibodies against 5 different proteins (Desmoplaquina 1 (250 KD), Desmoplaquina Il (Envoplaquina) (210 KD), Ag bullous pemphigoid (230 KD), Periplaquine (190 KD) and an unidentified protein (170 KD), which would be responsible for the loss of adhesion between the cells of the epidermis.
  • Desmoplaquina 1 250 KD
  • Desmoplaquina Il 210 KD
  • Ag bullous pemphigoid 230 KD
  • Periplaquine 190 KD
  • an unidentified protein 170 KD
  • composition of the invention comprises an antisense oligonucleotide and is used for the treatment of squamous cell carcinoma.
  • composition of the invention comprises an antisense oligonucleotide and is used for the treatment of pemphigus vulgaris.
  • the composition of the invention comprises an antibody and is used for the treatment of squamous cell carcinoma.
  • the composition of the invention comprises an antibody and is used for the treatment of pemphigus vulgaris.
  • Treatment refers to both therapeutic and prophylactic treatment or preventive measures. Those necessary for treatment include those already associated with alterations as well as those in which the alteration is prevented.
  • An “alteration” is any condition that would benefit from treatment with the composition of the invention, as described herein.
  • composition provided by this invention can be facilitated by any route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form suitable to the route of administration chosen.
  • the IKKalpha activity modulating agents of said compositions are in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of modulating agents (or genetic constructions that allow their intracellular expression) calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes , due to the characteristics of said agents (and constructions) and the therapeutic effect to be achieved.
  • the pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • the invention provides methods for identifying compounds that can be used for the treatment of diseases related to IKKalpha, and in particular those that are associated with a spolysis. These methods allow the identification of candidates, compounds to be tested or agents (for example, peptides, peptidomimetics, organic molecules, antisense oligonucleotides or other molecules) that can bind to IKKalpha and / or have an activating or inhibiting effect of the biological activity of IKKalpha or of its expression, and thus determine if these compounds would have an effect on the diseases in which IKKalpha is involved, and specifically those that go with a clolysis.
  • agents for example, peptides, peptidomimetics, organic molecules, antisense oligonucleotides or other molecules
  • Assays to identify these molecules, compounds or agents that modulate the activity of IKKalpha can employ cells that express IKKalpha, or in assays with isolated IKKalpha (or with its variants, as biologically active fragments or fusion proteins that include a portion or part of IKKalpha).
  • Another aspect of the invention consists in a method of selection of therapeutic agents useful in the treatment of diseases that occur with an estrolysis comprising:
  • these assays may involve the complete IKKalpha polypeptide, a biologically active fragment thereof, or a fusion protein that involves all or a portion of the IKKalpha polypeptide. Determining the ability of a compound to modulate the activity of IKKalpha can be performed, for example, by determining the ability of IKKalpha to bind or interact with a target molecule of said compound, directly or indirectly. They can also be activity tests, directly or indirectly measuring the activity of IKKalpha. It can also be an expression assay, directly or indirectly determining the expression of the IKKalpha mRNA or of the IKKalpha protein.
  • tests can also be combined with an in vivo test by measuring the effect of a test compound on the symptoms of diseases related to IKKalpha, and in particular those that occur with a choleolysis (for example, but not limited to animal models or other model systems known in the art).
  • the compounds to be tested used in the method of selection of therapeutic agents are not limited to low molecular weight organic molecules, proteins (including antibodies), peptides, oliogonucleotides, etc. They can be natural and / or synthetic.
  • antibodies capable of binding to an IKKalpha epitope can also be used in immunohistochemical assays, such as Western blots, ELISAs, radioimmunoassays, immunoprecipitation assays, or other immunohistochemical assays known in the state of the art.
  • IKKalpha can be used to immunize an animal, to obtain polyclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies can also be prepared by techniques that allow the production of antibodies by cultured cell lines, which include, but are not limited to, hybridomas, human B cell hybridomas. Techniques for producing chimeric, humanized or synthetic antibodies are known.
  • the therapeutic agents identified by the selection method described herein can be used in an animal or other model to determine the mechanism of action of said agent. Moreover, the therapeutic agents selected by the method described herein would be used in the treatment of diseases that occur with the alteration of IKKalpha and, in particular, that occur with a spolysis.
  • a method of selection of therapeutic agents useful in the treatment of diseases that are present is described with a clolysis that includes:
  • a) determine the activity of IKKalpha at an established concentration of the compound to be analyzed or in the absence of said compound, b) determine the activity of IKKalpha at a concentration of the compound to be analyzed different from that of a).
  • Another aspect of the invention consists in a method of selection of therapeutic agents useful in the treatment of diseases that occur with an astrolysis comprising:
  • the diseases in which the alteration of the activity of IKKalpha can be diagnostic, and in particular those that are studied with chorolysis, can be detected by measuring the amount of nucleic acids (DNA and / or RNA and / or mRNA) that code for IKKalpha, or the amount of IKKalpha protein that is expressed, compared to normal cells.
  • the detection of oligonucleotides can be done by methods well known in the state of the art (such as, but not limited to, probes with labeled nucleotides, DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR amplification using labeled nucleotides, the RT-PCR).
  • IKKalpha protein Methods for detecting the expression of the IKKalpha protein are also well known in the state of the art, such as, for example, poly or monoclonal antibodies, ELISA, radioimmunoassay (RIA), and FACS (fluorescence activated cell sorting).
  • poly or monoclonal antibodies such as, for example, poly or monoclonal antibodies, ELISA, radioimmunoassay (RIA), and FACS (fluorescence activated cell sorting).
  • ELISA ELISA
  • RIA radioimmunoassay
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • a method for the collection of data useful in the diagnosis and / or prognosis of diseases that occur with a spinalysis comprising:
  • a) determine the expression of IKKalpha in a sample taken from a mammal, b) compare the values of the expression of IKKalpha obtained in a) with the standard values in healthy or diseased mammals.
  • CECAs carcinomas are preferably included. More preferably, the method includes the determination of the values of IKKalpha, cadherin-E, and of the keratins K1 and K10.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • peptide refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • word “comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and characteristics of the invention will emerge partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIG. 1 Accelerated differentiation in clones H-IKKa.
  • A Expression of IKKa on day 6 of differentiation in H-IKK ⁇ -Pool and H-Control by Western blot.
  • B H-IKK ⁇ -Pool, H-IKK ⁇ -2c and H-Control cells under differentiation conditions.
  • C Northern blot of the keratin HK10 in H-IKK ⁇ -Pool ( ⁇ ) and H-Control (Co). 7S, load control. The graph represents the quantification of the relative expression levels of K10, corrected by the signals obtained for 7S.
  • D Corneocytes in the H-IKK ⁇ -Pool and H-Control cultures on day 9 of differentiation.
  • Fig. 2 Increased levels of cadherin-E expression in H-IKKa cells. Effect of cadherin-E blockade on the differentiation of H-IKKa cells.
  • A, C Western blot of cells in monolayer culture (A) and at 6 days of differentiation (C).
  • B Immunofluorescence of H-IKKa and H-Control cells, in conventional culture, with a specific antibody against cadherin E.
  • D Inhibition of stratification in H-IKKa by blocking cadherin-E. 7 days under differentiation conditions and incubated with 20 ⁇ g / ml of the anti-cadherin-E blocking antibody, 20 ⁇ g / ml of control IgG or untreated cells.
  • FIG. 3 Expression of IKK ⁇ and cadherin-E in PDVC57 Co and IKK ⁇ cells and tumors.
  • A, B Expression of the HA epitope, I KKa and cadherin-E by Western blot in cells (A 1 ) in tumors (B).
  • Fig. 4 Histological analysis of C57-Control and C57-IKK ⁇ tumors and human ECSC.
  • AH Staining H / E. Invaginations in the cavities forming pseudoglandular structures in C57-IKK ⁇ tumors (E, * - asterisks indicate the cavities formed by pseudogladular structures-); Chololytic cells (D, black arrows).
  • FH histology of human ECSC tumors. It is noteworthy the marked similarity of the histological phenotype between C5-IKK ⁇ tumors and human ECSC: intratumoral cavities filled with discohesive keratinocytes (dates in G) are characteristic of this CEC variant.
  • H Papillary projection within a cavity (the cavity has been delimited with the black line for clarity)
  • Fig. 5 Immunohistochemical analysis of C57-Control and C57-IKK ⁇ tumors. Analysis of the expression of the proteins IKK ⁇ (A, B), K1 (C, D), K13 (E, F) and cadherin-E (G, H) by immunohistochemical staining. Cytosolic staining of cadherin-E in the CECA (H) and membrane regions in the CEC (G, H).
  • Fig. 6. Immunohistochemical analysis of human tumors CECs with different degrees of differentiation and CECAs. Analysis of the expression of the proteins IKK ⁇ (AC), cadherin-E (DF) and K1 (GI) by immunohistochemical staining in histological sections of human tumors (CECs of different degrees of differentiation and CECAs).
  • the C-insert indicates preferably cytosolic staining of cadherin-E in the chololytic keratinocytes.
  • the asterisk (G) shows positive staining of K1 in a CEC spot found in the ECSC tumor.
  • IKKalpha and cadherin-E Similarity in the expression of IKKalpha and cadherin-E in C57-IKKalpha tumors, in human ECSC and in human vulgar pemphigus. Note the high expression of IKKalpha and cadherin-E in the discohesive keratinocytes found inside the cavities that form in the three types of samples.
  • Fig. 8 Delocalised expression of implicacrine in an example of seborrheic keratosis with estrolisis and in the HaCaT-IKKalpha skin equivalents.
  • Fig. 9 Offshoring expression of placoglobin in pemphigus vulgaris and in HaCaT-IKKalpha skin equivalents. Suprabasal staining of placoglobin in the HaCaT-Control skin equivalents and delocalized expression in the immediate suprabasal layer at the basal level in the HaCaT IKKalpha skin equivalents. Observe the intense suprabasal staining of placoglobin in normal human skin, while in the PV the placoglobin staining appears delocalized, being more intense in the regions where the breakage occurs due to the spine (above the basal layer).
  • Fig. 10 Decrease in the expression of Dsg3 in the HaCaT-IKKalpha skin equivalents. Above: Relative expression of Dsg3 in skin equivalents of HaCaT-IKKalpha cells with respect to HaCaT-Control equivalents. Note that Dg3 decreases to 67%. Below: Dsg3 mRNA expression in two different samples of HaCaT-Control cells (blue curves) and HaCaT-IKKalpha (red curves).
  • IKK ⁇ accelerates the early differentiation of keratinocytes (stratification) and allows them to reach terminal differentiation (measured as presence of corneocytes) (Fig. 1).
  • These experiments have been carried out by means of the stable transfection of the HaCaT human keratinocyte line that has the property of differentiating in plaque in the absence of serum, as demonstrated by the expression of keratins K1 and K10 (early differentiation markers) and the formation of clusters of stratification.
  • H-IKKa I KKa
  • H-Co control cells
  • K10 keratin an early marker of epidermal differentiation
  • the terminal differentiation was studied in the H-IKK ⁇ -Pool and H-Control cultures on different days, by analyzing the presence of corneocytes in the culture.
  • the corneocytes are flattened and coreless keratinocytes, in a terminal stage of differentiation.
  • On day 9 of differentiation we found abundant corneocytes in H-IKK ⁇ -Pool while they were not observed in the control ( Figure 1-D).
  • On day 16 of differentiation it was observed that the number of corneocytes in H-IKKa was much higher than that found in control cells (125 ⁇ 10.7 x10 4 versus 1.5 ⁇ 0.9 x10 4 per ml; p ⁇ 0.01).
  • Cadherin-E expression was analyzed by Western blotting and immunofluorescence and we observed a substantial increase in the levels of this protein in keratinocytes expressing high levels of IKK ⁇ , both undifferentiated ( Figure 2 A and B) and in the digested cells ( Figure 2 C).
  • a specific antibody against cadherin-E was used, blocking its activity and we verified that the partial blocking of the function of cadherin-E with 5 and 10 ⁇ g / ml of antibody partially blocked the differentiation of H-IKKa cells, while that a total inhibition, in the presence of 20 ⁇ g / ml of antibody Ia completely inhibited (Figure 2 D).
  • cadherin-E has a fundamental role as mediator of the effect of I KKa on the differentiation of keratinocytes, since the partial blockage of the function of cadherin-E partially inhibits the differentiation induced by IKK ⁇ , while this is completely inhibited with a major blockage. These results therefore indicate that IKK ⁇ regulates the differentiation of keratinocytes by a mechanism dependent on cadherin-E.
  • Example 2 Study of the role of IKK ⁇ in epidermal carcinogenesis. IKK ⁇ as a tumor suppressor in skin
  • human CECAs have the same characteristics as murine CECAs: they express high levels of IKK ⁇ and cadherin-E in the absence of K1 and K10. These results therefore demonstrate that IKK ⁇ increases the malignancy of tumor epidermal cells and is responsible for the appearance of the histological variant of human ECSC.
  • This type of tumor resembles human pseudoglandular (CECA) or pseudoglandular tumors (Figure 4 F-H), in which tumor cells proliferate forming gland-like structures or acini (intraepidermal cystic cavities) that vary in size (Figure 4 F ) that contain in the light cells that are detached (chololytic keratinocytes) ( Figure 4 G, black arrows).
  • Figure 4 F the appearance of tubular or alveolar structures similar to pseudoglandular appendages is frequent ( Figure 4- H, asterisks).
  • Example 3 Involvement of IKK alpha in the development of other diseases of the skin that occur with a clolysis.
  • the Dsg3 resulting in an absence of function of this protein.
  • the Dsg3 is responsible for maintaining the union between the keratinocytes, so that their lack of function causes a rupture (blister) between the basal and immediate suprabasal layers; subsequently, the disunity originates between the keratinocytes and therefore the phenomenon of the coralolysis.
  • HaCaT-IKKalpha equivalents show a phenotype similar to that of vulgar pemphigas in terms of the presence of spongiosis (intercellular spaces) that are also found in vulgar pemphiguses (Fig. 11).

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Abstract

Composición que comprende un agente modulador de la actividad de IKKalpha, para el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis, y más específicamente para el tratamiento del carcinomas epidermoides o 5escamoso-celulares y del pénfigo. Método de selección de fármacos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis y método para la recolección de datos útiles en el diagnóstico de dichas enfermedades.

Description

COMPOSICIÓN CAPAZ DE MODULAR LA ACTIVIDAD DE IKKalpha PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES QUE CURSAN CON
ACANTOLISIS.
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular y de Ia medicina, y específicamente se refiere a una composición capaz de modular Ia actividad de Ia IKKalpha para el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis, y más específicamente para el tratamiento de los carcinomas epidermoides o escamoso-celulares y del pénfigo. También se refiere a un método de selección de fármacos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis y a un método para Ia recolección de datos útiles en el diagnóstico de dichas enfermedades.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La incidencia de las neoplasias, tanto benignas como malignas de Ia piel, ha crecido alarmantemente en los últimos años, siendo además Ia piel uno de los principales sitios de metástasis de otras neoplasias. En concreto, las neoplasias epiteliales son una de las principales causas de enfermedad en humanos: el carcinoma basocelular (CBC) y el carcinoma epidermoide, espinocelular o de células escamosas (CEC) son las más frecuentes de todas las neoplasias malignas de Ia piel. El CEC es un tumor maligno de las células queratinizantes de Ia epidermis y sus anexos. Compromete a Ia piel y a las mucosas con epitelio escamoso. Es el segundo cáncer más frecuente de Ia Dermatología, con importante crecimiento de las tasas de incidencia en las últimas décadas, especialmente en personas inmunodeprimidas. Puede ser muy agresivo y metastático, y se han descrito numerosas variantes dependiendo de su modelo de crecimiento y grado de diferenciación: así, los CEC típicos pueden ser bien diferenciados, moderadamente diferenciados, pobremente diferenciados o CEC fusocelulares; otras variantes son el CEC acantolítico o pseudoglandular, el CEC pseudovascular, los CEC que se producen en Ia enfermedad de Bowen, el carcinoma verrugoso y el carcinoma desmoplástico. Sin embargo, se conoce poco al respecto de los mecanismos que dan lugar a un CEC típico o a una variante distinta, como en concreto Ia CEC acantolítica.
La acantolisis consiste en Ia pérdida de conexión entre los queratinocitos de Ia epidermis como resultado de Ia destrucción de los desmosomas intercelulares que conlleva a Ia formación de hendiduras y vesículas intraepidérmicas. En Ia tabla 1 se muestra una clasificación de las enfermedades que cursan con acantolisis.
Figure imgf000003_0001
Tabla 1. Clasificación de enfermedades que cursan con acantolisis.
La enfermedad de Hailey-Hailey o pénfigo benigno familiar es un trastorno autosómico dominante que afecta al gen ATP2C1 del cromosoma 3. Este gen codifica una bomba de calcio cuya función es aportar dicho elemento al interior del aparato de Golgi y que resulta fundamental para Ia síntesis proteica. La alteración de esta ATP-asa conlleva una disminución del calcio a dicho nivel provocando un déficit en Ia síntesis de las proteínas de adhesión intercelular. El grupo de los pénfigos es un grupo de patologías de origen autoinmune Ia acantolisis se produce porque existen autoanticuerpos dirigidos en el caso del pénfigo vulgar y vegetante contra Ia desmogleína 3 y 1 y en el caso del pénfigo foliáceo y eritematoso contra Ia desmogleína 1. La enfermedad de Darier es un trastorno autosómico dominante (localizado en el gen ATP2A2 del cromosoma 12) en el que se produce una alteración de Ia queratinización.
En Ia infección por herpesvirus también se observan células acantolíticas además del efecto citopático viral con balonización y formación de células multinucleadas, así como en el acantoma acantolítico, un tumor solitario que afecta predominante al tronco de individuos de mediana edad.
Se ha descrito acantolisis incidental en multitud de lesiones epiteliales, fibrohistiocitarias, melanocíticas o inflamatorias. En lesiones epiteliales se ha descrito en Ia queratosis seborreica, condilomas acuminados, carcinoma basocelular y carcinoma epidermoide clásico. En lesiones fibrohistiocitarias se ha descrito en el dermatofibroma, en Ia pápula fibrosa y en cicatrices, en lesiones melánicas se ha descrito en nevus melanocítico y se ha postulado que podría tratarse de un marcador de atipia melanocítica y en melanomas malignos. En lesiones inflamatorias ha aparecido en psoriasis, en pitiriasis rubra pilar, pitiriasis rosada y condrodermatitis de hélix. Por último también se ha descrito en comedones o en folículos rotos.
El mecanismo por el que se produce Ia acantolisis a nivel molecular aún no se conoce con exactitud, postulándose que Ia acantolisis podría tratarse de un marcador de atipia en proliferaciones cutáneas, ya que se describe con frecuencia en lesiones tumorales incipientes. Los avances en los mecanismos moleculares implicados en Ia acantolisis permitirían disponer de agentes terapéuticos útiles en tratamiento de estas enfermedades y de métodos para el diagnóstico correcto de las mismas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de Ia presente invención han demostrado que Ia estimulación de Ia expresión de IKKalpha incrementa tanto Ia diferenciación temprana como tardía de los queratinocitos humanos a través de un mecanismo dependiente de cadherina-E, y que Ia expresión de niveles elevados de IKKalpha en células epidérmicas tumorales de ratón induce, cuando estas células son inoculadas en ratones inmunosuprimidos, un cambio en Ia variante histológica de los carcinomas de células escamosas (CECs) que se producen, de modo que en vez de desarrollar CECs convencionales, dan lugar a Ia aparición de unos tumores pseudoglandulares semejantes a los CECs acantolíticos humanos (CECAs). Estos CECAs murinos se caracterizan por una expresión elevada de cadherina-E (de localización citosólica en vez de estar en Ia membrana celular) y ausencia de las queratinas K1 y K10, marcadoras de diferenciación que hasta ahora siempre se había encontrado que se expresaban de forma proporcional a IKKalpha y a cadherina-E. Se han caracterizado por primera vez propiedades moleculares de los CECAs humanos, tumores éstos de mal pronóstico, gran agresividad y elevado riesgo de metastatizar, encontrando que los CECAs humanos presentan las mismas características que los CECAs murinos inducidos por IKKalpha: expresan elevados niveles de IKKalpha y de caherina-E en ausencia de K1 y K10. Los inventores han puesto de manifiesto que IKKalpha es responsable de Ia aparición de Ia variante histológica de CECAs humanos, y que IKKalpha sería Ia molécula responsable del fenómeno de acantolisis en humanos, tanto en los tumores como en otras enfermedades que cursan con acantolisis
Un primer aspecto de Ia invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de Ia invención, que comprende un agente modulador de Ia actividad de IKKalpha para el tratamiento de enfermedades que cursan con acantolisis. El término "IKKalpha" ó "IKKα" (también llamado en Ia literatura IKK1 , I- kappa-B quinasa 1 , IKK-a quinasa o conserved helix-loop ubiquitous kinase) como se usa aquí se refiere a Ia subunidad alfa del complejo IKB quinasa, kappaB quinasa (IKK). El complejo IKK está formado por dos subunidades catalíticas IKKalpha e IKK beta y una subunidad reguladora (IKKgamma) y es fundamental en Ia regulación de Ia actividad del factor de transcripción NF-kappaB (Factor Nuclear kappa B). La actividad catalítica de IKKalpha en concreto es importante en Ia regulación de Ia actividad de éste factor. IKKalpha tiene otras funciones como son Ia modificación de Ia función de histonas, Io que es crítico para Ia activación de Ia expresión de genes dependientes de NF-kappaB. IKKa se asocia a acetil transferasas ya a deacetilasas de histonas e influye así en Ia regulación transcripcional de de genes no-dependientes de NF-kappaB.
A no ser que se indique Io contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "IKKalpha" ó "IKKα", se refiere tanto al gen como a Ia proteína IKKalpha humana. En el contexto de Ia presente invención, IKKalpha se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante de Ia proteína IKKalpha, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 1 , b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipétptido que comprende Ia secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con Ia SEQ ID NO: 1. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia proteína IKKalpha.
El término "que modula Ia actividad" como se usa aquí, se refiere tanto a que inhibe (disminuye) o estimula (incrementa) el nivel de actividad de Ia proteína IKKalpha en una célula. La actividad de IKKalpha puede ser modulada por Ia modificación de los niveles y/o de Ia actividad de Ia proteína IKKalpha, o por Ia modificación de los niveles a los que se transcribe el gen IKKalpha tal que los niveles de actividad de Ia proteína IKKalpha en Ia célula es modulada. Los agentes moduladores pueden ser también agonistas (sustancias que son capaces de unirse a un receptor y provocar una respuesta en Ia célula, en concreto un aumento de Ia actividad de IKKalpha), como antagonistas (sustancias que no solamente no activan el recptor, sino que en realidad bloquea su activación por los agonistas). En el contexto de Ia presente invención, Ia inhibición es Ia forma preferida de modulación.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, los agentes moduladores comprendidos en Ia composición de Ia invención se seleccionan de una lista que comprende: a) una molécula orgánica, b) una molécula de ARN, c) un oligonucleótido antisentido, d) un anticuerpo, o e) una ribozima.
Un experto en Ia materia podría preparar moléculas orgánicas que pueden unirse específicamente a Ia IKKalpha sin unirse a otros polipéptidos o proteínas. Las moléculas orgánicas tendrán preferiblemente un peso de 100 a 20.000 daltons, más preferiblemente 500 a 15.000 daltons, y más preferiblemente 1000 a 10.000 daltons. Librerías de moléculas orgánicas se encuentran disponibles comercialmente. La vía de administración puede ser, sin limitarse a estas, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmica. Entre las moléculas orgánicas moduladoras de Ia actividad de IKKalpha se encuentran, pero sin limitarnos, el hidrocloruro de N-(1 ,8-Dimetilimidazo[1 ,2-a]quinoxalin-4-il)-1 ,2-etanodiamina (BMS-
345541 ; Ci4Hi7N5 - HCI; PubChem ID 24724429) (Burke, J. R., et al., 2003. J. Biol. Chem. 278, 1450-1456; Mclntyre, K.W., et al., 2003. Arthritis Rheum. 48, 2652-2659), el N-(3,5-Bis-trifluorometilfenil)-5-cloro-2- hidroxibenzamida (IMD-0354; Ci5H8CIF6NO2; PubChem ID 24724513)( Tanaka A, et al., 2005. Blood 105, 2324-2331 ), el dihidrocloruro de N-(6- Cloro-9H-pirido[3,4-b]indol-8-il)-3-piridincarboxamida (PS-1145;
C17H11CIN4O - 2HCI; PubChem ID 24724584) (Lam, L.T., et al., 2005. Clin. Cáncer Res. 11 , 28-40; Yemelyanov, A., et al., 2006. Oncogene 25, 387- 398, Roychowdhury, S., et al, 2004. J. Nati. Cáncer Inst. 96, 1447-1457), Ia Wedelolactona (7-Metoxi-5,11 ,12-trihidroxicoumestan; C16H10O7; PubChem Substance ID 24724667),( Kobori et al., 2004. Ce// Death and Differentiation 11 , 123-130), y Ia Tetrazolopiridazin-fenilsulfoxido (Ci0H7N5OS; PubChem Substance ID 24724597), (Swinney, D.C., et al., 2002. J. Biol. Chem. 277, 23573-23581 ).
Recientemente, con el desarrollo de Ia tecnología antisentido, secuencias de nucleótidos específicamente complementarios a una determinada secuencia de ADN o ARN, podrían formar complejos y bloquear Ia transcripción o traducción. Así, con el progreso del silenciamiento génico post-transcripcional, y en particular del ARN de interferencia (RNA interferente o RNAi), se han desarrollado herramientas que permiten Ia inhibición específica de Ia expresión de un gen. La inhibición de Ia expresión de Ia proteína IKKalpha constituiría por ende Ia inhibición de su actividad biológica, y en concreto, de Ia actividad que está contribuyendo al agravamiento de las características tumorales de las células cancerosas y/o a Ia aparición de acantolisis. Por "polinucleótidos antisentido" se entienden cadenas de ribonucleótidos o desoxirribonucleóitidos que pueden inhibir Ia producción de Ia proteína IKKalpha por uno de estos tres mecanismos:
1- Interfiriendo Ia transcripción, al hibridar en el gen estructural o en una región regulatoria del gen que codifica para IKKalpha. Puesto que Ia transcripción o expresión es bloqueada de manera efectiva por Ia hibridación del oligonucleótido antisentido con el ADN, disminuye Ia producción de IKKalpha.
2- La unión del oligonucleótido antisentido en el citoplasma con el ARNm, interfiriendo con Ia formación de Ia construcción de traducción propiamente dicha, inhibiendo Ia traducción de ARNm a Ia proteína.
3- La formación de un ARNm - antisentido dúplex que permite una rápida degradación del ARNm dúplex por ARNasas (como ARNasa H). Esto da lugar a una menor producción de IKKalpha.
Oligonucleótidos antisentido capaces de modular Ia actividad de Ia IKKalpha son conocidas en el estado de Ia técnica. Por ejemplo, y sin limitarnos, podría ser una secuencia de ribonucleótidos o ARN que pertenece al denominado siRNA (small interferíng RNA), ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento, capaz de inhibir Ia expresión genética de Ia proteína IKKalpha. En el contexto de Ia presente memoria se entiende como "siRNA" (small interferíng RNA ó ARN pequeño de interferencia) una clase de ARN de doble cadena de 19 a 25 nucleótidos de largo, y más preferentemente entre 21 y 23 nucleótidos, que está involucrado en Ia ruta de Ia interferencia de ARN, donde el siRNA interfiere Ia expresión de un gen específico. En Ia presente invención, este gen específico es el IKKalpha. En este sentido, Ia presente invención incluye a título ilustrativo como siRNA, pero sin limitarse, los recogidos en Ia solicitud de patente US 2007/0191300 (que corresponden a las secuencias SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 8). También podría ser cualquier siRNA capaz de hibridar una molécula de ácido nucleico que codifique Ia proteína IKKalpha humana que se recoge en Ia SEQ ID NO: 1. También podrían ser una construcción de ARN que al menos contenga una cualquiera de las secuencias de nucleótidos posibles de siRNA capaces de inhibir Ia expresión de IKKalpha, y sin perjuicio de que adicionalmente formen parte de Ia presente invención cualquiera de las secuencias y construcciones de RNA de Ia invención anteriormente descritas que sean objeto de modificaciones, preferentemente químicas, que conduzcan a una mayor estabilidad frente a Ia acción de ribonucleasas y con ello a una mayor eficiencia. Sin que dichas modificaciones supongan Ia alteración de su mecanismo de acción, que es Ia unión específica al complejo RISC (RNA- induced silencing complex), activándolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo Ia hebra antisentido asociada al complejo. El complejo ribonucleoprotéico resultante se une al mRNA diana (ARN mensajero del IKKalpha, que se recoge en Ia SEQ ID NO: 2). Si Ia complementariedad no es perfecta, RISC queda asociado al mensajero y se atenúa Ia traducción. Pero si es perfecta, RISC actúa como RNasa, cortando al mensajero y quedando libre para repetir el proceso.
Adicionalmente resulta evidente para un experto en Ia materia que una gran cantidad de polinucleótidos de mARN pueden traducirse a IKKalpha como consecuencia, por ejemplo, de que el código genético es degenerado. Cualquier siRNA capaz de inhibir Ia traducción de estos mARN también forman parte de Ia invención.
La preparación de Ia secuencia de siRNA de Ia invención o de Ia construcción de RNA de Ia invención sería evidente para un experto en Ia materia, y se podría llevar a cabo por síntesis química, Io cual permite además Ia incorporación de modificaciones químicas tanto en los distintos nucleótidos del producto como Ia incorporación de otros compuestos químicos en cualquiera de los extremos. Por otro lado, Ia síntesis también podría realizarse enzimáticamente utilizando cualquiera de las RNA polimerasas disponibles. La síntesis enzimática también permite alguna modificación química de los productos o RNAs inhibidores.
El diseño de Ia secuencia de nucleótidos del siRNA de Ia invención también sería evidente para un experto en Ia materia. Así, se podría realizar mediante un diseño aleatorio en el que se seleccionen 19-25 bases del ARNm diana sin tener en cuenta Ia secuencia o Ia información posicional que tiene en el transcrito. Otra alternativa no limitativa de Ia presente invención sería el diseño convencional mediante parámetros simples desarrollados por los pioneros de Ia técnica (Calipel, A. et al., 2003. J Biol Chem. 278(43): 42409-42418) completados con un análisis BLAST de nucleótidos. Otra posibilidad podría ser un diseño racional, en el que se emplee un procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas de siRNA en un ARNm. Las secuencias diana se analizan en grupos de 19 nucleótidos a Ia vez y se identifican las que tienen mejores características en función de un algoritmo que incorpora un gran número de parámetros termodinámicos y de secuencia.
También podría formar parte de Ia composición de Ia invención una construcción genética de ADN, Ia cual dirigiría Ia transcripción in vitro o intracelular de Ia secuencia siRNA o construcción de ARN de Ia invención, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de ADN, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, Ia secuencia codificante del siRNA de Ia invención o de Ia construcción de ARN de Ia invención para su transcripción, o, b) secuencia de nucleótidos de ADN, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende Ia secuencia codificante de Ia secuencia de ARN de Ia invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc.. para su uso en aquellos contextos patológicos en los que IKKalpha está contribuyendo al agravamiento de las características tumorales de las células cancerosas y/o a Ia aparición de acantolisis. Múltiples de estas construcciones, sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia (Sambrook et al. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York)
Las composiciones de Ia presente invención permiten Ia transfección del siRNA de Ia invención al interior de una célula, in vivo o in vitro. La transfección se podría llevar a cabo, pero sin limitarnos a, transfección directa o vectores que faciliten el acceso del siRNA al interior de Ia célula. Así, ejemplos de estos vectores son, sin limitarse a, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del Herpes simplex, plásmidos de DNA no virales, liposomas catiónicos y conjugados moleculares. Así, por ejemplo, los siRNA de Ia presente invención, así como ARN o ADN precursores de estos siRNA, pueden conjugarse con péptidos de liberación u otros compuestos para favorecer el transporte de estos siRNA al interior de Ia célula.
El término "anticuerpo" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) Ia proteína IKKalpha. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas, incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como Ia pepsina. Puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Los anticuerpos capaces de unirse a Ia proteína IKKalpha pueden ser empleados para inhibir Ia actividad de dicha proteína. Tales anticuerpos están disponibles comercialmente (como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, los anticuerpos Anti-IKKα comercializados por Sigma-Aldrich 16139, I7778, I7903, que reconocen como antígenos péptidos que corresponden a los aminoácidos (718-732), (699-715) y (716-734) de Ia IKB Kinasa α (I KKa ó IKKalpha) humana. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, podrían ser capaces de inhibir Ia actividad de Ia proteína IKKalpha que contribuye a Ia adquisición de las características propias de Ia acantolisis. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epitopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, por manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de Ia IKKalpha y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores.
Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es uno que ha sido producido en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de Ia recombinación homologa.
Estos rAc se pueden expresar y dirigir hacia subcompartimentos celulares específicos cuando se les incorpora las secuencias apropiadas para el tráfico intracelular. Estos anticuerpos se denominan intrabodies, y han demostrado su eficacia no sólo para desviar proteínas de su compartimento habitual o bloquear interacciones entre proteínas implicadas en vías de señalización, sino también para activar proteínas intracelulares.
También forman parte de Ia invención las construcciones genéticas de DNA capaces de transcribirse a un péptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para su uso en el tratamiento de enfermedades que cursan con acantolisis. Dicha construcción genética de DNA dirigiría Ia transcripción in vitro o intracelular de Ia secuencia del anticuerpo o fragmento del mismo, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, Ia secuencia codificante del anticuerpo de Ia invención o del fragmento de anticuerpo de Ia invención para su transcripción in vitro, o intracelular, b) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende Ia secuencia codificante de Ia secuencia de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de Ia invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc.. para su uso en aquellos contextos patológicos que transcurren con acantolisis.
Un "ribozima" tal y como se entiende en Ia presente invención, se refiere a un polinucleótido catalítico (típicamente RNA), que puede construirse para reconocer específicamente, por hibridación, un mRNA y fragmentarlo o eliminar su expresión. Las ribozimas pueden introducirse en Ia célula como moléculas de RNA catalíticas o como construcciones genéticas que se expresan a moléculas catalíticas de RNA. En esta memoria se define como "acantolisis" a Ia pérdida de conexión entre los queratinocitos de Ia epidermis como resultado de Ia destrucción de los desmosomas intercelulares, Io que conlleva a Ia formación de ampollas y a Ia total desunión y posterior desprendimiento de los queratinocitos. La acantolisis aparece clásicamente en Ia enfermedad de Hailey-Hailey, Ia enfermedad de Darier, Ia dermatitis acantolítica transitoria, el grupo de los pénfigos, Ia infección por herpesvirus o el disqueratoma verrucoso. Además puede ocurrir en el síndrome estafilocócico de Ia piel escaldada, el impétigo, Ia queratosis actínica acantolítica o el carcinoma epidermoide acantolítico. Por último, Ia acantolisis también puede ser un hallazgo incidental. Se ha descrito en multitud de trastornos epiteliales benignos y malignos, lesiones fibrohistiocitarias, lesiones melanocíticas y lesiones inflamatorias. Estos cambios histopatológicos pueden aparecer tanto dentro de Ia lesión como sobre Ia piel sana adyacente. La causa de este hallazgo incidental permanece desconocida.
En otra realización preferida de este aspecto, Ia composición de Ia invención se usa para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona de Ia lista que comprende: Ia enfermedad de Hailey-Hailey (Pénfigo crónico benigno familiar), Ia enfermedad de Darier, Ia dermatitis acantolítica transitoria (enfermedad de Grover), el grupo de los pénfigos, Ia infección por herpesvirus o el disqueratoma verrucoso, el síndrome estafilocócico de Ia piel escaldada, el impétigo, Ia queratosis actínica acantolítica o el carcinoma epidermoide acantolítico. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención se usa para el tratamiento del carcinoma epidermoide acantolítico. En otra realización más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención se usa para el tratamiento del pénfigo. En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención se usa para el tratamiento del pénfigo vulgar. En esta memoria el término "pénfigo" hace referencia a una enfermedad autoinmune, caracterizada clínicamente por vesículoampollas y erosiones localizadas en Ia piel y/o mucosas. Los pacientes presentan autoanticuerpos IgG circulantes en sangre periférica dirigidos contra diferentes proteínas de los desmosomas, produciendo una rotura de las uniones intercelulares entre los queratinocitos, y Ia aparición posterior de ampollas.
Dentro del grupo de los pénfigos distinguiremos diferentes entidades: pénfigo vulgar, pénfigo vegetante, pénfigo foliáceo, pénfigo eritematoso, pénfigo herpetiforme, pénfigo IgA, pénfigo inducido por fármacos y pénfigo paraneoplásico. Las 3 entidades con mayor relevancia clínica son el pénfigo vulgar, el pénfigo foliáceo y el pénfigo paraneoplásico.
El pénfigo vulgar es Ia forma clínica más común de pénfigo y representa un 85% del total. Se caracteriza por ampollas intraepidérmicas flácidas que se originan por acantolisis. Suele afectar a individuos entre Ia 3a y Ia 5a década de Ia vida, sin predilección de sexos.
En el pénfigo foliáceo las lesiones ampollosas se rompen muy fácilmente y en ocasiones son muy difíciles de ver, apreciándose únicamente lesiones descamativas y costrosas. Suelen localizarse en Ia cabeza y Ia parte superior de tronco y no existe afectación mucosa. Es una forma más benigna que el pénfigo vulgar. El examen histológico muestra los mismos hallazgos que en el pénfigo vulgar, pero con ampolla más superficial. El pronóstico es mejor que en el pénfigo vulgar.
El pénfigo paraneoplásico es una erupción mucocutánea polimorfa, asociada a neoplasia interna, generalmente transtornos linfoproliferativos. Es una enfermedad autoinmune por autoanticuerpos frente a 5 proteínas distintas (Desmoplaquina 1 (250 KD), Desmoplaquina Il (Envoplaquina) (210 KD), Ag penfigoide ampolloso (230 KD), Periplaquina (190 KD) y una proteína no identificada (170 KD), que serían los responsables de Ia pérdida de adhesión entre las células de Ia epidermis.
Clínicamente se manifiesta como lesiones polimorfas, a modo de ampollas flaccidas o tensas, con o sin erosiones, que pueden simular un liquen plano, eritema multiforme o pénfigo vulgar o vegetante, localizadas en habitualmente en el tronco y Ia parte proximal de las extremidades. Es frecuente que exista afectación palmoplantar y perioniquia. Suelen respetar Ia cabeza y Ia cara. Puede afectarse mucosa oral, provocando una estomatitis intratable que suele ser el primer síntoma de Ia enfermedad. Con frecuencia conduce a caquexia y se precisa alimentación parenteral o enteral. Puede haber también afectación ocular a modo de conjuntivitis pseudomembranosa, simblefaron y deficiencias visuales importantes. Otras mucosas que pueden también afectarse son Ia mucosa genital y esofágica.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención comprende un oligonucleótido antisentido y se usa para el tratamiento del carcinoma epidermoide acantolítico. En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención comprende un oligonucleótido antisentido y se usa para el tratamiento del pénfigo vulgar.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención comprende un anticuerpo y se usa para el tratamiento del carcinoma epidermoide acantolítico. En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición de Ia invención comprende un anticuerpo y se usa para el tratamiento del pénfigo vulgar. "Tratamiento" se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene Ia alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con Ia composición de Ia invención, tal y como se describe en el presente documento.
La composición proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida. Los agentes moduladores de Ia actividad de IKKalpha de dichas composiciones se encuentran en una cantidad terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de agentes moduladores (o construcciones genéticas que permitan su expresión intracelular) calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos agentes (y construcciones) y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia.
La invención proporciona métodos para identificar compuestos que pueden ser usados para el tratamiento de enfermedades relacionadas con IKKalpha, y en concreto aquellas que cursan con acantolisis. Estos métodos permiten Ia identificación de candidatos, compuestos a ensayar o agentes (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas orgánicas, oligonucleótidos antisentido o otras moléculas) que pueden unirse a IKKalpha y/o tener un efecto activador o inhibidor de Ia actividad biológica de IKKalpha o de su expresión, y así determinar si esos compuestos tendrían un efecto sobre las enfermedades en las que IKKalpha está implicado, y en concreto aquellas que cursan con acantolisis.
Los ensayos para identificar estas moléculas, compuestos o agentes que modulan Ia actividad de IKKalpha pueden emplear células que expresan IKKalpha, o en ensayos con IKKalpha aislado (o con sus variantes, como fragmentos biológicamente activos o proteínas de fusión que incluyen una porción o parte de IKKalpha).
Así, otro aspecto de Ia invención consiste en un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende:
a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polipéptido IKKalpha, b) detectar Ia unión de dicho compuesto a analizar con el polipéptido IKKalpha.
Los compuestos que se unen al polipéptido IKKalpha se identificaían como agentes terapéuticos potenciales frente a enfermedades que cursan con acantolisis.
Como se ha dicho, estos ensayos pueden implicar el polipéptido completo IKKalpha, un fragmento biológicamente activo del mismo, o una proteína de fusión que implique toda o una porción del polipéptido IKKalpha. Determinar Ia capacidad de un compuesto para modular Ia actividad de IKKalpha puede realizarse, por ejemplo, determinando Ia capacidad de IKKalpha de unirse o interaccionar con una molécula diana de dicho compuesto, de manera directa o indirecta. Pueden ser también ensayos de actividad, midiendo de manera directa o indirecta Ia actividad de IKKalpha. También puede ser un ensayo de expresión, determinando de manera directa o indirecta Ia expresión del mARN de IKKalpha o de Ia proteína IKKalpha. Estos ensayos también pueden combinarse con un ensayo in vivo midiendo el efecto de un compuesto test sobre los síntomas de enfermedades relacionadas con IKKalpha, y en concreto aquellas que cursan con acantolisis (por ejemplo, pero sin limitarse, sobre modelos animales u otros sistemas modelo conocidos en Ia técnica).
Los compuestos a testar empleados en el método de selección de agentes terapéuticos no se limitan a moléculas orgánicas de bajo peso molecular, proteínas (incluyendo anticuerpos), péptidos, oliogonucleótidos, etc. Pueden ser naturales y/o sintéticos.
Por ejemplo, anticuerpos capaces de unirse a un epitopo de IKKalpha , que pueden ser empleados terapéuticamente, como se ha expuesto anteriormente, pueden emplearse también en ensayos inmunohistoquímicos, como Western blots, ELISAs, radioinmunoensayos, ensayos de inmunoprecipitación, o otros ensayos inmunohistoquímicos conocidos en el estado de Ia técnica. IKKalpha puede emplearse para inmunizar a un animal, para obtener anticuerpos policlonales. También se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas que permiten Ia producción de anticuerpos por líneas celulares en cultivo, entre las que se incluyen, pero sin limitarse, hibridomas, hibridomas de células B humanas. Técnicas para producir anticuerpos quiméricos, humanizados o sintéticos son conocidas.
Los agentes terapéuticos identificados por el método de selección aquí descrito pueden ser usados en un modelo animal o de otro tipo para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Más aún, los agentes terapéuticos seleccionados por el método aquí descrito se emplearían en el tratamiento de enfermedades que cursen con Ia alteración de IKKalpha y, en concreto, que cursen con acantolisis.
En otro aspecto de Ia invención se describe un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende:
a) determinar Ia actividad de IKKalpha a una concentración establecida del compuesto a analizar o en ausencia de dicho compuesto, b) determinar Ia actividad de IKKalpha a una concentración del compuesto a analizar diferente de Ia de a).
Compuestos que den lugar a una actividad diferente de IKKalpha se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente a enfermedades que cursan con acantolisis.
Otro aspecto de Ia invención consiste en un método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende:
a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polinucleótido IKKalpha, b) detectar Ia unión de dicho compuesto a analizar con el polinucleótido IKKalpha
Los compuestos que se unen al polinucleótido IKKalpha se identificarían como agentes terapéuticos potenciales frente a enfermedades que cursan con acantolisis.
Las enfermedades en las que Ia alteración de Ia actividad de IKKalpha puede ser diagnóstica, y en concreto aquellas que cursan con acantolisis, pueden ser detectadas midiendo Ia cantidad de ácidos nucleicos (ADN y/o ARN y/o mARN) que codifican para IKKalpha, o Ia cantidad de proteína IKKalpha que se expresa, en comparación con células normales. La detección de los oligonucleótidos puede hacerse por métodos bien conocidos en el estado de Ia técnica (como por ejemplo, pero sin limitarse, sondas con nucleótidos marcados, hibridación ADN-ADN ó ADN-ARN, amplificación por PCR empleando nucleótidos marcados, Ia RT-PCR). Procedimientos para detectar Ia expresión de Ia proteína IKKalpha también son bien conocidos en el estado de Ia técnica, como por ejemplo anticuerpos poli o monoclonales, ELISA, radioinmunoensayo (RIA), y FACS (fluorescence activated cell sorting).
Por tanto, en otro aspecto de Ia invención se describe un método para Ia recolección de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades que cursan con acantolisis que comprende:
a) determinar Ia expresión de IKKalpha en una muestra extraída de un mamífero, b) comparar los valores de Ia expresión de IKKalpha obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
Entre las enfermedades que cursan con acantolisis se incluyen preferiblemente los carcinomas CECAs. Más preferiblemente, el método incluye Ia determinación de los valores de IKKalpha, cadherina-E, y de las queratinas K1 y K10.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.
Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Diferenciación acelerada en los clones H-IKKa. (A) Expresión de IKKa en el día 6 de diferenciación en H-IKKα-Pool y H-Control mediante Western blot. (B) Células H-IKKα-Pool, H-IKKα-2c y H-Control en condiciones de diferenciación. C) Northern blot de Ia queratina HK10 en H- IKKα-Pool (α) y H-Control (Co). 7S, control de carga. La gráfica representa Ia cuantificación de los niveles relativos de expresión de K10, corregidos por las señales obtenidas para 7S. (D) Corneocitos en los cultivos de H- IKKα-Pool y H-Control en el día 9 de diferenciación.
Fig. 2. Aumento de los niveles de expresión de cadherina-E en células H-IKKa. Efecto del bloqueo de cadherina-E sobre Ia diferenciación e las células H-IKKa. (A, C) Western blot de células en cultivo en monocapa (A) y a los 6 días de diferenciación (C). (B) Inmunofluorescencia de células H-IKKa y H-Control, en cultivo convencional, con un anticuerpo específico contra cadherina E. D) Inhibición de Ia estratificación en H-IKKa mediante el bloqueo de cadherina-E. 7 días en condiciones de diferenciación e incubadas con 20 μg/ml del anticuerpo bloqueante anti- cadherina-E, 20 μg/ml de IgG control o células sin tratar. Las líneas en rojo y las flechas indican los cúmulos de estratificación. Fig. 3. Expresión de IKKα y cadherina-E en las células y tumores PDVC57 Co e IKKα. (A,B) Expresión del epítopo HA, de I KKa y de cadherina-E por Western blot en células (A1) en tumores (B).
Fig. 4. Análisis histológico de tumores C57-Control y C57-IKKα y CECAs humanos. (A-H) Tinción H/E. Invaginaciones en las cavidades formando estructuras pseudoglandulares en los tumores C57-IKKα (E, * - los asteriscos señalan las cavidades formadas por las estructuras pseudogladulares-); células acantolíticas (D, flechas negras). F-H, histología de tumores CECA humanos. Es de destacar Ia marcada similitud del fenotipo histológico entre los tumores C5-IKKα y los CECA humanos: las cavidades intratumorales rellenas de queratinocitos discohesivos (fechas en G) son características de esta variante de CEC. (H) Proyección papilar dentro de una cavidad (Ia cavidad se ha delimitado con Ia línea negra para mayor claridad)
Fig. 5. Análisis inmunohistoquímico de tumores C57-Control y C57- IKKα. Análisis de Ia expresión de las proteínas IKKα (A, B), K1 (C, D), K13 (E, F) y cadherina-E (G, H) mediante tinción inmunohistoquímica. Tinción citosólica de cadherina-E en las regiones CECA (H) y de membrana en las CEC (G, H).
Fig. 6. Análisis inmunohistoquímico de tumores humanos CECs con distinto grado de diferenciación y CECAs. Análisis de Ia expresión de las proteínas IKKα (A-C), cadherina-E (D-F) y K1 (G-I) mediante tinción inmunohistoquímica en cortes histológicos de tumores humanos (CECs de distinto grado de diferenciación y CECAs). El inserto en C indica tinción preferentemente citosólica de cadherina-E en los queratinocitos acantolíticos. El asterisco (G) muestra tinción positiva de K1 en un foco de CEC que se encuentra en el tumor CECA. Fig. 7. Figura 7. Similitud en Ia expresión de IKKalpha y cadherina-E en los tumores C57-IKKalpha, en los CECA humanos y en los pénfigos vulgares humanos. Obsérvese Ia expresión elevada de IKKalpha y de cadherina-E en los queratinocitos discohesivos que se encuentran en el interior de las cavidades que se forman en los tres tipos de muestras.
Fig. 8. Expresión deslocalizada de involucrina en un ejemplo de queratosis seborreica con acantolisis y en los equivalentes de piel HaCaT-IKKalpha. Tinción suprabasal de involucrina en los equivalentes de piel HaCaT-Control y expresión deslocalizada en Ia capa suprabasal inmediata a Ia basal en los equivalentes de piel HaCaT IKKalpha. Tinción suprabasal de involucrina en Ia piel humana normal, sin alteraciones, y tinción deslocalizada, basal en las regiones de acantolisis de Ia queratosis humana.
Fig. 9. Expresión deslocalizada de placoglobina en pénfigo vulgar y en los equivalentes de piel HaCaT-IKKalpha. Tinción suprabasal de placoglobina en los equivalentes de piel HaCaT-Control y expresión deslocalizada en Ia capa suprabasal inmediata a Ia basal en los equivalentes de piel HaCaT IKKalpha. Obsérvese Ia tinción suprabasal intensa de placoglobina en Ia piel humana normal, mientras que en los PV Ia tinción de placoglobina aparece deslocalizada, siendo más intensa en las regiones en las que se produce Ia rotura por acantolisis (por encima de Ia capa basal).
Fig. 10. Disminución de Ia expresión de Dsg3 en los equivalentes de piel HaCaT-IKKalpha. Arriba: Expresión relativa de Dsg3 en equivalentes de piel de células HaCaT-IKKalpha con respecto a los equivalentes de HaCaT-Control. Obsérvese que Dg3 disminuye a un 67%. Abajo: Expresión de mRNA de Dsg3 en dos muestras diferentes de células HaCaT-Control (curvas azules) y HaCaT-IKKalpha (curvas rojas).
Figura 11. Presencia de espongiosis en los PV y en los equivalentes de piel HaCaT-IKKalpha. Tinción histológica de PV y equivalente de piel HaCaT-IKKalpha en el que se observa Ia presencia de espongiosis (grandes espacios intercelulares) entre las células de las capas basal y suprabasales inmediatas.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. Caracterización de Ia proliferación y diferenciación epidérmica promovida por IKKα.
Los inventores han demostrado mediante experimentación que IKKα acelera Ia diferenciación temprana de los queratinocitos (estratificación) y permite que alcancen Ia diferenciación terminal (medida como presencia de corneocitos) (Fig. 1 ). Estos experimentos se han realizado mediante Ia transfección estable de Ia línea de queratinocitos humanos HaCaT que tiene Ia propiedad de diferenciar en placa en ausencia de suero, como Io demuestra Ia expresión de las queratinas K1 y K10 (marcadores de diferenciación temprana) y Ia formación de cúmulos de estratificación. Los estudios de diferenciación temprana demostraron que las células transfectadas con I KKa (H-IKKa) experimentan una diferenciación acelerada respecto a las células control (H-Co), ya que se observaron cúmulos de estratificación bien diferenciados en los cultivos H-IKKa en el día 8 (e incluso en días anteriores), mientras que en las células H-Control aparecieron por primera vez en el día 14, siendo todavía muy rudimentarios (Figura 1-B, flechas). Como análisis complementario, se estudió por Northern blot Ia expresión de Ia queratina K10, marcador temprano de diferenciación epidérmica, a distintos días de diferenciación en H-IKKα-Pool (procedente de más de 40 colonias diferentes IKKalpha) y H-Control. En el día 6 ya se observó un alto nivel de expresión de este marcador de diferenciación en H-IKKa- Pool, mientras que en H-Control hasta el día 13 no se apreció un aumento de esta magnitud en Ia expresión de K10. Por Io tanto, el análisis del nivel de expresión de K10 confirmó Ia diferenciación acelerada de las células que expresaban niveles elevados de IKKα (Figura 1-C).
Se estudió Ia diferenciación terminal en los cultivos H-IKKα-Pool y H- Control en distintos días, mediante el análisis de Ia presencia de corneocitos en el cultivo. Los corneocitos son queratinocitos aplanados y sin núcleo, en un estadio terminal de diferenciación. A día 9 de diferenciación encontramos abundantes corneocitos en H-IKKα-Pool mientras que no se observaron en el control (Figura 1-D). En el día 16 de diferenciación se observó que el número de corneocitos en H-IKKa era muy superior al encontrado en las células control (125± 10.7 x104 frente a 1.5± 0.9 x104 por ml; p< 0.01 ).
Se comprobó que Ia vía de señalización de NF-κB no está implicada en los cambios de diferenciación observados en las células con niveles elevados de IKKα (no mostrado). Y también que IKKα regula Ia diferenciación de los queratinocitos por un mecanismo dependiente de cadherina-E, una proteína esencial para el desarrollo y Ia diferenciación epidérmica, tal y como Io han puesto de manifiesto estudios in vivo e in vitro; Ia ausencia de cadherina-E en Ia epidermis supone Ia aparición de defectos en Ia diferenciación terminal e incluso provoca muerte perinatal por pérdida de agua. Se analizó la expresión de cadherina-E mediante Western blot e inmunofluorescencia y observamos un incremento sustancial en los niveles de esta proteína en los queratinocitos que expresan niveles elevados de IKKα, tanto sin diferenciar (Figura 2 A y B) como en las células dierenciadas (Figura 2 C). A continuación se utilizó un anticuerpo específico contra cadherina-E, bloqueante de su actividad y comprobamos que el bloqueo parcial de Ia función de cadherina-E con 5 y 10 μg/ml de anticuerpo bloqueaba parcialmente Ia diferenciación de las células H-IKKa, mientras que una inhibición total, en presencia de 20 μg/ml del anticuerpo Ia inhibía completamente (Figura 2 D). Estos resultados indican que cadherina-E tiene un papel fundamental como mediador del efecto de I KKa sobre Ia diferenciación de los queratinocitos, ya que el bloqueo parcial de Ia función de cadherina-E inhibe parcialmente Ia diferenciación inducida por IKKα, mientras que ésta es completamente inhibida con un bloqueo mayor. Estos resultados por tanto indican que IKKα regula Ia diferenciación de los queratinocitos por un mecanismo dependiente de cadherina-E.
Ejemplo 2. Estudio de Ia función de IKKα en Ia carcinogénesis epidérmica. IKKα como supresor tumoral en piel
Se ha demostrado que Ia expresión de niveles elevados de IKKα en células epidérmicas tumorales de ratón induce, cuando estas células son inoculadas en ratones inmunosuprimidos, un cambio en Ia variante histológica de los carcinomas epidermoides o escamoso-celulares (CECs) que se producen, de modo que en vez de desarrollar CECs convencionales, dan lugar a Ia aparición de unos tumores pseudoglandulares semejantes a los CECs acantolíticos (CECAs) humanos. Estos CECAs murinos se caracterizan por una expresión elevada de cadherina-E (de localización citosólica en vez de estar en Ia membrana celular) y ausencia de las queratinas K1 y K10, marcadoras de diferenciación que hasta ahora siempre se había encontrado que se expresaban de forma proporcional a IKKα y a cadherina-E. De gran importancia en el área de Ia salud es que hemos caracterizado por primera vez propiedades moleculares de los CECAs humanos, tumores éstos de mal pronóstico, gran agresividad y elevado riesgo de metastatizar. Hemos encontrado que los CECAs humanos presentan las mismas características que los CECAs murinos: expresan elevados niveles de IKKα y de cadherina-E en ausencia de K1 y K10. Estos resultados por tanto demuestran que IKKα aumenta Ia malignidad de las células epidérmicas tumorales y es responsable de Ia aparición de Ia variante histológica de CECAs humanos.
El efecto que tiene el incremento en los niveles de expresión de IKKα sobre el comportamiento neoplásico de células epidérmicas tumorigénicas, se ha realizado en Ia línea celular de ratón PDVC57 ya que porta una mutación en el gen Ha-ras y produce, al ser inyectada subcutáneamente en ratones inmunodeficientes, CECs bien o moderadamente diferenciados que recuerdan a los que se originan en los ensayos de carcinogénesis química en piel de ratón. Se obtuvieron transfectantes estables que expresaban los vectores pRC-βActin-3xHA-IKKα (C57-IKKα) o pcDNA3 (C57-Control). Se comprobó por Western blot (Figura 3-A) Ia expresión de HA y Ia sobreexpresión de IKKα en las células C57-IKKα. También se comprobó que Ia expresión de cadherina-E estaba aumentada en las células C57-IKKα (Figura 3-A).
Posteriormente se inyectaron subcutánemente las células C57-IKKα y Co en ratones inmunosuprimidos. El análisis histopatológico reveló destacadas diferencias entre los tumores de ambos genotipos: mientras que los tumores C57-Control eran CECs moderadamente diferenciados (Figura 4 A, B), los tumores originados a partir de las células C57-IKKα presentaban escasas zonas con características de CEC típico, bien diferenciadas, y extensas áreas de apariencia pseudoglandular (Figura 4- C). En las que se distinguía Ia presencia de queratinocitos discohesivos (Fig. 4D) y de proyecciones papilares de células de epitelio escamoso en las cavidades que se forman (Fig. 4E). Este tipo de tumor se asemeja a los tumores acantolíticos (CECA) o pseudoglandulares humanos (Figura 4 F- H), en los cuales las células tumorales proliferan formando estructuras semejantes a glándulas o acinos (cavidades císticas intraepidérmicas) variables en tamaño (Figura 4 F) que contienen en Ia luz células que se van desprendiendo (queratinocitos acantolíticos) (Figura 4 G, flechas negras). Además, en ellos es frecuente Ia aparición de estructuras tubulares o alveolares similares a apéndices pseudoglandulares (Figura 4- H, asteriscos).
El análisis inmunohistoquímico de los tumores mostró un patrón de expresión de queratinas muy distinto entre C57-IKKα y C57-Control. Los tumores C57-Control presentaron escasa tinción de queratinas K1 ó K10 - marcadores característicos de tumores bien diferenciados-. Por el contrario, en los tumores C57-IKKα las áreas de CEC bien diferenciadas presentaron abundante tinción positiva para K1 y K10 (Figura 5 C, D y resultados no mostrados) mientras que las zonas con diferenciación pseudoglandular eran negativas para K1 y K10 (Figura 5-D). La expresión de K13 -queratina de epitelios escamosos estratificados que se expresa en tumores premalignos de piel- era muy abundante en los tumores C57- IKKα, dando un patrón de tinción muy llamativo, principalmente en el epitelio que rodea las cavidades císticas y en el interior del lumen (Figura 5-F). K13 fue detectado únicamente en pequeños focos de los tumores control (Figura 5-E). La tinción inmunohistoquímica para IKKα en los tumores H-IKKa mostró una expresión elevada tanto en las áreas bien diferenciadas del tumor como en las regiones CECA (Figura 5-B; nótese Ia tinción de IKKα en los acantocitos, cabezas de flecha negra). Sin embargo, Ia tinción contra I KKa en los tumores H-Control mostró una baja expresión de IKKα (Fig. 5 A).
El análisis de Ia expresión de cadherina-E por Western blot e inmunohistoquímica reveló bajos niveles de esta proteína en los tumores C57-Control, de acuerdo con Io descrito previamente para SCCs moderadamente diferenciados (Figuras 3 y 5-G). Sin embargo, los tumores C57-IKKα mostraron altos niveles de expresión de cadherina-E tanto en las zonas CEC bien diferenciados como en las áreas CECA de diferenciación pseudoglandular (Figuras 3 y 5-H). Es de destacar Ia presencia de tinción citosólica de cadherina-E en las áreas acantolíticas con queratinocitos discohesivos en vez de Ia tinción en membrana celular observada en las regiones CEC de ambos tipos tumorales, C57-Control y C57-IKKα (Figura 5 G, H).
El análisis inmunohistoquímico de Ia expresión de IKKα, cadherina-E y de las queratinas K1 y K10 en CECAs de origen humano indica que estos tumores presentan muchas semejanzas con los CECAs murinos homólogos (C57-IKKα): elevada expresión de IKKα (Figura 6-A); cadherina-E se expresa extensamente y Ia señal es principalmente citosólica, en concordancia con el patrón de expresión en las regiones CECA de los tumores C57-IKKα murinos (Figura 6-D) y no se detecta expresión de K1 ni de K10, excepto un foco de CEC convencional presente en el CECA acantolítico (Figura 6-G). Posteriormente, analizamos los niveles de expresión de estas proteínas en CECs humanos de distinto grado de diferenciación y comprobamos que IKKα, cadherina-E y las queratinas K1 y K10 se expresan en estos tumores de forma proporcional entre ellas y directamente proporcional también al grado de diferenciación del tumor, de manera que Ia expresión de las tres proteínas es elevada en los tumores bien diferenciados y casi no se detecta en los indiferenciados (Figura 6 B-C, E-F, H-I).
Estos estudios por tanto muestran que, en el caso de los tumores humanos, ambos, los CECs indiferenciados y los CECAs se consideran agresivos y con alta capacidad de metastatizar, difieren completamente en cuanto a sus niveles de expresión de IKKα y de cadherina-E. Como los tumores CECs indiferenciados pierden Ia expresión de IKKα, se había sugerido un papel para I KKa como supresor de Ia progresión y metástasis tumoral. Sin embargo, estos resultados establecen una elevada expresión de IKKα en tumores agresivos humanos (CECAs), sugiriendo un nuevo papel para IKKα en Ia génesis de los tumores de piel.
Ejemplo 3. Implicación de IKK alpha en el desarrollo de otras enfermedades de Ia piel que cursen con acantolisis.
Se han realizado experimentos en los que hemos analizado pénfigos vulgares y queratosis, encontrando que en las regiones acantolíticas de estos dos tipos de enfermedades se encuentra una expresión elevada de IKKalpha y de cadherina-E, como ocurre en las regiones acantolíticas de los CECA humanos y de ratón (tumores C57-IKKalpha) (Fig. 7).
En un intento de reproducir Ia enfermedad pénfigo vulgar in vitro, se han realizado equivalentes de piel con los queratinocitos humanos HaCaT que sobreexpresan IKKalpha. Se ha encontrado una característica en ellos que los diferencia de los equivalentes control, como es Ia expresión deslocalizada, de involucrina, un marcador de diferenciación que se concentra en Ia capa suprabasal inmediata superior a Ia basal, mientras que en los equivalentes control, al igual que en Ia piel normal se localiza en capas suprabasales mas superficiales. Se ha comprobado que en las regiones de piel afectadas de pénfigo vulgar, involucrina se expresa como en los equivalentes HaCaT IKKalpha (Fig. 8). También se deslocaliza placoglobina en el pénfigo vulgar y en nuestros equivalentes (Fig. 9).
La causa aceptada del origen del pénfigo vulgar es Ia aparición de autoanticuerpos en los pacientes contra Desmogleinas 1 y 3
(principalmente Ia 3) de los desmosomas en Ia capa suprabasal inmediata a Ia basal de Ia epidermis, Io que induce cambios conformacionales en
Dsg3 que resultan en una ausencia de función de esta proteína. La Dsg3 es responsable de mantener Ia unión entre los queratinocitos, por Io que su falta de función produce una rotura (ampolla) entre las capas basal y suprabasal inmediata; posteriormente, se origina Ia desunión entre los queratinocitos y por tanto el fenómeno de acantolisis.
Experimentos de microarrays de los equivalentes HaCaT y su posterior confirmación por PCR cuantitativa, muestran una disminución en Ia cantidad de Dsg 3 en los equivalentes HaCaT-IKKalpha. (Fig. 10).
Histológicamente los equivalentes HaCaT-IKKalpha muestran un fenotipo similar al de los pénfigos vulgares en cuanto a Ia presencia de espongiosis (espacios intercelulares) que también se encuentran en los pénfigos vulgares (Fig. 11 ).
El hecho de que el único cambio que se ha introducido en los equivalentes HaCaT respecto a los controles sea Ia sobrexpresión de IKKalpha en las células HaCaT y con ello se produzca un fenotipo histológico que recuerda al de los PV y que se deslocalicen ciertas moléculas de manera similar (involucrina, placoglobina) y que presenten menos Dsg3 funcional, nos induce a pensar que IKKalpha es responsable de Ia aparición del pénfigo vulgar humano y de una queratosis con acantolisis superpuesta. Nuestros resultados sugieren que IKKa sea también posiblemente Ia responsable de Ia acantolisis de otras enfermedades humanas cutáneas.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Composición que comprende un agente modulador de Ia actividad de IKKalpha para el tratamiento de enfermedades que cursan con acantolisis.
2. Uso de una composición que comprende un agente modulador de Ia actividad de IKKalpha para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que cursan con acantolisis.
3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, en Ia que los agentes moduladores se seleccionan de Ia lista que comprende: a) una molécula pequeña, b) una molécula de RNA, c) un oligonucleótido antisentido, d) un anticuerpo, o e) una ribozima. o cualquiera de sus combinaciones.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en Ia que los agentes moduladores se seleccionan de Ia lista que comprende: BMS-345541 , IMD-0354, PS-1 145, Wedelolactona ó Tetrazolopiridazin-fenilsulfoxido, los siRNA de las secuencias SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o los anticuerpos 16139, I7778, I7903.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, donde Ia enfermedad que cursa con acantolisis se selecciona de Ia lista que comprende: Ia enfermedad de Hailey-Hailey (Pénfigo crónico benigno familiar),la enfermedad de Darier, Ia dermatitis acantolítica transitoria (enfermedad de Grover), el grupo de los pénfigos, Ia infección por herpesvirus o el disqueratoma verrucoso, el síndrome estafilocócico de Ia piel escaldada, el impétigo, Ia queratosis actínica acantolítica, otras acantolisis incidentales, o el carcinoma epidermoide acantolítico.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el carcinoma epidermoide acantolítico.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde Ia enfermedad que cursa con acantolisis pertenece al grupo de los pénfigos.
8. Composición según Ia reivindicación anterior, donde Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el pénfigo vulgar.
9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el agente modulador de Ia actividad de IKKalpha es un oligonucleótido antisentido y Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el carcinoma epidermoide acantolítico.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el agente modulador de Ia actividad de IKKalpha es un oligonucleótido antisentido y Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el pénfigo.
11. Composición según Ia reivindicación anterior, donde Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el pénfigo vulgar.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el agente modulador de Ia actividad de IKKalpha es un anticuerpo y Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el carcinoma epidermoide acantolítico.
13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el agente modulador de Ia actividad de IKKalpha es un anticuerpo y Ia enfermedad que cursa con acantolisis es el pénfigo vulgar.
14. Método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende: a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polipéptido IKKalpha, b) detectar Ia unión de dicho compuesto a analizar con el polipéptido IKKalpha.
15. Método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende: a) determinar Ia actividad de IKKalpha a una determinada concentración del compuesto a analizar o en ausencia de dicho compuesto, b) determinar Ia actividad de IKKalpha a una concentración del compuesto a analizar diferente de Ia de a).
16. Método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende: a) determinar Ia actividad de IKKalpha a una determinada concentración del compuesto a analizar, b) determinar Ia actividad de IKKalpha en presencia de un compuesto que se conoce que modula Ia actividad de IKKalpha.
17. Método de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades que cursen con acantolisis que comprende: a) poner en contacto el compuesto a analizar con el polinucleótido IKKalpha, b) detectar Ia unión de dicho compuesto a analizar con el polinucleótido IKKalpha.
18. Método para Ia recolección de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades que cursan con acantolisis que comprende a) determinar Ia expresión de IKKalpha en una muestra extraída de un mamífero, b) comparar los valores de Ia expresión de IKKalpha obtenidos en a) con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
19. Método según Ia reivindicación anterior, en el que además de Ia determinación de Ia expresión de IKKalpha, se determinan los valores de expresión de cadherina-E y de las queratinas K1 y K10, y se comparan con los valores estándar en mamíferos sanos o enfermos.
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